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WO1999033873A1 - NOUVEAUX POLYPEPTIDES, ADNc CODANT CES POLYPEPTIDES ET UTILISATION DE CEUX-CI - Google Patents

NOUVEAUX POLYPEPTIDES, ADNc CODANT CES POLYPEPTIDES ET UTILISATION DE CEUX-CI Download PDF

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Publication number
WO1999033873A1
WO1999033873A1 PCT/JP1998/005952 JP9805952W WO9933873A1 WO 1999033873 A1 WO1999033873 A1 WO 1999033873A1 JP 9805952 W JP9805952 W JP 9805952W WO 9933873 A1 WO9933873 A1 WO 9933873A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cdna
present
polypeptide
seq
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/005952
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Daikichi Fukushima
Shiro Shibayama
Hideaki Tada
Original Assignee
Ono Pharmaceutical Co. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ono Pharmaceutical Co. Ltd. filed Critical Ono Pharmaceutical Co. Ltd.
Priority to KR1020007007159A priority Critical patent/KR100692226B1/ko
Priority to EP98961596A priority patent/EP1043333A4/en
Publication of WO1999033873A1 publication Critical patent/WO1999033873A1/ja
Priority to US11/593,037 priority patent/US20070054310A1/en
Priority to US12/772,617 priority patent/US20100285527A1/en
Priority to US13/242,077 priority patent/US20120027764A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide, a method for producing the same, a cDNA encoding the polypeptide, a vector comprising the cDNA, a host cell transformed with the vector, an antibody of the polypeptide, and a polypeptide.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a peptide or an antibody.
  • the present inventors have so far studied the cloning of genes for growth / differentiation factors that work in the hematopoietic and immune systems. Most of secreted proteins such as growth differentiation factors (for example, various site proteins) and membrane proteins such as their receptors (hereinafter collectively referred to as secreted proteins, etc.). Focusing on the fact that it has a sequence called a signal peptide at the N-terminus, the inventor has intensively studied a method for efficiently and selectively cloning a gene encoding a signal peptide. As a result, a method (signal sequence strap (STST) method) that can easily select cDNA encoding a signal peptide using animal cells was found (see JP-A-6-315380).
  • STST signal sequence strap
  • yeast SST method a method for isolating a gene encoding a signal peptide more efficiently and easily using yeast (yeast SST method) has also been developed (see US Patent No. 5,536,637). ). Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to find novel factors (polypeptides) that are useful in therapy, diagnosis, or research, particularly, secretory proteins and membrane proteins having secretory signals. .
  • Clones OM07 and OMB096 are full-length cDNAs containing the complete cDNA sequence encoding the secreted protein (herein designated as OM077 and OMB096 proteins, respectively). is there.
  • the cDNA sequences provided by the present invention were identified as clones OAF0038-Leu and OAF038-Pro, and were prepared from a cell line derived from adult human bone marrow (HAS303) by the yeast SST method described above. cDNA isolated from DNA library. Clones OAF0.38—Leu and OAF0.38—Pro contain complete cDNA sequences encoding membrane proteins (here represented as OAF0038—Leu and ⁇ AF038-Pro proteins). Includes full-length cDNA.
  • the cDNA sequence provided by the present invention was identified as clone OR087H, and was isolated from a cDNA library prepared from human fetal liver by the yeast SST method described above.
  • Clone OR087H is a full-length cDNA chain containing the complete cDNA sequence encoding a secreted protein (here represented as OR087H protein).
  • Clones OA004-FG and OA004-LD are full-length cDNAs that contain the complete cDNA sequence encoding a membrane protein (here represented as OA004-FG and OA004-LD proteins).
  • BLASTN and FASTA are used to check known nucleic acid sequences registered in the nucleic acid sequence database
  • BLASTX, BLASTP and FASTA are used to check amino acid sequences of known polypeptides registered in the amino acid sequence database.
  • polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16, or 19,
  • the present invention relates to cDNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, or 21. Detailed description of the invention
  • the present invention relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16, or 19 in a substantially pure form, a homolog thereof. A fragment of the sequence and a homolog thereof.
  • the invention further relates to cDNAs encoding those polypeptides. More specifically, cDNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, or 20, and SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 1
  • the present invention relates to cDNA having a fragment that selectively hybridizes to a nucleotide sequence represented by 1, 12, 14, 15, 17, 18, 20, or 21.
  • the hybridizing cDNA includes a sequence complementary to the above sequence. The conditions for hybridization are preferably stringent.
  • a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16 or 19 in a substantially pure form generally means 90% or more of the polypeptide at the time of production, for example, It means that 95, 98 or 99% is a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16 or 19.
  • a homologue of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16 or 19 generally means at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 100 It is at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably at least 95% homologous in the contiguous amino acid region, and such homologs are hereinafter referred to as polypeptides of the present invention. .
  • polypeptide fragment comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16 or 19 or a homologous fragment thereof is at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids.
  • Amino acid for example, a 20, 25, 30, 40, 50 or 60 amino acid moiety.
  • the cDNA that selectively hybridizes to cDNA having the nucleotide sequence represented by 20 or 21 is generally at least 20, preferably at least 20,
  • cDNA contiguous nucleotide sequences It is at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such cDNA is hereinafter referred to as cDNA of the present invention.
  • a cDNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20 or 21 is at least 10 bases, Preferably it means at least 15 bases, for example a 20, 25, 30 or 40 bases portion, and such fragments are also included in the cDNA of the present invention.
  • the present invention includes a replication or expression vector comprising the cDNA of the present invention.
  • the vector include a plasmid, a virus or a phage vector comprising an ori region and, if necessary, a promoter for expression of the above-mentioned cDNA and a regulator of the promoter.
  • the vector may contain one or more selectable marker genes, for example, an ampicillin resistance gene.
  • the vector can be used in vitro, for example, for the production of RNA corresponding to cDNA and for the transformation of host cells.
  • the present invention provides a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 15, 17, 18, 20, or 21, or an open sequence thereof.
  • a host cell transformed with a vector for replicating or expressing the cDNA of the present invention, including a cDNA having a reading frame, is also included.
  • Cells include, for example, bacteria, yeast, insect cells or mammalian cells.
  • the present invention also includes a method for producing the polypeptide of the present invention, which comprises culturing the host cell of the present invention under conditions for expressing the polypeptide of the present invention.
  • the cultivation is preferably carried out under conditions under which the polypeptide of the present invention is expressed and produced from host cells.
  • An antisense RNA can also be produced by inserting the cDNA of the present invention into an antisense region of a vector as described above. Such an anti-se The sense RNA can also be used to control the level of the polypeptide of the present invention in a cell.
  • the present invention also includes monoclonal or polyclonal antibodies of the polypeptides of the present invention. Furthermore, the present invention includes a method for producing a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention. Monoclonal antibodies can be produced by ordinary hybridoma technology using the polypeptide of the present invention or a fragment thereof as an antigen. The polyclonal antibody can be produced by an ordinary method in which a host animal (for example, a rat or a heron) is inoculated with the polypeptide of the present invention and immune serum is collected.
  • a host animal for example, a rat or a heron
  • the present invention also includes a pharmaceutical composition comprising the polypeptide of the present invention, an antibody thereof, and a pharmaceutically acceptable excipient and / or carrier.
  • polypeptide of the present invention of (1) in addition to those having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16 or 19, those having a part of the amino acid sequence deleted (for example, In SEQ ID NO: 1, a polypeptide consisting only of a portion essential for the expression of a biological activity, etc.), a partially substituted amino acid (eg, an amino acid having similar properties), and one of them. It also includes those in which another amino acid is added or inserted in the part.
  • nucleotide sequence of cDNA can be changed without changing the amino acid sequence of the polypeptide.
  • the cDNA of the present invention specified in (2) includes all nucleotide sequences encoding the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16 or 19 in (1). It is. Changing the nucleotide sequence may improve the productivity of the polypeptide.
  • the cDNA specified by SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14, 17, and 20 in (3) is an embodiment of the cDNA shown in (2) and represents a natural sequence.
  • the cDNAs represented by SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, and 21 in (4) are obtained by adding the sequence obtained by adding the natural untranslated portion to the cDNA specified in (3). Show.
  • cDNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, or 21 is performed according to the following method.
  • yeasts such as Saccharomyces cerevisiae to use sucrose or raffinose as an energy or carbon source, they must secrete invertase into the culture medium (Inversease replaces raffinose with sucrose). It is an enzyme that breaks down sucrose into fructose and glucose into melibiose.) It is also known that many known mammalian signal peptides can secrete yeast invertase. Based on these findings, this method was used as a method for screening a novel signal peptide that enables secretion of yeast ymbelose from a mammalian cDNA library using the growth of yeast on raffinose medium as an indicator. Was developed.
  • a non-secretory invertase gene SUC2 (GENBANK accession No. V01311) from which the translation initiation point ATG was deleted was incorporated into a yeast expression vector to prepare a yeast SST vector pSUC2.
  • Expression vectors include AAH5 plasmid (Ga erer, Methods in Enzymol. 101, 192-201, 1983), an expression promoter (ADH promoter), and Yuichi Minei Yoichi (ADH Yuichi Minei Yoichi). ) Are integrated, and the yeast origin of replication is 2 or 2.
  • the yeast selection marker incorporates TRP1, the E. coli origin of replication contains ColEl ori, and the E. coli drug resistance marker contains the ampicillin resistance gene.
  • a yeast SST cDNA library was prepared by incorporating mammalian cDNA upstream of the SUC2 gene. This library was transformed into yeast lacking secreted ymbeltase. If the integrated mammalian cDNA encodes a signal peptide, it will bind to yeast-expressed ymbertase. However, the secretion effect can be considered more, and as a result, growth on raffinose medium is possible. Therefore, the yeast was cultured from the colonies that appeared, a plasmid was prepared, and the nucleotide sequence of the insert cDNA was determined, whereby the search for a novel signal peptide was quickly and easily performed.
  • step (1) after stimulating with a suitable stimulant from a target mammalian organ or cell line as necessary, a known method (hereinafter, known methods are not particularly described. For example, Molecular Cloning (by Sambrook, J., Fritsc, EF and Maniatis, T., published in 1989 from Cold Spring Harbor Laboratory Press) or Current Protocol in Molecular Biology (ed by FM Ausubel et al., Published by Wiohn Wiley & Sons, Inc.) The isolation of mRNA is performed according to the method described in (1).
  • the target cells are HAS 303 (human bone marrow stromal cell line: courtesy of Keiichi Toyama, Assistant Professor, Department of Internal Medicine, Tokyo Medical University, J. Cell. Physiol. H8, 245-251, 1991 and Experimental Hematol. 22, 482-487, 1994), human glioblastoma cell line T98G (ATCC No. CRL-1690), or human fetal liver (CLONTECH, # CL6527-1).
  • the tissue includes a human adult brain.
  • the synthesis of double-stranded cDNA using a random primer is performed by a known method.
  • the restriction enzyme (enzyme I) site to be connected to the adapter and the restriction enzyme (enzyme II) site used in the next step (2) may be any as long as they are different from each other.
  • Xho I is used as enzyme I
  • Eco RI is used as enzyme II. Is used.
  • step (2) blunt the ends with T4 DNA polymerase, ligate the enzyme II adapter, digest with enzyme I, and fractionate 300-800 bp cDNA by agarose electrophoresis (AGE).
  • Enzyme II may be anything different from enzyme I as described above.
  • Step (3) is a step of transforming Escherichia coli by incorporating the cDNA fragment obtained in (2) upstream of the invertase gene from which the signal peptide linked to the yeast expression plasmid vector has been deleted. is there.
  • various plasmid vectors for yeast expression are known.For example, YEp24, which also functions in Escherichia coli, is used, and preferably, the plasmid pSUC2 described above is used. .
  • E. coli strains are already known for transformation, and are preferably DH10B competent cells.
  • the transformation may be performed by any known method, but is preferably performed by an electroporation method.
  • the transformant is cultured by a conventional method to obtain a cDNA library for yeast SST.
  • the cDNA library can be transformed into yeast Saccharomycs cerevisiae (for example, strain YT455) which does not have the invertase gene or a strain in which the invertase gene has been artificially deleted (can be prepared according to known methods).
  • yeast Saccharomycs cerevisiae for example, strain YT455
  • the cDNA library is introduced, and a fragment having a sequence encoding a signal peptide is screened.
  • the yeast is transformed by a known method, for example, the lithium acetate method. After the transformants are grown on a selective medium, they are transferred to a medium containing raffinose as a carbon source, viable colonies are selected, and the plasmid is recovered. Raffinose to carbon The growth of yeast as a source indicates that some secretory protein signal peptide was incorporated into the library.
  • nucleotide sequence of the isolated positive clone was determined, and for cDNA that was found to encode an unknown protein, a full-length clone was isolated using it as a probe, and the full-length nucleotide sequence was determined. Can be determined. These operations are performed in a manner known to those skilled in the art.
  • cDNA encoding the protein of the present invention present in mammals or CDNAs encoding homologs and subsets of the proteins of the present invention can be obtained.
  • PCR is performed from a mammalian cDNA library or mRNA by PCR, or by hybridizing a fragment having an appropriate nucleotide sequence as a probe.
  • cDNA encoding the protein of another mammalian type can be obtained.
  • the cDNA obtained in this way contains the base sequence of the cDNA fragment obtained by SST (or a homologous sequence thereof), it means that the signal peptide is coded. It is clear that the cDNA is full-length or almost full-length (the signal peptide is coded at the 5 'end of the open reading frame of cDNA, since the signal peptide is present at the N-terminus of the protein without exception).
  • the full length may be confirmed by Northern analysis using the cDNA as a probe.
  • the size of the mRNA obtained from the hybridized band is compared with the size of the cDNA, and if they are almost the same, the cDNA is considered to be almost full length.
  • the proteins of the present invention include both full-length and mature forms.
  • the full-length and mature forms of these proteins are shown in SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 13, 16 and 19. These mature proteins are represented by SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, It can be obtained by expressing the full-length cDNAs represented by 18 and 21 in appropriate mammalian cells or other host cells.
  • the sequence of the mature protein can be predicted from the full-length amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, or 20 is determined, it is then probed by chemical synthesis or by chemically synthesizing a fragment of the nucleotide sequence.
  • the cDNA of the present invention can be obtained.
  • a required amount of the desired cDNA can be obtained by introducing the vector containing the present cDNA into an appropriate host and growing it.
  • Vector systems include, for example, bacterial, yeast, insect cell and mammalian cell expression systems.
  • the cDN encoding the mature protein when expressed in E. coli, the cDN encoding the mature protein
  • An initiation codon is added to the 5 'end of A, and the resulting cDNA is converted to an appropriate promoter (eg, a trp promoter, a lac promoter, a ⁇
  • An expression vector is prepared by connecting downstream of an L promoter, a ⁇ 7 promoter, etc.) and inserting into a vector that functions in E. coli (eg, pBR322, pUC18, pUC19, etc.).
  • Escherichia coli for example, E. Coli DH1, E. Coli JM109, E. Coli HB101, etc.
  • Escherichia coli transformed with this expression vector is cultured in an appropriate medium, and the cells are purified from the cells. Can be obtained.
  • a signal peptide of a patella eg, a signal peptide of pe1B
  • the target polypeptide can be secreted into the periplasm.
  • Sa can produce fusion proteins with other polypeptides.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, or 20 may be replaced with an appropriate vector (for example, a retrovirus vector, a papilloma virus vector, An expression vector is prepared by inserting a suitable promoter (for example, SV40 promoter, LTR promoter, meta- mouth thionine promoter, etc.) in a vaccinia virus vector, SV40-based vector, etc.).
  • a suitable promoter for example, SV40 promoter, LTR promoter, meta- mouth thionine promoter, etc.
  • appropriate mammalian cells eg, monkey COS-7 cells, Chinese Hamster CHO cells, mouse L cells, etc.
  • the protein (polypeptide) of the present invention is expressed as follows depending on whether it is a secretory protein or a membrane protein.
  • fusion protein can also be produced by ligating with another polypeptide, for example, a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of an antibody.
  • the protein of the present invention is a membrane protein
  • the desired polypeptide is expressed on the cell membrane.
  • a deletion form lacking the transmembrane region of cDNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 18, or 21 was inserted into the above-described vector, and the resulting vector was used as a suitable mammalian cell.
  • the soluble polypeptide of interest is secreted into the culture solution.
  • fusion of the fusion DNA with the cDNA fragment encoding the deletion fragment lacking the transmembrane region and other polypeptides, for example, the cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of the antibody. (Fusion protein) can also be produced.
  • polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method. Industrial applicability
  • polypeptides of the present invention and the cDNAs encoding them will exhibit one or more effects or biological activities, including those associated with the assays listed below.
  • the effects or biological activities described with respect to the proteins of the present invention may be attributed to the administration or use of the protein or the administration or use of a cDNA encoding the protein (eg, for gene therapy or transduction of cDNA).
  • a suitable vector may be used.
  • the protein of the present invention may exhibit cytodynamic activity and cell proliferation (induction or inhibition) Z differentiation activity (induction or inhibition), or induce or suppress the production of other cytokines in a certain cell population.
  • Many of the currently discovered proteinaceous factors, including all known site forces, have been active in one or more factor-dependent cell proliferation assays, and their It functions as a convenient method of confirming the activity of the site.
  • the activity of the proteins of the present invention can be demonstrated by any of a number of conventional factor-dependent cell line cell proliferation assays.
  • proteins of the present invention also exhibit immunostimulatory and immunosuppressive activities. Certain proteins may also regulate (stimulate or inhibit) the growth and proliferation of, for example, T and / or B lymphocytes, as well as affect the cytotoxic activity of NK cells and other populations. Giving it would be effective in treating a variety of immunodeficiencies and diseases, including severe combined immunodeficiency (SCID). These immunodeficiencies can be hereditary or can be caused by, for example, a virus such as HIV, as well as bacterial or fungal infections. Alternatively, it may come from an autoimmune disease.
  • SCID severe combined immunodeficiency
  • proteins of the present invention may be responsible for infections caused by viruses, bacteria, mold or other infections, including various fungal infections such as (leshmani a), malaria (malaria) and Candida (Candida). It is thought that it can be treated by using it.
  • the protein of the present invention is considered to be effective in places where it is generally suggested that the immune system is enhanced, that is, in the treatment of cancer.
  • the proteins of the present invention are also believed to be effective in treating allergic reactions and conditions such as asthma and other respiratory diseases. It is contemplated that other conditions for which immunosuppression is desired (including, for example, asthma and related respiratory diseases) can be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention includes, for example, TNF, which has been proven to be effective by inflammatory bowel disease, Crohn's disease, or IL_11, such as septic shock or systemic inflammatory response syndrome (SIRS). It may also suppress chronic or acute inflammation associated with infections resulting from overproduction of cytokines such as IL-1.
  • TNF inflammatory bowel disease
  • Crohn's disease Crohn's disease
  • IL_11 septic shock or systemic inflammatory response syndrome (SIRS). It may also suppress chronic or acute inflammation associated with infections resulting from overproduction of cytokines such as IL-1.
  • the protein of the present invention is expected to be effective in controlling hematopoietic cells and, correspondingly, in treating myeloid or lymphoid cells deficiency. Even weak bioactivity with the help of colony forming cells or factor-dependent cell lines suggests that they may be involved in the control of hematopoietic cells.
  • the biological activity relates to one or all of the following examples.
  • erythroid progenitors alone, or in combination with other cytokins, and suggests their efficacy, such as treating various anemias, or producing erythroid progenitors and / or erythrocytes Stimulating radiation therapy Used in combination with Z chemotherapy; supports growth and proliferation of myeloid cells such as granulocytes and monocyte Z macrophages (ie, classical CSF activity); prevents myelosuppression associated with chemotherapy In combination with chemotherapy; support for megakaryocyte growth and proliferation and subsequent platelet growth and proliferation; General use in platelet transfusions or complementation to protect and treat various platelet disorders such as thrombocytopenia; hematopoietic stem cells that can mature into some or all of the above hematopoietic cells Supports the growth and proliferation of humans and thus has a therapeutic effect on a variety of stem cell disorders, including but not limited to those commonly treated with transplantation, including aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria It is also possible to
  • the protein of the present invention can be measured by the following method, among other methods.
  • the proteins of the present invention are believed to be used in any of bone, cartilage, tendons, ligaments, and nerve tissue growth or regeneration, as well as wound healing and tissue repair, and treatment of burns, incisions, and ulcers. Can be
  • Proteins of the invention that induce cartilage and / or bone or any growth in an environment that does not form bone normally have application in the healing of fractures and cartilage damage or defects in humans and other animals.
  • the preparation using the protein of the present invention is used for reduction of closed fracture as well as open fracture and improvement of fixation of artificial joint.
  • New bone formation induced by osteogenic agents contributes to the repair of congenital, traumatic, and craniofacial defects induced by carcinomactomy. It is also effective in the field of cosmetic plastic surgery.
  • the proteins of the present invention are also believed to be used in the treatment of periodontosis and other dental restorations. Such drugs are thought to provide an environment that attracts osteogenic cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate.
  • the proteins of the present invention may be used to stimulate osteoporosis and osteoporosis by stimulating the repair of bone and / or cartilage or any of them, or by inhibiting the process of inflammation or tissue destruction mediated by the inflammatory process (collagenase activity or osteoclast activity). Osteoarthritis treatment It is considered effective.
  • tissue regeneration activity that may be attributed to the proteins of the present invention is tendon / ligament formation.
  • the protein of the present invention induces such tissue formation in an environment where tendon ligament-like tissue or other tissue is not properly formed. Applicable to healing of tendon ligament disorders. Formulations using proteins that induce tendon / ligament-like tissue can be used to improve the fixation of tendon ligaments to bone or other tissues and to repair tendon ligament tissue defects, Preventive use for damage prevention is also conceivable.
  • Neo-tendon Z ligament-like tissue formation induced by the compositions of the present invention contributes to the repair of congenital, traumatic, or tendon or ligament defects of other origin. It is also effective in cosmetic plastic surgery in which tendons or ligaments are attached or repaired.
  • compositions of the present invention provide an environment that attracts tendon Z ligament forming cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate.
  • the inducible ligament cells or their progenitor cells may be induced ex vivo in preparation for in vivo reversion to achieve tissue repair.
  • the compositions of the invention are also effective in treating tendinitis, Carpal Tunnel Syndrome, and other tendon or ligament defects.
  • the composition also includes a suitable matrix and a Seques tering agent well known to those skilled in the art, as well as a carrier.
  • the proteins of the present invention may be centrally and mechanically and traumatically impaired, including nerve cell proliferation and regeneration of nerve and brain tissue, i.e., degeneration, death, or trauma of nerve cells or nerve tissue. It may also be effective in treating peripheral nervous system diseases and neurological diseases. Specifically, certain proteins are diseases of the peripheral nervous system, such as peripheral neuropathy, peripheral neuropathy, and focal neuropathy, and Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral disease (amyo It is thought to be effective in treating central nervous system disorders such as tropi cl ateral) and Shy-Drager syndrome. In addition, conditions that can be treated in accordance with the present invention include cerebrovascular disease such as spinal cord injury, head trauma, and stroke. Includes mechanical and trauma disorders. Peripheral neurosis caused by chemotherapy or other treatments can also be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention has an activity of producing other tissues such as organs including the kidney, liver, intestine, kidney, skin, endothelium, smooth, skeletal or cardiac muscle, and vascular tissues including vascular endothelium, or the like. It is also expected to exhibit the activity of promoting the proliferation of cells constituting such tissues. Part of the desired effect may also be mediated by the inhibition of fibrous scars that regenerate normal tissue.
  • the protein of the present invention is also considered to be effective for gastrointestinal tract protection or regeneration, and for treatment of conditions caused by fibrosis of lung or liver, reperfusion injury of various tissues, and systemic site force-in disorder. .
  • the proteins of the present invention exhibit activity associated with activin Z inhibin.
  • Activin is characterized by its activity in stimulating the release of follicle-stimulating hormone (FSH)
  • inhibin is characterized by its activity in inhibiting the release of follicle-stimulating hormone (FSH). Therefore, the protein of the present invention is a contraceptive regulator based on the activity of inhibin, which is used alone or as a heterodimer with a member of inhibin ⁇ -family, to reduce the fertilization rate of female mammals and to reduce male spermatogenesis. It is considered to be effective. Administration of sufficient amounts of other inhibins can induce infertility in mammals.
  • the protein of the present invention is a homodimer or heterodimer with other protein subunits of the inhibin / 3 group, and is a therapeutic infertility based on the activity of an activin molecule that stimulates FSH release from cells of the pituitary gland. It is believed to be effective as a guide (see US Patent 4,798,885).
  • the protein of the present invention is believed to be effective in hastening the onset of pregnancy in sexually immature mammals, in order to extend the lifespan of livestock such as cattle, sheep and pigs. .
  • the protein of the present invention can be used, for example, for mammalian cells, including monocytes, neutrophils, ⁇ cells, mast cells, eosinophils, and endothelial cells, or any of them.
  • mammalian cells including monocytes, neutrophils, ⁇ cells, mast cells, eosinophils, and endothelial cells, or any of them.
  • it is thought to have chemotactic z chemokinetic activity to act as a chemokine.
  • Chemotaxis Chemomotility proteins can be used to immobilize or attract a desired cell population to a desired site of a reaction.
  • Chemotactic chemokinetic proteins offer special advantages in treating wounds and other trauma, as well as local infections. For example, attracting lymphocytes, monocytes, or neutrophils to a tumor or site of infection may result in an improved immune response to the tumor or site of infection.
  • a protein or peptide retains chemotactic activity on a particular cell population if it can directly or indirectly stimulate the indicated direction or movement of that cell population. Desirably, the protein or peptide retains the activity of directly stimulating the directed movement of the cell. Whether a particular protein retains chemotactic activity for a cell in a population can be readily determined by using such a protein or peptide in any known cell chemotaxis assay. .
  • proteins of the present invention also exhibit clotting or thrombotic activity. As a result, such proteins are expected to be effective in treating a variety of coagulation disorders, including genetic disorders such as hemophilia. Alternatively, it is expected to promote clotting and other clotting events in the treatment of wounds caused by trauma, surgery or other causes.
  • the protein of the present invention is also considered to be effective in dissolving or inhibiting the formation of thrombus, and in treating and preventing conditions caused by thrombus or stroke.
  • the protein of the present invention may also exhibit activity as an inhibitor or agonist of a receptor, receptor ligand or receptor / ligand.
  • receptors and ligands include cytokine receptors and their ligands, receptor kinases and their ligands, receptor phosphatases and their ligands, and receptors associated with cell-cell interactions (Selectin). , Integur in, oh And its ligands, including cell adhesion molecules such as receptor kinases) and their ligands, and combinations of receptors / ligands involved in antigen presentation, antigen recognition, and the development of cellular and humoral immune responses.
  • Receptors and ligands are also effective in screening for possible peptides or small molecules for their interaction.
  • the proteins of the present invention (including but not limited to receptor and ligand fragments) are themselves considered to be effective as inhibitors of receptor-no-ligand interaction.
  • the proteins (polypeptides) of the invention may exhibit one or more of the following additional activities or effects: infectious agents, including bacteria, viruses, molds, and other parasites Has the effect of suppressing or promoting physical characteristics such as height, weight, hair color, eye color, skin or other tissue pigmentation, or organ size such as breast gain or weight loss : Affects the breakdown of dietary fat, protein or carbohydrates; Affects behavioral characteristics including appetite, libido, stress, cognition (cognitive impairment), depression, violent behavior; Reduces analgesic effects or other pain Promotes the differentiation and proliferation of embryonic stem cells into other lineages other than the hematopoietic lineage; and, in the case of enzymes, compensates for the deficiency of the enzyme and cures related diseases To.
  • infectious agents including bacteria, viruses, molds, and other parasites
  • Proteins having the above activities include, for example, proliferation or cell death of B cells, T cells, mast cells, class-specific induction of immunoglobulin by promoting class switching, differentiation of B cells into antibody-producing cells, granulocyte precursor cells Proliferation or differentiation, cell death, proliferation or differentiation of monocytes, macrophage progenitor cells, cell death, neutrophils, monocytes ⁇ macrophages, eosinophils, basophils proliferation or hyperfunction, cell death, megakaryocyte precursors Cell proliferation or cell death, neutrophil precursor cell proliferation or differentiation, cell death, B or T precursor cell proliferation or differentiation, cell death, erythrocyte production promotion, erythrocyte, neutrophil, eosinophil, basophil Balls, monocytes, macrophages, mast cells, megakaryocyte progenitor cells, neutrophils, monocytes, macrophages, B cells or T cells Stimulation, Thymocyte proliferation or cell death, Adipocyte differentiation inhibition, Natural killer cell proliferation or cell death, Hematop
  • polypeptide of the present invention since the polypeptide of the present invention is also expected to act on the nervous system, it differentiates into various neurotransmitter-operated neurons and maintains their survival or cell death; Process extension, ganglion cell survival or cell death, astrocytic proliferation or differentiation promotion or cell death, peripheral nerve proliferation or survival, cell death, Schwann cell proliferation or cell death, motor nerve proliferation or It is thought that it also has the effect of maintaining survival and cell death.
  • polypeptide of the present invention may be used in the developmental process of the early embryo during the development of the early embryo, such as formation of the epidermis, brain, spine, and nerve by the action of inducing ectoderm, the dorsal cord connective tissue (bone, muscle, tendon) and blood cells by the action of inducing mesoderm Organ formation of cells, heart, kidney, gonads, or digestive organs (stomach, intestine, liver, ligament), respiratory system by endoderm induction
  • the polypeptide of the present invention itself may be a disease relating to a decrease or increase in the function of the immune system or nervous system or bone metabolism, or a hypoplasia or abnormal proliferation of hematopoietic cells, such as an inflammatory disease (rheumatic disease).
  • Hematopoietic stem cell depletion after bone marrow transplantation Cancer, Leukemia, platelets, B-cell or T-cell depletion after radiation or chemotherapy for leukemia, Anemia, Infectious disease, Cancer It is expected to be used as a preventive or therapeutic agent for leukemia, AIDS, abnormal bone metabolism (osteoporosis, etc.), various degenerative diseases (Alzheimer's disease, multiple sclerosis, etc.), or nerve damage.
  • polypeptide of the present invention may be used to divide ectoderm, mesoderm or endoderm-derived organs. It is expected to be used as a tissue repair agent for organs (epidermal, bone, muscle, tendon, heart, kidney, stomach, intestine, liver, kidney, lung, trachea, etc.) You.
  • polypeptide of the present invention can be quantified in a living body using the polypeptide polyclonal antibody or monoclonal antibody, whereby the relationship between the polypeptide and the disease can be studied or the disease can be diagnosed. It can be used for such purposes.
  • Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies can be prepared by a conventional method using the polypeptide or a fragment thereof as an antigen.
  • an affinity column is prepared, and a known or unknown protein (ligand) that binds to the present polypeptide is synthesized. Identification, purification or cloning of the gene can be performed.
  • the yeast two-hybrid method can be used to identify downstream signaling molecules that interact with the polypeptide in the cytoplasm and to perform gene cloning.
  • polypeptide of the present invention it is also possible to screen for an inhibitor between the polypeptide receptor of the present invention, an antagonist of the present invention, a receptor and a signaling molecule, and the like.
  • the cDNA of the present invention is not only an important and essential type II for producing the polypeptide of the present invention, which is expected to have tremendous utility, but also the diagnosis and treatment of genetic diseases (for gene deficiency). It can be used for treatment or treatment by stopping the expression of polypeptide by antisense DNA (RNA).
  • RNA antisense DNA
  • dienomic (genomic) DNA can be isolated using the cDNA of the present invention as a probe.
  • a gene for a human-related polypeptide highly homologous to the cDNA of the present invention, and a polypeptide highly homologous to the polypeptide of the present invention in an organism other than mouse It is also possible to isolate the gene for the tide.
  • the polypeptide of the present invention or an antibody against the polypeptide of the present invention is usually administered systemically or locally, generally orally or parenterally.
  • Preferred are oral administration, intravenous administration and intraventricular administration.
  • Dosage varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but is generally within the range of 100 g to 100 mg / day for each adult. It is orally administered once to several times, or parenterally once per adult, in the range of 10 g to 100 mg once or several times a day.
  • the dose varies depending on various conditions, so that a dose smaller than the above-mentioned dose may be sufficient, or may be required outside the range.
  • the compound of the present invention When the compound of the present invention is administered, it is used as a solid composition, a liquid composition and other compositions for oral administration, an injection for parenteral administration, an external preparation, a suppository and the like.
  • Solid compositions for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like.
  • Capsules include soft capsules and hard capsules.
  • the one or more active substances include at least one inert diluent (e.g., lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch). , Polyvinylpyrrolidone, magnesium aluminate metasilicate, etc.).
  • the composition is prepared according to a conventional method using additives other than an inert diluent, for example, a lubricant (such as magnesium stearate), a disintegrant (such as calcium cellulose glycolate), a stabilizer (human serum albumin, lactose). Etc.) and solubilizing agents (arginine, aspartic acid, etc.).
  • Tablets or pills may be coated with a gastric or enteric film, such as sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, etc., if necessary. May be coated. Also included are absorbable materials such as gelatin.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like, and commonly used inert diluents (eg, purified water, Ethanol etc.). Such compositions may contain, in addition to the inert diluent, adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, and preservatives.
  • adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, and preservatives.
  • compositions for oral administration include sprays which contain one or more active substances and are formulated in a manner known per se.
  • This composition contains, in addition to the inert diluent, a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity, an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. It may be.
  • a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity
  • an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. It may be.
  • Methods for producing sprays are described in detail, for example, in US Pat. Nos. 2,868,691 and 3,095,355.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • aqueous or non-aqueous solution, suspension one or more active substances is mixed with at least one inert diluent.
  • Aqueous diluents include, for example, distilled water for injection and saline.
  • non-aqueous diluent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, Polysorbate 80 (registered trademark) and the like.
  • compositions may also contain adjuvants such as preserving, wetting, emulsifying, dispersing, and stabilizing agents (eg, human serum albumin, lactose, etc.) and solubilizing agents (eg, arginine, aspartic acid, etc.). It may contain an agent.
  • adjuvants such as preserving, wetting, emulsifying, dispersing, and stabilizing agents (eg, human serum albumin, lactose, etc.) and solubilizing agents (eg, arginine, aspartic acid, etc.). It may contain an agent.
  • RNA is extracted from human adult brain tissue using TRIzo 1 reagent (TRIzol reagent, registered trademark, sold by GIBC0BRL), and mRNA purification kit (mRNA Purification Kit, trade name, sold by Pharmacia) ) was used to purify po 1 y (A) + RNA.
  • TRIzo 1 reagent TRIzol reagent, registered trademark, sold by GIBC0BRL
  • mRNA purification kit mRNA Purification Kit, trade name, sold by Pharmacia
  • Plasmids of this cDNA library were prepared, and the yeast YTK12 strain was transformed by the lithium acetate method (see Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1). Then, spread the yeast transformants without Tributofan (T rp) on a plate of selective medium (CMD-T rp medium) and incubate at 30 for 48 hours. After removal, a replica of a colony (transformant) obtained by using Actran Replica Replicator (Accutran Replica Plater, trade name, sold by Schleicher & Schuell) is placed on a YPR plate using raffinose as a carbon source.
  • Actran Replica Replicator Acceler & Schuell
  • PCR was performed according to a known method using two types of primers (the sense strand was a biotinylated primer) at both ends of the cloning site of pSUC2, and after the insert cDNA was amplified, Dynabeads (Dynabeads , A trade name, sold by DYNAL) was used to purify the biotinylated single-stranded cDNA, and the nucleotide sequence was determined.
  • the nucleotide sequence is determined by a fluorescent dye using DNA sequencing kit (DNA Sequencing kit (Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction), trade name, sold by Applied Biosystems Inc.).
  • a 28-mer primer OMO07-F2: 5 'on the 3' side of the OM007-F1 primer was added to the 5'-AAGAGGACAT TGTTTTC ATC ATGGATGC- 3 ' (SEQ ID NO: 24) was prepared and subjected to nested PCR.
  • the cDNA amplified specifically to clone ⁇ M007 was fractionated by agarose gel electrophoresis, ligated into pT7Blue-2 T-Vector (trade name, sold by Novagen), and transformed into E. coli DH5a. To prepare the plasmid.
  • nucleotide sequence on the 5 'side was determined to confirm that the nucleotide sequence of OM007SSTcDNA was present. Then, the entire nucleotide sequence was determined, and the cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained. Furthermore, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2.
  • clone OM007 the region between amino acid sequences 21 and 765 of SEQ ID NO: 1
  • chicken 'collabsin 2 collapsin-2 [Gallusgallus], Genbank Accession U28240 amino acid
  • clone ⁇ MO07 is expected to retain at least the same activity as the Semaphori family one to which collapsin belongs.
  • Example 2 Clone OMB 096
  • the example of the clone # MB096 of the present invention used the same method as OM007, except for the following points.
  • the cDNA specifically amplified in the clone OMB096 was recloned in the same manner as in OM007, the entire nucleotide sequence was determined, and the cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 6 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 4 and 5.
  • TRIzol reagent registered trademark, GIBC0BRL
  • HAS 303 human bone marrow stromal cell line HAS 303 (provided by Keisuke Sotoyama, Assistant Professor, Department of Internal Medicine, Tokyo Medical University)
  • Total RNA was extracted using a commercially available mRNA (purchased from Pharmacia) using mRNA Purification Kit (trade name, sold by Pharmacia).
  • OAF 038 The cDNA specifically amplified to clone OAF 038 was recloned in the same manner as OM007, the entire nucleotide sequence was determined, and the cDNA sequences shown in SEQ ID NOS: 9 and 12 were obtained.
  • PCR was performed with the adapter and the primer attached to the kit.
  • the cDNA specifically amplified to the clone OR087H was recloned in the same manner as in OM007, the entire nucleotide sequence was determined, and the cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 15 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acid to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 13 and 14.
  • BLASTN and FASTA are used to detect known nucleic acid sequences registered in the nucleic acid sequence database, and BLASTX, BLASTP and FASTA are used to check the amino acid sequences of known polypeptides registered in the amino acid sequence database.
  • BLASTX, BLASTP and FASTA are used to check the amino acid sequences of known polypeptides registered in the amino acid sequence database.
  • TRIzol reagent registered trademark, sold by GIBCO BRL
  • mRNAI U ⁇ ificationKit
  • plasmid pSP ⁇ RT1 (GIBC0BRU was used as a vector) from ⁇ 1y (A) + RNA of human daryoblastoma cell line T98G using the Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (product name: GIBCO BRL).
  • a positive clone was isolated and a plasmid was prepared.
  • the nucleotide sequence on the 5 ′ side is determined to confirm that the nucleotide sequence of OA004S STc DNA exists.After that, the entire nucleotide sequence is determined, and the cDNA sequences shown in SEQ ID NOS: 18 and 21 are copied. Therefore, they were named OA004-FG and OA004-LD, respectively.
  • the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 16, 17 and 19, 20, respectively.
  • clones OA004-FG and OA004-LD region between amino acid sequences 236 to 319 of SEQ ID NOs: 16 and 19
  • human presenilin 2 Preseni 11 in-2 [Homo sapiens], Genbank Accession A56993 Region between the amino acid sequences 340 and 416) of the amino acid sequence. Based on these homologies, clones OA004-FG and OA004-LD are expected to retain at least the same activity as the preseni 11 in family one.

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Description

明 細 書 新規なポリペプチド、 そのポリペプチドをコードする cDNA、 およびその用途 技術分野
本発明は、 新規なポリペプチド、 その製造方法、 そのポリペプチドをコ一 ドする cDNA、 その c DNAからなるベクター、 そのべクタ一で形質転換 された宿主細胞、 そのポリペプチドの抗体、 およびそのペプチドまたは抗体 を含有する薬学的組成物に関する。 背景技術
従来、 ある特定のポリペプチドまたはそれをコードする c DNAを得よう とする場合、 組織や細胞培養液中に目的とする生物活性を確認し、 次いでポ リペプチドの単離精製を経て、 遺伝子をクローニングするという方法、 ある いはその生物活性を指標として遺伝子を発現クローニングする方法が一般的 に用いられてきた。 しかし、 生体内生理活性ポリペプチドは、 多様な生物活 性を有している場合が多いので、 あるひとつの活性を指標にして遺伝子をク ローニングした結果、 それが既知のポリペプチドと同一であることが後にな つて判明するという事例が増えている。 また、 微量しか産生されなかったり、 特別な生理的条件でのみ発現する因子も多く、 そのことが単離、 精製および 生物活性の確認を困難なものとしている。
近年、 cDNAの作製技術やシークェンス技術は急速に発展し、 大量の c DN Aのシークェンスを迅速に行なうことができるようになった。 そこで これらの技術を利用して、 様々な細胞や組織から cDNAライブラリーを作 製し、 ランダムに c DNAをクローニングして塩基配列を決定し、 新規なポ リペプチドをコードする遺伝子を単離する方法が発展している。 この方法は、 生化学的、 遺伝学的な解析を一切必要とせずに遺伝子をクローニングし、 そ の塩基配列の情報を得ることができるという特徴を有しているが、 目的とす る遺伝子の発見は偶発的要素が大きい。
本発明者らは、 これまで造血系や免疫系で働く増殖分化因子の遺伝子のク ローニングを研究してきた。 そして、 増殖分化因子 （例えば、 各種サイト力 イン等） のような分泌蛋白質やそのレセプ夕一のような膜蛋白質 （以下、 こ れらをまとめて分泌蛋白質等と呼ぶ。 ） の大部分がその N末端にシグナルべ プチドと呼ばれる配列を有していることに着目して、 シグナルべプチドをコ —ドする遺伝子を効率的かつ選択的にクローニングする方法を鋭意検討した。 その結果、 動物細胞を用いて、 シグナルペプチドをコードする c D N Aを簡 単に選抜できる方法 （シグナルシークェンストラップ（S S T)法） を見出し た （特開平 6-315380 号参照） 。 さらに同じ概念のもとに、 酵母を用いてさら に効率よく簡便にシグナルペプチドをコードする遺伝子を単離する方法 （酵 母 S S T法） も開発された （米国特許 No. 5, 536, 637参照） 。 発明の開示
本発明者らは、 治療、 診断、 あるいは研究上有益な新規な因子 （ポリぺプ チド） 、 特に分泌シグナルを有する分泌蛋白質および膜蛋白質に着目してそ れを見出すべく、 鋭意検討を行なった。
その結果、 前記の方法を用いて、 多種多様な分泌蛋白および膜蛋白を産生 していると予想される細胞株および組織、 例えばヒト成人の脳組織および脳 組織由来の細胞株、 ヒト骨髄由来の細胞株、 およびヒト胎児肝臓が産生して いる新規な分泌蛋白質あるいは膜蛋白質、 およびそれをコードする c D N A を見出すことに成功し、 本発明を完成した。
本発明が提供する c D N A配列は、 クローン O M 0 0 7および O M B 0 9 6として同定され、 上記酵母 S S T法によりヒト成人脳組織から作製し た c D N Aライブラリーより単離された。 クローン OM 0 0 7および O M B 0 9 6は分泌蛋白質 （ここではそれぞれ O M 0 0 7および O M B 0 9 6蛋白 として表される） をコードする完全な c D N A配列を含む全長鎖 c D N Aで ある。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN お よび FASTA により、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知の ポリペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検 索した結果、 本発明のポリペプチド OM007、 OMB 096およびそれぞ れをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明 のポリぺプチドは、 新規な分泌蛋白質であることが判明した。
本発明が提供する c DNA配列は、 クローン OAF 0038 -L e uおよ び OAF 038 -P r oとして同定され、 上記酵母 S ST法により成人のヒ ト骨髄由来の細胞株 （HAS 303) から作製した c DNAライブラリーよ り単離された。 クローン OAF 0 0 3 8— L e uおよび OAF 0 3 8— P r oは膜蛋白質 （ここでは OAF 0038— L e uおよび〇AF 038 - P r o蛋白として表される） をコードする完全な c DNA配列を含む全長鎖 c DNAである。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN お よび FASTA により、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知の ポリペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検 索した結果、 本発明のポリペプチド OAF 0038 _L e u、 OAF 038 — P r oおよびそれぞれをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規の膜蛋白質であることが判明 した。
本発明が提供する c DN A配列は、 クローン OR 087 Hとして同定され、 上記酵母 S ST法によりヒト胎児肝臓から作製した c DN Aライブラリーよ り単離された。 クローン OR 087 Hは分泌蛋白質 （ここでは OR 087 H 蛋白として表される） をコードする完全な c DNA配列を含む全長鎖 c DN Aである。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN お よび FASTA により、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知の ポリペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検 索した結果、 本発明のポリペプチド OR 087 Hおよびそれをコードする核 酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規な分泌蛋白質であることが判明した。
本発明が提供する c DN A配列は、 クローン OA 004 - F Gおよび OA004— LDとして同定され、 上記酵母 S ST法によりヒトグリア芽腫 細胞株 T 98 Gから作製した c DN Aライブラリーより単離された。 クロー ン OA004— FGおよび OA004— LDは膜蛋白質 （ここでは OA 00 4一 FGおよび OA004— LD蛋白として表される） をコードする完全な c DNA配列を含む全長鎖 c DNAである。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTA により、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知の ポリペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検 索した結果、 本発明のポリぺプチド OA 004— F Gおよび OA 004 - LDおよびそれぞれをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。 この ことから、 本発明のポリペプチドは、 新規な膜蛋白質であることが判明した。 すなわち、 本発明は
(1) 配列番号 1、 4、 7、 10、 1 3、 16または 19で示されるァミノ 酸配列からなるポリペプチド、
(2) 前記 （1) に記載したポリペプチドをコードする cDNA、
(3) 配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 17または 20で示される塩基配 列を有する cDNA、
(4) 配列番号 3、 6、 9、 12、 1 5、 18または 21で示される塩基配 列を有する c DNAに関する。 発明の詳細な説明
本発明は、 実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 7、 10、 1 3、 1 6または 19で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 そのホモロー グ、 その配列のフラグメントおよびそのホモローグに関する。
本発明はさらにそれらのポリべプチドをコ一ドする c DNAに関する。 よ り具体的には、 配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 17または 20で示され る塩基配列を有する c DNA、 および配列番号 2、 3、 5、 6、 8、 9、 1 1、 12、 14、 1 5、 1 7、 18、 20または 2 1で示される塩基配列に 選択的にハイプリダイズするフラグメントを有する c DNAに関する。 ハイ ブリダィズする cDNAには、 上記配列の相補配列も含まれる。 ハイブリダ ィズの条件は、 ストリンジェントであることが望ましい。
実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 16または 1 9で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、 一般に、 生産時のポ リペプチドの 90%以上、 例えば、 95、 98または 99 %が配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 16または 19で示されるアミノ酸配列を有するポリ ぺプチドであることを意味する。
配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 16または 19で示されるアミノ酸配 列からなるポリペプチドのホモローグとは、 一般に少なくとも 20個、 好ま しくは少なくとも 30個、 例えば 40、 60または 100個の連続したアミ ノ酸領域で、 少なくとも 70 %、 好ましくは少なくとも 80または 90%、 より好ましくは 95 %以上相同性であるものであり、 そのようなホモローグ は、 以後本発明のポリペプチドとして記載される。
さらに、 配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 16または 19で示されるァ ミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント、 またはそれらのホモロー グのフラグメントとは、 少なくとも 10アミノ酸、 好ましくは少なくとも 1 5アミノ酸、 例えば 20、 25、 30、 40、 50または 60アミノ酸部分 を意味する。
配列番号 2、 3、 5、 6、 8、 9、 1 1、 12、 14、 15、 17、 18、
20または 21で示される塩基配列を有する cDN Aに選択的にハイブリダ ィズする cDNAとは、 一般に、 少なくとも 20個、 好ましくは少なくとも
30個、 例えば 40、 60または 100個の連続した塩基配列領域で、 少な くとも 70 %、 好ましくは少なくとも 80または 90 %、 より好ましくは 95 %以上相同性であるものであり、 そのような c DNAは、 以後本発明の cDNAとして記載される。
配列番号 2、 3、 5、 6、 8、 9、 1 1、 12、 14、 15、 17、 18、 20または 2 1で示される塩基配列を有する c DN Aのフラグメントとは、 少なくとも 10塩基、 好ましくは少なくとも 1 5塩基、 例えば 20、 25、 30または 40塩基部分を意味し、 そのようなフラグメントも本発明の c D NAに含まれる。
さらに、 本発明には、 本発明の c DNAからなる複製または発現ベクター が含まれる。 ベクタ一としては、 例えば、 o r i領域と、 必要により上記 c DN Aの発現のためのプロモーター、 プロモーターの制御因子などからなる プラスミド、 ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。 ベクターはひ とつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、 例えばアンピシリン耐性遺伝 子を含んでいてもよい。 ベクターは、 イン ' ビトロ （in vitro) において、 例えば c DNAに対応する RNAの製造、 宿主細胞の形質転換に用いること ができる。
さらに、 本発明には、 配列番号 2、 3、 5、 6、 8、 9、 1 1、 12、 1 4、 1 5、 1 7、 18、 20または 21で示される塩基配列、 またはそれら のオープンリーディングフレームを有する c DNAを含む本発明の c DNA を複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれ る。 細胞としては、 例えば細菌、 酵母、 昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げ られる。
さらに、 本発明には、 本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、 本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリぺプチドの製造方法 も含まれる。 培養は、 本発明のポリペプチドが発現し、 宿主細胞より製造さ れる条件下で行なわれることが好ましい。
本発明の c DNAは、 上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入す ることでアンチセンス RN Aを製造することもできる。 このようなアンチセ ンス R N Aは、 細胞中の本発明のポリぺプチドのレベルを制御することに用 いることもできる。
本発明は、 本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクロ —ナル抗体も含む。 さらに本発明におけるポリぺプチドのモノクローナルま たはポリクローナル抗体の製造方法も含む。 モノクローナル抗体は、 本発明 のポリペプチドまたは、 その断片を抗原として用い、 通常のハイプリ ドーマ の技術により製造することができる。 ポリクロ一ナル抗体は、 宿主動物 （例 えば、 ラットやゥサギ等） に本発明のポリペプチドを接種し、 免疫血清を回 収する、 通常の方法により製造することができる。
本発明には、 本発明のポリペプチド、 その抗体と薬学的に許容される賦形 剤および または担体を含有する薬学的組成物も含まれる。
(1) の本発明のポリペプチドとしては、 配列番号 1、 4、 7、 10、 1 3、 16または 19で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、 その一部 が欠損したもの （例えば、 配列番号 1中、 生物活性の発現に必須な部分だけ からなるポリペプチド等） 、 その一部が他のアミノ酸と置換したもの （例え ば、 物性の類似したアミノ酸に置換したもの） 、 およびその一部に他のアミ ノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、 ひとつのアミノ酸をコードするコドンは 1〜6 種類 （例えば、 Me tは 1種類、 L e uは 6種類） 知られている。 従って、 ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく c DNAの塩基配列を変える ことができる。
(2) で特定される本発明の c DN Aには、 （1) の配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 16または 19で示されるポリペプチドをコードするすべての 塩基配列群が含まれる。 塩基配列を変えることによって、 ポリペプチドの生 産性が向上することがある。
(3) の配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 1 7および 20で特定される cDNAは、 （2) で示される c DNAの一態様であり、 天然型配列を表わ す。 (4) の配列番号 3、 6、 9、 1 2、 1 5、 1 8および 2 1で示される c DNAは、 （3) で特定される c DNAに天然の非翻訳部分を加えた配列を 示す。
配列番号 3、 6、 9、 1 2、 1 5、 1 8または 2 1で示される塩基配列を 有する cDNAの作製は、 以下の方法に従って行なわれる。
はじめに酵母 S ST法 （米国特許 No. 5, 536, 637 に記載） の概要について 説明する。
サッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) なとの酵母が ショ糖またはラフィノースをエネルギー源や炭素源として利用するためには インベルターゼを培地中に分泌しなければならない （インベル夕ーゼはラフ ィノースをショ糖とメリビオースに、 ショ糖をフルクト一スとグルコースに 分解する酵素である。 ） 。 また数多くの既知の哺乳類のシグナルペプチドは 酵母のィンベルターゼを分泌させうることが知られている。 これらの知見か ら、 酵母のィンベル夕ーゼの分泌を可能にする新規のシグナルべプチドを哺 乳類の c DNAライブラリーからラフィノース培地上での酵母の生育を指標 にスクリーニングする方法として本方法は開発された。
まず、 翻訳開始点 ATGを削除した非分泌型のインベル夕ーゼ遺伝子 S U C 2 (GENBANK accession No. V01311)を酵母の発現ベクターに組み込んで 酵母 S ST用ベクター p SUC 2を作製した。 発現ベクターには、 AAH 5 プラスミ ド （Ga画 erer, Methods in Enzymol. 101, 192-201, 1983) 由来の発 現用プロモーター （ADHプロモーター） および夕一ミネ一夕一 （ADH夕 一ミネ一夕一） が組み込まれ、 酵母複製起点としては 2 o r し 酵母選択 マーカーには TRP 1、 大腸菌複製起点としては ColEl o r i、 大腸菌薬剤 耐性マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子がそれぞれ組み込まれている。 その SUC 2遺伝子の上流に哺乳類の c DNAを組み込んで、 酵母 S ST c DNAライブラリーを調製した。 このライブラリ一を分泌型ィンベルタ一 ゼを欠損している酵母に形質転換した。 組み込まれた哺乳類 c DNAがシグ ナルペプチドをコードしている場合、 酵母で発現されたィンベルタ一ゼに対 しても分泌作用をもっと考えられ、 その結果ラフィノース培地上での生育が 可能となる。 よって出現したコロニーから酵母を培養してプラスミドを調製 し、 インサート c DNAの塩基配列を決定することによって、 新規シグナル ペプチドの検索を迅速かつ容易にした。
酵母 S ST c DN Aライブラリ一の作製は
( 1) 対象となる細胞より mRN Aを単離し、 特定の制限酵素 （酵素 I ) サイトを連結したランダムプライマーを用いて二本鎖 c DNAを合成し、
(2) 酵素 Iとは異なる特定の制限酵素 （酵素 II) サイトを含むアダプタ 一を連結して、 酵素 Iで消化した後、 適当なサイズで分画し、
(3) 酵母発現ベクター内のシグナルペプチドを削除したインベル夕ーゼ 遺伝子の上流に得られた c DN A断片を連結し、 形質転換する工程よりなる。 各工程を詳しく説明すると、 工程 （1) では、 対象となる哺乳類の臓器や 細胞株などより、 必要により適当な刺激剤で刺激した後、 公知の方法 （以下、 公知の方法は特に記載がなければ Molecular Cloning (Sambrook, J. , Fritsc , E. F.および Maniatis, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Press より 1989年に発刊) または Current Protocol in Molecular Biology (F. M. Ausubel ら編、 〗ohn Wiley&Sons, Inc より発刊）に記載の方法に従って行なわれる。 ） に従って mRN Aの単離が行なわれる。
対象となる細胞としては、 HAS 303 (ヒト骨髄ストローマ細胞株：東 京医科大学第一内科外山圭助教授、相沢信助手より供与。 J. Cell. Physiol. H8, 245-251, 1991 および Experimental Hematol. 22, 482-487, 1994に記載) 、 ヒトグリァ芽腫細胞株 T 98 G (ATCC No. CRL-1690) 、 またはヒト胎児肝臓 (CLONTECH, #CL6527- 1)が挙げられる。 また組織としては、 ヒト成人脳が挙げ られる。 ランダムプライマーを用いる二本鎖 c DN Aの合成は公知の方法に より行なわれる。
アダプターに連結される制限酵素 （酵素 I) サイトと次の工程 （2) で用 いられる制限酵素 （酵素 II) サイトは、 互いに異なるものであれば何を用い てもよい。 好ましくは、 酵素 Iとして X ho I、 酵素 II としては Ec o R I が用いられる。
工程 （2) では T 4 DN Aポリメラーゼで末端を平滑化し、 酵素 II ァダプ 夕一を連結した後、 酵素 Iで消化し、 ァガロース電気泳動 （AGE) により 300〜800 b pの c DNAを分画する。 酵素 II は、 前記したように酵素 Iと異なるものなら何でもよい。
工程 （3) は、 酵母発現用プラスミドベクターに連結されたシグナルぺプ チドを削除したインベル夕ーゼの遺伝子の上流に （2) で得られた cDNA 断片を組み込んで大腸菌に形質転換する工程である。 ここで酵母発現用ブラ スミドベクターとしては種々のものが知られているが、 例えば、 大腸菌内で も機能する YE p 24などが用いられるが、 好適には前述したプラスミ ド p SUC 2が用いられる。
形質転換のための宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られており、 好ま しくは DH 10 Bのコンビテントセルである。 また形質転換方法は公知のい ずれを用いてもよいが、 好ましくはエレクトロポレーシヨン法により行なわ れる。 形質転換体は常法により培養され、 酵母 S ST用の c DNAライブラ リーが得られる。
この c DNAライブラリーでは、 すべてのクローンに c DNA断片が導入 されている訳ではないし、 またすべてが未知の （新規の） シグナルペプチド をコードする遺伝子断片とは限らない。 そこで、 次に該ライブラリーから未 知のシグナルペプチドをコードする遺伝子断片をスクリーニングする必要が ある。 そのためには、 c DNAライブラリーをインベル夕一ゼ遺伝子をもた ない酵母 Saccharomycs cerevisiae (例えば YT455株など） またはインべ ルターゼ遺伝子を人為的に欠損させた株 （公知の方法に従い作製可能） に、 該 c DNAライブラリーを導入し、 シグナルペプチドをコ一ドする配列を有 する断片のスクリーニングを行なう。
酵母の形質転換は公知の方法、 例えば酢酸リチウム法によって行なわれる。 形質転換体を選択培地で生育後、 ラフィノースを炭素源とする培地に移し、 生育可能なコロニーを選択し、 プラスミドを回収する。 ラフイノースを炭素 源として酵母が生育したということは、 ライブラリ一中に何らかの分泌蛋白 質のシグナルぺプチドが組み込まれていたことを示している。
次に、 単離した陽性クローンについて、 塩基配列を決定し、 未知の蛋白質 をコードすることが明らかになった c DN Aについては、 それをプローブと して全長クローンを単離し、 全長の塩基配列を決定することができる。 これ らの操作は、 当業者にとってすベて公知の方法で行なわれる。
配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 17または 20で示される塩基配列が、 一部、 好ましくは全てが確定されると哺乳類に存在する本発明の蛋白質をコ 一ドする c DNAもしくは本発明蛋白質のホモローグおよびサブセットをコ ードする cDNAを得ることができる。 適当な塩基配列を有するオリゴヌク レオチドを合成し、 それを用いて、 哺乳類由来の c DNAライブラリーある いは mRNAから P CR法により、 あるいは適当な塩基配列の断片をプロ一 ブとしてハイブリダィズさせることにより、 他の哺乳類 c DN Aライブラリ —あるいは該ゲノムライブラリ一から、 他の哺乳類型の当該蛋白質をコード する c DNAを得ることができる。
このようにして得られた c DN Aが、 S STで得られた c DNA断片の塩 基配列 （またはその相同配列） を含んでいるならばシグナルペプチドをコー ドしていることになるので、 該 cDNAが全長、 またはほぼ全長であること は明らかである （シグナルペプチドは例外なく蛋白質の N末端に存在するこ とから、 c DNAのオープンリーディングフレームの 5 ' 末端にコードされ ている。 ） 。
さらに公知の方法に従い、 該 c DNAをプローブとしてノザン（Northern) 解析によって全長の確認してもよい。 ハイブリダィズしたバンドから得られ る mRNAのサイズと該 c DN Aのサイズを比較し、 ほぼ同じであれば該 c DNAはほぼ全長であると考えられる。
本発明の蛋白には、 全長型および成熟型の両方が含まれる。 これらの蛋白 の全長型および成熟型は、 配列番号 1、 4、 7、 10、 1 3、 16および 1 9に示されている。 これらの成熟蛋白は、 配列番号 3、 6、 9、 12、 15、 18および 2 1で示される全長 c DNAを適当な哺乳類の細胞あるいはその 他の宿主細胞で発現させることにより得ることができる。 成熟型の蛋白の配 列は全長型のアミノ酸配列より予測可能である。
配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 17または 20で示される塩基配列が 一旦確定されると、 その後は、 化学合成によって、 あるいは該塩基配列の断 片を化学合成し、 これをプローブとしてハイブリダィズさせることにより、 本発明の c DNAを得ることができる。 さらに、 本 c DNAを含有するべク 夕一 c DNAを適当な宿主に導入し、 これを増殖させることによって、 目的 とする c DN Aを必要量得ることができる。
本発明のポリペプチドを取得する方法としては、
(1) 生体または培養細胞から精製単離する方法、
(2) ペプチド合成する方法、 または
(3) 遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、 工業的には （3) に記載した方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系 （宿主
—ベクター系） としては、 例えば、 細菌、 酵母、 昆虫細胞および哺乳動物細 胞の発現系が挙げられる。
例えば、 大腸菌で発現させる場合には、 成熟蛋白部分をコードする c DN
Aの 5 ' 末端に開始コドン （ATG) を付加し、 得られた cDNAを、 適当 なプロモーター （例えば、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 λ Ρ
Lプロモーター、 Τ 7プロモーター等） の下流に接続し、 大腸菌内で機能す るベクター （例えば、 pBR 322、 pUC 18、 pUC 1 9等） に揷入し て発現ベクターを作製する。
次に、 この発現ベクターで形質転換した大腸菌 （例えば、 E. Coli DH 1、 E. Coli J M 109, E. Col i H B 10 1株等） を適当な培地で培養して、 その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。 また、 パクテリ ァのシグナルペプチド （例えば、 p e 1 Bのシグナルペプチド） を利用すれ ば、 ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。 さ らに、 他のポリペプチドとのフュージョン · プロテイン （fusion protein) を生産することもできる。
また、 哺乳動物細胞で発現させる場合には、 例えば、 配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 17または 20で示される塩基配列を適当なベクター （例えば、 レトロウイルスベクター、 パピローマウィルスベクター、 ワクシニアウィル スベクター、 SV40系ベクター等） 中の適当なプロモーター （例えば、 SV40プロモーター、 LTRプロモーター、 メタ口チォネインプロモー夕 一等） の下流に挿入して発現ベクターを作製する。 次に、 得られた発現べク ターで適当な哺乳動物細胞 （例えば， サル COS— 7細胞、 チャイニーズハ ムスター CHO細胞、 マウス L細胞等） を形質転換し、 形質転換体を適当な 培地で培養することによって、 本発明の蛋白 （ポリペプチド） が分泌蛋白の 場合と膜蛋白の場合で、 次のように発現される。
本発明の蛋白が分泌蛋白の場合、 その細胞上清中に目的とするポリべプチ ドが発現される。 さらに、 その他のポリペプチド、 例えば抗体の定常領域 (Fc portion)をコードする c DN A断片と連結することによって、 フュージョン · プロテイン （fusion protein) を生産することもできる。
一方、 本発明の蛋白が膜蛋白の場合、 その細胞膜上に目的とするポリぺプ チドが発現される。 また配列番号 9、 12、 18または 2 1で示されるアミ ノ酸配列をコードする c DN Aの膜貫通領域を欠いた欠失体を上記ベクター に挿入し、 これを用いて適当な哺乳類動物細胞を形質転換することによって、 その培養液中に目的とする可溶性ポリペプチドが分泌される。 さらにその膜 貫通領域を欠いた欠失体をコードする c DN A断片とその他のポリペプチド、 例えば抗体の定常領域 (Fc portion) をコードする c DN A断片を連結するこ とによって、 フュージョン ' プロテイン （fusion protein) を生産すること もできる。
以上のようにして得られたポリペプチドは、 一般的な生化学的方法によつ て、 単離精製することができる。 産業上の利用可能性
本発明のポリぺプチドおよびそれをコ一ドする c DNAは、 一つあるいは それ以上の効果あるいは生物活性 （以下に列挙するアツセィに関連するもの を含む） を示すことが考えられる。 本発明の蛋白に関して記述される効果あ るいは生物活性は、 その蛋白の投与あるいは使用により、 あるいは、 その蛋 白をコードする c DN Aの投与あるいは使用 （例えば、 遺伝子療法や c DN A導入に適したベクター） により、 提供される。
[サイトカイン活性および細胞増殖/分化活性]
本発明の蛋白は、 サイト力イン活性および細胞増殖 （誘導あるいは阻害） Z分化活性 （誘導あるいは阻害） を示す可能性、 あるいはある細胞集団に他 のサイトカインの産生を誘導あるいは抑制すると考えられる。 全ての既知の サイ 卜力インを含む、 現在発見されている多くの蛋白性因子は、 因子に依存 した一つあるいはそれ以上の細胞増殖アツセィ法で、 活性を示してきたので、 それらのアツセィは、 サイト力イン活性の便利な確認法として機能する。 本 発明の蛋白の活性は、 多くの従来の因子依存性の細胞株の細胞増殖アツセィ のうちのいずれかによつて証明され得る。
[免疫刺激 Z抑制活性]
本発明の蛋白は、 免疫刺激活性および免疫抑制活性をも示すと考えられる。 また、 ある蛋白は、 例えば、 Tリンパ球および Bリンパ球あるいはどちらか 一方の成長および増殖を制御 （刺激あるいは抑制） することや、 同様に NK 細胞や他の集団の細胞傷害性活性に影響を与えることによって、 様々な免疫 不全および疾患 (severe combined immunodeficiency (S C I D) を含む）の 治療に効果を示すと考えられる。 これらの免疫不全は遺伝性である場合もあ るし、 例えば H I Vのようなウィルスや、 同様に細菌やカビの感染が原因で 起こる場合もある。 あるいは、 自己免疫疾患から由来する可能性もある。 具 体的には、 H I V、 肝炎ウィルス （hepatitis viruses) 、 ヘルぺスウィルス (herpes viruses) 、 マイコバクテリア (mycobacteria) 、 リーシュマニア ( l eshmani a) 、 マラリア （mal ar i a) およびカンジダ （Cand i da) のような様々 なカビ感染を含む、 ウィルス、 細菌、 カビあるいは他の感染による感染症の 原因を、 本発明の蛋白を用いることによって治療できると考えられる。 もち ろん、 この関連より、 本発明の蛋白は、 免疫システムが増大していることが 一般的に示唆される場所、 すなわち癌治療の箇所において効果を示すと考え られる。
本発明の該蛋白は、 アレルギー反応および喘息や他の呼吸器系疾患のよう な状況の治療に効果にも効果を示すと考えられる。 免疫抑制が望まれるよう な他の状態 （例えば、 喘息や関連呼吸器疾患を含む） にも、 本発明の蛋白を 用いて治療できると考えられる。
本発明の蛋白は、 例えば、 敗血病性のショックあるいは全身性炎症反応症 候群 （S I R S ) のような、 炎症性大腸炎、 クローン病、 あるいは I L _ 1 1により効果が証明された T N Fや I L— 1のようなサイトカインの過剰産 生に由来するような感染に関連した慢性あるいは急性の炎症を抑制する可能 性もある。
[造血細胞制御活性]
本発明の蛋白は、 造血細胞の制御に、 またそれに応じて骨髄球様細胞ある いはリンパ球様細胞の欠乏に対する治療にも効果を示すと考えられる。 コロ ニー形成細胞あるいは因子依存性細胞株の援助の下での極く弱い生物活性で さえも、 造血細胞の制御に係わることを示唆する。 その生物活性とは、 次に 挙げる例の全てあるいはそのいずれかで例えられるようなものに係わるもの である。 赤血球前駆細胞のみの成長および増殖を支持、 あるいは他のサイト 力インとの組み合わせ、 また、 それが示唆する有効性、 例えば様々な貧血の 治療、 あるいは赤血球前駆細胞および赤血球あるいはそのどちらかの産生を 刺激する放射線療法 Z化学療法と組み合わせての使用 ；顆粒球および単球 Z マクロファージのような骨髄球の成長および増殖を支持 （すなわち、 古典的 な C S F活性） 、 化学療法に伴う骨髄抑制を防ぐための化学療法との併用 ； 巨核球の成長および増殖およびそれに続く血小板の成長および増殖の支持、 それによつて血小板減少症のような様々な血小板障害を防御および治療を可 能とする血小板輸血の際あるいは相補的に一般的使用；上記造血細胞の幾つ かあるいは全ての細胞へ成熟可能な造血幹細胞の成長および増殖の支持、 従 つて、 様々な幹細胞障害 （限定はされないが、 再生不良性貧血および発作性 夜間血色素尿症を含む、 移植で一般的に治療されるようなもの） に治療的効 果を見い出せる、 また、 正常細胞あるいは遺伝子療法のため遺伝的に操作さ れた細胞をイン ' ビトロ （i n vi t ro) あるいはェクス · ビポ （ex v ivo) (す なわち、 骨髄移植に伴う） どちらかで、 放射線療法/化学療法後の幹細胞分 画の再構築を行うことも同様である。
本発明の蛋白は、 他の方法の中で、 以下の方法により測定することが可能 である。
[組織生成 Z修復活性]
本発明の蛋白は、 損傷治癒および組織修復、 また、 火傷、 切開、 および潰 瘍の治療と同様に、 骨、 軟骨、 腱、 靭帯、 および神経組織成長あるいは再生 のいずれかに使用されると考えられる。
骨を正常に形成しない環境での軟骨および骨あるいはいずれかの成長を誘 導するような本発明の蛋白は、 ヒトおよび他の動物の骨折および軟骨損傷あ るいは欠損の治癒に適用される。 本発明の蛋白を使用している製剤は、 開放 骨折と同様に閉鎖骨折の整復、 また人工関節の固定の改良に用いられる。 骨 形成剤により誘導された新生骨形成は、 先天性、 外傷性、 癌切除術により誘 発した頭蓋顔面の欠損の修復に貢献する。 また、 美容形成外科分野にも有効 である。
本発明の蛋白は、 歯根膜症の治療および他の歯の修復にも使用されると考 えられる。 そのような薬品は、 骨形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖を刺 激し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 本発明 の蛋白は、 骨および軟骨あるいはいずれかの修復を刺激することを通して、 あるいは炎症あるいは炎症過程で介される組織破壊 （コラゲナーゼ活性や破 骨細胞の活性） の過程を阻止すことにより、 骨粗鬆症および骨関節炎の治療 に有効と考えられる。
本発明の蛋白に起因すると考えられる組織再生活性の別のカテゴリ一は腱 /靭帯形成である。 本発明の蛋白は、 腱 靭帯様組織あるいは他の組織が正 常に形成されない環境でそのような組織形成を誘導するものであるが、 ヒト および他の動物における腱 Z靭帯の裂傷、 奇形、 および他の腱 靭帯の障害 の治癒に適用できる。 腱/靭帯様組織を誘導する蛋白を使用している製剤は、 骨あるいは他の組織への腱ノ靭帯の固定の改良、 および腱 靭帯組織の欠損 の修復での使用はもちろん、 腱あるいは靭帯の損傷の防御に対して予防的使 用も考えられる。 本発明の構成物により誘導された新生腱 Z靭帯様組織形成 は、 先天性、 外傷、 あるいは他の起源の腱あるいは靭帯欠損の修復に貢献す る。 また、 腱あるいは靭帯の貼付あるいは修復という美容形成外科でも有効 である。 本発明の構成物は、 腱 Z靭帯形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖 を刺激し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 あ るいは、 組織修復を果たすためイン ' ビトロ （i n v ivo) への返還に備えてェ クス · ビボ （ex vivo) で腱ノ靭帯細胞あるいはその前駆細胞を誘導する。 該 発明の構成物は、 腱炎、 手根トンネル症候群 （Carpa l tunne l syndrome) 、 および他の腱あるいは靭帯欠損の治療にも有効である。 該構成物には、 適当 なマトリックスおよびキヤリア一と同様に当業者に良く知られているシーク エス夕リング （Seques ter i ng) 剤も含まれる。
本発明の蛋白は、 神経細胞の増殖、 および神経および脳組織の再生、 すな わち、 神経細胞あるいは神経組織の変性、 死、 あるいは外傷を含む機械的お よび外傷的障害と同様に中枢および末梢神経系疾患および神経病の治療に対 しても、 効果を示すと考えられる。 具体的には、 ある蛋白は、 末梢神経障害、 末梢神経症、 および局所的神経症のような末梢神経系の疾患、 およびァルツ ハイマー病、 パーキンソン病、 ハンチントン病、 筋萎縮性側策症 （amyo t ropi c l ateral ) 、 およびシャイ · ドレーガー （Shy- Drager) 症候群のような中枢神 経系の疾患の治療に有効であると考えられる。 更に本発明に応じて治療され 得る条件には、 脊髄障害、 頭部外傷、 および脳卒中等の脳血管疾患のような 機械的および外傷的障害を含む。 化学療法あるいは他の治療に起因する末梢 神経症も本発明の蛋白を用いて治療可能である。
本発明の蛋白は、 例えば塍臓、 肝臓、 腸、 腎臓、 皮膚、 内皮を含む臓器、 平滑、 骨格あるいは心臓筋肉、 および血管内皮を含む血管組織のような他の 組織を生成する活性、 あるいはそのような組織を構成する細胞の増殖を促進 する活性を示す可能性も期待される。 望まれる効果の一部は、 正常組織を再 生させる繊維性瘢痕 （scarr i ng) の阻害によっても担われると考えられる。 本発明の蛋白は、 消化管保護あるいは再生、 および肺あるいは肝臓の繊維 化、 様々な組織の再還流損傷、 および全身性サイト力イン障害に起因する状 態に対する治療にも有効であると考えられる。
[ァクチビン Zインヒビン活性]
本発明の蛋白は、 ァクチビン Zインヒビンに関連した活性を示すと考えら れる。 ァクチビンは濾胞刺激ホルモン （F S H) の放出を刺激する活性によ つて特徴づけられるが、 インヒビンは、 濾胞刺激ホルモン （F S H) の放出 を阻害する活性によって特徴づけられる。 よって、 本発明の蛋白は、 単独あ るいはインヒビン αフアミリーのメンバーとのヘテロダイマーで、 哺乳類動 物の雌の受精率を減少させ、 雄の精子形成を減少させるインヒビンの活性に 基づく避妊調節剤として有効であると考えられる。 充分量の他のインヒビン の投与によって、 哺乳動物の不妊を誘導可能である。 一方、 本発明の蛋白は、 インヒビン /3グループの他の蛋白サブュニットとのホモダイマ一あるいはへ テロダイマーで、 前脳下垂体の細胞から F S H放出を刺激するァクチビン分 子の活性に基づいた治療的な不妊誘導として有効であると考えられる （米国 特許 4, 798, 885 を参照） 。 本発明の蛋白は、 牛、 羊、 および豚のような家畜 の生涯出産能力可能な期間を延ばすために、 性的に未熟な哺乳類動物におけ る妊娠開始を早めることに有効であると考えられる。
[走化性 化学運動性活性]
本発明の蛋白は、 例えば、 単球、 好中球、 Τ細胞、 マスト細胞、 好酸球、 および内皮細胞、 あるいはそのいづれかを含む、 哺乳動物の細胞に対して、 例えば、 ケモカインとして働く走化性 z化学運動性活性を有すると考えられ る。 走化性 化学運動性蛋白は、 反応の望まれる部位へ、 望まれる細胞集団 を固定化あるいは引き寄せるため使用されることが可能である。 走化性 化 学運動性蛋白は、 局所的な感染と同様に、 創傷および他の外傷の治療に特別 な優位性を提供する。 例えば、 リンパ球、 単球、 あるいは好中球を腫瘍ある いは感染部位へ引き寄せることは、 腫瘍あるいは感染部位に対する免疫応答 を改善する結果となると考えられる。
蛋白やペプチドは、 もしそれが直接あるいは間接に特殊な細胞集団に対し て指示された方向あるいは運動を刺激可能であれば、 そのような細胞集団に 対する走化性活性を保持している。 望ましくは、 その蛋白やペプチドは、 細 胞の指示された運動を直接的に刺激する活性を保持する。 特別な蛋白がある 集団の細胞に対し走化性活性を保持するか否かは、 どんな既知の細胞走化性 のアツセィ法にそのような蛋白あるいはぺプチドを使用しても容易に決定で さる。
[凝血および血栓活性]
本発明の蛋白は、 凝血あるいは血栓活性をも示すと考えられる。 結果とし て、 そのような蛋白は、 様々な凝固障害 （血友病のような遺伝性障害を含む） の治療に有効であると予期される。 あるいは、 外傷、 手術あるいは他の原因 により生じた創傷の治療における凝固および他の凝血事象を促進させること が予期される。 本発明の蛋白は、 血栓の形成の溶解あるいは阻害、 および血 栓あるいは卒中等により生じる状態の治療および予防にも効果があると考え られる。
[受容体/リガンド活性]
本発明の蛋白は、 受容体、 受容体 リガンドあるいは受容体/リガンドの インヒビ夕一あるいはァゴニストとしての活性を示す可能性もある。 そのよ うな受容体およびリガンドの例として、 サイ トカイン受容体およびそのリガ ンド、 受容体キナーゼおよびそのリガンド、 受容体フォスファタ一ゼおよび そのリガンド、 細胞間相互作用に関連した受容体 （Se l ec t i n、 Integur i n、 お よびそのリガンド、 受容体キナーゼ等の細胞接着分子を含む） およびそのリ ガンド、 および抗原提示、 抗原認識、 および細胞性および液性免疫反応の発 達に係わる受容体/リガンドの組み合わせが挙げられるが、 本発明を制限す るものではない。 受容体およびリガンドは、 その相互作用に対する可能なぺ プチドあるいは小分子のインヒビ夕一のスクリーニングにも有効である。 本 発明の蛋白 （受容体およびリガンドの断片を含むが、 制限されるものではな レ は、 それ自身受容体ノリガンドの相互作用のインヒビ夕一として有効で あると考えられる。
[その他の活性]
本発明の蛋白 （ポリペプチド） は、 以下に示す付加的な活性あるいは効果 の一つあるいはそれ以上を示すと考えられる ：細菌、 ウィルス、 カビ、 およ び他の寄生虫を含む感染性の物質を殺傷する；身長、 体重、 髪の色、 目の色、 肌あるいは他の組織の色素沈着、 あるいは例えば胸部増量あるいは減量等の 器官の大きさ等の身体的特徴を抑制あるいは促進する効果を及ぼす：食餌脂 肪、 蛋白、 あるいは炭水化物の分解に効果を及ぼす；食欲、 性欲、 ストレス、 認識 （認識障害） 、 鬱病、 暴力行動を含む行動特徴に効果を及ぼす；鎮痛効 果あるいは他の痛みを減少させる効果を及ぼす；胚性幹細胞の造血系以外の 他の系統への分化および増殖を促進する ；および、 酵素の場合、 その酵素の 欠失を補う、 および関連疾患を治療する。
上記活性を有する蛋白は、 例えば、 B細胞、 T細胞、 肥満細胞の増殖また は細胞死、 免疫グロプリンのクラススィツチ促進によるクラス特異的誘導、 B細胞の抗体産生細胞への分化、 顆粒球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 単球，マクロファージ前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 好中球、 単球 · マクロファージ、 好酸球、 好塩基球の増殖または機能亢進、 細胞死、 巨核球 前駆細胞の増殖または細胞死、 好中球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 Bまたは T前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 赤血球の産生促進、 赤血球、 好中球、 好酸球、 好塩基球、 単球 ·マクロファージ、 肥満細胞、 巨核球前駆 細胞の増殖支持、 好中球、 単球 ·マクロファージ、 B細胞または T細胞の遊 走促進、 胸腺細胞の増殖または細胞死、 脂肪細胞の分化抑制、 ナチュラルキ ラー細胞の増殖または細胞死、 造血幹細胞の増殖または細胞死、 幹細胞およ び各種造血前駆細胞の増殖抑制、 間葉系幹細胞からの骨芽細胞、 軟骨細胞へ の分化促進または増殖、 細胞死、 あるいは破骨細胞の活性化や単球から破骨 細胞への分化促進による骨吸収の促進の作用を本発明のポリペプチドのみで、 またリガンドーレセプター間の結合を介して、 あるいは他の分子と相乗的に 働くことにより有すると考えられる。
また本発明のポリペプチドは神経系にも作用することが予測されるので、 各種神経伝達物質作動性神経細胞への分化ならびにそれらの生存維持または 細胞死、 グリア細胞の増殖促進または細胞死、 神経突起の伸展、 神経節細胞 の生存維持または細胞死、 ァストロサイ 卜の増殖または分化促進または細胞 死、 末梢神経の増殖または生存維持、 細胞死、 シュワン細胞の増殖または細 胞死、 運動神経の増殖または生存維持、 細胞死の作用もあると考えられる。 さらに、 本発明のポリペプチドは初期胚の発生過程において、 外胚葉誘導 作用による表皮、 脳、 背骨、 神経の器官形成、 中胚葉誘導作用による背索結 合組織 （骨、 筋肉、 腱） 、 血球細胞、 心臓、 腎臓、 生殖巣の器官形成、 ある いは内胚葉誘導作用による消化器系臓器 （胃、 腸、 肝臓、 滕臓） 、 呼吸器系
(肺、 気管） の形成に促進的または抑制的に作用すると考えられるとともに、 生体においても上記器官の増殖あるいは増殖抑制作用を有すると考えられる。 したがって、 本発明のポリペプチドはそれ自身で、 免疫系または神経系も しくは骨代謝の機能の低下または亢進に関する疾患、 または造血系細胞の発 育不全または異常増殖、 例えば、 炎症性疾患 （リウマチ、 潰瘍性大腸炎等） 、 骨髄移植後の造血幹細胞の減少症、 ガン、 白血病に対する放射線照射または 化学療法剤投与後の白血球、 血小板、 B細胞または T細胞の減少症、 貧血、 感染症、 ガン、 白血病、 A I D S、 骨代謝異常 （骨粗鬆症等） 、 各種変性疾 患 （アルツハイマー病、 多発性硬化症等） 、 あるいは神経損傷の予防または 治療薬として用いることが期待される。
また本発明のポリペプチドは、 外胚葉、 中胚葉または内胚葉由来器官の分 化または増殖作用を有すると考えられるので、 各器官 （表皮、 骨、 筋肉、 腱、 心臓、 腎臓、 胃、 腸、 肝臓、 塍臓、 肺、 気管等） の組織修復剤として用いる ことも期待される。
また、 本発明のポリぺプチドのポリクローナル抗体またはモノク口一ナル 抗体を用いて、 生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、 これによつて そのポリぺプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用するこ とができる。 ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリべプチ ドあるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。 また本発明のポリぺプチド （好ましくはその細胞外ドメインのポリぺプチ ド） を用いることにより、 例えばァフィ二ティーカラムを作製して、 本ポリ ペプチドと結合する既知または未知の蛋白 （リガンド） の同定、 精製あるい はその遺伝子クローニングを行うことができる。
また本発明のポリぺプチド （好ましくはその膜貫通領域または細胞内ドメ インのポリペプチド） を用いて、 例えばウェスト一ウエスタン法により、 ま たはその c D N A (好ましくは該ポリペプチドの膜貫通領域または細胞内ド メインをコードする c D N A) を用いて、 例えば酵母 2—ハイブリッド法に より該ポリペプチドと細胞質内で相互作用する下流のシグナル伝達分子の同 定、 遺伝子クローニングを行うこともできる。
さらに本発明のポリべプチドを用いることによって、 本ポリペプチドレセ プ夕一ァゴニスト、 アン夕ゴニストおよび受容体一シグナル伝達分子間の阻 害剤等のスクリーニングを行なうこともできる。
本発明の c D N Aは、 多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを 生産する際の重要かつ必須の铸型となるだけでなく、 遺伝病の診断や治療 （遣 伝子欠損症の治療またはアンチセンス D N A ( R N A) によって、 ポリぺプ チドの発現を停止させることによる治療等） に利用できる。 また、 本発明の c D N Aをプローブとしてジエノミック （genomi c) D N Aを分離できる。 同 様にして、 本発明 c D N Aと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、 またマウス以外の生物における本発明ポリぺプチドと相同性の高いポリぺプ チドの遺伝子を分離することも可能である。
[医薬品への適用]
前記の疾患に適応するために、 本発明のポリペプチド、 あるいは本発明の ポリペプチドに対する抗体は通常、 全身的または局所的に、 一般的には経口 または非経口の形で投与される。 好ましくは、 経口投与、 静脈内投与および 脳室内投与である。
投与量は、 年齢、 体重、 症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間等により異 なるが、 通常、 成人一人あたり、 一回につき、 1 0 0 gから 1 0 O m gの 範囲で、 一日一回から数回経口投与されるかまたは、 成人一人あたり、 一回 にっき、 1 0 gから 1 0 O m gの範囲で、 一日一回から数回非経口投与さ れる。
もちろん前記したように、 投与量は、 種々の条件により変動するので、 上 記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 また範囲を越えて必要な場合 もある。
本発明化合物を投与する際には、 経口投与のための固体組成物、 液体組成 物およびその他の組成物、 非経口投与のための注射剤、 外用剤、 坐剤等とし て用いられる。
経口投与のための固体組成物には、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒 剤等が含まれる。 カプセルには、 ソフトカプセルおよびハードカプセルが含 まれる。
このような固体組成物においては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少 なくとも一つの不活性な希釈剤 （例えば、 ラクト一ス、 マンニトール、 グル コース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 微結晶セルロース、 デンプン、 ポ リビニルピロリドン、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等） と混合される。 組成物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加物、 例えば、 潤滑剤 （ス テアリン酸マグネシウム等） 、 崩壊剤 （繊維素グリコール酸カルシウム等） 、 安定化剤 （ヒト血清アルブミン、 ラクトース等） 、 溶解補助剤 （アルギニン、 ァスパラギン酸等） を含有していてもよい。 錠剤または丸剤は、 必要により白糖、 ゼラチン、 ヒドロキシプロピルセル ロース、 ヒドロキシプロピルメチルセル口一スフ夕レート等の胃溶性あるい は腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、 また 2以上の層で被膜してもよい。 さらにゼラチンのような吸収されうる物質の力プセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、 薬学的に許容される乳濁剤、 溶液剤、 懸 濁剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を含み、 一般に用いられる不活性な希釈 剤 （例えば、 精製水、 エタノール等） を含んでいてもよい。 この様な組成物 は、 不活性な希釈剤以外に湿潤剤、 懸濁剤のような補助剤、 甘味剤、 風味剤、 芳香剤、 防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、 ひとつまたはそれ以上の活性 物質を含み、 それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。 この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリゥムのような安定剤と 等張性を与えるような安定化剤、 塩化ナトリウム、 クェン酸ナトリウムある いはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。 スプレー剤の製造方法 は、 例えば米国特許第 2, 868, 691 号および同第 3, 095, 355 号明細書に詳しく 記載されている。
本発明による非経口投与のための注射剤としては、 無菌の水性または非水 性の溶液剤、 懸濁剤、 乳濁剤を包含する。 水性または非水性の溶液剤、 懸濁 剤としては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少なくとも一つの不活性な 希釈剤と混合される。 水性の希釈剤としては、 例えば注射用蒸留水および生 理食塩水が挙げられる。 非水性の希釈剤としては、 例えばプロピレングリコ ール、 ポリエチレングリコール、 ォリーブ油のような植物油、 エタノールの ようなアルコール類、 ポリソルべ一ト 8 0 (登録商標） 等が挙げられる。 このような組成物は、 さらに防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ラクトース等） 、 溶解補助剤 （例えば、 ァ ルギニン、 ァスパラギン酸等） のような補助剤を含んでいてもよい。 発明を実施するための最良の形態 以下に本発明のクローンに関する実施例を挙げて本発明をより具体的に説 明するが、 これらは本発明の範囲を制限するものではない。 実施例 1 ： クローン OM007
[ o l y (A) +RNAの調製]
ヒト成人脳組織より TR I z o 1試薬（TRIzol reagent,登録商標、 GIBC0BRL より販売）を用いて全 RNAを抽出し、 mRNAピユリフィケーシヨン ·キッ ト （mRNA Purification Kit, 商品名、 Pharmacia より販売）を用いて po 1 y (A) +RNAを精製した。
[酵母 S ST c DNAライブラリーの調製]
上記の p o l y (A) +RNAを铸型に Xh o I部位を連結したランダム 9
NNNNNNNN- 3 ' (配列番号 22 ) をプライマーとして、 スーパース クリプト · プラスミ ド · システム （Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning, 商品名、 GIBCOBRL より販売）を用いて 2本 鎖 c DNAの合成を行なった。 Ec OR Iアダプター （GIBCOBRL より販売） を DN Aライゲ一シヨン 'キット V e r . 2 (DNA ligation kit ver.2, 商 品名， 宝酒造 （株） より販売。 以後 cDNAの連結はすべて本キットを使用 した。 ） を用いて連結した後、 Xh o lで消化し、 ァガロース電気泳動で 300〜 800 b pの c DNAを切り出して分画し、 pSUC 2 (米国特許 5536637号参照） の Ec oR iZNo t I部位に連結し、 大腸菌 DH 10 B株 にエレクトロポレーシヨン法で形質転換して酵母 S ST用の c DN Aライブ ラリーを得た。
[S STによるスクリーニングおよび S ST陽性クローンの塩基配列の決定] この c DNAライブラリーのプラスミドを調製し、酢酸リチウム法（Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1 を参照）により酵母 Y T K 12株を 形質転換し、 トリブトファン（T r p) 不含の酵母形質転換体の選択培地 (CMD— T r p培地） のプレート上にまき、 30でで 48時間インキュべ 一卜した後、 ァクトラン · レプリカ ·プレー夕一 （Accutran Replica Plater, 商品名、 Schleicher&Schuell より販売） を用いて得られたコロニー （形質転 換体） のレプリカをラフィノースを炭素源とする YP Rプレートにとり、 30 で 14日間インキュベートした。 3日目以降、 出現してきた各々のコ ロニ一を一つずつ再度 YP Rプレートにストリークして 30^で 48時間ィ ンキュペートした後、 シングルコロニーを YPD培地に植菌し、 30でで 4 8時間インキュベートした後、 プラスミドを調製した。 続いて p SUC 2の クローニングサイトの両端の配列の 2種類のプライマ一 （センス鎖はビォチ ン化プライマー） を用いて公知の方法に従って P CRを行ない、 インサート cDNAを増幅した後、 ダイナビーズ （Dynabeads, 商品名、 DYNAL より販売） を用いてピオチン化 1本鎖 c DNAを精製し、 塩基配列の決定を行なった。 塩基配列の決定は DN Aシーゲンシング 'キット （DNA Sequencing kit (Dye Terminator Cycle Sequencing Ready React ion) , 商品名、 Applied Biosystems Inc.より販売） を用いた蛍光ダイ夕一ミネ一夕一サイクルシークェンス法で 反応を行ない、 自動 DN Aシークェンサ一 373 (Applied Biosystems In ） で読み取りを行なった （以降塩基配列決定はすべて本方法で行なった。 ） 。 得られた塩基配列および推定されるアミノ酸配列についてデータベースと の相同性検索を行ない、 デ一夕ベースに登録されていない新規の c DNAで あることが明らかとなったクローンについて、 全長 c DN Aのクローニング を試みた。 また推定されるアミノ酸配列を既知のシグナルペプチドと比較す ることにより各 c DN Aが機能的かつ構造的にもシグナルペプチドを有する ことを確認した。
[全長 cDNAのクローニングおよび塩基配列の決定]
全長 c DN Aのクローニングはマラソン · c DN Aアンプリフィケ一ショ ン 'キット （Marathon cDNA Amplification Kit, 商品名、 Clontech 社より販 売）による 3 ' RACE (Rapid Amplification of cDNA End)法を用いて行な つた。 2本鎖 c DNAを調製には、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳 組織の p o l y (A) +RNAをより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の 情報に基づいて推定翻訳開始点 ATG領域を含む 2 7 me rのプライマー OM007 - F 3 ： 5 ' -AACTGCAGATCTTGGGACTCAT CAGCC- 3 ' (配列番号 23) を作製して、 該キットに添付されたァダ プ夕一プライマーとで P C Rを行なった。 また、 1回の P CRで cDNAが 十分に増幅されなかったので、 OM007— F 1プライマーの 3 ' 側にさら に 28me rのプライマー OMO 07 - F 2 ： 5 ' — AAGAGGACAT TGTTTTC ATC ATGGATGC— 3 ' (配列番号 24) を作製して ネステッド （nested) PCRを行なった。 クローン〇M 007に特異的に増 幅された c DN Aをァガロース電気泳動で分画後、 pT7Blue- 2 T- Vector (商 品名、 Novagen より販売） に連結し、 大腸菌 DH 5 aに形質転換してプラスミ ドを調製した。 初めに 5 ' 側の塩基配列を決定して OM007 S ST c DN Aの塩基配列が存在することを確認した後、 全塩基配列を決定し、 配列番号 3に示す c DN A配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定 し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 1および 2に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN お よび FASTA により、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知の ポリペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検 索した結果、 本発明のポリペプチド OM007およびそれをコードする核酸 配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規の分泌蛋白質であることが判明した。 しかし、 相同性検索の結果、 BLASTX, BLASTPおよび FASTAは、 クローン OM007 (配列番号 1 のアミノ酸配列 2 1 - 765間の領域） とニヮトリ 'コラブシン 2 (collapsin-2[Gallusgallus], Genbank Accession U28240 のアミノ酸配列 9〜 7 53間の領域） の間に有為 な相同性があることを示した。 これらの相同性に基づいて、 クローン〇M0 07は、 少なくとも collapsin が属するセマフォリン （Semaphori) ファミリ 一と同様な活性を保持すると期待される。 実施例 2 ：クローン OMB 096 本発明のクローン〇MB 096に関する実施例は、 OM007と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
[全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定]
全長 c DN Aのクローニングは Marathon cDNA Amplification Kit (商品名、 Clontech 社より販売）による 3 ' RACE法を用いて、 OM007と同様の方 法で行なった。 2本鎖 c DNAを調製には、 各クローンの由来、 すなわちヒ ト成人脳組織の p o l y (A) +RNAをより作製した。 S STで得られた塩 基配列の情報に基づいて推定翻訳開始点 ATG領域を含む 27me rのブラ イマ一 OMB 096 - F 1 ： 5 ' - A C A A C AT G C A C C A C C A G T GGCTTCTGC- 3 ' (配列番号 25 ) を作製して、 該キットに添付さ れたアダプタ一プライマーとで P CRを行なった。 クローン OMB 096に 特異的に増幅された c DNAを、 OM007と同様な手法でリクローニング し、 全塩基配列を決定し、 配列番号 6に示す c DN A配列を得た。 さらに オープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 4お よび 5に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTA により、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知の ポリペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検 索した結果、 本発明のポリべプチド OMB 096およびそれをコードする核 酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規の分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 3 ： クローン OAF 038—L e uおよび OAF 038— P r o 本発明のクローン OAF 038 - L e uおよび OAF 038— P r oに関 する実施例は、 OMO 07と同様な手法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
[p o l y (A) +RNAの調製]
ヒ卜骨髄ストローマ細胞株 HAS 303 (東京医科大学第一内科外山圭助 教授、 相沢信助手より供与） より TRIzol reagent (登録商標、 GIBC0BRL より 販売）を用いて全 RNA を抽出し、 mRNA Purification Kit (商品名、 Pharmacia より販売）を用いて p o 1 y (A) +RNAを精製した。
[全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定]
全長 c DNAのクローニングは Marathon cD A Amplification Kit (商品名、 Clontech 社より販売）による 3 ' RACE法を用いて、 OM007と同様の方 法で行なった。 2本鎖 c DNAを調製には、 各クローンの由来、 すなわち、 HAS 303の p o l y (A) +RNAをより作製した。 S STで得られた塩 基配列の情報に基づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 28 me rのブラ イマ一 OAF 038— F 1 ： 5 ' -AGAATGTGGAGCCATTTG AACAGGCTCC— 3 ' (配列番号 26 ) を作製して、 該キットに添付 されたアダプタープライマーとで P CRを行なった。 クローン OAF 038 に特異的に増幅された c DNAを OM007と同様な手法でリクローニング し、 全塩基配列を決定し、 配列番号 9および 1 2に示す c DNA配列を得た ので、 それぞれのクローンを OAF 038— L e uおよび OAF 038— P r oと名付けた。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸 に翻訳して各々配列番号 7、 8および 10、 1 1に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN お よび FASTA により、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知の ポリペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検 索した結果、 本発明のポリペプチド OAF 038— L e u、 OAF 038 - P r oおよびそれぞれをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。 こ のことから、 本発明のポリペプチドは、 新規の膜蛋白質であることが判明し た。 しかし、 相同性検索の結果、 BLASTX、 BLASTP および FASTA は、 クローン OAF 038— L e uおよび OAF 038 - P r o (配列番号 7および 1 0 のアミノ酸配列 5〜 343間の領域） とラット MCA— 32蛋白質 （Rat MCA - 32 protein, Genbank Accession U39546 のアミノ酸配列 42— 268間の領 域） の間に有為な相同性があることを示した。 ポリペプチド OAF 038— L e uおよび OAF 038— P r oは Rat MCA- 32 protein と同様に、 細胞外 領域に I gドメインを、 細胞質領域に SH2ドメインを持つタンパクであり、 これらの相同性に基づいて、 クローン OAF 038— L e uおよび OAF 038— P r oは、 少なくとも上記の Rat MCA-32 protein と同様な活性を保 持すると期待される。 実施例 4 ： クローン OR 087H
本発明のクローン OR 087 Hに関する実施例は、 OM007と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
[po l y (A) +RNAの調製]
CL0NTECHよりヒト胎児肝臓 P o 1 y (A) +RNA (CL6527- 1)を購入した。
[全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定]
全長 c DNAのクローニングは Marathon cDNA Amplification Kit (商品名、 Clontech社より販売）による 3' RACE法を用いて、 OM007と同様の方 法で行なった。 該キットの方法に従って各クローン由来、 すなわちヒト胎児 肝臓の p o l y (A) +RNAをよりアダプターを連結した 2本鎖 c DNAを 調製した。 S STで得られた塩基配列の情報に基づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 27me rのプライマー OR 087 H- F 1 ： 5 ' -TGAA GCCCTTGTCCGTAAGCCTTGAAC— 3 ' (配列番号 27) を作製して、 該キットに添付されたアダプタ一プライマ一とで P CRを行な つた。 クローン OR 087Hに特異的に増幅された c DNAを OM007と 同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列を決定し、 配列番号 1 5に示す cDNA配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミ ノ酸に翻訳して配列番号 13および 14に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTA により、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の ポリペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検 索した結果、 本発明のポリペプチド〇R 087 Hおよびそれをコードする核 酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規の分泌蛋白質であることが判明した。 しかし相同性検索の結果、 BLASTX、 BLASTP および FASTA は、 クローン OR 087 H (配列番号 13のアミノ酸配 列 1 — 1 1 5間の領域） とヒ トラパミシン— F K 5 0 6結合蛋白質 (rapamycin- and FK506- binding protein [Homo sapiens] , Genbank Accession M75099 のアミノ酸配列 1〜1 16間の領域） の間に有為な相同性があること を示した。 これらの相同性に基づいて、 クローン OR 087 Hは、 少なくと も FK結合蛋白質 （FK- binding protein) ファミリーと同様な活性を保持す ると期待される。 実施例 5 ： クローン OA 004— FGおよび OA004— LD
本発明のクローン OA004— FGおよび OA004一 LDに関する実施例 は、 OM007と同様な手法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
[ o l y (A) +RNAの調製]
ヒトグリァ芽腫細胞株 T 98 G (ATCC No. CRL-1690) より TRIzol reagent (登 録商標、GIBCOBRLょり販売）を用ぃて全RNAを抽出し、mRNAI)UΓificationKit (商品名、 Pharmaciaより販売）を用いて p o 1 y (A) +RNAを精製した。
[全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定]
全長 c DN Aのクローニングはジーントラッパ一 c DNAポジティブセレ クシヨンシステム （GENETRAPPER cDNA Positive Selection System, 商品名、 GIBCOBRLより販売）を用いて行なった。 まず Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (商品名、 GIBCOBRL)を用いてヒトダリ ァ芽腫細胞株 T 98 Gの ρ ο 1 y (A) +R N Aよりプラスミド p S P〇 R T 1 (GIBC0BRUをベクターとして dT— primed c DNAライブラリ一を作製し た。 つぎに S STで得られた塩基配列の情報に基づいて 2 7 me rのビォチ ン化プライマ一 OA004— F 1 ： 5 ' biotin-ATGCACATCTTC AAGCATGCTCAG— 3' (配列番号 28) を作製した後、 GeneTrapper キッ卜の方法にしたがってピオチン化プライマーと特異的にハイプリダイズ するプラスミドを上記の c DN Aライブラリーから回収し、 大腸菌 DH 1 0 Bに形質転換した。 さらにランダムプライマー · DNAラベリングキット (Random Primer DNA Labeling kit, 商品名、 宝酒造より販売） を用いて 32P-d CTPでラベルした OA004 S ST c D N Aをプローブとして、 公知の方法によりコロニーハイブリダィゼーシヨンを行ない、 陽性クローン を単離して、 プラスミドを調製した。 初めに 5 ' 側の塩基配列を決定して OA004 S ST c DN Aの塩基配列が存在することを確認した後、 全塩基 配列を決定し、 配列番号 1 8および 2 1に示す c DNA配列を得たので、 そ れぞれ OA 004一 FGおよび OA004— LDと名付けた。 さらにオーブ ンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して各々配列番号 1 6、 1 7および 19、 20に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTA により、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知の ポリペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検 索した結果、 本発明のポリペプチド OA004— FG、 〇A004— LD よびそれぞれをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。 このことか ら、 本発明のポリペプチドは、 新規の膜蛋白質であることが判明した。 しか し、 相同性検索の結果、 BLASTX、 BLASTP および FASTAは、 クローン OA 00 4— FGおよび OA004 -LD (配列番号 1 6および 1 9のアミノ酸配列 1 5 1〜353間の領域） とシーエレガンス 52.8kD蛋白質 （Hypothetical 52.8kD protein[Caenorhabdtis elegans] , SwissProt Accession YJ95_CAEEL のアミノ酸配列 238〜453間の領域） の間に有意な相同性があることを 示した。 また、 クローン OA004— FGおよび OA004— LD (配列番 号 1 6および 1 9のアミノ酸配列 236〜3 1 9間の領域） とヒトプレゼ二 リン 2 (preseni 11 in-2 [Homo sapiens] , Genbank Accession A56993 のァミノ 酸配列 340〜4 16間の領域） の間にも有為と考えられる相同性があるこ とを示した。 これらの相同性に基づいて、 クローン OA 004— FGおよび OA004— LDは、 少なくとも preseni 11 in ファミリ一と同様な活性を保 持すると期待される。

Claims

請求の範囲
1. 実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 16また は 19で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 またはそのホモ口一 グ、 そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモローグからなるポリべ プチド。
2. 配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 16または 19で示されるァミノ 酸配列からなる請求の範囲第 1項記載のポリべプチド。
3. 請求の範囲第 1項に記載されたポリぺプチドをコ一ドする c D N A。
4. 配列番号 2、 5、 8、 11、 14、 17または 20で示される塩基配 列を有する請求の範囲第 3項記載の c DNA、 またはその配列に選択的に八 イブリダィズするフラグメントからなる c D N A。
5. 配列番号 3、 6、 9、 12、 15、 18または 21で示される塩基配 列を有する請求の範囲第 3項記載の c DNA、 またはその配列に選択的にハ イブリダィズするフラグメントからなる c D N A。
6. 請求の範囲第 3項乃至第 5項のいずれかの項に記載の c DN Aからな る複製または発現ベクター。
7. 請求の範囲第 6項記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿 主細胞。
8. 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリぺプチドを発現させ るための条件下で請求の範囲第 7項記載の宿主細胞を培養することからなる 請求の範囲第 1項または第 2項に記載のポリぺプチドの製造方法。
9. 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドのモノクロ ーナルまたはポリクロ一ナル抗体。
10. 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドまたは請 求の範囲第 9項記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および/または 担体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
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