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WO1999033997A1 - Luciferase et technique permettant de doser l'atp intracellulaire au moyen de ladite luciferase - Google Patents

Luciferase et technique permettant de doser l'atp intracellulaire au moyen de ladite luciferase Download PDF

Info

Publication number
WO1999033997A1
WO1999033997A1 PCT/JP1998/005864 JP9805864W WO9933997A1 WO 1999033997 A1 WO1999033997 A1 WO 1999033997A1 JP 9805864 W JP9805864 W JP 9805864W WO 9933997 A1 WO9933997 A1 WO 9933997A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
luciferase
surfactant
amino acid
atp
luminescence
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/005864
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Noriaki Hattori
Seiji Murakami
Original Assignee
Kikkoman Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kikkoman Corporation filed Critical Kikkoman Corporation
Priority to DE69838434T priority Critical patent/DE69838434T2/de
Priority to US09/581,241 priority patent/US6812012B1/en
Priority to AU16883/99A priority patent/AU1688399A/en
Priority to EP98961523A priority patent/EP1041151B1/en
Publication of WO1999033997A1 publication Critical patent/WO1999033997A1/ja
Priority to US10/829,250 priority patent/US7560245B2/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Definitions

  • the present invention relates to a novel luciferase having surfactant resistance and a method for measuring intracellular ATP using the same.
  • intracellular ATP is routinely measured for the purpose of measuring the presence or absence of cells in a sample and the number of cells.
  • an ATP extraction reagent containing a surfactant as an active ingredient is added to a sample containing cells to extract intracellular ATP outside the cells, and then a luminescent reagent containing luciferase Is generally added to a sample, and the amount of emitted luminescence is measured.
  • Luciferase is an enzyme that catalyzes the luminescence reaction of the substrate luciferin in the presence of ATP and magnesium ions.
  • luciferase in the method for measuring intracellular ATP for example, those derived from fireflies (genji fireflies, heike fireflies, American fireflies, Russian fireflies, etc.) are used.
  • Extraction of intracellular ATP is achieved by adding an ATP extraction reagent to a sample containing cells and stirring the sample.
  • concentration of surfactant is 0.05% or more
  • the enzymatic reaction is significantly inhibited in the step of measuring ATP concentration by bioluminescence, and the measurement sensitivity and accuracy are greatly reduced. This is thought to be due to the decrease in luciferase activity caused by high concentrations of detergent.
  • American firefly luciferase reduces its activity to about 20% in the presence of 0.1% benzalkonium chloride (see Table 1).
  • a method of suppressing the inhibition of the luminescence reaction by a surfactant As a method of suppressing the inhibition of the luminescence reaction by a surfactant, a method of using cyclodextrin or a derivative thereof is known (Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-504200) c. ATP is contacted with a detergent to extract intracellular ATP, and then the ATP is measured by the luciferin-luciferase bioluminescence reaction method. A method for measuring intracellular ATP, which is characterized by applying the method, is also known (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-23995).
  • an object of the present invention is to provide a novel surfactant-resistant luciferinase whose activity does not decrease even when a surfactant is present at a high concentration.
  • Another object of the present invention is to provide a method for extracting intracellular ATP using a surfactant, and then measuring the intracellular ATP by a bioluminescence reaction method using luciferase.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of suppressing the inhibition of the reaction and not reducing the extraction efficiency of intracellular ATP.
  • suppression means that the inhibition of the bioluminescence reaction by the surfactant is significantly reduced, and that the inhibition is completely eliminated. Disclosure of the invention
  • the present invention is a luciferase having resistance to a surfactant.
  • Examples of the luciferase having resistance to the above-mentioned surfactant include amino acid at position 490 in the amino acid sequence of wild-type firefly luciferase, or amino acid at the same position as position 490 of luciferase of Genji firefly or Hydrangea glutamicum.
  • Other amino acids other than the acid, for example, those substituted with lysine may be mentioned.
  • a polypeptide comprising the following (a) or (b):
  • polypeptide of (a) one or more amino acids added or deleted in the polypeptide of (a); Or a polypeptide comprising a substituted amino acid sequence and having a luciferase activity resistant to a surfactant, or
  • Bolibeptide comprising (a) or (b):
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been added, deleted or substituted in the polypeptide of (a), and having a luciferase activity resistant to a surfactant;
  • the present invention is a luciferase gene encoding a luciferase having resistance to the above-mentioned surfactant.
  • the present invention is a recombinant vector containing a luciferase gene encoding luciferase having resistance to the above-mentioned surfactant.
  • the present invention is a transformant containing the above recombinant vector.
  • the present invention is a method for producing the luciferase, which comprises culturing the above-mentioned transformant in a medium and collecting luciferase having a surfactant-resistance from the resulting culture.
  • the present invention provides a first step of extracting ATP from a sample containing cells in the presence of a surfactant, a second step of adding a luminescent reagent containing luciferase to the ATP extract to emit light, and A method for measuring intracellular ATP, which comprises using a luciferase having resistance to a surfactant as a luciferase in the method for measuring intracellular ATP including the third step of detecting the amount of luminescence.
  • FIG. 1 is a diagram showing the production of the mutant luciferase HIK gene
  • FIG. 2 is a diagram showing the change over time in the luminescence of the natural luciferase
  • FIG. FIG. 4 is a diagram showing a comparison of resistance to benzalkonium
  • FIG. 4 is a diagram showing a comparison of resistance of mutant luciferase to benzetonium chloride.
  • the luciferase having resistance to the surfactant of the present invention will be described.
  • Resistant to surfactants means those having any of the following properties.
  • a substance whose initial light emission in the presence of a surfactant is larger than that of a conventionally known luciferinase.
  • the term “comparison” used herein refers to, for example, the case where a luciferase of the present invention is produced by introducing a mutation into the amino acid sequence of a known luciferase, the luminescence of luciferase before the introduction of the mutation, It means comparison with the luminescence of luciferase after introduction.
  • surfactant-resistant luciferase is referred to as “surfactant-resistant luciferase”.
  • the “Activity” means the catalytic activity of a bioluminescent reaction.
  • the “surfactant” in the present invention may be any surfactant that can be used in a measurement system for intracellular ATP.
  • an anionic surfactant, a cationic surfactant, and a Twitter Examples thereof include anionic surfactants and nonionic surfactants, and more specifically, a reagent mainly composed of a quaternary ammonium salt such as benzalkonium chloride or benzethonium chloride.
  • the luciferase of the present invention can be obtained by preparing it from a luminous organ of a luminous organism.
  • the luminescent organism include luminescent insects, luminescent bacteria, and the like.
  • the luminescent insects include those belonging to the order Cleoptera, for example, insects of the family Fireflies and Click Beetles.
  • the luciferase of the present invention can be obtained by cloning a luciferase gene from the luminescent organism and expressing the gene using an appropriate vector-host system. It is.
  • the luciferase of the present invention can be obtained by introducing mutations such as addition, deletion, and substitution into the amino acid sequence of a conventionally known luciferase.
  • a known genetic engineering technique can be used as a method for introducing a mutation into the amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence of the luciferase gene or the known lumferase gene derived from the luminescent organism is used.
  • a mutant luciferase gene is constructed by introducing mutations such as addition, deletion, and substitution by genetic engineering techniques.
  • the mutant gene is introduced into an appropriate vector-host system to produce a recombinant microorganism.
  • those producing the luciferase of the present invention may be screened, cultured in a medium, and luciferase may be collected from the resulting culture.
  • mutant luciferase the surfactant-resistant luciferase obtained by introducing a mutation into the amino acid sequence.
  • mutant luciferases include, for example, luciferase in which the amino acid at the position 490 equivalent to that of Genji firefly or Heike firefly luciferase in the amino acid sequence of wild-type firefly luciferase is substituted with an amino acid other than glutamic acid.
  • amino acids other than glutamic acid include basic amino acids, specifically, lysine, arginine, histidine and the like.
  • amino acid at the position equivalent to position 490 of Genji firefly or Heike firefly luciferase means, when the determined amino acid sequence of luciferase is compared with the amino acid sequence of Genji firefly or Heike firefly luciferase, It means an amino acid corresponding to the amino acid at position 490 of firefly luciferase.
  • amino acid at position 490 is glutamic acid.
  • amino acid at the same position as position 490 of Genji firefly or Heike firefly luciferase is glutamate at position 487.
  • mutant luciferase is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or one or more amino acids of the amino acid sequence are added, A polypeptide containing a deleted or substituted amino acid sequence.
  • Mutant luciferase is obtained by constructing a mutant luciferase gene by introducing mutations such as addition, deletion and substitution into the base sequence of a known luciferase gene, and expressing the gene in an appropriate vector-host system. can get.
  • Examples of the known luciferase gene include, but are not particularly limited to, for example, a firefly luciferase gene, specifically, a wild-type wild firefly luciferase gene.
  • thermostable lyophile luciferase gene (described in Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-244942), and the like.
  • a method for introducing a mutation into the luciferase gene there may be mentioned a method in which the gene is brought into contact with a mutagenic agent, specifically, hydroxylamine, nitrite, sulfite, 5-bromouracil, or the like. it can.
  • a mutagenic agent specifically, hydroxylamine, nitrite, sulfite, 5-bromouracil, or the like.
  • methods such as ultraviolet irradiation, cassette mutation, and site-specific mutagenesis using the PCR method can be widely used.
  • the mutated Lumbulase gene is inserted into a vector DNA having a promoter sequence, a marker gene, an origin of replication, etc., to obtain a recombinant plasmid.
  • Any vector can be used as long as it can replicate in a host cell, and examples include plasmid DNA and bacteriophage DNA.
  • the vector DNA includes plasmid PUC119 (Takara Shuzo), pBluescript SK + (Stratagene), pMAL-C2 (NEW England Labs), pGEX-5X-1 (Pharmacia), pXal (Belinger), pMA56
  • an appropriate host cell is transformed or transduced using the above-mentioned recombinant plasmid, and a recombinant microorganism having a mutant luciferase-producing ability is screened.
  • Eukaryotic cells and prokaryotic cells can be used as host cells.
  • Eukaryotic cells Examples include cells of animals, plants, insects, yeasts, and the like, and examples of prokaryotic cells include Escherichia coli, Bacillus subtilis, and actinomycetes.
  • animal cells CH0, COSs HeLa cells and cells of the myeloma cell line are used.
  • Stratage ne HB10 ATCC33694) and the like can be used.
  • the transformation is performed, for example, by the method of DM Morrison (Meth. Enzymo 1., 68, 326-331, 1979), and the transduction is performed, for example, by the method of B. Hohn (Meth. Enzymol. , 68, 299-309, 1979).
  • Methods for purifying recombinant DNA from recombinant microorganisms include, for example, the method of P. Guerry (J. Bacteriology, 116, 1064-1066, 1973) and the method of DB Clewell (J. Bacteriology, 110, 667-676, 1972) can be used.
  • the nucleotide sequence of the gene inserted into the recombinant DNA can be determined, for example, by the Maxam-Gilbert method (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560-564, 1977), the Dideoxy method (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977).
  • the recombinant luciferase of the present invention can be produced by culturing the recombinant microorganism obtained by the above method in a medium.
  • the recombinant Escherichia coli may be cultured by a solid culture method. It is preferably cultured by a liquid culture method.
  • the culture medium may be, for example, sodium chloride, potassium phosphate, sodium nitrate, phosphoric acid, or one or more nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor or soy or wheat bran leachate.
  • One or more inorganic salts such as dipotassium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate, or manganese sulfate are added, and if necessary, saccharide raw materials, vitamins, etc. are appropriately added. Is used.
  • the initial pH of the medium is suitably adjusted to pH 7-9.
  • the cultivation is preferably carried out at 30 to 42 ° C, preferably around 37 ° C, for 3 to 24 hours, preferably 5 to 8 hours, by submerged aeration and agitation culture, shaking culture, stationary culture and the like.
  • a normal enzyme collecting means can be used to collect the mutant luciferase from the culture. That is, after the cells are obtained by centrifuging the culture, lysis treatment using enzymes such as lysozyme, ultrasonic crushing, and grinding The cells are destroyed by treatment, etc., and the fusion protein is discharged out of the cells. Next, a crude enzyme solution containing the mutant luciferase can be obtained by removing insolubles by filtration or centrifugation.
  • the above crude enzyme solution may be used as a protein sample as it is, but the purity may be further increased using a normal protein purification method. Specifically, ammonium sulfate precipitation, organic solvent precipitation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, etc. are used alone or in appropriate combination.
  • a surfactant can be added at a high concentration in the step of extracting intracellular ATP.
  • an ATP extraction reagent containing a surfactant as an active ingredient is added to a sample containing cells to extract intracellular ATP outside the cells.
  • Cells refer to cells derived from animals, plants, microorganisms (eg, yeast, mold, mushroom, bacteria, actinomycetes, unicellular algae, viruses, protozoa, etc.).
  • the sample is not particularly limited as long as it contains the above-mentioned cells.
  • food and drink, medicine, cosmetics, seawater, river water, industrial water, sewage, soil, urine, feces, blood, sputum, pus Examples include cultures of the above cells.
  • a solution in which the above sample is suspended in an appropriate solvent for example, distilled water, physiological saline, phosphate buffer, Tris buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • the sample solution contains a solid content
  • the sample solution can be handled in the same manner as a liquid solution by suspending the sample solution in an appropriate solvent or homogenizing with a mixer or the like.
  • the sample in the form of a solution may be filtered through a hydrophilic or hydrophobic filtration membrane to capture cells, and then the filtration membrane may be used as the sample.
  • the hydrophilic filter membrane include hydrophilic polytetrafluoroethylene, hydrophilic polyvinylidene fluoride, hydrophilic polyamide, acetyl cellulose, nitrocellulose, etc. Can be used as a film or sheet.
  • the hydrophobic filtration membrane include PVDF (polyvinylidene fluoride), PT Materials made of FE (polytrafluoroethylene), PE (polyethylene), etc. can be used.
  • the surfactant examples include an anionic surfactant, a cationic surfactant, a Twitter monoionic surfactant, and a nonionic surfactant.
  • anionic surfactant examples include sodium dodecyl sulfate (SDS), potassium lauryl sulfate, sodium monolauroyl phosphate, and sodium alkyl benzene sulfonate.
  • cationic surfactants include benzalkonium chloride (BAC), benzylbenzene (BZC), cetylpyridinium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, and myristyldimethylbenzylammonium chloride.
  • tweeter-type surfactants include, but are not limited to, Twitter Detergent 3-08, 3-10, 3-12, 3-14, 3-16, and Tego.
  • nonionic surfactants such as Tween 20, 60, 80, Span 60, 80, Triton X-45, x-100, polyoxyethylene ether, and polyoxyethylene lauryl ether can be mentioned.
  • the concentration of the surfactant may be any concentration as long as it exhibits sufficient ATP extraction ability.However, the concentration of the surfactant is preferably 0 with respect to the mixed solution obtained by mixing the sample and the ATP extraction reagent. . Add so that it becomes more than 05%.
  • the reaction conditions between the sample and the ATP extraction reagent may be room temperature or contact while heating.
  • the bioluminescent reagent is, for example, a reagent containing the following components (a) to (c).
  • a substance involved in pH adjustment or storage stability improvement may be added to the luminescent reagent.
  • Such substances include, for example, EDTA 2Na, dithiothreitol, ammonium sulfate, sucrose, 2-mercaptoethanol, HEPES , Tricine ⁇ Tris, and the like.
  • the amount of light emitted by the addition of the bioluminescent reagent can be measured using a luminometer such as a Lumin Tester K-100 manufactured by Kikkoman, a Luminescence Reader BL R-201 manufactured by Aroka (improved), manufactured by Berthold. It can be measured by Lumat LB9501 or the like.
  • a bioluminescence image analysis system such as ARGU S-50 / CL (with a tapered fiber: manufactured by Hamamatsu Photonics KK) is used as the sample.
  • the number of cells can be measured by imaging the bright spots.
  • luciferases derived from Genji and Hydrangea were prepared. That is, ImM ethylenediaminetetraacetic acid disodium acetate and 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride were added to a 25 mM tris (hydroxy) aminomethane monohydrochloride buffer solution, and ammonium sulfate was further added to 10% saturation.
  • the luciferase preparation was appropriately diluted with an enzyme diluent (1 mM EDTA, 1 m 2-mercaptoethanol, 1% BSA, 50 mM HBPES, (pH 7.5)), and 100/1 of the substrate solution (1.4 mM luciferin, 40 mM ATP, 300 mM MgS04.7H20, 50 mM HEPES, (pH 7.5)).
  • the amount of luminescence was measured using a BLR-201 Luminescence reader (manufactured by Aloka) under the following setting conditions. Measuring range: ⁇ ⁇
  • the activity value when the measured value under this condition was 1 Kcount was set to 1 MLU (megalite punip) / ml.
  • Various firefly-derived luciferases were prepared using an enzyme diluent (1 m EDTA, 1 mM 2_mercaptoethanol, 5% glycerol, 50 mM HEPES (pH 7.5)) to a concentration of 0.5 MLU / ml. After adjustment, an enzyme preparation was obtained.
  • the firefly luciferase has a low initial light emission and the light emission is rapidly attenuated. This is due to the low surfactant resistance of American firefly luciferase, which causes a decrease in sensitivity and a decrease in the accuracy of measured values.
  • Genji firefly luciferase had a higher initial luminescence than American firefly luciferase. That is, it was shown that Genji firefly luciferase has more excellent surfactant resistance than American firefly luciferase.
  • the firefly luciferase exhibited a higher initial light emission than Genji firefly luciferase and a slower decay of luminescence, indicating that it exhibited excellent resistance.
  • a mutant luciferase gene was created by site-directed mutagenesis using PCR. Plasmid pHLf7-217Leu described in JP-A-5-244942 as a type of PCR reaction
  • E. coli JM101 pHLf7-217Leu
  • E. coli JM101 pHLf7-217Leu
  • the Institute of Life Science and Industrial Technology National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-1, Tsukuba East, Ibaraki Prefecture) No. 3 to FERM BP-3840
  • Oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 were used as primers for the PCR reaction, and KOD dash pol ylmerase (manufactured by TOYOBO) as a DNA polymerase was used.
  • KOD dash pol ylmerase manufactured by TOYOBO
  • a PCR reaction was carried out by repeating 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 2 seconds, and 74 ° C for 3 minutes for 30 cycles.
  • the resulting PCR product was subjected to ligation in a conventional manner to obtain a circular recombinant plasmid pHLfLK.
  • the mutant luciferase gene contained in pHLf LK was sequenced.
  • the reaction was performed using a dye primer tack sequencing kit (manufactured by Applied Biosystems), and electrophoresis analysis was performed using an ABI 373A DNA sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • SEQ ID NO: 3 The entire nucleotide sequence of the mutant luciferase gene thus obtained is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 4.
  • mutant luciferase gene the gene corresponding to alanine at position 217 of wild-type lycopodium luciferase is replaced with lysine, and the gene corresponding to glutamate at position 490 is replaced with a lysine-encoding gene. It had been.
  • E. coli JM109 strain into which pHLfLK was introduced was named E. coli (E. coli) JM109 (pHLfLK) (see Fig. 1).
  • Escherichia coli (E. coli) JM109 (pHLfLK) has been deposited with the Institute of Life Science and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as FERM BP-6147 (deposit date: October 16, 1997 (1997)).
  • the polypeptide shown in SEQ ID NO: 4 was named mutant luciferase HLK. (Preparation of gene encoding mutant luciferase HIK)
  • Plasmid pHLf 7-2171 le described in JP-A-5-244942 (gene of heat-resistant firefly luciferase in which the gene portion corresponding to Ala at position 217 is replaced with a gene encoding lie in plasmid pUC119) Mutated luciferase gene was prepared using the recombinant plasmid (with recombinant DNA). A strain transformed with the plasmid has been deposited with the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology as FERM BP-3841 (deposited date: April 22, 1992 (1992)).
  • E. coli JM109 The recombinant plasmid thus obtained was named pHLf IK, and the E. coli JM109 strain into which the plasmid had been introduced was named E. coli JM109 (pHLf IK).
  • Escherichia coli (E. coli) JM109 (pHLf IK) has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as FE RM BP-6146 (deposit date: October 16, 1997).
  • SEQ ID NO: 5 shows the entire nucleotide sequence of the mutant luciferinase gene contained in pHLf IK
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the gene.
  • the gene corresponding to alanine at position 217 of the wild type luciferase luciferase is replaced with isoloisin
  • the gene corresponding to glutamate at position 490 is replaced with a lysine-encoding gene. (See Figure 1).
  • polypeptide shown in SEQ ID NO: 6 was designated as mutant luciferase H I K.
  • E. coli (B. coli) JM109 (pHLfLK) and Escherichia coli (E. coli) JM109 (pHLf IK) were each added to an LB medium containing ampicillin (Bacto tryptone 1% (W / V), yeast extract 0.5). % (W / V), NaCl 0.5% (W / V), ampicillin (50 ig / ml), 1.4% (W / V) agar] and inoculated at 37 ° C for 18 hours Culture was performed.
  • the resulting culture was centrifuged at 8000 pm for 10 minutes, and the precipitated cells were placed in 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.8), 0.1 M ammonium sulfate, 1 mM EDTA]. After suspending, sonication was performed. Subsequently, the mixture was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes to obtain a crude enzyme solution. The obtained crude enzyme solution was electrophoretically purified to a single substance by the above-mentioned purification method.
  • Heike I mutant is a thermostable fly luciferase in which Ala at position 217 of wild-type fly luciferase is substituted with lie (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-244942).
  • Heike L mutant is a thermostable fly luciferase in which the 217th Ala of wild type fly luciferase is substituted with Leu (Japanese Patent Laid-Open No. 5-244942).
  • HKI is a mutant in which the Glu at position 490 of the Hike I mutant has been replaced with Lys, and is the mutant luciferase H I prepared in Example 3.
  • HLK is a mutant in which the Glu at position 490 of the Hike L mutant has been replaced with Lys, and is the mutant luciferase HLK prepared in Example 3.
  • Table 1 shows the luminescence intensity obtained using Bertho Id Lumat LB-9501 under the measurement conditions of 5 seconds waiting time and 3 seconds measuring time. The luminescence when 25 mM Tricine (pH 7.75) was used instead of 0.4% benzalkonium chloride was used as a control, and the luminescence when 0.4% benzalkonium chloride was present was used as the control value. The divided value was calculated as the luminescence (remaining activity).
  • Table 1 Luminescence rates of various luciferases Luminescence (RLU)
  • HLK 390289 396764 101.7 US firefly luciferase has the lowest luminescence rate of 21.6! 3 ⁇ 4, suggesting that sensitivity is greatly reduced.
  • the luminescence rates of Genji firefly luciferase and Heike firefly luciferase were 41.0% and 76.3%, respectively, indicating that the effect of sensitivity reduction is smaller than that of American firefly luciferase.
  • the luminescence rates of the mutant luciferases HIK and HLK were 89.3 and 101.7%, respectively, and far exceeded the luminescence rates of the wild-type Heike firefly luciferase and the thermotolerant Heike firefly luciferase. Above all, the luminescence of HLK is almost 100%, and the same luminescence can be obtained regardless of the presence or absence of the surfactant. In other words, it was shown that the sensitivity was not reduced at all even when a surfactant was used, and that highly accurate measurement was possible.
  • HLK 0.035 Among the three wild-type luciferases, American firefly luciferase showed the lowest IC50, indicating the least resistance to detergents. Heikebo tarluciferase showed the highest IC50 of the wild type. HLK and HIK exceeded the IC50 of wild-type Heike firefly luciferase and heat-resistant Heike firefly luciferase, indicating that the substitution of the amino acid at position 490 improved the resistance. Among them, the IC50 of HLK was higher than that of HIK, suggesting that it has the highest surfactant resistance.
  • TCA trichloroacetic acid
  • TC A extraction method a luciferin luciferase luminescence reaction
  • the TCA extraction method has excellent ATP extraction efficiency, and since luminescence is measured after diluting a sample containing TCA 100-fold, the luminescence reaction is not inhibited by TCA.
  • the TCA extraction method has a problem that the operation is complicated and the measurement sensitivity is lowered.
  • Benzalkonidum chloride (BAC, Osban solution of the Japanese Pharmacopoeia Law) was used as a surfactant.
  • Escherichia coli ATCC 25922
  • Staphylococcus aureus ATCC 25923
  • Pseu domonas aeruginosa ATCC 27853
  • Enterococcus faecalis ATCC 29212
  • a stock solution of a culture solution obtained by culturing the above microorganisms in a normal bouillon medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) at 35 ° C overnight was used as a sample.
  • a diluted solution obtained by diluting the stock solution of the culture solution 100-fold with sterile water was used as a sample.
  • H I K and HLK were used as the detergent-resistant luciferase of the present invention.
  • known Luciferase species American firefly luciferase, Genji firefly luciferase, Heike firefly luciferase, Heike I mutant, Heike L mutant were used.
  • luciferases were added to a solution of 0.15 mM norrecifulin, 6 mM EDTA, 15 mM magnesium acetate, 0.2 mM dithiothreitol, 0.5% BSA, 25 mM HEPESC pH 7.75) and used as a luminescence reagent.
  • Rushifuwera Ichize amount is to be added, the amount of light emitted from the time that the ATP standard solution was added of 2xlO_ 8 M of an equal amount to the light-emitting reagent 100 zl is, as a light-emitting reagent "Lucifera Ichize LU" that comes with the (Kikkoman Co., Ltd.) Adjustment was performed so as to be the same as when the luminescent reagent was used. 2. How to measure intracellular ATP
  • ATP extraction reagent 1 was added to sample 100 ⁇ 1. After standing at room temperature for 20 seconds, 100 zl of a luminescent reagent was added, and the amount of luminescence was measured immediately using Lumat LB-9501 manufactured by Berthold.
  • the luminescent reagent using American firefly luciferase did not emit any light, and the firefly luciferase showed only weak light emission. This is because luciferase itself was inactivated by the surfactant. Therefore, it was shown that high-concentration surfactants such as those used in this study could not be used as ATP extraction reagents for these luciferases.
  • Heike firefly luciferase unlike the American firefly luciferase and Genji firefly luciferase, luminescence of about 60 to 70% of the TCA extraction method was observed. Heike firefly luciferase was shown to have higher surfactant resistance than American firefly luciferase genji firefly luciferase. In the case of the Hike I mutant and the Hike L mutant, which are heat resistant luciferases, the luminescence obtained is about 40% of the TCA extraction method, indicating that the wild type Hikebota It was far below the case of Lulu Sifelaze.
  • the obtained luminescence was higher than that of the wild-type Heike firefly luciferase and the thermostable luciferase.
  • the luminescence amount was 60 to 80% of the TCA extraction method.
  • 1111: and ⁇ 11 ⁇ are those in which the Glu at position 490 of the Heike I mutant and the Heike L mutant is substituted with Lys. It is considered that the introduction of the mutation into the amino acid at position 490 improved the resistance to surfactants. Therefore, since 1111 ⁇ and ⁇ 11 ⁇ have little decrease in sensitivity to the high-concentration ATP extraction reagent used in this study, highly accurate measurement is possible by using them. It has been shown. Industrial applicability
  • novel luciferase which is resistant to the surfactant according to the present invention can be used to measure intracellular ATP using the same, so that even if the surfactant is present at a high concentration, the intracellular ATP C

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Description

明 細 書 ルシフヱラーゼおよびそれを用いる細胞内 A T Pの測定法 技術分野
この発明は、 界面活性耐性を有する新規ルシフェラ一ゼおよびそれを用いる細 胞内 A T Pの測定法に関する。 背景技術
食品衛生、 バイオ、 臨床検査、 医学、 超純水、 環境などの分野では、 試料中の 細胞の有無や細胞数の計測等を目的として、 細胞内 A T Pの測定が日常的に行な われている。 細胞内 A T Pの測定法においては、 細胞を含む試料に、 界面活性剤 を有効成分とする A T P抽出試薬を添加して、 細胞内 A T Pを細胞外に抽出した 後、 ルシフ ラ一ゼを含む発光試薬を試料に添加し、 生じる発光の発光量を測定 する方法が一般的である。
ルシフヱラーゼは、 A T Pおよびマグネシウムイオンの存在下で、 基質である ルシフェリ ンの発光反応を触媒する酵素である。 細胞内 A T Pの測定法における ルシフヱラーゼとしては、 例えばホタル (ゲンジボタル、 ヘイケボタル、 ァメリ カホタル、 ロシアホタル等) を由来とするものが用いられている。
細胞内 A T Pの抽出は、 細胞を含む試料に、 A T P抽出試薬を添加して撹拌す ることにより成し遂げられる。 充分な抽出能力を発現させるためには、 試料と抽 出試薬を混合したときの混合液に対し、 界面活性剤の濃度が 0. 05%以上になるよ うに添加することが望ましい。 し力、し、 界面活性剤の濃度が 0. 05%以上である場 合、 生物発光により ATP濃度を測定する工程で酵素反応を著しく阻害するため、 測定感度および精度が大きく低下する。 これは、 高濃度の界面活性剤によりルシ フェラ一ゼの活性が低下することが原因であると考えられている。 例えば、 ァメ リカホタルのルシフヱラ一ゼは、 0. 1 %の塩化ベンザルコニゥムの存在下では、 その活性が約 20%にまで低下する (第 1表参照) 。
一方、 界面活性剤の濃度が低いと生物発光反応の阻害を小さくできるが、 A T Pの抽出効率が不十分となる。
界面活性剤による発光反応の阻害を抑制する方法として、 サイクロデキス卜リ ンまたはその誘導体を使用する方法は公知である (特表平 6— 5 0 4 2 0 0号) c また、 細胞を含む試料を界面活性剤と接触させて細胞内 A T Pを抽出し、 次いで ルシフヱリン—ルシフヱラーゼ生物発光反応法により該 A T Pを測定する方法に おいて、 A T P抽出後の試料をサイクロデキストリンと接触させた後に生物発光 反応法を適用することを特徴とする細胞内 A T Pの測定方法も公知である (特開 平 7— 2 0 3 9 9 5号公報) 。
しかしながら、 ルシフ ラーゼに注目して、 界面活性剤による生物発光反応の 阻害を抑制しようとした試みはなかった。
従って、 発明の目的は、 界面活性剤が高濃度に存在する場合でも活性が低下し ない、 界面活性剤に耐性を有する新規なルシフニラーゼを提供することにある。 また、 本発明の目的は、 界面活性剤を使用して細胞内 A T Pを抽出し、 ついで該 細胞内 A T Pをルシフ ラーゼを用いる生物発光反応法により測定する方法にお いて、 界面活性剤による生物発光反応の阻害を抑制することができ、 且つ細胞内 A T Pの抽出効率を低下させることがない方法を提供することにある。
なお、 ここでいう 「抑制」 とは、 界面活性剤による生物発光反応の阻害を有意 に低減すること、 及び該阻害を完全に排除することを意味する。 発明の開示
本発明は、 界面活性剤に耐性を有するルシフェラーゼである。
上記界面活性剤に耐性を有するルシフ ラ一ゼとしては、 野生型ホタルルシフ エラーゼのアミノ酸配列において、 490位のアミノ酸、 またはゲンジボタルもし くはへィケボタルのルシフヱラーゼの 490位と同等位置のァミノ酸を、 グルタミ ン酸以外の他のァミノ酸、 例えばリジンに置換したものが挙げられる。
また、 上記界面活性剤に耐性を有するルンフェラ一ゼとしては、 以下の (a ) 又は (b ) からなるポリペプチド
( a ) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド
( b ) ( a ) のポリペプチドにおいて 1若しくは複数のアミノ酸が付加、 欠失若 しくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつ界面活性剤に耐性を有するルシフ エラーゼ活性を有するポリペプチド、 あるいは
以下の (a ) 又は (b ) からなるボリべプチド
( a ) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
( b ) ( a ) のポリペプチドにおいて 1若しくは複数のアミノ酸が付加、 欠失若 しくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつ界面活性剤に耐性を有するルシフ ヱラーゼ活性を有するタンパク質、
が挙げられる。
さらに、 本発明は上記界面活性剤に耐性を有するルシフェラーゼをコ一ドする ルシフヱラーゼ遺伝子である。
さらに、 本発明は上記界面活性剤に耐性を有するルシフェラーゼをコードする ルシフヱラーゼ遺伝子を含む組換ベクターである。
さらに、 本発明は上記組換ベクターを含む形質転換体である。
さらに、 本発明は上記形質転換体を培地に培養し、 得られる培養物から界面活 性剤に耐性を有するルシフェラ一ゼを採取することを特徴とする該ルシフェラー ゼの製造法である。
さらに、 本発明は細胞を含む試料から界面活性剤の存在下に A T Pを抽出する 第 1工程、 該 A T P抽出液にルシフェラ一ゼを含む発光試薬を添加して発光させ る第 2工程、 および該発光量を検出する第 3工程を含む細胞内 A T Pの測定法に おいて、 ルシフヱラーゼとして、 界面活性剤に耐性を有するルシフヱラーゼを使 用することを特徴とする細胞内 A T Pの測定法である。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本国特許出願、 平成 9年特許願第 3 6 1 0 2 2号の明細書及び Zまたは図面に記載される内容を包含する。 囟面の簡単な説明
第 1図は変異型ルシフェラーゼ HIKの遺伝子の作製図を示す図であり、 第 2図 は天然型ルシフェラーゼの発光量の経時変化を示す図であり、 第 3図は変異型ル シフェラ一ゼの塩化べンザルコニゥムに対する耐性比較を示す図であり、 第 4図 は変異型ルシフェラーゼの塩化べンゼトニゥムに対する耐性比較を示す図である。 発明の詳細な説明
以下、 本発明について詳述する。
〔界面活性剤に耐性を有するルンフェラーゼについて〕
本発明の界面活性剤に耐性を有するルシフェラ一ゼについて説明する。
「界面活性剤に耐性を有する」 とは、 次のいずれかの性質を有するものをいう。
( 1 ) 従来公知のルシフニラーゼと比較した場合に、 界面活性剤存在下での初発 の発光量が增大するものをいう。 ここでいう 「比較」 とは、 例えば、 公知のルシ フヱラーゼのァミノ酸配列に変異を導入して本発明のルシフヱラーゼを作製する 場合であれば、 変異導入前のルシフヱラ一ゼの発光量と、 変異導入後のルシフエ ラーゼの発光量との比較を意味する。
( 2 ) 従来公知のルシフユラーゼと比較した場合に、 界面活性剤存在下での活性 の低下が緩やかであることをいう。
( 3 ) 0 . 4 %の界面活性剤存在下で、 8 5 %以上の残存活性を有することをい ラ o
以後、 「界面活性剤に耐性を有するルシフ ラーゼ」 を、 「界面活性剤耐性ル シフヱラーゼ」 と表記する。
「活性」 とは、 生物発光反応の触媒活性を意味する。 また、 本発明でいう 「界 面活性剤」 とは、 細胞内 A T Pの測定系に使用されうるものであればいずれでも よく、 例えば、 ァニオン系界面活性剤、 カチオン系界面活性剤、 ツイッタ一ィォ ン系界面活性剤、 非イオン系界面活性剤等が挙げられ、 さらに具体的には、 塩化 ベンザルコニゥムあるいは塩化べンゼトニゥム等の第 4級ァンモニゥム塩を主成 分とする試薬が挙げられる。
本発明のルシフェラ一ゼは、 発光性生物の発光器官等から調製することにより 得られる。 発光性生物としては、 発光性昆虫、 発光性細菌等が挙げられる。 発光 性昆虫としては、 甲虫目 (cleoptera)に属するもの、 例えばホタル科ゃコメツキ ムシ科の昆虫、 具体的には、 ゲンジボタル、 ヘイケボタル、 アメリカホタル、 口 シァホタル、 ヒカリコメツキムシツチボタル、 鉄道虫等が挙げられる。 また、 本 発明のルシフヱラーゼは、 上記の発光生物からルシフヱラ一ゼ遺伝子をクローニ ングし、 該遺伝子を適当なベクター一宿主系を用いて発現させることにより得ら れる。
さらに、 本発明のルシフヱラ一ゼは、 従来公知のルシフヱラーゼのアミノ酸配 列に付加、 欠失、 置換等の変異を導入することにより得られる。 アミノ酸配列に 変異を導入する方法としては、 公知の遺伝子工学的手法を使用することができる その場合、 まず、 上記の発光性生物を由来とするルシフ ラーゼ遺伝子や既知の ルンフェラーゼ遺伝子の塩基配列に遺伝子工学的手法により付加、 欠失、 置換等 の変異を導入して変異型ルシフェラーゼ遺伝子を構築する。 ついで、 該変異型遺 伝子を適当なベクター—宿主系に導入して組み換え微生物を作製する。 さらに該 組み換え微生物の中から、 本発明のルシフェラ一ゼを生産するものをスクリ一二 ングし、 それを培地に培養し、 得られる培養物からルシフェラーゼを採取すれば よい。
以後、 ァミノ酸配列に変異を導入することにより得られた界面活性剤耐性ルン フェラーゼを、 「変異型ルシフヱラーゼ」 と表記することとする。
変異型ルシフヱラーゼとしては、 例えば、 野生型ホタルルシフヱラーゼのアミ ノ酸配列において、 ゲンジボタルもしくはヘイケボタルのルシフヱラーゼの 490 位と同等位置のァミノ酸が、 グルタミン酸以外のァミノ酸に置換されたルシフエ ラ一ゼが挙げられる。 グルタミン酸以外のアミノ酸としては、 例えば塩基性アミ ノ酸、 具体的には、 リジン、 アルギニン、 ヒスチジン等が挙げられる。 「ゲンジ ボタルもしくはヘイケボタルのルシフヱラーゼの 490位と同等位置のァミノ酸」 とは、 確定したルシフヱラーゼのァミノ酸配列をゲンジボタルまたはへィケボタ ルルシフヱラ一ゼのァミノ酸配列と比較した場合に、 ゲンジボタルまたはへィケ ボタルルシフヱラーゼの 490位のァミノ酸に対応するァミノ酸を意味するもので める。
なお、 ゲンジボタルまたはへィケボタルのルシフヱラ一ゼでは、 490位のアミ ノ酸はグルタミン酸である。 また、 アメ リカホタルルシフェラーゼにおいて、 「ゲンジボタルまたはヘイケボタルのルシフェラーゼの 490位と同等位置のァミ ノ酸」 とは、 4 8 7位のグルタミ ン酸である。
さらに具体的には、 変異型ルシフェラーゼとは、 配列番号 1または 2で表され るアミノ酸配列、 又は該ァミノ酸配列のうちの 1若しくは複数のァミノ酸が付加、 欠失若しくは置換されたァミノ酸配列を含むポリべプチドである。
〔遺伝子工学的手法を用いて変異型ルシフェラ一ゼを得る方法〕
以下に、 遺伝子工学的手法を用いて変異型ルシフェラーゼを得る方法について 説明する。
変異型ルシフヱラーゼは、 既知のルシフヱラーゼ遺伝子の塩基配列に付加、 欠 失、 置換等の変異を導入して変異型ルシフェラ一ゼ遺伝子を構築し、 該遺伝子を 適当なベクター一宿主系により発現させることにより得られる。
既知のルシフヱラーゼ遺伝子としては、 特に限定されないが、 例えば、 ホタル ルシフヱラーゼ遺伝子、 具体的には、 野生型へィケボタルルシフヱラーゼ遺伝子
(特開平 2— 1 7 1 1 8 9号公報に記載) 、 耐熱性へィケボタルルシフヱラーゼ 遺伝子 (特開平 5 - 2 4 4 9 4 2号公報に記載) 等が挙げられる。
i ) ルシフェラ一ゼ遺伝子に変異を導入する方法としては、 該遺伝子と変異原 となる薬剤、 具体的にはヒ ドロキシルァミ ン、 亜硝酸、 亜硫酸、 5—プロモウラ シル等を接触させる方法を挙げることができる。 この他、 紫外線照射法、 カセッ ト変異法、 P C R法を用いた部位特異的変異導入法等の方法を広く用いることが できる。 更には、 化学合成した D N Aをアニーリングして所望の部位に変異を有 する変異型ルシフエラーゼ遺伝子を構築することも可能である。
i i) 次いで、 変異型ルンフヱラ一ゼ遺伝子を、 プロモーター配列、 マーカー遺 伝子、 複製起点等を有するベクター D N Aに挿入して組み換え体プラスミ ドを得 る。 ベクター D N Aは、 宿主細胞で複製可能なものであれば如何なるものでもよ く、 例えば、 プラスミ ド D N A、 バクテリオファージ D N A等が挙げられる。 宿 主細胞が大腸菌である場合のベクター D N Aとしては、 プラスミ ド PUC119 (宝酒 造社製) 、 pBluescri pt SK+(Stratagene社製)、 pMAL-C2 (NEW England Labs社 製) 、 pGEX- 5X- 1 (フアルマシア社製) 、 pXal (ベ一リ ンガー社製) 、 pMA56
(G. Ammerer, Meth. Enzymol. , 101, 192, 1983) 等が使用できる。
i i i)次いで、 上記の組み換え体プラスミ ドを用いて適当な宿主細胞を形質転換 又は形質導入し、 変異型ルシフェラーゼの生産能を有する組み換え微生物をスク リ一二ングする。
宿主細胞としては、 真核細胞及び原核細胞のいずれをも使用できる。 真核細胞 としては動物、 植物、 昆虫、 酵母等の細胞が、 原核細胞としては大腸菌、 枯草菌、 放線菌等が挙げられる。 動物細胞としては、 CH0、 COSs HeLa細胞及びミエロー マ細胞系統の細胞が、 原核細胞としては、 エツシェリシァ属に属する微生物、 例 えば大腸菌 JM10 ATCC 33876)、 J 109 (宝酒造社製) 、 XL1- Blue (Stratage ne社製) 、 HB10 ATCC33694)等が使用できる。
本発明においては、 形質転換は、 例えば、 D.M. Morrisonの方法 (Meth. Enzymo 1., 68, 326-331, 1979) 等により、 形質導入は、 例えば、 B. Hohnの方法 (Meth. En zymol., 68, 299-309, 1979) 等により行うことができる。
組み換え微生物より組み換え体 DNAを精製する方法としては、 例えば、 P.Gu erryの方法 (J. Bacteriology, 116, 1064-1066, 1973) 、 D. B. Clewellの方法 (J. Bacteriology, 110, 667-676, 1972) 等を用いることができる。 又、 組み換え体 D N Aに揷入された遺伝子の塩基配列の決定は、 例えば、 Maxam- Gilbert 法 (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560-564, 1977 ) 、 Dideoxy法 (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977) 等により行うことができる。
iv) 上記の方法により得られた組み換え微生物を培地中で培養することにより、 本発明の変異型ルシフヱラーゼを生産することができる。
宿主細胞が大腸菌である場合、 組み換え大腸菌を固体培養法で培養してもよい カ^ 液体培養法により培養するのが好ましい。 培地としては、 例えば、 酵母ェキ ス、 トリプトン、 ペプトン、 肉エキス、 コーンスティ一プリカ一あるいは大豆も しくは小麦ふすま浸出液等の 1種以上の窒素源に、 塩化ナトリウム、 リン酸 1力 リウム、 リン酸 2カリウム、 硫酸マグネシゥム、 塩化マグネシゥム、 塩化第 2鉄、 硫酸第 2鉄、 あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の 1種以上を添加し、 更に必要 により糖質原料、 ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。 なお、 培地の初 発 pH は、 pH 7〜9に調製するのが適当である。 また培養は 30〜42°C、 好まし くは 37°C前後で 3〜24時間、 好ましくは 5〜8時間、 通気撹拌深部培養、 振とう 培養、 静置培養等により実施するのが好ましい。
組み換え大腸菌の培養終了後、 培養物より変異型ルシフ Xラーゼを採取するに は、 通常の酵素採取手段を用いることができる。 すなわち、 培養物を遠心分離し て菌体を得た後、 リゾチーム等の酵素を用いた溶菌処理、 超音波破砕処理、 磨砕 処理等により菌体を破壊し、 融合タンパク質を菌体外に排出させる。 次いで、 ろ 過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去することにより、 変異型ルシフエラ一ゼ を含有する粗酵素液を得ることができる。
本発明では、 上記の粗酵素液をそのままタンパク質標品としてもよいが、 通常 のタンパク質精製法を用いて、 更に純度を高めてもよい。 具体的には、 硫安塩析 法、 有機溶媒沈澱法、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマ トグラフィ一、 電気泳動法等を、 単独又は適宜組み合わせて用いることができる 本発明の界面活性剤耐性ルシフ ラーゼを使用することにより、 細胞内 A T P の抽出工程において、 界面活性剤を高濃度に添加することが可能となる。
〔本発明の細胞内 A T Pの測定法〕
以下に、 本発明の細胞内 A T Pの測定法について説明する。
i) まず、 細胞を含む試料に、 界面活性剤を有効成分とする A T P抽出試薬を添 加して、 細胞内 A T Pを細胞外に抽出する。 細胞とは、 動物、 植物、 微生物 (例 えば、 酵母、 カビ、 キノコ、 細菌、 放線菌、 単細胞藻類、 ウィルス、 原生動物 等) 等を由来とする細胞を意味する。
試料とは、 上記の細胞を含むものであれば特に限定されないが、 例えば、 飲食 物、 医薬、 化粧品、 海水、 河川水、 工業用水、 下水、 土壌、 尿、 糞便、 血液、 喀 痰、 膿汁、 上記細胞の培養物等が挙げられる。 また、 上記の試料を、 適当な溶媒 (例えば、 蒸留水、 生理的食塩水、 リン酸緩衝液、 トリス緩衝液、 酢酸ナトリウ ム緩衝液等) に懸濁した溶液を試料としてもよい。 検体液が固形分を含む場合に は、 該検体液を適当な溶媒に懸濁するか、 ミキサーなどでホモジナイズすれば溶 液状のものと同様に扱うことができる。
また、 上記溶液状の試料を、 親水性または疎水性の濾過膜で濾過して細胞を捕 捉した後に該濾過膜を試料としてもよい。 細胞を捕捉した濾過膜を試料とする場 合、 親水性濾過膜としては、 例えば親水性ポリテトラフルォロエチレン、 親水性 ポリビニリデンフルオラィ ド、 親水性ポリアミ ド、 ァセチルセルローズ、 ニトロ セルローズ等を材料とするフィルム状又はシート状のものが使用できる。 また、 疎水性濾過膜としては、 例えば P V D F (ポリビニリデンフルオライ ド) 、 P T F E (ポリ トラフルォロエチレン) 、 P E (ポリエチレン) 等を材料とするもの が使用できる。
界面活性剤としては、 例えば、 ァニオン系界面活性剤、 カチオン系界面活性剤、 ツイッタ一イオン系界面活性剤、 非イオン系性界面活性剤等が挙げられる。 ァニ オン系界面活性剤としては、 例えばドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 、 ラウリル 硫酸カリウム、 モノラウロイルリン酸ナトリウム、 アルキルべンスルホン酸ナト リウムがあげられる。 カチオン系界面活性剤としては、 例えば塩化ベンザルコニ ゥム (BAC) 、 塩化べンゼトニゥム (BZC) 、 塩化セチルピリジニゥム、 臭化セ チルトリメチルァ ンモニゥム、 塩化ミ リスチルジメチルベンジルアンモニゥム があげられる。 また、 ッイツターイオン系界面活性剤としては、 例えば Twi t terg ent De tergent 3-08, 3-10, 3-12, 3-14, 3-16、 Tegoがあげられる。 さらに非ィ オン性界面活性剤、 例えば、 Tween 20, 60, 80、 Span 60, 80、 Tr i ton X - 45, x-100,ポリオキシエチレンエーテル、 ポリオキシエチレンラウリルエーテルがあ げられる。
界面活性剤の濃度は、 充分な ATP抽出能力を発現させる濃度であればいずれで もよいが、 試料と A T P抽出試薬を混合した時の混合液に対し、 界面活性剤の濃 度が好ましくは 0. 05%以上になるように添加する。
試料と A T P抽出試薬との反応条件は、 室温あるいは加温しつつ接触させれば よい。
U) A T P抽出後の試料に界面活性剤耐性ルシフェラーゼを含む生物発光試薬を 添加して発光を生じさせ、 生じた発光を検出する。
界面活性剤耐性ルシフユラ一ゼがホタル由来のものである場合、 生物発光試薬 とは、 例えば以下の (ィ) 〜 (ハ) の成分を含む試薬である。
(ィ) 界面活性剤耐性ルシフ Xラーゼ
(口) ノレシフェリン
(ハ) マグネシウムイオンまたは他の金属イオン
なお、 発光試薬には上記の成分のほか、 p H調製や保存性向上に関与する物質 を添加してもよい。 そのような物質としては、 例えば、 EDTA 2Na、 ジチオスレィ トール、 硫酸アンモニゥム、 シユークロース、 2-メルカプトエタノール、 HEPES 、 Tricineヽ Tris、 等が挙げられる。
iii) 生物発光試薬の添加により生じた光の発光量は、 ルミノメーター、 例えば キッコーマン社製ルミテスタ一 K- 100、 ァロカ社製ルミネッセンスリ一ダー B L R- 2 0 1 (改良型) 、 ベルトールド社製 Lumat LB9501等により測定することが できる。 また、 細胞を捕捉した濾過膜を試料とする場合、 生物発光画像解析シス テム装置、 例えば ARGU S— 5 0 /C L 〔テーパーファイバー付:浜松ホトニ クス (株) 社製〕 を用いて濾過膜上の輝点を撮像することにより、 細胞数を測定 することが可能である。
以下に、 実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。 ただし、 本発明はこれら の実施例にそのその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例 1〕 各種ホタル由来の天然型ルシフェラーゼの界面活性剤耐性
(各種ホタル由来の野生型ルシフ ラーゼの調製法)
以下の方法に準じて、 ゲンジおよびへィケボタル由来のルシフヱラーゼを調製 した。 すなわち、 25mMトリス (ヒ ドロキシ) ァミノメタン一塩酸緩衝液に、 ImM エチレンジァミ ン 4酢酸 2ナトリゥム及び 2mMフエニルメチルスルフォニルフル オリ ドを添加し、 更に硫酸アンモニゥムを 10%飽和となる如く添加して得た混液
(pH7.8) に、 各種ホタルの尾部を添加してヒスコ トロン 〔 (株) 日音医理科器 械製作所製〕 を用いて破壊した。 得られた溶液を 12, 000r. p.m.で 20分間遠心分離 し、 上清を以下の精製工程の出発原料とした。 精製は、 硫酸アンモニゥム塩析、 ウルトロゲル (Ultrogel) A c A34 (LKB社製) カラム、 ヒ ドロキシ—ァパタ イ ト HP L C (東洋曹達工業社製、 TSKgel HA— 1000) カラムの工程により 行い、 最終的に電気泳動的に単一な標品を得た。 なお、 アメ リカホタル由来のル シフェラーゼは市販品 (Sigma社製、 L- 9506) を使用した。
(ルシフェラーゼの活性測定法)
ルシフヱラーゼ標品を酵素希釈液 (1 mM EDTA, 1 m 2-メルカプトエタノール, 1% BSA, 50 mM HBPES, (pH 7.5)) にて適宜希釈し、 その 100〃 1に 100 1の 基質溶液 (1.4 mMルシフヱリン, 40 mM ATP, 300 mM MgS04.7H20, 50 mM HEPES, (pH 7.5)) を添加した。 発光量の測定は、 BLR- 201 Luminescence reader (ァ ロカ社製) を用いて以下の設定条件で測定を行った。 測定レンジ : χΐ οο
表示数値: X1000
測定温度: 30°C
測定時間: 20秒間
この条件での測定値が 1 Kcountの時の活性値を 1 MLU (メガライトュニプト) /mlとし た。
(界面活性剤耐性の測定法)
各種ホタル由来ルシフエラーゼ標品を 0. 5 MLU/mlの濃度になるよう酵素希釈液 (1 m EDTA, 1 mM 2_メルカプトエタノール, 5%グリセロール, 50 mM HEPES (pH 7. 5)) を用いて調整し、 酵素標品とした。
100 1の基質溶液 (4 mM ATP, 0. 4 mMルシフヱリン, 10 mM 硫酸マグネシゥ ム, 50 mM HEPES (pH 7. 5)) に 50 1の 0. 4¾ί塩化ベンザルコニゥム (25 mM Tri e ine (pH 7. 75)) を添加し、 さらに 50 z 1の酵素標品を添加して、 5秒撹拌した 後に Berthol d Lumat LB-9501にて 1秒ごとに 1分間の発光量を経時的に測定した c その結果を図 2に示す。 図中縦軸には、 0. 4¾ί塩化ベンザルコニゥムの代わりに 25 mM Tri cine (pH 7. 75)を使用したときの初発発光量を 100%とした際の発光量 の相対比をプロッ トしている。
この結果において、 アメ リカホタルルシフヱラーゼは初発の発光量が低く、 ま た発光量が急激に減衰しているのがわかる。 これはァメ リカホタルルシフヱラー ゼの界面活性剤耐性が低いためであり、 感度の低下および測定値の精度の低下を 招く。 これに対し、 ゲンジボタルルシフヱラ一ゼはアメ リカホタルルシフヱラ一 ゼと比べ初発の発光量が高かった。 すなわち、 ゲンジボタルルシフヱラーゼはァ メ リカホタルルシフヱラーゼより界面活性剤耐性が優れていることが示された。 さらにへィケボタルルシフヱラーゼはゲンジボタルルシフヱラーゼより初発の発 光量が高く、 発光の減衰も緩やかであったことから、 優れた耐性を示すことが明 らかになつた。 この結果より、 ルシフヱラーゼの界面活性剤に対する耐性度は、 起源とするホタルの種類により異なっていることが示唆された。
〔実施例 2〕 変異型ルシフ ラ一ゼ HLKおよび HIKの作製
以下の方法により、 ヘイケボタルを由来とする 2種類の変異型ルシフヱラ一ゼ ( 「HLK」 及び 「H IK」 と命名) を調製した。
(変異型ルシフ ラーゼ HLKをコードする遺伝子の作製)
PCRを用いた部位特異的変異法により、 変異型ルシフ ラ一ゼ遺伝子を作成し た。 PCR反応の铸型として特開平 5- 244942号公報記載のプラスミ ド pHLf7- 217Leu
(プラスミ ド PUC119に、 217番目の Alaに相当する遺伝子部分が Leuをコードす る遺伝子に置換された耐熱性へィケボタルルシフエラーゼの遺伝子が挿入された 組み換え体プラスミ ド) を使用した。 なお、 該プラスミ ドが導入された大腸菌 JM 101株は、 大腸菌 (E. co l i ) JM101 (pHLf7- 217Leu)と命名され、 工業技術院生 命工学工業技術研究所 (茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号) に FERM BP-3840
(寄託日 :平成 4年(1992) 4月 22日) として寄託されている。
PCR反応のプライマーとして配列番号 1、 2で表される塩基配列のォリゴヌク レオチドを、 また DNA po l ymeraseとしての KOD dash pol ymerase (TOYOBO社製) を使用した。 KOD dash pol ymerase に付属の実施例に準じて GeneAmp PCR Sys tem
9600 (Perki n Elmer社製) を用い、 94°Cで 30秒、 50°Cで 2秒、 74°Cで 3分のサ イクルを 30サイクル繰り返し、 PCR反応を行った。 生じた PCR産物を常法に従つ て Li gat i onを行い、 環状の組み換え体プラスミ ド pHLfLKを得た。
pHLf LKに含まれる変異型ルシフヱラーゼ遺伝子のシークェンシングを行った。 ダイプライマ一タックシークェンシングキッ ト (アプライ ドバイオシステムズ社 製) を用いて反応を行い、 AB I 373A DNAシークェンサ一 (アプライ ドバイオシス テムズ社製) で泳動解析を行った。 このようにして得られた変異型ルシフヱラー ゼ遺伝子の全塩基配列を配列番号 3に、 また、 該遺伝子がコードするポリべプチ ドのァミノ酸配列を配列番号 4に示す。 変異型ルシフエラーゼ遺伝子では、 野性 型へィケボタルルシフヱラーゼの 217番目のァラニンに相当する遺伝子部分が口 ィシンに、 また 490番目のグルタミ ン酸に相当する遺伝子部分がリジンをコード する遺伝子に置換されていた。
pHLf LKを導入した大腸菌 JM109株を、 大腸菌 (E. col i ) JM109 (pHLfLK)と命 名した (図 1参照) 。 大腸菌 (E. co l i ) JM109(pHLfLK)は、 工業技術院生命ェ 学工業技術研究所に FERM BP-6147 (寄託日 :平成 9年(1997) 10月 16日) として 寄託されている。 配列番号 4に示すポリべプチドを、 変異型ルシフヱラーゼ H L Kと命名した。 (変異型ルシフェラ一ゼ HIKをコードする遺伝子の作製)
特開平 5- 244942号公報記載のプラスミ ド pHLf 7- 2171 l e (プラスミ ド pUC119に、 217番目の Alaに相当する遺伝子部分が l ieをコードする遺伝子に置換された耐 熱性ヘイケボタルルシフヱラーゼの遺伝子が揷入された組み換え体プラスミ ド) を用いて変異型ルシフヱラーゼ遺伝子を作成した。 該プラスミ ドによる形質転換 株は、 工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM BP-3841 (寄託日 :平成 4年 (1992) 4月 22日) として寄託されている。
pHLfLKを EcoRVおよび Nar lで切断し得られた約 560bpの断片をァガロースゲル 電気泳動により取得し、 同じ制限酵素で処理した pHLf7-217 U eに挿入した。
このようにして得られた組み換え体プラスミ ドを pHLf IKと命名し、 該プラスミ ドを導入した大腸菌 JM109株を大腸菌 (E. col i) JM109(pHLf IK)と命名した。 大腸菌 (E. col i) JM109(pHLf IK)は、 工業技術院生命工学工業技術研究所に FE RM BP- 6146 (寄託日 :平成 9年(1997) 10月 16日) として寄託されている。
pHLf IKに含まれる変異型ルシフニラーゼ遺伝子の全塩基配列を配列番号 5に、 また、 該遺伝子がコ一ドするポリべプチドのアミノ酸配列を配列番号 6に示す。 変異型ルシフェラ一ゼ遺伝子では、 野性型へィケボタルルシフェラーゼの 217番 目のァラニンに相当する遺伝子部分がィソロイシンに、 また 490番目のグルタミ ン酸に相当する遺伝子部分がリジンをコードする遺伝子に置換されていた (図 1 参照) 。
配列番号 6に示すポリべプチドを、 変異型ルシフヱラーゼ H I Kと命名した。
〔実施例 3〕 変異型ルシフヱラーゼ HLKおよび HIKの調製
大腸菌 (B. col i) JM109(pHLfLK)及び大腸菌 (E. col i) JM109(pHLf IK)を、 それぞれアンピシリンを含む L B培地 〔バク ト トリプトン 1 % (W/V) 、 酵母ェ キス 0. 5% (W/V) 、 NaCl 0. 5% (W/V) 、 アンピシリ ン (50 i g/ml) 、 1. 4% (W/V) 寒天〕 に接種し、 3 7 °Cで 1 8時間培養を行なった。 得られた培養液を、 8000 p. m.で 1 0分間の遠心分離し、 沈殿した菌体を 0. 1 M リン酸カリウム緩 衝液 (pH7. 8) 、 0. 1 M硫酸アンモニゥム、 1 mM EDTA] に懸濁した後、 超音波 破砕した。 次いで、 12000 r. p. m.で 1 0分間遠心分離を行ない、 粗酵素液を得た。 得られ た粗酵素液を前述した精製法により、 電気泳動的に単一にまで精製した。
〔実施例 4〕 変異型ルシフエラーゼ HLKおよび HIKの界面活性剤耐性
(発光の経時変化)
変異型ルシフェラーゼと公知のルシフェラ一ゼとの界面活性剤耐性を比較する ため、 前述した界面活性剤耐性の測定法に準じて発光量の経時変化を測定した。 界面活性剤として、 0. 4 %塩化ベンザルコニゥム(25mM Tri cineCpH 7. 75)) を使 用した結果を図 3に、 0. 8 %塩化べンゼトニゥム(25mM Tri cineCpH 7. 75)) を使 用した結果を図 4に示す。
図中 「ヘイケ I変異体」 は、 野性型へィケボタルルシフェラーゼの 217番目の Alaが l ie に置換された耐熱性へィケボタルルシフヱラーゼ (特開平 5-244942号 公報) であり、 「ヘイケ L変異体」 は、 野性型へィケボタルルシフェラ一ゼの 21 7番目の Alaが Leu に置換された耐熱性へィケボタルルシフヱラーゼ (特開平 5 - 244942号) である。 また、 「H I K」 はへィケ I変異体の 4 9 0番目の Glu を Ly s に置換した変異体であり、 実施例 3で調製した変異型ルシフェラーゼ H I で ある。 「H L K」 はへィケ L変異体の 4 9 0番目の Glu を Lys に置換した変異体 であり、 実施例 3で調製した変異型ルシフヱラーゼ H L Kである。
図 3に示した塩化ベンザルコニゥムの結果において、 H I Kとへィケ I変異体 とを比較すると H I Kのほうが発光の減衰が穏やかであることがわかる。 また、 H L Kとへィケ L変異体とを比較すると、 H L Kのほうが初発発光量が 20%程度 向上しており、 また発光の減衰が穏やかであることがわかる。 このことより 4 9 0番目のアミノ酸の置換により界面活性剤耐性が向上していることが示された。 図 4に示した塩化べンゼトニゥムの結果において、 H I Kとへィケ I変異体と を比較すると、 H I Kのほうが発光の減衰が穏やかであることがわかる。 また、 H L Kとへィケ L変異体とを比較すると、 H L Kのほうが発光の減衰が穏やかで あることがわかる。 このことより 4 9 0番目のアミノ酸の置換により界面活性剤 耐性が向上していることが示された。
(発光率の比較)
発光の経時変化を測定する際に使用した酵素溶液、 基質溶液および塩化ベンザ ルコニゥムを用い、 実際の発光測定条件下での測定値への影響を調べた。 Ber tho I d Lumat LB-9501を用い、 待ち時間 5秒、 測定時間 3秒の測定条件で求めた発光 量を第 1表に示す。 なお、 0. 4%塩化ベンザルコニゥムの代わりに 25 mM Tr i c i ne (pH 7. 75)を使用したときの発光量をコントロールとし、 0. 4%塩化ベンザルコニ ゥム存在時の発光量をコントロール値で割った値を発光率 (残存活性) として算 出した。 第 1表 各種ルシフェラーゼの発光率 発光量 (RLU)
発光率
シフ Iラ -セ'の種類
抽出試薬なし 抽出轼薬ぁリ (%)
ァ刈カ本'タ シフ 1う-せ' 452563 97790 21.6
r '/本'タル Aシフ Iラ -¾· 409406 167805 41.0
ヘイ タルルシフ Iラーセ' 425792 324724 76.3 ヘイケ 1変異体 422269 341039 80.6
ヘイケし変異体 423728 343634 81.1
HIK 386429 345159 89.3
HLK 390289 396764 101.7 アメリカボタルルシフヱラ一ゼは発光率が 21. 6!¾と最も低く、 感度が大幅に低 下することが示唆された。 これに対しゲンジボタルルシフェラ一ゼおよびヘイケ ボタルルシフヱラーゼの発光率はそれぞれ 41. 0%および 76. 3%であり、 アメリカ ボタルルシフエラーゼと比較し感度低下の影響が少ないことがわかる。
一方、 変異型ルシフヱラーゼ H IKおよび HLKの発光率はそれぞれ 89. 3 および 101. 7%であり、 野性型のヘイケボタルルシフヱラーゼおよび耐熱性へィケボタ ルルシフェラーゼの発光率を大きく上回った。 中でも HLKの発光率はほぼ 100%で あり、 界面活性剤の有無にかかわらず同じ発光量を得ることが出来る。 すなわち 界面活性剤を用いても感度低下を全く受けず、 精度の高い測定が可能であること が示された。
( I C50の比較) 塩化ベンザルコニゥムと各種ルシフヱラ一ゼを 10分間接触させ、 活性の 50¾を 失活させる塩化ベンザルコニゥム濃度 (I C50) を求めた。 前述した濃度に調整し たルシフヱラーゼ溶液と 0. 01〜0. 1!¾までの塩化ベンザルコニゥムを等量で混和し、 10分間室温で放置した。 その後、 100 1の基質溶液を添加して、 Ber tho l d Lum at LB-9501にて直ちに発光量を測定した。 得られた I C50を第 2表にまとめた。 第 2表 各種ルシフヱラーゼの I C 5 0 シフ Iラ-セ'の職 に so (¾) アメリカ本'タルルシフェラ-セ' 0.014
r 本'タルルシフ Iラ-セ' 0.0 6
ヘイ^タルルシフ Iう-セ' 0.026 ヘイケ 1変異体 0.028
ヘイケ L変異体 0.028
HIK 0.032
HLK 0.035 野性型ルシフエラーゼ 3種のうちァメ リカホタルルシフヱラーゼは最も低い IC 50を示し、 界面活性剤に対する耐性が最も劣っていることが示された。 ヘイケボ タルルシフヱラーゼは野性型の中で最も高い I C50を示した。 HLKおよび H I Kは、 野性型ヘイケボタルルシフヱラーゼおよび耐熱性ヘイケボタルルシフェラ一ゼの IC50を更に上回り、 490番目のァミノ酸の置換により耐性が向上したことが示さ れた。 中でも HLKの I C50は H IKを上回り、 最も界面活性剤耐性が優れているこ とが示唆された。
〔実施例 5〕 (細胞内 ATPの測定法)
次に、 本発明の界面活性剤耐性ルシフェラーゼを用いた細胞内 ATPの測定法に ついて説明する。
なお、 従来法として、 トリクロ口酢酸 (TCA)により細胞内 ATPを抽出し、 抽出 された ATP量をルシフヱリンールシフヱラーゼ発光反応により測定する方法 (TC A抽出法) を採用した。 TCA抽出法は ATP の抽出効率が非常に優れており、 ま た、 TCA を含む試料を 1 0 0倍に希釈した後に発光を測定するので、 TCA による 発光反応の阻害も生じない。 しかし、 この希釈操作のため、 TCA 抽出法は、 操作 が煩雑となり、 また、 測定感度の低下が起こるという問題がある。
1. 実験材料
( 1 ) 使用した界面活性剤
界面活性剤として、 塩化ベンザルコニゥム (BAC、 日本薬局法のォスバン液) を使用した。 上記界面活性剤を 0.25 %濃度で 25πιΜ Tricine(pH 7.75) に溶解し たものを、 ATP抽出用試薬とした。
(2) 使用した微生物
Escherichia col i (ATCC 25922)、 Staphylococcus aureus (ATCC 25923)、 Pseu domonas aeruginosa (ATCC 27853) および Enterococcus faecalis (ATCC 29212) の 4 菌種を使用した。
(3) 試料の調製
従来法では、 上記微生物を普通ブイヨン培地 (栄研化学 (株) 製) で一晩 3 5 °Cで培養して得られた培養液の原液を試料とした。 一方、 本発明の方法では、 該 培養液の原液を滅菌水で 100 倍希釈して得られた希釈液を試料とした。
(4) 使用したルシフェラーゼ
本発明の界面活性剤耐性ルシフェラーゼとして、 H I K及び HLKを使用した。 また、 対照として公知のルシフヱラ一ゼ種 (アメリカボタルルシフヱラーゼ、 ゲ ンジボタルルシフヱラーゼ、 ヘイケボタルルシフヱラーゼ、 ヘイケ I変異体、 へ ィケ L変異体) を使用した。
( 5 ) 発光試薬
各種ルシフヱラーゼを、 0.15 mM ノレシフヱリ ン、 6 mM EDTA, 15 mM酢酸マグネ シゥム、 0.2 mMジチオスレィ トール、 0.5 % BSA、 25 mM HEPESCpH 7.75)の溶液 に添加し、 発光試薬として用いた。
添加するルシフヱラ一ゼ量は、 発光試薬 100 zl に等量の 2xlO_8Mの ATP 標準 液を添加した時の発光量が、 発光試薬として 「ルシフェラ一ゼ LU 」 ( キッコー マン社製) に付属の発光試薬を用いた時と同じになるように調整した。 2. 細胞内 A TPの測定法について
( 1 ) 本発明の方法
試料 100〃 1に ATP抽出用試薬 1を添加した。 20秒間室温で放置した後、 発光試薬 100 zlを添加し、 直ちに発光量を Berthold社製 Lumat LB- 9501 を用い て測定した。
( 2 ) 従来法
試料 に等量の 10%のトリクロ口酢酸溶液を加えて 1分間放置した。 そ の抽出液に 9.8 ml の 25mM Tricine(pH 7.75 )を添加してよく攪拌した。 この試 料 100 1に 100〃1 の 25mM Tricine(pH 7.75 )および 「ルシフェール LU 」 ( キッコ一マン社製) に付属の発光試薬 を添加し、 直ちに発光量を Bertho Id社製 Lumat LB- 9501 を用いて測定した。 結果を第 3表及び第 4表に示す。 また、 従来法 (TCA抽出法) で得られた発光 量を 100%とした際に、 各種ルシフユラーゼを用いた発光試薬で得られた発光量 の相対比も表中に示した。 第 3表 細胞内 AT Pの測定
Ecoli ATCC 25922 S.aureus ATCC 25923
ΪΗ定 11 相対比 測定値 相対比
(RLU) (%) (RLU) (%) 從来法
132794 (100.0)
(TCA抽出法) 130220 (100.0) ァ刈カ本'タ Mシフ Iラ -セ' 153 (0.1) 163 (0.1) ゲ '本'タルルシフ Iラ -セ' 463 (0.3) 659 (0.5) ヘイケ本'タルルシフェラ-セ' 76082 (57.3) 74019 (56.8) ヘイケ 1変異体 47655 (35.9) 50031 (38.4) ヘイケし変異体 46217 (34.8) 51243 (39.4)
HIK 97073 (73.1) 76533 (58.8)
HLK 87981 (66.3) 72182 (55.4) 第 4表 細胞内 ATPの測定
P.aeruginosa ATCC 27853 E.faecaJisATCC29212
¾定法 Sお M*
V" * wノ (RLU) ( \%)/
絲法
168141 (100.0) 12427 (100.0) ァ刈 'タル Aシフ Iラ-セ' 553 (0.3) 113 (0.1) ゲ '本'タルルシフ Iラーせ' 1503 u · ノ 163 1 · ノ lt'タルシフ Iラ-セ. 117096 (69.6) 8132 (65.4) ヘイケ 1変異体 80455 (47.8) 4586 (36.9) ヘイケし変異体 81069 (48.2) 4762 (38.3)
HIK 131134 (78.0) 7914 (63.7)
HLK 131815 (78.4) 7998 (64.4)
アメ リカボタルルシフヱラーゼを用いた発光試薬は全く発光せず、 またゲンジ ボタルルシフヱラーゼの場合も微弱な発光しか示さなかった。 これは、 ルシフヱ ラーゼ自体が界面活性剤により失活してしまったためである。 従って、 これらの ルシフヱラーゼには、 ATP抽出用試薬として本検討で用いたような高濃度の界面 活性剤は使用出来ないことが示された。
—方、 ヘイケボタルルシフヱラ一ゼの場合、 アメ リカボタルルシフヱラーゼゃ ゲンジボタルルシフヱラーゼと異なり、 TCA抽出法の 6〜7割程度の発光が認め られた。 ヘイケボタルルシフヱラ一ゼは、 アメ リカボタルルシフヱラーゼゃゲン ジボタルルシフヱラーゼより高い界面活性剤耐性を有することが示された。 耐熱性へィケボタルルシフヱラ一ゼであるへィケ I変異体およびへィケ L変異 体の場合、 得られた発光量は TCA抽出法の 4割前後であり、 野性型のへィケボタ ルルシフエラーゼの場合を大きく下回つた。
ところで、 本発明の界面活性剤耐性ルシフヱラーゼ、 すなわち H I K及び HL Kの場合、 得られた発光量は野性型ヘイケボタルルシフユラ一ゼ及び耐熱性ルシ フヱラーゼを上回るものであった。 また、 この場合の発光量は、 TCA抽出法の 6 〜 8割であった。 1111:及び^1 1^は、 ヘイケ I変異体およびへィケ L変異体の 490位の Glu を Lys に置換したものである。 490位のアミノ酸への変異の導入により、 界面活 性剤に対する耐性が向上したものと考えられる。 従って、 1111^及び^1 1^は、 本検討で用いたような高濃度の ATP 抽出用試薬に対しても感度低下は少ないので、 これらを用いることにより、 精度の高い測定が可能であることが示された。 産業上の利用可能性
本発明にかかわる界面活性剤に耐性を有する新規なルシフェラーゼは、 それを 用いて細胞内 A T Pを測定することにより界面活性剤が高濃度に存在する場合で もルンフニラーゼ活性が低下することなく細胞内 A T Pを測定することができる c 本明細書で引用する全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書に取り入れるものとする。 配列表フリ一テキスト
配列番号 1 :合成 DNA
配列番号 2 :合成 DNA

Claims

請 求 の 範 囲
1. 界面活性剤に耐性を有するルシフェラーゼ。
2. ホタルルシフヱラーゼのアミノ酸配列において、 ゲンジボタルもしくはヘイ ケボタルのルシフヱラーゼの 490位と同等位置のァミノ酸が、 グルタミン酸以 外の他のァミノ酸に置換されたものである、 請求の範囲第 1項記載のルシフヱ ラーゼ。
3. グルタミン酸以外の他のアミノ酸がリジンである、 請求の範囲第 2項記載の ルシフェラーゼ。
4. 以下の (a) 又は (b) からなる請求の範囲第 1項記載のルシフヱラーゼ。
(a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド
(b) (a) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ 酸が付加、 欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつ界面活性剤に 耐性を有するルシフェラーゼ活性を有するポリベプチド
5. 以下の (a) 又は (b) からなる請求の範囲第 1項記載のルシフェラ一ゼ。
( a ) 配列番号 6で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド
(b) (a) のポリペプチドにおいて 1若しくは複数のアミノ酸が付加、 欠失 若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつ界面活性剤に耐性を有するル シフヱラーゼ活性を有するポリべプチド
6. 請求の範囲第 1項乃至第 5項のいずれかの項記載のルシフユラーゼをコ一ド する、 ルシフヱラーゼ遺伝子。
7. 請求の範囲第 6項記載のルシフエラーゼ遺伝子を含む組換ベクタ一。
8. 請求の範囲第 7項記載の組換ベクタ—を含む形質転換体。
9. 請求の範囲第 8項記載の形質転換体を培地に培養し、 得られる培養物からル シフヱラーゼを採取することを特徵とするルシフェラ一ゼの製造法。
1 0. 細胞を含む試料から界面活性剤の存在下に AT Pを抽出する第 1工程、 該 A T P抽出液にルシフ ラーゼを含む発光試薬を添加して発光させる第 2工程 および該発光量を検出する第 3工程を含む細胞内 ATPの測定法において、 ル シフヱラ一ゼとして、 界面活性剤に耐性を有するルシフヱラ一ゼを使用するこ とを特徴とする細胞内 A T Pの測定法。
1. 界面活性剤に耐性を有するルシフェラ一ゼが請求項 1乃至 5のいずれかの 項記載のルシフヱラーゼであることを特徴とする、 請求の範囲第 1 0項記載の 細胞内 AT Pの測定法。
2. 発光試薬の添加による発光が、 0.01%以上の界面活性剤の存在下で行なわ れる請求の範囲第 1 0項または第 1 1項に記載の細胞内 A TPの測定法。 3. 界面活性剤がカチオン系界面活性剤、 ァニオン系界面活性剤、 非イオン系 界面活性剤、 ツイッターイオン系界面活性剤のいずれかである請求の範囲第 1 0項、 第 1 1項または第 1 2項に記載の細胞内 AT Pの測定法。
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