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WO1999035287A1 - Sondes pour detecter un acide nucleique cible, procede de detection d'un acide nucleique cible, et phase solide pour detecter l'acide nucleique cible et procede de production de ce dernier - Google Patents

Sondes pour detecter un acide nucleique cible, procede de detection d'un acide nucleique cible, et phase solide pour detecter l'acide nucleique cible et procede de production de ce dernier Download PDF

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Publication number
WO1999035287A1
WO1999035287A1 PCT/JP1999/000041 JP9900041W WO9935287A1 WO 1999035287 A1 WO1999035287 A1 WO 1999035287A1 JP 9900041 W JP9900041 W JP 9900041W WO 9935287 A1 WO9935287 A1 WO 9935287A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
probe
nucleic acid
target nucleic
base sequence
solid phase
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/000041
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Satoshi Abe
Hirofumi Kodama
Original Assignee
Laboratory Of Molecular Biophotonics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratory Of Molecular Biophotonics filed Critical Laboratory Of Molecular Biophotonics
Priority to EP99900152A priority Critical patent/EP1016731A1/en
Publication of WO1999035287A1 publication Critical patent/WO1999035287A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the present invention relates to a target nucleic acid detection probe, a target nucleic acid detection method, a target nucleic acid detection solid phase, and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a probe for detecting a target nucleic acid having a specific polynucleotide sequence, a detection solid phase thereof, a method for producing the solid phase, and a method for detecting a target nucleic acid having a specific polynucleotide sequence.
  • a problem common to such a hybridization method is a low ability to recognize a base sequence. That is, since nucleic acid interaction based on hybridization can sufficiently occur even if there is some mismatch between sequences, it is not sufficient as a method for detecting only a nucleic acid having a strictly specific base sequence. Disclosure of the invention The present invention solves the above problems, provides a target nucleic acid detection probe for easily and quickly detecting a target nucleic acid, has a high recognition ability, a target nucleic acid detection solid phase, a method for producing the same, and a target nucleic acid. It is to provide a detection method.
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above-mentioned drawbacks of the conventional hybridization method, and have found a target nucleic acid detection probe having a novel structure and a target nucleic acid detection solid phase having such a probe immobilized on a solid phase.
  • the present invention has been successfully completed, and the present invention has been completed by successfully initiating a target nucleic acid detection method using such a probe or solid phase.
  • the present invention provides the following 1 to 8 target nucleic acid detection probes.
  • One set of target nucleic acid detection probes One set of target nucleic acid detection probes.
  • One set of target nucleic acid detection probes One set of target nucleic acid detection probes.
  • the probe 2 further has a spacer between the solid-phase fixing portion and the cutting portion, or
  • the probe 1 further has a spacer between the solid-phase fixing part and the cutting part, or
  • the target nucleic acid detection probe according to any one of the above 1. or 3., wherein the probe 2 further has a label portion between the 5 ′ end of the base sequence B 2 and the cleavage portion.
  • Target nucleic acid detection probe the position where the label portion is provided is not limited to the position between the 5 ′ end of the base sequence B2 and the cleavage portion, and includes the case where the label portion is provided in the base sequence B2 by various bonding forms. (The same applies to 13, 13 and 21 below.)
  • the probe for detecting a target nucleic acid according to any one of the above 2 or 4, wherein the probe 1 further has a labeling portion between the 3 ′ end of the base sequence B1 and the cleavage portion.
  • a probe for detecting a target nucleic acid is not limited to the position between the 3 ′ end of the base sequence B1 and the cleavage portion, and includes the case where the label portion is provided in the base sequence B1 by various bonding forms. (The same applies to 14. and 22.)
  • a target nucleic acid detection probe wherein the cleavage portion has a disulfide bond.
  • the probe for detecting a target nucleic acid according to any one of the above 5. or 6., wherein the labeled portion has digoxigenin.
  • the present invention also provides a solid phase for detecting a target nucleic acid described in 9 to 16 below.
  • Target nucleic acid detection solid phase
  • Probe 2 having a base sequence B 2 complementary to A 2 of the base sequence A 1 A 2, wherein a second solid-phase immobilized portion is bound to the 5 ′ end of the base sequence B 2 was fixed to the surface by the second solid-phase fixing portion, Target nucleic acid detection solid phase.
  • the probe 2 further has a spacer between the second solid-phase fixing portion and the cutting portion, or
  • the probe 1 further has a spacer between the first solid-phase fixing portion and the cutting portion, or (b) the probe 2 has the second solid-phase fixing portion.
  • a solid phase for detecting a target nucleic acid further comprising a spacer between the base sequence and the 5 ′ end of the base sequence B2.
  • a solid phase for detecting a target nucleic acid comprising:
  • a solid phase for detecting a target nucleic acid comprising:
  • a solid phase for detecting a target nucleic acid wherein the cleavage portion has a disulfide bond.
  • the present invention provides a method for detecting a target nucleic acid described in the following 17. to 25.
  • a first step of immobilizing the probe 2 on the surface of the solid phase with the second solid phase immobilization section is
  • (E) a fifth step of detecting the probe 1 formed by the third step, wherein the probe 1 has the nucleotide sequence B2 of the probe 2 and the cleavage site bound thereto, the method comprising the steps of: Method.
  • a cleavage site is bound to the 3 terminal of the base sequence B1, and
  • the probe 2 further has a spacer between the second solid-phase fixing portion and the cutting portion, or
  • the probe 1 further has a spacer between the first solid-phase fixing portion and the cutting portion, or
  • the present invention provides a method for producing a solid phase for detecting a target nucleic acid described in the following 26. to 28.
  • (C) a third step of removing the target nucleic acid from the hybrid.
  • (C) a third step of removing the target nucleic acid from the hybrid body.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a target nucleic acid detection probe according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the target nucleic acid detection probe according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the method for producing a nucleic acid detection solid phase according to the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a cleavage part of the probe for detecting a target nucleic acid according to the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of a cleavage portion of the probe for detecting a target nucleic acid according to the present invention.
  • FIG. 8A is a schematic diagram showing a direct fluorescence detection method which is one embodiment of the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention shown in Example (12).
  • FIG. 8B is a schematic diagram showing a direct fluorescence detection method which is an embodiment of the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention shown in Example (13).
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the digoxigenin-fluorescent antibody method, which is one embodiment of the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention described in Example (10).
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the digoxigenin-enzyme antibody method (fluorescence), which is one embodiment of the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention shown in Example (11).
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing the digoxigenin-enzyme antibody method (chemiluminescence), which is one embodiment of the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention shown in Example (14).
  • the probe for detecting a target nucleic acid according to the present invention comprises one set of two types of probes (hereinafter referred to as probe 1 and probe 2). Further, the solid phase for detecting a target nucleic acid according to the present invention is obtained by immobilizing the two kinds of probes according to the present invention on a solid phase surface while maintaining an appropriate spatial arrangement. Further, the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention is to detect a target nucleic acid with high sensitivity and high recognition using the solid phase for detecting a target nucleic acid. Further, the method for producing a solid phase for detecting a target nucleic acid according to the present invention is a method for producing such a solid phase for detecting a target nucleic acid.
  • FIG. 1 type 1
  • FIG. 2 type 2
  • the difference in the structure of the probe shown in Figures 1 and 2 is that the cut (or label) described below is introduced into probe 1 or probe 2. is there. Therefore, in the type 1 shown in FIG. 1, a cleavage portion (or further a labeling portion) is bonded to the terminal 5 of the base sequence B2 of the probe 2. On the other hand, in the type 2 shown in FIG. 2, a cleavage portion (or a labeling portion) is bonded to the 3, terminal of the nucleotide sequence B1 of the probe 1.
  • FIGS. 1 type 1
  • FIG. 2 type 2
  • probes 1 and 2 further schematically show a target nucleic acid to be detected, which has a specific continuous base sequence A1A2.
  • Both type 1 and type 2 probes 1 and probe 2 have a base sequence (B 1, B 2) that can hybridize continuously with A 1 A 2.
  • B 1, B 2 base sequence
  • the 5 'end of probe 1 is phosphorylated so that these probes are bound by the ligase reaction (indicated by P in the figure).
  • Type 1 and type 2 have no essential differences in the operation, detection method, and results obtained in the detection of target nucleic acid.
  • type 1 (Fig. 1) probes 1, 2 2 will be described.
  • Probe 1 and probe 2 each have a solid-phase fixing portion for immobilization on an appropriate solid-phase surface.
  • Such a solid phase immobilization section enables the probe 1 and the probe 2 to be immobilized so as to take a preferable spatial position on the surface of the solid phase.
  • the probe 1 or the probe 2 can have a spacer which is not affected by the above-mentioned hybridization, ligase reaction and cleavage reaction.
  • a spacer is mainly used for adjusting the distance from the surface of the solid phase so that the reaction of immobilizing the probe on the solid phase according to the present invention and the detection reaction described below proceed more efficiently. It is used for.
  • the probe 2 has a group that can be selectively cleaved by an appropriate chemical, enzymatic, or physical means (hereinafter, a cleavage portion).
  • the probe 2 has, if necessary, a label portion for enabling a combination with various detection methods described below.
  • FIG. 3 schematically shows a preferred example of the target nucleic acid detection solid phase and the method for producing the same according to the present invention. According to such a method, the spatial position of the probe 1 and the probe 2 immobilized on the solid phase enables a stable hybrid body of the target nucleic acid and the probes 1 and 2 to be formed.
  • FIGS. 4 and 5 show a method for detecting a target nucleic acid using the detection solid phase according to the present invention.
  • An example of the method is schematically shown. That is, when the target nucleic acid detection solid phase is mixed with the target nucleic acid, the target nucleic acid efficiently forms a hybrid with the probes 1 and 2 on the solid phase surface. Further, probes 1 and 2 are bound by a ligase reaction. At this time, only the probes 1 and 2 which correctly form the hybrid form are bound due to the high recognition property of the ligase reaction.
  • the probe bound by the ligase reaction shows a cyclic structure on the solid phase. Further, the probe not bound by the ligase reaction returns to the original state on the solid phase. Further, the probe 2 is released directly from the solid phase by the reaction of cleaving (cleaving) the cleavage portion, but at this time, the probe 2 bound to the probe 1 by the ligase reaction is not released into the solution. . On the other hand, the probe 2 that did not bind to the probe 1 by the ligase reaction is released into the solution and removed.
  • FIG. 5 schematically shows another example of a method for detecting a target nucleic acid using the detection solid phase according to the present invention. That is, as shown in FIG. 4, a method for performing a reaction for cutting the cut portion after forming a hybrid body and performing a ligase reaction in the same manner as in FIG. 4 and then performing an operation for removing the target nucleic acid was shown. In this method, as in FIG.
  • probe 2 bound to probe 1 by the ligase reaction was not released into the solution, and probe 2 not bound to probe 1 by the ligase reaction. Will be liberated and removed in the solution.
  • detecting that the protein 2 bound by the ligase reaction remains on the solid phase means that the ligase reaction has occurred, that is, the target nucleic acid has It indicates that it existed.
  • Various methods can be used for detecting that the probe 2 linked by the ligase reaction remains on the solid phase. Further, it is also possible to detect that the probe 2 not linked by the ligase reaction does not remain on the solid phase. No reaction occurred, indicating that the target nucleic acid was not present.
  • Various methods can be used to detect that the probe 2 not linked by the ligase reaction does not remain.
  • the type of nucleic acid (target nucleic acid) having a specific polynucleotide sequence detectable by the present invention is not particularly limited, and can be applied to various nucleic acids (DNA, RNA, oligonucleotides, etc.). Also, the length of the target nucleic acid is not particularly limited, and the target nucleic acid itself or a nucleic acid prepared to an appropriate length by appropriate treatment can be used according to the purpose.
  • the present invention uses two types of probes having a base sequence capable of hybridizing with a specific polynucleotide sequence in a target nucleic acid to be detected.
  • the specific polynucleotide sequence needs to be known in advance. There is.
  • the number of bases of the specific polynucleotide sequence known in advance is not particularly limited. However, (1) sufficient hybridization with the probe according to the present invention is possible, and (2) ligating described below. It is necessary to have a sufficient number of bases to bind the probe by the enzyme reaction. The number of such bases depends on the type and number of bases of the probe used and the type and number of bases of a specific polynucleotide sequence of the target nucleic acid, but it is easy for those skilled in the art to find the optimum number of bases.
  • the number of bases should be at least 20 and more preferably 30 or more. If the number of bases is too large, it is not preferable because of difficulty in synthesizing and handling the probe.
  • At least one of the above-mentioned specific polynucleotide sequence portions is required for hybridization with the probe of the present invention.
  • it is necessary to be a chain, it can be easily formed into a single chain by ordinary known means (method such as heat or alkali denaturation, treatment with low salt concentration).
  • the probe according to the present invention has a set of two types of probes (probe 1 and probe 2). ). Describing the type 1, the probe 2 has at least a solid-phase immobilization part, a target recognition part, and a cleavage part. Further, the probe 1 has at least a solid-phase immobilization part and a target recognition part. Further, if necessary, probe 1 or probe 2 can have a spacer. Further, if necessary, the probe 2 has a label portion used for detection.
  • the structures of the probes 1 and 2 of type 1 according to the present invention can be specifically configured as follows.
  • Oligonucleotides B1 and B2 having a nucleotide sequence complementary to A1 and A2 are determined and used as nucleotide sequences for recognizing the nucleotide sequences of probe 1 and probe 2, respectively.
  • a solid-phase immobilized part is bound to the 5 'end of B2 of probe 2 via a cleavage part.
  • the solid-phase immobilization part is not particularly limited as long as it is a group for immobilizing the probe on the surface of the solid phase. Not done.
  • the fixation may be maintained in the process used in the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention.
  • Specific examples include a binding group by a normal chemical reaction and a binding group by various interactions.
  • a group capable of forming a covalent bond with an active group (eg, a hydroxyl group, a carboxylic acid group, an amino group, etc.) on the surface of the solid phase can be selected as a binding group by a normal chemical reaction.
  • Specific examples include ester, ether, amide, and thioamide bonds. Examples of various interactions include a binding effect between a protein and a ligand.
  • biotin / avidin can be preferably selected.
  • avidin or streptavidin
  • Such a solid phase can be prepared by an ordinary known method.
  • a normal binding reaction can be preferably used.
  • the phosphoramidite method is applicable.
  • B 1 and B 2 recognizing the target nucleic acids of probes 1 and 2 have a base sequence complementary to the specific polynucleotide sequence portion of the target nucleic acid, and have the specific polynucleotide sequence portion A 1 It can be hybridized continuously with A2.
  • the number of base sequences of each probe is not particularly limited, but in the present invention, the number of base sequences is about 10 or more, preferably 15 or more. When the number of bases is small, there is no sufficient specific recognition effect, and the ligase reaction becomes difficult. If the amount is too large, problems arise in handling and storage.
  • the cleavage portion according to the present invention is not particularly limited as long as it is a group that can be selectively cleaved under various appropriate reaction conditions (chemical reaction, enzyme reaction, physicochemical reaction). Such selection depends on the conditions of the cleavage reaction, the group of the cleavage part formed as a result of the cleavage reaction (if the group is the same or different), and the detection method using various labeling parts. More possible.
  • the conditions of the cleavage reaction are not particularly limited, and ordinary chemical reaction, photoreaction, enzymatic reaction and the like can be selected.
  • FIGS. (1) Some preferred examples of the cutting portion in the present invention are shown in FIGS. (1), shown together with FIG.
  • the cutting method is preferable because various reducing agents can be used.
  • Specific examples include dithiothreitol (DTT).
  • the cleavage method is preferable in that various basic reagents can be used.
  • C (D)
  • E (E)
  • the cleavage site is an amide bond (including a thioamide bond, not shown), an ester bond, or an ether bond.
  • cleavage by various chemical reactions cleavage by various chemical reactions, cleavage by light reaction, cleavage by enzymatic reaction (for example, beptidase, esterase) and the like are possible.
  • enzymatic reaction for example, beptidase, esterase
  • hydrolysis is mentioned, and the ether bond of the type (E) can be easily cleaved by a photoreaction.
  • the cut portions of the types (C), (D) and (E) can generate a specific cut end on one side after the cleavage reaction. Therefore, after the cleavage reaction, only a specific cleavage end can be further labeled by various reactions and used for detection.
  • Peroxides include organic peroxides (eg, peracetic acid) and inorganic peroxides (eg, hydrogen peroxide).
  • the recognition portion of the target nucleic acid is other than the RNA sequence, for example, a DNA sequence. In such a case, cleavage by ribonuclease is possible.
  • the recognition portion of the target nucleic acid must be other than a DNA sequence, for example, an MA sequence.
  • a DNA sequence for example, an MA sequence.
  • cleavage with a deoxyribonuclease is possible.
  • FIG. 7 shows a cutting method in a case where the cut portion is deoxyperidine.
  • peracyl DNA glycosidase a type of DNA repair enzyme that catalyzes the reaction that removes peracyl from single- or double-stranded DNA generated by the incorporation of dUTP or the deamination of cytosine during DNA replication
  • it is possible to cut by heating under alkaline conditions generating a cut end with aldehyde on one side and phosphoric acid on the other side).
  • the label portion according to the present invention is obtained by introducing a label group suitable for combination with a detection means into the above-mentioned probe, and whether the label group is present on the solid phase after the cleavage reaction (or not). Is to be detected. Therefore, the label group is not particularly limited, and various kinds of groups that achieve the object can be selected and used. There is no particular limitation on the method for introducing such a labeling portion, and a generally known method for labeling a nucleic acid can be easily and appropriately applied.
  • labeling of digoxigenin can be mentioned as one utilizing an antigen-antibody reaction.
  • a commonly used method can be used for labeling with digoxigenin.
  • labeling using fluorescent dyes for example, BODIPY493 / 503, Rhodamine Red or TEXAS Red
  • fluorescent beads can be mentioned as those utilizing fluorescence.
  • Labeling with a fluorescent dye can be easily introduced by reacting a succinimide ester derivative of a fluorescent dye with an amino group previously introduced into an oligonucleotide used for probe synthesis, and a commercially available kit is used for this purpose. Available at Labeling with fluorescent beads can be achieved by chemically binding the fluorescent beads to a probe.
  • labeling with a radioisotope may be mentioned.
  • phosphate groups are introduced for the ligase reaction.
  • the probe can be radioisotope labeled by using 32 P.
  • cut portions form different groups after being cut (for example, cut portions of types (C), (D), and (E) in FIG. 6), the chemical structure of the cut end is changed. It is also possible to introduce a label (label group) for detection selectively after cleavage based on the nature ⁇
  • each probe can be further provided with a spacer as described below.
  • a spacer By providing such a spacer, the efficiency of the hybridization can be improved, or the cleavage reaction at the various cutting portions described above, and further, various detection methods and the like usable in the present invention can be optimized and made more efficient. Can be achieved. Specifically, by introducing a spacer having an appropriate length between the solid-phase fixing portion and the cutting portion, the cutting reaction at the cutting portion can be efficiently performed.
  • the base sequence of the target nucleic acid can be improved.
  • A1 A2 The efficiency of hybridization to the base sequence B1 and B2 of the target nucleic acid by separating the base sequence B1 and B2 of the probe 1 and probe 2 that can hybridize with the base sequence from the solid phase surface Can be achieved.
  • the spacer there is no particular limitation on the type, shape, etc. of the spacer that can be preferably used here. It is sufficient that the probe has sufficiently strong binding properties under the conditions for hybridizing the above two types of probes and the target nucleic acid, the washing operation involved, and the operation for removing the target nucleic acid.
  • Specific examples include oligonucleotides, oligopeptides, alkylene chains, and the like.
  • oligothymidine can be preferably used, and the required length can be easily obtained by the number of thymidine.
  • an alkylene chain having an appropriate number of carbon atoms can be preferably used.
  • the method for introducing the spacer is not particularly limited, and various known binding reactions can be used. Specifically, it can be easily carried out by using the usual phosphoramidite method of oligonucleotide synthesis. (Detection solid phase)
  • the detection solid phase is a solid phase medium in which the two types of probes described above are bonded adjacently on the surface thereof.
  • the bonding density, etc. and bonding at various densities can be used.
  • the type of the solid phase medium there is no limitation on the type of the solid phase medium.
  • an inorganic substance solid medium or an organic substance solid medium can be used.
  • Specific examples of the inorganic substance solid medium include various metal films (for example, a sensor chip used in a surface plasmon resonance device), silica gel, alumina, glass, quartz, and the like.
  • the organic solid phase medium include nitrocellulose membranes, nylon membranes, and plastic materials such as polystyrene and polyethylene. It is also possible to use those having carboxymethyl dextran or the like bonded to their surfaces. In the present invention, it is particularly preferable to use a polystyrene resin plate or quartz glass.
  • the solid phase for detection according to the present invention is one in which two types of probes are immobilized on a solid phase so as to have a specific spatial arrangement. That is, the probe is a spatial arrangement in which the probe continuously hybridizes with a specific polynucleotide sequence of the target nucleic acid and can be further linked by an enzyme reaction.
  • the method for producing a solid phase for detection by immobilizing a probe in the specific spatial arrangement described above includes, for example, mixing the two types of probes in advance so as to have a preferable concentration, and mixing the mixture with the surface of the solid phase for detection. There is a method of reacting and binding at the solid phase fixed part. In this case, two types of probes are obtained that are randomly bonded to the solid phase surface. In this case, very few of the above two types of spatial arrangements that have a spatial arrangement that continuously hybridizes with a specific polynucleotide sequence of the target nucleic acid and can be linked by an enzymatic reaction are used. it is conceivable that.
  • the following means can be preferably used as a method for immobilizing more than one set of probes in a preferable spatial arrangement on a solid phase (FIG. 3). That is, two types of probes are first mixed with a target nucleic acid and hybridized. The resulting hybrid is allowed to undergo a binding reaction on a solid phase for detection, and the hybrid is fixed. After washing the solid phase sufficiently, the target nucleic acid is removed from the hybrid by heat or by a manual treatment. By such an operation, the two kinds of probes are immobilized on the solid phase so that their spatial arrangement is preferable for hybridizing with the target nucleic acid.
  • the conditions for hybridizing a set of probes according to the present invention and a target nucleic acid are not particularly limited, and ordinary conditions can be used. For example, it can be used according to the method described on page 172 of the “Molecular Biology Experiment Manual” (supervised by Masaya Kawakami; Kodansha) or modified.
  • the conditions for removing the target nucleic acid from the formed hybrid and forming a single strand are not particularly limited, and generally known conditions can be preferably used. For example, alkali treatment, heat treatment, acid treatment, or the like is used.
  • an enzyme that can be used to bind a set of two types of probes includes, for example, ligase.
  • the type of ligase and reaction conditions are not particularly limited, and various known ligase reactions can be used based on ordinary selection.
  • T4 DNA ligase manufactured by Takara Shuzo
  • Ampligase manufactured by EP ICENTER TECHNOLOGIES
  • Pfu DNA ligase manufactured by STRATAGENE
  • the target nucleic acid can be removed by various operations (for example, heat treatment, alkali treatment, acid treatment, etc.).
  • the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention uses the solid phase for detection according to the present invention, wherein a set of probes on the solid phase for detection is hybridized continuously with a specific polynucleotide sequence of the target nucleic acid.
  • the soybean is used to form a ligated product obtained by binding the above two types of probes to the resulting hybrid by a ligase reaction. If the base sequence of the target nucleic acid is different and the probe is erroneously recognized, the ligase reaction will not cause the formation of the above-mentioned conjugate, and after removing the target nucleic acid by alkali treatment or the like, the above-mentioned probes will be ligated. Instead, each end will be present, and the set of props will return to their original state.
  • the present invention further utilizes a cleavage reaction of a probe cleavage portion after removing a target nucleic acid by alkali treatment or the like. That is, when the above-described conjugate is formed, the pair of probes according to the present invention remains on the solid phase in a linked state by the cleavage reaction. On the other hand, if the base sequence of the target nucleic acid is different and the probe is erroneously recognized, the formation of the above-mentioned conjugate does not occur by the ligase reaction. Since the set of probes returns to the initial state, one of the set of probes according to the present invention is released into the solution by the cleavage reaction of the cleavage portion and does not exist on the solid phase.
  • the same operation may be carried out after the ligase reaction, by first performing a cleavage reaction of the cut portion of the probe, and then performing the removal of the target nucleic acid by an aliquot treatment or the like. Can be.
  • a conjugate is formed by the ligase reaction, one set of probes remains on the solid phase in a linked state, and the base sequence of the target nucleic acid is different. If the probe is erroneously recognized, one of the pair of probes according to the present invention is released in the solution and does not exist on the solid phase.
  • the present invention detects whether or not the ligase reaction has occurred by detecting the probe present on the solid phase after the cleavage reaction, and determines whether or not the target nucleic acid is present based on the result. Can be determined.
  • the ligase reaction used in the present invention has extremely high base specificity, and the method according to the present invention can reduce the degree of misrecognition (mismatch) to an extremely low level. It is what becomes.
  • the label (antigen, enzyme, fluorescence, radioisotope, etc.) bound to the conjugate.
  • the labeled portion is an antigen, it can be confirmed by recognizing with an enzyme-linked antibody and detecting the color development of the substrate by the enzyme.
  • the decrease in the mass of the nucleic acid present on the solid phase can be detected by, for example, a surface plasmon resonance method, thereby confirming the decrease in the probe.
  • the synthesis of the nucleic acid was generally performed using an automatic nucleic acid synthesizer based on a phosphoramidite solid-phase synthesis method, and purified by ion-exchange HPLC (purity of 99% or more).
  • B0DIPY493 / 503 Rhodamine Red, TEXAS Red and antigen digoxigenin were added to the amino group introduced into the oligonucleotide chain by Uni-Link Amino Modifier.
  • Rhodamine Red-X succ inimidyl ester Rhodamine Red-X succ inimidyl ester, TEXAS Red-X succinimidyl ester (also available from Molecular Probes) or Digoxigenin-3-0-methyl-carbonyl- ⁇ -aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimide ester (Boehringer's Mannheim ) The reaction was performed according to the method. (Example)
  • Probe 2A 5 (biotin) -GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3, consisting of a 20-base oligonucleotide whose 5 ′ end was biotinylated, was automatically synthesized by a conventional phosphoramidite solid-phase synthesis method.
  • Probe consisting of a 22-base oligonucleotide with a disulfide bond (indicated as [SS]) introduced with a 5,5 terminal end that is biotinylated.
  • [SS] disulfide bond
  • 2B 5,-(Potin) -TT- [SS]- GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3 'was synthesized automatically by the usual phosphoramidite solid phase synthesis method.
  • Probe consisting of a 25-nucleotide oligonucleotide with the terminal biotinylated and a disulfide bond introduced 2C, 5,-(pyotin) -TTTTT- [SS] -GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3 was automatically synthesized by a conventional phosphoramidite solid-phase synthesis method.
  • Probe consisting of 30 nucleotides oligonucleotide with a terminally biotinylated disulfide bond 2D, 5,-(biotin)-TTTTTTTTTT-[SS]-GGTGGCGGCCGCTCTAGMC-3 was synthesized automatically by the phosphoramidite solid phase synthesis method.
  • the probe 2A containing no disulfide bond showed an increase in 1487 resonance unit (a value representing the attenuation angle of reflected light in surface plasmon resonance, which reflects the change in mass on the solid surface).
  • an increase of 504 resonance units was observed for probe 2B containing a disulfide bond, an increase of 588 resonance units for probe 2C, and an increase of 935 resonance units for probe 2D.
  • the probe 2B, probe 2C and probe 2D probes containing disulfide bonds had lower amounts of immobilized probes compared to probe 2A without disulfide bonds due to DTT. This indicates that the disulfide bond was broken in the solution.
  • the probe (400 nM each) obtained in (1-1), (2), (1-3), and (4) was heated at 100 ° C for 5 minutes in IxSSPE, and immediately Cooled down. After reacting these probe solutions with a BIAcore sensor chip coated with streptavidin at 37 ° C for 5 minutes, 0.1% aqueous sodium dodecyl sulfate, lOmM sodium hydroxide aqueous solution and lOmM hydrochloric acid aqueous solution were added at 37 ° C. The reaction was continued for 1 minute at a time to remove probes that did not bind to the solid phase.
  • the surface plasmon shows the change in mass of the solid phase after a reaction at 37 ° C for 10 minutes in IxSSPE containing lOOmM DTT and the chip on which each probe was immobilized, prepared in (2-1).
  • Observation with a resonance measurement apparatus revealed that probe 2A containing no disulfide bond increased 31 resonance units, probe 2B containing disulfide bond decreased 544 resonance units, probe 2C decreased 495 resonance units, and probe 2C decreased 495 resonance units.
  • 2D showed a decrease of 313 resonance units. Except for probe 2A, the large decrease in the resonance unit in each probe 2B, probe 2C, and probe ID containing disulfide bonds indicates that the disulfide bonds were immobilized by DTT. Indicates that a disconnection was received above. (3) Detection of target nucleic acid (surface plasmon resonance)
  • (3-1) Probe consisting of a 20-nucleotide oligonucleotide whose terminal 3 'end is biotinylated and phosphorylated at 5, and 1,5,-(P) -TAGTGGATCCCCCGGGCTGC- (pyotin) 3, a normal phosphoramidite solid It was synthesized automatically by the phase synthesis method.
  • a target capable of holding one of probe 2A or probe 2B or probe 2C or probe 2D adjacent to probe 1 obtained in (3-1) A target nucleic acid A consisting of a 40-base oligonucleotide having the following sequence was synthesized as a nucleic acid.
  • Probe 2B, probe 1 and target nucleic acid A (400 nM each) or probe 2C, probe 1 and target nucleic acid A (400 nM each) were mixed in lxSSPE and denatured by heating at 100 ° C for 5 minutes. Thereafter, hybridization was carried out by keeping the mixture at 55 ° C for 10 minutes. The hybrid was diluted 10-fold with lxSSPE, reacted with a BIAcore sensor chip coated with streptavidin at 37 ° C for 5 minutes to solidify the probe, and then 0.1% aqueous sodium dodecyl sulfate was added.
  • the reaction was carried out with a 10 mM aqueous sodium hydroxide solution and a 10 mM aqueous hydrochloric acid solution at 37 ° C. for 1 minute, respectively, to dissociate the target nucleic acid A from the probe.
  • the target nucleic acid A (400 nM) was allowed to react in lxSSPE at 37 ° C for 5 minutes on the solid phase from which the target nucleic acid A holding the two probes adjacent to each other in (3-3) was dissociated.
  • T4 DNA ligase (Takara Shuzo, containing 3500 IU ligase per 1 ml) diluted with the attached reaction buffer was reacted at 37 ° C for 5 minutes on the solid phase where target nucleic acid A was hybridized in (3-4). Then, a 0.1% aqueous solution of sodium dodecyl sulfate, a 10 mM aqueous solution of sodium hydroxide, and a 10 mM aqueous solution of hydrochloric acid are sequentially reacted at 37 ° C for 1 minute, and the target nucleic acid A is purified. Dissociated from the probe.
  • Resonance sunit of the solid phase hybridized with target nucleic acid A was reduced in each of probe 2 B / probe 1 and probe 2 C / probe 1 compared to the solid phase in which target nucleic acid A was not hybridized. This was because probe 2B and probe 1 or both probe 2C and probe 1 were hybridized and retained adjacent to target nucleic acid A, and both probes were subjected to T4 DNA ligase. Due to the ligation of the probe, the target nucleic acid recognition sequence of probe 2B or probe 2C remains on the solid phase without being washed away even if the disulfide bond of probe 2B or probe 2C is cleaved by DTT. This is because a large change in mass on the phase did not occur. The above results indicate that the target nucleic acid can be detected by this method.
  • Probe 2A and probe 2E (400 nM each) were heated at 100 ° C. for 5 minutes in 1 ⁇ SSPE, and immediately cooled with ice. 1M DTT was added to each probe solution to a concentration of 100 mM, and left at 37 ° C for 10 minutes. Coated with streptavidin When the BIAcore sensor chip and the DTT-probe solution were reacted at 37 ° C for 5 minutes, the mass change of the solid phase was observed with a surface plasmon resonance measurement device. The probe 2 did not contain disulfide bonds. In A, an increase of 1377 resonance units was observed, whereas in probe 2E containing a disulfide bond, the increase was only 103 resonance units.
  • Probe 2E (400 nM) was heated in 1 ⁇ SSPE at 100 ° C. for 5 minutes and immediately cooled on ice. After reacting this probe solution with the avidin-coated BIAcore sensor chip prepared in (5-1) at 37 ° C for 5 minutes, 0.1% sodium dodecyl sulfate aqueous solution, lOmM sodium hydroxide aqueous solution, lOmM Washing was performed sequentially with an aqueous hydrochloric acid solution at 37 ° C. for 1 minute.
  • the chip immobilized with the probe 2E prepared in (5-2) was reacted with 1 ⁇ SSPE containing 100 mM DTT at 37 ° C. for 10 minutes. 0.1% sodium dodecyl sulfate aqueous solution, lOmM hydroxyl
  • the mass change of the solid phase was observed with a surface plasmon resonance measurement apparatus. This result indicates that the disulfide bond of probe 2E was cleaved on the solid phase by DTT.
  • a 1-base excess sequence consisting of a 41-base oligonucleotide with adenosine inserted between the 20th base and the 21st base from the 5 'end of target nucleic acid A,
  • 5'-GCAGCCCGGGGGATCCACTAAGTTCTAGAGCGGCCGCCACC-3 ' was automatically synthesized by a conventional phospho-mouth amidite solid-phase synthesis method.
  • 5'-GCAGCCCGGGGGATCCACTGTTCTAGAGCGGCCGCCACC-3 ' was automatically synthesized by a conventional phosphoramidite solid-phase synthesis method.
  • a 50 mM N-hydroxysuccinimide solution containing 200 mM l-ethyl 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide was mixed with a carboxymethyl dextran BIAcore sensor chip CM5 using a surface plasmon resonance spectrometer. After reacting at 37 ° C for 7 minutes, 10 mM acetate buffer (pH 5.0) containing 1 ml of avidin was reacted at 37 ° C for 1 to 8 minutes, and adjusted to pH 8.5 with aqueous sodium hydroxide. In the evening, the reaction was stopped by adding noramine hydrochloride at 37 ° C for 7 minutes.
  • Probe 2E, probe 1 and target nucleic acid A (400 nM each) were mixed in lx SSPE, denatured by heating at 100 ° C for 5 minutes, and then hybridized by keeping at 55 ° C for 10 minutes. This hybrid was diluted 10-fold with lx SSPE and reacted with the avidin-coated BIAcore sensor chip prepared in (6-3) at 37 ° C for 5 minutes.
  • the target nucleic acid A was reacted with the 0.1% sodium dodecyl sulfate aqueous solution, lOmM sodium hydroxide aqueous solution, and 10 mM hydrochloric acid aqueous solution at 37 ° C for 1 minute, and the target nucleic acid A was removed from the probe. Dissociated.
  • the target nucleic acid A and its mutant nucleic acid, a 1-base excess sequence and a 1-base deletion sequence are placed at different locations on the solid phase where the target nucleic acid A, which held two probes adjacent to each other in (6-4), was dissociated. (400 nM each) was reacted in lx SSPE at 37 ° C for 5 minutes, and the mass change of the solid phase was observed with a surface plasmon resonance spectrometer. As a result, an increase of 337 to 379 resonance units was observed. It was confirmed that the solid phase prepared in 4) hybridized with the target nucleic acid A and its mutant nucleic acid, ie, one base excess sequence and one base deletion sequence.
  • T4 DNA ligase diluted with the attached reaction buffer (3500 IU / ml ligase) was applied to the solid phase in which target nucleic acid A and its mutant nucleic acid, a 1-base excess sequence and a 1-base deletion sequence, were hybridized in (6-5).
  • target nucleic acid A and its mutant nucleic acid, a 1-base excess sequence and a 1-base deletion sequence were hybridized in (6-5).
  • a 0.1% aqueous solution of sodium dodecyl sulfate, an aqueous solution of lOmM sodium hydroxide, and an aqueous solution of lOmM hydrochloric acid at 37 ° C for 1 minute.
  • the target nucleic acid A and its mutant nucleic acid were dissociated from the probe.
  • the solid phase in which the target nucleic acid A was hybridized only reduced 54 resonance units.
  • the decrease in the number of resonance units in the solid phase in which target nucleic acid A was hybridized compared to the others was because both probe 2E and probe 1 hybridized to target nucleic acid A and were held adjacent to each other.
  • the target nucleic acid recognition sequence of probe 2E remains on the solid phase without being washed away even after the disulfide bond of probe 2E has been cleaved by DTT due to ligation by T4 DNA ligase. This is because no large change in mass occurred. This result indicates that a difference of one base in the sequence near the probe ligation of the target nucleic acid was recognized.
  • the end is biotinylated, digoxigenin modification (sometimes referred to as [DIG] in this specification or in the figure) is performed in the oligonucleotide chain, and two thymidines are introduced between biotin and digoxigenin.
  • Probe 2G 5,-(pyotin) -TT- [SS]-[DIG] -GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3 'was synthesized automatically by the usual phosphoramidite solid-phase synthesis method.
  • Probe 2F and probe 2G (500 pM each) were heated in lx SSPE at 95 ° C for 5 minutes and immediately cooled on ice.
  • the probe solution attached to Northern ELISA (Berlinga. Mannheim: ELISA kit for digoxigenin detection) 941 was added per well to a 96-well micro-tie evening plate coated with leptavidin, and reacted at 37 ° C for 30 minutes with shaking.
  • Probe consisting of a 20-base oligonucleotide 2H, 5 'with a biotinylated end, disulfide bond and digoxigenin modification in the oligonucleotide chain, and no thymidine introduced between biotin and disulfide bond -(Piotin)-[SS]-[DIG] -GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3 'was synthesized automatically by the usual phosphoramidite solid phase synthesis method.
  • (8-2) Probe consisting of a 25-base oligonucleotide in which the end is piotinized, the oligonucleotide chain is modified with disulfide bonds and digoxigenin, and five thymidines are introduced between the biotin and disulfide bonds.
  • 2I, 5,-(Piotin) -TTTT- [SS]-[DIG] -GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3 was automatically synthesized by a conventional phosphoramidite solid phase synthesis method.
  • Probe consisting of a 30-base oligonucleotide in which the 5 'end is biotinylated, disulfide bond and digoxigenin modification are performed in the oligonucleotide chain, and 10 thymidines are introduced between the biotin and disulfide bond.
  • 2 J 5,-(Piotin) -TTTTTTTTTT- [SS]-[DIG] -GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3 'was synthesized automatically by a conventional phosphoramidite solid-phase synthesis method.
  • Probe 2G, probe 2H, probe 2I and probe 2J (500 pM each) were heated in 1X SSPE at 95 ° C for 5 minutes and immediately cooled on ice. These programs The lobe solution was added to a 96-well microplate coated with streptavidin attached to Northern ELISA per 1 ⁇ l, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes with shaking.
  • Probe 2 J (10 thymidines) 4.3 19.1 100
  • probe 2H gave a value about 3 times (75%) higher at a DTT concentration of 100 mM and about 6 times (28%) at 500 mM. This indicates that the disulfide bond was not efficiently cleaved due to the lack of a sufficient spacer between the biotin and the disulfide bond.
  • Probe 1 probe 2 G, and target nucleic acid A (300 pM each) were mixed in lx SSPE, denatured by heating at 95 ° C for 5 minutes, and then hybridized by keeping at 55 ° C for 10 minutes. . 94 l of this hybrid was added to a 96-well microtiter plate attached with streptavidin attached to the Northern blotter, and the reaction was carried out at 37 ° C for 30 minutes with shaking. I let it. After washing each well three times with the washing solution 2501 attached to the nozzle, add 100 mM per well of 15 mM aqueous sodium hydroxide solution and react at 37 ° C for 30 minutes to prepare the target nucleic acid A. Dissociated from the probe.
  • each gel was washed three times with 250 2501 of a washing solution.
  • nucleic acid with 1 base excess sequence and 1 base deletion sequence shows the same value as the gel without added nucleic acid, and only target nucleic acid A is significantly larger The value was shown. This indicates that a single base difference in the sequence of the target nucleic acid in the vicinity of the open-end junction was recognized. From the results of this experiment, it was proved that the presence or absence of the target nucleic acid could be detected.
  • Probe 1 probe 2G and target nucleic acid A (500 nM each) were mixed in lxSSPE, denatured by heating at 95 ° C for 5 minutes, and then hybridized by keeping at 55 ° C for 10 minutes. This hybrid was coated with streptavidin. To a black 96-well micro-tie evening plate (Boehringer's Mannheim) was added 94 zl per gel and reacted at 37 ° C for 30 minutes with shaking.
  • a rhodamine-labeled anti-digoxigenin antibody (Behringer-'Mannheim: 100 1 containing 2 g of antibody per well) was added to the wells prepared in (10-4), and reacted at 37 ° C for 30 minutes. Thereafter, each gel was washed three times with a washing solution 250-1.
  • Target nucleic acid ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ gave a significantly larger value than when no nucleic acid was added.
  • the mutant nucleic acid, a single nucleotide excess sequence and a single nucleotide deletion sequence showed a value slightly larger than the value without the addition of the nucleic acid, but significantly smaller than that of the target nucleic acid A.
  • Probe 1 probe 2G and target nucleic acid A (each ⁇ ) were mixed in IxSSPE, denatured by heating at 95 ° C for 5 minutes, and then hybridized by keeping at 55 ° C for 10 minutes.
  • the hybrid body was added to a black 96-well microtie overnight plate coated with streptavidin at a ratio of 94/1 per well, and reacted at 37 ° C for 30 minutes with shaking. After washing each well three times with the washing solution 250 1 attached to the Northern ELISA, add 10 mM sodium hydroxide aqueous solution containing 0.1% sodium dodecyl sulfate 100/1 per well, and 37 C for 10 minutes After the reaction, the target nucleic acid A was dissociated from the probe.
  • Probe 1 probe 2K and target nucleic acid A (750 nM each) were mixed in lxSSPE, denatured by heating at 95 ° C for 5 minutes, and then hybridized by keeping at 55 ° C for 10 minutes.
  • the hybrid body was added to a black 96-well micro-tie overnight plate coated with streptavidin at 94 l / well, and reacted at 37 ° C for 30 minutes with shaking. After washing each well three times with the washing solution 250 / zl attached to the Northern ELISA, add 100 mM 20 mM aqueous sodium hydroxide solution per 1 ml and react at 37 ° C for 7 minutes to probe the target nucleic acid A. More dissociated.
  • each well to which the probe was immobilized in (12-2 add 100 ⁇ l per well of target nucleic acid A and its mutant nucleic acid, one nucleotide excess sequence and one nucleotide deletion sequence (1.5 / M each). After adding and reacting at 37 ° C for 30 minutes in lxSSPE, each gel was washed four times with 250 d of washing solution.
  • Probe 1 probe 2 L, and target nucleic acid A (1 ⁇ M each) were mixed in lx SSPE, denatured by heating at 95 ° C for 5 minutes, and then hybridized by keeping at 55 ° C for 10 minutes. .
  • This hybrid body was treated with streptavidin-coated black Was added to a 96-well micro-tie evening plate at 94 ° C. per 1 ⁇ l, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes with shaking. After washing each well three times with 250 L of the washing solution attached to the Northern ELISA, 20 mM sodium hydroxide aqueous solution was added per 1 mL, and reacted at 37 ° C for 7 minutes to dissociate the target nucleic acid A from the probe. .
  • Ampligase (100/1 containing 20 U ligase per well) diluted with the attached reaction buffer was added to the gel prepared in (13-3), and the mixture was reacted at 37 ° C for 30 minutes. After washing each well four times with 250 ⁇ of washing solution, add 100 mM per well of 20 mM sodium hydroxide aqueous solution and react at 37 ° C for 7 minutes to dissociate the target nucleic acid A and its mutant nucleic acid from the probe. did.
  • Probe 1 probe 2 G, and target nucleic acid A (each ⁇ ) were mixed in lxSSPE, denatured by heating at 95 ° C for 5 minutes, and then hybridized by keeping at 55 ° C for 10 minutes.
  • the hybrid body was added to a black 96-well microtie overnight plate coated with streptavidin at 94-1 per well, and reacted at 37 ° C for 10 minutes with shaking. After washing each well three times with the washing solution 250 ⁇ 1 attached to the Northern Elisa, add 100 1 of 20 mM aqueous sodium hydroxide solution per 1 ml, and react at 37 ° C for 5 minutes to convert the target nucleic acid A from the probe. Dissociated. (14-2) Hybridization of target nucleic acid A and its mutant nucleic acid
  • target nucleic acid A and its mutant nucleic acid a 1-base excess sequence and a 1-base deletion sequence (InM, respectively), at 100 ⁇ l / well. After reacting at 37 ° C. for 60 minutes in 1 ⁇ SSPE, each well was washed four times with 250 ⁇ 1 washing solution.
  • the wells prepared in (14-3) contain 400 mM DTT and 0.1% sodium dodecyl sulfate O.
  • IM Tris-HCl buffer pH 8.0
  • a target nucleic acid A complementary sequence consisting of 40 nucleotide oligonucleotides having a sequence complementary to target nucleic acid A, was automatically synthesized by a conventional phosphoramidite solid-phase synthesis method. .
  • Probe 1 probe 2M and target nucleic acid A (500 pM each) were mixed in IxSSPE, denatured by heating at 95 ° C for 5 minutes, and then hybridized by keeping at 55 ° C for 10 minutes. This hybrid was added to a 96-well micro-tie evening plate coated with streptavidin attached to Northern Elisa at 94 ⁇ l / well, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes with shaking. After washing each well three times with the washing solution 2501 attached to the Northern ELISA, 100 1 of a 20 mM aqueous sodium hydroxide solution was added per well, and reacted at 37 ° C for 5 minutes to dissociate the target nucleic acid A from the probe.
  • each well on which the probe was immobilized in (15-3) add 100/1 target nucleic acid A complementary sequence (each InM) consisting of target nucleic acid A and its complementary sequence. After the reaction at 37 ° C for 60 minutes, each well was washed four times with a washing solution 250 ⁇ 1.
  • the target nucleic acid A complementary sequence which is a mutant nucleic acid, showed a value equivalent to that of the wells to which no nucleic acid was added, and only the target nucleic acid A showed a significantly larger value. From the experimental results, it was proved that cleavage (cleavage) occurred even when the cleavage site was deoxyperidine, and that the presence or absence of the target nucleic acid could be detected by using a probe into which deoxyperidine was introduced as the cleavage site.
  • Probe 1 probe 2 G and target nucleic acid A (each InM) were mixed in 1 x SSPE, denatured by heating at 95 ° C for 5 minutes, and then hybridized by keeping at 55 ° C for 10 minutes. .
  • This hybrid was added per well to a black 96-well microtie overnight plate coated with streptavidin, and reacted at 37 ° C for 10 minutes with shaking. After washing each well twice with 250 jl of the washing solution attached to Northern Elisa, 20 mM aqueous sodium hydroxide solution was added at 100-1 per well, and the reaction was carried out at 37 ° C for 5 minutes to dissociate the target nucleic acid A from the probe. .
  • target nucleic acid B (100 bases) gave a significantly larger value compared to the absence of nucleic acid, another sequence other than the sequence recognized by the probe was not included in the target nucleic acid. It was proved that even if it was included, it could be detected.
  • Probe 1 probe 2G, and target nucleic acid A (each InM) were mixed in lxSSPE, denatured by heating at 95 ° C for 5 minutes, and then hybridized by keeping at 55 ° C for 10 minutes. This hybrid was added to a black 96-well microtiter evening plate coated with streptavidin at 90 ⁇ 1 per well, and reacted at 37 ° C for 10 minutes with shaking. After washing each gel four times with the washing solution 250/1 supplied with Northern Elisa, add 100 mM per 20 mM aqueous sodium hydroxide solution and react at 37 ° C for 5 minutes to dissociate the target nucleic acid A from the probe. did.
  • the probes 1 and 2 according to the present invention and the solid phase according to the present invention have the structure described above. Therefore, when the target nucleic acid is hybridized on the solid phase according to the present invention, The probe has a spatial position advantageous for forming a hybrid, and forms a hybrid efficiently. Thus, the ligation reaction effectively binds props 1 and 2. Furthermore, after removing the target nucleic acid in the hybrid form, the cleavage reaction at the cleavage portion allows only the bound probe 2 to be present on the solid phase.

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Description

曰月糸田
標的核酸検出プローブ、 標的核酸検出方法、 標的核酸検出固相及びその製造方法 技術分野
本発明は、特定のポリヌクレオチド配列を有する標的核酸を検出するプローブ、 その検出固相、 その固相の製造方法及び特定のポリヌクレオチド配列を有する標 的核酸の検出方法に関する。 背景技術
近年の研究の進展により、 種々の生物情報が遺伝子の配列から得ることが出来 るようになった。 それに伴い当該遺伝子を検出 （標的核酸中の特定のポリヌクレ ォチド配列に対応する） することにより、 医療分野においては疾病の存在、 薬物 に対する感受性、 臓器移植の適合性などを診断することが、 食品分野においては 食中毒の原因になる様々な病原体を検出したり同定することが可能になった。 このような特定のポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）を検出するためには、 従来から、 検出される塩基配列と相補的な配列を有するプローブであってラベル 化されたものを用いてハイプリッド体を形成する方法 （ハイブリダィゼ一シヨン 法） が行われている。 検出される塩基配列は目的に応じて多岐にわたるので、 検 出には目的に応じた種々の塩基配列のプロ一プが用いられている。
しかしながら、 係るハイプリダイゼーシヨン法に共通する問題として、 塩基配 列の認識能が低いことが指摘されている。 すなわち、 ハイブリダィゼーシヨンに 基づく核酸相互作用は配列間に多少のミスマッチがあっても十分起こり得ること から、 厳密に特定の塩基配列を有する核酸のみを検出する方法としては不十分で ある。 発明の開示 本発明は、 以上の問題点を解決し、 高い認識能を有し、 簡便迅速に標的核酸を 検出するための標的核酸検出プロ一ブ、 及び標的核酸検出固相とその製造方法、 さらに標的核酸検出方法を提供することにある。
本発明者は上記従来のハイプリダイゼーシヨン法の持つ欠点に鑑み鋭意研究し、 新規な構造を有する標的核酸検出プローブ、 及び係るプローブを固相上に固定し た標的核酸検出固相を見出すことに成功し、 さらに係るプローブ又は固相を用い る標的核酸検出法を閧発することに成功し本発明を完成したものである。
すなわち、 本発明は、 以下に示す 1 . から 8 . の標的核酸検出プローブを提供 するものである。
1 . ( 1 ) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1と 相補的な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5， 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3， 末端に第 1の固相固定部が結合された、
プローブ 1と、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、
(a)前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(b)前記切断部の他端に第 2の固相固定部が結合された、
プロ一ブ 2とからなる、
1組の標的核酸検出プローブ。
2 . ( 1 ) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1と 相補的な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5， 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(c)前記切断部の他端に第 1の固相固定部が結合された、
プローブ 1と、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、 前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端に第 2の固相固定部が結合された、 プローブ 2とからなる、
1組の標的核酸検出プローブ。
3. 上記 に記載の標的核酸検出プローブであって、
(a)前記プローブ 2が、 前記固相固定部と前記切断部の間に、 さらにスぺーサ 一 を有すること、 又は
(b) 前記プローブ 1が、 前記固相固定部と前記塩基配列 B 1の 3' 末端の間に、 さらにスぺーサーを有することを特徴とする標的核酸検出プローブ。
4. 上記 2. に記載の標的核酸検出プロ一プであって、
(a)前記プローブ 1が、 前記固相固定部と前記切断部の間に、 さらにスぺ一サ一 を有すること、 又は
(b) 前記プローブ 2が、 前記固相固定部と前記塩基配列 B 2の 5' 末端の間に、 さらにスぺーサ一を有することを特徴とする標的核酸検出プローブ。
5. 上記 1. 又は 3. いずれかに記載の標的核酸検出プローブであって、 前記プローブ 2が、 前記塩基配列 B 2の 5' 末端と前記切断部の間にさらに標識 部を有することを特徴とする標的核酸検出プローブ。 ここで前記標識部が設けら れる位置は、 前記塩基配列 B 2の 5' 末端と前記切断部の間に限定されず、 前記 塩基配列 B 2内においても種々の結合形式により設けることをも含むものである (以下、 13,、 21. において同じ）。
6. 上記 2. 又は 4. のいずれかに記載の標的核酸検出プローブであって、 前記プローブ 1が、 前記塩基配列 B 1の 3' 末端と前記切断部の間にさらに標識 部を有することを特徴とする標的核酸検出プローブ。 ここで前記標識部が設けら れる位置は、 前記塩基配列 B 1の 3' 末端と前記切断部の間に限定されず、 前記 塩基配列 B 1内においても種々の結合形式により設けることをも含むものである (以下、 14.、 22. において同じ）。
7. 上記 1. から 6. のいずれか 1項に記載の標的核酸検出プローブであつ て、 前記切断部が、 ジスルフィ ド結合を有することを特徴とする標的核酸検出プ ローブ。
8. 上記 5. 又は 6. のいずれかに記載の標的核酸検出プローブであって、 前記標識部が、ジゴキシゲニンを有することを特徴とする標的核酸検出プローブ。 また、 本発明は、 以下 9. から 1 6. に示す標的核酸検出固相を提供するもの である。
9. (1) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1と 相補的な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5， 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3， 末端に第 1の固相固定部が結合されたプローブ 1 が、
前記第 1の固相固定部により表面に固定され、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、
(a)前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(b)前記切断部の他端に第 2の固相固定部が結合されたプローブ 2が、 前記第 2の固相固定部により表面に固定された、
標的核酸検出固相。
1 0. (1) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1 と相補的な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5 ' 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3' 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(c)前記切断部の他端に第 1の固相固定部が結合されたプローブ 1が、 前記第 1の固相固定部により表面に固定され、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、 前記塩基配列 B 2の 5' 末端に第 2の固相固定部が結合されたプローブ 2が、 前記第 2の固相固定部により表面に固定された、 標的核酸検出固相。
1 1. 上記 9. に記載の標的核酸検出固相であって、
(a) 前記プローブ 2が、 前記第 2の固相固定部と前記切断部の間に、 さらにス ぺーサ一を有すること、 又は
(b)前記プローブ 1が、 前記第 1の固相固定部と前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端 の 間に、 さらにスぺーサーを有することを特徴とする標的核酸検出固相。
12. 上記 10. に記載の標的核酸検出固相であって、
(a) 前記プローブ 1が、 前記第 1の固相固定部と前記切断部の間に、 さらにス ぺ―サ—を有すること、 又は (b)前記プローブ 2が、 前記第 2の固相固定部と前記塩基配列 B 2の 5' 末端 の 間に、 さらにスぺーサーを有することを特徴とする標的核酸検出固相。
13. 上記 9. 又は 1 1. のいずれかに記載の標的核酸検出固相であって、 前記プローブ 2が、 前記塩基配列 B 2の 5' 末端と前記切断部の間にさらに標識 部を有することを特徴とする標的核酸検出固相。
14. 上記 10. 又は 12. のいずれかに記載の標的核酸検出固相であって、 前記プロ一ブ 1が、 前記塩基配列 B 1の 3' 末端と前記切断部の間にさらに標識 部を有することを特徴とする標的核酸検出固相。
15. 上記 9. から 14. のいずれか 1項に記載の標的核酸検出固相であつ て、
前記切断部が、 ジスルフイ ド結合を有することを特徴とする標的核酸検出固相。
16. 上記 13. 又は 14. のいずれか 1項に記載の標的核酸検出固相であ つて、 前記標識部が、 ジゴキシゲニンでラベル化されていることを特徴とする標 的核酸検出固相。
さらに、 本発明は、 以下 17. から 25. に示す標的核酸検出方法を提供する ものである。
17. (A) (1) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1と相補的な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5， 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端に第 1の固相固定部が結合された、 プローブ 1を前記第 1の固相固定部で固相表面に固定し、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、
(a)前記塩基配列 B 2の 5， 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(b)前記切断部の他端に第 2の固相固定部が結合された、
プローブ 2を前記第 2の固相固定部で固相表面に固定する第 1の工程と、
(B) 前記プローブ 1と、 前記プローブ 2と、 前記標的核酸とをハイブリダィズ してハイプリッド体を形成する第 2の工程と、
(C) 前記ハイプリッド体の前記プロ一プ 1と前記プローブ 2とをリガ一ゼ反応 により結合する第 3の工程と、
(D) 前記プローブ 2の切断部を切断反応により切断する第 4の工程と、
(E) 前記第 3の工程により形成される、 前記プローブ 2の塩基配列 B 2と前記 切断部を結合した前記プローブ 1を検出する第 5の工程とを、 含むことを特徴と する標的核酸検出方法。
1 8 . (A) ( 1 ) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうち の A 1と相補的な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5 ' 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3， 末端に切断部が結合され、 かつ
(c)前記切断部の他端に第 1の固相固定部が結合されたプローブ 1を前記第 1 の固相固定部で固相表面に固定し、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、 前記塩基配列 B 2の 5， 末端に第 2の固相固定部が結合されたプローブ 2を前記 第 2の固相固定部で固相表面に固定する第 1の工程と、
(B) 前記プローブ 1と、 前記プローブ 2と、 前記標的核酸とをハイブリダィズ してハイプリッ ド体を形成する第 2の工程と、
(C) 前記ハイプリッド体の前記プローブ 1と前記プローブ 2とをリガーゼ反応 により結合する第 3の工程と、
(D) 前記プローブ 1の切断部を切断反応により切断する第 4の工程と、
(E) 前記第 3の工程により形成される、 前記プローブ 1の塩基配列 B 1と前記 切断部を結合した前記プローブ 2を検出する第 5の工程とを、 含むことを特徴と する標的核酸検出方法。
1 9. 上記 1 7. に記載の標的核酸検出方法であって、
(a) 前記プローブ 2が、 前記第 2の固相固定部と前記切断部の間に、 さらにス ぺーサ一を有すること、 又は
(b) 前記プローブ 1が、 前記第 1の固相固定部と前記塩基配列 B 1の 3， 末端 の間に、 さらにスぺーサ一を有することを特徴とする標的核酸検出方法。
20. 上記 18. に記載の標的核酸検出方法であって、
(a) 前記プローブ 1が、 前記第 1の固相固定部と前記切断部の間に、 さらにス ぺ一サーを有すること、 又は
(b) 前記プローブ 2が、 前記第 2の固相固定部と前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端 の間に、 さらにスぺーサ一を有することを特徴とする標的核酸検出方法。
2 1. 上記 1 7. 又は 19. のいずれかに記載の標的核酸検出方法であって、 前記プローブ 2が、 前記塩基配列 B 2の 5' 末端と前記切断部の間にさらに標識 部を有し、 前記標識部を検出することを特徴とする標的核酸検出方法。
22. 上記 1 8. 又は 20. のいずれかに記載の標的核酸検出方法であって、 前記プローブ 1が、 前記塩基配列 B 1の 3' 末端と前記切断部の間にさらに標識 部を有し、 前記標識部を検出することを特徴とする標的核酸検出方法。
23. 上記 1 7. から 22. のいずれか 1項に記載の標的核酸検出方法であ つて、 前記切断部が、 ジスルフィ ド結合を有し、 かつ前記第 4の工程においてジ スルフイ ド結合を還元剤により切断することを特徴とする標的核酸検出方法。 24. 上記 1 7. から 23. のいずれか 1項に記載の標的核酸検出方法であ つて、 前記第 5の工程において、 固相に結合しているプローブの質量を表面ブラ ズモン共鳴法により検出することを特徴とする標的核酸検出方法 （ここで、 プロ —ブの質量は、 プロ一ブ 1又はプローブ 2の有無を示す）。
25. 上記 2 1. 又は 22. のいずれか 1項に記載の標的核酸検出方法であ つて、 前記標識部が、 ジゴキシゲニンでラベル化されていることを特徴とし、 前 記第 5の工程において、 ジゴキシゲニンを検出することを特徴とする標的核酸検 出方法。
さらに、 本発明は、 以下 26. から 28. に示す標的核酸検出固相の製造方法 を提供するものである。
26. (A) (1) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1A2と、
(2) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1と相補的 な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5， 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3， 末端に第 1の固相固定部が結合された、
プローブ 1と、
(3) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、
(a)前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(b)前記切断部の他端に第 2の固相固定部が結合された、
プローブ 2とを、
ハイブリダィズしてハイプリッド体を形成する第 1の工程と、
(B) 前記ハイブリッド体を、 前記第 1の固相固定部および前記第 2の固相固定 部で、 固相表面に固定する第 2の工程と、
(C) 前記ハイブリッド体から前記標的核酸を除去する第 3の工程とを、 有する標的核酸検出固相の製造方法。
27. (A) (1) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A2と、 (2) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1と相補的 な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5 ' 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3， 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(c)前記切断部の他端に第 1の固相固定部が結合された、
プローブ 1と、
(3) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、 前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端に第 2の固相固定部が結合された、
プローブ 2とを、
ハイブリダィズしてハイブリツド体を形成する第 1の工程と、
(B) 前記ハイブリッド体を、 前記第 1の固相固定部および前記第 2の固相固定 部で、 固相表面に固定する第 2の工程と、
(C) 前記ハイプリッド体から前記標的核酸を除去する第 3の工程とを、 有する標的核酸検出固相の製造方法。
2 8 . 上記 2 6 . 又は 2 7 . において、 前記プロ一ブ 1又は 2が、 さらにス ぺーサ一又は標識部、 又はその両方を含む標的核酸検出固相の製造方法。
以下、 本発明を、 実施の形態に即してより詳しく説明する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明に係る標的核酸検出プローブの一例を示す図である。
図 2は、 本発明に係る標的核酸検出プローブの一例を示す図である。
図 3は、 本発明に係る核酸検出固相の製造方法の一例を示す図である。
図 4は、 本発明に係る標的核酸検出方法の一例を示す図である。
図 5は、 本発明に係る標的核酸検出方法の一例を示す図である。
図 6は、 本発明に係る標的核酸検出プローブの切断部一例を示す図である。 図 7は、 本発明に係る標的核酸検出プローブの切断部一例を示す図である。 図 8A は、 実施例（12)で示される本発明に係る標的核酸検出方法の一態様であ る直接蛍光検出法を示す模式図である。
図 8B は、 実施例（13 )で示される本発明に係る標的核酸検出方法の一態様であ る直接蛍光検出法を示す模式図である。
図 9は、 実施例（10)で示される本発明に係る標的核酸検出方法の一態様である ジゴキシゲニン-蛍光抗体法を示す模式図である。
図 10 は、 実施例（11 )で示される本発明に係る標的核酸検出方法の一態様であ る示すジゴキシゲニン-酵素抗体法 （蛍光） を示す模式図である。
図 11 は、 実施例（14)で示される本発明に係る標的核酸検出方法の一態様であ る示すジゴキシゲニン-酵素抗体法 （化学発光） を示す模式図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明に係る標的核酸検出プローブは、 1組 2種類のプローブ （以下プローブ 1およびプローブ 2とする） からなるものである。 また、 本発明に係る標的核酸 検出固相は、 上記本発明に係る 2種類のプローブを固相表面上に適当な空間配置 を保持して固定されたものである。 さらに、 本発明に係る標的核酸検出方法は係 る標的核酸検出固相を用いて、標的核酸を高感度'高認識で検出するものである。 さらに、 本発明に係る標的核酸検出固相の製造方法は、 係る標的核酸検出固相を 製造する方法である。
本発明に係るプローブ 1およびプローブ 2の具体的な構造を図 1 (タイプ 1と する） および図 2 (タイプ 2とする） にそれぞれ示した。 図 1と 2で示されたプ ローブの構造上の違いは、 以下に説明する切断部 （又はさらに標識部） を、 プロ —ブ 1に導入するか、 又はプローブ 2に導入するかの違いである。 従って、 図 1 に示されるタイプ 1では、 プローブ 2の塩基配列 B 2の 5， 末端に切断部 （又は さらに標識部） が結合している。 一方、 図 2に示されるタイプ 2では、 プローブ 1の塩基配列 B 1の 3， 末端に切断部 （又はさらに標識部） が結合している。 図 1、 2にはさらに、 検出されるべき標的核酸であって、 特定の連続する塩基 配列 A 1 A 2を有する核酸を模式的に示した。 タイプ 1およびタイプ 2のプロ一 ブ 1とプローブ 2は共に、 A 1 A 2と連続してハイプリダイズ可能な塩基配列（ B 1 , B 2 ) をそれぞれ有するものである。 さらにリガ一ゼ反応によりこれらのプ ローブが結合されるように、 プローブ 1の 5， 末端はリン酸化されている （図で は Pで表されている）。
なお、 タイプ 1とタイプ 2は、 標的核酸の検出における操作、 検出方法、 得ら れる結果に本質的な違いはなく、 以下の説明では、 主にタイプ 1 (図 1 ) のプロ —ブ 1、 2について説明する。
プローブ 1およびプローブ 2は、 適当な固相表面に固定するための固相固定部 を有する。 係る固相固定部は、 プローブ 1及びプローブ 2を、 固相表面上に好ま しい空間位置をとるように固定化可能とするものである。
さらに、 プローブ 1又はプローブ 2は、 必要ならば、 上記のハイブリダィゼー シヨン、 リガーゼ反応、 切断反応に影響されないスぺ一サーを有することが可能 である。係るスぺーサ一は、本発明に係る固相上にプローブを固定化する反応や、 以下説明する検出反応がより効率的に進行するために、 主に固相表面からの距離 を調整するために用いられるものである。
さらに、 プローブ 2は、 適当な化学的、 酵素的又は物理的手段により選択的に 切断され得る基 （以下切断部） を有するものである。
さらに、 プロ一ブ 2は、 必要ならば、 以下説明する種々の検出方法との組合せ を可能とするための標識部を有するものである。
また、 図 3には、 本発明に係る標的核酸検出固相とその製造方法の好ましい一 例を模式的に示した。 係る方法により、 固相上に固定化されたプローブ 1および プローブ 2の空間位置は、 標的核酸とプローブ 1および 2の安定なハイプリッド 体を形成可能とする。
さらに、 図 4、 図 5には、 本発明にかかる検出固相を用いて標的核酸の検出方 法の一例を模式的に示した。 すなわち、 上記標的核酸検出固相と標的核酸を混合 すると、 標的核酸はプローブ 1 , 2と固相表面上で効率的にハイブリッド体を形 成する。 さらに、 リガーゼ反応によりプローブ 1と 2を結合する。 この際、 リガ ーゼ反応の高認識性により、 正しくハイブリツ ド体を形成しているプローブ 1及 び 2のみが結合されることとなる。
図 4では、 この後、 標的核酸をのぞくと、 リガ一ゼ反応により結合したプロ一 ブは固相上で環状構造を示すこととなる。 また、 上記リガーゼ反応により結合し なかったプローブは固相上でもとの状態へと戻ることとなる。 さらに、 切断部を 切断（開裂）する反応によりプローブ 2は直接固相上からは遊離するが、 この際、 上記リガーゼ反応によりプローブ 1に結合したプロ一ブ 2は溶液中には遊離しな い。 一方、 上記リガ一ゼ反応によりプローブ 1と結合しなかったプローブ 2は溶 液中に遊離して除かれることとなる。 その結果、 上記リガ一ゼ反応により連結さ れたプローブ 2が固相上に残存することを検出することは、 上記リガーゼ反応が 生じていたことを意味し、 すなわち、 標的核酸が存在していたことを示すことと なる。 また、 図 5には、 本発明に係る検出固相を用いて標的核酸の検出方法の別 の一例を模式的に示した。 すなわち図 4と同様にハイブリツト体の形成とリガ一 ゼ反応を行った後、 まず切断部を切断する反応を行い、 次に、 標的核酸を除く操 作をする方法を示した。 この方法においても図 4と同様に、 上記リガ一ゼ反応に よりプロ一ブ 1に結合したプローブ 2は溶液中には遊離せず、 上記リガーゼ反応 によりプロ一ブ 1と結合しなかったプローブ 2は溶液中に遊離して除かれること となる。 その結果、 上記リガ一ゼ反応により結合されたプロ一プ 2が固相上に残 存することを検出することは、 上記リガ一ゼ反応が生じていたことを意味し、 す なわち標的核酸が存在していたことを示すこととなる。 上記リガーゼ反応により 連結されたプローブ 2が固相上に残存することを検出する方法は、 種々の方法が 利用可能である。 また、 上記リガ一ゼ反応により連結されなかったプローブ 2が 固相上に残存しないことを検出することも可能であり、 この場合は、 上記リガ一 ゼ反応が生じなかったことを意味し、 標的核酸が存在しなかったことを示すこと となる。 上記リガーゼ反応により連結されなかったプローブ 2が残存しないこと を検出する方法は、 種々の方法が利用可能である。
以下本発明をより詳細に説明する。
(標的核酸）
本発明により検出可能な特定のポリヌクレオチド配列を有する核酸 （標的核 酸） の種類については、 特に制限はされず、 各種の核酸 （D N A , R N A、 オリ ゴヌクレオチド等） に適用可能である。 また標的核酸の長さにおいても特に制限 はなく目的に応じて標的核酸自体、 又は適当な処理により適当な長さに調製した ものにも使用可能である。
また本発明は、 検出される標的核酸中の特定のポリヌクレオチド配列とハイブ リダイズ可能な塩基配列を有する 2種類のプローブを用いるものであり、 従って この特定のポリヌクレオチド配列はあらかじめ知られている必要がある。
このあらかじめ知られている特定のポリヌクレオチド配列の塩基数については 特に制限はないが、 （1 )本発明に係るプローブと充分なハイブリダィゼ一シヨン が可能であり、 かつ（2 )以下で説明するリガ一ゼ反応によりプローブを結合する に十分な塩基数を有する必要がある。 係る塩基数は、 用いるプローブの種類およ び塩基数、 また標的核酸の特定のポリヌクレオチド配列の種類および塩基数に依 存するが、 最適の塩基数を見出すことは当業者にとって容易である。
具体的には、 少なくとも 2 0塩基数あればよく、 さらに好ましくは 3 0塩基以 上である。 なお、 あまりに塩基数が大きくなるとプローブの合成、 取扱の困難性 等から好ましくない。
またその特定のポリヌクレオチド配列の標的核酸中での位置についても特に制 限はない。 末端付近でも中間部分でもよい。
さらに、 本発明に係る方法を使用する際には、 本発明に係るプローブとハイプ リダイズさせるために、 少なくとも上記特定のポリヌクレオチド配列部分は 1本 鎖である必要があるが、 通常の公知の手段 （熱またはアルカリ変性、 低塩濃度処 理等の方法） により容易に 1本鎖とすることが可能である。
(標的核酸検出プローブ）
本発明に係るプローブは、 図 1 (タイプ 1) および図 2 (タイプ 2) にいくつ かの例が示されているように、 1組の 2種類のプローブ （プローブ 1及びプロ一 ブ 2とする） からなる。 タイプ 1について説明すれば、 プローブ 2は、 少なくと も固相固定部と、 標的認識部、 及び切断部とを有する。 またプローブ 1は少なく とも固相固定部と、 標的認識部とを有する。 さらに必要な場合プローブ 1又はプ ローブ 2はスぺ一サーを有することも可能である。 さらに、 必要な場合、 プロ一 ブ 2に検出に用いる標識部を有する。
本発明に係るタイプ 1のプローブ 1、 2は具体的には以下のようにその構造が 構成され得る。
(i) 図 1に示されるように、 検出されるべき標的核酸の連続する特定の塩基配 列 A 1A2を任意に決める。
(ii) 塩基配列 A 1及び A 2に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド B 1及び B 2を決定し、 それぞれプローブ 1とプローブ 2の塩基配列認識用の塩基 配列とする。
(iii) プロ一ブ 1の B 1の 5' 末端をリン酸化する。
(iv) プローブ 1の B 1の 3' 末端に、 固相固定部を結合する。
(V) 必要な場合は、 B 1の 3， 末端と固相固定部間にさらにスぺ一サ一を結合 する。
(vi) プローブ 2の B 2の 5' 末端に切断部を介して固相固定部を結合する。
(vii) 必要な場合は、 切断部と固相固定部間にさらにスぺーサ一を結合する。
(viii) 必要な場合は、 前記切断部と B2の 5' 末端間にさらに標識部を結合す る。
また、 固相固定部は、 固相表面上に該プローブを固定する基であれば特に制限 されない。 本発明に係る標的核酸検出方法に使用する処理において該固定が保持 されればよい。 具体的には、 通常の化学反応による結合基、 種々の相互作用によ る結合基等が挙げられる。 通常の化学反応による結合基には、 固相表面の活性基 (例えば水酸基、 カルボン酸基、 アミノ基等） と共有結合を形成可能な基を選択 できる。 具体的には、 エステル、 エーテル、 アミ ド、 チォアミ ド結合等が挙げら れる。 また、 種々の相互作用としては、 例えば蛋白質—リガンド間の結合作用が 挙げられる。具体的には、 ピオチン/アビジン間相互作用が好ましく選択できる。 この場合は、 固相表面上にはアビジン （又はストレプトアビジン） をあらかじめ 固定しておくことが好ましい。 係る固相は通常の公知の方法により作製可能であ る。さらに、該固相固定部をプローブに導入する方法についても特に制限はなく、 通常の結合反応を好ましく使用可能である。 具体的にはホスホロアミダイ ト法が 適用可能である。
プローブ 1、 2の標的核酸を認識する B 1、 B 2は、 上記の標的核酸の特定の ポリヌクレオチド配列部分と相補的な塩基配列を有するものであり、 上記の特定 のポリヌクレオチド配列部分 A 1 A 2と連続してハイブリダィズできるものであ る。 それぞれのプローブの塩基配列の数には特に制限はないが、 本発明において は、 塩基配列数は約 1 0以上、 好ましくは 1 5以上である。 塩基数が少ない場合 は充分な特異的認識作用がなく、 またリガーゼ反応が困難となる。 また、 あまり に多いと取扱性、 保存性などに問題を生じる。
また、 本発明に係る切断部は、 種々の適当な反応条件下 （化学反応、 酵素反応、 物理化学反応） により選択的に切断可能な基であれば特に制限はない。 係る選択 は、 切断反応の条件に、 また切断反応の結果形成される切断部の基 （同じ基であ る場合、 相違する基である場合） に、 さらに種々の標識部を利用する検出方法に より可能である。 上記切断反応の条件は特に制限はなく、 通常の化学反応、 光反 応、 または酵素反応等が選択可能である。
本発明において該切断部としてのいくつかの好ましい例を、 以下図 6の（A)〜 ( 1 )、 図 7とともに示した。
(A) 切断部がジスルフイ ド結合 （一 S— S—） の場合。
この場合は切断方法としては種々の還元剤が使用可能である点で好ましい。 具 体的にはジチオスレィ トール（DTTとする）が挙げられる。
(B) 切断部が一 S 02—結合の場合。
この場合は切断方法としては種々の塩基性試薬が使用可能である点で好ましい。 (C) (D)(E) 切断部がアミ ド結合 （チォアミ ド結合も含む、 図示せず)、 エステル 結合、 エーテル結合の場合。
この場合は、 種々の化学反応による切断、 または光反応による切断、 酵素反応 (例えばべプチダーゼ、 エステラーゼ） による切断等が可能である。 特にアミ ド 結合、エステル結合の場合は加水分解が挙げられ、（E )のタイプのエーテル結合 は 光反応により容易に切断することが可能である。 また、 これら（C)(D) (E)のタイ プの切断部は、 該切断反応後に特有の切断端を一方に発生させることができるも のである。 従って、 該切断反応の後、 特定の切断端のみをさらに種々の反応によ りラベル化し、 検出に用いることが可能となる。
(F) (G) (H)切断部が係る結合基を有する場合は、一般的に過酸化物により容易 に 切断することが可能である。 過酸化物は有機過酸化物 （例えば過酢酸） 及び無機 過酸化物 （例えば過酸化水素） を含む。
( I ) 切断部が係る結合基を有する場合は、 ヒドロキシルァミンで容易に切断可 能である。
さらにその他の例を具体的に説明する （図示せず）。
( i ) 切断部が MA配列の場合。
この場合、 標的核酸の認識部が RNA配列以外、 例えば DNA配列であることが必 須である。 係る場合は、 リボヌクレア一ゼによる切断が可能である。
( ii ) 切断部が DNA配列の場合。
この場合、 標的核酸の認識部が DNA配列以外、 例えば MA配列であることが必 須である。 係る場合は、 デォキシリボヌクレアーゼによる切断が可能である。
( ii i ) 切断部が炭水化物ポリマーである場合。
この場合は、 種々のグリコシダ一ゼによる切断が可能である。
( iv) 切断部がデォキシゥリジンである場合。
図 7には、切断部がデォキシゥリジンである場合の切断方法を示した。つまり、 ゥラシル DNAグリコシダ一ゼ （DNA修復酵素の一つ、 DNA複製過程 での dUTPの 取り込みあるいはシトシンの脱ァミノ化によって生じた 1本鎖あるいは 2本鎖 DNA からゥラシルを除去する反応を触媒） 処理に引き続いてアルカリ条件での加 熱により切断 （一方をアルデヒド、 他方をリン酸とする切断端を生成） が可能で ある。
本発明に係る標識部は、 上記プローブに検出手段との組合せに適当なラベル基 が導入されたものであり、 切断反応後に係るラベル基が固相上に存在するか （又 は存在しないか） を検出可能とするためのものである。 従って、 該ラベル基は特 に限定されず係る目的を達成する種々の種類の基を選択利用可能である。 係る標 識部の導入方法についても特に制限はなく通常公知の核酸へのラベル化方法が容 易に適当可能である。
具体的には、 （i )抗原抗体反応を利用するものとして、 ジゴキシゲニンのラベ ル化が挙げられる。 係るジゴキシゲニンによるラベル化には通常使用される方法 が可能である。 また、 （ii )蛍光を利用するものとして、 蛍光色素 （例えば BODIPY493/503, Rhodamine Redあるいは TEXAS Red) や、 蛍光ビーズによるラベ ル化が挙げられる。 蛍光色素によるラベル化には、 プローブ合成の際に使用する オリゴヌクレオチドにあらかじめ導入したァミノ基に蛍光色素のスクシンィミ ド エステル誘導体を反応させることで容易に導入可能であり、 市販のキッ卜がこの 目的で利用可能である。 また、 蛍光ビーズによるラベル化は、 該蛍光ビーズをプ ローブと化学的に結合させることにより可能となる。 さらに、 （iii )ラジオアイ ソト一プによるラベル化が挙げられる。 例えば、 リガーゼ反応用にリン酸基が導 入されたプローブの合成において、 32 Pを用いることでプローブをラジオァイソ ト一プ標識することが可能である。
また、上で説明した切断部が切断された後互いに相違する基を形成する場合 (例 えば、 図 6の（C) (D) (E)のタイプの切断部） は、 切断端の化学的性質に基づいて 切断後にさらに、 選択的に検出用の標識 （ラベル基） を導入することも可能であ る ο
必要な場合、 それぞれのプローブには以下で説明するスぺーサーをさらに設け ることが可能である。 係るスぺ一サーを設けることで、 ハイブリダィゼ一シヨン の効率化、 又は以上で説明した種々の切断部での切断反応、 さらに本発明におい て使用可能な種々の検出方法等を最適化、 効率化を図ることが可能となる。 具体 的には、 固相固定部と切断部の間に適度な長さのスぺーサーを導入することで切 断部での切断反応を効率よく行うことが可能となる。 また、 プローブ 1の固相固 定部と塩基配列 B 1の間、 又はプローブ 2の固相固定部と切断部の間、 あるいは その両方にスぺーサ一を設けることで、 標的核酸の塩基配列 A 1 A 2とハイプリ ダイズ可能なプローブ 1及びプロ一ブ 2の塩基配列 B 1及び B 2が固相表面より 離れることにより、 標的核酸の塩基配列 B 1及び B 2へのハイブリダイゼーショ ンの効率化を図ることが可能となる。
ここで好ましく使用可能なスぺーサ一の種類、 形状等には特に制限はない。 上 記 2種類のプローブと標的核酸をハイブリダイズする条件、それに伴う洗浄操作、 さらに該標的核酸を除去する操作等において充分強固な結合性を有していればよ い。 具体的には、 オリゴヌクレオチド、 オリゴペプチド、 アルキレン鎖等が挙げ られる。 特にオリゴチミジンが好ましく使用でき、 必要な長さはチミジンの数に より容易に得ることができる。 また、 適当な数の炭素数を有するアルキレン鎖も 好ましく使用可能である。 係るスぺーサーを導入する方法においても特に制限は なく種々の公知の結合反応が利用可能である。 具体的には、 通常のオリゴヌクレ ォチド合成のホスホロアミダイ ト法を利用して容易に実施可能である。 (検出固相）
本発明において検出固相とは、 固相媒体であって、 その表面上に、 上記説明し た 2種類のプロ一ブが隣接して結合されたものである。 その結合の密度等につい ては特に制限はなく、 種々の密度で結合されたものが使用可能である。 さらに、 固相媒体の種類についても制限はなく、 例えば、 無機物質固相媒体、 または有機 物質固相媒体等使用可能である。 無機物質固相媒体には、 具体的には種々の金属 膜（例えば表面プラズモン共鳴装置で使用されるセンサ一チヅプ)、 シリ力ゲル、 アルミナ、 ガラス、 石英等が挙げられる。 有機物質固相媒体には、 ニトロセル口 —ス膜、 ナイロン膜、 ポリスチレン、 ポリエチレンなどのプラスチック系材料等 が挙げられる。 また、 これらの表面にカルボキシメチルデキストランなどを結合 したものを用いることも可能である。 本発明においては特にポリスチレン系の夕 イタ—プレートや石英ガラスの使用が好ましい。
(検出用固相製造方法）
本発明に係る検出用固相は、 2種類のプローブが特定の空間配置を有するよう に固相上に固定されたものである。 すなわち、 上記プローブが標的核酸の特定の ポリヌクレオチド配列と連続してハイブリダイズし、 さらに、 酵素反応により連 結され得る空間配置である。
上記の特定の空間配置にプローブを固定して検出用固相を製造する方法には、 例えば、 上記 2種類のプローブが好ましい濃度になるようにあらかじめ混合し、 その混合物を検出用固相表面と反応させ、 固相固定部で結合する方法がある。 こ の場合、 2種類のプロ一ブは上記固相表面にランダムに結合したものが得られる。 この場合においては、 上記 2種類のプローブの空間配置のうち、 標的核酸の特定 のポリヌクレオチド配列と連続してハイプリダイズし、 さらに、 酵素反応により 連結され得る空間配置をとるものは極めて少数であると考えられる。
本発明においては、 好ましい空間配置にある 1組のプローブをより多く固相上 に固定するための方法として、 以下の手段が好ましく使用可能である （図 3 )。 すなわち、 2種類のプローブをまず標的核酸と混合してハイブリダィズさせる。 得られたハイプリッド体を検出用固相上で結合反応させ、 ハイプリッド体を固定 する。 上記固相を充分洗浄後、 ハイブリッド体から標的核酸を熱、 またはアル力 リ処理等で除去する。 係る操作により、 2種類のプローブがそれらの空間配置が 標的核酸とハイブリダィズするに好ましいように、 固相上に固定されることとな る。
(ハイブリダィズの条件）
本発明において、 本発明に係る 1組のプローブと標的核酸とのハイプリダイズ 条件は特に制限なく通常の条件を使用可能である。 例えば、 「分子生物学実験マ ニュアル」 （川上正也監修；講談社） 172 ページに記載の方法に準じて、 または 修正して使用できる。 また、 形成されるハイブリッド体から標的核酸を除き、 1 本鎖にする条件は特に制限はなく、 通常公知の条件が好ましく使用可能である。 例えば、 アルカリ処理、 または熱処理、 酸処理等である。
(酵素）
本発明においては、 1組の 2種類のプローブを結合するに用いることができる 酵素は例えば、 リガ一ゼが挙げられる。 リガーゼの種類および反応条件について は、 特に制限はなく通常の選択に基づいて種々の公知のリガーゼ反応を使用可能 である。例えば T4 DNAリガーゼ（宝酒造製)、 Ampl igase (EP ICENTRE TECHNOLOGIES 製）、 Pfu DNAリガーゼ （STRATAGENE製） が好ましく使用可能である。
さら.に、 リガ一ゼ反応に基づく連結後は、 種々の操作 （例えば、 熱処理、 アル カリ処理、 酸処理等） に基づき、 標的核酸を除去することが可能である。
(検出方法）
本発明に係る標的核酸の検出方法は、 本発明に係る検出固相を用いるものであ つて、 前記検出固相上の 1組のプローブが標的核酸の特定のポリヌクレオチド配 列と連続してハイプリダイズさせ、 得られるハイプリッド体にリガーゼ反応によ り上記 2種類のプローブ間を結合して得られる連結体形成を利用するものである。 標的核酸の塩基配列が異なり、 プローブが誤認識した場合には、 リガーゼ反応に よって上記連結体の形成は生じないこととなり、 アルカリ処理等で標的核酸を除 いた後は、 上記プローブ同士が連結されず、 それぞれの末端部が存在することと なり、 1組のプロ一プは最初の状態に戻ることとなる。
本発明はさらに、 アルカリ処理等で標的核酸を除いた後、 プローブの切断部の 開裂反応を利用するものである。 すなわち、 上記連結体を形成した場合は、 係る 開裂反応により本発明に係る 1組のプローブが連結された状態で固相上に残存す ることとなる。 一方、 標的核酸の塩基配列が異なり、 プローブが誤認識した場合 には、 リガ一ゼ反応によって上記連結体の形成は生じず、 アルカリ処理等で標的 核酸を除いた後は、 本発明に係る 1組のプローブは最初の状態に戻ることとなる ので、 切断部の開裂反応により本発明に係る 1組のプローブの一方は溶液中に遊 離し、 固相上には存在しないこととなる。
本発明に係る標的核酸検出方法において、 同様な操作はリガーゼ反応の後に、 まずプローブの切断部の開裂反応を行い、 次に続いてアル力リ処理等で標的核酸 の除去を行っても行うことができる。 この場合も同様に、 リガ一ゼ反応により連 結体を形成した場合には 1組のプローブが連結された状態で固相上に残存するこ とになり、 また標的核酸の塩基配列が異なり、 プローブが誤認識した場合には、 本発明に係る 1組のプローブの一方は溶液中に遊離し、 固相上に存在しないこと となる。
従って、 本発明は、 上記開裂反応後の固相上に存在するプローブを検出するこ とにより、 上記リガ一ゼ反応が起ったか否かを知り、 その結果により標的核酸が 存在するか否かを判別することを可能とするものである。
本発明において使用するリガーゼ反応は極めて高い塩基特異性を有しているこ とが知られており、 本発明に係る方法において誤認識 （ミスマッチ） の程度を極 めて低いレベルとすることが可能となるものである。
本発明に係る、 上記開裂反応後の固相上に存在するプローブの構造を検出する 方法については以下に説明するように種々の公知の方法が使用できる。
( 1 ) 連結体に結合している標識部 （抗原、 酵素、 蛍光、 ラジオアイソトープ等 ） の存在を検出する。例えば、標識部が抗原の場合、酵素結合抗体により認識させ、 その酵素による基質の発色を検出することで確認することができる。
( 2 )プローブの連結反応後、 切断部を開裂した後に、 切断部を含んでいる方の プ ロープの標的核酸認識部の相補鎖あるいは該プローブ内の別の配列の相補鎖を持 つラベル化オリゴヌクレオチド （例えば蛍光標識オリゴヌクレオチド） を添加し て検出する方法が可能である。
( 3 ) または固相上に存在する核酸の質量の減少を、 例えば表面プラズモン共鳴 方法等により検出することでプローブの減少を確認することが出来る。
以下実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、 本発明はその要旨を超えな い限り以下の実施例に限定されるものではない。
ここで、 核酸の合成は、 一般的にホスホロアミダイ ト固相合成法による自動核 酸合成機にて合成し、 イオン交換 HPLCにて精製 （純度 99%以上） した。
5，リン酸化は、 5， -Phosphate- ON Phosphoramiditeを、 5，ピオチン化は Biotin
Amidite を、 3，ピオチン化は 3， Biotin- ON CPG を、 ジスルフィ ド結合は C6- Disulfide Phosphoramidite を、 オリゴヌクレオチド鎖内へのァミノ基の導入に は Uni-Link Amino Modifier を用いた。 以上の試薬は、 CL0NTECH社より入手可 能である 。デォキシゥリジンの導入には、 dU-CE Phosphoramidite (Glen esearch 製） を用いた。
また、 オリゴヌクレオチドへの蛍光色素 B0DIPY493/503、 Rhodamine Red, TEXAS Red や抗原ジゴキシゲニン の導入には、 Uni- Link Amino Modifier によりオリ ゴヌクレオチド鎖内に導入したァミノ基に、 B0DIPY493/503 C3- SE、 Rhodamine Red-X succ inimidyl ester、 TEXAS Red-X succinimidyl ester (レヽずれも Molecular Probes 社製) あるいは Digoxigenin-3-0-methyl-carbonyl- ε -aminocaproic ac id-N-hydroxysuccinimide ester (ベーリンガー 'マンハイム社製） を公知の 方法により反応させて行った。 (実施例）
( 1 ) プローブの溶液中でのジスルフィ ド結合切断実験
( 1-1 ) 5'末端をピオチン化した 20塩基のオリゴヌクレオチドからなるプロ一 ブ 2 A、 5 （ビォチン）- GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC- 3，を通常のホスホロアミダイ ト 固相合成法により自動合成した。
( 1-2) 5，末端をピオチン化し、 ジスルフイ ド結合（[SS]と表記）を導入した 2 2塩基のオリゴヌクレオチドからなるプローブ 2 B 、 5，-（ピオチン）- TT- [SS]- GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3'を通常のホスホロアミダイ ト固相合成法により自動合 成した。
( 1-3) 5，末端をビォチン化し、 ジスルフイ ド結合を導入した 2 5塩基のオリ ゴヌ ク レオチ ドからなるプローブ 2 C , 5，-（ ピオチン）- TTTTT-[SS]- GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3'を通常のホスホロアミダイ ト固相合成法により自動合 成した。
( 1-4) 5，末端をピオチン化し、 ジスルフイ ド結合を導入した 3 0塩基のオリ ゴヌクレオチ ドからなるプローブ 2 D 、 5， -（ビォチン）- TTTTTTTTTT-[SS]- GGTGGCGGCCGCTCTAGMC- 3，を通常のホスホロアミダイ ト固相合成法により自動合 成した。
( 1-5) ( 1-1 )、 ( l-2 ) ( 1-3)、 （1-4)で得られたプローブ（それぞれ 400nM)を、 l SSPE( 150mM NaCl, 10mM NaH2P043 ImM EDTA, pH7.4)中で 100°Cにて 5 分間カロ 熱し、 すぐに氷冷した。 それぞれのプローブ溶液に 1Mジチオスレィ トール （DTT と略記する） を lOOmM となるように添加し、 37°Cにて 10分間放置した。 固相と なる、 ストレプトアビジンでコートされた BIAcoreセンサーチップ （フアルマシ ァ ： SA5 ) と、 DTT—プローブ溶液を 37°Cにて 5分間反応させたときの固相の質 量変化を表面プラズモン共鳴測定装置 （フアルマシア： BIAcore2000 ) にて観察 したところ、 ジスルフィ ド結合を含まないプローブ 2 Aで 1487 レゾナンスュニ ット （表面プラズモン共鳴における反射光の減衰角度を表す値で、 固相表面の質 量変化を反映する） の上昇を認めたのに対し、 ジスルフィ ド結合を含むプローブ 2 Bでは 504レゾナンスュニヅ卜の上昇、 プローブ 2 Cでは 588レゾナンスュニ ットの上昇、 プローブ 2 Dでは 935レゾナンスユニットの上昇が観測された。 ジ スルフィ ド結合を含まないプローブ 2 Aに比較して、 ジスルフィ ド結合を含む、 プローブ 2 B、 プロ一ブ 2 C、 プロ一ブ 2 D各プローブの固相化量が低かったの は DTTによりジスルフイ ド結合が溶液中で切断されたことを示す。
(2) プローブの固相上でのジスルフィ ド結合切断実験
(2-1 ) プローブの固相化
( 1-1 )、 （卜 2)、 ( 1-3), (卜 4)で得られたプローブ （それぞれ 400nM) を、 I x SSPE 中で 100°Cにて 5分間加熱し、 すぐに氷冷した。 これらのプローブ溶液を、 スト レプトアビジンでコートされた BIAcoreセンサ一チップと 37°Cにて 5分間反応 させた後、 0. ドデシル硫酸ナトリゥム水溶液、 lOmM水酸化ナトリゥム水溶液、 lOmM塩酸水溶液を 37°Cにて 1分間づっ順次反応させて、 固相と結合しなかった プロ一ブを除去した。
(2-2) DTTとの反応
(2-1 )で調製した、 それぞれのプローブを固相化したチップと lOOmM DTT を含む I x SSPE中にて 37°Cにて 10分間反応させたときの固相の質量変化を表面プラズ モン共鳴測定装置にて観察したところジスルフィ ド結合を含まないプローブ 2 A で 31 レゾナンスュニヅ卜の上昇、 ジスルフィ ド結合を含むプローブ 2 Bでは 544 レゾナンスュニッ卜の減少、 プローブ 2 Cでは 495レゾナンスュニヅ卜の減少、 プローブ 2 Dでは 313レゾナンスュニットの減少を認めた。 プロ一プ 2 Aを除い て、 ジスルフイ ド結合を含むプローブ 2 B、 プロ一ブ 2 C、 プローブ I D各プロ —ブでレゾナンスュニットが大きく減少したことは、 DTT によりジスルフィ ド結 合が固相上で切断を受けたことを示す。 (3) 標的核酸の検出 （表面プラズモン共鳴）
(3-1) 3'末端をピオチン化し、 5，末端をリン酸化した 20塩基のオリゴヌク レオチドからなるプローブ 1、 5，-（P)- TAGTGGATCCCCCGGGCTGC -(ピオチン） 3，を通 常のホスホロアミダイ ト固相合成法により自動合成した。
(3-2) プロ一ブ 2 Aあるいはプローブ 2 Bあるいはプロ一ブ 2 Cあるいはプ ローブ 2Dのうちの 1 つと（3-1)で得られたプロ一ブ 1を隣接して保持できる標 的核酸として以下の配列を有する 40塩基のオリゴヌクレオチドからなる標的核 酸 Aを合成した。
5'-GCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACC-3'
(3-3) プローブの固相化
プローブ 2B、 プロ一ブ 1と標的核酸 A (それぞれ 400nM) あるいはプロ一ブ 2 C、 プローブ 1と標的核酸 A (それぞれ 400nM) を lxSSPE 中で混合し、 100°C にて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハイブリダィ ズさせた。 このハイブリッド体を lxSSPEで 10倍に稀釈し、 ストレブトァビジ ンでコートされた BIAcoreセンサ一チップと 37°Cにて 5分間反応させてプロ一 ブを固相化した後、 0.1%ドデシル硫酸ナトリゥム水溶液、 10mM水酸化ナトリゥ ム水溶液、 10mM塩酸水溶液でそれぞれ 37°Cにて 1分間づっ順次反応させ、 標的 核酸 Aをプローブより解離させた。
(3-4) 標的核酸のハイブリダィゼ一シヨン
(3-3)で 2つのプローブを隣接して保持していた標的核酸 Aが解離した固相に、 標的核酸 A (400nM) を lxSSPE中にて 37°Cにて 5分間反応させた。
(3-5) 固相上でのリガーゼ反応
(3-4)で標的核酸 Aをハイプリダイズした固相に、 添付の反応緩衝液で稀釈した T4 DNAリガーゼ （宝酒造： 1mlあたり 3500IU のリガーゼを含む） を 37°Cにて 5 分間反応させた後、 0.1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液、 lOmM水酸化ナトリゥ ム水溶液、 10mM塩酸水溶液を 37°Cにて 1分間順次反応させ、 標的核酸 Aをプロ ーブより解離させた。
( 3-6 ) DTTによるジスルフィ ド結合の切断
( 3-5 )で調製した固相に lOOmM DTT を含む l x SSPE中で 37°Cにて 10分間反応さ せたときの固相の質量変化を表面プラズモン共鳴測定装置にて観察したところ、 プロ一ブ 2 B /プローブ 1では 67 レゾナンスユニットの減少を、 プロ一ブ 2 C /プロ一ブ 1では 71 レゾナンスユニッ トの減少を認めた。 一方、 （3- 4)で標的核 酸 Aをハイブリダィズさせずに T4 DNA リガ一ゼを反応させた固相についてはプ ローブ 2 B /プローブ 1では 136レゾナンスュニッ卜の減少を、 プローブ 2 C / プローブ 1では 131 レゾナンスュニッ卜の減少を認めた。 プローブ 2 B /プロ一 ブ 1、 プローブ 2 C/プロ一プ 1それぞれにおいて、 標的核酸 Aをハイプリダイ ズさせなかった固相に比べて、 標的核酸 Aをハイブリダィズさせた固相のレゾナ ンスュニッ卜の減少が抑えられたのは、 プローブ 2 Bとプロ一プ 1あるいはプロ ーブ 2 Cとプローブ 1の両プロ一ブが標的核酸 Aとハイブリダィズして隣接して 保持され、 T4 DNAリガ一ゼにより両プローブが連結されたために、 DTTによるプ ローブ 2 Bあるいはプローブ 2 Cのジスルフィ ド結合の切断を受けてもプローブ 2 Bあるいはプローブ 2 Cの標的核酸認識配列が洗い流されずに固相上に残り、 固相上の大きな質量変化が起きなかったためである。 以上の結果は、 本法により 標的核酸の検出が可能であることを示している。
(4) 蛍光色素標識プローブの溶液中でのジスルフィ ド結合切断実験
(4-1 ) 5，末端をピオチン化し、 ジスルフィ ド結合および蛍光色素 B0DIPY493
/503 (F と表記） を導入した 20塩基のオリゴヌクレオチドからなるプローブ 2 E、 5， -(ビォチン）- [SS] - F-GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3'を通常のホスホロァミダイ ト固相合成法により自動合成した。
(4-2 ) プローブ 2 Aとプローブ 2 E (それぞれ 400nM)を、 1 x SSPE中で 100°C にて 5分間加熱し、 すぐに氷冷した。 それぞれのプローブ溶液に 1M DTTを lOOmM となるように添加し、 37°Cにて 10 分間放置した。 ストレプトアビジンでコート された BIAcoreセンサ一チップと DTT—プローブ溶液を 37°Cにて 5分間反応させ たときの固相の質量変化を表面ブラズモン共鳴測定装置にて観察したところ、 ジ スルフィ ド結合を含まないプローブ 2 Aで 1377 レゾナンスュニッ卜の上昇を認 めたのに対し、 ジスルフィ ド結合を含むプロ一ブ 2 Eでは 103レゾナンスュニヅ 卜の上昇にとどまった。 プローブ 2 Eを ImM DTTで反応させた場合は 717レゾナ ンスュニッ 卜の上昇を認め、 DTT 濃度が高いほど固相化量が少なかった。 この結 果は、 DTT によりプローブ 2 Eのジスルフィ ド結合が溶液中で切断されたことを 示す。
(5) 蛍光色素標識プローブの固相上でのジスルフィ ド結合切断実験
( 5-1 ) アビジンコートチップの調製
200mM l _ェチル _ 3 — （ 3—ジメチルァミノプロピル） カルポジイミ ド（SIGMA) を含む 50mMN—ヒドロキシスクシンィミ ド （SIGMA) 溶液を表面プラズモン共鳴 測定装置にてカルボキシメチルデキストランが結合した B I Acore用センサーチヅ プ （フアルマシア： CM5 ) と 37°Cにて 7分間反応させた後、 1mlあたり 100〃g のアビジン （SIGMA) を含む lOmM酢酸緩衝液 pH5.0を 37°Cにて 1〜8分間反応さ せ、 水酸化ナトリゥム水溶液で PH8.5 に調製した 1Mエタノールァミンハイ ドロ クロリ ドを 37°Cにて 7分間添加して反応を止めた。
( 5-2) プローブの固相化
プローブ 2 E (400nM) を、 1 x SSPE中で 100°Cにて 5分間加熱し、 すぐに氷冷し た。 このプローブ溶液を、 （5-1 )で調製した、 アビジンでコートされた BIAcore センサ一チップと 37°Cにて 5 分間反応させた後、 0.1%ドデシル硫酸ナトリウム 水溶液、 lOmM水酸化ナトリゥム水溶液、 lOmM塩酸水溶液でそれぞれ 37°Cにて 1 分間づっ順次洗浄した。
(5-3) DTTとの反応
(5- 2)で調製した、 プローブ 2 Eを固相化したチップと lOOmM DTTを含む 1 X SSPE を 37°Cにて 10分間反応させた。 0.1%ドデシル硫酸ナトリゥム水溶液、 lOmM水酸 化ナトリゥム水溶液、 10mM塩酸水溶液でそれぞれ 37°Cにて 1分間づっ順次洗浄 したときの固相の質量変化を表面プラズモン共鳴測定装置にて観察したところ 1400〜2100 レゾナンスュニットの減少を認めた。 この結果は DTT によりプロ一 ブ 2 Eのジスルフイ ド結合が固相上で切断されたことを示す。
(6 ) 蛍光色素標識プローブを用いた標的核酸の検出 （表面プラズモン共鳴）
(6-1 ) プローブ調製
標的核酸 Aの 5'末端から 2 0番目の塩基と 2 1番目の塩基の間にアデノシンを 挿入した、 4 1塩基のオリゴヌクレオチドからなる 1塩基過剰配列、
5' -GCAGCCCGGGGGATCCACTAAGTTCTAGAGCGGCCGCCACC-3'を通常のホスホ口アミダイ ト固相合成法により自動合成した。
(6-2) 標的核酸 Aの 5'末端から 2 0番目の塩基のアデノシンを欠損した、 3 9塩基のオリゴヌクレオチドからなる 1塩基欠損配列、
5' -GCAGCCCGGGGGATCCACTGTTCTAGAGCGGCCGCCACC-3'を通常のホスホロアミダイ ト 固相合成法により自動合成した。
(6-3) アビジンをコートしたセンサ一チップの調製
200mM l —ェチル一 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル） カルボジイミ ドを含む 50mMN—ヒドロキシスクシンィミ ド溶液を表面プラズモン共鳴測定装置にてカル ボキシメチルデキストランが結合した BIAcoreセンサ一チップ CM5と 37°Cにて 7 分間反応させた後、 1mlあたり のアビジンを含む 10mM酢酸緩衝液 pH5.0を 37°Cにて 1〜8分間反応させ、 水酸化ナトリウム水溶液で pH8.5に調製した 工 夕ノールァミンハイ ドロクロリ ドを 37°Cにて 7分間添加して反応を止めた。
(6-4) プローブの固相化
プローブ 2 E、 プローブ 1と標的核酸 A (それぞれ 400nM) を l x SSPE中で混合 し、 100°Cにて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハ イブリダィズさせた。 このハイブリッド体を l x SSPEで 10倍に稀釈し、 （6- 3 )で 調製したアビジンでコートされた BIAcoreセンサーチップと 37°Cにて 5分間反 応させてプローブを固相化した後、 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液、 lOmM 水酸化ナトリゥム水溶液、 10mM塩酸水溶液でそれぞれ 37°Cにて 1分間づっ順次 反応させて、 標的核酸 Aをプローブより解離させた。
(6-5) 標的核酸 A及びその変異核酸のハイプリダイゼ一ション
(6- 4)で 2つのプローブを隣接して保持していた標的核酸 Aが解離した固相の 別々の場所に、 標的核酸 Aとその変異核酸である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配 列 （各 400nM) を l x SSPE中で 37°Cにて 5分間反応させたときの固相の質量変化 を表面プラズモン共鳴測定装置にて観察したところ 337〜379 レゾナンスュニッ 卜の上昇を認め、 （6- 4)で調製した固相が標的核酸 Aとその変異核酸である 1塩 基過剰配列、 1塩基欠損配列とハイブリダィズすることを確認した。 このことは レヽずれの配列も固相と結合し、 ハイプリダイゼーシヨンに基づく結合量からは検 出しようとする核酸配列と、 これとはわずかに異なる核酸配列を区別することが できないことを示している。標的核酸等何もハイブリダィズさせなかつた場合は、
6レゾナンスュニッ卜の上昇にとどまった。
(6-6) 固相上でのリガーゼ反応
(6 - 5)で標的核酸 Aとその変異核酸である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列をハ イブリダィズさせた固相に、 添付の反応緩衝液で稀釈した T4 DNAリガーゼ （1ml あたり 3500IUのリガーゼを含む） を 37°Cにて 5分間反応させた後、 0.1%ドデシ ル硫酸ナトリゥム水溶液、 lOmM水酸化ナトリウム水溶液、 lOmM塩酸水溶液でそ れそれ 37°Cにて 1分間づっ順次反応させて、 標的核酸 A及びその変異核酸をプ ローブより解離させた。
(6-7) DTTによるジスルフイ ド結合の切断
(6-6)で調製した固相に、 lOOmM DTTを含む l x SSPE中で 37°Cにて 10分間反応さ せたときの固相の質量変化を表面プラズモン共鳴測定装置にて観察したところ、 1塩基欠損配列をハイブリダィズさせた固相については 82 レゾナンスュニット の減少、 1塩基過剰配列をハイプリダイズさせた固相については 95 レゾナンス ュニッ卜の減少、 標的核酸等何もハイブリダィズさせなかった固相については
116 レゾナンスユニットの減少を認めた。 一方、 標的核酸 Aをハイブリダィズさ せた固相については 54 レゾナンスユニットの減少にとどまった。 他に比べて標 的核酸 Aをハイプリダイズさせた固相でレゾナンスユニットの減少が抑えられた のは、 プロ一ブ 2 Eとプローブ 1の両プローブが標的核酸 Aとハイブリダィズし て隣接して保持され、 T4 DNAリガ一ゼにより連結されたために、 DTTによるプロ —ブ 2 Eのジスルフィ ド結合の切断を受けてもプローブ 2 Eの標的核酸認識配列 が洗い流されずに固相上に残り固相上の大きな質量変化が起きなかったからであ る。 この結果は、 標的核酸の、 プローブ連結付近の配列の 1塩基の違いを認識し たことを示す。
(7) ジゴキシゲニン標識プロ一ブの切断実験
(7-1 ) プローブの調製
5，末端をビォチン化、 オリゴヌクレオチド鎖内にジゴキシゲニン修飾 （本明細書 中、 又は図中で [DIG]と表記される場合がある） を施し、 ピオチンとジゴキシゲ ニンの間にチミジンを 2個導入した、 2 2塩基のオリゴヌクレオチドからなるプ ローブ 2 F、 5 ' -(ピオチン）- TT- [DIG]- GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC- 3，を通常のホスホ 口アミダイ ト固相合成法により自動合成した。
(7-2) 5，末端をピオチン化、 オリゴヌクレオチド鎖内にジスルフイ ド結合及 びジゴキシゲニン修飾を施し、 ピオチンとジスルフィ ド結合の間にチミジンを 2 個導入した、 2 2塩基のオリゴヌクレオチドからなるプローブ 2 G、 5，-（ピオチ ン）- TT- [SS]- [DIG]- GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3'を通常のホスホロアミダイ ト固相 合成法により自動合成した。
(7-3) プローブの固相化
プローブ 2 Fおよびプローブ 2 G (それぞれ 500pM) を、 l x SSPE中で 95°Cにて 5分間加熱し、 すぐに氷冷した。 これらのプローブ溶液を、 ノーザンエリ一ザ（ベ —リンガ一 .マンハイム ： ジゴキシゲニン検出 ELISA キット ） に添付の、 スト レプトアビジンでコートされた 9 6穴マイクロタイ夕一プレートに 1ゥエルあた り 94 1添加し、 振盪しながら 37°Cにて 30分間反応させた。
( 7-4) DTTによるジスルフイ ド結合の切断
各ゥエルをノ一ザンェリ一ザに添付の洗浄液 250 z lで 3回洗浄後、 1M、 100mM、 ImM 各濃度の DTTを含む l x SSPE を 1ゥエルあたり 100〃1添加して、 振盪しな がら 37°Cにて 30分間反応させた。
( 7-5) ジゴキシゲニン検出
各ゥエルを洗浄液 250 z lで 3回洗浄後、ノーザンェリ一ザに添付の Anti- DIG-P0D
(ペルォキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体： 1 ゥエルあたり 5mUの抗体を含 む 100 / 1 を添加） と振盪しながら 37°Cにて 30分間反応させた。 各ゥヱルを洗 浄液 250〃1で 3回洗浄後、 ノーザンエリ一ザに添付の TMB Substrate Solution
(ペルォキシダーゼ基質トリメチルベンジジン、 1 ゥエルあたり 100 z l を添加） と室温にて 5分間反応させ、 ノ一ザンェリ一ザに添付の Stop Reagent (1ゥエル あたり 100 z l を添加） で反応を止めた。 ペルォキシダ一ゼの働きにより トリメ チルベンジジンは青色を発する生成物へと変化し増幅される。 Stop Reagent を 添加することにより青色を発する生成物の増幅反応がストップされ、 溶液は黄色 を呈する。 450皿から 500nmの波長の光の吸光度の大きさにより、 ゥエル内のぺ ルォキシダーゼの量、 ひいてはジゴキシゲニンの量を評価することができる。 マ イク口プレートリーダ一 SPECTRA MAX 250 (Molecular Devices) を用いて 470nm の吸光度を測定した結果を表に示す。 （2ゥエルの平均値）
DTT濃度 1M lOOmM ImM OmM
プローブ 2 F 2.82 3.26 3.22 3.30
プローブ 2 G 0.03 0.12 2.12 2.99 数値が大きいほどマイク口タイ夕一プレートのゥヱルにジゴキシゲニンが多く存 在していることを意味する。 上の表より、 ジスルフィ ド結合を含まないプローブ
2 Fでは、 DTT濃度の如何にかかわらず 470nm吸光度は変わらないが、 ジスルフ ィ ド結合を含むプローブ 2 Gでは DTTの濃度変化に応じて 470皿吸光度が変化す ることが観測された。 この結果は、 DTT によりジスルフィ ド結合が固相上で切断 されることを示す。
(8) ピオチン一ジスルフィ ド結合間に導入したスぺ一サ一の有無によるジスル フィ ド結合切断効率の比較検討
( 8-1 ) プローブの調製
5，末端をピオチン化、 オリゴヌクレオチド鎖内にジスルフィ ド結合及びジゴキシ ゲニン修飾を施し、 ビォチンとジスルフイ ド結合の間にチミジンを 1つも導入し ない 20塩基のオリゴヌクレオチドからなるプローブ 2 H、 5 ' -(ピオチン） -[SS]- [DIG] -GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3'を通常のホスホロアミダイ ト固相合成法により 自動合成した。
( 8-2 ) 5，末端をピオチン化、 オリゴヌクレオチド鎖内にジスルフイ ド結合及 びジゴキシゲニン修飾を施し、 ピオチンとジスルフイ ド結合の間にチミジンを 5 個導入した、 25 塩基のオリゴヌクレオチドからなるプローブ 2 I、 5，-（ピオチ ン）- TTTTT- [SS] - [DIG]-GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC- 3，を通常のホスホロアミダイ ト固 相合成法により自動合成した。
( 8-3 ) 5'末端をピオチン化、 オリゴヌクレオチド鎖内にジスルフイ ド結合及 びジゴキシゲニン修飾を施し、 ピオチンとジスルフィ ド結合の間にチミジンを 10 個導入した、 30 塩基のオリゴヌクレオチドからなるプローブ 2 J、 5，-（ピオチ ン）- TTTTTTTTTT- [SS]- [D IG]- GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3'を通常のホスホロアミダ ィ ト固相合成法により自動合成した。
( 8-4) プローブの固相化
プロ一ブ 2 G、 プローブ 2 H、 プローブ 2 Iおよびプロ一ブ 2 J (それぞれ 500pM) を、 1 X SSPE 中で 95°Cにて 5分間加熱し、 すぐに氷冷した。 これらのプ ローブ溶液を、 ノーザンエリ一ザに添付のストレプトアビジンでコートされた 9 6穴マイクロ夕イタ一プレートに 1ゥエル当たり 添加して、 振盪しながら 37°Cにて 30分間反応させた。
( 8-5 ) DTTによるジスルフィ ド結合の切断
各ゥヱルをノーザンエリ一ザに添付の洗浄液 250〃 1で 3回洗浄後、 DTT(500mM、 100mM、 0M) と 0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む lxSSPEを 1 ゥヱルあたり lOOjul添加し、 振盪しながら 37°Cにて 30分間反応させた。
(8-6) ジゴキシゲニン検出
各ゥエルを洗浄液 250 /1で 3回洗浄後、ノーザンェリ一ザに添付の Anti- DIG-P0D (1 ゥエルあたり 5inUの抗体を含む を添加） と振盪しながら 37°Cにて 30 分間反応させた。 各ゥエルを洗浄液 250〃1で 3回洗浄後、 ノーザンエリ一ザに 添付の TMB Substrate Solution (1 ゥエルあたり 100 /1 を添加） と室温にて 5 分間反応させ、 ノーザンエリーザに添付の Stop Reagent (1 ゥエルあたり 100〃 1 を添加） で反応を止めた。 マイクロプレートリーダー SPECTRA MAX 250を用い て 490nmの吸光度を測定した結果を表に示す。 数値は、 固相上に残るジゴキシゲ ニンの量を、 DTT濃度 0Mで処理したときの 490皿吸光度を 100 とした時の残存 率で表したものである。 （2ゥエルの平均値）
DTT濃度 500mM lOOmM 0M
プローブ 2H (チミジン 0個） 27.5 75.0 100
プローブ 2G (チミジン 2個） 4.4 24.0 100
プロ一プ 21 (チミジン 5個） 3.9 21.4 100
プローブ 2 J (チミジン 10個） 4.3 19.1 100 ピオチンとジスルフィ ド結合の間にチミジンを 2個以上導入したプローブ（2 G、 2 1、 2 J) では、 いずれも DTT濃度 lOOmMで 20%前後、 500mMで 4%前後であ るのに対し、 プローブ 2Hでは、 DTT濃度 lOOmMにおいて約 3倍 （75% )、 500mM において約 6倍 （28% ) 高い数値を与えた。 これは、 ピオチンとジスルフィ ド結 合の間に十分なスぺ一サーを設けなかったことにより、 ジスルフィ ド結合の切断 が効率よく行われなかったことを示す。 この結果から、 固相上においてプローブ の切断部であるジスルフィ ド結合での切断反応の効率化を図るには、 固相固定部 であるビォチンとジスルフィ ド結合の間にスぺ一サーを導入する方が好ましい。 ( 9 ) ジゴキシゲニン標識プローブを用いた標的核酸の検出 （酵素抗体法 (比色））
( 9-1 ) プローブの固相化
プロ一ブ 1、 プローブ 2 G、標的核酸 A (それぞれ 300pM) を l x SSPE 中で混合 し、 95°Cにて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハイ ブリダイズさせた。 このハイブリッド体をノ一ザンェリ一ザに添付の、 ストレプ トァビジンでコ一卜された 9 6穴マイクロタイ夕一プレートに 1ゥエル当たり 94 l添加して、 振盪しながら 37°Cにて 30分間反応させた。 各ゥエルをノ一ザ ンェリ一ザに添付の洗浄液 250 1で 3回洗浄後、 15mM水酸化ナトリゥム水溶液 を 1ゥエルあたり 100 1添加し、 37°Cにて 30分間反応させて標的核酸 Aをプロ ーブより解離した。
( 9-2 ) 標的核酸 A及びその変異核酸のハイプリダイゼーシヨン
( 9 - 1 )でプローブを固相化したそれぞれのゥエルに、 標的核酸 Aとその変異核酸 である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列（それぞれ 600pM) を 1ゥヱルあたり 100 1添加し、 l x SSPE中で 37°Cにて 30分間反応させた後、 各ゥヱルを洗浄液 250 〃1で 3回洗浄した。
( 9-3 ) 固相上でのリガ一ゼ反応
( 9 - 2 )で調製したゥヱルに、 添付の反応緩衝液で稀釈した T4 DNA リガーゼ （1ゥ エルあたり 30IUのリガ一ゼを含む 100 / 1) を添加し、 37°Cにて 30分間反応さ せた。 洗浄液で 3回洗浄後、 20mM水酸化ナトリゥム水溶液で 37°Cにて 30分間反 応させ、 標的核酸 A及びその変異核酸である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列を プローブから解離した。
(9-4) DTTによるジスルフイ ド結合の切断
(9-3)で調製したゥエルに、 1Mの DTTを含む 1XSSPE を 1 ゥエルあたり 100〃1 添加し、 室温にて 30分間反応後、 各ゥエルを洗浄液 250〃1で 3回、 1.0%ドデ シル硫酸ナトリゥム水溶液 100〃1で 1回洗浄した。
(9-5) ジゴキシゲニン検出
(9-4)で調製したゥェルに、 ノーザンエリ一ザに添付の Anti- DIG- POD (1 ゥエル あたり 5mUの抗体を含む 100 1 を添加） を振盪しながら 37°Cにて 30分間反応 させた。各ゥヱルを洗浄液 250 1で 4回洗浄後、 ノーザンエリ一ザに添付の TMB Substrate Solution (1ゥヱルあたり 100 /1を添加） と室温にて 10分間反応さ せ、 ノーザンエリ一ザに添付の Stop Reagent (1 ゥエルあたり 100〃1 を添加） で反応を止めた。 マイクロプレートリーダー SPECTRA MAX 250を用いて 460nmの 吸光度を測定した結果を以下に示す。 （3ゥエルの平均値土標準偏差値） 標的核酸 A 1塩基過剰配列 1塩基欠損配列 核酸無添加
0.861±0.077 0.182±0.052 0.140±0.019 0.137±0.052 変異核酸である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列は、 核酸を添加しなかったゥェ ルと同等の値を示し、 標的核酸 Aのみ有意に大きな値を示した。 標的核酸の、 プ 口一ブ連結付近の配列の 1塩基の違いを認識したことを示している。 この実験結 果より、 標的核酸の有無を検出できることを証明した。
(10) ジゴキシゲニン標識プローブを用いた標的核酸の検出 （蛍光抗体法、 図 9)
(10-1) プローブの固相化
プロ一ブ 1、 プローブ 2 G、標的核酸 A (それぞれ 500nM) を lxSSPE 中で混合 し、 95°Cにて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハイ ブリダィズさせた。 このハイブリッ ド体を、 ストレプトアビジンでコートされた 黒色の 96穴マイクロタイ夕一プレ一ト （ベーリンガー 'マンハイム） に 1ゥェ ルあたり 94 zl添加して、 振盪しながら 37°Cにて 30分間反応させた。 各ゥエル をノーザンエリ一ザに添付の洗浄液 250 1で 3回洗浄後、 0.1%ドデシル硫酸ナ トリゥムを含む 10mM水酸化ナトリゥム水溶液を 1ゥエルあたり 100〃1添加し、 37°Cにて 10分間反応させて標的核酸 Aをプローブより解離した。
(10-2) 標的核酸 A及びその変異核酸のハイプリダイゼ一シヨン
(10- 1)でプローブを固相化したそれぞれのゥヱルに、 標的核酸 Aとその変異核酸 である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列（それぞれ 1 M) を 1 ゥエルあたり 100 1添加し、 lxSSPE中で 37°Cにて 30分間反応させた後、 各ゥエルを洗浄液 250 〃1で 3回洗浄した。
(10-3) 固相上でのリガーゼ反応
(10- 2)で調製したゥヱルに、 添付の反応緩衝液で稀釈した T4 DNA リガーゼ （1 ゥエルあたり 30IUのリガ一ゼを含む 100〃1) を添加し、 37°Cにて 30分間反応 させた。 洗浄液で 3回洗浄後、 0.1%ドデシル硫酸ナトリゥムを含む lOmM水酸化 ナトリウム水溶液を 1ゥエルあたり 100 1添加し、 37°Cにて 10分間反応させ、 標的核酸 Aおよびその変異核酸をプロ一ブから解離した。
(10-4) DTTによるジスルフイ ド結合の切断
(10- 3)で調製したゥエルに、 500mMの DTTと 0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含 む lxSSPEを 1ゥヱルあたり 100 1添加し、 室温にて 30分間反応後、 各ゥエル を洗浄液 250〃1で 3回洗浄した。
(10-5) ローダミン標識抗 DIG抗体との反応
(10- 4)で調製したゥエルに、 ローダミン標識抗ジゴキシゲニン抗体 （ベ一リンガ — 'マンハイム ： 1 ゥエルあたり 2 gの抗体を含む 100 1 ) を添加し、 37°C にて 30分間反応させた後、 各ゥヱルを洗浄液 250 1で 3回洗浄した。
(10-6) 蛍光検出
(10- 5)で調製したゥエルに、 lxSSPE を 1 ゥエルあたり 100/ 1添加し、 蛍光プ レートリーダーフルォロスキャン I I (大日本製薬） を用いて励起波長 584nm、 観 測波長 612η で測定した結果を以下に示す。 （3ゥエルの平均値士標準偏差値） 標的核酸 A 1塩基過剰配列 1塩基欠損配列 核酸無添加
0.133±0.005 Ο. Π5±0.006 0.094±0.010 0.080±0.013 標的核酸 Αでは、 核酸無添加時に比べて明らかに大きな数値を与えた。 変異核酸 である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列は、 核酸無添加の数値よりわずかに大き いが標的核酸 Aに比べて有意に小さい数値を示した。 この実験結果より、 標的核 酸の有無を検出できることを証明した。
( 11 ) ジゴキシゲニン標識プローブを用いた標的核酸の検出 （酵素抗体法 (蛍光)、 図 10)
( 11-1 ) プローブの固相化
プローブ 1、 プローブ 2 G、標的核酸 A (それぞれ ΙΟΟηΜ) を I x SSPE 中で混合 し、 95°Cにて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハイ ブリダィズさせた。 このハイブリッ ド体を、 ストレプトアビジンでコートされた 黒色の 9 6穴マイクロタイ夕一プレートに 1ゥヱルあたり 94 / 1添加して、 振盪 しながら 37°Cにて 30分間反応させた。 各ゥエルをノーザンエリ一ザに添付の洗 浄液 250 1で 3回洗浄後、 0.1 %ドデシル硫酸ナトリウムを含む 10mM水酸化ナ トリウム水溶液を 1ゥエルあたり 100 / 1添加し、 37 Cにて 10分間反応させて標 的核酸 Aをプローブより解離した。
( 11-2) 標的核酸 A及びその変異核酸のハイプリダイゼーシヨン
(11-1 )でプロ一ブを固相化したそれぞれのゥエルに、 標的核酸 Aとその変異核酸 である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列（それぞれ 200nM) を 1ゥエルあたり 100 β \添加し、 1 X SSPE中で 37°Cにて 30分間反応させた後、 各ゥエルを洗浄液 250 〃1で 3回洗浄した。 (11-3) 固相上でのリガ一ゼ反応
(1卜 2)で調製したゥエルに、 添付の反応緩衝液で稀釈した T4 DNA リガ一ゼ （1 ゥエルあたり 30IUのリガーゼを含む 100〃1) を添加し、 37°Cにて 30分間反応 させた。 各ゥエルを洗浄液 250 zlで 3回洗浄後、 0.1%ドデシル硫酸ナトリウム を含む 10mM水酸化ナトリゥム水溶液を 1ゥエルあたり 添加し、 37°Cにて 10分間反応させ、 標的核酸 Aおよびその変異核酸をプローブから解離した。
(11-4) DTTによるジスルフイ ド結合の切断
(U- 3)で調製したゥヱルに、 500mMの DTT と 0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含 む lxSSPEを 1ゥヱルあたり 100〃1添加し、 室温にて 30分間反応後、 各ゥエル を洗浄液 250 1で 3回洗浄した。
(11-5) ジゴキシゲニン検出
(1卜 4)で調製したゥエルに、 アル力リフォスファタ一ゼ標識抗ジゴキシゲニン抗 体 （ベ一リンガ一 ·マンハイム ： 1 ゥエルあたり 7.5mUの抗体を含む 100 1) を添加し、 37°Cにて 30分間反応させた後、 各ゥヱルを洗浄液 250 1で 3回洗浄 した。 アルカリフォスファタ一ゼ基質として蛍光生成物を与える AttoPhos (ベ —リンガー 'マンハイム） を 1ゥエルあたり 100〃1添カ卩し、 37°Cにて 30分間反 応させた後、蛍光プレートリーダ一フルォロスキャン IIを用いて励起波長 485nm、 観測波長 590nmで測定した結果を以下に示す。 （4ゥエルの平均値士標準偏差値） 標的核酸 A 1塩基過剰配列 1塩基欠損配列 核酸無添加
230.4±15.2 159.3±6.2 132.0±9.3 63.5±2.8 標的核酸 Aでは、 核酸無添加時に比べて明らかに大きな数値を与えた。 変異核酸 である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列は、 核酸無添加の数値より大きいが標的 核酸 Aに比べて有意に小さい数値を示した。 この実験結果より、 標的核酸の有無 を検出できることを証明した。 (12) Rhodamine Red標識プローブを用いた標的核酸の検出 （図 8A)
(12-1) 5，末端をピオチン化、 オリゴヌクレオチド鎖内にジスルフイ ド結合及 び蛍光色素 Rhodamine Red ([RR]と表記） 修飾を施し、 ピオチンとジスルフィ ド 結合の間にチミジンを 2個導入した、 22 塩基のオリゴヌクレオチドからなるプ ローブ 2K、 5，-（ピオチン）- TT- [SS]- [RR]-GGTGGCGGCCGCTCTAGMC- 3，を通常のホ スホロアミダイ ト固相合成法により自動合成した。
(12-2) プローブの固相化
プローブ 1、 プローブ 2 K、標的核酸 A (それぞれ 750nM) を lxSSPE 中で混合 し、 95°Cにて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハイ ブリダィズさせた。 このハイブリッ ド体を、 ストレプトアビジンでコートされた 黒色の 96穴マイクロタイ夕一プレートに 1ゥエルあたり 94 l添加し、 振盪し ながら 37°Cにて 30分間反応させた。 各ゥエルをノーザンエリ一ザに添付の洗浄 液 250/zlで 3回洗浄後、 20mM水酸化ナトリウム水溶液を 1ゥヱルあたり 100 1 添加し、 37°Cにて 7分間反応させて標的核酸 Aをプローブより解離した。
(12-3) 標的核酸 A及びその変異核酸のハイブリダィゼーシヨン
( 12- 2 )でプロ一ブを固相化したそれぞれのゥエルに、 標的核酸 Aとその変異核酸 である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列（それぞれ 1.5 /M)を 1ゥエルあたり 100 μ.\添加し、 lxSSPE中で 37°Cにて 30分間反応させた後、 各ゥヱルを洗浄液 250 dで 4回洗浄した。
(12-4) 固相上でのリガーゼ反応
(12-3)で調製したゥヱルに、 添付の反応緩衝液で稀釈した Ampligase (EPICENTRE TECHNOLOGIES製：耐熱性リガーゼ、 1ゥエルあたり 20Uのリガーゼを含む 100〃 1 ) を添加し、 37°Cにて 30分間反応させた。 各ゥエルを洗浄液 250 /1で 4回洗 浄した後、 20mM水酸化ナトリゥム水溶液を 1 ゥヱルあたり 100〃 1添加し、 37°C にて 7分間反応させて標的核酸 Aおよびその変異核酸をプローブより解離した。
(12-5) DTTによるジスルフイ ド結合の切断 ( 12-4)で調製したゥエルに、 400mM DTT と 0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む 1 X SSPEを 1 ゥエルあたり 100 1添加し、 37°Cにて 30分間反応後、 各ゥエル洗 浄液 250 1で 4回で洗浄した。
( 12-6 ) 蛍光検出
( 12- 5 )で調製したゥエルに、 l x SSPE を 1 ゥエルあたり 100〃1添加し、 蛍光プ レートリーダーフルォロスキャン H を用いて励起波長 584nm、 観測波長 612nm で測定した結果を以下に示す。 （n=4の平均値士標準偏差値） 標的核酸 A 1塩基過剰配列 1塩基欠損配列 核酸無添加
0.385±0.020 0.199± 0.008 0.235±0.005 0.229±0.023 標的核酸 Aでは、 核酸無添加時に比べて有意に大きな数値を与えた。 変異核酸で ある 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列は、 核酸無添加の数値とほぼ同じ数値を与 え、 標的核酸 Aに比べて小さい数値を示した。 この実験結果より、 標的核酸の有 無を検出できることを証明した。
( 13 ) TEXAS Red標識プローブを用いた標的核酸の検出 （図 8B)
( 13-1 ) 5，末端をピオチン化、 オリゴヌクレオチド鎖内にジスルフィ ド結合及 び蛍光色素 TEXAS Red ( [TR]と表記） 修飾を施し、 ピオチンとジスルフィ ド結合 の間にチミジンを 2個導入した、 22 塩基のオリゴヌクレオチドからなるプロ一 ブ 2 L、
5， - (ピオチン） -TT- [ SS ] - [TR] -GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-3'を通常のホスホロアミダ ィ ト固相合成法により自動合成した。
( 13-2) プローブの固相化
プローブ 1、 プローブ 2 L、標的核酸 A (それぞれ 1〃M) を l x SSPE中で混合し、 95°Cにて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハイプリ ダイズさせた。 このハイブリッ ド体を、 ストレプトアビジンでコートされた黒色 の 96穴マイクロタイ夕一プレートに 1ゥヱルあたりに 94〃 1添加し、 振盪しな がら 37°Cにて 30分間反応させた。 各ゥエルをノーザンエリ一ザに添付の洗浄液 250 lで 3回洗浄後、 20mM水酸化ナトリゥム水溶液を 1ゥヱルあたり 添 加し、 37°Cにて 7分間反応させて標的核酸 Aをプローブより解離した。
(13-3) 標的核酸 A及びその変異核酸のハイプリダイゼ一シヨン
( 13-2 )でプロ一ブを固相化したそれぞれのゥヱルに、 標的核酸 Aとその変異核酸 である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列 （それぞれ を 1ゥヱルあたり 100 〃1添加し、 lxSSPE中で 37°Cにて 30分間反応させた後、 各ゥエルを洗浄液 250 Ulで 4回洗浄した。
(13-4) 固相上でのリガ一ゼ反応
(13- 3)で調製したゥヱルに、 添付の反応緩衝液で稀釈した Ampligase (1 ゥエル あたり 20Uのリガーゼを含む 100 /1 ) を添カ卩し、 37°Cにて 30分間反応させた。 各ゥエルを洗浄液 250〃1で 4回洗浄した後、 20mM水酸化ナトリゥム水溶液を 1 ゥエルあたり 100〃1添加し、 37°Cにて 7分間反応させて標的核酸 Aおよびその 変異核酸をプローブより解離した。
(13-5) DTTによるジスルフイ ド結合の切断
(13-4)で調製したゥエルに、 500mM DTT と 0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む 1 X SSPEを 1ゥエルあたり 100〃 1添加し、 37°Cにて 50分間反応後、 各ゥエルを 洗浄液 250 1で 4回で洗浄した。
(13-6) 蛍光検出
(13- 5)で調製したゥエルに、 lxSSPE を 1 ゥエルあたり 100 /1添加し、 蛍光プ レートリーダ—フルォロスキャン II を用いて励起波長 584nm、 観測波長 612nm で測定した結果を以下に示す。 （n=4の平均値士標準偏差値） 標的核酸 A 1塩基過剰配列 1塩基欠損配列 核酸無添加
0.128±0.010 0.054±0.007 0.062±0.004 0.058±0.011 標的核酸 Aでは、 核酸無添加時に比べて有意に大きな数値を与えた。 変異核酸で ある 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列は、 核酸無添加の数値とほぼ同じ数値を与 え、 標的核酸 Aに比べて小さい数値を示した。 この実験結果より、 標的核酸の有 無を検出できることを証明した。
(14) ジゴキシゲニン標識プローブを用いた標的核酸の検出 （酵素抗体法 (化学 発光)、 mi)
(14-1) プローブの固相化
プローブ 1、 プローブ 2 G、 標的核酸 A (それぞれ ΙΟΟρΜ) を lxSSPE中で混合 し、 95°Cにて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハイ ブリダィズさせた。 このハイブリッ ド体を、 ストレプトアビジンでコートされた 黒色の 96穴マイクロタイ夕一プレートに 1ゥエルあたり 94〃1添加して、 振盪 しながら 37°Cにて 10分間反応させた。 各ゥエルをノーザンエリーザに添付の洗 浄液 250〃 1で 3回洗浄後、 20mM水酸化ナトリゥム水溶液を 1 ゥヱルあたり 100 1添加し、 37°Cにて 5分間反応させて標的核酸 Aをプローブより解離した。 (14-2) 標的核酸 A及びその変異核酸のハイプリダイゼーシヨン
(14- 1)でプロ一ブを固相化したそれぞれのゥヱルに、 標的核酸 Aとその変異核酸 である 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列 （それぞれ InM) を 1 ゥエルあたり 100 〃1添加し、 1XSSPE中で 37°Cにて 60分間反応させた後、 各ゥエルを洗浄液 250 〃1で 4回洗浄した。
(14-3) 固相上でのリガーゼ反応
(14-2)で調製したゥヱルに、 添付の反応緩衝液で稀釈した Ampligase (1 ゥエル あたり 10Uのリガーゼを含む 100 /1) を添加し、 37°Cにて 15分間反応させた後、 各ゥ 1ルを洗浄液 250 1で 4回洗浄した。
(14-4) DTTによるジスルフイ ド結合の切断
(14-3)で調製したゥエルに、 400mM DTT と 0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む O. IM トリス塩酸緩衝液 （pH8.0) を 1 ゥエルあたり 100〃1添加し、 37°Cにて 30 分間反応した。 各ゥエルを洗浄液 250 1で 4回洗浄した後、 20mM水酸化ナトリ ゥム水溶液を 1 ゥヱルあたり 100 1添加し、 37°Cにて 5分間反応させて標的核 酸 Aおよびその変異核酸をプローブより解離した。
( 14-5 ) ジゴキシゲニン検出
( 14-4)で調製したゥヱルに、 1 %牛血清アルブミン含有リン酸緩衝溶液に溶解し たペルォキシダ一ゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体 (1 ゥエルあたり 5mUの抗体を含 む 100/ l) を添加し、 37°Cにて 30分間反応させた後、 各ゥヱルを洗浄液 250〃1 で 4回洗浄した。 BM Chemi luminescence EL ISA Reagent (ベーリンガ一 ·マンノ、 ィム） に添付の Substrate reagent A ( ルミノールおよび 4-ョ一ドフエノール 含有、 1 ゥエルあたり 99〃1 ) および Starting reagent B ( 過酸化水素含有、 1 ゥヱルあたり 1〃1 ) を添加し、 室温にて 5分間反応させた後、 発光プレート リーダ一 MLR100 (コロナ産業） を用いて測定した結果を以下に示す。 （n=4 の平 均値士標準偏差値） 標的核酸 A 1塩基過剰配列 1塩基欠損配列 核酸無添加
20556±442 1487±84 1757± 114 1394± 113 標的核酸 Aでは、 核酸無添加時に比べて有意に大きな数値を与えた。 変異核酸で ある 1塩基過剰配列、 1塩基欠損配列は、 核酸無添加の数値より大きいが標的核 酸 Aに比べて小さい数値を示した。 この実験結果より、 標的核酸の有無を検出で きることを証明した。
( 15 ) 切断部としてデォキシゥリジンを導入したプローブによる核酸検出
( 15- 1 ) 5，末端をピオチン化、 オリゴヌクレオチド鎖内にデォキシゥリジン （dU と表記） 及びジゴキシゲニン修飾を施した、 2 5塩基のオリゴヌクレオチドから なるプローブ 2 M、 5， - (ピオチン） - dUdUdUdUdU- [D I G ] -GGTGGCGGCCGCTCTAGAAC-35を通常のホスホロァ ミダイ ト固相合成法により自動合成した。
(15-2) 標的核酸 Aに相補的な配列を有する 40塩基のォリゴヌクレオチドか らなる標的核酸 A相補配列、 5' -GGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGC-3' を通常のホスホロアミダイ ト固相合成法により自動合成した。
(15-3) プローブの固相化
プローブ 1、 プローブ 2M、 標的核酸 A (それぞれ 500pM) を IxSSPE中で混合 し、 95°Cにて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハイ ブリダイズさせた。 このハイブリッド体をノーザンェリ一ザに添付の、 ストレブ トァビジンでコートされた 96穴マイクロタイ夕一プレートに 1ゥエルあたり 94 μ.1添加し、 振盪しながら 37°Cにて 10分間反応させた。 各ゥエルをノーザンェ リーザに添付の洗浄液 250 1で 3回洗浄後、 20mM水酸化ナトリウム水溶液を 1 ゥエルあたり 100 1添加し、 37°Cにて 5分間反応させて標的核酸 Aをプローブ より解離した。
(15-4) 標的核酸 A及び標的核酸 A相補配列のハイブリダィゼ一シヨン
(15- 3)でプローブを固相化したそれぞれのゥエルに、 標的核酸 Aとこれに相補的 な配列からなる標的核酸 A相補配列 （それぞれ InM) を 1 ゥエルあたり 100 /1 添加し、 IxSSPE中で 37°Cにて 60分間反応させた後、 各ゥエルを洗浄液 250〃1 で 4回洗浄した。
(15-5) 固相上でのリガ一ゼ反応
(15- 4)で調製したゥエルに、 添付の反応緩衝液で稀釈した Ampligase (1 ゥエル あたり 10Uのリガーゼを含む 100 zl) を添加し、 37°Cにて 15分間反応させた。 各ゥエルを洗浄液 250 /1で 4回洗浄後、 20mM水酸化ナトリゥム水溶液を 1ゥェ ルあたり 100 1添加し、 37°Cにて 5分間反応させ、 標的核酸 A及び標的核酸 A 相補配列をプロ一プから解離した。
( 15-6 ) ゥラシル DNAグリコシダ一ゼによるデォキシゥリジン鎖の切断 ( 15- 5 )で調製したゥヱルに、 添付の反応緩衝液で稀釈したゥラシル MAグリコシ ダーゼ （アマシャム： 1ゥヱルあたり 5Uの酵素を含む 100〃1) を添加し、 室温 にて 30分間反応させた。 各ゥヱルを洗浄液 250〃1で 4回洗浄後、 1.0M トリス 塩酸緩衝液 （ρΗΙΟ. Ο) を 1ゥエルあたり 100〃1添加し、 70°Cにて 10分間放置し た。 各ゥヱルを洗浄液 250 / 1で 4回洗浄後、 20mM水酸化ナトリゥム水溶液を 1 ゥエルあたり 100 1添加し、 37°Cにて 5分間反応させて標的核酸 Aおよび標的 核酸 A相補配列をプローブより解離した。
( 15-7) ジゴキシゲニン検出
( 15- 6 )で調製したゥエルに、 ノーザンエリーザに添付の Anti- D IG-POD ( 1ゥエル あたり 5mUの抗体を含む 100 1 ) を添加し、 振盪しながら 37°Cにて 30分間反応 させた。各ゥヱルを洗浄液 250〃1で 4回洗浄後、 ノ一ザンェリ一ザに添付の TMB Substrate Solution^ゥエルあたり 100〃1添加）と室温にて 1 0分間反応させ、 ノーザンエリ一ザに添付の Stop Reagent ( 1 ゥエルあたり 100〃1 添加）で反応を 止めた。 マイクロプレートリーダ一 SPECTRA MAX 250を用いて 460nmの吸光度を 測定した結果を以下に示す。 （n=4の平均値 ±標準偏差値） 標的核酸 A 標的核酸 A相補配列 核酸無添加
0.383± 0. 018 0.099±0.011 0. 119±0.004 変異核酸である標的核酸 A相補配列は、 核酸を添加しなかったゥエルと同等の値 を示し、 標的核酸 Aのみ有意に大きな値を示した。 この実験結果より、 切断部を デォキシゥリジンとした場合においても切断 （開裂） が起きること、 また切断部 としてデォキシゥリジンを導入したプローブを使用しても標的核酸の有無を検出 できることが証明された。
( 16 ) 長鎖標的核酸 （ 1 0 0塩基） の検出
( 16-1 ) 標的核酸 Aの配列を真ん中に含む、 1 0 0塩基のオリゴヌクレオチド からなる標的核酸 B、 5' -
CGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGC GGTGGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGA-3'を通常のホスホ口アミダイ ト固相合成法によ り自動合成した。
(16-2) プローブの固相化
プロ一ブ 1、 プローブ 2 G、 標的核酸 A (それぞれ InM) を 1 xSSPE中で混合し、 95°Cにて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハイプリ ダイズさせた。 このハイブリッド体を、 ストレプトアビジンでコートされた黒色 の 96穴マイクロタイ夕一プレートに 1ゥエルあたり 添加し、 振盪しなが ら 37°Cにて 10分間反応させた。各ゥヱルをノーザンエリーザに添付の洗浄液 250 j lで 2回洗浄後、 20mM水酸化ナトリゥム水溶液を 1 ゥエルあたり 100〃1添加 し、 37°Cにて 5分間反応させて標的核酸 Aをプローブより解離した。
(16-3) 標的核酸 B及び標的核酸 Aのハイブリダィゼ一シヨン
(16- 2)でプローブを固相化したそれぞれのゥヱルに、標的核酸 Bと標的核酸 A (陽 性対照） （それぞれ InM) を 1 ゥエルあたり 100〃 1添加し、 lxSSPE中で 60°Cに て 60分間反応させた後、 各ゥエルを洗浄液 250 1で 4回洗浄した。
( 16-4) 固相上でのリガーゼ反応
(16- 3)で調製したゥエルに、 添付の反応緩衝液で稀釈した Ampligase (1 ゥエル あたり 10Uのリガーゼを含む 100 1) を添加し、 60°Cにて 10分間反応させたあ と、 各ゥエルを洗浄液 250 /1で 4回洗浄した。
(16-5) DTTによるジスルフイ ド結合の切断
(16- 4)で調製したゥエルに、 400mM DTT と 0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む 0.1M トリス塩酸緩衝液 （pH8.0) を 1 ゥエルあたり 100〃1添加し、 60°Cにて 30 分間反応した。 各ゥヱルを洗浄液 250 1で 5回洗浄した後、 20mM水酸化ナトリ ゥム水溶液を 1 ゥエルあたり 100 1添加し、 60°Cにて 5分間反応させて標的核 酸 Bおよび標的核酸 Aをプローブより解離した。 (16-6) ジゴキシゲニン検出
(16-5)で調製したゥエルに、 ノーザンエリ一ザに添付の Anti-DIG-POD (1ゥエル あたり 5mUの抗体を含む 100 /1) を添加し、 振盪しながら 37°Cにて 30分間反応 させた。 各ゥヱルを洗浄液 250〃1で 4回洗浄後、 ノーザンエリーザに添付の TMB Substrate Solution(lゥェルあたり 100〃1添加）と室温にて 10分間反応させ、 ノーザンエリ一ザに添付の Stop Reagent (1 ゥエルあたり 100〃1添加）で反応を 止めた。 マイクロプレートリーダ一 SPECTRA MAX 250を用いて 460nmの吸光度を 測定した結果を以下に示す。 （n二 4の平均値土標準偏差値） 標的核酸 B( 100塩基） 標的核酸 A(40塩基） 核酸無添加
0.171±0.009 0.449±0.017 0.011±0.001 標的核酸 B( 100塩基)は、 核酸無添加と比較して有意に大きな数値を与えたこ とから、 標的核酸中にプローブが認識する配列以外に別の配列が含まれていても 検出できることを証明した。
(17) 二本鎖標的核酸 （40塩基対） の検出
(17-1) プローブの固相化
プローブ 1、 プローブ 2G、 標的核酸 A (それぞれ InM) を lxSSPE中で混合し、 95°Cにて 5分間加熱変性させ、 その後 55°Cにて 10分間保つことによりハイプリ ダイズさせた。 このハイブリッド体を、 ストレプトアビジンでコートされた黒色 の 96穴マイクロタイ夕一プレートに 1ゥヱルあたり 90〃1添加し、 振盪しなが ら 37°Cにて 10分間反応させた。各ゥヱルをノーザンエリーザに添付の洗浄液 250 /1で 4回洗浄後、 20mM水酸化ナトリウム水溶液を 1ゥヱルあたり 100〃1添加 し、 37°Cにて 5分間反応させて標的核酸 Aをプローブより解離した。
(17-2) 標的核酸 A及びその変異核酸のハイプリダイゼ一シヨン
(17- 1)でプロ一ブを固相化したそれぞれのゥエルに、 2XSSPEを 1 ゥエルあたり 90 1 添加した後、 標的核酸 Aと標的核酸 A相補配列からなる二本鎖核酸、 標的 核酸 A (陽性対照）および標的核酸 A相補配列（陰性対照）を InM含む O.OlxSSPE を 1 ゥヱルあたり 10〃1添加し （最終濃度 100pM)、 37°Cにて 60分間反応させた 後、 各ゥエルを洗浄液 250 1で 4回洗浄した。
(17-3) 固相上でのリガ一ゼ反応
(17- 2)で調製したゥヱルに、 添付の反応緩衝液で稀釈した Ampligase (1 ゥエル あたり 10Uのリガーゼを含む 100 /1) を添加し、 37°Cにて 15分間反応させたあ と、 各ゥ: ルを洗浄液 250 1で 4回洗浄した。
(17-4) DTTによるジスルフイ ド結合の切断
(17- 3)で調製したゥエルに、 400mM DTT と 0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む 0.1M トリス塩酸緩衝液 （pH8.0) を 1 ゥヱルあたり 100 1添加し、 37°Cにて 30 分間反応した。 各ゥヱルを洗浄液 250〃1で 4回洗浄した後、 20mM水酸化ナトリ ゥム水溶液を 1 ゥヱルあたり 100 zl添加し、 37°Cにて 5分間反応させて二本鎖 標的核酸およびコントロール核酸をプローブより解離した。
(17-5) ジゴキシゲニン検出
(17- 4)で調製したゥエルに、 ノーザンエリ一ザに添付の Anti- DIG-POD (1ゥエル あたり 5mUの抗体を含む 100 /1) を添加し、 振盪しながら 37°Cにて 30分間反応 させた。各ゥヱルを洗浄液 250〃1で 4回洗浄後、 ノーザンエリ一ザに添付の TMB Substrate Solution(lゥエルあたり 100 1添加）と室温にて 1 0分間反応させ、 ノーザンエリ一ザに添付の Stop Reagent (1 ゥエルあたり 100〃 1添加）で反応を 止めた。 マイクロプレートリーダー SPECTRA MAX 250を用いて 460nmの吸光度を 測定した結果を以下に示す。 （n=3の平均値士標準偏差値） 二本鎖核酸 標的核酸 A 標的核酸 A相補配列 核酸無添加
0.084±0.006 0.095±0.006 0.044±0.004 0.039±0.002 二本鎖核酸は、 核酸無添加時や標的核酸 A相補配列に比べて有意に大きな、 標的 核酸 Aに匹敵する数値を与えた。 この実験結果より、 二本鎖の試料を用いた場合 も標的核酸が検出できることを証明した。 産業上の利用可能性
本発明に係るプローブ 1及び 2、 また本発明に係る固相は、 以上説明した構造 を有するものであり、 従って、 本発明に係る固相上で標的核酸をハイブリダィズ させた場合、 固相上のプロ一ブはハイブリツド体を形成することに有利な空間位 置を有し、 効率的にハイブリッド体を形成する。 従ってリガ一ゼ反応によりプロ —プ 1及び 2が効率的に結合する。さらにハイプリヅド体の標的核酸を除いた後、 切断部の切断反応により、 上記結合したプローブ 2のみが固相上に存在し得るこ ととなる。
従って、 遊離のプローブ 2を洗浄で除いた後、 固相上の上記結合したプローブ 2 の存在を高感度でかつ、 高認識で検出することが可能となる。 このことは、 標 的核酸の存在を従来の方法に比較してより高感度かつ高認識で検出することを可 能とするものである。

Claims

請求の範囲
1 . ( 1 ) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1と相補的な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5， 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端に第 1の固相固定部が結合された、 プローブ 1と、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、
(a)前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(b)前記切断部の他端に第 2の固相固定部が結合された、
プローブ 2とからなる、
1組の標的核酸検出プローブ。
2 . ( 1 ) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1と相補的な塩基配列 B 1を有し、
)前記塩基配列 B 1の 5 ' 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(c)前記切断部の他端に第 1の固相固定部が結合された、
プローブ 1と、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、 前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端に第 2の固相固定部が結合された、
プローブ 2とからなる、
1組の標的核酸検出プ口一ブ。
3 . 請求項 1に記載の標的核酸検出プローブであって、
前記プローブ 2が、 前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端と前記切断部の間にさらに標 識部を有することを特徴とする標的核酸検出プローブ。
4 . 請求項 2に記載の標的核酸検出プローブであって、
前記プローブ 1が、 前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端と前記切断部の間にさらに標 識部を有することを特徴とする標的核酸検出プローブ。
5 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の標的核酸検出プローブであつ て、
前記切断部が、 ジスルフィ ド結合を有することを特徴とする標的核酸検出プロ ーブ。
6 . ( 1 ) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1と相補的な塩基配列 B 1を有し、
( a)前記塩基配列 B 1の 5 ' 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端に第 1の固相固定部が結合されたプローブ 1 が、
前記第 1の固相固定部により表面に固定され、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、
( a)前記塩基配列 B 2の 5， 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(b)前記切断部の他端に第 2の固相固定部が結合されたプローブ 2が、 前記第 2の固相固定部により表面に固定された、
標的核酸検出固相。
7 . ( 1 ) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2のうちの A 1と相補的な塩基配列 B 1を有し、
( a)前記塩基配列 B 1の 5， 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
( c )前記切断部の他端に第 1の固相固定部が結合されたプローブ 1が、 前記第 1の固相固定部により表面に固定され、
(2 ) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、 前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端に第 2の固相固定部が結合されたプローブ 2が、 前記第 2の固相固定部により表面に固定された、
標的核酸検出固相。
8 . 請求項 6に記載の標的核酸検出固相であって、
前記プローブ 2が、 前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端と前記切断部の間にさらに標 識部を有することを特徴とする標的核酸検出固相。
9 . 請求項 7に記載の標的核酸検出固相であって、
前記プローブ 1が、 前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端と前記切断部の間にさらに標 識部を有することを特徴とする標的核酸検出固相。
1 0 . 請求項 6〜9のいずれか 1項に記載の標的核酸検出固相であって、 前記切断部が、ジスルフィ ド結合を有することを特徴とする標的核酸検出固相。
1 1 . (A) ( 1 ) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2の うちの A 1と相補的な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5 ' 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3， 末端に第 1の固相固定部が結合された、
プローブ 1を前記第 1の固相固定部で固相表面に固定し、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、
(a)前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(b)前記切断部の他端に第 2の固相固定部が結合された、
プローブ 2を前記第 2の固相固定部で固相表面に固定する第 1の工程と、
(B)前記プローブ 1と、 前記プローブ 2と、前記標的核酸とをハイプリダイズ し てハイプリッド体を形成する第 2の工程と、
(C) 前記ハイブリツド体の前記プローブ 1と前記プローブ 2とをリガ一ゼ反応 により結合する第 3の工程と、
(D) 前記プローブ 2の切断部を切断反応により切断する第 4の工程と、
(E) 前記第 3の工程により形成される、 前記プローブ 2の塩基配列 B 2と前記 切断部を結合した前記プローブ 1を検出する第 5の工程とを、 含むことを特徴と する標的核酸検出方法。
1 2 . (A) ( 1 ) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A 2の うちの A 1と相補的な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5， 末端がリン酸ィ匕され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端に切断部が結合され、 かつ
(c)前記切断部の他端に第 1の固相固定部が結合されたプローブ 1を前記第 1 の固相固定部で固相表面に固定し、
(2) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、 前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端に第 2の固相固定部が結合されたプローブ 2を前記 第 2の固相固定部で固相表面に固定する第 1の工程と、
(B) 前記プローブ 1と、 前記プローブ 2と、 前記標的核酸とをハイブリダィズ してハイプリヅド体を形成する第 2の工程と、
(C) 前記ハイプリッ ド体の前記プローブ 1と前記プローブ 2とをリガ一ゼ反応 により結合する第 3の工程と、
(D) 前記プローブ 1の切断部を切断反応により切断する第 4の工程と、
(E)前記第 3の工程により形成される、前記プローブ 1の塩基配列 B 1と前記 切 断部を結合した前記プローブ 2を検出する第 5の工程とを、 含むことを特徴とす る標的核酸検出方法。
1 3 . 請求項 1 1に記載の標的核酸検出方法であって、
前記プローブ 2が、 前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端と前記切断部の間にさらに標 識部を有し、 前記標識部を検出することを特徴とする標的核酸検出方法。
1 4 . 請求項 1 2に記載の標的核酸検出方法であって、
前記プローブ 1が、 前記塩基配列 B 1の 3 ' 末端と前記切断部の間にさらに標 識部を有し、 前記標識部を検出することを特徴とする標的核酸検出方法。
1 5 . 請求項 1 1〜 1 4のいずれか 1項に記載の標的核酸検出方法で あって、
前記切断部が、 ジスルフィ ド結合を有し、 かつ前記第 4の工程においてジスル フィ ド結合を還元剤により切断することを特徴とする標的核酸検出方法。
1 6. 請求項 1 1〜 15のいずれか 1項に記載の標的核酸検出方法で あって、
前記第 5の工程において、 固相に結合しているプローブの質量を表面ブラズモ ン共鳴法により検出することを特徴とする標的核酸検出方法。
1 7. (A) (1) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1A2と、
(2) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1 A2のうちの A 1と相補的 な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5 ' 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3' 末端に第 1の固相固定部が結合された、
プローブ 1と、
(3) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、
(a)前記塩基配列 B 2の 5' 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(b)前記切断部の他端に第 2の固相固定部が結合された、
プローブ 2とを、
ハイプリダイズしてハイブリツド体を形成する第 1の工程と、
(B) 前記ハイブリッド体を、 前記第 1の固相固定部および前記第 2の固相固定 部で、 固相表面に固定する第 2の工程と、
(C) 前記ハイブリツド体から前記標的核酸を除去する第 3の工程とを、 有する標的核酸検出固相の製造方法。
18. (A) (1) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1A2と、
(2) 標的核酸の連続する 2つの特定の塩基配列 A 1A2のうちの A 1と相補的 な塩基配列 B 1を有し、
(a)前記塩基配列 B 1の 5， 末端がリン酸化され、
(b)前記塩基配列 B 1の 3， 末端が切断部の 1端と結合され、 かつ
(c)前記切断部の他端に第 1の固相固定部が結合された、
プローブ 1と、 (3) 前記塩基配列 A 1 A 2のうちの A 2と相補的な塩基配列 B 2を有し、 前記塩基配列 B 2の 5 ' 末端に第 2の固相固定部が結合された、
プローブ 2とを、
ハイブリダィズしてハイプリッド体を形成する第 1の工程と、
(B) 前記ハイブリッ ド体を、 前記第 1の固相固定部および前記第 2の固相固定 部で、 固相表面に固定する第 2の工程と、
(C ) 前記ハイプリッド体から前記標的核酸を除去する第 3の工程とを、 有する標的核酸検出固相の製造方法。
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