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WO1999039192A1 - Perfectionnements aux systemes d'electrophorese multicapillaires - Google Patents

Perfectionnements aux systemes d'electrophorese multicapillaires Download PDF

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Publication number
WO1999039192A1
WO1999039192A1 PCT/FR1999/000184 FR9900184W WO9939192A1 WO 1999039192 A1 WO1999039192 A1 WO 1999039192A1 FR 9900184 W FR9900184 W FR 9900184W WO 9939192 A1 WO9939192 A1 WO 9939192A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
capillaries
detection means
detection
capillary
light
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/000184
Other languages
English (en)
Inventor
Rainer Siebert
Samuele Bottani
Hans Rebscher
Luc Valentin
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority to JP53899999A priority Critical patent/JP2001519913A/ja
Priority to EP99901659A priority patent/EP0972188A1/fr
Priority to US09/402,219 priority patent/US6613212B1/en
Priority to CA002284901A priority patent/CA2284901A1/fr
Priority to AU21687/99A priority patent/AU2168799A/en
Publication of WO1999039192A1 publication Critical patent/WO1999039192A1/fr
Priority to US09/632,573 priority patent/US7018519B1/en

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44782—Apparatus specially adapted therefor of a plurality of samples
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis

Definitions

  • the present invention relates to multicapillary electrophoresis systems
  • Electrophoresis techniques are also known using for capillary migration filled with gel or other matrix of separation having the advantage of being particularly handy, easy to charge and of allowing substantially automatic operation, with higher separation speeds than in gel plate electrophoresis thanks to a large applicable electric field
  • Multicapillary electrophoresis systems are known in particular in which the laser beam of excitation of the molecules is sent thereon through the walls of the capillaries, along an axis in the plane of the bar, perpendicular to the direction in which the capillaries extend, the fluorescence of the molecules being observed by receiving means having an optical axis perpendicular to the plane of the capillary strip
  • the capillaries are held in relation to one another in a glass bowl in which said capillaries extend.
  • the molecules which pass through the capillaries are excited after having left said capillaries by laser radiation. which is sent, just at the outlet of the bar, in the plane of said bar and perpendicular to the direction in which the capillaries extend
  • the fluorescence of the molecules excited by this radiation is detected by means, for example, of a CCD camera which is oriented with an axis perpendicular to the plane of the capillary strip or with an axis parallel to the capillaries.
  • a CCD camera which is oriented with an axis perpendicular to the plane of the capillary strip or with an axis parallel to the capillaries.
  • such a system requires the provision of means such as laminar flows or guiding elements preventing the molecules leaving the different capillaries from diverging too far.
  • the cuvette requires high precision mechanical production in glass.
  • the device should make it possible to ensure a very regular flow and avoid any gas bubble or dust coming to disturb the flow.
  • this technique requires the use of different materials - at least as regards viscosity - for the capillaries and the cuvette which have distinct functions, one serving for the separation of molecules, the other for channeling. flows The use of large volumes of solutions to achieve the flow then becomes necessary
  • An object of the invention is therefore to propose a multicapillary electrophoresis system which, for chemical and pharmaceutical applications, is robust, inexpensive, reliable, easy to use, and has performance enabling high throughput sequencing and genotyping
  • the invention provides a multicapillary electrophoresis system comprising a plurality of juxtaposed capillaries, at least one source for the emission of 'a beam intended to excite molecules lying in its path and inside the capillaries, means for detecting the fluorescence of the molecules excited by said beam
  • the invention proposes to arrange the detection means so as to carry out a detection.
  • the excitation beam is of elongated section and simultaneously attacks several superposed capillaries
  • the space between the capillaries is filled, at least on the path of the excitation beam, with a material whose refractive index is chosen so that the excitation beam does not diverge after having passed through a capillary,
  • - it includes means for applying a pressure in the detection cuvette which makes it possible to fill the capillaries with the separation matrix, - it comprises dispersion means for spatially separating the different wavelengths of fluorescence,
  • the detection means collect a complete image of the light leaving the capillaries
  • the detection means comprise detection means of the charge transfer type (CCD), as well as focusing means,
  • FIG. 1 is a schematic perspective representation of a system according to a possible embodiment of the invention
  • FIG. 2 is a schematic representation illustrating the arrangement of the detection means with respect to the capillaries for the system of FIG. 1,
  • FIGS. 3a and 3b illustrate the use of an excitation beam of circular cross section
  • FIGS. 4a and 4b illustrate the use of a beam of elliptical cross section
  • FIG. 5 illustrates the use of a matrix of capillaries
  • FIGS. 6a and 6b illustrate two possible variants for mounting the capillaries
  • FIGS. 7a and 7b are two photographs illustrating the distribution of the excitation beam after having crossed capillaries, according to the index of the medium which surrounds the capillaries and which is crossed by said excitation beam,
  • FIG. 8 is a graph on which the response of the system has been plotted as a function of a fluoresceem concentration
  • FIG. 9 is a graph on which the signal / noise ratio by capillary has been plotted
  • - Figure 10 is a graph on which the signal / noise ratio has been plotted as a function of the laser power, for three different fluorescence concentrations
  • - Figure 11 is a graph on which the intensity of the signal ratio has been plotted / noise depending on the aperture of the lens
  • FIG. 12a is a graph on which the intensity collected as a function of time has been plotted for an example of sample separation implemented with the system illustrated in FIG. 1,
  • FIG. 12b is a graph on which we have plotted as a function of time the intensity collected for an example of DNA separation implemented with the system illustrated in Figure 1
  • the multicapillary electrophoresis system shown in FIG. 1 comprises, on an optical table 1
  • the CCD camera 6 observes the fluorescence of the molecules excited inside the capillaries by the laser beam F along an optical axis which is parallel to the axis of the capillaries C
  • the CCD camera 6 collects the fluorescent light coming directly from the excited molecules, which light forms a cone around the axis of said capillary according to the solid angle between the position of the excited molecules in the capillary and the opening of said capillary
  • the resolution of the camera is sufficient, this makes it possible to distinguish the light which emerges from the interior of the capillaries C from that coming from the walls of these and / or from the medium which surrounds them. This results in a considerable improvement in the signal-to-noise ratio.
  • capillaries C with an internal diameter of 100 ⁇ m and an external diameter of 300 ⁇ m
  • a CCD camera 6 allowing, in combination with the optical means 5, a resolution of the order of 20 ⁇ m
  • a black mask forming a diaphragm is advantageously mounted at the outlet of the capillaries C.
  • matrix must be understood generally and designates any set of capillaries C in which these are distributed by being superposed on each other in two directions. This term consequently therefore includes just as well matrices made up of several superimposed bars as other capillary arrangements and in particular for example assemblies in which the capillaries are distributed in staggered rows.
  • the number of capillaries per matrix can be very variable. Tests were carried out on matrices of 16, 50 and 100 capillaries. A higher number of capillaries per matrix could also be envisaged.
  • the excitation beam F emitted by the laser source 7 is sent to the detection cell 4, to attack the capillaries C perpendicular to the direction in which they extend.
  • the excitation beam F can then be either of circular section (FIGS. 3a and 3b), in which case it is sent in the plane of a bar of capillaries C to pass successively through the latter.
  • it can be elongated (for example elliptical) and attack a strip in an optical direction perpendicular to the plane of said strip, which allows the same beam F to simultaneously attack the different superposed capillaries C (FIGS. 4a and 4b) .
  • this allows greater tolerance on the relative position of the capillaries.
  • an elliptical beam F will advantageously be used in the case where the capillaries C are distributed not according to a strip, but according to a matrix.
  • the capillaries C can be held together by gluing and / or by pre-forms. Furthermore, as illustrated in FIG. 6a, it can be provided on the path of the excitation beam, in the interstices between the capillaries.
  • C a material whose refractive index is chosen so that the excitation beam does not diverge after having been crossed by a capillary, in particular a material whose index is lower than that of the capillaries
  • This material is chosen to be as transparent as possible and not fluorescent
  • FIGS. 7a and 7b The focusing effect obtained with such a material is illustrated by the photographs shown in FIGS. 7a and 7b. It can be seen in these photographs that a beam F illuminating several capillaries C in parallel creates zones of shadow after passing through the capillaries C when the indices of the capillaries C and of the surrounding medium are close, but that the transmitted light is focused when the external index is lower than that of the capillaries C Thus, the light at the outlet of each of the capillaries is focused on the capillary from the next row, which is directly opposite
  • This multiple focusing makes it possible, for example, to use the same elliptical beam F to illuminate different rows of capillaries C
  • This focusing effect also allows the advantageous use of the laser beam. Almost all of its intensity is focused in the various capillaries.
  • Such focusing is achievable with a network of capillaries or even more perfectly by micro lenses. It decreases the laser power required by at least a factor of 3, at the same time creating less noise.
  • the material which performs the focusing function may possibly consist of the material which is used for fixing the capillaries.
  • solutions are preferred in which a different material is used to prevent the excitation beam passing through the capillaries from diverging. of the one who fixes the capillaries.
  • the material which prevents the divergence of the excitation beam can be constituted by the buffer solution in which the capillaries bathe
  • FIG. 1 which has been used by the inventors.
  • the electrode in box 2 is supplied by a voltage generator sold by the company SPELLMAN
  • the inputs and outputs of the capillaries C are electrically connected by means of a buffer or of a polymer solution to the cathode and to the anode of this generator.
  • the voltage applied to the cathode can go up to 30 kV for a length of capillaries C between 15 and 60cm
  • the detection cell 4 where the capillaries C emerge is a rectangular parallelepiped with opaque walls provided with two lateral quartz windows for the entry and exit of the laser beam F, while another window, also made of quartz, is located in the axis of the capillaries C to allow the collection of the fluorescence light by the optics 5 and the camera 6
  • This last window can be replaced by a filter to discriminate fluorescent light from laser light.
  • this filter can be placed at the outlet of said window.
  • a fourth window on the upper wall of the cell makes it possible to observe with a microscope the alignment of the laser beam F with respect to the capillaries C.
  • the adhesive which is used to fix the capillaries C in the detection cell is a transparent adhesive which polymerizes to UV
  • Optic 5 is an objective which has a focal length of 1, 2 It is advantageously supplemented by two lenses with a total of 6 diopters, to obtain an enlargement close to 1
  • optic 5 can consist of two objectives, the first of which is reversed Between the two objectives, a multi-color dispersion system is advantageously mounted
  • the optics 5 can advantageously integrate a network of optical fibers interposed between the outputs of the capillaries and the CCD camera
  • the CCD 6 camera is of the type sold by PRINCETON under the name "frame transfer". It allows successive acquisitions to be made without dead time and without a mechanical shutter.
  • the active surface of the camera is 6 to 8 mm 2 with a pixel size of 22 ⁇ m / 22 ⁇ m
  • the camera is cooled by the Peltier effect to approximately -40 ° C
  • the laser is an argon laser (ILT) having a maximum power of around 100 mW at a wavelength of 488 nm.
  • ILT argon laser
  • a holographic prism makes it possible to eliminate any wavelength other than this wavelength of 488 nm.
  • the separation matrix (gel or other) is injected into the capillaries by means of a pump which makes it possible to apply a pressure in the detection cuvette
  • Figure 8 gives, as a function of the concentration of fluoresceesulfate injected, the number of charges collected on 25 pixels (summation by software). There is good linearity in the region shown which has been verified between 0 05 and 100 nmol / l
  • the two straight lines correspond to the charges collected for a central capillary and one at the edge of the row, respectively The difference is explained by the Gaussian distribution of the laser beam (conventionally elliptical)
  • FIG. 9 gives, as a function of the capillary number, the signal / noise ratio (S / N) 1 1
  • the tests implemented by the inventors have shown that the sensitivity of the system also depends on the position of the point of impact of the laser relative to the outlet of the capillaries C However, this does not vary much when we do vary the distance between said point of impact and the outlet from 2 mm to 250 ⁇ m, which confirms that most of the light exiting through the opening of the capillaries C is actually collected. To further increase sensitivity, it would then be necessary to s '' approach considerably with the beam F of the exit of the capillaries C Such a gain would involve a weak colhmation of the light, which would partially degrade the resolution of the image
  • the inventors made a migration test with the double-stranded sample ( ⁇ X174 from Gibco BRL) in a polymer solution (HPC 0.5%).
  • the marker used was the interlayer SYBR (I) (Molecular Probes) The result has been plotted on the graph of FIG.
  • the fluorescence light beams at the outlet of the capillaries C - which are collimated - can be directly transmitted to one or more intermediate prisms or to a network of diffraction, to spatially separate the different wavelengths emitted and send them over a network of photodiodes

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Abstract

Système d'électrophorèse multicapillaire comportant une pluralité de capillaires juxtaposés, au moins une source pour l'émission d'un faisceau destiné à exciter des molécules se trouvant sur son trajet et à l'intérieur des capillaires, des moyens pour détecter la fluorescence des molécules excitées par ledit faisceau, caractérisé en ce que lesdits moyens sont agencés de façon à réaliser une détection de la lumière qui émerge en sortie desdits capillaires et qui se propage selon la direction dans laquelle lesdits capillaires s'étendent et en ce que la résolution des moyens de détection est suffisante pour distinguer la lumière qui émerge en sortie des capillaires de celle venant des parois de ceux-ci et/ou du milieu qui les entoure.

Description

PERFECTIONNEMENTS AUX SYSTEMES D'ELECTROPHORESE
MULTICAPILLAIRES
La présente invention est relative aux syst mes d'electrophorèse multicapillaires
On sait que les techniques d'electrophorèse en gel classiques, dans lesquelles on injecte différents échantillons sur une pluralité de pistes définies dans un gel compris entre deux plaques, ne sont pas satisfaisantes, étant donné d'une part qu'elles nécessitent un certain nombre d'opérations manuelles et d'autre part qu'elles ne permettent pas des vitesses de migration et donc des débits de traitement très importants
Or les grands programmes de séquençage et de génotypage nécessitent un débit très élevé de séparation et d'identification des molécules d'ADN On connaît par ailleurs des techniques d'electrophorèse utilisant pour la migration un capillaire rempli de gel ou d'une autre matrice de séparation présentant l'avantage d'être particulièrement maniable, facile à charger et de permettre un fonctionnement sensiblement automatique, avec des vitesses de séparation plus élevées que dans l'électrophorèse en plaques de gel grâce à un champ électrique applicable important
Toutefois, l'utilisation d'un seul capillaire ne permet pas d'atteindre les mêmes débits que ceux que permettent les techniques d'electrophorèse en plaques qui possèdent de nombreuses pistes en parallèle, même si néanmoins les champs électriques qui peuvent être appliqués à un capillaire, et donc les vitesses de migration obtenues, sont importants
C'est pourquoi il a également été proposé des systèmes dits multicapillaires comportant une barrette de plusieurs capillaires juxtaposés
On connaît notamment des systèmes d'electrophorèse multicapillaires dans lesquels le faisceau laser d'excitation des molécules est envoyé sur celles-ci au travers des parois des capillaires, selon un axe dans le plan de la barrette, perpendiculaire à la direction selon laquelle les capillaires s'étendent, la fluorescence des molécules étant observées par des moyens de réception présentant un axe optique perpendiculaire au plan de la barrette des capillaires
On pourra par exemple à cet égard se référer à la publication
" A capillary Array Gel Electrophresis System Using Multiple Laser Focusing for DNA Sequencmg " - T Anazawa, S Takahashi, H Kambara - Anal
Chem - Vol 68, N°15, - 1er Août 1996 - p 2699-2704
Toutefois, une telle technique est peu satisfaisante compte tenu du bruit de détection résultant de l'interaction de la lumière d'excitation et de la fluorescence des parois du capillaire En outre, le faisceau laser perd en intensité au fur et à mesure qu'il traverse les capillaires, de sorte que les molécules qui se trouvent dans les capillaires les plus éloignés de la source laser sont moins excitées que celles qui se déplacent dans les premiers capillaires
Du fait de ces inconvénients majeurs, on préfère généralement aux systèmes d'electrophorèse multicapillaires dans lesquels le faisceau laser d'excitation des molécules est envoyé sur celles-ci au travers des parois des capillaires, les systèmes du type de ceux décrits dans la publication
" Analysis of Nucleic Acids by Capillary Electrophoresis " - C Heller - p
236 à 254 - Editions Vieweg - 1997 ou encore dans les brevets et demandes de brevet US-5 567 294 ou EP-
723 149
Dans les systèmes décrits dans cette publication ou ces brevets, les capillaires sont maintenus les uns par rapport aux autres dans une cuvette en verre dans laquelle lesdits capillaires s'étendent Les molécules qui traversent les capillaires sont excitées après être sorties desdits capillaires par un rayonnement laser qui est envoyé, juste en sortie de la barrette, dans le plan de ladite barrette et perpendiculairement à la direction selon laquelle les capillaires s'étendent
La fluorescence des molécules excitées par ce rayonnement est détectée au moyen par exemple d'une caméra CCD qui est orientée avec un axe perpendiculaire au plan de la barrette de capillaires ou encore avec un axe parallèle aux capillaires Cependant, un tel système oblige à prévoir des moyens tels que des flux laminaires ou des éléments de guidage empêchant que les molécules en sortie des différents capillaires ne divergent de façon trop importante Pour cela, la cuvette nécessite une réalisation mécanique de haute précision dans du verre En particulier, le dispositif devra permettre d'assurer un flux très régulier et éviter toute bulle de gaz ou poussière venant perturber le flux
En outre, cette technique nécessite d'utiliser des matériaux différents - au moins en ce qui concerne la viscosité - pour les capillaires et la cuvette qui ont des fonctions distinctes, l'un servant à la séparation des molécules, l'autre à la canalisation des flux L'utilisation de volumes importants de solutions pour réaliser le flux devient alors nécessaire
Comme on l'aura compris, une telle technique présente l'inconvénient d'être particulièrement onéreuse Un but de l'invention est donc de proposer un système d'electrophorèse multicapillaire qui, pour des applications chimiques et pharmaceutiques, est robuste, peu cher, fiable, facile d'utilisation, et présente des performances permettant un séquençage et un génotypage à haut débit A cet effet, l'invention propose un système d'electrophorèse multicapillaire comportant une pluralité de capillaires juxtaposés, au moins une source pour l'émission d'un faisceau destiné à exciter des molécules se trouvant sur son trajet et à l'intérieur des capillaires, des moyens pour détecter la fluorescence des molécules excitées par ledit faisceau Pour palier les inconvénients qui dans les systèmes connus dans l'état de la technique éloignaient l'homme du métier de ce type de système, l'invention propose d'agencer les moyens de détection de façon à réaliser une détection de la lumière qui émerge en sortie desdits capillaires et qui se propage selon la direction dans laquelle lesdits capillaires s'étendent, ainsi que d'utiliser des moyens de détection ayant une résolution suffisante pour distinguer la lumière qui émerge en sortie des capillaires de celle venant des parois de ceux-ci et/ou du milieu qui les entoure Une telle structure permet une détection des molécules à l'intérieur des capillaires tout en réduisant considérablement le bruit de détection
Ce système est avantageusement complété par les différentes caractéristiques avantageuses suivantes prises seules ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles
- il comporte une matrice de capillaires ,
- il comporte des moyens, tels que des microlentilles, pour réaliser une focalisation multiple sur une barrette de capillaires ,
- une barrette de capillaires réalise une focalisation multiple en entrée de la barrette suivante ,
- le faisceau d'excitation est de section allongée et attaque simultanément plusieurs capillaires superposés ,
- l'espace entre les capillaires est rempli, au moins sur la trajectoire du faisceau d'excitation, par un matériau dont l'indice de réfraction est choisi pour que le faisceau d'excitation ne diverge pas après avoir traversé un capillaire ,
- ledit matériau est transparent et non fluorescent ,
- il comporte des moyens pour appliquer dans la cuvette de détection, une pression qui permet de remplir les capillaires avec la matrice de séparation , - il comporte des moyens de dispersion pour séparer spatialement les différentes longueurs d'onde de fluorescence ,
- les moyens de détection relèvent une image complète de la lumière en sortie des capillaires ;
- les moyens de détection comportent des moyens de détection du type à transfert de charge (CCD), ainsi que des moyens de focalisation ,
- les moyens de détection comportent des moyens de détection du type à transfert de charge (CCD), ainsi qu'un faisceau de fibres interposé entre les sorties des capillaires et les moyens de détection du type à transfert de charge D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront encore de la description Cette description est purement illustrative et non limitative Elle doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels - la figure 1 est une représentation schématique en perspective d'un système conforme à un mode de réalisation possible de l'invention ,
- la figure 2 est une représentation schématique en illustrant la disposition des moyens de détection par rapport aux capillaires pour le système de la figure 1 ,
- les figures 3a et 3b illustrent l'utilisation d'un faisceau d'excitation de section droite circulaire ,
- les figures 4a et 4b illustrent l'utilisation d'un faisceau de section droite elliptique ,
- la figure 5 illustre l'utilisation d'une matrice de capillaires ,
- les figures 6a et 6b illustrent deux variantes possibles pour le montage des capillaires ,
- les figures 7a et 7b sont deux photographies illustrant la répartition du faisceau d'excitation après avoir traversé des capillaires, selon l'indice du milieu qui environne les capillaires et qui est traversé par ledit faisceau d'excitation ,
- la figure 8 est un graphe sur lequel on a porté la réponse du système en fonction d'une concentration de fluorescéme , - la figure 9 est un graphe sur lequel on a porté le rapport signal/bruit par capillaire ,
- la figure 10 est un graphe sur lequel on a porté le rapport signal/bruit en fonction de la puissance du laser, pour trois concentrations de fluorescéme différentes , - la figure 11 est un graphe sur lequel on a porté l'intensité du rapport signal/bruit en fonction de l'ouverture de l'objectif ,
- la figure 12a est un graphe sur lequel on a porté l'intensité collectée en fonction du temps pour un exemple de séparation d'échantillons mis en œuvre avec le système illustré sur la figure 1 ,
- la figure 12b est un graphe sur lequel on a porté en fonction du temps l'intensité collectée pour un exemple de séparation d'ADN mis en œuvre avec le système illustré sur la figure 1 Le système d'electrophorèse multicapillaire représenté sur la figure 1 comporte, sur une table optique 1
- un canal 3 dans lequel s'étendent des capillaires,
- une boîte à haute tension 2 avec chauffage sur laquelle sont montées les entrées des capillaires et sur laquelle est intégré un système de régulation de température,
- une cellule de détection 4 disposée en sortie du canal 3,
- une caméra CCD 6 et une optique de convergence 5 interposées entre ladite caméra 6 et la cellule de détection, - une source laser 7,
- des moyens optiques 8 qui sont montés sur un rail 9 et qui permettent de diriger le faisceau de la source 7 sur la cellule de détection 4
Ainsi que l'illustre plus particulièrement la figure 2, la caméra CCD 6 observe la fluorescence des molécules excitées à l'intérieur des capillaires par le faisceau F laser selon un axe optique qui est parallèle à l'axe des capillaires C La caméra CCD 6 collecte la lumière de fluorescence en provenance directe des molécules excitées, laquelle lumière forme un cône autour de l'axe dudit capillaire suivant l'angle solide entre la position des molécules excitées dans le capillaire et l'ouverture dudit capillaire Dès lors que la résolution de la caméra est suffisante, ceci permet de distinguer la lumière qui émerge de l'intérieur des capillaires C de celle venant des parois de ceux-ci et/ou du milieu qui les entoure II en résulte une amélioration considérable du rapport signal sur bruit
Par exemple, dans le cas de capillaires C de 100 μm de diamètre intérieur et de 300 μm de diamètre externe, on peut utiliser comme détecteur une caméra CCD 6 permettant, en combinaison avec les moyens optiques 5, une résolution de l'ordre de 20 μm
Egalement, pour minimiser le bruit de fond venant de la diffusion du faisceau F laser ou de la fluorescence des parois des capillaires C ou du milieu environnant, un cache noir formant diaphragme est avantageusement monté en sortie des capillaires C On notera qu'étant donné que l'observation de la fluorescence des molécules se fait en sortie des capillaires C selon un axe parallèle à la direction des capillaires C, il devient possible d'utiliser des matrices de capillaires C, ce qui permet de multiplier considérablement le rendement d'electrophorèse. Le terme matrice doit être entendu de façon générale et désigne tout ensemble de capillaires C dans lequel ceux-ci sont répartis en étant superposés les uns aux autres selon deux directions. Ce terme englobe par conséquent tout aussi bien des matrices constituées de plusieurs barrettes superposées que d'autres dispositions de capillaires et notamment par exemple des ensembles dans lesquels les capillaires sont répartis en quinconce.
Le nombre de capillaires par matrice peut être très variable. Des essais ont été réalisés sur des matrices de 16, 50 et 100 capillaires. Un nombre supérieur de capillaires par matrice pourrait également être envisagé.
Le faisceau F d'excitation émis par la source laser 7 est envoyé sur la cellule de détection 4, pour attaquer les capillaires C perpendiculairement à la direction selon laquelle ils s'étendent.
Le faisceau F d'excitation peut alors être soit de section circulaire (figures 3a et 3b), auquel cas il est envoyé dans le plan d'une barrette de capillaires C pour traverser successivement ces derniers.
Avantageusement également, il peut être allongé (par exemple elliptique) et attaquer une barrette selon une direction optique perpendiculaire au plan de ladite barrette, ce qui permet à un même faisceau F d'attaquer simultanément les différents capillaires C superposés (figures 4a et 4b). En outre, cela permet une plus grande tolérance sur la position relative des capillaires.
Et ainsi que l'illustre la figure 5, on utilisera avantageusement un faisceau F elliptique dans le cas où les capillaires C sont répartis non pas selon une barrette, mais selon une matrice.
Les capillaires C peuvent être maintenus entre eux par collage et/ou par des pré-formes. Par ailleurs ainsi que l'illustre la figure 6a il peut être prévu sur la trajectoire du faisceau d'excitation, dans les interstices entre les capillaires
C un matériau dont l'indice de réfraction est choisi pour que le faisceau d'excitation ne diverge pas après avoir ete traverse par un capillaire, notamment un matériau dont l'indice est inférieur a celui des capillaires
Ce matériau est choisi aussi transparent que possible et non fluorescent
L'effet de focalisation obtenu avec un tel matériau est illustré par les photographies reprises sur les figures 7a et 7b On voit sur ces photographies qu'un faisceau F éclairant plusieurs capillaires C en parallèle crée des zones d'ombres après le passage à travers les capillaires C quand les indices des capillaires C et du milieu environnant sont proches, mais que la lumière transmise est focalisée lorsque l'indice extérieur est inférieur à celui des capillaires C Ainsi, la lumière en sortie de chacun des capillaires se trouve focalisée sur le capillaire de la rangée suivante, qui est directement en regard
Cette focalisation multiple permet par exemple d'utiliser un même faisceau F elliptique pour éclairer différentes rangées de capillaires C
Cet effet de focalisation permet aussi l'utilisation d'une manière avantageuse du faisceau laser Quasiment la totalité de son intensité est focalisée dans les différents capillaires
Une telle focalisation est réalisable avec un réseau de capillaires ou encore plus parfaitement par des micro lentilles Elle diminue d'au moins un facteur 3 la puissance du laser nécessaire, créant en même temps moins de bruit
Le matériau qui assure la fonction de focalisation peut éventuellement être constitué par le matériau qui sert à la fixation des capillaires Toutefois, on préfère les solutions dans lesquelles on utilise, pour empêcher la divergence du faisceau d'excitation qui traverse les capillaires, un matériau différent de celui qui assure la fixation des capillaires On notera d'ailleurs, ainsi que l'illustre la figure 7b, que dans ce cas, le matériau qui empêche la divergence du faisceau d'excitation peut être constitué par la solution tampon dans laquelle les capillaires baignent
On donne ci-après des détails techniques relatifs au montage qui est illustré sur la figure 1 qui a été utilise par les inventeurs
L'électrode dans la boîte 2 est alimentée par un générateur de tension commercialisé par la société SPELLMAN
Les entrées et sorties des capillaires C sont électriquement reliées par l'intermédiaire d'un tampon ou d'une solution de polymère à la cathode et à l'anode de ce générateur
L'anode se trouvant à la masse, la tension appliquée sur la cathode peut aller jusqu'à 30 kV pour un longueur de capillaires C entre 15 et 60cm
La cellule de détection 4 où débouchent les capillaires C est un parallélépipède rectangle aux parois opaques muni de deux fenêtres latérales en quartz pour l'entrée et la sortie du faisceau F laser, tandis qu'une autre fenêtre, également en quartz, se trouve dans l'axe des capillaires C pour permettre la collection de la lumière de fluorescence par l'optique 5 et la caméra 6
Cette dernière fenêtre peut être remplacée par un filtre pour discriminer la lumière de fluorescence de la lumière laser En variante, ce filtre peut être disposé en sortie de ladite fenêtre
Une quatrième fenêtre, sur la paroi supérieure de la cellule permet d'observer avec un microscope l'alignement du faisceau F laser par rapport aux capillaires C. La colle qui est utilisée pour fixer les capillaires C dans la cellule de détection est une colle transparente qui polyméπse aux UV
L'optique 5 est un objectif qui présente une focale de 1 ,2 Elle est avantageusement complétée par deux bonnettes avec un total de 6 dioptries, pour obtenir un agrandissement proche de 1 Alternativement, l'optique 5 peut consister en deux objectifs dont le premier est inversé Entre les deux objectifs, on monte avantageusement un système de dispersion multicouleur En variante encore, l'optique 5 peut avantageusement intégrer un réseau de fibres optiques interposé entre les sorties des capillaires et la caméra CCD
La caméra CCD 6 est du type de celles commercialisées par PRINCETON sous la dénomination "frame transfer" Elle permet de réaliser des acquisitions successives sans temps mort et sans obturateur mécanique
La surface active de la caméra est de 6 à 8 mm2 avec une taille de pixels de 22 μm/22μm La caméra est refroidie par effet Peltier jusqu'à —40° C environ
Le laser est un laser argon (ILT) présentant une puissance maximale d'environ 100 mW à la longueur d'ondes de 488 nm.
Un prisme holographique permet d'éliminer toute longueur d'ondes autre cette longueur d'ondes de 488 nm La matrice de séparation (gel ou autre) est injectée dans les capillaires au moyen d'une pompe qui permet d'appliquer une pression dans la cuvette de détection
On présente ci-après les résultats qui ont été obtenus avec un tel système pour une puissance de faisceau F laser de 40 mW et une distance entre les tranches de sortie des capillaires C et le point d'impact du faisceau F d'excitation de détection de 750 μm, en injectant, par voie électrocinétique ou avec un flux hydrodynamique des dilutions d'oligonucléotides d'une concentration connue.
La figure 8 donne, en fonction de la concentration de fluorescéme sulfate injectée, le nombre de charges collectées sur 25 pixels (sommation par le logiciel). On constate une bonne linéarité dans la région représentée qui a été vérifié entre 0 05 et 100 nmol/l Les deux droites correspondent aux charges collectées pour un capillaire central et un au bord de la rangée, respectivement La différence s'explique par la distribution gaussienne du faisceau laser (classiquement elliptique)
En ce qui concerne la sensibilité minimale détectable, la figure 9 donne, en fonction du numéro de capillaire, le rapport signal/bruit (S/N) 1 1
obtenu pour la concentration d'1 nmol/l de fluorescéme On observe un rapport signal/bruit supérieur à 50 Même vu du bord, ce rapport est largement satisfaisant pour des expériences de séquençage ou de genotypage Pour améliorer encore la sensibilité, on peut utiliser des pixels plus gros, par exemple regroupant les 25 pixels précédemment envisagés On obtient alors une sensibilité environ trois - cinq fois plus élevée Ceci vient du fait que le bruit de lecture de la caméra est presque 25 fois plus élevé si on lit 25 pixels individuellement, que s'ils sont regroupés en un seul pixel Comme on peut l'observer dans la figure 10, il est également possible de gagner en sensibilité en augmentant simplement la puissance du laser Ceci montre que le système n'est pas à sa limite
La dépendance de la lumière récoltée en fonction de l'ouverture de l'objectif a également été testée Le rapport signal/bruit est donné pour trois ouvertures différentes de l'objectif de la figure 1 1
Par ailleurs, les tests mis en œuvre par les inventeurs ont montré que la sensibilité du système dépendait également de la position du point d'impact du laser par rapport à la sortie des capillaires C Toutefois, celle-ci varie peu lorsque l'on fait varier la distance entre ledit point d'impact et la sortie de 2 mm à 250 μm, ce qui confirme que l'essentiel de la lumière sortant par l'ouverture des capillaires C est effectivement collecté Pour gagner encore en sensibilité, il faudrait alors s'approcher considérablement avec le faisceau F de la sortie des capillaires C Un tel gain entraînerait une plus faible colhmation de la lumière, ce qui dégraderait partiellement la résolution de l'image
Pour montrer la capacité du système a séparer des bandes, les inventeurs ont fait un test de migration avec l'échantillon double brin (φ X174 de Gibco BRL) dans une solution de polymères (HPC 0,5%) Le marqueur utilisé était l'intercalaire SYBR(I) (Molecular Probes) Le résultat a été porté sur le graphe de la figure 12a pour deux capillaires C Pour une concentration d'1 ng/μl, les inventeurs ont obtenu une bonne séparation des bandes et un bon rapport signal sur bruit Les inventeurs ont également fait des tests de séparation avec un échantillon d'ADN (M13) d'une réaction de séquence (T-termmator kit d'AMERSHAM, primer marqué avec FITC de PHARMACIA) dans une solution de polymère (T15, 5%, de l'INSTITUT CURIE) à 55%C (figure 12b) La figure illustre la qualité de séparation, le bon rapport signal sur bruit ainsi que la vitesse de séparation (600 bases dans 1 h)
D'autres variantes que celle qui vient d'être décrite sont bien entendu envisageables Notamment, les faisceaux de lumière de fluorescence en sortie des capillaires C - qui sont collimatés - peuvent être directement transmis à un ou plusieurs prismes intermédiaires ou encore à un réseau de diffraction, pour séparer spatialement les différentes longueurs d'ondes émises et envoyer celles-ci sur un réseau de photodiodes
Comme on l'aura compris, les systèmes qui viennent d'être décrits sont d'une conception simple et permettent d'atteindre des hauts débits avec une grande fiabilité et une grande facilité de mise en œuvre

Claims

13
REVENDICATIONS
1 Système d'electrophorèse multicapillaire comportant une pluralité de capillaires juxtaposes, au moins une source pour l'émission d'un faisceau destiné à exciter des molécules se trouvant sur son trajet et à l'intérieur des capillaires, des moyens pour détecter la fluorescence des molécules excitées par ledit faisceau, caractérisé en ce que lesdits moyens sont agencés de façon à réaliser une détection de la lumière qui émerge en sortie desdits capillaires et qui se propage selon la direction dans laquelle lesdits capillaires s'étendent et en ce que la résolution des moyens de détection est suffisante pour distinguer la lumière qui émerge en sortie des capillaires de celle venant des parois de ceux-ci et/ou du milieu qui les entoure 2 Système selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comporte une matrice de capillaires 3 Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le faisceau d'excitation est de section allongée et attaque simultanément plusieurs capillaires superposés 4 Système selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens, tels que des microlentilles, pour réaliser une focalisation multiple sur une barrette de capillaires
5 Système selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce qu'une barrette de capillaires réalise une focalisation multiple en entrée de la barrette suivante.
6 Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'espace entre les capillaires est rempli, au moins sur la trajectoire du faisceau d'excitation, par un matériau dont l'indice de réfraction est choisi pour que le faisceau d'excitation ne diverge pas après avoir traversé un capillaire
7 Système selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit matériau est transparent et non fluorescent 14
Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour appliquer dans la cuvette de détection une pression qui permet de remplir les capillaires avec la matrice de séparation Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de dispersion pour séparer spatialement les différentes longueurs d'onde de fluorescence Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens de détection relèvent une image complète de la lumière en sortie des capillaires Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens de détection comportent des moyens de détection du type à transfert de charge (CCD), ainsi que des moyens de focalisation Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens de détection comportent des moyens de détection du type à transfert de charge (CCD), ainsi qu'un faisceau de fibres interposé entre les sorties des capillaires et les moyens de détection du type à transfert de charge
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