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WO2003048198A2 - Polypeptides induisant l'apoptose, polynucleotides les codant et leurs applications therapeutiques - Google Patents

Polypeptides induisant l'apoptose, polynucleotides les codant et leurs applications therapeutiques Download PDF

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Publication number
WO2003048198A2
WO2003048198A2 PCT/FR2002/004211 FR0204211W WO03048198A2 WO 2003048198 A2 WO2003048198 A2 WO 2003048198A2 FR 0204211 W FR0204211 W FR 0204211W WO 03048198 A2 WO03048198 A2 WO 03048198A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
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cells
era
polypeptide
sequence
vector
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/004211
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English (en)
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WO2003048198A3 (fr
Inventor
Monique Lafon
Christophe Prehaud
Stéphanie LAY
Mireille Lafage
Maria-Isabel Thoulouze
Original Assignee
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur filed Critical Institut Pasteur
Priority to AU2002364431A priority Critical patent/AU2002364431A1/en
Publication of WO2003048198A2 publication Critical patent/WO2003048198A2/fr
Publication of WO2003048198A3 publication Critical patent/WO2003048198A3/fr

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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
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    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to the induction of apoptosis, the production of apoptotic bodies and their therapeutic applications.
  • apoptosis can be induced by the rabies virus. Indeed, it has been established that the strains of rabies virus ERA and CVS infect lymphocytes but that only infection of lymphocytes by the rabies vaccine strain induces apoptosis (46). Paradoxically, the immunogenicity of strains of rabies virus is inversely proportional to the degree of cell death they induce (Thoulouze et a /. (1997) J. Virol., 71: 7372-80). The initiation of the apoptotic process or its blocking, either by the addition of the caspase inhibitor zVAD-FMK, or by overexpression of Bcl-2 has no effect on the viral production of the cells.
  • apoptotic process viro-induced by the ERA strain is an event which does not modify the viral cycle, certainly because it intervenes too late and that apoptosis does not improve the release of viral particles.
  • Rabies apoptosis cannot be induced by simply incubating cells with non-replicating virus and this makes it possible to exclude that the rabies virus induces apoptosis by interaction with membrane receptors.
  • Rabies apoptosis involves the activation of caspases 1, 3 and 8, so it is dependent caspase.
  • caspases 1, 3 and 8 caspases 1, 3 and 8
  • caspases 1, 3 and 8 caspases 1, 3 and 8
  • zVAD-FMK treatment experiments it was found that a subpopulation of apoptotic cells were resistant to the action of this inhibitor. This suggested that an independent caspase pathway should also be activated.
  • the present invention relates to an isolated or purified polypeptide and to the polynucleotide coding for it, inducing, through the activation of initiating caspase 8, the formation of apoptotic bodies capable of stimulating in a vertebrate a humoral immune response and preferably, a humoral immune response type B dependent.
  • the polypeptide of the invention can be selected, according to various preferred embodiments, from the group consisting of: a) a glycoprotein G, having a sequence comprising at least one proline in position 27, an isoleucine in position 48, a valine in position 219 or an arginine at position 491; b) a fragment of at least 100 amino acids of the glycoprotein G as defined in a); and c) a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 75% homology with an amino acid sequence as defined by SEQ ID NO: 2.
  • the polypeptide of the invention also comprises a threonine in position 89.
  • Another object of the invention is to provide an isolated or purified chimeric polypeptide comprising at least one polypeptide as defined according to the invention associated with an exogenous polypeptide sequence.
  • the exogenous polypeptide sequence is the sequence of an B epitope and / or a T epitope.
  • the polypeptide of the invention comprises a nucleotide sequence having at least 75% homology with the nucleotite sequence as defined by SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the invention is to provide an isolated or purified oligonucleotide comprising a sequence chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO 7.
  • the object of the invention is further to provide an expression or cloning vector which contains a polynucleotide of the invention.
  • the vector is selected from the group consisting of recombinant viruses and recombinant plasmids having an origin of eukaryotic replication.
  • the invention relates, in particular, to the vectors pRevTRE.G.ERA, pRevTRE.N.ERA, pRev-TRE-G-CVS and pRev-TRE-N-CVS deposited at the CNCM, on November 30, 2001 under the numbers d accession 1-2760, 1-2761, 1 -2758 and 1 -2759 respectively.
  • the invention further relates to a host cell containing a polynucleotide or a vector according to the present invention.
  • the polynucleotide or vector is stably integrated into the genome of the host cell.
  • the host cell is of lymphoblastoid origin.
  • the invention also relates to an immunogenic or vaccine composition containing at least one element chosen from the group consisting of a) a polypeptide, b) a polynucleotide, c) a vector, d) a host cell or an apoptotic body comprising a), b ), c) and or d), and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the object of the invention is also to provide a method of inducing humoral immunity comprising the administration to a vertebrate of an immunogenic or vaccine composition according to the present invention.
  • the invention also relates to the use of a polypeptide, a vector, a host cell or an apoptotic body according to the present invention for the preparation of a vaccine or an immunity adjuvant.
  • the vaccine or adjuvanted immunity induces a humoral immune response in a vertebrate.
  • the vaccine or adjuvant of immunity is intended for the prevention or treatment of viral encephalitis, rabies, cancer or neuropathology. It will be understood that the vaccine or the adjuvant according to the present invention relates to human or animal use.
  • nucleic acids and the polypeptides according to the invention make it possible, via the activation of caspase 8, which initiates the induction of the formation of apoptotic bodies capable of stimulating the humoral immune response of the target host.
  • Figure 1 is a diagram illustrating the mechanism of the RevTet-ON gene expression system.
  • Figure 2 is a diagram illustrating the formation of infectious but replication-deficient retroviral particles.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the demonstration of the expression of the various proteins in transgenic Jurkat lines.
  • the expression of the glycoproteins is visualized using the biotinylated primary antibody 8.2 (1/100) followed by strep-PE (1/100).
  • strep-PE 1/100
  • N proteins we used a mixture of three Japanese anti-N antibodies (each 1/50) followed by a biotinylated anti-mouse (1/100) and strep-PE (1/100).
  • the M1 marker is used to quantify the fluorescence of cells treated with Dox compared to untreated cells.
  • FIG. 4 represents the analysis of the size and the granulosity of the cells by flow cytometry.
  • the living cells, forming the R1 population are characterized by a small granulosity and a large size.
  • the dead cells, forming the R2 population, for their part, have a greater granulosity and a reduction in their size.
  • the quantification of the cells in apoptosis was made by the difference between the percentage of cells in apoptosis present in the cultures treated with Dox and the percentage of apoptosis in the cultures not treated. These results are representative of several analyzes.
  • Figures 5A, 5B and 5C show an analysis of cells in apoptosis by Hoechst 33342 labeling (0.5 mg / ml) and counting using the Metamorph offline software.
  • A Cells in apoptosis, a white arrow shows cells with a characteristic fragmentation of nuclear DNA.
  • B Non-apoptotic cells without nucleus fragmentation (white arrow).
  • C Cells counted using Metamorph offline software.
  • FIG. 6 represents the measurement of the activation of caspase I by flow cytometry.
  • the M1 marker is used to measure the fluorescence in cells treated with Dox compared to untreated cells.
  • FIG. 7 represents the measurement of the activation of caspase 8.
  • the marker is analyzed by flow cytometry.
  • the M1 marker is used to measure the fluorescence in cells treated with Dox compared to untreated cells.
  • Figure 8 is a graph showing the relative growth of the anti-rabies antibody titer (AU / ml, ELISA) (all proteins combined) produced in the days following the injection of apoptotic bodies (square points) or whole cells ( diamond dots) in syngeneic BALB / c mice of Wehi cells and following the recall.
  • AU / ml, ELISA anti-rabies antibody titer
  • Figure 9 is a graph showing the production of anti-protein N antibodies produced after injection of apoptotic bodies or whole cells into BALB / c syngeneic mice of Wehi cells.
  • Figure 10 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the gene coding for the protein G of the rabid strain ERA.
  • Figure 11 shows the peptide sequence (SEQ ID NO: 2) of the G-ERA protein deduced from the sequence shown in Figure 12.
  • Figure 12 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the gene coding for the protein G-ERA and the corresponding deduced peptide sequence (SEQ ID NO: 2).
  • Figure 13 shows the specific labeling of NT2-N cells infected with the ERA virus, against non-infected NT 2-N cells.
  • Figure 14 represents the quality of measurements in% of NT2-N cells in apoptosis according to whether they are uninfected, infected with CVS or infected with ERA, evaluated after staining with Hoechst.
  • FIG. 15 represents an example of the detection obtained of the G-ERA antigen in green monkey kidney cells (CV1) infected with the monoclonal antibody 8.2 (collection of the Viral Neuroimmonology Unit).
  • FIG. 16 represents the flow cytometry profiles of lymphoblastoid cells of mice, of infected EL4 line.
  • the R 2 populations are the cells entering apoptosis, while the R1 populations are the living cells.
  • FIG. 17 represents the determination by flow cytometry of the quantity of cells exhibiting both PE (and FITC) fluorescence.
  • the population of cells expressing at the both the G-ERA and HA antigens on the surface of their plasma membranes represent 82% of the population.
  • Figure 18 shows an example of the type of cells observed when making EL4 cells with the vv PHA and vv G-ERA viruses.
  • Hoechst 33342 staining allows visualization of cell nuclei.
  • the cells have a green fluorescence characterizing the detection of the HA antigen and a more or less significant nuclear fragmentation depending on the cells and visualized in blue.
  • Apoptotic bodies contain two types of viral antigens: HA (red, 18-B-D) and G-ERA (green, 18-C-D).
  • Figure 19 shows the apoptogenic capacity of different viruses in Jurkat cells.
  • the recombinant chimera R-N2C is a strain where in a SN10 genome, the glycoprotein gene has been replaced by that of the G protein of the CVS-N2C strain. If the strain SN10 is pro-apoptogenic in lymphoblastoid cells, this is not the case for the chimeric strain R-N2C. This is verified by apoptosis measurements carried out by different methods (percentage of activated caspase 8, tunnel or nuclear fragmentation).
  • FIG. 20 represents the apoptogenic capacity of different viruses in neuronal cells of SK-N-SH line.
  • the recombinant chimera R-N2C is a strain where in a genome of SN10 type, the gene of glycoprotein has been replaced by that of the protein G of the strain CVS-N2C (see FIG. 19). If the strain SN10 is pro-apoptogenic in neuronal cells, this is not the case for the chimeric strain R-N2C. This is verified by apoptosis measurements carried out by different methods (percentage of activated caspase 8, tunnel or nuclear fragmentation).
  • the present invention relates to an isolated or purified polypeptide which induces the formation of at least one apoptotic body capable of stimulating a humoral immune response, for example a humoral type B response in a vertebrate and preferably in a mammal.
  • a humoral immune response for example a humoral type B response in a vertebrate and preferably in a mammal.
  • isolated or purified is meant the molecules which have been altered by humans from their native state, that is to say that if such a molecule exists in nature, it has been changed and / or removed from its initial environment.
  • a polynucleotide or polypeptide naturally present in a living organism is not “isolated”.
  • the same polynucleotide or polypeptide when separated from its normal environment and / or obtained by cloning, amplification and / or by chemical synthesis is considered according to the present invention as being “isolated”.
  • a polynucleotide or polypeptide which is introduced into an organism by transformation, manipulation genetic or by any other method of genetic engineering is considered “isolated” even if it is still present in said organism.
  • humoral immune response is meant an in vivo or in vitro reaction in response to contact with an immunogen.
  • a humoral reaction is generally induced by the production of antibodies generated against said immunogen.
  • apoptotic body is meant a nucleic acid / protein complex formed by cell fragmentation during the apoptotic process of the cell.
  • the present invention relates to an immunostimulatory polypeptide which stimulates the response of humoral immunity by inducing the formation of apoptotic bodies by the activation of the caspase pathway and very particularly that of the initiating caspase-8.
  • the polypeptide is selected from the group consisting of: a) a glycoprotein G which has a sequence comprising at least one proline at position 27, an isoleucine at position 48, a valine at position 219 or an arginine at position 491, preferably, this glycoprotein is derived from a rabies virus; b) a fragment of at least 100 amino acids of the protein as defined in a); c) a polypeptide comprising a nucleotide sequence having at least 75% homology with an amino acid sequence as defined by the sequence SEQ ID NO.2
  • the polypeptide of the present invention can also comprise a threonine at position 89.
  • the inventors have discovered that a polypeptide having as sequence peptide the sequence SEQ ID NO: 2 was of particular interest.
  • the present invention also relates to a chimeric polypeptide having a sequence comprising at least one polypeptide as defined previously associated with an exogenous sequence, for example that of a B epitope and / or a T epitope
  • polypeptides according to the present invention can be prepared and / or obtained by any suitable method known to a person skilled in the art. They can in particular be obtained by chemical synthesis but it is also possible to obtain them by molecular biology techniques, using in particular RT-PCR and various appropriate vectors and cell lines as described below.
  • the present invention also relates to oligonucleotides having a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO 6 and SEQ ID NO: 7. These oligonucleotides being preferably used as a probe or as a primer, for example, in the context of an RT-PCR amplification of a polynucleotide which codes for the polypeptide of the invention. To this end, the present invention also relates to any polynucleotide encoding a polypeptide as defined above. More specifically, the polynucleotide preferably comprises a nucleotide sequence having at least 75% homology with that defined by the sequence SEQ ID NO: 1.
  • polynucleotide refers to any polyribonucleotide or poly-deoxyribonucleotide, which may be a modified DNA or RNA molecule.
  • This definition includes without limitation, single or double stranded DNA or RNA; DNA or RNA consisting of a mixture of single-double stranded region; single-double-triple strand and the DNA / RNA hybrid molecules made up of a mixture of single-double and / or triple-strand region.
  • Polynucleotides can also include triple strand regions of DNA and / or RNA. The strands of such regions can come from the same molecule or from a different molecule.
  • the molecule comprising a triple helix region can be an oligonucleotide.
  • the polynucleotides can further comprise DNA and / or RNA molecules comprising modified bases such as tritylated bases.
  • modified bases such as tritylated bases.
  • DNA and / or RNA molecules comprising particular bases such as inosine are included within the scope of the invention.
  • any polynucleotide which has been chemically, enzymatically or metabolically modified but which has retained the biochemical properties of the original polypeptide, that is to say which has retained its immunostimulatory power through the activation of caspase 8 initiator and therefore the formation of apoptotic bodies is included within the scope of the present invention.
  • polypeptide is defined as being any peptide or protein comprising at least two amino acids linked by a modified or unmodified peptide link.
  • the term polypeptide refers to short chain molecules such as peptides, oligopeptides or oligomers or to long chains such as proteins.
  • a peptide according to the present invention generally comprises from 2 to 20 amino acids, preferably from 2 to 10 amino acids, and even more preferably from 2 to 5 amino acids.
  • a polypeptide according to the present invention can comprise modified amino acids.
  • the polypeptide of the present invention can also be modified by a natural process such as post-transcriptional modifications or by a chemical process.
  • Some examples of these modifications are: acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, covalent bond with flavin, covalent bond with a heme, covalent bond with a nucleotide or a nucleotide derivative, bond with a lipid or a lipid derivative, covalent bond with a phosphotidylinositol, crosslinking, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, cysteine molecule formation, pyroglutamate formation, formylation, gamma-carboxylation, hydroxylation, iodination, methylation, oxidation, phosphorylation, racemization, hydroxylation, etc.
  • the subject of the invention is also vectors of expression and / or cloning
  • the invention also relates to any vector (cloning and / or expression) and any cellular host (prokaryotic or eukaryotic) transformed, transfected or infected with such a vector, and comprising the regulatory elements allowing the expression of the sequence of nucleotides coding for a peptide according to the invention.
  • the vectors are expression or cloning vectors comprising a polynucleotide of the present invention.
  • such vectors are selected from the group consisting of recombinant viruses and recombinant plasmids having an origin of eukaryotic replication.
  • the vectors are those named pRevTRE.G.ERA and pRevTRE.N.ERA (used as a negative control), pRev-G-CVS, pRev-TRE-N-CVS which have been deposited at the C.N.C.M. November 30, 2001 under accession numbers I-2760, 1-2761, 1-2758 and I-2759 respectively.
  • the invention also relates to host cells, preferably of lymphoblastic origin, which contain either a polynucleotide defined by SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, preferably this is integrated in a stable manner, or either a polypeptide or a vector as defined above.
  • vector refers to a polynucleotide construct designed to be transfected into different cell types.
  • these vectors target the expression vectors designed for the expression of a nucleotide sequence in a host cell; cloning vectors designed for the isolation, propagation and replication of inserted nucleotides; viral vectors designed for the production of recombinant virus or viral-like particle; or shuttle vectors that include attributes from more than one vector.
  • the present invention also relates to the use of these polypeptides and of the polynucleotides encoding them, of these host cells and of the apoptotic bodies induced according to the present invention for the preparation of vaccines or adjuvants of immunity.
  • adjuvant any substance or molecule introduced into the composition of a vaccine or of an immunogenic composition leading to an increase in the immune response. It is therefore understood that the polypeptide of the present invention can serve as an adjuvant to thereby enhance the humoral immune response against an antigen of interest.
  • antigens against which one may want to stimulate an immune response include, for example, viral, tumor and cellular antigens whose overexpression or alteration lead to a pathology (for example, neuropathology). It is also clear that other types of adjuvants well known to those skilled in the art can be added to the vaccine or immunogenic composition of the present invention described below.
  • the present invention relates to immunogenic or vaccine compositions containing apoptotic bodies as described below and which stimulate a humoral immune response and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • said apoptotic bodies are prepared from a host cell as defined above and more particularly by transfection or micro-injection of said polypeptide of the invention into the host cell.
  • the immunogenic or vaccine composition contains an element chosen from the group consisting of:
  • compositions can be advantageous for preventing or treating viral encephalitis including rabies, cancers or neuropathologies.
  • a method of inducing humoral immunity against an antigen of interest comprising a step comprising the administration to a human or an animal of such an immunogenic or vaccine composition.
  • the means of preparation and administration of the compositions of the present invention will not be described further because already known to those skilled in the art.
  • Example 1 Determination of a pro-apoptotic protein of the rabies virus
  • rabies apoptosis in Jurkat cells requires the virus to replicate and the caspases to be activated.
  • the entry into apoptosis is concomitant with an accumulation and a particular distribution of viral proteins in the cytoplasm. This suggests that engorgement of the cytoplasm by viral antigens induces apoptosis.
  • Certain rabies strains, such as the attenuated strain ERA induce apoptosis, which is not the case with the highly pathogenic strain CVS.
  • rabies virus ERA (vr332) and CVS (vr959) come from the American Type Cell Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA) and were amplified on BSR cells (derived from hamster kidney fibroblast cells) BHK-21). These cells are cultured in MEM medium supplemented with 8% fetal calf serum (SVF), tryptose-phosphate, 2 mM L-Glutamine, 40 mg / ml gentamycin.
  • ATCC American Type Cell Collection
  • BSR cells derived from hamster kidney fibroblast cells
  • BHK-21 BHK-21
  • the PT67 packaging cells (Retro Pack cell line from Clontech) are cultured on DMEM medium supplemented with 10% of FCS, 4 mM L-glutamine, 100 U / ml of penicillin, 100 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • NIH3T3 cells are cultured in DMEM medium supplemented with 10% FCS, 100U / ml of penicillin, 100 ⁇ g / ml of streptomycin, 1mM sodium-pyruvate.
  • Jurkat rtTA cells (47) are cells cultured in suspension in RPMI 1640 medium supplemented with 10% of FCS, 2 mm of L-Glutamine, 100 U / ml of penicillin, 100 ⁇ g / ml of streptomycin and 2.5 ⁇ g / ml of puromycin. All these media and solutions come from Invitrogen (France).
  • the regulatory plasmid pRevTet-ON codes, under the control of the strong CMV promoter, for the reverse transactivator Tetracycline rtTA (a fusion between the reverse Tet repressor and activator domain of VP16) ( Figure 1). The latter is fixed on its TRE response element present on the expression vector pRevTRE. The addition of Doxycycline (1 ⁇ g / ml) allows the transcription of the gene of interest. The protocol was carried out following the instructions in the RevTet manual (Clontech # K1627-1). Plasmid sequences and maps are available at http://www.clontech.com.
  • the different expression vectors pRevTRE containing the genes of interest, a selection gene with an antibiotic (HygromycinR), and ⁇ + (signal necessary for the formation of retroviral particles) or the regulatory vector pRevTet-ON having the selection gene to an antibiotic (Neomycin R) were transfected into the PT67 packaging cell lines using the GenePorterTM 2 Transfection Reagent kit (GTS.Ozyme).
  • the packaging cell line provides the structural genes necessary for the formation of a viral particle: gag (structural proteins), pol (reverse transcriptase, integrase) and env (envelope glycoprotein) integrated into the genome of the cell without no other viral sequence.
  • Retroviral vectors can integrate stably or be transiently expressed.
  • the viruses released by these cells are infectious but incompetent for replication, thus preventing viral production in the cell lines subsequently infected.
  • Selection with hygromycin (0.4 mg / ml) or G418 (0.4 mg / ml) makes it possible to isolate cells which have integrated the retroviral genome and which produce the recombinant MomuLV-NCVS, MomuLV-NERA retroviruses respectively, MomuLV-GERA, MomuLV-GCVS and MomuLV-TetON.
  • the cells 48 hours after infection, the cells are subjected to a selection with G418 (0.8 mg / ml) for pRevTet-ON or with hygromycin (0.4 mg / ml) for pRevTRE, for one week.
  • the virus titer corresponds to the number of colonies present at the highest dilution multiplied by the dilution factor, it is expressed in CFU / ml (Colony-forming Units / ml).
  • the transgenic Jurkat cells and the control cells having reached a density of 5 ⁇ 10 5 cells / ml are separated into two homogeneous batches of which only one is treated with Doxycycline at 1 ⁇ g / ml.
  • the cells are recovered after 18 h of induction, then centrifuged for 5 min at 800 rpm (4 ° C).
  • the cells are resuspended in PBS buffer and Cell Fix (Becton Dickinson, BD, USA).
  • the cells are then analyzed using the FACSCalibur cytofluorimeter and the Cell Quest Pro software (BD, USA).
  • the transgenic Jurkat cells and the control cells treated in the same way as above are incubated for 10 min at 37 ° C. with Hoechst 33342 (0.5 mg / ml), a DNA intercalating agent making it possible to visualize cells having a fragmentation characteristic of the nucleus.
  • the cells are centrifuged, washed with PBS, fixed for 30 min with 0.4% paraformaldehyde (PFA). After washing in PBS, the cells are taken up in buffered glycerol and mounted between slide and coverslip. The cells are observed under an inverted fluorescence microscope and a count of the cells exhibiting a characteristic fragmentation of nuclear DNA was carried out using the Metamorph offlline software (Metamorph software imaging System, Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA). Twenty fields were randomly counted for each condition and the mean was achieved.
  • the cells are washed in PB then incubated for 30 min with the appropriate components: streptavidin-PE (1/100) for the detection of the biotinylated antibody and for the N proteins, the anti mouse -biotinylated (1/100).
  • streptavidin-PE (1/100) for the detection of the biotinylated antibody and for the N proteins, the anti mouse -biotinylated (1/100).
  • the cells are washed in PB and finally resuspended in fluorescence labeling buffer (SB). Cells are incubated for 30 min with streptavidin-PE (1/100) to reveal the N proteins, then washed in SB buffer.
  • the cells are analyzed using the cytofluorimeter.
  • FITC-VAD-FMK CaspACETM FITC-VAD-FMK in situ Marker kit, Promega.
  • This compound contains an amino acid sequence recognized by cysteine proteases, it enters the cell, and irreversibly binds to activated caspases. Then we used the FAM-YVAD-FMK (CaspaTagTM Caspase 1 (YVAD) Activity Kit, Intergen), fluorescent analogue of N-benzyloxycarbonyl-Tyr-Val-Ala- Asp- fluoromethylketone: z-YVAD-FMK which is a specific inhibitor caspase 1, and FAM-LETD-FMK (CaspaTagTM Caspase 8 (LETD) Activity Kit, Intergen), fluorescent analogue of N-benzyloxycarbonyl-Leu-Glu-Thr-Asp-fluoromethylketone: z-LETD-FMK, which is a specific caspase 8 inhibitor.
  • FAM-YVAD-FMK CaspaTagTM Caspase 1 (YVAD) Activity Kit, Intergen
  • FAM-LETD-FMK CaspaTagTM
  • the transgenic Jurkat cells and the control cells having reached a density of 5 ⁇ 10 5 cells / ml are separated into two homogeneous batches, one of which is treated with Doxycycline at 1 mg / ml. Eighteen hours after induction, the cells are centrifuged and incubated for 1 hour at 37 ° C. with the various caspase inhibitors. The cells are then washed twice with PBS buffer, then once with SB, before being taken up in SB buffer and Cell Fix (BD, USA). The cells are analyzed with a cytofluorimeter. Results
  • RNAs were isolated 48 hours after infection of BSR cells with the two strains of rabies virus ERA and CVS at a multiplicity of infection of 3. RT-PCRs were performed on these extracts after denaturation of the secondary structures of the RNA molecules with methyl mercury. PCR products having a size compatible with the entire coding sequence for the G and N genes (1575nt and 1353nt respectively) were obtained. These PCR products were subjected to a double BamHI / Hpal enzymatic digestion. The digestion products did not show a substantial change in their size by 0.8% agarose gel electrophoresis.
  • Table 3 Comparison of sequences of the ERA and CVS glycoproteins with one another and with the reference strain PV.
  • each virus stock is added sterile polybrene at a final concentration of 4 ⁇ g / ml.
  • Serial dilutions are made (10 "1 to 10 " 6 ) and each dilution is placed in a well containing 10 5 NIH3T3 cells. 48 h after infection, the cells are subjected to a selection by hygromycin (0.4 mg / ml) or G418 (0.8 mg / ml).
  • the virus titer corresponds to the number of colonies present at the highest dilution multiplied by the dilution factor.
  • Jurkat cells are cells of the human lymphoblastoid line which grow in suspension with a doubling time of approximately 24 hours. These cells are sensitive to low cell densities and to cytotoxic or cytolytic mediators.
  • MomuLV-TetON multiplicity of infection of 1
  • the transgenic Jurkat cell lines were characterized for their capacity to induce the expression of the viral proteins N and G of the ERA and CVS strains after treatment with Doxycycline (Dox). Indeed, Dox has, compared to tetracycline, a 100 times higher affinity for the reverse transactivator rtTA. Therefore, it induces a greater activation of the rtTA protein and therefore a stronger induction of the gene to be expressed.
  • Dox has, compared to tetracycline, a 100 times higher affinity for the reverse transactivator rtTA. Therefore, it induces a greater activation of the rtTA protein and therefore a stronger induction of the gene to be expressed.
  • the transgenic lines have a 24-hour doubling rate which is similar to the JrtTA control cell line which only has rtTA. Like parental cells, these lines are sensitive to low cell concentrations and cytolytic factors.
  • the JrtTA-N.CVS, JrtTA-N.ERA, JrtTA-G.ERA, JrtTA-G.CVS cells as well as the JrtTA control cells were cultured. When they reached a density of 5 ⁇ 10 5 cells / ml, these cultures were individually separated into two homogeneous batches, only one of which was treated with Dox at 1 ⁇ g / ml.
  • the system consists of an integration of the gene of interest into the genome of the Jurkat cell. This random integration can locate the transgene in a transcriptionally active region or not. In some cases, the transgene may be difficult to access, and the rtTA may more or less bind to its TRE target. The transgenic lines being for the moment non-clonal, it is therefore very likely that the integration products are located at different loci.
  • variable reactivity of the antibodies We could also explain this weak expression by the fact that the antibodies used recognize more or less well the proteins synthesized. Indeed, these viral proteins are expressed in the absence of their other viral protein partners and, for the moment, we do not know if all the molecules expressed are correctly structured or not. Otherwise, a more or less important part of the synthesized protein may not have the epitope recognized by the monoclonal antibody.
  • the transgenic Jurkat lines as well as the control JrtTA line were cultured. When the cell cultures reached a density of 5 ⁇ 10 5 cells / ml, they were separated into two homogeneous batches, one of which was treated with Dox at 1 ⁇ g / ml. The cell phenotype of apoptosis induction was analyzed 18 hours after induction either by measuring the size and particle size of the cells by flow cytometry, or by counting the cells having a fragmentation of their nuclei (Hoechst staining technique).
  • apoptosis cells undergo characteristic morphological changes, some of which can be measured by flow cytometry.
  • the dead cells, forming the R2 population are characterized by a high granulosity (SSC: Side Light Scatter) and by a reduction in their size (FSC: For ard Light Scatter).
  • SSC Side Light Scatter
  • FSC For ard Light Scatter
  • the living cells, forming the R1 population have a smaller grain size and a larger size.
  • Fig 4. In all cultures we observe the presence of an R2 population. After treatment with Dox, Jurkat rtTA cells have a basic level of 10% of dead cells which could correspond to cells in apoptosis.
  • the expressed viral glycoproteins cause greater cell death than nucleoproteins whatever their origin.
  • the cells expressing the glycoprotein of the ERA strain which have the most marked phenotype.
  • the one of the phenotypes characteristic of apoptosis is the condensation of chromatin and the fragmentation of nuclear DNA which lead to a morphological modification of cell nuclei.
  • We have studied these phenomena by labeling the nuclei with Hoechst 33342 (0.5 mg / ml). The results obtained are shown in FIG. 5.
  • apoptotic cell cultures Compared to a cell culture which does not have cells dying of apoptosis, apoptotic cell cultures have many cells where the cell nucleus is completely destructured and even fragmented into several globular components. The cells were observed under an inverted fluorescence microscope and then we performed an image analysis using the Metamorph offline software to count the cells in terminal apoptosis, that is to say having a fragmented nucleus. The data in FIG. 5 clearly show that it is the JrtTA-G.ERA line which has the most cells in apoptosis (28.2%). These results confirm the results obtained by analyzing the size and grain size of the cells, the G-ERA protein is the main pro-apoptogenic protein.
  • caspase 1 cytokine activator and pro-inflammatory
  • caspase 8 initiating caspase
  • the expression of the G-ERA protein is a main factor triggering apoptosis in Jurkat cells. This process involves the caspase pathway and more precisely the initiating caspase 8. Unlike the CVS strain, the ERA strain glycoprotein does not appear to activate caspase 1.
  • G-ERA unlike G-CVS, would be cleaved by the initiating caspase 8 at a potential non-consensual site of cleavage. 2) G-ERA would interact with pro-caspase 8 and cause its activation, while G-CVS would lack this property.
  • G-ERA unlike G-CVS, would be cleaved by caspase 8. It has been established in two human diseases, Huntington's disease and cystic fibrosis, that cellular dysfunction is directly linked to the aggregation of proteins in the cell. It would appear, in fact, that the mutant form of huntingtin (Huntington's disease) or CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) causes the loss of functionality of the structure which degrades the abnormal proteins, the proteasome (49). It therefore seems that the toxic accumulation of certain proteins can induce the loss of the entire cell and cause the death of the cell.
  • Huntington's disease Huntington's disease
  • cystic fibrosis cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
  • a malfunction of the proteasome could be at the origin of other neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease and Spinocerebral ataxia (50-53).
  • Huntington's disease is characterized by the generation of N-terminal proteolytic fragments of huntingtin, containing repeats of several glutamines, which aggregate in the nucleus and cytoplasm of neurons. Accumulation of the pathological form of huntingtin is thought to result from abnormal cleavage by the caspases (54).
  • Huntingtin is said to be cleaved by caspase 6 at the IVLD sequence which is a potential non-consensual site for cleavage of group III caspases (55, 56).
  • G-ERA would be cleaved by caspases which would induce an abnormal aggregation of the protein leading to a deterioration of the function of the proteasome and the death of the cell.
  • G-CVS is not cleaved by caspases, does not accumulate abnormally and therefore does not induce apoptosis.
  • This hypothesis can be advanced since the analysis of the protein sequences of the glyproteins of the CVS and ERA strains highlights the existence of a potential non-consensual site of cleavage by group III caspases.
  • Fas did not is not involved in rabies apoptosis since the addition of anti-Fas antibodies does not increase apoptosis (58).
  • the glycoprotein of the strain ERA could play a role of catalyst in the oligomerization of the molecules of pro-caspase 8.
  • the demonstration of an interaction between the G-ERA protein and the pro-caspase 8 at the level of their DED could be envisaged by 1) carrying out co-immunoprecipitation experiments, using an anti-caspase 8 antibody, for example, the monoclonal antibody Ab-3 ( Oncogene) reacting with pro-caspase 8.
  • an anti-caspase 8 antibody for example, the monoclonal antibody Ab-3 ( Oncogene) reacting with pro-caspase 8.
  • EXAMPLE 2 Demonstration of the Superiority of the Presentation of Antigens in the Form of Apoptotic Bodies Compared to That of Infected Infected Cells in Term of Antibody Response
  • the Applicant shows that the apoptotic bodies, generated during the apoptosis of lymphoblastoid cells infected with the rabies virus, contain at least two of the viral proteins: the glycoprotein G and the nucleoprotein N.
  • the Applicant has established in a mouse model that animals vaccinated with apoptotic bodies produce much more antibody than animals injected with whole infected cells.
  • the Applicant therefore demonstrates an innovative advantage of the stimulation of B cells.
  • the preparations are inactivated by UV (inactivation of 100% of the infectious power of the virus).
  • the presence of apoptotic bodies was checked by immunohistochemistry and measured by ELISA (Cell death detection Elisa kit) which detects nucleosomes.
  • the quantity of viral antigens injected was measured by ELISA quantification of the protein N (Montano-Hirose et al., 1995, Res. Virol., 146, 217-224).
  • the effective dose by intraperitoneal injection is 200 to 400 ng per mouse.
  • Four groups of 8 syngeneic BALB / c mice of Wehi cells were injected with the same volume of the following four preparations:
  • the booster effect was measured after injection on day 21 of the whole rabies vaccine (PM strain, production on VERO cell).
  • FIGS. 8 and 9 The results of these experiments are represented in FIGS. 8 and 9. As can be seen, the injection of apoptotic bodies leads to an immunostimulation of the response B. In addition, the effect of booster vaccination (heterologous for cells or apoptotic bodies) indicates a very strong immunopotentiation in mice having received a primary injection of apoptotic bodies.
  • apoptotic bodies generated during the apoptosis of lymphoblastoid cells infected with the rabies virus (strain ERA), contain at least two of the viral proteins: the glycoprotein G and the nucleoprotein N.
  • the glycoprotein G and the nucleoprotein N.
  • mice vaccinated with apoptotic bodies produce more antibodies than animals injected with whole infected cells.
  • apoptotic bodies supported by CPA may be an important source of antigens that are effectively presented to the immune system. They also suggest that the inclusion of a pro-apoptotic protein in a genetically engineered vaccine could be a determining factor in improving these vaccines, which are most often weak immunogens (recombinant vectors, DNA / RNA vaccine).
  • Embryonic carcinoma (EC) cells are the "stem cells” (CS) that exist in some germ line tumors, teratocarcinomas. Like CS cells, human CE cells proliferate extensively in vitro and in teratomas formed in vivo after injection in immunocompromised animals. However, unlike CS cells, human CE cells are aneuploid and only differentiate in certain specific cell types (Stem Cells: Scientific progress and future research directions, June 2001, NIH report, http: //www.nih. gov / news / stemceII / scireport.htm).
  • N Tera 2D1 cells can differentiate into pure cultures of post-mitotic human neurons (NT2-N) after induction of the differentiation of N Tera 2D1 by all-trans retinoic acid, then treatment with mitosis inhibitors and purification by gentle trypsination (Andrews, PW, 1998, APMIS, 106, 158-167).
  • NT2-N cells have all the specific markers of differentiated human neurons (Guillemain, I., The Journal Of Comparative Neurology, 2000, 422, 380-395). They can establish in synaptic contacts with each other and functional contacts with astrocytes in coculture. These cells are currently the best model because they offer the possibility of cultivating large quantities of post-mitotic human neurons with a homogeneous physiological state.
  • NT2-N cultures were cultured on individual labteck type chambers treated with polylysine and laminin, a treatment which allows their adhesion. After 48 h of culture, the cell bodies express and the Neurofilament 200 (Nf) antigen of the axons. On uninfected cells, the presence of neurofilament proteins was detected by a specific anti-Nf antibody (Anti Neurofilament 200, sigma, USA, no. N4142). These cells were either infected with the rabies virus strain ERA (pro-apoptotic) at a multiplicity of infection of 5, or uninfected. 24 h postinfection the cells were fixed with 80% acetone (30 min at 4 ° C) followed by an incubation of 20 min in pure ethanol.
  • the integrity of the cell nucleus or its fragmentation taken as a marker of apoptosis was demonstrated by staining with Hoechst 33342 at 1 ⁇ g / ⁇ l.
  • the results presented in FIG. 13 show that the NT2-N cells are specifically labeled with the anti-Nf antibody, thus attesting to their character as neurons.
  • the cells infected with the ERA virus exhibit a punctate fluorescence characteristic of the rabies nucleocapsid.
  • the infected cells show a breakdown of the nuclear structure, visualized by Hoechst 33342 staining, which is characteristic of the apoptotic process.
  • the NT2-N cells were infected either with the ERA strain, or with the CVS strain (not apoptogenic in Jurkat cells), or else uninfected and 24 h post infection the quantity of neurons in apoptosis was evaluated. after coloring with Hoechst.
  • the results are represented in FIG. 16.
  • the strain ERA generates a neuronal apoptosis (18.55%) which is significantly greater than the control of uninfected cells (2.8%>) or the cells infected with CVS. (4%).
  • the ERA (non-pathogenic) strain of the rabies virus unlike the CVS (pathogenic) strain, is therefore capable of triggering neuronal apoptosis as it does in cells of the lymphoblastic lines.
  • an insert corresponding to the open reading phase of the G-ERA glycoprotein gene was isolated from the plasmid pRev-TRE.G.ERA (CNCM, n ° 1- 2760) by enzymatic cleavage by the restriction enzymes BamHI and Hpal .
  • This insert was cloned into the vector pTG 186 previously cut by the restriction enzymes BamHI and Smal and dephosphorylated.
  • the plasmids of these bacteria were purified and analyzed by enzyme restriction. Four recombinant plasmids possessing the integration of the G-ERA gene under the control of the 7.5K promoter were characterized.
  • the nucleic acid sequences have been established. A representative clone was selected and used for the experiments of co-transfection with the infectious DNA of vaccinia Copenhagen. Four recombinant viruses were selected. The expression of the G-ERA transgene was measured by flow cytofluorimetry after infection of green monkey kidney cells (CV1) and detection of the antigen by the monoclonal antibody 8.2 (collection of the Viral Neuroimmunology Unit). An example of the type of detection obtained is shown in Figure 15. The four recombinant viruses gave a similar expression of the glycoprotein. c) Construction of a recombinant vaccinia virus expressing G-ERA and HA-influenza
  • Dr. Coupar constructed a plasmid allowing the insertion of a gene of interest under the control of the 7.5K promoter into a multiple cloning site of a shuttle plasmid (pTK-7.5 A) at the Hind III-F locus of the vaccinia (Coupar et al, 1988, Gene, 68, 1). This plasmid also has the tk gene of the HSV virus under the control of the vaccinia PF promoter.
  • an insert corresponding to the open reading phase of the G-ERA glycoprotein gene was isolated from the plasmid pRev-TRE.G.ERA (CNCM, n ° 1- 2760) by enzymatic cleavage by the restriction enzymes BamHI and Hpal .
  • This insert was cloned into the vector pTK 7.5-A previously cut by the restriction enzymes Hind III (repaired at the Hind III site) and BamHI, and dephosphorylated.
  • Hind III repaired at the Hind III site
  • BamHI dephosphorylated.
  • the plasmids of these bacteria were purified and analyzed by enzyme restriction.
  • a recombinant plasmid having integration of the G-ERA gene under the control of the 7.5K promoter was characterized. The nucleic acid sequence has been established. The selection of recombinant viruses is underway.
  • mice were infected intravenously with 10 7 UFP of virus or 10 7 and 10 5 of virus by intraperitoneal route which is the commonly described route.
  • Mouse lymphoblastoid cells, line EL4 (ATCC # TIB-39) were infected with the vv G-ERA virus at a multiplicity of infection of 3. After 24 hours of infection, the cells were fixed using cell fix (Becton Dickinson, USA) to be analyzed by flow cytometry ( Figure 16). During apoptosis, EL4 cells undergo characteristic morphological changes, some of which can be measured by flow cytometry (Kishimoto, H. et al, 1995, J. Exp. Med, 181, 649-655). The cells entering apoptosis form the R2 population and are characterized by a high grain size (SSC: Side Light Scatter) and by a reduction in their size (FSC: Forward Light Scatter).
  • SSC Side Light Scatter
  • FSC Forward Light Scatter
  • the population R2 represents 67%> in the case of cells infected with the vv G-ERA virus, whereas it does not represents that 20% of all the cells after infection with the vaccinia virus not expressing a transgene (vv TG186 empty). This establishes that the expression of G-ERA using this vector retains well the pro-apoptotic property of G-ERA.
  • the HA protein of the influenza virus induces less apoptosis than the G ERA protein of the rabies virus
  • the EL4 cells were then infected with the recombinant vaccinia virus expressing the HA protein of the influenza virus (vv PHA).
  • the results are represented in FIG. 16 B.
  • the population R2 represents 46% of the totality of the cells, whereas it represented 67% in the case of cells infected with the vv G-ERA virus. This confirms that the pro-apoptotic character is an intrinsic property of G-ERA and that it is not associated with any viral glycoprotein of which HA is the prototype.
  • the HA and G-ERA proteins are co-expressed on the cell surface in the case of vv PHA and vv G-ERA co-infection.
  • double infections were carried out either with the viruses vv PHA and vv G-ERA, or vv PHA and vv TG186 or finally with vv G-ERA and vv TG 186 with a multiplicity of infection of 3 for each virus.
  • the presence of antigens on the cell surface has been demonstrated by specific labeling of either the HA antigen using a polyclonal antibody directed against the influenza virus (gift from Nicolas Escriou, GMVR Unit, Institut Pasteur) followed a secondary antibody coupled to biotin, then streptavidin coupled to phycoerythrin (PE), or a monoclonal antibody specific for the G-ERA protein (mAb 8.2) followed by a secondary antibody coupled to FITC.
  • PE phycoerythrin
  • mAb 8.2 monoclonal antibody specific for the G-ERA protein
  • the quantity of cells exhibiting both PE and FITC fluorescence was determined by flow cytometry.
  • the results are presented in FIG. 17. It is observed that in the population co-infected with the vv PHA viruses and vv G-ERA, the population of cells expressing both the G-ERA and HA antigens on the surface of their plasma membrane represents 82% of the population.
  • the cells co-infected with the vv PHA and vv G-ERA viruses and treated with the antibodies described above were analyzed by immunofluorescence after fixation with 80% acetone and staining with Hoechst 33342.
  • the dye Hoechst 33342 makes it possible to visualize the state of cell nuclei.
  • Cells in apoptosis are characterized by condensation of chromatin and nuclear fragmentation.
  • An example of the type of cells that we observe during this type of co-infection is shown in Figure 18. As we can see, the cells do show a green fluorescence characterizing the detection of G-ERA, a red fluorescence characterizing the detection HA antigen and more or less significant nuclear fragmentation depending on the cells and displayed in blue.
  • EL4 cells were infected with recombinant vaccinia viruses vv PHA, w G-ERA or vv TG-186 at a multiplicity of infection of three, under conditions allowing to obtain more than 95% of infected cells between 30 and 48 hours of culture.
  • the state of infection or co-infection was established by flow cytometry analysis as described above.
  • the measurement of the apoptosis of the population was carried out by flow cytometry (size of R2) and by immunofluorescence experiments after labeling with Hoechst 33342.
  • the following cell preparations were carried out: 1. Cells infected with vv PHA and vv TG-186
  • the comparison of conditions 1, 2 and 7 makes it possible to establish that only G-ERA, and not PHA, has an amplifying effect on the response B directed against the antigens of vv TG-186.
  • the comparison of conditions 1, 3 makes it possible to establish that G-ERA is an immunopotentiator against the heterologous viral antigen HA.
  • the comparison of conditions 3 and 4 provides information on the impact of the mode of presentation of G-ERA in relation to the heterologous antigen and answers the question is what the two antigens must be expressed by the same cell or can they be presented by different cells.
  • the comparison of the responses of antibodies directed against HA and against G-ERA under conditions 3 and 5 as well as 4 and 6, demonstrates the role of the induction of apoptosis in the immunogenic power of G-ERA
  • the preparations are inactivated by UV (inactivation of 100% of the infectious power of the virus).
  • Eight groups of 10 syngeneic C57BL mice of EL4 cells were injected intraperitoneally in the same volume. Response B is analyzed for 21 days. Blood samples are taken from the retro-orbital plexus.
  • mice were then boosted, 90 days after the first injection, a dose of inactivated influenza virus.
  • the anti-HA antibody response was then measured 7 and 15 days after the booster.
  • rabies virus glycoprotein The apathogenic strain of rabies virus glycoprotein is the only protein inducing caspase-dependent apoptosis in human cells
  • SN10 is the apathogenic prototype strain which allowed the development of the reverse genetic system of the rabies virus (Schnell, MJ et al, 1994, EMBO J., 13: 4195-4203, accession number in GenBank M31046).
  • the nucleotide sequence of the gene coding for protein G is different between ERA and SN10.
  • the CVS-N2C strain is a highly pathogenic, neurotropic and non-apoptogenic strain (Morimoto, K. et al, 1998, PNAS, 95: 3152-3156).
  • the recombinant chimera R-N2C is a strain in which, in an SN10 genome, the glycoprotein gene has been replaced by that of the G protein of the CVS-N2C strain (Morimoto, K.
  • glycoprotein is indeed the only determining factor of the apoptogenic phenotype.
  • the rabies virus being a neurotropic virus, we then set out to show that these results could be extended to human neuronal cells.
  • the results represented in FIG. 20 are identical to those obtained with Jurkat cells.
  • glycoprotein is indeed the major determinant of viro-induced apoptosis both on lymphoblastoid cells and on neuronal cells.
  • ICAM- I Inter-Cellular Adh sion molecule i ⁇ ter-ceilulaire adhesion molecule
  • PV Pasteur production Virus Pulsteur pioduclion virus
  • TNF- ⁇ T mor Necrosis Factor Tumor Necrosis Factor
  • TRE Te racycline-Re. ⁇ onsive El ment (Wine Tetracycline Response Element) wine Human Immunodeficiency Virus

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Abstract

La présente invention se rapporte à un polypeptide isolé ou purifié et au polynucléotide le codant induisant, par le biais de l'activation de la caspase 8 initiatrice, la formation de corps apoptotiques capables de stimuler dans un vertébré une réponse immunitaire humorale et préférentiellement, une réponse immunitaire humorale de type B dépendante.

Description

POLYPEPTIDES INDUISANT L'APOPTOSE, POLYNUCLEOTIDES LES CODANT ET LEURS APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION a) Domaine de l'invention
La présente invention se rapporte à l'induction de l'apoptose, la production de corps apoptotiques et leurs applications thérapeutiques.
b) Brève description de l'art antérieur
Lors de l'infection d'une cellule par un virus, la physiologie cellulaire est perturbée et ces modifications peuvent conduire à l'apoptose. Il est connu que l'apoptose peut être induite par le virus de la rage. En effet, il a été établi que les souches de virus rabique ERA et CVS infectent les lymphocytes mais que seule l'infection des lymphocytes par la souche rabique vaccinale induit l'apoptose (46). Paradoxalement, l'immunogénicité des souches de virus rabique est inversement proportionnelle au degré de mort cellulaire qu'elles induisent (Thoulouze et a/.(1997) J. Virol., 71:7372-80). Le déclenchement du processus apoptotique ou son blocage, soit par l'addition de l'inhibiteur de caspases zVAD-FMK, soit par surexpression de Bcl-2 n'a pas d'effet sur la production virale des cellules.
Ceci indique que le processus apoptotique viro-induit par la souche ERA est un événement qui ne modifie pas le cycle viral, certainement parce qu'il intervient trop tardivement et que l'apoptose n'améliore pas le relarguage des particules virales. L'apoptose rabique ne peut pas être induite par la seule incubation des cellules avec du virus non réplicatif et ceci permet d'exclure que le virus de la rage induise l'apoptose par interaction avec des récepteurs membranaires.
L'apoptose rabique implique l'activation des caspases 1, 3 et 8, elle est donc caspase dépendante. Dans des expériences de traitement par zVAD-FMK il a été constaté qu'une sous-population des cellules en apoptose étaient résistantes à l'action de cet inhibiteur. Ceci laissait penser qu'une voie indépendante des caspases devait aussi être activée. Récemment il vient d'être montré au laboratoire que les souches qui induisent l'apoptose activent la voie AIF (Prehaud et al. , Forum Neurosciences, 2001). Les deux formes d'apoptose sont bloquées par Bcl-2.
Récemment, on rapportait une corrélation entre que le degré d'apoptose induite et la surexpression de la glycoprotéine G (Dietzschold, Faber & Schnell, XII International Meeting on Advances in Rabies Ressearch and Control in the Americas, 2001). De plus, une étude réalisée avec des clones de cellules Jurkat surexprimant Bcl-2 a montré que cette résistance à l'apoptose s'accompagnait d'une modification de la répartition des antigènes viraux N et G. Ainsi dans les cellules qui n'entrent pas en apoptose, les antigènes viraux sont concentrés dans des structures périnucléaires globulaires. Au contraire, dans les cellules qui entrent en apoptose, ils s'accumulent dans le cytoplasme et cette accumulation conduit à la mort par apoptose. Ces résultats rappellent ceux observés dans le système de cellules lymphoblastoides non transfectées par Bcl-2, entre une souche non apoptogène (CVS) et une souche pro-apoptotique (ERA). On voit donc ainsi que le passage à un phénotype apoptogène se caractérise par l'accumulation des antigènes viraux de manière diffuse dans tout le cytoplasme et que le phénotype non-apoptogène correspond à une accumulation de protéines dans des structures périnucléaires globulaires. Ceci suggérait que la voie d'apoptose rabique soit de type toxique.
La désagrégation de l'intégrité de la cellule infectée conduit à la génération de corps apoptotiques qui contiennent, en plus de morceaux de noyaux et de cytoplasme, des antigènes viraux. De nombreuses évidences expérimentales attestent maintenant que ces structures sont des immunopotentiateurs extrêmement efficaces lorsqu'ils sont pris en charge par certaines cellules présentatrices d'antigènes CPA (Cellules dendritiques) et qu'il y a présentation des antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I, donc une induction de la réponse immunitaire cellulaire (Albert et al. (1998) Nature 392:86; Bérard et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1535; Arrode et al. (2000) J. Virol. 74(21):10018-24; Paczesky et al. (2000) Cancer Res. 61:2386; Sasaki et al. (2001) Nature Biotechnology 19:543-547).
La possibilité d'induire de façon spécifique et contrôlée l'apoptose pour qu'elle puisse être utilisée afin d'augmenter le pouvoir immunostimulateur de vaccins, tel un adjuvant, afin de stimuler une réponse immunitaire humorale explique le besoin de caractériser une protéine qui induit la production de corps apoptotiques capables de stimuler la réponse des cellules B du système immunitaire.
La présente invention répond à ce besoin et à d'autres besoins comme cela sera apparent pour une personne versée dans le domaine à la lecture de la présente description de l'invention
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte à un polypeptide isolé ou purifié et au polynucleotide le codant induisant, par le biais de l'activation de la caspase 8 initiatrice, la formation de corps apoptotiques capables de stimuler dans un vertébré une réponse immunitaire humorale et préférentiellement, une réponse immunitaire humorale de type B dépendante.
Le polypeptide de l'invention peut être sélectionné, selon différents modes de réalisation préférés, dans le groupe constitué par : a) une glycoprotéine G, présentant une séquence comprenant au moins une proline en position 27, une isoleucine en position 48, une valine en position 219 ou une arginine en position 491 ; b)un fragment d'au moins 100 acides aminés de la glycoprotéine G telle que définie en a) ; et c)un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés présentant au moins 75% d'homologie avec une séquence d'acides aminés telle que définie par SEQ ID NO : 2.
Selon un autre mode de réalisation préféré le polypeptide de l'invention comprend également une thréonine en position 89. Un autre objet de l'invention est de fournir un polypeptide chimérique isolé ou purifié comprenant au moins un polypeptide tel que défini selon l'invention associé à une séquence polypeptidique exogène. Préférentiellement, la séquence polypeptidique exogène est la séquence d'un épitope B et/ou d'un épitope T.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide de l'invention comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 75% d'homologie avec la séquence nucléotitique telle que définie par SEQ ID NO : 1.
Un autre objet de l'invention est de fournir un oligonucléotide isolé ou purifié comprenant une séquence choisie dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO 7.
L'invention a en outre pour objet de fournir un vecteur d'expression ou de clonage qui contient un polynucleotide de l'invention. Selon certains modes de réalisation préférés, le vecteur est sélectionné dans le groupe constitué par les virus recombinants et les plasmides recombinants possédant une origine de réplication eucaryote.
L'invention concerne, en particulier, les vecteurs pRevTRE.G.ERA, pRevTRE.N.ERA, pRev-TRE-G-CVS et pRev-TRE-N-CVS déposés à la C.N.C.M., le 30 novembre 2001 sous les numéros d'accession 1-2760, 1-2761 , 1 -2758 et 1 -2759 respectivement.
L'invention concerne en outre une cellule hôte contenant un polynucleotide ou un vecteur selon la présente invention. Dans un mode de réalisation préféré, le polynucleotide ou vecteur est intégré de façon stable dans le génome de la cellule hôte. Dans un autre mode de réalisation préféré, la cellule hôte est d'origine lymphoblastoide. L'invention vise également une composition immunogène ou vaccinale contenant au moins un élément choisi dans le groupe constitué par a) un polypeptide, b) un polynucleotide, c) un vecteur, d) une cellule hôte ou un corps apoptotique comprenant a), b), c) et ou d), et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Par ailleurs, l'invention a aussi pour objet de fournir une méthode d'induction d'une immunité humorale comprenant l'administration à un vertébré d'une composition immunogène ou vaccinale selon la présente invention.
L'invention porte également sur l'utilisation d'un polypeptide, d'un vecteur, d'une cellule hôte ou d'un corps apoptotique selon la présente invention pour la préparation d'un vaccin ou d'un adjuvant de l'immunité. Préférablement, le vaccin ou l'adjuvant de l'immunité induit une réponse immunitaire humorale dans un vertébré. Préférablement encore, le vaccin ou l'adjuvant de l'immunité est destiné à la prévention ou au traitement d' une encéphalite virale, de la rage, d'un cancer ou d'une neuropathologie. On comprendra que le vaccin ou l'adjuvant selon la présente invention a pour objet un usage humain ou animal.
Un des avantages majeurs de la présente invention est que les acides nucléiques et les polypeptides selon l'invention permettent via l'activation de la caspase 8 initiatrice de l'induction de la formation de corps apoptotiques capables de stimuler la réponse immunitaire humorale de l'hôte ciblé.
De nombreux autres objectifs et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description non limitative de l'invention qui suit. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 est un schéma illustrant le mécanisme du système d'expression de gènes RevTet-ON.
La Figure 2 est un schéma illustrant la formation de particules rétrovirales infectieuses mais déficientes pour la réplication.
La Figure 3 est un schéma illustrant la mise en évidence de l'expression des différentes protéines dans des lignées Jurkat transgéniques. L'expression des glycoprotéines est visualisée à l'aide de l'anticorps primaire 8.2 biotinylé (1/100) suivi de la strep-PE (1/100). Pour les protéines N, nous avons utilisé un mélange de trois anticorps Japonais anti-N (chacun au 1/50) suivi d'un anti-souris biotinylé (1/100) et de la strep-PE (1/100). Le marqueur M1 est utilisé pour quantifier la fluorescence des cellules traitées à la Dox par rapport aux cellules non traitées.
La Figure 4 représente l'analyse de la taille et de la granulosité des cellules par cytométrie de flux. Les cellules vivantes, formant la population R1 se caractérise par une granulosité faible et une grande taille. Les cellules mortes, formant la population R2, présentent quant à elles, une plus forte granulosité et une réduction de leur taille. La quantification des cellules en apoptose a été faite par la différence entre le pourcentage de cellules en apoptose présent dans les cultures traitées à la Dox et le pourcentage d 'apoptose dans les cultures non traitées. Ces résultats sont représentatifs de plusieurs analyses.
Les Figures 5A, 5B et 5C montre une analyse des cellules en apoptose par marquage au Hoechst 33342 (0.5 mg/ml) et dénombrement à l'aide du logiciel Metamorph offline. (A) Cellules en apoptose, une flèche blanche montre des cellules présentant une fragmentation caractéristique de l'ADN nucléaire. (B) Cellules non apoptotiques ne présentant pas de fragmentation du noyau (flèche blanche). (C) Cellules dénombrées à l'aide du logiciel Metamorph offline.
La Figure 6 représente la mesure de l'activation de la caspase I par cytométrie de flux. Le marqueur M1 est utilisé pour mesurer la fluorescence dans les cellules traitées à la Dox par rapport aux cellules non traitées..
La Figure 7 représente la mesure de l'activation de la caspase 8. Le marqueur est analysé par cytométrie de flux. Le marqueur M1 est utilisé pour mesurer la fluorescence dans les cellules traitées à la Dox par rapport aux cellules non traitées.
La Figure 8 est un graphique montrant la croissance relative du titre d'anticorps anti-rage (AU/ml, ELISA) (toutes protéines confondues) produits dans les jours suivant l'injection de corps apoptotiques (points carrés) ou de cellules entières (points en losange) dans des souris BALB/c syngéniques des cellules Wehi et suivant le rappel.
La Figure 9 est un graphique montrant la production d'anticorps anti-protéine N produits après injection de corps apoptotiques ou de cellules entières dans des souris BALB/c syngéniques des cellules Wehi.
La Figure 10 montre la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 1) du gène codant pour la protéine G de la souche rabique ERA.
La Figure 11 montre la séquence peptidique (SEQ ID NO : 2) de la protéine G- ERA déduite à partir de la séquence montrée à la Figure 12.
La Figure 12 montre la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 1) du gène codant pour la protéine G-ERA et la séquence peptidique déduite correspondante (SEQ ID NO : 2). La Figure 13 représente le marquage spécifique des cellules NT2-N infectées par le virus ERA, contre des cellules NT 2-N non infectées.
La Figure 14 représente la qualité de mesures en % de cellules NT2-N en apoptose selon qu'elles sont non infectées, infectées par le CVS ou infectées par l'ERA, évaluée après coloration au Hoechst.
La Figure 15 représente un exemple de la détection obtenue de l'antigène G- ERA dans des cellules de rein de Singe vert (CV1) infectées par l'anticorps monoclonal 8.2 (collection de l'Unité de Neuroimmonologievirale).
La Figure 16 représente les profils de cytométrie de flux de cellules lymphoblastoides de souris, de lignée EL4 infectées. Les populations R 2 sont les cellules entrant en apoptose, alors que les populations R1 sont les cellules vivantes.
La Figure 17 représente la détermination par cytométrie de flux de la quantité de cellules présentant à la fois une fluorescence PE (et FITC. Dans la population co- infectée par les virus vv PHA et vv G-ERA, la population de cellules exprimant à la fois les antigènes G-ERA et HA à la surface de leur membrane plasmique représente 82% de la population.
La Figure 18 représente un exemple du type de cellules observées lors de confection de cellules EL4 par les virus vv PHA et vv G-ERA. La coloration au Hoechst 33342 permet de visualiser les noyaux cellulaires. Les cellules présentent une fluorescence verte caractérisant la détection de l'antigène HA et une fragmentation nucléaire plus ou moins importante en fonction des cellules et visualisée en bleu. Les corps apoptotiques contiennent les deux types d'antigènes viraux : HA (rouge, 18-B-D) et G-ERA (vert, 18-C-D).
La figure 19 représente la capacité apoptogène de différents virus dans les cellules Jurkat. Le recombinant chimère R-N2C est une souche où dans un génome de type SN10, le gène de la glycoprotéine a été remplacé par celui de la protéine G de la souche CVS-N2C. Si la souche SN10 est pro-apoptogène en cellules lymphoblastoides, ce n'est pas le cas pour la souche chimère R-N2C. Ceci est vérifié par des mesures d'apoptose réalisées par différentes méthodes (pourcentage de caspase 8 activée, tunnel ou fragmentation nucléaire).
La figure 20 représente la capacité apoptogène de différents virus dans les cellules neuronales de lignée SK-N-SH. Le recombinant chimère R-N2C est une souche où dans un génome de type SN10, le gène de la glycoprotéine a été remplacé par celui de la protéine G de la souche CVS-N2C (voir figure 19). Si la souche SN10 est pro-apoptogène en cellules neuronales, ce n'est pas le cas pour la souche chimère R-N2C. Ceci est vérifié par des mesures d'apoptose réalisées par différentes méthodes (pourcentage de caspase 8 activée, tunnel ou fragmentation nucléaire).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention vise un polypeptide isolé ou purifié qui induit la formation d'au moins un corps apoptotique capable de stimuler une réponse immunitaire humorale , par exemple une réponse humorale de type B chez un vertébré et de préférence chez un mammifère.
Par « isolé ou purifié », on entend les molécules qui ont été altérées par l'homme de leur état natif c'est-à-dire que si une telle molécule existe dans la nature, elle a été changée et/ou retirée de son environnement initial. Par exemple, un polynucleotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas « isolé ». Toutefois, le même polynucleotide ou polypeptide lorsque séparé de son environnement normal et/ou obtenu par clonage, amplification et/ou par synthèse chimique est considéré selon la présente invention comme étant « isolé ». D'ailleurs, un polynucleotide ou polypeptide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par n'importe quelle autre méthode de génie génétique est considéré « isolé » même si il est encore présent dans ledit organisme.
Par « réponse immunitaire humorale », on entend une réaction in vivo ou in vitro en réponse à un contact avec un immunogène. Une réaction humorale est généralement induite par une production d'anticorps générée contre ledit immunogène.
Par « corps apoptotique », on entend un complexe acide nucléique/protéine formé par le morcellement cellulaire lors du processus apoptotique de la cellule. 1. Polypeptide et polynucleotide
Dans un premier aspect, la présente invention vise un polypeptide immunostimulateur qui stimule la réponse de l'immunité humorale en induisant la formation de corps apoptotiques par l'activation de la voie des caspases et tout particulièrement celle de la caspase-8 initiatrice. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le polypeptide est sélectionné dans le groupe constitué par : a) une glycoprotéine G qui présente une séquence comprenant au moins une proline en position 27, une isoleucine en position 48, une valine en position 219 ou une arginine en position 491 , de préférence, cette glycoprotéine est issue d'un virus de la rage ; b) un fragment d'au moins 100 acides aminés de la protéine telle que définie en a); c) un polypeptide comprenant une séquence nucléotidique présentant au moins 75% d'homologie avec une séquence d'acide aminée telle que définie par la séquence SEQ ID NO.2
Le polypeptide de la présente invention peut également comprendre une thréonine en position 89. De manière avantageuse, les inventeurs ont découvert qu'un polypeptide ayant comme séquence peptidique la séquence SEQ ID NO :2 était particulièrement intéressant. La présente invention vise également un polypeptide chimérique présentant une séquence comprenant au moins un polypeptide tel que défini précédemment associée à une séquence exogène, par exemple celle d'un épitope B et/ou d'un épitope T.
Les polypeptides selon la présente invention peuvent être préparés et/ou obtenus par tout procédé approprié et connu par une personne versée dans le domaine. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par les techniques de biologie moléculaire, utilisant notamment la RT-PCR et différents vecteurs et lignées cellulaires appropriés tel que décrits ci-après.
La présente invention a aussi pour objet des oligonucléotides ayant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO : 7. Ces oligonucléotides étant préférablement utilisés comme sonde ou comme amorce, par exemple, dans le cadre d'une amplification par RT-PCR d'un polynucleotide qui code pour le polypeptide de l'invention. A cet effet, la présente invention vise également tout polynucleotide codant pour un polypeptide tel que défini auparavant. Plus précisément, le polynucleotide comprend préférablement une séquence nucléotidique présentant au moins 75% d'homologie avec celle définie par la séquence SEQ ID NO : 1.
Selon le contexte de la présente invention, le terme "polynucleotide" se réfère à tout polyribonucléotide ou poly-désoxyribonucléotide, qui peut être une molécule d'ADN ou d'ARN modifiée. Cette définition inclut sans restriction, l'ADN ou l'ARN simple ou double brin; l'ADN ou l'ARN constitué d'un mélange de région simple-double brin; simple-double-triple brin et les molécule hybrides ADN/ARN constituées d'un mélange de région de simple-double et/ou triple brin. Les polynuclétides peuvent également comprendre des régions de triple brin d'ADN et /ou d'ARN. Les brins de telles régions peuvent provenir d'une même molécule ou d'une molécule différente. La molécule comprenant une région triple hélice peut être un oligonucléotide. Les polynucléotides peuvent en outre comprendre des molécules d'ADN et/ou d'ARN comprenant des bases modifiées telles que les bases tritylées. Ainsi, de telles molécules modifiées pour fins de stabilité ou pour toutes autres raisons sont incluses dans la portée de la présente invention. De plus, les molécules d'ADN et/ou d'ARN comprenant des bases particulières telles que l'inosine sont incluses dans la portée de l'invention. Tout polynucleotide qui ont été modifié chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement mais qui ont conservé les propriétés biochimiques du polypeptide d'origine c'est-à-dire qui a conservé son pouvoir immunostimulateur par l'entremise de l'activation de la caspase 8 initiatirice et donc la formation de corps apoptotiques, est incluse dans la portée de la présente invention.
Dans le contexte de la présente invention, le terme "polypeptide" est définit comme étant tout peptide ou protéine comprenant au moins deux acide aminés liés par un lien peptidique modifié ou non. Le terme polypeptide se réfère à des molécules de courtes chaîne telles que des peptides, oligopeptides ou oligomères ou a des longues chaînes telles des protéines. Un peptide selon la présente invention comprend généralement de 2 à 20 acides aminés, préférablement de 2 à 10 acides aminés, et encore plus préférablement de 2 à 5 acides aminés. Un polypeptide selon la présente invention peut comprendre de des acides aminés modifiés. Ainsi, le polypeptide de la présente invention peut également être modifié par un procédé naturel tel que les modifications post- transcriptionel ou par un procédé chimique. Quelques exemples de ces modifications sont: acétylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, liaison covalente avec la flavine, liaison covalente avec un hème, liaison covalente avec un nucléotide ou un dérivé nucléotidique, liaison avec un lipide ou un dérivé lipidique, liaison covalente avec un phosphotidylinositol, réticulation, cyclisation, formation de lien disulfure, déméthylation, formation de molécule cystéine, formation de pyroglutamate, formylation, gamma-carboxylation, hydroxylation, iodination, méthylation, oxidation, phosphorylation, racemisation, hydroxylation, etc. Ainsi, toutes modifications du polypeptide qui n'a pas pour effet d'éliminer les caractéristiques biochimiques du polypeptide d'origine, c'est-à-dire la capacité d'activer la caspase 8 initiatrice et par le fait même de provoquer la formation de corps apoptotiques qui ont pour effet de stimuler une réponse immunitaire humorale, sont couvert dans la portée de la présente invention. 2. Vecteur et Cellule
L'invention a aussi pour objet des vecteurs d'expression et/ou de clonage
(plasmide, cosmide, virus, etc.) comprenant les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides de l'invention. Elle vise également les cellules hôtes comportant ces vecteurs d'expression desquelles le polypeptide de la présente invention peut être récupéré par les moyens connus de l'homme de l'art.
L'invention concerne aussi tout vecteur (de clonage et/ou d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé, transfecté ou infecté par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention. Préférablement, les vecteurs sont des vecteurs d'expression ou de clonage comprenant un polynucleotide de la présente invention. Avantageusement, de tels vecteurs sont sélectionnés dans le groupe constitué par les virus recombinants et les plasmides recombinants possédant une origine de réplication eucaryote. Plus préférablement, les vecteurs sont ceux nommés pRevTRE.G.ERA et pRevTRE.N.ERA (utilisé comme témoin négatif), pRev-G- CVS, pRev-TRE-N-CVS qui ont été déposés à la C.N.C.M. le 30 novembre 2001 sous les numéros d'accession I-2760, 1-2761 , 1-2758 et I-2759 respectivement.
L'invention concerne également des cellules hôtes, préférablement d'origine lymphoblastique, lesquelles contiennent soit un polynucleotide défini par la SEQ ID NO: 1 ou un fragment de celui-ci, et ce, préférablement intégré de façon stable, ou soit un polypeptide ou un vecteur tels que définis précédemment.
Dans le contexte de la présente invention, le terme "vecteur" se réfère à une construction polynucléotidique conçu pour être transfecté dans différents types cellulaires. De ce fait ces vecteurs visent les vecteurs d'expression conçus pour l'expression d'une séquence nucléotidique dans une cellule hôte; les vecteurs de clonage conçus pour l'isolation, propagation et la réplication de nucléotides insérés; les vecteurs viraux conçu pour la production de virus recombinant ou de particule virale (viral-like particle); ou des vecteurs navettes qui comprennent des attributs de plus d'un vecteur. 3. Compositions et utilisation
La présente invention porte également sur l'utilisation de ces polypeptides et des polynucléotides les codant, de ces cellules hôtes et des corps apoptotiques induits selon la présente invention pour la préparation de vaccins ou d'adjuvants de l'immunité.
Par « adjuvant » on entend toute substance ou molécule introduite dans la composition d'un vaccin ou d'une composition immunogène conduisant à une augmentation de la réponse immunitaire. Il est par conséquent entendu que le polypeptide de la présente invention peut servir en tant qu'adjuvant pour ainsi augmenter la réponse immunitaire humorale contre un antigène d'intérêt. Parmi les antigènes contre lesquels on peut vouloir stimuler une réponse immunitaire, on inclut, à titre d'exemple, les antigènes viraux, tumoraux et cellulaires dont la surexpression ou l'altération conduisent à une pathologie (par exemple, une neuropathologie). Il est également clair que d'autres types d'adjuvants bien connus de l'homme de l'art peuvent être ajoutés à la composition vaccinale ou immunogène de la présente invention ci-après décrite.
Ainsi, la présente invention vise des compositions immunogènes ou vaccinales contenant des corps apoptotiques tels que décrits ci-après et qui stimulent une réponse immunitaire humorale et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Préférablement, lesdits corps apoptotiques sont préparés à partir d'une cellule hôte telle que définie précédemment et plus particulièrement par transfection ou micro-injection dudit polypeptide de l'invention dans la cellule hôte.
Dans un mode de réalisation privilégié, la composition immunogène ou vaccinale contient un élément choisi dans le groupe constitué par :
- un polypeptide selon la présente invention ;
- un polynucleotide selon la présente invention ; - un vecteur selon la présente invention ; et
- une cellule hôte selon la présente invention . Ces compositions peuvent être avantageuses pour prévenir ou traiter des encéphalites virales dont la rage, des cancers ou des neuropathologies. Par exemple, on peut envisager une méthode d'induction de l'immunité humorale contre un antigène d'intérêt comprenant une étape comportant l'administration à un être humain ou un animal d'une telle composition immunogène ou vaccinale. Les moyens de préparation et d'administration des compositions de la présente invention ne seront pas décrits davantage parce que déjà connus par l'homme de l'art.
Les exemples suivants permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent servent à illustrer l'étendue d'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être apportées sans échapper à l'esprit ou à la portée de l'invention. Bien que l'on puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
Exemple 1 : Détermination d'une protéine pro-apoptotique du virus rabique
Il a été montré précédemment au laboratoire (46) que l'apoptose rabique dans les cellules Jurkat nécessite que le virus se réplique et que les caspases soient activées. L'entrée en apoptose est concomitante d'une accumulation et d'une répartition particulière des protéines virales dans le cytoplasme. Ceci suggère que l'engorgement du cytoplasme par les antigènes viraux induit l'apoptose. Certaines souches de rage, comme la souche atténuée ERA induisent l'apoptose, ce qui n'est pas le cas de la souche hautement pathogène CVS.
Comme, il a été montré que les cellules Jurkat sont infectées par les deux souches virales, nous avons émis l'hypothèse que l'entrée en apoptose était liée à la nature intrinsèque des protéines virales : celles de ERA induisant l'apoptose contrairement aux protéines de la souche CVS. Dans le but d'identifier et de caractériser les protéines pro-apoptotiques, nous avons mis au point un système d'expression inductible des protéines du virus de la rage sous contrôle de l'opérateur Tet dans des cellules Jurkat. L'objectif du travail consistait à établir un système qui permette d'étudier les bases moléculaires de l'apoptose induite par le virus rabique hors d'un contexte d'infection par un virus complet.
Matériel et Méthodes
1. Virus et cellules
Les souches de laboratoire du virus rabique ERA (vr332) et CVS (vr959) proviennent de l'American Type Cell Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA) et ont été amplifiées sur des cellules BSR (dérivées de fibroblastes de rein de hamster BHK-21). Ces cellules sont cultivées dans du milieu MEM supplémenté par 8% de sérum de veau foetal (SVF), tryptose-phosphate, 2mM de L- Glutamine, 40mg/ml gentamycine. Les cellules d'encapsidation PT67 (Rétro Pack cell line de chez Clontech) sont cultivées sur milieu DMEM supplémenté par 10% de SVF, 4 mM de L-glutamine, 100U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine. Les cellules NIH3T3 sont cultivées dans du milieu DMEM supplémenté par 10% de SVF, 100U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine, 1mM de sodium-pyruvate. Les cellules Jurkat rtTA (47) sont des cellules cultivées en suspension dans du milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de SVF, 2 Mm de L-Glutamine, 100U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine et 2.5 μg/ml de puromycine. Tous ces milieux et solutions proviennent de chez Invitrogen (France).
2. Mécanisme du système d'expression de gènes RevTet-ON
Le plasmide régulateur pRevTet-ON code, sous contrôle du promoteur fort CMV, pour le transactivateur inverse Tétracycline rtTA ( une fusion entre le répresseur Tet inverse et le domaine activateur de VP16) (Figure 1). Ce dernier se fixe sur son élément de réponse TRE présent sur le vecteur d'expression pRevTRE. L'addition de la Doxycycline (1 μg/ml) permet la transcription du gène d'intérêt. Le protocole a été réalisé en suivant les instructions du manuel RevTet (Clontech # K1627-1). Les séquences et cartes des plasmides sont disponibles sur http://www.clontech.com.
3. Clonage des gènes viraux et séquençage
Les techniques de biologie moléculaire utilisées pour les RT-PCR, les clonages et le séquençage sont communément décrites dans le manuel de Perbal (48).
4. Obtention des rétrovirus recombinants à partir des lignées PT67
Les différents vecteurs d'expression pRevTRE contenant les gènes d'intérêt, un gène de sélection à un antibiotique ( HygromycineR ), et Ψ+ (signal nécessaire pour la formation de particules rétrovirales) ou le vecteur régulateur pRevTet-ON ayant le gène de sélection à un antibiotique (Néomycine R ) ont été transfectés dans les lignées cellulaires d'encapsidation PT67 en utilisant le kit GenePorterTM 2 Transfection Reagent (GTS.Ozyme). La lignée cellulaire d'encapsidation apporte les gènes structuraux nécessaires à la formation d'une particule virale : gag (protéines de structure), pol (transcriptase inverse, intégrase) et env ( glycoprotéine d'enveloppe) intégrés dans le génome de la cellule sans aucune autre séquence virale. Les vecteurs rétroviraux peuvent s'intégrer de manière stable ou être transitoirement exprimés. Les virus libérés par ces cellules sont infectieux mais incompétents pour la réplication empêchant ainsi une production virale dans les lignées cellulaires infectées par la suite. Une sélection avec de l'hygromycine (0,4mg/ml) ou du G418 (0,4 mg/ml) permet d'isoler des cellules ayant intégré le génome rétroviral et produisant respectivement les rétrovirus recombinants MomuLV-NCVS, MomuLV-NERA, MomuLV-GERA, MomuLV-GCVS et MomuLV-TetON.
5. Titrage des stocks rétroviraux Afin de vérifier la viabilité des particules rétrovirales recombinantes MomuLV produites par les lignées d'encapsidation PT67, nous avons réalisé un titrage en plaque sur cellules NIH3T3. 1 ml du surnageant de culture est additionné d'1 μl de polybrène stérile (agent cationique facilitant la fusion) à une concentration finale de 4 μg/ml. Des dilutions en séries du virus sont ensuite réalisées (10"1 à 10"6) dans du milieu NIH3T3 + polybrène (4mg/ml). Les cellules cibles NIH3T3 (105 cellules/puits) sont ensuite infectées par les différentes dilutions. 48h après l'infection, les cellules sont soumises à une sélection au G418 (0,8mg/ml) pour pRevTet-ON ou à l'hygromycine (0,4mg/ml) pour pRevTRE, pendant une semaine. Le titre du virus correspond au nombre de colonies présentes à la plus haute dilution multiplié par le facteur de dilution, il s'exprime en UFC/ml (Unités Formant Colonies/ml).
6. Obtention de lignées de cellules Jurkat transgénigues stables Nous avons dans un premier temps infecté les cellules Jurkat avec le recombinant MomuLV-TetON. Deux jours après l'infection, sont sélectionnées avec du G418 (0,8mg/ml) les cellules ayant intégré le transactivateur inverse rtTA. Après un mois de repiquage et amplification sur milieu sélectif, nous avons obtenu une population non clonale de cellules résistantes au G418. Cette lignée Jurkat TetON est en cours de caractérisation. Les cellules Jurkat rtTA possédant le transactivateur inverse sous forme épisomale ont été infectées avec les différents rétrovirus recombinants MomuLV. Une sélection par la puromycine (2,5 μg/ml) et l'hygromycine (0,4mg/ml) a permis d'isoler des lignées stables non clonales possédant à la fois le rtTA sous forme épisomale et ayant intégré le gène d'intérêt.
7. Analyse de la taille et de la granulométrie des cellules par cytométrie de flux Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin ayant atteint une densité de 5 x105 cellules/ml sont séparées en deux lots homogènes dont un seulement est traité avec de la Doxycycline à 1 μg/ml. Les cellules sont récupérées après 18h d' induction, puis centrifugées pendant 5min à 800 rpm (4°C). Les cellules sont resuspendues dans du tampon PBS et du Cell Fix (Becton Dickinson, BD, USA). Les cellules sont ensuite analysées à l'aide du cytofluorimètre FACSCalibur et du logiciel Cell Quest Pro (BD, USA).
8. Marquage au Hoechst 33342 et dénombrement.
Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin traitées de la même façon que précédemment sont incubées 10 min à 37°C avec du Hoechst 33342 (0,5 mg/ml), agent intercalant de l'ADN permettant de visualiser des cellules présentant une fragmentation caractéristique du noyau. Les cellules sont centrifugées, lavées avec du PBS, fixées 30min avec de la paraformaldéhyde 0,4% (PFA). Après un lavage dans du PBS, les cellules sont reprises dans du glycérol tamponné et montées entre lame et lamelle. Les cellules sont observées au microscope inversé à fluorescence et un dénombrement des cellules présentant une fragmentation caractéristique de l'ADN nucléaire à été effectué à l'aide du logiciel Metamorph offlline (Metamorph software imaging System, Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA). Vingt champs ont été comptés au hasard pour chaque condition et la moyenne a été réalisée.
9. Détection de l'expression des protéines par cytométrie de flux.
Ce protocole est décrit dans Thoulouze et al (46). Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin, traitées de la même façon que précédemment, sont centrifugées, lavées avec du tampon PBS, fixées 30 min avec de la paraformaldéhyde 0,4%, et perméabilisées avec 0,1% de saponine (Tampon PB). Les cellules sont resuspendues et incubées 1h à 4°C avec les anticorps monoclonaux spécifiques : mAb 8.2 biotinylé au (1/100) pour G, et un mélange de trois Mab 1/50 fournit par le Dr N. Minamoto, Université de Gifu (Japon) pour les protéines N. Les cellules sont lavées dans du PB puis incubées 30 min avec les composants appropriés : la streptavidine-PE (1/100) pour la détection de l'anticorps biotinylé et pour les protéines N, l'anti souris-biotinylé (1/100). Les cellules sont lavées dans du PB et resuspendues au final dans du tampon de marquage pour fluorescence (SB). Les cellules sont incubées 30 min avec streptavidine-PE (1/100) pour la révélation des protéines N, puis lavées dans du tampon SB. Les cellules sont analysées à l'aide du cytofluorimètre.
10. Marquage des caspases totales et des caspases 1 et 8 Nous avons dans un premier temps, utilisé un inhibiteur des caspases totales, le FITC-VAD-FMK (kit CaspACETM FITC-VAD-FMK in Situ Marker, Promega). Cette molécule est un analogue fluorescent du z-VAD-FMK (N- benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone) où le groupe bloquant N terminal (N-benzyloxycarbonyl = z) a été remplacé par l'isothiocyanate de fluoresceine (FITC) pour créer un marqueur fluorescent. Ce composé contient une séquence en acides aminés reconnue par les protéases à cystéine, il pénètre dans la cellule, et se fixe de façon irréversible aux caspases activées. Ensuite nous avons utilisé le FAM-YVAD-FMK (CaspaTagTM Caspase 1(YVAD) Activity Kit, Intergen), analogue fluorescent du N-benzyloxycarbonyl-Tyr-Val-Ala- Asp- fluoromethylketone : z-YVAD-FMK qui est un inhibiteur spécifique de la caspase 1 , et le FAM-LETD-FMK (CaspaTagTM Caspase 8 (LETD) Activity Kit, Intergen), analogue fluorescent du N-benzyloxycarbonyl-Leu-Glu-Thr-Asp- fluoromethylketone : z-LETD-FMK, qui est un inhibiteur spécifique de la caspase 8. Les cellules Jurkat transgéniques et les cellules témoin ayant atteint une densité de 5x105 cellules/ml sont séparées en deux lots homogènes dont l'un est traité avec de la Doxycycline à 1 mg/ml . Dix-huit heures après l'induction, les cellules sont centrifugées, et incubées 1h à 37°C avec les différents inhibiteurs de caspases. Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec du tampon PBS, puis une fois avec du SB, avant d'être reprises dans du tampon SB et du Cell Fix (BD, USA). Les cellules sont analysées au cytofluorimètre. Résultats
1. Clonage des gènes codant pour les protéines N et G des souches de rage CVS et ERA. Les clones des gènes codant pour les nucléoprotéines et les glycoprotéines des souches ERA et CVS, utilisées dans le travail précédent (46) pour démontrer la nature pro-apoptogène de la souche ERA, n'existaient pas encore au laboratoire. Le travail a donc été de réaliser le clonage moléculaire de ces gènes. Le clonage a été réalisé dans le plasmide pRevTRE qui devait servir à l'établissement du système inductible TetON. L'analyse de la séquence de référence du génome rabique dans la banque de données de l'EMBL (Numéros d'accession M13215, M21634 par Tordo et coll.) indiquait que les sites de restriction BamHI et Hpal n'étaient présents ni dans le gène codant pour la nucléoprotéine, ni dans celui de la glycoprotéine. Ceci nous a permis de réaliser le clonage en utilisant ces deux sites de restrictions de pRevTRE. Des oligonucléotides contenant soit le site BamHI et le codon d'initiation du gène correspondant, soit le site Hpal et le codon stop de ce même gène ont été synthétisés et sont décrits dans le tableau suivant.
Tableau 1 : Oligonucléotides synthétiques pour le clonage
G-BamH1-start (valable ERA CVS) SEQ ID NO:4
5" GGCCGGATCCATGGTTCCTCAGGCTCTC 3'
N-BamH1-start (valable ERA/CVS) SEQ ID NO:5
51 GGCCGGATCCATGGATGCCGACAAGATT 3'
G-Hpa1-CVS-stop SEQ ID NO:6
5' GGCCGTTAACTCACAGTCTGGTCTGACC 3'
G-Hpa1-ERA-stop SEQ ID NO:7
5' GGCCGTTAACTCACAGTCTGGTCTCACC 3'
N-Hpa1-stop (valable ERA/CVS) SEQ ID NO:8
5' GGCCGTTAACTTATGAGTCACTCGAATA 3'
Les ARN intracellulaires totaux ont été isolés 48h après l'infection de cellules BSR avec les deux souches de virus rabique ERA et CVS à une multiplicité d'infection de 3. Des RT-PCR ont été réalisées sur ces extraits après dénaturation des structures secondaires des molécules d'ARN par du méthyle de mercure. Des produits PCR possédant une taille compatible avec l'intégralité de la séquence codante pour les gènes G et N (respectivement 1575nt et 1353nt) ont été obtenus. Ces produits PCR ont été soumis à une double digestion enzymatique BamHI/Hpal. Les produits de digestion ne montraient pas par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8% une modification substantielle de leur taille. Cette observation prouvait donc que le choix des sites de clonage avait été pertinent et que ni les gènes N et G des deux souches ERA et CVS ne possédaient ces sites de restriction. Ces produits PCR ont été introduits dans le vecteur pRevTRE digéré par BamHI/Hpal et dephosphorylé. Après transformation de bactéries compétentes XL1 Gold et sélection par résistance à l'ampicilline, des clones bactériens ont été isolés. La présence de plasmides pRevTRE recombinants a été vérifiée par l'établissement de profils de restriction et le séquençage des extrémités du plasmide de part et d'autre du site de clonage. Deux clones au moins ont été sélectionnés par construction, et la totalité de la séquence de l'insert a été réalisée.
Les séquences de ces gènes ont été comparées entre elles et à la séquence de référence du génome de la souche de virus rabique PV. Les résultats sont présentés dans les Tableaux 2 et 3 . Ceci a permis d'établir que des séquences correspondant aux gènes N et G des souches ERA et CVS avaient bien été clonées. Un clone représentatif de chaque gène a été utilisé dans la suite de ce travail, ils sont dénommés pRevTRE.N.ERA, pRevTRE.G.ERA, pRevTRE.N.CVS et pRevTRE.G.CVS. De l'analyse des comparaisons de séquences des protéines N et G de ERA et CVS, on peut conclure que les protéines N et les glycoprotéines divergent légèrement entre elles par 5 et 6 acides aminés respectivement. Comparée à PV, séquence de référence, on constate que la souche ERA serait la plus " éloignée " (9 acides aminés différents pour N et 18 pour G entre ces deux souches) par rapport à CVS ( 4 acides aminés différents pour N et 16 pour G).
Tableau 2 : Comparaison de séquences des protéines N ERA et CVS entre elles et avec la souches de référence PV.
Figure imgf000025_0001
Tableau 3 : Comparaison de séquences des glycoprotéines ERA et CVS entre elles et avec la souches de référence PV.
Figure imgf000025_0002
2. Isolement de lignées productrices de particules rétrovirales recombinantes.
Comme les cellules Jurkat sont difficilement transfectables par les méthodes classiques (électroporation, transfection), nous avons choisi de faire pénétrer les transgènes en utilisant la capacité d'infection de particules rétrovirales recombinantes du virus MomuLV. Nous disposions de la lignée PT67 qui contient les gènes structuraux gag, pol et env du MomuLV. Le vecteur pRevTRE possédant les séquences de régulation 3'LTR/5'LTR ainsi que le signal d'encapsidation +, la transfection du plasmide pRevTRE recombinant dans ces cellules aboutit à la production de particules rétrovirales possédant un transgène dans leur génome. Nous avons réalisé la transfection des cellules PT67 avec les plasmides pRevTRE.N.ERA, pRevTRE.G.ERA, pRevTRE.N.CVS et pRevTRE.G.CVS. Nous avons aussi inclus une série de transfections avec le plasmide pRevTet-ON qui possède comme transgène le transactivateur tétracycline rtTA sous contrôle du promoteur CMV. La première série de plasmides possède le gène codant pour la résistance à l'hygromycine et le plasmide pRevTet-ON possède celui codant pour la résistance au G418. Deux jours après la transfection, un milieu sélectif contenant soit de l'hygromycine (0,4mg/ml), soit du G418 (0,8mg/ml) est ajouté au milieu de culture. Au bout de 4 à 7 jours, les cellules qui n'ont pas intégré le génome rétroviral défectif meurent et se décollent . Au contraire, celles qui ont subi cette intégration et qui expriment les gènes de résistances aux drogues restent adhérentes et génèrent des amas de cellules. Après trois phases d'amplification et repiquage sur une période d'environ 3 semaines, nous disposions de lignées non clonales résistantes soit à l'hygromycine soit au G418 pour tous les plasmides originellement transfectés. La capacité de ces cellules à produire du virus dans le surnageant de culture a été contrôle en réalisant un titrage sur des cellules NIH3T3. Les résultats de ces titrages sont présentés dans le tableau 4. Tableau 4 : Titrage des rétrovirus recombinants MomuLV produits dans le surnageant de culture par les lignées d'encapsidation sur cellules NIH3T3.
Figure imgf000027_0001
1 ml de chaque stock de virus est additionné de polybrène stérile à une concentration finale de 4ug/ml. Des dilutions en séries sont réalisées (10"1 à 10"6) et chaque dilution est déposée dans un puits contenant 105 cellules NIH3T3. 48 h après l'infection, les cellules sont soumises à une sélection par hygromycine (0.4mg/ml) ou au G418(0,8mg/ml). Le titre du virus correspond au nombre de colonies présentes à la plus haute dilution multiplié par le facteur de dilution.
Pour toutes les lignées isolées, une production virale a été obtenue avec succès. Ceci atteste donc de la viabilité biologique de nos constructions et de leur capacité à générer des particules rétrovirales MomuLV recombinantes fonctionnelles. Il faut noter cependant que les titres viraux restent faibles (de l'ordre de 102 UFC) ce qui est significativement plus faible que les titres de 105
UFC qui sont décrits dans la littérature. Le fait que nous ayons isolé des lignées d'encapsidation non clonales, qui sont constituées d'un mélange hétérogène de cellules fortement productrices et de cellules plus faiblement productrices de virions, pourrait expliquer ce résultat. Les titres viraux représenteraient donc un titre moyen. Cette hypothèse a été vérifiée pour au moins une lignée puisque en sous clonant les cellules nous avons été capable d'isoler des sous clones produisant des virus avec un plus haut titre . 3. Obtention de lignées de cellules Jurkat transgéniques
Notre but était de pouvoir isoler des lignées transgéniques de cellules Jurkat possédant à la fois le transactivateur inverse tétracycline rtTA et les transgènes N et G des souches ERA ou CVS. Les cellules Jurkat sont des cellules de la lignée lymphoblastoide humaine qui poussent en suspension avec un temps de doublement d'environ 24h. Ces cellules sont sensibles aux faibles densités cellulaires et aux médiateurs cytotoxiques ou cytolytiques. Dans un premier temps, nous avons infecté des cellules Jurkat avec le MomuLV-TetON (multiplicité d'infection de 1) dans le but d'intégrer le rtTA. Deux jours après l'infection, ces cellules ont été transférées dans un milieu sélectif contenant du G418 (0,8mg/ml). Après 7 jours de culture dans ces conditions, des cellules vivantes dont la croissance est ralentie par la présence de cellules mortes apparaissent. Après un mois de repiquage et amplification en milieu sélectif (deux passages par semaine), et tentative d'éliminer les cellules mortes par centrifugation à basse vitesse (800rpm/mn, pendant 10 min), nous avons obtenu une population non-clonale de cellules résistantes au G418. Cette lignée Jurkat TetON est en cours de caractérisation.
Dans le but de pouvoir tester plus rapidement le phénotype de nos transgènes viraux, nous avons décidé d'utiliser aussi une lignée Jurkat rtTA déjà existante ou le rtTA est présent sous forme épisomale. Dans ces cellules, le rtTA est maintenu par une sélection à la puromycine. Cette lignée nous a été gracieusement fournie par le Dr John Hiscott (47) par l'intermédiaire du Pr Alain Israël (IP, Paris). Ces cellules ont été infectées par les rétrovirus recombinants MomuLV-N.CVS, MomuLV-N.ERA, MomuLV-G-ERA ou MomuLV-G.CVS. Deux jours après l'infection, ces cellules ont été mises en culture dans un milieu sélectif contenant 0,4mg/ml d'hygromycine. Une procédure identique à celle effectuée pour les cellules Jurkat TetON a été ensuite appliquée. Au bout de 1 ,5 mois nous disposions de lignées stables non-clonales résistantes à la fois à la puromycine et à l'hygromycine qui possédaient les transgènes viraux intégrés. Ces lignées ont été nommées JrtTA-N.CVS, JrtTA-N.ERA, JrtTA-G.ERA, JrtTA- G.CVS. 4. Caractérisation des lignées de cellules Jurkat transgéniques
Les lignées de cellules Jurkat transgéniques ont été caractérisées pour leur capacité à induire l'expression des protéines virales N et G des souches ERA et CVS après traitement avec de la Doxycycline (Dox). En effet, la Dox possède, par rapport à la tétracycline, une affinité 100 fois supérieure pour le transactivateur inverse rtTA. De ce fait, elle induit une plus grande activation de la protéine rtTA et donc une induction plus forte du gène à exprimer.
Les lignées transgéniques, présentent un taux de doublement de 24h qui est similaire à la lignée cellulaire témoin JrtTA qui ne possède que le rtTA. Comme les cellules parentales, ces lignées sont sensibles aux faibles concentrations cellulaires et aux facteurs cytolytiques. Les cellules JrtTA-N.CVS, JrtTA-N.ERA, JrtTA-G.ERA, JrtTA-G.CVS ainsi que les cellules témoin JrtTA ont été mises en culture. Lorsqu'elles ont atteint une densité de 5x105 cellules/ml, ces cultures ont été individuellement séparées en deux lots homogènes dont l'un uniquement a été traité avec de la Dox à 1 μg/ml. Après une induction de 18h, on observe que les cellules mises en présence de Dox ont un léger retard de croissance par rapport aux cellules non traitées et présentent un taux de cellules mortes légèrement supérieur (10-15%) ce qui traduit une certaine toxicité du traitement à la doxycycline. Les cellules ont été centrifugées, fixées à la paraformaldéhyde et enfin perméabilisées avec 0,1% de saponine pour vérifier l'expression des protéines par immunochimie. Un marquage à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques des antigènes viraux N et G intracellulaires et membranaires (dans le cas de la glycoprotéine) a été effectué. L'analyse a été faite ensuite par cytométrie de flux. Les résultats sont présentés dans la Fig 3.
Dans le cas des cellules témoin JrTA, l'analyse du marquage ne montre aucune différence en absence ou en présence de Dox ce qui atteste de la spécificité des réactions. Au contraire, pour les lignées Jurkat transgéniques on observe un décalage du pic de fluorescence ce qui correspond à une augmentation du nombre de cellules marquées par les anticorps en présence de Dox. Nous constatons que 46% de cellules Jurkat expriment la protéine N-CVS, et 64% expriment la protéine N-ERA. Pour les protéines G, le taux d'expression est de 40% pour G-ERA et de 25% pour G-CVS. Ces résultats indiquent que les quatre protéines sont bien exprimées de façon inductible dans notre système mais que les taux d'expression sont variables (de 25 à 64 %). Ceci pourrait résulter de deux situations : 1) efficacité variable des sites d'intégration
Le système consiste en une intégration du gène d'intérêt dans le génome de la cellule Jurkat. Cette intégration qui se fait au hasard peut localiser le transgène dans une région transcriptionnellement active ou pas. Dans certains cas, le transgène peut être difficilement accessible, et le rtTA peut se fixer plus ou moins bien sur sa cible TRE. Les lignées transgéniques étant pour l'instant non clonales, il est donc très vraisemblable que les produits d'intégration soient localisés à des loci différents.
2) réactivité variable des anticorps Nous pourrions aussi expliquer cette expression faible par le fait que les anticorps utilisés reconnaissent plus ou moins bien les protéines synthétisées. En effet, ces protéines virales sont exprimées en l'absence de leurs autres partenaires protéiques viraux et, pour l'instant, nous ne savons pas si toutes les molécules exprimées sont correctement structurées ou non. Dans le cas contraire, une partie plus ou moins importante de la protéine synthétisée pourrait ne pas présenter l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal.
Malgré les légères variations, nos résultats démontrent que les lignées de cellules Jurkat transgéniques produisent de façon inductible les quatre protéines que nous avons décidé d'étudier. Nous avons donc en main un système qui nous permet d'étudier les bases moléculaires de l'apoptose .
5. Mise en évidence d'un phénotype pro-apoptogène Nous venons de montrer que nous disposions d'un système de cellules
Jurkat où l'expression des protéines N et G des souches ERA et CVS était inductible. Nous nous sommes donc attardés à démontrer que cette expression pouvait avoir une implication sur la physiologie cellulaire et plus particulièrement sur la mort cellulaire programmée. Les lignées Jurkat transgéniques ainsi que la lignée JrtTA témoin ont été mises en culture. Lorsque les cultures cellulaires ont atteint une densité de 5x105 cellules/ml, elles ont été séparées en deux lots homogènes dont l'un a été traité avec de la Dox à 1 μg/ml. Le phénotype cellulaire d'induction d'apoptose a été analysé 18h après l'induction soit en mesurant la taille et la granulométrie des cellules en cytométrie de flux, soit en dénombrant les cellules présentant une fragmentation de leurs noyaux (technique de coloration Hoechst). Lors de l'apoptose, les cellules subissent des changements morphologiques caractéristiques dont certains peuvent être mesurés par cytométrie de flux. Les cellules mortes, formant la population R2, sont caractérisées par une forte granulosité (SSC : Side Light Scatter) et par une réduction de leur taille (FSC : For ard Light Scatter). En revanche, les cellules vivantes, formant la population R1, présentent une granulosité moindre et une plus grande taille. Les résultats sont présentés dans la Fig 4. Dans toutes les cultures nous observons la présence d'une population R2. Après traitement par la Dox, les cellules Jurkat rtTA présentent un niveau de base de 10% de cellules mortes qui pourraient correspondre à des cellules en apoptose. Ce résultat montre que la présence du transactivateur inverse au sein des cellules et l'induction par la Dox n'est pas neutre pour la viabilité de la population de cellule. Par contre, on observe dans les lignées Jurkat transgéniques une variation de cette population R2 qui est dépendante du transgène exprimé. De fait, on note le gradient du nombre de cellules mortes suivant :
G-ERA >G-CVS >N-CVS >N-ERA >JrtTA 35% 20% 15% 11% 10%
Il est donc intéressant de noter que les glycoprotéines virales exprimées provoquent une mort cellulaire plus importante que les nucléoproteines quelque soit leur origine. Cependant, ce sont indéniablement les cellules exprimant la glycoprotéine de la souche ERA qui possèdent le phénotype le plus marqué. La condensation de la chromatine et la fragmentation de l'ADN nucléaire qui conduisent à une modification morphologique des noyaux cellulaires, sont un des phénotypes caractéristiques de l'apoptose. Nous avons étudié ces phénomènes en effectuant un marquage des noyaux avec du Hoechst 33342 (0,5mg/ml). Les résultats obtenus sont représentés sur la Fig 5. Par rapport à une culture cellulaire qui ne présente pas de cellules mourant d'apoptose, les cultures cellulaires apoptotiques présentent de nombreuses cellules où le noyau cellulaire est entièrement déstructuré et même fragmenté en plusieurs composants globulaires. Les cellules ont été observées au microscope à fluorescence inversé puis nous avons réalisé une analyse d'image à l'aide du logiciel Metamorph offline pour dénombrer les cellules en apoptose terminale, c'est-à-dire présentant un noyau fragmenté. Les données de la figure 5 montrent bien que c'est la lignée JrtTA-G.ERA qui présente le plus de cellules en apoptose (28.2%). Ces résultats confirment les résultats obtenus par l'analyse de la taille et de la granulométrie des cellules, la protéine G-ERA est la protéine pro-apoptogène principale.
Nous avons de plus vérifier que le fait de mettre en présence le surnageant de culture de cellules JrtTA-G.ERA induites par la Dox sur des cellules Jurkat naïves n'entraînait pas l'apoptose de ces cellules. Ce résultat indique que l'apoptose mise en évidence dans les études précédentes est bien consécutive à l'expression de la protéine et n'est pas due à une action à distance par libération de médiateurs solubles.
6. Caractérisation moléculaire de l'apoptose viro-induite
Nous avons établi que parmi les quatres protéines virales exprimées, la glycoprotéine de la souche ERA était la protéine la plus pro-apoptogène. Nous avons donc décidé de commencer à étudier quels pouvaient être les mécanismes qui permettent de déclencher le processus apoptotique. Il avait été précédemment montré dans le laboratoire que l'apoptose viro-induite par le virus rabique était dépendante de la voie des caspases (caspases 8 et 3). Nous nous sommes donc attardés à étudier ce qu'il en était pour la protéine G-ERA exprimée. La mesure de l'activation des caspases a été réalisée 18h post-induction en cytométrie de flux dans les cultures de cellules JrtTA-N.CVS, JrtTA-N.ERA, JrtTA-G.ERA, JrtTA-G.CVS ainsi que les cellules témoin JrtTA. Ceci a été effectué en utilisant l'inhibiteur de caspases marqué avec un fluorochrome FITC- VAD-FMK (Promega, France) directement sur les cellules non fixées et dans leur milieu de culture. Cette molécule, qui permet la détection de la totalité des caspases activées, pénètre dans la cellule et se fixe de façon irréversible à celles-ci réalisant ainsi un marquage " in situ " de ces protéases. Après lavages des cellules et fixation, le marquage peut être détecté au cytomètre en flux. Nous avons pu constater que cette méthodologie permettait bien la détection des caspases activées par cytométrie de flux. Cependant, nous avons aussi observé que la quantification de l'activation spécifique était difficile du fait de la présence d'un bruit de fond important. Dans cette expérience, il n'a pas été possible de conclure pour les lignées Jurkat transgéniques exprimant les nucléoproteines. Néanmoins, cette analyse a permis de montrer que la G-ERA induisait une nette activation des caspases alors que celle-ci est plus faible pour G-CVS.
Dans le but de caractériser plus avant les caspases impliquées, nous avons analysé l'état d'activation de deux d'entre elles : la caspase 1 (activatrice des cytokines et pro-inflammatoire) et la caspase 8 (caspase initiatrice). Ces expériences ont été réalisées en suivant la même procédure expérimentale que ci-dessus mais en utilisant cette fois-ci des substrats à haute activité spécifique que sont FAM-YVAD-FMK pour la caspase 1 , ou FAM-LETD-FMK pour la caspase 8 (Intergen, France). Les résultats sont présentés Figures 6 et 7.
L'analyse au cytofluorimètre fait apparaître des différences nettes entre ERA et CVS, nous constatons que l'expression de la protéine G-ERA dans les cellules Jurkat provoque l'activation de la caspase 8 de façon importante. Ainsi nous observons 19% d'activation alors que l'expression de la protéine G-CVS conduit seulement à une activation de 5% et celle de N-CVS à 3%. Nous observons un autre profil concernant la caspase 1 pro-inflammatoire. L'expression de la protéine G-ERA conduit seulement à une activation de 7% alors que la protéine G-CVS induit une forte activation (23%) ; l'expression de la protéine N-CVS quant à elle, donne une activation de 12%. La protéine N-ERA n'active ni la caspase 1 ni la caspase 8. En suivant cette méthodologie, il s'est avéré assez difficile de quantifier avec précision en double marquage les cellules qui étaient positives à la fois pour la détection de la protéine virale et pour l'activation des caspases1/8. En effet comme nous l'avions dit précédemment, la mesure de l'expression se fait plutôt sur les cellules de faible granulométrie et de grande taille. Alors que les caspases activées sont principalement détectées sur les cellules de plus grande granulométrie et de taille plus faible.
Il est cependant clair à la vue de ces résultats que l'expression de la protéine G-ERA est un facteur principal de déclenchement de l'apoptose dans les cellules Jurkat. Ce processus implique la voie des caspases et plus précisément la caspase 8 initiatrice. Contrairement à la souche CVS, la glycoprotéine de souche ERA ne semble pas activer la caspase 1.
Discussion et Perspectives Ce travail a permis de mettre en place un système d'expression inductible des protéines du virus de la rage dans un modèle cellulaire de lymphocytes humains (cellules Jurkat). À l'aide de ce modèle, nous avons établi que 1) l'expression de la protéine G-ERA dans les lymphocytes cibles Jurkat rtTA induit l'apoptose, 2) au cours de cette apoptose, la voie des caspases est activée, 3) la protéine G-ERA induit l'activation de la caspase 8 initiatrice, 4) la protéine G-ERA a finalement perdu la capacité d'activer la caspase 1 pro-inflammatoire qui reste la caractéristique des protéines de la souche non apoptotique CVS.
Ces résultats confirment les résultats précédemment établis au laboratoire selon lesquels, l'apoptose viro-induite par le virus rabique se caractérise principalement par une activation de la voie des caspases (8 et 3) et que la caspase 1 est plutôt activée par la souche CVS. La souche CVS étant non apoptotique, ces résultats suggèrent que la caspase 1 n'est certainement pas impliquée dans le phénomène d'apoptose. Il se pourrait, au contraire, qu'elle participe à l'inflammation. Le fait que la protéine N-ERA ne soit pas activatrice de caspases apoptotiques démontre ce qui avait été suggéré sur la base de l'analyse des cinétiques (46) c'est-à-dire que la protéine G et non la N induit l'apoptose. Les séquences primaires des glycoprotéines des souches CVS et ERA montrent que ces deux protéines divergent entre elles par seulement 6 acides aminés. Pourtant ces 6 différences se traduisent par un phénotype très tranché vis-à-vis de l'apoptose. On peut se demander pourquoi et comment cette glycoprotéine peut accomplir cette tâche. Nous pourrions pour expliquer le fonctionnement différent des deux protéines, formuler deux hypothèses :
1) G-ERA contrairement à G-CVS serait clivée par la caspase 8 initiatrice au niveau d'un site potentiel non consensuel de clivage. 2) G-ERA interagirait avec la pro-caspase 8 et provoquerait son activation, alors que la G-CVS serait dépourvue de cette propriété.
- Hypothèse 1 : G-ERA, contrairement à G-CVS, serait clivée par la caspase 8. II a été établi dans deux maladies humaines, maladie de Huntington et mucoviscidose, que le dysfonctionnement cellulaire est directement lié à l'agrégation de protéines dans la cellule. Il semblerait, en effet, que la forme mutante de l'huntingtine (maladie de Huntington) ou de la CFTR ( cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) entraine la perte de fonctionnalité de la structure qui dégrade les protéines anormales, le proteasome (49). Il semble donc que l'accumulation toxique de certaines protéines puisse induire la perte de l'intégralité cellulaire et provoquer la mort de la cellule. Un mauvais fonctionnement du proteasome pourrait être à l'origine d'autres maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et l'ataxie Spinocérébrale (50-53). La maladie de Huntington se caractérise par la génération de fragments protéolytiques N-terminaux de l'huntingtine, contenant des répétitions de plusieurs glutamines, qui s'agrègent dans le noyau et le cytoplasme des neurones. L'accumulation de la forme pathologique de l'huntingtine résulterait d'un clivage anormal par les caspases (54). L'huntingtine serait clivée par la caspase 6 au niveau de la séquence IVLD qui est un site potentiel non consensuel de clivage des caspases du groupe III (55, 56). Nous pourrions faire l'hypothèse que d'une façon similaire à ce qui est observé avec l'huntingtine, la G-ERA serait clivée par les caspases ce qui induirait une agrégation anormale de la protéine entraînant une altération de la fonction du proteasome et la mort de la cellule. Au contraire, la G-CVS ne serait pas clivée par les caspases, ne s'accumulerait pas de façon anormale et n'induirait donc pas l'apoptose. Cette hypothèse peut être avancée puisque l'analyse des séquences protéiques des glyprotéines des souches CVS et ERA met en évidence l'existence d'un site potentiel non consensuel de clivage par les caspases du groupe III. L'analyse précise montre que pour ERA, le site IVLD est en fait muté en 48IVED51 , alors que pour CVS il est muté en 48WED51. Il conviendrait donc maintenant d'établir que le site IVED est fonctionnel alors que le site WED ne l'est pas, en étudiant si ces glycoprotéines sont clivées par des caspases du groupe III (les caspases iniatrices). Par la suite , il serait intéressant d'identifier 2) la nature de la caspase qui serait responsable du clivage, 3) si les produits de clivage s'accumulent dans le cytoplasme (et éventuellement dans le noyau), et 4) si dans ce cas la fonctionnalité du proteasome est altérée.
Cette hypothèse, si elle se vérifiait, expliquerait pourquoi l'on observe un engorgement du cytoplasme par les antigènes viraux dans le cas de l'infection des cellules Jurkat par la souche ERA et pas dans le cas de CVS.
- Hypothèse 2 : G-ERA, interagirait avec la pro-caspase 8 et provoguerait son activation.
Nos expériences ont montré que les cellules qui expriment la protéine G de la souche ERA activent la caspase 8. Lors de la voie d'activation de la caspase 8 initiatrice par transduction du signal via l'interaction Fas-L/Fas, il y a recrutement du zymogène (pro-caspase8) au niveau du DISC par l'interaction du domaine effecteur de mort DED de FADD avec les DED de la pro-caspase 8. Ceci conduit à l'activation protéolytique de la pro-caspase 8 et au relarguage de la caspase 8 activée dans le cytoplasme (57). L'apoptose rabique ne peut pas être induite par la seule incubation des cellules avec du virus non replicatif. Ce qui permet d'exclure que le virus de la rage induise l'apoptose par interaction avec des récepteurs membranaires comme Fas. Il est vraisemblable que Fas ne soit pas impliqué dans l'apoptose rabique puisque l'addition d'anticorps anti-Fas n'augmente pas l'apoptose (58). Il faut donc penser que c'est la synthèse intracellulaire de la protéine G de la souche ERA qui provoque directement ou indirectement cette activation de la caspase 8. Il est intéressant de noter qu'entre les acides aminés 254 et 417 de la protéine G, on trouve une séquence qui présente une homologie avec les deux DED (A et B) de la procaspase 8. Néanmoins, cette séquence est conservée entre les souches CVS et ERA, il est donc vraisemblable que s'il y a une différence fonctionnelle, entre les glycoprotéines ERA et CVS, cela ne se passe pas au niveau des séquences primaires. Les prédictions des structures secondaires de ces 2 protéines effectuées avec le logiciel peptidestructure de GCG ( Genetic Computer Group, Université du Wisconsin, USA ) montrent que les mutations présentes de part et d'autre de cette séquence provoquent des repliements différents de la protéine G. On peut donc émettre l'hypothèse que ceci pourrait éventuellement conduire à une exposition de cette séquence d'homologie avec les DED pour la souche ERA à la surface des trimères de G et au contraire à son masquage pour CVS. Il a été démontré qu'en l'absence de Fas-L/Fas et FADD, la pro-caspase 8 pouvait être activée par une activité autoprotéolytique médiée par l'interaction de molécules de pro-caspase 8 entre elles suite à l'interaction de leurs DED (59, 60). Il pourrait être envisagé que lors de sa synthèse et de sa maturation post-traductionnelle, la glycoprotéine de la souche ERA puisse jouer un rôle de catalyseur dans l'oligomérisation des molécules de pro-caspase 8. La mise en évidence d'une interaction entre la protéine G-ERA et la pro-caspase 8 au niveau de leur DED pourrait être envisagée en 1) réalisant des expériences de co- immunoprécipitation, en utilisant un anticorps anti-caspase 8, par exemple, l'anticorps monoclonal Ab-3 (Oncogene) réagissant avec la pro-caspase 8. On s'attendrait dans le cas, où notre hypothèse est vérifiée, à co-immunoprécipiter la protéine G-ERA et pas la protéine G-CVS. Ce résultat serait vérifié en réalisant l'immunoprécipitation réciproque en utilisant un anticorps anti-G pour voir s'il y a co-immunoprécipitation de la pro-caspase 8 avec la protéine G-ERA et pas avec G-CVS. Cette hypothèse fournirait une explication sur le phénomène d'activation d'une des caspases initiatrices majeures : la caspase 8 qui pourrait activer en cascade les autres caspases.
La deuxième hypothèse n'est pas antinomique de la première puisqu'elle expliquerait comment les premières molécules de glycoprotéines peuvent être clivées par des caspases. En effet, la glycoprotéine G-ERA pouvant être responsable de l'oligomérisation de la pro-caspase 8 qui par action autoprotéolytique devient active, pourrait être ensuite éventuellement clivée par la caspase 8 au niveau du site potentiel non consensuel de clivage.
Exemple 2 : Mise en évidence de la supériorité de la présentation d'antigènes sous formes de corps apoptotiques par rapport à celle de cellules infectées intactes en terme de réponse en anticorps
Lors de l'infection d'une cellule par un virus, la physiologie cellulaire est perturbée et ces modifications peuvent conduire à l'apoptose. La désagrégation de l'intégrité de la cellule infectée conduit à la génération de corps apoptotiques qui contiennent, en plus de morceaux de noyaux et de cytoplasme, des antigènes viraux. De nombreuses évidences expérimentales attestent maintenant que ces structures sont des immunopotentiateurs extrêmement efficaces lorsqu'ils sont pris en charge par certaines cellules présentatrices d'antigènes CPA (cellules dendritiques) et qu'il y a présentation des antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I . Aussi, est-il pertinent d'envisager que la possibilité d'induire de façon spécifique et contrôlée l'apoptose puisse être utilisée pour augmenter le pouvoir immunostimulateur de vaccins générés par génie génétique. Il serait donc intéressant et innovateur de caractériser une protéine virale pro-apoptotique qui stimulerait la réponse des cellules B du système immunitaire. Ceci serait particulièrement important pour les vaccins dérivés de vecteurs recombinants ou de molécules d'acide nucléique.
La Demanderesse montre que les corps apoptotiques, générés lors de l'apoptose de cellules lymphoblastoides infectées par le virus rabique, contiennent au moins deux des protéines virales : la glycoprotéine G et la nucléoprotéine N. Expérimentalement, la Demanderesse a établi dans un modèle murin que les animaux vaccinés avec des corps apoptotiques produisent beaucoup plus d'anticorps que les animaux injectés avec des cellules infectées entières. La Demanderesse démontre donc un avantage innovateur de la stimulation des cellules B. Ces résultats suggèrent que les corps apoptiques pris en charge par les CPA peuvent être une source importante d'antigènes efficacement présentée au système immunitaire. Ils suggèrent aussi que l'inclusion d'une protéine pro-apoptotique dans un vaccin généré par génie génétique pourrait être un facteur déterminant d'amélioration de ce vaccin. L'adjonction de la protéine G-ERA qui est dérivée d'une souche vaccinale communément utilisée en médecine vétérinaire est une garantie de satisfaction aux contraintes de biosécurité.
Résultats
Pouvoir immunogène des corps apoptotiques
Des cellules Wehi ont été infectées par la souche ERA du virus de la rage à une multiplicité d'infection de trois ce qui permet d'obtenir 80% de cellules infectées après 48h de culture. Deux jours après infection, l'apoptose viro induite de ces cellules reste minoritaire bien que les antigènes viraux soient déjà en cours de synthèse. Quarante-huit heures après infection, l'apoptose est alors induite par un traitement à la céramide qui génère la formation de corps apoptotiques. En parallèle, des cellules non infectées sont traitées de la même manière. Les contrôles de l'effet potentiateur des corps apoptotiques consistent en des cellules infectées et non infectées non traitées à la céramide. Pour annuler l'effet vaccinant du virus vivant, les préparations sont inactivées aux UV (inactivation de100% du pouvoir infectieux du virus). La présence des corps apoptotiques a été vérifiée par immunohistochimie et mesurée par ELISA (Cell death détection Elisa kit) qui détecte les nucléosomes. La quantité d'antigènes viraux injectés a été mesurée par quantification ELISA de la protéine N (Montano-Hirose et al., 1995, Res. Virol., 146, 217-224). La dose efficace par injection intrapéritonéale est de 200 à 400 ng par souris. Quatre groupes de 8 souris BALB/c syngéniques des cellules Wehi ont été injectées avec un même volume des quatre préparations suivantes :
• Wehi infectées intactes
• Wehi non infectées intactes • Wehi infectées fragmentées en corps apoptotiques
• Wehi non infectées fragmentées en corps apoptotiques
L'effet rappel a été mesuré après injection au jour 21 de vaccin entier antirabique (souche PM, production sur cellule VERO). Les titres en anticorps spécifiques du virus de la rage présents dans les sera sont mesurés par test immuno-enzymatique. Les résultats sont exprimés de la façon suivante : 1) Titre pour les cellules={Titre obtenu pour les cellules infectées intactes - Titre obtenu pour les cellules non infectées intactes}, 2) Titre pour les corps apoptotiques={Titre obtenu pour les cellules infectées fragmentées en corps apoptotiques - Titre obtenu pour les cellules non infectées fragmentées en corps apoptotiques}.
Les résultats de ces expériences sont représentés sur les Figures 8 et 9. Comme on le voit, l'injection de corps apoptotiques conduit à une immunostimulation de la réponse B. De plus l'effet de la vaccination de rappel (hétérologue pour les cellules ou les corps apoptotiques) indique une très forte immunopotentiation chez les souris ayant reçu une injection primaire de corps apoptotiques.
Conclusion
Nous avions montré que les corps apoptotiques, générés lors de l'apoptose des cellules lymphoblastoides infectées par le virus rabique (souche ERA), contiennent au moins deux des protéines virales : la glycoprotéine G et la nucléoprotéine N. Expérimentalement nous avons établi ici, dans un modèle murin, que les animaux vaccinés avec des corps apoptotiques produisent plus d'anticorps que les animaux injectés avec des cellules infectées entières. Nous apportons aussi une évidence innovatrice de la stimulation des cellules B par les corps apoptotiques.
Ces résultats suggèrent que les corps apoptotiques pris en charge par les CPA peuvent être une source importante d'antigènes efficacement présentés au système immunitaire. Ils suggèrent aussi que l'inclusion d'une protéine pro- apoptotique dans un vaccin généré par génie génétique pourrait être un facteur déterminant d'amélioration de ces vaccins qui sont le plus souvent de faibles immunogènes (vecteurs recombinants, ADN/ARN vaccin).
Exemple 3 : Induction de l'apoptose des cellules NT2-N par la souche
ERA.
Les cellules de carcinome embryonnaire (CE) sont les « cellules souches » (CS) qui existent dans certaines tumeurs de la lignée germinale, les tératocarcinomes. Comme les cellules CS, les cellules CE humaines prolifèrent extensivement in vitro et dans les tératomes formés in vivo après injection chez des animaux immunocompromis. Cependant, contrairement aux cellules CS, les cellules CE humaines sont aneuploïdes et ne se différencient qu'en certains types cellulaires bien précis (Stem Cells : Scientific progress and future research directions, June 2001, NIH report, http://www.nih.gov/news/stemceII/scireport.htm). Ainsi les cellules N Tera 2D1 peuvent se différencier en cultures pures de neurones humains post- mitotiques (les NT2-N) après induction de la différenciation des N Tera 2D1 par l'acide rétinoique all-trans, puis traitement par des inhibiteurs de mitose et purification par trypsination ménagée (Andrews, P.W., 1998, APMIS, 106, 158- 167). Les cellules NT2-N possèdent tous les marqueurs spécifiques de neurones humains différenciés (Guillemain, I., The Journal Of Comparative Neurology, 2000, 422, 380-395). Elles peuvent établir in vitro des contacts synaptiques entre elles et des contacts fonctionnels avec des astrocytes en co-culture. Ces cellules sont à l'heure actuelle le meilleur des modèles car elles offrent la possibilité de cultiver en grande quantité des neurones humains post-mitotiques présentant un état physiologique homogène. Ces cellules ont été utilisées pour des essais thérapeutiques cliniques de phase II de reconstitution de cellules nerveuses (Thompson, T.P., Neurosurgery, 1999, 45, 4, 741-752). La culture et l'obtention de NT2-N sont couramment maîtrisées dans l'UP de Neuroimmunologie virale.
Des cultures de NT2-N ont été mises en culture sur des chambres individuelles de type labteck traitées par de la polylysine et de la laminine, traitement qui permet leur adhésion. Après 48 h de culture, les corps cellulaires expriment et l'antigène Neurofilament 200 (Nf) des axones. Sur les cellules non infectées, la présence de protéines de neurofilaments a été détectée par un anticorps spécifique anti-Nf (Anti Neurofilament 200, sigma, USA, no. N4142). Ces cellules ont été soit infectées par le virus rabique souche ERA (pro- apoptotique) à une multiplicité d'infection de 5, soit non infectées. 24 h postinfection les cellules ont été fixées par de l'acétone 80% (30 mn à 4 °C) suivi d'une incubation de 20 mn dans de l'éthanol pur.
L'intégrité du noyau cellulaire ou sa fragmentation pris comme marqueur d'apoptose a été mise en évidence par une coloration au Hoechst 33342 à 1 μg/μl.
La présence des antigènes viraux dans les cellules infectées a été vérifiée grâce à un anticorps anti-nucléocapside rabique (Anti Nucléocapside rabique, Sanofi Diagnostic Pasteur, no. 72114).
Les résultats présentés dans la figure 13 montrent que les cellules NT2-N sont marquées spécifiquement par l'anticorps anti-Nf attestant ainsi leur caractère de neurones. Les cellules infectées par le virus ERA présentent une fluorescence ponctiforme caractéristique de la nucléocapside rabique. Les cellules infectées présentent une désagrégation de la structure nucléaire, visualisée par la coloration au Hoechst 33342, qui est caractéristique du processus apoptotique.
Dans un deuxième temps, les cellules NT2-N ont été infectées soit avec la souche ERA, soit avec la souche CVS (non apoptogène en cellules Jurkat), ou bien non infectées et 24 h post infection la quantité de neurones en apoptose a été évaluée après coloration au Hoechst. Les résultats sont représentés sur la figure 16. On voit que la souche ERA génère une apoptose neuronale (18,55%) qui est significativement plus importante que le témoin de cellules non infectées (2,8%>) ou les cellules infectées par CVS (4%). La souche ERA (non pathogène) du virus rabique, à la différence de la souche CVS (pathogène), est donc capable de déclencher une apoptose neuronale comme elle le fait dans les cellules de la lignées lymphoblastique.
Exemple 4 : système vaccine
Construction des recombinants vaccine
a) Construction d'un virus recombinant de la vaccine exprimant la G-ERA
La stratégie que nous avons adoptée pour isoler un virus recombinant de la vaccine exprimant la G-ERA est fondée sur celle qui avait été établie avec succès par le Dr M. P. Kieny (Transgène S.A., France) pour l'expression de la glycoprotéine du virus rabique (Kieny et al, 1984, Nature,312, 163). Pour réaliser ce travail nous avons utilisé le vecteur pTG 186 décrit par Kieny et al (Biotechnology, 1986, 4, 790) qui possède un site multiple de clonage et qui permet l'insertion du gène d'intérêt sous le contrôle du promoteur 7.5K de la vaccine. La co-transfection de ce plasmide navette en présence de l'ADN infectieux de la vaccine sauvage Copenhague permet à des événements de recombinaison homologue de se produire au locus du gène tk et donc permet l'obtention et la sélection en présence de BrdUrd I de virus recombinant TK".
L o cu s tk
Figure imgf000044_0001
7.5 K G -ERA
C onstru ctio n du vecteu r vaccine tk- sim p le reco m binant exprim ant G E R A
Brièvement un insert correspondant à la phase ouverte de lecture du gène de la glycoprotéine G-ERA a été isolé du plasmide pRev-TRE.G.ERA (CNCM, n°1- 2760) par coupure enzymatique par les enzymes de restriction BamHI et Hpal. Cet insert a été clone dans le vecteur pTG 186 préalablement coupé par les enzymes de restriction BamHI et Smal et dephosphorylé. Après liguation et transformation de bactéries compétentes DH5α, des clones résistants à l'ampicilline ont été isolés. Les plasmides de ces bactéries ont été purifiés et analysés par restriction enzymatique. Quatre plasmides recombinants possédant l'intégration du gène G-ERA sous contrôle du promoteur 7.5K ont été caractérisés. Les séquences nucléiques ont été établies. Un clone représentatif a été sélectionné et a servi pour les expériences de co-transfections avec l'ADN infectieux de la vaccine Copenhague. Quatre virus recombinants ont été sélectionnés. L'expression du transgène G-ERA a été mesurée par cytofluorimétrie de flux après infection de cellules de rein de Singe vert (CV1) et détection de l'antigène par l'anticorps monoclonal 8.2 (collection de l'Unité de Neuroimmunologievirale). Un exemple du type de détection que l'on obtient est représenté sur la figure 15. Les quatre virus recombinants ont donné une expression semblable de la glycoprotéine. c) Construction d'un virus recombinant de la vaccine exprimant G-ERA et HA-grippe
Pour réaliser la construction d'un virus exprimant à la fois G-ERA et HA-grippe, nous avons décidé d'utiliser la stratégie qui avait été développée par le Dr Barbara Coupar du CSIRO (Australie). Le Dr Coupar a construit un plasmide permettant l'insertion d'un gène d'intérêt sous le contrôle du promoteur 7.5K dans un site multiple de clonage d'un plasmide navette (pTK-7.5 A) au locus Hind lll-F de la vaccine (Coupar et al, 1988, Gène, 68, 1).Ce plasmide possède aussi le gène tk du virus HSV sous le contrôle du promoteur vaccine PF. Après co- transfection de ce plasmide navette avec de l'ADN infectieux d'un virus vaccine tk- , des événements de recombinaison homologue peuvent se produire au locus Hind lll-F du génome du virus de la vaccine. La sélection des virus tk+ est réalisée en présence de méthotrexate comme cela a été décrit par Boyle et Coupar (J. Gen. Virol., 1986, 67,1591). L'utilisation du virus recombinant de la vaccine vv-PHA(tk-), dont dispose Nicolas Escriou (Unité GMVR) comme substrat pour la recombinaison conduit à l'obtention finale d'un vecteur double recombinant tk+ exprimant à la fois l'HA de la grippe et le gène d'intérêt qui est ici la G-ERA.
Locus tk Locus Hind III -F
Figure imgf000046_0001
7.5 K HA grippe PF HSV-tk 7.5K G-ERA
Construction du vecteur vaccine tk+ double recombinant HA grippe et G ERA
Brièvement un insert correspondant à la phase ouverte de lecture du gène de la glycoprotéine G-ERA a été isolé du plasmide pRev-TRE.G.ERA (CNCM, n°1- 2760) par coupure enzymatique par les enzymes de restriction BamHI et Hpal. Cet insert a été clone dans le vecteur pTK 7.5-A préalablement coupé par les enzymes de restriction Hind III (réparé au site Hind III) et BamHI, et dephosphorylé. Après ligation et transformation de bactéries compétentes DH5α, des clones résistants à l'ampicilline ont été isolés. Les plasmides de ces bactéries ont été purifiés et analysés par restriction enzymatique. Un plasmide recombinant possédant l'intégration du gène G-ERA sous contrôle du promoteur 7.5K a été caractérisé. La séquences nucléiques a été établie. La sélection des virus recombinants est en cours.
Mesure de la réponse anticorps
Dans le but d'établir les meilleures conditions expérimentales pour effectuer les tests de mesure de réponse en anticorps, nous avons tout d'abord testé les voies d'injections (iv ou ip) et les doses de virus vaccine (vv-PHA ou vv-contrôle) dans un modèle souris. Les souris ont été infectées par voie intra-veineuse avec 107 UFP de virus ou bien 107 et 105 de virus par voie intrapéritonéale qui est la voie couramment décrite.
Les prélèvement sanguins ont été effectués au niveau du plexus retro-orbitaire. Les anticorps sériques spécifiques ont été mesurés par test ELISA. Nous obtenons des titres anti-HA de 10 000 à 15 000 pour une injection i.v . de 107 UFP de virus, et de respectivement 500-4000 et 400-4000 pour des injections i.p. de 107 et 105de virus. Le pouvoir protecteur de la réponse induite a été testé par infection d'épreuve avec une dose létale de virus grippal homologue : toutes les souris injectées avec le virus vv-PHA ont survécu au contraire des animaux injectés par la vaccine contrôle.
La Glycoprotéine G-ERA exprimée dans le système vaccine induit l'apoptose
Des cellules lymphoblastoides de souris, lignée EL4 (ATCC#TIB-39) ont été infectées par le virus vv G-ERA à une multiplicité d'infection de 3. Après 24 heures d'infection les cellules ont été fixées à l'aide de cell fix (Becton Dickinson, USA) pour être analysées par cytométrie de flux (Figure 16 ). Lors de l'apoptose, les cellules EL4 subissent des changements morphologiques caractéristiques dont certains peuvent être mesurés par cytométrie de flux (Kishimoto, H. et al, 1995, J. Exp. Med, 181 , 649-655). Les cellules entrant en apoptose forment la population R2 et sont caractérisées par une forte granulosité (SSC : Side Light Scatter) et par une réduction de leur taille (FSC : Forward Light Scatter). En revanche, les cellules vivantes forment la population R1 et présentent une granulosité moindre et une plus grande taille. Comme on le voit sur les profils de cytométrie de flux représentés Figure 16 (A et C), la population R2 représente 67%> dans le cas des cellules infectées par le virus vv G-ERA, alors qu'elle ne représente que 20% de la totalité des cellules après infection par le virus de la vaccine n'exprimant pas de transgène (vv TG186 vide). Ceci établit que l'expression de G-ERA à l'aide de ce vecteur conserve bien la propriété pro- apoptotique de G-ERA.
La protéine HA du virus de la Grippe induit moins d'apoptose que la protéine G ERA du virus rabique
Les cellules EL4 ont ensuite été infectées par le virus recombinant de la vaccine exprimant la protéine HA du virus de la Grippe (vv PHA). Les résultats sont représentés dans la Figure 16 B. Dans ces conditions, la population R2 représente 46% de la totalité des cellules, alors qu'elle représentait 67% dans le cas des cellules infectées par le virus vv G-ERA. Ceci confirme que le caractère pro apoptotique est une propriété intrinsèque à G-ERA et qu'elle n'est pas associé a n'importe quelque glycoprotéine virale dont HA serait le prototype.
Les protéines HA et G-ERA sont co-exprimées à la surface des cellules dans le cas de co-infection vv PHA et vv G-ERA.
Dans le but de déterminer si les deux glycoprotéines G-ERA et HA pouvaient être co-exprimées à la surface des cellules EL4, des infections doubles ont été réalisées soit avec les virus vv PHA et vv G-ERA, soit vv PHA et vv TG186 ou enfin avec vv G-ERA et vv TG 186 avec une multiplicité d'infection de 3 pour chaque virus. La présence des antigènes à la surface des cellules a été mise en évidence par marquage spécifique soit de l'antigène HA à l'aide d'un anticorps polyclonal dirigé contre le virus grippal (don de Nicolas Escriou, Unité GMVR, Institut Pasteur) suivi d'un anticorps secondaire couplé à biotine, puis de streptavidine couplée à la phycoerythrine (PE), soit d'un anticorps monoclonal spécifique de la protéine G-ERA (mAb 8.2) suivi d'un anticorps secondaire couplé à FITC. La quantité de cellules présentant à la fois une fluorescence PE et FITC a été déterminée par cytométrie de flux. Les résultats sont présentés dans la Figure 17. On observe que dans la population co-infectée par les virus vv PHA et vv G-ERA, la population de cellules exprimant à la fois les antigènes G-ERA et HA à la surface de leur membrane plasmique représente 82% de la population.
Les corps apoptotiques générés lors de la co-infection vv PHA et vv G-ERA présentent bien les deux antigènes
Les cellules co-infectées par les virus vv PHA et vv G-ERA et traitées avec les anticorps décrits précédemment ont été analysées par immunofluorescence après fixation à l'acétone 80% et coloration au Hoechst 33342. Le colorant Hoechst 33342 permet de visualiser l'état des noyaux cellulaires. Les cellules en apoptose se caractérisent par une condensation de la chromatine et une fragmentation nucléaire. Un exemple du type de cellules que nous observons lors de ce type de co-infection est représenté sur la Figure 18. Comme on le voit les cellules présentent bien une fluorescence verte caractérisant la détection de la G- ERA, une fluorescence rouge caractérisant la détection de l'antigène HA et une fragmentation nucléaire plus ou moins importante en fonction des cellules et visualisée en bleu. D'autre part, on voit bien sur ces photographies d'immunofluorescence que les corps apoptotiques contiennent bien les deux types d'antigènes viraux : HA (rouge, 18-B-D) et G-ERA (vert, 18-C-D).
Les corps apoptotiques co-présentant les protéines G-ERA et HA induisent une stimulation de la réponse B anti G-ERA et anti-HA chez les souris
Des cellules EL4 ont été infectées par les virus recombinants de la vaccine vv PHA, w G-ERA ou vv TG-186 à une multiplicité d'infection de trois, dans des conditions permettant d'obtenir plus de 95% de cellules infectées entre 30 et 48h de culture. L'état d'infection ou de co-infection a été établi par analyse en cytométrie de flux comme décrit ci-dessus. La mesure de l'apoptose de la population a été réalisée par cytométrie de flux (taille de R2) et par des expériences d'immunofluorescence après marquage au Hoechst 33342. Les préparations cellulaires suivantes ont été réalisées : 1. Cellules infectées par vv PHA et vv TG-186
2. Cellules infectées par vv G-ERA et vv TG-186
3. Cellules infectées par vv G-ERA et vv PHA
4. Cellules infectées par vv G-ERA plus cellules infectées par vv PHA 5. idem 3 mais avec adjonction de l'inhibiteur d'apoptose Z VAD-FMK
6. idem 4 mais avec adjonction de l'inhibiteur d'apoptose Z VAD-FMK
7. Cellules infectées par vv TG-186
8. Cellules non infectées
La comparaison des conditions 1, 2 et 7 permet d'établir que seule G-ERA, et pas PHA, a un effet amplificateur sur la réponse B dirigée contre les antigènes de vv TG-186. La comparaison des conditions 1, 3 permet d'établir que G-ERA est un immunopotentiateur à encontre de l'antigène viral hétérologue HA. La comparaison des conditions 3 et 4 renseigne sur l'impact du mode de présentation de la G-ERA par rapport a l'antigène hétérologue et répond à la question est ce que les deux antigènes doivent être exprimés par la même cellule ou peuvent ils être présentés par des cellules différentes. La comparaison des réponses en anticorps dirigés contre HA et contre G-ERA dans les conditions 3 et 5 ainsi que 4 et 6, démontre le rôle de l'induction de l'apoptose dans le pouvoir immunogène de G-ERA
Pour annuler l'effet vaccinant du virus vivant, les préparations sont inactivées aux UV (inactivation de100% du pouvoir infectieux du virus). Huit groupes de 10 souris C57BL syngéniques des cellules EL4 ont été injectées par voie intrapéritonéale sous un même volume. La réponse B est analysée pendant 21j. Les prélèvements sanguins sont effectués au niveau du plexus retro-orbitaire.
L'analyse des anticorps sériques est réalisée par des tests ELISA (Montano- Hirose et al, 1995, Res. Virol., 146, 217-224), par test de réduction de foyers fluorescents (RFFIT, Smith et al, 1980, WHO monograph, Aguilar-Setien, A. et al, 2002, J. Wild. Dis., 38(3),539-544) et par test d'inhibition de l'hémagglutination pour l'antigène HA (Johnston, SL et al, 1992, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 15(4), 363-365 ; Astoul, E. ét al, 1996, J. Exp. Med., 183(4), 1623-1631).
Pour tester la rémanence de l'effet immunopotentiateur de la G-ERA, les souris ont reçu ensuite en rappel, 90 j après la première injection, une dose de virus de grippe inactivé. La réponse en anticorps anti-HA a été ensuite mesurée 7 et 15 jours après le rappel.
Une autre série d'expériences a permis de tester l'efficacité de la réponse protectrice contre une dose létale de virus de grippe létal pour une souris sur deux.
Exemple 5 : souche apathogène
La glycoprotéine d'une souche apathogène de virus rabique est la seule protéine inductrice d'apoptose caspase dépendante en cellules humaines
Le travail précédent a permis de mettre en place un système d'expression inductible des protéines du virus de la rage dans un modèle cellulaire de lymphocytes humains (cellules Jurkat). À l'aide de ce modèle, nous avons établi que 1) l'expression de la protéine G-ERA dans les lymphocytes cibles Jurkat rtTA induit l'apoptose, 2) au cours de cette apoptose, la voie des caspases est activée ( caspase 8). Nous nous sommes ensuite attachés à démontrer que ce phénomène n'était pas limité uniquement à la souche ERA mais aussi à d'autres souches apathogènes et que, de plus, la gycoprotéine était le déterminant majeur même dans un contexte où les autres protéines virales sont exprimées. Pour répondre à ces questions, nous avons bénéficié de l'utilisation de virus générés par génétique inverse par le Dr B. Dietzschold (Thomas Jefferson University, Philadelphia, USA).
SN10 est la souche prototype apathogène qui a permis la mise au point du système de génétique inverse du virus rabique (Schnell, M.J. et al, 1994, EMBO J., 13 :4195-4203, numéro d'accession dans GenBank M31046 ). La séquence nucléotidique du gène codant pour la protéine G est différente entre ERA et SN10. La souche CVS-N2C est une souche hautement pathogène, neurotrope et non apoptogène (Morimoto, K. et al, 1998, PNAS, 95 :3152-3156). Le recombinant chimère R-N2C est une souche où dans un génome de type SN10, le gène de la glycoprotéine a été remplacé par celui de la protéine G de la souche CVS-N2C (Morimoto, K. et al, 2000, J. of NeuroVirol., 6 :373-381, voir figure 19). Nous avons analysé la capacité apoptogène de ces différents virus dans les cellules Jurkat (voir figure 19). Nous observons que si la souche SN10 est pro-apoptogène en cellules lymphoblastoides, ce n'est pas le cas pour la souche chimère R-N2C. Ceci est vérifié par des mesures d'apoptose réalisées par différentes méthodes (pourcentage de caspase 8 activée, tunnel ou fragmentation nucléaire). Cette absence d'apoptose n'est pas lié à une difficulté d'infection des cellules par ces virus). Ainsi la seule absence de la G d'une souche pro-apoptotique non- pathogène est nécessaire et suffisante pour abolir le caractère pro-apoptogène de la souche SN10. Ceci démontre ainsi que, dans ce système, la glycoprotéine est bien le seul facteur déterminant du phénotype apoptogène. Le virus rabique étant un virus neurotrope, nous nous sommes ensuite attachés à montrer que ces résultats pouvaient être étendus aux cellules neuronale humaines. Nous avons donc réalisé les mêmes expériences dans une lignée de neuroblastomes humains (SK-N-SH, ATCC N° HTB-11). Les résultats représentés dans la figure 20 sont identiques à ceux obtenus avec les cellules Jurkat. Nous démontrons donc ici que la glycoprotéine est bien le déterminant majeur de l'apoptose viro-induite aussi bien sur cellules lymphoblastoides que sur cellules neuronales.
Bien que la présente invention ait été décrite par rapport aux réalisations concrètes et privilégiées, il apparaîtra toutefois évident aux personnes versées dans l'art ou la science en cause qu'il est possible d'introduire un certain nombre de variations et modifications sans déroger de la portée de l'invention décrite dans ce document. BIBLIOGRAPHIE
J. Gaudiπ, Y., TuITereau. C, Durrer, P., Bmrrner, J., Flamand, Λ. & uigrak, R. (1999) Mol Metnbr βiυl 1(5, 21- 1.
2. Lafoπ, M., Wiktor, T. J. & Macfarlan, R. I (1983) J Gen Virol 64, 843-51.
3. Barge, Λ., Gagnon, J., ChaflfoUe, Λ., Tïmmins, P., Langowski, J., Ruigrok, R.. "W. & Gau in, Y. ( 1 96) Virology Z 19, 465-70.
4. Tordo, N.; Poch, O., Erminc, Λ„ Keil , G. & Rougcon, F. ( 19S6) Froc Natl Λcad Sci U S A 83, 3914-8.
5. Tordo, N., Poch, O., Ermine, Λ., Keilli, G. & Rυugeon, F. (1988) Virology 165, 565-76.
6. Charllon, K. M. (1994) Cuir o Microbiol Immunol 187, 95-1 19,
7. Murphy, F. Λ., Harrison, Λ. K., Wli , W. C. & Bauer, S. P. (1973) ab Invest 29, 1-16.
8. Schneider, L. G (1991) in //; The Nalural Hislory ofjiabic , éd. Bπer, G. M., Boca Raton), pp. 133.
9. Murphy, F. Λ. ( 1977) Arch Virol 54, 79-97.
10. Gosztoπyi, G. (1994) Curr Top Microbiol Immunol 187, 43-68.
11. aux, H., Flamand, Λ. & Blonde!, Iλ (2000) J Viiol 74, 10212-6.
12. Jacob, Y., Badrane, H., Ceccaldi, P. E. & Tordo, N. (2000) J Tvol 74, 10217-22.
13. Hemachudha, T., Plianuphak, P., Sriwanthatia, B., Manutsathit, S., Pliantlminclimda, K., Siriprasomsup, W., Ukachoke, C, Rasameechan, S. & Kaoroptham, S. ]98d) Am J Med 94, 673-7.
14. Camelo, S., Castellanos, J., Lαfage, M. & Laion, M. (2001) J Virol 75, 3427-34.
15. Galelli, Λ., Baloul, L. & Lafon, M. (2000) JNeurovirol 6, 359-72.
16. Bursch, W., Kleine, L. & Tenniswood, M. (1990) Biochem Cell Biol 68, 107 j -4.
17. Kerr, ). P., Wyllie, Λ. 11. & Cuπic, Λ. R. ( 1972) Br J Cancer 26, 23 -57.
18. Kroeπier, G., Petit, P., Zamzami, N., Vayssiere, J. L. & Mignotte, B. (1995) Faseb J 9, 1277-87.
19. Fiers, W., Beyacrt. R., Declercη. W. & Vandεnabcele, P. ( 1999) Oncogene 18, 7719-30.
20. Roulslon, Λ., Marcellus, R. C. & Biaiilon, P. E. (1999) Annu Rev Microbiol 53, 577-628.
21. Hard ick, J. M. ( 1998) Semin Cell Dev Biol 9, 339-49.
22. Evcrell, IL & McFaddeti, G. (1999) Trend Microbiol 7, 160-5.
23. Green, D. R. (1998) Cell 94, 695-8.
24. Λs ketiazi, A. & Dixit, V. M. (1998) Science 28i, 1305-8.
25. PaM, H. L. &. Baeuerle, P. Λ. (1997) Trends Biochem Sci 22, 63-7.
26. Eaπishaw, W. C, Martïns, L. M. & Kaufrnann, S. H. (1999) Annu Rev Biochem 68, 383- 424.
27. Nicholsoπ, D. W. (1999) CellDeath Differ 6, 1028-42.
28. Slee, E. A., Adrain, C. & Martin, S. J. (1999) CellDeath Differ 6t 1067-74.
29. Rcstifo, K P. (2000) Curr Opin Immunol 12, 597-603.
30. Loefϋer, M. & Kroe er, G. (2000) Exp Cell Res 256, 19-26.
31. Migπαtte, B. & Vayssiere, I L. (1998) Eut J Biochem 252, 1-15.
32. Kroemer, G., Zamzami, N. & Susiπ, S. A. (1997) Immunol Today 18, 44-51.
33. Susin, S. Λ., Loreπzo, H. K., Zamzami, N., Marzo, L, Snow, B. E., Brothers, G. M., Mangion, J., Jacotαt, E., Coslanlirii, P., LoefTIer, M., Larochelte, N., Goodlelt, D. R-, Aebersold, R., Siderovski, D. P., Peπnïnger, J. M. & Kroemer, G. (1999) ΛroΛ rβ 397, 441-6.
34. Gross, Λ., Me Dounell, j M. & Koismeyer, S. J. (1999) Genes& Dev 13, 1899- 19 I I. 35. Kroemer, G. ( 1999) Biochem Soc Synψ 66, 1- 15,
36. Sπiylh, M. J. & Trapani, j. Λ. (1995) Immunol Today 1 , 202-6.
37. Yuan. S O997) Cvrrcnt opinion in cell 7.47-51.
Figure imgf000053_0001
38. Hardwick, J. M. (1997) Aώ' Ph rmac l 41, 295-336.
39. Miller, L. K. (1997) J Cell Physiol 173, 178-82.
40. Tyler. K. L„ Squier, M. K., Rucfgers, S. E, Sclmeider, B. E., Obeihaus, S, M., Grdina, T. A., Cohen, J. J. & Dcrmody, T. S. (1995) ./ Virol 69, 6972-9.
41. Uo, M., Yamamolo, T., Watanabe, M , Ihara, T., Kamiya, FI. & Saknmî, M. (1996) FEMS immunol Me t Microbiol 15, 1 15-22.
42. Ohniiπus, IL, lleinkcle , M. & Jassoy, C. (1997) Immunol 159, 5246-52.
43. Notebom, M. H., Todd, D., Verschueren, C, A., de Gau , II. W., Curran, W. L,, Veldka p, S., Douglas, Λ. J., McNulty, M. S., van der, E. A. & Kαch, G. (1994) ./ Virol 68, 346-5 1.
44 Despres, P., Flamand, M., Ceccaldi, P. Ji. & Deubel, V. ( 1996) J Virol 70, 4090-6,
45. Marianneau, P., Flamand, M., Coυrageot, M. P., Deubel, V. & Despres, P. (1998) Aim Biol Clin (Paris) 56, 395-405.
46. Thoulouze, M. I., Lafrge, M., Monlaπo-Hirαse, J. A. & Lafoπ, M. (1997) J Virol 71, 7372- 80.
47. Kwon, H., Pelletier, N., DeLuca, C, Genïn, P., Cisternas, S., Lin, R., Wainberg. M. A. & Hiscott, J. (1998) JBiol Chem 273, 7431-40.
48. Perbal, B, (1 88) A pracfical giride to moleciilar cloning.
49 Bcnce, N. F., Sanφat, R. M. & Kopito, R. R. (2001) Science 292, 1552-5.
50. Femandez-Funez, P., Niπo-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C, Lucha , J, M., Martinez, P., Turiegano, E.r Benito, J., Capovilla, M., Skiαner, P. J., McCall, A., Canal. L, Oir, H. T., Zoghbi, II. Y. & Bolas, J. (2000) Nature 408, 101-6.
51. Keller, J. N., f Ianπi, K. B. & Matkesbery, W. R. (2000) JNeurochem 75, 436-9.
52. Kitada, T , Asakawa, S., Hattori, N., Matsumiπe, H., Yamamura, Y., Miπoshima, S., Yokoc i, M., Mizuno, Y, &. Shimizu, N. (1998) Nature 392, 605-8.
53. Leroy, E., Boyer, R., Auburger, G., Leube, B., Ulm, G., Mezey, E., Harta, G., Bro nstein, M. J., Jonnalagada, S., Cheinova, T., Dehejia, A., Lavedaπ, C, Gasser, T., Sleiubach, V. J., Wilkinsoπ, K, D. &. Poiymerσpαulos, M. H. (1998) Nature 395, 451-2.
54. Wellington, C. L., Elleiby, L. M., Iîackam, Λ. S., Margolis, R. L., T firo, M. Λ., Singaraja, R., McCutcheoπ, K., Salvesen, G. S., Propp, S. S., Brorrun, M., Rowland, K, J„ Zhaπg, T., Rasper, , Roy, S., Thorπberry, M, Pinsky, L., Kakizuka, A., Ross, C. A, Nicholson, D. W., Bredesen, D. E. & Ilayden, M. II. (1998) JBiol Chem 273, 158-67.
55. Wellington, C. L., Singaraja, R., Ellerby, L., Savill, S., Roy, S., Leavitt, B., Cattaneo, E., Hackam, A., Sharp, A, Thorπberry, N., Nicholson, D. W., Bredesen, D. E. & Ilayden, M. R. (2000) JBiol Chem 275, 19831-8,
56. Wellington, C. L., Leavilt, B. R. & Hayden, M. R. (2000) JNeυral Transm Suppl , 1-1 ,
57. Krammer, P. f 1. (2000) Nature 407, 789-95.
58. Jacotot, E., Cardona, A , Rebouilîat, D., Terradillos, O., Marianneau, P., Thoulouze, M. L, Lafoπ, M., Deubel, V. & Edelmari, L. (1999) Λpσpfosis 4, 169-178.
59. Yang, X., Chang, H. Y. & Baltimore, D. (1998) Mol Cell 1, 319-25.
60. Muzio, M., Stock eU. B. R., Steunicke, H. R., Salvesen, G. S. & Dixit, V. M. (1998) JBiol Chem 273, 2926-30. ABREVIATIONS
ADN Acide Désoxyribonucléique
AD? Λpoptosis Indncing Facior
Apaf-1 Apoptotic protease activa fingfactor l
ARN Acide Ribonucléique
BHK-21 Baby Hamster Kidmy~2l (rein de hamster nouveau-né)
BSR Fibroblaste de Rein de Hamster
CAV Chicken Anémia Virus
CMV Cytomégalo Virus cvs Challenge Virus Standard (Souche CVS du virus de la rage)
DED Death Kffec/or Domain
DISC Deaih Indncing Signait ng Comphx
Dox Doxycycline
ERA Evelyn-Rol tnicld-Abelseth (Souche vaccinale du viius de la rage)
FADD Fas-associσted death domain proiein
FITC Fluorescein isothiocyanate (Isothiocyanate de Fluoresceine)
Flury LEP Flury Lou> Egg Passage (Faible passage chez l'embryon de poulet)
Flury IIEP Flury High Egg Pas age (Haut passage chez l'embryon de poulet)
ICAM- I Inter-Cellular Adh sion molécule (Molécule d'adhésion iπter-ceilulaire)
IFN-y Iπterférσπ-γ
IL Interleukine
MCP-1 Monocyle Chemoiaclic Proiein- 1
MomuLV Moloney Mu fine Leukemia Virus (Vîms Moloney de la leucémie mûri ne)
PBS Phosphate Btiffer Saline (Solution Tampon 6e au phosphate)
PE Phycoérytlume
PFA Paraformaldéhyde
PM Piltman-Moore
PV Pasteur production Virus (Virus de pioduclion Pasteur)
PTP Pore Transitoire de perméabilité
RE Réticulum Endoplasmique
RT Reverse Transcήplase (Transcriptase inverse)
PCR Polymerase Chain Reaction (réaction de Polymérisation en Chaîne) rtTA Reverse Transactivateur Teïracycline
SAD Street Âlabama Dog
SNC Système Nerveux Central
SVF Sérum de Veau Foetal
TNF-α T mor Necrosis Factor (Facteur de Nécrose Tumorale)
TRE Te(racycline-Re.ψonsive El ment (Elément de réponse à la tétracycline) vin Virus de ITmmuno-déficience Humaine
FITC-VAD-FMK Analogue fluorescent du N-benzyloxycarboπyl-Val-Ala-Λsp-fluorornediylketone

Claims

REVENDICATIONS:
1- Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il induit la formation de corps apoptotiques capable de stimuler chez un vertébré une réponse immunitaire humorale contre un antigène d'intérêt.
2- Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il active la voie des caspases.
3- Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il active la caspase- 8 initiatrice.
- Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par : a) une glycoprotéine G issue d'un virus de la rage, ladite glycoprotéine présentant une séquence comprenant au moins une praline en position
27, une isoleucine en position 48, une valine en position 219 ou une arginine en position 491 ; et b) un fragment d'au moins 100 acides aminés de la protéine telle que définie en a).
- Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que sa séquence comprend également une thréonine en position 89.
- Polypeptide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO : 2.
- Polypeptide selon la revendication 4, comprenant une séquence d'acides aminés présentant au moins 75% d'homologie avec une séquence d'acides aminés telle que définie en SEQ ID NO : 2. 8- Polypeptide chimérique isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7 associé à une séquence polypeptidique exogène.
9- Polypeptide chimérique selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite séquence polypeptidique exogène est la séquence d'un épitope B et/ou d'un épitope T.
10- Polynucleotide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
11- Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 75% d'homologie avec une séquence nucléotitique telle que définie par SEQ ID NO : 1.
12- Oligonucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO 7.
13- Vecteur d'expression ou de clonage, caractérisé en ce qu'il contient un polynucleotide tel que défini à la revendication 10 ou 11.
14- Vecteur selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les virus recombinants et les plasmides recombinants possédant une origine de réplication eucaryote.
15- Vecteur pRevTRE.G.ERA déposé à la C.N.C.M., le 30 novembre 2001 sous le numéro d'accession 1-2760.
16-Vecteur pRevTRE.N.ERA déposé à la C.N.C.M. le 30 novembre 2001 sous le numéro d'accession 1-2761. - Vecteur pRev-TRE-G-CVS déposé à la C.N.C.M. le 30 novembre 2001 sous le numéro d'accession 1-2758.
- Vecteur pRev-TRE-N-CVS déposé à la C.N.C.M. le 30 novembre 2001 sous le numéro d'accession 1-2759.
-Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle contient un polynucleotide selon la revendication 10 ou 11 ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 13 à 18.
-Cellule hôte selon la revendication 19, caractérisée en ce que ledit polynucleotide ou vecteur est intégré de façon stable dans le génome de la cellule hôte.
-Cellule hôte selon la revendication 19 ou 20, caractérisée en ce qu'elle est d'origine lymphoblastoide.
-Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
- Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, caractérisée en ce qu'elle contient également un antigène d'intérêt ou bien un polynucleotide codant pour ledit antigène d'intérêt.
-Composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un élément choisi dans le groupe constitué par : a)un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 et 11 ; b)un polynucleotide selon la revendication 10 ; d) un vecteur selon l'une quelconque des revendications 13 à 18 ; e) une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 19 à 23 ; f) un corps apoptotique comprenant a), b), c) et/ou d) ; et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
-Composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un corps apoptotique capable de stimuler chez un mammifère une réponse immunitaire humorale contre un antigène d'intérêt et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
-Composition immunogène ou vaccinale selon la revendication 25, caractérisée en ce que lesdits corps apoptotiques sont préparés à partir d'une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 19 à 23.
-Composition immunogène ou vaccinale selon la revendication 26, caractérisée en ce que lesdits corps apoptotiques sont préparés par transfection ou micro-injection d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 et 11.
-Composition immunogène ou vaccinale selon la revendication 25 caractérisée en ce que lesdits corps apoptotiques sont préparés à partir de cellules exprimant une glycoprotéine G issue d'une souche non pathogène du virus de la rage.
-Composition immunogène ou vaccinale selon la revendication 25, caractérisée en ce que lesdits corps apoptotiques sont préparés à partir de cellules co-exprimant une glycoprotéine G issue d'une souche non pathogène du virus de la rage et d'un antigène d'intérêt.
- Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 et
11, ou d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 13 à 18 ou d'une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 19 à 23 ou d'un corps apoptotique tel que défini selon l'une quelconque des revendications 24 et 25 à 28 pour la préparation d'un vaccin ou d'un adjuvant de l'immunité. -Utilisation selon la revendication 30, caractérisée en ce que ledit vaccin ou ledit adjuvant de l'immunité induit une réponse immunitaire humorale dans un vertébré.
- Utilisation selon la revendication 31 , caractérisée en ce que ledit vaccin ou ledit adjuvant de l'immunité est destiné à la prévention ou au traitement d' une encéphalite virale, de la rage, d'un cancer ou d'une neuropathologie.
-Utilisation selon l'une quelconque des revendications 30 à 32, caractérisée en ce que ledit vaccin ou ledit adjuvant de l'immunité est destiné à un usage humain ou animal.
-Méthode d'induction d'une immunité humorale, caractérisée en ce qu'elle comprend l'administration à un vertébré d'une composition immunogène ou vaccinale selon l'une quelconque des revendications 24 et 25 à 29.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2239330A1 (fr) 2009-04-07 2010-10-13 Institut Pasteur Génération, régénération et protection de neurones
EP2581384A1 (fr) 2011-10-11 2013-04-17 Institut Pasteur Produits utiles pour le traitement des tumeurs malignes du système nerveux humain
EP2592091A1 (fr) 2011-11-08 2013-05-15 Institut Pasteur Polypeptides à affinité MAST2 élevée et utilisations associées

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2563434B1 (fr) * 1984-04-25 1986-07-25 Transgene Sa Vaccin contre la rage et procede pour sa preparation
CA1337115C (fr) * 1987-07-30 1995-09-26 Bernhard Dietzschold Vaccin contre les maladies apparentees a la rage
AU7081896A (en) * 1995-10-05 1997-04-28 Microbix Biosystems Inc. Rabies recombinant adenovirus
WO2001070932A2 (fr) * 2000-03-23 2001-09-27 Thomas Jefferson University Vaccin recombine contre la rage genetiquement modifie pour l'immunisation de chiens errants et de la faune

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2239330A1 (fr) 2009-04-07 2010-10-13 Institut Pasteur Génération, régénération et protection de neurones
WO2010116258A1 (fr) * 2009-04-07 2010-10-14 Institut Pasteur Génération, régénération et protection des neurones
US8822665B2 (en) 2009-04-07 2014-09-02 Institut Pasteur Neuron generation, regeneration and protection
US9249194B2 (en) 2009-04-07 2016-02-02 Institut Pasteur Neuron generation, regeneration and protection
EP2581384A1 (fr) 2011-10-11 2013-04-17 Institut Pasteur Produits utiles pour le traitement des tumeurs malignes du système nerveux humain
WO2013053848A1 (fr) 2011-10-11 2013-04-18 Institut Pasteur Produits utiles pour le traitement de néoplasmes malins du système nerveux humain
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