[go: up one dir, main page]

WO2003060117A1 - Procede de surveillance de l'expression genique - Google Patents

Procede de surveillance de l'expression genique Download PDF

Info

Publication number
WO2003060117A1
WO2003060117A1 PCT/JP2003/000117 JP0300117W WO03060117A1 WO 2003060117 A1 WO2003060117 A1 WO 2003060117A1 JP 0300117 W JP0300117 W JP 0300117W WO 03060117 A1 WO03060117 A1 WO 03060117A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
expression
nmr
gene
monitoring
polyphosphate
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/000117
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuro Kokubo
Masahiro Shirakawa
Jeremy Robin Howard Tame
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science And Technology Agency filed Critical Japan Science And Technology Agency
Priority to EP03700514A priority Critical patent/EP1473363A4/en
Priority to US10/501,039 priority patent/US20050244822A1/en
Publication of WO2003060117A1 publication Critical patent/WO2003060117A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
    • G01R33/46—NMR spectroscopy
    • G01R33/465—NMR spectroscopy applied to biological material, e.g. in vitro testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for non-destructively monitoring gene expression using NMR, and a method for screening various drugs using the monitoring method.
  • the expression profile is the most important information for analyzing gene function.
  • the structure of the promoter region is indispensable in locating each gene, and it also provides very valuable information at the same time as specifying the function of the downstream encoded protein. unknown. Multiple remains involved in the same event
  • the fact that this type of information is rarely used in specifying functions is that its expression can be examined in detail at the cellular level. This is because there are only a few genes in the whole genome. Therefore, it is indispensable to collect expression data at the cell level for as many genes as possible and to construct a database of expression profiles in order to understand biological systems.
  • PET micro-positron emiss ion tomography
  • SPECT syngl e-pho ton emi ss io n comp Ted tomography
  • An object of the present invention is a technology capable of safely and easily obtaining the most important expression profile information in gene function analysis, that is, real-time monitoring of the expression level of a gene and corresponding to deep tissues
  • the aim is to provide non-destructive and high-resolution visualization technology for in-vivo that is highly versatile.
  • the promoter structure is important in determining the start position of a gene, and when a gene on the genome is transcribed, in vitro transcription reactions such as changes in nuclear structure, chromosomal structure, and DNA structure are performed. Multistage that cannot be reproduced by itself It is believed that floor reactions occur continuously. On the other hand, budding yeast
  • Polyphosphate synthases PHM1 to 4 were isolated as potential target genes for PH PH4, but subsequent analysis showed that they encoded membrane proteins that were very similar to each other. In addition, it was shown that the amount of accumulated polyphosphate was reduced in all of the deficient strains. In particular, no accumulation of polyphosphate is observed in the phm1 ⁇ phm2 ⁇ double mutant, the phm3A strain, and the phm4A strain. These facts strongly suggest that the PHM 1-4 gene may encode a subunit of polyphosphate synthase which is thought to function in the vacuole or on the membrane.
  • the present inventors have found that water around all organisms that measured directly by a marked amount accumulation 3 1 P- NMR poly-phosphate that is known to, or iron ions to be adsorbed to poly-phosphate by indirectly measured by the influence of the 1 H- NMR to be given to, poly-phosphate synthase of the budding yeast (P HM) gene considered than can be used as a reporter Isseki monogenic, the PHM gene constructs a plasmid incorporating the downstream of a promoter response to medium conditions and external stimuli like, introduced into the P HM-deficient strain of Saccharomyces cerevisiae, 3 1 P- NMR and 1 H- NMR of poly phosphoric acid in the cell Non-expression As a result of destructive and real-time measurement, they found that the amount of polyphosphate accumulated in yeast cells changed according to the expression level, and completed the present invention. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a method for monitoring expression of a predetermined gene, characterized in that the amount of accumulated molecules that can be measured by NMR by changing the NMR signal is measured by NMR without adding an exogenous substrate.
  • Item 1) the method for monitoring expression of a predetermined gene according to claim 1, wherein the molecule which changes the NMR signal and can be measured by NMR is polyphosphate.
  • the acid is polyphosphate produced by expression of a polyphosphate synthase gene linked downstream of the predetermined gene.
  • polyphosphate is a polyphosphate produced by the expression of a polyphosphate synthase gene linked in-frame downstream of a predetermined gene.
  • the method for monitoring the expression of a predetermined gene according to claim 2 (Claim 4), and the molecule which changes the NMR signal and can be measured by NMR is a cytochrome.
  • the method for monitoring the expression of a predetermined gene according to any one of claims 1 to 7, wherein the expression level of the gene in a cell, a tissue, or an organ is detected (claim 8).
  • Basic The present invention relates to the method for monitoring the expression of a predetermined gene according to any one of claims 1 to 8, which is a target gene of a transcription factor (claim 9).
  • the present invention also relates to a method for screening various drugs (claim 10), which comprises using the method for monitoring expression of a predetermined gene according to any one of claims 1 to 9. Brief description of the drawings ''
  • Figure 1 shows the results of phosphorus (3 1 P) NMR-spectrum Le measured by NMR system in the cell population of the wild strain and phm 4 Nokkua ⁇ preparative strain ( ⁇ 4) of budding yeast (S. cerevisiae) It is a photograph.
  • FIG. 2 is a photograph showing the result of one-dimensional imaging of wild-type cells of S. cerevisiae by 31 P-NMR.
  • Fig. 3 shows the Phm4 knockout strain ( ⁇ 4 (ga11-10 PHM4)) transformed with a plasmid linked to the PHM4 gene downstream of the GAL1 promoter overnight, and the budding yeast ( 2 is a photograph showing the results of measuring the amount of polyphosphoric acid in the cell populations of a wild type (Wild type) of S. cerevisiae) and a phm4 knockout strain ( ⁇ 4) in the same manner as in FIG.
  • ⁇ 4 ga11-10 PHM4
  • Figure 4 is cultured in a wild strain (top) and p HM4 Bruno Kkuau preparative strain (bottom) and a YPD medium supplemented with F e C 1 3 of each 1 mM of budding yeast (S. cerevisiae), obtained 4 is a photograph showing the results of measuring colonies by 1 H-NMR.
  • a monitor signal for measuring the amount of accumulated molecules that can be measured by NMR by NMR without adding an exogenous substrate by changing the NMR signal is not particularly limited as long as the NMR signal is changed, and the molecules that can be measured by NMR are synthesized from the orbital moment of each nucleon constituting the nucleus and the spin moment of the nucleon. Any molecule that has a magnetic moment specific to the nuclide and has a nuclide whose resonance absorption is observed when irradiated with electromagnetic waves, specifically, polyphosphate, various cytochromes, and ferritin Heme proteins having an iron atom in the molecule can be suitably exemplified.
  • the polyphosphoric acid which accumulates significantly in all organisms and can be directly measured by 31 P-NMR, includes the polyphosphate synthase gene linked downstream of a given gene, such as PHM of budding yeast Genes, particularly PHM1 to 4 genes, can be used as reporter genes, and specific examples of polyphosphate produced by their expression can be given. It is preferable to use the polyphosphate synthase gene linked by the above.
  • Poly Li is a polymer size of phosphate average chain length 5 0 mer polymers size of polyphosphoric acid to accumulate by this method within the detection range of the NMR or less, the sensitivity is highest in particular 3 1 P- NMR It is preferable to consider about 1 Omer, and the polymer size can be confirmed by subjecting the cell lysate to polyacrylamide gel electrophoresis and then staining with toluidine blue.
  • NMR signals derived from polyphosphate can be measured independently without interference from nucleic acid signals.
  • the nucleotide sequences of the PHM 1 to 5 genes and the amino acid sequences of PHM 1 to 5 are shown in SEQ ID NOs: 1 to 10.
  • the polyphosphoric acid synthase is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of producing polyphosphoric acid in a cell.
  • prokaryotic PPK polyphosphoric acid Kinases
  • their functional (functional) homologs or orthologs can be used.
  • the above various cytochromes include cytochrome b, c! , C, addition of a 3, cytochrome c Okishidaze Ya cytochrome P 4 5 0, Chitokuro over arm b- 5 5 9, b- 5 6 but 3 may be mentioned, cytochrome b- and a total measurement sensitivity by NMR 5 is preferred.
  • the nucleotide sequence of the rat-derived cytochrome b_5 gene is SEQ ID NO: 11 and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 12, and the nucleotide sequence of the yeast-derived cytochrome b-5 gene is SEQ ID NO: 12.
  • SEQ ID NO: 13 and its amino acid sequence are shown as SEQ ID NO: 14, respectively.
  • examples of the heme protein having an iron atom in the molecule include ferritin, hemoglobin, powerase, peroxidase, and the like. Since these heme proteins can be expressed by linking the heme protein gene downstream of a predetermined gene in-frame, the heme protein gene itself becomes a repo overnight gene.
  • the predetermined gene in the method for monitoring the expression of a predetermined gene according to the present invention is not particularly limited. However, for the purpose of obtaining the most important expression profile information in the analysis of gene function and analyzing its expression mechanism.
  • Genes targeted by basic transcription factors such as TF IID Subunit (TAF), that is, genes targeted by the basic transcription factor and controlling its expression, such as RPS5 gene, HIS4 gene, TUB2 gene, etc. There is a monkey.
  • the expression of the given gene in an opaque site such as a deep tissue of an animal is detected in order to detect the expression level of the given gene in cells, tissues or organs. Preference is given to a method of destructive measurement or a method of monitoring the expression of a given gene in real time.
  • a PPK (polyphosphate kinase) gene of Escherichia coli is used.
  • the screening method for various drugs of the present invention is not particularly limited as long as it is a screening method using the above-described method for monitoring the expression of a predetermined gene of the present invention.
  • the test signal is brought into contact with a test agent in vitro with a cell or tissue that expresses or accumulates a molecule that can be measured by NMR by altering the NMR signal and measures the expression level of a given gene by NMR.
  • various drugs that suppress or promote the expression of a predetermined protein, which is a translation product of the predetermined gene can be screened.
  • candidate drugs include drugs for the treatment of AIDS, leukemia, and carcinogenesis of viruses such as cancer.
  • the NMR device used in the method for monitoring the expression of a predetermined gene and the method for screening various drugs according to the present invention is not particularly limited as long as it can change a NMR signal and can measure a molecule that can be measured by NMR.
  • the NMR device and the magnetic field gradient amplifier which have improved probe parts so that high resolution can be achieved even with large-diameter probes, so that they can be applied to animals and plants such as mice, as well as microorganisms, have been improved.
  • NMR equipment is preferred.
  • the phm4 knockout strain was transformed with a plasmid having the PHM4 gene ligated downstream of the GAL1 promoter. After selecting transformants on a minimal synthetic medium, the cells are grown on YPG medium (Bacto yeast extract [1% w / v], Bacto pepton [2% w / v], Galactose [2% w / v]). Induced expression of the PHM4 gene. The amount of polyphosphate in the transformant after the induction of expression was measured in the same manner as in FIG. The results are shown in Figure 3. As is clear from Fig. 3, the recovery of accumulation was observed. Active Therefore, the 3 1 P- NMR signals for poly-phosphate of GAL 1 promoter It turned out that sex could be monitored.
  • the present invention it is possible to safely and easily obtain the most important expression profile information in gene function analysis, that is, it is possible to monitor the gene expression level in real time, and
  • a non-destructive and high-resolution visualization technology for in-vivo which is highly versatile, for example, capable of dealing with deep tissues such as mice.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

明 现 曞 遺䌝子発珟のモニタリング方法 技術分野
本発明は、 N M Rを甚いた遺䌝子発珟の非砎壊的なモニタリング方法、 及び該モニタリング方法を利甚した各皮薬剀のスクリヌニング方法に関 する。 背景技術
真栞现胞における遺䌝子発珟がいかなる原理によっお制埡されおいる のかを物質レベルで理解するこずは、 珟代生物孊においお最も重芁な研 究課題の䞀぀であるずされおいる。 R. Roeder が初めお詊隓管内転写反 応に成功しお以来玄 2 0幎が経過したが、 この間、 むンビトロ転写系を 甚いた膚倧な実隓が䞖界䞭で行われ、 本発明者らによる基本転写因子 T F I I Dの粟補 · クロヌニングなど、 個々の芁玠に関する数々の知芋が埗 られおいる。 しかしながらこうしお埗られた知芋を生䜓系に適甚しょう ずするず未だに次々ず理解できない珟象が芳察される。 これは生䜓内で は個々の芁玠がばらばらに存圚するのではなく、 あるシステムの䞀員ず しお協調的に機胜しおいるためであるず掚察される。 この生䜓内制埡シ ステムを正しく理解するためには、 詊隓管内実隓系のみでは䞍十分であ り、 より良い生䜓内実隓系の開発が必芁䞍可欠であるずされおいる。 埓来、倖来基質を必芁ずする /3—ガラク トシダヌれゃルシフェラヌれ、 あるいは自己発光する G F Pなどがレポ䞀倕䞀遺䌝子ずしお開発され、 様々な局面で有甚な情報をもたらしおきたが、 倚くの堎合その適甚は透 明な生物に限られ、 動物の深郚組織のような䞍透明詊料には適甚できな かった。 䞀方、 䞍透明詊料の堎合、 磁気共鳎を利甚した倖来遺䌝子の高 感床むメヌゞング法 M R I ) ずしお、 トランスフェリ ンレセプ倕䞀及 び )3 _ガラク トシダヌれをレポヌタヌ遺䌝子ずしお甚いる方法が知られ おいるが、 いずれも特殊な基質のデリバリヌが必芁である。 䟋えば前者 の堎合は M I 〇Nず呌ばれる酞化鉄を含む埮粒子をトランスフェリンず 融合させる必芁があり、 埌者の堎合は E g a d M e ず呌ばれるガラク ト ピラノシル環を含むガドリニゥムむオン錯䜓の合成が必芁である。 さら にこれらの基質は生䜓内に䞀旊蓄積されれば容易には分解されず、 遺䌝 子の発珟量をリアルタむムでモニタヌするには適圓ではない。 たた、 組 織切片を䜜補するィンサむチュハむブリダィれヌシペ ンのような極めお 高い解像床を有する方法も知られおいるが、 3䞇皮類ずもいわれる高等 真栞生物の遺䌝子党おに぀いお、 倥しい数の組織切片を䜜補し、 それら の発珟を现胞レベルで調べ、 コンピュヌ倕䞀䞊で再構築するこずは珟実 的に䞍可胜である。 れブラフィ ッシュや線虫のように透明な䜓を持぀極 く少数の䟋倖を陀けば、 既存の方法により遺䌝子発珟を詳现に調べよう ずすれば、 個䜓を切り刻むしかないのが実状である。 その䞀方で、 発生 段階や䞭枢神経系で働く遺䌝子の倚くは極めお短時間に発珟がオン · ォ フするため、 組織切片による解析すら極めお困難である。 したがっお、 who l e body m i c r o- i mag i ngの手法は今埌たすたす重芁になるず考えられ る。
ゲノムプロゞェク 卜の進展に䌎い、 倚くの生物皮においお塩基配列が 続々ず決定されおいるが、 遺䌝子機胜の解析にはその発珟プロフアむル が最も重芁な情報である。 プロモヌタヌ領域の構造が各遺䌝子の䜍眮を 特定する䞊で必芁䞍可欠であるこずは圓然のこずずしお、 それが同時に 䞋流にコヌドされる蛋癜質の機胜を特定する䞊でも極めお貎重な情報を もたらすこずはあたり知られおいない。 同䞀の事象に関䞎する耇数の遺 䌝子が同䞀の现胞で発珟するのは圓然のこずであるにもかかわらず実際 にこの皮の情報が機胜特定の際に利甚されるケヌスが少ないのは、 现胞 レベルでその発珟が詳しく調べられおいる遺䌝子がゲノム党䜓から芋れ ばごく僅かにすぎないためである。 埓っお今埌できるだけ倚くの遺䌝子 に぀いお现胞レベルでの発珟デヌタを収集し、 発珟プロファむルのデヌ 倕ベヌスを構築しおいく こずは生䜓システムを理解する䞊で必芁䞍可欠 である。
前述したように、 動物の深郚組織のような䞍透明詊料の堎合、 トラン スプリンレセプ倕䞀や /3—ガラク トシダ䞀れ遺䌝子を甚い、 M R Iで 枬定する方法が知られおいるが、 いずれも特殊な基質を甚いる必芁があ り、 これらの基質は生䜓内に蓄積され、 分解が遅いこずから、 遺䌝子の 発珟量をリアルタむムにモニタ䞀するには適圓ではなく、 たた党おの现 胞に均等に基質を分配するこずは事実䞊極めお困難であり、 その他、 æ·± 郚組織にも察応できる非砎壊蚈枬法ずしお、 P E T (micro-positron emi ss i on tomography) や S P E C T ( s i ngl e-pho ton emi ss i on compu ted tomography) 等も知られおいるが、 解像床が mmレベルであり、 䞀现胞 を可芖化するには未だ䞍十分であり、 汎甚性の高いむンビポにおける可 芖化技術の開発が必芁ずされおいた。
本発明の課題は、 遺䌝子機胜の解析における最も重芁な発珟プロファ ィル情報を安党か぀簡䟿に埗るこずができる技術、 すなわち、 遺䌝子の 発珟量をリアルタむムにモニタヌするこずができ、 深郚組織にも察応で きるなど汎甚性の高いィンビポにおける非砎壊的か぀高解像床の可芖化 技術を提䟛するこずにある。
プロモヌタヌ構造が遺䌝子の開始䜍眮を決定する䞊で重芁であり、 ゲ ノム䞊の遺䌝子が転写される際には、 栞内構造の倉化、 染色䜓構造の倉 化、 D N A構造の倉化など詊隓管内転写反応だけでは再珟できない倚段 階の反応が連続しお起こるず考えられおいる。 他方、 出芜酵母はわずか
6 0 0 0個の遺䌝子しかもたない単玔な単现胞生物であるにもかかわら ず、 ヒ トずほが同等の転写装眮を備えおおり、 情報発珟系の芳点から生 䜓システムを理解するためには珟圚最も魅力的なモデル生物であるずい われおいる。 この出芜酵母においお、 最近、 ポリ リ ン酞合成系に関䞎す る䞀矀の遺䌝子 P HM遺䌝子 が、 真栞生物ずしおは初めお同定され た Molecular Biology of the Cell, Vol.11, 309-4321, 2000)。 出芜酵母においおは、 培地䞭のリン酞濃床の䜎䞋に䌎い転写因子 PH 〇 4が高リ ン酞化状態から䜎リン酞化状態ぞず移行し、 その結果 PH〇 4の栞内蓄積量が䞊昇しおリン酞代謝に関わる䞀連の暙的遺䌝子矀を掻 性化するこずが知られおいる。 ポリ リン酞合成酵玠 P HM 1〜 4は P H 〇 4の暙的遺䌝子候補ずしお単離されたものであるが、 その埌の解析か らこれらは互いによく䌌た膜蛋癜質をコ䞀ドしおいるこず、 䞊びにその 欠損株においおはいずれもポリ リン酞の蓄積量が䜎䞋するこずが瀺され た。 特に p hm 1△ p hm 2△二重倉異株、 p hm 3 A株、 p hm4A 株においおはポリ リン酞の蓄積が党く芋られなくなる。これらのこずは、 PHM 1〜 4遺䌝子が液胞内もしくは膜䞊においお機胜するず考えられ るポリ リン酞合成酵玠のサブュニッ トをコ䞀ドする可胜性を匷く瀺唆し おいる。 本発明者らは、 党おの生物に著量蓄積するこずが知られおいる ポリ リ ン酞を3 1 P— NMRによっお盎接蚈枬するこず、 あるいはポリ リ ン酞に吞着する鉄むオンの呚囲の氎に䞎える圱響を 1 H— NMRにより 間接的に蚈枬するこずにより、 䞊蚘出芜酵母のポリ リ ン酞合成酵玠 P HM) 遺䌝子がレポ䞀倕䞀遺䌝子ずしお䜿甚しうるのではず考え、 P H M遺䌝子を培地条件や倖界刺激等にレスポンスするプロモヌタヌの䞋流 に組み蟌んだプラスミ ドを構築し、 出芜酵母の P HM欠損株に導入し、 3 1 P— NMR及び1 H— NMRにより现胞内のポリ リン酞の発珟量を非 砎壊的か぀リアルタむムに蚈枬したずころ、 発珟レベルに応じお酵母现 胞内のポリ リン酞の蓄積量が倉化するこずを芋い出し、 本発明を完成す るに至った。 発明の開瀺
すなわち本発明は、 NMRシグナルに倉化を䞎え NMRによっお蚈枬 可胜な分子の蓄積量を、 倖来基質を添加するこずなく、 NMRにより枬 定するこずを特城ずする所定遺䌝子の発珟のモニタリ ング方法 請求項 1 ) や、 NMRシグナルに倉化を䞎え NMRによっお蚈枬可胜な分子が、 ポリ リン酞であるこずを特城ずする請求項 1蚘茉の所定遺䌝子の発珟の モニタリング方法 請求項 2 ) や、 ポリ リン酞が、 所定遺䌝子の䞋流に 連結されたポリ リン酞合成酵玠遺䌝子の発珟により産生されるポリ リン 酞であるこずを特城ずする請求項 2蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリ ング方法 請求項 3 ) や、 ポリ リン酞が、 所定遺䌝子の䞋流にむンフレ ィムで連結されたポリ リ ン酞合成酵玠遺䌝子の発珟により産生されるポ リ リン酞であるこずを特城ずする請求項 2蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモ 二倕リング方法 請求項 4) や、 NMRシグナルに倉化を䞎え NMRに よっお蚈枬可胜な分子が、 チトクロヌム類であるこずを特城ずする請求 項 1蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法 請求項 5) や、 NM Rによる枬定が、 NMRによる非砎壊的な枬定であるこずを特城ずする 請求項 1〜 5のいずれか蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリ ング 法 (請求項 6 ) や、 所定遺䌝子の発珟をリアルタむムでモニタヌするこず を特城ずする請求項 1〜 6のいずれか蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタ リング方法 請求項 7 ) や、 所定遺䌝子の现胞内、 組織内又は噚官内の 発珟量を怜出するこずを特城ずする請求項 1〜 7のいずれか蚘茉の所定 遺䌝子の発珟のモニタリ ング方法 請求項 8 ) や、 所定遺䌝子が、 基本 転写因子の暙的遺䌝子であるこずを特埵ずする請求項 1〜 8のいずれか 蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法 請求項 9 ) に関する。
たた本発明は、 請求項 1〜 9のいずれか蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモ 二タリング方法を甚いるこずを特城ずする各皮薬剀のスクリヌニング方 法 請求項 1 0 ) に関する。 図面の簡単な説明 '
第 1図は、 出芜酵母 S.cerevisiae) の野生株及び p h m 4ノックァ ゥト株 ΔΡΗΜ4) の现胞集団におけるリン 3 1 P) NMRスぺク ト ルを NMRシステムで枬定した結果を瀺す写真である。
第 2図は、 出芜酵母 S.cerevisiae) の野生株の现胞を3 1 P— N M R による 1次元むメヌゞングを行った結果を瀺す写真である。
第 3図は、 GAL 1プロモ䞀倕䞀の䞋流に PHM 4遺䌝子を連結した プラスミ ドを圢質転換した P hm4ノックアり ト株 ΔΡΗΜ 4 ( g a 1 1 - 1 0 P HM 4 ))、 出芜酵母S.cerevisiae) の野生株 Wild type) 及び p hm4ノックアりト株 ΔΡΗΜ4) の现胞集団におけるポリ リ ン酞量を図 1 ず同様の方法で枬定した結果を瀺す写真である。
第 4図は、 出芜酵母 S.cerevisiae) の野生株 䞊段 ず p hm4ノ ックアり ト株 䞋段 ずをそれぞれ 1 mMの F e C 1 3を添加した Y P D培地で培逊し、 埗られたコロニヌを 1 H— NMRにより枬定した結果 を瀺す写真である。
発明を実斜するための最良の圢態
本発明の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法ずしおは、 NMRシグ ナルに倉化を䞎えるこずにより、 NM Rによっお蚈枬可胜な分子の蓄積 量を、 倖来基質を添加するこずなく、 NMRにより枬定するモニタリ ン グ方法であれば特に制限されるものではなく、 かかる NM Rシグナルに 倉化を䞎えお NMRによっお蚈枬可胜な分子ずしおは、 原子栞を構成す る個々の栞子の軌道モヌメン 卜ず栞子のスピンモヌメントから合成され た栞皮に固有の磁気モヌメントをもち、 電磁波を照射するず共鳎吞収が 芳枬される栞皮を有する分子であればどのようなものでもよく、 具䜓的 にはポリ リン酞の他、 各皮チトクロヌム類、 フェリチン等の分子内に鉄 原子を有するヘム蛋癜質を奜適に䟋瀺するこずができる。
党おの生物に著量蓄積し、 3 1 P—NMRによっお盎接蚈枬するこずが できる䞊蚘ポリ リン酞ずしおは、 所定遺䌝子の䞋流に連結されたポリ リ ン酞合成酵玠遺䌝子、 䟋えば、 出芜酵母の PHM遺䌝子、 特に P HM 1 〜 4遺䌝子をレポヌタヌ遺䌝子ずしお甚い、 その発珟により産生される ポリ リン酞を具䜓的に䟋瀺するこずができるが、 リアルタむムで枬定す る堎合には所定遺䌝子の䞋流にむンフレむムで連結されたポリ リ ン酞合 成酵玠遺䌝子を甚いるこずが奜たしい。 ポリ リ ン酞のポリマヌサむズず しおはこの方法により蓄積するポリ リン酞のポリマヌサむズは NMRの 怜出範囲内にある平均鎖長 5 0 m e r以䞋、 特に3 1 P— NMRにおいお 感床が最も高いず考えられる 1 Ome r皋床が奜たしく、 ポリマヌサむ ズは现胞砎砕液をポリアクリルアミ ドゲル電気泳動にかけた埌トルむゞ ンブルヌで染色するこずによっお確認するこずができる。 たた、 ポリ リ ン酞に由来する NMRシグナルは栞酞のシグナルに干枉されるこずなく 独立に枬定するこずができる。 P HM 1〜 5遺䌝子の塩基配列及び P H M 1〜 5のアミノ酞配列を配列番号 1〜 1 0に瀺す。 䞊蚘ポリ リ ン酞合 成酵玠ずしおは、 现胞内でポリ リン酞を産生しうる酵玠であれば特に制 限されず、 䞊蚘出芜酵母の P HMの他、 原栞生物由来の P P K (ポリ リ ン酞キナヌれ、 あるいはこれらのファンクショナル 機胜 ホモログや オル゜ログを䜿甚するこずができる。 䞊蚘各皮チトクロヌム類ずしおは、 チトクロヌム b、 c  , c、 a 3の ほか、 チトクロヌム cォキシダヌれゃチトクロヌム P 4 5 0、 チトクロ ヌム b— 5 5 9、 b— 5 6 3を挙げるこずができるが、 NMRによる蚈 枬感床からしおチトクロヌム b— 5が奜たしい。 参考たでに、 ラッ ト由 来のチトクロヌム b _ 5の遺䌝子の塩基配列を配列番号 1 1、 そのアミ ノ酞配列を配列番号 1 2ずしお、 酵母由来のチトクロヌム b— 5の遺䌝 子の塩基配列を配列番号 1 3、そのアミノ酞配列を配列番号 1 4ずしお、 それぞれ瀺す。 その他、 分子内に鉄原子を有するヘム蛋癜質ずしおは、 フェリチン、 ヘモグロビン、 力倕ラヌれ、 ペルォキシダヌれなどを挙げ るこずができる。 これらヘム蛋癜質は、 所定遺䌝子の䞋流にむンフレむ ムでヘム蛋癜質遺䌝子を連結するこずにより発珟させるこずができるこ ずから、 ヘム蛋癜質遺䌝子自䜓がレポ䞀倕䞀遺䌝子ずなる。
本発明の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法における所定遺䌝子ず しおは特に制限されるものではないが、 遺䌝子機胜の解析における最も 重芁な発珟プロファむル情報を埗、 その発珟機構を解析する目的等から しお、 T F IIDサブュニッ ト TAF) 等の基本転写因子の暙的遺䌝子、 すなわち基本転写因子が暙的ずし、 その発珟を支配する遺䌝子、 䟋えば、 R P S 5遺䌝子、 H I S 4遺䌝子、 TUB 2遺䌝子等を挙げるこずがで さる。
本発明の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法においおは、 所定遺䌝 子の现胞内、 組織内又は噚官内の発珟量を怜出するために、 動物の深郚 組織のような䞍透明郚䜍における所定遺䌝子の発珟を非砎壊的に枬定す る方法や、 所定遺䌝子の発珟をリアルタむムでモニタヌする方法が奜た しい。 本発明の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法を実斜するには、 䞊蚘出芜酵母の P HM遺䌝子をレポ䞀倕䞀遺䌝子ずしお甚いる方法の他 に、 䟋えば倧腞菌の P P K (ポリ リン酞キナヌれ 遺䌝子を所定のプロ モヌタヌの䞋流に連結し、 NMRにより蓄積したポリ リン酞量を枬定す る方法を挙げるこずができ、 この倧腞菌を甚いる堎合、 真栞现胞の合成 系ずは異なり、 P P Kは 1ステップで AT Pからポリ りン酞を合成する こずができる。 たた、 動物现胞のも぀ポリ リン酞合成系の遺䌝子矀をレ ポヌタヌ遺䌝子ずしお甚いるこずも可胜である。
本発明の各皮薬剀、 䟋えば所定遺䌝子の発珟を調節するプロモヌタヌ を暙的ずした各皮薬剀のスクリヌニング方法ずしおは、 䞊述の本発明の 所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法を甚いるスクリヌニング方法であ れば特に制限されるものではなく、 䟋えば、 NMRシグナルに倉化を䞎 え NMRによっお蚈枬可胜な分子を発珟又は蓄積しおいる现胞や組織ず 被怜薬剀ずをィンビトロで接觊させ、 NMRにより所定遺䌝子の発珟量 を枬定し、 被怜薬剀のない察照における所定遺䌝子の発珟量ず比范 · 評 䟡するこずにより、 所定遺䌝子の翻蚳産物である所定蛋癜質の発珟を抑 制又は促進する各皮薬剀をスクリヌニングするこずができる。 このよう な候補薬剀ずしおは、 A I D S、 癜血病、 癌等のりィルス発癌などの治 療甚薬剀を挙げるこずができる。
本発明の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法や各皮薬剀のスクリ䞀 ニング方法においお甚いられる NM R装眮ずしおは、 NMRシグナルに 倉化を䞎え NMRによっお蚈枬可胜な分子を枬定しうるものであれば特 に制限されないが、 埮生物のみならずマりス等の動物や怍物に適甚しう るように、 倧口埄プロヌブにおいおも高分解胜が達成できるようにプロ ヌブ郚分が改良された NMR装眮や磁堎募配アンプが改善された NMR 装眮が奜たしい。
以䞋、 実斜䟋により本発明をより具䜓的に説明するが、 本発明の技術 的範囲はこれらの䟋瀺に限定されるものではない。
出芜酵母 S.cerevisiae) の野生株ず p h m 4ノ ックアり ト株ずを Y P D培地 (Bacto yeast extract [ l %w/v]、 Bacto peptone [ 2 % w ノ v]、 Glucose [ 2 % w/ v ]) で生育させ、 埗られた现胞集団のリ ン (3 1 P) NMRスペク トルを NMRシステム ブルカヌ瀟補 D R X - 5 0 0) を䜿甚しお枬定した。 文献倀を参考にしおシグナルの垰属を行぀ た結果、 现胞内の無機リン酞 orthophosphate)、 ポリ リン酞の末端郚 (polyphosphate ends)、 ポリ リ ン酞 (polyphosphates) の内郚に盞圓 するシグナルをそれぞれ同定した。 結果を図 1に瀺す。 図 1から明らか なように、 野生型の酵母现胞では殆どの燐酞がポリ リン酞ずしお蓄えら れおいるこずがわかる。 しかし p hm4ノックァゥ ト株においおはポリ リ ン酞が完党に消倱しおいた。
NMR枬定管に现胞を詰めた埌、 3 1 P— NMRによる 1次元むメヌゞ ング  1次元プロファむル を取っおみた。 結果を図 2に瀺す。 図 2か ら明らかなように、 ポリ リン酞の内郚 ポリ リン酞の末端郚 Z無機リン 酞のいずれのシグナルを利甚しおもプロファむルをずるこずができた。 これは现胞内のポリ リン酞をむメヌゞングするこずが可胜であるこずを 瀺す。 䞀方、 よく䜿われる 1 H (氎玠原子栞 侀 MR I の手法による氎 に由来するシグナルを利甚した 1次元プロファむルでは现胞が詰たった 郚分ず懞濁液の郚分を区別するこずができないこずがわかった。
p hm4ノックアり ト株に察しお、 GAL 1プロモヌタヌの䞋流に P HM4遺䌝子を連結したプラスミ ドを圢質転換した。 最小合成培地䞊で 圢質転換䜓を遞抜した埌、 Y P G培地 Bacto yeast extract [ 1 % w/ v]、 Bacto pepton [ 2 %w/ v ], Galactose [ 2 %w/ v ]) で生育さ せ、 P HM 4遺䌝子の発珟を誘導した。 発珟誘導埌の圢質転換䜓に぀い お、 図 1ず同様の方法によりポリ リン酞量を枬定した。 結果を図 3に瀺 す。 図 3から明らかなように、 蓄積の回埩が認められた。 このこずから、 ポリ リ ン酞の3 1 P— NMRシグナルにより GAL 1プロモヌタヌの掻 性をモニタヌするこずができるこずがわかった。
出芜酵母 S.cerevisiae) の野生株 図 4䞊段 ず p h m4ノ ックァ ゥト株 図 4䞋段 ずをそれぞれ I mMの F e C 1 3を添加した Y P D 培地で培逊し、 埗られたコロニヌを幅 3 mm、 厚さ l mmのアクリル版 に塗垃し、 N MR管に詰め、 暪からのコロニヌの1 H— NMRによるィ メヌゞングを行った。 その結果を図 4に瀺す。 これらの結果、 通垞の方 法によるむメヌゞングで、 䞡株においお同等のシグナルが怜出できるこ ずがわかった 図 4巊。 たた、 䞊蚘のコロニヌを特殊な技法によりィメ 䞀ゞングした結果、 ポリ リン酞に貯蔵された鉄むオンの効果が匷調され るこずが明らかずなり、 野生型では鉄むオンの圱響でシグナルが有意に 枛匱しおいるこずがわかった 図 4右。 さらに条件を怜蚎するこずによ り、 野生株のシグナルを完党に消すこずも可胜であるず考えられる。 こ の枬定手法を甚いれば、 P HM 4の発珟を非垞に感床良くモニタヌする こずができる。 産業䞊の利甚可胜性
本発明によるず、 遺䌝子機胜の解析における最も重芁な発珟プロファ ィル情報を安党か぀簡䟿に埗るこずができる技術、 すなわち、 遺䌝子の 発珟量をリアルタむムにモニタヌするこずができ、 埮生物や现胞のみな らず、 マりス等の深郚組織にも察応できるなど汎甚性の高いむンビポに おける非砎壊的か぀高解像床の可芖化技術を提䟛するこずができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. NMRシグナルに倉化を䞎え NMRによっお蚈枬可胜な分子の蓄積 量を、 倖来基質を添加するこずなく、 NMRにより枬定するこずを特城 ずする所定遺䌝子の発珟のモニタリ ング方法。
2. NMRシグナルに倉化を䞎え NMRによっお蚈枬可胜な分子が、 ポ リ リン酞であるこずを特城ずする請求項 1蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモ 二タリング方法。
3. ポリ リン酞が、 所定遺䌝子の䞋流に連結されたポリ リン酞合成酵玠 遺䌝子の発珟により産生されるポリ リ ン酞であるこずを特城ずする請求 項 2蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法。
4. ポリ リン酞が、 所定遺䌝子の䞋流にむンフレむムで連結されたポリ リン酞合成酵玠遺䌝子の発珟により産生されるポリ リン酞であるこずを 特城ずする請求項 2蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法。
5. NMRシグナルに倉化を䞎え NMRによっお蚈枬可胜な分子が、 チ トクロヌム類であるこずを特城ずする請求項 1蚘茉の所定遺䌝子の発珟 のモニタリ ング方法。
6. NMRによる枬定が、 NMRによる非砎壊的な枬定であるこずを特 城ずする請求項 1〜 5のいずれか蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリ ン グ方法。
7. 所定遺䌝子の発珟をリアルタむムでモニタヌするこずを特城ずする 請求項 1〜 6のいずれか蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法。
8. 所定遺䌝子の现胞内、 組織内又は噚官内の発珟量を怜出するこずを 特城ずする請求項 1〜 7のいずれか蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリ ング方法。
9. 所定遺䌝子が、 基本転写因子の暙的遺䌝子であるこずを特城ずする 請求項 1〜 8のいずれか蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリング方法。
1 0 . 請求項 1〜 9のいずれか蚘茉の所定遺䌝子の発珟のモニタリング 方法を甚いるこずを特城ずする各皮薬剀のスクリ䞀二ング方法。
PCT/JP2003/000117 2002-01-09 2003-01-09 Procede de surveillance de l'expression genique WO2003060117A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03700514A EP1473363A4 (en) 2002-01-09 2003-01-09 METHOD OF MONITORING GENE EXPRESSION
US10/501,039 US20050244822A1 (en) 2002-01-09 2003-01-09 Method of monitoring gene expression

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-002396 2002-01-09
JP2002002396A JP2003207508A (ja) 2002-01-09 2002-01-09 遺䌝子発珟のモニタリング方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003060117A1 true WO2003060117A1 (fr) 2003-07-24

Family

ID=19190738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/000117 WO2003060117A1 (fr) 2002-01-09 2003-01-09 Procede de surveillance de l'expression genique

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20050244822A1 (ja)
EP (1) EP1473363A4 (ja)
JP (1) JP2003207508A (ja)
WO (1) WO2003060117A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102977206B (zh) * 2012-11-19 2014-10-01 䞭囜农䞚科孊院生物技术研究所 细胞色玠结合结构域蛋癜䜜䞺助分泌因子提高倖源基因圚毕赀酵母䞭分泌衚蟟量的甚途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996028190A1 (en) * 1995-03-15 1996-09-19 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Non-invasive imaging of gene transfer
WO1998033809A1 (en) * 1997-01-31 1998-08-06 The General Hospital Corporation Compositions and methods for imaging gene expression

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2327912T3 (es) * 2002-03-07 2009-11-05 Carnegie Mellon University Agentes de contraste para formacion de imganes de resonancia magnetica y metodos relacionados con los mismos.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996028190A1 (en) * 1995-03-15 1996-09-19 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Non-invasive imaging of gene transfer
WO1998033809A1 (en) * 1997-01-31 1998-08-06 The General Hospital Corporation Compositions and methods for imaging gene expression

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IZUMI SAITO: "Experimental Medicine", 1 September 1997, KABUSHIKI KAISHA YODOSHA, article "The protocol series idenshi donyu & Hatsugen kaiseki jikkenho", pages: 98 - 133, XP002967062 *
NOBUO OGAWA ET AL.: "New component of a system for phosphate accumulation and polyphosphate metabolism in saccharomyces cerevisiae revealed by genomic expression analysis", MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, vol. 11, 2000, pages 4309 - 4321, XP002967061 *
See also references of EP1473363A4 *
SHARFSTEIN SUSAN T. ET AL.: "Polyphosphate metabolism in escherichia coli", ANNAL OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCE, vol. 745, 1994, pages 77 - 91, XP002967060 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003207508A (ja) 2003-07-25
US20050244822A1 (en) 2005-11-03
EP1473363A4 (en) 2005-07-20
EP1473363A1 (en) 2004-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bhagwan et al. Isogenic models of hypertrophic cardiomyopathy unveil differential phenotypes and mechanism-driven therapeutics
Gu et al. A novel and simple cell-based electrochemical impedance biosensor for evaluating the combined toxicity of DON and ZEN
Wang et al. A genetically encoded β‐lactamase reporter for ultrasensitive 129Xe NMR in mammalian cells
Ni et al. Enhanced performance of an electrochemical aptasensor for real-time detection of vascular endothelial growth factor (VEGF) by nanofabrication and ratiometric measurement
Shen et al. Redox probes tagged electrochemical aptasensing device for simultaneous detection of multiple cytokines in real time
Anton‐Leberre et al. Exposure to high static or pulsed magnetic fields does not affect cellular processes in the yeast Saccharomyces cerevisiae
US20030180800A1 (en) Stable isotope based dynamic metabolic profiling of living organisms for characterization of metabolic diseases, drug testing and drug development
CN109142710B (zh) 䞀种快速灵敏检测河豚毒玠ttx的方法
JP5999644B2 (ja) 倚色発光现胞を甚いた免疫毒性評䟡システム
US20070077205A1 (en) Use of non-invasive imaging technologies to monitor in vivo gene-expression
US9606106B2 (en) NMR-based metabolite screening platform
CN1726290B (zh) 产生甚于筛选掻性物莚的经遗䌠修饰生物的方法
EP2176409B1 (en) Nucleic acid construct systems capable of diagnosing or treating a cell state
CN112816692A (zh) 䞀种同时检测倚种癌症标记物的液晶生物䌠感噚及其制倇䞎检测方法
Xu et al. Non‐negative blind deconvolution for signal processing in a CRISPR‐edited iPSC‐cardiomyocyte model of dilated cardiomyopathy
Hashi et al. Modifying expression modes of human neurotensin receptor type 1 alters sensing capabilities for agonists in yeast signaling biosensor
WO2003060117A1 (fr) Procede de surveillance de l'expression genique
Sasa et al. A dual-targeted electrochemical aptasensor for neuroblastoma-related microRNAs detection
Liu et al. A novel electrochemical method based on screen-printed electrodes and magnetic beads for detection of trinucleotide repeat sequence d (CAG) n
Moura et al. Assignment of individual heme EPR signalsof Desulfovibrio baculatus (strain 9974) tetraheme cytochrome c3: A redox equilibria study
Gao et al. Highly sensitive real-time detection of intracellular oxidative stress and application in mycotoxin toxicity evaluation based on living single-cell electrochemical sensors
CN115704771B (zh) 䞀种甚于组氚酞检测的细菌荧光䌠感噚及其制倇方法
Hoit et al. Phenotype-driven genetic approaches in mice: high-throughput phenotyping for discovering new models of cardiovascular disease
Sugihara et al. Mutation in fission yeast phosphatidylinositol 4-kinase Pik1 is synthetically lethal with defect in telomere protection protein Pot1
JP6071634B2 (ja) の定量方法及びそれに甚いるキット

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT SE SI SK TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003700514

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003700514

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10501039

Country of ref document: US