WO2003008967A1

WO2003008967A1 - Procede d'analyse d'une substance reposant sur l'analyse de l'effet d'activation de ppar$g(d) et medicament associe

Info

Publication number: WO2003008967A1
Application number: PCT/JP2002/007277
Authority: WO
Inventors: Kazuyoshi Yamaoka; Kenichiro Takagi; Kenichiro Kataoka; Masanori Yamamoto; Toshihiro Chikanishi
Original assignee: Teijin Limited
Priority date: 2001-07-17
Filing date: 2002-07-17
Publication date: 2003-01-30
Also published as: JP2012062315A; CN1533504A; KR101021817B1; EP1416273A4; CA2452246A1; KR100912852B1; EP1416273B1; JPWO2003008967A1; KR101106518B1; DE60234348D1; EP1416273A1; JP3888998B2; KR20090074800A; KR20040017300A; ATE448481T1; US7396642B2; US20080287544A1; CN100419425C; CN101259276A; AU2002318743B2

Description

明細書

P P AR δ活性化作用を測定することを特徴とする物質の選択方法及び

技術分野

本発明は、ペルォキシゾーム増殖物質活性化受容体 δ (peroxisome p roliferator activated receptor： P P AR δ ) 活性化作用を測定することによる熱産生亢進作用を有する物質の選択方法、及び P PAR δを活性化する作用を有する化合物を含有する熱産生亢進作用を有する薬剤に関する。また本発明は、脂肪酸、ピルビン酸を基質とするエネルギー代謝 (呼吸）細胞内の小器官であるミトコンドリアの機能のうち、脱共役蛋白質（UCP) によって惹起される脱共役呼吸又はミトコンドリア内膜のプロトンリーク（以下、プロトンリークと総称する）を特異的に亢進させる薬剤に関する。さらに本発明は、抗糖尿病剤、抗肥 ¾剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、又は内臓脂肪蓄積抑制剤に関する。背景技術

生体のエネルギー代謝調節系は、摂食調節系とエネルギー消費調節系からなつている。エネルギー消費調節系は、生命維持のための基礎代謝に使用されるエネルギー消費と、それ以外のエネルギー消費に分けられる。後者の範疇で主要なものが熱産生である非ふるえ熱産生

(nonshivering thermogenesis； n S T) で、その機能的な意義は生まれ立て時、寒冷暴露時、冬眠から覚める時などの体温維持や、過剰摂取エネルギーの消費による肥満、糖脂質代謝障害の防御などが挙げられる。特に、恒温動物である哺乳動物や鳥類、特に小動物において、体温維持のため、 n S Tは重要である。 n S Tの惹起機序には、ミトコンドリアのプロトンリーク、すなわち細胞の呼吸鎖の電子伝達系と AT P合成の関与が重要である。

褐色脂肪組織（BAT) には、その褐色脂肪細胞（BA) の呼吸鎖電子伝達系と、 AT P合成を脱共役させる特異的蛋白質である脱共役蛋白質ー 1 (UCP 1) とよばれる約 3 00アミノ酸からなる分子量 3 2 k Dの蛋白質が、ミトコンドリアの膜に存在する。 UC P 1は約 1 00個のアミノ酸からなるドメインの 3回繰り返し構造からなり、各ドメインに 2箇所ずつ、合計 6箇所の膜貫通部位があって、これらの膜貫通部位がミトコンドリアの膜にチャネルを形成している。

UC P 1はプロトンを輸送するキヤリァである。 UCP 1等が形成するプロトンチャネルは、電気化学的な勾配に従って自由にプロトンを透過させて熱を放出する機能を発現している。これが n STとなる。つまり n S Tは、プロトンチャネルのプロトン透過によって脱共役を起こし、脱共役により AT Pの合成が低下し、 ATPと ADPの比を一定に維持するためにミトコンドリア内の呼吸が活発になり、その結果として大量の脂肪と糖が酸化されて熱が発生して生じる。

UC P 1の生理的意義としては、生まれ立て時、寒冷暴露時などにおける体温維持機能が重要であるが、そのほかにトランスジエニックマウスを使った研究より、肥満の防御に関与することが明らかになっている。肥満の発症、進展、維持に UCP 1が関与していることは、様々な肥満モデルで UCP 1の発現が低下していることから示唆されていた。例えば、 B A T減少トランスジエニックマウスで過食無しに肥満が発症することが確認された（Lowell ら、 Nature, 366, 740-742 (1993)) 。また、 UC P 1遺伝子を脂肪細胞特異的な遺伝子 a P 2のプロモータ一に組込み、 UC P 1を強制的に大量発現させたマウスでは、体脂肪の減少、高脂肪食負荷による食餌性肥満に対する抵抗性が観察された（Kopecky ら、 J. Clin. Invest. , 96, 2914-2923 (1995)) 。さらに、 UC P 1の発現が 1/3に抑えられたマウスでは、寒冷暴露時の体温維持能低下、体脂肪量増加による肥満、そしてインスリン抵抗性が確認された（Lowell B.

B. et al., Nature 366, 740-742 (1993)) 。さらに UC P Iのノックアウトマウスは寒冷非耐性であった（Enerback S. et al. , Nature 387,

90-94 (1997)) 。以上のように、 U C P 1が熱産性分子として体温調節やエネルギー消費に重要な役割を有し、肥満と密接な関係にあることは動物実験の結果から明らかとなっている。

UCP 1の発現量は、主に核内の遺伝子の転写レベルで調節されており、 c AMP濃度上昇により UCP 1遺伝子発現は増加する（斎藤ら、最新医学、 52, 1095-1096 (1997)) 。

細胞内のエネルギー消費の約 20〜40 %はミトコンリア内膜のプ口トンリークによって生じると考えられている。 B ATが少量しかないヒ小成人やその他の動物では、 n STの大部分は骨格筋や白色脂肪組織

(WAT) で生じると考えられていた。以上のことから、 BAT以外の組織における UC Pの存在が推定されていた。 Ί 9 9 7年には、二つのグループから相次いで BAT以外の組轡から UC P 2の c DNAクロ一ニングが ¾告された（Fleuryら、 Nature Genet, 15, 269-272 (1997)； Gimeno ら、 Diabetes 46, 900-906 (1997)) 。 ' ヒト UCP 2はヒト UC P 1と 5 9 %のホモロジ一を示し、 UCP 1 と同様に 6箇所の膜貫通部位を有するチャネルを形成し、かつプリンヌクレオチド結合部位を有している。 UCP 2は UCP 1とは異なり、全身組織に広汎に発現しており、特に肺、滕臓で高濃度で発現している。ほかにも心臓、肝臓、脳、腎臓、精巣、 WAT、 BAT, 骨格筋で発現が検出されている。 UC P 2の機能については、高脂肪食負荷マウスで副精巣周囲脂肪組織の UC P 2遺伝子発現の亢進が認められている。しかし、 UC P 2のノックアウトマウスは、寒冷条件下で体温維持能が正常であることが報告された（Arsenijevic D. et al. , Nature Genet 26, 387-388 (2000))_c また上述の UC P 1のノックアウトマウスでは、代償作用と考えられる、褐色脂肪組織における UC P 2の大幅な発現亢進が認められるが、このマウスは寒冷非耐性であった（Enerback S. et al., Nature 387, 90-9 4 (1997)) 。さらに、 UC P 2は塍 /3細胞において細胞内 ATP濃度変化を介し、ィンスリン分泌を抑制していることが示された（Zhang C.-Y. et al. , Cell 105, 745-755 (2001))。これは抗糖尿病の観点からみると相反する特性であった。以上のように、 UC P 2については、そのプ口トンチャンネルとしての脱共役能は確認されているものの、現在までのところ、エネルギー消費 Z肥満との関連性は明らかにはされていない。生体内の余剰エネルギーは、まず優先的に内臓脂肪（特に腸管膜脂肪）として蓄積される。この内臓脂肪は他の部位の脂肪（特に皮下脂肪）に比べ、脂肪動員を受けやすく、速やかに分解され、消費される。この内臓脂肪（肥満）は生活習慣病（成人病）発症の多重危険因子とみなされている。その理由は、 WATの白色脂肪細胞（WA) からの分泌脂肪酸が門脈を経由して直接肝臓に流入してィンスリン抵抗性と脂肪合成を亢進し、その結果、耐糖能異常、高血圧および高脂血症を惹起し、最終的にはこれらが合併して動脈硬化を発症するに至るためである。したがつて、内臓脂肪の蓄積抑制と蓄積内臓脂肪の低減化が、ヒト成人の糖尿病をはじめとする生活習慣病発症予防およびその治療に有効であると期待される。

ペルォキシソーム増殖物質活性化受容体（peroxisome proliferator activated receptor： P PAR) は、その構造などから核内受容体（核ホルモン受容体）スーパーファミリーの一員と考えられている。これまで、 P PAR o;、 P PAR 5 (別称 NUC— 1、 P PAR j6、 FAAR)、および P PARァと称される 3種の P PARのサブタイプが同定され、それらの遺伝子 ( c DN A)がクローニングされている (Lemberger ら、 Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 12, 335-363 (1996)) 。

これら 3種のうち、 P PAR aに関しては、そのリガンド効果を有することが知られているフイブレート系薬剤に、臨床で強い血清トリァシルグリセ口一ルレベル低下作用が認められている（Formanら、 Proc. Na tl. Acad. Sci. USA, 94, 4312-4317 (1997)) 。

P PARァは特に脂肪組織で発現しており、脂肪細胞の分化に深く関与する因子であるとされている（Tontonoz ら、 Genes and Development, 8, 1224-1234 (1994)； Tontonoz ら、 Cell, 79， 1147-1156 (1994)) 。種々のチアゾリジンジオン誘導体は、インスリン非依存性糖尿病（N I DDM： non-insulin-dependent diabetes melitus) のモテレ動物で血糖降下作用を示し、ィンスリン抵抗性解除作用を有する新しい N I DD M治療薬として期待されている。これらチアゾリジンジオン誘導体はまた、 P PARrのリガンドとして作用し、 P PARァを特異的に活性化することが最近の研究で明らかとなった（Lehmannら、 J. Biol. Chem. , 270, 12953-12956 (1995)) 。

しかしながら、 P PAR (5の生理作用は明らかにされていない（Will sonら、 J. Med. Chem. 43 (4), 527-50 (2000)) 。 W〇 97 /28 1 4 9号明細書には P PAR δリガンドの血中 HD L上昇作用が、また WO 9 9 048 1 5号明細書には P PAR δ受容体を活性化する物質を投与することによるコレステロール低下作用が開示されている。しかし、 Ρ PAR Sと熱産生亢進作用との関係や、 P P AR δと脱共役蛋白質との関係については開示も示唆もされていない。また、ァラキドン酸のような不飽和脂肪酸、カルパプロス夕サイクリン（c P G I ) 、および L— 1 6 5 0 4 1

(4-(3-(2-propyl-3-hydro'xy-4-acetyl-phenoxy)propyloxy)-phenoxy acetic. acid) が U C P 2の発現を増加させることがわかった（The Journal Of Biological Chemistry, Vol .276, No.14, Issue of April 6, pp.10853-10860, 2001) 。しかし、 U C P 1と P P A R δの関係については、明らかにされていない。 ' 発明の開示

本発明の目的は、熱産生を亢進させる^用を有する物質の選択方法、及びその薬剤を提供することである。さらに、本発明の目的は、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤を提供することである。

本発明者らは、生体エネルギー消費調節系のうちの n S Τを促進することによる熱産生亢進作用に着眼した。そして、ミトコンドリアの脱共役呼吸の亢進、 n S Τの組織としては相対的に小さい BAT内ミトコンドリアのプロトンリーク亢進に加え、 WAT内ミトコンドリァプロトンリーク、及び脱共役蛋白質同族体である UC P 1の機能を亢進させる手段を創造し、よってその効率を向上させることを意図した。

本発明者らは、上記課題を解決することを目標として鋭意研究した結果、非特異的 P PARリガンドである力ルバプロス夕サイクリン（ c P G I ： 6, 9 οί-met ylene-ll , 15S - dihydroxy - prosta - 5Ε, ί3Ε - die n-l-oic acid) ゃィ口プロスト（ I 1 o p r o .s t ： 5 - {(E)— (IS, 5S, 6R, 7R)-7-hydroxy-6-[(E)-(3S, RS)-3-hydroxy-4-methyl-5-octen-6-inyl] -bicyclo[3.3.0]-octa'n-3-yl idene} pentanoic acid)が、骨格筋細胞もしくは脂肪細胞において UC P 1発現の亢進作用を有することを見出した。

そして、この新たな知見、ならびに P P ARひのリガンドであるフィプレート系化合物および Wy 1 4643や、 P PARァのリガンドであるチアゾリジンジオン系化合物に U C P 1発現の亢進作用がほとんど認められないという知見を総合し、 UC P 1発現の宂進作用には P PAR δが主に関与しているのではないがと考え、 P PAR δ活性化作用を有する化合物について更に研究した。

そして、 P PAR δ活性化作用を有する物質が、 UCP 1の発現亢進作用を示すことを、ヒトおよびげつ歯類の骨格筋細胞および脂肪細胞を用いた実験により明らかにした。

さらに本発明者らは、このように UC Ρ遺伝子の発現が P PAR δにより制御を受けていることから、 P P A R <5活性化作用を測定することによって、 UC P 1遺伝子の発現を増加させ、 n S T機能を増進させる、熱産生亢進作用を有する物質のスクリ一ニングが可能であることを見出した。

すなわち、本発明は以下の事項を包含する。

(1) P PAR δ活性化作用を測定することを特徴とする、熱産生亢進作用を有する物質の選択方法。

(2) P PAR 6活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリアの脱共役呼吸を亢進させる作用を有する物質の選択方法。

(3) P PAR δ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリア内膜でのプロトンリークを亢進させる作用を有する物質の選択方法 <

(4) P PAR δ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリア含有細胞の UC P 1の発現量を増大させる物質の選択方法。 (5) P PAR (5活性化作用を測定することを特徴とする、脂肪酸 )3酸化を亢進させる物質の選択方法。

(6) レポ一夕一遺伝子を利用する、（ 1) から（5) のいずれかに記載の物質の選択方法。

(7) 下記①から③の工程を含む（6) に記載の熱産生亢進作用を有する物質の選択方法。

① UC P 1遺伝子を発現する細胞に P PAR (5活性化作用を有する物質を接触および Zまたは導入する工程。

②前記細胞における UC P 1遺伝子の発現量を測定する工程。

③前記細胞における前記 UC P 1遺伝子の発現量を増加させる化合物を選択する工程。

(8) 前記 UCP 1遺伝子を発現する細胞が、脂肪細胞又は骨格筋細胞である（7) に記載の選択方法。

(9) 前記 UCP 1遺伝子を発現する細胞が、脂肪細胞である（7) に記載の選択方法。

( 10) P PAR <5を活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、熱産生亢進作用を有する薬剤。

( 1 1 ) P PAR dを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリアの脱共役呼吸を亢進させる薬剤。

( 12) P PAR δを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリア内膜でのプロトンリークを亢進させる薬剤。

( 1 3) P PAR (5を活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリア含有細胞の U C P 1の発現量を増大させる薬剤。

( 14) P P AR (5を'活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、脂肪酸 /3酸化を亢進させる薬剤。

( 1 5 ) 前記 P PAR dを活性化する作用を有する物質が、非特異的 P P A Rリガンド又は P P A R δリガンドである（1 0) から（ 14) のいずれかに記載の薬剤。

( 1 6) 前記 P PAR δを活性化する作用を有する物質が、力ルバプロス夕サイクリン、イロプロスト、又は p- (3- (4- acety卜 3- hydroxy- 2 - propylphenoxy) ropoxy) henyl acetic acidである ( 1 0 j力、ら ( 1 4 ) のいずれかに記載の薬剤。

( 1 7) 前記ミトコンドリアが骨格筋、白色脂肪組織、もしくは褐色脂肪組織の細胞のものである（1 1) から（ 1 3) のいずれかに記載の薬剤。

(1 8) 前記ミトコンドリアが白色脂肪組織、もしくは褐色脂肪組織の細胞のものである（ 1 1) から（ 1 3) のいずれかに記載の薬剤。

( 1 9) P PAR <5を活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。

(2 0) ( 1 0) から（1 8) のいずれかに記載の薬剤を有効成分として含有する、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。 ■ 図面の簡単な説明

第 1図は、 P P AR <5リガンドほか各種被験化合物によりヒト脂肪細胞において誘導される UC P 1 mRNA発現量を示す。第 2図は、 P P AR <5リガンドほか各種被験化合物によりヒ卜脂肪細胞において誘導される UC P 2 mRNA発現量を示す。第 3図は、 P P AR <5リガンドほか各種被験化合物によりヒト脂肪細胞において惹起される遊離脂肪酸酸化亢進の程度を示す。発明を実施するための形態

本発明の n S T組織のミトコンドリアのプロトンリ一ク等を特異的に亢進する作用を有する薬剤は、 P PAR <5活性化作用を有する化合物またはその誘導体を有効成分とする。本発明の薬剤は、上記有効成分そのものでも、それを含む適宜の配合物、組成物、混合物であってもよい。また、 P PAR活性化作用を有する化合物とは、「P PARリガンド」として P PARに結合することにより、 P PARの標的遺伝子の転写活性化能を制御する化合物を指し、天然に存在するものに限られず、人工的に合成されたものも含まれる。

上記有効成分の有用性を明らかにするために、実施例に具体的に示されているように、各種 P PARリガンドを各種骨格筋細胞、脂肪細胞に添加して UC P 1の mRNA量を測定した。その結果、測定した P PA R aリガンド、 P P AR Tリガンドに対し、有意に UCP 1の mRNA の発現量が多いものは P PAR dリガンドであった。なお、 P PAR <5 リガンドとしては、例えば、コレステロール低下作用を示す化合物とし TWO 9 9048 1 5号明細書に記載された、 p- (3- (4_acety卜 3 - hydroxy-2-propylphenoxy)propoxy) henyl acetic acid (YM— 1 66 3 8) 等が挙げられる。

ある物質について、 P PARに対する結合 Z活性化の程度を簡便かつ高感度に知る方法として、レポ一夕一遺伝子が利用される。例えば酵母の転写因子である G,AL 4の DNA結合領域と P PARのリガンド結合領域とを結合させた融合蛋白質発現用のベクター、および GAL 4の応答配列（GAL4 binding element) に連結されたレポ一ター遺伝子を含むレポ一夕一プラスミドを導入した動物細胞を用いる方法が知られている (W096/33724; Lehmann ら、 J. Biol. Chem. 270, 12953-12956 (1995)； Willsonら、 J. Med. Chem. , 39, 665-668 (1996)) 。レポーター遺伝子を利用する方法とは、例えば、まず被験化合物が P PARに結合又は活性化する物質であると、被験化合物が GAL 4の P PARのリガンド結合領域に結合する。すると、 P PARのリガンド結合領域に融合させた GAL 4の DN A結合領域が、レポータープラスミドの GAL 4の応答配列に結合し、レポ一夕一遺伝子の発現が亢進する。レポ一夕一遺伝子によって発現した蛋白質の活性等を測定すること、つまりレポーター活性を検出することによって、被験化合物が P PARに結合又は活性化する物質か否かが検出できる。

したがって、 P PARに結合する未知のリガンドのスクリーニングゃ被験化合物が P PARに結合するリガンドであるか否かの検査において. その天然または人工的に合成されたリガンドを検出し、単離することができる。なお、レポ一夕一活性の検出は、レポーター遺伝子の種類に応じ、染色、蛍光、細胞の生死などを指標に、当業者の技術常識に基づいて適宜行うことができる。

さらに、本発明におけるスクリーニング方法は、上述のレポ一夕ー活性の検出系に (a) UCP 1遺伝子を発現する細胞に被験試料を接触および/または導入する工程、（.b) 該細胞における UC P 1遺伝子の発現量を測定する工程、（c) 該細胞における UCP 1遺伝子の発現量を増加させる化合物を選択する工程、を加えることができる。

スクリーニングに用いる「UC P 1遺伝子を発現する細胞」としては、特に制限はないが、特に白色脂肪細胞や褐色脂肪細胞等の脂肪細胞、骨格筋細胞が好適である。細胞は、動物組織から分離した初代培養細胞であってもよく、癌化もしくは不死化した株化細胞であってもよい。脂肪細胞としては、例えば、後述する実施例に記載のヒト白色脂肪細胞、あるいはラット褐色脂肪細胞、 3 T 3— L 1 (マウス脂肪細胞）などの各種脂肪細胞が、骨格筋細胞としては、例えば、 S kMC (ヒト骨格筋細胞）、 C 2 C 1 2 (マウス骨格筋細胞）などの各種骨格筋細胞が好適に用いられる。なお UC Pファミリ一（脱共役蛋白同族体）遺伝子としては、例えば UC P 1遺伝子、 UCP 2遺伝子、 UCP 3遺伝子、 UC P 4遺'伝子が挙げられる。 .

本発明のスクリーニング方法の一工程では、これら UC P 1遺伝子を発現する細胞に被験物質を接触および Zまたは導入し、 UCP 1遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現量の測定には、当業者によく知られた種々の方法を用いることが可能である。例えば、ノザンプロット法（S ambrookら、 Molecular Cloning, 201-206 (1987), Cold Spring Harbor Laboratory) あるいは RT— P CR法（Shaffer ら、 Anal. Biochem. , 190, 292-296 (1990)) などの方法で、 DNA、 RNA又は蛋白質を測定することによって、行うことができる。

UC P 1遺伝子の発現量測定の結果、 UCP 1遺伝子の発現の有意な増加が認められれば、用いた被験試料の化合物は n S T機能を増進させる作用を有する。 n S Tの組織内細胞のミトコンドリァで脂肪および糖が燃焼するためには UCP 1の発現が不可欠であるが、本発明の有効成分は、前記のように該組織内細胞の UCP 1発現量を顕著に増大させる作用を有する。この分子レベルでの知見から、本発明の薬剤は内臓脂肪蓄積抑制および蓄積内臓脂肪の低減化に有効である。

実際に、実施例では P PAR δリガンドにより発現が亢進した UC Ρ が内臓脂肪蓄積を抑制および低減するべく機能しうること、すなわち細胞内の脂肪および糖の燃焼を促進することを確認するために、各種 P P ARリガンドを初代ヒト脂肪細胞に添加し、脂肪燃焼宂進の指標のひとつとして知られる脂肪酸 jS酸化を測定した。実施例に具体的に示されているように、 UC Pの発現量に比例して脂肪酸 /3酸化も亢進した。そして最も脂肪酸 j8酸化が亢進したのは P PAR δリガンドであった。本発明の薬剤は、 n S Tに関与する骨格筋、脂肪等の非ふるえ熱産生組織細胞中のミトコンドリアにある内膜貫通型蛋白質の U C P 1の発現量を増大させ、上記細胞中のミトコンドリアの脱共役呼吸、プロトンリーク、及び熱産生を特異的に亢進させる作用を有する。本発明の薬剤は、 P P A R (5活性化作用を有する化合物またはその誘導体を有効成分とするものであり、上記したように脂肪、骨格筋等の n S T組織細胞中の U C P 1の発現量を著しく増大させる高 U C P 1発現作用をもつ。本発明の薬剤は、 U C P 1発現活性を指標として同定および分離 ·精製することができる。そうして得られた物質を有効成分とすることで、特に抗肥満に著効を有する内臓蓄積脂肪低減化剤ないし内臓脂肪蓄積抑制剤を調製することができる。

本発明の薬剤は、エネルギー代謝や脂質代謝を促進させ、血漿脂質を低下させるので、特に哺乳動物（例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ィヌ、サル、ネコ、ゥマ、ゥサギ等）や鳥類の肥満の予'防または治療に用いることができる。さらに、肥満に合併する疾患（例えば糖尿病、高血圧症、高脂血症、動脈硬化、虚血性心疾患等の成人病等）等の予防または治療にも有効である。

当該低減剤又は抑制剤の担体としては、その使用形態に応じて、適当な充填剤、結合剤、増量剤、，崩壊剤、'表面活性剤、防湿剤、賦形剤、希釈剤などを使用することができる。製剤形態は、その使用目的に応じて適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば錠剤、顆粒剤、粉末剤、丸剤、カプセルなどの固剤や、液剤、懸濁剤、乳剤などが例示される。かくして得られる抗糖尿病剤、抗肥満剤、または内臓蓄積脂肪低減化剤ないし内臓脂肪蓄積抑制剤は経口投与が望ましく、その投与量は、投与する者の症状等に応じて適宜選択される。したがって、投与量、投与回数などは特に限定されない。実施例

次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は当該実施例によって何ら限定されるものではない。なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Mole cular Cloning) 」 (Sambrook, J. , Fr i tsch, E. F. および Maniatis, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより発刊）に記載の方法により行った。なお、市販の試薬やキット 'を用いる場合には市販品に添付の指示書に従った。

[実施例 1] ヒト白色脂肪細胞における UC P 1および UCP 2mRN A発現誘導に対する薬剤の影響

( 1) ヒト白色脂肪細胞の培養と RNA調製

ヒト脂肪細胞は、皮下脂肪組織由来の未分化凍結前駆脂肪細胞（C a t . N o. S P— F, L o t . N o. L 0 1 1 3 9 9 ) を米国 Z e n— B i o社から購入した。これを 24穴プレートにて培養し、業者の指示に従って分化誘導を行うことにより脂肪細胞を得、ヒト白色脂肪組織由来脂肪細胞として使用した。すなわち、 24穴プレートで、 p r e a d i p o c y t e me d i um培地中、コンフルェン卜な状態まで 3 7 °Cで C O ₂ィンキュベー夕で培養後、 d i f f e r e n t i a t i o n me d i um培地に培地交換し、約 7 2時間培養することにより分化誘導を行った。さらに a d i p o c y t e m'e d i um培地に培地交換し、 14日間培養して白色脂肪細胞へと分化させた。この培養細胞についてさらに以下の条件で培養した。

各種被験化合物を終濃度 1 0 Mとなるように培地に加え、 6時間培養した（n= 3) 。各種被験化合物は、 P PAR aリガンドのべザフィブレ一ト（B e z a f i b r a t e) 、 WY 14643、 P PAR Sリガンドの YM— 1 6 6 3 8、 P P AR Tリガンドのトログリタゾン（T r o 1 i t a z o n e) 、口シグリ夕ゾン R o s i g l i t a z o n e ) , 非特異的 P PARリガンドの c P G I、イロプロスト（ I l o p r o s t ) 、）S 3アドレナリンレセプ夕一ァゴニストの L 7 5 5 50 7とした。コントロールは被験化合物の溶媒である D M S Oを終濃度 0. 5 %となるように加え、同様に培養した。培養した細胞を各々回収し、細胞溶解用緩衝液（RLT溶液、 Q I AGEN社製） 1 5 0 ^ 1 に懸濁した後、細胞を破砕し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液からト一夕ル RNAを調製した。 RNAの調製は RNA調製キット（商品名： RN e a s y t o t a l RNAキット、 Q I AG EN社製）を用いて指示書に従って行った。

(2) UCP 1 mRNA発現量の測定

前項（ 1) で得た RNA (トータル RNA、約 0. l g) をテンプレートとして、以下のようにリアルタイムポリメラ一ゼ連鎖反応（R e a 1 T i me P CR) により UC P 1 mR N A発現量を測定した。ヒト UCP 1遺伝子用の P CRプライマ一としては、 5， — AACC CACAGAGGTCGTGAAAG- 3 ' (フォワード側プライマー）、および 5 ' - CGTGTAGCGAGGTTTGATTC C - 3 ' (リパ一ス側センスプライマ一）の 2種を用いた。 P C Rプロ一ブとしては、 5 ' — CAGACTT CAAGCATAGAGC CAT CTC CA - 3 ' を用いた。プローブに結合した蛍光色素は F AMであった。また、 2— R e p o r t e r A s s a yとして同時に測定した G 3 PDH mRNAの測定については P E Ap p l i e d B i o s y s t em sの推奨する方法に従って行った。なお、プライマーの化学合成は Am e r s h am P h a rma c i a B i o t e c h社、フ口一ブのィ匕学合成（蛍光色素の結合を含む）は P E Ap p l i e d B i o s y s t ems社に依頼した。

調製した被験トータル RNA、上記プライマ一およびプローブ、市販のリアルタイム検出 PCR用試薬キット（Ta qMan EZ RT— PCR Co r e Re ag e n t K i t (商品名）、 p E A p p l i e d B i o s y s t e m s社製）を用いて反応チューブ l本あたり表 1に示す反応液を調製'した。

【表 1】

P CR P e r k i n E l me r M i c r o amp Op t i c a 1 Tu b e (商品名、 P E Ap p l i e d B i o s y s t em s社製） 1本あたり上記反応液を 2 5 ^ 1調製し、キャップをした後、 AB I PR I SM 7 7 0 0 S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t em (商品 ¾、 P E Ap p l i e d B i o s y s t e m s社製）にセットし、以下の条件で反応を行った。

混入 DN Aの UN Gによる分解反応 5 0°C、 5 0分、逆転写工程 6 0°C、 1 0分、 UN Gの失活 9 5°C、 2分の後、 P CR反応を変性工程 9 5°C、 1 5秒、ァニ一リング工程 5 8。C、 9 0秒の条件 (サイクル数： 40サィクル）で行った。反応開始後、蛍光強度をリアルタイムで自動測定することにより UC P 1 mRN A発現量を測定した。 UC P 1 mRNA 発現量は対照であるブランクコントロールを 1 0 0とした場合の相対値で示し、 G 3 PDH mRNA発現量で補正をかけて算出した。

その結果を第 1図に示した。 UC P 1 mRN A発現量は、 P P AR δ リガンド（P PAR dを活性化する作用を有する化合物）である YM— 1 6 6 38でコントロールの約 1 2倍の増加を示した。これにより、 P P A R δリガンドはかかる作用を顕著に発現することが明確となった。本実験において P PAR δリガンドは UC P 1遺伝子を特異的に増強することが判明したことから、 P P AR δリガンドによる WATの機能亢進作用は、 P P AR δリガンドの WATへの直接的な作用であることがわかった。 UCP 1は、げっ歯類のみならず、ヒト白色脂肪細胞において顕著な発現の増大が観察されたことから、ヒトの糖尿病や肥満に対し、 P P AR (5リガンドが極めて有効であることが示された。

(3) UC P 2 mRNA発現量の測定 .

前項（ 1) で得た RNA (ト一タル RNA、約 0. l g) をテンプレートとして、前項（2) と同様にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により UCP 2 mRNA発現量を測定した。ヒト UC P 2遺伝子用の P CRプライマーとしては、 5 ' - CGC CAAATGAGCTTTGC CT— 3，（フォワード側プライマ一）、および 5 ' — GC CCTTG GTGTAGAACTGTTTGA- 3 ' (リバ一ス側センスプライマ一）の 2種を用いた。 P CRプローブとしては、 5， — TGTC CGC ATC GGC CTGTATGATTC— 3，を用いた。プローブに結合した蛍光色素は F AMであった。

その結果を第 2図に示した。 U C P 2 mRN A発現量は P P AR δリガンド（P PAR <5を活性化する作用を有する化合物）である YM— 1 6 6 3 8で対照の約 2倍の増加を示した。

[実施例 2] ヒト白色脂肪細胞における遊離脂肪酸酸化に対する薬剤の影響

実施例 1で述べた方法と同様にヒト白色脂肪細胞を分化誘導後、上清を除去し、 a d i p o c y t e m e d i u m培地にォレイン酸おょぴパルミチン酸をそれぞれ 0. 6 7mMおよび 0. 3 3mMとなるように溶解した培地 5 0 0 z l に交換した。各種被験化合物を終濃度 1 0 tM となるように培地に加えた後、 [9, 1 0 (η) -³Η] パルミチン酸 (アマシャムフアルマシア社製、終濃度 1 ? C i /m 1 )を加え、 3 7°C で 48時間培養した。被験化合物は、 P P AR δリガンドである YM— 1 6 6 3 8、 P PAR aリガンドの W Y 14643、 /3 3アドレナリンレセプターァゴニストの L 7 5 5 , 5 0 7、 P PAR rリガンドのロシグリタゾン（R o s i 1 i t a z o n e ) とした。コントロールは被験化合物の溶媒である DMS Oを終濃度 0 · 5 %となるように加え、同様に培養した。また培養中、細胞による [ 9， 1 0 (n) 一 ³ H] ノルミチン酸の) 3酸化により生じた³ H₂〇が蒸散しないように、住友べークラ一ト社製ミニカルチャーフィルタ一（MS— 3 0 0 5 5) で培養プレートをシールした。

48時間培養後、培地上清 2 0 0 Γを 1. 5m lエツペンドルフチュ一ブに移し、 5 0 %トリクロロ酢酸を 50 1添加し、氷上で 3 0分間沈殿を形成させ、 1 5 , 0 0 0 r pmで 1 0分間遠心した。次に、あらかじめ 5 0 0 1の純水を入れた 2 0m lガラスバイアルの中に蓋なし 1. 5 m 1エツペンドルフチューブを入れ、このエツペンドルフチューブに上記遠心で得られた上清を全量移し、ポリプロピレンパッキン付きの蓋で厳重に封をした。このパイアルを 5 0°Cで 1 8時間加温してパィアル内を³ H₂0で飽和させ、 4 °Cで冷却後、遠心し（ 1 0 0 0 r pm、 1分) 、バイアル内のエツペンドルフチューブに残っている培地上清とエツペンドルフチューブを廃棄した。バイアル内に残った³ H₂0を含んだ純水に 5 m 1の液体シンチレ一夕一（ウルチマゴールド、パッカード社製）を加え、十分に混和後、カウントした。

この結果を第 3図に示した。 P PAR δリガンド YM 1 6 638 1 0 Mにより細胞の i3酸化は 3 0 %亢進した。一方、 P PARァリガンド r o s i g l i t a z o n e 1 0 Mでは 1 5 %の亢進、 P P A R リガンド WY 14643 1 0 Mぉょび)3 3 a d r e n a g i c r e c e p t o rァゴニスト L 7 5 5, 50 7 1 0 では /3酸化の亢進はみられなかった。この結果は実施例 1で示した各種 P PARリガンドの UC P 1 mRN A発現亢進作用と良く相関している。すなわち、 P P AR δリガンドは UCP 1遺伝子の発現亢進によりその蛋白量も増加させ、 UC P 1の機能の一つである遊離脂肪酸を基質とした酸化を宂進、ひいてはエネルギー代謝を促進し、内臓脂肪蓄積を抑制および低減させることを示すものである。このことからも P PAR δリガンドがヒトの抗糖尿病、抗 ί巴満に対して有効であることが示された。産業上の利用可能性

本発明により、熱産生亢進作用等を有する物質が得られ、それを含む抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、又は内臓脂坊蓄積抑制剤等の薬剤が得られる。

Claims

請求の範囲

1. P PAR δ活性化作用を測定することを特徴とする、熱産生亢進作用を有する物質の選択方法。

2. P PAR δ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリァの'脱共役呼吸を亢進させる作用を有する物質の選択方法。

3. P PAR S活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリァ内膜でのプロトンリークを亢進させる作用を有する物質の選択方法。

4. P PAR (5活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリァ含有細胞の UC P 1の発現量を増大させる物質の選択方法。

5. P P AR δ活性化作用を測定することを特徴とする、脂肪酸 i3酸化を亢進させる物質の選択方法。

6. レポーター遺伝子を利用する、請求の範囲第 1項から請求の範囲第 5項のいずれか 1項に記載の物質の選択方法。

7. 下記（ 1 ) から（3) の工程を含む請求の範囲第 6項に記載の熱産生亢進作用を有する物質の選択方法。

( 1) UCP 1遺伝子を発現する細胞に P PAR <5活性化作用を有する物質を接触および Zまたは導入する工程。

(2) 前記細胞における UC P 1遺伝子の発現量を測定する工程。

(3) 前記細胞における前記 U CP 1遺伝子の発現量を増加させる化合物を選択する工程。

8. 前記 UC P 1遺伝子を発現する細胞が、脂肪細胞又は骨格筋細胞である請求の範囲第 7項に記載の選択方法。

9. 前記 UC P 1遺伝子を発現する細胞が、脂肪細胞である請求の範囲第 7項に記載の選択方法。

1 0. P PAR δを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、熱産生亢進作用を有する薬剤。 '

1 1. P P AR δを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有 'する、ミトコンドリアの脱共役呼吸を亢進させる薬剤。

1 2. P PAR <5を活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリア内膜でのプロトンリークを亢進させる薬剤。

1 3. P P AR δを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリア含有細胞の U CP 1の発現量を増大させる薬剤。

14. P P AR δを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、脂肪酸 8酸化を亢進させる薬剤。

1 5. 前記 P PAR δを活性化する作用を有する物質が、非特異的 P P ARリガンド又は P P AR δリガンドである請求の範囲第 1 0項から第 14項のいずれか 1項に記載の薬剤。

1 6. 前記 P PAR を活性化する作用を有する物質が、力ルバプロス夕サイクリン、イロプロスト、又は p -（3- (4 - acety卜 3- hydroxy- 2 - propylphenoxy)propoxy) phenyl acetic acidである請求の範囲第 1 0 項から第 14項のいずれか 1項に記載の薬剤。

1 7. 前記ミトコンドリアが骨格筋、白色脂肪組織、もしくは褐色脂肪組織の細胞のものである請求の範囲第 1 1項から第 1 3項のいずれか 1 項に記載の薬剤。

1 8. 前記ミトコンドリアが白色脂肪組織、もしくは褐色脂肪組織の細胞のものである請求の範囲第 1 1項から第 1 3項のいずれか 1項に記載の薬剤。

1 9. P P AR (5を活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、抗糖尿病剤、'抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。

2 0 . 請求の範囲第 1 0項から第 1 8項のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分として含有する、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。