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WO2003030925A1 - Angiogenesis drugs - Google Patents

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Publication number
WO2003030925A1
WO2003030925A1 PCT/JP2002/010278 JP0210278W WO03030925A1 WO 2003030925 A1 WO2003030925 A1 WO 2003030925A1 JP 0210278 W JP0210278 W JP 0210278W WO 03030925 A1 WO03030925 A1 WO 03030925A1
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WO
WIPO (PCT)
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amino acid
peptide
acid sequence
agent according
angiogenic agent
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/010278
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kiyoshi Nokihara
Yoshinosuke Hamada
Nariaki Matsuura
Junzo Takahashi
Original Assignee
Kiyoshi Nokihara
Yoshinosuke Hamada
Nariaki Matsuura
Junzo Takahashi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kiyoshi Nokihara, Yoshinosuke Hamada, Nariaki Matsuura, Junzo Takahashi filed Critical Kiyoshi Nokihara
Priority to JP2003533956A priority Critical patent/JP4338516B2/ja
Priority to EP02800742.5A priority patent/EP1452182B1/en
Priority to US10/491,418 priority patent/US7091175B2/en
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Definitions

  • the present invention relates to an angiogenic agent having an action of generating blood vessels.
  • the angiogenic agent of the present invention is useful not only for the treatment of ischemic diseases, but also for the regeneration and repair of organs using biosubstitute materials such as artificial bones.
  • bioadhesive functional molecular peptides have been proposed to improve the affinity with surrounding soft and hard tissues.
  • a bone substitute a complex obtained by mixing carbonate abatite, which is similar in composition to crystallinity of living hard tissue, and collagen, which is one of the bioadhesive functional molecular peptides
  • carbonate abatite which is similar in composition to crystallinity of living hard tissue
  • collagen which is one of the bioadhesive functional molecular peptides
  • peptides that have great advantages in safety, metabolism, etc., including side effects, are easy to design, and high-efficiency synthetic methods and assay methods have been established.
  • amino acid derivatives are convenient building units for constructing combinatorial chemical libraries, and their structure can be optimized in a short time by solid phase synthesis. Therefore, if a peptide having a relatively small molecular weight having an angiogenic action is present, it is synthesized and administered alone or combined with a biomaterial to form a soft tissue around the biomaterial that is in contact with the biomaterial.
  • the interaction can be better.
  • an object of the present invention is to find a peptide having an angiogenic action and to provide a novel angiogenic agent which contains the peptide as an active ingredient and which can be used clinically for treatment of humans and the like.
  • the present inventors have conducted intensive studies and as a result, have found that a peptide having a specific amino acid sequence has an angiogenic effect, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or in the sequence, one to three amino acids are substituted or located at one or both ends.
  • angiogenesis agent of the present invention can be used for regenerating and repairing organs using biological substitute materials such as human bones, and for ischemic diseases such as myocardial infarction, cerebral infarction and obstructive aortic sclerosis, which are a large part of lifestyle-related diseases. It is also useful for treating diseases.
  • a heptapeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has an angiogenic effect. Therefore, a preferred example of the angiogenic agent of the present invention contains a heptapeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • a peptide having a physiological activity one or more amino acids are substituted or deleted in the amino acid sequence, or one or more amino acids are inserted or added to the amino acid sequence. It is well known that the physiological activity may be maintained even when the activity is performed. Accordingly, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, one to three amino acids are substituted, or one or two amino acids located at one or both ends are deleted, or A peptide having an amino acid sequence in which another amino acid sequence is added to one or both ends of the amino acid sequence (hereinafter sometimes referred to as “modified peptide” for convenience) and has an angiogenic action Peptides are also included in the scope of the present invention.
  • the amino acids contained in the “modified peptide” are not limited to the amino acids that constitute a natural protein, but are obtained by chemically modifying a natural amino acid (for example, a nitro group or halogen in the side chain of the amino acid). And the like) are also included. Further, it may be a D-type amino acid.
  • a peptide having an amino acid sequence in which one amino acid at the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been deleted is represented by SEQ ID NO: 1. It exerts an angiogenic effect comparable to that of a peptide having an amino acid sequence, and is a preferred embodiment of the present invention.
  • the peptide in which the fourth tyrosine of SEQ ID NO: 1 was substituted with alanine lost the angiogenic effect, so the fourth tyrosine residue is important. It is preferable not to make substitutions that would significantly alter the chemical structure of the side chain. However, even if it is not natural L-type Tyr, D-type or tyrosine side chain phenol ring with a halogen or nitro group is usually designed as a Tyr-substituted molecule by medicinal chemistry. , It is often known that they have stronger or equivalent effect ing.
  • the fourth tyrosine may be used as specifically described in Examples below. It was confirmed that the peptide substituted with fenilalanine exerted more excellent effects. Therefore, among the modified peptides, one amino acid substituted with one or two amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or one amino acid located at one or both ends is preferable. Or a peptide having an amino acid sequence in which another amino acid sequence is added to one or both ends of the amino acid sequence, wherein the fourth amino acid residue has a cysteine residue.
  • amino acid having an aromatic ring in a group or a side chain preferably a peptide having an angiogenic action, which is L-diarazine
  • the “amino acid having an aromatic ring in the side chain” is not necessarily limited to the amino acid constituting the natural protein, and as described above, the nitro group, the nitro group, or the Tyrosine or phenylalanine derivatives to which at least one substituent selected from the group consisting of halogen, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms and an acyl group having 1 to 5 carbon atoms are also included.
  • the number of substituents on the aromatic ring, preferably on the benzene ring is "!
  • the aromatic ring J is preferably It is a condensed ring (may be a heterocyclic ring) such as a benzene ring or a naphthalene ring containing a benzene ring, and particularly preferably a benzene ring.
  • phenylalanine is an amino acid having an aromatic ring (benzene ring) in a side chain.
  • a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing or one amino acid located at one or both ends in the sequence is deleted, or Another amino acid sequence is added to one or both ends of the amino acid sequence or one or both ends of the amino acid sequence in which one amino acid located at one or both ends of the amino acid sequence is deleted.
  • a peptide having an amino acid sequence Angiogenic agents including peptides having angiogenic action can also be mentioned. Since the region having an angiogenic action is included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part of the amino acid is substituted or a terminal region thereof.
  • the peptide can exert an angiogenic action.
  • the cell-adhesive action of cell-adhesive peptides such as fibronectin and laminin is exerted by the region consisting of only three amino acids called RGD and the region consisting of only five amino acids called YI GSR. It can be inferred from this. Therefore, since the region having an angiogenic activity is included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial amino acid thereof is substituted or an end region thereof.
  • the upper limit of the size of the peptide used in the present invention is not limited at all, but if it is too large, the production becomes difficult, handling is inconvenient, and the angiogenesis activity per unit weight decreases. Therefore, the total number of amino acids of the peptide is usually 4 to 350, preferably 4 to 50, more preferably 5 to 20 and more preferably 5 to 10, and more preferably Is from 6 to 10. Further, an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 7 and 9 to 11 or a peptide having 10 or less amino acids added to one or both ends of the amino acid sequence is also preferable.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 12 and 13 is a peptide obtained by adding another amino acid sequence to one end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It has been confirmed that it has properties.
  • the array It has been specifically confirmed in the Examples below that peptides having the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 2 to 7 and 9 to 11 as well as No. 1 have been specifically confirmed in the Examples below. Is also a preferred example.
  • Whether the peptide has an angiogenic effect or not was determined by specifically embedding a microcell filled with a peptide solution into the back of a mouse, as shown in the examples below. By observing the formation status, it can be checked.
  • the above peptide can be easily synthesized manually or by a conventional method using a commercially available peptide synthesizer.
  • large-sized peptides can be produced by a conventional method by genetic engineering.
  • the peptide can be locally administered alone or in the form of an injection dissolved in a physiological buffer to a tissue in which angiogenesis is desired.
  • Local administration of the angiogenic agent of the present invention to a wound or the like caused by surgery or trauma by injection, application, spraying or the like promotes angiogenesis and promotes wound healing.
  • the peptide concentration in the peptide solution used for injection, application or spraying is not particularly limited, but is usually about 1 to 10 g (microgram) ZmL.
  • the dose can be appropriately selected depending on the size and depth of the wound or the like, but may be such that the whole wound is covered with the peptide solution. It can be given once to several times every one to several days until the wound heals.
  • the injection solution may contain various components usually contained in a therapeutic agent for wounds, such as other disinfectants and anti-inflammatory analgesics.
  • angiogenesis by binding a peptide to a carrier and implanting the carrier with the peptide bound into a living body. Since this is immobilized on the carrier, it can selectively act on the required site, and has a great potential as a new DDS (drag delivery system).
  • Local administration of the angiogenesis agent of the present invention to a biomaterial transplantation site by application, spraying, or the like promotes angiogenesis and promotes postoperative healing.
  • the carrier is not particularly limited, and examples thereof include resins used for bone substitutes, tooth substitutes, artificial organs, and the like, and biopolymers such as proteins.
  • a protein in the present specification, unless otherwise specified, the term “protein” includes a protein-containing complex such as a glycoprotein or a phosphoprotein) can be used as a carrier.
  • the protein used as the carrier may be any protein having biocompatibility, and in particular, is preferably a cell-adhesive protein in order to improve the junction with a living tissue.
  • the cell adhesion protein include, but are not limited to, collagen (gelatin), fibronectin, vitronectin, laminin and the like, and partial hydrolysates thereof.
  • These proteins are preferably purified proteins from which allergens have been removed from the viewpoint of preventing allergic reactions.
  • various collagens derived from animals are commercially available as collagen, but these are low in purity, contain allergens, and have poor reproducibility of quality, so it is not preferable to apply them to clinical use.
  • gelatin obtained by partially hydrolyzing animal-derived collagen and removing allergens is commercially available for clinical use, it is preferable to use such purified collagen or a partially hydrolyzed product thereof.
  • the amount of the peptide bound to the carrier is not particularly limited and can be appropriately selected.
  • the weight ratio of the carrier to the peptide (carrier: peptide) is about 100: 1 to 1: 1. It is preferably about 20: 1 to 5: 1.
  • the bond between the carrier and the peptide is preferably a covalent bond. Bonding can be easily carried out, for example, by bonding the amino group at the N-terminus of the peptide to an arbitrary amino group in the carrier using a bonding cross-linking agent such as dartaldehyde, etc. An example of a simple coupling method is described. In the case of binding to a resin such as an artificial organ, a monomer containing a group such as an amino group that can be used for binding to a peptide is copolymerized in the resin, and the resin is combined with the amino group or the like. The amino group at the N-terminus of the peptide can be attached.
  • a blood vessel in which a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial amino acid thereof has been substituted or deleted. It is also preferable to employ a modified peptide having a nascent action in which one or both ends of another modified peptide having an arbitrary amino acid sequence is bound, and this arbitrary peptide is subjected to binding with a carrier.
  • the carrier to which the peptide is bound can be embedded in a living body as it is, in addition to being applied or sprayed.
  • the peptide-bound carrier can be used alone or together with other medicinal ingredients as a suture, various orthopedic materials, a wound adhesion promoter, and the like.
  • a mixture of a carrier protein bound with a peptide and other materials such as a carbonate carbonate and a cell adhesive protein not bound with the peptide of the present invention can be used as a bone substitute or the like.
  • the amount of the peptide contained in the final biomaterial such as bone substitute is not particularly limited, but is usually about 0.1 mg to 10 mg per 1 Og of the biomaterial.
  • the peptide used in the present invention is composed of amino acids that constitute a natural protein, and is degraded to amino acids by the action of a peptide in vivo. , High safety. In fact, no toxicity was observed in in vivo experiments using mice performed in the following examples. This indicates that no toxic effects were observed at the doses that exert their efficacy.
  • Example 2 Angiogenesis in cultured vascular endothelial tissue cultured three-dimensionally
  • Rat vascular endothelial cells were three-dimensionally cultured in the presence of AGP synthesized in Example 1. This operation was specifically performed as follows. The cells used were transformed rat lung en dothe lia l ce l l s (TRLEG cells). TRLEG cells were seeded in a collagen I layer mixed with a peptide solution at a concentration of 10 g / ml, and cultured in a carbon dioxide incubator for 14 days. Controls were performed with the factor (-) and the protein VEGF (+), conventionally known as an angiogenic factor.
  • Polarity is the property of cells having a part that shares functions such as the head and tail.Even if endothelial cells are cultured normally, they have no polarity and thus do not form a lumen. It indicates that The tube formation length was significantly better with AGP than with VEGF. These results indicate that AGP has the effect of adhering cells to each other and forming a lumen in the tissue composed of cultured endothelial cells (in vivo, this lumen becomes a blood vessel). ) was confirmed.
  • Example 3 Comparative Example 1 In Vivo Angiogenesis by DAS Atssay
  • a solution obtained by dissolving a peptide at a concentration of 10 g / ml in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) used as a cell culture solution was obtained.
  • a microcell consisting of a cylinder with a diameter of 0.45 solid covered with a Mill ⁇ ⁇ ⁇ re filter (trade name) is embedded in the back of the mouse.
  • the peptide solution such as AGP and VEGF solution were injected into the microcell.
  • phosphate buffer (PBS) alone containing no peptide was also used as a control (Comparative Example 1). Five days later, the state of the tissue around the microcell was observed with a microscope.
  • AGP1 is obtained by substituting Ala at position 1
  • AGP7 is obtained by substituting Ala at position 7, and parentheses indicate the above-mentioned angiogenesis magnitude. From the above results, at least N-end of AGP The ends and the c-terminus proved to be unnecessary for angiogenic effects. Therefore, it was revealed that the use of the N-terminus or C-terminus of AGP as a carrier binding site does not impair the angiogenesis effect.
  • FreAlagin AD type (Miyagi Chemical Industry Co., Ltd., molecular weight 2000 to 20000), which is a gelatin obtained by partially hydrolyzing animal-derived collagen and removing allergens, was used.
  • the FreAlagin AD type has been approved for clinical use.
  • FreAlagin AD carrier protein
  • Mi 11 iQ water 100 mg was dissolved in 2.5 mL of Mi 11 iQ water.
  • 1.20-1.32 mg of AGP was dissolved in 1 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) and added to the carrier protein under ice-cooling.
  • Glutaraldehyde (25% solution in 0.1 M phosphate buffer
  • Rat vascular endothelial cells were three-dimensionally cultured in the presence of AGP-bound gelatin synthesized in Example 10. This operation was specifically performed as follows. Transformed rat lung endothelial eel Is (TRLEG cells) was used as the cells. Peptide AGP-conjugated gelatin (conjugate) and collagen type I are mixed at a ratio of 1:10, and TRLEG cells are seeded in a conjugate-collagen mixed solution mixed layer at a concentration of 10j «g (microgram) / ml. The cells were cultured in a carbon dioxide incubator for 14 days. The control used was a factor (-), and the other protein VEGF (+), which is conventionally known as an angiogenic factor.
  • TRLEG cells Transformed rat lung endothelial eel Is
  • Peptide AGP-conjugated gelatin (conjugate) and collagen type I are mixed at a ratio of 1:10, and TRLEG cells are seeded in a conjug
  • the control revealed no lumen at all. won.
  • the AGP conjugate and VEGF formed a lumen, and the cells surrounding this lumen were adhered. Further, when the lumen was observed with an electron microscope at a magnification of 7000 times, it was confirmed that a plurality of microvilly (fine cell projection) forces were formed on the inner wall of the lumen. Further, at a magnification of 15,000, the junction of the endothelial cells surrounding the lumen was observed. As a result, a region where the endothelial cells were firmly connected, that is, a tight junction was observed. The tube formation length was significantly better for the AGP conduit than for VEGF. From these results, the AGP conjugation has the effect of adhering cells to each other and forming a lumen between them in a tissue composed of cultured vascular endothelial cells. ) Was confirmed.
  • Example 11 Comparative Example 3 Angiogenesis by ASnV ivo by DAS assay
  • AGP conjugate (produced in Example 10) at a concentration of 100 ig / ml was dissolved in collagen I at a ratio of 1:10 to obtain a peptide-bound gelatin-collagen mixed solution having a concentration of 10j «g / ml.
  • a microcell composed of a cylinder having a diameter of 0.45 and covering the upper and lower cylinders with a Millipore filter-1 (trade name) in the back of a mouse
  • the above-mentioned AGP conjugate and VEGF solution were injected into the microcell.
  • a phosphate buffer (PBS) containing no peptide alone was also injected (Comparative Example 3). After 5 he observed the structure around the microcell with a microscope.
  • Example 18 is a D amino acid and means the D form of Tyr.
  • the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 9 to 11 has very excellent angiogenic activity, and particularly, the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is particularly excellent in the blood vessels. It was found to have a neoplastic activity. Further, it was revealed that a peptide having another amino acid sequence at the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 also has excellent angiogenic activity.
  • the angiogenic agent of the present invention has a strong angiogenic action and is useful for implanting a living body substitute material such as an artificial bone or the like and an artificial organ in the body and repairing the organ. It is also useful for the treatment of ischemic diseases such as myocardial infarction, cerebral infarction and obstructive aortic sclerosis, which account for a large part of lifestyle-related diseases.

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Description

明細書
血管新生剤
技術分野
本発明は、 血管を新生させる作用を有する血管新生剤に関する。 本発明の血管 新生剤は虚血性疾患の治療のみならず人工骨等の生体代用材料を用いた臓器の再 生■修復にも有用である。
背景技術
現在日本人の死因として、 心筋梗塞、 脳梗塞など血管の閉塞に起因する虚血の ためにおこる疾患がかなり多数を占めている。 また、 死因とならないまでも閉塞 性大動脈硬化症のように下肢の切断を余儀なくされ、 Q0L (生活の質） の損なわ れる疾患も見られる。 これらの虚血性疾患に対しては、 新たに血管を形成するこ とによる血管新生療法に大きな期待が寄せられている。 血流が乏しいことによる 虚血性疾患の治療に加えて、 血管新生は生体材料の生着にも重要な役割を果たし ている。 従来より、 骨補填材またインプラント材として、 アパタイトやチタン等 が用いられている。 これらの従来の生体材料は、周囲の軟'硬組織との親和性が良 くないために本来の機能が十分発揮できない場合が多い。
周囲の軟■硬組織との親和性を良好にするために、 生体接着機能性分子べプチ ドを用いることが提案されている。 例えば、 生体硬組織の組成■結晶性に類似し た炭酸アバタイトと、 生体接着機能性分子ペプチドの 1つであるコラーゲンとを 混合した複合体を代用骨として用いることが提案されている （K. Nokihara et a I. , The Japanese Peptide Society, Osaka, 373-376, 2001.， Development of B i om i met i c Materials: Novel Composite Material Carrying Immobilized Func tional Peptides; . Okazaki et al. , Dentistry in Japan, 37, 95-100, 2001, A New Concept of C03 apatite-Col lagen Composites with Adhesion Motif as B i omater i a I s. )。 この複合体は生体親和性が良好であり、 バイオミメティック な代用骨として有望である。
もし、 このような生体材料表面， 内面に血管が新生されれば、 移植生体材料の 表面， 内面の細胞へ術後早期に豊富な血液により栄養、 酸素が十分に供給され、 細胞の機能を発揮するのに最適の環境が形成され、 その結果、 生体と良好な生着 性が得られるため好都合である。
一方、 副作用を含む安全性、 代謝性等で大きな利点を有するペプチドはデザィ ンが容易であり高効率な合成法や検定法が確立されている。 加えてアミノ酸誘導 体はコンビナ卜リアルケミカルライブラリー構築の都合よいビルディングュニッ トであり、 固相合成法によって短時間で構造の最適化が可能である。 従って、 も し、 血管新生作用を有する比較的分子量の小さいペプチドが存在すれば、 これを 合成し、 単独投与あるいは生体材料に結合することにより、 生体材料が接する周 囲の軟■硬組織との相互作用をより良好にすることができ有利である。 しかしな がら、 顕著な血管新生作用を有する低分子のペプチド、 あるいはペプチドミメテ ィックな有機化合物はほとんど知られていない。
発明の開示
従って、 本発明の目的は、 血管新生作用を有するペプチドを見出し、 それを有 効成分として含む、 ヒ卜の治療等の臨床使用が可能な新規な血管新生剤を提供す ることである。
本願発明者らは、 鋭意研究の結果、 特定のアミノ酸配列を有するペプチドが、 血管新生作用を有することを見出し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有するぺ プチド又は該配列において、 1個〜 3個のアミノ酸が置換し、 若しくは一方若し くは両方の端部に位置する 1個若しくは 2個のアミノ酸が欠失し、 若しくは前記 ァミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のァミノ酸配列が付加されたアミノ 酸配列を有するぺプチドであって血管新生作用を有するぺプチドを含む血管新生 剤を提供する。
本発明により、 強い血管新生作用を有するペプチドが見出され、 それを有効成 分として含む新規な血管新生剤が初めて提供された。 本発明の血管新生剤は、 人 ェ骨等の生体代用材料を用いた臓器の再生 '修復や、生活習慣病として大きな部 分を占める心筋梗塞、 脳梗塞、 閉塞性大動脈硬化症などの虚血性疾患の治療にも 有用である。 発明の実施の形態
下記実施例で具体的に示されるように、 本願発明者らは、 配列番号 1に示され るアミノ酸配列を有するヘプタぺプチドが血管新生作用を有することを見出した。 従って、 本発明の血管新生剤の好ましい一例では、 配列番号 1に示されるァミノ 酸配列を有するヘプタぺプチドを有効成分として含む。
一般に、 生理活性を有するペプチドにおいて、 そのアミノ酸配列のうち、 1若 しくは複数のァミノ酸が置換し若しくは欠失し、 若しくは該ァミノ配列に 1若し くは複数のァミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、 該生理活性 が維持されることがあることは周知である。 従って、 配列番号 1に示されるアミ ノ酸配列において、 1個〜 3個のアミノ酸が置換し、 若しくは一方若しくは両方 の端部に位置する 1個若しくは 2個のァミノ酸が欠失し、 若しくは前記ァミノ酸 配列の一方若しくは両方の端部に他のァミノ酸配列が付加されたァミノ酸配列を 有するペプチド （以下、 便宜的に 「修飾ペプチド」 と呼ぶことがある） であって 血管新生作用を有するペプチドも本発明の範囲に含まれる。 なお、 ここで、 「修 飾ペプチド」 に含まれるアミノ酸は、 天然のタンパク質を構成するアミノ酸に限 定されるものではなく、 天然のアミノ酸を化学修飾 （例えば、 アミノ酸の側鎖に ニトロ基やハロゲンを導入する等） して得られるアミノ酸も包含される。 また、 D型アミノ酸であってもよい。 下記実施例で具体的に確認されたように、 配列番 号 1で示されるアミノ酸配列の N末端又は C末端の 1アミノ酸を欠失したァミノ 酸配列を有するぺプチドは、配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有するぺプチ ドと何ら遜色のない血管新生効果を発揮するものであり、 本発明の好ましい形態 である。 下記実施例で具体的に記載するように、 配列番号 1の 4番目のチロシン をァラニンに置換したペプチド （配列番号 8 ) では血管新生作用が失われたので、 4番目のチロシン残基は重要であると考えられ、 その側鎖の化学構造が大幅に変 更されるような置換はしない方が好ましい。 もっとも、 天然の L型の T y rでな くても D型あるいはチロシンの側鎖のフエノールリングにハロゲンやニトロ基を 入れたものなどが通常 T y rの置換体としてメデイシナルケミストリーで分子設 計され、 より強い効果や同等の効果を発揮する場合がしばしばあることが知られ ている。 また、 側鎖に芳香環を有する他のアミノ酸 （例えばフエ二ルァラニンな ど） でも同等の効果を発揮するであろうと考えられ、下記実施例に具体的に記載 するように、 4番目のチロシンをフエ二ルァラニンで置換したペプチドは、 より 優れた効果を発揮することが確認された。 従って、 修飾ペプチドのうち、 好まし いものとして、 配列番号 1に示すアミノ酸配列において、 1個若しくは 2個のァ ミノ酸が置換し、 若しくは一方若しくは両方の端部に位置する 1個のァミノ酸が 欠失し、 若しくは前記ァミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のァミノ酸配 列が付加されたァミノ酸配列を有するペプチドであって、 4番目のァミノ酸残基 がチ口シン残基又は側鎖に芳香環を有するアミノ酸、好ましくはフ； L二ルァラ二 ンである血管新生作用を有するペプチドを挙げることができる。 なお、 ここで、 「側鎖に芳香環を有するアミノ酸」 は必ずしも天然のタンパク質を構成するアミ ノ酸に限定されるものではなく、 上記のようにチロシン又はフエ二ルァラニンの 芳香環にニトロ基、ハロゲン、炭素数 1〜5のアルキル基及び炭素数 1〜5のァシ ル基から成る群より選ばれる少なくとも 1種の置換基を結合させたチロシン又は フエ二ルァラニン誘導体も包含される。 置換基が存在する場合、 芳香環、 好まし くはベンゼン環上に置換する置換基の数は、 "！〜 5個であり、 1 ~ 3個が好ましい。 また、 「芳香環 Jは好ましくはベンゼン環又はベンゼン環を含むナフタレン環のよ うな縮合環 （複素環でもよし、）であり、特に好ましくはべンゼン環である。
下記実施例に具体的に記載されるように、 本願発明者らは、配列番号 1の第 4 番目のチロシンをフヱニルァラニンに置換した、 配列番号 9で示されるアミノ酸 配列を有するぺプチドが、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有するぺプチド よりもさらに優れた血管新生効果を有することを見出した。 なお、フェ二ルァラ ニンは、側鎖に芳香環 (ベンゼン環） を有するアミノ酸である。 したがって、 本発 明の好ましい形態として、配列表の配列番号 9で示されるァミノ酸配列を有する ペプチド又は該配列において、 一方若しくは両方の端部に位置する 1個のアミノ 酸が欠失し、 若しくは前記ァミノ酸配列若しくは前記ァミノ酸配列の一方若しく は両方の端部に位置する 1個のァミノ酸が欠失したァミノ酸配列の一方若しくは 両方の端部に他のァミノ酸配列が付加されたァミノ酸配列を有するぺプチドであ つて血管新生作用を有するぺプチドを含む血管新生剤を挙げることができる。 血管新生作用を有する領域は、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列中に含まれ るので、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有するぺプチド又はその一部のァ ミノ酸が置換若しくはその端部領域が欠失した、 血管新生作用を有する修飾ぺプ チドの一端又は両端に他の任意のアミノ酸配列が付加されていてもそのべプチド は血管新生作用を発揮し得る。 このことは、 フイブロネクチンやラミニン等の細 胞接着性べプチドの細胞接着作用が RGDという僅か 3つのアミノ酸から成る領域 や、 YI GSRという僅か 5つのアミノ酸から成る領域等により発揮されるものであ ることからも類推できる。 従って、 血管新生活性を有する領域は、 配列番号 1に 示されるアミノ酸配列中に含まれるので、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列を 有するぺプチド又はその一部のアミノ酸が置換若しくはその端部領域が欠失した、 血管新生作用を有する修飾べプチドの一端又は両端に、 長いアミノ酸配列が付加 されている場合であっても、 上記べプチド又は修飾べプチド領域が相互作用のた めに露出している限りは血管新生作用を発揮するものと考えられる。 なお、 現在 では、 人工ペプチドの立体構造は、 その一次配列から、 市販のコンピュータ一ソ フトを用いて容易に予測することができるので、 サイズの大きなぺプチドであつ ても、 上記べプチド又は修飾べプチド領域が露出するべプチドは容易にデザイン できる。
従って、 本発明に用いられるぺプチドのサイズの上限は何ら限定されるもので はないが、 あまりに大きいと製造が困難となり、 取り扱いが不便であり、 また、 単位重量当たりの血管新生活性が減少すると考えられるので、 ぺプチドの総アミ ノ酸数は、 通常、 4〜3 5 0、 好ましくは 4〜5 0、 さらに好ましくは 5〜2 0、 さらに好ましくは 5〜 1 0であり、さらに好ましくは 6〜 1 0である。 また、 配 列番号 1〜 7及び 9〜 1 1のいずれかに示すァミノ酸配列又は該ァミノ酸配列の 一方若しくは両方の端部にそれぞれ 1 0個以下のアミノ酸が付加されたべプチド も好ましい。 例えば、 配列番号 1 2及び 1 3に示すアミノ酸配列は、 配列番号 1 に示すァミノ酸配列のいずれか一端に他のァミノ酸配列を付加したべプチドであ るが、いずれも優れた血管新生活性を有することが確認されている。 なお、 配列 番号 1のみならず、 配列番号 2〜 7及び 9 ~ 1 1に記載したアミノ酸配列を有す るペプチドが血管新生作用を有することは下記実施例において具体的に確認され ているので、 これらはいずれも好ましい例である。
なお、 ペプチドが血管新生作用を有するか否かは、 下記実施例に具体的に示す ように、 ペプチド溶液を充填したマイクロセルをマウスの背部に埋め込み、 埋め 込んだ周囲の組織内の毛細血管の形成状況を観察することによリ調べることがで さる。
上記べプチドは、 手動あるいは市販のぺプチド合成機を用いる常法によリ容易 に合成することができる。 また、 サイズの大きなペプチドは、 常法により、 遺伝 子工学的に製造することができる。
上記ペプチドは、 単独で、 又は生理緩衝液中に溶解した注射液等の形態で、 血 管新生が望まれる組織に局所投与することができる。 手術や外傷により生じた創 傷等の近傍に本発明の血管新生剤を、 注射や塗布、 噴霧等の方法により局所投与 することにより、 血管新生が促進され、 創傷の治癒が促進される。 ここで、 注射 又は塗布若しくは噴霧等に用いるペプチド溶液中のペプチド濃度は、 特に限定さ れないが、 通常、 l〜10 g (マイクログラム） Zm L程度である。 また、 投与量 は、 傷などの大きさや深さにより適宜選択できるが、 傷全体がペプチド溶液で被 覆される程度でよい。 また、 傷が治癒するまで、 1曰〜数日毎に 1回〜数回投与 することができる。 また、 注射液には、 他の消毒剤や消炎鎮痛剤など、 通常、 傷 の治療薬に含まれる種々の成分を含んでいてもよい。
また、 ペプチドをキャリアに結合し、 ペプチドが結合されたキャリアを生体に 埋め込むことによリ血管新生を促進することもできる。 これはキヤリァに固定化 している為に必要な部位に選択的に作用させることができ、 新たな DDS (ドラッ グデリバリーシステム） としての可能性に富んでいる。 生体材料移植部に本発明 の血管新生剤を、 塗布、 噴霧等の方法により局所投与することにより、 血管新生 が促進され、 術後の治癒が促進される。 ここで、 キャリアとしては、 特に限定さ れるものではなく、 代用骨や代用歯、 人工臓器等に用いられる樹脂や、 タンパク 質等の生体高分子を挙げることができる。 樹脂に上記べプチドを結合することに より、 該樹脂を生体に埋め込んだ際に、 樹脂と接する周辺組織中での血管新生が 促進され、 樹脂の生体との親和性がより向上する。 また、 より好ましい態様とし て、 タンパク質 （本明細書において、 特に断りがない限り 「タンパク質」 という 語は、 糖タンパク質やリンタンパク質等のタンパク質含有複合体を包含する） を キャリアとして用いるができる。
ここで、 キャリアとして用いるタンパク質は、 生体適合性を有するいずれのタ ンパク質であってもよく、 とりわけ、 生体組織との接合を良好にするために、 細 胞接着性タンパク質であることが好ましい。 細胞接着性タンパク質の好ましい例 として、 コラーゲン （ゼラチン） 、 フイブロネクチン、 ビトロネクチン及びラミ ニン等並びにこれらの部分加水分解物を挙げることができるがこれらに限定され るものではない。 なお、 これらのタンパク質は、 アレルゲンを除去した精製タン パク質であることが、 アレルギー反応の防止の観点から好ましい。 例えば、 コラ 一ゲンとしては、 動物由来のコラーゲンが種々市販されているが、 これらは純度 が低く、 アレルゲンが含まれており、 品質の再現性も劣るので臨床用途に適用す ることは好ましくない。 動物由来のコラーゲンを部分加水分解し、 アレルゲンを 除去したゼラチンが臨床用途のために市販されているので、 このような精製され たコラーゲン又はその部分加水分解物を用いることが好ましい。
キャリアに結合されるペプチドの量は、 特に限定されず、 適宜選択することが できるが、 通常、 キャリアとペプチドの重量比率 （キャリア：ペプチド） が 1 0 0 ： 1〜 1 ： 1程度であり、 好ましくは 2 0 ： 1〜5 ： 1程度である。
キャリアとペプチドとの結合は、 共有結合によることが好ましい。 結合は、 例 えばぺプチドの N末端のァミノ基と、 キャリア中の任意のアミノ基をダルタルァ ルデヒド等の結合架橋剤を用いて結合することにより容易に行うことができ、 下 記実施例に詳細な結合方法の一例が記載されている。 また、 人工臓器等の樹脂に 結合する場合には、 この樹脂中に、 アミノ基等の、 ペプチドとの結合に用いるこ とができる基を含むモノマーを共重合させておき、 当該アミノ基等とぺプチドの N末端のアミノ基を結合することができる。 また、 配列番号 1に示されるァミノ 酸配列を有するぺプチド又はその一部のアミノ酸が置換若しくは欠失した、 血管 新生作用を有する修飾べプチドの一端又は両端に、 任意のアミノ酸配列を有する 他のぺプチドを結合したものを採用し、 この任意のぺプチドをキャリアとの結合 に供することも好ましい。
ぺプチドを結合したキャリアは、 塗布又は噴霧する他にそのままで生体内に埋 め込むことができる。 キャリアとして、 細胞接着性タンパク質を採用した場合に は、 ペプチド結合キャリアは、 縫合糸、 各種整形手術材料、 傷口の癒着促進剤等 として単独又は他の薬効成分とともに用いることができる。 また、 ペプチドを結 合したキャリアタンパク質を、 炭酸アバタイ 卜や、 本発明のペプチドを結合して いない細胞接着性タンパク質等の他の材料と混合したものを代用骨等として用い ることができる。 この場合、 代用骨等の最終の生体材料中に含まれるペプチドの 量は、 特に限定されないが、 通常、 生体材料 1 O O g当たり、 0.1mg〜10 mg程 度である。
本発明に用いられるぺプチドは、 天然のタンパク質を構成するアミノ酸によ つて構成されているものであり、 生体内ではべプチダーゼの作用を受けてやが てはアミノ酸に分解されるものであるので、 安全性が高い。 実際、 下記実施例 で行った、 マウスを用いた in vivoの実験において、 毒性は全く観察されなかつ た。 このことは、 薬効を発揮する使用量において、 毒性が認められなかったこ とを示している。
実施例
以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
実施例 1 ペプチドの合成
Fmoc化学による高効率固相法 (K. Nokihara et al. , Innovation and Perspe ctives in Sol id-Phase Synthesis 1992, ed. , R. Epton, Intercept Limited, Andover, UK, 445-448, 1992, Desi n and Applications of a Novel Simultane ous Multiple Solid-Phase Peptide Synthesizer; 軒原清史、 有機合成化学協会 52, 347-358, 1994, 高効率ペプチド合成： 多種品目同時自動合成とぺプチ ドライブラリー） に基づき、 ペプチド自動合成機を用いて配列番号 1に示される アミノ酸配列を有するヘプタペプチド (AGP (angiogenic peptideの略）と命名） を合成した。 得られたペプチドを、 液体クロマトグラフィー結合質量スぺクトル
(LCMS)システムで検定し、 高純度であることを確認した （単一成分、 質量理論値 と一致） 。
実施例 2 三次元培養された血管内皮培養組織中での血管新生作用
実施例 1で合成した AGPの存在下でラッ卜の血管内皮細胞を三次元培養した。 この操作は具体的には次のようにして行った。 細胞は transformed rat l ung en dothe l i a l ce l l s (TRLEG細胞 ）を用いた。 10 g/m lの濃度のペプチド溶液混和 コラーゲン I 層 中に TRLEG細胞を播種し、 14日間の炭酸ガスインキュベータ一 中で培養した。 コントロールは因子 (-）と従来より血管新生因子として知られて いるタンパク質 VEGF (+)で行った。
14日後に培養細胞を顕微鏡で観察したところ、 コントロールはまったく管腔 を形成しなかった。 AGPと VEGFは管腔を形成し、 この管腔を囲包する細胞同士 が接着されていた。 さらに、 倍率 7 0 0 0倍で電子顕微鏡で管腔部分を観察した ところ、 管腔の内壁にマイクロビライ （微細細胞突起） が複数個形成されている ことが認められた。 さらに、 倍率 1 5 0 0 0倍で、 管腔を取り囲む血管内皮細胞 同士の接合部分を観察したところ、 内皮細胞同士が堅固に結合されている領域、 すなわち、 タイトジャンクション （密着結合） が認められた。 これらの所見は内 皮細胞が極性を獲得して、 管腔を形成したことを示す。 なお、 極性というのは細 胞が頭と尻尾のような機能分担する部分をもつ性質で、 内皮細胞を通常培養して いても極性はなく、 したがって管腔も作らないので、 このペプチドで誘導された ことを示している。 管腔形成長さは有意に AGPの方が VEGFより優れていた。 こ れらの結果から、 AGPには血管内皮培養細胞から構成される組織中に、 細胞同士 を接着させてそれらの間に管腔を形成する作用 （生体内では、 この管腔が血管に なる） があることが確認された。
実施例 3、 比較例 1 DASアツセィによる i n V i voでの血管新生作用
細胞培養液として用いられる DMEM (ダルベッコ修飾イーグル培地） 中に 10 g /m lの濃度のプチドを溶解した溶液を得た。 直径 0. 45固の円筒の上下を M i l l ί ρο reフィルター （商品名） で塞いで構成されるマイクロセルをマウスの背部に埋 め込んだ後、 マイクロセル内に上記 AGP等のぺプチド溶液や VEGF溶液をィンジェ クシヨンした。 また、 対照として、 ペプチドを含まないリン酸緩衝液 （PBS ) 単独もインジ: i:クシヨンした （比較例 1 ) 。 5日後に、 マイクロセル周辺の 組織の様子を顕微鏡で観察した。
その結果、 AGP溶液をインジェクションしたマイクロセルに接していた組織で は、 枝分かれした毛細血管が多数形成されていた。 一方、 P BSのみを投与した 比較例 1 (コントロール） では、 このような毛細血管の生成は全く認められなか つた。 この結果をマグニチュードで示すと AGPでは 5 (マグニチュード 5を以下、 「M5」 のように表記する） 、 コントロールでは MO、 比較のために用いた既知 の血管新生タンパク質 VEGFでは M3であった。 なお、 マグニチュードは、 スパ ィラル化した血管新生数であり、 M0が 0本、 M1が 1-10本、 M2力 11 - 20本、 M3 が 21 - 30本、 M4が 31-40本、 M5が 41-50本、 M6が 51本以上であることを示す。 従って、 マグニチュード Mが大きいほど血管新生作用が大きい。 上記結果から、 AGPの in vivoにおける強い （顕著な） 血管新生作用が確認された。
実施例 4〜9、 比較例 2
AGPを構成する 7個のアミノ酸のうちの 1個をァラニンに置換した、 合計 7種 類のへプタペプチド （配列番号 2〜8) を実施例 1と同様にして合成した。 各へ プタぺプチドについて、 実施例 3に記載した DASアツセィによリマウス体内にお ける血管新生作用を調べた。
その結果、 配列番号 1の 4番目のチロシンをァラニンに置換したペプチド （配 列番号 8、 比較例 2) では、 比較例 1と同様、 スパイラル化した血管新生作用が 全く認められなかったが、 他のペプチド （配列番号 2〜7、 実施例 4〜9) では、 AGPと同等又はそれ以上の新生血管が形成されており、 明らかな血管新生作用が 認められた。 血管新生能をマグニチュード Mで表記すると、 コントロール （ぺプ チドなし） 震'、 AGP (M5)、 AGP1 (M5)、 AGP2 (M3)、 AGP3 ( 2)、 AGP4 (MO)、 AGP5 ( 3)、 AGP6(M4)、 AGP7(M6)であった。 なお、 ここで、 AGP1は 1位を Alaで置換し たもの、 以下同様で AGP7は 7位を Ala 置換したものであり、 括弧内は上記し た血管新生マグニチュードを示す。 上記結果から、 AGPのうち、 少なくとも N末 端と c末端は、 血管新生作用にとって必要ではないことが明らかになった。 従つ て、 AGPの N末端又は C末端を、 キャリアとの結合部位として利用しても血管新 生作用が損なわれないことが明らかになった。
実施例 1 0 ペプチドのキャリアタンパク質への結合
キャリアタンパク質として、 動物由来コラーゲンを部分加水分解し、 アレルゲ ンの部分を除去したゼラチンである FreAlagin ADタイプ （宮城化学工業株式会 社製、 分子量 2000〜20000) を用いた。 FreAlagin ADタイプは、 臨床での使用が 認められているものである。
FreAlagin AD (キャリアタンパク質） 100 mgを 2.5 mL の Mi 11 iQ水に溶解し た。 AGP 1.20-1.32 mgを 0.1 M リン酸緩衝液 （pH 7.0) 1 mL に溶解し，キヤリ ァ蛋白質に氷冷下で加えた。 グルタルアルデヒド（25%溶液を 0.1 Mリン酸緩衝液
(pH 7.0)で 10倍に希釈し、 0.15 mLを得られた混合物に滴下 （4°C) 、 反応混合 物を 4°Cで 3〜4 時間攪拌した。 これにより、 AGPの N末端のァミノ基と、 キヤ リアタンパク質のァミノ基が共有結合された。
完全な結合の確認は薄層クロマトグラフィー （TLG) で原料消失にて行った。 反応混合物は 5%酢酸を溶出液とし G10カラム （フアルマシア社製） で脱塩した。 主ピークを凍結乾燥しほぼ定量的に結合物を得た。
実施例 1 1 AGP結合ゼラチンの三次元培養された血管内皮培養組織中での血 管新生作用
実施例 1 0で合成した AGP結合ゼラチンの存在下でラッ卜の血管内皮細胞を三 次元培養した。 この操作は具体的には次のようにして行った。 細胞は transform ed rat lung endothel ial eel Is (TRLEG細胞）を用いた。 ペプチド AGP結合ゼラ チン （コンジュゲート） とコラーゲンタイプ Iを 1 : 10の割合で混和し、 10j«g( マイクログラム)/ mlの濃度にしたコンジュゲート■コラーゲン混和溶液混和層 中に TRLEG細胞を播種し、 14日間の炭酸ガスインキュベータ一中で培養した。 コ ントロールは因子 (-）で他は従来より血管新生因子として知られているタンパク 質 VEGF(+)を用いた。
14日後に顕微鏡で観察したところ、 コントロールはまったく管腔を形成しな かった。 AGPコンジュゲートと VEGFとは管腔を形成し、 この管腔を囲包する細 胞同士が接着されていた。 さらに、 倍率 7000倍で電子顕微鏡で管腔部分を観 察したところ、 管腔の内壁にマイクロビライ （微細細胞突起） 力複数個形成され ていることが認められた。 さらに、 倍率 1 5000倍で、 管腔を取り囲む血管内 皮細胞同士の接合部分を観察したところ、 内皮細胞同士が堅固に結合されている 領域、 すなわち、 タイトジャンクションが認められた。 管腔形成長さは有意に A GPコンジユゲー卜の方が VEGFより優れていた。 これらの結果から、 AGPコンジ ユゲー卜には血管内皮培養細胞から構成される組織中に、 細胞同士を接着させて それらの間に管腔を形成する作用 （生体内では、 この管腔が血管になる） がある ことが確認された。
実施例 1 1、 比較例 3 DASァッセィによる ί n V i voでの血管新生作用
100 ig/mlの濃度の AGPコンジユゲー卜 （実施例 1 0で作製） をコラーゲン Iに 1 ： 10の割合で溶解し、 10j«g/mlの濃度のプチド結合ゼラチンコラーゲン混和溶 液を得た。 直径 0.45國の円筒の上下を Mil l iporeフィルタ一 （商品名） で塞い で構成されるマイクロセルをマウスの背部に埋め込んだ後、 マイクロセル内に 上記 AGPコンジュゲートと VEGF溶液とをインジェクションした。 また、 対照とし て、 ペプチドを含まないリン酸緩衝液 （P BS) 単独もインジェクションした (比較例 3) 。 5曰後に、 マイクロセル周辺の組織の様子を顕微鏡で観察した。 その結果、 AGPコンジュゲート■コラーゲン混和溶液をインジェクションした マイクロセルに接していた組織では、 スパイラル化した毛細血管が多数形成され ていた。 一方、 P BSのみを投与した比較例 3では、 このようなスパイラル化し た血管の形成は全く認められなかった。 血管新生マグニチュードは、 対照は MO、 AGPは M 5、 VEGFは M 3であった。 この結果から、 AGPコンジユゲー卜の in viv oにおける血管新生作用が確認された。
実施例 1 2〜 2 1、 比較例 4〜 7
配列番号 9ないし 22に示すアミノ酸配列を有するぺプチドを合成し、 実施例 3と同様にして DASアツセィを行った。 結果を下記表 1に示す。 表 1
Figure imgf000014_0001
注 実施例 1 8 (配列番号 1 5 )の yは Dアミノ酸で Tyrの D体を意味する。 以上の結果から、 配列番号 9 ~ 1 1で示すアミノ酸配列を有するペプチドが非 常に優れた血管新生活性を有し、 とりわけ、配列番号 9で示すアミノ酸配列を有 するぺプチドが特に優れた血管新生活性を有することが明らかになった。 また、 配列番号 1で示すァミノ酸配列の N末端又は C末端に他のァミノ酸配列を有する ペプチドも優れた血管新生活性を有することが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明の血管新生剤は、 強い血管新生作用を有し、人工骨等の生体代用材料や 人工臓器の体内埋め込み及び臓器の修復に有用である。 また、生活習慣病として 大きな部分を占める心筋梗塞、 脳梗塞、 閉塞性大動脈硬化症などの虚血性疾患の 治療にも有用である。

Claims

請求の範囲
1 . 配列表の配列番号 1で示されるァミノ酸配列を有するぺプチド又は該配列 において、 1個〜 3個のアミノ酸が置換し、 若しくは一方若しくは両方の端部に 位置する 1個若しくは 2個のァミノ酸が欠失し、 若しくは前記ァミノ酸配列の一 方若しくは両方の端部に他のァミノ酸配列が付加されたァミノ酸配列を有するぺ プチドであって血管新生作用を有するぺプチドを有効成分として含む血管新生剤。
2. 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有するぺプチド又は該配列 において、 1個若しくは 2個のアミノ酸が置換し （ただし、 4番目のチロシン残 基はチロシン残基又は側鎖に芳香環を有するアミノ酸である） 、 若しくは一方若 しくは両方の端部に位置する 1個のァミノ酸が欠失し、 若しくは前記ァミノ酸配 列の一方若しくは両方の端部に他のァミノ酸配列が付加されたァミノ酸配列を有 するぺプチドであって血管新生作用を有するぺプチドを含む請求項 1記載の血管 新生剤。
3 . 前記側鎖に芳香環を有するアミノ酸が、フエ二ルァラニン又はそのべンゼ ン環に 1又は複数の置換基を有する化学修飾フ： I：二ルァラニンである請求項 2記 載の血管新生剤。
4 · 配列表の配列番号 9で示されるアミノ酸配列を有するぺプチド又は該配列 において、 一方若しくは両方の端部に位置する 1個のアミノ酸が欠失し、 若しく は前記ァミノ酸配列若しくは前記ァミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に位置 する 1個のアミノ酸が欠失したァミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のァ ミノ酸配列が付加されたァミノ酸配列を有するぺプチドであって血管新生作用を 有するぺプチドを含む請求項 1記載の血管新生剤。
5 . 配列表の配列番号 1ないし 7のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する ぺプチド又はこれらのァミノ酸配列のいずれかの一方若しくは両方の端部に他の ァミノ酸配列が付加されたァミノ酸配列を有するぺプチドであって血管新生作用 を有するぺプチドを含む請求項 2記載の血管新生剤。
6. 配列表の配列番号 9ないし 1 1のいずれかで示されるアミノ酸配列を有す るぺプチド又はこれらのアミノ酸配列のいずれかの一方若しくは両方の端部に他 のァミノ酸配列が付加されたァミノ酸配列を有するペプチドであつて血管新生作 用を有するぺプチドを含む請求項 2記載の血管新生剤。
7 . 配列番号 9で示されるアミノ酸配列を有するぺプチド又はこれらのァミノ 酸配列のいずれかの一方若しくは両方の端部に他のァミノ酸配列が付加されたァ ミノ酸配列を有するぺプチドであって血管新生作用を有するぺプチドを含む請求 項 6記載の血管新生剤。
8 . 前記べプチドの総アミノ酸残基数が 4〜 3 5 0である請求項 1ないし 7の ずれか 1項に記載の血管新生剤。
9 . 前記べプチドの総ァミノ酸残基数が 4〜 5 0である請求項 8記載の血管新 生剤。
1 0 . 前記ペプチドの総アミノ酸残基数が 5〜2 0である請求項 9記載の血管 新生剤。
1 1 . 前記べプチドは、 配列表の配列番号 1ないし 7のいずれかで示されるァ ミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部にそれぞれ 1 0個以下 のアミノ酸が付加されたべプチドである請求項 5記載の血管新生剤。
1 2 . 前記べプチドは、 配列表の配列番号 1ないし 7のいずれかで示されるァ ミノ酸配列を有する請求項 1 1記載の血管新生剤。
1 3 . 前記べプチドは、 配列表の配列番号 9ないし 1 1のいずれかで示される ァミノ酸配列又は該ァミノ酸配列の一方若しくは両方の端部にそれぞれ 1 0個以 下のアミノ酸が付加されたべプチドである請求項 1 2記載の血管新生剤。
1 4 . 前記べプチドは、 配列表の配列番号 9ないし 1 1のいずれかで示される アミノ酸配列を有する請求項 1 3記載の血管新生剤。
1 5 . キャリアに結合された形態にある請求項 1ないし 1 4のいずれか 1項に 記載の血管新生剤。
1 6 . 前記キャリアがタンパク質である請求項 1 5記載の血管新生剤。
1 7 . 前記キャリアタンパク質が、 細胞接着性タンパク質である請求項 1 6記 載の血管新生剤。
1 8 . 前記細胞接着性タンパク質がコラーゲン又はその部分加水分解物である 請求項 1 7記載の血管新生剤。
1 9 . 血管新生が所望される患者の部位に請求項 1ないし 1 8のいずれか 1項 に記載の血管新生剤を投与することを含む、 血管の新生方法。
2 0. 請求項 1ないし 1 8のいずれか 1項に記載のペプチド又はキャリアに結 合されたぺプチドの血管新生剤製造のための使用。
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