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WO2003031619A1 - Dispositif et procede de collecte d'acides nucleiques - Google Patents

Dispositif et procede de collecte d'acides nucleiques Download PDF

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Publication number
WO2003031619A1
WO2003031619A1 PCT/JP2002/005209 JP0205209W WO03031619A1 WO 2003031619 A1 WO2003031619 A1 WO 2003031619A1 JP 0205209 W JP0205209 W JP 0205209W WO 03031619 A1 WO03031619 A1 WO 03031619A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
solution
concentration
solid phase
speed
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/005209
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshinari Sakurai
Toshiaki Yokobayashi
Original Assignee
Hitachi, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi, Ltd. filed Critical Hitachi, Ltd.
Priority to JP2003534589A priority Critical patent/JPWO2003031619A1/ja
Priority to DE60230534T priority patent/DE60230534D1/de
Priority to US10/490,903 priority patent/US20040259093A1/en
Priority to EP02730752A priority patent/EP1437407B1/en
Publication of WO2003031619A1 publication Critical patent/WO2003031619A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the present invention mainly relates to a nucleic acid recovery apparatus for capturing a nucleic acid contained in a solution as a solid phase and recovering the nucleic acid from the solution, a nucleic acid recovery method, a nucleic acid-containing solution production method, and a nucleic acid-containing solution.
  • the present invention relates to a method for measuring a nucleic acid concentration.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. H11-1266664 discloses a method for automating nucleic acid extraction using a nucleic acid capturing chip having a built-in solid phase containing silicide force.
  • the nozzle tip is attached to the movable nozzle for sucking and discharging the liquid, and the binding promoter that promotes the binding of nucleic acid to the solid phase is sucked from the pot. To be discharged. Next, the nozzle tip is discarded, and a new nucleic acid capturing chip is attached to the movable liquid suction / drain nozzle. The mixed solution is sucked from the reaction container into the nucleic acid capturing chip.
  • the nucleic acid in the inhaled mixture is bound to the solid phase in the chip for capturing nucleic acid, and then the liquid in the chip for capturing nucleic acid is discharged.
  • the washing liquid in the washing container is sucked into the chip for capturing nucleic acid, and then discharged, thereby washing the solid phase and the inside of the chip for capturing nucleic acid to which the nucleic acid is bound.
  • the eluate is sucked into the nucleic acid capturing chip, and the eluate containing the nucleic acid released from the solid phase is discharged to the purified product container. Thereby, the nucleic acid can be purified from the nucleic acid-containing sample.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. H11-1266864 discloses that a nucleic acid capturing chip containing a solid phase is detachably connected to a movable nozzle for sucking and discharging a liquid, so that the flow of the mixed solution is controlled. This is a method that can improve the contact efficiency between the mixed solution and the solid phase and can be easily automated.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-515066 discloses a method using a housing containing a three-dimensional structure including a plurality of adsorptive particles in a porous polymer matrix.
  • Housing containing silica-filled membrane matrix There is an explanation about In this method, the housing is attached to the tip of a pipette, equilibrated with GuHCl or NaI, and then the DNA / GuHC1 solution (or NaI solution) is aspirated and transferred to the housing. DNA is bound to the built-in silica-filled membrane matrix for washing and elution.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-74757 discloses a method for automating nucleic acid extraction using a chip for nucleic acid capture containing a solid phase containing silicide force. A method is disclosed in which the pressure is measured to accurately determine solid phase degradation.
  • US Patent No. U.S. Pat. No. 6,175,409 discloses a method for applying a plurality of polymer samples to a mobile phase for analysis in high performance liquid chromatography or the like.
  • U.S. Patent No. U.S. Pat. No. 6,175,409 describes flowing a solution containing a plurality of polymer samples in one direction relative to a mobile phase at a predetermined speed.
  • U.S. Pat. No. 6,175,409 relates to high-performance liquid chromatography or the like in which the above solution flows in one direction with respect to a mobile phase, and does not relate to a device provided with a nucleic acid capturing chip.
  • the present invention relates to a nucleic acid recovery apparatus and a nucleic acid recovery method for recovering nucleic acids contained in a solution with high yield by using a solid phase in a nucleic acid capturing container, a method of adjusting a nucleic acid recovery apparatus, a nucleic acid production apparatus and a nucleic acid production method, or The purpose is to provide a method for examining nucleic acid concentration. Disclosure of the invention
  • the present invention mainly relates to a method for aspirating a nucleic acid-containing component from a nucleic acid-containing solution into a nucleic acid capturing container (for example, a tip) provided with a solid phase capable of capturing the nucleic acid.
  • the present invention relates to a nucleic acid recovery apparatus and a nucleic acid recovery method for capturing nucleic acid on the solid phase, separating nucleic acid captured on the solid phase, and recovering nucleic acid.
  • the recovery rate of the nucleic acid is improved by adjusting the discharge speed or the internal pressure in the container. That is, by controlling the contact state between the solid phase and the solution, the nucleic acid contained in the sample can be recovered with high yield.
  • FIG. 1 is a side view of a nucleic acid capturing chip having a solid phase therein.
  • FIG. 2 is a plan view of a work table in the nucleic acid purification device.
  • FIG. 3 is a perspective view of a main part of the nucleic acid purification apparatus.
  • FIG. 4 is a main part configuration diagram showing a state where a dispensing tip is attached to a dispensing nozzle.
  • FIG. 5 is a plan view of an essential part showing a state where the nucleic acid capturing chip 1 is attached to the liquid suction / discharge movable nozzle.
  • FIG. 6 is a schematic configuration diagram showing a state in which a dispensing tip is removed from a dispensing nozzle using a tip remover.
  • FIG. 7 ′ is a block diagram showing an electric system of the nucleic acid purification device.
  • FIG. 8 shows the amount of nucleic acid contained in the mixed solution before suction and the mixed solution after discharge when the discharge speed in step 2a was set to 500 n 1 / s and the suction speed was changed.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing a relationship with the amount of nucleic acid contained in the slab.
  • Fig. 9 shows that when the discharge speed in step 2a was set to 200 nl Z s and the suction speed was changed, the amount of nucleic acid contained in the mixed solution before suction and the mixed solution after discharge were changed.
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing a relationship with an amount of contained nucleic acid.
  • FIG. 10 shows that the suction speed in the step 2a was set to 500 l / s, FIG.
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing a relationship between the amount of nucleic acid contained in the mixed solution before suction and the amount of nucleic acid contained in the mixed solution after ejection when the suction speed is changed.
  • nucleic acid recovery apparatus and the nucleic acid recovery method the adjustment method of the nucleic acid recovery apparatus, the nucleic acid production apparatus and the nucleic acid production method, or the nucleic acid concentration inspection method according to the present invention will be described in more detail.
  • a nucleic acid capturing container as shown in FIG. 1 for example, a nucleic acid is captured by a solid phase 44 inside the chip 31, and the inside of the nucleic acid capturing chip 31 is washed using a washing solution. Then, a nucleic acid purifying apparatus for extracting a nucleic acid from the nucleic acid capturing chip 31 will be exemplified.
  • the present invention does not limit the technical scope to these modes.
  • the nucleic acid purification apparatus 100 includes two arms 16 and 33 movable in the directions indicated by arrows X in FIG. 2, a sample rack 12 and a chip. And a work surface 5 on which a rack 30 and the like are arranged.
  • the arms 16 and 33 are provided with drive control means (not shown) so that the arms 16 and 33 can be movably driven horizontally (in the direction indicated by the arrow X in FIG. 2) with respect to the in-plane direction of the work surface 5.
  • the drive control means (not shown) is provided so that the nozzle holders 17, 34 can be moved freely along the longitudinal direction of the arms 16, 33, and can be freely moved toward and away from the work table 5. And are connected respectively.
  • the arm 16 is provided with a nozzle holder 17 that holds the dispensing nozzle 36.
  • a dispensing tip 15 can be attached to the tip of the dispensing nozzle 36.
  • the dispensing nozzle 36 is connected to the syringe pump 10 via a flexible pipe 42.
  • the syringe pump 10 is connected to a pure water supply device (not shown). The inside of the syringe pump 10 and the pipe 42 are supplied from this pure water supply device. Filled with pure water.
  • the arm 33 is provided with a nozzle holder 134 for holding a movable nozzle 39 for sucking and discharging liquid.
  • a tip 31 for capturing nucleic acid can be attached to the tip of the movable nozzle 39 for sucking and discharging liquid.
  • the liquid suction / discharge movable nozzle 39 is connected to a syringe pump 32 via a flexible pipe 35.
  • the syringe pump 32 is connected to a pure water supply device (not shown). The inside of the syringe pump 32 and the pipe 35 is filled with pure water supplied from the pure water supply device.
  • the syringe pump 32 is a control means for controlling the pressure applied to the liquid suction / drainage movable nozzle 39, for example, a stepper motor 73, a control mechanism 65, a PC 60, a keypad 6 shown in FIG.
  • a desired pressure can be applied to the liquid suction / discharge movable nozzle 39 by the control means including 1, 1 and the CRT 62. Therefore, when the syringe pump 32 applies a predetermined pressure to the liquid suction / discharge movable nozzle 39, the nucleic acid capturing chip 31 attached to the liquid suction / discharge movable nozzle 39 is given a predetermined pressure in accordance with the pressure. The mixed liquid and the like can be sucked and discharged at a speed of.
  • the arms 16 and 33 are mounted at different heights so that they can cross each other when moving horizontally with respect to the in-plane direction of the work surface 5.
  • the work surface 5 includes a sample rack 12 for holding a plurality of sample containers 13, a container rack 23 for holding a plurality of processing containers 24, and a container storage for holding a plurality of purified product containers 26.
  • a rack 25, chip racks 14a, 14b, and 14c that hold a plurality of dispensing tips 15 and chip racks 30 that hold a plurality of nucleic acid capturing chips 31 are provided in a predetermined manner. It is located at the location.
  • the work surface 5 has a first reagent bottle 21 containing a predetermined reagent and a second reagent bottle 21.
  • the medicine bottle 22, the second reagent bottle 19, the fourth reagent bottle 102, and the fifth reagent bottle 20 are arranged at predetermined positions.
  • the first reagent bottle 21 is used in the first step described later
  • the second reagent pot 22 is used in the second a and second b steps described later
  • the third reagent bottle 19 is used in the third step described later.
  • the fourth reagent bottle 102 is used in a fourth step described below
  • the fifth reagent potter 20 is used in a fifth step described later.
  • the worktable 5 receives pure water discharged from the dispensing nozzle 36 during priming, and a liquid receiving portion 11 serving as a home position of the dispensing nozzle 36, and a liquid suction / drainage during priming.
  • the liquid receiving portion 28 serving as the home position of the movable nozzle 39 for receiving and discharging the pure water discharged from the movable nozzle 39 for liquid absorption and the nucleic acid capturing chip 31
  • a waste liquid port 29 for discharging the mixed liquid is provided.
  • the worktable 5 is provided with a chip remover 27 from which the dispensing chip 15 and the nucleic acid capturing chip 31 can be removed. Note that a chip disposal port 50 is formed below the chip remover 27.
  • the sample rack 12 can hold, for example, without limitation, 48 sample containers 13 in 8 rows and 6 columns.
  • the sample container 13 contains a nucleic acid-containing sample.
  • nucleic acid-containing samples include biological samples such as whole blood, serum, sputum, and urine, biological samples such as cultured cells and cultured bacteria, or nucleic acids and DNA amplified in gels after electrophoresis. Reaction products such as enzymes and substances containing nucleic acids in a partially purified state can be targeted.
  • the nucleic acid is meant to include a double-stranded, single-stranded, or partially deoxyliponucleic acid (DNA) and a liponucleic acid (RNA) having a double-stranded or single-stranded structure.
  • the container rack 23 adjusts the held processing container 2 to a desired temperature. It has a temperature control function for With this temperature adjustment function, the processing container 24 held in the container rack 23 and the mixed liquid stored in the processing container 24 can be maintained at a desired temperature.
  • the container storage rack 25 can hold, for example, but not limited to, 48 purified product containers 26 in 8 rows and 6 columns.
  • the purified product container 26 contains a purified solution obtained by purifying a nucleic acid component from a nucleic acid-containing sample.
  • the tip racks 14a, 14b and 14c have a plurality of openings for holding a plurality of dispensing tips 15 as shown in FIG. 5 has a box shape having a height such that the tip does not contact the work surface 5. That is, the plurality of dispensing tips 15 are held in a state where they are inserted into the openings of the tip racks 14a, 14b, and 14c, respectively.
  • the dispensing tip 15 When attaching the dispensing tip 15 to the dispensing nozzle 36, press the dispensing tip 15 into the tip of the dispensing nozzle 36.
  • the chip rack 30 can hold the nucleic acid capturing chip 31 shown in FIG. 1 in, for example, 8 rows and 6 columns.
  • FIG. 1 shows an example of a container for nucleic acid capture used in the present invention, which is a nucleic acid capture chip formed so that the inner diameter is gradually reduced from a head 54 toward a tip 48 located below.
  • the nucleic acid capturing container 31 includes a solid phase 44 capable of capturing nucleic acids, a space containing a mixed solution containing nucleic acids, and a suction and discharge of the mixed solution containing nucleic acids in the space. Any opening may be used as long as it has an opening for changing the internal pressure of the space.
  • the head 54 (pressure adjustment opening) of the nucleic acid capturing chip 31 can be fitted airtight to the tip of the dispensing nozzle 36 or can be press-fitted to the tip of the dispensing nozzle 36. It has an inside diameter of about 5.5 mm, for example. Also, solid phase The inside diameter of the space for accommodating 44 has an inside diameter of, for example, about 3.0 mm, and the inside diameter of the front end 48 (liquid suction / discharge opening) has an inside diameter of, for example, about 0.8 mm. I have.
  • the nucleic acid capturing chip 31 is formed by injection molding using a transparent or translucent synthetic resin such as polypropylene.
  • the nucleic acid capturing chip 31 is provided with disc-shaped blocking members 40a and 40b at intervals of, for example, about 3 mm.
  • the solid phase 44 is accommodated in the space to be sandwiched.
  • the blocking members 40a and 40b have a large number of holes through which liquids and gases can easily pass, and the holes are large enough to prevent the outflow of the solid phase 44. That is, the contained solid phase 44 is prevented from flowing out of the space interposed between the blocking members 40a and 4Ob.
  • the blocking members 40a and 40b for example, a cylindrical member having a diameter of about 3.1 mm and a height of about 2.0 mm formed by sintering quartz particles having a diameter of about 0.1 mm is used. can do.
  • polyvinylidene fluoride which has little non-specific adsorption of nucleic acid components and the like and has hydrophilicity can be used.
  • a material having hydrophilicity such as a polyvinylidene lip is used, non-specific adsorption of proteins and nucleic acids can be reduced, so that the purity and yield of nucleic acids can be increased.
  • Examples of the solid phase 44 include, but are not limited to, silica gel (manufactured by Toshiba Chemical Co., grade B, 6 to 12 m, 5 mg) and flint glass (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). Can be used. In this example, it is preferable to use stone wool. In addition, since flint glass has a high silica content having a nucleic acid capturing effect, nucleic acids can be purified in high yield. In addition, as the solid phase 44, other than the above, glass particles, silica particles, quartz filter paper, or their crushed materials or diatomaceous earth, silicon oxide, etc. Any substance can be used as long as it contains.
  • the first reagent bottle 21 contains a reagent capable of promoting the release of nucleic acid from the nucleic acid-containing sample.
  • the reagent include 2% Triton X-100 (manufactured by LKB) and 5.5 mol / L guanidine thiosuccinate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for biochemistry).
  • MES 2-raorpholino-ethanesul fonic acid: 2-morpholinoenosulfonic acid, manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories
  • the reagent preferably has a low viscosity.
  • RNA degrading enzyme When recovering RNA as nucleic acid, it is desirable to use a reagent to which an RNase inhibitor has been added or a guanidine thiosinate has been added in order to prevent the RNA from being degraded by RNA degrading enzyme.
  • the second reagent potter 22 contains a reagent containing a substance that promotes binding of nucleic acid to the solid phase 44.
  • a reagent generally called a force optic reagent can be used.
  • guanidine thionate, etc. it is desirable to add guanidine thionate, etc. as in the case of the reagent contained in the first reagent bottle 21.
  • the final concentration is 3 mo1 / L or more.
  • the pH is acidic.
  • the third reagent potter 19 contains a reagent capable of washing a substance that promotes the binding of the nucleic acid contained in the reagent contained in the second reagent bottle 22 while maintaining the binding of the nucleic acid to the solid phase 44. ing.
  • a reagent capable of washing a substance that promotes the binding of the nucleic acid contained in the reagent contained in the second reagent bottle 22 while maintaining the binding of the nucleic acid to the solid phase 44.
  • this reagent for example, a solution containing ethyl alcohol, isopropyl alcohol, or the like at a concentration of 70% or more can be used.
  • ethyl alcohol and isopropyl alcohol may adversely affect the use of recovered nucleic acids in PCR, etc., use as low a concentration as possible within the range that has the above-mentioned washing action. It is desirable to do. This perspective Therefore, as this reagent, it is preferable to use 50% ethyl alcohol containing 25% o
  • the fourth reagent bottle 102 is rinsed with ethyl alcohol or the like contained in the reagent contained in the third reagent pot 22, and the third reagent pot 22 Contains reagents that prevent the reagents contained in the container from being carried over to the next step. From this viewpoint, it is preferable to use 50 mmol ZL of potassium acetate as the reagent. Further, it is preferable to use this reagent at a liquid temperature of 20 ° C. or lower.
  • the fifth reagent potor 20 contains a mixed solution containing a substance having an action of eluting nucleic acids from the solid phase 44.
  • a mixed solution containing a substance having an action of eluting nucleic acids from the solid phase 44.
  • a water mixture having a low salt concentration or pure water can be used.
  • this mixed solution it is preferable to use, for example, a mixed solution containing 10 mmol ZL bicine (pH 8.5) and 0.1 band ol / LEDTA.
  • the chip remover 27 is formed of a plate-like member having a slit 55 at a predetermined height from the work surface 5.
  • the slit 55 is smaller than the outer diameter of the head 52 of the dispensing tip 15 and the head 54 of the nucleic acid capturing chip 31 and larger than the outer diameter of the dispensing nozzle 36. It is formed to have a width.
  • the personal computer as the operation control unit, the (PC) 60 has a keyboard 61 as an operation panel for inputting operating conditions and sample information, and a display for displaying input information and warning information.
  • a CRT 62 as a display device and a mechanism controller 65 for controlling each mechanism are connected.
  • the mechanism control unit 65 includes a stepping motor for driving a piston for causing the syringe pump 10 to perform a suction and discharge operation, and a stepping motor for driving a piston for causing the syringe pump 32 to perform a suction and discharge operation.
  • 7 2 Stepping pin motor for moving nozzle holder 17 horizontally and up and down 7 3
  • the AC servo motor 75 and the AC servo motor 76 for horizontally moving the arm 33 are controlled.
  • the mechanism control unit 65 controls the operation of the step damper 71 and the like in accordance with a predetermined program input to the PC 60.
  • the program may be input by the operator of the nucleic acid purification apparatus 100 using the keyboard 61 or the like, or may be selected from a plurality of programs recorded in the PC 60 in advance.
  • the nucleic acid purification apparatus 100 configured as described above has the following steps: a first step, a second a step, a second b step, a third a step, a third b step, and a fourth step. And through the fifth step, nucleic acid can be recovered (produced) from the nucleic acid-containing sample.
  • a nucleic acid containing sample such as a 1 0 6 I UZmL ⁇ l 0 2 I UZmL secondary standard hepatitis C serum was pricing in International Standard of WHO in serum of hepatitis C-negative An example in which a mixed solution whose concentration is adjusted by a factor of 10 will be described below.
  • the first step is a releasing step of releasing nucleic acids from the nucleic acid-containing sample.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the dispensing tip 15 is attached to the tip of the dispensing nozzle 36.
  • the syringe pump 10 is driven to suction 200 L of the nucleic acid-containing sample contained in the sample container 13 into the dispensing chip 15 and dispensed to the processing container 24.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the dispensing tip 15 used by the operation described with reference to FIG. 6 is removed using the tip remover 27.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and an unused dispensing tip 15 is attached to the tip of the dispensing nozzle 36.
  • the syringe pump 10 is driven, 700 L of the first reagent is drawn from the first reagent pot 21 into the dispensing tip 15, and the nucleic acid-containing sample is dispensed into the processing container 24. Discharge.
  • the syringe pump 10 is driven, and the mixed solution in the processing container 24 is suctioned and discharged five times using the dispensing tip 15 to sufficiently mix. Thereafter, it is preferable to leave it for, for example, 10 minutes.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the used dispensing tip 15 is removed by the tip remover 27.
  • the second step a and the second step b are a capturing step of bringing the mixed solution containing the released nucleic acid into contact with the solid phase 44 and adsorbing the nucleic acid ′ to the solid phase 44.
  • the arm 16 and the nozzle holder # 7 are driven, and an unused dispensing tip 15 is attached to the tip of the dispensing nozzle 36.
  • the syringe pump 10 is driven, 100 L of the second reagent is sucked into the dispensing tip 15 from the second reagent pot 22, and the mixture of the nucleic acid-containing sample and the first reagent is collected. Discharge into the processing container 24 that has entered.
  • the syringe pump 10 is driven, and the mixed solution in the processing container 24 is sucked and discharged five times using the dispensing tip 15 to mix well.
  • arm 3 3 and nozzle holder 1 3 4 And the nucleic acid capturing chip 31 is attached to the tip of the liquid suction / discharge movable nozzle 39.
  • the arm 33 and the nozzle holder 34 are moved to a processing container 24 containing a mixed solution containing the nucleic acid-containing sample, the first reagent, and the second reagent, and then the syringe pump 32 is driven. Then, the entire amount of the mixed solution is sucked into the nucleic acid capturing chip 31.
  • the sucked mixed solution is discharged into the processing vessel 24 until the blocking member 40b on the upper side of the nucleic acid capturing chip 31 does not exceed the upper surface of the mixed solution.
  • the mixture of the above is sucked to the position where the boundary between the mixture and the air does not exceed the lower blocking member 40a of the nucleic acid capturing chip 31.
  • the suction and discharge operations do not allow air to flow into the portion where the solid phase 44 is disposed, and always maintain a state filled with the liquid.
  • the mixed solution in the processing container 24 is sucked in its entirety into the nucleic acid capturing chip 31, and the blocking member 40 a is further mixed with the mixed solution and air.
  • the arm 33 and the nozzle holder 134 are driven to move the nucleic acid capturing chip 31 to the liquid receiving portion 29. I do.
  • the syringe pump 32 is driven to discharge the sucked mixed liquid to a position that does not exceed the holding member 40b, and waits for the next operation.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the unused dispensing tip 15 is attached to the dispensing nozzle 36.
  • the syringe pump 10 is driven to draw 800 / xL of the second reagent from the second reagent potter 19 into the dispensing tip 15 and the processing container containing the mixed solution is sucked. Discharge the entire amount to 2 4.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the used dispensing tip 15 is removed by the tip remover 27.
  • the arm 33 and the nozzle holder 34 are driven, and the nucleic acid capturing chip 3 1 is moved to the processing container 24 containing the second reagent.
  • the syringe pump 32 is driven, suction and discharge are repeated five times in the same manner as in the case of the above-mentioned mixed solution, and then the entire mixed solution in the processing container 24 is sucked.
  • a. Intake air until the boundary between the mixture and air does not cross.
  • the arm 33 and the nozzle holder 34 are driven, the nucleic acid capturing chip 31 is moved onto the liquid receiving portion 29, the syringe pump 32 is driven, and the sucked second reagent is transferred to the blocking member 4. Discharge to a position not exceeding 0 b and wait for the next operation.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and an unused dispensing tip 15 is attached to the dispensing nozzle 36.
  • the third step a and the third b step are washing steps for removing components other than nucleic acids and second reagents contained in the nucleic acid-containing sample from the nucleic acid capturing chip 31 and the solid phase 44. is there.
  • the syringe pump 10 is driven, 400 L of the third reagent from the third reagent pot 19 is sucked into the dispensing nozzle 15, and the whole amount is transferred to the processing container 24. Discharge.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the used dispensing tip 15 is removed by the tip remover 27.
  • the arm 33 and the nozzle holder 34 are driven to move the nucleic acid capturing chip 31 onto the processing container 24 containing the third reagent.
  • the syringe pump 32 is driven, and suction and discharge of the third reagent are repeated three times in the same manner as in the case of the mixed solution.
  • the first washing of the nucleic acid capturing chip 31 and the solid phase 44 is performed.
  • the entire amount of the mixed solution in the processing container 24 is sucked, and further, the air is sucked to a position where the boundary between the mixed solution and the air does not exceed the blocking member 40a.
  • the arm 33 and the nozzle holder 134 are driven, the nucleic acid capturing chip 31 is moved onto the liquid receiving portion 29, the syringe pump 32 is driven, and the sucked third reagent is entirely discharged. And wait. Meanwhile, arm 16 and nozzle holder 17 Drive, attach the unused dispensing tip 15 to the dispensing nozzle 36, and further drive the syringe pump 10 to aspirate the third reagent potter 19 to 800, the third reagent. Discharge the entire amount to the processing container 24.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the used dispensing tip 15 is removed by the tip remover 27.
  • the arm 33 and the nozzle holder 34 are driven to move the chip 31 for nucleic acid capture onto the processing container 24 containing the third reagent.
  • the second washing of the nucleic acid capturing chip 31 and the solid phase 44 is performed.
  • the third reagent is discharged into the liquid receiver 29 as in the case of the first washing.
  • the operation using the third reagent may be repeated again. This washing operation can be further repeated if necessary.
  • the fourth step is a rinsing step for removing components contained in the third reagent such as ethyl alcohol from the nucleic acid capturing chip 31 and the solid phase 44.
  • the arm 1 6 and the nozzle holder 17 are driven, and an unused dispensing tip 15 is attached to the dispensing nozzle 36.
  • the syringe pump 10 is driven to suck 200 L of the fourth reagent from the fourth reagent bottle 102 into the dispensing tip 15 and discharge the entire amount to the processing container 24.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the used dispensing tip 15 is removed with the tip remover 27.
  • the arm 33 and the nozzle holder 34 are driven to move the nucleic acid capturing chip 31 onto the processing container 24 containing the fourth reagent.
  • drive the syringe pump 32 Repeat the suction and discharge of the fourth reagent three times.
  • the nucleic acid capturing chip 31 and the solid phase 44 are rinsed.
  • the syringe pump 32 is driven to suck the whole amount of the fourth reagent in the processing container 24 and further air, the arm 33 and the nozzle holder 134 are driven, and the nucleic acid capturing chip 31 is received in the liquid receiver 2. Go to 9.
  • the syringe pump 32 is driven to discharge the entire amount of the fourth reagent in the nucleic acid-capturing tip 31, and the operation of sucking and discharging 1 mL of air into the nucleic acid-capturing chip 31 is performed. Repeat several times.
  • the fifth step is an elution step of eluting and recovering the nucleic acid adsorbed on the solid phase 44.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven to attach an unused dispensing tip 15 ⁇ to the dispensing nozzle 36.
  • the syringe pump 10 is driven to suck 100 L of the fifth reagent from the fifth reagent pot 20, and the entire amount is discharged to the processing container 24.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the used dispensing tip 15 is removed by the tip remover 27.
  • the arm 33 and the nozzle holder 34 are driven to move the nucleic acid capturing chip 31 onto the processing container 24 containing the fifth reagent.
  • the syringe pump 32 is driven to repeat the suction and discharge of the fifth reagent 20 times, and discharge the entire amount of the fifth reagent.
  • the nucleic acid adsorbed on the solid phase 44 is eluted.
  • the arm 33 and the nozzle holder 34 are driven, and the used nucleic acid capturing chip 31 is removed by the chip removing device 27.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and an unused dispensing tip 15 is attached.
  • the syringe pump 10 is driven, the entire amount of the fifth reagent is sucked from the processing container 24, and a small amount of air is further sucked.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the container for the purified product is driven. Move dispensing tip 15 onto 26.
  • the syringe pump 1.0 is driven, and the entire amount of the fifth reagent in the dispensing tip 15 is discharged into the purified product container 26. Put out.
  • the arm 16 and the nozzle holder 17 are driven, and the used dispensing tip 15 is removed by the tip remover 27.
  • the operation of purifying the nucleic acid from the nucleic acid-containing sample stored in the predetermined sample container 13 is completed.
  • the mixed nucleic acid capture chip 31 Is sucking and discharging.
  • the syringe pump is controlled by the control means.
  • the inventor thought that by controlling the suction speed per one nucleic acid capturing chip, the generation of bubbles around the solid phase 44 in the nucleic acid capturing chip 31 can be surely prevented. In addition, by controlling the discharge speed,
  • the nucleic acid recovery rate can be controlled by controlling the suction speed and the discharge speed.
  • the nucleic acid recovery rate is defined as the nucleic acid concentration (initial concentration; N s) of the mixed solution containing nucleic acids before suction into the nucleic acid capturing container, and dissolving the nucleic acids captured on the solid phase.
  • the prerequisites for calculating the nucleic acid recovery rate are the volume of the mixed solution containing the nucleic acid before being aspirated into the nucleic acid capturing container, the mixed solution that dissolves the nucleic acid captured on the solid phase, and is discharged from the nucleic acid capturing container. That is, the volume of the combined liquid is the same. If the two have different capacities, The acid concentration is multiplied by a predetermined coefficient, and the capacities of the two are determined as being the same.
  • the initial nucleic acid amount can be calculated from the product of the volume of the mixed solution containing the nucleic acid before suction into the nucleic acid capturing container and the initial concentration.
  • the amount of recovered nucleic acid can be calculated from the volume of the mixed solution discharged from the nucleic acid capturing container and the concentration of recovered nucleic acid.
  • the initial concentration (nucleic acid contained in the mixture of the intake before (e.g., concentration of genomic nucleic acid) of the virus) is Ru with 1 0 2 I der range of 1 0 6 I UZmL from UZmL less
  • the nucleic acid recovery rate decreases as the initial concentration increases.
  • the nucleic acid recovery rate controls the Aspirate and discharge rate to be 1% or more, ensures the correct determination It can be carried out. Further, when both the initial concentration is less from 1 0 2 IU / m L is in the range of-10 6 IU / mL, to control the suction and discharge speed so that the nucleic acid recovery rate of 1 0% or more desirable.
  • the tolerance of the apparatus in the nucleic acid analysis field is on the order of one, if the nucleic acid recovery rate is 10% or more, quantitative determination of nucleic acids contained in the mixed solution before suction can be reliably performed. That's why. For the same reason as described above, the quantitative determination can be reliably performed by controlling the suction / discharge speed so that the nucleic acid recovery rate is 10% or more when the initial concentration is high.
  • both the initial concentration is less in the range of from 1 0 2 IU / mL of 10 6 IU / mL
  • Nucleic acid purification due to high nucleic acid recovery Efficiency (production efficiency) is improved.
  • the nucleic acid recovery rate is almost constant regardless of the concentration of the nucleic acid contained in the mixed solution before aspiration, the nucleic acid concentration in the mixed solution after aspiration is included in the mixed solution before the aspiration.
  • the nucleic acid concentration can be accurately grasped. For the same reason as described above, the same effect can be obtained by controlling the suction / discharge speed so that the nucleic acid recovery rate is 50% or more when the initial concentration is high.
  • the nucleic acid recovery rate regardless of the initial concentration It is desirable to control the suction / discharge speed so that the value is almost constant. Almost constant means that the variation of the nucleic acid recovery with respect to the initial concentration falls within a range of ⁇ 10%. In other words, is that the initial concentration of 1 0 2 difference between the maximum nucleic acid recovery and lowest nucleic acid recovery rate when the I UZmL in the range of 1 0 6 IU / mL of 2 within 0%.
  • the present invention when used as a nucleic acid concentration measuring device that calculates the initial concentration from the amount of nucleic acid contained in the mixed liquid after ejection, the initial concentration can be reduced to within 10% (errors of measuring instruments in the nucleic acid detection field can be reduced). It can be measured with an error within the allowable range.
  • the concentration of a predetermined nucleic acid contained in a body fluid or the like of a subject can be measured with an error of 10%.
  • the variation of the nucleic acid recovery rate with respect to the initial concentration is within 5% of the soil. If the recovery rate is almost constant, the amount of nucleic acid contained in the nucleic acid-containing mixture can be accurately measured by quantifying the nucleic acid contained in the mixture recovered in the purified product container 26.
  • the suction speed is set so that the suction speed per nucleic acid capturing chip is 500 lZs or less. It is desirable to control the pull speed. Preferably, the suction speed is less than 3501 / s. Thereby, it is possible to prevent the generation of bubbles around the solid phase 44 in the nucleic acid capturing chip 31.
  • the suction speed is set to be equal to or less than 500 ⁇ lZs.
  • the discharge speed is set to be higher than this suction speed.
  • nucleic acid contained in the mixture prior to aspiration e.g., HCV
  • concentration of a 1 0 6 I UZmL from 1 0 2 I UZmL corresponding to each nucleic acid concentration (virus concentration)
  • the variation in nucleic acid recovery can be kept within 10% of soil. In other words, the difference between the maximum nucleic acid recovery rate and the minimum nucleic acid recovery rate is within 20%.
  • the present invention is not only an apparatus and method for purifying nucleic acid from a nucleic acid-containing mixture, but also a nucleic acid concentration bundling device for measuring the initial nucleic acid concentration in the mixture before suction from the amount of nucleic acid collected. It can be understood that it can be used.
  • the nucleic acid recovery It can be 1% or more.
  • the qualitative determination of the predetermined nucleic acid contained in the mixed solution before suction can be performed.
  • Suction speed and spitting If suitably adjusted output rate, (For example, HCV) nucleic acid contained in the mixture before sucking the nucleic acid recovery rate when the concentration of a 1 0 6 IU / mL 1 0 % ( currently the (Tolerable range of errors in measuring instruments in the technical field).
  • HCV Murrell nucleic acid mixed solution prior to aspiration
  • nucleic acid recovery rate when suitably adjusted aspiration rate and the discharge rate, it can be a nucleic acid recovery rate when the concentration of nucleic acid contained in a mixture before the suction is 1 0 6 I UZmL with 5 0% or more it can.
  • nucleic acid contained in the mixture prior to aspiration of the low concentration of about 1 0 2 IU ZmL nucleic acid recovery regardless of the suction and discharge speed is often of 50% or more, in a mixture of pre-suction The higher the concentration of the contained nucleic acid, the lower the nucleic acid recovery rate.
  • the nucleic acid recovery rate when the concentration of nucleic acids contained in the mixture solution before the suction is 1 0 6 I UZmL and 50% or more, of the nucleic acid contained in the mixture prior to aspiration Regardless of the concentration, the nucleic acid contained in the mixture can be recovered at a substantially constant yield.
  • the suction speed and discharge speed of the mixture in step 2a were changed, and the amount of nucleic acid contained in the mixture before suction and the amount of nucleic acid after the process were completed. The amount of nucleic acid contained in the mixture was compared.
  • mixture 1 0-fold such that 1 0 6 I UZmL ⁇ l 0 2 IU / mL secondary standard hepatitis C serum was pricing in International Standard of WHO in serum of hepatitis C-negative The concentration was adjusted in steps.
  • the initial concentration of the mixture generally viral load that exists when the serum of hepatitis C in the following 1 0 7 IU / mL, for the treatment of a guide by the interferon administration is the 1 0 5 I UZmL , was 10 6 I UXmL ⁇ 1 0 2 I UZmL.
  • the amount of nucleic acid contained in the mixed solution after the process was determined by Roche PCR equipment. (COBAS-AMPUCOR) and HCV v2.0 reagent. Specifically, 48.5 L of the mixture to be evaluated, HC CV master mix V 2.0 41.7 // L, 8.3 L of HCV manganese reagent and HCV internal controller V 2.0 1. After mixing 5 L, the operation of the apparatus was performed according to the procedure attached to the reagent kit, and the mixed solution after the process was serially diluted was used as a sample to measure the amount of nucleic acid contained therein.
  • FIGS. 8 to 10 The measurement results are shown in FIGS. 8 to 10.
  • FIG. 8 shows the results when the discharge speed in the step 2a was fixed at 500 lZs and the suction speed was changed.
  • FIG. 9 shows the results when the discharge speed was fixed at 200 lZ s and the suction speed was changed.
  • FIG. 10 shows the results when the suction speed in the step 2a was fixed at 5001 s and the discharge speed was changed. 8 to 10, the horizontal axis represents the concentration of the nucleic acid contained in the mixture, and the vertical axis represents the concentration of the nucleic acid contained in the mixture after the step.
  • suction speed 100 to 400 l / s according to FIG. 8 suction speed 100 to 400 zl Zs according to FIG. 9, and suction speed 1 according to FIG. from 0 0 ⁇ 4 0 0 il Z s measurement results of, by appropriately controlling the suction and discharge speed, the initial concentration of the suction before mixing liquid in the range of 1 0 2 I'UZmL of 10 6 IU / mL It was verified that the nucleic acid recovery rate at a certain time could be controlled to 1% or more.
  • the suction speed as aspiration rate per one nucleic acid capturing tip is less than 500 H 1 / s, the nucleic acid when the initial concentration of the suction before mixing liquid is 1 0 6 IU / mL It can be confirmed that the recovery rate can be 1% or more.
  • the suction By appropriately controlling the initial concentration of the suction before mixing liquid can verify that it is possible to control braking of the nucleic acid recovery rate when in the range of 1 0 2 IU / mL or al 1 0 6 I UZmL more than 1 0% Was. Further, by controlling the suction speed as aspiration rate per one nucleic acid capturing tip is less than 3 5 0 1 / s, when the initial concentration of the intake before mixture is 1 0 6 IU / mL Nucleic acid recovery rate
  • the suction and discharge speeds can be adjusted appropriately. by controlling the initial concentration could be verified that it is possible to control the nucleic acid recovery rate when in the range of 1 0 6 I mL of 1 0 2 IU / mL to 50% or more.
  • nucleic acids of different concentrations can be recovered from samples of the same concentration by combining the same apparatus and reagents. This means that if the speed control is selected incorrectly, a virus concentration lower than the original value may be determined.If speed control cannot be performed properly, the reliability of the device will be significantly reduced. , Represents. Therefore, it is extremely important to control the speed of suction and discharge under predetermined conditions.
  • the concentration of the recovered nucleic acid can be changed from the recovered nucleic acid concentration to the concentration before recovery by introducing a calibration. Calculate Is possible.
  • Calibration here is the same as calibration in general measuring equipment. Unknowns are obtained by collecting and measuring a sample with a known concentration by the same method as a sample with an unknown concentration, and creating a calibration curve. The original concentration of a sample with a given concentration can be calculated correctly. In other words, information on the relationship between the nucleic acid concentration contained in the mixed solution, the recoverable nucleic acid concentration or nucleic acid amount, the suction speed, and the ejection speed is created in advance, and this information is compared with the suction speed and the ejection speed. By doing so, the concentration of the nucleic acid contained in the sample can be calculated.
  • the processing time can be reduced.
  • the suction speed and the discharge speed are appropriately controlled based on this information.
  • the suction speed in order to recover at a constant recovery rate from low concentration to high concentration side, it is necessary to reduce the suction speed to 200 L / s or less. Therefore, it is possible to set the suction speed to 500 LZ s, and when sucking the same amount of liquid, the necessary time can be compressed to 2Z5, and the processing time can be reduced.
  • This is a very effective method for shortening the time.
  • Such a method is unsuitable for obtaining a large amount of nucleic acid from a certain sample, but it can be said to be an extremely effective method for measuring the concentration in a sample such as a clinical test.
  • the means for controlling the suction speed and the discharge speed of the nucleic acid recovery device are adjusted in relation to the characteristics of the sample and the use of the device user, and the nucleic acid recovery is controlled by controlling the suction speed and the discharge speed.
  • the rate and processing time can be changed.
  • the range of use of the nucleic acid recovery device is expanded, and it becomes possible to use an appropriate device according to the sample and the application.
  • the principle of the present invention is applied to a method for accurately measuring the nucleic acid concentration of a mixed solution containing nucleic acids, a method for efficiently producing a nucleic acid-containing solution from a mixed solution containing nucleic acids, and the like. It can. All publications, patents, and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. Industrial applicability
  • the contact state of the solution containing a nucleic acid and the solid phase in a container for nucleic acid capture can be controlled,
  • the present invention can provide a method, a method for adjusting a nucleic acid recovery device, a nucleic acid production device and a nucleic acid production method, or a method for measuring a nucleic acid concentration.

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Description

明 細 書
核酸回収装置、 及び核酸回収方法 技術分野
本発明は、 主に、 溶液中に含まれる核酸を固相で捕捉して当該溶液か ら核酸を回収する核酸回収装置、 及び核酸回収方法， 核酸含有溶液の生 産方法、 並びに核酸含有溶液の核酸濃度の測定方法に関する。 背景技術
分子生物学の進歩によって、 遺伝子に関する数々の技術が開発され、 また、 それらの技術により多くの疾患性の遺伝子が分離され、 同定され た。 その結果、 医療の分野でも、 診断、 或いは、 検査法において分子生 物学的な手法が取り入れられ、 従来極めて困難であった診断が可能とな り、 検査日数の大幅短縮が達成されつつある。
このような進歩は、 核酸増幅法、 特に、 ポリメラ一ゼ連鎖反応 （PCR 法と称される、 polymerase chain react ion ) の実用化によるところが 大きい。 P C R法は、 混合液中の核酸を配列特異的に増幅することが可 能なため、 例えば、 血清中に極微量しか存在しないウィルスの存在を、 そのウィルスに由来する核酸を増幅し検出することにより、 間接的に証 明できる。 しかし、 この P C R法を臨床の場で日常検査に使用した際に、 いくつかの問題点が存在する。 その中でも特に、 生体試料から核酸を抽 出する前処理においては、 前処理後の P C R法における精度を維持する ため精製工程で精製度の高い核酸を抽出することが重要であることが指 摘されている （大島ほか， JJCLA, 22(2), 145-150(1997))。 すなわち、 前処理によつて生体試料から核酸を抽出する際には、 不純物を極力排除 して純粋なかたちで核酸を分離するように精製工程を行う必要がある。 以下に示すように、 核酸の精製に関しては、 いくつかの手法が提案され ている。
特開平 1 1 一 2 6 6 8 6 4号公報には、 シリ力含有の固相を内蔵した 核酸捕捉用チップを用いて核酸抽出を自動化する方法が開示されている, この手法では、 先ず、 ノズルチップを液体吸排用可動ノズルに装着し、 上記固相に対する核酸の結合を促進する結合促進剤をポトルより吸引し. 次いで核酸含有試料を検体容器から吸引し、 それらの混合液を反応容器 内に吐出する。 次に、 ノズルチップを廃棄し、 液体吸排用可動ノズルに 新たに核酸捕捉用チップを装着する。 前記反応容器内から核酸捕捉用チ ップ内に混合液を吸入する。 続いて、 吸入した混合液中の核酸を核酸捕 捉用チップ内の固相に結合させた後、 上記核酸捕捉用チップ内の液体を 排出する。 続いて、 洗浄用容器内の洗浄液を核酸捕捉用チップ内に吸入 し、 その後、 排出することによって、 核酸を結合した状態の上記固相及 び上記核酸捕捉用チップ内を洗浄する。 最後に、 上記核酸捕捉用チップ 内に溶離液を吸入し、 上記固相から離脱された核酸を含む溶離液を精製 品用容器に吐出する。 これによつて、 核酸含有試料から核酸を精製する ことができる。
しかしながら、 特開平 1 1 一 2 6 6 8 6 4号公報には、 固相を内蔵し た核酸捕捉用チップを液体吸排用可動ノズルに着脱可能に接続する事に より、 混合液の流れを双方向とする事で、 混合液と固相との接触効率を 向上し、 かつ、 容易に自動化が可能な方法である。
また、 特表 2 0 0 0— 5 1 5 0 6 6号公報には、 多孔質のポリマーマ トリックス中に複数の吸着性粒子を含んでなる三次元構造物を含むハウ ジングを用いる方法が開示され、 シリカ充填膜マトリクスを含むハウジ ングに関する説明がある。 この方法では、 当該ハウジングをピペッ トの 先端に取り付け、 G u H C l 、 或いは、 N a lで平衡化した後、 D NA /G u H C 1溶液（或いは N a I溶液）を吸引し、 ハウジングに内蔵され たシリカ充填膜マトリクスに D NAを結合させ、 洗浄， 溶離を行ってい る。
さらにまた、 特開 2 0 0 1 — 7 4 7 5 6号公報には、 シリ力含有の固 相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いて核酸抽出を自動化する方法にお いて、 当該チップ内の圧力を測定して固相の劣化を正確に判定する方法 が開示されている。
さらにまた、 米国特許番号 U S 6， 175， 409 号には、 高速液体クロマト グラフィ等において、 移動相に複数の高分子サンプルをアプライして解 析する方法が開示されている。 特に、 米国特許番号 U S 6, 175， 409 号に は.、 複数の高分子サンプルを含む溶液を移動相に対して一方向に所定の 速度で流すことが記載されている。 しかしながら、 米国特許番号
U S 6, 175, 409 号は、 上記溶液を移動相に対して一方向に流す高速液体 クロマトグラフィ等に関するものであり、 核酸捕捉用チップを備える装 置に関するものではない。
本発明は、 核酸捕捉用容器内の固相により、 溶液に含まれる核酸を収 率よく回収する核酸回収装置及び核酸回収方法， 核酸回収装置の調整方 法， 核酸生産装置及び核酸生産方法、 若しくは核酸濃度調査方法を提供 することを目的とする。 発明の開示
本発明は、 主に、 核酸を捕捉できる固相を備えた核酸捕捉用容器 （例 えば、 チップ （tip)) に、 核酸を含む溶液から核酸を含む成分を吸引及 び吐出して、 上記固相に核酸を捕捉し、 固相に捕捉された核酸を分離し て核酸を回収する核酸回収装置及び核酸回収方法に係り、 吸引の際の吸 引速度、 及び吐出の際の吐出速度あるいは上記容器内の内圧を調整する ことにより、 核酸の回収率を向上することを特徴とする。 すなわち、 固 相と溶液との接触状態を制御することにより、 当該試料中に含まれる核 酸を収率よく回収できる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 内部に固相を有する核酸捕捉用チップの側面図である。 第 2図は、 核酸精製装置における作業台の平面図である。
第 3図は、 核酸精製装置の要部斜視図である。
第 4図は、 分注ノズルに分注用チップを取り付ける状態を示す要部構 成図である。
第 5図は、 液体吸排用可動ノズルに核酸捕捉用チップ 1を取り付けた 状態を示す要部平面図である。
第 6図は、 チップ外し器を用いて分注ノズルから分注チップを取り外 す状態を示す概略構成図である。
第 7図'は、 核酸精製装置の電気系を示すプロック図である。
第 8図は、 第 2 a工程における吐出速度を 5 0 0 n 1 / s に設定し、 吸引速度を変化させた場合において、 吸引前の混合液に含まれる核酸量 と、 吐出後の混合液に含まれる核酸量との関係を示す特性図である。 第 9図は、 第 2 a工程における吐出速度を 2 0 0 n l Z s に設定し、 吸引速度を変化させた場合において、 吸引前の混合液に含まれる核酸量 と、 吐出後の混合液に含まれる核酸量との関係を示す特性図である。 第 1 0図は、第 2 a工程における吸引速度を 5 0 0 l / sに設定し、 吸引速度を変化させた場合において、 吸引前の混合液に含まれる核酸量 と、 吐出後の混合液に含まれる核酸量との関係を示す特性図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明に係る核酸回収装置及び核酸回収方法、 核酸回収装置の 調整方法、 核酸生産装置及び核酸生産方法、 若しくは核酸濃度調査方法 をさらに詳細に説明する。 以下の説明においては、 第 1図に示すような 核酸捕捉用容器である、 例えばチップ 3 1内部の固相 4 4で核酸を捕捉 し、 洗浄液を用いて当該核酸捕捉用チップ 3 1内部を洗浄し、 当該核酸 捕捉用チップ 3 1から核酸を抽出する核酸精製装置を例示する。 但し、 本発明は、 これらの形態にその技術的範囲を限定するものではない。
核酸精製装置 1 0 0は、 第 2図及び第 3図に示すように、 第 2図中矢 印 Xで示す方向に移動可能な 2本のアーム 1 6， 3 3 と、 検体ラック 1 2やチップラック 3 0等を配設した作業面 5 とを備える。アーム 1 6， 3 3は、 作業面 5の面内方向に対して水平（第 2図中矢印 Xで示す方向） に移動自在に駆動できるように、図示しない駆動制御手段を備えている。 ノズルホルダ一 1 7， 3 4は、 アーム 1 6， 3 3の長手方向に沿って移 動自在に駆動できるとともに、 作業台 5に対して接離自在に駆動できる ように、 図示しない駆動制御手段とそれぞれ接続されている。
アーム 1 6には、 第 4図に示すように、 分注ノズル 3 6を保持するノ ズルホルダー 1 7が配設されている。 分注ノズル 3 6の先端部には、 分 注用チップ 1 5を取り付けることができる。 分注ノズル 3 6は、 可撓性 を有する配管 4 2を介してシリンジポンプ 1 0に接続されている。なお、 シリンジポンプ 1 0は、 図示しない純水供給装置と接続されている。 シ リンジポンプ 1 0及び配管 4 2の内部は、 この純水供給装置から供給さ れた純水で満たされている。
アーム 3 3には、 第 5図に示すように、 液体吸排用可動ノズル 3 9を 保持ずるノズルホルダ一 3 4が配設されている。 液体吸排用可動ノズル 3 9の先端部には、 核酸捕捉用チップ 3 1 を取り付けることができる。 液体吸排用可動ノズル 3 9は、 可撓性を有する配管 3 5を介してシリン ジポンプ 3 2に接続されている。 なお、 シリンジポンプ 3 2は、 図示し ない純水供給装置と接続されている。 シリンジポンプ 3 2及び配管 3 5 の内部は、 この純水供給装置から供給された純水で満たされている。 シリ ンジポンプ 3 2は、 液体吸排用可動ノズル 3 9に負荷する圧力を 制御するための制御手段、例えば第 Ί図に示すステツピンダモー夕 7 3 , 制御機構部 6 5 , P C 6 0， キ一ポード 6 1、 及び C R T 6 2を含む制 御手段により、 液体吸排用可動ノズル 3 9に対して所望の圧力を負荷す ることができる。 したがって、 シリンジポンプ 3 2が所定の圧力を液体 吸排用可動ノズル 3 9に対して負荷することによって、 液体吸排用可動 ノズル 3 9に取り付けられた核酸捕捉用チップ 3 1は当該圧力に応じて 所定の速度で混合液等を吸引及び吐出することができる。
また、 アーム 1 6及びアーム 3 3は、 それぞれ作業面 5の面内方向に 対して水平に移動する際に互いに交差可能なように、 互いに異なる高さ 位置に取り付けられている。
作業面 5には、 複数の検体容器 1 3を保持する検体ラック 1 2 と、 複 数の処理容器 2 4を保持する容器ラック 2 3 と、 複数の精製品用容器 2 6を保持する容器保存ラック 2 5 と、 複数の分注用チップ 1 5を保持 するチップラック 1 4 a， 1 4 b , 1 4 c と、 複数の核酸捕捉用チップ 3 1 を保持するチッブラック 3 0 とが所定の位置に配設されている。 ま た、 作業面 5には、 所定の試薬を収容した第一試薬ボトル 2 1， 第二試 薬ボトル 2 2， 第 Ξ試薬ボトル 1 9 , 第四試薬ボトル 1 0 2及び第五試 薬ボトル 2 0が所定の位置に配設されている。 なお、 第一試薬ボトル 2 1は後述する第一工程で使用され、 第二試薬ポトル 2 2は後述する第 二 a及び第二 b工程で使用され、 第三試薬ボトル 1 9は後述する第三ェ 程で使用され、 第四試薬ボトル 1 0 2は後述する第四工程で使用され、 第五試薬ポトル 2 0は後述する第五工程で使用されるものである。 さら に、 作業台 5には、 プライミングの際に分注ノズル 3 6から放出される 純水を受け入れるとともに分注ノズル 3 6のホームポジションとなる液 受け部 1 1 と、 ブライミングの際に液体吸排用可動ノズル 3 9から放出 される純水を受け入れるとともに液体吸排用可動ノズル 3 9のホ一ムポ ジショ ンとなる液受け部 2 8 と、 核酸捕捉用チップ 3 1内に充填した不 要な混合液を排出するための廃液口 2 9 とが穿設されている。 さらにま た、 作業台 5には、 分注用チップ 1 5及び核酸捕捉用チップ 3 1を取り 外すことができるチップ外し器 2 7が配設されている。 なお、 チップ外 し器 2 7の下方には、 チップ廃棄口 5 0が形成されている。
検体ラック 1 2は、 限定されないが、 例えば、 8行 6列で 4 8本の検 体容器 1 3を保持することができる。 検体容器 1 3には、 核酸含有試料 が収容されている。 核酸含有試料としては、 全血， 血清， 喀痰， 尿等の 生体試料や培養細胞， 培養細菌等の生物学的な試料、 あるいは、 電気泳 動後のゲルに保持された状態の核酸， D N A増幅酵素等の反応産物や粗 精製状態の核酸を含む物質等を対象とすることができる。 なお、 ここで の核酸とは、 2本鎖， 1本鎖、 あるいは部分的に 2本鎖もしくは 1本鎖 構造を有するデォキシリポ核酸 （D N A ) 及びリポ核酸 （R N A ) を含 む意味である。
容器ラック 2 3は、 保持している処理容器 2 を所望の温度に調節す るための温度調節機能を有している。 この温度調節機能によって、 容器 ラック 2 3に保持された処理容器 2 4及び処理容器 2 4に収容された混 合液を所望の温度に維持することができる。
容器保存ラック 2 5は、 限定されないが、 例えば、 8行 6列で 4 8本 の精製品用容器 2 6を保持することができる。 精製品用容器 2 6は、 核 酸含有試料から核酸成分を精製処理して得られた精製溶液を収容するも のである。
チップラック 1 4 a , 1 4 b , 1 4 cは、 第 4図に示すように、 複数 の分注用チップ 1 5を保持するための複数の開口部を有し、 分注用チッ プ 1 5の先端部が作業面 5に接触しない程度の高さを有する箱形を呈し ている。 すなわち、 複数の分注用チップ 1 5は、 チップラック 1 4 a， 1 4 b , 1 4 cの開口部にそれぞれ挿入された状態で保持されている。 分注用チップ 1 5を分注ノズル 3 6に装着する際には、 分注ノズル 3 6 の先端部に分注用チップ 1 5を圧入する。
チップラック 3 0は、 第 1図に示した核酸捕捉用チップ 3 1 を、 例え ば、 8行 6列で保持することができる。 第 1図は、 本発明で利用する核 酸捕捉用容器の一例とし、 頭部 5 4から下方に位置する先端 4 8に向け て徐々に内径が細くなるように形成されている核酸捕捉用チップ 3 1 を 例示することが、 核酸捕捉用容器は、 核酸を捕捉できる固相 4 4と、 核 酸を含む混合液を収容する空間と、 前記空間に核酸を含む混合液を吸引 し、 排出するための開口部と、 前記空間の内圧を変化するための開口部 を有するものであればいかなるものを使用しても良い。
核酸捕捉用チップ 3 1 の頭部 5 4 (圧力調整用開口部） は、 分注ノズ ル 3 6の先端部に気密に嵌合するか、 分注ノズル 3 6の先端部に圧入可 能な程度の内径、 例えば 5 . 5 mm 程度の内径を有している。 また、 固相 4 4を収容する空間部の内径は、 例えば 3 . 0 mm 程度の内径を有し、 先 端 4 8 (液体吸排用開口部） の内径は、 例えば 0 . 8 mm 程度の内径を有 している。 核酸捕捉用チップ 3 1は、 例えば、 ポリプロピレン等'の透明 又は半透明な合成樹脂を用いて射出成形により形成され Tいる。
核酸捕捉用チップ 3 1には、 円板状の阻止部材 4 0 a， 4 O bが例え ば 3 mm程度の間隔となるように配設されており、これら阻止部材 40 a , 4 0 bにより挟み込まれる空間に固相 4 4が収容されている。 阻止部材 4 0 a , 4 O bは、 液体及び気体が容易に通過し得る多数の孔を有する が、 その孔は固相 4 4の流出を阻止できる大きさである。 すなわち、 収 容されている固相 4 4は、 阻止部材 4 0 a， 4 O bにより挟み込まれる 空間から外部に流出することが防止されている。 阻止部材 4 0 a， 40 b としては、 例えば、 直径約 0 . 1 mm の石英粒子を焼結することによって 成形した、 直径約 3 . 1 mm、 高さ約 2 . 0 mm の円筒部材を使用すること ができる。 また、 阻止部材 4 0 a , 4 0 bの材質としては、 核酸成分等 の非特異吸着が少なく親水性を有するポリビニリデンフロラィ ドを用い ることもできる。 このポリビニリデンフ口ライ ド等の親水性を有する材 質を用いた場合、タンパク質や核酸等の非特異吸着を少なくできるので、 核酸の精製度や収率を高くすることができる。
また、 固相 4 4としては、 限定しないが、 例えば、 石英ゥ一ル （東芝 ケミカル社製， グレード B , 6〜 1 2 m , 5 mg) やフリントガラス (和 光純薬工業製） の粉末等を使用することができる。 本例においては、 石 英ウールを使用することが好ましい。 また、 フリントガラスは、 核酸捕 捉効果を有するシリカ含有量が高いため、 高収率で核酸を精製すること ができる。 また、 固相 4 4としては、 その他にも、 ガラス粒子， シリカ 粒子， 石英濾紙、 若しくはそれら破碎物又はケイソゥ土等， 酸化ケィ素 を含有する物質であれば使用することができる。
また、 第一試薬ボトル 2 1には、 核酸含有試料から核酸の遊離を促す ことできる試薬が収容されている。 この試薬としては、 例えば 2 % Triton X - 1 0 0 (L KB社製）、 5. 5 mol/ L グァニジンチオシァ ン酸塩（和光純薬工業（株）製、生化学用） を含む ME S ( 2 -raorpholino - ethanesul f onic acid： 2—モルホリノエ夕ンスルホン酸、 （株） 同仁 化学研究所製） 緩衝液を使用することができる。 この試薬としては、 低 粘度であることが好ましい。 核酸として RNAを回収する場合には、 R N A分解酵素による RN Aの分解作用を防ぐため、 RN a s eインヒ ビターの添加やグァニジンチオシァネートを添加した試薬を使用するこ とが望ましい。
第二試薬ポトル 2 2には、 固相 4 4への核酸の結合を促進する物質を 含む試薬が収容されている。 この試薬としては、 例えば、 一般に力オト ピック試薬と呼ばれるものが使用できる。 核酸として RNAを回収する 場合には、 第一試薬ボトル 2 1に収容した試薬と同様に、 グァニジンチ オシァネ一 ト等を添加することが望ましく、 その最終濃度は 3 mo 1/L 以上、 また、 最終 p Hが酸性であることが望ましい。
第三試薬ポトル 1 9には、固相 4 4に対する核酸の結合を維持しつつ、 第二試薬ボトル 2 2に収容された試薬に含まれる核酸の結合を促進する 物質を洗浄できる試薬が収容されている。 この試薬としては、 例えば、 エチルアルコール， イソプロピルアルコール等を 7 0 %以上の濃度で含 む溶液を使用することができる。 しかしながら、 エチルアルコール及び イソプロピルアルコール等は、 回収後の核酸を P C R等に利用する際に 悪影響を与える虞があるため、 使用する濃度としては、 上記洗浄作用を 有する範囲で可能な限り低い濃度で使用することが望ましい。 この観点 からこの試薬としては、 2 5 匪 o l Z L酢酸力リウムを含む 5 0 %ェチル アルコールを用いることが好ましい。
第四試薬ボトル 1 0 2には、 固相 4 4に対する核酸の結合を維持しつ つ、 第三試薬ポトル 2 2に収容された試薬に含まれるエチルアルコール 等を濯ぎ、 第三試薬ポトル 2 2に収容された試薬を次の工程へ持越すこ とを防ぐ試薬が収容されている。 この試薬としては、 この観点から、 5 0 mmo l Z Lの酢酸カリウムを用いることが好ましい。 また、 この試薬 を液温が 2 0 °C以下の状態で使用することが好ましい。
第五試薬ポトル 2 0には、 固相 4 4から核酸を溶離する作用を有す物 質を含む混合液が収容されている。 この混合液としては、 例えば低塩濃 度の水混合液や純水を使用することができる。 この混合液としては、 例 えば 1 0 mmo l Z Lビシン （ p H 8 . 5 ) 及び 0 . 1 匪 o l / L E D T Aを 含む混合液を使用することが好ましい。
さらに、 チップ外し器 2 7は、 第 6図に示すように、 作業面 5から所 定の高さ位置に、 スリッ ト 5 5を有する板状部材から構成されている。 スリ ッ ト 5 5は、 分注用チップ 1 5の頭部 5 2及び核酸捕捉用チップ 3 1 の頭部 5 4の外径よりも小さく、 且つ分注ノズル 3 6の外径より大 きな幅となるように形成されている。 チップ外し器 2 7を用いて、 例え ば分注用チップ 1 5を分注ノズル 3 6から取り外す際には、 先ず、 ァー ム 1 6及びノズルホルダー 1 Ίを駆動して、 スリッ ト 5 5が位置する高 さよりも頭部 5 2を低く した状態で分注ノズル 3 6をスリッ ト 5 5内に 浸入させる。 次いで、 ノズルホルダー 1 7を上昇させることによって、 頭部 5 2が板状部材の下面に当接し、 ノズルホルダ一 1 7の更なる上昇 によりチップ 1 5が分注ノズル 3 6から抜け落ちる。 なお、 核酸捕捉用 チップ 3 1 を液体吸排用可動ノズル 3 9から取り外す際も同様に行う。 一方、 核酸精製用装置 1 0 0における電気系を、 第 7図に示す。 動作 制御部としてのパーソナルコンピュータ，（P C) 6 0には、 操作条件及 び検体情報を入力するための操作パネルとしてのキ一ポ一ド 6 1 , 入力 情報や警告情報等を表示するための表示装置としての C R T 6 2及び各 機構部を制御する機構制御部 6 5が接続されている。機構制御部 6 5は、 シリンジポンプ 1 0に吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステ ッピングモ一夕 7 1， シリ ンジポンプ 3 2に吸排動作を行わせるための ピス トン駆動用のステッピングモ一タ 7 2 , ノズルホルダ一 1 7を水平 移動及び上下動させるためのステツピンダモー夕 7 3， ノズルホルダ一 3 4を水平移動及び上下動させるためのステツビングモータ 7 4， ァ一 ム 1 6を水平移動させるための A Cサーポモータ 7 5及びアーム 3 3を 水平移動させるための A Cサーポモータ 7 6を制御する。 機構制御部 6 5は、 P C 6 0に入力された所定のプログラムに従って、 ステツピン ダモー夕 7 1等の動作を制御する。 プログラムとしては、 核酸精製用装 置 1 0 0の操作者がキーボード 6 1等を用いて入力することもできるし 予め P C 6 0に記録された複数のプログラムから選択したものであって もよい。
以上のように構成された核酸精製用装置 1 0 0は、 以下に説明する、 第一工程，. 第二 a工程， 第二 b工程， 第三 a工程， 第三 b工程， 第四ェ 程及び第五工程を経ることによって核酸含有試料から核酸を回収 （生 産） することができる。 なお、 以下では、 核酸含有試料として、 WHO の International Standard で値付けを行った 2次スタンダード C型肝 炎血清を C型肝炎陰性の血清で 1 0 6 I UZmL〜 l 0 2 I UZmLと なるように 1 0倍刻みで濃度調製した混合液を用いた例について説明す る。 第一工程は、 核酸含有試料から核酸を遊離させる遊離工程である。 第 一工程では、 先ず、 アーム 1 6及びノズルホルダー 1 7 を駆動し、 分注 ノズル 3 6の先端部に分注用チップ 1 5を取り付ける。 次に、 シリ ンジ ポンプ 1 0を駆動し、 検体容器 1 3に収容された核酸含有試料を分注用 チップ 1 5内に 2 0 0 L吸引し、 処理容器 2 4へ分注する。 次に、 ァ —ム 1 6及びノズルホルダ一 1 7を駆動し、 第 6図を用いて説明した動 作により使用した分注用チップ 1 5をチップ外し器 2 7 を用いて取り外 す。 次に、 アーム 1 6及びノズルホルダ一 1 7を駆動し、 分注ノズル 3 6の先端部に未使用の分注用チップ 1 5を取り付ける。 次に、 シリン ジポンプ 1 0を駆動し、 第一試薬ポトル 2 1から第一試薬を分注用チッ プ 1 5内に 7 0 0 L吸引し、 核酸含有試料を分注した処理容器 2 4へ 吐出する。 このとき、 シリンジポンプ 1 0を駆動して、 分注用チップ 1 5を用いて、 処理容器 2 4内の混合液を 5回吸引 · 吐出を行って十分 に混合する。 その後、 例えば 1 0分間放置することが好ましい。 当該放 置の間に、 アーム 1 6及びノズルホルダー 1 7を駆動し、 使用した分注 用チップ 1 5をチップ外し器 2 7で取り外す。
第二 a工程及び第二 b工程は、 遊離した核酸を含む混合液を固相 4 4 と接触させ、 固相 4 4に核酸'を吸着させる捕捉工程である。 第二 a工程 では、 先ず、 アーム 1 6及びノズルホルダー Ί 7を駆動し、 分注ノズル 3 6の先端部に未使用の分注用チップ 1 5を取り付ける。 次に.、 シリン ジポンプ 1 0を駆動し、 第二試薬ポトル 2 2から第二試薬を分注用チッ プ 1 5内に 1 0 0 L吸引し、 核酸含有試料と第一試薬の混合液が入つ た処理容器 2 4へ吐出する。 このとき、 シリンジポンプ 1 0を駆動して、 分注用チップ 1 5を用いて、 処理容器 2 4内の混合液を 5回吸弓 I · 吐出 を行って十分に混合する。 その間、 アーム 3 3及びノズルホルダ一 3 4 を駆動し、 液体吸排用可動ノズル 3 9の先端部に核酸捕捉用チップ 3 1 を取り付けておく。 次に、 アーム 3 3及びノズルホルダ一 3 4を、 核酸 含有試料， 第一試薬及び第二試薬からなる混合液を収容した処理容器 2 4上に移動させた後、 シリンジポンプ 3 2を駆動し、 核酸捕捉用チッ プ 3 1内に当該混合液の全量を吸引する。
次に、 吸引した混合液を、 核酸捕捉用チップ 3 1の上側の阻止部材 4 0 bを混合液の上面が越えない位置まで、 処理容器 2 4内に吐出し、 その後、 処理容器 2 4内の混合液を、 核酸捕捉用チップ 3 1の下側の阻 止部材 4 0 aを混合液と空気の境界線が越えない位置まで吸引する。 す なわち、 この吸引と吐出の操作によって固相 4 4が配された部分に空気 が流入せず、 常に液体で満たされた状態を維持する。 この吸引と吐出の 操作を 1 0回繰り返した後、 処理容器 2 4内の混合液を、 核酸捕捉用チ ップ 3 1内に全量吸引し、 更に、 阻止部材 4 0 aを混合液と空気との境 界線が越えない位置まで空気を吸引する。 次に、 混合液を核酸捕捉用チ ップ 3 1内に収容した状態で、 アーム 3 3及びノズルホルダ一 3 4を駆 動して、 液受け部 2 9へ核酸捕捉用チップ 3 1を移動する。 次に、 シリ ンジポンプ 3 2を駆動し、 吸引した混合液を保持部材 4 0 bを越えない 位置まで吐出し、 次動作まで待機する。
第二 b工程では、 先ず、 アーム 1 6及びノズルホルダ一 1 7を駆動し、 分注ノズル 3 6 に未使用の分注用チップ 1 5を取り付ける。 次に、 シリ ンジポンプ 1 0 を駆動し、 第二試薬ポトル 1 9から 8 0 0 /x Lの第二試 薬を分注用チップ 1 5内に吸引し、 混合液が収容されていた処理容器 2 4へ全量を吐出する。 次に、 アーム 1 6及びノズルホルダー 1 7を駆 動し、 使用した分注用チップ 1 5をチップ外し器 2 7で取り外す。 同時 に、 アーム 3 3及びノズルホルダー 3 4を駆動し、 核酸捕捉用チップ 3 1 を移動し、 第二試薬を収容した処理容器 2 4上に移動させる。 次に、 シリンジポンプ 3 2を駆動し、 上記混合液の場合と同様にして吸引と吐 出を 5回繰り返した後、 処理容器 2 4内の混合液を全量吸引し、 更に、 阻止部材 4 0 aを混合液と空気の境界線が越えない位置まで空気を吸引 する。 次に、 アーム 3 3及びノズルホルダー 3 4を駆動し、 液受け部 2 9上へ核酸捕捉用チップ 3 1 を移動し、シリンジポンプ 3 2を駆動し、 吸引した第二試薬を、 阻止部材 4 0 bを越えない位置まで吐出し、 次動 作まで待機する。その間、 アーム 1 6及びノズルホルダ一 1 7を駆動し、 分注ノズル 3 6に未使用の分注用チップ 1 5を取り付ける。
第三 a工程及び第三 b工程は、 核酸含有試料に含まれていた核酸以外 の成分や第二試薬等を、 核酸捕捉用チップ 3 1及び固相 4 4から除去す るための洗浄工程である。 第三 a工程は、 先ず、 シリンジポンプ 1 0を 駆動し、 第三試薬ポトル 1 9から 4 0 0 Lの第三試薬を分注用ノズル 1 5内に吸引し、 処理容器 2 4へ全量を吐出する。 次に、 ァ一ム 1 6及 びノズルホルダー 1 7を駆動し、 使用した分注用チップ 1 5をチップ外 し器 2 7で取り外す。 その間に、 アーム 3 3及びノズルホルダ一 3 4を 駆動し、 核酸捕捉用チップ 3 1を、 第三試薬を収容した処理容器 2 4上 に移動する。 次に、 シリンジポンプ 3 2を駆動し、 上記混合液の場合と 同様に、 第三試薬の吸引と吐出を 3回繰り返す。 これにより、 核酸捕捉 用チップ 3 1及び固相 4 4に対する第一回目の洗浄を行う。 その後、 処 理容器 2 4内の混合液を全量吸引し、 更に、 混合液と空気との境界線が 阻止部材 4 0 aを越えない位置まで空気を吸引する。 次に、 アーム 3 3 及びノズルホルダ一 3 4Γを駆動し、 液受け部 2 9上へ核酸捕捉用チップ 3 1 を移動させ、 シリンジポンプ 3 2を駆動し、 吸引した第三試薬を全 量吐出し、 待機する。 その間に、 アーム 1 6及びノズルホルダー 1 7を 駆動し、 分注ノズル 3 6に未使用の分注用チップ 1 5を取り付け、 さら にシリ ンジポンプ 1 0を駆動し、 第三試薬ポトル 1 9から 8 0 0 乙の 第三試薬を吸引し、 処理容器 2 4へ全量を吐出する。
第三 b工程では、 先ず、 アーム 1 6及びノズルホルダー 1 7を駆動し、 使用した分注用チップ 1 5をチップ外し器 2 7で取り外す。 その間に、 アーム 3 3及びノズルホルダ一 3 4を駆動して、 核酸捕捉用チップ 3 1 を、 第三試薬を収容した処理容器 2 4上に移動し、 上記混合液の場合と 同様に、 第三試薬の吸引と吐出を 3回繰り返す。 これにより、 核酸捕捉 用チップ 3 1及び固相 4 4に対する第二回目の洗浄を行う。 その後、 第 一回目の洗浄の際と同様に、 液受け部 2 9に第三試薬を吐出する。特に、 第二回目の洗浄の際には、 液受け部 2 9の位置でシリンジポンプ 3 2を 駆動し、 核酸捕捉用チップ 3 1内に空気 1 m Lを吸引及び吐出する操作 を 1 0回繰り返し、 待機する。 なお、 第三 b工程において、 第三試薬に よる操作を再度繰り返して行ってもよい。 なお、 この洗浄操作は、 必要 であれば更に繰り返して行うことができる。
第四工程は、 エチルアルコール等の第三試薬に含まれている成分を、 核酸捕捉用チップ 3 1及び固相 4 4から除去するための濯ぎ工程である < 第四工程では、 先ず、 アーム 1 6及びノズルホルダー 1 7を駆動し、 分 注ノズル 3 6に未使用の分注用チップ 1 5を取り付ける。 次に、 シリン ジポンプ 1 0を駆動し、 第四試薬ボトル 1 0 2から 2 0 0 Lの第四試 薬を分注用チップ 1 5内に吸引し、 処理容器 2 4へ全量を吐出する。 そ の後、 アーム 1 6及びノズルホルダ一 1 7を駆動し、 使用した分注用チ ップ 1 5をチップ外し器 2 7で取り外す。 その間に、 アーム 3 3及びノ ズルホルダー 3 4を駆動し、 核酸捕捉用チップ 3 1 を、 第四試薬を収容 した処理容器 2 4上に移動する。 次に、 シリンジポンプ 3 2を駆動し、 第四試薬の吸引と吐出を 3回繰り返す。 これにより、 核酸捕捉用チップ 3 1及び固相 4 4に対する濯ぎを行う。 その後、 シリンジポンプ 3 2を 駆動し、 処理容器 2 4内の第四試薬全量及び更に空気を吸引し、 アーム 3 3及びノズルホルダ一 3 4を駆動し、 核酸捕捉用チップ 3 1 を液受け 2 9へ移動する。 そして、 シリンジポンプ 3 2を駆動し、 核酸捕捉用チ ップ 3 1内の第四試薬全量を吐出するとともに、 核酸捕捉用チップ 3 1 内に空気 1 m Lを吸引及び吐出する操作を 1 0回繰り返す。
第五工程は、 固相 4 4に吸着した核酸を溶離させて回収する溶離工程 である。 第五工程では、 先ず、 アーム 1 6及びノズルホルダー 1 7を駆 動し、 分注ノズル 3 6に未使用の分注用チップ 1 5 ¾取り付ける。 次に、 シリンジポンプ 1 0を駆動し、 第五試薬ポトル 2 0から 1 0 0 Lの第 五試薬を吸引し、 処理容器 2 4へ全量を吐出する。 その後、 アーム 1 6 及びノズルホルダー 1 7を駆動し、 使用した分注用チップ 1 5をチップ 外し器 2 7で取り外す。 その間に、 アーム 3 3及びノズルホルダー 3 4 を駆動し、 核酸捕捉用チップ 3 1 を、 第五試薬を収容した処理容器 2 4 上に移動する。 次に、 シリ ンジポンプ 3 2を駆動し、 第五試薬の吸引及 び吐出を 2 0回繰り返し、 第五試薬の全量を吐出する。 これにより、 固 相 4 4に吸着した核酸の溶離を行う。 その後、 アーム 3 3及びノズルホ ルダー 3 4を駆動し、 使用した核酸捕捉用チップ 3 1をチップ外し器 2 7で取り外す。 その間に、 アーム 1 6及びノズルホルダ一 1 7を駆動 し、 未使用の分注用チップ 1 5を取り付ける。 次に、 シリンジポンプ 1 0を駆動し、 処理容器 2 4から第五試薬全量を吸引し、 更に、 少量の 空気を吸引した後、 アーム 1 6及びノズルホルダー 1 7を駆動して精製 品用容器 2 6上へ分注用チップ 1 5を移動する。 次に、 シリンジポンプ 1. 0を駆動し、 分注チップ 1 5内の第五試薬全量を精製品容器 2 6へ吐 出する。 その後、 アーム 1 6及びノズルホルダー 1 7を駆動し、 使用し た分注用チップ 1 5をチップ外し器 2 7で取り外す。
以上で、 所定の検体容器 1 3に収容された核酸含有試料からの核酸の 精製操作が終了する。 特に、 第 2 a工程及び第 2 b工程では、 シリンジ ポンプ 3 2を駆動することにより液体吸排用可動ノズル ·3 9に負荷する 圧力を制御しつつ、 核酸捕捉用チップ 3 1で混合混合液等を吸引及び吐 出している。 核酸精製装置 1 0 0では、 制御手段によりシリンジポンプ
3 2を制御しているため、 液体吸排用可動ノズル 3 9に対して所望の圧 力を負荷することができ、 その結果、 混合液等の吸引及び吐出を所望の 速度で行うことができる。
発明者は、核酸捕捉用チップ 1本あたりの吸引速度を制御することで、 核酸捕捉用チップ 3 1内の固相 4 4周辺における気泡の発生を確実に防 止することができると考えた。 また、 吐出速度を制御することで、 固相
4 付近に発生し或いは存在している気泡を外部に確実に排出すること ができると考えた。 そして、 検証実験の結果、 吸引速度と吐出速度を制 御することによって、 混合液と固相 4 4との接触状態を良好に維持でき る.ため、 固相が収率よく核酸を捕捉することを突き止めた。 また、 吸引 速度と吐出速度を制御することによって、 核酸回収率を制御できること を見出した。 ここで、 核酸回収率とは、 核酸捕捉用容器に吸引する前の 核酸を含む混合液の核酸濃度 （初期濃度 ； N s ) と、 固相に捕捉された 核酸を溶解し、 核酸捕捉用容器から吐出された混合液の核酸濃度 （回収 核酸濃度 ； N r ) との比 （N r / N s ) である。 尚、 核酸回収率の算出 の前提条件は、 核酸捕捉用容器に吸引する前の核酸を含む混合液の容量 と、 固相に捕捉された核酸を溶解し、 核酸捕捉用容器から吐出された混 合液の容量とが同一であることである。 両者の容量が異なる場合は、 核 酸濃度に所定の係数を乗じて両者の容量を同一とみなして求める。また、 核酸捕捉用容器に吸引する前の核酸を含む混合液容量と初期濃度と積に より、 初期核酸量が算出できる。 また、 核酸捕捉用容器から吐出された 混合液容量と回収核酸濃度により、 回収核酸量が算出できる。
核酸回収率の観点から、 本発明を説明する。本発明では、 初期濃度 （吸 引前の混合液中に含まれる核酸 （例えば、 ウィルスのゲノム核酸） の濃 度） が少なく とも 1 02 I UZmLから 1 06 I UZmLの範囲内であ る場合に、 核酸回収率が 1 %以上となるように吸引 · 吐出速度を制御す ることが望ましい。 核酸回収率が 1 %以上であれば、 吸引前の混合液中 に所定核酸が含まれているか否かの検査、 すなわち定性判定を確実に行 うことができるためである。 尚、 核酸回収率は、 初期濃度が大きくなる に従い低下する。 従って、 初期濃度が高い場合 （例えば、 初期濃度が 1 06 I UZmLである場合） に核酸回収率が 1 %以上となるように吸 引 ·吐出速度を制御することでも、 訂正判定を確実に行うことができる。 また、 初期濃度が少なく とも 1 02 I U / m Lから · 106 I U/mLの 範囲内である場合に、 核酸回収率が 1 0 %以上となるように吸引 · 吐出 速度を制御することが望ましい。 一般に、 核酸解析分野における装置の 許容誤差は 1オーダであるため、 核酸回収率が 1 0 %以上であれば、 吸 引前の混合液中に含まれる核酸についての定量判定を確実に行うことが できるためである。 尚、 前述と同様の理由により、 初期濃度が高い場合 に核酸回収率が 1 0 %以上となるように吸引 · 吐出速度を制御すること でも、 定量判定を確実に行うことができる。
さらに、 初期濃度が少なく とも 1 02 I U/mLから 106 I U/mL の範囲内である場合に、 核酸回収率が 5 0 %以上となるように吸引 · 吐 出速度を制御することが望ましい。 核酸の回収率が高いため、 核酸精製 効率 （生産効率） が向上する。 また、 核酸回収率が、 吸引前の混合液中 に含まれる核酸の濃度に依らずほぼ一定となるため、 吸引後の混合液中 に含まれる核酸濃度から、 吸引前の混合液中に含まれる核酸濃度を的確 に把握することができる。 尚、 前述と同様の理由により、 初期濃度が高 い場合に核酸回収率が 5 0 %以上となるように吸引 · 吐出速度を制御す ることでも、 同様の効果が得られる。
さらに、 初期濃度 （吸引前の混合液中に含まれる核酸の濃度） が少な く とも 1 02 I UZmLから 1 06 I UZmLの範囲内である場合に、 初期濃度によらず核酸回収率の値がほぼ一定となるように吸引 · 吐出速 度を制御することが望ましい。 ほぼ一定とは、 初期濃度に対する核酸回 収率の変動が、 ± 1 0 %の範囲に収まることである。 言い換えれば、 初 期濃度が 1 02 I UZmLから 1 06 I U/mLの範囲内である場合の 最大核酸回収率と最低核酸回収率の差が 2 0 %以内となることである。 これにより、 本発明を、 吐出後の混合液に含まれる核酸量から初期濃度 を算出する核酸濃度測定装置として利用した場合に、 初期濃度を 1 0 % 以内 （核酸検出分野における測定機器の誤差の許容範囲） の誤差で測定 することができる。 また、 本発明を医療現場で核酸濃度測定装置として 利用した場合に、 被験者の体液等に含まれる所定の核酸濃度を 1 0 %の 誤差で測定することができる。
より好適には、 初期濃度に対する核酸回収率の変動が土 5 %の範囲に 収まることが望ましい。 回収率がほぼ一定であれば、 精製品用容器 2 6 に回収された混合液に含まれる核酸を定量することにより、 核酸含有混 合液に含まれる核酸量を正確に測定することができる。
吸引 ' 吐出速度の観点から本発明を説明する。 本発明では、 核酸捕捉 用チップ 1本あたりの吸引速度が 5 0 0 l Z s以下となるように、 吸 引速度を制御することが望ましい。 好適には、 吸引速度が 3 5 0 1 / s以下とする。 これにより、 核酸捕捉用チップ 3 1内の固相 44周辺に おける気泡の発生を防止することができる。
核酸捕捉用チップ 1本あたりの吐出速度が 1 0 0 0 1 / s以下とな るように、 吸引速度を制御することが望ましい。 好適には、 吐出速度が 5 0 0 ^ l Zs以下となるようにする。 また、 核酸捕捉用チップ 1本あ たりの吸引速度が 5 0 0 / 1 Z s以上の場合には、 この吸引速度より吐 出速度が大きくなるようにする。 これにより、 固相 44付近に発生し或 いは存在している気泡き外部に確実に排出することができる。
具体的には、 吸引前の混合液中に含まれる核酸 （例えば、 HCV) の 濃度が 1 02 I UZmLから 1 06 I UZmLである場合に、 各核酸濃 度 （ウィルス濃度） に対応する核酸回収率の変動を土 1 0 %以内とする ことができる。 言い換えると、 最大核酸回収率と最低核酸回収率の差が 2 0 %以内となる。
また、 吸引速度と吐出速度を好適に調整した場合は、 各濃度に対応す る核酸回収率の変動を ± 5 %以内とすることができる。 これにより、 吸 引前の混合液中に含まれる核酸の濃度に拘わらず、 混合液中に含まれる 核酸をほぼ一定の収率で回収することができる。 このことからも、 本発 明は、 核酸含有混合液から核酸を精製する装置及び方法のみならず'、 回 収した核酸量から吸引前混合液中の核酸初期濃度を測定する核酸濃度束 手装置に利用できることが理解できる。
また、 本 明の効果を別の観点で捕らえれば、 吸引前の混合液中に含 まれる核酸 （例えば、 HCV) の濃度が 1 0.6 I U/mLである場合に、 核酸回収率を 1 %以上とすることができる。 これにより、 吸引前の混合 液中に含まれる所定核酸の定性判定を行うことができる。 吸引速度と吐 出速度を好適に調整した場合は、 吸引前の混合液中に含まれる核酸 （例 えば、 HCV) の濃度が 1 06 I U/mLである場合の核酸回収率を 1 0 % (現在の本技術分野における測定機器の誤差の許容範囲） 以上と することができる。 このように、 本発明は実用的価値を有する。 特に、 吸引速度と吐出速度を好適に調整した場合は、 吸引前の混合液中に含ま れる核酸の濃度が 1 06 I UZmLである場合の核酸回収率を 5 0 %以 上とすることができる。 吸引前の混合液中に含まれる核酸が 1 02 I U ZmL程の低濃度のとき、 吸引 · 吐出速度によらず核酸回収率は 50 % 以上となることが多く、 吸引前の混合液中に含まれる核酸が高濃度にな るに従って核酸回収率が小さくなる。 したがって、 吸引前の混合液液中 に含まれる核酸の濃度が 1 06 I UZmLである場合の核酸回収率を 5 0 %以上とすることができれば、 吸引前の混合液中に含まれる核酸の 濃度に拘わらず、 混合液中に含まれる核酸をほぼ一定の収率で回収する ことができる。 . このことを検証するため、 上述した核酸精製装置において、 第 2 aェ 程における混合液の吸引速度及び吐出速度を変更し、 吸引前の混合液に 含まれていた核酸量と工程終了後の混合液に含まれていた核酸量とを比 較した。 なお、 混合液は、 WHOの International Standard で値付け を行った 2次スタンダード C型肝炎血清を C型肝炎陰性の血清で 1 06 I UZmL〜 l 02 I U/mLとなるように 1 0倍刻みで濃度調製した ものである。 混合液の初期濃度は、 一般に、 C型肝炎の場合血清中に存 在するウィルス量は 1 07 I U/mL以下で、 インターフェロン投与に よる治療の目安は 1 05 I UZmLとされているため、 106 I UXmL 〜 1 02 I UZmLとした。
なお、 工程終了後の混合液に含まれる核酸量は、 Roche 社の P C R装 置 （COBAS— AMPUCOR) と H CV v 2. 0 試薬により評価した。 具体的 には、 評価対象の混合液 4 8. 5 L、 H CVマスターミックス V 2.0 4 1. 7 // L、 H C Vマンガン試薬 8. 3 L及び H C V内部コント口 —ル V 2 . 0 1 . 5 Lを混合し、試薬キッ トに付属の手順書に従い、 装置の操作を行い、 工程終了後の混合液を段階希釈した物をサンプルと し、 含まれる核酸量を測定した。
測定結果を第 8図から第 1 0図に示す。 第 8図は、 第 2 a工程におけ る吐出速度を 5 0 0 l Z s に固定し、 吸引速度を変化させた際の結果 を示す。 第 9図は、 吐出速度を 2 0 0 l Z s に固定し、 吸引速度を変 化させた際の結果を示す。 また、 第 1 0図は、 第 2 a工程における吸引 速度を 5 0 0 1 s に固定し、吐出速度を変化させた際の結果を示す。 なお、 第 8図から第 1 0図において、 横軸は混合液中に含まれる核酸の 濃度を示し、 縦軸は工程終了後の混合液に含まれる核酸の濃度を示して いる。
第 8図にかかる吸引速度 1 0 0〜 4 0 0 l / s、 第 9図にかかる吸 引速度 1 0 0〜 4 0 0 z l Z s の測定結果、 及び第 1 0図にかかる吸引 速度 1 0 0〜 4 0 0 i l Z sの測定結果より、 吸引 · 排出速度を適切に 制御することで、 吸引前混合液の初期濃度が 1 0 2 I'UZmLから 106 I U/mLの範囲内であるときの核酸回収率を 1 %以上に制御できるこ とが検証できた。 また、 核酸捕捉用チップ 1本あたりの吸引速度が 500 H 1 / s以下となるように吸引速度を制御することで、 吸引前混合液の 初期濃度が 1 0 6 I U/mLであるときの核酸回収率を 1 %以上とでき ることが確認できる。
第 8図にかかる吸引速度 1 0 0〜 3 0 0 1 Z S、 及び第 9図にかか る吸引速度 1 0 0〜 4 0 0 x l Zs の測定結果より、 吸引 ■ 排出速度を 適切に制御することで、 吸引前混合液の初期濃度が 1 02 I U/mLか ら 1 06 I UZmLの範囲内であるときの核酸回収率を 1 0 %以上に制 御できることが検証できた。 また、 核酸捕捉用チップ 1本あたりの吸引 速度が 3 5 0 1 / s以下となるように吸引速度を制御することで、 吸 引前混合液の初期濃度が 1 06 I U/mLであるときの核酸回収率を
1 0 %以上とできることが確認できる。
第 8図にかかる吸引速度 1 0 0〜 2 0 0 l / s、 及び第 9図にかか る吸引速度 1 0 0〜 2 0 0 1 Z sの測定結果より、 吸引 ， 排出速度を 適切に制御することで、 初期濃度が 1 02 I U/mLから 1 06 I mLの範囲内であるときの核酸回収率を 5 0 %以上に制御できることが 検証できた。
第 1 0図にかかる吸引速度 1 0 0〜4 0 0 n l Z sの測定結果より、 核酸捕捉用チップ 1本あたりの吸引速度が 5 0 0 i / s以上の場合に. この吸引速度より吐出速度が大きくすることで、 吸引前混合液の初期濃 度が 1 06 I UZmLであるときの核酸回収率を 1 %以上とできること が検証できた。
以上のように、 吸引と吐出の速度制御を行う事により、 同一構成の装 置と試薬の組み合わせにより、 同一濃度の検体から異なる濃度の核酸が 回収される。 これは、 速度制御の選択を誤った場合、 本来の値よりも低 いウィルス濃度の判定を行う可能性がある事、 速度制御を適切に行えな い場合、 装置の信頼性を著しく低下させる事、 を表している。 そのため、 吸引と吐出の速度制御を所定の条件で行う事は、極めて重要な事である。
また、 所定の吸引と吐出速度の組み合わせの範囲において繰り返し再 現性を有していれば、 たとえ回収性能が低い場合でも、 キヤリブレーシ ヨ ンの導入により、 回収された核酸濃度から回収前の濃度を算出する事 が可能である。
ここでのキヤリブレーションとは、 一般的な測定機器におけるキヤリ ブレーシヨンと同様で、 未知濃度の検体と同様の手法により、 既知濃度 の検体を回収， 測定し、 検量線を作成する事により、 未知濃度の検体の 本来の濃度を正しく算出する事が出来る。 つまり、 混合液に含まれる核 酸濃度と、 回収できる核酸濃度若しくは核酸量と、 吸引速度と、 吐出速 度との関連性に関する情報を予め作成し、 この情報と吸引速度と吐出速 度を比較することで、試料に含まれる核酸濃度を算出することができる。
また、 この情報に基づき吸引速度と吐出速度を適切に制御すると、 処 理時間を短縮することができる。 例えば、 第 8図において、 低濃度から 高濃度側まで一定の回収率で回収を行うためには、 吸引速度を 2 0 0 L / s以下にする必要が生じるが、 キヤリブレ一ションを行う事によ り、 5 0 0 L Z s の吸引速度とする事が可能であり、 同量の液体を吸 引する際には、 必要な時間を 2 Z 5に圧縮する事が可能であり、 処理時 間の短縮に極めて有効な手法である。 このような方法は、 ある検体から 多量の核酸を得たい場合には不向きであるが、 臨床検査のように、 検体 中の濃度を測定したい場合には、 極めて有効な方法といえる。
また、 この情報に基づき、 試料の特性， 装置使用者の用途等に関連し て核酸回収装置の吸引速度 · 吐出速度の制御手段を調整し、 吸引速度と 吐出速度を制御することで、 核酸回収率や処理時間を変更することがで きる。 これにより、 核酸回収装置の利用範囲が広がり、 試料や用途に対 応した適切な装置利用が可能となる。
以上述べたように、 本発明の原理は、 核酸を含む混合液の核酸濃度を 高精度に測定する方法、 及び、 核酸を含む混合液から核酸含有溶液を効 率的に生産する方法等に適用できる。 本明細書で引用した全ての刊行物， 特許及び特許出願をそのまま参考 として本明細書に取り入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 核酸捕捉用容器内の固相と核酸を含む溶液の接触状 態を制御することができ、 当該溶液中に含まれる核酸を収率よく回収す る核酸回収装置及び核酸回収方法， 核酸回収装置の調整方法， 核酸生産 装置及び核酸生産方法、 若しくは核酸濃度の測定方法を提供することが できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 核酸を捕捉できる固相を有する核酸捕捉用容器に、 核酸を含む溶液 を吸引し、 吸引した核酸を上記固相に捕捉し、 捕捉した核酸を固相から 分離し、 該容器から核酸を吐出することにより、 前記溶液に含まれる核 酸を回収する核酸回収装置であって、 核酸回収率 （前記溶液に含まれる 核酸濃度 （N s ) と、 回収された核酸濃度 （N r ) との比 (N r /N s )) が 1 0 %以上になるように吸引速度と吐出速度を制御する制御機構を備 えた核酸回収装置。
2. 請求の範囲 1記載の核酸回収装置であって、
前記制御機構により、 前記溶液に含まれる核酸濃度 （N s ) と、 回収 された核酸濃度 （N r ) との比 （N r ZN s ) が 5 0 %以上になるよう に吸引速度と吐出速度を制御する核酸回収装置。
3. 請求の範囲 1記載の核酸回収装置であって、
吸引速度が 5 0 0 L / s より小さい （ただし、 0を除く） 核酸回収
4. 請求の範囲 3記載の核酸回収装置であって、
吸引速度が 3 5 0 L / sより小さレゝ （ただし 0を除く） 核酸回収
5. 請求の範囲 1記載の核酸回収装置であって、
吐出速度が 1 0 0 0 L Z sより小さい （ただし、 0を除く） 核酸回 収装置。
6. 請求の範囲 5記載の核酸回収装置であって、
吐出速度が 5 0 0 L / s より小さい （ただし、 0を除く） 核酸回収 装置。
7. 請求の範囲 1記載の核酸回収装置であって、 吸引速度が 5 0 0 LZ S以上であり、 吐出速度が吸引速度より大き い核酸回収装置。
8. 請求の範囲 1記載の核酸回収装置であって、
吸引速度が 3 5 0 LZ s より小さく （ただし、 0を除く）、 吐出速度が 5 0 0 L Z s より小さい （ただし、 0を除く） 核酸回収
9. 以下の構成を含む核酸回収装置。
( 1 ) 核酸を含む溶液を保持する容器
( 2) 回収した核酸を保持する容器
( 3) 前記溶液を収容する空間と、 核酸を捕捉する固相と、 前記溶液を 吸引し、 及び排出ずるための液体吸排用開口部と、 前記空間の内 圧を変化させるための圧力調整用開口部とを有する核酸捕捉用容
( 4) 核酸回収率 （前記溶液中の核酸濃度 （N s ) と回収した核酸濃度
(N r ) との比 （N r /N s )) が 1 0 %以上となるように前記 空間の内圧を制御する制御機構
1 0. 請求の範囲 9記載の核酸回収装置であって、
前記制御機構により、 核酸回収率 （前記溶液に含まれる核酸濃度 (N s ) と、 回収された核酸濃度 （N r ) との比 （N r /N s )) が 5 0 %以上となるように前記空間の内圧を制御する核酸回収装置。
1 1. 請求の範囲 9記載の核酸回収装置であって、
前記制御機構により、 前記核酸捕捉用容器の吸引速度が 3 5 0 s より小さくなるように （ただし、 0を除く） 前記空間の内圧を制御す る核酸回収装置。
1 2. 請求の範囲 1 1記載の核酸回収装置であって、 前記制御機構により、 前記核酸捕捉用容器の吸引速度が 3 5 0 L / sより小さくなるように （ただし、 0を除く） 前記空間の内圧を制御す る核酸回収装置。
1 3 . 請求の範囲 9記載の核酸回収装置であって、
前記制御機構により、 前記核酸捕捉用容器の吐出速度が 1 0 0 0 L Z s より小さくなるように （ただし、 0を除く） 前記空間の内圧を制御 する核酸回収装置。
1 4 . 請求の範囲 1 3記載の核酸回収装置であって、
前記制御機構により、 前記核酸捕捉用容器の吐出速度が 5 0 0 L Z sより小さくなるように （ただし、 0を除く） 前記空間の内圧を制御す る核酸回収装置。
1 5 . 請求の範囲 1 0記載の核酸回収装置であって、
前記制御機構により、 吸引速度が 5 0 0 L / s以上の場合に、 吐出 速度が吸引速度より大きくなるように前記空間の内圧を制御する核酸回 収装置。
1 6 . 請求の範囲 1 0記載の核酸回収装置であって、
前記制御機構により、 吸引速度が 3 5 0 ^ L Z s より小さく （ただし、 0を除く）、 吐出速度が 5 0 0 Lノ s より小さく （ただし、 0を除く） なるように前記空間の内圧を制御する核酸回収装置。
1 7 . 核酸を捕捉できる固相を有する核酸捕捉用容器に核酸を含む溶液 を吸引し、 該溶液を吐出して前記固相に核酸を捕捉し、 前記固相に捕捉 された核酸を分離できる溶液を前記核酸捕捉容器に吸引して捕捉した核 酸を前記固相から分離し、 前記溶液に含まれる核酸を回収する核酸回収 方法であって、
前記溶液に含まれる核酸濃度 （N s .) と、 回収された核酸濃度 （N r ) との比 （ N r / N s ) が 1 0 %以上になるように吸引速度と吐出速度を 制御する工程を有する方法。
1 8. 請求の範囲 1 7記載の核酸回収方法であって、
前記溶液に含まれる核酸濃度 （N s ) と、 回収された核酸濃度 （N r ) との比 （N r ZN s ) が 5 0 %以上になるように吸引速度と吐出速度を 制御する工程を有するる核酸回収方法。
1 9. 請求の範囲 1 7記載の核酸回収方法であって、
前記吸引速度が 5 0 0 LZ sより小さい （ただし、 0を除く） 核酸 回収方法。
2 0. 請求の範囲 1 9記載の核酸回収方法であって、
前記吸引速度が 3 5 0 L / s より小さい （ただし、 0を除く） 核酸 回収方法。
2 1. 請求の範囲 1 7記載の核酸回収方法であって、
前記吐出速度が 1 0 0 0 L / s より小さい （ただし、 0を除く） 核 酸回収方法。
2 2. 請求の範囲 2 1記載の核酸回収方法であって、
前記吐出速度が 5 0 0 L Z s より小さい （ただし、 0を除く） 核酸 回収方法。
2 3. 請求の範囲 1 7記載の核酸回収方法であって、
前記吸引速度が 5 0 0 L / sより大きく、 吐出速度が吸引速度より 大きい核酸回収方法。
2 4. 請求の範囲 1 7記載の核酸回収方法であって、
吸引速度が 3 5 0 / Lノ sより小ざく （ただし、 0は除く）、 吐出速度が 5 0 0 L / sより小さい （ただし、 0は除く） 核酸回収 方法。
2 5. 核酸を捕捉できる固相を有する核酸捕捉用容器に核酸を含む溶液 を吸引し、 該溶液を吐出して前記固相に核酸を捕捉し、 捕捉した核酸を 前記固相から分離して、 前記溶液に含まれる核酸を回収する核酸回収方 法であって、
核酸を含む溶液の核酸濃度が 1 02 I UZmLから 1 06 I U/mL の範囲内にあるときに核酸回収率 （前記溶液の核酸濃度 （N s ) と回収 された核酸濃度 （N r ) との比 （N r ZN s )) がほぼ一定値となる吸 引速度又は Z及び吐出速度により、 核酸を含む溶液を吸引し、 又は Z及 び吸引した溶液を吐出する核酸回収方法。
2 6. 核酸を捕捉できる固相を有する核酸捕捉用容器に核酸を含む溶液 を吸引し、 該溶液を吐出して前記固相に核酸を捕捉し、 捕捉した核酸を 前記固相から分離して、 前記溶液に含まれる核酸を回収する核酸回収装 置であって、
核酸回収率 （核酸を含む前記溶液の核酸濃度 （N s ) と回収された核 酸濃度 （N r ) との比 （N r ZN s )) と、 吸引速度又は/及び吐出速 度との関係についての情報に基づいて、 回収された核酸濃度と吸引速度 又は Z及び吐出速度核酸を含む前記溶液の核酸濃度を算出する演算機構 を備えた核酸回収装置。
2 7. 以下の工程を含む核酸回収方法。
( 1 ) 核酸を含む試料から当該核酸を遊離させ、 遊離した核酸を含む溶 液を調製する遊離工程
(2) 遊離した核酸を含む溶液に、 核酸捕捉用容器内に配設された固相 と当該核酸との結合を促進する物質を添加し、 当該核酸捕捉用容 器内に溶液を吸引し、 1 0 0 0 LZ sより小さい （ただし、 0 を除く） 吐出速度で吸引した溶液を当該核酸捕捉用容器から吐出 する捕捉工程
( 3 ) 上記固相に捕捉された核酸以外の成分を除去することができる溶 液を上記核酸捕捉用容器内に吸引し、 続いて吸引した溶液を当該 核酸捕捉用容器から吐出する洗浄工程
( 4 ) 上記固相に捕捉された核酸を当該固相から溶離することができる 物質を含む溶液を上記核酸捕捉用容器内に吸引、 続いて吸引した 溶液を当該核酸捕捉用容器から吐出する溶離工程
2 8 . 請求の範囲 2 7記載の核酸回収方法であって、
上記捕捉工程では、 5 0 0 L / s より小さい （ただし、 0を除く） 吸引速度で当該核酸捕捉用容器内に溶液を吸引する核酸回収方法。
2 9 . 請求の範囲 2 7記載の核酸回収方法であって、
上記捕捉工程では、 3 5 0 L / s より小さい （ただし、 0を除く） 吸引速度で当該核酸捕捉用容器内に溶液を吸引する核酸回収方法。
3 0 . 請求の範囲 2 7記載の核酸回収方法であって、
上記捕捉工程では、 5 0 0 / L / sより小さい （ただし、 0は除く） 吐出速度で吸引した溶液を当該核酸捕捉用容器から吐出する核酸回収方 法。
3 1 . 請求の範囲 2 7記載の核酸回収方法であって、
上記捕捉工程では、 前記吸引速度が 5 0 0 L Z sより大きく、 前記 吐出速度が前記吸引速度より大きい核酸回収方法。
3 2 . 核酸を捕捉できる固相を有する核酸捕捉用容器を備え、 以下のェ 程を行うための構成を有する核酸回収装置。
( 1 ) 核酸を含む試料から当該核酸を遊離させる遊離工程
( 2 ) 遊離した核酸を含む溶液に、 核酸捕捉用容器内に配設された固相 と当該核酸との結合を促進する物質を添加し、 5 0 0 3 ょ り小さい （ただし、 0を除く） 吸引速度で当該核酸捕捉用チップ 内に溶液を吸引し、 1 0 0 0 L/ sより小さい （ただし、 0を 除く） 吐出速度で吸引した溶液を当該核酸捕捉用容器から吐出す る捕捉工程
( 3 ) .前記固相に捕捉された核酸以外の成分を除去することができる溶 液を前記核酸捕捉用容器内に吸引し、 吸引した溶液を当該核酸捕 捉用容器から吐出する洗浄工程
(4) 前記固相に捕捉された核酸を当該固相から溶離することができる 物質を含む溶液を前記核酸捕捉用容器内に吸引し、 吸引した溶液 を当該核酸捕捉用容器から吐出する溶離工程
3 3. 核酸を捕捉できる固相を有する核酸捕捉用容器に核酸を含む溶液 を吸引し、 該溶液を吐出して前記固相に核酸を捕捉し、 前記固相に捕捉 された核酸を分離できる溶液を前記核酸捕捉容器に吸引して捕捉した核 酸を前記固相から分離し、 前記溶液に含まれる核酸含有溶液を生産する 核酸含有溶液生産方法であって、
核酸生産率 （前記溶液に含まれる核酸濃度 （N s ) と、 生産された核 酸含有溶液に含まれる核酸濃度 （N r ) との比 （N r ZN s )) が 1 0 % 以上になるように吸引速度と吐出速度を制御する核酸含有溶液生産方法,
34. 核酸を捕捉できる固相を有する核酸捕捉用容器に核酸を含む溶液 を吸引し、 該溶液を吐出して前記固相に核酸を捕捉し、 前記固相に捕捉 された核酸を分離できる溶液を前記核酸捕捉容器に吸引して前記溶液に 含まれる核酸を含有する核酸含有溶液を生産し、 該核酸含有溶液の核酸 濃度から前記溶液の核酸濃度を調べる核酸濃度測定方法であって、 核酸回収率 （前記溶液に含まれる核酸濃度 （N s ) と、 前記核酸含有 溶液に含まれる核酸濃度 （N r ) との比 （N rZN s )) と、 吸引速度、 及び z又は吐出速度との関係に関する情報に基づいて、 前記核酸含有溶 液に含まれる核酸濃度 （N r ) と吸引速度又は/及び吐出速度かも前記 溶液の核酸濃度を算出する核酸濃度測定方法。
3 5. 以下の構成を含む核酸回収装置。
( 1 ) 核酸を含む溶液を保持する容器
(2) 回収した核酸を保持する容器
(3) 前記溶液を収容する空間と、 核酸を捕捉する固相と、 前記溶液を 吸引し、 及び排出するための液体吸排用開口部と、 前記空間の内 圧を変化させるための圧力調整用開口部とを有する核酸捕捉用容
(4) 前記核酸捕捉容器の吸引速度又はノ及び吐出速度が、 核酸を含む 溶液の核酸濃度が 1 02 I UZmLから 1 06 I UZmLの範囲 内にあるときに核酸回収率 （前記溶液の核酸濃度 （N s ) と回収 された核酸濃度 （N r ) との比 （N r ZN s )) がほぼ一定値と なる吸引速度又は Z及び吐出速度となるように、 核酸捕捉用容器 の内圧を制御する制御機構
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