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WO2003038032A2 - Mittel zur hemmung der synthese von virusproteinen - Google Patents

Mittel zur hemmung der synthese von virusproteinen Download PDF

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WO2003038032A2
WO2003038032A2 PCT/DE2002/004052 DE0204052W WO03038032A2 WO 2003038032 A2 WO2003038032 A2 WO 2003038032A2 DE 0204052 W DE0204052 W DE 0204052W WO 03038032 A2 WO03038032 A2 WO 03038032A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vpr
hiv
cypa
inhibitors
cyclophilin
Prior art date
Application number
PCT/DE2002/004052
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English (en)
French (fr)
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WO2003038032A3 (de
WO2003038032A8 (de
Inventor
Uwe Tessmer
Karsten Bruns
Ulrich Schubert
Original Assignee
Viromics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Viromics Gmbh filed Critical Viromics Gmbh
Priority to DE20220744U priority Critical patent/DE20220744U1/de
Priority to AU2002347102A priority patent/AU2002347102A1/en
Priority to EP02782752A priority patent/EP1439853A2/de
Publication of WO2003038032A2 publication Critical patent/WO2003038032A2/de
Publication of WO2003038032A8 publication Critical patent/WO2003038032A8/de
Publication of WO2003038032A3 publication Critical patent/WO2003038032A3/de

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV

Definitions

  • the invention relates to agents for inhibiting lentiviruses and in particular to the use of PPIase inhibitors as agents for inhibiting the lentivirus protein R of primates (virus protein R - Vpr), especially the human immunodeficiency viruses type 1 and 2 (HIV-1 and HIV-2 ) and the monkey (Simian) immunodeficiency virus (SIV).
  • PPIase inhibitors as agents for inhibiting the lentivirus protein R of primates (virus protein R - Vpr), especially the human immunodeficiency viruses type 1 and 2 (HIV-1 and HIV-2 ) and the monkey (Simian) immunodeficiency virus (SIV).
  • Vpr interacts with the enzyme cyclophilin A (CyPA) and that this interaction can be inhibited by the agent cyclosporin (CsA).
  • CsA cyclophilin A
  • This Vpr-CyPA interaction is essential for the protein stability, folding and function of Vpr.
  • CsA as well as other PPIase inhibitors, the function of Vpr can be blocked due to ⁇ 5 of this newly recognized connection.
  • the invention describes the new finding that after treatment of an HIV-infected cell with the inhibitor CsA, the Vpr becomes unstable and therefore can no longer function in the replication cycle of HIV. Due to the fact that Vpr is an important pathogenicity factor in the clinical picture of an HIV infection, CsA and other PPIase-
  • inhibitors for the treatment of AIDS can be used as a novel anti-retroviral therapy.
  • PPIases 25 peptidylprolyl isomerases are a group of cytosolic enzymes that were originally characterized by their ability to catalyze the cis-trans isomerization of c / s-peptidylprolyl bonds within a protein. It was later discovered that these PPIases are the direct target of certain immunosuppressive drugs, including cyclosporin A (CsA), FK506 and rapamycin. Newer me-
  • CsA immunosuppressive are the substances "SDZ NIM811" and “SanglipherinA” developed by Novartis. These PPIases are also called immunophilins. Immunophilins are widespread and highly expressed in higher eukaryotes. It it can therefore be assumed that PPIases play an important role in cell physiology. This role is not yet understood, essential and according to the nature of PPIases, these enzymes have an important function for the correct folding and expression of proteins, including multiprotein complexes such as Ca (2+) ion channels, steroid-receptor complexes and receptors for the thyrosine kinase.
  • multiprotein complexes such as Ca (2+) ion channels, steroid-receptor complexes and receptors for the thyrosine kinase.
  • the PPIase inhibitors CsA and FK506 are natural products from microorganisms and potent inhibitors because they form a specific complex with PPIases.
  • Serine / threonine protein phosphatase calcineurin (CN) is a well-characterized target for the effects of CsA.
  • the HIV replication cycle begins when the virus binds to various cell receptors, among which the CD4 glycoprotein acts as the primary receptor. Virus entry occurs through pH-independent membrane fusion, followed by the "uncoating" of the virus particles in the cytosol.
  • the viral RNA genome is transcribed by means of enzymatic activities of reverse transcriptase (RT), RNase H and polymerase into double-stranded DNA, which is then transported in association with the pre-integration complex into the cell nucleus and is inserted as a provirus genome in chromosomal DNA using viral integrase.
  • RT reverse transcriptase
  • RNase H reverse transcriptase
  • polymerase reverse transcriptase
  • Gag / Gag-Pol polyproteins and envelope proteins are transported to the cell membrane, where virions are assembled.
  • the virus particles mature through proteolytic processing of the Gag / Gag-Pol polyproteins (for review see Martin, 1993).
  • HIV-1 encodes other genes: tat and rev are essential for virus replication; Tat is the main transactivator of the virus promoter and Rev performs post-transcriptional functions by regulating the transport of unspliced gaglpol and simply spliced vif, vpr and vpu / env mRNAs from the cell nucleus into the cytoplasm (for review see Trono, 1995).
  • nef vif vpr and vpu are not absolutely necessary for virus replication in cell cultures and are therefore usually referred to as "accessory" genes.
  • the gene vpr was first described in 1987 as a small open reading frame in the genome of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and was designated with the letter "R".
  • the vpr gene is conserved among all known isolates of HIV-1 and HIV-2 as well as the monkey immunodeficiency virus (SIV) and is therefore also called the lentivirus protein Vpr.
  • Vpr has various biological activities such as: oligomerization, localization in and transport of the viral pre-integration complex to the cell nucleus, transcriptional activation of HIV-1 and heterologous virus promoters, induction of cell differentiation and cell cycle arrest, binding and interaction with various cellular proteins, especially the glucocorticoid receptor (GR) and enhancement of the effect of steroid hormones (for review see Emerman, 1996).
  • oligomerization localization in and transport of the viral pre-integration complex to the cell nucleus
  • transcriptional activation of HIV-1 and heterologous virus promoters induction of cell differentiation and cell cycle arrest
  • binding and interaction with various cellular proteins especially the glucocorticoid receptor (GR) and enhancement of the effect of steroid hormones (for review see Emerman, 1996).
  • GR glucocorticoid receptor
  • Vpr is necessary for the development of AIDS-like symptoms in SlV-infected rhesus monkeys, or that point mutations in the vpr gene revert to functional Vpr in vivo as the infection spreads (Lang et al., 1993 ). Furthermore, the double mutations in vpx and vpr of SIV- mac 239 prevent AIDS progression (Gibbs et al, 1995). Vpr is the only accessory protein that is incorporated into virus particles in significant amounts and through a specific mechanism.
  • Vpr occurs early in the HIV replication cycle, immediately after membrane fusion and "uncoating" of the invading virus particle.
  • anti-Vpr drugs showed that vpr-specific antisense constructs can suppress HIV-1 virus replication in macrophages (Balotta et al, 1993). Vpr supports virus replication in differentiated, no longer dividing primary human monocytes / macrophages (Heinzinger et al, 1994). This fact is justified by the fact that Vpr is no longer part of the import of the viral pre-integration complex into the cell nucleus. lent cells is necessary and HIV can infect differentiated cells regardless of cell mitosis.
  • Vpr induces cell differentiation and cell cycle arrest and causes transport and various functions in the cell nucleus. Since Vpr, as part of the pre-integration complex, influences elementary processes of the cell in the interest of virus replication, it is understandable that Vpr enters into specific connections with cellular factors. For example, an interaction of Vpr with an approximately 200 kDa protein and with a 41 kDa cellular protein as a complex with the human glucocorticoid receptor type II (GR-II) was observed (Refaeli et al., 1995).
  • GR-II human glucocorticoid receptor type II
  • Vpr also suppresses T cell receptor-mediated apoptosis and T cell activation (activation of lymphokine expression IL-2, IL-10, IL-12, TNF-alpha and IL-4) by influencing NF- K B activity (Ayyavoo et al ., 1997). Vpr is also said to enter into a specific interaction with the second UBA (ubiquitin associated) domain of the human DNA repair protein HHR23A, which forms a three-helix bundle structure (Diekmann et al., 1998).
  • UBA ubiquitin associated
  • Vpr also interacts directly with the glucocorticoid receptor and various transcription factors and can thus, as a co-activator, increase the effect of glucocorticoids in different cell lines (Kino et al., 1999).
  • the effect of Vpr as a glucocorticoid coactivator is believed to contribute to increased glucocorticoid sensitivity and thereby to the pathogenesis of AIDS.
  • CyPA and Cyclophilin B interact with HIV-1 Gag proteins and are therefore incorporated in significant amounts into HIV-1 virions during virus assembly (Luban et al., 1999; Franke et al., 1994) , CyPA binds to a proline-rich sequence in HIV-1 gag, but a cis / trans isoproline phenomenon is not known for gag. It is therefore assumed that CyPA only binds to Gag, but does not have any enzymatic function for folding Gag.
  • the incorporation of CyPA in HIV-1 virions is regulated by an exposed proline-rich loop sequence in the N-terminal region of the HIV-1 capsid (CA), p24 CA , within the Pr55 Gag polyprotein.
  • CyPA - / - cell line is also used in the present description of the invention, but only to test the effect of CyPA on the expression and function of Vpr.
  • the HIV-1 Vpr is conserved in all lentiviruses, including the immunodeficiency-inducing viruses HIV-1 and HIV-2, the causative agents of AIDS in humans, and SIV, the causative agents of monkey AIDS and in lower and higher primates. Vpr is therefore also referred to as the lentivirus protein R. Vpr plays a crucial role in the pathogenesis of AIDS. Blocking Vpr therefore has decisive potential for novel anti-viral strategies.
  • Vpr For the biological function of Vpr, it is necessary that this protein is expressed in sufficient quantities in the infected cell in order to also be incorporated into the maturing virus particle in the process of assembly, budding, and the release of progeny viruses . It is essential that Vpr is the only regulatory HIV protein that is incorporated into progeny viruses in significant quantities. As a result, Vpr is part of the invading virus in the process of infection and can therefore influence important processes in the early phase of HIV infection before the new synthesis of viral proteins is initiated. Inhibiting the incorporation of Vpr in progeny viruses is therefore a relevant approach for an anti-viral strategy.
  • the CyPA-Gag interaction is limited to HIV-1 only.
  • the HIV-2 and SIV gag proteins do not contain CypA binding motifs, while the CyPA binding motif is contained in all of the HIV-1, HIV-2 and SIV Vpr proteins.
  • the invention has for its object to provide means for inhibiting the virus protein R (Vpr).
  • Vpr virus protein R
  • the problem was solved by using inhibitors of peptidylprolyl isomerases (PPIases) - the peptidylprolyl isomerase inhibitors (PPIase inhibitors).
  • PPIases peptidylprolyl isomerases
  • PPIase inhibitors peptidylprolyl isomerase inhibitors
  • all compounds are suitable which block the enzymatic function of PPIases.
  • the inhibitors according to the invention are administered in pharmaceutical preparations. These active substances are compounds which contain inhibitors of the cellular chaperones of the class of the PPIases or immunophilins. In particular, these inhibitors are said to inhibit the PPIases CyPA and CyPB.
  • These agents, the PPIase inhibitors include the drugs CyclosporinA (CsA), FK506, Rapamycin, SDZ NIM811, and Sanglipherin
  • CyPA an 18 kDa protein in the cytosol, human genome name PPIA;
  • CyPB an 18-20 kDa protein in the endoplasmatic see reticulum, human genome name PPIB;
  • CyPC an 18 kDa protein in the secretory pathway, human genome name PPIC;
  • CyPF or Cyp3 an 18-22 kDa protein in the inner membrane of the mitochondrion, human genome name PP1F;
  • CyPM or PPIL1 an 18 kDa protein in the cytosol, human genome name PPIL1; USA-CyP or Cyp20: a 20 kDa protein in the cell nucleus, human genome name USA-CYP;
  • CyPE or Cyp33A a 40 kDa protein in the cell nucleus, human genome name PPIE;
  • Cyp40 a 40 kDa protein in the cytosol and cell nucleus, human genome name PP1D;
  • Cyp60 a 60 kDa protein in the cell nucleus, human genome name PPIL2;
  • Hal539-CyP a 60kDa protein, human genome name CYP; - NK-TRCyP: an 89 kDa protein in the cell nucleus, human genome name NKTR;
  • NUP-358 a 358 kDa protein in the cell nucleus, human genome name RAN-BP1 (Braaten and Luban, 2001).
  • An essential characteristic of these inhibitors is that they block the enzymatic function of PPIases. As a result, the cis / trans isomerization of prolyl-peptide bonds in proteins can no longer take place. As a major consequence of the use of these agents, the high proportion of prolyl residues in the cis conformation within the N-terminus of Vpr is preserved. However, this cis conformation is disadvantageous for the expression and the stability function of Vpr.
  • Vpr no functional Vpr molecules can be expressed in an HIV-infected cell.
  • Vpr is inactivated in the course of HIV infection. Since Vpr is an important pathogenicity factor in the course of an HIV infection, these agents can be used for the treatment of AIDS and for the treatment and prevention of infection with the lentiviruses HIV-1, HIV-2 and SIV.
  • Vpr interacts with certain cellular factors. In the HIV host cell, these factors are chaperones, enzymes which regulate the folding of proteins and are generally assigned to the class of cis / trans prolylpeptidyl isomerases (PPIases).
  • the class of PPIases also includes enzymes with the names immunophilins or cyclophilins.
  • the enzymes CyclophilinA and B (CyPA and CyPB) belong to the immunophilins.
  • Essential to the invention is our finding that conserved prolines occur in the N-terminus of Vpr in an unusually high proportion in the cis conformation.
  • a recognition sequence for PPIases is contained in the N-terminus of Vpr.
  • the PPIase CyPA binds to Vpr. This binding is released by the PPIase inhibitor CsA. After inactivation of CyPA by CsA or after inactivation of CyPA, Vpr becomes unstable.
  • Vpr from HIV-1 binds to CyPA.
  • Vpr has the ability to interact with PPIases and whether this interaction is important for the protein stability of Vpr.
  • a sequence comparison of over 150 known Vpr sequences from a wide variety of HIV-1 isolates clearly shows that all four proline residues that contribute to the above-mentioned s / tr ⁇ ns phenomenon (proline residues in positions 4, 10, 14 and 35) are contained in all previously known Vpr sequences; A biological function of these proline residues was therefore further investigated according to the invention (FIG. 4).
  • CyPA inhibitors reduce the protein stability and expression of HIV-1 Vpr and thereby block the biological function of Vpr in an HIV-infected cell.
  • the inhibitors of Cypa reduce the expression, the stability and thus the amount of Vpr in an HIV-infected cell and consequently the amount of Vpr that can be incorporated into a maturing progeny virus. drastically reduced to such an extent that after application of CyPA inhibitors, no biological activity of Vpr is detectable. Since a specific interaction between CyPA and Vpr was determined and this influences the folding and the stability of Vpr, it was investigated - derived from the molecular, biochemical and structural findings according to the invention (as stated above) - whether inhibitors of CyPA (these are known and have been used in the treatment of certain diseases as immunosuppressants for years), i.e.
  • Vpr-transmitted increase in virus production in HIV-infected monocytes / macrophages as well - Vpr-mediated co-activation of the glycocorticoid receptor. It was also found
  • CsA prevents the interaction of Vpr with other cellular factors, such as with the glycocorticoid receptor, and
  • CsA prevents the transport of Vpr in the cell, especially to the cell nucleus.
  • CsA reduces the amount of Vpr in an HIV-infected cell (FIG. 9). It was further observed that after the addition of CsA in a dose-dependent mechanism, the amount of Vpr in the cell (FIG. 10) as well as in the released virions is reduced. It is now observed for the first time that the binding of CyPA to Vpr is essential for its stability. It was further recognized that after inactivation of CyPA by the administration of CsA, the Vpr after inhibition of the main protease and after application of proteasome inhibitors, the extremely rapid loss of Vpr cannot be restored.
  • Vpr-containing virions are detected that are released by HIV-1 infected CyPA - / - cells. It is also found that the Vpr-induced G2 cell cycle arrest is undetectable in CyPA - / -.
  • the solution according to the invention thus provides evidence that the function of Vpr is lost without the action of the folding enzyme CyPA and / or other PPIases (either after inhibition by PPIase inhibitors, such as, for example, the CyPA inhibitor CsA, or after genetic inactivation) ,
  • PPIase inhibitors such as CsA
  • CsA PPIase inhibitors
  • CsA and other PPIase inhibitors switch off the function of the essential regulatory protein Vpr by the agents according to the invention and thereby prevent, switch off, block, negatively regulate or influence the HIV replication cycle.
  • CyPA only interacts with p24 A of HIV-1, but not with the gag proteins of other lentiviruses, -
  • the anti-viral effect of CsA on HIV-1 does not include the function of Vpr.
  • a cell already infected with HIV-1 is no longer affected by CsA; the inhibitory effect of CsA on p24 CA is only active in the infection process.
  • CyPA co-translationally regulates the folding, expression and stability of a viral protein. No such mechanism has been demonstrated for any viral or cellular protein.
  • the essence of the invention lies in the use of known agents for a new purpose and in a combination of known elements - the inhibitors of peptidylprolyl isomerases (PPIase inhibitors) - and a new effect - their use in influencing the primates lentiviruses HIV-1, HIV -2 and SIV - which, in their new overall effect, result in an advantage and the desired success, which lies in the fact that means are now available for inhibiting the virus protein R necessary for virus replication.
  • the invention further relates to the use of PPIase inhibitors for the production of agents for the inhibition of primates lentiviruses.
  • HIV-induced dementia HIV-induced disorders in lipid metabolism, especially HLS syndrome (HIV-associated lipodystrophy syndrome).
  • HIV-induced disorders in kidney function especially the HIV AN syndrome (HIV associated nephropathy).
  • the invention relates in summary to the use of PPIase inhibitors as agents for the inhibition of primates lentiviruses, human immunodeficiency viruses types 1 and 2 (HIV-1 and HIV-2) and Simian immunodeficiency viruses (SIV).
  • Vpr HIV-1 virus protein R
  • PPIases cellular cis / trans peptidylprolyl isomerases
  • the anti-viral effect of PPIase inhibitors, especially CyclosporinA is based on a specific interaction of PPIases, especially CyclophilinA, with chocolates in the N-terminus of Vpr.
  • Areas of application are anti-retroviral therapy and prevention of infections with lentiviruses that cause immunodeficiency in animals and humans, in particular AIDS or HIV-induced pathological symptoms, also in combination with other anti-retroviral drugs.
  • Example 1 Detection of the Vpr-CyPA interaction using BIAcore spectroscopy
  • Flow cell 1 was used as a reference without CyPA coupling Peptide Vpr 1'40 was injected into a flow buffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 50 ⁇ M EDTA, 0.005% Tween 20, pH 7.4) over all flow cells in a concentration range from 1 to 250 ⁇ M, at a flow rate of 5 ⁇ l / min. All data were measured at 2.5 Hz during a 120 sec association and dissociation phase. In general, the CyPA-Vpr 1 "40 interaction reached equilibrium within 30 sec.
  • Vpr 1 "40 was used in a concentration range of 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 and 250 ⁇ M, CyPA was bound to the chip matrix with a constant concentration. All data were corrected on the RU data of the control cell (without CyPA). The measurements were repeated at least three times with different CyPA and Vpr preparations and were reproducible at all times.
  • the following mutants were also tested, which contain Pro-Asn amino acid changes in the positions critical for the CyPA interaction: Mutant Vpr 1 "40 , P 5,10 '14 -N (Pro-Asn exchange in positions 5, 10 and 14, Fig.
  • Example 3 The expression of Vpr in HIV-1 infected cells CyPA - / - knock out cells is reduced
  • Vpr protein of human immunodeficiency virus type 1 influences nuclear localization of viral nucleic acids in nondividing host_cells. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91: 7311-7315.
  • the HIV-1 virion-associated protein Vpr is a coactivator of the human glucocorticoid receptor.
  • Figure 1 Evidence of structural instability of Vpr N-terminus using CD spectroscopy.
  • FIG. 2 High-resolution structure of Vpr N-terminus by means of 1H NMR at Vpr 1 "40 .
  • Figure 3 Detection of cis / trans isomerism in proline residues of Vpr by means of ⁇ NMR spectroscopy.
  • FIG. 4 A CyPA binding motif is conserved by the Vpr in the N-terminus.
  • the amino acid sequence is shown of Vpr of the isolate HIV-I N L ".
  • the amino acid positions conserved in all previously known HIV-1 isolates are marked in bold. It can be seen that the amino acid positions, Pro-4, Pro-10, Pro-14 and Pro-35, which are found in the context of the invention and which are important for the interaction between Vpr and CypA, have a high degree of conservation.
  • the secondary structural elements in the N-terminus of Vpr are shown.
  • Figure 5 Detection of Vpr-CyPA interaction using Far-Western blot.
  • 6 to 8 binding studies on Vpr and CypA using BlAcore or plasmon resonance spectroscopy.
  • HeLa cells were transfected with the proviral pNL4-3, radioactively labeled with [ 35 S] -methionine for 25 min and then subjected to an 8-hour chase in the absence of radioactivity.
  • Vpr was immunoprecipitated with polyclonal antiserum and Gag proteins with anti-p24 CA antibodies. The relatively small amount of Vpr as well as the percentage stability are shown.
  • FIG. 10 CsA causes a very rapid loss of Vpr.
  • HeLa cells were transfected with the Vpr expression vector CMV-VprFlag, pulse-labeled for 5 min with [ 35 S] -met and subjected to a 60 min chase. After cell lysis, the cell lysates were separated by centrifugation into nuclear and cytosol fractions, and Vpr was immunoprecipitated using anti-flag monoclonal antibodies. As a result, it is found that in the presence of CspA, less Vpr is contained in both the cell nucleus and the cytosol fraction.
  • FIG. 12 The expression on Vpr in CypA knock out cells is reduced.
  • Jurkat cells, human CD4 + T cells, either as wild type or as a genetically modified variant in which both CypA alleles are mutated by genetically knocking out (CypA - / -), were infected with HIV-1NL4-3 and for 7 days cultured.
  • CypA - / - genetically knocking out
  • both cultures were subjected to a pulse chase experiment (5 min pulse, 8 hr chase).
  • Gag and Vpr proteins were immunoprecipitated using anti-Gag and anti-Vpr antibodies, separated in 10-16% SDS-PAGE and visualized by fluorography.
  • Vpr is significantly reduced relative to the amount of p24CA in the knock out culture CypA - / -. This demonstrates according to the invention that CypA is necessary for the expression and stability of Vpr.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Mittel zur Hemmung von Primaten Lentiviren und insbesondere die Verwendung von PPIase-Inhibitoren als Mittel zur Hemmung von Humanen Immundefizienzviren Typ 1 und 2 (HIV-1 und HIV-2) sowie von Simian Immundefizienzviren (SIV). Anhand des Virusproteins R (Vpr) wird gezeigt, dass Inhibitoren von zellulären cis/trans Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen) sowohl die Expression, Faltung, Proteinstabilität als auch die biologische Wirksamkeit von Vpr hemmen. Die anti-virale Wirkung von PPIase-Inhibitoren, speziell von CyclosporinA, beruht auf einer spezifischen Wechselwirkung von PPIasen, speziell von CyclophilinA, mit Prolinen im N-Terminus von Vpr. Anwendungsgebiete sind die antiretrovirale Therapie und Vorbeugung bei Infektionen mit Immundefizienz verursachenden Lentiviren bei Tieren und Menschen, insbesondere von AIDS oder HIV-induzierten pathologischen Erscheinungen, auch in Kombination mit anderen anti-retroviralen Medikamenten.

Description

Mittel zur Hemmung von Lentiviren
Beschreibung
5 Die Erfindung betrifft Mittel zur Hemmung von Lentiviren und insbesondere die Verwendung von PPIase-Inhibitoren als Mittel zur Hemmung des Lentivirusproteins R von Primaten (Virusprotein R - Vpr), vor allem der Humanen Immundefizienzviren Typ 1 und 2 (HIV-1 und HIV-2) sowie der Affen- (Simian)-Immunodefizienzviren (SIV). Diese Mittel sind insbesondere dazu geeignet, die Wechselwirkung von Vpr mit einer Klasse von zellulären Chaperonen,
IO den cis/trans Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen), zu unterbinden. Dabei wird insbesondere festgestellt, dass Vpr mit dem Enzym Cyclophilin A (CyPA) in Wechselwirkung tritt und dass diese Wechselwirkung durch das Mittel Cyclosporin (CsA) gehemmt werden kann. Diese Wechselwirkung Vpr-CyPA ist essentiell für die Proteinstabilität, die Faltung und die Funktion von Vpr. Durch das Mittel CsA, sowie anderen Hemmern von PPIasen, kann aufgrund ι5 dieses neu erkannten Zusammenhanges die Funktion von Vpr blockiert werden. Die Erfindung beschreibt die neue Erkenntnis, dass nach Behandlung einer HlV-infizierten Zelle mit dem Inhibitor CsA das Vpr instabil wird und daher seine Funktion im Replikationszyklus von HIV nicht mehr ausüben kann. Aufgrund der Tatsache, dass Vpr ein wichtiger Pathogenitäts- faktor in dem Krankheitsbild einer HIV-Infektion ist, können CsA und andere PPIase-
20 Inhibitoren für die Behandlung von AIDS als neuartige anti-retrovirale Therapie eingesetzt werden.
Stand des Wissens
1. Immunophiline (PPIasen) als zelluläre Chaperone
25 Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen) stellen eine Gruppe von zytosolischen Enzymen dar, welche ursprünglich durch ihre Fähigkeit charakterisiert wurden, die cis-trans Isomerisierung von c/s-Peptidylprolylbindungen innerhalb eines Proteins zu katalysieren. Später hat sich herausgestellt, dass eben diese PPIasen das direkte Target von bestimmten immunosuppressiven Medikamenten sind, dazu zählen Cyclosporin A (CsA), FK506 und Rapamycin. Neuere Me-
30 dikamente, welche nicht wie
CsA immunosuppressiv wirken, sind die von der Firma Novartis entwickelten Substanzen "SDZ NIM811" und "SanglipherinA". Diese PPIasen werden auch als Immunophiline bezeichnet. Immunophiline sind weit verbreitet und hoch exprimiert in höheren Eukaryoten. Es ist daher anzunehmen, dass PPIasen eine wichtige Rolle in der Zellphysiologie spielen. Diese Rolle ist bislang noch nicht verstanden, wesentlich und der Natur von PPIasen entsprechend, haben diese Enzyme eine wichtige Funktion für die korrekte Faltung und Expression von Proteinen, dazu zählen Multiproteinkomplexe wie zum Beispiel Ca(2+)-Ionenkanäle, Steroid- Rezeptorkomplexe und Rezeptoren für die Thyrosinkinase. Die PPIase-Inhibitoren CsA und FK506 sind Naturprodukte aus Mikroorganismen und potente Inhibitoren, da sie einen spezifischen Komplex mit PPIasen eingehen. Als ein gut charakterisiertes Target für die Wirkung von CsA gilt die Serin/Threonin-Proteinphosphatase Calcineurin (CN). Für Review dieses Abschnittes siehe Ivery, 1999, 2000.
2. HIV und PPIasen
2.1. Replikationszyklus von HIV
Der Replikationszyklus von HIV beginnt mit der Bindung des Virus an verschiedene Zellrezeptoren, unter denen das Glykoprotein CD4 als der primäre Rezeptor fungiert. Der Virusein- tritt erfolgt durch pH-unabhängige Membranfusion, gefolgt von dem "uncoating" der Viruspartikel im Zytosol. Das virale RNA-Genom wird mittels enzymatischer Aktivitäten von Reverser Transkriptase (RT), RNase H und Polymerase in doppelsträngige DNA umgeschrieben, welche dann in Assoziation mit dem Präintegrationskomplex in den Zellkern transportiert und als Provirusgenom in chromosomale DNA mittels viraler Integrase eingebaut wird. Nach Transkription und Translation werden Gag/Gag-Pol-Polyproteine sowie Hüllproteine an die Zellmembran transportiert, wo die Assemblierung von Virionen erfolgt. Nach Budding und Abschnürung reifen die Viruspartikel durch proteolytische Prozessierung der Gag/Gag-Pol- Polyproteine (für Review siehe Martin, 1993).
2.2. Bedeutung akzessorischer Virusgenprodukte im Replikationszyklus von HIV-1
Zusätzlich zu den Prototyp-Retrovirusgenen gag,pol und env kodiert HIV-1 weitere Gene: tat und rev sind essentiell für die Virusreplikation; Tat ist der Haupttransaktivator des Viruspromoters und Rev übt posttranskriptionelle Funktionen aus, indem es den Transport von nicht gespleißter gaglpol sowie einfach gespleißter vif, vpr und vpu/env mRNAs aus dem Zellkern in das Zytoplasma reguliert (für Review siehe Trono, 1995). Dagegen sind nef vif vpr und vpu für die Virusreplikation in Zellkulturen nicht unbedingt erforderlich und werden daher gewöhnlich als "akzessorische" Gene bezeichnet. Es mehren sich jedoch Hinweise in der Lite- ratur, wonach diese Proteine die Infektionsausbreitung und die Krankheitsprogression einzelner Viren in vivo wesentlich bestimmen. Weiterhin haben Experimente in vitro gezeigt, dass einzelne dieser akzessorischen Proteine in bestimmten Zellkulturen, insbesondere in kultivierten primären humanen Monozyten/Makrophagen, eine essentielle Funktion für die Virusrepli- kation ausüben.
2.3. Das akzessorische Regulatorprotein Vpr
Das Gen vpr wurde erstmals 1987 als ein kleiner offener Leserahmen im Genom des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) beschrieben und mit dem Buchstaben "R" bezeich- net. Das vpr Gen ist unter allen bekannten Isolaten von HIV-1 und HIV-2 wie auch den Affen- Immundefizienzviren (SIV) konserviert und wird daher auch als das Lentivirus-Protein Vpr bezeichnet. Vpr besitzt diverse biologische Aktivitäten wie zum Beispiel: Oligomerisierung, Lokalisation im und Transport des viralen Präintegrationskomplexes zum Zellkern, Transkriptionsaktivierung von HIV-1 und heterologen Viruspromotoren, Induktion von Zelldifferenzie- rung und Zellzyklusarrest, Bindung und Wechselwirkung mit verschiedenen zellulären Proteinen, insbesondere dem Glucocorticoidrezeptor (GR) und Verstärkung der Wirkung von Ste- roidhormonen (für Review siehe Emerman, 1996).
2.4. Biologische Funktionen von Vpr Studien im Tiermodell zeigten, dass Vpr für die Entwicklung von AIDS-ähnlichen Symptomen in SlV-infizierten Rhesusaffen erforderlich ist, beziehungsweise dass Punktmutationen im vpr Gen im Verlauf der Infektionsausbreitung in vivo zu funktionellem Vpr revertieren (Lang et al., 1993). Weiterhin verhindern die Doppelmutationen in vpx und vpr von SIV- mac239 die AIDS-Progression (Gibbs et al, 1995). Vpr ist das einzige akzessorische Protein, welches in signifikanten Mengen und durch einen spezifischen Mechanismus aktiv in Viruspartikel eingebaut wird. Diese Tatsache führte zu der Vermutung, dass die Wirkung von Vpr frühzeitig im HIV-Replikationszyklus erfolgt, unmittelbar nach Membranfusion und "uncoating" des eindringenden Viruspartikels. Studien über eine mögliche Anwendung von "anti- Vpr-Drogen" zeigten, dass vpr spezifische antisense-Konstrukte die HIV- 1 -Virusreplikation in Makrophagen unterdrücken können (Balotta et al, 1993). Vpr unterstützt die Virusreplikation in ausdifferenzierten, sich nicht mehr teilenden primären humanen Monozyten/Makrophagen (Heinzinger et al, 1994). Diese Tatsache wird dadurch begründet, dass Vpr für den Import des viralen Präintegrationskomplexes in den Zellkern von sich nicht mehr tei- lenden Zellen notwendig ist und dadurch HIV unabhängig von der Zellmitose ausdifferenzierte Zellen infizieren kann.
Weiterhin ist bekannt, dass Vpr Zelldifferenzierung und Zellzyklusarrest induziert und den Transport sowie verschiedene Funktionen im Zellkern bewirkt. Da Vpr als Bestandteil des Präintegrationskomplexes elementare Prozesse der Zelle im Interesse der Virusreplikation beeinflusst, ist verständlich, dass Vpr spezifische Verbindungen mit zellulären Faktoren eingeht. Zum Beispiel wurde eine Wechselwirkung von Vpr mit einem ca. 200 kDa großen Protein sowie mit einem 41 kDa zellulären Protein als Komplex mit dem humanen Glucocorticoidrezeptor Typ II (GR-II) beobachtet (Refaeli et al., 1995). Weiterhin unterdrückt Vpr die T-Zellrezeptor-vermittelte Apoptose und T-Zellaktivierung (Aktivierung der Lymphokinexpression IL-2, IL-10, IL-12, TNF-alpha und IL-4) durch Beeinflussung der NF-KB Aktivität (Ayyavoo et al., 1997). Weiterhin soll Vpr mit der zweiten UBA (ubiquitin associated) Domäne des humanen DNA-Reparaturproteins HHR23A eine spezifische Wechselwirkung eingehen, welche eine drei-helix-Bündelstruktur bildet (Diekmann et al., 1998). Vpr tritt ebenfalls in direkte Wechselwirkung mit dem Glucocorticoidrezeptor sowie verschiedenen Transkriptionsfaktoren und kann dadurch, sozusagen als Co-Aktivator, die Wirkung von Glucocorticoiden in verschiedenen Zelllinien erhöhen (Kino et al., 1999). Es wird angenommen, dass die Wirkung von Vpr als Glucocorticoid-Coaktivator zu einer erhöhten Glucocorticoid-Sensitivität und dadurch zur Pathogenese von AIDS beiträgt.
2.5. HIV-Gag und CyPA
Über eine Wechselwirkung von Vpr mit dem zellulären Chaperon CyPA oder anderen Cyc- lophilinen, wie dies erstmals in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung dargestellt wird, wurde bislang weder in der Fach- noch in der Patentliteratur berichtet. Bislang wurde lediglich berichtet, dass CyPA für die maximale Infektiosität von HIV-1, nicht aber von HIV-2 oder anderen Lentiviren notwendig ist (für Review siehe Luban, 1996). Bekannt ist, dass CyPA und Cyclophilin B (CypB) mit HIV-1 Gag Proteinen in Wechselwirkung treten und daher in signifikanten Mengen in HIV-1 Virionen während der Virusassemblierung eingebaut werden (Luban et al., 1999; Franke et al., 1994). CyPA bindet an eine Prolin-reiche Sequenz in HIV-1 Gag, ein cis/trans Isoprolin-Phänomen ist jedoch für Gag nicht bekannt. Es wird daher angenommen, dass CyPA nur an Gag bindet, jedoch keine enzymatische Funktion für die Faltung von Gag ausübt. Der Einbau von CyPA in HIV-1 Virionen wird durch eine exponierte Prolin-reiche Loop- Sequenz in der N-terminalen Region des HIV-1 Capsid (CA), p24CA, innerhalb des Pr55 Gag- Polyproteins, reguliert. Diese Wechselwirkung soll wesentlich für die Faltung von Gag nach Virusassemblierung sein (Dietrich et al., 2001). Da HIV-1 Gag an eine Klasse von Peptidyl-Prolyl-Isomerasen bindet, zu denen auch CyPA und CypB zählen, wurde gezeigt, dass nach genetischer Inaktivierung durch homologe Rekombination (knock out) beider CyPA-Gene in einer humanen CD4+ T-Zelllinie (CyPA-/-) in der Tat in der Abwesenheit von CyPA die Infektiosität von HIV-1 verringert ist und naturgemäß der CyPA Inhibitor CsA keinen zusätzlichen inhibitorischen Einfluss mehr auf die Infek- tiosität von HIV-1 ausübte (Braaten und Luban, 2001). Dieser Befund war der wesentliche Beweis, dass CyPA die Infektiosität von HIV-1 reguliert. Die gleiche CyPA-/- Zelllinie wird ebenfalls in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung verwendet, jedoch ausschließlich, um den Effekt von CyPA auf die Expression und Funktion von Vpr zu testen. Die neuartige Wechselwirkung von CyPA und Vpr, welche in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung erstmals dargestellt ist, wurde in allen o.g. Publikationen über CyPA und HIV-1 nicht erkannt, erwähnt, und/oder beschrieben.
Weiterhin wurde kürzlich berichtet, dass ein extrazellulärer Rezeptor, CD 147, mit Virusassoziierten CyPA in Wechselwirkung tritt, und dass diese Vpr-CyPA- Wechselwirkung für die frühen Schritte einer HIV- 1 -Infektion notwendig sind (Pushkarsky et al, 2001). Ebenfalls wurde eine Verbindung von CyPA und Vpr, wie sie in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung erstmals genannt wird, nicht in dieser Publikation beschrieben.
In dem US-Patent 4,814,323 wird von Andrieu et al. 1989 erstmals berichtet, dass die Behandlung von AIDS-Patienten mit dem immunsuppremierenden Medikament CyclosporinA (CsA) zu einer Verbesserung der Krankheitssymptome, speziell zu einer Erhöhung der CD4- Zahl führt. In dieser Beschreibung wird angenommen, dass CsA eine allgemeine Verbesserung des Immunstatus von HlV-Infizierten bewirkt, eine direkte Inhibierung von HIV-1 wurde nicht erkannt und auch nicht geschützt. Ebenfalls wird die Klasse von PPIase-Inhibitoren nicht geschützt, lediglich nur das Medikament CsA. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindungsbeschreibung, die Wechselwirkung von CyPA und Vpr, wird von diesem Patent nicht betroffen. Erfindungsbeschreibung
Das HIV-1 Vpr ist in allen Lentiviren konserviert, dazu zählen die Immundefizienz- induzierenden Viren HIV-1 und HIV-2, die Erreger von AIDS beim Menschen, sowie SIV, die Erreger von Affen AIDS sowie in niederen und höheren Primaten. Daher wird Vpr auch als das Lentivirus-Protein R bezeichnet. Vpr spielt eine entscheidende Rolle in der Pathogene- se von AIDS. Eine Blockierung von Vpr hat daher entscheidendes Potential für neuartige an- tivirale Strategien.
Für die biologische Funktion von Vpr ist es notwendig, dass dieses Protein in ausreichenden Mengen in der infizierten Zelle exprimiert wird, um darüber hinaus auch in das reifende Vi- ruspartikel im Prozess der Assemblierung, des Buddings, und der Freisetzung von Nachkommenviren mit eingebaut zu werden. Dabei ist wesentlich, dass Vpr das einzige regulatorische HIV-Protein ist, welches in bedeutenden Mengen in Nachkommenviren eingebaut wird. Dadurch ist Vpr Bestandteil des eindringenden Virus im Prozess der Infektion und kann daher wichtige Prozesse in der frühen Phase der HIV -Infektion beeinflussen, bevor die Neusynthese von viralen Proteinen initiiert ist. Eine Inhibierung des Einbaus von Vpr in Nachkommenviren ist daher ein relevanter Ansatz für eine anti-virale Strategie.
Es ist bekannt, dass verschiedene zelluläre Proteine in Virionen von HIV enthalten sind, jedoch wird nur CyPA in signifikanten Mengen eingebaut. Die Verhinderung des Einbaus von CyPA, entweder in CyPA-/- knock out oder durch die Behandlung mit CsA, hat einen deutli- chen Einfluss auf die Infektiosität von HIV-1. Dieser Zusammenhang wurde bislang jedoch nur auf die Wechselwirkung zwischen CyPA und HIV-1 Gag untersucht. Diese bereits bekannte CyPA-Gag Interaktion ist lediglich notwendig, um den Einbau von CyPA in Virionen zu regulieren. Der inhibitorische Effekt von CsA auf die HIV-Replikation kann jedoch allein durch die CyPA-Gag Interaktion nicht erklärt werden. Daher wird in der vorliegenden Erfin- dungsbeschreibung erstmals nachgewiesen, dass die enzymatische Aktivität von CyPA für die Faltung, Proteinstabilität und die Funktion von Vpr notwendig ist und daher der Inhibitor CsA eine neuartige Wirkung vollkommen unabhängig der CyPA-Gag Interaktion auf die Replikati- on von HIV-1 auswirkt. Diese neuartige inhibitorische Wirkung ist auch nicht allein auf HIV- 1 beschränkt, sondern betrifft alle Lentiviren, HIV-1, HIV-2 und SIV. Als wesentlichen Vor- teil im Vergleich zu bislang beschriebenen Wirkungen von CsA auf die HIV-Replikation ist die in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung erstmals erwähnte Vpr-CyPA Wechselwirkung ist die Tatsache, dass alle bislang bekannten AIDS-Erreger durch diese Wechselwirkung betroffen sind. Im Unterschied dazu - und zum wesentlichen Nachteil für die bisher beschrie- benen CyPA-Gag Wechselwirkung - ist die CyPA-Gag- Wechselwirkung nur auf HIV-1 beschränkt. Die Gag-Proteine von HIV-2 und SIV enthalten keine CypA-Bindungsmotive, während das CyPA-Bindungsmotiv in allen Vpr-Proteinen von HIV-1, HIV-2 und SIV enthalten ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Hemmung des Virusproteins R (Vpr) zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wurde durch den Einsatz von Inhibitoren der Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen) - den Peptidylprolyl-Isomerase-Inhibitoren (PPIase- Inhibitoren) - gelöst. Grundsätzlich geeignet sind alle Verbindungen, welche die enzymati- sehe Funktion von PPIasen blockieren. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren werden in pharmazeutischen Zubereitungen verabreicht. Bei diesen Wirkstoffen handelt es sich um Verbindungen, die Inhibitoren der zellulären Chaperone der Klasse der PPIasen oder Immunophiline enthalten. Speziell sollen diese Inhibitoren die PPIasen CyPA und CyPB hemmen. Zu diesen Mitteln, den PPIase-Inhibitoren, zählen die Medikamente CyclosporinA (CsA), FK506, Rapamycin, SDZ NIM811, und SanglipherinA.
Als Target für diese Mittel kommen alle Cyclophiline, die mit Vpr in Wechselwirkung treten können, in Frage. Dazu gehören:
- CyPA: ein 18 kDa Protein im Zytosol, Human-Genom-Name PPIA;
- CyPB: ein 18-20 kDa Protein im endoplasmati sehen Retikulum, Human-Genom-Name PPIB;
- CyPC: ein 18 kDa Protein im sekretorischen Pathway, Human-Genom-Name PPIC;
- CyPF oder Cyp3: ein 18-22 kDa Protein in der inneren Membran des Mitochondriums, Human-Genom-Name PP1F;
- CyPM oder PPIL1 : ein 18 kDa Protein im Zytosol, Human-Genom-Name PPIL1; - USA-CyP oder Cyp20: ein 20 kDa Protein im Zellkern, Human-Genom-Name USA-CYP;
- CyPE oder Cyp33A: ein 40 kDa Protein im Zellkern, Human-Genom-Name PPIE;
- Cyp40: ein 40 kDa Protein im Zytosol und Zellkern, Human-Genom-Name PP1D;
- Cyp60: ein 60 kDa Protein im Zellkern, Human-Genom-Name PPIL2;
- KIAA0073 oder Hal539-CyP: ein 60kDa Protein, Human-Genom-Name CYP; - NK-TRCyP: ein 89 kDa Protein im Zellkern, Human-Genom-Name NKTR;
- RAΝ-BP2 oder NUP-358: ein 358 kDa Protein im Zellkern, Human-Genom-Name RAN- BP1 (Braaten und Luban, 2001). Wesentliche Charakteristik dieser Inhibitoren ist, dass sie die enzymatische Funktion von PPIasen blockieren. Dadurch kann die cis/trans Isomerisierung von Prolyl-Peptid-Bindungen in Proteinen nicht mehr erfolgen. Als eine wesentliche Konsequenz der Anwendung dieser Mittel wird dadurch der hohe Anteil von Prolyl-Resten in der cis-Konformation innerhalb des N- Terminus von Vpr konserviert. Diese cis-Konformation ist jedoch nachteilig für die Expression und die Stabilitätsfunktion von Vpr. Als Konsequenz der Anwendung dieser Mittel können somit keine funktionalen Vpr-Moleküle in einer HlV-infizierten Zelle exprimiert werden. Als Folge der Anwendung dieser Mittel wird Vpr im Verlauf einer HIV-Infektion inaktiviert. Da Vpr ein wichtiger Pathogenitätsfaktor im Krankheitsverlauf einer HIV-Infektion ist, können diese Mittel für die Behandlung von AIDS sowie für die Behandlung und Vorbeugung einer Infektion mit den Lentiviren HIV-1, HIV-2 und SIV eingesetzt werden. Zu den erfindungswesentlichen Erkenntnissen gehört, dass Vpr mit bestimmten zellulären Faktoren interagiert. Diese Faktoren sind in der HIV- Wirtszelle Chaperone, Enzyme, welche die Faltung von Proteinen regulieren und allgemein der Klasse der cis/trans Prolylpeptidyl- Isomerasen (PPIasen) zugeordnet werden. Zu der Klasse der PPIasen zählen auch Enzyme mit dem Namen Immunophiline oder Cyclophiline. Speziell zu den Immunophilinen zählen die Enzyme CyclophilinA und B (CyPA und CyPB). Wesentlich für die Erfindung ist unsere Erkenntnis, dass konservierte Proline in dem N-Terminus von Vpr in einem ungewöhnlich hohen Anteil in der cis-Konformation vorkommen. Weiterhin ist in dem N-Terminus von Vpr eine Erkennungssequenz für PPIasen enthalten. Speziell konnte gezeigt werden, dass die PPIase CyPA an Vpr bindet. Diese Bindung wird durch den PPIase-Inhibitor CsA aufgehoben. Nach Inaktivierung von CyPA durch CsA oder nach genetischer Inaktivierung von CyPA wird Vpr instabil. Die Inaktivierung von Vpr durch CsA ist ein sehr schneller Effekt und erfolgt vermutlich sogar im Verlauf der Proteinsynthese, also ko-translational. Infolge der Inaktivie- rung von Vpr durch CsA tritt ein fast vollständiger Verlust der Vpr-Funktion in einer HIV-1 infizierten Zelle auf: Als Konsequenz der Erfindung und wesentlich neuartig ist die Tatsache, dass nach Inaktivierung von CyPA die Vpr vermittelten biologische Aktivitäten wie zum Beispiel Zellzyklusarrest, Apoptose und der Einbau von Vpr in Nachkommenviren vollständig blockiert werden. Damit ergibt sich eine neuartige anti-retrovirale Strategie auf der Basis von PPIase-Inhibitoren. Im N-Terminus von Vpr ist ein hoher Anteil von Prolin-Peptidbindungen in der cis- Konformation enthalten.
Mittels Methoden der Protein-Strukturaufklärung (Η NMR, CD und Infrarot-Spektroskopie) wurde festgestellt, dass im N-Terminus von Vpr ein besonderes c s/trαrts-Phänomen vorkommt. Dies bedeutet, dass sich ein ungewöhnlich großer Anteil der Prolin-Reste in den Positionen 4, 10, 14 und 35 in Abwesenheit von CyPA in der cz's-Konformation befindet. Dadurch neigt Vpr zu einer extremen Instabilität, die durch das Faltungsenzym CyPA reguliert werden kann. Insbesondere wird als Teil der Erfindung beobachtet, dass ohne die Struktur- stabilisierende Wirkung von CyPA der N-Terminus von Vpr nicht stabil ist und keine definierte Sekundärstruktur annehmen kann. Dies wird durch CD-Messungen (Fig.l), NMR- Strukturberechnung (Fig. 2) ermittelt. Der Anteil von Prolin-Resten in der cw-Konformation wird durch hochauflösende TOCSY (1H NMR) Spektren bestimmt (Fig. 3).
Vpr von HIV-1 bindet an CyPA.
Aufgrund dieser völlig unerwarteten und neuartigen Erkenntnis eines cis/trans Phänomens im N-Terminus von Vpr wurde untersucht, ob Vpr die Fähigkeit besitzt, mit PPIasen in Wechselwirkung zu treten und ob diese Wechselwirkung für die Proteinstabilität von Vpr wichtig ist. Ein Sequenzvergleich von über 150 bekannten Vpr-Sequenzen unterschiedlichster HIV-1- Isolate zeigt deutlich, dass alle vier Prolin-Reste, welche zu dem o.g. s/trαns-Phänomen beitragen (Prolin-Reste in den Positionen 4, 10, 14 und 35) in allen bislang bekannten Vpr- Sequenzen enthalten sind; eine biologische Funktion dieser Prolin-Reste wurde daher erfindungsgemäß weiter untersucht (Fig. 4). Zunächst wurde die vermutete Wechselwirkung zwischen Vpr und CyPA mittels Far- Western blot, einer spezifischen Form des Western blots auf Nitrozellulose, nachgewiesen. Dabei ist festgestellt worden, dass gereinigtes rekombinantes CyPA an synthetisches Vpr bindet (Fig. 5). Weiterhin wurde die Vpr-CyPA- Wechselwirkung mittels Plasmonresonanz (BIAcore)- Spektroskopie nachgewiesen (Figuren 6 bis 7). Dabei wurde spezifisch festgestellt, dass Vpr nur an den N-Terminus, und zwar nur an die ersten 40 Aminosäurepositionen, bindet. Vpr bindet nicht an den C-Terminus. Des weiteren ist festgestellt worden, dass diese Proline wichtig für die Bindung an CyPA sind, insbesondere der Rest Prolin-35 ist essentiell für die Wechselwirkung mit CyPA. Mutationen in diesen Positionen verhindern die Bindung von Vpr an CyPA. Als wesentlicher Kern der Erfindung wurde gezeigt, dass die Mutation von Prolin-35 nach Asparagin (ein konservierter Aminosäureaustausch) zum einen die Bindung von Vpr an CyPA in der BIAcore-Untersuchungen unterbindet als auch später wurde in biologischen Untersuchungen gezeigt, dass diese Mutation die Stabilität und damit die Funktion von Vpr in HIV-1 infizierten Zellen komplett unterdrückt.
CyPA Inhibitoren reduzieren die Proteinstabilität und Expression von HIV-1 Vpr und blockieren dadurch die biologische Funktion von Vpr in einer HlV-infizierten Zelle.
Es gehört weiterhin zu den erfindungswesentlichen Erkenntnissen, dass die Hemmer von Cy- PA die Expression, die Stabilität und damit die Menge an Vpr in einer HlV-infizierten Zelle reduzieren und damit konsequenterweise jene Menge an Vpr, die in ein reifendes Nachkommenvirus eingebaut werden kann, drastisch in einem solchen Umfang reduziert, dass nach Applikation von CyPA-Inhibitoren keine biologische Aktivität von Vpr mehr nachweisbar ist. Da eine spezifische Wechselwirkung zwischen CyPA und Vpr festgestellt wurde und dadurch die Faltung und die Stabilität von Vpr beeinflusst wird, wurde untersucht - abgeleitet von den erfindungsgemäßen molekularen, biochemischen und strukturellen Erkenntnissen (wie oben angegeben) - ob Inhibitoren von CyPA (diese sind bekannt und wurden in der Behandlung von bestimmten Krankheiten als Immunsuppressiva seit Jahren angewendet), ob also Inhibitoren von CyPA, speziell der Inhibitor CsA, die Expression von Vpr regulieren, beeinflussen oder möglicherweise sogar blockieren. Dabei wurde völlig überraschend festgestellt, dass CsA die Wechselwirkung von Vpr mit CyPA unterbindet. Weiterhin wurde gegen jede Erwartung erkannt, dass der Inhibitor CsA die Stabilität und damit die Expression von Vpr dramatisch reduziert. Überraschenderweise wurde weiterhin festgestellt, dass mit Hemmern von CyPA, zum Bei- spiel dem Medikament CyclosporinA (CsA), die Funktion von Vpr in einer HIV- 1 -infizierten Zelle unterbunden werden kann, insbesondere die Vpr-induzierte Apoptose und der Zellzyk- lusarrest. Zunächst wurde festgestellt, dass nach Zugabe von CsA Vpr nicht mehr an CyPA bindet. Daraufhin ließ sich nachweisen, dass alle wesentlichen Funktionen von Vpr durch CsA blockiert werden können. Dazu zählen - der Vpr-induzierte Zellzyklusarrest in der G2 -Phase (G2-Arrest),
- die Vpr-induzierte Apoptose,
- die Vpr-übermittelte Erhöhung der Virusproduktion in HlV-infizierten Monozyten / Makrophagen sowie - die Vpr-vermittelte Ko-Aktivierung des Glykocorticoidrezeptors. Es wurde weiterhin festgestellt,
- dass CsA den Einbau von Vpr in Virionen verhindert,
- dass CsA die Wechselwirkung von Vpr mit anderen zellulären Faktoren, wie zum Beispiel mit dem Glykocorticoid-Rezeptor, unterbindet und
- dass CsA den Transport von Vpr in der Zelle, speziell zum Zellkern, verhindert.
Als wesentlicher Mechanismus in diesen Beobachtungen wurde völlig überraschend erkannt, dass CsA die Menge an Vpr in einer HlV-infizierten Zelle reduziert (Fig. 9). Es wurde weiter- hin beobachtet, dass nach Zugabe von CsA in einem Dosis-abhängigen Mechanismus die Menge an Vpr in der Zelle (Fig. 10) wie auch in den freigesetzten Virionen reduziert ist. Damit wird erstmals beobachtet, dass die Bindung von CyPA an Vpr für dessen Stabilität essentiell ist. Es wurde weiterhin erkannt, dass nach Inaktivierung von CyPA durch die Gabe von CsA das Vpr nach Hemmung der hauptsächlichen Protease, nach Applikation von Proteasom- Inhibitoren, dass der extrem schnelle Verlust von Vpr nicht wieder hergestellt werden kann. Daraus lässt sich ableiten, dass die Wechselwirkung von CyPA mit Vpr für die de novo Synthese von Vpr, sprich für die Expression, also für die ko-translationale Faltung von Vpr, notwendig ist. Damit wird erstmals eine Funktion von CyPA für die ko-translationale Faltung eines Proteins, insbesondere eines viralen, insbesondere eines HIV-Proteins, festgestellt. Der Mechanismus, dass CyPA ko-translational die Faltung von Vpr reguliert, ist relativ neu. Obwohl es vorläufige Hinweise dafür gibt, dass neu synthetisierte Proteine unmittelbar nach Synthese mit Faltungsenzymen in Wechselwirkung treten, um die optimale Proteinfaltung zu gewähren (für Review siehe Frydman, 2001), liegen bislang keine Hinweise darauf vor, dass an diesen ko-translationalen Prozessen CyPA beteiligt ist.
Der Mechanismus der Beobachtung wird darin gesehen, dass CyPA an den N-Terminus von Vpr im Prozess der Proteinsynthese binden muss, um die weitere Stabilität und Faltung und damit die volle biologische Wirksamkeit des Proteins zu gewährleisten. In einer weiteren Folge der Erfindung wird festgehalten, dass bei vollkommener Abwesenheit von CyPA bedeutend weniger Vpr in einer HlV-infizierten Zelle exprimiert wird. Hierzu wurde eine genetisch manipulierte humane CD4+ T-Zelllinie eingesetzt, die in beiden Allelen des CyPA-Gens mutiert ist und daher kein zelluläres CyPA exprimieren kann. In diese CyPA knock out Zelllinie, genannt CyPA-/-, ist die Menge an viralen Vpr intrazellulär sehr stark reduziert oder fast gar nicht nachweisbar (Fig. 12). Ebenfalls werden keine Vpr-enthaltenden Virionen nachgewiesen, die von HIV-1 infizierten CyPA-/- Zellen freigesetzt werden. Ebenfalls wird festgestellt, dass der Vpr-induzierte G2-Zellzyklusarrest in CyPA-/- nicht nachweisbar ist. Die erfindungsgemäße Lösung erbringt damit den Beweis dafür, dass ohne die Wirkung des Faltungsenzyms CyPA und/oder anderer PPIasen (entweder nach Inhibierung durch PPIase- Inhibitoren, wie zum Beispiel dem CyPA-Inhibitor CsA, oder nach genetischer Inaktivierung) die Funktion von Vpr verloren geht.
Die inhibitorische Wirkung von PPIase-Inhibitoren, wie zum Beispiel CsA, auf die Vpr Stabi- lität kann in verschiedenen Expressionssystemen für Vpr nachgewiesen werden. Hierzu zählen:
- Infektion mit HIV-1, HIV-2, SIV oder chimären Viren davon,
- Transfektion mit der DNA von Vpr kodierenden Expressionsvektoren,
- Infektion mit rekombinanten und Vpr kodierenden Retroviren, - Infektion mit rekombinanten und Vpr kodierenden Adenoviren,
- Infektion mit rekombinanten und Vpr kodierenden Vakziniaviren,
- Infektion mit rekombinanten und Vpr kodierenden Bacculoviren.
Die neuartige anti-virale Wirkung von CsA und anderer PPIase-Inhibitoren besteht darin, dass sie die Funktion des essentiellen Regulatorproteins Vpr durch die erfindungsgemäßen Mittel ausschalten und dadurch den HIV-Replikationszyklus unterbinden, ausschalten, blockieren, negativ regulieren oder beeinflussen.
Da Vpr ein wichtiger Pathogenitätsfaktor einer HIV-Infektion und den damit verbundenen Krankheitsbildern - wie zum Beispiel AIDS - ist, ergibt sich durch die Anwendung von CsA und anderen PPIase-Hemmern eine vollkommen neuartige anti-retrovirale Strategie, insbesondere dadurch, dass ein Grossteil der bislang bekannten PPIase-Inhibitoren bereits als Medikamente eingesetzt wurden und nunmehr als anti-retrovirale Mittel Verwendung finden. Die Entdeckung, dass CyPA mit dem HIV- 1 -Strukturprotein p24CA in Wechselwirkung tritt und dadurch der Inhibitor CsA die Infektiosität von HIV reduziert, hat zwei wesentliche Nachteile gegenüber der erfinderischen Lösung:
- CyPA tritt nur in Wechselwirkung mit p24 A von HIV-1, nicht aber mit den Gag-Proteinen anderer Lentiviren, - die anti-virale Wirkung von CsA auf HIV- 1 beinhaltet nicht die Funktion von Vpr. Eine bereits mit HIV-1 infizierte Zelle wird durch CsA nicht mehr beeinflusst; die hemmende Wirkung von CsA auf p24CA wird nur im Infektionsvorgang aktiv.
Der wesentliche Neuheitswert der Erfindung im Vergleich mit bislang im Zusammenhang von HIV und CyPA publizierten Daten kann wie folgt zusammengefasst werden:
- Es besteht ein neues Target für die anti-virale Wirkung von CyPA - das Lentivirus-Protein Vpr.
- Es besteht ein neuartiger Mechanismus, und zwar der, dass CyPA ko-translational die Faltung, Expression und Stabilität eines viralen Proteins reguliert. Ein solcher Mechanismus wurde bislang für kein virales oder zelluläres Protein nachgewiesen.
- Dieser Mechanismus beinhaltet nicht nur die bloße Bindung (wie im Falle von HIV-1 p24CA), sondern auch die enzymatische Aktivität von CyPA, welche die Konformations- Umwandlung der Prolin-Peptidyl-Bindungen in dem N-terminalen Bereich von Vpr aus einer eis in eine stabilere trarcs-Konformation bewirkt. - Neu und vorteilhaft ist ferner, dass das neue Target für PPIase-Inhibitoren in allen bislang bekannten Lentiviren (HIV- 1 , HIV-2 und SIV) enthalten ist und dadurch im wesentlichen Unterschied zu der bislang beschriebenen inhibitorischen Wirkung von CsA auf HIV- 1 p24CA nicht allein auf HIV- 1 beschränkt ist. Das Wesen der Erfindung liegt in der Verwendung bekannter Mittel zu einem neuen Zweck und in einer Kombination bekannter Elemente - den Inhibitoren der Peptidylprolyl- Isomerasen (PPIase-Inhibitoren) - und einer neuen Wirkung - ihrem Einsatz zur Beeinflussung der Primaten Lentiviren HIV-1, HIV-2 und SIV - die in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Vorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass nunmehr Mittel zur Hemmung des für die Virusreplikation notwendigen Virusproteins R zur Verfügung stehen. Die Erfindung richtet sich ferner auf die Verwendung von PPIase-Inhibitoren zur Herstellung von Mitteln zur Hemmung von Primaten Lentiviren. Dazu gehört ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von HIV-Infektionen, AIDS und damit verwandter pathologischer Erscheinungen, wie zum Beispiel HlV-induzierter Demenz, HlV-induzierten Störungen im Lipidstoffwechsel, speziell dem HLS Syndrom (HIV- associated lipodystrophy syndrome) sowie von HlV-induzierten Störungen in der Nierenfunktion, speziell dem HIV AN Syndrom (HIV associated nephropathy).
Die Erfindung betrifft zusammengefasst die Verwendung von PPIase-Inhbitoren als Mittel zur Hemmung von Primaten Lentiviren, Humane Immundefizienzviren Typ 1 und 2 (HIV-1 und HIV-2) sowie Simian Immundefizienzviren (SIV). Am Beispiel des HIV-1 Virusproteins R (Vpr) wird gezeigt, dass Inhibitoren von zellulären cis/trans Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen) sowohl die Expression, Faltung, Proteinstabilität als auch die biologische Wirksamkeit von Vpr hemmen. Die anti-virale Wirkung von PPIase-Inhbitoren, speziell von CyclosporinA, beruht auf einer spezifischen Wechselwirkung von PPIasen, speziell von CyclophilinA, mit Pralinen im N-Terminus von Vpr. Anwendungsgebiete sind die anti-retrovirale Therapie und Vorbeugung bei Infektionen mit Immundefizienz verursachenden Lentiviren bei Tieren und Menschen, insbesondere von AIDS oder HlV-induzierten pathologischen Erscheinungen, auch in Kombination mit anderen anti-retroviralen Medikamenten.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 : Nachweis der Vpr-CyPA Wechselwirkung mittels BIAcore Spektroskopie
Oberflächen-Plasmon-Resonanz (surface plasmon resonance) Biosensor-Analyse (BIAcore- Sprektroskopie) wurde verwendet, um die neuartige Wechselwirkung zwischen CyPA und Vpr zu untersuchen. Hierzu wurde das synthetisch hergestellte Peptid Vpr1"40 sowie gereinigtes rekombinantes CypA (Sigma) verwendet. Surface plasmon resonance Messungen wurden bei 25°C mit einem BIACORE 2000 (Biacore AB, Uppsala Schweden) Spektrometer durchgeführt, welches mit einen CM5 Forschungsgrad Sensor-Chip ausgerüstet war. CypA wurde in einer Menge von 4200 bis 1 1200 RU (resonance units) (Fließzellen 2, 3 und 4) unter Ver- wendung von Standard Amino-Kopplungsreaktionen immobilisiert. Die Fließzelle 1 wurde als Referenz ohne CyPA-Kopplung eingesetzt. Das Peptid Vpr1'40 wurde in einen Fließpuffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 50 μM EDTA, 0.005% Tween 20, pH 7.4) über alle Fließzellen injiziert in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 250 μM, bei einer Flussrate von 5 μl/min. Alle Daten wurden bei 2.5 Hz während einer 120 sec langen Assoziations- und Dissoziati- onsphase gemessen. In der Regel erreichte die CyPA-Vpr1"40 Interaktion das Gleichgewicht innerhalb von 30 sec.
Vpr1"40 wurde in einem Konzentrationsbereich von 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 und 250 μM eingesetzt, CyPA war mit konstanter Konzentration an die chip-Matrix gebunden. Alle Daten wurden an den RU-Daten der Kontroll-Zelle (ohne CyPA) korrigiert. Die Messungen wurden mindestens drei Mal mit verschiedenen CyPA und Vpr-Präparationen wiederholt und waren zu allen Zeitpunkten reproduzierbar. Neben der Wildtyp-Sequenz von HIV-lNL4-3 Vpr (Fig. 6, Panel A, Vpr1"40) wurden ebenfalls folgende Mutanten getestet, welche Pro-Asn Aminosäureaustausche in den für die CyPA- Interaktion kritischen Positionen enthalten: Mutante Vpr1"40, P5,10'l4-N (Pro-Asn Austausch in den Positionen 5, 10 und 14, Fig. 6 Panel B); Mutante Vpr1"40, P35-N (Pro-Asn Austausch in der Position 35, Fig. 6 Panel C); Mutante Vpr1"40, P5>10>14>35_N (Pro-Asn Austausch in den Positionen 5, 10, 14 und 35 Fig. 6 Panel D). Ähnliche BlAcore Ergebnisse wurden unter Verwendung des Peptides Vpr21"40 sowie dessen Mutante Vpr21"40, P35-N erzielt (Fig. 7). Dieses Fragment von Vpr hat spezifische Affinität für CyPA, welche durch Mutation von Pro-35 aufgehoben werden kann. Im Unterschied dazu konnte für das N-terminale Fragment Vpr " keine Bindung an CyPA nachgewiesen werden (Fig. 8). Im Ergebnis dieser BlAcore Studien konnte die neuartige CyPA- Vpr- Wechsel Wirkung überzeugend demonstriert werden. Anhand dieser Daten kann festgestellt werden, dass CyPA an den N-Terminus von Vpr in Form des Peptides Vpr1"4 bindet und dass für diese Bindung Pro- lin in Position 35 essentiell ist.
Beispiel 2: Nachweis der Vpr-CyPA Wechselwirkung mittels Far- Western blot
Um die Wechselwirkung zwischen Vpr und Cyp in dem Kontext von Gesamt- Vpr zu untersuchen, wurde die Far- Western blot Technik eingesetzt. Die Wechselwirkung von Gesamt- Vpr mit CyPA konnte nicht direkt mittels BlAcore untersucht werden, da Gesamt- Vpr eine starke Tendenz zur Selbstassoziation zeigt und daher eine unspezifische Bindung bei Resonanz- Messungen ergeben kann.
Für die Far- Western blot Technik wurde rekombinantes CyPA in einem 15% SDS PAGE bei einer Konzentration von ca. -150 ng CyPA pro Spur im SDS-PAGE aufgetrennt. Das Protein wurde dann auf Nitrozellulose elektrotransferiert und einzelne Streifen dieses Western blots wurden für 4 hr mit 3% BSA in TBS blockiert. Die so gewonnenen CyPA-Western blot Strei- fen wurden dann für 12 hr bei 4°C mit synthetischem Gesamt- Vpr, dem Peptid Vpr1"96, bei einer Konzentration von 1 μg/ml entweder ohne Detergenzien (Fig. 5, Spur 1) oder in TBS/T mit 0,5 % Triton XI 00 (Fig. 5, Spur 2) inkubiert. Anschließend wurden die Streifen 3 Mal in TBS/T für 10 min gewaschen, dann mit anti-Vpr1"96 (polyklonales Antiserum aus Kaninchen) in einer Verdünnung von 1 :2000 in 3% BSA TBS/T, für 4 hr bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden die gebundenen anti-Vpr-Antikörper durch anti-Kaninchen IgG- Peroxidase-Konjugat sowie "enhanced chemiluminescence" (ECL) Reaktion sichtbar gemacht. Eine 5 min Exposition mit Kodak-Röntgenfilm ist in Figur 5 dargestellt. Mit diesen Untersuchungen wird erstmals gezeigt, dass beide Proteine, Vpr und CyPA, eine spezifische Wechselwirkung eingehen, dass diese Wechselwirkung nicht nur den N-Terminus von Vpr, sondern auch das gesamte Protein betrifft und dass die hohe Affinität von CyPA an Vpr selbst die Wechselwirkung mit CyPA ermöglicht, welches an Nitrocellulose gebunden und nach SDS-PAGE an der Nitrozellulose renaturiert wurde.
Beispiel 3: Die Expression von Vpr in HIV-1 infizierten Zellen CyPA-/- knock out Zellen wird reduziert
Jurkat-Zellen, humane CD4+ T-Zellen, entweder als Wildtyp oder als eine genetisch veränderte Variante, in der beide CypA Gen-Allele durch genetisch knock out mutiert sind (CypA-/-) (Braaten und Luban, 12001), wurden mit HIV-lNL4-3 infiziert und für 7 Tage kultiviert. Zum Zeitpunkt der maximalen Virusexpression wurden beide Kulturen einem pulse-chase- Experiment unterzogen (5 min pulse, 8 hr chase). Gag- und Vpr-Proteine wurden mittels anti- Gag und anti-Vpr Antikörpern immunpräzipitiert, in 10-16% SDS-PAGE aufgetrennt und durch Fluorographie sichtbar gemacht (Fig. 12). Es ist zu erkennen, dass die Menge an Vpr relativ zur Menge an p24CA in der knock out Kultur CypA -/- deutlich reduziert ist. Dadurch wird erfindungsgemäß demonstriert, dass CypA für die Expression und Stabilität von Vpr notwendig ist.
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Legenden zu den Figuren
Figur 1 : Nachweis einer strukturellen Instabilität von Vpr N-Terminus mittels CD- Spektroskopie.
Figur 2: Hochauflösende Struktur von Vpr N-Terminus mittels 1H NMR an Vpr1"40.
Figur 3: Nachweis von cis/trans Isomerien in Prolin-Resten von Vpr mittels Η NMR Spektroskopie.
Figur 4: Ein CyPA Bindungsmotiv ist im N-Terminus vom Vpr konserviert.
In der Abbildung ist die Aminosäuresequenz von Vpr des Isolates HIV-INL« dargestellt. Die in allen bislang bekannten HIV-1 Isolaten konservierten Aminosäurepositionen sind fett markiert. Dabei ist zu erkennen, dass die im Rahmen der Erfindung festgestellten Aminosäurepositionen, Pro-4, Pro-10, Pro-14 und Pro-35, welche für die Interaktion zwischen Vpr und Cy- pA wichtig sind, einen hohen Konservierungsgrad aufweisen. Die Sekundärstrukturelemente im N-Terminus von Vpr sind dargestellt.
Figur 5: Nachweis von Vpr-CyPA Wechselwirkung mittels Far- Western blot. Figur 6 bis 8: Bindungsstudien an Vpr und CypA mittels BlAcore oder Plasmonreso- nanzspektroskopie.
Im Rahmen der Erfindung wird festgestellt, dass - der N-Terminus in Form des Peptides Vpr1"40 spezifisch an CypA bindet,
- besonders das Fragment Vpr21-40 an CypA bindet,
- die Mutante Vpr21-40 mit Pro-Asn Austausch nicht an CypA bindet,
- das C-terminale Fragment Vpr47-96 nicht an CypA bindet.
Figur 9: Der CyPA Inhibitor CsA bewirkt Instabilität von Vpr in HIV-1 infizierten Zellen.
HeLa-Zellen wurden mit den proviralen pNL4-3 transfiziert, für 25 min mit [35S]-Methionin radioaktiv markiert und anschließend einem 8-Stunden chase in der Abwesenheit von Radioaktivität unterzogen. Vpr wurde mit polyklonalen Antiserum und Gag-Proteine mit anti-p24CA Antikörpern immunpräzipitiert. Die relativ kleine Menge an Vpr wie auch die prozentuale Stabilität sind dargestellt. Im Rahmen der Erfindung wird gezeigt, dass nach Zugabe von CsA (50 microg/ml) sowohl die Menge an Vpr unmittelbar nach der [ S]-Met pulse-Markierung ca. 10-fach reduziert ist als auch die Halbwertszeit von Vpr deutlich reduziert ist. Als Kontrolle hat die Behandlung mit CspA keinen Einfluss auf die Expression und die proteolytische Prozessierung von HIV Gag- Strukturprotein. Obwohl bekannt ist, dass CypA auch an HIV-1 Gag-Proteine bindet, bewirkt nur die im Rahmen der Erfindung neuartig festgestellte Vpr-CypA Interaktion eine dramatische Reduktion der Expression und Stabilität von Vpr.
Figur 10: CsA bewirkt einen sehr schnellen Verlust von Vpr. HeLa-Zellen wurden mit dem Vpr-Expressionsvektor CMV-VprFlag transfiziert, für 5 min mit [35S]-Met pulse-markiert und einem 60 min chase unterzogen. Nach Zelllyse wurden die Zelllysate durch Zentrifugation in Zellkern- und Zytosol-Fraktionen getrennt, und Vpr wurde mittels anti-Flag monoklonalen Antikörpern immunpräzipitiert. Im Ergebnis wird festgestellt, dass in Gegenwart von CspA sowohl in der Zellkern als auch in der Zytosol-Fraktion weniger Vpr enthalten ist. Da dieser Verlust sehr schnell auftritt - bereits nach der kurzen pulse-Zeit von 5 min - wird erfindungsgemäß festgestellt, dass die Inaktivierung von CypA durch Csp die Instabilität und daher den Verlust der Vpr-Expression bewirkt. Figur 11 : Proteasom-Inhibitoren restaurieren nicht die Stabilität von Vpr nach CsA- Behandlung.
Figur 12: Die Expression on Vpr in CypA knock out Zellen ist reduziert. Jurkat-Zellen, humane CD4+ T-Zellen, entweder als Wildtyp oder als eine genetisch veränderte Variante, in der beide CypA Allele durch genetisch knock out mutiert sind (CypA-/-), wurden mit HIV-1NL4-3 infiziert und für 7 Tage kultiviert. Zum Zeitpunkt der maximalen Virusexpression wurden beide Kulturen einem pulse-chase-Experiment unterzogen (5 min pulse, 8 hr chase). Gag und Vpr Proteine wurden mittels anti-Gag und anti-Vpr Antikörpern im- munpräzipiert, in 10-16% SDS-PAGE aufgetrennt und durch Fluorographie sichtbar gemacht. Im Rahmen der Erfindung ist zu erkennen, dass die Menge an Vpr relativ zur Menge an p24CA in der knock out Kultur CypA -/- deutlich reduziert ist. Dadurch wird erfindungsgemäß demonstriert, dass CypA für die Expression und Stabilität von Vpr notwendig ist.
Abkürzungsverzeichnis
AIDS Aquired Immunodeficiency Syndrome
BSA Bovine serum albumin
CD cluster of differentiation
CD4 Glykoprotein
CsA Cyclosporin, Cyclosporin A
CyPA Cyclophilin A
CyPB Cyclophilin B usw.
DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
HIV Humane Immundefizienzviren
'H NMR Proton NMR Spektroskopie hr Stunden
IL Interleukin kDa Kilodalton
NMR Nuclear Magnetic Resonance (kernmagnetische Resonanz)
PPIasen Peptidylprolyl-Isomerasen
RT Reverse Transkriptase RNA Ribonucleinsäure (ribonucleic acid)
SDS- Natriumdodecylsulfat (Sodium Dodecylsulfat)
SDS-PAGE SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SIV Affen-Immundefizienzviren
TBS Tris Borat Saline
TBS/T Tris Borat Saline/T ween
TNF Tumor Nekrose Faktor
TOCSY total correlation spectroscopy
Vpr Lentivirus-Protein R

Claims

Patentansprüche
1. Mittel zur Hemmung des Primaten Lentivirusproteins R (Vpr) der Immundefizienzviren HIV-1, HIV-2 und SIV, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponenten In- hibitoren von zellulären Chaperonen enthalten, welche für die korrekte Faltung, Stabilität und damit die biologische Funktion von Vpr notwendig sind.
2. Mittel zur Hemmung des Lentivirusproteins R (Vpr), dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponenten Inhibitoren der Peptidylprolyl-Isomerasen - PPIasen- in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten.
3. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponenten Verbindungen enthalten, welche die enzymatische Funktion von PPIasen blockieren.
4. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhibitoren PPIasen hemmen, welche zu den Immunophilinen oder Cyclophilinen zählen.
5. Mittel nach den Ansprüchen 1, 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhibitoren an cis-trans Peptidylprolyl-Isomerasen (PPIasen) binden oder anderweitig mit diesen in
Wechselwirkung treten und dadurch deren enzymatische Aktivität beeinflussen, regulieren oder hemmen.
6. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass Vpr mit Cyclophili- nen in Wechselwirkung tritt, dass diese Wechselwirkung für die Expression, die Proteinstabilität und die biologischen Funktionen von Vpr wichtig ist, und dass diese Cyclophilin- Vpr- Wechselwirkung durch die PPIase-Inhibitoren
6.1. Cyclosporin A (CsA) und/oder
6.2. FK506 und/oder 6.3. Rapamycin gehemmt wird.
7. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass Vpr mit Cyclophili- nen in Wechselwirkung tritt und dass diese Wechselwirkung durch die nicht- immunosuppressiv wirkenden PPIase-Inhbitoren
7.1 SDZ NIM811 und/oder 7.2 SanglipherinA gehemmt wird.
8. Mittel nach den Ansprüchen 1, 2, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass Vpr mit einen oder mehreren der Enzyme 8.1 Cyclophilin A (CyPA)
8.2 Cyclophilin B (CyPB)
8.3 Cyclophilin C (CyPC)
8.4 Cyclophilin F (CyPF) /
8.5 Cyclophilin 3 (CyP3) 8.6 Cyclophilin M (CyPM)
8.7 PPIL1
8.8 USA-Cyclophilin (USA-CyP)
8.9 Cyclophilin 20 (CyP20)
8.10 Cyclophilin E (CyPE) 8.1 1 Cyclophilin 33 A (CyP33A)
8.12 Cyclophilin 40 (CyP40)
8.13 Cyclophilin 60 (CyP60)
8.14 KIAA0073
8.15 Hal539- Cyclophilin (Hal539-CyP) 8.16 NK-TR-Cyclophilin (NK-TRCyP)
8.17 RAN-BP2
8.18 NUP-358 in Wechselwirkung tritt und dass diese Wechselwirkungen durch PPIase-Inhbitoren gemäß den Ansprüchen 6 und 7 gehemmt werden.
Mittel nach den Ansprüchen 1 , 2, 6, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass - Vpr vorrangig an die zellulären PPIase CyPA bindet, - diese Wechselwirkung die trans-Konformation von Prolin-Peptidyl Bindungen im N- Terminus von Vpr reguliert,
- und dass diese c/s-nach-trαrcs-Umlagerung durch PPIase Inhibitoren gehemmt werden kann.
10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die CyPA- Vpr Wechselwirkung die Prolin-Reste in den Positionen 5, 10, 14, und 35 von Vpr beinhaltet und, dass die cis- nach-tra«s-Umlagerung in diesen Prolin-Positionen durch PPIase-Inhibitoren gehemmt werden kann.
11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die PPIase-Inhibitoren die CyPA- Vpr Wechselwirkung blockieren, in dem sie eines, mehrere oder alle der vier Proline in den Positionen 5, 10, 14, und 35 von Vpr neutralisieren .
12. Mittel nach den Ansprüchen 1, 2 und 6, gekennzeichnet durch einen Mechanismus, nach dem CyPA ko-translationell die Expression, Faltung und Stabilität von Vpr reguliert.
13. Mittel nach den Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Mechanismus der stabilisierenden Wirkung von CyPA oder anderen PPIasen auf die Expression und Faltung von Vpr in einer Zelle infiziert mit HIV-1 , HIV-2, SIV, oder chimären Viren davon, einer Zelle transfiziert mit der DNA von Vpr kodierenden Expressionsvektoren, einer Zelle infiziert mit rekombinanten und Vpr kodierenden Retroviren, einer Zelle infiziert mit rekombinanten und Vpr kodierenden Adenoviren, - einer Zelle infiziert mit rekombinanten und Vpr kodierenden Vakziniaviren, einer Zelle infiziert mit rekombinanten und Vpr kodierenden Bacculoviren, wirksam wird.
14. Mittel nach den Ansprüchen 1 , 2 und 6, sowie den Ansprüchen 9-13, dadurch gekenn- zeichnet, dass genetische oder andere Methoden die Expression und/oder die enzymati- schen Aktivitäten von CyPA oder anderen PPIasen beeinflussen und dadurch die biologischen Funktionen von Vpr - in Wirtszellen von HIV-1 , in CD4+ T-Zellen sowie in Mono- zyten oder Makrophagen -, beeinflussen, regulieren oder blockieren.
15. Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass diese Methoden die Expression und / oder Transfektion von anti-sense DNA oder RNA beinhalten, welche spezifisch die Translation von CyPA und / oder anderen PPIasen hemmen.
16. Mittel nach den Ansprüchen 1, 2 und 6 sowie den Ansprüchen 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass alle wesentlichen biologischen Funktionen von Vpr der Vpr-induzierte Zellzyklusarrest in der G2-Phase (G2 -Arrest), die Vpr-induzierte Apoptose, die Vpr-übermittelte Erhöhung der Virusproduktion in HlV-infizierten Monozyten / Makrophagen sowie die Vpr-vermittelte Ko-Aktivierung des Glykocorticoidrezeptors durch die Applikation von PPIase-Inhibitoren und genetischen anti-PPIase Methoden blockiert werden.
17. Mittel nach den Ansprüchen 1, 2 und 6 sowie den Ansprüchen 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass PPIase-Inhibitoren und genetischen anti-PPIase Methoden den Einbau von Vpr in Virionen verhindern, die Wechselwirkung von Vpr mit anderen zellulären Faktoren, wie dem Glykocorti- coid-Rezeptor, unterbinden und - den Transport von Vpr in der Zelle sowie zum Zellkern verhindern.
18. Verwendung der Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass durch ihren Einsatz Lentiviren a) Humanes Immundefizienzvirus Type 1 (HIV-1) oder b) Humanes Immundefizienzvirus Type 2 (HIV-2) oder c) Affenimmundefizienzvirus (SIV) gehemmt werden.
19. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die in den Mitteln enthal- tenen wirksamen Komponenten sowie verwendeten Methoden das Lentivirusprotein R
(Vpr) beeinflussen, regulieren oder blockieren.
20. Verwendung nach den Ansprüchen 17 und 18 zur Bekämpfung / Behandlung von Erkrankungen / pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit Lentiviren verursacht wurden.
21. Verwendung nach den Ansprüchen 17 bis 19 zur Bekämpfung / Behandlung von AIDS.
22. Verwendung nach den Ansprüchen 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass PPIase- Inhibitoren als neuartige anti-retrovirale Therapie zur Behandlung von AIDS eingesetzt werden.
23. Verwendung nach den Ansprüchen 17 und 18 zur Blockierung der wesentlichen Funktionen von Vpr in vivo, im infizierten Organismus, der Vpr-induzierte Zellzyklusarrest in der G2-Phase (G2-Arrest), die Vpr-induzierte Apoptose, - die Vpr-übermittelte Erhöhung der Virusproduktion in HlV-infizierten Monozyten /
Makrophagen sowie die Vpr-vermittelte Ko-Aktivierung des Glykocorticoidrezeptors durch PPIase-Inhibitoren.
24. Verwendung nach den Ansprüchen 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, dass PPIase- Inhibitoren in vivo, im infizierten Organismus,
- den Vpr-induzierte Zellzyklusarrest in der G2-Phase (G2-Arrest)
- die Vpr-induzierte Apoptose
- den Einbau von Vpr in Virionen und/oder - den Transport von Vpr in der Zelle sowie zum Zellkern
- verhindern und
- die Wechselwirkung von Vpr mit anderen zellulären Faktoren, wie dem Glykocorti- coid-Rezeptor, unterbinden.
25. Verwendung von PPIase-Inhibitoren nach den Ansprüchen 6 und 7 zur Herstellung von Mitteln zur Hemmung des Lentivirusproteins R (Vpr).
26. Verwendung von PPIase-Inhibitoren nach den Ansprüchen 6 und 7 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Verhinderung des Ausbruchs von AIDS in HIV- Infizierten.
27. Verwendung von PPIase-Inhibitoren nach den Ansprüchen 20 und 21 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe einer HIV-Infektion.
28. Verwendung nach den Ansprüchen 20 bis 27, in Kombination mit 28.1 anderen anti-retro viralen Medikamenten 28.2 Blockern der Reversen Transkriptase und/oder der viralen Protease
28.3 anti-retro viralen Therapien basierend auf gentherapeutischen Interventionen
28.4 intrazellulärer Immunisierung
28.5 dem Einbringen von anti-HIV- l/HIV-2 wirksamen Genen in Stammzellen und/oder peripheren CD4+ Lymphozyten.
29. Verwendung nach Anspruch 28 zur Bekämpfung / Behandlung von AIDS in fortgeschrittener Krankheitsphase.
30. Verwendung nach Anspruch 20 bis 29 zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral lo- ad") von symptomlosen HIV-l/HIV-2 seropositiven und HIV-l/HIV-2 infizierten Personen.
31. Verwendung nach Anspruch 20 bis 30 zur Behandlung / Bekämpfung / Verhinderung von HlV-induzierter Demenz, insbesondere zur Verhinderung der HIV-Infektion von Neuronen, Glia, und Endothelzellen in Kapillaren des Gehirns.
32. Verwendung von PPIase-Inhibitoren nach Anspruch 20 bis 31 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von HlV-induzierten Störungen im Li- pidstoffwechsel, speziell dem HLS Syndrom (HlV-associated lipodystrophy syndrome).
33. Verwendung von PPIase-Inhibitoren nach Anspruch 20-32 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von HlV-induzierten Störungen in der Nierenfunktion, speziell dem HIV AN Syndrom (HIV associated nephropathy).
34. Verwendung nach den Ansprüchen 20 bis 33 zur Verhinderung der Etablierung einer systemischen HIV-l/HIV-2 Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen Viren, etwa bei Nadel-Stich- Verletzungen mit HIV -kontaminiertem Blut oder Blutprodukten.
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