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WO2004078217A1 - 骨の石灰化促進因子 - Google Patents

骨の石灰化促進因子 Download PDF

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WO2004078217A1
WO2004078217A1 PCT/JP2004/002748 JP2004002748W WO2004078217A1 WO 2004078217 A1 WO2004078217 A1 WO 2004078217A1 JP 2004002748 W JP2004002748 W JP 2004002748W WO 2004078217 A1 WO2004078217 A1 WO 2004078217A1
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WO
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bone
dmp1
calcification
promoting
gene
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PCT/JP2004/002748
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Satoru Toyosawa
Original Assignee
Koken Co. Ltd.
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Publication date
Application filed by Koken Co. Ltd. filed Critical Koken Co. Ltd.
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a means for promoting bone mineralization at a desired site in a living body. More specifically, the present invention relates to a method for promoting bone mineralization and a factor for promoting mineralization used therein. In particular, it relates to a novel use of DMP1 (Dentin matrix protein 1).
  • osteoinduction factor-2 As pharmacologically active agents having osteogenic potential, factors that induce osteoinduction by differentiating osteogenic cells such as rhBMP-2, rhBMP-7, and TGF- ⁇ , bFGF, and PTH are known. However, there are no known substances that accelerate the calcification of the bone matrix and form mature bone that has been calcified earlier.
  • the extracellular matrix is mainly a collagen, but also includes a non-collagenous matrix, and most of the non-collagenous matrix is an acidic phosphorylated protein. It has been believed that the collagen fibers function as scaffolds for depositing hydroxypatite crystals, and that acidic phosphorylated proteins are involved in the calcification of extracellular matrix.
  • the acidic phosphorylated protein identified by recombinant DNA technology was first AG1 (J. BiolChem 1993; 268: 12624-12630: non-patent document 1) and later changed to DMP1 (J. Histchem Cytochem 1994; 42: 1527-1531: non-patent document 2).
  • DMP1 The cDNA clone of DMP1 was identified from a rat tooth cDNA library and has been considered to be specific for dental dentin (J. Histchem Cytochem 1994; 42: 1527-1531: Non-patent document 3) ), Later it was shown that its expression is also present in other calcified tissues. Recently, the present inventor has found that DMP1 gene exists in the genome of birds, which are animal species lacking the ability to form teeth, and that DMP1 is expressed in bone tissue specifically. It was suggested that there is an important role in the organization (J. Mol Evol 2000; 48: 160-166: Non-Patent Document 4).
  • the present inventor has found that in bone tissue of birds and mammals, the DMP1 gene is not expressed in osteoblasts that secrete bone matrix, and is not expressed in the bone matrix of calcified bone matrix. It was specifically expressed in the bone cells present in the bone, and the protein was found to be distributed only in the bone matrix surrounding the bone cells (J. Bone Miner Res 2001; 16: 2017-2026: Non-patent document 5) .
  • the characteristic aspect of DMP1 is that it has a very high content of acidic amino acid and is highly phosphorylated in the tissue, so it is highly negatively charged in the tissue.
  • Non-Patent Document 1 J. BiolChem 1993; 268: 12624-12630
  • Non-Patent Document 2 J. Histchem Cytochem 1994; 42: 1527-1531
  • Non-patent Document 3 J. Histchem Cytochem 1994; 42: 1527.1531
  • Non-Patent Document 4 J. Mol Evol 2000; 48: 160-166
  • Non-Patent Document 5 J. Bone Miner Res 2001; 16: 2017-2026
  • An object of the present invention is to provide a novel means for promoting bone mineralization, and particularly to find a new use of DMP1.
  • DMP1 is highly negative in the organization It is presumed that it binds to calcium and thus promotes calcification of extracellular matrix. To date, several non-collagenous proteins have been identified in calcified tissues, but none have promoted extracellular Malingera mineralization in vivo. In order to obtain possible indications of DMP1 in hard tissue engineering, the characteristics of DMP1 molecules and their possible functions in the calcification process were examined.
  • the present inventor has established means for specifically expressing DMP1 in bone tissue, and from examining its function, the production of an appropriate amount of DMP1 does not cause side effects on the living body, and bone density
  • the present invention has been completed by finding that it promotes the increase of the calcification and, in turn, bone mineralization.
  • the present invention consists of the following.
  • a method for promoting bone mineralization wherein the target bone formation site is in a negatively charged state.
  • a bone mineralization-promoting factor comprising DMP1 or a DMP1 gene carrying vector used in the method according to any one of 2 to 7 above.
  • the calcification-promoting factor according to 8 above which is a derivative of DMP1 or the gene-carrying vector. 1 0.
  • a therapeutic agent for bone or dental disease and Z or disorder comprising the calcification promoting factor according to any one of 8 to 10 as an active ingredient.
  • a bone or tooth forming agent comprising as an active ingredient the calcification promoting factor according to any one of 8 to 10 above.
  • a pharmaceutical composition for bone or teeth comprising as an active ingredient the calcification promoting factor according to any one of 8 to 10 above.
  • FIG. 1 is a diagram in which the bone density of the cortical bone on the distal side of the femur of a mouse was measured.
  • FIG. 2 is a diagram showing the bone density of cortical bone at the diaphysis of the femur of a mouse. Explanation of symbols
  • the horizontal axis in Fig. 1 is slice No. [15 slices were prepared on the distal side from the distal side toward the diaphysis / femur. Normally, calcification starts from the distal side and the degree of calcification (bone density) increases toward the diaphysis / femur.
  • the vertical axis indicates bone density (mg / cm3), and Tg2M is 5 times that of DMP1. Forced expression, Tg3H means 30 times forced expression of DMP1, WT means wild type. ⁇ indicates Tg2M, ⁇ indicates Tg3H, and ⁇ indicates wild type. Each value is an average value.
  • the horizontal axis in Fig. 2 is each Tg2M, Being Tg3H and WT, the vertical axis represents bone density ( mg / cm 3 ).
  • DMP1 is an acidic protein that is an extracellular Matritas protein having 400 to 550 amino acids.
  • the amino acid sequence and gene sequence are disclosed by Toyozawa et al. (J Mol Evol 1999; 48: 160-166, Gene 1999; 234: 307-314, J Mol Evol 2000; 50: 31-38, etc.) .
  • the DMP1 gene is a known gene, and the sequence of DMP1 has been reported from 10 animals including humans. From a comparison of amino acid sequences, it is known that all species of DMP1 begin with a hydrophobic leader sequence containing 16-21 amino acids.
  • the cell-adhesive peptide RGD motif is not specific to the DMP1 molecule, but has been found to be present in many other acidic phosphoproteins, such as osteobontin, bone shaloprotein, and dentin sialylphosphoprotein .
  • the Ai'g-Gly-Asp sequence is strictly conserved with the mammalian DMP1 sequence and may have its important biological functions.
  • DMP1 contains a very large number of amino acids showing acidity, and many motif sequences including Sei 'are phosphorylated, so it is judged to be highly negatively charged in tissues. This suggests that DMP1 has a strong binding ability with calcium ions and is necessary for calcification of extracellular Malingera.
  • One feature of the present invention is that a relationship between the negative ion state at the bone formation site and the bone mineralization rate has been found.
  • the inventor selectively expressed the DMP1 gene in bone tissue and accumulated the protein in the bone matrix. The expression level was adjusted by changing various conditions, and it was confirmed that there was an optimal concentration of DMP1 production and bone mineralization rate. It was confirmed by the present invention that DMP1 is a protein that is highly negatively charged in tissues, and that this is strongly related to the rate of bone calcification. Stone Ashing is the deposition of calcium phosphate in the extracellular matrix, but DMP1 attracts calcium ions, and collagen attracts phosphate, so that calcium ions and phosphate accumulate at the same site, resulting in calcium phosphate. It is thought that crystals are formed and calcification is promoted.
  • DMP1 and its derivatives function as calcification promoting factors. It has already been established that DMP1 can be produced by genetic engineering, and it is possible to use recombinant DMP1 that has been mass-produced in a system using a known general-purpose E. coli host promoter system. In particular, post-translational modifications such as sugar chain structure are not necessary, and DMP1 produced by E. coli is sufficient.
  • the DMP1 derivative has one to several amino acid substitutions / deletions, additions, etc., that maintain the calcification-promoting function of DMP1, particularly the conserved sequence confirmed in mammals, and Synthetic polypeptides consisting of dozens of amino acids partially mimicking the amino acid sequence of DMP1 are also targeted.
  • the derivative include a protein having a bone-forming scaffold structure or a biodegradable synthetic resin.
  • proteins collagen, particularly type I collagen, and polylactic acid derivatives can be suitably used as biodegradable synthetic resins.
  • the bond may be any physical or chemical bond, but is preferably a disulfide bond.
  • DMP1 may be a mixture with a protein having a matrix structure or a biodegradable synthetic resin even if it is not derivatized.
  • the amount of DMP1 used to promote calcification per 1 ml of the material may be any concentration that promotes bone mineralization.
  • it is usually O. l g or more, preferably several g, more preferably 5 to 20 ⁇ g.
  • DMP1 in order to fill DMP1 into the target bone formation part, it is preferably prepared in a paste form by general-purpose means by blending with a known composition. Yes.
  • a blended composition with collagen or polylactic acid derivative can be used.
  • a vector carrying the DMP1 gene or a derivative gene thereof can exhibit the bone mineralization promoting function of the present invention by means of specific gene introduction into bone tissue.
  • the object of the present invention can also be achieved by means for carrying a gene in a self-propagating vector. That is, a vector carrying the DMP1 gene can also be included in the calcification promoting factor of the present invention.
  • the means for introducing the gene is desirably an integration method, for example, a ribosome method, a calcium phosphate method, an electroporation method, or the like.
  • a transient expression method such as a ribosome method, a calcium phosphate method, an electroporation method, a virus vector method, or a atelocollagen method may be used.
  • the vector to be used is not particularly limited, and any set of known plasmids, phages, cosmids, BACs, YACs, recombinant viruses, transposons, etc. into which inserted DNA fragments can be introduced by ordinary recombination experiments. It can be applied to replacement vectors.
  • vectors can be constructed with promoters and enhancers for which known combinations are suitable.
  • a commercially available protein expression vector in which a promoter suitable for a normal host is inserted can be used.
  • telocollagen examples include ZAP Express (manufactured by Stratagene), pSVK3 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), pEGFP-Cl (manufactured by Clontech), and atelocollagen.
  • the mouse pro-CK 1 (1) collagen promoter was used in the examples of the present invention, but other osteocalcin promoters may be used. Since this promoter is a promoter of a protein that is specifically secreted by osteogenic cells, it provides a powerful means for specifically expressing DMP1 in bone tissue.
  • the insertion of the DMP1 polynucleotide into the vector comprises Alternatively, the DNA fragment containing this is ligated so as to be placed under the control of a promoter downstream of the promoter in the vector.
  • a vector having the following is also preferably used. There are no particular restrictions on the polypeptide used as the tag, but examples include the FLAG tag (BioTechniques, 7, 580, (1989)).
  • DMP1 or a derivative thereof thus prepared can be directly loaded into the bone formation site where bone mineralization is desired.
  • a vector carrying the DMP1 gene or its derivative gene can be administered by direct injection, gene gun, injection or the like.
  • DMP1 or a derivative thereof can be used for filling a joint of a fracture, filling a bone after removing bone by infection, filling a joint after filling a bone after a wide excision due to tumor or osteomyelitis, and the like. It can be used effectively for alveolar bone filling after alveolar bone removal due to alveolar pyorrhea, filling for alveolar ridge formation of dentures, filling for alveolar bone formation for implant implantation, etc. With the introduction of the present invention, after the osteogenic cells grow and the extracellular matrix is produced, the level of calcification rises early, and early function can be demonstrated as mature bone.
  • the pharmaceutical composition containing the calcification promoting factor of the present invention as an active ingredient can contain a pharmaceutically acceptable salt.
  • the pharmacologically acceptable salts include conventional non-toxic salts, that is, acid addition salts and salts with various bases. You can.
  • inorganic acid salts such as hydrochloric acid, nitric acid, and sulfuric acid
  • organic acid salts such as acetic acid, citrate, fumaric acid, and tartaric acid
  • sulfonates such as methanesulfonic acid and p-toluenesulfonic acid
  • alanine Amino acid salts such as leucine, glutamic acid and the like
  • alkali metal salts for example, sodium salts, potassium salts, etc.
  • alkaline earth metal salts for example, magnesium salts, calcium salts, etc.
  • triethylamine salts pyridine
  • organic amine salts such as salts, picoline salts, ethanolamine salts, triethanolamine salts, dicyclohexylamine salts, N, N, and monodibenzylethylenediamine salts.
  • the technical scope of the present invention is not limited to the bone mineralization promoting method and the bone mineralization promoting factor, but also the bone or tooth formation method using the bone mineralization promoting method, the bone or dental disease and the like. It also extends to methods of treatment for damage.
  • the present invention includes a pharmaceutical composition comprising the calcification promoting factor of the present invention as an active ingredient, and a therapeutic agent for bone or dental disease and Z or disorder, and further a bone or tooth forming agent. Is included.
  • Rat DMP1 gene translation region from start codon to stock and pucodon is expressed selectively in bone tissue with pro- ⁇ 1 (1) collagen promoter (Reference: J Cell Biol. 1995; 129: 1421-1432)
  • a construct for the production of transgenic mice was constructed by incorporating restriction enzymes into pNASS jS (CLONTECH Lab., Inc.). This construct The gene was introduced into a fertilized egg of C57B / L, a DMP1 transgenic mouse was prepared, and the bone density of the bone tissue in which DMP1 was forcibly expressed (4 groups per group, 3 groups) was examined. The bone density at each part of the femur at 3 months of age was measured. The expression level of DMP 1 in bone tissue was examined in Northern, the site of expression was confirmed again by in situ hybridization, and about 5 times normal expression of DMP1 was forcibly expressed, about 30 times normal expression for normal. These were compared with normal mice.
  • Figure 1 shows the bone density of the cortical bone on the distal side of the mouse femur.
  • the horizontal axis was sliced in 0.5mm increments from the distal side, and each bone density (mg / cm 3 ) of slices up to No. 15 was measured by peripheral quantitative computed tomography (pQCT).
  • pQCT peripheral quantitative computed tomography
  • DMP1 transgenic mice in which DMP1 was forcibly expressed approximately 30 times normal showed no change in bone density compared to normal mice. It was confirmed that DMP1 supplementation has an adaptive amount, and that it has no effect when accumulated in large amounts in bone tissue. In other words, when it is forced to express about 5 times the normal, the rate of increase in cortical bone density is faster than normal, which means that calcification is promoted.
  • the effect of DMP1 was confirmed by the gene transfer method as an experimental system, but this effect proved that the same effect can be derived even if DMP1 itself is filled directly or together with a matrix substance such as collagen in the target site. I think it is.
  • Fig. 2 shows the bone density of cortical bone at the diaphysis of the femur of a mouse.
  • the horizontal axis shows each Tg2M (DMP1 is forced to express approximately 5 times normal from the left.
  • WT normal mice
  • the means of the present invention is an effective means for promoting bone formation at an early stage by increasing the speed of calcification by causing calcification in the extracellular matrix portion that is a scaffold for calcification during bone formation. I will provide a. As a result, it provides new clinical significance in bone treatment.
  • the means of the present invention promotes the calcification of bone during the bone formation period, but when the calcification level rises and mature bone formation ends, the function of promoting calcification is no longer exhibited. Therefore, it can be a treatment method for bone diseases with excellent safety without causing side effects such as hypercalcification.

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Abstract

本発明は、生体内所望部位の骨の石灰化を促進する新規な手段を提供することを課題とする。骨組織にDMP1（Dentin matrix protein１）を加えマイナスイオンチャージ状態にすることで、細胞外マトリックスがリン酸カルシウムに結合し、骨の石灰化が促進される。DMP1を特異的に骨組織で発現させることでDMP1が適量産生され、マトリックス物質とリン酸カルシウムが結合し、骨形成への副作用を起こすことなく、骨密度の上昇、ひいては骨の石灰化を促進させることができる。

Description

骨の石灰化促進因子
本出願は、 参照によりここに援用されるところの、 日本特許出願番号 特願 2003 - 059130からの優先権を請求する。 明
技術分野
田
本発明は、 生体内所望部位の骨の石灰化を促進する手段に関する。 さ らに詳細には、 骨の石灰化促進方法及びそれに使用する石灰化促進因子 に関する。 特に、 DMP1 (Dentin matrix protein 1) の新規な用途 に関する。
背景技術
骨形成能を有する薬理学的活性剤として、 rhBMP-2、 rhBMP-7, 及ぴ TGF- β , bFGF, PTH等の骨形成細胞を分化させ、 骨誘導を起こす因子 が知られている。 しかし、 これまでに骨マトリックスの石灰化の速度を 速め、 より早期に石灰化した成熟した骨を形成する物質等の存在は知ら れていない。
骨、 象牙質及びセメント質は、 細胞外マトリックスにリン酸カルシゥ ムが沈着し、 石灰化したものである。 該細胞外マトリ ックスは、 主にコ ラーゲンであるが、 非コラーゲン性マトリックスも含まれ、 非コラーゲ ン性マトリッタスの殆どは酸性リン酸化蛋白質である。 該コラーゲンの 線維はハイ ドロキシァパタイ ト結晶の沈着する足場として機能し、 酸性 リン酸化蛋白質は細胞外マトリッタスの石灰化に関与すると信じられて きた。組替え DNA技術で同定された該酸性リン酸化蛋白質は、最初 AG1 と名づけられ (J. BiolChem 1993； 268:12624- 12630 :非特許文献 1 )、 後 に DMP1 と 変 更 さ れ た （ J. Histchem Cytochem 1994； 42:1527-1531：非特許文献 2 )。 DMP1の cDNAクローンは、 ラットの 歯の cDNAライブラリ一から同定され、歯の象牙質に特異的であると考 えられてきたが （J. Histchem Cytochem 1994; 42:1527-1531：非特許 文献 3 )、後に、その発現は他の石灰化組織でも存在することが示された。 最近、 本発明者は、 歯の形成能を欠失した動物種である鳥類において もゲノムの中に、 DMP1 遺伝子が存在し、骨組織で特異的にその遺伝子 発現がある事から、 DMP1は骨組織で重要な働きがある事を示唆した（J. Mol Evol 2000; 48:160-166：非特許文献 4 )。 さらに、 本発明者は、 鳥 類や哺乳類の骨組織では、 その動物種に関係なく共通して、 DMP1 遺伝 子は骨マトリックスを分泌する骨芽細胞には発現せず、 石灰化した骨マ トリックスの中に存在する骨細胞に特異的に発現し、 その蛋白は骨細胞 周囲の骨マトリツタスにのみ分布する事を発見した（J. Bone Miner Res 2001； 16:2017-2026：非特許文献 5 )。 DMP1 の特徴的様相は、 酸性ァ ミノ酸含有量が非常に高いこと、 また、 組織中で高度にリン酸化される ことから、 組織中では高度に負に荷電する事である。
(非特許文献 1 ) J. BiolChem 1993； 268:12624-12630
(非特許文献 2 ) J. Histchem Cytochem 1994； 42:1527-1531
(非特許文献 3 ) J. Histchem Cytochem 1994； 42:1527.1531
(非特許文献 4 ) J. Mol Evol 2000； 48:160-166
(非特許文献 5 ) J. Bone Miner Res 2001； 16:2017-2026 宪明の開示
本発明は、 新規な骨の石灰化促進手段の提供を課題とし、 特に DMP1 の新規な用途を見出すことにある。 DMP1は、 組織中で高度にマイナス にチャージする性状から、 カルシウムと結合し、 それによつて細胞外マ トリックスの石灰化を促進していると推測される。 これまでに石灰化組 織において幾つかの非コラーゲン性蛋白質が同定されてきたが、 in vivo で細胞外マトリッタスの石灰化を促進させたものはなかった。 硬組織工 学において DMP1の可能な適応を得るために、 DMP1分子の特徴と石灰 化過程におけるその可能な機能を検討した。
本発明者は、 上記課題を解決するため、 DMP1を特異的に骨組織で発 現させる手段を確立し、 その機能の検討から、 DMP1の適量産生が生体 への副作用を起こすことなく、 骨密度の上昇、 ひいては骨の石灰化を促 進するものであることを見出し本発明を完成した。
本発明は、 以下よりなる。
1 . 標的骨形成部位をマイナスチャージ状態にすることを特徴とする骨 の石灰化促進方法。
2 . マイナスイオンチャージ状態が、 化合物の存在によって達成される 前項 1の方法。
3 . 化合物が、 DMP1又は DMP1誘導体である前項 2の方法。
4 . 化合物の存在が充填によるものである前項 2又は 3の方法。
5 . 化合物の存在が、 選択的骨組織における遺伝子導入法による産生の 増加による前項 2又は 3の方法。
6 . 化合物の存在が、 マトリックス物質との結合又は共存である前項 4 の方法。
7 . 結合させるマトリックス物質が、 コラーゲンである前項 6の方法。 8 . 前項 2〜 7の何れか一に記載の方法に使用する DMP1又は DMP1 遺伝子担持べクタ一を含む骨の石灰化促進因子。
9 . DMP1の誘導体又は該遺伝子担持ベクターである前項 8の石灰化促 進因子。 1 0 . 遺伝子担持ベクターが、 骨での特異的発現調節に適合したプロモ 一ターを担持する前項 8又は 9の石灰化促進因子。
1 1 . 前項 1〜 7のいずれか一項に記载する骨の石灰化促進方法を用い た骨又は歯の形成方法。
1 2 . 前項 1〜 7のいずれか一項に記載する骨の石灰化促進方法を用い た骨若しくは歯の疾患及び Z又は障害の治療方法。
1 3 . 前項 8〜1 0のいずれか一項に記載の石灰化促進因子を有効成分 として含む骨若しくは歯の疾患及び Z又は障害用治療剤。
1 4 . 前項 8〜1 0のいずれか一項に記載の石灰化促進因子を有効成分 として含む骨若しくは歯の形成剤。
1 5 . 前項 8〜1 0のいずれか一項に記載の石灰化促進因子を有効成分 として含む骨又は歯用の医薬組成物。 図面の簡単な説明
第 1図は、 マウスの大腿骨の遠位側の皮質骨の骨密度を測定した図で ある。
第 2図は、 マウスの大腿骨の骨幹部の皮質骨の骨密度を測定した図で ある。 符号の説明
第 1図の横軸はスライス NO.〔遠位側から骨幹部/大腿骨へ向かって遠 位側で 1 5分割のスライスを調製した。 正常では遠位側から石灰化が始 まり骨幹部/大腿骨に向けて石灰化度 （骨密度） があがる〕、 縦軸は骨密 度 （mg/cm3) を表し、 Tg2Mは DMP1の 5倍強制発現、 Tg3Hは DMP1 の 30倍強制発現、 WTは野生型を意味する。 ©は Tg2M、 Δは Tg3H、 〇は野生型を示す。 各値は平均値を示した。 第 2図の横軸は各 Tg2M、 Tg3H、 WTであること、 縦軸は骨密度 （mg/cm3) を表す。 発明を実施するための最良の形態
DMP1は、 ァミノ酸数 400〜550個の細胞外マトリッタス蛋白質であ る酸性蛋白質である。 そのアミノ酸配列及び遺伝子配列は、 豊沢等によ り開示されている（J Mol Evol 1999;48:160-166, Gene 1999； 234： 307- 314, J Mol Evol 2000； 50:31-38など）。 DMP1遺伝子は公知の遺伝子で あり、 ヒ トを含む 10種の動物から DMP1の配列が報告されている。 ァ ミノ酸配列の比較から、全ての種の DMP1は 16-21個のァミノ酸を含む 疎水性リーダー配列で始まることが知られている。 細胞接着性のぺプチ ド RGDモチーフは DMP1分子特異的ではないが、 多くの他の酸性リン 酸化蛋白質、 例えばォステオボンチン、 骨シァロ蛋白質、 及び象牙質シ ァロリン酸化蛋白質に存在することが確認されている。 Ai'g-Gly-Asp配 列は厳格に哺乳動物の DMP1配列で保存され、その重要な生物学的機能 を有することが考えられる。 また、 DMP1は酸性を示すアミノ酸を非常 に多く含有し、 また、 Sei' を含む多数のモチーフ配列がリン酸化を受け る事から、 組織中で高度にマイナスにチャージしていると判断される。 このことから、 DMP1はカルシウムイオンと強固な結合能を有し、 細胞 外マトリッタスの石灰化に必要であると考えられる。
本発明の一の特徴は、 骨形成部位におけるマイナスイオン状態と骨の 石灰化の速度との関係を見出したことである。 本発明者は、 DMP1遺伝 子を骨組織で選択的に発現させ、 その蛋白質を骨基質に蓄積させた。 そ してその発現量を種々の条件を変えることで調節し、 DMP1の産生量と 骨の石灰化速度には最適濃度が存在することを確認した。 DMP1は、 組 織中で高度にマイナスにチャージする蛋白質であり、 このことが骨の石 灰化の速度に強く関係することが本発明によって確認された。 なお、 石 灰化はリン酸カルシウムが細胞外マトリッタスに沈着する事であるが、 DMP1がカルシウムイオンを引き寄せ、 コラーゲンがリン酸を引き寄せ る事により、 同部位にカルシウムイオンとリン酸が集積し、 リン酸カル- シウム結晶が形成され、 石灰化が促進されると考えられる。
本発明において、 DMP1及ぴその誘導体が石灰化促進因子として機能 することを確認した。 DMP1は、 既に遺伝子工学的に産生できることが 確立しており、 既知の汎用される大腸菌宿主プロモーター系を使った系 で大量生産した組み換え DMP1の使用が可能である。 特に、糖鎖構造な どの翻訳後修飾は必要でなく、 大腸菌が生産する DMP1で十分である。 本発明において、 DMP1誘導体は、 DMP1の石灰化促進機能を維持した、 特に哺乳類で確認された保存配列を維持したァミノ酸の 1個から数個の 置換 ·欠失.付加等の配列変異、 及び DMP1のアミノ酸配列を部分的に 模した数十個のァミノ酸からなる合成ポリべプチドをも対象とする。 誘 導体には、 骨形成の足場構造をもつ蛋白質或いは生分解性合成樹脂等も 例示される。 蛋白質としては、 コラーゲン、 特に I型コラーゲン、 生分 解性合成樹脂としてはポリ乳酸誘導体が好適に利用できる。 結合は、 物 理的結合或いは化学的結合を問わず、 あらゆる可能性があるが、 好適に はジスルフィ ド結合である。また、 DMP1は誘導体化されていなく とも、 マトリックス構造をもつ蛋白質或いは生分解性合成樹脂等との混合物で あっても十分である。
本発明の石灰化促進手段において、材料 1ml当りの石灰化を促進する DMP1の使用量は、 骨の石灰化作用を促進する濃度であればいずれでも よい。 例えば、 通常は O. l g以上、 好ましくは数 g、 より好ましくは 5〜20 ί gでめる。
DMP1を例えば、 標的骨形成部に充填するためには、 既知組成物との 配合による汎用手段によってペースト状に調製されていることが好まし い。 例えば、 コラーゲンやポリ乳酸誘導体等との配合組成物が利用可能 である。
DMP1遺伝子又はその誘導体遺伝子を担持するベクターは、 骨組織へ の特異的遺伝子導入手段により、 本発明の骨石灰化促進機能を発揮する ことができる。 自己増殖ベクターに遺伝子を担持する手段によっても本 発明の目的は達成可能である。 つまり、 DMP1遺伝子を担持したベクタ 一も本発明の石灰化促進因子に含めることができる。 遺伝子の導入手段 は、 望ましくはインテグレーションさせる方法、 例えばリボソーム法、 リン酸カルシウム法、エレク トロポレーション法等によるのが好ましい。 しかし一過性に発現させるリボソーム法、 リン酸カルシウム法、 エレク トロポレーシヨン法、 ウィルスベクター法、 ァテロコラーゲン法等の方 法であってもよい。 用いるベクターは特に限定されず、 公知のプラスミ ド、 ファージ、 コスミ ド、 BAC、 YAC、 組換えウィルス、 トランスポゾ ン等、 通常の組み換え実験によって揷入 DNA断片を導入することが可 能な全ての組換えベクターに適用することができる。 ベクターは、 当然 に自体公知の組合せが好適であるプロモーター、 ェンハンサーと共に構 築することができる。 例えば、 通常宿主に適したプロモーターが揷入さ れている市販の蛋白質発現ベクターを用いることができる。
具体的には、 ZAP Express (ス トラタジーン社製）、 pSVK3 (アマシ ャムフアルマシアバイオテク社製）、 pEGFP-Cl (クロンテック社製）、 ァテロコラーゲン等が挙げられる。 プロモーターは、 本発明の実施例で は、 マウスの pro- CK 1(1) collagenプロモーターを使ったが、 その他ォス テオカルシンプロモーター等でもよい。 このプロモーターは、 骨形成細 胞が特異的に分泌する蛋白質のプロモーターであることから、 DMP1を 骨組織で特異的に発現させるために有力な手段を提供するものである。 ベクターへの DMP1ポリヌクレオチドの揷入は、該ポリヌクレオチド 又はこれを含む DNA断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモ 一ターの制御下におかれるように連結して行う。 また、 プロモーターと DMP1との間にコザック配列 （Kosak, M.， Gene, 234, 187, (1999)) を 揷入したり、 DMP1の下流にタグとなるポリペプチドをコードする DNA を挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。 タグとなるポ リ ぺプチ ドと しては特に制限はないが、 例えば、 FLAG タ グ (BioTechniques, 7， 580, (1989)) 等が挙げられる。
プロモーターを連結した DMP1 ポリヌクレオチドを標的細胞の染色 体中に直接揷入する相同組換え技術 （A. A. Vertes et al.， Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 2036(1993)) , あるいはトランスポゾンゃ揷 入配列 (A. A. Vertes et al.， Molecular Microbiol., 11, 739(1994)) 等を 用いて発現させることができる。
かく して調製された DMP1又はその誘導体は、骨の石灰化を所望する 骨形成部位に直接充填することができる。 また、 DMP1遺伝子又はその 誘導体遺伝子を担持するベクターを、 直接注入、 遺伝子銃、 注射などに よって投与することができる。
本発明により、 DMP1又はその誘導体は、 骨折の接合部充填、 感染に よる腐骨除去後の骨充填、 腫瘍や骨髄炎による広範囲切除後のセラミッ クなどの充填物と既存骨との接合部充填、 歯槽膿漏による歯槽骨除去後 の歯槽骨充填、 入れ歯の歯槽堤形成術のための充填、 インプラント植立 のための歯槽骨形成のための充填等に有効に使用可能である。 本発明の 導入により、 骨形成細胞が増生し細胞外基質が産生された後、 早期に石 灰化レベルが上昇し、 成熟した骨としての早期機能発揮が可能となる。 また、本発明の石灰化促進因子を有効成分として含む医薬組成物には、 薬学的に許容される塩を含むことができる。 薬理学的に許容される塩と は、 慣用の無毒性の塩すなわち酸付加塩及び各種塩基との塩を挙げるこ とができる。 より具体的には、 塩酸、 硝酸、 硫酸等の無機酸塩、 酢酸、 クェン酸、 フマル酸、 酒石酸等の有機酸塩、 メタンスルホン酸、 p—ト ルエンスルホン酸等のスルホン酸塩及ぴァラニン、 ロイシン、 グルタミ ン酸等のアミノ酸塩並びにアルカリ金属塩 (例えばナトリゥム塩、 カリ ゥム塩等）、 アルカリ土類金属塩 （例えばマグネシウム塩、 カルシウム塩 等）等の無機塩基塩及びトリェチルァミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、 エタノールアミン塩、 トリエタノールアミン塩、 ジシクロへキシルアミ ン塩、 N , N，一ジベンジルエチレンジァミン塩等の有機アミン塩が挙げ られる。
本発明の技術的範囲は骨の石灰化促進方法及び骨の石灰化促進因子に 限定されるのみではなく、 骨の石灰化促進方法を用いた骨若しくは歯の 形成方法、 骨若しくは歯の疾患及ぴ 又は障害の治療方法にも及ぶ。 さ らに、 本発明は本発明の石灰化促進因子を有効成分として含む医薬組成 物を含み、 骨若しくは歯の疾患及び Z又は障害用治療剤、 さらに骨若し くは歯の形成剤をも含むものである。 実施例
以下、 実施例によって、 本発明を具体的に説明するが、 これらは本発 明の範囲を限定するものではない。 実施例 1
ラッ ト DMP1 遺伝子の翻訳領域の開始コドンからストツ,プコドンま でを pro- α 1(1) collagen プロモーター （文献： J Cell Biol. 1995； 129:1421-1432 ) で骨組織に選択的に発現させる よ う pNASS jS (CLONTECH Lab., Inc.)に制限酵素を使って組み込み、 トランスジェニ ックマウス作製用のコンストラク トを構築した。 このコンストラク トを 使い、 C57B/Lの受精卵に遺伝子導入し、 DMP1 トランスジエニックマ ウスを作製し、 DMP1を強制発現させた骨組織の骨密度 （1群 4匹で 3 群) を検討した。 生後 3ヶ月における大腿骨の各部位における骨密度を 測定した。 骨組織における DMP 1の発現は、 Northern でその発現量を 検討し、 in situ hybridizationでその発現部位を再度確認し、 DMP1の 正常値の約 5倍強制発現したもの、 正常の約 30倍強制発現したものを 正常マウスの場合と比較検討した。
図 1は、 マウスの大腿骨の遠位側の皮質骨の骨密度を測定したもので ある。 横軸は、 遠位側から 0.5mm刻みでスライスし、 No.15 までのス ライスについて皮質骨の各骨密度（mg/cm3) を peripheral quantitative computed tomography (pQCT)で測定した。 大腿骨などの長幹骨では、 骨端軟骨部から骨幹部へと遠位側に行くに従い皮質骨の骨密度が上昇す る。 DMP1を正常の約 5倍に強制発現させた DMP1 トランスジェ -ッ クマウス （Tg2M群） では正常マウス （WT群） にく らべて骨密度が各 スライス部で有為に上昇した。 一方、 DMP1を正常の約 30倍に強制発 現させた DMP1 トランスジヱニックマウス （Tg3H群） は正常マウスに く らベて骨密度に変化はなかった。このことは DMP1の補充には適応量 があり、 骨組織に多量に蓄積させると無影響になることが確認された。 すなわち、 正常の約 5倍に強制発現させた場合に、 皮質骨の骨密度の上 昇率が正常よりも早くなり、 石灰化が促進されていることを意味するの である。 ここでは、実験系として遺伝子導入法で DMP1の効果を確認し たが、 この効果は DMP1自体を直接、 あるいはコラーゲン等のマトリク ス物質とともに対象部位に充填しても同様の効果が導けることを証明し ているものと思料する。
図 2は、 マウスの大腿骨の骨幹部の皮質骨の骨密度を測定したもので ある。 横軸は、 左から各 Tg2M (DMP1を正常の約 5倍に強制発現させ た DMP1 トランスジエニックマウス）、 Tg3H (DMP1を正常の約 30倍 に強制発現させた DMP1 トランスジエニックマウス）、 WT (正常マウス） について各骨密度（mg/cm 3)を上記と同様に測定した。この結果、 Tg2M、
Tg3H群と WT群間で骨密度に差異はなかった。 このことは、 石灰化が 進み、骨が成熟した骨密度のブラトー状況下ではもはや DMP1は薬理学 的作用をおこすことなく過剰な骨の石灰化を導かないことを示すもので める。 産業上の利用可能性
本発明の手段は、 骨形成に際し、 石灰化の足場となる細胞外マトリツ タス部に石灰化を引き起こしゃすく し、 石灰化の速度をあげて早期に成 熟した骨形成を促すに有効な手段を提供する。 その結果、 骨治療におけ る新たな臨床的意義を提供するものである。 特に、 本発明手段は、 骨の 形成期にあっては、 骨の石疢化を促進するが、 石灰化レベルが上昇し成 熟した骨形成が終了すると、 もはや石灰化促進機能は発揮しないもので あるから、 過石灰化等の副作用を起こさない安全性にも優れた骨疾患の 治療手段になり うるものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 標的骨形成部位をマイナスチャージ状態にすることを特徴とする骨 の石灰化促進方法。
2 . マイナスイオンチャージ状態が、 化合物の存在によって達成される 請求の範囲第 1項の方法。
3 .化合物が、 DMP1又は DMP1誘導体である請求の範囲第 2項の方法。
4 . 化合物の存在が、 充填によるものである請求の範囲第 2項又は第 3 項の方法。
5 . 化合物の存在が、 選択的骨組織における遺伝子導入法による産生の 増加による請求の範囲第 2項又は第 3項の方法。
6 . 化合物の存在が、 マトリ ックス物質との結合又は共存である請求の 範囲第 4項の方法。
7 . マトリックス物質が、 コラーゲンである請求の範囲第 6項の方法。
8 . 請求の範囲第 2項〜第 7項の何れか一に記載の方法に使用する
DMP1又は DMP1遺伝子担持ベクターを含む骨の石灰化促進因子。
9 . DMP1の誘導体又は該遺伝子担持ベクターである ft求の範囲第 8 項の石灰化促進因子。
1 0 . 遺伝子担持ベクターが、 骨での特異的発現調節に適合したプロモ 一ターを担持する請求の範囲第 8項又は第 9項の石灰化促進因子。
1 1 . 請求の範囲第 1項〜第 7項のいずれか一項に記載する骨の石灰化 促進方法を用いた骨又は歯の形成方法。
1 2 . 請求の範囲第 1項〜第 7項のいずれか一項に記載する骨の石灰化 促進方法を用いた骨若しくは歯の疾患及び/又は障害の治療方法 ώ
1 3 . 請求の範囲第 8項〜第 1 0項のいずれか一項に記載の石灰化促進 因子を有効成分として含む骨若しくは歯の疾患及ぴノ又は障害用治 療剤。
1 4 . 請求の範囲第 8項〜第 1 0項のいずれか一項に記載の石灰化促進 因子を有効成分として含む骨若しくは歯の形成剤。
1 5 . 請求の範囲第 8項〜第 1 0項のいずれか一項に記載の石灰化促進 因子を有効成分として含む骨又は歯用の医薬組成物。
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