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WO2004113366A1 - ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびその製造方法 - Google Patents

ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびその製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2004113366A1
WO2004113366A1 PCT/JP2004/008924 JP2004008924W WO2004113366A1 WO 2004113366 A1 WO2004113366 A1 WO 2004113366A1 JP 2004008924 W JP2004008924 W JP 2004008924W WO 2004113366 A1 WO2004113366 A1 WO 2004113366A1
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WO
WIPO (PCT)
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mmol
tyr
general formula
group
boc
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/008924
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Minoru Yoshida
Norikazu Nishino
Original Assignee
Riken
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Riken filed Critical Riken
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Priority to US10/561,298 priority patent/US7662778B2/en
Priority to DE602004025935T priority patent/DE602004025935D1/de
Priority to EP04746393A priority patent/EP1640380B1/en
Priority to AT04746393T priority patent/ATE460425T1/de
Publication of WO2004113366A1 publication Critical patent/WO2004113366A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/12—Cyclic peptides with only normal peptide bonds in the ring
    • C07K5/126—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the present invention relates to a histone deacetylase (HDAC) inhibitor and a method for producing the same.
  • HDAC histone deacetylase
  • HAT histone acetylating enzyme
  • HDAC histone deacetylating enzyme
  • TSA Trichostatin A
  • Non-Patent Document 6 Trichostatin A
  • Non-Patent Documents 7 to: 14 the use of a drug that activates gene expression through a mechanism different from that of HDAC inhibitors synergistically increases the differentiation-inducing action and apoptosis-inducing action.
  • retinoic acid which activates the nuclear receptor retinoic acid receptor and induces gene expression related to differentiation
  • an HDAC inhibitor promotes the differentiation of cancer cells (Non-Patent Documents 9, 13) , 15 and 16).
  • Non-Patent Documents 17 to 21 HDAC inhibitors are expected not only as anticancer drugs but also as cancer preventive drugs. TSA and SAHA significantly suppressed the development of breast cancer in animal chemical carcinogenesis models. Studies using valproic acid also show that HDAC inhibitors suppress metastasis (Non-Patent Document 14).
  • HDAC inhibitors include, for example, autologous diseases, neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease (Non-Patent Documents 22 and 23), skin diseases, infectious diseases (Non-Patent Document 24), etc.
  • Various applications have also been attempted, including treatment and amelioration drugs, and more efficient vector transfer in gene therapy (Non-Patent Document 25), and enhanced transgene expression (Non-Patent Document 26).
  • HDAC inhibitors are considered to have angiogenesis inhibitory effects (Non-patent Documents 27 and 28).
  • Non-Patent Document 29 acetylation of p53 itself is important for the functional expression of the tumor suppressor gene P53, which plays a very important role in suppressing carcinogenesis
  • HMC1 and HMC2 are involved in inhibiting its function
  • Non-Patent Document 30 Oncogenes such as PML-MR and PLZF-RAR involved in the development of promyelocytic leukemia (APL) and Bel-6 involved in the development of lymphoma
  • APL promyelocytic leukemia
  • Bel-6 Bel-6 involved in the development of lymphoma
  • HDAC6 is an enzyme that shuts off between the nucleus and cytoplasm by nuclear export and is usually localized in the cytoplasm (Non-Patent Document 37). HDAC6 is highly expressed in testis and the like, and is presumed to be involved in the differentiation of normal tissues. It is known that HDAC6 is involved in deacetylation of microtubules and controls the stability of microtubules (Non-Patent Document 38). Furthermore, HDAC6 is a deacetylase that binds to microtubules and is involved in cell motility (Non-Patent Document 3
  • inhibitors of HDAC6 may be metastasis inhibitors.
  • TSA is for each HDAC sub Although the type is almost equally strongly inhibited, trapoxin having a cyclic tetrapeptide structure and having an epoxy ketone as an active group cannot inhibit HDAC6 (Non-Patent Document 40). From the information on the three-dimensional structure of the enzyme, it is presumed that the cyclic tetrapeptide interacts with the outside of the active center of the enzyme, which is poorly conserved, and thus the structure of the cyclic tetrapeptide moiety has low binding to HDAC6. This suggests that modification of the cyclic tetrapeptide moiety may allow the creation of selective inhibitors for various HDACs.
  • TSA exhibits inhibitory activity by coordinating a hydroxamic acid group to zinc in an HDAC active pocket (Non-Patent Document 41).
  • Oxamflatin Non-Patent Document 42
  • CHAP Non-Patent Documents 40 and 43
  • TSA is an HDAC inhibitor with hydroxamic acid because it is unstable in the blood and forms a chelate with other essential metal ions due to the strong chelating action of hydroxamic acid. Has not been used as a pile cancer drug so far.
  • FK228 is a prodrug that is activated by being reduced by intracellular reducing power (Non-Patent Document 44).
  • Non-Patent Document 1 Marks, PA, Richon, V. ⁇ ., And Rifkind, RA (2000) Histone deacetylase inhibitors: Inducers of differentiation or apoptosis of transformed cells. J. Natl. Cancer Inst. 92, 1210-1216
  • Non-Patent Document 3 Bernhard, D., Loffler, M., Hartmann, BL, Yoshida, M., Kofler, R., and Csordas, A. (1999) Interaction between dexamethasone and butyrate in apoptosis induction: non- Additive in thymocytes and synergistic in a T cell l-derived leukemia cell line.Cell Death Diff. 6, 609-617
  • Non-patent Document 4 Nakajima, ⁇ ⁇ , Kim, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , Terano, ⁇ . , Yoshida, ⁇ , and Horinouchi, S. (1998) FR901228, a potent antitumor antibiotic, is a novel hi stone deacetylase inhibitor. Exp.Cell l Res. 241, 126-133
  • Non-patent Document 5 Saito, A., Yamashita, T., Mariko, Y. Nosaka, ⁇ ⁇ , Tsuchiya, Ando, T, Suzuki, T Tsuruo, T, and Nakani shi, 0 (1999) A synth etic inhibitor of histone deacetylase, MS-27-275, with marked in vivo anti tumor activity against human tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 459 2-4597
  • Non-Patent Document 6 Yoshida, ⁇ ⁇ , Kijima, M., Akita, M. , And Beppu, T. (1990) Potent and specific inhibition of mammal ian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin AJ Biol. Chem. 265, 17174-17179
  • Non-Patent Document 7 Yoshida, ⁇ S., and Beppu, ⁇ ⁇ (1987) Effects of trichostatins on differentiation of murine erythroleukemia cells. Cancer Res. 47: 3688-3691
  • Non-Patent Document 8 Hoshikawa, ⁇ , Ki jima, ⁇ , Yoshida, ⁇ , and Beppu, T. (1991) Expression of differentiation-related markers in teratocarcinoma cels via hi stone hyperacetylation by trichostatin A. Agric. Biol. Chem. 55: 1491-1495 (Non-Patent Document 9) Minucci, S. Horn, V. Bhattacharyya, N Russanova, V. 0gryzko VV Gabriele, L. Howard, BH and Ozato,. (1997) A histo ne deacetylase inhibitor potentiates retinoid receptor action in embryona 1 carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 11295-11300
  • Non-Patent Document 10 Inokoshi, J. Katagiri, ⁇ Arima S., Tanaka, H. Haya shi M. Kim, Y.B.Furumai, R. Yoshida, M. Horinouchi, S. and Omura,
  • Non-patent Document 1 2) Munster, P. Tro Troso- Sandoval, ⁇ Rosen, N. Rifkind, R Marks, PA and Richon, VM (2001) The hi stone deacetylase inhib iter suberoyl an i) i de hydroxami c ac id induces di fferent i at i on of human bre ast cancer cells.Cancer Res. 8492-8497
  • Non-Patent Document 13 Ferrara, F.F, Fazi, F. Bianchini, A., Padula, F. Ge lmetti, V., Minucci, S. Mancini, M. Pel icci, PG, Lo Coco, F. and Ne rvi C. (2001) Histone deacety ase- targeted treatment restores retinoic a cid signaling and differentiation in acute myeloid leukemia. Cancer Res. 61 2-7
  • Non-Patent Document 14 Gottlich, ⁇ Minucci, S. Zhu ⁇ Kramer, 0.H., Sc himpf, A. iavara S. Sleeman, JP Lo Coco, F Nervi, C Pel icci, P. G and Heinzel, T. (2001) Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells.EMB0 J. 20 69 69-6978
  • Non-Patent Document 15 Coffey, D., Kutko, M., Glick, RD, Butler, LM, Heller, G Rifkind, RA, Marks, PA, Richon, V.M, and La Quaglia, MP (2001)
  • the histone deacetylase inhibitor, CBHA inhibits growth of human neuroblastoma xenografts in vivo, alone and synergistically wit h all- trans retinoic acid.Cancer Res. 61: 3591-3594
  • Non-Patent Document 16 Petti, M., Fazi, F., Gentile, M., Diverio, D., De Fa britiis, P., De Propris, MS, ⁇ iorini, R., Spiriti, M. A Li Padula, F., Pel icci, PG, Nervi, C., and Lo Coco, F. (2002) Complete remission thro ugh blast cell differentiation in PLZF / RARa 1 pha-po sitive acute promyelocy tic leukemia: in vitro and in vivo studies.Blood 100: 1065-1067
  • Non-Patent Document l7 Nan, X., Ng, HH, Johnson, CA, Laherty, CD, Turner, B.M. Ei senman, R.N. , and Bird 3 A. (1998) Transcriptional repressi on by the methyl— CpG—binding protein Me and P2 involves a histone deacetylase complex.Nature 393: 386—389
  • Non-Patent Document 19 Li, QL, Ito, K., Sakakura, C., Fukamachi, ⁇ ⁇ , Inoue, ⁇ ⁇ , Chi, X. ⁇ ⁇ , Lee, KY, Nomura, S., Lee, C I, Han, S. ⁇ ⁇ , Kim, H.., Kim, WJ, Yamamoto, H., Yamasmta, N., Yano, T., Ikeda, T., Itohara,
  • Non-Patent Document 21 Primeau, M., Gagnon, J., and Momparler, RL (2003) Synergistic antineoplastic action of DNA methylation inhibitor 5-AZA- 2'-deo xycytidine and histone deacetylase inhibitor depsipeptide on human breast carcinoma cells.Int J Cancer 103: 177-184
  • Non-Patent Document 22 Darkin-Rattray SJ, Gurnett AM, Myers RW, Dulski PM, Crumley TM, Allocco JJ, Cannova C, Meinke PT, Colletti SL, Bednarek MA, Singh SB, Goetz MA, Dombrowski AW, Poli shook JD, Schraatz DM. (1996) a novel a ntiprotozoal agent that inhibits parasite histone deacetylase. Proc. Naxl
  • Non-Patent Document 23 Steffan JS, Bodai L, Pallos J, Poelman M, McCampbell A, tend B, Kazantsev A, Schmidt E, Zhu YZ, Greenwald M, Kuroka a R, Hou sman DE, Jackson GR, Marsh JL, Thompson L. (2001) Hi stone deacetylase in hibitors arrest polyglutamine—dependent neurodegeneration in Drosophi la.Nature. 413 739-43
  • Non-Patent Document 24 McCampbell A, Taye AA, Whitty L, Penney E, Steffan JS, Fischbeck KH. (2001) Histone deacetylase inhibitors reduce polyglutamine toxicity.Proc Natl Acad Sci U S A .: 98 15179-15184
  • Non-Patent Document 25 Dion LD, Goldsmith KT, Tang DC, Engler JA, Yoshida M, Garver RI Jr. (1997) Amplification of recombinant adenoviral transgene products occurs by inhibition of histone deacetylase.Virology 231, 201-209 (Non-Patent Document 26) Chen WY, Bailey EC, McCune SL, Dong JY, Townes TM. (199 7) Reactivation of silenced, virally transduced genes by inhibitors of hi Natl. Acad. Sci.
  • Non-Patent Document 27 Kim, MS, Kwon, HJ, Lee, YM, Baek, JH, Jang, JE, Lee, SW, Moon, EJ, Kim, HS, Lee, SK, Chung, HY, Kim, CW, and Kim, KW (2001) Histone deacetylases induce angiogenesis by negative regulation of tumor suppressor genes.Nature Med. 7, 437-443 (Non-patent literature 2 8] Kwon, HJ, Kim, MS, Kim, MJ, Nakajima, H., and
  • Non-Patent Document 29 Ito, A., Lai, CH, Zhao, X., Saito, S., Hamilton, MH, Appella, E., and Yao, TP (2001) p300 / CBP—mediated p53 acetylation is commonly induced by p53-activating agents and inhibited by MDM2.EMB0
  • Non-Patent Document 30 Juan, L.J., Shia, W. J. , Chen, M.H., Yang, W.M., Seto, E., Lin, Y.S., and Wu, C.W. (2000) Histone Deacetylases Specifically Down-regulate p53-dependent Gene Activation. J. Biol. Chem. 275, 20436-2
  • Non-Patent Document 31 Dhordain P., Albagli, 0., Lin, RJ, Ansieau, S., Quie f, S., Leutz, A., Kerckaert, JP, Evans, RM, and Leprince, D. ( 1997) Corepressor SMRT binds the BTB / POZ repressing domain of the LAZ3 / BCL6 on coprotein.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94, 10762-10767
  • Non-patent Document 32 Grignani, F., De, MS, Nervi, C., Tomassoni, L., Gelmetti, V., Shioce, M., Fanelli, M., Ruthardt, M., Ferrara, FF, Zamir, I. Seiser, C., Grignani, F., Lazar, MA, Minucci, S., and Pelicci, PG (1998) Fusion proteins of the retinoic acid receptor-alpha recruit histon e deacetylase in promyelocytic leukaemia. Nature 391, 815-818
  • Non-Patent Document 33 He, LZ, Guidez, F., Tribioli, C., Peruzzi, D., Rutha rdt, M., Zelent, A., and Pandolfi, PP (1998) Distinct interactions of PML-RARalpha and PLZF-RARalpha with co-repressors determine differentia ⁇ responses to RA in APL.Nature Genet. 18, 126-135
  • Non-Patent Document 34 Lin, RJ, Nagy, L., Inoue, S., Shao, W., Miller, WJ, and Evans, RM (1998) Role of the histone deacetylase complex in ac ute promye ⁇ ocytic leukaemia. Nature 391, 811—814
  • Non-Patent Document 35 McKinsey, T.A., Zhang, C.L., Lu, J., and Olson, E.N.
  • Non-Patent Document 36 Verdel, A., and Khochbin, S. (1999) Identification of a new family of higher eukaryotic histone deacetylases.Coordinate express ion of differentiation-dependent chromatin modifiers.J. Bio ⁇ .Chem. 274,
  • Non-Patent Document 37 Verdel, A., Curtet, S., Brocard, M.-P., Rousseaux, S., Lemercier, C., Yoshida, M., and Krochbin, S. (2000) Active maintenance of raHDA2 / mHDAC6 liistone-deacetylase in the cytoplasm. Curr.Biol. 10, 747-7 49
  • Non-Patent Document 38 Matsuyama, A., Shimazu, T., Sumida, ⁇ ., Saito, A., Yosh imatsu, Y., Se gneur m-Berny, D., Osada, H., Komatsu, Y., Nishino, N., Krochbin, S., Horinouchi, S., and Yoshida, M. (2002) In vivo destabilizatio of dynamic microtubules by HD ACS-media ted deacetylation. EMB0 J. 21, 68 20- 6831
  • Non-Patent Document 39 Hubbert, C., Guardiola, A., Shao, R., Kawaguchi, Y., Ito, A., Nixon, A., Yoshida, M., Wang, X.—F. , And Yao, T.—P. (2002) HDAC6 isa microtubule—associated deacetylase. Nature 417, 455-458
  • Non-Patent Document 40 Furumai, R., Komatsu, ⁇ ⁇ , Nishino, N., Khochbin, S., Yo shida, M., and Horinouchi, S. (2001) Potent histone deacetylase inhibitor s built from trichostatin A and cyclic tetrapeptide antibiotics including trapoxin. Pro Natl. Acad. Sci. USA 98: 87-92
  • Non-patent Document 4 1 Finnin, MS, Donigian, JR, Cohen, A., Richon, VM, Rifkind, RA, Marks, PA, Breslow, R., and Pavletich, NP (199 9) Structures of a histone deacetylase homologue bound to the TSA and SAH A inhibitors. Nature 401: 188-193
  • Non-Patent Document 4 2 Kim, Y. ⁇ , Lee, ⁇ .- ⁇ ., Sugita, ⁇ ,, Yoshida, ⁇ ., And Horinouchi, S. (1999) Oxamf latin is a novel antitumor compound that inhibits s mammalian histone deacetylase. Oncogene 18: 2461—2470
  • Non-Patent Document 43 Komatsu, Y., Tomizaki, K.-y., Tsukamoto, ⁇ ., Kato, ⁇ ., Nishino, ⁇ ., Sato, S., Yamori, ⁇ ., Tsuruo, ⁇ ., Furumai, R., Yoshida, ⁇ ., Horinouchi, S., and Hayashi, H. (2001 Cyclic Hydroxamic- ac id-containing Peptide 31, a potent synthetic histone deacetylase inhibitor with ant i turn or activity.Cancer Res. 61 : 4459-446b
  • Non-Patent Document 44 Furumai, R., Matsuama, A., obashi, N., Lee, K.-H "Ni shiyama, M., Nakajima, H., Tanaka, A., Komatsu, Y ., Nishino, N., Yoshida,
  • An object of the present inventors is to provide a novel HDAC inhibitor having a cyclic tetrapeptide structure and a method for producing the same.
  • the present inventors have synthesized compounds having a cyclic tetrapeptide structure having various functional groups, which can be coordinated to zinc located in the active center of histone deacetylase.
  • the HDAC inhibitory activity was analyzed.
  • the compound having a bonyl group, the compound having a fluoro group, and the compound having a retrohydroxamic acid group exhibited strong HDAC inhibitory activity in both i / 7 vitro and in J 'systems.
  • TSA trichostatin A
  • these compounds inhibit not only deacetylation of histone but also deacetylation of tupurin. That is, these compounds showed strong activity in cells, indicating that they are useful as HDAC inhibitors.
  • the present invention relates to an HDAC inhibitor and a method for producing the same, and provides the following [1] to [11].
  • R n, R 21, R 31 , R 41 are each independently hydrogen or a methyl group.
  • R 22 , R 23 , R 32 , R 33 , R 42 , and R 43 may each independently have hydrogen, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a non-aromatic cyclic alkyl group or a substituent.
  • R 21 and R 92 , R 2 , and R 23 , R 31 and R 32 , R 32 and R 33 , R 41 and R 42 , R 42 and 3 each have no bond and show an acyclic structure, or a linear alkylene group having a chain length of 1 to 5 carbon atoms, Via a linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms having a branched chain having 1 to 6 carbon atoms, or a linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms having a ring structure having 1 to 6 carbon atoms. Shows the ring structure linked by n can be selected in a range having HDAC inhibitory activity.
  • X represents any structure having a structure capable of coordinating with zinc located in the active center of the histone deacetylase.
  • a tubulin deacetylase inhibitor comprising the compound of [1] as an active ingredient.
  • An apoptosis inducer comprising the compound of [1] as an active ingredient.
  • a differentiation inducer comprising the compound of [1] as an active ingredient.
  • An angiogenesis inhibitor comprising the compound of [1] as an active ingredient.
  • a cancer metastasis inhibitor comprising the compound of [1] as an active ingredient.
  • a drug for treating or preventing a disease caused by histone deacetylase 1, 4, or 6, comprising the compound of [1] as an active ingredient.
  • the disease caused by histone deacetylase 1, 4, or 6 is cancer, an autoimmune disease, a neurodegenerative disease, a skin disease, or an infectious disease, for the treatment or prevention described in (9). Drugs.
  • the compound of this effort can be represented by the above general formula (1). Such compounds can be used as HDAC inhibitors.
  • R protest, R 21 , R 31 and R 41 each independently represent hydrogen or a methyl group
  • R 22 , R 23 , R 32 , R 33 , R 42 and R 43 each represent Independently hydrogen, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a non-aromatic cyclic alkyl group or a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms to which an aromatic ring which may have a substituent is bonded
  • R 21 and R—R 22 andoccasionR 3i And R: 2 and R: «, and , R 42 and R 43 each have no bond and represent an acyclic structure, or a linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms in the chain length, 1 to
  • Ring structure bound via a sharp emission group may be formed. Since this cyclic tetrapeptide structure is considered to be capable of functioning as a cap for closing the HDAC boxet, the linear alkyl group and aromatic cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms described above can be used as a cap structure. However, it is possible to arbitrarily select an aromatic which can be these substituents.
  • X represents any structure having a structure capable of coordinating with zinc located at the active center of the histone deacetylase.
  • Functional group highly reactive to X When it is substituted, it becomes unstable in vivo. Therefore, when X is a highly reactive functional group, it is preferable to combine it with a means capable of stably transporting it to a desired site such as a drug delivery system.
  • a substituent that is substituted in the living body and is not harmful to the living body As such a substituent, a substituent having a ketone-type Zn ligand in a side chain is preferable, and the substituent itself may exhibit some effect, or may simply function as a protecting group. It may be provided.
  • n can be selected within a range having HMC inhibitory activity.
  • n is preferably 4 to 6, and most preferably 5.
  • a carbon chain extending from this cyclic tetrapeptide structure and having n carbon atoms penetrates into the active pocket of HDAC, and contacts various functional groups at the tip of this carbon chain with zinc molecules in the HDAC boxet to inhibit HDAC. It is considered to have the function of
  • the compound of the present embodiment can be produced as follows using a compound represented by the general formula (2) or (6) as a raw material.
  • n definitions such as R n, R 2 have R 22, R 23, R 31 , R 32, R 33, R 41, R 42, R 43, P have P 2 and X are described in the above description Since the definition is the same, the description is omitted here.
  • the first embodiment of the method for producing a compound according to the present invention is a method for producing a compound represented by the following general formula (2) as a raw material. Specifically, the general formula (2)
  • the compound represented by the general formula (4) is treated in the presence of a peptide binder.
  • a compound represented by the general formula (1) First, when a protecting group is bonded at a specific position of X in the general formula (2), in the last step, the protecting group is removed by catalytic hydrogenation, acid treatment, fluoride ion treatment, or hydrolysis. A step may be included.
  • the second embodiment of the method for producing the compound of the present invention is a method for producing a compound represented by the following general formula (6) as a raw material. Specifically, the general formula (5)
  • the compound represented by (7) is obtained.
  • the compound represented by the general formula (7) is converted into catalytic hydrogen I spoon, acid treatment, Furuori door two-on process, or by hydrolysis!
  • a compound is Ru represented by the general formula (1) obtain.
  • the last step is to remove the protecting group by catalytic hydrogenation, acid treatment, fluoride ion treatment, or hydrolysis. May be included.
  • X of the cyclic tetrapeptide of the general formula (1) is a carboxyl group or a sulfhydryl group are substituted with trifluoroacetic anhydride, pentafluoropropanoic anhydride, or 1,1,1_trifluoro-3-, respectively.
  • a compound represented by the general formula (1), which forms another substituent X is obtained.
  • Valproic acid defines a novel class of H DAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells.EMB0 J. 20:
  • the compound of the present invention can be used as an apoptosis inducer, a differentiation inducer, and a cancer metastasis inhibitor.
  • compounds that inhibit HDAC are expected to inhibit angiogenesis (Kim, MS, Kwon, HJ , Lee, YM, Baek, JH, Jang, J. E s Lee, SW, Moo n, EJ, Kim, HS, Lee, SK, Chung, HY, Kim, CW, and Kim, KW
  • Histone deacetylases induce angiogenesis by negative regulation of tumor suppressor genes.Nature Med. 7, 437--443; Kwon, HJ, Kim, MS, Kim, MJ, Nakajima, H., and Kim, KW (2002) Histone deacetylase inhi bitor FK228 inhioits tumor angiogenesis. Int. J. Cancer 97, 290-296). Therefore, the compounds of the present invention can also be used as angiogenesis inhibitors.
  • the compound of the present invention shows a strong inhibitory activity on HDAC 1, 4 or 6 among various HDACs. Therefore, the compound of the present invention is useful as an agent for treating or preventing a disease caused by HDAC 1, 4, or 6.
  • This disease includes, besides cancer, autoimmune diseases involving HDAC 1, 4 or 6, neurodegenerative diseases, skin Diseases, infectious diseases, etc. can be included.
  • the compound of the present invention can be used not only as an agent for treating or preventing the above-mentioned diseases, but also as an auxiliary agent for gene therapy such as efficient vector introduction in gene therapy and enhanced expression of a transgene. Alternatively, it may be applied as a promoter.
  • the compound of the present invention can be used in combination with a retinoic acid or a DNA methyl hi inhibitor.
  • the present invention also provides such a combination.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, surfactants, and lubricants are used as necessary. Can be done. Further, a coloring agent, a preservative, a flavor, a flavoring agent, a sweetening agent, and other pharmaceuticals may be contained in the pharmaceutical preparation. Various forms of this pharmaceutical preparation can be selected depending on the purpose of treatment or prevention, for example, tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, injections, suppositories, etc. No.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saline
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above materials may further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing pudose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride. It may be used in combination with an agent, for example, an alcohol, specifically, ethanol, a polyalcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant, for example, polysorbate 80 TM, or HC0-50.
  • an agent for example, an alcohol, specifically, ethanol, a polyalcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant, for example, polysorbate 80 TM, or HC0-50.
  • examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffers such as phosphate buffers Liquid, sodium acetate buffer, soothing agents such as proforce hydrochloride, stabilizers such as benzyl alcohol, phenol, and antioxidants.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampoule.
  • Administration to patients can be oral or parenteral.
  • dosage forms for parenteral administration include injection dosage forms, nasal dosage forms, pulmonary dosage forms, transdermal dosage forms, and the like.
  • injection forms include systemic or local administration by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like. It can also be administered intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally, or orally by methods known to those skilled in the art.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, and administration method.
  • the dose can be administered in terms of the amount converted per body weight or 60 kg, or the amount converted per body surface area.
  • the single dose varies depending on the administration subject, the target organ, the symptoms, and the administration method. It is considered to be about 100 ⁇ g to 20 mg per.
  • FIG. 1 is a diagram showing a compound of the general formula (1).
  • FIG. 2 is a view showing a typical example of the substituent X in the compound of the general formula (1).
  • FIG. 3 is a diagram showing a natural conformation of natural Cyl-1 and Cyl-2.
  • Figure 4 shows the levels of tubulin and histone acetylation in cells 4 is a photograph showing the results of measurement by Western using a lysine lysine antibody.
  • FIG. 5 is a diagram showing the structural formulas of O-phenylenediamine (0PD), an amide of 0_aminophenol (0AP0H), an esterol of 0-am inophenol (OAPNH), and O-arainothiophenol (OATP).
  • 2-ami ⁇ -6-bromonexanoic acid is “Ab6”
  • 2-amino-o-acetylthiohexanoic acid is “Am6 (Ac)”
  • 2-amino-6- (3,3 ′ , 3, -trif luoracetonylthio) -hexanoic ac id is "Am6 (Tfacet) J
  • 2,8-diaminooctanoic acid A2oc
  • 2-araino_7_dimethylphosphonylheptanoic acid is" Aph "
  • ⁇ 3 ⁇ 4-aminosuberic acid is” Asu "
  • 2-amino_8—oxo-9,9,9-trif luorononanoic ac id “TfmJ, 0-methy] tyrosine is“ Tyr (
  • Dioxane was distilled off, and the residue was extracted with ethyl acetate. After washing with a 10% aqueous solution of citric acid and water three times each, and drying over magnesium sulfate, ethyl acetate was distilled off to obtain an oily target product. Yield 2.34 g (6, 15 ramol, 100%).
  • Boc-D- Tyr (Me)-L- ILe-DL- Pip_0Bzl (2.45 g, 4.02 mmol) was dissolved in methanol (10 ml), and Pd-C (500 mg) was added. Stir for 3 hours. After confirming the reaction, Pd-C was filtered, and methanol was distilled off to obtain a foam-form target. Yield 1.98 g (3.81 mmol, 95%) 0
  • Boc_L-Lys (For, OBzl) -OTmse (338 mg, 0.7 mmol) under ice cooling, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes.
  • Boc- D- Tyr (Me) - L- lie- DL_Pip- 0H (363 mg, 0.7 mmol) and HOBt ⁇ H 2 0 a (160 mg, 1, 05 mmol ) was added, DMF ( 1 ml).
  • HBTU 398 mg, 1.05 mmol
  • Et 3 N (0.41 ml, 2.9 mmol
  • LDLL-form Yield 88 mg (0.13 mmol, 24 ° /.), TLC: Rf, 0.8 (CHCl 3 / Me0H, 9/1), RP-HPLC retention time: 22.44 min (column: WakoPak C18 ⁇ 4.6 ⁇ 150 mm, eluent: CH 3 CN 1 0-100% / 0.1% TFA linear gradient over 30 min, flow rate: 1 ml / min).
  • Boc-L-Ab7-0H (2.7 g, 8.3 mmol) and Tmse-OH (2.37 ml, 16.6 mmol) were dissolved in DCM (4 ml), and DMAP (101 mg, 0.83 mmol) and DCC ( 2.05 g, 9. 96 mraol) and stirred for 6 hours.
  • the reaction solution was concentrated and extracted with ethyl acetate.
  • 0-Benzylhydroxylamine hydrochloride (3.19 g, 20 mmol) was dissolved in chloroform, washed with 4% aqueous sodium hydrogencarbonate solution, dried over sodium carbonate, and evaporated. . This was dissolved in formic acid (20 ml). On the other hand, acetic anhydride (7.5 ml, 80 mmol) was added to formic acid (40 ml) under ice cooling, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes. To this, the formic acid solution of 0-benzylhydroxylamine was added, and the mixture was stirred for 24 hours. The reaction solution was concentrated, and the residue was extracted with ethyl acetate.
  • Boc-L-Ab7-OTmse (846 mg, 2.0 mmol), 0_benzylhydroxylinoleamide formate (453 mg, 3.0 mmol), potassium iodide (166 mg, 1.0 mmol) and carbonated carbonate ( 1.20 g, 8.0 mmol) was dissolved in anhydrous acetone (40 ml) and refluxed at 90 ° C for 4 days. The reaction solution was filtered and then concentrated. The mixture was extracted with getyl ether, washed once with a 0.5 N aqueous sodium hydroxide solution and twice with distilled water, and then dried with anhydrous sodium carbonate to distill off geethyl ether.
  • the reaction solution was concentrated, and the residue was extracted with ethyl acetate.
  • the mixture was washed three times with a 10% aqueous solution of citrate, a 4% aqueous solution of sodium hydrogencarbonate, and a saturated saline solution, dried with magnesium sulfate, and then ethyl acetate was distilled off.
  • the product was purified by silica gel chromatography to obtain a foamed target product (column: Merck Kieselgel 60 ⁇ 2.4 ⁇ 20 cm, eluent: CHCl 3 / Me0H, 99/1).
  • TLC Rf, 0. 65 (CHCl 3 / MeOH, 9/1). Yield 289 mg (0.32 mmol, 71%) 0
  • Boc- D-Tyr (Me)-L-lie- DL- Pip-L-Hly (For, OBzl) -OTmse (289 mg, 0.32 mmol) was dissolved in DMF (1 ml) and 1 M TBAF / THF (0.7 ml, 0.7 mmol) was added and left for 30 minutes. After the reaction solution was concentrated, it was extracted with ethyl acetate. After washing with a 10% aqueous solution of cunic acid and distilled water three times, and drying over magnesium sulfate, ethyl acetate was distilled off. To this, TFA (3 ml) was added under ice cooling, and the mixture was left for 30 minutes. After the TFA was distilled off, ethyl ether and petroleum ether were added to obtain a white powder. Yield 261 mg (0.32 mmol, 100%) 0
  • the mixture was extracted with ethyl acetate, washed three times with a 10% aqueous solution of citrate, a 4% aqueous solution of sodium hydrogen carbonate and saturated saline, dried over magnesium sulfate, and distilled off the ethyl acetate.
  • the product was purified by silica gel gel chromatography to separate diastereomers (LDLL-form and LD LD-form) (column: Merck Kieselgel 60 ⁇ 1.5 ⁇ 36 cm, eluent: CHCl 3 / MeOH, 99/1).
  • LDLL-form yield 61 mg (0.090 mmol, 28 ° /.), TLC: Rf, 0.55 (CHCl 3 / MeOH, 9/1), RP-HPLC retention time: 22.40 min (column: YMC-Pack C8 ⁇ 4.
  • Boc-L-Ab7-0H (1.46 g, 4.5 ramol) and Tmse-OH (0.77 ml, 5.4 ol) were dissolved in DCM (10 ml), and MAP (55 mg, 0.45 ol) was added under ice cooling. And DCC (1.1 g, 5.4 ramol) were added, and the mixture was stirred for 16 hours.
  • the solvent was distilled off, and extracted with ethyl acetate. The extract washed three times with a 10% aqueous solution of citrate, a 4% aqueous solution of sodium hydrogen carbonate, and a saturated saline solution, dried over magnesium sulfate, and then ethyl acetate was distilled off.
  • Boc-L-Ab7-0Tmse (2, 3 g 5 5.5 ramol), 0-benzylhydroxylamide formic acid (1, 45 g, 9.6 mmol), potassium iodide (465 mg, 2.8 ml ol) and potassium carbonate (3. 04 g, 22 mmol) was dissolved in anhydrous acetone (50 ml) and refluxed at 90 ° C for 36 hours. The reaction solution was filtered and then concentrated. The mixture was extracted with getyl ether, washed once with a 0.5N aqueous sodium hydroxide solution and twice with distilled water, dried over magnesium sulfate, and distilled to remove getyl ether.
  • TFA (4 ml) was added to Boc-L-lie-L-Pro_0Bzl (1.00 g, 2.6 mmol) under ice cooling, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes. TFA was distilled off and dried under reduced pressure. This was dissolved in DMF (6 ml), Boc_D-Tyr (Me) -0H (770 mg, 2.6 mmol) was added, and then HOBt0 (597 mg, 3.9 mmol), HBTU (1.50 g, 3.9 mmol) and Et 3 N (0.88 ml, 6.3 mmol) were stirred for 16 hours. The reaction solution was concentrated and extracted with ethyl acetate.
  • the reaction mixture was concentrated, extracted with ethyl acetate, and washed three times with a 10% aqueous citric acid solution, a 4% aqueous sodium bicarbonate solution, and a saturated saline solution, respectively. Then, after drying over magnesium sulfate, ethyl acetate was distilled off. Purification by silica gel chromatography gave the desired product in the form of a foam (column: Merck Kieselgel 60 ⁇ 3.4 ⁇ 30 cm, eluent: CHCl 3 / MeOH, 99/1). TLC: Rf, 0.6 (CHCl 3 / MeOH, 19/1). Yield 470 mg (0.55 mmol, 69%).
  • Boc-D-Tyr (Me) -L-Ile-L-Pro-L-Hly (For, OBzl) OTmse (470 mg, 0.55 mmol) was dissolved in DMF (2 ml) and 1 M TBAF / THF (1.9 ml, 1.9 mmol) and left at room temperature for 2 hours.
  • the reaction solution was concentrated, extracted with ethyl acetate, washed three times with a 10% aqueous solution of citric acid and distilled water, dried over magnesium sulfate, and distilled off the ethyl acetate.
  • TFA (2 ml) was added under ice cooling, and the mixture was left for 30 minutes. After TFA was distilled off, getyl ether was added to obtain a white powder. Yield 437 mg (0.55 mmol, 100%).
  • reaction solution was concentrated, extracted with ethyl acetate, washed three times with a 10% aqueous solution of citric acid, a 4% aqueous solution of sodium bicarbonate, and a saturated saline solution, dried over magnesium sulfate, and distilled off the ethyl acetate. Purification was performed by gel chromatography on a silica gel to obtain an oil (column: Merck Kieselgel 60 ⁇ 3.4 ⁇ 30 cm, eluent: CHCl 3 / Me0H, 991).
  • TFA TFA (5 ml) was added to Boc-L-11 eD-Pro-0Bzl (1.63 g, 3.38 mmol) under ice cooling, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes. TFA was distilled off and dried under reduced pressure. This was dissolved in DMF (8 ml), BocD-Tyr (Me) -OH (1.50 g, 5.07 ramol) was added, and HOBt ⁇ 0 (518 mg, 3.38 mmol), HBTU (1.92 g, 5.07 mmol) and Et 3 N (2.37 ml, 16.9 mmol) were added and stirred for 3 hours.
  • reaction solution was concentrated, extracted with ethyl acetate, washed three times with a 10% aqueous solution of citric acid, a 4% aqueous solution of sodium hydrogen carbonate, and a saturated saline solution, dried over magnesium sulfate, and then distilled off the ethyl acetate.
  • Purification by silica gel gel chromatography gave a foam-form of the desired product (column: Merck Kieselgel 60 ⁇ 3.4 ⁇ 30 cm, eluent: CHCl 3 / MeOH, 99/1).
  • TLC Rf, 0.89 (CHCl 3 / Me0H, 9/1). Yield 1.44 g (2.42 Ol, 72%).
  • reaction solution was concentrated, extracted with ethyl acetate, washed three times with a 10% aqueous solution of citric acid, a 4% aqueous solution of sodium hydrogen carbonate, and a saturated saline solution, dried over magnesium sulfate, and distilled off ethyl acetate.
  • Purification by silica gel chromatography yielded the desired product in the form of a foam (column: Merck Kieselgel 60 ⁇ 3.4 ⁇ 30 cm, eluent: CHC1 MeOH, 99/1) 0 TLC: Rf, 0.7 (CHCl 3 / MeOH 3 9 / 1 :). Yield 830 mg (0.94 ramol, 83%).
  • Boc-D-Tyr (Me) -L-Ile-D-Pro-L-Hly (For, OBzl) -OTmse (830 mg, 0.94 mmol) was dissolved in DMF (2 ml) and 1 M TBAF / THF ( 1.9 ml, 1.9 ramol) and left at room temperature for 2 hours.
  • the reaction solution was concentrated, extracted with ethyl acetate, washed three times with a 10% aqueous solution of citric acid and distilled water, dried over magnesium sulfate, and distilled off the ethyl acetate.
  • TFA (2 ml) was added under ice cooling, and the mixture was left for 30 minutes. After the TFA was distilled off, getyl ether was added to obtain a white powder. Yield 437 mg (0.78 mmol, 93%).
  • the above tetrapeptide / DMF solution (1 ml), HATU (89 mg, 0.23 bandol) and 0.081 M DIEA / DMF solution (1 ml, 0.47 mmol) were added to DMF (160 ml), and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. . After repeating the same operation 5 times, the reaction solution was concentrated.
  • Boc-L-Ab8-0H (3.37 g, 10 bandol) and Trase-OH (2.86 ml, 20 mmol) were dissolved in DCM (5 ml), and DMAP (122 rag, 1.0 mmol) and DCC were dissolved on ice. (2.48 g, 12 mmol) and the mixture was stirred for 6 hours.
  • the reaction solution was concentrated, and the residue was extracted with ethyl acetate. After washing three times with a 10% aqueous solution of citrate, a 4% aqueous solution of sodium bicarbonate, and saturated saline, and drying over magnesium sulfate, ethyl acetate was distilled off.
  • Boc-L-Ab8-OTmse (2.39 g, 5.50 mmol), 0-benzylhydroxylamide formate (1.24 g, 8.2 ramol), potassium iodide (456 mg, 2.75 ramol) and potassium carbonate (3.30 g, 22 bandol) was dissolved in anhydrous acetone (110 ml) and refluxed at 90 ° C for 6 days. The reaction solution was filtered and then concentrated. After extraction with getyl ether, the extract was washed once with a 5N aqueous solution of sodium hydroxide and three times with distilled water, dried over sodium carbonate, and the getyl ether was distilled off.
  • the mixture was extracted with ethyl acetate, washed three times with a 10% aqueous solution of citrate, a 4% aqueous solution of sodium hydrogen carbonate, and a saturated saline solution, dried over magnesium sulfate, and distilled off the ethyl acetate. Purification by gel chromatography was performed to obtain the desired product in the form of a foam (column: Merek Kieselgel 60 1.5 ⁇ 35 cm, eluent: CHCL / MeOH, 99/1). Yield 47 mg (0.068 mmol, 21%).
  • LDLL-body TLC: Rf, 0.6 (CHCl 3 / Me0H, 9/1), RP-HPLC retenti on time: 24.02 min (column: WakoPak C18 4.6x150 mm, eluent: CH 3 CN 10-10 0 /0.1% TFA linear gradient over 30 min, flow rate: 1 ml / min
  • Cyclo (-L-A2oc (For, OBzl) -D_Tyr (Me) -L-Ile_DL-Pip_) (47 mg, 0.068 mmol) was dissolved in acetic acid a ml. Add Pd-C (100 rag) and place in a hydrogen atmosphere at room temperature for 1 hour While stirring. Pd_C was filtered and acetic acid was distilled off. Diastereomers (LDLL-form and LDLD-form) were separated and purified by HPLC fractionation.
  • Lyophilized powders were obtained respectively (column: YMC-Pack C8 ⁇ 10x250 mm, eluent: CH 3 CN 44-53% / 0.1% TFA linear gradient over 20 min, flow rate: 3 ml / min) 0 LDLL-body: yield 10 mg (0.017 awake ol, 25%), RP-HPLC retention time: 20.14 min (column: Wa kp Pak C18 ⁇ 4.6.6x150 mm, eluent: CH 3 CN 10-100% / 0.1% TFA linear gradient o ver 30 min, flow rate: 1 ml / min). (. Calcd, 601.
  • Boc-L-Ab6-OH (622 rag, 2.0 ramol) and benzyl alcohol (0.26 ml, 2.4 raiiio 1) were dissolved in DCM (8 ml). 24 mg, 0.2 mrnol) and DCC
  • Boc-L-Ab7-OTmse 425 mg, 1 mmol
  • acetonitrile 2 ml
  • Nal 150 mg, 1 mmol
  • P (0Me) 3 500 mg, 4 ol
  • Boc-L-Aph-0Trase 440 mg, 98%).
  • FABMS matrix: 2, 2, -dithiodiethanol: m / z, 354 [M + H] + .
  • Boc-L-Aph-OTmse 440 mg, 1 mmol
  • 1 M TBAF / THF 2 ml
  • the residue was dissolved in ethyl acetate, washed with a 10% aqueous solution of citric acid and brine, and dried over magnesium sulfate.
  • Ethyl acetate was distilled off to obtain Boc-L-Aph_0H (250 mg, 0.71 t ol, 70%).
  • Boc-D-Tyr (Me) -L-lie-D-Pro_0Bzl (416 mg, 0.7 mmol) in TFA (3 ml) for 30 minutes After treatment, TFA was distilled off to obtain TFA ⁇ HD-Tyr (Me) -L-lie-D-Pro-OBzl.
  • Boc-L_Aph—D-Tyr (Me) _L—lie— D_Pro-OBzl (200 mg, 0.24 mmol) was hydrogenated in the presence of 5% Pd / C (50 mg) in methanol to give Boc-L_Aph-D- Tyr (Me) -L_Ile-D-Pro-0H (160 mg, 0.22 mmol, 92%) was obtained.
  • the Boc group was removed by treatment with TFA (2 ml) for 30 minutes under ice-cooling, and then TFA was distilled off and solidified with ether.
  • FIG. 2 shows a list of the substituent structures of the compounds whose activities were measured. Cyl_l, Cyl-2 (Furumai et al. (2001) Proc. Natl.
  • HDAC solution was prepared as follows. 1 00 mm dish seeded with 1 X 1 0 7 amino 29 3 T cells, human HDACl, 4 or vector expressing the murine HDAC6 (l ⁇ g) of LipofectAmine 2000 reagent (Li fe Technologies After 24 hours, Inc Gaithersburg, MD).
  • the human HDAC1 expression vector is pc DNA3-HD1 (Yang, WM, Yao, Y., Sun, JM, Davie, JR & Seto, E. (1997) J. Biol. Chem.
  • Human HDAC4 expression vector is pc DNA 3.1 (+) — HD4 (Fischle, W., Emiliani, S., Hendzel, MJ, Nagase, T., Nomura, N., Voelter, W. & Verdin, E. (1999) J. Biol. Chem. 274, 11713-1172 0.)
  • mouse HDAC6 expression vector is pc DNA—mHDA2H HDAC6 (Verdel, A. & Khochbin, S. (1999) J. Biol. Chem. 274, 2440-2445.) Was used.
  • the medium was replaced with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) and incubated for 9 hours. After washing the cells with PBS, the cells are suspended in lysis buffer (50 mM Tris—HC1 (pH 7.5), 120 mM NaC1, 5 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40). , Sonication. The supernatant was collected by centrifugation, and protein-A / G plus agarose beads (Santa Cruz Biotechnologies, Inc.) were used to remove the specific white protein.
  • lysis buffer 50 mM Tris—HC1 (pH 7.5), 120 mM NaC1, 5 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40.
  • an anti-FLAG M2 antibody (Sigma-Aldrich Inc.) was added to the cell supernatant expressing HDAC1 and HDAC4 to express HDAC6.
  • Anti_HA antibody (clone 3F10, Roche Molecular Biochemicals) was added to the cell supernatant, and reacted at 4 for 1 hour.
  • the HDAC inhibitory activity of the Inro system was evaluated as follows.
  • the test compound was dissolved in DMSO to prepare a stock solution having a concentration of 1 OmM, which was used as a stock solution of the inhibitor.
  • Atsusi went by incubating Asechiru of histone peptide solution labeled presence of the test compound H DAC solution and coumarin 3 7 ° C for 30 min (reaction volume product 20 mu 1) the reaction solution to 30 mu 1 of trypsin was added, and the amount of ami / methyl coumarin released by the enzyme reaction was measured using a fluorescent plate.
  • the same operation was performed without adding an inhibitor to the reaction system as a negative control.
  • the inhibitory activity was expressed as the 50% inhibitory concentration of HDAC activity in the negative control (" IC5Q (M)") (Table 1).
  • the HDAC inhibitory activity of the in JVO system was measured using the p21 promoter-inducing activity as an index as follows.
  • the MFLL-9 cells used in the experiment were cells that stably harbored the fusion gene (Dr. B. Vogelstaein) of the human wild-type p21 promoter and luciferase, and were phenol red-free DMEM medium supplemented with 10% FBS. 37. C. Culture was performed using a steam-saturated incubator in the presence of 5% carbon dioxide.
  • the MFLL-9 cells were seeded in a 96-well microplate at a cell density of 85,000 cells / well, cultured in the above-mentioned medium 991 for 6 hours per well, and then a test compound solution 11 was added. 18 hours ⁇ cultivated.
  • TSA was also used as a positive control compound for p21 promoter inducing activity due to HDAC inhibitory activity.
  • y (Me) indicates D-Tyr (Me)
  • Tyr (Me) indicates 0-methyltyrosine
  • I3 ⁇ 4L-Ile pip indicates D_pipecolic acid
  • Pip indicates L-pipecolic acid.
  • Uppercase letters indicate L-form amino acids
  • lowercase letters indicate D-form amino acids).
  • NT also indicates that it has not been tested.
  • the compounds of the present invention showed strong inhibitory activity against HDAC1, 4 and 6. It has been reported that compounds having a cyclic tetrapeptide structure cannot inhibit HDAC6.However, by changing the structure of the tetrapeptide skeleton as in the present invention, HDAC6 can also be inhibited. It became. In addition, when the structure of the X site is different, the inhibitory activity for each enzyme subtype is greatly different, indicating that the compound of the present invention has an enzyme subtype-selective inhibitory activity.
  • acetylation levels of tubulin and histone were measured by allowing the test compound to act on HeLa cells and confirming the acetylation levels of tubulin and histone in the Western using an anti-acetylated lysine antibody.
  • human uterine cancer cells HeLa
  • the cells were cultured in a DMEM medium supplemented with 10% FBS at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide in a steam-saturated incubator.
  • the cells were seeded at a cell density of 15,000 Zml at a cell density of 2 ml on a 6-well plate, and cultured for 18 hours. Then, a test compound solution was added, followed by culturing for 6 hours.
  • lys buffer 50 niM Tris_HC1 (pH 7.5), 120 mM NaC1, 5 mM EDTA, 0.5% Nonidet P—4 0
  • sonicate I did.
  • the supernatant was collected by centrifugation, mixed with the SDS buffer, and treated at 100 ° C for 5 minutes.
  • the sample was electrophoresed on a 15% SDS gel, and then transferred to a membrane film.
  • AKL5C1 Jopan Energy
  • anti-mouse LIFE SCIENCE
  • ECL amersham pharmacia biotech
  • acetylated bands were detected (FIG. 4).
  • the unit of the concentration of the compound described in FIG. 4 is M.
  • the inhibition tendency was consistent with the result of the p21 promoter inducing activity measurement (EC 5 ).
  • Such enzyme selectivity is unique to HDAC inhibitors having other cyclic tetrapeptide structures.
  • TIG-3 normal human lung cells
  • HeLa human uterine cancer cells
  • the product was purified by gel filtration chromatography to obtain cyclo (L-Asu (OATP) _D-Tyr (Me) -L-Ile-D-Pro) SS-dimer (column: Sephadex LH-20 ⁇ 2.0x100 cm, eluent: DMF). Yield 120 mg (0 09 mmol, 80%).
  • SS-dimer was fed with dithiothreitol for 3 days, it easily gave the HS-isomer.
  • the HDAC inhibitory activity of the in 'ra system was measured using the p21 promoter-inducing activity as an index.
  • the experimental method was in accordance with Example 11. Activity intensity of the test compound was compared with the concentration at which gives 50% of the value of the maximum activity value by TSA ( "EC 5. ( ⁇ )”) (Table 3). Table 3
  • the compounds of the present invention show strong inhibitory activity against various subtypes of HMC.
  • the compound of the present invention can be used as an agent for treating or preventing a disease associated with HDAC 1, 4, and 6. Further, various types of compounds can be easily synthesized by the method for producing a compound of the present invention. Therefore, by using the production method of the present invention, the structure of the tetrapeptide skeleton can be changed in various modes, and the selectivity of the compound for the target enzyme can be easily changed. That is, the method for producing the compound of the present invention is expected to contribute to the development of HDAC inhibitors having new properties.

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Description

明細書 ヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤およびその製造方法 技術分野
本発明はヒストン脱ァセチル化酵素 （Histone deacetylase : HDAC) 阻害剤およ びその製造方法に関する。 背景技術
真核生物のクロマチン構造と遺伝子の発現は、 ヒストンァセチル化酵素 （HAT) によるヒストンのァセチルイ匕と、 ヒストン脱ァセチル化酵素 （HDAC) による脱ァ セチル化によって調節されている。 HDACの阻害剤ががん細胞の分化や、 アポトー シスを誘導することが以前から知られ、 制がん剤としての応用が期待されている (非特許文献 1〜3 )。 実際、 米国では動物実験で制がん剤としての有効性を示す いくつかの HDAC阻害剤 (非特許文献 4及び 5 )の臨床研究が開始されている。
HDAC特異的阻害剤としてはトリコスタチン A (TSA) が有名である（非特許文献 6 )。 実際、 TSAは白血病細胞、 神経細胞、 乳癌細胞などの分化を誘導することが 知られている （非特許文献 7〜： 1 4 ) 。 さらに HDAC阻害剤とは異なる機構で遺伝 子発現を活性化する薬物との併用によって、 その分化誘導作用やアポトーシス誘 導作用は相乗的に増大することも知られている。 例えば、 核内受容体であるレチ ノィン酸受容体を活性化し、 分化に関する遺伝子発現を引き起こすレチノイン酸 と HDAC阻害剤との併用でがん細胞の分化が促進される （非特許文献 9、 1 3、 1 5及び 1 6 ) 。 また、 多くのがん細胞ではがん抑制遺伝子の発現が低下している が、 その原因として知られる DNAのメチル化を阻害する 5 -ァザデォキシシチジンと の併用によってがん抑制遺伝子の発現の回復とがん細胞のアポトーシスが促進さ れる （非特許文献 1 7〜2 1 ) 。 HDAC阻害剤は、 制がん剤としてのみならず、 がん予防薬としても期待されてい る。 TSAや SAHA等は、 動物の化学発がんモデルにおいて乳癌の発生を顕著に抑制し た。 また、 バルプロ酸を用いた研究から、 HDAC阻害剤は転移を抑制することも示 されている （非特許文献 1 4 ) 。
HDAC阻害剤は制がん剤以外にも、 例えば自己^疫疾患、 ポリグルタミン病等の 神経変性疾患 （非特許文献 2 2及び 2 3 ) 、 皮膚病、 感染症 （非特許文献 2 4 ) などの治療 ·改善薬、 さらには遺伝子治療におけるベクター導入の効率化 （非特 許文献 2 5 ) 、 導入遺伝子の発現亢進 （非特許文献 2 6 ) など様々な応用も試み られている。 また、 HDAC阻害剤は血管新生阻害作用を有すると考えられている (非特許文献 2 7及び 2 8 ) 。
HDACには 10種類以上のサブタイプが存在するが、 近年、 特定の HDACサブタイプ とがんとの密接な関係がわかってきた。 例えば、 発がんの抑制に極めて重要な役 割を果たすがん抑制遺伝子 P53の機能発現に p53自身のァセチル化が重要であり（非 特許文献 2 9 )、 その機能阻害に HMC1や HMC2が関わること（非特許文献 3 0 )、 前 骨髄球性白血病 （APL) の発症に関わる蛋白質 PML-MRや PLZF - RAR、 リンパ腫の発 症に関わる Bel- 6等のがん遺伝子が.， 核内コリプレッサーを介して HDAC4などをリ クルー 1、し、 正常な分化に必要な遺伝子群の発現を抑制することで発がんに至る ことなどが示されている（非特許文献 3 1〜3 4 )。 その一方で、 組織特異的に発 現する HDACサブタイプの中には、 正常な組織の発生や分化に重要な役割を果たす ものが存在することが知られている（非特許文献 3 5及ぴ 3 6 )。
HDAC6は核外輸送によって核 -細胞質間をシャトノレし、 通常は細胞質に局在する 酵素である （非特許文献 3 7 ) 。 HDAC6は精巣などで発現が高く、 正常な組織の分 化に関わると推定される。 また、 HDAC6は微小管の脱ァセチルイ匕に関与し、 微小管 の安定性を制御することが知られている （非特許文献 3 8 ) 。 さらに、 HDAC6は微 小管に結合する脱ァセチル化酵素で、 細胞の運動性に関与する （非特許文献 3
9 ) 。 よって HDAC6の阻害剤は転移抑制剤となる可能性がある。 TSAは各 HDACサブ タイプをほぼ同等に強く阻害するが、 環状テトラペプチド構造を有し、 活性基と してエポキシケトンを持つトラポキシンは HDAC6を阻害することができない （非特 許文献 4 0 ) 。 酵素の立体構造の情報から、 環状テトラペプチドはあまり保存さ れていない酵素の活性中心の外側と相互作用するため、 環状テトラペプチド部分 の構造によって HDAC6との結合性が低いと推定される。 このことは環状テトラぺプ チド部分の改変によって様々な HDACに選択的な阻害剤を創製できる可能性がある ことを示している。
TSAはヒドロキサム酸基が HDAC活性ボケット内で亜鉛に配位することで阻害活性 を示す （非特許文献 4 1 ) 。 ヒ ドロキサム酸を有する HDAC阻害剤としては、 Oxamf latin (非特許文献 4 2 ) 、 CHAP (非特許文献 4 0及ぴ 4 3 ) なども知られている。 しかし、 TSAは血中で不安定である上にヒドロキサム酸のキレート作用が強力なた めに他の必須な金属イオンとキレートを形成してしまうなどの理由で、 ヒドロキ サム酸を有する HDAC阻害剤はこれまでのところ杭がん剤として実際の使用には至 つていない。 これに対し、 最近になって FK228のジスルフイ ド結合の還元により生 じるチオール基が、 HDAC活性ボケット内の亜鉛と配位する活性基となり、 HDACを 阻害し得ることが示された。 二のように FK228は、 細胞内の還元力で還元されて活 性化するプロドラッグである (非特許文献 4 4 ) 。
また、 天然界から環状テトラペプチド構造を有し、 活性基としてエポキシケト ンを持つ HDAC阻害剤が複数単離されている。 このような知見から、 酵素認識に対 する環状テトラペプチド構造の有用性が示唆されている力 S (前掲 Yoshidaら， 1995)、 これまでの阻害剤は安定性などの種々の点で医薬品として十分に満足できるレべ ルには達したものはない。 そこでそれらの問題点を解決した薬剤の開発が強く望 まれている。
尚、 本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
〔非特許文献 1〕 Marks, P. A. , Richon, V. Μ.， and Rifkind, R. A. (2000) Hi stone deacetylase inhibitors： Inducers of differentiation or apoptosis of transformed cells. J. Natl. Cancer Inst. 92， 1210-1216
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〔非特許文献 3〕 Bernhard, D.， Loffler, M.， Hartmann, B. L.， Yoshida, M.， Kofler, R.， and Csordas, A. (1999) Interaction between dexamethasone and butyrate in apoptosi s induction : non-additive in thymocytes and synergist ic in a T cel l-derived leukemia cell l ine. Cell Death Diff. 6， 609-617 〔非特許文献 4〕 Nakaj ima, Η·， Kim, Υ· Β·， Terano, Η. , Yoshida, Μ·， and Ho rinouchi, S. (1998) FR901228, a potent antitumor antibiotic, is a novel h i stone deacetylase inhibitor. Exp. Cel l Res. 241, 126 - 133
〔非特許文献 5〕 Saito, A. , Yamashita, T.， Mariko, Yリ Nosaka, Υ·， Tsuchiy a， ， Ando， T， Suzuki , T Tsuruo, T， and Nakani shi , 0 (1999) A synth etic inhibitor of histone deacetylase, MS - 27 - 275， with marked in vivo ant i tumor activity against human tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 459 2-4597
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〔非特許文献 8〕 Hoshikawa, Υ·， Ki j ima, Μ·， Yoshida, Μ·， and Beppu, T. (19 91) Expression of differentiation-related markers in teratocarcinoma cel l s via hi stone hyperacetylation by trichostatin A. Agric. Biol. Chem. 55 : 1491-1495 〔非特許文献 9〕 Minucci, S. Horn, V. Bhattacharyya, N Russanova, V. 0gryzko V. V. Gabriele, L. Howard, B. H. and Ozato, . (1997) A histo ne deacetylase inhibitor potentiates retinoid receptor action in embryona 1 carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 11295-11300
〔非特許文献 1 0〕 Inokoshi, J. Katagiri, Μ· Arima S. , Tanaka, H. Haya shi M. Kim, Y. B. Furumai, R. Yoshida, M. Horinouchi, S. and Omura,
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〔非特言午文献 1 1〕 Wang, J. Saunthararajah, Y. Redner? R. L. and Liu, J.
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〔非特許文献 1 2〕 Munster, P. Ν· Troso- Sandoval, Τ· Rosen, N. Rifkind, R Marks, P. A. and Richon, V. M. (2001) The hi stone deacetylase inhib i ter suberoyl an i ] i de hydroxami c ac id induces di fferent i at i on of human bre ast cancer cells. Cancer Res. 8492-8497 ·
〔非特許文献 1 3 Ferrara, F. F, Fazi, F. Bianchini, A. , Padula, F. Ge lmetti, V. , Minucci, S. Mancini, M. Pel icci, P. G. , Lo Coco, F. and Ne rvi C. (2001) Histone deacety ase- targeted treatment restores retinoic a cid signaling and differentiation in acute myeloid leukemia. Cancer Res. 61 2-7
〔非特許文献 1 4〕 Gottlicher, Μ· Minucci, S. Zhu Ρ· Kramer, 0. H. , Sc himpf, A. iavara S. Sleeman, J. P. Lo Coco, F Nervi, C Pel icci, P. G and Heinzel, T. (2001) Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells. EMB0 J. 20 69 69-6978
〔非特許文献 1 5〕 Coffey, D. ， Kutko, M. ， Glick， R. D.， Butler, L. M. , Heller, Gリ Rifkind, R. A.， Marks, P. A.， Richon, V. M，， and La Quagl ia， M. P. (2001) The histone deacetylase inhibitor, CBHA， inhibits growth of human neuroblastoma xenografts in vivo, alone and synergistically wit h all- trans retinoic acid. Cancer Res. 61 : 3591 - 3594
〔非特許文献 1 6〕 Petti, M. ， Fazi, F. , Gentile, M.， Diverio， D.， De Fa britiis, P.， De Propris, M. S.， ^ iorini, R.， Spiriti, M. Aリ Padula, F.， Pel icci, P. G.， Nervi, C.， and Lo Coco, F. (2002) Complete remission thro ugh blast cell differentiation in PLZF/RARa 1 pha-po s i t i v e acute promyelocy tic leukemia : in vitro and in vivo studies. Blood 100 : 1065—1067
〔非特許文献 l 7〕 Nan, X.， Ng， H. H.， Johnson, C. A.， Laherty, C. D.， Tur ner， B. M。 Ei senman, R. N。 , and Bird3 A。 (1998) Transcriptional repressi on by the methyl— CpG— binding protein Meし P2 involves a histone deacetylase complex. Nature 393： 386—389
〔非特言午文 1 8〕 Cameron, E。 E。， Bachman, K。 E。 Myohanen, S。 5 Herman, J。
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〔非特許文献 1 9〕 Li， Q. L.， Ito， K.， Sakakura, C.， Fukamachi, Η·， Inoue, Κ·， Chi, X. Ζ·， Lee， K. Y. , Nomura, S. , Lee, C. I , Han, S. Β·， Kim， H. . , Kim, W. J.， Yamamoto, H.， Yamasmta, N.， Yano, T.， Ikeda, T.， Itohara,
S.， Inazawa, J. , Abe, T.， Hagi ara, A.， Yamagishi, H.， 0oe， Aリ Kaneda, A.， Sugimura, T.， Ushijima, T,， Bae， S. Cつ and Ito, Y. (2002) Causal rel ationship between the loss of RUNX3 expression and gastric cancer. Cell 1 Q9 : 113-124 〔非特許文献 2 0〕 Boivin, A. J. , Momparler, L. F. , Hurtubise, A.， and Mom parler, R. L. (2002) Antineoplastic action of 5 - aza - 2' -deoxycytidine and phenylbutyrate on human lung carcinoma cells. Anticancer Drugs 13 : 869-87 4
〔非特許文献 2 1〕 Primeau, M. , Gagnon, J.， and Momparler, R. L. (2003) Sy nergistic antineoplastic action of DNA methylation inhibitor 5-AZA- 2' - deo xycytidine and histone deacetylase inhibitor depsipeptide on human breast carcinoma cells. Int J Cancer 103 : 177-184
〔非特許文献 2 2〕 Darkin-Rattray SJ, Gurnett AM, Myers RW, Dulski PM, Cru mley TM, Allocco JJ, Cannova C， Meinke PT， Colletti SL, Bednarek MA, Sing h SB, Goetz MA, Dombrowski AW, Poli shook JD， Schraatz DM. (1996) a novel a ntiprotozoal agent that inhibits parasite histone deacetylase. Proc. Naxl
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〔非特許文献 2 3〕 Steffan JS, Bodai L， Pallos J， Poelman M, McCampbell A, Apostol Bし, Kazantsev A, Schmidt E, Zhu YZ, Greenwald M, Kuroka a R, Hou sman DE, Jackson GR, Marsh JL, Thompson L . (2001) Hi stone deacetylase i n hibitors arrest polyglutamine— dependent neurodegeneration in Drosophi la. Nature. 413 739-43
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〔非特許文献 2 9〕 Ito, A. , Lai, C. H. , Zhao, X. , Saito, S. , Hamilton, M. H. , Appella, E. , and Yao, T. P. (2001) p300/CBP— mediated p53 acetylation is commonly induced by p53-activating agents and inhibited by MDM2. EMB0
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〔非特許文献 3 0〕 Juan, L. J. , Shia, W。 J。， Chen, M. H. , Yang, W. M. , Set o， E. , Lin, Y. S. , and Wu， C. W. (2000) Histone Deacetylases Specifically Down-regulate p53 - dependent Gene Activation. J. Biol. Chem. 275, 20436-2
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〔非特許文献 3 1〕 Dhordain P.， Albagli, 0.， Lin, R. J.， Ansieau, S.， Quie f, S. , Leutz, A.， Kerckaert, J. P.， Evans, R. M.， and Leprince, D. (1997) Corepressor SMRT binds the BTB/POZ repressing domain of the LAZ3/BCL6 on coprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10762 - 10767
〔非特許文献 3 2〕 Grignani, F. , De, M. S.， Nervi, C.， Tomassoni, L.， Gelm etti, V. , し ioce， M. , Fanelli, M.， Ruthardt, M. , Ferrara, F. F.， Zamir, I. Seiser, C.， Grignani, F.， Lazar, M. A.， Minucci, S.， and Pelicci, P. G. (1998) Fusion proteins of the retinoic acid receptor-alpha recruit histon e deacetylase in promyelocytic leukaemia. Nature 391， 815-818
〔非特許文献 3 3〕 He, L. Z. , Guidez, F. , Tribioli, C. , Peruzzi, D.， Rutha rdt, M. , Zelent, A. , and Pandolfi, P. P. (1998) Distinct interactions of PML-RARalpha and PLZF-RARalpha with co- repressors determine differentia丄 responses to RA in APL. Nature Genet. 18, 126-135
〔非特許文献 3 4〕 Lin, R. J.， Nagy, L. , Inoue, S. , Shao, W. , Mi ller, W. J. , and Evans, R. M. (1998) Role of the histone deacetylase complex in ac ute promye丄 ocytic leukaemia. Nature 391, 811—814
〔非特許文献 3 5〕 McKinsey, T. A. , Zhang, C. L. , Lu， J. , and Olson, E. N.
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〔非特許文献 3 6〕 Verdel, A. , and Khochbin, S. (1999) Identification of a new family of higher eukaryotic histone deacetylases. Coordinate express ion of differentiation-dependent chromatin modifiers. J. Bio丄. Chem. 274,
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〔非特許文献 3 7〕 Verdel, A.， Curtet, S.， Brocard, M. - P.， Rousseaux, S.， Lemercier, C.， Yosh i da, M. , and Khochbin, S. (2000) Active maintenance of raHDA2/mHDAC6 liistone - deacet- yl ase in the cytoplasm. Curr. Biol . 10, 747 - 7 49
〔非特許文献 3 8〕 Matsuyama, A. , Shimazu, T. , Sumida, Υ. , Saito, A.， Yosh imatsu, Y.， Se i gneur m-Berny, D.， Osada, H. , Komatsu, Y. , Nishino, N. , Kh ochbin, S.， Horinouchi, S. , and Yoshida, M. (2002) In vivo destabilizatio n of dynamic microtubules by HD ACS - media ted deacetylation. EMB0 J. 21, 68 20-6831
〔非特許文献 3 9〕 Hubbert, C. , Guardiola, A. , Shao, R.， Kawaguchi, Y.， It o， A. , Nixon, A. , Yoshida, M.， Wang, X.— F.， and Yao, T.—P. (2002) HDAC6 i s a microtubule— associated deacetylase. Nature 417, 455 - 458
〔非特許文献 4 0〕 Furumai, R.， Komatsu, Υ·， Nishino, N. , Khochbin, S.， Yo shida, M.， and Horinouchi, S. (2001) Potent histone deacetylase inhibitor s built from trichostatin A and cyclic tetrapeptide antibiotics including trapoxin. Pro Natl. Acad. Sci. USA 98 : 87-92
〔非特許文献 4 1〕 Finnin, M. S. , Donigian, J. R.， Cohen, A.， Richon, V. M. , Rifkind, R. A. , Marks, P. A.， Breslow, R.， and Pavletich, N. P. (199 9) Structures of a histone deacetylase homologue bound to the TSA and SAH A inhibitors. Nature 401： 188-193
〔非特許文献 4 2〕 Kim, Y. Β· , Lee, Κ. - Η. , Sugita, Κ· , Yoshida, Μ. , and Ho rinouchi, S. (1999) Oxamf latin is a novel antitumor compound that inhibit s mammalian histone deacetylase. Oncogene 18 : 2461—2470
〔非特許文献 4 3〕 Komatsu, Y.， Tomizaki, K. -y. , Tsukamoto, Μ. , Kato, Τ. , Nishino, Ν.， Sato, S.， Yamori, Τ. , Tsuruo, Τ. , Furumai, R.， Yoshida, Μ.， Horinouchi, S. , and Hayashi, H. (2001 Cycl ic Hydroxamic- ac id - containing Peptide 31, a potent synthetic histone deacetylase inhibitor with ant i turn or activity. Cancer Res. 61 : 4459 - 446b
〔非特許文献 4 4〕 Furumai , R. , Mat su ama, A. , obashi , N. , Lee, K. - H" Ni shiyama, M. , Nakajima, H. , Tanaka, A.， Komatsu, Y.， Nishino, N.， Yoshida,
M. , and Horinouchi, S. (2002) FK228 (depsipeptide) as a natural prodrug that inhibits class I histone deacetylases. Cancer Res. 62, 4916-4921 発明の開示
本願発明者らは、 環状テトラペプチド構造を有する新規な HDAC阻害剤およびそ の製造方法を提供することを目的とする。
上記課題に鑑み、 本願発明者らは、 ヒストン脱ァセチル化酵素の活性中心部に 位置する亜鉛に配位することのできる、 様々な官能基を有する環状テトラぺプチ ド構造を有する化合物を合成し、 その HDAC阻害活性を解析した。 その結果、 カル ボニル基を有する化合物および、 フルォロ基を有する化合物、 レトロヒドロキサ ム酸基を有する化合物は i/7 vitro, in J' どちらの系においても強い HDAC阻害活 性を示すことが確認された。 さらに、 細胞レベルでのこれらの化合物の活性を解 析したところ、 HDAC阻害剤として知られているトリコスタチン A (TSA) と同様の 強い活性が観察された。 また、 これらの化合物はヒストンの脱ァセチル化を阻害 するだけでなく、 チュープリンの脱ァセチルイ匕についても阻害することが観察さ れた。 すなわち、 これらの化合物は細胞内で強い活性を示すことから、 HDAC阻害 剤として有用であることが示された。
即ち、 本発明は、 HDAC阻害剤およびその製造方法に関し、 以下の 〔1〕 〜 〔1 1〕 を提供するものである。
〔1〕 以下の一般式 （1 ) で示される化合物。
Figure imgf000013_0001
式中、 Rn, R21, R31, R41はそれぞれ独立して水素またはメチル基を示す。 R22, R23， R32, R33， R42， R43はそれぞれ独立して水素、 炭素数 1〜6の直鎖アルキ ル基、 非芳香族環状アルキル基もしくは置換基を有することもある芳香環 が結合した炭素数 1〜6の直鎖アルキル基、 非芳香族環状アルキル基、 また は非芳香族環状アルキル基もしくは置換基を有することもある芳香環が結 合した非芳香族環状アルキル基のいずれかを示す。 また、 R21と R92， R2,と R23， R31と R32, R32と R33， R41と R42， R42と 3は、 それぞれ結合を持たず非環状構造 を示すか、 または鎖長炭素数 1〜5の直鎖アルキレン基、 炭素数 1〜6の分岐 鎖を有する鎖長炭素数 1〜5の直鎖アルキレン基、 もしくは、 炭素数 1〜6の 環構造を備えた鎖長炭素数 1〜5の直鎖アルキレン基を介して結合した環構 造を示す。 nは HDAC阻害活性を有する範囲で選択することができる。 Xは、 ヒストン脱ァセチル化酵素の活性中心部に位置する亜鉛に配位することの できる構造を持つ任意の構造体を示す。
X部位の構造が以下の構造式で示す置換基のいずれかである、 〔1〕 に記 載の化合物。
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0002
CF3
Pfek
Figure imgf000014_0003
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000015_0003
Figure imgf000015_0004
Figure imgf000015_0005
〔3〕 〔1〕 記載の化合物を有効成分として含有する、 ヒス トン脱ァセチル化 酵素阻害剤。
〔4〕 〔1〕 記載の化合物を有効成分として含有する、 チューブリン脱ァセチ ル化酵素阻害剤。
〔5〕 〔1〕 記載の化合物を有効成分として含有する、 アポトーシス誘導剤。
〔6〕 〔1〕 記載の化合物を有効成分として含有する、 分化誘導剤。
〔7〕 〔1〕 記載の化合物を有効成分として含有する、 血管新生阻害剤。
〔8〕 〔1〕 記載の化合物を有効成分として含有する、 がん転移抑制剤。
〔9〕 〔1〕 記載の化合物を有効成分として含有する、 ヒストン脱ァセチル化 酵素 1、 4または 6に起因した疾患の治療または予防のための薬剤。 0〕 ヒストン脱ァセチル化酵素 1、 4または 6に起因した疾患が、 がん、 自己免疫疾患、 神経変性疾患、 皮膚病、 または感染症である、 〔9〕 記 載の治療または予防のための薬剤。
1〕 一般式 ( 2 )
Figure imgf000016_0001
(式中、 Xは請求項 1、 2で定義したものと同様であり、
保護基を表す) で示される化合物を、 一般式 ( 3 )
Figure imgf000016_0002
(エ 中、 Ru，
Figure imgf000016_0003
は、 一 jl
( 1 ) で定義したものと同様であり、 P2 はカルボキシル基の保護基を表 す） で示される化合物とベプチド結合剤の存在下で反応させ、 一般式
( 4 )
Figure imgf000017_0001
COOP2
(4) 中、 Π, Rn, R21, R22， ¾3' L SV Λ32， ¾3' R«, ^42, ¾3' Pl， ?2» 及 <^X は、 前記で定義したものと同様である） で示される化合物を得、 次いで 前記一般式 （4) で示される化合物を、 触媒的水素化、 酸処理、 もしく は加水分解により、 Pi 及び P2 を除去した後に、 ペプチド結合剤の存在 下で環化反応させるか、 または一般式 （5)
R22 R23 R32 R33 R42 R43
乂 乂 ,乂 (5)
Pi— NR21 、C0NR31 へ CONR41 、COOH
(式中、 ぃ R,., R23, R3 R32， R ， R4 R4」， R ， 及ぴ？】 は 前記で定義 したと同様である) で示される化合物を、 一般式 (6)
Figure imgf000017_0002
(式中、 n， Rn, P2, 及び Xは、 前記で定義したものと同様である） で示さ れる化合物とぺプチド結合剤存在下で反応させ、 一般式 (7)
Pi -
Figure imgf000017_0003
(式中、 Π， Rn, R21， R22， R235 R3 Rs2» ¾3» ^41， ^43， Pi， 2， 及び X は、 前記で定義したと同様である） で示される化合物を得、 次いで一般式 ( 7 ) で示される化合物を、 触媒的水素化、 酸処理、 フルオリ ドア-オン 処理、 もしくは加水分解により P, 及ぴ P2 を除去した後に、 ペプチド結合 剤の存在下で環化反応するか、 または一般式 （1 ) の環状テトラペプチド の Xがカルボキシル基またはスルフィ ドリル基であるものを、 それぞれ無 水トリフルォロ酢酸や無水ペンタフルォロプロパン酸または 1, 1， 1-トリフ ルオロ- 3 -ブロモアセトンと反応させて別種の置換基 Xとなすことを含む、 〔1〕 記載の化合物の製造方法。
以下、 本発明の実施の形態について図面に基づき詳細に説明する。
本努明の化合物は、 上記の一般式 （1 ) で示すことができる。 このような化合 物は HDAC阻害剤として使用できる。
上記式 （1 ) 中、 R„， R21, R31， R41はそれぞれ独立して水素またはメチル基を示 す。 R22， R23， R32， R33， R42， R43はそれぞれ独立して水素、 炭素数 1〜6の直鎖アルキ ル基、 非芳香族環状アルキル基もしくは置換基を有することもある芳香環が結合 した炭素数 1〜6の直鎖アルキル基、 非芳香族環状アルキル基、 または非芳香族環 状アルキル基もしくは置換基を有することもある芳香環が結合した非芳香族環状 アルキル基のいずれかを示す。 また > R21と R— R22と „ R3iと R: 2と R:«, と ,, R42と R43は、 それぞれ結合を持たず非環状構造を示すか、 または鎖長炭素数 1〜5 の直鎖アルキレン基、 炭素数 1〜6の分岐鎖を有する鎖長炭素数 1〜5の直鎖アルキ レン基、 もしくは、 炭素数 1〜6の環構造を備えた鎖長炭素数 1〜5の直鎖アルキレ ン基を介して結合した環構造を形成してもよい。 この環状テトラペプチド構造部 分は HDACのボケットをふさぐキヤップとして機能し得ると考えられるため、 この キャップ構造として機能し得る範囲で、 上記炭素数 1〜6の直鎖アルキル基、 芳香 族環状アルキル基、 これらの置換基となり得る芳香族を任意に選択することがで さる。
また、 式 （1 ) 中 Xは、 ヒストン脱ァセチル化酵素の活性中心部に位置する亜鉛 に配位することのできる構造を持つ任意の構造体を示す。 Xに反応性の高い官能基 を置換した場合には、 生体内'で不安定となる。 そのため、 Xが反応性の高い官能基 である場合には、 ドラッグデリバリーシステムなどのように所望の部位まで安定 に輸送し得る手段と組み合わせることが好ましい。 また、 HDAC阻害活性を有する 官能基の安定性を高めるために、 生体内で代 され、 生体に有害でない置換基を 用いることが好ましい。 このような置換基としては、 側鎖にケトン型の Zn配位子 を有する置換基が好ましく、 置換基自身で何らかの効能を示すものであってもよ く、 また、 単に保護基としての機能を備えているものであってもよい。
置換基 Xの好ましい構造の例を次に示す。
0
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
CF3
F2C、 zO Pfek
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000020_0003
Figure imgf000020_0004
H
N
Figure imgf000020_0005
また、 本発明において式 （1 ) 中、 nは HMC阻害活性を有する範囲で選択するこ とができ、 例えば、 nは好ましくは 4〜6、 最も好ましくは 5である。 この環状テ トラペプチド構造から伸び、 炭素数 nからなる炭素鎖は、 HDACの活性ポケット部分 に侵入し、 この炭素鎖先端の様々な官能基を HDACのボケット内の亜鉛分子に接触 させ HDACを阻害する機能を有すると考えられる。
また、 以下に本発明の化合物の製造方法について説明する。 本実施形態の化合 物は、 一般式 （2 ) もしくは （6 ) で示された化合物を原料として以下の通り製 造することができる。 なお、 n， Rn, R2い R22， R23, R31， R32, R33， R41， R42, R43， Pい P2および X などの定義は上述の説明で述べた定義と同一であるので、 ここではそ の説明を省略する。
本発明における化合物の製造方法の第一の態様は、 以下の一般式 （2 ) で示さ れた化合物を原料として製造する方法である。 具体的には、 一般式 （2 )
Figure imgf000021_0001
で示される化 物 （Xにおける置換基の特定の部位が以後の化学反応によつて何ら かの修飾および置換を受ける場合は、 修飾および置換を受ける部位に保護基を結 合させてもよい） と、 一般式 （3 )
Figure imgf000021_0002
で示される化合物をペプチド結合剤の存在下で反応させ、 一般式 （4 )
P1-NR11
Figure imgf000021_0003
COOP2
( 4 ) で示される化合物を得る。 これら式中、 Xは図 2に記載の置換基、 P2 はァミノ基 の保護基を表す。
次いで前記一般式 （4) で示される化合物を、 触媒的水素化、 酸処理、 フルォ リ ドア二オン処理、 もしくは加水分解により、 Pi及び P2 を除去した後に、 ぺプ チド結合剤の存在下で環化反応させ、 一般式 （1) で示される化合物を得る。 始 めに一般式 （2) の Xの特定の部位において保護基を結合させた場合、 最後の過程 において、 触媒的水素化、 酸処理、 フルオリ ドア二オン処理、 もしくは加水分解 により保護基を取り除く工程を含んでもよい。
本発明の化合物の製造方法の第二の態様は、 以下の一般式 （6) で示された化 合物を原料として製造する方法である。 具体的には、 一般式 （5)
PI
Figure imgf000022_0001
で示される化合物を、 一般式 (6)
HR1¾N
Figure imgf000022_0002
で示される化合物 における置換基の特定の部位が以後の化学反応によって何ら かの修飾および置換を受ける場合は、 修飾および置換を受ける部位に保護基を結 合させてもよい) とぺプチド結合剤存在下で反応させ、 一般式 (7)
P1 - NR
Figure imgf000022_0003
0P2
(7) で示される化合物を得る。 次いで一般式 (7) で示される化合物を、 触媒的水素 ィ匕、 酸処理、 フルオリ ドア二オン処理、 もしくは加水分解により ! 及び P2 を除 去した後に、 ペプチド結合剤の存在下で環化反応させて、 一般式 （1 ) で示され る化合物を得る。 始めに一般式 （2 ) の Xの特定の部位において保護基を結合させ た場合、 最後の過程において、 触媒的水素化、 酸処理、 フルオリ ドア二オン処理、 もしくは加水分解により保護基を取り除く工程を含んでもよレ、。 また、 一般式 ( 1 ) の環状テトラペプチドの Xがカルボキシル基またはスルフィドリル基であ るものを、 それぞれ無水トリフルォロ酢酸や無水ペンタフルォロプロパン酸また は 1， 1， 1_トリフルォロ- 3 -ブロモアセトンと反応させて別種の置換基 Xとなす一 般式 （1 ) で示される化合物を得る。
HDACを阻害する化合物が、 がん細胞、 白血病細胞、 および神経細胞などの分化 を誘導すること、 アポトーシスを誘導すること、 また、 がんの転移を抑制するこ とが以前から知られている (Yoshida, M.， Nomura, S.， and Beppu, T. (1987) Ε ffects of trichostatins on diff erentiation of murine erythro ieukerai a cel l s. Cancer Res. 47 : 3688-3691 ; Hoshikawa, Y. , Kijima, M.， Yoshida, M. , and Beppu, T. (1991リ Expression of differentiation-related markers in terato carc inoma eel 1 s v ia hi stone hyperacetyl at ion by trichostat in A. Agric. Bi ol. Chem. 55 : 1491-1495 ; Minucci, S. , Horn, V. , Bhattacharyya, N. , Russan ova, V. , Ogryzko, V. V.， Gabriele, L.， Howard, B. H.， and Ozato, K. (199 7) A histone deacetylase inhibitor potentiates retinoid receptor action i n embryonal carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 11295 - 11300 ; Inokoshi, J. , Katagiri, M. , Arima, S.， Tanaka, H.， Hayashi, M.， Kim, Y. B.， Furumai, R.， Yoshida, M. , Horinouchi, S. , and Omura, S. (1999) . Neuro nal difierentiation of Neuro 2a cells by inhibitors of ceil progression, trichostatin A and butyrolactone 丄. Biochem. Biophys. Res. Commun. 256, 3 72-376； Wang, J. , Saunthararajah, Y.， Redner, R. L. , and Liu, J. M. (199 9) Inhibitors of histone deacetylase relieve ET0— mediated repression and induce differentiation of AML1-ET0 leukemia cells. Cancer Res. 59 : 2766-2 769； Munster, P. N.， Troso - Sandoval, T. , Rosen, N. , Rifkind, R. , Marks, P. A. , and Richon, V. M. (2001) The histone deacetylase inhibitor suberoyla nilide hydroxamic acid induces differentiation of human breast cancer eel Is. Cancer Res. 61： 8492-8497； Ferrara, F. F.， Fazi, F. , Bianchini, A.， P adula, F.， Gelmetti, V. , Minucci, S. , Mancini, M.， Pelicci, P. G. , Lo Coc o， F. , and Nervi, C. (2001 Histone deacetylase - targeted treatment restor es retinoic acid signaling and differentiation in acute myeloid leukemia. Cancer Res. 61 : 2-7 ; Gottlicher, M. , Minucci, S. , Zhu, P. , Kramer, 0. H. , Schimpf, A. , Giavara, S. , Sleeraan, J. P. , Lo Coco, F.， Nervi, C.， Pel icc i, P. G.， and Heinzel, T. (2001) Valproic acid defines a novel class of H DAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells. EMB0 J. 20 :
6969-6978) 。 よって、 本発明の化合物は、 アポトーシス誘導剤、 分化誘導剤、 およびがん転移抑制剤として利用できる。
また、 HDACを阻害する化合物は、 血管新生を阻害すると予想されている (Kim, M. S. , Kwon, H. J.， Lee, Y. M. , Baek, J. H. , Jang, J. E s Lee, S. W. , Moo n, E. J.， Kim, H. S.， Lee, S. K.， Chung, H. Y. , Kim, C. W.， and Kim, K. W.
(2001) Histone deacetylases induce angiogenesis by negative regulation o f tumor suppressor genes. Nature Med. 7, 437—443 ; Kwon, H. J. , Kim, M. S.， Kim, M. J. , Nakaj ima, H. , and Kim, K. W. (2002) Histone deacetylase inhi bitor FK228 inhioits tumor angiogenesis. Int. J. Cancer 97, 290-296) 。 よ つて、 本発明の化合物は、 血管新生阻害剤としても利用できる。
また、 本発明の化合物は、 種々の HDACのうち、 HDAC 1 , 4または 6に対して強 い阻害活性を示す。 そのため、 本発明の化合物は、 HDAC 1 , 4または 6に起因し た疾患の治療または予防のための薬剤として有用になる。 この疾患としては、 が ん以外にも、 HDAC 1 , 4または 6が関与した自己免疫疾患、 神経変性疾患、 皮膚 病、 感染症などを含めることができる。 また、 本発明の化合物は、 上記疾患の治 療または予防のための薬剤への応用だけでなく、 遺伝子治療におけるベクター導 入の効率化、 導入遺伝子の発現亢進などのような遺伝子治療の補助剤あるいは促 進剤として応用してもよい。
また、 本発明の化合物はレチノイン酸や DNAメチルイヒ阻害剤と併用することがで きる。 本発明は、 このような併用剤もまた提供するものである。
本発明の化合物を製剤化する場合には、 必要に応じて充填剤、 増量剤、 結合剤、 保湿剤、 崩壌剤、 界面活性剤、 滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いることが できる。 また、 この医薬製剤中に着色剤、 保存剤、 香料、 風味剤、 甘味剤等や他 の医薬品を医薬製剤中に含有させてもよい。 この医薬製剤としては各種の形態が 治療目的または予防目的に応じて選択でき、 例えば、 錠剤、 丸剤、 散剤、 液剤、 懸濁剤、 乳剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 注射剤、 坐剤等が挙げられる。
錠剤、 力プセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサ 力リンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状 担体を含有することができる。
また、 注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 プドウ糖やその他の補助 薬を含む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化 ナトリウムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタ ノール、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコ一 ル、 非イオン性界面活性剤、 例えばポリソルベート 80™、 HC0-50と併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばべンジルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよレ、。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、 経口、 非経口投与のいずれでも可能である。 非経口投与の剤 型としては、 例えば、 注射剤型、 経鼻投与剤型、 経肺投与剤型、 経皮投与型など が挙げられる。 注射剤型の例としては、 例えば、 静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔 内注射、 皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。 また、 鼻腔内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法に より投与しうる。
本発明の化合物を非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対 象臓器、 症状、 投与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人
(体重 60kgとして） においては、 通常、 1日当り約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 より好ましくは約 0 1から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好 都合であると考えられる。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量、 あ るいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
また、 本発明の化合物を経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法によっても異なるが、 例えば通常成人 （体重 60kgとし て） においては、 1日あたり約 100 μ gから 20mgであると考えられる。
なお、 本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、 参照として本明 細書に組み入れられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 一般式 ( 1 ) の化合物を示した図である。
図 2は、 一般式 （1 ) の化合物における置換基 Xの代表的な例を示した図である。 図 3は、 天然の Cyl- 1, Cyl- 2は立体コンフオメーシヨンを示す図である。
図 4は、 細胞内でのチューブリン及びヒストンァセチル化レベルを、 抗ァセチ ル化リジン抗体を用いたウェスタンにより測定した結果を示す写真である。 図中 R 4, R5, R6は各々 N (0H) C0H (n=4) , N (OH) COH (n=5) , N (0H) C0H (n=6)を示す。
図 5は、 O-phenylenediamine (0PD) 、 0_aminophenolのアミ ド (0AP0H) 、 0 - am inophenolのエステノレ （OAPNH) 、 O-arainothiophenol (OATP) の構造式を示した図 である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により、 さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施 例に制限されるものではない。
本発明の各化合物の合成工程について以下に詳細に説明する。 なお、 ここでは 2-ami ηο-6-bromonexano i c acidを 「A b 6」 と、 2 - amino- o-acetylthiohexanoic ac idを 「Am6 (Ac)」 、 2- amino- 6- (3 ，3' ，3， -trif luoracetonylthio) -hexanoic ac i dを 「Am6 (Tfacet) J 、 2, 8-di aminooctanoi c acid 「A2oc」 、 2-araino_7_dimeth ylphosphonylheptanoic acidを 「Aph」 、 <¾ - aminosuberic acidを 「Asu」 、 formy 1基 「For」 、 homolysineを 「Hly」 、 2 - amino_8— oxo- 9, 9， 9-trif luorononanoic ac idを 「TfmJ , 0 - methy] tyrosineは 「Tyr (Me)」 、 2-amino - 8 - oxo - 9， 9， 10， 10， 10 - pentaf luorodecanoic acidを 「Pfe」 、 ipecol ic acidを 「Pip」 と略す。 また、 0— pheny丄 enediamineを 「0PD」 、 0—aminophenolのノ ドを 「0AP0H」 、 0— aminophe nolのエステノレを 「0AP丽」 、 0- aminothiophenolを 「0ATP」 と略す。
実施例 1 . cyclo (-L-Asu (OMe) - D- Tyr (Me) - L - lie- D-Pro- )の合成
既存の方法で合成した cyclo (- L- Asu (OBzl) - D- Tyr (Me) - L- Ile-D-Pro- ) (0. 150 m raol, 100 mg) を MeOH (1 ml) に溶解した。 4 N HC1/ジォキサン （50 μ 1) を加 え、 室温で 8 時間放置した。 反応液を濃縮し、 シリカゲルク口マトグラフィ一で 精製し、 フォーム状の目的物を得た （column : Merck Kiesekgel 60 Φ 1. 5x15 cm, eluent : CHCl3/Me0H, 99/1)。 収量 65 mg (0. 113 ramol, 76%) 0
実施例 2 . cyclo (-L-Lys (For, 0H) _D- Tyr (Me) _L-Ile-L-Pip-) および cyclo (- L_ Lys (For, OH)- D- Tyr (Me)- L- lie- D- Pip- ) の合成
(1) Ac- DL- Ab6- OtBuの合成
Ac-DL-Ab6-0H (1.26 g， 50 mmol) を DCM (100 ml) に溶解し、 濃硫酸 (1 ml) を加えた。 氷冷下、 イソブチレンガス （50 ml) を吹き込み、 室温で 11日間放置 した。 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液 (80 ml) を加えた後、 放置してイソブチレ ンガスを揮発させた。 DCM溶液を 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム 水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 DCMを 留去した。 シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、 シロップ状の目的物を得た (column: Merck Kieselgel 60 Φ 5.0x10 cm, eluent: CHC13 /MeOH, 49/1)。 TLC: Rf， 0.8 (CHCl3/Me0H, 49/1)。 収量 9.25 g (30.1 mmol, 60%)。
(2) Ac- DL- Lys(OBzl)- OtBu の合成
Ac - DL - Ab6- OtBu (9.25 g, 30 mmol) をメタノール （120 ml) に溶解し、 0_ベン ジルヒ ドロキシルァミン塩酸塩 （9,58 g, 60 mmol) および DIEA (20.9 ml, 120 m mol) を加え、 80°C で 4日間還流を行った。 反応液を濃縮し、 酢酸ェチルで抽出 した。 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 蒸留水で 1 回ずつ洗浄した後、 炭酸ナト リゥムで乾燥し、 酢酸ェチルを留去した。 シリ力ゲルクロマトグラフィーによつ て精製し、 シロップ状の目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 5.0x22 c m， eluent: CHCl3/Me0H, 49/1) 。 TLC: Rf, 0.3 (CHCl3/MeOH, 49/1)。 収量 5.13 g (14.6 mmol, 49%) 0
(3) Ac- DL- Lys (For, OBzl)- OtBu の合成
氷冷下 Ac- DL- Lys(OBzl)- OtBu (4.01 g, 11.5 mmol) にギ酸 (58 ml) および無 水酢酸 （5.4 ml, 50 mmol) を加え、 1 時間攪拌した。 反応液を濃縮し、 酢酸ェチ ルで抽出した。 3 回水洗後、 硫酸マグネシウムで乾燥し、 酢酸ェチルを留去した シリカゲルク口マトグラフィ一で精製し、 シロップ状の目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 Φ 3.4x20 cm, eluent: CHCl3/Me0H, 99/1) 。 TLC: Rf, 0.45 (CHCl3/MeOH, 49 1)。 収量 3.27 g (8.53 mmol, 75%)。 ( 4 ) Ac-DL-Lys (For, OBzl) - OH の合成
Ac-DL-Lys (For, 0Bzl) -0tBu (3. 27 g, 8. 53 mmol) に TFA (9 ml) を加え、 室温 で 2 時間放置した。 反応液を濃縮し、 酢酸ェチルで抽出した。 3 回水洗し、 硫酸 マグネシゥムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。
( 5 ) Boc-L-Lys (For, OBzl) -OH の合成
Ac-DL-Lys (For, OBzl) -OH (8. 53 ramol) を蒸留水 （2 ml) に溶解し、 2 N水酸 化ナトリウム水溶液を用いて溶液の pHを 7 に調整した。 塩化コバルト 6水和物 (7 mg) および Aspergillus genus ァミノアシラーゼ (260 mg) を加え、 40。C で 一晩放置した。 反応液を 5 ml まで濃縮し、 ジォキサン （5 ml) を加えた。 氷冷下 Boc20 (1. 86 g, 8. 52 ramol) および Et3N (1, 79 ml, 12. 8 ramol) を加え、 6 時間 攪拌した。 ジォキサンを留去し、 残渣を酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水 溶液および水で各 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去し て油状の目的物を得た。 収量 2. 34 g (6, 15 ramol, 100%)。
( 6 ) Boc-L-Lys (For, OBzl) - OTmse の合成
Boc-L-Lys (For, OBzl) -OH (2. 34 g, 6. 15 mmol) および Tmse- OH (1. 76 ml, 12. 8 讓 ol)を DCM (3 ml) に溶解し,. 氷冷下 DMAP (15 mg, 0. 62 ramol) および DCC (1. 52 g, 7. 38 mmol) を加え、 10 時間燈拌した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェ チルで抽出した。 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食 塩水でそれぞれ 3 回ずつ洗浄し、 硫酸マグネシウム乾燥後、 酢酸ェチルを留去し た。 シリカゲルク口マトグラフィ一で精製し、 油状の目的物を得た (column: Mer ck Kieselgel 60 Φ 2. 4x20 cm, eluent : AcOEt/hexane, 1/4)。 TLC: Rf, 0. 5 (CH Cl3/MeOH， 99/1)。 収量 338 mg (0. 7 mmol, 11%) 0
( 7 ) Boc-L- lie- DL- Pip- OBzl の合成
Boc-L-Ile-0H · 1/2H20 (2. 88 g， 12 mmol) 、 HC1 · H-DL- Pip- OBzl (2. 55 g, 10 mmol) および HOBt · H20 (2. 30 g， 15 mmol) を DMF (10 ml) に溶解し、 氷冷下 E t3N (1. 4 ml, 10 腿 ol) および DCC (3. 10 g, 15 腿 ol) を加えた。 一晚攪拌し、 不溶物を濾過し反応液を濃縮した。 残渣を酢酸ェチルで抽出し、 10% クェン酸水 溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 および飽和食塩水でそれぞれ 3回洗浄し、 硫酸マグネシゥムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去してフォーム状の目的物を得た。 収量 3.79 g (9.1 mmol, 91%) 0
(8) Boc- D- Tyr(Me)- L- lie- DL- Pip- OBzl の合成
Boc- L- lie- DL- Pip- OBzl (2.64 g, 6.1 mmol) に水冷下 TFA (4 ml) を加え、 30 分間放置した。 TFA を留去した後、 Boc- D- Tyr(Me)_0H (2.16 g, 7.3 mmol) およ ぴ HOBt ·Η20 (1.40 g, 9.15腿 ol) を加え、 DMF (10 ml) に溶解した。 永冷下 H BTU (3.47 g， 9.15 mmol) および Et3N (3.51 ml, 25 mmol) を加え、 1 時間攪拌 した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネ シゥムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルクロマトグラフィーで精製 してフォーム状の目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 5.0x12 cm, elu ent: CHCl3/MeOH, 99/1)。 TLC: Rf, 0.75 (CHCl3/ e0H, 9/1)。 収量 2.45 g (4.02 mmol, 66%)。
(9) Boc- D- Tyr(Me)- L- lie- DL- Pip- OH の合成
Boc-D- Tyr(Me)- L- ILe - DL- Pip_0Bzl (2.45 g, 4.02 mmol) をメタノーノレ （10 m 1) に溶解し、 Pd-C (500 mg) を加え、 水素雰囲気下、 室温で 3 時間攪拌した。 反応確認後 Pd- C を濾過し、 メタノールを留去してフォーム状の目的物を得た。 収量 1.98 g (3.81 mmol, 95%) 0
(10) Boc- D- Tyr(Me)- L- lie- DL- Pip- L- Lys(For， OBzl)- OTmse の合成
氷冷下 Boc_L - Lys (For, OBzl) -OTmse (338 mg, 0.7 mmol) に TFA (1 ml) を加 え、 30分放置した。 TFA を留去した後、 Boc- D- Tyr(Me)- L- lie- DL_Pip- 0H (363 m g, 0.7 mmol) および HOBt · H20 (160 mg, 1, 05 mmol) を加え、 DMF (1 ml) に溶 解した。 氷冷下 HBTU (398 mg, 1.05 mmol) および Et3N (0.41 ml, 2.9 mmol) を加え、 1 時間攪拌した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗 浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルクロマト グラフィ一により精製し、 フォーム状の目的物を得た （column: Merck Kieselge 1 60 Φ 1.5x12 cm, eluent: CHCl3/MeOH, 99/1) 。 TLC: Rf, 0.3 (CHCl3/MeOH, 49 /1)0 収量 485 mg (0.55 mmol, 79%)。
(1 1) TFA · H- D- Tyr(Me)- L-Ile- DL_Pip- L- Lys(For, OBzl)- OH の合成
Boc_D_Tyr(Me)- L_Ile_DL- Pip- L_Lys(For, OBzl)- OTmse (485 mg, 0.55 mmol) を DMF (0.5 ml) に溶解し、 1 M TBAF/THF (2.2 ml, 2.2 ramol) を加え、 室温で 3 0 分放置した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水 溶液、 蒸留水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥して酢酸ェチルを 留去した。 これに、 氷冷下 TFA (2 ml) を加え、 30 分放置した。 TFA を留去した 後、 ジェチルエーテルおよび石油エーテルを加えて白色の粉末を得た。 収量 489 rag (0.5り mmol , 100%) 0
(1 2) cyclo(-L-Lys(For, OBzl)- D_Tyr (Me)_L- lie- L- Pip_) および cyclo(_L- Ly s (For, OBzl) - D- Tyr(Me) - L- Ile-D- Pip- ) の合成
TFA♦ H-D-Tyr (Me) - L- Ile-DL- Pi p- L- Lys (For, OBzl) -OH (489 mg, 0.55 mmol) を DMF (5 ml) に溶解した。 DMF (275 ml) 中に、 上記テトラペプチド/ DMF溶液 (1 ml)、 HATU (63 mg, 0.16 mmol) および 0.076 M DIEA/DMF溶液 (1 ml) をカロ え、 室温で 1 時間攪拌した。 これを 5 回繰り返した後、 反応液を濃縮して、 残 渣を酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶 液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄した。 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチ ノレを留去した。 シリ力ゲルク口マトグラフィ一で精製し、 ジァステレオマー (LDL L -体 および LDLD-体） の分離を行い、 それぞれフォーム状の目的物を得た （colu mn: Merck Kieselgel 60 Φ 1.5x35 cm, eluent: CHCl3/Me0H, 99/1)。 LDLL-体： 収量 88 mg (0.13 mmol, 24°/。）、 TLC: Rf, 0.8 (CHCl3/Me0H, 9/1)、 RP-HPLC rete ntion time: 22.44 min (column: WakoPak C18 Φ4.6x150 mm, eluent： CH3CN 1 0-100%/0.1% TFA linear gradient over 30 min, flow rate: 1 ml/min)。 LDLD- 体：収量 92 mg (0.14 mmol, 25%) 、 TLC: Rf， 0.9 (CHCl3/MeOH, 9/1)、 RP-HPLC retention time: 24.59 min (column: WakoPak C18 Φ4.6x150 ram, eluent-' CH3 CN 10-100%/0.1% TFA linear gradient over 30 min, flow rate: 1 ml /min) 0 (13) cyclo (- L_Lys (For, 0H)_D_Tyr (Me)- L - Ile_L- Pip -） の合成
cyclo (-L-Lys (For, OBzl) _D— Tyr (Me)— L - lie - L一 Pip -） (88 rag, 0.13励 1) をメ タノール （2 ml) に溶解し、 Pd - C (100 mg) を加え、 水素雰囲気下、 室温で 1 時 間攪拌した。 Pd - C を濾過し、 メタノールを留去した。 凍結乾燥を行い、 白色粉末 を得た。 収量 76 mg (0.13 mmol, 100%) 0 RP-HPLC retention time: 17.78 min (column: WakoPak C18 Φ4.6x150 mm, eluent: CH3CN 10-100%/0.1% TFA linear gradient over 30 min, flow rate: 1 ml/min)。 FABMS (matrix: 2, 2 -dithiod iethanol)： m/z, 574.3228 [M+H]+ (Calcd. , 573.3163, C29H4307N5)。
(14) cyclo (-L-Lys (For, OH) - D - Tyr (Me) - L - lie- D- Pip- ) の合成
cyclo (-L-Lys (For, OBzl) -D-Tyr (Me) -L-Ile-D-Pip-) (92 mg, 0.14励 1) をメ タノール (2 ml) に溶解した。 Pd-C (100 mg) を加え、 水素雰囲気下、 室温で 1 時間攪拌した。 HPLC にて反応確認後.， Pd-C を濾過し、 メタ .ノールを留去した。 凍結乾燥を行い、 白色粉末を得た。 収量 75 mg (0.13 mmol, 93%)。 RP- HPLC rete ntion time: 19.57 rain (column: WakoPak C18 Φ4.6x150 mm, eluent: CH3CN 1 0-100 /0.1% TFA linear gradient over 30 min, flow rate: 1 ml/min) 0 FABMS (matrix: 2， 2， -dithiodiethanol)： m/z, 574.3230 [M+H]+ (Calcd. , 573.3163, C29H4307N5)o
実施例 3. cyclo (-L-Hly (For, OH) -D-Tyr (Me) - L_Ile- L- Pip- ) および cyclo (- L - Hly (For, OH)- D- Tyr (Me)- L- lie- D-Pip- ) の合成
(1) Boc - L- Ab7 - OTmse の合成
Boc-L-Ab7-0H (2.7 g, 8.3 mmol) および Tmse - OH (2.37 ml, 16.6 mmol) を D CM (4 ml) に溶解し、 氷冷下 DMAP (101 mg, 0.83 mmol) および DCC (2.05 g, 9. 96 mraol) を加え、 6 時間攪拌した。 反応液を濃縮し、 酢酸ェチルで抽出を行った。
10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウム乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルクロマ トグラフィ一で精製し、 油状の目的物を得た （column : Merck Kieselgel 60 Φ 3· 4x20 cm, eluent： AcOEt/hexane, 1/8) 。 TLC : Rf, 0. 85 (CHCl3/MeOH, 49/1)。 収量 1. 92 mg (4. 54 mraol, 55%)。
( 2 ) ギ酸 0 -ベンジルヒ ドロキシアミ ドの合成
0-ベンジルヒドロキシルァミン塩酸塩 （3. 19 g， 20 mmol) をクロ口ホルムに溶 解し、 4% 炭酸水素ナトリゥム水溶液で洗浄し、 炭酸ナトリゥムで乾燥後、 ク口 口ホルムを留去した。 これをギ酸 （20 ml ) に溶解した。 一方氷冷下で無水酢酸 (7. 5 ml, 80 mmol) をギ酸 （40 ml) に加え 30分間放置した。 これに、 上記 0-ベ ンジルヒドロキシルァミンのギ酸溶液を加え、 24時間攪拌した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水 溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 炭酸ナトリゥムで乾燥後、 酢酸ェチル を留去した。 シリカゲルク口マトグラフィ一で精製し、 シロップ状の目的物を得 7こ tcol uran : Merck Kieselgel 60 5. 0x12 cm, eluent : AcOEt/hexane, 1/1) TLC : Rf, 0. 3 (CHCL/MeOH, 49/1)。 収量 1. 69 g (11. 2 mmol, 56%) 0
( 3 ) Boc- L-Hly (For, OBzl) - OTmse の合成
Boc-L- Ab7- OTmse (846 mg, 2. 0 mmol)、 ギ酸 0_ベンジルヒ ドロキシノレアミ ド (453 mg, 3. 0 mmol)、 ヨウ化カリゥム (166 mg, 1. 0 mmol) および炭酸力リゥム (1. 20 g, 8. 0 mmol) を無水アセトン （40 ml) に溶解し、 90°C で 4 日間還流を 行った。 反応液を濾過後、 濃縮した。 ジェチルエーテルで抽出し、 0. 5 N水酸化 ナトリゥム水溶液で 1 回、 蒸留水で 2 回洗浄した後、 無水炭酸ナトリゥムで乾 燥し、 ジェチルェ一テルを留去した。 シリカゲルク口マトグラフィ一で精製し、 油状の目的物を得た (column : Merck Kieselgel 60 Φ 2. 4x15 cm, eluent : AcOEt /hexane, 1/3) 。 TLC : Rf, 0. 5 (CHC1ノ MeOH, 49/1)。 収量 235 mg (0. 48 mmol, 24%) o
( 4 ) Boc- D- Tyr (Me) _L- lie- DL- Pip- L_Hly (For, OBzl) - OTmse の合成
氷冷下 Boc_L - Hly (For, OBzl) -OTmse (235 mg, 0. 48 mmol)に TFA (1 ml) を加え、 30 分放置した。 TFA を留去した後、 Boc - D- Tyr (Me) - L_Ile-DL- Pip_0H (233 mg, 0. 45 mmol) および HOBt · H20 (110 mg, 0. 72 mmol) を加え、 DMF (1 ml) に溶解し た。 氷冷下 HBTU (273 mg, 0. 72 mmol) および Et3N (0. 27 ml, 1. 9 mmol) を加え、 1 時間攪拌した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸 水溶液、 4% 炭酸水素ナトリゥム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫 酸マグネシゥム乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルク口マトグラフィー で精製し、 フォーム状の目的物を得た （column : Merck Kieselgel 60 Φ2. 4x20 c m, eluent : CHCl3/Me0H， 99/1) 。 TLC: Rf， 0. 65 (CHCl3/MeOH, 9/1)。 収量 289 m g (0. 32 mmol, 71%) 0
( 5 ) TFA · H- D-Tyr (Me) - L- lie- DL- Pip_L-Hly (For, OBzl) - OH の合成
Boc- D-Tyr (Me) - L- lie- DL- Pip - L- Hly (For， OBzl) -OTmse (289 mg, 0. 32 mmol) を DMF (1 ml) に溶解させ、 1 M TBAF / THF (0. 7 ml, 0. 7 mmol) を加え、 30 分 放置した。 反応液を濃縮後、 酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水溶液,. 蒸留 水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 これに、 氷冷下 TFA (3 ml) を加え、 30 分放置した。 TFA を留去した後、 ジェチ ルエーテルおよび石油エーテルを加えて白色の粉末を得た。 収量 261 mg (0. 32 m mol, 100%) 0
( 6 ) cyclo (- L- Hly (For, OBzl) - D- Tyr (Me) - L- lie - L- Pip- ) および cyclo (- L- Hly (For, OBzl) - D- Tyr (Me) - L - lie- D- Pip- ) の合成
TFA · H- D- Tyr (Me) - L_Ile_DL- Pip- L- Hly (For， OBzl) -OH (261 mg, 0. 32 mmol) を DMF (3 ml) に溶解した。 DMF (270 ml) 中に、 上記テトラペプチド/ DMF溶液 (1 ml)、 HATU (62 mg, 0. 16 mmol) および 0. 075 M DIEA/DMF溶液 （1 ml) を加 え、 室温で 45 分間攪拌した。 これを 3 回繰り返した後、 反応液を濃縮した。 酢 酸ェチルで抽出し、 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和 食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウム乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルク口マトグラフィ一で精製し、 ジァステレオマー (LDLL-体および LD LD -体) の分離を行った (column: Merck Kieselgel 60 Φ1.5x36 cm, eluent: C HCl3/MeOH, 99/1)。 LDLL-体：収量 61 mg (0.090 mmol, 28°/。）、 TLC: Rf, 0.55 (CHCl3/MeOH, 9/1)、 RP-HPLC retention time: 22.40 min (column: YMC - Pack C8 Φ4.6x150 mm, eluent: CH3CN 10- 100%/0.1% TFA linear gradient over 30 min, flow rate: 1 ml/min)0 LDLD-体：収量 60 mg (0.089 mmol, 28%)、 TLC: Rf, 0. 65 (CHCl3/Me0H, 9/1) 、 RP-HPLC retention time: 24.29 min (column: YMC-Pack C8 Φ4.6x150 mm, eluent: CH3CN 10-100%/0.1% TFA linear gradient over 30 min, flow rate: 1 ml/min)。
(7) cyclo(-L-Hly(For, OH) - D_Tyr (Me) - L- Ile_L- Pip_) の合成
cyclo(-L-Hly(For, OBzl) - D_Tyr (Me) - L- lie- L - Pip- ) (61 mg, 0.090 mmol) を 酢酸 （2 ml) に溶解した。 Pd-C (100 mg) を加え、 水素雰囲気下、 室温で 1 時間 攪拌した。 Pd-C を濾過し、 酢酸を留去した。 凍結乾燥を行い、 白色粉末を得た。 収量 48 mg (0.082 mmol, 91°/。）。 RP- HPLC retention time: 16。 02 min (column: WakoPak C18 Φ4.6x150 mm, eluent: CH3CN 10-100%/0.1% TFA linear gradient over 30 min, flow rate: 1 ml/min)。 FABMS (matrix: 2, 2' - dithiodoethano 1): m/z, 588.3379 [M+H]+ (Calcd.， 587.3319， C30H4507N5)。
(8) cyclo(_L - Hly(For， OH)- D- Tyr (Me)- L- Ile_D- Pip- ) の合成
cyclo(-L-Hly(For, OBzl) - D_Tyr (Me)- L - lie- D- Pip -） (60 mg, 0.089 腿 ol)をメ タノール （2 ml) に溶解し、 Pd- C (100 mg)を加え、 水素雰囲気下、 室温で 1時間 攪拌した。 Pd - Cを濾過し、 メタノールを留去した。 凍結乾燥を行い、 白色粉末を 得た。 収量 38 mg (0.065 mmol, 73%)。 RP- HPLC retention time: 18.68 min (co lumn: WakoPak C18 Φ4.6x150 mm, eluent: CH3CN 10 - 100°/。/0.1% TFA linear gra dient over 30 min, flow rate: 1 ml/min)。 FABMS (matrix: 2, 2' 一 dithiodiet hanol)： m/z, 588.3388 [M+H]+ (Calcd. , 587.3319， C3。H4507N5)。
実施例 4. cyclo(-L-Hly(For, OH)- D- Tyr (Me)- L_Ile- L- Pro- ) の合成
(1) Boc- L- Ab7-0Tmse の合成
Boc-L-Ab7-0H (1.46 g, 4.5 ramol) および Tmse-OH (0.77 ml, 5.4 醒 ol) を D CM (10 ml) に溶解し、 氷冷下で MAP (55 mg, 0.45 腿 ol) および DCC (1.1 g, 5. 4 ramol) を加え、 16 時間撹拌した。 溶媒を留去し、 酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水溶液、 4%炭酸水素ナトリゥム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗 浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルクロマト グラフィ一で精製し、 油状の目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 Φ3.4x 30 cm, eluent: CHC13)。 TLC: Rf， 0.95 (CHCl3/MeOH, 9/1)。 収量 1.25 g (3.0 m mol, 67%)。
(2) Boc-L-Hly (For, OBzl) - OTmse の合成
Boc-L-Ab7-0Tmse (2, 3 g5 5.5 ramol) , ギ酸 0 -ベンジルヒ ドルキシルアミ ド （1, 45 g, 9.6 mmol)、 ヨウ化カリゥム （465 mg, 2.8 讓 ol) および炭酸カリゥム （3. 04 g， 22 mmol) を無水ァセトン （50 ml) に溶解させ、 90°C で 36 時間還流を行 つた。 反応液を濾過後、 濃縮した。 ジェチルエーテルで抽出し、 0 5 N水酸化ナ トリウム水溶液で 1 回、 蒸留水で 2 回洗浄した後、 硫酸マグネシウムで乾燥し、 ジェチルエーテルを留去した。 シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、 油状の 目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 Φ3.4x30 cm, eluent: CHCl3/Me0H, 49/1) o TLC: Rf， 0.4 (CHCl3/Me0H, 49/1)。 収量 1.33 g (2.7 mmol, 49 %)。
(3) Boc-L-Ile-L-Pro-OBzl の合成
Boc- L- lie- OH · 1/2 H20 (1.19 g， 5.0 mmol) および HC1 · H- L- Pro-OBzl (1.02 g， 5.0 mmol) を DMF (10 ml) に溶解し、 氷冷下 HOBt · H20 (765 mg, 5.0 mmol)、 DCC (1.24 g， 6.0 ramol) および Et3N (0.7 ml, 5.0 mmol) を加え 16 時間撹拌し た。 溶媒を留去し、 残渣を酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水溶液、 4%炭酸 水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで 乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリ力ゲルク口マトグラフィ一で精製し、 油状 の目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 Φ 3.4x30 cm, eluent: CHC13/Me0 H, 49/1)。 TLC: Rf, 0.8 (CHCl3/MeOH, 19/1).。 収量 1.00 g (2.6 nimol, 52 )0 (4) Boc- D- Tyr(Me)_L_Ile- L-Pro- OBzl の合成
氷冷下 Boc- L- lie- L- Pro_0Bzl (1.00 g, 2.6 mmol) に TFA (4 ml) を加え、 30 分間放置した。 TFA を留去し、 減圧下で乾燥した。 これを DMF (6 ml) に溶解し、 Boc_D- Tyr(Me)- 0H (770 mg, 2.6 mmol) を加え、 続いて氷冷下 HOBt · 0 (597 mg, 3.9 mmol), HBTU (1.50 g, 3.9 mmol) および Et3N (0.88 ml, 6.3 mmol) をカロ え 16 時間撹拌した。 反応液を濃縮し、 酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水 溶液、 4%炭酸水素ナトリゥム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸 マグネシウムで乾燥し、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルクロマトグラフィー で精製し、 フォーム状の目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 Φ 3.4x30 c m, eluent: CHC1ノ Me0H， 99/1)。 TLC: Rf, 0.45 (CHCl3/Me0H, 19/1)。 収量 1.17 g (2.06 mmol, 79 %)0
(5) Boc— D— Tyr(Me)— L— lie— L- Pro- OH の合成
Boc— D— Tyr(Me) - L— lie - L一 Pro - OBzl (595 rag, 1.0 mmol) をメタノール （10 ml) に溶解し、 Pd- C (200 mg)を加え、 水素雰囲気下で 3 時間攪拌した。 Pd - C を濾過 し、 メタノールを留去し、 フォーム状の目的物を得た。 収量 380 mg (0.8腕 ol， 80%)
(6) Boc-D-Tyr (Me) -L-Ile-L-Pro-L-Hly (For, 0Bzl)_0Tmse の合成
氷冷下 Boc- L - Hly (For, 0Bzl)_0Tmse (394 mg, 0.8 mmol) に TFA (2 ml) を加 え、 30 分間放置した。 TFA を留去し、 減圧乾燥した。 これを DMF (2 ml) に溶解 し、 Boc- D- Tyr(Me)_L- lie- L- Pro - 0H (380 mg, 0.8 mmol) を加え、 氷冷下 HOBt · H20 (183 mg, 1.2腿 ol)、 HBTU (461 mg, 1.2腿 ol) および Et3N (0.23 ml, 1.6 mmol) を加え 16 時間撹拌した。 反応液を濃縮し、 酢酸ェチルで抽出し、 10% ク ェン酸水溶液、 4%炭酸水素ナトリゥム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄 し、 硫酸マグネシゥムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルクロマトグ ラフィ一で精製し、 フォーム状の目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 Φ 3.4x30 cm, eluent: CHCl3/MeOH, 99/1)。 TLC: Rf, 0.6 (CHCl3/MeOH, 19/1)。 収 量 470 mg (0.55 mmol, 69 %)。
(7) TFA . H- D - Tyr(Me)-L_Ile - L- Pro- L-Hly(For, 0Bzl)_0H の合成
Boc-D-Tyr (Me) -L-Ile-L-Pro-L-Hly (For, OBzl) OTmse (470 mg, 0.55 mmol) を DMF (2 ml) に溶解させ、 1 M TBAF/THF (1.9 ml, 1.9 mmol) を加え室温で 2 時 間放置した。 反応液を濃縮し、 酢酸ェチルで抽出し、 10% クェン酸水溶液、 蒸留 水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 これに氷冷下 TFA (2 ml) を加え、 30 分放置した。 TFA留去後、 ジェチルエーテ ルを加えて白色粉末を得た。 収量 437 mg (0.55 mmol, 100%)。
(8) cyclo(- L- Hly(For， OBzl)- D_Tyr (Me) - L- Ile_L_Pro- ) の合成
TFA · H - D-Tyr(Me) - L一 lie- L- Pro- L- Hly(For, OBzl) -OH (437 mg, 0.55 mmol) を DMF (5 ml) に溶解した。 DMF (160 ml) 中に上記テトラペプチド/ DMF溶液 （1 m 1)、 HATU (63 rag, 0.017 mmol) および 0.057 M DIEA/DMF溶液 (1 ml, 0.33 mmo 1) を加え、 室温で 30 分攪拌した。 これを 3 回繰り返した後、 反応液を濃縮し た。 酢酸ェチルで抽出し、 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留 去した。 シリ力ゲルク口マトグラフィ一で精製し、 白色粉末を得た (column: Mer ck Kieselgel 60 Φ 1.5x30 cm, eluent: CHC13)。 TLC: Rf, 0.55 (CHCl3/MeOH, 19 /1)。 収量 160 mg (0.24 mmol, 44%)。 RP - HPLC retention time: 7.2 min (colum n: Chromolith performance RP- 18e， eluent: CH3CN 10- lOOVO.1% TFA linear g radient over 15 min, flow rate: 2 ml/min)。 HR-FABMS (matrix: 2, 2' - dithi odiethanol)： m/z, 664.3735 [M+H]+ (Calcd. , 663.3632, C36H5。07N5)。
(9) cyclo(-L-Hly(For, OH)- D- Tyr (Me)_L_Ile- L - Pro- ) の合成
cyclo (- L - Hly(For， 0Bzl)_D- Tyr (Me)- L- Ile_L- Pro-) (160 mg, 0.24 mmol) を 酢酸 （3 ml) に溶解し、 Pd -硫酸バリゥム （100 mg) を加え、 水素雰囲気下、 室 で 5時間攪拌した。 Pd -硫酸バリウムを濾過し、 溶媒を留去し、 ジェチルエーテル で結晶ィ匕した。 収量 68 mg (0.12 讓 ol， 50%)。 RP-HPLC retention time: 6.2 mi n (column: Chromolith performance RP - 18e, eluent: CH3CN 10 - 100%/0· 1% TFA linear gradient over 15 min, flow rate: 2 ml/rain) 0 HR-FABMS (matrix: 2, 2， - dithiodiethanol) : m/z, 574.3259 [M+H] + (Calcd. , 573.3163, C29H4407N5)。 実施例 5. cyclo(-L-Hly(For, OH)- D- Tyr (Me)_L_Ile- D_Pro_) の合成
( 1 ) Boc-L-Ile-D-Pro-OBzl の合成
Boc - L - lie- OH · 1/2 H20 (1.39 g， 6.0 膽 ol) および HC1 · H_D - Pro - OBzl (956 mg, 4.0 mmol) を DMF (10 ml) に溶解し、 氷冷下 HOBt · ¾0 (613 mg, 4.0 匪 ol)、 DCC (1.24 g, 6.0 ramol) および Et3N (0.70 ml, 4.0 mmol) を加え 8 時間撹拌 した。 反応液を濃縮し、 酢酸ェチルで抽出し、 10% クェン酸水溶液、 4%炭酸水素 ナトリウム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥 後、 酢酸ェチルを留去した。 シリ力ゲルク口マトグラフィ一で精製し、 油状物を 得た （column: Merck Kieselgel 60 Φ3.4x30 cm, eluent: CHCl3/Me0H, 99 1)。
TLC: Rf, 0.92 (CHC1ノ MeOH, 9/1) 0 収量 1.63 g (3.38 mmol, 85%) 0
(2) Boc- D- Tyr(Me)_L- lie- D-Pro- OBzl の合成
氷冷下 Boc- L- 11 e-D-Pro-0Bzl (1.63 g， 3.38 mmol) に TFA (5 ml) を加え、 30 分間放置した。 TFA を留去し、 減圧乾燥した。 これを DMF (8 ml) に溶解し、 Bo c-D-Tyr(Me)-OH (1.50 g， 5.07 ramol) を加え、 氷冷下 HOBt · 0 (518 mg, 3.38 mmol), HBTU (1.92 g， 5.07 mmol) および Et3N (2.37 ml, 16.9 mmol) を加え 3 時間撹拌した。 反応液を濃縮し、 酢酸ェチルで抽出し、 10% クェン酸水溶液、 4%炭酸水素ナトリゥム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネ シゥムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルク口マトグラフィ一で精製 し、 フォーム状の目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 Φ3.4x30 cm, elu ent: CHCl3/MeOH， 99/1)。 TLC: Rf, 0.89 (CHCl3/Me0H, 9/1)。 収量 1.44 g (2.42 讓 ol, 72 %)。
(3) Boc- D- Tyr(Me)- L- lie- D- Pro- OH の合成
Boc - D - Tyr(Me)- L- Ile_D - Pro - OBzl (1.44 g, 2.42 ramol) をメタノール (12 ml) に溶解させ、 Pd-C (150 mg) を加え、 水素雰囲気下、 室温で 5 時間攪拌を行つ た。 Pd- C を濾過し、 メタノールを留去し、 フォーム状の目的物を得た。 収量 1.2 1 g (2.4 mraol, 99%)。
(4) Boc- D - Tyr(Me)-L_Ile D- Pro-L- Hly(For， OBzl)- OTmse の合成
永冷下 Boc - L- Hly(For， OBzl) -OTmse (593 mg, 1.2画 ol) に TFA (5 ml) を加 え、 30 分間放置した。 TFA を留去し、 減圧乾燥した。 これを DMF (3 ml) に溶解 し、 Boc- D - Tyr(Me)- L - Ile-D- Pro_0H (660 mg, 1.3 mmol) を加え、 氷冷下 HOBt · H20 (230 mg, 1.5 ramol)、 HBTU (760 mg, 2.0 mmol) および Et3N (0.56 ml, 4.0 mmol) を加え 16 時間撹拌した。 反応液を濃縮し、 酢酸ヱチルで抽出し、 10% ク ェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄 し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルクロマトグ ラフィ一で精製し、 フォーム状の目的物を得た (column: Merck Kieselgel 60 Φ 3.4x30 cm, eluent: CHC1ノ MeOH, 99/1) 0 TLC: Rf, 0.7 (CHCl3/MeOH3 9 /1:)。 収 量 830 mg (0.94 ramol, 83 %)。
(5) TFA · H- D- Tyr(Me)- L-Ile- D- Pro- L- Hly(For, OBzl) OH の合成
Boc-D-Tyr (Me) -L-Ile-D-Pro-L-Hly (For, OBzl) -OTmse (830 mg, 0.94 mmol) を DMF (2 ml) に溶解し、 1 M TBAF/THF (1.9 ml, 1.9 ramol) を加え、 室温で 2 時 間放置した。 反応液を濃縮し、 酢酸ェチルで抽出し、 10% クェン酸水溶液、 蒸留 水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 これに氷冷下 TFA (2 ml) を加え、 30 分放置した。 TFA 留去後、 ジェチルエーテ ルを加えて、 白色粉末を得た。 収量 437 mg (0.78 mmol, 93%)。
(6) cyclo (- L_Hly(For， OBzl)- D - Tyr (Me) L_Ile_D- Pro -） の合成
TFA · H- D- Tyr(Me)_L- lie- D- Pro- Hly(For， OBzl) -OH (437 mg, 0.78匪 ol) を D F (5 mL) に溶解した。 DMF (160 ml) 中に上記テトラペプチド/ DMF溶液 （1 ml)、 HATU (89 mg， 0.23 匪 ol) および 0.081 M DIEA/DMF溶液 （1 ml, 0.47 mmol) を 加え、 室温で 30分攪拌した。 同様の操作を 5 回繰り返した後、 反応液を濃縮し た。 酢酸ェチルで抽出し、 10% クェン酸水溶液、 4%炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄した。 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを 留去した。 シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、 白色粉末を得た （column: M erck Kieselgel 60 Φ 1.5x30 cm, eluent: CHC13 )。 TLC: Rf, 0.65 (CHC1 /MeOH, 9/1)。 収量 340 mg (0.51 mmol, 66%) 0 RP-HPLC retention time: 8.2 min (col umn: Chromolith performance RP- 18e, eluent: CH3CN 10- 100%/0.1% TFA linear gradient over 15min, flow rate-' 2 ml/min)。 HR - FABMS (matrix.- 2, 2' - dith iodiethanol)： m/z, 664.3700 [M+H]+ (Calcd.， 663.3632， C36H5。07N5)。
(7) cyclo(-L-Hly(For, OH)- D- Tyr (Me)_L_Ile- D-Pro- ) の合成
cyclo(-L-Hly(For, OBzl) -D- Tyr (Me)- L- lie- D- Pro-) (200 mg, 0.30 mmol) を メタノール （3 ml) に溶解し、 Pd -硫酸バリゥム （100 mg) を加え、 水素雰囲気下、 室温で 15 時間攪拌した。 Pd -硫酸バリゥム触媒を濾過した後、 溶媒を留去した。 凍結乾燥で白色粉末を得た。 収量 119 mg (0,21 mmol, 70%)。 RP-HPLC retenrion time: 7.0 mm (column: Chromolith performance RP_18e, eluent: C CN 10-1 00°/o/0.1% TFA linear gradient over 15min， flow rate: 2 ml/min)。 HR- FABMS (matrix: 2， 2， - dithiodiethanol)： m/z, 574.3229 [M+H]+ (Calcd.， 573.3163, C29H4407N5)。
実施例 6. cyclo (-L-A2oc (For, OH) _D - Tyr (Me) - L- lie- L- Pip- ) および cyclo (- L-A2oc (For, OH)- D_Tyr (Me) - L_Ile- D- Pip -） の合成
( 1 ) Boc-L-Ab8-0Tmse の合成
Boc-L-Ab8-0H (3.37 g, 10 匪 ol) および Trase- OH (2.86 ml, 20 mmol) を DCM (5 ml) に溶解させ、 氷冷下、 DMAP (122 rag, 1.0 mmol) および DCC (2.48 g， 12 mmol) を加え、 6 時間攪拌した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄後、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルクロ マトグラフィ一で精製し、 油状の目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 Φ 3.4X15 cm, eluent: AcOEt/hexane, 1/8) 。 TLC: Rf， 0.9 (CHC1ノ MeOH， 9/1)。 収量 4.20 mg (9.60 nimol, 96%)。
(2) Boc-L-A2oc (For, OBzl)- OTmse の合成
Boc - L- Ab8 - OTmse (2.39 g, 5.50 mmol)、 ギ酸 0-ベンジルヒ ドロキシルアミ ド (1.24 g, 8.2 ramol), ヨウ化カリウム （456 mg， 2.75 ramol) および炭酸カリウム (3.30 g, 22匪 ol) を無水アセトン （110 ml) に溶解し、 90°C で 6日 間還流し た。 反応液を濾過後、 濃縮した。 ジェチルエーテルで抽出し、 5 N水酸化ナトリ ゥム水溶液で 1 回、 蒸留水で 3 回洗浄した後、 炭酸ナトリゥムで乾燥後、 ジェ チルエーテルを留去した。 シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、 油状の目的 物 ¾"得 7こ (column: Merck Kieselgel 60 3.4x20 cm, eluent： AcOEt/hexane, 1 /4) 。 TLC: Rf, 0.5 (CHCl3/MeOH, 49/1)。 収量 814 nig (1.60 mmol, 29%) 0
(3) Boc- D- Tyr(Me) - L- lie- DL-Pip- L- A2oc(For, OBzl) -OTmse の合成
氷冷下 Boc-L- A2oc (For, OBzl) -OTmse (487 rag, 0.96 ramol) に TFA (2 ml) を 加え、 30 分放置した。 TFA を留去した後、 Boc-D-Tyr (Me) - L- lie- DL-Pip-OH (841 mg, 1.61 ramol) および HOBt · H20 (230 mg, 1.50 mmol) を加え、 DMF (2 ml) に溶解した。 水冷下 HBTU (569 mg, 1.50 mmol) および Et3N (0.60 ml, 4.30讓 ol) を加え、 1 時間攪拌した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェチルで抽出した。 1 0% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリゥム水溶液、 飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリカゲルクロ マトグラフィ一で精製し、 フォーム状の目的物を得た （column: Merck Kieselgel 60 Φ2.4x13 cm, eluent: CHCl3/MeOH, 99/1) 。 TLC: Rf, 0.65 (CHCl3/Me0H, 9/ 1)。 収量 213 mg (0.23 mmol, 24%)。
(4) TFA · H- D- Tyr(Me) - L - lie- DL- Pip - L- A2oc(For， OBzl)- OH の合成 Boc—D - Tyr(Me)— L— lie - DL - Pip— L - A2oc(For, OBzl) - OTmse (213 mg, 0.23 mmol) を DMF (0.5 ml) に溶解させ、 1 M TBAF/THF (0.5 ml, 0.5 mmol) を加え、 室温 で 30 分放置した。 反応液を濃縮後、 酢酸ェチルで抽出した。 10% クェン酸水溶 液および蒸留水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチル を留去した。 残った油状物に、 氷冷下 TFA (2 ml) を加え、 30 分放置した。 TFA を留去後、 ジェチルエーテルおよび石油エーテルを加え、 白色粉末を得た。 収量 186 mg (0.23 mmol, 100%) 0
(5) cyclo(- L- A2oc(For， 0Bzl)-D - Tyr (Me) - L- lie- DL_Pip-) の合成
TFA · H- D- Tyr(Me)- L - Ile_DL_Pip- L_A2oc(For， OBzl) -OH (261 mg, 0.32 mmol) を DMF (3 ml) に溶解した。 DMF (200 ml) 中に、 上記テトラペプチド/ DMF溶液 (1 ml), HATU (44 rag, 0.12 mmol) および 0.053 M DIEA/DMF溶液 （1 ml) を加え、 室温で 40 分間攪拌した。 これを 3 回繰り返した後、 反応液を濃縮した。 酢酸ェ チルで抽出し、 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩 水でそれぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 シリ力ゲルク口マトグラフィ一で精製し、 フォーム状の目的物を得た (column: M erek Kieselgel 60 1.5x35 cm, eluent: CHCL/MeOH, 99/1)。 収量 47 mg (0,0 68 mmol, 21%)。 LDLL -体： TLC: Rf, 0.6 (CHCl3/Me0H， 9/1)、 RP-HPLC retenti on time: 24.02 min (column: WakoPak C18 4.6x150 mm, eluent: CH3CN 10-10 0 /0.1% TFA linear gradient over 30 min, flow rate: 1 ml/minノ。 LDLD—体： TLC: Rf, 0.65 (CHCl3/Me0H, 9/1) 、 RP-HPLC retention time: 26.56 min (colu mn: WakoPak C18 Φ4.6x150腿， eluent: CH3CN 10-100%/0.1% TFA linear gradi ent over 30 min, flow rate' 1 ml/min)。
( 6 ) cyclo (-L-A2oc (For, OH) - D - Tyr (Me) - L_Ile-L- Pip- ) および cyclo (- L - A2oc (For, OH)- D- Tyr (Me)- L- lie- D - Pip- ) の合成
cyclo (-L-A2oc (For, OBzl)- D_Tyr (Me)- L- Ile_DL - Pip_) (47 mg, 0.068 mmol) を酢酸 a ml) に溶解した。 Pd- C (100 rag) を加え、 水素雰囲気下、 室温で 1 時 間攪拌した。 Pd_C を濾過し、 酢酸を留去した。 HPLC分取により、 ジァステレオ マー （LDLL-体および LDLD-体） の分離、 精製を行った。 凍結乾燥により、 それぞ れ白色の粉末を得た （column: YMC-Pack C8 Φ 10x250 mm, eluent : CH3CN 44-53% /0. 1% TFA linear gradient over 20 min, flow rate : 3 ml/min) 0 LDLL-体：収 量 10 mg (0. 017 醒 ol, 25%) 、 RP-HPLC retention time : 20. 14 min (column: Wa kp Pak C18 Φ4. 6x150 mm, eluent : CH3CN 10-100%/0. 1% TFA linear gradient o ver 30 min, flow rate : 1 ml/min)。 HR - FABMS (matrix : 2, 2' -dithiodiethano 1) : m/z, 602. 3521 [M+H]+ (Calcd. , 601. 3476, C31H4707N5) o LDLD-体：収量 6 mg (0. 010 ramol, 15%) 、 RP-HPLC retention time : 22. 43 min (column: WakoPak CI 8 Φ4. 6x150 mm, eluent : CH3CN 10-100%/0. 1% TFA linear gradient over 30 mi n, flow rate : 1 ml /min) 0 HR-FABMS (matrix : 2, 2' -dithiodiethanol)： m/z, 602, 3526 [M+H]+ (Calcd. , 601. 3476, C31H4707N5)。
実施例 7 , cyclo (- L- Am6 (Tfacet) - D- Tyr (Me) - L- lie- D- Pro- ) の合成
( 1 ) Boc- L_Ab6- OBzl の合成
Boc- L- Ab6- OH (622 rag, 2. 0 ramol) およびべンジルアルコール (0. 26 ml, 2. 4 raiiio 1 ) を DCM (8 ml) に溶解させ.， 氷冷下で DMAP (24 mg, 0. 2 mrnol) および DCC
(453 mg, 2. 2 mrnol) を加え一夜撹拌した。 DCM を留去し、 残渣に酢酸ェチルを 加え、 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液でそれぞれ 3 回洗 浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 真空乾燥後、 フラッ シュクロマトグラフィー (column : Merck Kieselgel 60 Φ2. 5x15 cm, eluent : C HCl3/Me0H, 99/1) で精製し、 フォームを得た。 収量 626 mg (1. 6 mmol, 78 %)。 TLC: Rf, 0. 94 (CHCl3/Me0H, 9/1)。
( 2 ) Boc- D_Tyr (Me) - L_Ile- D_Pro- L- Ab6_0Bzl の合成
Boc_L_Ab6- OBzl (626 mg, 1. 6 mmol) に氷冷下 TFA (2 ml) を加え、 30分間 0°C で放置し、 Boc 基を除去した。 TFA留去後、 減圧下乾燥し H-L- Ab6- OBzl · TF A の油状物を得た。 これに Boc - D- Tyr (Me) _L- lie- D- Pro - 0H (870 mg, 1. 7 醒 ol) を DMF (3 ml) に溶解し、 氷冷下で HATU (712 mg, 1.9 ramol)、 および Et3N (0. 7 ml, 4.8 mmol) を加え 3 時間攪袢した。 DMF を留去し、 残渣に酢酸ェチルを加 え、 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水素ナトリゥム水溶液でそれぞれ 3 回洗浄 し、 硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去した。 真空乾燥後、 フラッシ ュクロマトグラフィー (column: Merck Kieselgel 60 Φ2.5x20 cm, eluent: CH Cl3/MeOH, 99/1) で精製し、 フォームを得た。 収量 1.1 g (1.4 mmol, 89 )0 T LC: Rf, 0.92 (CHCl3/MeOH, 9/1)。
(3) Boc- D- Tyr(Me)- L- lie- D- Pro_L- Ab6_0H の合成
Boc— D-Tyr(Me)_L_Ile-D - Pro_L— Ab6— OBzl (1.1 g, 1.4 mmol) をメタノーノレに溶 解し、 5% Pd-C (80 mg) を加えて ガスと 6 時間反応させた。 メタノールを留 去し、 真空乾燥してフォームを得た。 収量 925 mg (1.3 mmol, 96 %)0 TLC: Rf, 0.52 (CHCl3/ e0H, 9/1)。
( 4 ) cyclo (- L- Ab6- D- Tyr (Me) - L- lie- D- Pro- ) の合成
Boc- D- Tyr(Me)- L- lie- D- Pro- L- Ab6- OH (925 mg, 1.3 mmol) に氷冷下 TFA (3 m L) を加え、 30 分間 0°C で放置し Boc 基を除去した。 TFA を留去し、 エーテル 一石油ェ一亍ルを加えて白色粉末を得た。 H- D- Tyr(Me)-L- lie- D- Pro-L- Ab6- 0H - T FA， HBTU(759 mg, 2.0 mmol), HOBt (306 mg, 2.0 mmol) および DIEA (1.46 m 1) を 5 分割して 30 分毎に DMF (240 ml) に加えて、 環化反応を行った。 2 時 間後溶媒を留去して残渣を酢酸ェチルに取り、 10% クェン酸水溶液、 4% 炭酸水 素ナトリウム水溶液、 および食塩水で 3 回洗い、 硫酸マグネシウムで乾燥した。 酢酸ェチルを留去し、 残った油状物をシリカゲルカラムで精製して、 フォームを 得た。 収量 267 mg (0.43 mmol, 32%) 0 TLC: Rf, 0.82 (CHCl3/Me0H, 9/1)。 RP-H PLC retention time, 9.04 min. HR-FABMS (matrix: 2， 2' - dithiodiethanol) : ra/z, 579.2197 [M+H]+, (Calcd.， 578.2132， C27H4。05N4S7¾r；)。
(5) cyclo(- L- Am6(Ac)- D- Tyr(Me)- L- Ile-D- Pro- ) の合成
cyclo(- L-Ab6 - D_Tyr(Me)_L- lie- D- Pro- ) (230 mg, 0.40 mmol) , およびチォ酢 酸カリウム （69 mg, 0.60 mmol) の DMF (1.0 ml) 溶液にを加えて 3 時間反応さ せた。 DMF を留去し、 残渣を酢酸ェチルに抽出し、 10% クェン酸水溶液および飽 和食塩水でそれぞれ 3 回洗い、 硫酸マグネシウムで乾燥した。 酢酸ェチルを留去 し、 フォームを得た。 収量 230 mg (〉100 %)。 TLC: Rf, 0.82 (CHCl3/MeOH, 9/1)。 (6) cyclo(- L- Am6(Tfacet) - D- Tyr(Me)- L- lie- D- Pro- ) の合成
cyclo(_L- Am6(Ac)_D- Tyr(Me)- L-Ile- D- Pro- ) (114 mg, 0.20 mmol) の DMF (1 m 1) 溶液にメタノール性アンモニア （1.0 ml) を作用させてァセチル基を除去した。 溶媒留去後 DMF (1.5 ml) に溶かし、 3- Bromo- 1.1.1 - ti f luoroacetone (0.062 ml, 0.60 mmol) および Et3N (0.085 ml, 0.60 mmol) を加え、 一夜反応させた。 DMF を留去し、 残渣を酢酸ェチルに抽出し、 10% クェン酸水溶液および食塩水でそれ ぞれ 3 回洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥した。 酢酸ェチルを留去して残った油 状物を HPLCで精製し、 白色粉末 15 mg (12%)を得た。 HR-FABMS (matrix: 2， 2' - d ithiodiethanol)： m/z, 643.2768 [M+H]+, (Calcd. , 642.2707, C30H4206M4F3S) 0 実施例 8. cyclo (-L-Tfm-D-Tyr (Me) - L- lie- D- Pro- ) の合成
(1) cyclo(_L- Asu(0- · Li+)- D-Tyr(Me)- L- lie- D- Pro- ) の合成
cyelo - L - Asu(OBzl) - D - Tyr(Me) - L - lie- D-Pro -） （410 rag, 0.63 mmol) を LiOH (53 mg, 1.2 mmol) と共に THF (2 mL) および水 (2 ml) に溶解し、 氷温で一夜撹 拌した。 溶媒を留去し、 エーテルを加えて固化した。 収量 355 mg (100%) HPLC: 9.7 min (Chromolith, 10-100% CH3CN gradient containing 0.1% TFA over 15 min)。
(2) cyclo (-L-Tfm-D-Tyr (Me) - L - Ile_D_Pro- ) の合成：
cyclo(- L_Asu(0- · Li+)_D- Tyr(Me)- L- Ile_D- Pro- ) (355 mg, 0.63 mmol) を C Cl2 (10 ml) に溶解し、 氷温で （CF3C0)20 (0.6 ml, 3.8 mmol) を加え、 次いでピ リジン （ 0.41 ml, 5 mmol) を加えて室温で 4 時間撹拌した。 反応液に水 （10 m 1) を加えて振った後、 目的化合物を CH2C12に抽出した。 有機層を硫酸マグネシ ゥムで乾燥後留去し、 残渣から目的化合物を HPLC で分離精製した。 収量 155 mg (40%)。 HPLC: 8.0 min (Chromolith, 10-100% CH3CN gradient containing 0.1% TFA over 15 min)。 HR— FABMS (matrix: 2, 2' -dithiodiethanol)： m/z, 611.30 41 [M+H]+ (Calcd. , 610.2966, C3。H4206N4F3)。
実施例 9. cyclo (-L-Pfe-D-Tyr (Me) _L- lie- D- Pro-) の合成
cyclo (- L_Asu(0_ · Li+)_D-Tyr (Me) _L-Ile_D_Pro_) (355 mg， 0.63 mmol) を CH2C 12 (10 ml) に溶解し、 氷温で (CF3CF2C0)20 (0.75 ml, 3.8 mmol) を加え、 次レ、 でピリジン （ 0.41 ml, 5 mmol) を加えて室温で 4 時間撹拌した。 反応液に水 (10 ml) を加えて振った後、 目的化合物を CH2C12に抽出した。 有機層を硫酸マグネ シゥムで乾燥後留去し、 残渣から目的化合物を HPLC で分離精製した。 収量 16 m g (5%) 0 HPLC: 8.8 min (hydrate) and 10.5 (keto) (Chromolith, 10 - 100% CH3C N gradient containing 0.1% TFA over 15 min)。 HR-FABMS (matrix: 2, 2' -dit hiodiethanol)： m/z, 661.3050 [M+H]+ (Calcd. , 660.2955, C31H42F506N4)。
実施例 1 0 eye 1 o (-L-Aph-D-Tyr (Me) -L-Tl e- D- Pro- ) の合成
(1) Boc-L-Aph-0Tmse の合成
Boc- L- Ab7- OTmse (425 mg, 1 mmol) のァセトニトリノレ (2 ml) 溶液に、 Nal (150 mg, 1 mmol) および P(0Me)3 (500 mg, 4 腿 ol) を加え 70°C で 20 時間攪 拌した。 ァセトニトリルを留去し、 残渣を酢酸ェチルに抽出して水洗し、 硫酸マ グネシゥムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去して Boc-L-Aph-0Trase (440 mg, 98%) を 得た。 FABMS (matrix: 2, 2， -dithiodiethanol)： m/z, 354 [M+H]+。
(2) Boc-L-Aph-0H の合成
Boc - L - Aph- OTmse (440 mg, 1 mmol) の DMF (1 ml) 溶液に、 1 M TBAF/THF (2 m 1)を加え、 2 時間室温で攪拌した。 DMF を留去した後残渣を酢酸ェチルに溶解し、 10% クェン酸水溶液おょぴ食塩水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥した。 酢酸 ェチルを留去して Boc - L- Aph_0H (250 mg, 0.71 腿 ol， 70%) を得た。
(3) Boc- L- Aph- D- Tyr(Me)_L- lie - D_Pro- OBzl の合成
Boc- D- Tyr(Me)- L- lie- D- Pro_0Bzl (416 mg, 0.7 mmol) を TFA (3 ml) で 30 分 処理し、 TFA を留去して TFA · H- D- Tyr (Me) - L- lie- D- Pro- OBzl を得た。 これに B oc-L-Aph-OH (250 mg， 0. 71 ramol) の DMF (3 ml) 溶液、 HBTU (400 rag, 1. 05 mm ol)、 HOBt 107 mg, 0. 7 mmol) および Et3N (0. 5 ml, 3. 5 mmol) を加えて 0°C で終夜攪拌した。 DMFを留去した後、 残渣を酢酸ェチルに抽出し、 10% クェン酸水 溶液、 4% NaHC03水溶液、 およぴ飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄した後、 硫酸マ グネシゥムで乾燥した。 酢酸ェチルを留去し、 カラムクロマトグラフィ一で精製 して、 Boc_L_Aph- D- Tyr (Me) - L- lie- D - Pro- OBzl (200 mg, 0. 24 mmol, 35%) を得 た。 MALDI-T0FMS : m/z, 854 [M+Na] + 0
( 4 ) cyclo (- L- Aph- D- Tyr (Me) - L-Ile- D - Pro- ) の合成
Boc—L_Aph—D - Tyr (Me) _L— lie— D_Pro - OBzl (200 mg, 0. 24 mmol) をメタノール中 5% Pd/C (50 mg) 存在下水素添加し、 Boc- L_Aph- D- Tyr (Me) - L_Ile- D - Pro - 0H (16 0 mg, 0. 22 mmol, 92%) を得た。 Boc 基を氷冷下 30 分の TFA (2 ml) 処理で除 去し、 ついで TFA を留去後 エーテルによって固化した。 得られたテトラべプチ ド TFA塩 (140 mg, 0. 20 mmol)の DMF (75 ml) 溶液に、 HATU (114 mg, 0. 3 mmo 1) および DIEA (0. 12 ml, 0, 7 mmol) を加え室温で攪拌した。 3 時間後、 減圧下 DMF を留去し、 残渣を酢酸ェチルに抽出し、 10% クェン酸水溶液 4% NaHC03水 溶液、 および飽和食塩水でそれぞれ 3 回洗浄した後硫酸マグネシウムで乾燥した。 酢酸ェチルを留去し、 残った油状物をカラムクロマトグラフィ一で精製し、 目的 物 （15 mg, 0. 024 mmol, 11%) を得た。 HPLC retention time, 7. 0 min (Chromol ith, 10-100% CH3CN gradient containing 0. 1% TFA over 15 min) 0 HR-FABMS (m atrix : 2, 2 ' -dithiodiethanol)： m/z, 623. 3177 [M+H]+ (Calcd, 623. 3210, C30 H4708N4P)。
実施例 1 1 . H D A C酵素阻害活 "生の測定
本実施例では様々な官能基を置換基 Xに有する環状テトラベプチド構造の化合物 である N (0H) C0H (n=4)， N (0H) C0H (n=5) , N (OH) C0H (n=6) , C00H, COOMe, COOBzl, T fk， Pfek, Mtfk, Stfk, SMe, S02Me, Aphの酵素阻害活性の測定を行った。 活性を測定した化合物の置換基の構造の一覧を図 2に示す。 天然の HMC阻害剤 である図 3に示すような Cyl_l, Cyl-2 (Furumai et al. (2001) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 98, 87-92.) を元に環状テトラペプチド構造のコンフォ メーシヨン及び活性基までの炭素鎖数を検討した。 天然の Cyl-1， Cyl- 2は立体コ ンフオメーシヨンが LDLL体であるが、 本実施例では LDLL体おょぴ LDLDのコンフォ メーションを持つものについても検討した。
HDAC阻害活性測定を行うにあたり、 次の通り HDAC溶液を調製した。 1 00 mm ディッシュに 1 X 1 07個の 29 3 T細胞をまき、 24時間後にヒ ト HDAC1、 4また はマウス HDAC6を発現するベクター （l ^ g) を LipofectAmine 2000 reagent (Li fe Technologies, Inc. Gaithersburg, MD) を用いてトランスフエクシヨンした。 なお、 上記ヒ ト HDAC1発現ベクターは p c DNA3— HD 1 (Yang, W. M. , Yao, Y. し， Sun, J. M.， Davie, J. R. & Seto, E. (1997) J. Biol. Chem. 272, 28001-28007. ) , ヒ ト HD A C 4発現ベクターは p c D N A 3. 1 (+ ) — HD 4 (Fischle, W.， Emiliani, S.， Hendzel, M. J. , Nagase, T.， Nomura, N. , Voelter, W. & Verdin, E. (1999) J. Biol. Chem. 274, 11713 - 1172 0. ) , マウス HD AC 6発現べクタ一は p c DNA— mHDA 2ノ HD AC 6 (V erdel, A. & Khochbin, S. (1999) J. Biol. Chem. 274, 2440-2445. ) を 用いた。
OPT I—MEM中で 5時間ベクターを取り込ませた後、 Dulbecco's modified Eagle' s medium (DMEM) に培地を交換して I9時間インキュベートした。 細胞 を PBSで洗った後、 lysis buffer (5 0 mM T r i s— HC 1 (pH7. 5) , 1 20 mM N a C 1 , 5 mM EDTA, 0. 5 % N o n i d e t P-40) に懸濁し、 ソニケーシヨンした。 上清を遠心分離により集め、 ProteinA/G plus a garose beads (Santa Cruz Biotechnologies, Inc. ) を用レヽて、 特異白勺タンノ ク を除いた。 その後、 HDAC 1、 HDAC 4を発現させた細胞上清には、 a n t i一 F LAG M2抗体 （Sigma- Aldrich Inc.) を加え、 HDAC 6を発現させた 細胞上清には a n t i _HA抗体 (clone 3F10, Roche Molecular Biochemical s) を加えて 4でで 1時間反応させた。
これにァガロースビーズを加えて 4°Cで 1時間反応させた後、 lysis bu erで ァガロースビーズを 3回洗い、 HD buffer (20 mM T r i s -HC 1 (pH 8. 0) , 1 50 mM N a C 1 , 1 0%グリセローノレ， a complete protease in hibitor cocktail (Boehringer Mannheim, Germany) ) で 1回洗った。 HD buff er (200 μ 1 ) 中 FLAGペプチド （40 ;U g) (Sigma— Aldrich Inc. ) また は HAペプチド （1 00 /z g) で 4°C、 1時間インキュベートしてァガロースビ ーズから結合したタンパクを回収し、 HDAC反応溶液とし、 以下の HDAC阻害活 性測定に用いた。
In ' ro系の HDAC阻害活性を以下のように評価した。 被験化合物を DM S 〇に溶解して、 濃度 1 OmMの原溶液を調製し、 これを阻害剤の原溶液とした。 アツセィは被験化合物存在下 H DAC溶液とクマリンで標識したァセチル化ヒス トンペプチド溶液を 3 7°Cで 30分間インキュベートすることで行った （反応容 積 20 μ 1 ) 反応液に 30 μ 1のトリプシンを添加して、 酵素反応で切り放さ れたァミ /メチルクマリンを蛍光プレ一トリ一ダ一で測定した。 なお陰性コン 卜 ロールとして、 阻害剤を反応系に添加せず、 同じ操作を行った。 阻害活性は、 陰 性コントロールにおける HDAC活性の 50%阻害濃度（ 「IC5Q ( M) 」 ）で表し た （表 1) 。
また、 in JVO系の HDAC阻害活性は p21プロモーター誘導活性を指標に次の通り 測定した。 実験に用いた MFLL - 9細胞はヒ ト野生型 p21プロモーターとルシフェラ一 ゼの融合遺伝子 （Dr. B. Vogelstaein) を安定に保持した細胞であり、 10%FBS を添加したフエノールレッド不含 DMEM培地を用い、 37。C、 5%二酸化炭素存在下、 水蒸気飽和したィンキュベータ一を用いて培養を行った。 この MFLL - 9細胞を 85000 個/ wellの細胞密度で 96穴マイクロプレートに播種し、 各 well当たり上記の培 地 99 1中で、 6時間培養した後、 被験化合物溶液 1 1を添加し、 引き続き 18時間 ±咅養した。 また、 ここでも TSAを HD A C阻害活性に起因する p 2 1プロモーター 誘導活性の陽性コント口ール化合物とした。
Luc Lite (Packard BioScsience Company) を用い、 細胞内に発現しているルシ フェラーゼの酵素反応の生成物に起因する発光強度を測定した。 被験化合物の活 性強度は TSAによる最大活性値の 50%の値を示す時の濃度（ 「EC5。 ( i M) 」 ）を用い て比較した （表 1) 。
αι
〇
Figure imgf000052_0001
表中 y (Me)は D - Tyr (Me) , Tyr (Me)は 0- methyltyrosine, I¾L-Ile, pipは D_pipec olic acid, Pipは L - pipecolic acidを示す (アミノ酸は一文字表記で示しており、 大文字は L体アミノ酸、 小文字は D体アミノ酸を示す） 。 また、 NTはテストしてい ないことを示す。
以上の結果より、 X部位の構造が違うと各酵素サブタイプに対する阻害活性が大 きく異なるという、 酵素サブタイプ選択的な阻害活性を持つことが示された。
本発明の化合物は HDAC1, 4および 6に対して強い阻害活性を示した。 環状テトラ ペプチド構造を有する化合物は HDAC6を阻害することができないとされてきたが、 本発明のようにテトラペプチド骨格の構造を変化させることで HDAC6に対しても阻 害能を持たせることが可能となった。 また、 X部位の構造が違うと各酵素サブタイ プに対する阻害活性が大きく異なり、 本発明の化合物が酵素サブタイプ選択的な 阻害活性を持つことが示された。
本発明の化合物の製造方法によりテトラぺプチド骨格の構造を容易に変えるこ とで、 化合物の標的酵素に対する選択性を容易に変化させることが出来ると期待 され.る。
実施例 1 2 . 細胞レベルでの HDAC阻害活性の測定
チューブリンおよびヒストンのァセチル化レベルの測定は、 HeLa細胞に対して 被験化合物を作用させ、 抗ァセチル化リジン抗体を使用してチューブリンおよび ヒストンのァセチル化レベルをウェスタンで確認することにより行った。 詳細に は、 ヒ ト子宮がん細胞 （HeLa) は 10%FBSを添加した DMEM培地を用い、 37°C、 5%二 酸化炭素存在下、 水蒸気飽和したインキュベーターを用いて培養を行った。 この 細胞を 15000個 Zmlの細胞密度で 6穴プレートに 2 ml播種し、 18時間培養した後、 被験化合物溶液を添加し、 引き続き 6時間培養した。 細胞を resで洗った後、 lysi s buffer ( 5 0 niM T r i s _ H C 1 ( p H 7 . 5 ) 、 1 2 0 mM N a C 1、 5 mM E D T A、 0 . 5 % N o n i d e t P— 4 0 ) に懸濁し、 ソニケーショ ンした。 上清を遠心分離により集め、 SDS bufferと混合し、 100°Cで 5分間処理し たサンプルを 15%SDSゲルで電気泳動後、 メンブレンフィルムにトランスファ一し た。 1次抗体として AKL5C1 (ジャパンエナジー）、 2次抗体： ant i-マウス（LIFE SC IENCE)で処理後 ECL (amersham pharmacia biotech)処理し、 ァセチル化バンドの検 出を行った （図 4 ) 。 なお、 図 4において記載している化合物の濃度の単位は M である。
図 4に示す通り、 p21プロモーター誘導活性測定の結果 (EC5。）と一致した阻害傾 向が示された。 また、 Tfkおよび N (0H) C0H (n=5)は細胞内でチューブリン脱ァセチ ル化酵素を阻害し、 チューブリンの高度なァセチル化を誘導した。 このような酵 素選択性は他の環状テトラぺプチド構造を有する HDAC阻害剤にはなかつた性質で める。
実施例 1 3 . 細胞毒性テスト
Tfk, Pfek, Ml:fkおよび Aphの細胞毒性テス トをヒ ト肺正常細胞 （TIG- 3) 、 ヒ ト 子宮がん細胞 （HeLa) を用いて行った。 これら TIG - 3細胞、 HeLa細胞を 10%FBSを添 加した DMEM培地を用い、 37°C、 5%二酸化炭素存在下、 水蒸気飽和したインキュべ 一ターを用いて培養を行った。 TIG- 3は 15000個ノ wel l HeLaは 5000個/ we 11の糸田 胞密度で 9 6穴マイクロプレートに播種し、 各 well当たり上記の培地 100 1中で 1 8時間培養した後、 培地に希釈した被験化合物溶液を添カ卩し、 引き続き 48時間培養 した。
各 wellに Cel l Prol iferation Kit II (XTT) (ロシュ ·ダイァグノスティック ス）の基質混合溶液を 50 μ 1ずつ入れ、 十分時間ィンキュベートして呈色反応をさ せた。 十分な呈色反応が進んだら、 0D495 nmの発色強度をマイクロプレートリー ダ一で測定した。 阻害活性は、 遊離 XTT率 50。/。となるときの濃度を IC5。として示し た。 なお、 がん細胞選択的細胞傷害活性の値 （正常細胞 TIG IC50 I がん細胞 HeLa IC50) が高いほど、 がん細胞選択的に細胞死を誘導していることを示す。 表 2
IC50 (nM) がん細胞選択的 抑制剤 HeLa TIG-3 細胞傷害活性
TSA 12.3 151 12.3
Tfk 8.8 87.1 9.9
Pfek 616 13443 21.8
Mtfk 52.5 468 8.9
Aph 〉50000 雇 00 - 上記表 2に示されている通り、 本発明における化合物は TSAとほぼ同程度のがん 細胞選択的に強い細胞傷害活性を有することが示された。
実施例 14. cyclo(L- Asu(OPD)- D- Tyr(Me)- L- lie- D- Pro) の合成
(1) cyclo (L-Asu-D-Tyr (Me) -L-Ile-D-Pro) の合成
既存の方法で合成した cyclo(L- Asu(0Bzl)-D-Tyr(Me)- L- lie- D- Pro) (360 rag, 0.56 mmol) をメタノール（20 ml) に溶解し、 Pd/C (100 mg) を加えて 5時間接触 水素還元した。 触媒を濾去し、 メタノールを留去して cyclo (L-Asu-D-Tyr (Me)-L- lie- D- Pro) を得た 。 収量 310 mg (0.56 mmol, 100%)。
(2) cyclo (L-Asu (0PD) -D-Tyr (Me) - L - lie- D-Pro) の合成
cyclo (L-Asu-D-Tyr (Me) _L_Ile- D- Pro) (150 mg, 0.27 mmol) を DMF (2 ml) に 溶解し、 H0Bt-H20 (41 mg, 0.27腿 ol)、 HBTU (154 mg, 0.4 mmol), o-phenylen ediamine (58 mg, 0.54 mmol) 、 およびトリエチノレアミン （0.12 ml, 0.8 mmol) を 0°Cで加え 3 時間撹拌した。 ゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、 cyclo (L-A su(OPD)- D - Tyr(Me)- L- lie- D- Pro) を得た （column: Sephadex LH-20 Φ2.0x100 c m, eluent: DMF)D 収量 140 mg (0.216 mmol, 80%) 0
実施例 1 5. cyclo (L-Asu (0AP0H) -D-Tyr (Me) -L-Ile-D-Pro) およぴ cyclo (L_Asu (0APNH) -D-Tyr (Me) - L_Ile- D- Pro) の合成
実施例 1と同様の方法で合成した cyclo(L-Asu-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro) (150 m g, 0.27 mmol) を DMF (2 ml) に溶解し、 H0Bt-¾0 (41 mg, 0.27 ramol)、 BOP試薬 (179 mg, 0.4 ramol)、 o-aminophenol (35 mg, 0.32 mmol) 、 およびトリェチノレ ァミン （0.12 ml, 0.8 mmol) を 0。C で加え 3 時間撹拌した。 ゲル濾過クロマトグ ラフィ一で精製し、 まず cyclo(L- Asu(OAPOH)- D- Tyr(Me)- L - Ile_D_Pro) を得た （c olumn: Sephadex LH - 20 Φ2.0x100 cm, eluent: DMF)。 収量 70 mg (0.108 mmol, 40%) さらに溶出を続け cyclo(L_Asu(0APNH) - D-Tyr(Me) - L_Ile - D - Pro) を得た
(column: Sephadex LH- 20 Φ2.0x100 cm, eluent: DMF)。 収量 50 mg (0.08 mmol, 30%) 。
実施例 1 6. cyclo (L-Asu (0ATP) -D-Tyr (Me) -L-Ile-D-Pro) dimer の合成
実施例 1と同様の方法で合成した cyclo(L-Asu-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro) (125 m g, 0.22 mmol) を DMF (2 ml)に溶解し、 HOBt. H20 (34 mg, 0.22 mmol), BOP試薬 (146 mg, 0.33 腿 ol)、 o - aminothiophenol (33 mg, 0.33 mmol)、 およびトリェ チルァミン （0, 12 ml, 0.8 mmol) を 0DC で加え,， 3 時間撹拌した。 ゲル濾過クロ マトグラフィ一で精製し、 cyclo(L—Asu(OATP)_D-Tyr(Me)-L—Ile-D-Pro) の SS - di mer を得た （column: Sephadex LH - 20 Φ2.0x100 cm, eluent: DMF)。 収量 120 m g (0 09 mmol, 80%) 。 この SS- dimer はジチオスレィ トールで 3養元すると、 容易 に HS-体を与えた。
実施例 1 7. HDAC酵素阻害活性の測定
0PD、 0AP0H、 0AP腿、 0ATPについて、 in 系の HD A C阻害活性を評価した。 実験方法は実施例 1 1に準じた。 活性を測定した化合物の構造の一覧を図 5に示 す。 阻害活性は、 陰性コントロールにおける HD A C活性の 50 %阻害濃度（ 「IC BO (μΜ) j )で表した (表 3) 。
また、 in 'ra系の HDAC阻害活性は p21プロモーター誘導活性を指標に測定した。 実験方法は実施例 1 1に準じた。 被験化合物の活性強度は TSAによる最大活性値の 50%の値を示す時の濃度（ 「EC5。 （μΜ) 」 ）を用いて比較した （表 3) 。 表 3
Ι€50 (μΜ) p21プロモーター
Ε€50 (μΜ)
X HDAC1 HDAC4 HDAC6
OPD 4.04 15.7 321 30.9
OAPOH 1.22 0.23 5042 55.1
OAPNH 0.40 0.24 441 12.9
OATP 2.03 0.23 408 >100
産業上の利用の可能性 '
本発明の化合物は、 様々なサブタイプの HMCに対して強い阻害活性を示す。 本 発明の化合物は、 HDAC 1 , 4および 6に関与している疾患の治療または予防のた めの薬剤として、 利用し得る。 また、 本発明の化合物の製造方法により、 種々の タイプの化合物を簡便に合成することができる。 そのため、 本発明の製造方法を 用いることにより、 テトラペプチド骨格の構造を様々な様態に変化させ、 化合物 の標的酵素に対する選択性を容易に変化させることが出来る。 すなわち、 本発明 の化合物の製造方法は、 新たな性質を持つた HDAC阻害剤などの開発に寄与するこ とが期待される。

Claims

請求の範囲 以下の一般式 （1 ) で示される化合物。
Figure imgf000058_0001
式中、 R„， R21， R31， R41はそれぞれ独立して水素またはメチル基を示す。 R22， R23， R32， R33， R42, R43はそれぞれ独立して水素、 炭素数 1〜6の直鎖アルキル基 非芳香族環状アルキル基もしくは置換基を有することもある芳香環が結合し た炭素数 1〜6の直鎖アルキル基、 非芳香族環状アルキル基、 または非芳香族 環状アルキル基もしくは置換基を有することもある芳香環が結合した非芳香 族環状アルキル基のいずれかを示す。 また、 R2Iと R22, R22と R23， R31と R32, R32と R33， R41と R42， R42と R43は、 それぞれ結合を持たず非環状構造を示すか、 または 鎖長炭素数 1〜5の直鎖アルキレン基、 炭素数 1〜6の分岐鎖を有する鎖長炭素 数 1〜5の直鎖アルキレン基、 もしくは、 炭素数 1〜6の環構造を備えた鎖長炭 素数 1〜5の直鎖アルキレン基を介して結合した環構造を示す。 nは HDAC阻害活 性を有する範囲で選択することができる。 Xは、 ヒストン脱ァセチルイヒ酵素の 活性中心部に位置する亜鉛に配位することのできる構造を持つ任意の構造体 を示す。
Xが以下の構造式で示す置換基のいずれかである、 請求項 1に記載の化合物。
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000059_0002
¾0
Figure imgf000059_0003
O
- g -
Figure imgf000059_0004
99εεπ請 OAV
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000060_0002
Figure imgf000060_0003
3. 請求項 1記載の化 物を有効成分として含有する.， ヒストン脱ァセチ/レ化酵 素阻害剤。
4. 請求項 1記載の化合物を有効成分として含有する、 チューブリン脱ァセチル 化酵素阻害剤。
5. 請求項 1記載の化合物を有効成分として含有する、 アポトーシス誘導剤。
6. 請求項 1記載の化合物を有効成分として含有する、 分化誘導剤。
7. 請求項 1記載の化合物を有効成分として含有する、 血管新生阻害剤。
8. 請求項 1記載の化合物を有効成分として含有する、 がん転移抑制剤。
9. 請求項 1記載の化合物を有効成分として含有する、 ヒストン脱ァセチル化酵 素に起因した疾患の治療または予防のための薬剤。
10. ヒストン脱ァセチル化酵素に起因した疾患が、 がん、 自己免疫疾患、 神経 変性疾患、 皮膚病、 または感染症である、 請求項 9記載の治療または予防 のための薬剤。
一般式 （2)
Pi -
Figure imgf000061_0001
(式中、 ！！， ， は請求項 2で定義したものと同様であり、 はアミ ノ基の保護基を表す） で示される化合物を、 一般式 （3)
Figure imgf000061_0002
(式中、 R„， R21, R22, R23, R31, R32， R33， R41, R42， 及び R43は、 請求項 1の 一般式 （ 1 ) で定義したものと同様であり、 ^ は力ルポキシル基の保護基 を表す) で示される化合物とぺプチド結合剤の存在下で反応させ、 一般式 (4)
R22 23 R32 R33 R 2 43 n
Pi~NRir CONR21 CONRs CONR41 COOP2
(4)
、式中、 n, Rn, ι\21, Λ22， R23， R3i, R32， R33, 41， 42， R43， Ρい r2, 及び X は、 前記で定義したものと同様である) で示される化合物を得、 次いで前 記一般式 （4) で示される化合物を、 触媒的水素化、 酸処理、 もしくはカロ 水分解により、 Pi 及び P2 を除去した後に、 ペプチド結合剤の存在下で環 化反応させるか、 または一般式 （5) R22 R23 R32 R33 R42 R43
乂 乂 乂 ( 5 )
— NR21 、C0NR31 、CONR 、COOH
(式中、 R21, R22, R23 R31, R32, R33, R41 R42 R43， 及び は、 前記で定義 したと同様である） で示される化合物を、 一般式 （6 )
HR11N
Figure imgf000062_0001
(式中、 n Rn, P2， 及び Xは、 前記で定義したものと同様である） で示さ れる化合物とペプチド結合剤存在下で反応させ、 一般式 （7 )
Figure imgf000062_0002
( 7 )
(ェ中、 n, Ru, R21, R22, R23 rv31, R32 R33, i\41, R42, R43, Pい P2， 及び X は 前記で定義したと同様である） で示される化合物を得.,， 次いで一般式
( 7 ) で示される化合物を、 触媒的水素化、 酸処理、 フルオリ ドア二オン 処理、 もしくは加水分解により Pi及び P2 を除去した後に、 ぺプチド結合 剤の存在下で環化反応するか、 または一般式 （1 ) の環状テトラペプチド の Xが力ルボキシル基またはスルフィドリル基であるものを、 それぞれ無 水トリフルォロ酢酸や無水ペンタフルォロプロパン酸または 1, 1 1-トリフ ルォロ -3-ブロモアセトンと反応させて別種の置換基 Xとなすことを含む、 請求項 1記載の化合物の製造方法。
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