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WO2005073365A1 - 移植用細胞の処理方法、細胞懸濁液、移植用補綴物、および損傷部位の治療方法 - Google Patents

移植用細胞の処理方法、細胞懸濁液、移植用補綴物、および損傷部位の治療方法 Download PDF

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Publication number
WO2005073365A1
WO2005073365A1 PCT/JP2005/000919 JP2005000919W WO2005073365A1 WO 2005073365 A1 WO2005073365 A1 WO 2005073365A1 JP 2005000919 W JP2005000919 W JP 2005000919W WO 2005073365 A1 WO2005073365 A1 WO 2005073365A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
transplantation
cells
treating
prosthesis
tgf
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/000919
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazunori Yasuda
Harukazu Tohyama
Tomoo Okuizumi
Original Assignee
Japan Tissue Engineering Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Tissue Engineering Co., Ltd. filed Critical Japan Tissue Engineering Co., Ltd.
Priority to JP2005517442A priority Critical patent/JPWO2005073365A1/ja
Publication of WO2005073365A1 publication Critical patent/WO2005073365A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/066—Tenocytes; Tendons, Ligaments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating cells for transplantation, a cell suspension, a prosthesis for transplantation, and a method for treating a damaged site.
  • ACL anterior cruciate ligament
  • ACL As one of the treatment methods for ACL, a treatment method by transplantation is known, and transplantation with an artificial ligament has been attempted. ACL reconstruction with tendon transplantation is most commonly known.
  • an ACL autologous tendon transplantation model as an experimental model has been established and research is being conducted to establish a method for healing earlier. As described in Non-Patent Document 1, this ACL autologous tendon transplantation model can be produced by performing freeze-thaw processing on ACL to necrotize endogenous fibroblasts.
  • Non-Patent Document 2 discloses that by administering a low concentration of TGF-1 to an ACL autologous tendon transplantation model, the mechanical properties seen in ACL autologous tendon transplantation are sufficiently suppressed, and the autologous tendon transplantation is suppressed.
  • ACL reconstruction model has been established to enable early repair
  • Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 3 describe therapeutic methods by gene transfer. Gene therapy in which TGF-j31 is produced in vivo using a denovirus or the like has been disclosed. In this method, a vector containing a gene is produced to produce TGF-jS1 at a high concentration, and the recombinant vector is transfected into fibroblasts. Has been injected.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Publication No. 2002-542801
  • Non-patent document 1 Journal of Biomechanical Engineering, 2000, Vol. 122, p. 594-599
  • Non-patent document 2 Journal of Orthopaedic Research, 2002, Vol. 20, p. 1345- 1351
  • Non-patent document 3 Arthritis Research & Therapy , 2003, Vol. 5, pl32- 139
  • TGF- / 31 administration of TGF- / 31 to a living body at a high concentration does not improve the mechanical properties of ACL, and cannot deny the possibility that undesirable side effects of TGF_j31 may occur.
  • gene therapy in addition to the above-mentioned problems relating to dispersion, there are problems such as side effects due to the use of a virus-derived vector.
  • the present invention provides a method for treating cells for transplantation, a cell suspension, a prosthesis for transplantation, and a method for treating a damaged site for early and good repair (reconstruction) of transplanted tissue or damaged living tissue.
  • the purpose is to provide.
  • the method for treating cells for transplantation of the present invention is characterized by comprising a culturing step of culturing connective tissue cells in a medium containing at least one factor of the TGF- / 3 superfamily.
  • the cell suspension of the present invention is characterized by containing the cells for transplantation treated by the method for treating cells for transplantation.
  • the transplant prosthesis of the present invention is characterized by being produced by the method for treating cells for transplant of the present invention.
  • the method for treating a damaged site comprises a culturing step for culturing connective tissue cells in a medium containing at least one factor of the transforming growth factor (TGF) _ / 3 super family, and an activation method obtained by the culturing step. And a transplantation step of transplanting the cultured cells into a patient.
  • TGF transforming growth factor
  • the present invention since connective tissue cells cultured in a medium containing at least one factor of the TGF_i3 superfamily are used, transplantation for promptly and satisfactorily repairing a transplanted tissue or a damaged biological tissue is performed.
  • the present invention can provide a method for treating cells for use, a cell suspension, a prosthesis for transplantation, and a method for treating a damaged site.
  • FIG. 1 is an image of a right knee ACL stained with hematoxylin-eosin (HE) 12 weeks after freezing and thawing according to an example of the present invention.
  • HE hematoxylin-eosin
  • FIG. 2 is a graph comparing the mechanical properties (a. Tensile strength, b. Tangential elasticity) of the right knee ACL 12 weeks after freezing and thawing with the examples of the present invention.
  • FIG. 3 is a transmission electron microscopy (TEM) photograph of a right knee ACL 12 weeks after a freeze-thaw treatment using an example of the present invention.
  • TEM transmission electron microscopy
  • the method of treating cells for transplantation of the present invention comprises a culturing step of culturing connective tissue cells in a medium containing at least one factor of the TGF- / 3 superfamily. Since the connective tissue cells are pre-activated by culturing them in a medium containing the TGF-j3 superfamily, transplantation of the treated cells involves direct administration of the activated cells to the site of transplantation or injury. This results in the infiltration of activated connective tissue cells, which are different from those infiltrated during the tissue repair process during the natural healing process The living tissue can be repaired early and effectively without causing significant tissue deterioration, and the treatment can be completed in a short time.
  • transplantation can be performed in a short period of 12 weeks (about 3 months). Repair of tissue or damaged tissue can be achieved.
  • the cells for transplantation mentioned here may be administered in the form of cells such as a cell suspension, but are preferably transplanted in the form of tissue such as a cultured fibroblast sheet. When cells for transplantation in the form of tissue are transplanted, local healing can be expected to be performed more effectively. Also, for skin defects such as wrinkles, by injecting in the form of a cell suspension, it is possible to repair the defective part (injured part) at an early stage.
  • the TGF-j3 superfamily used here includes TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, TGF- ⁇ 4, TGF- ⁇ 5, BMP (osteogenic protein) _2, BMP_3, BMP_4, BMP_5, BMP_6, BMP-7 and the like.
  • TGF- can be used as isolated and purified from living organisms, and purified and commercially available TGF- can also be used.
  • TGF-iS purified from platelet homogenate can be used as cell-derived TGF-iS.
  • TGF-J3 may be used alone or in combination as long as it is a factor belonging to this superfamily.
  • TGF-iS1 is particularly preferable in terms of the mechanism of action.
  • TGF-jS1 can be used at a concentration of 0.1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably 4 ng / ml to 10 ng / ml.
  • the connective tissue cells in the present invention may be connective tissue cells constituting a living tissue, and from the viewpoint of ease of collection, cells obtained from tissues such as skin, synovium, muscle, bone marrow, and the like.
  • the cells are cells differentiated from the cells.
  • the connective tissue cells may be any cells capable of avoiding rejection during the period from the use as cells for transplantation or tissue to the time of repair, and are most preferably autologous.
  • connective tissue cells skin-derived fibroblasts, synovium-derived fibroblasts, and muscle and fibroblasts, which are preferred by fibroblasts and stem cell-like cells in terms of cell group proliferation ability and repair ability, are preferred.
  • Fibroblasts differentiated from mesenchymal stem cells such as bone marrow are included.
  • ACL tissue collection and cell proliferation, for example, ACL
  • a skin-derived fibroblast is preferable.
  • Such connective tissue cells are used after tissue collection in order to proliferate to a sufficient number of cells in advance and to differentiate or select suitable cells of interest from other cells.
  • preliminary culture may be performed prior to the culture step. Examples of such preculture include those usually performed as an explant culture method, a cell culture method, and the like. For example, in synovium-derived fibroblasts, after synovial tissue explants are collected using an arthroscopy, they are cultured for several days to several weeks using a tissue explant culture method. Can be obtained. Subculture may be performed as necessary.
  • a medium used in the culturing step a liquid medium usually used for culturing can be used.
  • a medium usually used for culturing
  • examples of such a medium include Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • An appropriate medium can be selected depending on the type of connective tissue cells to be cultured. Substances and the like may be added in appropriate amounts.
  • a sheet-shaped transplantation tissue composed of fibroblasts including the extracellular matrix produced by fibroblasts
  • this cultured fibroblast sheet has sufficient strength, it has good operability, and local healing can be expected even after transplantation.
  • Te applying a cell culture method seeding density of connective tissue cells at the start of cultivation, is appropriately selected depending on the cell type and growth rate, in general, IX 10 3 cells / cm 2 - 1 X 10 7 cells / cm 2, preferably, 1 X 10 4 cells / cm 2 - a 1 X 10 6 cells / cm 2.
  • the culture step is continued until the number and state (morphology) of cells that can be used as transplantation cells or tissues are obtained and connective tissue cells are appropriately activated by TGF- ⁇ .
  • the period of the culturing step varies depending on the cell type, the seeding density and the like, but is generally 17 days per day, preferably 2 days to 5 days, more preferably 2 days.
  • the connective tissue cells are more preferably carried on a scaffold material, and more preferably carried. Easy to handle cells for transplantation by supporting on scaffold material At the same time, the activated cells can be placed at a local transplant site, and the transplant cells can be efficiently healed without being dispersed.
  • the scaffold material examples include fibrin, collagen, and hyaluronic acid from the viewpoint of biological action, and fibrin and collagen are particularly preferable from the viewpoint of embedding and supporting cells.
  • fibrin a commercially available fibrin 'sealant (fibrin glue) formed by mixing fibrinogen and thrombin can be used.
  • a scaffold material derived from a living body is preferable.
  • One of such scaffolds derived from living organisms is the aforementioned extracellular matrix typified by collagen, which regulates the growth, migration, differentiation, etc. of force cells, and as various other extracellular matrix components. As long as the function is maintained, it is not limited to a natural product, and may be an artificial extracellular matrix component. These can be used alone or in combination.
  • a bioabsorbable material or a biocompatible material artificial or natural material may be used as another scaffolding material.
  • a bioabsorbable or biocompatible material include polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polyglycolic acid lactic acid copolymer (PGLA), polytaxane, gelatin, chitin, chitosan , Canolaresium anoregate, polyrotaxane hydrogel, and the like.
  • Still other scaffold materials include bio-inert materials.
  • a biologically inert material is a material in which a thin film (foreign material film) is interposed between living tissue and a living tissue when implanted in a living body. Examples thereof include alumina ceramics, carbon ceramics, and zirconia. Ceramics, titanium, titanium alloys, cobalt-chromium alloys, cobalt-chromium-molybdenum alloys, stainless steels, and the like.
  • These scaffold materials are preferably in the form of a mesh, gel, or sponge.
  • any form may be used as long as the shape is suitable for transplanting cells for transplantation.
  • it is shaped. Therefore, by using a three-dimensional shape that matches the shape of the tissue defect, the defect can be physically compensated, while by adopting a sheet shape, the transplanted or damaged tissue can be operable over a wide range with good operability. Capable of covering and fixing.
  • Connective tissue cells may be seeded on the surface of the scaffold material or embedded in the scaffold material. Good. In particular, it is preferable that the cells are cultured in a gel-like extracellular matrix component. In this case, the connective tissue cells are encapsulated in the scaffold material by mixing with the scaffold material in a conventional manner.
  • the seeding density of the connective tissue cells depends on the anticipated culture period, the type of culture carrier, and the composition of the medium, but is generally 1 ⁇ 10 4 Zml—1 ⁇ 10 8 Zml. is suitable, from about 1 X 10 5 cells Zml- 1 X 10 preferably eight Zml instrument about 1 X 10 6 cells Zml- about 1 X 10 7 cells Zml is more preferable. If the seeding density is lower than this range, the growth rate is not sufficient, so it is not preferable. It is not efficient if the seeding density is higher than this range.
  • Encapsulation can be performed before or after the culturing step.
  • cells When embedding is performed before the culturing step, cells may be inoculated into a mixture of a normal medium and a scaffold material. In this case, cell growth and activation with TGF-3 can be performed simultaneously in the encapsulated state.
  • the encapsulation when the encapsulation is performed after the culturing step, the cells after growing to a predetermined number of cells may be mixed with the scaffold material. In this case, activation by TGF- / 3 can be performed regardless of the timing of the encapsulation. Which of these methods to carry out the encapsulation can be easily determined by those skilled in the art according to the cell type and the state of the cells.
  • the cell suspension of the present invention contains the cells for transplantation obtained by the method for treating cells for transplantation, and is a culture step of culturing connective tissue cells in a medium containing at least one factor of the TGF_i3 superfamily. It can be obtained by processing with a processing method including
  • the liquid medium in the cell suspension of the present invention may be any liquid as long as it can be injected into humans, and examples thereof include phosphate buffer (PBS) and physiological saline.
  • PBS phosphate buffer
  • a basal medium such as DMEM can also be used. Since the cell suspension contains cells activated by the treatment method of the present invention, when injected into a skin defect such as a wrinkle, it actively produces extracellular matrix and rapidly It can repair damaged areas.
  • the prosthesis for transplantation of the present invention contains the cells for transplantation obtained by the above-described method for treating cells for transplantation, and is formed using a medium containing at least one factor of the TGF- / 3 superfamily. It can be produced by a treatment method including a culturing step of culturing a synthetic tissue cell. Preferably, it is supported on a scaffold material, that is, it has a supporting step of supporting connective tissue cells on the scaffold material.
  • Such a prosthesis for transplantation can be used for treatment of a transplanted tissue or a damaged tissue in a living body, for example, ligaments, tendons, skin, cartilage, bone, and the like, and particularly, ligaments, tendons, and skin. It is preferred that The application of the prosthesis for transplantation includes a transplanted tissue or a damaged tissue in a living tissue.
  • the transplanted tissue may be an autotransplant, an allograft, a cultured transplant, or an artificial material transplant that is transplanted into a tissue defect.
  • the prosthesis for transplantation is different from a conventional cultured tissue for transplantation (cultured transplant) for directly supplementing a tissue defect, such as an autotransplanted tissue directly transplanted to the tissue defect.
  • the purpose of this method is to make the transplant of the present invention quickly and efficiently compatible and to complete the healing by tissue repair.
  • the prosthesis for transplantation of the present invention contains cells useful for tissue repair and is indirectly involved in the repair of transplanted or damaged tissues.
  • the concept of cell therapy in which tissue is repaired in situ, is applied to orthopedic surgery, especially to the treatment of tendon's ligament. .
  • connective tissue cells are used for treatment.
  • a method including a transplantation step of transplanting the transplanted cells or transplanted prosthesis after transplantation into a transplanted tissue or a damaged tissue of a patient is employed.
  • the cells for transplantation after culturing are embedded in a scaffold material. It is particularly preferable that the scaffold material has a sheet shape.
  • the implanting step preferably comprises coating the implant or tissue lesion with a sheet-shaped implant prosthesis.
  • a sheet-shaped implant prosthesis Particularly, it is preferable for treating ligaments and tendons.
  • the implantable prosthesis can be handled with good operability, and the healing effect is not dissipated due to dispersion, so that it is effective for local treatment.
  • the scaffold material is not used and the above-mentioned cultured fibroblast sheet is used.
  • the ACL on the right knee of the heron was exposed, and the ACL was frozen using a cryoprobe composed of a stainless steel tube and a urethane foam-coated syringe.
  • the liquid nitrogen in the syringe flows through the tube and is discharged into the air as nitrogen gas.
  • the tube section comes into contact with the ACL and freezes the ACL.
  • the ACL was then thawed by injecting 25 ° C saline into the joint cavity. This freeze-thaw procedure was repeated three times for each ACL. This method can kill 95-100% of cells in ACL.
  • tissue injury site ACL autologous tendon transplant model
  • FIG. 1 As shown in Fig. 1, many connective tissue cells were observed inside the right knee ACL in gnorape I (Fig. La), and cell proliferation and cell infiltration into the ACL were performed early and efficiently. It was clear. This indicates that transplanted ACLs or damaged ACLs can be effectively repaired.
  • the right knee femur ACL—tibia complex was used for biomechanical evaluation using a video dimension analyzer. was subjected to a tensile test. Statistical analysis of the test results was performed by one-way ANOVA using Fisher's PLSD and Scheffs F tests for multiple comparisons. The result is shown in figure 2.
  • Fig. 2a tensile strength
  • Fig. 2b tangential elastic modulus
  • TGF-iS1 promoted the reconstitution of collagen 'fibrils at the tissue injury site from the early stage of transplantation.
  • increasing the diameter of such collagen 'fibrils also contributes to the improvement of mechanical properties.
  • the mechanical properties and ultrastructure of the ACL autologous tendon transplantation model can be restored in a short period of three weeks. It can be restored to the same state as ACL.
  • the conventional method using autologous tendon transplantation requires one year to recover more than 70%, whereas the application of the present invention can shorten this time to 12 weeks (about 3 months). Conceivable.
  • the present invention since connective tissue cells cultured in a medium containing at least one factor of the TGF- / 3 superfamily are used, when the connective tissue cells are used for transplantation, the effect is early and effective.
  • the living tissue is repaired.
  • the present invention is effective in treating damaged tissues and the like, and is a very useful technique in industries that are deeply involved in the biological and medical fields.

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Abstract

　移植組織または損傷した生体組織、特に腱や靭帯、皮膚、軟骨又は骨を早期に且つ良好に修復するための移植用補綴物および細胞懸濁液を提供することを技術的課題とする。 　前記課題を解決するため、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１因子、特にＴＧＦ−β１を含有する培地で、線維芽細胞などの結合組織細胞を培養し、前記移植用補綴物および細胞懸濁液を得る。特に移植用補綴物の場合、前記結合組織細胞を、コラーゲン、フィブリン又はヒアルロン酸などの細胞外マトリクス成分、特にフィブリンに包埋して、シート形状の移植用補綴物を得る。この移植用補綴物を、移植組織または組織損傷部に被覆する。

Description

明 細 書
移植用細胞の処理方法、細胞懸濁液、移植用補綴物、および損傷部位 の治療方法
技術分野
[0001] 本発明は、移植用細胞の処理方法、細胞懸濁液、移植用補綴物、および損傷部 位の治療方法に関する。
背景技術
[0002] 生体組織が欠損または損傷した場合において、 自家または同種組織、あるいは培 養移植物または人工移植物の移植による治療方法、薬剤や成長因子などの有効成 分を投与する治療方法、さらに、機能性遺伝子の導入による治療方法などが種々試 みられている。例えば、前十字靱帯（以下、 ACLと呼ぶ）のような負荷の掛かり易い 組織では、治癒期間の短縮が求められることから、早期に且つ良好な靭帯が再形成 される治療方法の確立が求められている。
[0003] ACLの治療方法の 1つとしては、移植による治療方法が知られており、人工靭帯に よる移植なども試みられてレ、る力 患者自身の膝蓋腱や膝屈筋腱を用いた自家腱移 植による ACL再建術が最も一般的に知られている。その一方で、より早期に治癒さ せる方法を確立するために、実験モデルとしての ACL自家腱移植モデルが確立さ れ、研究が進められている。この ACL自家腱移植モデルは、非特許文献 1に記載さ れるように、 ACLに対して凍結一解凍処理を行い、内在している線維芽細胞を壊死さ せることによって作製すること力 Sできる。
有効成分の投与による治療方法に関しては、 ACL自家腱移植モデルに対して、ト ランスフォーミング成長因子 (TGF) - 1を投与する方法が試みられている（非特許 文献 2参照）。この非特許文献 2では、 ACL自家腱移植モデルに対して低濃度の TG F- 1を投与することによって、 ACL自家腱移植に見られる力学的特性の悪化を充 分に抑制して自家移植腱の早期修復を可能とする ACL再構築モデルが確立された
[0004] さらに、遺伝子導入による治療方法に関しては、特許文献 1及び非特許文献 3にァ デノウィルスなどを用いて TGF— j3 1を生体内で産生させる遺伝子療法（gene therapy)が開示されている。この方法では、 TGF- jS 1を高濃度に生成させるために 遺伝子を含むベクターを作製し、この組換えベクターを線維芽細胞にトランスフエクシ ヨンさせた後に、この線維芽細胞を損傷した膝間接などに注入している。
[0005] 特許文献 1 :特表 2002 - 542801号公報
非特許文献 1 : Journal of Biomechanical Engineering, 2000, Vol. 122, p.594-599 非特許文献 2 Journal of Orthopaedic Research, 2002, Vol. 20, p.1345— 1351 非特許文献 3 : Arthritis Research & Therapy, 2003, Vol. 5, pl32- 139
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] しかしながら、自家腱移植 (ACL自家腱移植モデル）の自然治癒経過での組織修 復（再構築）プロセスにおいては、移植腱への細胞の浸潤によって一時的に力学的 特性が減少し (非特許文献 1参照）、その回復には数年という長期間を要するという 問題点がある。また、 TGF— を直接的に損傷組織へ投与した場合では、 TGF- /3 が投与部位力も関節内全体へ分散 (拡散)するため、標的部位 (治療部位)への集中 が困難となるだけでなぐ 目的としない部位に TGF— が作用し、関節に好ましくない 反応を惹起する可能性がある。更に、 TGF- /3 1を高濃度で生体に投与することは、 ACLの力学的特性がむしろ改善されず、 TGF_ j3 1の好ましくない副作用が発生す る可能性を否定できない。一方、遺伝子療法においては、上述のような分散に関す る問題に加えて、ベクターにウィルス由来のものを用いることに基づく副作用等の問 題点を抱えている。
従って本発明は、移植組織または損傷した生体組織を早期に且つ良好に修復（再 構築）するための移植用細胞の処理方法、細胞懸濁液、移植用補綴物、および損傷 部位の治療方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明の移植用細胞の処理方法は、 TGF—/3スーパーファミリーの少なくとも 1因 子を含有する培地で結合組織細胞を培養する培養工程を含むことを特徴としている 本発明の細胞懸濁液は、前記移植用細胞の処理方法で処理された移植用細胞を 含むことを特徴としている。
本発明の移植用補綴物は、本発明の移植用細胞の処理方法によって作製された ことを特徴としている。
本発明の損傷部位の治療方法は、トランスフォーミング成長因子 (TGF)_ /3スーパ 一ファミリーの少なくとも 1因子を含有する培地で結合組織細胞を培養する培養工程 、及び前記培養工程によって得られる活性化された培養細胞を患者に移植する移植 工程を含むことを特徴としてレ、る。
発明の効果
[0008] 本発明によれば、 TGF_ i3スーパーファミリーの少なくとも 1因子を含有する培地で 培養した結合組織細胞を使用するので、移植組織または損傷した生体組織を早期 に且つ良好に修復させるための移植用細胞の処理方法、細胞懸濁液、移植用補綴 物、および損傷部位の治療方法を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]本発明の実施例に力、かる凍結一解凍処理後 12週の右膝 ACLのへマトキシリン —ェォジン (HE)による染色像である。
[図 2]本発明の実施例に力、かる凍結一解凍処理後 12週の右膝 ACLの力学的特性（a .引っ張り強度、 b.接線弾性率）を比較したグラフである。
[図 3]本発明の実施例に力かる凍結 -解凍処理後 12週の右膝 ACLの透過型電子顕 微鏡 (TEM)写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明の移植用細胞の処理方法は、 TGF—/3スーパーファミリーの少なくとも 1因 子を含有する培地で結合組織細胞を培養する培養工程を含むことを特徴としている これによれば、結合組織細胞を TGF— j3スーパーファミリーを含む培地で培養して 予め活性化させるので、処理後の細胞の移植は、活性化された細胞を移植部位また は損傷部位に直接投与することになる。これにより、自然治癒経過での組織修復プロ セスにおける浸潤細胞とは異なる活性化された結合組織細胞の浸潤が起こり、一時 的な組織劣化を生じさせることなく早期に且つ効果的に生体組織が修復され、短期 間で治療を完了することができる。従って、本処理方法により得られた移植用細胞を 用いれば、 TGF— スーパーファミリーの直接投与よりも早期かつ安全に、例えば A CLの場合には 12週間 (約 3ヶ月）という短期間で、移植組織または損傷組織の修復 を達成することができる。ここで云う移植用細胞とは、細胞懸濁液のような細胞の状態 で投与してもよいが、培養線維芽細胞シートのような組織の状態で移植するものが好 ましい。組織形態の移植用細胞を移植した場合には、局所的な治癒をより効果的に 行うことが期待できる。また、しわ等の皮膚欠損に対しては、細胞懸濁液の状態で注 入することによって、早期に欠損部 (損傷部位)を修復することができる。
[0011] ここで使用される TGF— j3スーパーファミリー（以下、特に断らない限り TGF— /3と する）には、 TGF- β 1、 TGF- β 2、 TGF- β 3、 TGF— β 4、 TGF— β 5、 BMP (骨 形成タンパク）_2、 BMP_3、 BMP_4、 BMP_5、 BMP_6、 BMP—7などが挙げら れる。これらの TGF- は、生体内から単離 ·精製されたものを使用でき、精製された 市販のものを使用することもできる。また、細胞由来の TGF- iSとして、血小板のホモ ジネートから精製された TGF— を使用することができる。 TGF- J3は、このスーパー ファミリーに属する因子であれば、単独でも組み合わせて使用してもよい。
TGF- J3の中でも、特に作用機序の観点力 TGF- iS 1が好ましい。 TGF—jS 1は 、いわゆる低濃度であればよぐ 0. lng/ml— 100ng/ml、好ましくは 4ng/ml— 10ng/mlの濃度で使用することができる。
[0012] 本発明における結合組織細胞は、生体組織を構成する結合組織細胞であればよ いが、採取しやすさの観点から皮膚、滑膜、筋肉、骨髄などの組織から得られる細胞 およびこの細胞から分化された細胞であることが好ましい。また結合組織細胞は、移 植用細胞または組織としての用途から、修復までの期間において拒絶反応を回避す ること力 Sできるものであればよく、 自家のものであることが最も好ましい。
更に、このような結合組織細胞としては、細胞群増殖能力及び修復能力などの観 点から線維芽細胞及び幹細胞様細胞が好ましぐ皮膚由来線維芽細胞、滑膜由来 線維芽細胞や、筋肉及び骨髄等の間葉系幹細胞から分化された線維芽細胞が含ま れる。中でも、組織の採取し易さ及び細胞の増殖容易性の観点から、例えば ACLの 場合には滑膜由来線維芽細胞であることが特に好ましぐしわ等の皮膚欠損の場合 は皮膚由来線維芽細胞が好ましい。
[0013] このような結合組織細胞は、充分な細胞数に予め増殖させるため及び他の細胞か ら目的とする好適な細胞に分化させたり選別したりするために、組織の採取後であつ て培養工程の前に、予備培養を行ってもよい。このような予備培養には、組織片培養 法（explant culture)や細胞培養法（cell culture)等として通常行われているものが挙 げられる。例えば、滑膜由来線維芽細胞では、関節鏡を使用して関節部位力 滑膜 組織片を採取した後に、数日から数週間にわたって組織片培養法で培養することに よって、滑膜組織力も容易に選別して得ることができる。また、必要に応じて継代培養 を行ってもよい。
[0014] 培養工程に用いられる培地には、培養に通常使用される液体培地を使用すること ができる。このような培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)等を挙げ ることができるが、培養対象である結合組織細胞の種類によって適切な培地を選択 することができ、必要に応じて血清、抗生物質等を適当量で添加してもよい。殊に、 ァスコルビン酸を添加した培地で線維芽細胞を培養する場合には、線維芽細胞で構 成されるシート形状の移植用組織 (線維芽細胞が産生する細胞外マトリクスを含む） が形成される。この培養線維芽細胞シートは、十分な強度を有しているので操作性 が良好で、移植後においても局所的な治癒が期待できる。
培養工程にぉレ、て細胞培養法を適用する場合には、培養開始時の結合組織細胞 の播種密度は、細胞の種類及び増殖速度によって適宜選択されるが、一般に、 I X 103個/ cm2— 1 X 107個/ cm2、好ましくは、 1 X 104個/ cm2— 1 X 106個/ cm2で ある。
[0015] 培養工程は、移植用細胞または組織として使用可能な細胞数や状態 (形態）が得 られると共に結合組織細胞が TGF— βによって適度に活性化されるまで継続される。 この培養工程の期間は、細胞種及び播種密度等によって異なるが、一般に 1日一 7 日間であり、 2日一 5日間が好ましぐ更に好ましくは 2日間である。
[0016] 結合組織細胞は、足場材料に担持されていることが好ましぐ包坦されていることが さらに好ましレ、。足場材料に担持させることによって、移植用細胞の取扱いを容易に すると共に、活性化細胞を局所的な移植部位に配置し、移植用細胞を分散させるこ となく効率よく治癒させることができる。
[0017] 足場材料としては、生体作用の観点からフイブリン、コラーゲン、ヒアルロン酸などが 挙げられるが、細胞を包埋し担持する観点から、フイブリン及びコラーゲンが特に好ま しい。なお、フイブリンは、フイブリノ一ゲンとトロンビンとを混合することにより形成され る市販のフイブリン 'シーラント（フイブリン糊）を使用することができる。またこのような 足場材料としては、生体由来の足場材料が好ましい。このような生体由来の足場材 料の 1つとして、前述するコラーゲンを代表とする細胞外マトリクスが挙げられる力 細 胞の増殖、移動、分化などの調節やその他の種々の細胞外マトリクス成分としての機 能が維持されているものであれば如何なるものであってもよぐ天然物に限らず、人 ェ的な代用性細胞外マトリクス成分であってもよい。これらは、単独又は組み合わせ て使用すること力 Sできる。
また、他の足場材料として、生体吸収性材料又は生体親和性材料の人工材料また は天然材料を使用してもょレ、。このような生体吸収性材料又は生体親和性材料とし ては、ポリ乳酸（PLA)、ポリグリコール酸（PGA)、ポリグリコール酸乳酸共重合体（P GLA)、ポリ口タキサン、ゼラチン、キチン、キトサン、ァノレギン酸カノレシゥム、ポリロタ キサンヒドロゲル等を挙げることができる。さらに他の足場材料としては、生体不活性 材料が挙げられる。生体不活性材料とは、生体内に埋植されたときに生体組織との 間に薄い皮膜 (異物膜）が介在される材料であって、例えば、アルミナセラミックス、力 一ボンセラミックス、ジルコ二アセラミックス、チタン、チタン合金、コバルト一クロム合金 、コバルト—クロム—モリブデン合金、ステンレス鋼、等が挙げられる。
[0018] これらの足場材料は、メッシュ状、ゲル状又はスポンジ状であることが好ましぐまた 、移植用細胞を移植する際に適切な形状であれば如何なる形態のものでもよぐ例 えばシート形状であることが好ましい。従って、組織の欠損部の形状に合わせた立体 的な形状とすることによって物理的に欠損部を補うことができ、一方、シート形状にす ることによって操作性よく広範囲にわたって移植組織または損傷組織を被覆し固定 すること力 Sできる。
[0019] 結合組織細胞は、足場材料の表面上に播種してもよいし、足場材料に包埋しても よい。殊に、ゲル状の細胞外マトリクス成分に包坦して培養することが好ましい。この 場合、結合組織細胞は、常法により足場材料と混合されることによって足場材料に包 坦される。この際、結合組織細胞の播種密度は、予定される培養期間や培養担体の 種類、培地の組成に依存するが、一般に、 1 X 104個 Zml— 1 X 108個 Zmlとするこ とが適切であり、約 1 X 105個 Zml— 1 X 108個 Zmlが好ましぐ約 1 X 106個 Zml— 約 1 X 107個 Zmlが更に好ましい。この範囲よりも播種密度が少ないと、増殖率が十 分でないため、好ましくなレ、。この範囲よりも播種密度が多いと効率的でない。
[0020] 包坦は、培養工程の前後にかかわらず行うことができる。培養工程の前に包埋を行 う場合には、通常培地と足場材料との混合物に対して細胞を播き込めばよい。この場 合には、包坦状態で細胞の増殖と TGF— /3による活性化を同時に行うことができる。 一方、培養工程の後に包坦を行う場合には、所定の細胞数に増殖した後の細胞を 足場材料と混合すればよい。この際、 TGF- /3による活性化は、包坦の時期に関係 なく行うことができる。これらのいずれで包坦を行うかは、細胞種及び細胞の状態等 に応じて、当業者に容易に判断することができる。
[0021] 次に、本発明の細胞懸濁液について説明する。
本発明の細胞懸濁液は、上記移植用細胞の処理方法で得られた移植用細胞を含 むものであり、 TGF_ i3スーパーファミリーの少なくとも 1因子を含有する培地で結合 組織細胞を培養する培養工程を含む処理方法によって処理することによって得るこ とができる。
本発明の細胞懸濁液における液状媒体は、ヒトに注入可能な液体であればいずれ であってもよぐ例えば、リン酸緩衝液（PBS)や生理食塩水などが上げられる。また、 基礎培地である DMEMなども利用可能である。本細胞懸濁液は、本発明の処理方 法によって活性化された細胞を含んでいるので、しわ等の皮膚欠損部に注入された 場合には、細胞外マトリクスを活発に産生し、早期に損傷部位の修復をおこなうことが できる。
[0022] 次に、本発明の移植用補綴物について説明する。
本発明の移植用補綴物は、上記移植用細胞の処理方法で得られた移植用細胞を 含むものであり、 TGF—/3スーパーファミリーの少なくとも 1因子を含有する培地で結 合組織細胞を培養する培養工程を含む処理方法によって製造することができる。好 ましくは、足場材料に担持されていること、すなわち、結合組織細胞を足場材料に担 持させる担持工程を有してレ、ることが好ましレ、。
本方法によれば、前述したように、移植組織または損傷した生体組織を早期に且つ 良好に修復させるための移植用補綴物を容易に得ることができる。
[0023] このような移植用補綴物は、生体における移植組織や組織損傷部、例えば、靱帯、 腱、皮膚、軟骨、骨等の治療に用いることができ、特に靱帯や腱、皮膚などであること が好ましい。移植用補綴物の適用は、生体組織における移植組織や組織損傷部が 挙げられる。移植組織としては、組織欠損部に移植される自家移植組織、同種移植 組織又は培養移植物や人工材料移植物であってもよい。ここで、本移植用補綴物は 、組織欠損部を直接的に補うための従来の移植用培養組織 (培養移植物）とは異な り、組織欠損部に直接的に移植された自家移植組織などの移植物を、早期かつ効 率よく親和させ、組織修復による治癒を完了させるためのものである。本発明の移植 用補綴物は組織修復に有用な細胞が含まれており、かつ間接的に移植組織または 損傷組織の修復に関与すると言う点において、 in vitroで組織代替物を作製すると云 う従来の組織工学（Tissue Engineering)的な概念とは異なり、 in situにおいて組織を 修復すると云う細胞療法 (cell therapy)の概念を整形外科学領域、殊に腱'靭帯の治 療に適用したものである。
[0024] 本移植用補綴物を治療に用いる場合には、上述したように結合組織細胞を TGF—
βを含有する培地で培養する培養工程に加えて、培養後の移植用細胞や移植用補 綴物を患者の移植組織または組織損傷部に移植する移植工程を含む方法が採用さ れる。このとき、培養後の移植用細胞は、足場材料に包埋されていることが好ましぐ 足場材料がシート形状であることが特に好ましい。
足場材料がシート形状である場合には、移植工程は、シート形状の移植用補綴物 で移植組織または組織損傷部を被覆することを含むことが好ましい。殊に、靭帯や腱 の治療に好ましい。これにより、移植用補綴物を操作性よく取扱うことができ、且つ分 散による治癒効果の散逸がないため、局所的な治療に効果的である。なお、足場材 料を用いなレ、前述の培養線維芽細胞シートにぉレ、ても同様のことが云える。 実施例
[0025] 1.細胞の調製及び TGF— β 1による活性化
体重が 3. 4± 0. 4kg (平均 ±標準偏差)である成獣雌日本白色ゥサギ 44匹を、 11 匹ずつの 4グループ（I一 IV)へと任意に分けた。このうちグループ I及び IIにおいてゥ サギ各々の左膝から、関節鏡を使用しながら滑膜組織を採取した。採取した滑膜組 織を組織片培養法で培養することによって、アウトグロースしてくる滑膜由来線維芽 細胞を選択的に回収した。回収した細胞を継代する時、 5mlの DMEMに 3 X 106個 の細胞を懸濁した細胞懸濁液を、 2mlのフイブリン（ティシール（登録商標）：バクスタ 一社製）と混合した。混合後 1週間の培養によって、シート形状の操作性の良好な移 植用補綴物（線維芽細胞包坦フイブリン）が得られた。フイブリンに包埋された細胞は 、表面及び内部に均一に分布していた。
[0026] グループ Iにおいては途中 5日目に（すなわち移植が行われる予定の 2日前）、 10η gの TGF_ i3 1 (R&Dシステムズ社製）が培地に加えられ、 TGF_ i3 1を含有する培 地による培養が開始された。一方、グループ IIにおいては、途中何も加えずに 1週間 培養を行った。
[0027] 2. in situ凍結—解凍処理による ACL自家腱移植モデルの構築
ゥサギの右膝の ACLを露出させ、ステンレス鋼チューブとウレタンフォーム被覆シリ ンジで構成されたクライオプローブを用いて ACLの凍結処理を行った。凍結処理に おいて、シリンジ内の液体窒素はチューブ内を流れ、窒素ガスとして空気中に排出さ れる。このとき、チューブの部分が ACLと接触し、 ACLを凍結させる。その後、 ACL を関節腔に 25°Cの生理食塩水を注入することによって解凍した。この凍結一解凍手 順は、各 ACLについて 3回繰り返した。この方法によって ACLの 95— 100%の細胞 を壊死させることができる。
[0028] 3.移植
組織の採取後 4週の時点で、上述のように右膝の ACLの凍結 -解凍処理を行って 内部線維芽細胞を壊死させて、組織損傷部 (ACL自家腱移植モデル)を作製した。 損傷部の周囲をシート形状の線維芽細胞包坦フイブリンで被覆し、 2本の 5_0ナイ口 ン縫合糸で固定した。それから更に 12週間にわたってその状態を維持した。 [0029] 4.組織学的観察
損傷部に固定してから 12週間後に、ゥサギを屠殺して、右膝 ACLの横断面検体を へマトキシリンーェォジン (HE)を用いて染色し、光学顕微鏡を用いて組織学的観察 を行った（X 100、 n= 2)。
図 1に示されるように、グノレープ Iでは多くの結合組織細胞が右膝 ACL内部におい て観察され（図 la)、細胞の増殖及び ACLへの細胞の浸潤が早期に且つ効率よく行 われていることが明らかであった。これは、移植 ACLまたは損傷 ACLが効果的に修 復可能であることを示してレ、る。
これに対して、 TGF- /3 1活性化細胞を有しないフイブリンを用いた場合 (グループ II、図 lb)では、右膝 ACL内部において結合組織細胞が散在している状態が観察さ れ、細胞の増殖及び組織修復に必要な結合組織細胞の浸潤が充分でないことが明 らかであった（図 lb)。
また、細胞が包坦されていないフイブリンのみを被覆した場合（グループ III、図 lc) では、 ACLの内部に僅かな数の結合組織細胞が観察されるのみであった。このこと は、フイブリンで被覆するだけでは、組織修復に必要な結合組織細胞の周囲組織か ら ACLへの浸潤が起こりにくいことを示しており、完治するまでに長い治療期間が必 要であることが示されてレ、る。
[0030] 5.力学的特性評価
屠殺された上記グループのゥサギ (各グループについて n= 7)に対して、生体力学 的評価のためにビデオ'ディメンジョン解析器（video dimension analyzer)を使用して 、右膝大腿骨 ACL—脛骨複合体の前内側繊維束について引っ張り試験を行った。こ の試験結果の統計解析は、複数比較のため、 Fisher's PLSD及び Scheffs F試験を 用いた one- way ANOVAによって行った。結果を図 2に示す。
[0031] 図 2に示されるように、各グノレープ間において、引っ張り強度（図 2a)及び接線弾性 率（図 2b)に大きな差があることが示され、特に、 TGF— 1活性化細胞を用いた場 合 (グノレープ I)は、健常な ACL (グノレープ IV)と明確な差がなかった。これに対して T GF- β 1活性化細胞を有しなレ、場合 (グノレープ Π)及びフィブリンのみの場合 (グルー プ ΠΙ)は、健常な ACLと比較して力学的特性に劣っていることが示された（いずれも ρ < 0. 05)。
[0032] 6.超微細構造
次に処理後の ACLについて、改変 Karnovsky固定液を用いることによって、超微細 構造を観察した。屠殺直後の各グループのゥサギ (各グループにつレ、て n= 2)の右 膝 ACLを曝露し、常法の酢酸ウラン法を用いて in situにて固定を行った。染色され た右膝 ACLの断面像を、透過型電子顕微鏡 (TEM)を用いて観察した（図 3)。
[0033] 図 3aに示されるように TGF— j3 1活性化細胞を用いた場合（グループ I)では、 ACL 内部におけるコラーゲン'フィブリルの大部分力 健常な ACL (グループ IV、図 3c)の それと非常に類似した直径分布を有していた。これに対して、フイブリンのみのダル ープ ΠΙは、通常よりも細いコラーゲン'フィブリルが多く観察された（図 3b)。 TGF- /3
1活性化細胞を用いないグノレープ IIについても、同様に通常よりも細いコラーゲン繊 維が多く観察された (データ示さず)。
このことは、 TGF- iS 1による活性化によって、移植初期の段階から組織損傷部に おけるコラーゲン'フィブリルの再構築が促進されたことを示している。また、このような コラーゲン'フィブリルの直径が太くなることによって、力学的特性の改善にも寄与す るものと推察される。
[0034] このように、 TGF- J3 1活性化細胞を用いた本発明の移植用補綴物を用いれば、 3 週間という短期間で、 ACL自家腱移植モデルの力学的特性及び微細構造を健常な ACLと同等の状態にまで修復することができる。この回復について、従来の自家腱 移植による方法では 70%以上の回復に 1年を要するのに対して、本発明を適用する と、それを 12週（約 3ヶ月）という短期間に短縮できると考えられる。
産業上の利用の可能性
[0035] 本発明によれば、 TGF—/3スーパーファミリーの少なくとも 1因子を含有する培地で 培養した結合組織細胞を使用するため、前記結合組織細胞を移植のため用いた場 合、早期且つ効果的に生体組織が修復される。つまり、本発明は損傷組織の治療等 に有効であり、生物学的分野及び医学的分野が深くかかわる産業において、非常に 有益な技術である。

Claims

請求の範囲
[I] トランスフォーミング成長因子 (TGF) - βスーパーファミリーの少なくとも 1因子を含 有する培地で結合組織細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする移植用細 胞の処理方法。
[2] 前記結合組織細胞が、線維芽細胞であることを特徴とする請求項 1に記載の移植 用細胞の処理方法。
[3] 前記 TGF— スーパーファミリーの 1因子力 TGF- J3 1であることを特徴とする請 求項 1または 2に記載の移植用細胞の処理方法。
[4] さらに結合組織細胞を足場材料に担持させる担持工程を含むことを特徴とする請 求項 1記載の移植用細胞の処理方法。
[5] 前記足場材料が、コラーゲン、フイブリン又はヒアルロン酸のいずれかを含むことを 特徴とする請求項 4に記載の移植用細胞の処理方法。
[6] 請求項 1一 3のいずれか 1項に記載の移植用細胞の処理方法によって処理された 移植用細胞を含むことを特徴とする細胞懸濁液。
[7] 皮膚欠損を修復するために皮膚組織の欠損部に有効量を注入されることを特徴と する請求項 6に記載の細胞懸濁液。
[8] 請求項 1一 5のいずれ力 4項に記載の移植用細胞の処理方法によって作製された 移植用補綴物。
[9] シート形状であることを特徴とする請求項 8に記載の移植用補綴物。
[10] 靱帯、腱、皮膚、軟骨又は骨の治療用である請求項 8に記載の移植用補綴物。
[II] 前記結合組織細胞が、滑膜由来、又は間葉系幹細胞から分化した線維芽細胞で あることを特徴とする請求項 8に記載の移植用補綴物。
[12] 患者の損傷部位を治療するための方法であって、
トランスフォーミング成長因子 (TGF) _ j3スーパーファミリーの少なくとも 1因子を含 有する培地で結合組織細胞を培養する培養工程、及び
前記培養工程によって得られる活性化された培養細胞を患者に移植する移植工程 を含むことを特徴とする損傷部位の治療方法。
[13] 前記培養細胞がシート形状の移植用補綴物であり、且つ前記移植用補綴物を患 者の損傷部位に被覆することを特徴とする請求項 12に記載の損傷部位の治療方法
[14] 前記損傷部位が、生体、 自家移植物、同種移植物、または人工材料移植物のレ、ず れかの腱または靭帯であることを特徴とする請求項 12または 13に記載の損傷部位 の治療方法。
[15] 前記トランスフォーミング成長因子 (TGF)は、 TGF- β 1であることを特徴とする請 求項 12— 14のいずれかに記載の損傷部位の治療方法。
[16] 前記結合組織細胞が、線維芽細胞であることを特徴とする請求項 12— 15のいず れかに記載の損傷部位の治療方法。
[17] 前記線維芽細胞が、滑膜由来細胞または間葉系幹細胞から分化された細胞である ことを特徴とする請求項 16記載の損傷部位の治療方法。
[18] 患者の損傷部位を治療するための方法であって、
結合組織細胞をフイブリンに包埋する包坦工程、
前記細胞をフイブリンに包埋された状態でトランスフォーミング成長因子 (TGF)ス 一パーファミリーの少なくとも 1因子を含有する培地で培養する培養工程、および 前記培養工程によって得られるシート形状の移植用補綴物で患者の腱または靭帯 を被覆する移植工程、
を含むことを特徴とする腱または靭帯の治療方法。
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