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WO2005015200A1 - Simple diagnosis of disorder with sera and tailor made treatment - Google Patents

Simple diagnosis of disorder with sera and tailor made treatment Download PDF

Info

Publication number
WO2005015200A1
WO2005015200A1 PCT/JP2004/001087 JP2004001087W WO2005015200A1 WO 2005015200 A1 WO2005015200 A1 WO 2005015200A1 JP 2004001087 W JP2004001087 W JP 2004001087W WO 2005015200 A1 WO2005015200 A1 WO 2005015200A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
disease
sugar chain
serum
analysis
subject
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/001087
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Hiroaki Nakagawa
Megumi Hatou
Kenichi Niikura
Kisaburo Deguchi
Shinichiro Nishimura
Original Assignee
Shionogi Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shionogi Co., Ltd. filed Critical Shionogi Co., Ltd.
Publication of WO2005015200A1 publication Critical patent/WO2005015200A1/en

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates

Definitions

  • the present invention relates to tailor-made treatment using sugar chain analysis. More specifically, the present invention relates to a tailor-made treatment based on glycan analysis of whole serum. Background art
  • tailor-made treatment is a method of selecting a treatment that is tailored to the characteristics of the patient (or etiology).
  • SNPs sequence difference
  • SNPS refers to a base sequence that differs by at least one base.
  • the present invention provides a simple method for diagnosing a subject using serum, and It is an object to provide tailor-made treatment according to the requirements.
  • the present invention provides the following.
  • the disease marker includes at least a sugar chain selected from the group consisting of code number 210.1, code number 210.2, and code number 210.3.
  • a method for treating or preventing the above-mentioned subject by diagnosing using serum from the subject by diagnosing using serum from the subject.
  • a method for presenting a treatment or prevention according to the condition of the subject by diagnosing using serum from the subject is a method for presenting a treatment or prevention according to the condition of the subject by diagnosing using serum from the subject.
  • a system for diagnosing a disease using serum from a subject comprising: a means for correlating the analyzed disease marker with information on the disease.
  • the system according to item 63 further comprising means for correlating a sugar marker analysis result at a disease marker level with a sugar chain analysis result at a serum level.
  • a system for presenting a treatment or prevention according to the state of the subject by diagnosing using serum from the subject is provided.
  • FIG. 1 shows the structure of immunoglobulin.
  • Fig. 2 shows changes in sugar chains in rheumatoid arthritis.
  • Figure 3 shows the two-dimensional mapping scheme.
  • FIG. 4 shows the results of analyzing an N-linked sugar chain of IgG using an ODS column.
  • A 1 OmM sodium phosphate (: H3.8) and eluent B: eluent A
  • the eluent B was analyzed by a linear gradient of 20% to 50% using 0.5% butanol at a flow rate of 1.0 ml / min at 55 ° C for 60 minutes. Detection was performed at an excitation wavelength of 320 nm and an emission wavelength of 400 nm.
  • the abbreviations in the figure are as follows: Man; mannose, G1cNAc; N-acetyldarcosamine, Gal; galactose, Fuc; fucose.
  • FIG. 5 shows an example of analysis results of N-linked bran chains obtained from IgG. Abbreviations in the figure are as follows: IgG; human IgG (Sigma), BB; fracture, OA; osteoarthritis, RA; rheumatoid arthritis, Man; mannose, G 1 cNAc: N-acetyl darcosamine, Gal: galactose, Fuc: fucose.
  • FIG. 6A shows an example of analysis results of N-linked sugar chains in serum using an ODS column.
  • Eluent A 10 mM sodium phosphate (pH 3.8) and eluent B: eluted with 0.5% butanol in eluent A at a flow rate of 1.
  • Oml / min at 55 ° C for 60 minutes
  • Liquid B was analyzed by a 20% to 50% linear gradient.
  • An asterisk indicates a by-product.
  • FIG. 6B shows an example of the results of analysis of N-linked sugar chains using an amide column with peaks a to n obtained in the serum of rheumatoid arthritis obtained in 6A.
  • Eluent A 3% triethylamine acetate (pH 7.3): acetonitrile (35:65 (v / v)) and eluent B: 3% triethylamine acetate (pH 7.3): acetonitrile
  • the eluent B was analyzed by a linear gradient of 0% to 60% of eluent B using Tril (50:50 (v / v)) at a flow rate of 1. Oml / min at 40 ° C. for 30 minutes.
  • Detection was performed at an excitation wavelength of 32 Onm and an emission wavelength of 400 nm.
  • Stars indicate by-products.
  • the abbreviations in the figure are as follows: Man; mannose, G1cNAc; N-acetylda norecosamine, Gal; galactose, Fuc; fucose.
  • FIG. 7 shows an example of a change in elution time due to partial enzyme digestion.
  • FIG. 8 shows changes on the map of serum N-linked sugar chains by partial enzymatic digestion.
  • U indicates a glucose unit
  • * indicates a by-product.
  • 9A and 9B show examples of the results of analysis of N-linked sugar chains obtained from serum.
  • Abbreviations in the figures are as follows: IgG; human IgG (Sigma), BB; fracture, OA; osteoarthritis, RA; rheumatoid arthritis.
  • the abbreviations in the figure are as follows: Man; mannose, G1cNAc; N-acetyldarcosamine, Gal; galactose, Fuc; fucose.
  • FIG. 10 shows a comparison of the sugar chain pattern between serum and IgG.
  • the control in the serum comparison is human serum (Sigma).
  • the control in the IgG comparison is human IgG (Sigma).
  • the abbreviations in the figure are as follows: BB; fracture, OA; osteoarthritis, RA; rheumatoid arthritis, Man: mannose, G1cNAc; N-acetyldarcosamine, Ga 1; galactose, Fuc; fucose. In rheumatic patients, similar results were obtained when comparing the relative concentrations of 210.1, 210.2 and 210.3 in serum.
  • FIG. 11 shows a computer-based embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 shows chromatograms of various human serum glycoprotein PA oligosaccharides on HPLC.
  • a) shows that a PA oligosaccharide mixture of human serum glycoproteins is separated by HP LC on a DEAE column depending on the content of sialic acid.
  • b) Neutral, monosialic, disialic, and trisialic acid oligosaccharides are each separated on a second ODS column.
  • c) An example of the result of applying the separated oligosaccharide to a third amide column is shown.
  • the arrow indicates the elution position of the standard glucose oligomer.
  • the numbers indicate the number of glucose units.
  • FIG. 13 shows the identification of the structures of neutral and sialooligosaccharides of human serum glycoproteins.
  • the following is an example of the analysis process for neutral oligosaccharide E (a), monosialyl oligosaccharide B (b), and monosialyl oligosaccharide C (c).
  • Closed circles are neutral oligosaccharides and open circles are monosialyl oligosaccharides. 20.1 and the like are code numbers.
  • the arrow points out the enzyme This shows the coordinate movement of the oligosaccharide after conversion.
  • the solid arrow is galactosidase, the dashed line is - ⁇ -acetylacetylhexosaminidase, and the dotted line is sialidase.
  • FIG. 14 shows the 40 O MHz NMR of oligosaccharides Mono-B, Di_A and Tri-B derived from serum glycoproteins and standard fetuin oligosaccharides.
  • disease marker refers to a molecule that is caused either as a cause of a specific disease or as a result of the disease. By examining the presence or absence or increase or decrease in the expression level of this molecule, the disease marker in an individual can be determined. The presence or risk of contracting the disease is indicated. Suitable disease markers include, but are not limited to, glycoproteins, glycopeptides, glycolipids, gangliosides, sugar chains, and products partially degraded or derived therefrom.
  • Preferred disease marker I g G and ⁇ -linked sugar chain, alpha iota _ acid glycoprotein and its N-linked sugar chain, mono- Hue preparative protein and ⁇ -linked sugar chains, transferrin and its sugar chain ( GTP and its G-linked sugar chains, cholinesterase and its N-linked sugar chains, thyroglobulin, bone alkaline phosphatase and its sugar chains, blood group substances, human Chorionic gonadotropin and its N-bond Type sugar chains, carcinoembryonic antigens and their N-linked sugar chains, lactosaccharide antigens, CA19_9, CA125, and products partially decomposed or derived therefrom.
  • the term “purified”, “purified”, or “purified” means that a substance in a sample substantially separates or is purified from a state existing in a sample before separation. That means. Thus, the material separated from the sample has at least a reduced content of other substances that it contained before being separated. The substance is also considered substantially purified when present with carriers or diluents that do not interfere with the intended purpose of the substance. Therefore, a “purified disease marker” means that substances other than the disease marker that were present in the data prior to the analysis are substantially reduced.
  • sugar chain refers to a compound formed by linking one or more unit sugars (monosaccharides and / or derivatives thereof). When two or more unit sugars are linked, the unit sugars are usually bonded by dehydration condensation through glycosidic bonds.
  • Such sugar chains include, for example, monosaccharides (glucose (G1c), galactose (Gal), mannose (Man), fucose (Fuc), xylose (Xyl), N-acetyl Darcosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc), sialic acid (SA) and their complex derivatives, as well as polysaccharides, oligosaccharides, glycoproteins, It includes a wide range of sugar chains decomposed or derived from complex biomolecules such as proteodalican, glycosaminodalican, and glycolipid, but is not limited thereto.
  • a sugar chain can be used interchangeably with “polysaccharide”, “carbohydrate”, and “carbohydrate”.
  • the term “sugar chain” in this specification may include both a sugar chain and a sugar chain-containing substance.
  • monosaccharide refers to a polyhydroxyaldehyde or a polyhydroxy aldehyde containing at least one hydroxyl group and at least one aldehyde group or ketone group. If it is a hydroxy ketone, its derivative is referred to as ⁇ .
  • monosaccharide is represented by the general formula C n H 2 n O n not limited to, fucose (Kisosu to Dokishi), also include such N- ⁇ Se Chirudarukosamin.
  • n 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 in the above formula are replaced by geose, triose, tetrose, pentose, hexose, heptose, octose, respectively. , Nonose and Decourse. Generally, they correspond to aldehydes or ketones of chain polyhydric alcohols. The former is called aldose and the latter is called ketose.
  • a monosaccharide derivative refers to a substance that results from one or more hydroxyl groups on an unsubstituted monosaccharide being replaced by another substituent.
  • Examples of such monosaccharide derivatives include sugars having a carboxyl group (eg, aldonic acid in which the C-1 position is oxidized to form a carboxylic acid (eg, D-dalconic acid in which D-glucose is oxidized) ), At the end of which has a peronic acid (D-gluconic acid in which D-glucose is oxidized), a derivative of an amino group or an amino group (eg, an acetylated amino group).
  • a carboxyl group eg, aldonic acid in which the C-1 position is oxidized to form a carboxylic acid (eg, D-dalconic acid in which D-glucose is oxidized)
  • a peronic acid D-gluconic acid in which D-glucose is oxidized
  • a derivative of an amino group or an amino group eg, an acetylated amino group
  • Sugars for example, N-acetyl-D-darcosamine, N-acetyl-D-galactosamine, etc.
  • sugars having both an amino group and a carboxyl group for example, N-acetylneuraminic acid (NANA, a kind of sialic acid) ), N-acetylmuramamic acid, etc.
  • deoxylated sugars for example, 2-dexoxy-D-ribose
  • sulfated sugars containing a sulfate group phosphoric acid containing a phosphate group
  • the term “simple bran” includes the above-mentioned derivatives, or the sugar having a hemiacetal structure, which reacts with alcohol to form an acetal structure.
  • Glycosides are also included in the range of monosaccharides.A plurality of these monosaccharides are linked to form an oligosaccharide or a polysaccharide, usually a dehydration condensation by a glycosidic bond, but the direction of the bond of the sugar at the non-reducing terminal side. It is known that depending on the nature, ⁇ and] 3, and the position of each of the carbons, greatly affects the physical properties. Important information along with types of monosaccharides (constituent sugars) There is no clear division between oligosaccharides and polysaccharides, but roughly 10-50 sugars The degree is the boundary. In the present specification, unless otherwise specified, oligosaccharide and polysaccharide are used interchangeably.
  • sugar chain-containing substance refers to a substance containing a sugar chain and a substance other than the sugar chain.
  • sugar chain-containing substances are found abundantly in living organisms. For example, in addition to monosaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides contained in living organisms, glycoproteins, proteodalicans, glycosaminodalicans, glycolipids , And a wide range of sugar chains decomposed or derived from these complex biomolecules, but is not limited thereto.
  • glycoprotein refers to a protein containing at least one sugar chain, preferably a protein having such a sugar chain bound thereto.
  • glycoproteins unless otherwise specified include glycopeptides.
  • the glycopeptide may refer to a polypeptide smaller than the glycoprotein.
  • glycoproteins have sugar chains necessary for their functions in higher organisms. Examples of such glycoproteins include, but are not limited to, glycoproteins having an N-linked sugar chain, an O-linked sugar chain, and a C-linked sugar chain singly or a plurality thereof. Not done.
  • glycoproteins include, but are not limited to, enzymes, hormones, cytokines, growth factors, binding factors, antibodies, vaccines, receptors, structural proteins, serum proteins, and the like.
  • sugar chain structure refers to the state of the sugar chain sequence and its information. Unless otherwise specified, a sugar chain and a sugar chain structure can be used interchangeably herein. Examples of sugar chain structures that have an important effect on cells, tissues, organs, and living organisms include, for example, asparagine-linked glycoprotein sugar chain (N-linked sugar chain), mucin, and mucin-linked glycoprotein sugar chain (0-linked sugar chain).
  • bran chains are contained in glycolipids, glycolipids, sugar nucleotides, proteodalicans, GPI anchors and the like.
  • the term "set of sugar chain structures" or “set of sugar chains” is used interchangeably herein, and refers to, for example, a set of substances or compositions having a plurality of types of sugar chains. Refers to the sugar chain structure or sugar chain.
  • Such a set of carbohydrate structures may be, for example, the diversity of carbohydrates linked to amino acids at the same position on the same type of glycoprotein, or different carbohydrate structures in multiple glycoproteins. It may be.
  • Quantitative change information of a sugar chain structure refers to information on a change in abundance or expression level of a plurality of sugar chains (or a set of sugar chain structures). Such information on the quantitative change of the sugar chain structure can be displayed as information on the presence or absence of the sugar chain itself, or the entire molecule (for example, glycoprotein) containing the sugar chain is displayed as information. You can also. Quantitative change information can also be expressed as, but is not limited to, the ratio of notable sugar chains. Units indicating the amount (or level) of each sugar chain or sugar-containing molecule that constitutes such quantitative change information include, for example, ng, mo1, signal intensity in mass spectrometry, and spectrophotometric analysis.
  • Such interactions include, for example, covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, non-ionic interactions, hydrophobic interactions, electrostatic interactions, etc. Not limited.
  • the interaction is preferably a covalent bond. Forces and other interactions may also be important in the sugar chain.
  • level such as interaction, expression, presence, etc. means the interaction, A measure of the strength of expression, presence, etc., which can be used to determine information about sugar chains.
  • levels include, for example, physical analysis (eg, mass spectrometry,
  • Spectroscopic analysis eg, analysis of antibody and lectin agglutination and color reaction
  • Chemical analysis eg, chemical quantification of specific binding such as oxime binding
  • biological analysis eg, a method for quantifying the reactivity of cells specific to a certain sugar chain
  • blood is used in the same meaning as commonly used in the art, and refers to a body fluid circulating in a vascular system (circulatory system).
  • serum refers to a portion obtained by removing blood cells and blood coagulation components from blood. “Serum” refers to the liquid component of the supernatant of blood cells and coagulated components after leaving the blood or centrifuging. Serum contains blood proteins such as albumin and globulin.
  • immunoglobulin or “Ig” is a generic term for proteins having a molecular structure as an antibody. Immunoglobulins are found in serum and body fluids of all vertebrates. During human serum, it is said to have 1 6 to 1 8 m g included per 1 ml. Imnoglobulin has a sugar chain, and it is said that this sugar chain plays an important role in biological activity.
  • immunoglobulin G or "Ig G” is a kind of immunoglobulin, which is a major immunoglobulin in amphibian and higher animals and accounts for about 70% of immunoglobulin in humans. It is said that. It is said that it is not included in fish. Its biological properties depend on the animal species and on the subclasses in the IgG. In humans there are four subclasses of I g G 1, I g G 2, 1 ⁇ 0 3 Oyobi 1 8 G 4.
  • a method for preparing serum is well known in the art, in which a collected blood is left or centrifuged to separate a liquid component from a solid component. Blood collection for clinical tests is usually performed using a vacuum blood collection tube. The collected blood is separated into a gel-like substance obtained by coagulating blood cells and coagulation components, and a liquid component (serum) during standing or centrifugation. Separated.
  • Such analysis methods include, for example, physical methods (eg, mass spectrometry, NMR, etc.), chemical methods (eg, analysis of chemical-specific reactions with sugar-specific functional groups, identification of sugar chains) Chromatography utilizing the interaction of various substances, two-dimensional mapping methods combining them, biochemical methods (eg, lectins, antibodies, Atssey using the specificity of enzymes, etc.), biological methods (eg, And Atsushi, which examines the affinity, priority, etc. of a microorganism for a certain sugar), but is not limited thereto.
  • physical methods eg, mass spectrometry, NMR, etc.
  • chemical methods eg, analysis of chemical-specific reactions with sugar-specific functional groups, identification of sugar chains
  • Chromatography utilizing the interaction of various substances
  • two-dimensional mapping methods combining them
  • biochemical methods eg, lectins, antibodies, Atssey using the specificity of enzymes, etc.
  • biological methods eg, And Atsushi, which
  • a sample containing a sugar chain is prepared and then the sample is subjected to mass spectrometry.
  • Methods for mass spectrometry are well known in the art and include, but are not limited to, MALDI-TOF and the like. Those skilled in the art can appropriately modify such methods and use them in the present invention. With such mass spectrometry, it is usually possible to analyze samples up to lOpmo1 level, more usually up to 100pmo1. An exemplary method is described below.
  • the sample used for mass spectrometry can be provided by analyzing by a technique such as chromatography and electrophoresis. Techniques such as chromatography are well known in the art.
  • chromatography refers to the use of a difference in mobility (partition equilibrium) in a carrier (stationary phase) from a sample of a mixture to identify a specific target substance or target substance group in the sample. A method of separating from another substance or group of substances. Therefore, the sample Any technique is within the scope of chromatography as long as separation is achieved. Chromatography can be used, for example, to separate a target substance from a mixture, or to perform a qualitative or quantitative analysis of a target substance. For example, electrophoretic techniques, not usually referred to as chromatography, are also within the scope of chromatography herein, as they can usually separate at least one component in a sample.
  • the stationary phase can usually be a liquid or a solid.
  • the mobile phase can usually be a liquid or a gas.
  • a sample is adsorbed to one end of a stationary phase or mobile phase such as an adsorbent, and a suitable solvent (mobile phase) is moved to this, the components in the sample become stationary phase (there is a stationary phase such as the surface or inside of the stationary phase).
  • a suitable solvent mobile phase
  • the mobile phase is liquid, it is also called liquid chromatography.
  • liquid chromatography also includes HPLC, FPLC (registered trademark), etc.) and gas chromatography (eg, GLC, GSC, etc.) are classified according to whether the mobile phase is liquid or gas.
  • gas chromatography eg, GLC, GSC, etc.
  • GPC gel permeation chromatography
  • GFC gel filtration chromatography
  • the stationary phase are classified into types such as column chromatography, thin-layer chromatography, and paper chromatography.
  • the method of the invention can be used in any form of chromatography.
  • the stationary phase and the mobile phase can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose of using the chromatography.
  • Such stationary and mobile phases The selection of is well known in the art, and is described in, for example, "Basics and Experiments of High Performance Liquid Chromatography for Life Science", edited by Terumasa Nakagawa, Keisuke Makino, and Hirokawa Shoten.
  • Preparation of a sample containing a sugar chain may be performed by separating a sugar chain or a substance containing a sugar chain using a lectin, an antibody, or the like. Various separations can be performed by using desired stringency conditions according to the purpose.
  • separating a sugar chain or a sugar chain-containing substance in a sample means that the sugar chain or sugar chain-containing substance is substantially separated or purified from a state existing in the sample before separation. To do. Therefore, in the sugar chain or the sugar chain-containing substance separated from the sample, the content of the sugar chain or the substance other than the sugar chain-containing substance contained before separation is at least reduced. Therefore, in the analysis of the sugar chain structure of the present invention, it is preferable to use a sample containing such a separated sugar chain or sugar chain-containing substance.
  • “desired stringency (conditions)” refers to conditions under which the interaction between a substance that specifically interacts with a sugar chain and a sugar chain or a sugar chain-containing substance is not dissociated. . Such conditions are determined using various techniques such as reagents, carriers, bran or sugar chain-containing substances, substances that specifically interact with sugar chains, and the interactions to be formed, using techniques well known in the art. A person skilled in the art can select an appropriate one while taking into account the above. For example, if the interaction is a covalent bond, the desired stringency may be rinsing with water (eg, ultrapure water) or a buffer (eg, acetate buffer).
  • water eg, ultrapure water
  • a buffer eg, acetate buffer
  • two-dimensional map method “two-dimensional mapping method”, “three-dimensional map method”, “2 / 3-dimensional map method” or “multidimensional map method” are used interchangeably, and two or more types of chromatographs are used. Analysis is performed in combination with the use of graphography. Preferably, such chromatography is of a different type (eg, a hydrophobic chromatograph). , Normal-phase chromatography, abundance chromatography, etc.). In addition to these techniques, nuclear magnetic resonance (NMR), mass spectrometry, spectroscopy, methylation analysis, lectin affinity analysis, and their combination with exoglycosidase digestion were also used to separate each of the two-dimensional mappings. It is often used to clearly analyze the sugar chains, and can be used alone or in combination in the practice of the present invention.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • Two-dimensional mapping can analyze a very wide range of N-linked glycan structures of glycans.
  • human IgG contains various diantennary sugar chains, insect and plant glycoproteins produce xylose-containing sugar chains, and erythropoietin-derived sugar chains are G a1 j31-4G It has a 1cNAc repeat unit or Gali31_3GlcNAc sequence, and porcine hamster caridinogenase has three and four antenna sugar chains and galactose that have variations at galactose residues. Includes sugar chains substituted with N-acetyl galactosamine.
  • the two-dimensional map method can handle sugar chains having such various structures.
  • N-linked sugar chains can be released from glycoproteins by both chemical and enzymatic methods.
  • the most reliable chemical method is hydrazinolysis. Hydrazine degradation was first reported by Matsushima and Fujii (Bull. Chem. Soc. Jpn., 30, 48, 1957) and was described by Takasaki et al. (Methods in Enzymology Ginsburg, V., Ed., Academic Press, New York, 1982, 263). Devices and reagent kits that can easily degrade hydrazine are also commercially available.
  • enzymatic methods mainly utilize glycoamidase digestion.
  • Enzymatic N-glycan release can be achieved by using the endo-- --acetyldarcosaminidase first discovered by Koide and Muramatsu et al. (J. Biol. Chem., 249, 4897, 1974). Dalicoamidase, which has a wide range of substrate specificities and does not leave N-acetyldarcosamine residues in the protein, is generally used. Glycoamidase was discovered by Takaha shi (Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 1194, 1977) and is widely marketed as glycopeptidase, peptide-N-glycosidase, N-glycosidase, glycoamidase, etc. It's being used.
  • Glycoamidases sold on the market include glycoamidase A derived from almond and glycoamidase F derived from microorganisms (Flavobacterium). Glycoamidase F is known to be less likely to act on the sugar chain structure of ⁇ -1,3-linked fucose to the reducing terminal N-acetyldarcosamine found in plants and insects, but both are sufficient for glycopeptide substrates. And the dissociation of sugar chains is usually almost quantitative.
  • the preparation of a glycopeptide suitable for digestion by glycoamidase the present inventors exemplify the following method. For sialic acid-containing glycoproteins, heat denature the glycoprotein (eg, about 2%) at neutral pH (eg, 100 ° C, 10 minutes).
  • trypsin and chymotrypsin eg, 1100 weight of substrate each
  • buffer pH 7-8
  • Incubate for 1 to 2 days preferably in the presence of 10 mM Ca 2+ .
  • a 2% solution of S-carboxamide methylated glycoprotein may be digested with thermolysin (1Z50 to 1/100% by weight of the substrate) at pH 7 to 8 and 80 ° C for 40 minutes. This process of degrading the bran protein into glycopeptides reduces steric hindrance and makes the enzyme more responsive to sugar chains, but may be omitted in some cases.
  • protease digestion is stopped by heating at 100 ° C for 10 minutes at neutral pH and used directly for glycoamidase digestion. If sufficient sample is obtained, the protease digestion mixture can be chromatographed, for example, using a Sephadex® G-25 column to purify the glycopeptide prior to glycoamidase digestion.
  • the bran peptide sample has a sugar content of 20 1 / 100m M citrate monophosphate buffer (pH 5-6), and dissolve in glycoamidase A solution (0.2 mU / l 0 ⁇ 110 OmM citrate monophosphate buffer ( ⁇ 5-6 ) ( May be phosphate buffer, acetate buffer, or Tris-HC 1 buffer).
  • glycoamidase A solution 0.2 mU / l 0 ⁇ 110 OmM citrate monophosphate buffer ( ⁇ 5-6 ) (May be phosphate buffer, acetate buffer, or Tris-HC 1 buffer).
  • the reaction mixture is incubated at 37 ° C for 5 to 16 hours.
  • the glycoamidase F is allowed to act on the glycopeptide treated with trypsin and chymotrypsin, add 0.2 U of a glycoamidase F solution per lOOnmol of glycan at near neutral pH and add 1 to 24 at 37 ° C. Time incubate.
  • the amount of enzyme used may be increased.
  • the released sugar chains are subjected to purification, desalting, etc. according to the following analysis methods. For example, treatment with an enzyme such as pronase, which degrades a peptide to amino acid units after releasing the sugar chain, and reducing the molecular weight of the peptide makes it easier to purify the sugar chain by gel filtration dione exchange or the like.
  • an enzyme such as pronase
  • enzymatically or chemically hydrazine For 0-linked sugar chains, enzymatically or chemically hydrazine (Kuraya & Hase, J. Biochem.) Such as 0-glycosidase (Iwase et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151, 422, 1988). , 112, 122, 1992) can be used to release sugar chains. Glycolipids are widely analyzed without releasing their sugar chains. Similarly, enzymatically or chemically, such as endoglycoceramidase (Ito & Yamagata, J. Biol. Chem., 264, 9510, 1989). It can also liberate sugar chains. When these sugar chains are not subjected to a cleavage treatment, free sugar chains can be analyzed.
  • Labeling methods include a method using a radioisotope such as tritium, and a method of binding a compound having fluorescence or ultraviolet absorption such as 2-aminoviridine or octyl ester of 4-aminobenzoate. Fluorescence detector, ultraviolet detector, scintillation counter, etc. detect with high sensitivity. Even unlabeled sugar chains can be detected by a differential refractometer, a pulsed-ambometry detector, a mass spectrometer, or the like.
  • sugar chains are not separated by chromatography, when sugar chains separated by chromatography are detected discontinuously, or when sugar chains are separated by paper chromatography, thin-layer chromatography, electrophoresis, etc.
  • detection methods a method of chemically coloring sugar by the orcinol-sulfuric acid method, etc., and a method of measuring aggregation, coloration, colorimetry, etc. using substances that recognize a specific sugar chain structure such as antibodies and lectins
  • techniques for imaging on films using colorimetric / colorimetric or radioisotope elements, mass spectrometry, NMR analysis, etc. can be used.
  • a method such as a sugar chain chip for profiling a sugar chain by spotting a lectin or antibody that recognizes a specific structure on a substrate can also be used.
  • sugar chain structure analysis methods two-dimensional mapping methods that separate sugar chains that have been fluorescently labeled by two or more types of chromatography and simultaneously estimate the sugar chain structure from their elution positions are widely used. .
  • This method is performed not only for N-type sugar chains, but also for 0-type sugar chains, glycolipid sugar chains, and Dalphins.
  • Several methods have been proposed for N-glycans alone, due to differences in the labeling method, chromatographic method used, standard samples, etc., but only for neutral sugar chains developed by the Takahashi group.
  • glycolipid glycans and 0-linked glycans there is almost no difference in the nomenclature of bran chains among researchers, but various notations are made for N-glycans.
  • the sugar chain structure is referred to by Takahashi et al.'S nomenclature (http: ⁇ ⁇ .gak.co.jp; edited by Reiko Takahashi, Biochemistry Experimental Method 23, Glycoprotein Glycoprotein Research Method, Gakkai Shuppan Center, 1989; Takahash i N, Tomiya N: Analysis of N- linked oligosaccharides: Application of gly coamidase A: in Handbook of endoglycosidases and glycoamidases (Takahashi N, Muramatsu Teds.).
  • the pentasaccharide can be classified as either N-acetyl-lactosamine type, high-mannose type or mixed type, the naming of N-acetyl-lactosamine type has priority.
  • sialic acid If sialic acid is present, write the number of sialic acid residues, then write A if the sialic acid molecular species is N-acetyl neuraminsan, and set a set of unique numbers. Put before the chain structure and connect with-.
  • Examples of such display methods include Lactose j31,4- N-acetyltylcolasamine j31,2-mannose ⁇ 1,3- (mannose al, 3- (mannose ⁇ 1,6-) mannose ⁇ 1,6-) mannose] 31, 4- ⁇ - Acetylda lucosamine ⁇ 1,4-N-acetyltilcosamine with H 5.12, galactose 1,4-N-acetyldarcosamine j31,2-mannose a 1,3- (mannose a 1, 6-) mannose ⁇ 1,4- ⁇ -Acetyl darcosamine ⁇ , 4- ⁇ -Acetyl glucosamine to 100.4, galactose] 31,4- ⁇ -Acetyl darcosamine j31,2-Mannose a 1,3- (Mannose a 1,3- (Mannose a; 1, 6-) Mannose a 1, 6-) Mannose j31, 4-N-Acetylda lucosamine 1,4-
  • Reducing reagent sodium dichloropropanohydride (A1dricChChemica1Co.) 2 Omg of water added with 121 in water (prepared before use)
  • Glycan structure determination is mainly performed by high performance liquid chromatography (HPLC) and partial enzymatic digestion, but in some cases several techniques (methylation, nuclear magnetic resonance (NMR), and mass spectrometry (MS)) Is implemented in combination.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • MS mass spectrometry
  • the separation of the PA sugar chain can be performed by HP LC using the following three types of columns.
  • Step 3 Size fractionation using a TSK-GEL Amide_80 column (0.46 x 25 cm, Tosoh) HP LC:
  • PA sugar chains are detected by fluorescence using excitation and emission wavelengths of 320 nm and 400 nm, respectively. Detection of various types of PA glycans is approximately equivalent on a molar basis. Therefore, the peak area of each PA sugar chain reflects the molar amount of the sugar chain.
  • the HPLC chart of the sugar chain separation in the above three steps is as shown in FIG. 12 (see Anal. Biochem. 226, 130-, 1995).
  • Figure 12 shows the elution positions of more than 150 types of PA glycans on two HPLC columns (ODS-silica column and amide-silica column) for neutral glycans (neutral glycans). 2D map).
  • This elution position is reproducible when analyzed under the same conditions as described above, and the sugar chain structure can be estimated from the elution positions of the 0DS column and the amide column.
  • the difference in elution position increases when the type of first-class column is different, but elution is almost the same with Nakanopack (Nakano Vinegar), CDS and HRC (Shimadzu) 0DS force ram 6 x 15 Omm High reproducibility.
  • the sugar chain structure can be estimated from the elution positions of the 0DS column and the amide column even for the sugar chains separated by the number of sialic acid residues in the first step. In this way, the sugar chain structure is estimated by comparing with the known sugar chain elution position.
  • the digested structure is digested with various daricosidases to confirm the correct structure.
  • the first step it is classified as a neutral sugar chain, and peak E in the 0DS column analysis is 20.4 (Gal ⁇ 1, -GlcNAc ⁇ 1, 2 to Man a 1, 3- (Gal ⁇ 1, 4-GlcNAc 1, 2-Mana 1, 6-)) Mani3 1, 4-GlcNAc It was estimated to be ⁇ 1, -GlcNAc).
  • B and C were successively treated with ⁇ -galactosidase, ⁇ - ⁇ -acetylhexosaminidase, and Arthrobacter-derived sialidase.
  • 3 Man ⁇ 1, 6-
  • Man 1 4-GlcNAc jS 1, 4- GlcNAc
  • C is 100.3
  • Man «1, 3 (Gal ⁇ 3 1, 4-GlcNAc ⁇ 1, 2-
  • the elution position was similar to that of Man a 1, 6-) Man ⁇ 1, 4-GlcNAc J31,4-GlcNAc) (see Fig. 13, Anal. Biochem. 226, 130-, 1995).
  • B is NANA ⁇ 2,6-Gal31,4-GlcNAc) 31,2-Mana1,3 (GlcNAc ⁇ 1,2-Mana1,6-) Man] 31,4 -GlcNAc 1,4-GlcNAc (1A1-200.4) and C is GlcNAc ⁇ 1,2-Man a 1,3 (NANA a 2,6-Gal ⁇ 1,4-GlcNAc ⁇ 1,2-Man a 1, 6-) Man ⁇ 1, 4-GlcNAc ⁇ 1, 4-GlcNAc (1A2-200.4) and its structure were determined, and B was confirmed by NMR analysis ( Figure 14, Anal. Biochem. 226, 130-, 1995).
  • sample refers to any source from which the analysis of at least one component (preferably, a sugar chain or a sugar chain-containing substance) is intended.
  • a sample in particular, whole serum can be used.
  • the use of sugar chains in whole serum for diagnosis has not been known so far and can be said to be a remarkable effect.
  • the sample may be, but is not limited to, taken from all or part of an organism.
  • the sample may have been synthesized by a synthesis technique. The use of a sample synthesized by such a synthesis technique as a sample is useful, for example, when collecting standard data, or when measuring metabolism of sugar chains or binding to living organisms.
  • a serum prepared by a preparation method well known in the art can be used as it is, but it may be easily purified. Therefore, any preparation method may be used as a sample preparation method as long as the method does not adversely affect the analysis of a sugar chain as an object to be analyzed.
  • a preparation method for example, a supernatant obtained by collecting blood from a vein and then performing centrifugation (for example, 2000 X g) can be used as a serum sample.
  • biomolecule refers to a molecule associated with a living organism.
  • a sample containing such a biomolecule may be particularly referred to herein as a biological sample.
  • organ refers to a biological organism, including, but not limited to, animals, plants, fungi, viruses, and the like. Therefore, a biomolecule includes, but is not limited to, a molecule extracted from a living body, and is included in the definition of a biomolecule as long as it is a molecule that can affect a living body.
  • biomolecules include proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, amino acids, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (e.g., DNA such as cDNA, genomic DNA, mRNA, etc. , Polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, lipids, small molecules (eg, hormones, ligands, signal transducers, Molecules, etc.), and these complex molecules are included, but not limited thereto.
  • the biomolecule is preferably a sugar chain or a complex molecule containing a sugar chain (eg, glycoprotein, glycolipid, etc.), but any biomolecule that reflects the sugar chain structure contained therein.
  • a sugar chain eg, glycoprotein, glycolipid, etc.
  • any biomolecule that reflects the sugar chain structure contained therein e.g, even if the biomolecule itself does not have a sugar chain, it can be used in the present invention.
  • the source of such a biomolecule is not particularly limited as long as it is a material to which a sugar chain derived from a living organism is attached or attached, and it is not limited to animals, plants, bacteria, and viruses. More preferably, an animal-derived biological sample is used.
  • a liquid sample containing a sugar chain component such as a glycoprotein such as whole blood or plasma is used, and more preferably, serum is used.
  • the term "correlation" between the sugar chain structure and information on a disease refers to a certain sugar chain structure (preferably, information on a quantitative change in the sugar chain structure) or specific information on the change, and the disease level. Is referred to as a correlation. Such a relationship is called a correlation. Conventionally, the correlation between the sugar chain structure at the serum level and the disease level has not been known so far, and in the present invention, the discovery of such a correlation can be said to be a special effect.
  • the correlation is defined as a change (increase or decrease) or degree of change (change amount) of at least one sugar chain structure and a change in a cell, tissue, organ, secretion or living body (eg, disease state). ), For example, by associating the increase or decrease or appearance or change of a certain sugar chain structure with the level or appearance or change of a disease state.
  • the number of carbohydrate structures used for the correlation may be as small as the correlation can be performed, usually at least one, preferably at least two, more preferably at least three It is not limited to.
  • mathematical processing may be performed using a determinant.
  • the As shown it may be sufficient to observe at least one sugar of a particular species and use it for correlation. Therefore, when the level of a specific sugar chain in serum is associated with a disease, the disease can be diagnosed by examining the specific sugar chain even if it is of one type.
  • Specific methods of correlation include, for example, a method of statistically processing a specific bran chain and the type of disease, the type and degree of symptoms, and other information useful for diagnosis and treatment and drawing a regression curve. But not limited to them.
  • the term "diagnosis” refers to the identification of various parameters related to the type of disease, type and degree of disorder, physical condition, etc. in the subject, and the current state of such disease, disorder, condition, and drug reaction. Sex prediction, disease state change prediction, or determining the cause.
  • the sugar chain structure can be analyzed and correlated with the disease state, and the disease, disorder, condition, and administration in the subject should be administered using such information.
  • Various parameters can be selected, such as formulation or method for treatment or prevention, such as type and amount of drug.
  • the diagnostic method of the present invention is industrially useful because, in principle, it can use things that have come out of the body, and can be practiced separately from medical staff such as doctors.
  • treatment refers to preventing the deterioration of a disease or disorder when such a condition occurs, preferably maintaining the status quo, more preferably reducing the disease, More preferably, it refers to fluctuating.
  • subject refers to an organism to which the treatment of the present invention is applied
  • pathogenesis refers to a factor associated with a disease, disorder, or condition of a subject (also referred to herein as a “lesion” or a disease in plants).
  • pathogens pathogenic factors including chemicals
  • pathogens pathogenic factors including chemicals
  • pathogens diseased cells
  • pathogenic viruses pathogenic microorganisms
  • physical forces words and situations that have a strong mental effect, lack of sleep
  • Examples include, but are not limited to, biased nutrition and lifestyle.
  • the “disease” targeted by the present invention may be any disease associated with etiology.
  • diseases include cancer, viral or bacterial infections, allergies, high blood pressure, hyperlipidemia, diabetes, heart disease, cerebral infarction, dementia, obesity, atherosclerotic disease, infertility, and psychiatric nerves.
  • Diseases cataracts, progeria, UV radiation hypersensitivity, and the like, but are not limited thereto.
  • disorder targeted by the present invention can be any disorder associated with etiology.
  • cardiovascular diseases eg, anemia (eg, aplastic anemia (especially severe aplastic anemia)), renal anemia, cancerous anemia, secondary Anemia, refractory anemia, etc.), cancer or tumor (eg, leukemia, multiple myeloma), etc .
  • nervous system diseases disementia, Alzheimer's disease, sequelae of stroke, brain tumor, spinal cord injury, etc.
  • Immune system diseases T cell deficiency, leukemia, etc.
  • Motor organs and skeletal diseases fractures, osteoporosis, joint dislocation, subluxation, sprains, ligament damage, osteoarthritis, osteosarcoma, Ewing sarcoma, bone
  • dermatological diseases hairlessness, melanoma, cutaneous malignant lymphoma, angiosarcoma, histiocytosis, bullous disease, pustula, etc.
  • IgG-related disease refers to a condition in which the state of IgG (eg, the state of sugar chains) is related to the symptoms of the disease.
  • diseases include, but are not limited to, rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, allergies, IgA nephropathy, atopic dermatitis, diabetes, liver disease, muscular dystrophy, Schoondalene syndrome, Pegener's granulomas, hypertension, etc. .
  • rheumatoid arthritis is simply referred to as “rheumatoid”, is a systemic disease, and refers to a disease affecting the connective tissue.
  • Arthritis is the main clinical manifestation Arthritis causes thickening of soft tissue in many joints (eg, limbs). Normally, it is said that the synovial tissue covers articular cartilage and erodes cartilage. It is said that joint deformation and destruction often occur.
  • drug refers to a substance used for treating, preventing or prognosing a condition, disorder or disease (or disease).
  • a drug may be used interchangeably with, but not limited to, a medicament, a pesticide, and the like. Therefore, the drug may be a medicament, a pesticide, or a candidate for them, and may include cooling, warming, massage, counseling, X-rays, exercise therapy, surgical surgery, etc. Anything that positively affects the disability is indicated.
  • Targets targeted by the drug include, for example, the subject's own cells, tissues or organs, or pathogenesis (eg, cancer cells, bacteria, fungi, viruses, eukaryotes, etc.). Not limited to them.
  • cancer cells fall into the category of cells of the subject itself and also fall into the category of etiology, but it is understood by those skilled in the art that such duplication has no effect in the interpretation of the present invention.
  • animals preferably mammals such as primates, including humans
  • drugs include, but are not limited to, the following drugs:
  • Central nervous system drugs for example, general anesthetics, hypnotics, sedatives, anxiolytics, antiepileptics, antipyretic analgesics and anti-inflammatory drugs, stimulants, stimulants, antiparkinson drugs, psychiatric drugs, general cold remedies, other Drugs for central nervous system);
  • Peripheral nerve agents eg, local anesthetics, skeletal muscle relaxants, autonomic nerve agents, anticonvulsants, etc.
  • Peripheral nerve agents eg, local anesthetics, skeletal muscle relaxants, autonomic nerve agents, anticonvulsants, etc.
  • Drugs for sensory organs eg, ophthalmic agents, otolaryngological agents, analgesics, etc.
  • Drugs for sensory organs eg, ophthalmic agents, otolaryngological agents, analgesics, etc.
  • Cardiovascular drugs eg, cardiotonic, arrhythmic, diuretic, antihypertensive, vasoconstrictor, vasodilator, hyperlipidemic, other cardiovascular drugs, etc.
  • cardiovascular drugs eg, cardiotonic, arrhythmic, diuretic, antihypertensive, vasoconstrictor, vasodilator, hyperlipidemic, other cardiovascular drugs, etc.
  • Respiratory drugs eg, respiratory stimulants, antitussives, expectorants, antitussive expectorants, bronchodilators, gargles, etc.
  • Gastrointestinal drugs eg, antidiarrheal, anti-intestinal, peptic ulcer, stomachic, antacids, laxatives, enemas, bile drugs, other gastrointestinal drugs
  • Hormonal agents for example, pituitary hormone agents, salivary hormone agents, thyroid gland, parathyroid hormone agents, anabolic steroid agents, adrenal hormone agents, male hormone agents, follicles, luteal hormone agents, mixed hormone agents, other Hormones, etc.;
  • Genitourinary and anal drugs eg, urologic, genital, uterine atrophy, hemorrhoids, other genitourinary and anal drugs
  • Dermatological agents e.g., germicidal disinfectants for dermis, wound protectants, suppurative diseases, analgesic, itching, astringent, anti-inflammatory, parasitic dermatological agents, emollients, hair agents, other dermis Agents;
  • Vitamin preparations for example, vitamin A preparations, vitamin D preparations, vitamin B preparations, vitamin C preparations, vitamin E preparations, vitamin K preparations, mixed vitamin preparations, and other vitamin preparations;
  • Nourishing tonics eg, calcium, minerals, sugars, protein amino acids, organs, infants, other tonics, etc.
  • Blood and body fluids eg, blood substitutes, hemostatic agents, anticoagulants, other blood and body fluid agents
  • Artificial dialysis agents eg, artificial kidney dialysis agents, peritoneal dialysis agents, etc.
  • metabolic drugs eg, drugs for organ diseases, antidotes, addictive drugs, gout treatments, enzyme preparations, diabetes drugs, metabolic drugs not classified elsewhere;
  • Cell enhancers eg, chlorophyll preparations, pigment preparations, other cell enhancers, etc.
  • Oncology drugs eg, alkylating agents, antimetabolites, antitumor antibiotics, antitumor plant component preparations, other oncology agents, etc.
  • Radiopharmaceuticals eg, alkylating agents, antimetabolites, antitumor antibiotics, antitumor plant component preparations, other oncology agents, etc.
  • Allergy drugs eg, antihistamines, stimulants, non-specific immunogen preparations, other allergy drugs, crude drugs and Chinese medicine-based drugs, crude drugs, Kampo preparations, other crude drug-based preparations);
  • Antibiotics eg, act on gram-positive bacteria, act on gram-negative bacteria, act on gram-positive and -negative bacteria, act on gram-positive mycoplasma, act on gram-positive negatives, rickettsia, act on acid-fast bacteria, Those acting on fungi, other antibiotics, etc.);
  • Chemotherapeutic agents eg, sulfa drugs, antituberculosis agents, synthetic antibacterial agents, antiviral agents, other chemotherapeutic agents, etc.
  • Bio products eg, vaccines, toxins, toxoids, antitoxins, anti-levutospira serum, blood products, biological test preparations, other biological products, antiprotozoal agents, anthelmintics, etc.
  • Biological products eg, vaccines, toxins, toxoids, antitoxins, anti-levutospira serum, blood products, biological test preparations, other biological products, antiprotozoal agents, anthelmintics, etc.
  • compositions eg, excipients, ointment bases, solubilizers, flavors, odor corrections, coloring agents, other preparations, etc.;
  • Diagnostic agents eg, X-ray contrast agents, functional test reagents, other diagnostic agents
  • public health agents eg, preservatives
  • Drugs eg, opium alkaloid drugs, coca alkaloid drugs, synthetic drugs, etc.
  • Heating, cooling, ultrasound, radiation such as X-rays, immobilization, counseling, surgical resection, exercise therapy, etc. are not drugs but are preferred and affect the subject in the disease. It is included in "drugs".
  • the term “effective amount” of a drug refers to an amount by which the drug can exert a desired drug effect. As used herein, among such effective amounts, The concentration is sometimes called the minimum effective dose. Such minimum effective amounts are well known in the art, and usually the minimum effective amount of a drug is determined by those skilled in the art, or can be determined by the skilled artisan as appropriate. In determining such an effective amount, an animal model can be used in addition to the actual administration. The present invention is also useful in determining such an effective amount.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to a substance used when producing agricultural chemicals such as pharmaceuticals or veterinary drugs, which does not adversely affect the active ingredient.
  • pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, for example, antioxidants, preservatives, coloring agents, flavorings, and diluents, emulsifiers, suspending agents, Solvents, boilers, extenders, buffers, delivery vehicles, excipients and / or agricultural or pharmaceutical adjuvants.
  • the type and amount of the drug used in the treatment method of the present invention are determined based on the information obtained by the method of the present invention (for example, information on a disease), the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.). It can be easily determined by those skilled in the art in consideration of the patient's age, weight, sex, medical history, form or type of the site of the subject to be administered, and the like.
  • the frequency of applying the monitoring method of the present invention to a subject (or patient) also depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, 'sex, medical history, and treatment. A person skilled in the art can easily determine it in consideration of the progress and the like.
  • the frequency of monitoring the disease state may include, for example, monitoring once every few months (eg, once a week, once a month). It is preferable to conduct monitoring once a week and once a month while monitoring the progress.
  • the “instruction” is a description of a tiller-made treatment method of the present invention for a person who administers such as a doctor or a patient.
  • This instruction describes a word indicating that the medicine of the present invention is to be administered, for example, immediately after or immediately before radiation treatment (for example, within 24 hours).
  • This directive is issued by the competent authority of the country in which the invention is implemented (eg, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan, and the Food and Drug Administration in the United States). (FDA), etc., and specify that it has been approved by its regulatory authority.
  • Instructions are so-called package inserts, which are usually provided on paper, but are not limited to them, for example, in the form of electronic media (eg, homepages provided on the Internet, e-mail). But can be provided.
  • more than one drug may be used in the treatment of the present invention.
  • substances having similar properties or origins may be used, or drugs having different properties or origins may be used.
  • Information on disease levels for methods of administering more than one such drug can also be obtained by the methods of this effort.
  • Gene therapy can also be performed based on the obtained information on the disease.
  • Gene therapy refers to therapy performed by the administration of an expressed or expressible nucleic acid to a subject.
  • the nucleic acids produce their encoded proteins, which mediate a therapeutic effect.
  • Gene therapy methods can also be used in the present invention.
  • An exemplary method is as follows. Such gene therapy can be used, for example, to alter disease levels.
  • an analysis result of a specific sugar chain structure is correlated with a disease level with respect to an organism, a cultured cell, a tissue, or the like of a similar kind (for example, a mouse for a human)
  • a response is taken if the disease level is correlated
  • the analysis result of the sugar chain structure can be correlated with the disease level.
  • Such matters are described and supported, for example, in Animal Culture Cell Manual, edited by Seno et al., Kyoritsu Shuppan, 1993, and the entire description is herein incorporated by reference.
  • screening refers to selecting a substance or an organism having a specific property of interest from a large number of candidates by a specific operation and / or evaluation method.
  • further drug screening can be performed by using the information on the disease obtained by the present invention.
  • a system using real substances such as in vitro and in vivo may be used, or a library generated using an in silico (computer-based) system may be used.
  • in silico computer-based
  • the present invention provides a method for diagnosing a disease using blood from a subject, comprising: (a) analyzing a sugar chain contained in serum from the subject; and (b) Correlating the analyzed sugar chains with information about a disease,
  • a method is provided.
  • the present invention provides a system for diagnosing a disease using serum from a subject, comprising: (a) means for analyzing a sugar chain contained in serum from the subject; And a means for correlating the sugar chain with information about a disease.
  • a method or means for providing a sample such as serum from a subject is well known in the art, and may be prepared or provided using any technique. In the present invention, it is sufficient for such a sample to be provided in some form, regardless of its preparation method or means.
  • a sample preparation method for example, blood can be collected by collecting blood, and then serum can be prepared by centrifugation. When IgG is required, it can be purified from serum using an affinity column (eg, protein G column).
  • the carbohydrates analyzed by the method or system of the present invention are advantageously species that have been found to behave approximately the same at serum and IgG levels, but Not exclusively. Carbohydrates at serum and IgG levels
  • the present invention does not know the relevance of the behavior, and the present invention eliminates the need to purify IgG, making it possible to easily analyze changes in sugar chains due to diseases. Changes in glycoprotein sugar chains other than the above can be detected at the same time, and it is expected that versatility will be expanded.
  • the present invention shows a remarkable effect in that such a correspondence is shown for the first time. Therefore, the present invention has an effect of achieving diagnosis and tailor-made treatment based on such unexpected findings.
  • the sugar chain structure to be analyzed by the present invention may advantageously include a plurality of sets of sugar chain structures.
  • correlation with disease state information can be examined in more detail. It has not been known that information of a set of a plurality of sugar chain structures derived from serum and information of a disease state can be correlated, and the present invention provides a diagnostic and diagnostic method based on such unexpected findings. It has the effect of achieving tailor-made treatment.
  • the information to be analyzed by the present invention is information on rheumatoid arthritis.
  • Rheumatoid arthritis is caused by changes in the immune-related condition, ie, immunoglobulin, in the subject.
  • immunoglobulin an immune-related condition
  • an attempt has been made to make a diagnosis based on any information relating to the immunogout purine.
  • the state of rheumatoid arthritis is associated with a specific sugar chain of immunoglobulin, and that a part of the change of the specific sugar chain is reflected in serum. It eliminates the need to purify glycoproteins from glycerol and has tremendous advantages in diagnosis and tailor-made therapy.
  • the sugar chain structure in which the method and system of the present invention is subject to analysis is N-linked sugar chain, more preferably, a c such sugar chains is terminated G a 1-deficient sugar chain Examples include, but are not limited to, code number 210.1, code number 210.2, and code number 210.3.
  • the subject targeted by the method and system of the present invention is a mammal, and more preferably, a model animal (eg, a primate (monkey, etc.), a rodent (mouse, rat, etc.)). And most preferably human. When a model animal is used as a subject, it is possible to provide an indication of information on a disease state in another animal (for example, a human).
  • samples serum obtained from humans can be used not only by direct analysis but also through other processes.
  • the subject to be analyzed is a subject intended to undergo treatment or prevention.
  • subjects that are not intended to be treated, prevented, etc., to generally provide information on the level of the disease state can also be analyzed.
  • the analysis of the glycan structure in the method or system of the present invention includes the analysis of information on the quantitative change of a plurality of glycan structures or related information thereof.
  • the analysis of the information on the quantitative change of a plurality of glycan structures or the related information includes analyzing the absolute amount of each glycan structure and analyzing the relative amount of the plurality of glycan structures. Means for doing so include, but are not limited to.
  • analyzing such a change in amount may be one feature.
  • the relative amount to a sugar chain or other substance as a standard may be analyzed.
  • the correlation includes, but is not limited to, a correlation between a disease state and information on quantitative changes in a plurality of sugar chain structures or analysis of related information thereof. Methods and means for performing such correlation can be performed using techniques known in the art.
  • the analysis of the information on the quantitative change of the sugar chain structure to be analyzed or its related information includes, for example, the absolute amount, relative amount (relative ratio) of a plurality of sugar chain structures, a certain standard substance (for example, galatatose ⁇ 1 , 4 - ⁇ -Acetyldarcosamine ⁇ ⁇ , 2 -mannose a 1,3- (galactose ⁇ 1,4- ⁇ -acetyldarcosamine 1,2-mannose ⁇ 1,6-) mannose ⁇ 1,4 - ⁇ - ⁇ cetyl Darco Sa Min 1, 4- ⁇ - ⁇ cetyl Darco sugars and I g G, such as Sa Min, trans Relative to a specific protein such as ferrin), and the units thereof include, but are not limited to, weight, volume, mole, and carbon atom weight.
  • a certain standard substance for example, galatatose ⁇ 1 , 4 - ⁇ -Acetyldarcosamine ⁇ ⁇ , 2 -man
  • the sugar chain structure to be subjected to sugar chain analysis in the method and system of the present invention includes asparagine-linked sugar chain (N-linked bran chain).
  • An asparagine-linked sugar chain is a sugar chain linked as an N-glycoside to an asparagine residue. It is known that this type of sugar chain can be processed into various structures by complex and elaborate biosynthetic pathways. Biosynthetic intermediates or various mature sugar chains at each stage are used to regulate the function of cells, to form mature proteins such as intracellular transport, to function in proteins such as intercellular recognition, etc. It is known to play a role in various situations, such as incorporation of proteins into hepatocytes.
  • the sugar chain structure targeted by the present invention may be an O-linked sugar chain (also referred to as O-darican).
  • O-linked sugar chain examples include N-acetylgalactosamine, N-acetyldarcosamine, a mucin-type sugar chain in which galactose or a sugar chain containing them is bound to serine or threonine, mannose, or N-acetyldarcos.
  • Examples include, but are not limited to, sugar chains in which samin binds to serine or threonine, and sugar chains in which galactose binds to hydroxylysine. Since glycoproteins having O-linked sugar chains have also been suggested to have functions of controlling signal transduction or cell-cell adhesion, these mucin-type sugar chains are also important sugar chain structures targeted by the present invention. Possible The
  • the present invention may advantageously further comprise a method or means for correlating the results of the glycan analysis at the IgG level with the results of the glycan analysis at the serum level, although not necessarily. It is not necessary. Such correlations can be made by comparison of relative or absolute amounts.
  • the present invention is characterized in that an IgG G level analysis result is unnecessary in principle, but may include such an IgG G level analysis result.
  • the present invention further comprises, but is not necessarily required to, perform a glycan analysis at the IgG level.
  • the sugar chain analysis of IgG can be performed in the same manner as for serum.
  • a method known in the art for example, a combination of an affinity column or a chromatography column can be used.
  • the analysis of the sugar chain structure used in the present invention includes an analysis by mouth chromatography.
  • chromatographic analysis is preferred because, for example, the separation and purification of sugar chains and the analysis can be performed simultaneously, and the quantification is good.
  • high-sensitivity analysis systems such as fluorescent labeling by reductive amination with aminoviridine have been established, and chromatographic analyzers are relatively easy to handle and are widely used.
  • Samples used for pattern analysis can be directly used for detailed sugar chain structure analysis.
  • it is advantageous to use at least two types of chromatography columns eg, ODS column, amide column, etc.).
  • the analysis of the sugar chain structure used in the present invention includes a mass analysis. It is preferable to use mass spectrometry because, for example, the amount of information is large because the analysis time is short and the resolution is high. In addition, the obtained data can be easily converted to digital, which is suitable for processing by a computer.
  • examples of a method for analyzing a sugar chain structure include, but are not limited to, a method using a sugar chain array and a sugar chain replica.
  • FIG. 11 shows an example of a computer configuration for executing the diagnosis method of the present invention or a system for realizing the same.
  • FIG. 11 shows a configuration example of a computer 500 that executes the diagnostic method of the present invention.
  • the computer 500 includes an input unit 501, a CPU 502, an output unit 503, a memory 504, and a bus 505.
  • the input unit 501, the CPU 502, the output unit 503, and the memory 504 are interconnected by a bus 505.
  • the input unit 501 and the output unit 503 are connected to an input / output device 506.
  • correlation program and selection program are stored in the memory 502, for example.
  • the correlation program and the selection program can be used independently or together of any type of recording medium, such as floppy disks, MOs, CD-ROMs, CD-Rs, DVD-ROMs. Can be recorded on the body.
  • correlation program and / or selected programming recorded on good c such recording medium be stored in the application server ram, input and output devices 506 (e.g., disk drives, network (e.g., the Internet)) and
  • the computer 500 executes the correlation method and / or the selection method of the present invention by executing the correlation program and / or the selection program by the c CPU 502 loaded into the memory 504 of the computer 500 via the computer 500.
  • the input unit 501 Through the input unit 501, the result of the analysis of the sugar chain structure (for example, sequence information, level, amount, etc.) and information on a disease are input. If necessary, secondary information such as a condition, a disorder or a disease that is correlated with the sugar chain, and information on treatment and / or prevention may also be input.
  • the CPU 502 correlates the information on the sugar chain structure with the disease level based on the information input at the input unit 501, and stores the correlation data in the memory 504. Thereafter, CPU 502 may store such information in memory 504. After that, the output unit 503 outputs information on the disease level selected by the CPU 502 as diagnostic information.
  • the output data can be output from the input / output device 506.
  • the present invention relates to a method for treating a subject or preventing a disorder by diagnosing the serum using the serum from the subject, comprising: Analyzing the sugar chains contained therein; (b) correlating the analyzed sugar chains with information on the disease; and (c) performing appropriate treatment or prevention depending on the information on the disease. And c) providing the means to the subject.
  • the present invention provides a method for treating or preventing a subject depending on the level of a disease in the subject.
  • the method includes the steps of (a) analyzing a sugar chain structure contained in a sample (eg, serum) from a subject; (b) correlating the analyzed sugar chain structure with a disease level; and And (c) subjecting the subject to treatment or prevention depending on the level of the disease.
  • a sample eg, serum
  • the present invention provides a system for treating or preventing a subject by diagnosing using serum from the subject, comprising: (a) means for analyzing a sugar chain contained in serum from the subject; (B) means for correlating the analyzed sugar chain with information on the disease; and (c) means for providing the subject with appropriate treatment or prevention means according to the information on the disease.
  • the present invention provides a system for treating or preventing a subject depending on the level of the disease in the subject.
  • This system (a) converts a sample (eg, serum) from a subject Means for analyzing the sugar chain structure contained therein; (b) means for correlating the analyzed sugar chain structure with the disease level; and (C) means for subjecting the subject to treatment or prevention corresponding to the disease level. .
  • a sample eg, serum
  • a method or means for providing a sample such as serum, IgG or the like from a subject is well known in the art, and is prepared or prepared using any technique. May be provided. In the present invention, it is sufficient that such a sample is provided in some form, and its preparation method or means does not matter.
  • a sample preparation method for example, blood can be collected by collecting blood, and then serum can be prepared by centrifugation. If IgG is required, it can be purified from serum using an affinity column (eg, protein G column).
  • the carbohydrates analyzed by the method or system of the present invention are advantageously species that have been found to behave approximately the same at serum and IgG levels, but Not exclusively.
  • the relationship of the sugar chain between the serum level and the IgG level is not known, and the present invention shows a remarkable effect in that it shows such a correspondence for the first time. Therefore, the present invention has an effect of achieving diagnosis and tailor-made treatment based on such unexpected findings.
  • the sugar chain structure targeted by the present invention may advantageously include a plurality of sets of sugar chain structures. By analyzing a plurality of sets of carbohydrate structures, correlation with disease state information can be examined in more detail.
  • the disease targeted by the present invention is rheumatoid arthritis.
  • Rheumatoid arthritis is an immune-related condition in the subject
  • Conventionally an attempt has been made to make a diagnosis based on any information related to the immunoglobulin due to the change in globulin.
  • the state of rheumatoid arthritis is associated with a specific sugar chain of immunoglobulin, and that a part of the change of the specific sugar chain is reflected in serum. As such, it has tremendous advantages in diagnosis and tailor-made treatment.
  • the sugar chain structure analyzed by the method or system of the present invention is an N-linked sugar chain, and more preferably, a sugar chain lacking a terminal G a1.
  • Examples of such a sugar chain include, but are not limited to, code number 210.1, code number 210.2, and code number 210.3.
  • the subject targeted by the method and system of the present invention is a mammal, and more preferably, a model animal (eg, a primate (monkey, etc.), a rodent (mouse, rat, etc.)). And most preferably human.
  • a model animal eg, a primate (monkey, etc.), a rodent (mouse, rat, etc.)
  • the subject to be analyzed is a subject that is intended to be treated or prevented.
  • subjects that are not intended to be treated, prevented, etc., to generally provide information on the level of the disease state can also be included in the subject.
  • the analysis of the sugar chain structure can use various analysis methods and means, as described in detail elsewhere herein.
  • Those skilled in the art can carry out the present invention with reference to the disclosure in the present specification.
  • the correlation between the analyzed glycan structure and the level of the disease and the means therefor can also be achieved by using various methods and means, as described in detail elsewhere herein.
  • Those skilled in the art can implement the present invention with reference to the disclosure in the present specification. In this case, the correlation can correlate unknown data or correlate with known data.
  • Treatment or prevention of a subject depending on the level of a disease includes, for example, This includes, but is not limited to, administering a drug by selecting a drug corresponding to the disease and prescribing it according to the subject.
  • a method can be performed by a human, such as a physician, or the method can be performed by an automated machine.
  • Such machines can be used to analyze carbohydrate structures, to correlate carbohydrate structures to disease levels, to select treatment or prevention depending on the level of disease, and to respond to such treatment or prevention.
  • any means for analyzing the sugar chain structure can be used as long as it can implement a method for analyzing the sugar chain structure.
  • Such means include physical methods (eg, mass spectroscopy, NMR, X-ray structural analysis, electron microscopy, etc.), chemical methods (eg, the angle of chemical-specific reaction with sugar-specific functional groups).
  • Means for correlating the sugar chain structure with the disease level include, but are not limited to, for example, a computer capable of performing data processing.
  • a correlating means comprises a recording medium on which information about the disease S is stored. Use of such information may facilitate correlation of sugar chain structure with disease level.
  • Means for selecting treatment or prevention according to the level of the disease also include, but are not limited to, for example, a computer capable of performing data processing.
  • such correlating means comprises a recording medium on which information relating to the disease and / or information relating to treatment or prevention is stored. preferable. Use of such information may facilitate treatment or prevention choices.
  • FIG. 11 shows a configuration example of a computer 500 that executes the correlation processing of the present invention.
  • the computer 500 includes an input unit 501, a CPU 502, an output unit 503, a memory 504, and a bus 505.
  • the input unit 501, the CPU 502, the output unit 503, and the memory 504 are interconnected by a path 505.
  • the input unit 501 and the output unit 503 are connected to an input / output device 506.
  • a program for executing the correlation method and / or the selection of the treatment or the prevention (hereinafter, referred to as a correlation program and a selection program, respectively) is stored in the memory 502, for example.
  • the correlation program and the selection program can be used independently or together of any type of recording medium, such as floppy disks, MOs, CD-ROMs, CD-Rs, DVD-ROMs. Can be recorded on the body. Alternatively, it may be stored in an application server.
  • the correlation program and / or the selection program recorded on such a recording medium are loaded into the memory 504 of the computer 500 via the input / output device 506 (for example, a disk drive, a network (for example, the Internet)).
  • the CPU 502 executes the correlation program and / or the selection program
  • the computer 500 functions as a device that executes the processing of the correlation method and / or the selection method of the present invention.
  • the result of the analysis of the sugar chain structure (for example, sequence information, level, amount, etc.) and information on a disease are input.
  • secondary information such as a condition, a disorder or a disease that is correlated with a sugar chain, and information on treatment and / or prevention may also be input.
  • the CPU 502 correlates the information on the sugar chain structure with the disease level based on the information input at the input section 501, and stores the correlation data in the memory 504. Thereafter, the CPU 502 may store the information in the memory 504.
  • the CPU 502 selects an appropriate signal strength based on this information as necessary. Based on the generated correlation data, 'select or create an appropriate treatment or prevention method. This information can also be stored in memory 504.
  • the output unit 503 outputs information on the level of the disease selected by the CPU 502, information on an appropriate treatment or prevention method, and the like.
  • the output data can be output from the input / output device 506.
  • Methods and means for providing a formulated formulation in response to treatment or prevention performed in the method or system of the present invention can be provided using methods or means well known in the art.
  • methods or means well known in the art such methods and measures have been selected for which treatment or prevention should be selected, such selected treatments or prophylaxis may be performed, (Eg, intended use, target disease (type, severity, etc.), symptom, patient age, weight, gender, medical history, type or type of site of subject being administered) and frequency of administration Understand that it is possible to formulate, take into account various laboratory data, formulate and treat the formulation, and understand that such means can be readily configured and used. Such means can be automated or integrated with other means.
  • the means for providing the formulation can also be configured as part of the computer.
  • the sugar chain structure analyzed in the treatment or prevention method and system of the present invention preferably includes a plurality of sets of sugar chain structures.
  • the correlation with disease information can be examined in more detail, thereby enabling more appropriate treatment Or you can choose a preventive method.
  • Set of multiple glycan structures derived from serum It has not been known that the information of the disease can be correlated with the information of the disease, and the present invention achieves the diagnosis and tailor-made treatment based on such unexpected findings. It has the effect of having done. '
  • the treatment or prevention method and system of the present invention is preferably, but not limited to, a method and system utilizing a rheumatoid arthritis drug.
  • Agents that may be used in such treatment or prevention include, for example, in the case of rheumatism, non-steroidal anti-inflammatory analgesics, steroids, immunosuppressants, gold preparations such as sodium gold thiomalate, and antirheumatic drugs such as methotrexate actalit.
  • the treatment or prevention to be selected in the present invention is appropriate for the disease (considering the condition of the patient as necessary). It is advantageous to administer a novel drug to the subject. In such a case, useless treatment or prevention can be avoided because the drug selected in the subject is known in advance to be effective. It is preferable that the drug administered to the subject does not cause another untoward adverse reaction such as renal disorder or allergy to the subject. When such an adverse reaction is caused, even a drug that has been found to be effective may cause harmful effects that are more than effective for the living body itself.
  • the glycan structure to be analyzed comprises at least a glycan selected from the group consisting of code No. 210.1, code No. 210.2 and code No. 210.3. May be included.
  • the disease to be treated may include rheumatoid arthritis.
  • the subject targeted by the treatment or prevention method system of the present invention is a mammal, and more preferably, a beneficial animal (eg, a domestic animal (eg, a pig, a pig, a pig). And most preferably human.
  • a beneficial animal eg, a domestic animal (eg, a pig, a pig, a pig).
  • the subject to be treated or prevented is a subject intended to be treated or prevented.
  • the analysis of the sugar chain structure preferably includes the analysis of information on the quantitative change of a plurality of sugar chain structures or information related thereto.
  • the analysis of the information on the quantitative change of the plurality of glycan structures or the related information is performed by analyzing the absolute amount and other clinical laboratory values such as the relative amount of the glycan structures and the amount of a specific protein. Analyzing the relative amounts of Further, the correlation preferably includes a correlation between the level of the disease and information on the quantitative change of the plurality of sugar chain structures or related information thereof.
  • the target of sugar chain analysis in the treatment or prevention method and system of the present invention may include sugar chains such as asparagine-linked sugar chains, mucin-type sugar chains, glycolipid sugar chains, and proteodaricans.
  • the analysis of the sugar chain structure used in the present invention includes, but is not limited to, mass spectrometry, chromatography, analysis using spectroscopic analysis, and the like.
  • the present invention provides a method for presenting a treatment or prevention according to the condition of a subject by diagnosing using serum from the subject, comprising: (B) correlating the analyzed sugar chain with information on a disease; and (c) performing appropriate treatment or prevention according to the information on the disease.
  • the present invention provides a system for presenting a treatment or prevention depending on the condition of a subject by diagnosing using serum from the subject, wherein (a) the system is included in serum from the subject.
  • Means for analyzing a sugar chain (b) means for correlating the analyzed sugar chain with information on a disease; and (c) means for appropriate treatment or prevention in accordance with the information on the disease.
  • Providing a system comprising:
  • a method or means for providing a sample such as serum or IgG from a subject is well known in the art, and can be prepared or provided by any technique. Good.
  • it is sufficient that such a sample is provided in some form, and its preparation method or means does not matter.
  • a sample preparation method for example, blood is collected by blood collection or the like, and then the serum can be prepared by clarification or centrifugation. If IgG is required, it can be purified from serum using an affinity column (eg, protein G column).
  • the present invention has an effect of achieving diagnosis and tailor-made treatment based on such unexpected findings.
  • the sugar chain structure targeted by the present invention may advantageously include a plurality of sets of sugar chain structures.
  • a plurality of sets of carbohydrate structures By analyzing a plurality of sets of carbohydrate structures, correlation with disease state information can be examined in more detail.
  • Information on a set of multiple glycan structures derived from serum and information on disease status It is not previously known that it can be associated, and the present invention has the effect of achieving diagnosis and tailor-made treatment based on such unexpected findings.
  • the disease targeted by the present invention is rheumatoid arthritis. Since rheumatoid arthritis is caused by changes in the immune-related state, i.e., immunoglobulin, in the subject, conventionally, attempts have been made to diagnose based on any information related to the immunoglobulin. . Rheumatoid arthritis status
  • the sugar chain structure to be analyzed by the method or system of the present invention is an N-linked sugar chain, more preferably a terminal G a1 deficient sugar chain.
  • Examples of such a bran chain include, but are not limited to, code number 20.1, code number 20.2 and code number 20.3.
  • the subject targeted by the method and system of the present invention is a mammal, and more preferably, a model animal (eg, a primate (monkey, etc.), a rodent (mouse, rat, etc.)). And most preferably human.
  • a model animal eg, a primate (monkey, etc.), a rodent (mouse, rat, etc.)
  • the subject to be analyzed is a subject that is intended to be treated or prevented.
  • subjects that are not intended to be treated, prevented, etc., to generally provide information on the level of the disease state can also be included in the subject.
  • Methods and means for analyzing the carbohydrate structure contained in a sample from a subject or a pathogen can employ a variety of analytical techniques, as described in detail elsewhere herein. It can be implemented with reference to the disclosure in the specification. Correlation of the analyzed glycan structure with the level of the disease and the means therefor are also described herein. Various techniques can be used, as described in detail elsewhere herein, and can be implemented by one of ordinary skill in the art with reference to the disclosure herein. In this case, the correlation can correlate unknown data or correlate with known data.
  • Selecting and presenting treatment or prevention according to the level of the disease can be easily performed by those skilled in the art, once given information about the level of such disease.
  • the selection can be presented in any format.
  • the method of selecting and presenting may take the form of, but is not limited to, a physician's prescription.
  • the presentation method may be a paper medium or an electronic medium (for example, a recording medium or a transmission medium (for example, the Internet)).
  • treatment or prevention depending on the level of the disease, and the means therefor, will also be readily apparent to those of skill in the art once given information about such disease levels. Can be implemented. Thus, one of skill in the art can obtain information regarding the level of disease in accordance with the disclosure herein and, based on such information, be able to select and present treatment or prevention. Such treatment or prevention includes, but is not limited to, for example, selecting a drug that is effective for the subject and prescribing the drug in accordance with the subject. Such methods and systems can be implemented by humans, such as physicians, or the methods can be performed by automated machines.
  • Such a machine is at least one means selected from the group consisting of means for analyzing the sugar chain structure, means for correlating the sugar chain structure with the disease level, and means for selecting treatment or prevention according to the disease level. And means for presenting the treatment or prevention so selected, as appropriate.
  • Means of presenting the selected treatment or prevention include, for example, data processing and a monitor connected to present such processed data.
  • Computer but is not limited thereto.
  • a presentation means includes a recording medium in which information on a disease is stored. By using such information, it may be easier to present information about the drug.
  • the sugar chain structure analyzed in the treatment or prevention presentation method of the present invention preferably includes a plurality of sets of sugar chain structures. Analyzing multiple sets of carbohydrate structures from serum allows for more detailed correlation with disease information, so that more appropriate treatment or prevention methods can be selected. Because. It has not been known that information of a set of a plurality of sugar chain structures can be correlated with information of a disease, and the present invention provides diagnosis and tailor-made based on such unexpected findings. This has the effect of providing a method and system for presenting treatment.
  • the present invention further includes a step or means of performing a sugar chain analysis at an IgG level.
  • the sugar chain analysis of IgG can be performed in the same manner as for serum.
  • a method well known in the art for example, a combination of an affinity column or a chromatography column can be used.
  • the method and system for presenting treatment or prevention of the present invention is preferably, but not limited to, a method and system for rheumatoid arthritis.
  • Drugs that may be used in such treatment or prevention include, for example, non-steroidal anti-inflammatory analgesics, steroids, immunosuppressants, gold preparations such as sodium gold thiomalate, antirheumatic drugs such as methotrexate aktarit, hyperthermia Exercise therapy, such as joint range of motion exercises and muscle strengthening training, Examples include, but are not limited to, wearing orthotics, performing operations such as synovial removal and artificial joint replacement, and taking care of life such as keeping the temperature at rest.
  • the treatment is presented in the presentation method of the present invention.
  • the treatment including the selected drug administration is effective in the subject, it is possible to avoid giving unnecessary treatment or prevention.
  • Such an agent in another embodiment, may be a combination of multiple agents or treatments.
  • such agents do not elicit another undesirable adverse reaction, such as renal impairment or allergy, to the subject.
  • another undesirable adverse reaction such as renal impairment or allergy
  • an adverse reaction is caused, even a drug that has been found to be effective may cause an adverse effect that exceeds the effect of effectively acting on the living body itself.
  • drugs that may cause such adverse reactions may be presented.
  • measures to avoid such an adverse reaction for example, administration of a drug to avoid allergy
  • Such adverse reaction avoidance measures can also be selected and performed by those skilled in the art using techniques known in the art.
  • the glycan structure to be analyzed comprises at least a glycan selected from the group consisting of code No. 210.1, code No. 210.2 and code No. 210.3. May be included.
  • the disease to be treated may include chronic joint rheumatism.
  • the subject to be treated by the method of presenting treatment or prevention of the present invention is a mammal, and more preferably, a beneficial 1 (for example, a domestic animal (eg, a domestic animal (pea, stag, poma, etc.)). And most preferably human.
  • the subject to be presented with the treatment or prevention method is a subject that is intended to undergo treatment or prevention.
  • information on drug resistance, constitution, disease, etc. of the subject to be treated or prevented is obtained in advance.
  • such information may be provided once the presentation method is performed.
  • the presentation of such information may be manual or may be in a form automatically input from a recording medium or the like. If the biological information about the subject to be presented is known in advance, such information can be provided stored on a recording medium. With such a presentation method, the subject can know a more appropriate personalized tailor-made treatment.
  • the analysis of the sugar chain structure may include the inclusion of a sugar chain of a species correlated with a serum level of the sugar chain and the disease, and / or the quantitative analysis of a plurality of sugar chain structures.
  • it includes analysis of the change information or its related information.
  • the analysis of such specific types of glycans and / or the analysis of the information on the quantitative change of such a plurality of glycan structures or the related information thereof can be carried out by analyzing the absolute amount and the Analyzing relative amounts.
  • the correlation includes a correlation between information on a disease and information on a quantitative change of the plurality of sugar chain structures or related information thereof.
  • the target of sugar chain analysis in the treatment or prevention method of the present invention may include sugar chains such as asparagine-linked sugar chains, mucin-type sugar chains, glycolipid sugar chains, and proteodaricans.
  • the analysis of the sugar chain structure used in the presentation method of the present invention includes, but is not limited to, analysis using mass spectrometry, chromatography, and spectroscopic analysis.
  • FIG. 11 shows a configuration example of 500 of a computer that executes a process of presenting a treatment or prevention method of the present invention.
  • the computer 500 has an input section 501, a CPU 502, an output section 503, A memory 504 and a path 505 are provided.
  • the input unit 501, the CPU 502, the output unit 503, and the memory 504 are interconnected by a path 505.
  • the input unit 501 and the output unit 503 are connected to an input / output device 506.
  • a correlation program and a selection program are stored in the memory 502, for example.
  • the correlation program and the selection program can be used independently or together with any type of recording medium such as a floppy disk, MO, CD-ROM, CD-R, DV-ROM. Can be recorded on the body. Alternatively, it may be stored in an application server.
  • the correlation program and / or the selection program recorded on such a recording medium are loaded into the memory 504 of the computer 500 via the input / output device 506 (for example, a disk drive, a network (for example, the Internet)).
  • the CPU 502 executes the correlation program and the Z or selection program
  • the computer 500 functions as an apparatus that executes the processing of the correlation method Z or the selection method of the present invention.
  • the input unit 501 Through the input unit 501, the result of the analysis of the sugar chain structure (for example, sequence information, level, amount, etc.) and information on disease are input. If necessary, secondary information such as a condition, a disorder or a disease that is correlated with the sugar chain, and information regarding treatment and prevention or prevention may also be input.
  • secondary information such as a condition, a disorder or a disease that is correlated with the sugar chain, and information regarding treatment and prevention or prevention may also be input.
  • the CPU 502 correlates the information on the sugar chain structure with the disease level based on the information input at the input unit 501, and stores the correlation data in the memory 504. Thereafter, CPU 502 may store such information in memory 504. The CPU 502 selects an appropriate signal strength based on such information as necessary. Based on the generated correlation data, select or create an appropriate treatment or prevention method. This information can also be stored in memory 504. Thereafter, the output unit 503 outputs information on the disease selected by the CPU 502, information on an appropriate treatment or prevention method, and the like. The output data can be output from the input / output device 506.
  • Such output data may be presented in the form of a paper medium, a force presented to the subject or a physician who examines the subject, or an electronic medium (eg, a recording medium or a transmission medium). Can be done. Any form of presentation in such media is possible, but it is preferred to follow regulatory standards. Therefore, it may be preferable to take the form of a prescription or medical chart.
  • Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that produces rheumatoid factor (RF) that recognizes and binds to autoimmune globulin G (IgG).
  • Ig as RF antigen G is a glycoprotein consisting of a dimer of each heavy chain and light chain, and having two N-linked sugar chains linked to Asn297 of two CH2 domains at the Fc site.
  • the IgG sugar chain has a double-stranded complex type sugar chain as shown in Fig. 2, and the ratio of IgG sugar chain in RA patients lacking non-reducing terminal G a1 is lower than that in healthy subjects.
  • Fig. 2 The ratio of IgG sugar chain in RA patients lacking non-reducing terminal G a1 is lower than that in healthy subjects.
  • rheumatic diseases could lead to such structural changes in sugar chains in N-linked sugar chains in whole serum, including other glycoproteins. Therefore, N-linked sugar chains released from all glycoproteins in serum were analyzed and compared with the sugar chain pattern in IgG.
  • the two-dimensional sugar chain map method used in this example will be described.
  • the two-dimensional glycan map method is an analysis method combining two different types of chromatography.
  • an ODS column (Octadecyl silica, manufactured by Shimadzu Corporation) and an amide column (Tosoh Corporation) are used. used.
  • the sugar chain can be separated from the sample, and the sugar chain structure can be analyzed from the elution position.
  • the accumulation of the coordinates of the elution positions of standard sugar chains of known structures using two types of columns is called a two-dimensional map.
  • the sample was prepared as follows. First, blood is collected from patients to be analyzed (fracture patients, osteoarthritis patients, rheumatoid arthritis patients) and healthy subjects using vacuum blood collection tubes, and serum is obtained by cleansing. Further, IgG was separated from the serum sample using MAb TraKit (Amersham Biosciences). For the IgG separated from the serum, the peptide chain was shortened using trypsin and chymotrypsin (Sigma). Next, the sugar chain portion was released from the peptide using N-glycosidase F (Roche). The peptides were decomposed into amino acids using Pronase (Calbiochem). Next, after purification by gel filtration, fluorescent labeling was performed.
  • 2-aminoviridine and sodium cyanoborate (manufactured by Aldrich) were used. After purifying this sample by gel filtration, sialic acid digestion The acid was released. The fluorescent-labeled sugar chains prepared in this way are converted to high-performance liquid chromatographs.
  • the analysis using the ODS column was performed as follows. The flow was performed at 55 ° C. for 1 mlZ. As the eluent, A: 1 OmM sodium phosphate (pH 3.8), B: 0.5% 1-butanol ZA was used. The two eluents were eluted with a linear gradient from 0% to 50% B2 (0 to 60 minutes). Figure 4 shows an example of separation.
  • the analysis was performed using a fluorescence spectrophotometer with excitation light of 320 nm and detection light of 400 nm. Since it has been found that the fluorescence intensity of the pyridylamino sugar chain does not change depending on the sugar chain structure, the peak area in HPLC can be treated as a molar ratio of each sugar chain structure.
  • Fig. 4 shows an example of a profile of IgG sugar chains at 0DS force ram
  • Fig. 5 shows the main sugar chain structures and their quantitative ratios (molar ratios).
  • Fig. 6A shows an example of a profile of a serum sugar chain on a 0DS column
  • Fig. 6B shows a chromatogram of analysis of each peak separated by 0DS using an Amide column.
  • Fig. 7 shows an example of the process of determining the sugar chain structure of each peak by partial enzymatic digestion
  • Fig. 8 shows the history of partial enzymatic digestion of serum-derived sugar chains on a two-dimensional map.
  • Fig. 9 shows the sugar chain structures derived from serum and their ratios (molar ratios).
  • Figure 10 focuses on the specific sugar chains 210.1 and 210.2 + 210.3, and observes the change in their ratio. It was known that 210.1 was increased in IgG sugar chains in rheumatic patients, but in the present study it was also increased in serum, indicating that sugar chain analysis of whole serum is useful for diagnosis of disease. It was suggested. Although not reported so far, the increase in peak A (210.1) and decrease in peak D (210.4) in IgG sugar chains in fractured patients, but marked changes in IgG sugar chains in osteoarthritis patients No decrease was observed in serum sugar chains, but a decrease in 210.1 compared to 210.2 + 3 was observed. Using this rise and fall as an index, serum sugar chain analysis showed that it could be used to diagnose rheumatism and osteoarthritis.
  • IgG sugar chains change in various diseases, and that they are useful for diagnosis of diseases and elucidation of the onset mechanism.However, this test is also useful for diagnosis of diseases in serum sugar chain analysis. It was suggested that there is. Furthermore, in the analysis of serum sugar chains, changes were observed in IgG bran chains, and sugar chain changes were observed even in diseases that could not be detected, suggesting that it is useful for diagnosis of multiple diseases. In addition to the fact that serum is easier to prepare than IgG for sample preparation, diagnosis using serum bran chains is industrially useful.

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Abstract

A simple diagnosis of disorder with the use of whole sera; and tailor made treatment according to the same. In particular, a method of diagnosing disorder with the use of sera, comprising the step of analyzing sugar chains contained in the whole sera from a test body (a) and the step of correlating the analyzed sugar chains with information on disorders (b). Although conventionally, accurate analysis has been infeasible unless purification to IgG level is conducted, sugar chains changing on serum level have now been identified to thereby enable conducting accurate diagnosis without effecting purification.

Description

明 細 書 血清を用いた簡易疾患診断およびテーラーメイド治療 技術分野  Description Simplified disease diagnosis using serum and tailor-made treatment
本発明は、 糖鎖分析を用いたテーラーメイド治療に関する。 より詳細には、 血 清全体の糖鎖分析に基づくテーラーメイド治療に関する。 背景技術  The present invention relates to tailor-made treatment using sugar chain analysis. More specifically, the present invention relates to a tailor-made treatment based on glycan analysis of whole serum. Background art
テーラーメイド治療 （またはオーダーメイド治療） という言葉が近年よく聞か れるようになった。 テーラーメイド治療とは、 患者 （または病因） の特性に合わ せて治療法を選択する方法をいう。  The term tailor-made treatment (or personalized treatment) has become more common in recent years. Tailor-made treatment is a method of selecting a treatment that is tailored to the characteristics of the patient (or etiology).
ゲノム解析が完了した現在、 このゲノム解析に基づいて個人ごとの配列の多様 性が分析されている。 そのような中、 S N P sと呼ばれる個人ごとに異なる配列 の相違が注目されている。 S N P sは、 少なくとも 1塩基異なる塩基配列のこと をいう。  Now that the genome analysis has been completed, the diversity of the sequence for each individual is being analyzed based on this genome analysis. In such a situation, attention has been paid to a sequence difference, which is called SNPs and differs for each individual. SNPS refers to a base sequence that differs by at least one base.
S N P sを用いた診断およびテーラーメイド治療は、 有用であるとの報告があ る反面、 必ずしもすべての症例に有効ではないということも報告されている。 従 つて、 S N P sを利用したテーラーメイド治療にはおのずから限界があることが 指摘されており、 この限界を克服するための解決手段が待ち望まれている。 血清を用いた分析は比較的簡易であり、 多用されているが、 それを糖鎖分析を 行うことによって疾患の診断に用いられた例はほとんど存在してない。 また、 血 清全体の糖鎖を分析することによって診断を試みた例は皆無である。 発明の開示  Although diagnostics and tailor-made treatments using SNPs have been reported to be useful, they have also been reported to be ineffective in not all cases. Therefore, it has been pointed out that there is a limit in tailor-made treatment using SNPs, and a solution to overcome this limitation is awaited. Although analysis using serum is relatively simple and frequently used, there are few cases where it was used for diagnosing diseases by performing sugar chain analysis. In addition, there has been no attempt to make a diagnosis by analyzing the sugar chains in the whole serum. Disclosure of the invention
上記状況にかんがみ、 本発明は、 血清を用いて被検体を簡便に診断し、 それに 応じたテーラーメイド治療を提供することを課題とする。 In view of the above situation, the present invention provides a simple method for diagnosing a subject using serum, and It is an object to provide tailor-made treatment according to the requirements.
上記課題は、 被検体に由来する血清全体を用いて糖鎖を分析した結果、 その糖 鎖の情報と疾患の情報とが本発明者らによつて予想外に相関付けられたことによ つて解決された。 従来は血液サンプルなどから疾患マーカーとなり得る糖タンパ ク質を精製しなければ精確な糖鎖分析ができなかったが、 精製を行っていない血 清を用いることで疾患により変化する糖鎖を同定することができたことから、 疾 患マーカーとなり得る糖タンパク質を精製することなく、 精確に診断を行うこと ができるようになった。 また、 精製後の疾患マーカー糖タンパク質 （例えば、 I gG) と血清レベルとで解析されるべき糖鎖が異なることから、 この診断方法は、 従来になかった効果をもたらす。 すなわち、 多くの種類のタンパク質の糖鎖変化 を解析 るため、 より多くの種類の診断の対象となる疾患に対応づけられた糖鎖 変化を同時に解析することになり、 精確かつ簡便な診断方法が開発されたことに なる。  The problem described above is based on the fact that, as a result of analyzing sugar chains using whole serum derived from a subject, information on the sugar chains and disease information were unexpectedly correlated by the present inventors. Solved. Conventionally, accurate sugar chain analysis could not be performed without purifying glycoproteins that could be disease markers from blood samples, etc., but using unpurified serum to identify sugar chains that change due to disease As a result, accurate diagnosis can be performed without purifying glycoproteins that can serve as disease markers. In addition, since the sugar chains to be analyzed are different between the purified disease marker glycoprotein (eg, IgG) and the serum level, this diagnostic method has an effect that has not been seen before. In other words, to analyze changes in sugar chains of many types of proteins, it is necessary to simultaneously analyze changes in sugar chains associated with more types of diseases to be diagnosed. It has been developed.
従って、 本発明は、 以下を提供する。  Therefore, the present invention provides the following.
(1) 以下の工程：  (1) The following steps:
(a) 被検体からの血清に含まれる疾患マーカーを分析する工程；および (a) analyzing a disease marker contained in serum from the subject; and
(b) 分析された上記疾患マーカーと、 疾患に関する情報とを相関付ける工程、 を包含する、 被検体からの血清を用いて疾患を診断する方法。 (b) a method of diagnosing a disease using serum from a subject, which comprises a step of correlating the analyzed disease marker with information on the disease.
(2) 上記疾患マーカーは、 上記疾患と相関関係がある、 項目 1に記載の方法。 (3) 上記疾患マーカーは、 I gGである、 項目 1に記載の方法。  (2) The method according to item 1, wherein the disease marker is correlated with the disease. (3) The method according to item 1, wherein the disease marker is IgG.
( 4 ) 上記疾患マーカーは、 複数の糖鎖のセットを含む、 項目 1に記載の方法。 (4) The method according to item 1, wherein the disease marker includes a set of a plurality of sugar chains.
( 5 ) 上記疾患は、 慢性関節リゥマチを含む、 項目 1に記載の方法。 (5) The method according to item 1, wherein the disease includes rheumatoid arthritis.
(6) 上記疾患マーカーは、 N結合型糖鎖を含む、 項目 1に記載の方法。  (6) The method according to item 1, wherein the disease marker includes an N-linked sugar chain.
(7) 上記疾患マーカーは、 末端 Ga 1欠損糖鎖を含む、 項目 1に記載の方法。 (8) 上記疾患マーカーは、 コード番号 210. 1、 コード番号 210. 2お ょぴコード番号 210. 3からなる群より選択される糖鎖を少なくとも含む、 項 目 1に記載の方法。 (7) The method according to item 1, wherein the disease marker includes a terminal Ga1-deficient sugar chain. (8) The disease marker includes at least a sugar chain selected from the group consisting of code number 210.1, code number 210.2, and code number 210.3. Method according to item 1.
(9) 上記被検体は、 ヒトである、 項目 1に記載の方法。  (9) The method according to item 1, wherein the subject is a human.
(10) 血清レベルの糖鎖分析と疾患マーカーレベルの糖鎖分析を行う工程を さらに包含する、 項目 1に記載の方法。  (10) The method according to item 1, further comprising a step of analyzing a sugar chain at a serum level and a sugar chain at a disease marker level.
(1 1) 疾患マーカーレベルの糖鎖分析結果と、 血清レベルの糖鎖分析結果と を相関づける工程をさらに包含する、 項目 10に記載の方法。  (11) The method according to item 10, further comprising a step of correlating the results of the sugar chain analysis at the disease marker level with the results of the sugar chain analysis at the serum level.
(12) 上記糖鎖の分析は、 クロマトグラフィーによる分析を含む、 項目 1に 記載の方法。  (12) The method according to item 1, wherein the analysis of the sugar chain includes an analysis by chromatography.
(13) 上記糖鎖の分析は、 少なくとも 2種類のクロマトグラフィー分析を含 む、 項目 1に記載の方法。  (13) The method according to item 1, wherein the analysis of the sugar chain includes at least two types of chromatographic analysis.
(14) 上記糖鎖の分析は、 ODSカラムおよびアミドカラムからなる群より 選択される少なくとも 1つのカラムによる分析を含む、 項目 1に記載の方法。  (14) The method according to item 1, wherein the analysis of the sugar chain includes an analysis using at least one column selected from the group consisting of an ODS column and an amide column.
(15) 少なくとも 1つの糖鎖消化酵素による消化工程をさらに包含する、 項 目 1に記載の方法。  (15) The method according to item 1, further comprising a digestion step with at least one sugar chain digestive enzyme.
(16) 上記血清は前処理なしに分析される、 項目 1に記載の方法。  (16) The method according to item 1, wherein the serum is analyzed without pretreatment.
(1 7) 上記血清は精製工程なしに分析される、 項目 1に記載の方法。  (17) The method according to item 1, wherein the serum is analyzed without a purification step.
(18) 以下の工程：  (18) The following steps:
(a) 被検体からの血清に含まれる疾患マーカーを分析する工程；  (a) analyzing a disease marker contained in serum from the subject;
(b) 分析された上記疾患マーカーと、 疾患に関する情報とを相関付けるェ 程；および  (b) correlating the analyzed disease marker with information on the disease; and
( c ) 上記疾患に関する情報に応じて適切な処置または予防のための手段を上 記被検体に提供する工程、  (c) providing the subject with appropriate treatment or prevention means in response to the information on the above-mentioned disease;
を包含する、 被検体からの血清を用いて診断することによって上記被検体を処置 または予防する方法。 A method for treating or preventing the above-mentioned subject by diagnosing using serum from the subject.
(19) 上記疾患マーカーは、 上記疾患と相関関係がある、 項目 18に記載の 方法。 (20) 上記疾患マーカーは、 I gGに結合する糖鎖である、 項目 18に記載 の方法。 (19) The method according to item 18, wherein the disease marker is correlated with the disease. (20) The method according to item 18, wherein the disease marker is a sugar chain binding to IgG.
(21) 上記疾患マーカーは、 複数の糖鎖のセットを含む、 項目 18に記載の 方法。  (21) The method according to item 18, wherein the disease marker includes a set of a plurality of sugar chains.
(22) 上記疾患は、 慢性関節リゥマチを含む、 項目 18に記載の方法。  (22) The method according to item 18, wherein the disease includes rheumatoid arthritis.
(2.3) 上記疾患マーカーは、 N結合型糖鎖を含む、 項目 18に記載の方法。 (2.3) The method according to item 18, wherein the disease marker includes an N-linked sugar chain.
(24) 上記疾患マーカーは、 末端 Ga 1欠損糖鎖を含む、 項目 18に記載の 方法。 (24) The method according to item 18, wherein the disease marker comprises a terminal Ga1-deficient sugar chain.
(25) 上記疾患マーカーは、 コード番号 210. 1、 コード番号 210. 2 およびコード番号 210. 3からなる群より選択される糖鎖を少なくとも含む、 項目 18に記載の方法。  (25) The method according to item 18, wherein the disease marker contains at least a sugar chain selected from the group consisting of code number 210.1, code number 210.2 and code number 210.3.
(26) 上記被検体は、 ヒトである、 項目 18に記載の方法。  (26) The method according to item 18, wherein the subject is a human.
(27) 血清レベルの糖鎖分析と疾患マーカーレベルの糖鎖分析を行う工程を さらに包含する、 項目 18に記載の方法。  (27) The method according to Item 18, further comprising a step of performing a sugar chain analysis at a serum level and a sugar chain analysis at a disease marker level.
(28) 疾患マーカーレベルの糖鎖分析結果と、 血清レベルの糖鎖分析結果と を相関づける工程をさらに包含する、 項目 27に記載の方法。  (28) The method according to item 27, further comprising a step of correlating a result of the sugar chain analysis at the disease marker level with a result of the sugar chain analysis at the serum level.
(29) 上記糖鎖の分析は、 クロマトグラフィーによる分析を含む、 項目 18 に記載の方法。 ' (29) The method according to item 18, wherein the analysis of the sugar chain includes an analysis by chromatography. '
(30) 上記糖鎖の分析は、 少なくとも 2種類のクロマトグラフィ一分析を含 む、 項目 18に記載の方法。 (30) The method according to item 18, wherein the analysis of the sugar chain includes at least two types of chromatographic analysis.
(31) 上記糖鎖の分析は、 ODSカラムおよびアミドカラムからなる群より 選択される少なくとも 1つのカラムによる分析を含む、 項目 18に記載の方法。  (31) The method according to item 18, wherein the sugar chain analysis includes an analysis using at least one column selected from the group consisting of an ODS column and an amide column.
(32) 少なくとも 1つの糠鎖消化酵素による消化工程をさらに包含する、 項 目 18に記載の方法。  (32) The method according to item 18, further comprising a digestion step using at least one bran chain digestive enzyme.
(33) 上記血清は前処理なしに分析される、 項目 18に記載の方法。  (33) The method according to item 18, wherein the serum is analyzed without pretreatment.
(34) 上記血清は精製工程なしに分析される、 項目 18に記載の方法。 (35) 以下の工程： (34) The method according to item 18, wherein the serum is analyzed without a purification step. (35) The following steps:
(a) 被検体からの血清に含まれる疾患マーカーを分析する工程；  (a) analyzing a disease marker contained in serum from the subject;
(b) 分析された上記疾患マーカーと、 疾患に関する情報とを相関付けるェ 程；および  (b) correlating the analyzed disease marker with information on the disease; and
(c) 上記疾患に関する情報に応じて適切な処置または予防のための手段を提 示する工程、  (c) providing appropriate measures for treatment or prevention according to the information on the above-mentioned diseases,
を包含する、 被検体からの血清を用いて診断することによつて上記被検体の状態 に応じた処置または予防を提示する方法。 A method for presenting a treatment or prevention according to the condition of the subject by diagnosing using serum from the subject.
(36) 以下：  (36) Below:
(a) 被検体からの血清に含まれる疾患マーカーを分析する手段；および (a) means for analyzing a disease marker contained in serum from the subject; and
(b) 分析された上記疾患マーカーと、 疾患に関する情報とを相関付ける手段、 を包含する、 被検体からの血清を用いて疾患を診断するシステム。 (b) A system for diagnosing a disease using serum from a subject, comprising: a means for correlating the analyzed disease marker with information on the disease.
(37) 上記疾患マーカーは、 上記疾患と相関関係がある、 項目 36に記載の システム。  (37) The system according to Item 36, wherein the disease marker is correlated with the disease.
(38) 上記疾患マーカーは、 I gGに結合する糖鎖である、 項目 36に記載 のシステム。  (38) The system according to Item 36, wherein the disease marker is a sugar chain binding to IgG.
(39) 上記疾患マーカーは、 複数の糖鎖のセットを含む、 項目 36に記載の システム。  (39) The system according to Item 36, wherein the disease marker includes a set of a plurality of sugar chains.
(40) 上記疾患は、 慢性関節リゥマチを含む、 項目 36に記載のシステム。 (41) 上記疾患マーカーは、 N結合型糖鎖を含む、 項目 36に記載のシステ ム。  (40) The system according to Item 36, wherein the disease includes rheumatoid arthritis. (41) The system according to Item 36, wherein the disease marker includes an N-linked sugar chain.
(42) 上記疾患マーカーは、 末端 G a 1欠損糖鎖を含む、 項目 36に記載の システム。  (42) The system according to Item 36, wherein the disease marker includes a terminal G a1 deficient sugar chain.
(43) 上記疾患マーカーは、 コード番号 210. 1、 コード番号 210. 2 およびコード番号 210. 3からなる群より選択される糖鎖を少なくとも含む、 項目 36に記載のシステム。 (44) 上記被検体は、 ヒトである、 項目 36に記載のシステム。 (43) The system according to Item 36, wherein the disease marker includes at least a sugar chain selected from the group consisting of code number 210.1, code number 210.2 and code number 210.3. (44) The system according to Item 36, wherein the subject is a human.
(45) 血清レベルの糖鎖分析と疾患マーカーレベルの糖鎖分析を行う手段を さらに備える、 項目 36に記載のシステム。  (45) The system according to Item 36, further comprising means for performing sugar level analysis at a serum level and sugar level analysis at a disease marker level.
(46) 疾患マーカーレベルの糖鎖分析結果と、 血清レベルの糖鎖分析結果と を相関づける手段を備える、 項目 45に記載のシステム。  (46) The system according to item 45, further comprising means for correlating a sugar chain analysis result at a disease marker level with a sugar chain analysis result at a serum level.
(47) 上記糖鎖の分析は、 クロマトグラフィーによる分析を含む、 項目 36 に記載のシステム。  (47) The system according to item 36, wherein the analysis of the sugar chain includes an analysis by chromatography.
(48) 上記糖鎖の分析は、 少なくとも 2種類のクロマトグラフィー分析を含 む、 項目 36に記載のシステム。  (48) The system according to item 36, wherein the sugar chain analysis includes at least two types of chromatographic analysis.
(49) 上記糖鎖の分析は、 ODSカラムおよびアミドカラムからなる群より 選択される少なくとも 1つのカラムによる分析を含む、 項目 36に記載のシステ ム。  (49) The system according to item 36, wherein the analysis of the sugar chain includes an analysis using at least one column selected from the group consisting of an ODS column and an amide column.
(50) 少なくとも 1つの糖鎖消化酵素による消化手段をさらに備える、 項目 36に記載のシステム。  (50) The system according to Item 36, further comprising a digestion means using at least one sugar chain digestive enzyme.
(51) 前記糖鎖を分析する手段は、 前記血清を前処理なしに分析する能力を 有する、 項目 36に記載のシステム。  (51) The system according to Item 36, wherein the means for analyzing the sugar chain has an ability to analyze the serum without pretreatment.
(52) 前記糖鎖を分析する手段は、 前記血清を精製工程なしに分析する能力 を有する、 項目 36に記載のシステム。  (52) The system according to Item 36, wherein the means for analyzing a sugar chain has an ability to analyze the serum without a purification step.
(53) 被検体から血清を採取する手段をさらに備える、 項目 36に記載のシ ステム。  (53) The system according to Item 36, further comprising means for collecting serum from a subject.
(54) 以下：  (54) Below:
(a) 被検体からの血清に含まれる疾患マーカーを分析する手段；  (a) means for analyzing a disease marker contained in serum from a subject;
(b) 分析された上記疾患マーカーと、 疾患に関する情報とを相関付ける手 段；および  (b) means for correlating the analyzed disease marker with information about the disease; and
(c) 上記疾患に関する情報に応じて適切な処置または予防のための手段を上 記被検体に提供する手段、 を包含する、 被検体からの血清を用いて診断することによつて上記被検体を処置 または予防するシステム。 (c) means for providing the subject with means for appropriate treatment or prevention in accordance with the information on the disease, A system for treating or preventing the subject by diagnosing using serum from the subject.
(55) 上記疾患マーカーは、 上記疾患と相関関係がある、 項目 54に記載の システム。  (55) The system according to Item 54, wherein the disease marker is correlated with the disease.
(56) 上記疾患マーカーは、 I g Gである、 項目 54に記載のシステム。 (56) The system according to item 54, wherein the disease marker is IgG.
(57) 上記疾患マーカーは、 複数の糖鎖のセットを含む、 項目 54に記載の システム (57) The system according to item 54, wherein the disease marker includes a set of a plurality of sugar chains.
(58) 上記疾患は、 リゥマチを含む、 項目 54に記載のシステム。  (58) The system according to item 54, wherein the disease includes rheumatism.
(59) 上記疾患マーカーは、 N結合型糖鎖を含む、 項目 54に記載のシステ ム。  (59) The system according to item 54, wherein the disease marker includes an N-linked sugar chain.
(60) 上記疾患マーカーは、 末端 Ga 1欠損糖鎖を含む、 項目 54に記載の システム  (60) The system according to item 54, wherein the disease marker includes a terminal Ga1-deficient sugar chain.
(61) 上記疾患マーカーは、 コード番号 210. 1、 コード番号 210. 2 およびコード番号 210. 3からなる群より選択される糖鎖を少なくとも含む、 項目 54に記載のシステム。  (61) The system according to item 54, wherein the disease marker includes at least a sugar chain selected from the group consisting of code number 210.1, code number 210.2 and code number 210.3.
(62) 上記被検体は、 ヒトである、 項目 54に記載のシステム。  (62) The system according to item 54, wherein the subject is a human.
(63) 血清レベルの糖鎖分析と疾患マーカーレベルの糖鎖分析を行う手段を さらに備える、 項目 54に記載のシステム。  (63) The system according to Item 54, further comprising means for performing sugar level analysis at a serum level and sugar level analysis at a disease marker level.
(64) 疾患マーカ一レベルの糖鎖分析結果と、 血清レベルの糖鎖分析結果と を相関づける手段をさらに備える、 項目 63に記載のシステム。  (64) The system according to item 63, further comprising means for correlating a sugar marker analysis result at a disease marker level with a sugar chain analysis result at a serum level.
(65) 上記糖鎖の分析は、 クロマトグラフィーによる分析を含む、 項目 54 に記載のシステム。  (65) The system according to item 54, wherein the analysis of the sugar chain includes an analysis by chromatography.
(66) 上記糠鎖の分析は、 少なくとも 2種類のクロマトグラフィー分析を含 む、 項目 54に記載のシステム。  (66) The system according to item 54, wherein the analysis of the bran chain includes at least two types of chromatographic analysis.
(67) 上記糖鎖の分析は、 ODSカラムおよびアミドカラムからなる群より 選択される少なくとも 1つのカラムによる分析を含む、 項目 54に記載のシステ ム。 (67) The system according to item 54, wherein the analysis of the sugar chain includes an analysis using at least one column selected from the group consisting of an ODS column and an amide column. Mu.
(68) 少なくとも 1つの糖鎖消化酵素による消化工程をさらに包含する、 項 目 54に記載のシステム。  (68) The system according to item 54, further comprising a digestion step with at least one sugar chain digestive enzyme.
(69) 前記疾患マーカーを分析する手段は、 上記血清を前処理なしに分析す る能力を有する、 項目 54に記載のシステム。  (69) The system according to item 54, wherein the means for analyzing the disease marker has an ability to analyze the serum without pretreatment.
(70) 前記疾患マーカーを分析する手段は、 上記血清を精製工程なしに分析 する能力を有する、 項目 54に記載のシステム。  (70) The system according to Item 54, wherein the means for analyzing the disease marker has an ability to analyze the serum without a purification step.
(71) 上記被検体から血清を採取する手段をさらに備える、 項目 54に記載 のシステム。  (71) The system according to item 54, further comprising means for collecting serum from the subject.
(72) 以下：  (72) Below:
(a) 被検体からの血清に含まれる疾患マーカーを分析する手段；  (a) means for analyzing a disease marker contained in serum from a subject;
(b) 分析された上記疾患マーカーと、 疾患に関する情報とを相関付ける手 段；および  (b) means for correlating the analyzed disease marker with information about the disease; and
(c) 上記疾患に関する情報に応じて適切な処置または予防のための手段を提 示する手段、  (c) means for providing appropriate measures for treatment or prevention according to the information on the above-mentioned diseases;
を備える、 被検体からの血清を用いて診断することによつて上記被検体の状態に 応じた処置または予防を提示するシステム。 A system for presenting a treatment or prevention according to the state of the subject by diagnosing using serum from the subject.
(73) 上記被検体から血清を採取する手段をさらに備える、 項目 72に記載 のシステム。 図面の簡単な説明  (73) The system according to item 72, further comprising means for collecting serum from the subject. Brief Description of Drawings
図 1は、 ィムノグロブリンの構造を示す。  FIG. 1 shows the structure of immunoglobulin.
図 2は、 慢性関節リゥマチにおける糖鎖変化の様子を示す。  Fig. 2 shows changes in sugar chains in rheumatoid arthritis.
図 3は、 二次元マップ法のスキームを示す。  Figure 3 shows the two-dimensional mapping scheme.
図 4は、 ODSカラムによる I gGの N結合型糖鎖の分析結果を示す。 溶離液 FIG. 4 shows the results of analyzing an N-linked sugar chain of IgG using an ODS column. Eluent
A： 1 OmM リン酸ナトリウム （： H3. 8) および溶離液 B ：溶離液 A中の 0. 5% ブタノールを用いて、 流速 1. 0ml/分、 55°Cにて 60分間かけ て溶離液 Bの 20 %〜 50 % 直線勾配により分析した。 励起波長： 320 n m、 発光波長： 400 nmにて検出した。 図中の略語は、 以下の通りである： Ma n ；マンノース、 G 1 c NA c ； N—ァセチルダルコサミン、 Ga l ;ガラクト ース、 F u c ； フコース。 A: 1 OmM sodium phosphate (: H3.8) and eluent B: eluent A The eluent B was analyzed by a linear gradient of 20% to 50% using 0.5% butanol at a flow rate of 1.0 ml / min at 55 ° C for 60 minutes. Detection was performed at an excitation wavelength of 320 nm and an emission wavelength of 400 nm. The abbreviations in the figure are as follows: Man; mannose, G1cNAc; N-acetyldarcosamine, Gal; galactose, Fuc; fucose.
図 5は、 I gGから得られる N結合型糠鎖の分析結果例を示す。 図中の略語は、 以下の通りである： I gG ;ヒ ト I gG (S i gma) 、 BB ;骨折、 OA；変 形性関節症、 RA；慢性関節リゥマチ、 Ma n ;マンノース、 G 1 cNAc ； N ーァセチルダルコサミン、 Ga l ;ガラクトース、 Fu c ;フコース。  FIG. 5 shows an example of analysis results of N-linked bran chains obtained from IgG. Abbreviations in the figure are as follows: IgG; human IgG (Sigma), BB; fracture, OA; osteoarthritis, RA; rheumatoid arthritis, Man; mannose, G 1 cNAc: N-acetyl darcosamine, Gal: galactose, Fuc: fucose.
図 6 Aは、 ODSカラムによる血清の N結合型糖鎖の分析結果例を示す。 溶離 液 A： 10mM リン酸ナトリウム （pH3. 8) および溶離液 B ：溶離液 A中 の 0. 5% プタノールを用いて、 流速 1. Oml/分、 55°Cにて 60分間か けて溶離液 Bの 20 %〜 50 % 直線勾配により分析した。 星印は、 副産物を示 す。  FIG. 6A shows an example of analysis results of N-linked sugar chains in serum using an ODS column. Eluent A: 10 mM sodium phosphate (pH 3.8) and eluent B: eluted with 0.5% butanol in eluent A at a flow rate of 1. Oml / min at 55 ° C for 60 minutes Liquid B was analyzed by a 20% to 50% linear gradient. An asterisk indicates a by-product.
図 6 Bは、 6 Aで得られた慢性関節リゥマチの血清において得られた各ピーク a〜nのアミ ドカラムによる N結合型糖鎖の分析結果例を示す。 溶離液 A： 3 % 酢酸ートリエチルァミン （pH 7. 3) ： ァセトニトリル （35 ： 65 (v/ v) ) およぴ溶離液 B ： 3 %酢酸ートリエチルァミン （pH7. 3) ： ァセトニ トリル （50 ： 50 (v/v) ) を用いて、 流速 1. Oml/分、 40°Cにて 30 分間かけて溶離液 Bの 0 %〜 60 % 直線勾配により分析した。 励起波長： 32 Onm、 発光波長： 400 nmにて検出した。 星印は、 副産物を示す。 図中の略 語は、 以下の通りである： Ma n；マンノース、 G 1 cNAc ； N—ァセチルダ ノレコサミン、 G a 1 ；ガラクトース、 F u c ； フコース。  FIG. 6B shows an example of the results of analysis of N-linked sugar chains using an amide column with peaks a to n obtained in the serum of rheumatoid arthritis obtained in 6A. Eluent A: 3% triethylamine acetate (pH 7.3): acetonitrile (35:65 (v / v)) and eluent B: 3% triethylamine acetate (pH 7.3): acetonitrile The eluent B was analyzed by a linear gradient of 0% to 60% of eluent B using Tril (50:50 (v / v)) at a flow rate of 1. Oml / min at 40 ° C. for 30 minutes. Detection was performed at an excitation wavelength of 32 Onm and an emission wavelength of 400 nm. Stars indicate by-products. The abbreviations in the figure are as follows: Man; mannose, G1cNAc; N-acetylda norecosamine, Gal; galactose, Fuc; fucose.
図 7は、 部分酵素消化による溶出時間の変化例を示す。  FIG. 7 shows an example of a change in elution time due to partial enzyme digestion.
図 8は、 部分酵素消化による血清の N結合型糖鎖のマップ上の変化を示す。 G FIG. 8 shows changes on the map of serum N-linked sugar chains by partial enzymatic digestion. G
Uは、 グルコース単位を示し、 *は、 副産物を示す。 図 9A〜Bは、 血清から得られた N結合型糖鎖の分析結果例を示す。 図中の略 語は、 以下の通りである ： I gG ; ヒ ト I gG (S i gma) 、 BB ;骨折、 O A ;変形性関節症、 RA ;慢性関節リウマチ。 図中の略語は、 以下の通りであ る ： Ma n ；マンノース、 G 1 c NA c ； N—ァセチルダルコサミン、 Ga l ； ガラクトース、 F u c ； フコース。 U indicates a glucose unit, and * indicates a by-product. 9A and 9B show examples of the results of analysis of N-linked sugar chains obtained from serum. Abbreviations in the figures are as follows: IgG; human IgG (Sigma), BB; fracture, OA; osteoarthritis, RA; rheumatoid arthritis. The abbreviations in the figure are as follows: Man; mannose, G1cNAc; N-acetyldarcosamine, Gal; galactose, Fuc; fucose.
図 10は、 血清と、 I gGとの糖鎖パターンの比較を示す。 血清比較における コントロールは、 ヒト血清 （S i gma) である。 I gG比較におけるコント口 ールは、 ヒト I gG (S i gma) である。 図中の略語は、 以下の通りである ： BB ；骨折、 OA；変形性関節症、 RA；慢性関節リゥマチ、 Ma n ；マンノー ス、 G 1 c NA c ； N—ァセチルダルコサミン、 G a 1 ；ガラクトース、 F u c ；フコース。 リウマチ患者において、 血清中の 210.1、 210.2および 210.3の相 対比を比較した場合、 I g Gと同様な結果が得られた。  FIG. 10 shows a comparison of the sugar chain pattern between serum and IgG. The control in the serum comparison is human serum (Sigma). The control in the IgG comparison is human IgG (Sigma). The abbreviations in the figure are as follows: BB; fracture, OA; osteoarthritis, RA; rheumatoid arthritis, Man: mannose, G1cNAc; N-acetyldarcosamine, Ga 1; galactose, Fuc; fucose. In rheumatic patients, similar results were obtained when comparing the relative concentrations of 210.1, 210.2 and 210.3 in serum.
図 11は、 本発明のコンピュータによる実施例を示す。  FIG. 11 shows a computer-based embodiment of the present invention.
図 12は、 ヒト血清糖タンパク質の P Aオリゴサッカリ ドの種々の H PLC上 のクロマトグラムを示す。 a) は、 ヒト血清糖タンパク質の P Aオリゴサッカリ ド混合物がシアル酸の含量によって、 DEAEカラムで HP LCによる分離され ることを示す。 b) 中性、 モノシアル酸、 ジシアル酸、 およびトリシアル酸のォ リゴサッカリ ドのそれぞれが、 第二の ODSカラムで分離される様子を示す。 c) 分離されたオリゴサッカリ ドを第三のアミ ドカラムに適用した結果例を示す。 矢印は、 標準グルコースオリゴマーの溶出位置を示す。 数は、 グルコース単位数 を示す。  FIG. 12 shows chromatograms of various human serum glycoprotein PA oligosaccharides on HPLC. a) shows that a PA oligosaccharide mixture of human serum glycoproteins is separated by HP LC on a DEAE column depending on the content of sialic acid. b) Neutral, monosialic, disialic, and trisialic acid oligosaccharides are each separated on a second ODS column. c) An example of the result of applying the separated oligosaccharide to a third amide column is shown. The arrow indicates the elution position of the standard glucose oligomer. The numbers indicate the number of glucose units.
図 13は、 ヒト血清糖タンパク質の中性オリゴサッ力リ ドおよぴシアルオリゴ サッカリ ドの構造の同定を示す。 中性オリゴサッカリ ド E (a) 、 モノシァリル オリゴサッカリ B (b) 、 およびモノシァリルオリゴサッカリ ド C (c) の分 析プロセス例を示す。 黒丸は中性オリゴサッカリ ドであり、 白丸はモノシァリル オリゴサッ力リ ドである。 200. 1などはコード番号である。 矢印は、 酵素消 化後のオリゴサッカリ ドの座標移動を示す。 実線矢印は、 ガラクトシダーゼで あり、 破線は —Ν—ァセチルへキソサミニダーゼであり、 点線はシァリダーゼ である。 FIG. 13 shows the identification of the structures of neutral and sialooligosaccharides of human serum glycoproteins. The following is an example of the analysis process for neutral oligosaccharide E (a), monosialyl oligosaccharide B (b), and monosialyl oligosaccharide C (c). Closed circles are neutral oligosaccharides and open circles are monosialyl oligosaccharides. 20.1 and the like are code numbers. The arrow points out the enzyme This shows the coordinate movement of the oligosaccharide after conversion. The solid arrow is galactosidase, the dashed line is -Ν-acetylacetylhexosaminidase, and the dotted line is sialidase.
図 1 4は、 血清糖タンパク質に由来するオリゴサッカリ ド M o n o— B、 D i _Aおよび T r i一 Bならびに標準フエチュインオリゴサッカリ ドの 4 0 O MH z NMRを示す。 発明を実施するための最良の形態  FIG. 14 shows the 40 O MHz NMR of oligosaccharides Mono-B, Di_A and Tri-B derived from serum glycoproteins and standard fetuin oligosaccharides. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
以下、 本発明を説明する。 本明細書の全体にわたり、 単数形の表現は、 特に言 及しない限り、 その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。 また、 本明細書において使用される用語は、 特に言及しない限り、 当該分野で通常用い られる意味で用いられることが理解されるべきである。  Hereinafter, the present invention will be described. It is to be understood that throughout this specification, the use of the singular includes the concept of the plural unless specifically stated otherwise. It is to be understood that the terms used in the present specification are used in a meaning commonly used in the art unless otherwise specified.
(用 Ρπ ) (For Ρπ)
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。  The definitions of terms used particularly in the present specification are listed below.
本明細書において 「疾患マーカー」 とは、 特定の疾患の原因またはその疾患の 結果のいずれかとして生じる分子をいい、 この分子の存在の有無もしくは発現量 の増減を調べることによって、 個体における疾患の存在もしくは疾患に罹患する 危険性が示される。 適切な疾患マーカーとしては、 糖タンパク質、 糖ペプチド、 糖脂質、 ガングリオシド、 糖鎖、 およびこれらから部分的に分解または誘導され た産物が挙げられるが、 これらに限定されない。 好ましい疾患マーカーとしては、 I g Gおよびその Ν結合型糖鎖、 α ι _酸性糖タンパク質およびその N結合型糖 鎖、 一フエトプロテインおよびその Ν結合型糖鎖、 トランスフェリンおよびそ の糖鎖 （Ν結合型糖鎖を含む） 、 y G T Pおよびその Ν結合型糖鎖、 コリンエス テラーゼおよびその N結合型糖鎖、 チログロブリン、 骨型アルカリフォスファタ ーゼぉよびその糖鎖、 血液型物質、 ヒト絨毛性ゴナドトロピンぉよびその N結合 型糖鎖、 癌胎児抗原およびその N結合型糖鎖、 ラクト系糖鎖抗原、 C A 1 9 _ 9、 C A 1 2 5、 ならびにこれらから部分的に分解または誘導された産物が挙げられ る。 As used herein, the term "disease marker" refers to a molecule that is caused either as a cause of a specific disease or as a result of the disease. By examining the presence or absence or increase or decrease in the expression level of this molecule, the disease marker in an individual can be determined. The presence or risk of contracting the disease is indicated. Suitable disease markers include, but are not limited to, glycoproteins, glycopeptides, glycolipids, gangliosides, sugar chains, and products partially degraded or derived therefrom. Preferred disease marker, I g G and Ν-linked sugar chain, alpha iota _ acid glycoprotein and its N-linked sugar chain, mono- Hue preparative protein and Ν-linked sugar chains, transferrin and its sugar chain ( GTP and its G-linked sugar chains, cholinesterase and its N-linked sugar chains, thyroglobulin, bone alkaline phosphatase and its sugar chains, blood group substances, human Chorionic gonadotropin and its N-bond Type sugar chains, carcinoembryonic antigens and their N-linked sugar chains, lactosaccharide antigens, CA19_9, CA125, and products partially decomposed or derived therefrom.
本明細書において 「精製された」 、 「精製されている」 または 「精製」 とは、 資料中のある物質が、 分離前に試料中に存在する状態から実質的に引き離すまた は精製されていることをいう。 従って、 試料から分離された物質は、 分離される 前に含んでいたその物質以外の物質の含量が少なくとも低減している。 その物質 力 この物質の意図された目的を妨げないキャリアまたは希釈剤などとともに存 在する場合もまた、 実質的に精製されたとみなされる。 従って、 「精製された疾 患マーカー」 とは、 分析前に資料中に存在していた疾患マーカー以外の物質が実 質的に減少していることを意味する。  As used herein, the term "purified", "purified", or "purified" means that a substance in a sample substantially separates or is purified from a state existing in a sample before separation. That means. Thus, the material separated from the sample has at least a reduced content of other substances that it contained before being separated. The substance is also considered substantially purified when present with carriers or diluents that do not interfere with the intended purpose of the substance. Therefore, a “purified disease marker” means that substances other than the disease marker that were present in the data prior to the analysis are substantially reduced.
本明細書において 「糖鎖」 とは、 単位糖 （単糖および/またはその誘導体） が 1つ以上連なってできた化合物をいう。 単位糖が 2つ以上連なる場合は、 各々の 単位糖同士の間は、 通常、 グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。 こ のような糖鎖としては、 例えば、 生体中に含有される単糖類 （グルコース （G1 c) 、 ガラクトース （Gal) 、 マンノース （Man) 、 フコース （Fuc) 、 キシロース (Xyl) 、 N—ァセチルダルコサミン （GlcNAc) 、 N—ァセチルガラクトサミン (GalNAc) 、 シアル酸 (SA) ならびにそれらの複合体おょぴ誘導体） の他、 これ らの単糖が複数結合した多糖やオリゴ糖、 糖タンパク質、 プロテオダリカン、 グ リコサミノダリカン、 糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖 など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。 したがって、 本明細書 では、 糖鎖は、 「多糖 （ポリサッカリド） 」 、 「糖質」 、 「炭水化物」 と互換可 能に使用され得る。 また、 特に言及しない場合、 本明細書において 「糖鎖」 は、 糖鎖およぴ糖鎖含有物質の両方を包含することがある。  As used herein, “sugar chain” refers to a compound formed by linking one or more unit sugars (monosaccharides and / or derivatives thereof). When two or more unit sugars are linked, the unit sugars are usually bonded by dehydration condensation through glycosidic bonds. Such sugar chains include, for example, monosaccharides (glucose (G1c), galactose (Gal), mannose (Man), fucose (Fuc), xylose (Xyl), N-acetyl Darcosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc), sialic acid (SA) and their complex derivatives, as well as polysaccharides, oligosaccharides, glycoproteins, It includes a wide range of sugar chains decomposed or derived from complex biomolecules such as proteodalican, glycosaminodalican, and glycolipid, but is not limited thereto. Therefore, in the present specification, a sugar chain can be used interchangeably with "polysaccharide", "carbohydrate", and "carbohydrate". Unless otherwise specified, the term “sugar chain” in this specification may include both a sugar chain and a sugar chain-containing substance.
本明細書において 「単糖」 とは、 少なくとも 1つの水酸基および少なくとも 1 つのアルデヒド基またはケトン基を含む、 ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリ ヒドロキシケトンならぴにその誘導体をいう。 通常単糖は、 一般式 C nH2 n O n で表されるがそれらに限定されず、 フコース （デォキシへキソース） 、 N—ァセ チルダルコサミンなども含まれる。 ここで、 上の式において、 n = 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 1 0であるものを、 それぞれジオース、 トリオース、 テトロース、 ペントース、 へキソース、 ヘプトース、 ォク トース、 ノノースおよ ぴデコースという。 一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当 するもので、 前者をアルドース， 後者をケトースという。 本明細書において特に 言及するときは、 単糖の誘導体は、 置換されていない単糖上の一つ以上の水酸基 が別の置換基に置換され、 結果生じる物質をいう。 そのような単糖の誘導体とし ては、 カルボキシル基を有する糖 （例えば、 C— 1位が酸ィ匕されてカルボン酸と なったアルドン酸 （例えば、 D—グルコースが酸化された D—ダルコン酸） 、 末 端の。原子がカルボン酸となったゥロン酸 （ D—グルコースが酸化された D—グ ルクロン酸） 、 アミノ基またはァミノ基の誘導体 （例えば、 ァセチル化されたァ ミノ基） を有する糖 （例えば、 N—ァセチル一D—ダルコサミン、 N—ァセチル 一 D—ガラク トサミンなど） 、 ァミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する 糖 （例えば、 N—ァセチルノイラミン酸 （NANA、 シアル酸の一種） 、 N—ァセチ ルムラミン酸など） 、 デォキシ化された糖 （例えば、 2—デォキシ一D—リボー ス） 、 硫酸基を含む硫酸化糖、 リン酸基を含むリン酸ィヒ糖などがあるがそれらに 限定されない。 本明細書では、 単糠という場合は、 上記誘導体も包含する。 ある いは、 へミアセタール構造を形成した糖において、 アルコールと反応してァセタ ール構造のグリコシドもまた、 単糖の範囲内にある。 これらの単糖が複数個結合 したものがオリゴ糖若しくは多糖である。 通常グリコシド結合による脱水縮合で あるが、 非還元末端側の糖の結合の方向性により αと ]3、 また夫々のどの位置の 炭素に結合するかにより物性に大きく影響することが知られている。 従って糖鎖 構造と言う場合には、 1, 4結合など結合様式が、 単糖の種類 （構成糖） と共に 重要な情報となる。 オリゴ糖と多糖との間の明確な区分は無いが、 大体 10- 50糖 程度が境界となる。 本明細書では、 特に言及しない限り、 オリゴ糖と多糖とは交 換可能に使用される。 As used herein, the term "monosaccharide" refers to a polyhydroxyaldehyde or a polyhydroxy aldehyde containing at least one hydroxyl group and at least one aldehyde group or ketone group. If it is a hydroxy ketone, its derivative is referred to as ぴ. Usually monosaccharide, is represented by the general formula C n H 2 n O n not limited to, fucose (Kisosu to Dokishi), also include such N- § Se Chirudarukosamin. Where n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 in the above formula are replaced by geose, triose, tetrose, pentose, hexose, heptose, octose, respectively. , Nonose and Decourse. Generally, they correspond to aldehydes or ketones of chain polyhydric alcohols. The former is called aldose and the latter is called ketose. As specifically referred to herein, a monosaccharide derivative refers to a substance that results from one or more hydroxyl groups on an unsubstituted monosaccharide being replaced by another substituent. Examples of such monosaccharide derivatives include sugars having a carboxyl group (eg, aldonic acid in which the C-1 position is oxidized to form a carboxylic acid (eg, D-dalconic acid in which D-glucose is oxidized) ), At the end of which has a peronic acid (D-gluconic acid in which D-glucose is oxidized), a derivative of an amino group or an amino group (eg, an acetylated amino group). Sugars (for example, N-acetyl-D-darcosamine, N-acetyl-D-galactosamine, etc.) and sugars having both an amino group and a carboxyl group (for example, N-acetylneuraminic acid (NANA, a kind of sialic acid) ), N-acetylmuramamic acid, etc.), deoxylated sugars (for example, 2-dexoxy-D-ribose), sulfated sugars containing a sulfate group, phosphoric acid containing a phosphate group In the present specification, the term “simple bran” includes the above-mentioned derivatives, or the sugar having a hemiacetal structure, which reacts with alcohol to form an acetal structure. Glycosides are also included in the range of monosaccharides.A plurality of these monosaccharides are linked to form an oligosaccharide or a polysaccharide, usually a dehydration condensation by a glycosidic bond, but the direction of the bond of the sugar at the non-reducing terminal side. It is known that depending on the nature, α and] 3, and the position of each of the carbons, greatly affects the physical properties. Important information along with types of monosaccharides (constituent sugars) There is no clear division between oligosaccharides and polysaccharides, but roughly 10-50 sugars The degree is the boundary. In the present specification, unless otherwise specified, oligosaccharide and polysaccharide are used interchangeably.
本明細書において 「糖鎖含有物質」 とは、 糖鎖および糖鎖以外の物質を含む物 質をいう。 このような糖鎖含有物質は、 生体内に多く見出され、 例えば、 生体中 に含有される単糖、 オリゴ糖、 多糖類の他、 糖タンパク質、 プロテオダリカン、 グリコサミノダリカン、 糖脂質などの複合生体分子、 およびそれら複合生体分子 から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定さ れない。  As used herein, “sugar chain-containing substance” refers to a substance containing a sugar chain and a substance other than the sugar chain. Such sugar chain-containing substances are found abundantly in living organisms. For example, in addition to monosaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides contained in living organisms, glycoproteins, proteodalicans, glycosaminodalicans, glycolipids , And a wide range of sugar chains decomposed or derived from these complex biomolecules, but is not limited thereto.
本明細書において 「糖タンパク質」 とは、 少なくとも 1種の糖鎖を含む、 好ま しくはそのような糖鎖が結合したタンパク質をいう。 従って、 特に言及しない場 合糖タンパク質は、 糖ペプチドを含む。 ただし、 糖ペプチドと糖タンパク質とを 区別する場合は、 糖ペプチドは、 糖タンパク質よりも小さなポリペプチドをさす ことがある。 通常、 糖タンパク質は、 高等生物において機能を発揮するために必 要な糖鎖を有している。 そのような糖タンパク質しては、 例えば、 N結合型糖鎖、 O結合型糖鎖、 C結合型糖鎖を単独で、 あるいはそれらの複数種類を有する糖タ ンパク質が挙げられるがそれらに限定されない。 そのような糖タンパク質は、 酵 素、 ホルモン、 サイトカイン、 増殖因子、 結合因子、 抗体、 ワクチン、 レセプタ 一、構造タンパク質、 血清タンパク質などを包含するが、 それらに限定されない。 本明細書において 「糖鎖構造」 とは、 糖鎖の配列状態およびその情報をいう。 特に言及しない限りは、 本明細書において糖鎖と糖鎖構造とは、 互換可能に用い られ得る。 細胞、 組織、 臓器および生体などに重要な影響を与える糖鎖構造とし ては、 例えば、 ァスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖 （N結合型糖鎖） 、 ムチン およびムチン結合型糖タンパク質糖鎖 （0結合型糖鎖） 、 糖脂質、 糖ヌクレオチ ド、 プロテオダリカン、 G P Iアンカーなどに含まれる糠鎖ならぴに遊離糖鎖、 それらの前駆体の構造が挙げられるがそれらに限定されない。 本発明では、 その ような糠鎖構造の変化を分析することも重要であり得る。 本明細書において 「糖鎖構造のセット」 または 「糖鎖のセット」 とは、 本明細 書において互換可能に利用されて、 例えば、 複数種の糖鎖を有する物質または組 成物における、 一組の糖鎖構造または糖鎖をいう。 そのような糖鎖構造のセット は、 例えば、 同一種類の糖タンパク質上の同位置のアミノ酸に結合している糖鎖 の多様性であってもよいし、 複数の糖タンパク質における別々の糖鎖構造であつ てもよい。 本発明では、 そのような糖鎖構造のセットのレベルの変化を分析する ことも重要であり得る。 As used herein, the term “glycoprotein” refers to a protein containing at least one sugar chain, preferably a protein having such a sugar chain bound thereto. Thus, glycoproteins unless otherwise specified include glycopeptides. However, when distinguishing a glycopeptide from a glycoprotein, the glycopeptide may refer to a polypeptide smaller than the glycoprotein. Normally, glycoproteins have sugar chains necessary for their functions in higher organisms. Examples of such glycoproteins include, but are not limited to, glycoproteins having an N-linked sugar chain, an O-linked sugar chain, and a C-linked sugar chain singly or a plurality thereof. Not done. Such glycoproteins include, but are not limited to, enzymes, hormones, cytokines, growth factors, binding factors, antibodies, vaccines, receptors, structural proteins, serum proteins, and the like. As used herein, the term “sugar chain structure” refers to the state of the sugar chain sequence and its information. Unless otherwise specified, a sugar chain and a sugar chain structure can be used interchangeably herein. Examples of sugar chain structures that have an important effect on cells, tissues, organs, and living organisms include, for example, asparagine-linked glycoprotein sugar chain (N-linked sugar chain), mucin, and mucin-linked glycoprotein sugar chain (0-linked sugar chain). But not limited to the structure of free sugar chains and their precursors, as long as the bran chains are contained in glycolipids, glycolipids, sugar nucleotides, proteodalicans, GPI anchors and the like. In the present invention, it may also be important to analyze such changes in bran chain structure. As used herein, the term "set of sugar chain structures" or "set of sugar chains" is used interchangeably herein, and refers to, for example, a set of substances or compositions having a plurality of types of sugar chains. Refers to the sugar chain structure or sugar chain. Such a set of carbohydrate structures may be, for example, the diversity of carbohydrates linked to amino acids at the same position on the same type of glycoprotein, or different carbohydrate structures in multiple glycoproteins. It may be. In the present invention, it may also be important to analyze changes in the level of such a set of carbohydrate structures.
本明細書において糖鎖構造の 「量的変化の情報」 とは、 複数の糖鎖 （または糖 鎖構造のセット） が有する存在量または発現量の変化に関する情報をいう。 この ような糖鎖構造の量的変化の情報は、 その糖鎖自体の存否に関する情報として表 示することもできるし、 その糖鎖が含まれる分子 （例えば、 糖タンパク質） 全体 を情報として表示することもできる。 量的変化の情報はまた、 注目すべき糖鎖の 割合の比として表現することができるがそれに限定されない。 そのような量的変 化の情報を構成するおのおのの糖鎖または糖鎖を含む分子の量 (またはレベル) を示す単位としては、 例えば、 n g、 m o 1、 質量分析における信号強度、 分 光分析における信号強度、 または m g /試料 g、 mm o 1 試料§、 あるいは相 対蛍光強度、 及びそれらを基にした百分率などの相対的数値などが挙げられるが それらに限定されない。 本発明では、 そのような糖鎖構造の量的変化量の変化を 分析 （区間微分などによる） することも重要であり得る。 As used herein, “quantitative change information” of a sugar chain structure refers to information on a change in abundance or expression level of a plurality of sugar chains (or a set of sugar chain structures). Such information on the quantitative change of the sugar chain structure can be displayed as information on the presence or absence of the sugar chain itself, or the entire molecule (for example, glycoprotein) containing the sugar chain is displayed as information. You can also. Quantitative change information can also be expressed as, but is not limited to, the ratio of notable sugar chains. Units indicating the amount (or level) of each sugar chain or sugar-containing molecule that constitutes such quantitative change information include, for example, ng, mo1, signal intensity in mass spectrometry, and spectrophotometric analysis. signal strength at or mg / sample g,, mm o 1 sample §, or relative fluorescence intensity, and they the like relative number, such as percentages based on, but is not limited to them. In the present invention, it may be important to analyze such a change in the amount of change in the sugar chain structure (by interval differentiation or the like).
本明細書において 「相互作用」 とは、 2つの物体について言及するとき、 その As used herein, the term "interaction" refers to two objects,
2つの物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。 そのような相互作用としては、 例えば、 共有結合、 水素結合、 ファンデルワールス力、 イオン性相互作用、 非ィ オン性相互作用、 疎水性相互作用、 静電的相互作用などが挙げられるがそれらに 限定されない。 ある実施形態では、 相互作用は、 共有結合であることが好ましい 力 その他の相互作用もまた、 糖鎖において重要であり得る。 Two objects acting on each other. Such interactions include, for example, covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, non-ionic interactions, hydrophobic interactions, electrostatic interactions, etc. Not limited. In certain embodiments, the interaction is preferably a covalent bond. Forces and other interactions may also be important in the sugar chain.
本明細書において相互作用、 発現、 存在などの 「レベル」 とは、 その相互作用、 発現、 存在などの強さを示す程度をいい、 糖鎖に関する情報を判断するために使 用され得る。 そのようなレベルは、 例えば、 物理学的解析 （例えば、 質量分析、As used herein, “level” such as interaction, expression, presence, etc. means the interaction, A measure of the strength of expression, presence, etc., which can be used to determine information about sugar chains. Such levels include, for example, physical analysis (eg, mass spectrometry,
NMR、 X線解析など） 、 分光学的解析 （例えば、 抗体、 レクチンによる凝集反 応および発色反応などを分析するなど） 、 化学的解析 （例えば、 ォキシム結合な どの特異的結合を化学的に定量する方法など） 、 生物学的解析 （例えば、 ある糖 鎖に特異的な細胞の反応性を定量する方法など） が挙げられるがそれらに限定さ れない。 NMR, X-ray analysis, etc.) Spectroscopic analysis (eg, analysis of antibody and lectin agglutination and color reaction), Chemical analysis (eg, chemical quantification of specific binding such as oxime binding) ) And biological analysis (eg, a method for quantifying the reactivity of cells specific to a certain sugar chain), but are not limited thereto.
(試料調製およぴ糖鎖分析） (Sample preparation and sugar chain analysis)
本明細書において 「血液」 とは、 当該分野において通常用いられる意味と同じ 意味で用いられ、 血管系 （循環系） を循環する体液をいう。  In the present specification, “blood” is used in the same meaning as commonly used in the art, and refers to a body fluid circulating in a vascular system (circulatory system).
本明細書において 「血清」 とは、 血液から血球と血液凝固成分をとり除いた部 分をいう。 「血清」 とは血液を放置若しくは遠心分離操作をして、 血球や凝固成 分の上清の液体成分を示す。 血清は、 アルブミン、 グロブリンなど血中タンパク 質を含む。  As used herein, the term “serum” refers to a portion obtained by removing blood cells and blood coagulation components from blood. “Serum” refers to the liquid component of the supernatant of blood cells and coagulated components after leaving the blood or centrifuging. Serum contains blood proteins such as albumin and globulin.
本明細書において 「ィムノグロブリン」 または 「I g」 とは、 抗体としての分 子構造をもつタンパク質の総称である。 ィムノグロブリンは、 すべての脊椎動物 の血清おょぴ体液中に含まれる。 ヒトの血清中には， 1 mlあたり 1 6〜1 8 mg含 まれているといわれている。 ィムノグロプリンは、 糖鎖を有しており、 この糖鎖 が生物学的活性に重要な働きを果たしているといわれている。 As used herein, “immunoglobulin” or “Ig” is a generic term for proteins having a molecular structure as an antibody. Immunoglobulins are found in serum and body fluids of all vertebrates. During human serum, it is said to have 1 6 to 1 8 m g included per 1 ml. Imnoglobulin has a sugar chain, and it is said that this sugar chain plays an important role in biological activity.
本明細書において 「ィムノグロブリン G」 または 「I g G」 とは、 ィムノグロ ブリンの一種であり、 両生類以上の高等動物では， 主要なィムノグロプリンで， ヒトではィムノグロブリンの約 7 0 %を占めるといわれている。 魚類では含まれ ていないといわれている。 その生物学的性質は動物の種により， また I g Gの中 のサブクラスにより異なる。 ヒトでは I g G 1、 I g G 2、 1 § 0 3ぉょび1 8 G 4の 4種類のサブクラスが存在する。 血清の調製方法は、 当該分野において周知であり、 採血した血液を放置若しく は遠心分離し液体成分を固形成分から分離したものである。 臨床検査のための採 血は真空採血管で行われることが殆どであり、 採血された血液は血球と凝固成分 が凝固したゲル状物質と、 液体成分 (血清）に、 放置若しくは遠心分離操作におい て分離される。 As used herein, the term "immunoglobulin G" or "Ig G" is a kind of immunoglobulin, which is a major immunoglobulin in amphibian and higher animals and accounts for about 70% of immunoglobulin in humans. It is said that. It is said that it is not included in fish. Its biological properties depend on the animal species and on the subclasses in the IgG. In humans there are four subclasses of I g G 1, I g G 2, 1 § 0 3 Oyobi 1 8 G 4. A method for preparing serum is well known in the art, in which a collected blood is left or centrifuged to separate a liquid component from a solid component. Blood collection for clinical tests is usually performed using a vacuum blood collection tube. The collected blood is separated into a gel-like substance obtained by coagulating blood cells and coagulation components, and a liquid component (serum) during standing or centrifugation. Separated.
本明細書において使用される糖鎖分析は、 当該分野において公知のものを利用 することができる。 そのような分析方法としては、 例えば、 物理学的方法 （例え ば、 質量分析、 NMRなど） 、 化学的方法 （例えば、 糖特異的官能基との化学的 特異的反応の解析、 糖鎖と特定の物質の相互作用を利用したクロマトグラフィー、 それらを組み合わせた 2次元マップ法など） 、 生化学的方法 （例えば、 レクチン、 抗体、 酵素の特異性を利用したアツセィなど） 、 生物学的方法 （例えば、 微生物 のある糖に対する親和性、 優先性などを調べるアツセィなど） が挙げられるがそ れらに限定されない。  As the sugar chain analysis used herein, those known in the art can be used. Such analysis methods include, for example, physical methods (eg, mass spectrometry, NMR, etc.), chemical methods (eg, analysis of chemical-specific reactions with sugar-specific functional groups, identification of sugar chains) Chromatography utilizing the interaction of various substances, two-dimensional mapping methods combining them, biochemical methods (eg, lectins, antibodies, Atssey using the specificity of enzymes, etc.), biological methods (eg, And Atsushi, which examines the affinity, priority, etc. of a microorganism for a certain sugar), but is not limited thereto.
そのような糖鎖分析の一例としては、 例えば、 糖鎖を含む試料を調製した後、 その試料を質量分析する方法が挙げられる。 質量分析の方法は、 当該分野におい て周知であり、 例えば、 MA L D I— T O Fなどが挙げられるがそれらに限定さ れない。 当業者はそのような方法を適宜改変して本発明に用いることができる。 そのような質量分析を用いると、 通常、 l O p m o 1 レベルの試料まで、 より 通常には 1 0 0 p m o 1までの分析可能となっている。 以下に例示的な方法を説 明する。  As an example of such a sugar chain analysis, for example, there is a method in which a sample containing a sugar chain is prepared and then the sample is subjected to mass spectrometry. Methods for mass spectrometry are well known in the art and include, but are not limited to, MALDI-TOF and the like. Those skilled in the art can appropriately modify such methods and use them in the present invention. With such mass spectrometry, it is usually possible to analyze samples up to lOpmo1 level, more usually up to 100pmo1. An exemplary method is described below.
質量分析に用いる試料は、 クロマトグラフィー、 電気泳動技術などの技術によ つて分析することによって提供され得る。 そのようなクロマトグラフィーなどの 技術は、 当該分野において周知である。  The sample used for mass spectrometry can be provided by analyzing by a technique such as chromatography and electrophoresis. Techniques such as chromatography are well known in the art.
本明細書において 「クロマトグラフィー」 とは、 混合物の試料から， 担体 （固 定相） 中の移動度 （分配平衡） の差を利用して試料中にある特定の標的物質また は標的物質群を別の物質または物質群から分離する方法をいう。 従って、 試料の 分離が達成される限りどのような技術もクロマトグラフィーの範囲内にある。 ク 口マトグラフィ一は、 例えば、 ある標的物質を混合物から分離する目的で使用さ れ得るし、 あるいは、 ある標的物質について定性的または定量的な分析をするた めにも使用され得る。 例えば、 通常クロマトグラフィーとは呼ばれない電気泳動 技術もまた、 通常試料中の少なくとも 1つの成分を分離することができることか ら、 本明細書においてクロマトグラフィーの範囲内にある。 固定相は通常液体ま たは固体であり得る。 移動相は通常液体または気体であり得る。 吸着剤などの固 定相または移動相の一端に試料を吸着させ， これに適当な溶媒 （移動相） を移動 させると試料中の成分は固定相 （固定相の表面または内部など固定相のある部 分） を溶出と吸着を繰り返しながら移動する。 その間に吸着されやすいものとさ れにくいものとの間に移動度の差を生じて， 混合物の分離が可能になる。 移動相 が液体のものは、 液体クロマトグラフィーとも呼ばれる。 従来、 移動相が液体か 気体かによつて液体クロマトグラフィー （L L C、 L S Cなど。 H P L C、 F P L C (登録商標） などもこれに入る） とガスクロマトグラフィー （例えば、 G L C、 G S Cなど） とに分けられ、 分離の機構によってキラルクロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー、 分配クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフ ィー、 疎水性クロマトグラフィー、 サイズ排除クロマトグラフィー （ゲル浸透ク 口マトグラフィー （G P C ) 、 ゲル濾過クロマトグラフィー （G F C) などめゲ ルクロマトグラフィー) 、 塩析クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 超臨界流体クロマトグラフィー、 高速向流 分配クロマトグラフィー、 パーフュージョンクロマトグラフィ一などの分類で使 用されている。 また固定相の形状により、 カラムクロマトグラフィー、 薄層クロ マトグラフィー、 ペーパークロマトグラフィーなどの種類に分類されている。 本 発明の方法は、 どのような形態のクロマトグラフィーにおいても使用され得る。 本明細書において固定相おょぴ移動相は、 そのクロマトグラフィーを使用する目 的に応じて当業者が適宜選択することができる。 そのような固定相およぴ移動相 の選定は、 当該分野において周知であり、 例えば、 「ライフサイエンスのための 高速液体クロマトグラフィー 基礎と実験」 中川照真、 牧野圭祐編、 廣川書店に 記載されている。 As used herein, “chromatography” refers to the use of a difference in mobility (partition equilibrium) in a carrier (stationary phase) from a sample of a mixture to identify a specific target substance or target substance group in the sample. A method of separating from another substance or group of substances. Therefore, the sample Any technique is within the scope of chromatography as long as separation is achieved. Chromatography can be used, for example, to separate a target substance from a mixture, or to perform a qualitative or quantitative analysis of a target substance. For example, electrophoretic techniques, not usually referred to as chromatography, are also within the scope of chromatography herein, as they can usually separate at least one component in a sample. The stationary phase can usually be a liquid or a solid. The mobile phase can usually be a liquid or a gas. When a sample is adsorbed to one end of a stationary phase or mobile phase such as an adsorbent, and a suitable solvent (mobile phase) is moved to this, the components in the sample become stationary phase (there is a stationary phase such as the surface or inside of the stationary phase). Move while repeating elution and adsorption. During that time, a difference in mobility occurs between those that are easily adsorbed and those that are hardly adsorbed, and the mixture can be separated. If the mobile phase is liquid, it is also called liquid chromatography. Conventionally, liquid chromatography (LLC, LSC, etc., also includes HPLC, FPLC (registered trademark), etc.) and gas chromatography (eg, GLC, GSC, etc.) are classified according to whether the mobile phase is liquid or gas. Depending on the mechanism of separation, chiral chromatography, adsorption chromatography, partition chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, size exclusion chromatography (gel permeation chromatography (GPC), gel filtration chromatography (GFC ), Such as gel chromatography, salting-out chromatography, reversed-phase chromatography, affinity chromatography, supercritical fluid chromatography, high-speed countercurrent distribution chromatography, and perfusion chromatography. . Also, according to the shape of the stationary phase, they are classified into types such as column chromatography, thin-layer chromatography, and paper chromatography. The method of the invention can be used in any form of chromatography. In the present specification, the stationary phase and the mobile phase can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose of using the chromatography. Such stationary and mobile phases The selection of is well known in the art, and is described in, for example, "Basics and Experiments of High Performance Liquid Chromatography for Life Science", edited by Terumasa Nakagawa, Keisuke Makino, and Hirokawa Shoten.
糖鎖を含む試料の調製は、 レクチン、 抗体などを利用して糖鎖または糖鎖を含 む物質を、 分離して行ってもよい。 目的に応じて所望のストリンジエンシー条件 を用いることによって、 種々の分離を行うことができる。  Preparation of a sample containing a sugar chain may be performed by separating a sugar chain or a substance containing a sugar chain using a lectin, an antibody, or the like. Various separations can be performed by using desired stringency conditions according to the purpose.
本明細書において、 試料中の糖鎖または糖鎖含有物質を 「分離」 するとは、 そ の糖鎖または糖鎖含有物質が、 分離前に試料中に存在する状態から実質的に引き 離すまたは精製することをいう。 従って、 試料から分離された糖鎖または糖鎖含 有物質は、 分離される前に含んでいた糖鎖または糖鎖含有物質以外の物質の含量 が少なくとも低減している。 従って、 本発明の糖鎖構造の分析には、 このような 分離された糖鎖または糖鎖含有物質を含む試料を用いることが好ましい。  As used herein, "separating" a sugar chain or a sugar chain-containing substance in a sample means that the sugar chain or sugar chain-containing substance is substantially separated or purified from a state existing in the sample before separation. To do. Therefore, in the sugar chain or the sugar chain-containing substance separated from the sample, the content of the sugar chain or the substance other than the sugar chain-containing substance contained before separation is at least reduced. Therefore, in the analysis of the sugar chain structure of the present invention, it is preferable to use a sample containing such a separated sugar chain or sugar chain-containing substance.
本明細書において 「所望のストリンジエンシー （条件） 」 とは、 糖鎖と特異的 に相互作用する物質と、 糖鎖または糖鎖含有物質との間の相互作用が解離しない ような条件をいう。 そのような条件は、 当該分野において周知の技術を用い、 用 いる試薬、 担体、 糠鎖または糖鎖含有物質、 糖鎖と特異的に相互作用する物質、 形成される相互作用などの種々のパラメータを参酌しながら、 当業者が適宜選定 することができる。 例えば、 相互作用が共有結合である場合は、 所望のストリン ジエンシーは、 水 （例えば、 超純水） または緩衝液 （例えば、 酢酸緩衝液） でリ ンスすることであってもよい。  As used herein, “desired stringency (conditions)” refers to conditions under which the interaction between a substance that specifically interacts with a sugar chain and a sugar chain or a sugar chain-containing substance is not dissociated. . Such conditions are determined using various techniques such as reagents, carriers, bran or sugar chain-containing substances, substances that specifically interact with sugar chains, and the interactions to be formed, using techniques well known in the art. A person skilled in the art can select an appropriate one while taking into account the above. For example, if the interaction is a covalent bond, the desired stringency may be rinsing with water (eg, ultrapure water) or a buffer (eg, acetate buffer).
(二次元マップ法） (2D map method)
本明細書において 「二次元マップ法」 「二次元マッピング」 「3次元マップ 法」 「2/3次元マップ法」 または 「多次元マップ法」 とは、 交換可能に用いられ、 2種類以上のクロマトグラフィーを併用して分析を行うことをいう。 好ましくは、 そのようなクロマトグラフィーは、 異なる種類 （例えば、 疎水性クロマトグラフ ィー、 順相クロマトグラフィー、 アブイ二ティークロマトグラフィーなど） を併 用することが有利である。 これらの技術に加えて、 核磁気共鳴 （NMR) 、 質量 分析、 分光法、 メチル化分析、 レクチンの親和性分析、 およびそれらとェキソグ リコシダーゼ消化との組み合わせもまた、 二次元マッピングにより分離された各 糖鎖を明確に構造解析を行うのにしばしば使用されており、 本発明の実施におい て適宜単独でまたは組み合わせて用いることができる。 In this specification, “two-dimensional map method”, “two-dimensional mapping method”, “three-dimensional map method”, “2 / 3-dimensional map method” or “multidimensional map method” are used interchangeably, and two or more types of chromatographs are used. Analysis is performed in combination with the use of graphography. Preferably, such chromatography is of a different type (eg, a hydrophobic chromatograph). , Normal-phase chromatography, abundance chromatography, etc.). In addition to these techniques, nuclear magnetic resonance (NMR), mass spectrometry, spectroscopy, methylation analysis, lectin affinity analysis, and their combination with exoglycosidase digestion were also used to separate each of the two-dimensional mappings. It is often used to clearly analyze the sugar chains, and can be used alone or in combination in the practice of the present invention.
二次元マップ法は糖鎖の非常に広範な N -結合型の糖鎖構造を分析することがで きる。 例えば、 ヒト I g Gは、 種々の二アンテナ糖鎖を含有し、 昆虫や植物糖タ ンパク質は、 キシロース含有糖鎖を生成し、 エリスロポエチン由来の糖鎖は、 G a 1 j3 1 - 4 G 1 c N A c反復単位または G a l i3 1 _ 3 G l c NA c配列を有 し、 そしてブタ膝臓カリジノゲナーゼは、 ガラクトース残基においてバリエーシ ョンを有する三アンテナ糖鎖および四アンテナ糖鎖やガラクトースが N-ァセチル ガラクトサミンに置換した糖鎖を含む。 このような多様な構造を有する糖鎖に二 次元マップ法は対応することができる。  Two-dimensional mapping can analyze a very wide range of N-linked glycan structures of glycans. For example, human IgG contains various diantennary sugar chains, insect and plant glycoproteins produce xylose-containing sugar chains, and erythropoietin-derived sugar chains are G a1 j31-4G It has a 1cNAc repeat unit or Gali31_3GlcNAc sequence, and porcine hamster caridinogenase has three and four antenna sugar chains and galactose that have variations at galactose residues. Includes sugar chains substituted with N-acetyl galactosamine. The two-dimensional map method can handle sugar chains having such various structures.
(糖鎖の遊離） (Release of sugar chains)
二次元マップ法で用いるための N結合型糖鎖の調製は当該分野において周知で ある。 例えば、 化学的方法および酵素的方法のいずれによっても、 糖タンパク質 から N結合型糖鎖を遊離することが可能である。 最も信頼できる化学的手法はヒ ドラジン分解である。 ヒドラジン分解は、 Matsushimaおよび Fujii (Bull. Chem. S oc. Jpn. , 30, 48, 1957) によって初めて報告され、 Takasakiら （Methods in Enzymo logy Ginsburg, V. , Ed.， Academic Press, New York, 1982, 263) によって改良さ れた方法である。 ヒドラジン分解を手軽に行える装置及び試薬キットも市販され ている。 一方酵素的方法は、 主にグリコアミダーゼ消化が利用される。 酵素によ る N-型糖鎖遊離は、 Koide及ぴ Muramatsuら （J. Biol. Chem. , 249, 4897, 1974) により最初に発見されたエンド - - Ν -ァセチルダルコサミニダーゼを用いること もできるが、 広範な基質特異性を持ち N-ァセチルダルコサミン残基がタンパク質 に残らないダリコアミダーゼの利用が一般的である。 グリコアミダーゼは Takaha shi (Biochem. Biophys. Res. Commun. , 76, 1194, 1977) により発見され、 グリ コぺプチダーゼ、 ペプチド- N-グリコシダーゼ、 N-グリコシダーゼ、 グリコアミ ダーゼなどと称されて広く市販、 利用されている。 巿販のグリコアミダーゼはァ 一モンド由来のグリコアミダーゼ Aと微生物 （Flavobacterium) 由来のグリコア ミダーゼ Fがある。 グリコアミダーゼ Fは植物や昆虫などに見られる還元末端 N -ァ セチルダルコサミンにフコースが α 1， 3結合した糖鎖構造に作用しにくいこと が知られるが、 双方とも糖ペプチド基質に対して十分に作用し、 そして糖鎖の遊 離は、 通常、 ほぼ定量的である。 グリコアミダ一ゼ Αによる消化に適した糖ぺプ チドの調製の関して、 本発明者らは、 以下の方法を例示的に説明する。 シアル酸 含有糖タンパク質について、 糖タンパク質 （例えば、 約 2%) を中性 pHにて熱 変性させる （例えば、 100°C、 10分間） 。 変性糖タンパク質サンプルに、 ト リプシンおょぴキモトリブシン （例えば、 各々、 基質の 1 100重量） ならび に緩衝液 （pH7〜8) を添加し、 必要な場合、 この混合物を、 例えば、 37°C で 1~2日間インキュベートする （好ましくは、 10mM Ca2 +の存在下 で） 。 あるいは、 例えば、 pH7〜8、 80°Cにて 40分間、 S—カルボキシァ ミドメチル化糖タンパク質の 2 %溶液を、 サーモリシン （基質の 1 Z 50〜 1 / 100重量） により消化してもよい。 この糠タンパク質を糖ペプチドの分解する 過程は、 立体障害を減らし酵素が糖鎖に反応しやすくするが、 省略される場合も ある。 プロテアーゼ消化を、 中性 pH、 100°Cにて 10分間加熱することによ り停止し、 そしてグリコアミダーゼ消化に直接使用する。 十分なサンプルが得ら れる場合、 プロテアーゼ消化混合物を、 例えば、 S e p h a d e x (登録商標） G— 25カラムを用いてクロマトグラフィーに供して、 グリコアミダーゼ消化の 前に糖ペプチドを精製することができる。 Preparation of N-linked sugar chains for use in the two-dimensional mapping method is well known in the art. For example, N-linked sugar chains can be released from glycoproteins by both chemical and enzymatic methods. The most reliable chemical method is hydrazinolysis. Hydrazine degradation was first reported by Matsushima and Fujii (Bull. Chem. Soc. Jpn., 30, 48, 1957) and was described by Takasaki et al. (Methods in Enzymology Ginsburg, V., Ed., Academic Press, New York, 1982, 263). Devices and reagent kits that can easily degrade hydrazine are also commercially available. On the other hand, enzymatic methods mainly utilize glycoamidase digestion. Enzymatic N-glycan release can be achieved by using the endo-- --acetyldarcosaminidase first discovered by Koide and Muramatsu et al. (J. Biol. Chem., 249, 4897, 1974). Dalicoamidase, which has a wide range of substrate specificities and does not leave N-acetyldarcosamine residues in the protein, is generally used. Glycoamidase was discovered by Takaha shi (Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 1194, 1977) and is widely marketed as glycopeptidase, peptide-N-glycosidase, N-glycosidase, glycoamidase, etc. It's being used. Glycoamidases sold on the market include glycoamidase A derived from almond and glycoamidase F derived from microorganisms (Flavobacterium). Glycoamidase F is known to be less likely to act on the sugar chain structure of α-1,3-linked fucose to the reducing terminal N-acetyldarcosamine found in plants and insects, but both are sufficient for glycopeptide substrates. And the dissociation of sugar chains is usually almost quantitative. Regarding the preparation of a glycopeptide suitable for digestion by glycoamidase, the present inventors exemplify the following method. For sialic acid-containing glycoproteins, heat denature the glycoprotein (eg, about 2%) at neutral pH (eg, 100 ° C, 10 minutes). To the denatured glycoprotein sample, add trypsin and chymotrypsin (eg, 1100 weight of substrate each) and buffer (pH 7-8) and, if necessary, mix the mixture at 37 ° C, for example. Incubate for 1 to 2 days (preferably in the presence of 10 mM Ca 2+ ). Alternatively, for example, a 2% solution of S-carboxamide methylated glycoprotein may be digested with thermolysin (1Z50 to 1/100% by weight of the substrate) at pH 7 to 8 and 80 ° C for 40 minutes. This process of degrading the bran protein into glycopeptides reduces steric hindrance and makes the enzyme more responsive to sugar chains, but may be omitted in some cases. The protease digestion is stopped by heating at 100 ° C for 10 minutes at neutral pH and used directly for glycoamidase digestion. If sufficient sample is obtained, the protease digestion mixture can be chromatographed, for example, using a Sephadex® G-25 column to purify the glycopeptide prior to glycoamidase digestion.
糠ぺプチド試料は、 凍結乾燥した後 糖嶺 lOOnmol当たり 20 1の 100m Mクェン酸一リン酸緩衝液 （p H 5〜6 ) に溶解させ、 グリコアミダーゼ A溶液 ( 0 . 2 mU/ l 0 μ 1 1 0 O mMクェン酸一リン酸緩衝液 （ρ Η 5〜6 ) (リン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 または T r i s— H C 1孿衝液であってもよ い） ) を添加する。 反応混合物を、 3 7 °Cで 5〜1 6時間インキュベートする。 グリコアミダーゼ Fをトリプシンとキモトリプシンで処理をした糖ぺプチドに作 用させるときは、 中性付近の p Hで糖鎖 lOOnmol当たりグリコアミダーゼ F溶液を 0. 2U相当加え、 37°Cで 1〜24時間ィンキュベートする。 プロテアーゼ消化を行わな いときや処理時間を短くするときは酵素使用量を増やして対応することもある。 遊離した糖鎖は以下の分析手法に応じて精製、 脱塩などの処理を行なう。 例えば、 糖鎖遊離後にプロナーゼなどべプチドをアミノ酸単位まで分解する酵素を用いて 処理し、 ぺプチドの低分子化により、 ゲルろ過ゃィオン交換などで糖鎖が精製し やすくなる。 化学的方法と酵素的方法とを比較する場合は一長一短があり当業者 は適宜その利点を考慮してこれらの方法を利用することができる。 After freeze-drying, the bran peptide sample has a sugar content of 20 1 / 100m M citrate monophosphate buffer (pH 5-6), and dissolve in glycoamidase A solution (0.2 mU / l 0 μ110 OmM citrate monophosphate buffer (ρΗ5-6 ) (May be phosphate buffer, acetate buffer, or Tris-HC 1 buffer). The reaction mixture is incubated at 37 ° C for 5 to 16 hours. When the glycoamidase F is allowed to act on the glycopeptide treated with trypsin and chymotrypsin, add 0.2 U of a glycoamidase F solution per lOOnmol of glycan at near neutral pH and add 1 to 24 at 37 ° C. Time incubate. When protease digestion is not performed or when the treatment time is shortened, the amount of enzyme used may be increased. The released sugar chains are subjected to purification, desalting, etc. according to the following analysis methods. For example, treatment with an enzyme such as pronase, which degrades a peptide to amino acid units after releasing the sugar chain, and reducing the molecular weight of the peptide makes it easier to purify the sugar chain by gel filtration dione exchange or the like. When comparing the chemical method and the enzymatic method, there are advantages and disadvantages, and those skilled in the art can use these methods considering their advantages as appropriate.
0-結合型の糖鎖についても同様に 0-グリコシダーゼ （Iwaseら、 Biochem. Bioph ys. Res. Commun. , 151, 422, 1988) など酵素的又は化学的にヒドラジン（Kuraya & Hase， J. Biochem. , 112, 122， 1992)などを用いて糖鎖を遊離することができ る。 糖脂質については糖鎖を遊離しないで分析することも広く行なわれているし、 同様にエンドグリコセラミダーゼ（Ito& Yamagata, J. Biol. Chem. , 264, 9510, 1989)など酵素的に、 又化学的に糖鎖を遊離することもできる。 これら糖鎖の遊 離処理を行なわない場合には遊離糖鎖の解析を行なうことができる。  For 0-linked sugar chains, enzymatically or chemically hydrazine (Kuraya & Hase, J. Biochem.) Such as 0-glycosidase (Iwase et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151, 422, 1988). , 112, 122, 1992) can be used to release sugar chains. Glycolipids are widely analyzed without releasing their sugar chains. Similarly, enzymatically or chemically, such as endoglycoceramidase (Ito & Yamagata, J. Biol. Chem., 264, 9510, 1989). It can also liberate sugar chains. When these sugar chains are not subjected to a cleavage treatment, free sugar chains can be analyzed.
(糖鎖の分析） (Sugar chain analysis)
遊離された糖鎖をク口マトグラフィ一で分離して分析するとき、 多くの場合検 出感度を上げるために標識ィ匕される。 標識方法としてはトリチウムなど放射性同 位元素を用いた手法と、 2—アミノビリジンや 4ーァミノ安息香酸ォクチルエス テルなど蛍光や紫外吸収を持った化合物を結合させる手法があり、 それらに対応 した蛍光検出器、 紫外検出器、 シンチレーシヨンカウンターなどで高感度に検出 される。 標識化されない糖鎖の場合でも、 示差屈折計、 パルスドアンべオメトリ 一検出器、 質量分析装置などにより検出することができる。 糖鎖をクロマトグラ フィ一で分離しない場合や、 クロマトグラフィーで分離した糖鎖を非連続的に検 出する場合、 ペーパークロマトグラフィー、 薄層クロマトグラフィー、 電気泳動 などで糖鎖を分離した場合などは前記の検出法の他、 オルシノール硫酸法などで 糖を化学的に発色させる手法、 抗体やレクチンなど特定の糖鎖構造を認識する物 質を用いて凝集 ·発色 ·比色などを計測する手法、 発色 ·比色や放射性同位体元 素を用いてフィルムなどにイメージングする手法、 質量分析や NMR解析などが用 いることができる。 特定の構造を認識するレクチンや抗体を基板上にスポットし て、 糖鎖のプロフアイリングを行う糖鎖チップなどの手法を用いることもできる。 多くの糖鎖構造解析法の中で蛍光標識を行なった糖鎖を 2種類以上のクロマトグ ラフィ一で分離し、 同時にその溶出位置から糖鎖構造を推定する 2次元マップ法 が広く普及している。 本法は N型糖鎖のみならず、 0型糖鎖、 糖脂質糖鎖、 ダル力 ン類においても行なわれる。 N-型糖鎖のみでも、 標識法、 利用するクロマトダラ フィ一、標準試料などの違いにより、 幾つかの手法が提唱されているが、 高橋の グループにより開発された中性糖鎖を対象とした二次元マツビング （Tomiya N e t al, Anal. Biochem. , 171, 73, 1988) 、 シァリル糖鎖まで対象に含めた 3次元 マッピング （Takahashi N et al, Anal. Biochem. , 226, 139, 1995) に準じて 本明細書中では説明する。 When the released sugar chains are separated and analyzed by mouth chromatography, they are often labeled to increase the detection sensitivity. Labeling methods include a method using a radioisotope such as tritium, and a method of binding a compound having fluorescence or ultraviolet absorption such as 2-aminoviridine or octyl ester of 4-aminobenzoate. Fluorescence detector, ultraviolet detector, scintillation counter, etc. detect with high sensitivity. Even unlabeled sugar chains can be detected by a differential refractometer, a pulsed-ambometry detector, a mass spectrometer, or the like. When sugar chains are not separated by chromatography, when sugar chains separated by chromatography are detected discontinuously, or when sugar chains are separated by paper chromatography, thin-layer chromatography, electrophoresis, etc. In addition to the above-mentioned detection methods, a method of chemically coloring sugar by the orcinol-sulfuric acid method, etc., and a method of measuring aggregation, coloration, colorimetry, etc. using substances that recognize a specific sugar chain structure such as antibodies and lectins In addition, techniques for imaging on films using colorimetric / colorimetric or radioisotope elements, mass spectrometry, NMR analysis, etc. can be used. A method such as a sugar chain chip for profiling a sugar chain by spotting a lectin or antibody that recognizes a specific structure on a substrate can also be used. Among many sugar chain structure analysis methods, two-dimensional mapping methods that separate sugar chains that have been fluorescently labeled by two or more types of chromatography and simultaneously estimate the sugar chain structure from their elution positions are widely used. . This method is performed not only for N-type sugar chains, but also for 0-type sugar chains, glycolipid sugar chains, and Dalphins. Several methods have been proposed for N-glycans alone, due to differences in the labeling method, chromatographic method used, standard samples, etc., but only for neutral sugar chains developed by the Takahashi group. Two-dimensional mapping (Tomiya N et al, Anal. Biochem., 171, 73, 1988) and three-dimensional mapping (Takahashi N et al, Anal. Biochem., 226, 139, 1995) including sialyl sugar chains as targets The description will be made in this specification accordingly.
(N-型糖鎖の命名） (Nomenclature of N-type sugar chains)
糖脂質糖鎖や 0-結合型糖鎖については研究者間で糠鎖命名についてほぼ統一が 取れているが、 N -型糖鎖に関してはいろいろな表記がなされる。 本明細書におい て糖鎖構造の表示は、 高橋らの命名法 （http:〃胃. gak. co. jp； 高橋禮子編著、 生化学実験法 23、 糖蛋白質糖鎖研究法、 学会出版センター、 1989年； Takahash i N, Tomiya N: Analysis of N— linked oligosaccharides： Application of gly coamidaseA: in Handbook of endoglycosidases and glycoamidases (Takahashi N, Muramatsu Teds. ) . pp. 209-241, CRC Press, BocaRaton, FL, 1992) に準ず る。 これは、 1)N-ァセチルラクトサミン型 （コンプレックス型） 糖鎖の場合には、 ( 1 ) 分岐の数を 3桁の数字の最初の数で示す。 （2 ) 還元末端の N-ァセチルダ ルコサミンにひ 1， 6結合にてフコースが結合しているときは 1を、 結合していな いときには 0を 3桁の数字の真ん中に入れる。 （3 ) コア構造 5糖の j3マンノース に N-ァセチルダルコサミンが β 1， 4で結合しているときは 1を、 結合していない ときには 0を 3桁の数字の最後に入れる。 3桁の数字の後に.を置きその右側には固 有番号をつける。 ¾高マンノース型 （ハイマンノース型） 糖鎖は最初に Μを、 次 にマンノース残基の数を入れる。 その後に.を置きその右側には固有記号をつけ る。 還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンに a l， 6結合にてフコースが結合してい るときは Μの後に Fを入れる。 3)混成型 （ハイブリッド型） 糖鎖は最初に Ηを、 次 にマンノース残基数を入れる。 その後に.を置きその右側には固有記号をつける。 還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンに α ΐ, 6結合にてフコースが結合していると きは Ηの後に Fを入れる。 4)還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンに α 1 , 3結合にて フコースが結合しているときは Fを、 コア構造 5糖の ]3マンノースにキシロースが β 1, 2で結合しているときは Xを全体の後に入れる。 その両方を有するときには FX の順に入れる。 5)N-ァセチルガラタトサミンをガラクトースの代わりに有する場 合は、 ガラクトースとして記号をつけた後に、 N -ァセチルガラクトサミンの数が 1なら a、 2なら b、 3なら c * · · と数に対応した小文字アルファベットを最後に つける。 6)コア構造 5糖のように N-ァセチルラクトサミン型と高マンノース型若 しくは混合型の何れにも分類できる場合は N-ァセチルラクトサミン型の命名を優 先する。 7)シアル酸を有する場合には、 シアル酸の残基数を書き、 次にシアル酸 の分子種が N -ァセチルノイラミンサンの場合には Aを、 さらに固有番号のセット を、 上記糖鎖構造の前につけて-で結ぶ。 そのような表示方法の例としては、 ガ ラク トース j31,4- N-ァセチルダルコサミン j31， 2 -マンノース α 1,3- (マンノース al,3- (マンノース α 1,6-) マンノース α1，6 -） マンノース ]31， 4 - Ν -ァセチルダ ルコサミン ^ 1,4 - N-ァセチルダルコサミンを H 5. 12、 ガラクトース 1,4- N- ァセチルダルコサミン j31,2 -マンノース a 1,3- (マンノース a 1， 6-) マンノース β 1, 4 - Ν-ァセチルダルコサミン βΐ, 4 - Ν-ァセチルグルコサミンを 100. 4、 ガ ラク トース ]31,4 - Ν-ァセチルダルコサミン j31,2-マンノース a 1,3- (マンノース a 1,3- (マンノース a; 1， 6-) マンノース a 1， 6-) マンノース j31， 4 - N-ァセチルダ ルコサミン 1,4- (フコース a 1， 6-) N-ァセチルダルコサミンを HF 5. 12、 N-ァセチルダルコサミン β 1, 2 -マンノース a 1, 3 - (N -ァセチルダルコサミンβ ' ΐ, 2-マンノース a 1,6-) マンノース 01,4- N -ァセチルダルコサミン j31,4- (フコー ス al，6- ) N-ァセチルダルコサミンを 210. 1およびガラク トース j31，4- N-ァ セチルダルコサミン 1， 2- (ガラク トース β 1, 3- Ν-ァセチルダルコサミン 31,4 - ) マンノース al，3_ (ガラタ トース 131，4_N -ァセチルダルコサミン /31,2-マンノ —ス a 1， 6-) マンノース 1， 4- Ν-ァセチルダルコサミン βί, 4-Ν-ァセチルダルコ サミンを 300. 22と呼ぶことが挙げられるがそれに限定されない。 Regarding glycolipid glycans and 0-linked glycans, there is almost no difference in the nomenclature of bran chains among researchers, but various notations are made for N-glycans. In this specification, the sugar chain structure is referred to by Takahashi et al.'S nomenclature (http: 〃 胃 .gak.co.jp; edited by Reiko Takahashi, Biochemistry Experimental Method 23, Glycoprotein Glycoprotein Research Method, Gakkai Shuppan Center, 1989; Takahash i N, Tomiya N: Analysis of N- linked oligosaccharides: Application of gly coamidase A: in Handbook of endoglycosidases and glycoamidases (Takahashi N, Muramatsu Teds.). pp. 209-241, CRC Press, BocaRaton, FL, 1992) You. This means 1) In the case of N-acetyl lactosamine type (complex type) sugar chains, (1) the number of branches is indicated by the first number of the three-digit number. (2) Insert 1 when fucose is bonded to the reducing terminal N-acetylsulcosamine by 1,6-bond, and 0 when it is not, in the middle of the three-digit number. (3) Core structure Insert 1 at the end of the three-digit number when N-acetyldarcosamine is linked to β3,4 at the j3 mannose of the pentasaccharide, and 0 when it is not linked. Place a. After the three-digit number and attach a unique number to the right. ¾High mannose type (high mannose type) For sugar chains, enter Μ first, and then the number of mannose residues. It is followed by a "." When fucose is bound to -acetyl dalcosamine at the reducing end by al and 6 bonds, insert F after Μ. 3) Hybrid molding (hybrid type) For sugar chains, enter Η first and then the number of mannose residues. It is followed by a "." When fucose is bound to the reducing terminal チ ル -acetyldarcosamine by α ΐ, 6 bond, insert F after Η. 4) When fucose is linked to α- acetyl-darcosamine at the reducing end by α 1,3 bond, F is linked to xylose at β 1,2 to the] 3 mannose of the core pentasaccharide. Sometimes put X after the whole. If you have both, put them in the order of FX. 5) When N-acetylgalatatosamine is used instead of galactose, after adding a symbol as galactose, if the number of N-acetylgalactosamine is 1, b if it is 2, c * if it is 3. Add a lowercase alphabet corresponding to the number at the end. 6) Core structure If the pentasaccharide can be classified as either N-acetyl-lactosamine type, high-mannose type or mixed type, the naming of N-acetyl-lactosamine type has priority. 7) If sialic acid is present, write the number of sialic acid residues, then write A if the sialic acid molecular species is N-acetyl neuraminsan, and set a set of unique numbers. Put before the chain structure and connect with-. Examples of such display methods include Lactose j31,4- N-acetyltylcolasamine j31,2-mannose α 1,3- (mannose al, 3- (mannose α 1,6-) mannose α1,6-) mannose] 31, 4-Ν- Acetylda lucosamine ^ 1,4-N-acetyltilcosamine with H 5.12, galactose 1,4-N-acetyldarcosamine j31,2-mannose a 1,3- (mannose a 1, 6-) mannose β 1,4-Ν-Acetyl darcosamine βΐ, 4-Ν-Acetyl glucosamine to 100.4, galactose] 31,4-Ν-Acetyl darcosamine j31,2-Mannose a 1,3- (Mannose a 1,3- (Mannose a; 1, 6-) Mannose a 1, 6-) Mannose j31, 4-N-Acetylda lucosamine 1,4- (Fucose a 1, 6-) N-Acetyl dalcosamine 5.12, N-Acetyldarcosamine β 1,2-mannose a 1,3-(N-Acetyldarcosamine β'ΐ, 2-mannose a 1,6-) Mannose 01,4-N-ase Rudarcosamine j31,4- (fucos al, 6-) N-acetyl darcosamine with 210.1 and galactose j31,4-N-acetyl darcosamine 1,2- (galactose β 1,3-Ν- Acetyldarcosamine 31,4-) mannose al, 3_ (galatatose 131,4_N-acetyldarcosamine / 31,2-mannose-a1,6--) mannose 1,4-Ν-acetyldarcosamine βί , 4-Ν-Acetyldarcosamine may be referred to as 300.22, but is not limited thereto.
(糖鎖分析例 1) (Sugar chain analysis example 1)
全血清の Ν-結合型糖鎖の Nakagawaら （Anal. Biochem.， 226, 130, 1995) の分析 例を挙げる。 健常人の血清 2 O O juLを 100°C10分間加熱変成後、 140 gのトリプシンと 140 μ gのキモトリプシンを加え、 pH8、 37°Cで 16時 間ィンキュベートしてタンパク質をぺプチドに分解した。 更に 1 mUの N -ダリコ アミダーゼ Aを加え 0. 5 Mクェン酸緩衝液中で 16時間インキュベートし糖鎖を 遊離した。 最終的に 200 μ gのプロナーゼを加えて反応させ、 ペプチドをアミ ノ酸に分解した。 Bio Gel P-4 (BioRad社） ゲルろ過で糖鎖を精製し、 2—ァ ミノピリジンで蛍光標識した。 糖鎖の還元末端へのピリジルァミノ基の導入は、 放射標識を用いずに、 糖鎖のピコモルレベルでの検出を可能にする （HaseS., et al. , J. Biochem. (Tokyo) , 85， 217, 1979) 。 糖鎖と 2 -アミノビリジンとの間 の反応は、 An example of analysis of Ν-linked sugar chains in whole serum by Nakagawa et al. (Anal. Biochem., 226, 130, 1995) is given below. 200 OO juL of healthy human serum was denatured by heating at 100 ° C for 10 minutes, and then 140 g of trypsin and 140 µg of chymotrypsin were added, and the mixture was incubated at pH 8 and 37 ° C for 16 hours to decompose the protein into peptides. Further, 1 mU of N-daricoamidase A was added, and the mixture was incubated in 0.5 M citrate buffer for 16 hours to release sugar chains. Finally, 200 μg of pronase was added and reacted to decompose the peptide to amino acid. Bio Gel P-4 (BioRad) The sugar chain was purified by gel filtration and fluorescently labeled with 2-aminopyridine. Introduction of a pyridylamino group at the reducing end of sugar chains enables detection of sugar chains at picomolar levels without using radiolabels (HaseS., Et. al., J. Biochem. (Tokyo), 85, 217, 1979). The reaction between the sugar chain and 2-aminoviridine is
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NHAc  NHAc
に示されるように進行する。 当初の手法 （Hase S et al, J. Biochem.， 95， 197, 1 984) は、 シアル酸の遊離が問題になり他の蛍光標識法が開発されたが基本的な 反応原理は同じ還元ァミノ化反応が殆どであり、 同じ長谷らのグループによりシ アル酸が遊離しないよう改良された （Yamamoto S et al, J. Biochem. , 105, 54 7， 1989) 。 この技術は、 クロマトグラフィー分離および糖鎖の決定のための、 最も有効かつ有名な手順の 1つである。 Proceed as shown in In the original method (Hase S et al, J. Biochem., 95, 197, 1984), the release of sialic acid was a problem, and other fluorescent labeling methods were developed. Most of the reaction was modified by Hase et al. (Yamamoto S et al, J. Biochem., 105, 547, 1989). This technique is one of the most effective and well-known procedures for chromatographic separation and glycan determination.
(糖鎖のピリジルァミノ化の手順） (Procedure for pyridylamination of sugar chains)
例示的な中性糖鎖のピリジルァミノ誘導体を調製する手順を以下に説明する。  The procedure for preparing an exemplary pyridylamino derivative of a neutral sugar chain is described below.
(試薬）  (Reagent)
1 . 2 -アミノビリジン塩酸溶液：濃塩酸 （ 1 2 N) に再結晶又は蛍光標識用の 2- アミノビリジンを溶解し、 水で 10倍に希釈したときに PH6. 8になるように調製す る。 . 1 2 - Aminobirijin hydrochloric acid solution: prepared as dissolving 2- Aminobirijin for recrystallization or fluorescent labels of concentrated hydrochloric acid (1 2 N), becomes P H6 8 when diluted to 10 times with water. You.
2 . 還元試薬：ソジゥムシァノポロヒドリ ド （A 1 d r i c h C h e m i c a 1 C o . ) 2 O m g当たり 1 2 1の水を加えたもの （用時調製）  2. Reducing reagent: sodium dichloropropanohydride (A1dricChChemica1Co.) 2 Omg of water added with 121 in water (prepared before use)
(手順）  (Procedure)
1 . 十分に乾燥したサンプルに 5 0 μ 1の 2-ァミノピリジン塩酸溶液を添加し、 そして混合する。 2. 密封し、 サンプルを 90°Cにて 10分間加熱する。 1. Add 50 μl of 2-aminopyridine hydrochloride solution to the well dried sample and mix. 2. Seal and heat the sample at 90 ° C for 10 minutes.
3. 5 μ 1の上記の還元試薬を添加する。  3. Add 5 μl of the above reducing reagent.
4. 密封し、 サンプルを 90°Cにて 1時間加熱する。  4. Seal and heat the sample at 90 ° C for 1 hour.
5. サンプルを 200〜 300/ 1の水に希釈する。 5. Dilute the sample in 200-300 / 1 water.
6. 1 OmM NH4HC03を溶出液として用いて、 S e p h a d e x (登録 商標 Amersham Biotech社） G— 15カラムによるゲル濾過によりピリジルァミ ノ化糖鎖 （PA糖鎖） を精製する。 6. Using a 1 OmM NH 4 HC0 3 as eluent, to purify the S ephadex (TM Amersham Biotech Co.) G-15 Pirijiruami Roh sugar chains by gel filtration through a column (PA sugar chain).
7. 糖鎖画分を収集し、 構造分析用サンプルとして使用する。  7. Collect the sugar chain fraction and use it as a sample for structural analysis.
糖鎖の構造決定は、 主に高速液体クロマトグラフィー （HPLC) と部分酵素消化 によりなされるが、 場合によりいくつかの技術 （メチル化、 核磁気共鳴 （NM R) 、 および質量分析 (MS) ) を組み合わせて実施される。  Glycan structure determination is mainly performed by high performance liquid chromatography (HPLC) and partial enzymatic digestion, but in some cases several techniques (methylation, nuclear magnetic resonance (NMR), and mass spectrometry (MS)) Is implemented in combination.
(高性能液体ク口マトグラフィー） (High performance liquid mouth chromatography)
P A糖鎖の分離は、 以下に示す 3種のカラム用いて、 HP LCにより実施する ことができる。  The separation of the PA sugar chain can be performed by HP LC using the following three types of columns.
第 1工程：陰ィオン交換樹脂 TSKgel DEAE-5PW (7.5x75mm, 東ソ一）を用いた HPL C： 1st step: HPL C using anion exchange resin TSKgel DEAE-5PW (7.5x75mm, Tosoichi):
溶出を、 溶媒 A (10% (v/v)ァセトニトリル水溶液にトリェチルァミンを加 えたもの、 pH9. 5) および溶媒 B ( 3 %酢酸-トリェチルァミン緩衝液 H 7.3とァセトニトリル 9 ： 1 (v/V)) を用いて、 30°Cにて流速 1. 0 m 1 /分で 実施する。 カラムを、 溶媒 Aにより平衡化する。 サンプルを注入した後、 溶媒 A に対する溶媒 Bの比を、 40分かけて 20%まで直線勾配で増加させる。 ピーク として表れた各々の糖鎖画分を回収し、 乾固するまで減圧下でエバポレートする。 第 2工程： Nakanopack ODSカラム （0. 6 X 15 cm、 中埜酢店） を用いた 逆相 HP LC：  Elution was performed using solvent A (10% (v / v) acetonitrile aqueous solution with triethylamine, pH 9.5) and solvent B (3% acetic acid-triethylamine buffer H7.3 and acetonitrile 9: 1 (v / V)). Perform at 30 ° C with a flow rate of 1.0 m 1 / min. Equilibrate the column with solvent A. After injecting the sample, the ratio of solvent B to solvent A is increased linearly to 20% over 40 minutes. Collect each sugar chain fraction that appeared as a peak and evaporate under reduced pressure until dryness. Second step: Reversed phase HP LC using Nakanopack ODS column (0.6 x 15 cm, Nakano vinegar store):
溶出を、 溶媒 C (1 OmM N a—リン酸緩衝液、 H3. 8) および溶媒 D (1 OmM N a—リン酸緩衝液、 0. 5% 1—ブタノール、 pH3. 8) を用 いて、 例えば、 55°Cにて流速 1. OmlZ分で実施する。 カラムを、 溶媒 Cお よび溶媒!)の 4 ： 1混合物 （容量） により平衡化する。 第一工程で分けられた 各々の糖鎖画分を注入した後、 溶媒 Cに対する溶媒!)の比を、 60分かけて 50 ： 50まで直線勾配で増加させる。 ODSカラムにおいてピークとして表れた各々 の糖鎖画分を回収し、 乾固するまで減圧下でエバポレートする。 Elution was performed with solvent C (1 OmM Na-phosphate buffer, H3.8) and solvent D (1 OmM Na-phosphate buffer, 0.5% 1-butanol, pH 3.8), for example, at 55 ° C at a flow rate of 1. OmlZ min. Equilibrate the column with a 4: 1 mixture (volume) of solvent C and solvent!). After injecting each of the sugar chain fractions separated in the first step, the ratio of solvent! To solvent C) is increased linearly to 50:50 over 60 minutes. Collect each sugar chain fraction that appeared as a peak on the ODS column, and evaporate under reduced pressure until dryness.
第 3工程： TSK— GEL Am i d e_80カラム （0. 46 X 25 cm、 東 ソー） を用いたサイズ分画 HP LC： Step 3: Size fractionation using a TSK-GEL Amide_80 column (0.46 x 25 cm, Tosoh) HP LC:
溶出を、 溶媒 E (3%酢酸—トリェチルァミン緩衝液、 H7. 3およびァセ トニトリルの 35 ： 65混合物） および溶媒 F ( 3。/。酢酸—トリェチルァミン、 pH7. 3 ：ァセトニトリルの 50 ： 50混合物） を用いて、 40°0にて流速1. Oml/分で実施する。 第 2工程で分離された糖鎖画分を、 溶媒 Eに溶解し、 ァ ミドカラムに注入する。 初めにカラムを溶媒 Eで平衡化する。 サンプルを注入し た後、 50分かけて直線勾配を使用し、 100%溶媒 Fを得る。  Elution was performed with solvent E (3:35 acetate / triethylamine buffer, 35:65 mixture of H7.3 and acetonitrile) and solvent F (3./.acetic acid-triethylamine, pH7.3: 50: 50 mixture of acetonitrile). And at 40 ° 0 at a flow rate of 1. Oml / min. The sugar chain fraction separated in the second step is dissolved in solvent E and injected into an amide column. First equilibrate the column with solvent E. After injecting the sample, use a linear gradient over 50 minutes to obtain 100% solvent F.
それぞれの HP LCシステムにおいて、 PA糖鎖を、 それぞれ、 320 nmお よび 400 nmの励起波長および発光波長を用いた蛍光により検出する。 様々な 種類の P A糖鎖の検出は、 モルベースでほぼ等価である。 従って、 各々の PA糖 鎖のピーク領域は、 糖鎖のモル量を反映する。  In each HP LC system, PA sugar chains are detected by fluorescence using excitation and emission wavelengths of 320 nm and 400 nm, respectively. Detection of various types of PA glycans is approximately equivalent on a molar basis. Therefore, the peak area of each PA sugar chain reflects the molar amount of the sugar chain.
上記 3工程での糖鎖分離の HPLCチャートは図 12 (Anal. Biochem. 226, 130- , 1995を参照） の様になる。  The HPLC chart of the sugar chain separation in the above three steps is as shown in FIG. 12 (see Anal. Biochem. 226, 130-, 1995).
(2/ 3次元糖マッピング） (2 / 3D sugar mapping)
ΡΑグルコースオリゴマ一を用いてサンプル Ρ Α糖鎖の溶出位置を較正すること が重要である。 これにより、 実験毎の P A糖鎖の溶出時間の変動を最小限に抑え ることができる。 上記の条件下で、 PAグルコースオリゴマーは、 逆相カラムお よびアミド吸着カラムにおいて、 効果的に分離され得る。 次いで、 サンプル P A 糖鎖の溶出位置を、 標準の P Aグルコースオリゴマーと溶出時間について比較す ることにより、 規定する。 サ ン プ ル It is important to calibrate the sample elution position of the sugar chain using glucose oligomer. As a result, fluctuations in the elution time of the PA sugar chain between experiments can be minimized. Under the above conditions, PA glucose oligomers can be effectively separated on reverse phase columns and amide adsorption columns. Then the sample PA The elution position of the sugar chain is defined by comparing the elution time with the standard PA glucose oligomer.
図 1 2には、 中性糖鎖において 2つの H P L Cカラム （O D S—シリカカラム およびアミドーシリカカラム） における、 1 5 0種以上の P A糖鎖の溶出位置が 示されている （中性糖鎖の 2次元マップ） 。 この溶出位置は、 前記と同じ条件で 分析した場合には再現性があり、 0DSカラムとアミドカラムの溶出位置により糖 鎖構造の推定ができる。 メ一力一等カラムの種類が異なると溶出位置の誤差が大 きくなるが、 Nakanopack (中埜酢店） ， CLCと HRC (島津製作所）の 0DS力ラム 6 x 1 5 O mmでは溶出がほぼ同じで再現性が高い。 第一工程でシアル酸の残基数によ り分離された糖鎖についでも、 同様に 0DSカラムとアミドカラムの溶出位置によ り糖鎖構造の推定ができる。 この様にして糖鎖構造は既知の糖鎖の溶出位置と比 較してその糖鎖構造が推定される。 次にその推定構造が正しいかどうか各種ダリ コシダーゼで消化して確認する。 例えば第 1工程で中性糖鎖に分類され、 0DS力 ラムの分析でのピーク Eはその溶出位置より 200. 4 (Gal β 1, -GlcNAc β 1， 2~Man a 1, 3- (Gal β 1, 4-GlcNAc 1, 2-Man a 1, 6-) ) Man i3 1, 4-GlcNAc β 1, -GlcNAc) と推 定された。 j3 -ガラクトシダーゼ （クチナタマメ由来、 生化学工業） を用いてこ の糖鎖を処理すると、 200. 1 (GlcNAc β 1, 2-Man a 1, 3- (GlcNAc β 1, 2~Man a 1, 6- ) ) Man β 1, 4-GlcNAc j3 1, 4-GlcNAc) の溶出位置に移動した。 更に i3 - N-ァセチル へキソサミニダーゼ （タチナタマメ由来、 生化学工業） で処理すると、 000. 1 (M an a 1, 3- (Man α 1, 6-) ) Man β 1, 4-GlcNAc β 1, -GlcNAc) の溶出位置に移動した。 このことにより、 ピーク Eが当初推定どおり 200. 4の構造であると決定した。 第 1 工程でモノシァリル糖鎖画分に溶出し、 0DS力ラムの分析で B及ぴ Cに溶出した糖 鎖は、 この時点では 2次元マップに該当する糖鎖は無かった。 α; 2，3と《2，6結合 の何れのシアル酸にも同様に作用する Arthrobacterureafaciens由来のシァリダ ーゼ （ナカライテスク） で中性糖鎖 200. 4の溶出位置に移動し、 a 2， 3シアル酸に 特異的な Salmonellatyphimurium由来のシァリダーゼ （寶酒造） では移動しなか つたことから中性糖鎖構造 200. 4にシアル酸が α 2, 6結合で 1残基結合していると 推定された。 Βと Cに jS -ガラクトシダーゼを作用させてから Arthrobacter由来の シァリダーゼを作用させると、 Bは 200. 3 (Gal 1, -GlcNAc 1, 2-Man α 1, 3 (Glc NAc 1, 2-Man a 1, 6-) Man β 1, 4-GlcNAc β 1, 4-GlcNAc) を、 Cは 200. 2 (GlcNAc 1, 2-Man a l, 3 (Gal β 1, 4- GlcNAc β 1， 2-Man a 1, 6-) Man β 1, 4 - GlcNAc β 1, 4- GlcNA c) と同様の溶出位置となった。 更に B及ぴ Cを β -ガラク トシダーゼ、 β - Ν -ァセ チルへキソサミニダーゼ、 Arthrobacter由来シァリダーゼで逐次処理を行なうと Bは 100. 4 (Gal β 1, -GlcNAc β 1, 2-Man α 1, 3 (Man α 1, 6-) Man 1， 4 - GlcNAc jS 1, 4- GlcNAc) を、 Cは 100. 3 (Man « 1, 3 (Gal ^3 1, 4-GlcNAc β 1, 2-Man a 1, 6-) Man β 1, 4- GlcNAc J3 1， 4 - GlcNAc) と同様の溶出位置となった （図 1 3、 Anal. Biochem. 22 6, 130-， 1995を参照） 。 この様にして Bは NANA α 2， 6- Gal 3 1, 4- GlcNAc )3 1， 2- Man a 1, 3 (GlcNAc β 1, 2-Man a 1, 6-) Man ]3 1， 4 - GlcNAc 1， 4- GlcNAc (1A1- 200. 4) と、 Cは GlcNAc β 1, 2-Man a 1, 3 (NANA a 2, 6- Gal β 1， 4 - GlcNAc β 1, 2-Man a 1， 6-) Man β 1, 4-GlcNAc β 1, 4-GlcNAc (1A2-200. 4) とその構造が決定され、 Bについては NMR 解析により確認された （図 1 4、 Anal. Biochem. 226, 130- , 1995を参照） 。 こ の様にして血清中より最終的に中性糖鎖 14種類、 モノシァリル糖鎖 8種類、 ジシ ァリル糖鎖 4種類、 トリシアリル糖鎖 5種類の構造が解析された （表 1、 Anal. Bi ochem. 226, 130— , 1995の Tablel) 。 Figure 12 shows the elution positions of more than 150 types of PA glycans on two HPLC columns (ODS-silica column and amide-silica column) for neutral glycans (neutral glycans). 2D map). This elution position is reproducible when analyzed under the same conditions as described above, and the sugar chain structure can be estimated from the elution positions of the 0DS column and the amide column. The difference in elution position increases when the type of first-class column is different, but elution is almost the same with Nakanopack (Nakano Vinegar), CDS and HRC (Shimadzu) 0DS force ram 6 x 15 Omm High reproducibility. Similarly, the sugar chain structure can be estimated from the elution positions of the 0DS column and the amide column even for the sugar chains separated by the number of sialic acid residues in the first step. In this way, the sugar chain structure is estimated by comparing with the known sugar chain elution position. Next, the digested structure is digested with various daricosidases to confirm the correct structure. For example, in the first step, it is classified as a neutral sugar chain, and peak E in the 0DS column analysis is 20.4 (Gal β 1, -GlcNAc β 1, 2 to Man a 1, 3- (Gal β 1, 4-GlcNAc 1, 2-Mana 1, 6-)) Mani3 1, 4-GlcNAc It was estimated to be β 1, -GlcNAc). When this sugar chain was treated with j3-galactosidase (derived from garden bean, Seikagaku Kogyo), 200.1 (GlcNAc β 1, 2-Mana 1, 3-(GlcNAc β 1, 2 ~ Mana 1, 6- )) It moved to the elution position of Manβ1,4-GlcNAc j3 1,4-GlcNAc). Further treatment with i3-N-acetylhexosaminidase (derived from Chinese bean, Seikagaku Kogyo) resulted in 000.1 (Mana1,3- (Manα1,6-)) Manβ1,4-GlcNAcβ1, -GlcNAc). From this, it was determined that peak E had a structure of 200.4 as originally estimated. In the first step, none of the sugar chains eluted in the monosialyl sugar chain fraction and eluted in B and C in the analysis of the 0DS force column had a sugar chain corresponding to the two-dimensional map at this time. α; 2,3 and 《2,6 bond sialidases (Nacalai Tesque) derived from Arthrobacterureafaciens which also act on both sialic acids. 3Sialidase derived from Salmonellatyphimurium specific to sialic acid (Takara Shuzo) does not migrate Therefore, it was presumed that sialic acid was bound to the neutral sugar chain structure 200.4 by one α2,6 bond. When jS-galactosidase was allowed to act on Β and C followed by sialidase derived from Arthrobacter, B was 20.3 (Gal1, -GlcNAc1,2-Manα1,3 (GlcNAc1,2-Mana 1, 6-) Man β 1, 4-GlcNAc β 1, 4-GlcNAc), C is 200.2 (GlcNAc 1, 2-Man al, 3 (Gal β 1, 4-GlcNAc β 1, 2-Man The elution position was the same as that of a 1, 6-) Man β 1, 4-GlcNAc β 1, 4-GlcNA c). Furthermore, B and C were successively treated with β-galactosidase, β-Ν-acetylhexosaminidase, and Arthrobacter-derived sialidase. , 3 (Man α 1, 6-) Man 1, 4-GlcNAc jS 1, 4- GlcNAc), and C is 100.3 (Man «1, 3 (Gal ^ 3 1, 4-GlcNAc β 1, 2- The elution position was similar to that of Man a 1, 6-) Man β 1, 4-GlcNAc J31,4-GlcNAc) (see Fig. 13, Anal. Biochem. 226, 130-, 1995). Thus, B is NANA α2,6-Gal31,4-GlcNAc) 31,2-Mana1,3 (GlcNAcβ1,2-Mana1,6-) Man] 31,4 -GlcNAc 1,4-GlcNAc (1A1-200.4) and C is GlcNAc β 1,2-Man a 1,3 (NANA a 2,6-Gal β 1,4-GlcNAc β 1,2-Man a 1, 6-) Man β 1, 4-GlcNAc β 1, 4-GlcNAc (1A2-200.4) and its structure were determined, and B was confirmed by NMR analysis (Figure 14, Anal. Biochem. 226, 130-, 1995). In this way, the structures of 14 types of neutral sugar chains, 8 types of monosialyl sugar chains, 4 types of disialyl sugar chains, and 5 types of trisialyl sugar chains were finally analyzed from serum (Table 1, Anal. Biochem. 226, 130—, Tablel in 1995).
表 1 table 1
ODS/アミドシリカにおけるヒト血清から得られた PAオリゴサッカリドの溶出位置  Elution position of PA oligosaccharide obtained from human serum on ODS / amide silica
Glc単位 ピーク番号/  Glc unit Peak number /
コード番号 PAオリゴサッカリドの構造 ODS アミド 中 A M ^ Code Number PA Oligosaccharide Structure ODS Amide Medium A M ^
Man 2Mana6 5.1 8.1  Man 2Mana6 5.1 8.1
\  \
Manao  Manao
/ \  / \
Mana3 Man 34GlcNAc 34GlcNAc  Mana3 Man 34GlcNAc 34GlcNAc
/  /
Mana2Mana3  Mana2Mana3
A2 Mana2Mana6 4.9 9.0 M8.1 \  A2 Mana2Mana6 4.9 9.0 M8.1 \
Man" 6  Man "6
/ \  / \
Man 3 an ?4GlcNAc^4GlcNAc  Man 3 an? 4GlcNAc ^ 4GlcNAc
/  /
Mana2Mana2Man 3  Mana2Mana2Man 3
B1 Mana6 5.8 8.0 M7.1 \  B1 Mana6 5.8 8.0 M7.1 \
Mana6  Mana6
/ \  / \
Man"3 Man^4GlcNAc/?4GlcNAc  Man "3 Man ^ 4GlcNAc /? 4GlcNAc
/  /
Mana2Mana2Mano;3  Mana2Mana2Mano; 3
B2 Mana2 ana6 5.2 9.7 M9.1 \  B2 Mana2 ana6 5.2 9.7 M9.1 \
Man 6  Man 6
/ \  / \
Mana2Mana3 Man^GIcNAc^GlcNAc  Mana2Mana3 Man ^ GIcNAc ^ GlcNAc
/  /
Mana2Mana2Mana3 Mana2Mana2Mana3
駕
Figure imgf000033_0001
Struggle
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/  /
\ 駕 a
Figure imgf000033_0002
\ Darling a
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\ "9W δ'9 a  \ "9W δ'9 a
/  /
3VM3ro VN3if) Bw ε"υ 3 VM 3 ro VN 3 if) B w ε "υ
\ /  \ /
\ '9P¾ \ '9P¾
VL 0 VL 0
表 1—つづき Table 1—Continued
Glc 単位 ピーク番号/  Glc unit Peak number /
コード番号 PAオリゴサッカリドの構造 ODS アミドCode No. Structure of PA oligosaccharide ODS amide
I Gal/34GlcNAc02Mana6 Fuca6 14.1 7.4I Gal / 34GlcNAc02Mana6 Fuca6 14.1 7.4
210.4 \ 210.4 \
Man 54GlcNAc/g4GlcNAc  Man 54GlcNAc / g4GlcNAc
/  /
Gal^4GlcNAc 32Mana3  Gal ^ 4GlcNAc 32Mana3
J GlcNAc/32Mana6 Fuco6 17.8 5.8 J GlcNAc / 32Mana6 Fuco6 17.8 5.8
211.1 \ 211.1 \
GlcNAc ^4-Man/?4GlcNAc 34GlcNAc  GlcNAc ^ 4-Man /? 4GlcNAc 34GlcNAc
/  /
GlcNAc^2Mana3  GlcNAc ^ 2Mana3
K Gal/S4G]cNAc/92Mana6 FucaG 18.7 6.6 K Gal / S4G] cNAc / 92Mana6 FucaG 18.7 6.6
211.2 \ 211.2 \
GlcNAc ?4-Man 74GlcNAc 34GlcNAc  GlcNAc? 4-Man 74GlcNAc 34GlcNAc
/
Figure imgf000034_0001
/
Figure imgf000034_0001
モノ一シァリル Mono Siryl
A GlcNAc^2Mana6 9.3 6.2 A GlcNAc ^ 2Mana6 9.3 6.2
1A1-20O.3 \ 1A1-20O.3 \
Man^GlcNAc^GlcNAc  Man ^ GlcNAc ^ GlcNAc
Neu5Aca6Gal^4GlcNAc/32Mana3 Neu5Aca6Gal ^ 4GlcNAc / 32Mana3
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000035_0001
表 1一つづき Table 1
Glc 単位 ピーク番号/  Glc unit Peak number /
コ一ド番号 PAオリゴサッカリドの構造 ODS アミド ジシァリル  Code Number Structure of PA Oligosaccharide ODS Amide Disialyl
A Neu5Aca6GaL?4GlcNAc/32Mana6 10.9 7.3 A Neu5Aca6GaL? 4GlcNAc / 32Mana6 10.9 7.3
2A1-200.4 \ 2A1-200.4 \
Man^GlcNAc^GlcNAc  Man ^ GlcNAc ^ GlcNAc
/  /
Neu5Aco6Gal?4GlcNAc^2Mana3  Neu5Aco6Gal? 4GlcNAc ^ 2Mana3
B Neu5Aca6Gal34GlcNAc^2Mana6 13.1 8.3 B Neu5Aca6Gal34GlcNAc ^ 2Mana6 13.1 8.3
2A1 -300.8 \ 2A1 -300.8 \
Gal34GlcNAc^4 Man?4GlcNAc34GlcNAc  Gal34GlcNAc ^ 4 Man? 4GlcNAc34GlcNAc
\ /  \ /
Man«3  Man «3
/  /
Neu5Acひ SGal^GlcNAc^  Neu5Ach SGal ^ GlcNAc ^
C Neu5Aca6Gal34GlcNAc>32Mana6 ^ Fuca6 13.8 7.7 C Neu5Aca6Gal34GlcNAc> 32Mana6 ^ Fuca6 13.8 7.7
2A1-210.4 2A1-210.4
ManJ4GlcNAcJ4GlcNAc  ManJ4GlcNAcJ4GlcNAc
/ I  / I
Ncu5Aca6Gal/34GlcNAc52Mana3  Ncu5Aca6Gal / 34GlcNAc52Mana3
D Neu5Aca6Ga】34GlcNAc¾Mana6 Fuca6 18.2 7.8 D Neu5Aca6Ga】 34GlcNAc¾Mana6 Fuca6 18.2 7.8
2A1-211.4 \ 2A1-211.4 \
GlcNAc^-Man^GlcNAc^GlcNAc  GlcNAc ^ -Man ^ GlcNAc ^ GlcNAc
/  /
Neu5Ac«6Gal?4GIcNAc?2Mana,3  Neu5Ac «6Gal? 4GIcNAc? 2Mana, 3
トリ一シァリル Tori Siryl
A Neu5Aca6Gal/94GlcNAc52Manafi 13.0 8.7 A Neu5Aca6Gal / 94GlcNAc52Manafi 13.0 8.7
3A2-300.31 \ 3A2-300.31 \
Neu5Aca3Gal/34GlcNAc/94 Man34GlcNAc/34GlcNAc  Neu5Aca3Gal / 34GlcNAc / 94 Man34GlcNAc / 34GlcNAc
I \ /  I \ /
Fuca3 Mana3  Fuca3 Mana3
/  /
Neu5Aca6Gal(04GlcNAc/32 Neu5Aca6Gal ( 04GlcNAc / 32
/ /
ε iM  ε iM
/ \  / \
3VN3ra 3 VN3K>WUBI W 3VN 3 ra 3 VN 3 K> W UB IW
Ζ,'8 9'6T 9
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a Ζ, '8 9'6T 9
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a
/ /
ε ι¾  ε ι¾
/ \ / \
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V9 ん ·9τ α V9 ん 9τα
/ /
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(試料） (Sample)
本明細書において 「試料」 とは、 その中の少なくとも 1つの成分 （好ましくは 糖鎖または糖鎖含有物質） の分析を目的とするものであれば、 どのような起源の ものをも使用することができる。 本発明において特に、 血清全体を使用すること ができる。 血清全体の糖鎖が診断に応用されることは従来知られておらず、 顕著 な効果といえる。 したがって、 試料は、 生物の全部または一部から取り出された ものであり得るが、 それに限定されない。 別の実施形態において、 試料は、 合成 技術によつて合成されたものであり得る。 そのような合成技術によって合成され たものを試料として用いるのは、 例えば、 標準データをとる場合や糖鎖の代謝や 生体への結合を測定する場合において有用である。  As used herein, the term “sample” refers to any source from which the analysis of at least one component (preferably, a sugar chain or a sugar chain-containing substance) is intended. Can be. In the present invention, in particular, whole serum can be used. The use of sugar chains in whole serum for diagnosis has not been known so far and can be said to be a remarkable effect. Thus, the sample may be, but is not limited to, taken from all or part of an organism. In another embodiment, the sample may have been synthesized by a synthesis technique. The use of a sample synthesized by such a synthesis technique as a sample is useful, for example, when collecting standard data, or when measuring metabolism of sugar chains or binding to living organisms.
試料としては、 例えば、 血清の場合、 当該分野において周知の調製方法で調製 された血清をそのまま用いることができるが、 簡単に精製してもよい。 従って、 試料の調製方法としては、 分析される対象としての糖鎖の分析に悪影響がない限 り、 どのような調製方法を用いてもよい。 そのような調製方法としては、 例えば、 静脈から採血し、 その後、 遠心分離 （例えば、 2 0 0 0 X g ) を行って得られた 上清を血清試料とすることができる。  As a sample, for example, in the case of serum, a serum prepared by a preparation method well known in the art can be used as it is, but it may be easily purified. Therefore, any preparation method may be used as a sample preparation method as long as the method does not adversely affect the analysis of a sugar chain as an object to be analyzed. As such a preparation method, for example, a supernatant obtained by collecting blood from a vein and then performing centrifugation (for example, 2000 X g) can be used as a serum sample.
本明細書において使用される用語 「生体分子」 とは、 生体に関連する分子をい う。 そのような生体分子を含む試料を、 本明細書において特に生体試料というこ とがある。 本明細書において 「生体」 とは、 生物学的な有機体をいい、 動物、 植 物、 菌類、 ウィルスなどを含むがそれらに限定されない。 従って、 生体分子は、 生体から抽出される分子を包含するが、 それに限定されず、 生体に影響を与え得 る分子であれば生体分子の定義に入る。 そのような生体分子には、 タンパク質、 ポリペプチド、 オリゴペプチド、 ペプチド、 アミノ酸、 ポリヌクレオチド、 オリ ゴヌクレオチド、 ヌクレオチド、 核酸 （例えば、 c D NA、 ゲノム D NAのよう な D NA、 mR NAのような R NAを含む） 、 ポリサッカリ ド、 オリゴサッカリ ド、 単糖、 脂質、 低分子 (例えば、 ホルモン、 リガンド、 情報伝達物質、 有機低 分子など） 、 これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。 本明 細書では、 生体分子は、 好ましくは、 糖鎖または糖鎖を含む複合分子 （例えば、 糖タンパク質、 糖脂質など） であるが、 含有される糖鎖構造が反映される生体分 子であれば、 その生体分子自体が糖鎖を有しなくても本発明において使用するこ とができる。 As used herein, the term “biomolecule” refers to a molecule associated with a living organism. A sample containing such a biomolecule may be particularly referred to herein as a biological sample. As used herein, the term "organism" refers to a biological organism, including, but not limited to, animals, plants, fungi, viruses, and the like. Therefore, a biomolecule includes, but is not limited to, a molecule extracted from a living body, and is included in the definition of a biomolecule as long as it is a molecule that can affect a living body. Such biomolecules include proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, amino acids, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (e.g., DNA such as cDNA, genomic DNA, mRNA, etc. , Polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, lipids, small molecules (eg, hormones, ligands, signal transducers, Molecules, etc.), and these complex molecules are included, but not limited thereto. In the present specification, the biomolecule is preferably a sugar chain or a complex molecule containing a sugar chain (eg, glycoprotein, glycolipid, etc.), but any biomolecule that reflects the sugar chain structure contained therein. For example, even if the biomolecule itself does not have a sugar chain, it can be used in the present invention.
そのような生体分子の供給源としては、 生物由来の糖鎖が結合または付属する 材料であれば特にその由来に限定はなく、 動物、 植物、 細菌、 ウィルスを問わな レ、。 より好ましくは動物由来生体試料が挙げられる。 好ましくは、 例えば、 全血、 血漿などの糖タンパク質など糖鎖成分を含む液状試料等が挙げられ、 より好まし くは血清がよい。  The source of such a biomolecule is not particularly limited as long as it is a material to which a sugar chain derived from a living organism is attached or attached, and it is not limited to animals, plants, bacteria, and viruses. More preferably, an animal-derived biological sample is used. Preferably, for example, a liquid sample containing a sugar chain component such as a glycoprotein such as whole blood or plasma is used, and more preferably, serum is used.
本明細書において糖鎖構造と疾患に関する情報との 「相関付け」 とは、 ある糖 鎖構造 （好ましくは糖鎖構造の量的変化の情報など） またはその変化の特定の情 報を、 疾患レベルに対応付けることをいい、 そのような関係を相関関係という。 従来、 特に血清レベルの糖鎖構造と疾患のレベルとの間の相関関係は知られてい なかったことから、 本発明においては、 そのような相関関係が発見されたことは 格別の効果といえる。  As used herein, the term "correlation" between the sugar chain structure and information on a disease refers to a certain sugar chain structure (preferably, information on a quantitative change in the sugar chain structure) or specific information on the change, and the disease level. Is referred to as a correlation. Such a relationship is called a correlation. Conventionally, the correlation between the sugar chain structure at the serum level and the disease level has not been known so far, and in the present invention, the discovery of such a correlation can be said to be a special effect.
本明細書において、 相関付けは、 少なくとも 1つの糖鎖構造の変化 （増減） ま たは変化の程度 （変化量） と、 細胞、 組織、 臓器、 分泌物または生体の変化 （例 えば、 疾患状態） とを関連付けること、 例えば、 ある糖鎖構造の増減または出現 もしくは消長と、 疾患状態のレベルまたは出現もしくは消長とを対応付けること によって行うことができる。 相関付けに使用される糖鎖構造の数は、 相関付けが 行うことができる限り少ない数であってよく、 通常少なくとも 1つ、 好ましくは 少なくとも 2つ、 より好ましくは少なくとも 3つであり得るがそれらに限定され ない。 特定の糖鎖、 および/または複数の糖鎖構造の増減または出現もしくは消 長と、 疾患の増減または出現もしくは消長とを対応付ける場合は、 行列式を利用 して数学的処理を行ってもよい。 好ましい実施形態では、 本明細書において示さ れるように、 特定の種の糖鎖を少なくとも 1種観察し、 相関付けに使用すること が十分であり得る。 従って、 特定の糖鎖の血清とにおけるレベルが疾患と対応づ けられている場合は、 その特定の糖鎖を調べることにより、 1種類であっても疾 患の診断を行うことができる。 As used herein, the correlation is defined as a change (increase or decrease) or degree of change (change amount) of at least one sugar chain structure and a change in a cell, tissue, organ, secretion or living body (eg, disease state). ), For example, by associating the increase or decrease or appearance or change of a certain sugar chain structure with the level or appearance or change of a disease state. The number of carbohydrate structures used for the correlation may be as small as the correlation can be performed, usually at least one, preferably at least two, more preferably at least three It is not limited to. When associating the increase / decrease or appearance or change of a specific sugar chain and / or a plurality of sugar chain structures with the increase / decrease or appearance or change of a disease, mathematical processing may be performed using a determinant. In a preferred embodiment, the As shown, it may be sufficient to observe at least one sugar of a particular species and use it for correlation. Therefore, when the level of a specific sugar chain in serum is associated with a disease, the disease can be diagnosed by examining the specific sugar chain even if it is of one type.
相関付けの具体的方法としては、 例えば、 特定の糠鎖と疾患の種類、 症状の種 類や程度およびその他の診断や治療に有用な情報を統計学的に処理して回帰曲線 を描く方法などが挙げられるがそれらに限定されない。  Specific methods of correlation include, for example, a method of statistically processing a specific bran chain and the type of disease, the type and degree of symptoms, and other information useful for diagnosis and treatment and drawing a regression curve. But not limited to them.
(診断） ' (Diagnosis) ''
本明細書において 「診断」 とは、 被検体における疾患の種類、 障害の種類と程 度、 身体状態などに関連する種々のパラメータを同定し、 そのような疾患、 障害、 状態の現状、 薬物反応性予測、 病態変化予測または原因を判定することをいう。 本発明の方法、 装置、 システムを用いることによって、 糖鎖構造を分析し、 疾患 の状態と相関付けることができ、 そのような情報を用いて、 被検体における疾患、 障害、 状態、 投与すべき薬物の種類や量など処置または予防のための処方物また は方法などの種々のパラメータを選定することができる。  As used herein, the term "diagnosis" refers to the identification of various parameters related to the type of disease, type and degree of disorder, physical condition, etc. in the subject, and the current state of such disease, disorder, condition, and drug reaction. Sex prediction, disease state change prediction, or determining the cause. By using the method, the device, or the system of the present invention, the sugar chain structure can be analyzed and correlated with the disease state, and the disease, disorder, condition, and administration in the subject should be administered using such information. Various parameters can be selected, such as formulation or method for treatment or prevention, such as type and amount of drug.
本発明の診断方法は、 原則として、 身体から出たものを利用することができる こと力 ら、 医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、 産業上有用である。  INDUSTRIAL APPLICABILITY The diagnostic method of the present invention is industrially useful because, in principle, it can use things that have come out of the body, and can be practiced separately from medical staff such as doctors.
(治療） (Treatment)
本明細書において 「治療」 とは、 ある疾患または障害について、 そのような状 態になった場合に、 そのような疾患または障害の悪化を防止、 好ましくは、 現状 維持、 より好ましくは、 軽減、 さらに好ましくは消長させることをいう。  As used herein, "treatment" refers to preventing the deterioration of a disease or disorder when such a condition occurs, preferably maintaining the status quo, more preferably reducing the disease, More preferably, it refers to fluctuating.
本明細書において 「被検体」 とは、 本発明の処置が適用される生物をいい、 As used herein, “subject” refers to an organism to which the treatment of the present invention is applied,
「患者」 ともいわれる。 患者または被検体は好ましくは、 ヒ トであり得る。 本明細書において 「病因」 とは、 被検体の疾患、 障害または状態 （本明細書に おいて、 総称して 「病変」 ともいい、 植物では病害ともいう） に関連する因子を レ、い、 例えば、 原因となる病原物質 （化学物質等を含む病原因子） 、 病原体、 病 変細胞、 病原ウィルス、 病原微生物、 物理的な力、 精神的に強い影響を与える言 葉や情況、 睡眠の不足、 偏った栄養や生活習慣などが挙げられるがそれらに限定 されない。 Also called a "patient." The patient or subject can preferably be human. As used herein, the term “pathogenesis” refers to a factor associated with a disease, disorder, or condition of a subject (also referred to herein as a “lesion” or a disease in plants). For example, causative pathogens (pathogenic factors including chemicals), pathogens, diseased cells, pathogenic viruses, pathogenic microorganisms, physical forces, words and situations that have a strong mental effect, lack of sleep, Examples include, but are not limited to, biased nutrition and lifestyle.
本発明が対象とする 「疾患」 は、 病因が関連する任意の疾患であり得る。 その ような疾患としては、 癌、 ウィルスまたは細菌による感染症、 アレルギー、 高血 圧、 高脂血症、 糖尿病、 心臓病、 脳梗塞、 痴呆症、 肥満、 動脈硬化性疾患、 不妊 症、 精神神経疾患、 白内障、 早老症、 紫外線放射線過敏症などが挙げられるがそ れらに限定されない。  The “disease” targeted by the present invention may be any disease associated with etiology. Such diseases include cancer, viral or bacterial infections, allergies, high blood pressure, hyperlipidemia, diabetes, heart disease, cerebral infarction, dementia, obesity, atherosclerotic disease, infertility, and psychiatric nerves. Diseases, cataracts, progeria, UV radiation hypersensitivity, and the like, but are not limited thereto.
本発明が対象とする 「障害」 は、 病因が関連する任意の障害であり得る。  The “disorder” targeted by the present invention can be any disorder associated with etiology.
そのような疾患、 障害または状態の具体例としては、 例えば、 循環器系疾患 (貧血 （例えば、 再生不良性貧血 （特に重症再生不良性貧血） 、 腎性貧血、 がん 性貧血、 二次性貧血、 不応性貧血など） 、 がんまたは腫瘍 （例えば、 白血病、 多 発性骨髄腫） など） ；神経系疾患 （痴呆症、 アルツハイマー病、 脳卒中おょぴそ の後遺症、 脳腫瘍、 脊髄損傷など） ；免疫系疾患 （T細胞欠損症、 白血病な ど） ；運動器 ·骨格系疾患 （骨折、 骨粗鬆症、 関節の脱臼、 亜脱臼、 捻挫、 靱帯 損傷、 変形性関節症、 骨肉腫、 ユーイング肉腫、 骨形成不全症、 骨軟骨異形成症 など） ；皮膚系疾患 （無毛症、 黒色腫、 皮膚悪性リンパ腫、 血管肉腫、 組織球症、 水疱症、 膿疱症、 皮膚炎、 湿疹など） ；内分泌系疾患 （視床下部 ·下垂体疾患、 甲状腺疾患 （甲状腺癌など） 、 副甲状腺 （上皮小体） 疾患、 副腎皮質 ·髄質疾患、 糖代謝異常、 脂質代謝異常、 タンパク質代謝異常、 核酸代謝異常、 先天性代謝異 常 （フェニールケトン尿症、 ガラクトース血症、 ホモシスチン尿症、 メーブ^/シ 口ップ尿症） 、 無アルブミン血症、 ァスコルビン酸合成能欠如、 高ビリルビン血 症、 高ビリルビン尿症、 カリクレイン欠損、 肥満細胞欠損、 尿崩症、 シン分泌異常、 侏儒症、 ウォルマン病 （酸リパーゼ （A c i d l i p a s e ) 欠損症） 、 ムコ多糖症 V I型など） ；呼吸器系疾患 （肺疾患 （例えば、 肺炎、 肺 がんなど） 、 気管支疾患、 肺がん、 気管支がんなど） ；消化器系疾患 （食道疾患 (例えば、 食道がん） 、 胃 ·十二指腸疾患 （例えば、 胃炎、 腸炎、 胃がん、 十二 指腸がんなど） 、 小腸疾患 ·大腸疾患 （例えば、 大腸ポリープ、 結腸がん、 直腸 がんなど） 、 胆道疾患、 肝臓疾患 （例えば、 肝硬変、 肝炎 （A型、 B型、 C型、 D型、 E型など） 、 劇症肝炎、 慢性肝炎、 原発性肝がん、 アルコール性肝障害、 薬物性肝障害） 、 膝臓疾患 （急性膝炎、 慢性膝炎、 睥臓がん、 嚢胞性膝疾患） 、 腹膜 ·腹壁'横隔膜疾患 （ヘルニアなど） 、 ヒルシュスプラング病など) ；泌尿 器系疾患 （腎疾患 （腎不全、 原発性糸球体疾患、 腎血管障害、 尿細管機能異常、 間質性腎疾患、 全身性疾患による腎障害、 腎がんなど） 、 膀胱疾患 （膀胱炎、 膀 胱がんなど） など） ；生殖器系疾患 （男性生殖器疾患 （男性不妊、 前立腺肥大症、 前立腺がん、 精巣がんなど） 、 女性生殖器疾患 （女性不妊、 卵巣機能障害、 子宮 筋腫、 子宮腺筋症、 子宮がん、 子宮内膜症、 卵巣がん、 絨毛性疾患など） な ど） ；循環器系疾患 （心不全、 狭心症、 心筋梗塞、 不整脈、 弁膜症、 心筋 ·心膜 疾患、 先天性心疾患 （例えば、 心房中隔欠損、 心室中隔欠損、 動脈管開存、 ファ ロー四徴） 、 動脈疾患 (例えば、 動脈硬化、 動脈瘤） 、 静脈疾患 （例えば、 静脈 瘤） 、 リンパ管疾患 （例えば、 リンパ浮腫） など） などが挙げられるがそれらに 限定されない。 Specific examples of such diseases, disorders or conditions include, for example, cardiovascular diseases (eg, anemia (eg, aplastic anemia (especially severe aplastic anemia)), renal anemia, cancerous anemia, secondary Anemia, refractory anemia, etc.), cancer or tumor (eg, leukemia, multiple myeloma), etc .; nervous system diseases (dementia, Alzheimer's disease, sequelae of stroke, brain tumor, spinal cord injury, etc.) ; Immune system diseases (T cell deficiency, leukemia, etc.); Motor organs and skeletal diseases (fractures, osteoporosis, joint dislocation, subluxation, sprains, ligament damage, osteoarthritis, osteosarcoma, Ewing sarcoma, bone) Dysplasia, osteochondrodysplasia, etc.); dermatological diseases (hairlessness, melanoma, cutaneous malignant lymphoma, angiosarcoma, histiocytosis, bullous disease, pustulosis, dermatitis, eczema, etc.); endocrine system diseases (Hypothalamus · Pituitary disease, thyroid disease (thyroid cancer, etc.), parathyroid (parathyroid) disease, adrenal cortex and medulla disease, abnormal glucose metabolism, abnormal lipid metabolism, abnormal protein metabolism, abnormal nucleic acid metabolism, abnormal metabolic abnormalities (phenyl ketone) Urinary disease, galactosemia, homocystinuria, meab ^ / syrup urine), analbuminemia, lack of ascorbic acid synthesis ability, hyperbilirubinemia, hyperbilirubinuria, kallikrein deficiency, mast cell deficiency, Diabetes insipidus, Syndrome abnormalities, Delta confection, Wolman disease (acid lipase (A cidlipase) deficiency), mucopolysaccharidosis VI, etc.); respiratory diseases (lung diseases (eg, pneumonia, lung cancer, etc.), bronchial diseases, lung cancer , Bronchial cancer, etc.); digestive diseases (esophageal disease (eg, esophageal cancer)), stomach and duodenal disease (eg, gastritis, enteritis, stomach cancer, duodenal cancer, etc.), small bowel disease, large bowel disease ( For example, colon polyp, colon cancer, rectal cancer, etc., biliary tract disease, liver disease (eg, cirrhosis, hepatitis (A, B, C, D, E, etc.), fulminant hepatitis, chronic hepatitis) , Primary liver cancer, alcoholic liver injury, drug-induced liver injury, knee disease (acute knee inflammation, chronic knee inflammation, overlying cancer, cystic knee disease), peritoneum · abdominal wall 'diaphragmatic disease (hernia etc.) ), Hirschsprung's disease, etc.); Urology Diseases (kidney disease (renal failure, primary glomerular disease, renal vascular disorder, renal tubular dysfunction, interstitial kidney disease, renal disorder due to systemic disease, kidney cancer, etc.), bladder disease (cystitis, bladder Reproductive diseases (male infertility, benign prostatic hyperplasia, prostate cancer, testicular cancer, etc.), female reproductive diseases (female infertility, ovarian dysfunction, fibroids, uterine adenomyosis) , Uterine cancer, endometriosis, ovarian cancer, chorionic disease, etc.); cardiovascular diseases (heart failure, angina, myocardial infarction, arrhythmia, valvular disease, myocardial / pericardial disease, congenital disease) Heart disease (eg, atrial septal defect, ventricular septal defect, patent ductus arteriosus, tetralogy of Fallot), arterial disease (eg, atherosclerosis, aneurysm), venous disease (eg, varicose vein), lymphatic disease (For example, lymphedema). But not limited to them.
本明細書において 「I g Gに関連する疾患」 とは、 I g Gの状態 （例えば、 糖 鎖の状態） がその疾患の症状などに関連するものをいう。 そのような疾患として は、 慢性関節リウマチ、 自己免疫疾患、 アレルギー、 IgA腎症、 アトピー性皮膚 炎、 糖尿病、 肝疾患、 筋ジストロフィー、 シユーンダレーン症候群、 ゥヱゲナー 肉芽腫、 高血圧などが挙げられるがそれらに限定されない。  As used herein, “IgG-related disease” refers to a condition in which the state of IgG (eg, the state of sugar chains) is related to the symptoms of the disease. Such diseases include, but are not limited to, rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, allergies, IgA nephropathy, atopic dermatitis, diabetes, liver disease, muscular dystrophy, Schoondalene syndrome, Pegener's granulomas, hypertension, etc. .
本明細書において 「慢性関節リウマチ」 とは、 単に 「リウマチ」 ともいい、 全 身性の疾患であり、 結合糸且織を侵す疾患を言う。 臨床症状としては、 関節炎が主 に挙げら; Τι、 関節炎は、 多数の関節 （例えば、 手足） において関節軟部組織の肥 厚を生じる。 通常、 関節軟骨を滑膜組織がおおい軟骨を侵食するといわれる。 関 節の変形および廃疾がしばしば起きるといわれる。 In the present specification, “rheumatoid arthritis” is simply referred to as “rheumatoid”, is a systemic disease, and refers to a disease affecting the connective tissue. Arthritis is the main clinical manifestation Arthritis causes thickening of soft tissue in many joints (eg, limbs). Normally, it is said that the synovial tissue covers articular cartilage and erodes cartilage. It is said that joint deformation and destruction often occur.
本明細書において 「薬剤」 とは、 ある状態、 障害または疾患 （または病害） を 処置、 予防または予後のために使用するために用いられる物をいう。 本明細書で は、 薬剤は、 医薬、 農薬などと互換的に使用され得るがそれに限定されない。 従 つて薬剤は、 医薬であってもよく、 農薬であっても、 またそれらの候補物質であ つてもよいし、 冷却、 加温、 マッサージ、 カウンセリングや X線、 運動療法、 外 科的手術など障害に好ましい影響を与えるもの全てを示す。 薬剤が標的とする対 象としては、 例えば、 被検体自体の細胞、 組織または臓器 （器官） 、 あるいは病 因 （例えば、 がん細胞、 細菌、 真菌、 ウィルス、 真核生物など） が挙げられるが それらに限定されない。 ここで、 がん細胞は被検体自体の細胞の範疇にも入り、 病因の範疇にも入るが、 本発明の解釈においてはそのような重複は影響を与えな いことが当業者に理解されるべきである。 そのような薬剤のうち動物 （好ましく は、 ヒトを含む霊長類のような哺乳動物） としては、 例えば、 以下のような薬剤 が挙げられるがそれらに限定されない：  As used herein, “drug” refers to a substance used for treating, preventing or prognosing a condition, disorder or disease (or disease). As used herein, a drug may be used interchangeably with, but not limited to, a medicament, a pesticide, and the like. Therefore, the drug may be a medicament, a pesticide, or a candidate for them, and may include cooling, warming, massage, counseling, X-rays, exercise therapy, surgical surgery, etc. Anything that positively affects the disability is indicated. Targets targeted by the drug include, for example, the subject's own cells, tissues or organs, or pathogenesis (eg, cancer cells, bacteria, fungi, viruses, eukaryotes, etc.). Not limited to them. Here, cancer cells fall into the category of cells of the subject itself and also fall into the category of etiology, but it is understood by those skilled in the art that such duplication has no effect in the interpretation of the present invention. Should. Among such drugs, animals (preferably mammals such as primates, including humans) include, but are not limited to, the following drugs:
中枢神経系用薬 （例えば、 全身麻酔剤、 催眠鎮静剤、 抗不安剤、 抗癲癇剤、 解 熱鎮痛消炎剤、 興奮剤、 覚醒剤、 抗パーキンソン剤、 精神神経用剤、 総合感冒剤、 その他の中枢神経系用薬など） ；  Central nervous system drugs (for example, general anesthetics, hypnotics, sedatives, anxiolytics, antiepileptics, antipyretic analgesics and anti-inflammatory drugs, stimulants, stimulants, antiparkinson drugs, psychiatric drugs, general cold remedies, other Drugs for central nervous system);
末梢神経用剤 （例えば、 局所麻酔剤、 骨格筋弛緩剤、 自律神経剤、 鎮けい剤な ど） ；  Peripheral nerve agents (eg, local anesthetics, skeletal muscle relaxants, autonomic nerve agents, anticonvulsants, etc.);
感覚器官用薬 （例えば、 眼科用剤、 耳鼻科用剤、 鎮暈剤など） ；  Drugs for sensory organs (eg, ophthalmic agents, otolaryngological agents, analgesics, etc.);
循環器官用薬 （例えば、 強心剤、 不整脈用剤、 利尿剤、 血圧降下剤、 血管収縮 剤、 血管拡張剤、 高脂血症用剤、 その他の循環器官用薬など） ；  Cardiovascular drugs (eg, cardiotonic, arrhythmic, diuretic, antihypertensive, vasoconstrictor, vasodilator, hyperlipidemic, other cardiovascular drugs, etc.);
呼吸器官用薬 （例えば、 呼吸促進剤、 鎮咳剤、 去痰剤、 鎮咳去痰剤、 気管支拡 張剤、 含嗽剤など） ； 消化器官用薬 （例えば、 止瀉剤、 整腸剤、 消化性潰瘍用剤、 健胃消化剤、 制酸 剤、 下剤、 浣腸剤、 利胆剤、 その他の消化器官用薬など） ； Respiratory drugs (eg, respiratory stimulants, antitussives, expectorants, antitussive expectorants, bronchodilators, gargles, etc.); Gastrointestinal drugs (eg, antidiarrheal, anti-intestinal, peptic ulcer, stomachic, antacids, laxatives, enemas, bile drugs, other gastrointestinal drugs);
ホルモン剤 （例えば、 脳下垂体ホルモン剤、 唾液腺ホルモン剤、 甲状腺、 副甲 状腺ホルモン剤、 蛋白同化ステロイド剤、 副腎ホルモン剤、 男性ホルモン剤、 卵 胞、 黄体ホルモン剤、 混合ホルモン剤、 その他のホルモン剤など） ；  Hormonal agents (for example, pituitary hormone agents, salivary hormone agents, thyroid gland, parathyroid hormone agents, anabolic steroid agents, adrenal hormone agents, male hormone agents, follicles, luteal hormone agents, mixed hormone agents, other Hormones, etc.);
泌尿生殖器官および肛門用薬 （例えば、 泌尿器官用剤、 生殖器官用剤、 子宮収 縮剤、 痔疾用剤、 他の泌尿生殖器管、 肛門用薬など） ；  Genitourinary and anal drugs (eg, urologic, genital, uterine atrophy, hemorrhoids, other genitourinary and anal drugs);
外皮用薬 （例えば、 外皮用殺菌消毒剤、 創傷保護剤、 化膿性疾患用剤、 鎮痛、 鎮痒、 収斂、 消炎剤、 寄生性皮膚疾患用剤、 皮膚軟化剤、 毛髪用剤、 その他の外 皮用剤など） ；  Dermatological agents (e.g., germicidal disinfectants for dermis, wound protectants, suppurative diseases, analgesic, itching, astringent, anti-inflammatory, parasitic dermatological agents, emollients, hair agents, other dermis Agents);
歯科口腔用剤；  Dental oral preparations;
その他の個々の器官系用薬；  Other individual organ system drugs;
ビタミン剤 （例えば、 ビタミン A剤、 ビタミン D剤、 ビタミン B剤、 ビタミン C剤、 ビタミン E剤、 ビタミン K剤、 混合ビタミン剤、 その他のビタミン剤な ど） ；  Vitamin preparations (for example, vitamin A preparations, vitamin D preparations, vitamin B preparations, vitamin C preparations, vitamin E preparations, vitamin K preparations, mixed vitamin preparations, and other vitamin preparations);
滋養強壮薬 （例えば、 カルシウム剤、 無機質製剤、 糖類剤、 蛋白アミノ酸製剤、 臓器製剤、 乳幼児用剤、 その他の滋養強壮剤など） ；  Nourishing tonics (eg, calcium, minerals, sugars, protein amino acids, organs, infants, other tonics, etc.);
血液おょぴ体液用薬 （例えば、 血液代用剤、 止血剤、 血液凝固阻止剤、 その他 の血液、 体液用剤など） ；  Blood and body fluids (eg, blood substitutes, hemostatic agents, anticoagulants, other blood and body fluid agents);
人工透析用薬 （例えば、 人工腎臓透析用剤、 腹膜透析用剤など） ；  Artificial dialysis agents (eg, artificial kidney dialysis agents, peritoneal dialysis agents, etc.);
その他の代謝性医薬品 (例えば、 臓疾患用剤、 解毒剤、 習慣性中毒用剤、 痛風 治療剤、 酵素製剤、 糖尿病用剤、 他に分類されない代謝性薬など） ；  Other metabolic drugs (eg, drugs for organ diseases, antidotes, addictive drugs, gout treatments, enzyme preparations, diabetes drugs, metabolic drugs not classified elsewhere);
細胞賦活用剤 （例えば、 クロロフィル製剤、 色素製剤、 その他の細胞賦活用剤 など） ；  Cell enhancers (eg, chlorophyll preparations, pigment preparations, other cell enhancers, etc.);
腫瘍用薬 （例えば、 アルキル化剤、 代謝拮抗剤、 抗腫瘍性抗生物質製剤、 抗腫 瘍性植物成分製剤、 その他の腫瘍用剤など） ； 放射性医薬品； Oncology drugs (eg, alkylating agents, antimetabolites, antitumor antibiotics, antitumor plant component preparations, other oncology agents, etc.); Radiopharmaceuticals;
アレルギー用薬 （例えば、 抗ヒスタミン剤、 刺激療法剤、 非特異性免疫原製剤、 その他のアレルギー用薬、 生薬および漢方処方に基づく医薬品、 生薬、 漢方製剤、 その他の生薬漢方処方に基づく製剤など） ；  Allergy drugs (eg, antihistamines, stimulants, non-specific immunogen preparations, other allergy drugs, crude drugs and Chinese medicine-based drugs, crude drugs, Kampo preparations, other crude drug-based preparations);
抗生物質製剤 （例えば、 グラム陽性菌に作用する、 グラム陰性菌に作用する、 グラム陽、 陰性菌に作用、 グラム陽性菌マイコプラズマ作用、 グラム陽性陰性、 リケッチアに作用、 抗酸菌に作用するもの、 真菌 （力ビ） に作用するもの、 その 他の抗生物質製剤など） ；  Antibiotics (eg, act on gram-positive bacteria, act on gram-negative bacteria, act on gram-positive and -negative bacteria, act on gram-positive mycoplasma, act on gram-positive negatives, rickettsia, act on acid-fast bacteria, Those acting on fungi, other antibiotics, etc.);
化学療法剤 （例えば、 サルファ剤、 抗結核剤、 合成抗菌剤、 抗ウィルス剤、 そ の他の化学療法剤など） ；  Chemotherapeutic agents (eg, sulfa drugs, antituberculosis agents, synthetic antibacterial agents, antiviral agents, other chemotherapeutic agents, etc.);
生物学的製剤 （例えば、 ワクチン類、 毒素、 トキソイド類、 抗毒素、 抗レブト スピラ血清、 血液製剤類、 生物学的試験用製剤類、 その他の生物学的製剤、 抗原 虫剤、 駆虫剤など） ；  Biological products (eg, vaccines, toxins, toxoids, antitoxins, anti-levutospira serum, blood products, biological test preparations, other biological products, antiprotozoal agents, anthelmintics, etc.);
調剤用薬 （例えば、 賦形剤、 軟膏基剤、 溶解剤、 矯味、 矯臭、 着色剤、 その他 の調剤用剤など） ；  Pharmaceutical preparations (eg, excipients, ointment bases, solubilizers, flavors, odor corrections, coloring agents, other preparations, etc.);
診断用薬 （例えば、 X腺造影剤、 機能検査用試薬、 その他の診断用薬） ； 公衆衛生用薬 （例えば、 防腐剤） ；  Diagnostic agents (eg, X-ray contrast agents, functional test reagents, other diagnostic agents); public health agents (eg, preservatives);
体外診断用医薬品 (例えば、 細菌学的検査用薬など） ； ―  In vitro diagnostics (eg, bacteriological agents);
分類されない治療を主目的としない薬剤；ならびに  Drugs not primarily intended for unclassified treatment; and
麻薬 （例えば、 あへんアルカロイド系麻薬、 コカアルカロイド系製剤、 合成麻 薬など） 。  Drugs (eg, opium alkaloid drugs, coca alkaloid drugs, synthetic drugs, etc.).
温熱、 冷却、 超音波、 X線等放射線、 固定、 カウンセリング、 外科的切除、 運 動療法などは薬物ではないが疾患に於いて被検体に好ましレ、影響を与えるもので あり、 本明細書に言う 「薬剤」 に含まれる。  Heating, cooling, ultrasound, radiation such as X-rays, immobilization, counseling, surgical resection, exercise therapy, etc. are not drugs but are preferred and affect the subject in the disease. It is included in "drugs".
本明細書において薬剤の 「有効量」 とは、 その薬剤が目的とする薬効が発揮す ることができる量をいう。 本明細書において、 そのような有効量のうち、 最小の 濃度を最小有効量ということがある。 そのような最小有効量は、 当該分野におい て周知であり、 通常、 薬剤の最小有効量は当業者によって決定されているか、 ま たは当業者は適宜決定することができる。 そのような有効量の決定には、 実際の 投与のほか、 動物モデルなどを用いることも可能である。 本発明はまた、 このよ うな有効量を決定する際に有用である。 As used herein, the term “effective amount” of a drug refers to an amount by which the drug can exert a desired drug effect. As used herein, among such effective amounts, The concentration is sometimes called the minimum effective dose. Such minimum effective amounts are well known in the art, and usually the minimum effective amount of a drug is determined by those skilled in the art, or can be determined by the skilled artisan as appropriate. In determining such an effective amount, an animal model can be used in addition to the actual administration. The present invention is also useful in determining such an effective amount.
本明細書において 「薬学的に受容可能なキャリア」 は、 医薬または動物薬のよ うな農薬を製造するときに使用される物質であり、 有効成分に有害な影響を与え ないものをいう。 そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、 例えば、 以 下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、 保存剤、 着色料、 風味料、 および希釈剤、 乳化剤、 懸濁化剤、 溶媒、 ブイラ一、増量剤、 緩衝剤、 送達ビヒ クル、 賦形剤および/または農学的もしくは薬学的アジュバント。  As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" refers to a substance used when producing agricultural chemicals such as pharmaceuticals or veterinary drugs, which does not adversely affect the active ingredient. Such pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, for example, antioxidants, preservatives, coloring agents, flavorings, and diluents, emulsifiers, suspending agents, Solvents, boilers, extenders, buffers, delivery vehicles, excipients and / or agricultural or pharmaceutical adjuvants.
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、 本発明の方法に よって得られた情報 (例えば、 疾患に関する情報） を元に、 使用目的、 対象疾患 (種類、 重篤度など） 、 患者の年齢、 体重、 性別、 既往歴、 投与される被検体の 部位の形態または種類などを考慮して、 当業者が容易に決定することができる。 本発明のモニタリング方法を被検体 （または患者） に対して施す頻度もまた、 使 用目的、 対象疾患 （種類、 重篤度など） 、 患者の年齢、 体重、 '性別、 既往歴、 お よび治療経過などを考慮して、 当業者が容易に決定することができる。 疾患状態 をモニタリングする頻度としては、 例えば、 毎日一数ケ月に 1回 （例えば、 1週 間に 1回一 1ヶ月に 1回） のモユタリングが挙げられる。 1週間一 1ヶ月に 1回 のモニタリングを、 経過を見ながら施すことが好ましい。  The type and amount of the drug used in the treatment method of the present invention are determined based on the information obtained by the method of the present invention (for example, information on a disease), the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.). It can be easily determined by those skilled in the art in consideration of the patient's age, weight, sex, medical history, form or type of the site of the subject to be administered, and the like. The frequency of applying the monitoring method of the present invention to a subject (or patient) also depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, 'sex, medical history, and treatment. A person skilled in the art can easily determine it in consideration of the progress and the like. The frequency of monitoring the disease state may include, for example, monitoring once every few months (eg, once a week, once a month). It is preferable to conduct monitoring once a week and once a month while monitoring the progress.
本明細書において 「指示書」 は、 本発明のティラーメイド治療方法などを医師、 患者など投与を行う人に対して記載したものである。 この指示書は、 本発明の医 薬などを例えば、 放射線治療直後または直前 （例えば、 2 4時間以内など） に投 与することを指示する文言が記載されている。 この指示書は、 本発明が実施され る国の監督官庁 （例えば、 日本であれば厚生労働省、 米国であれば食品医薬品局 (FDA) など） が規定した様式に従って作成され、 その監督官庁により承認を 受けた旨が明記される。 指示書は、 いわゆる添付文書 （p a c k a g e i n s e r t) であり、 通常は紙媒体で提供されるが、 それに限定されず、 例えば、 電 子媒体 （例えば、 インターネットで提供されるホームページ、 電子メール） のよ うな形態でも提供され得る。 In the present specification, the “instruction” is a description of a tiller-made treatment method of the present invention for a person who administers such as a doctor or a patient. This instruction describes a word indicating that the medicine of the present invention is to be administered, for example, immediately after or immediately before radiation treatment (for example, within 24 hours). This directive is issued by the competent authority of the country in which the invention is implemented (eg, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan, and the Food and Drug Administration in the United States). (FDA), etc., and specify that it has been approved by its regulatory authority. Instructions are so-called package inserts, which are usually provided on paper, but are not limited to them, for example, in the form of electronic media (eg, homepages provided on the Internet, e-mail). But can be provided.
必要に応じて、 本発明の治療では、 2種類以上の薬剤が使用され得る。 2種類 以上の薬剤を使用する場合、 類似の性質または由来の物質を使用してもよく、 異 なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。 このような 2種類以上の薬剤を投 与する方法のための疾患レベルに関する情報も、 本努明の方法によつて入手する ことができる。  If desired, more than one drug may be used in the treatment of the present invention. When two or more drugs are used, substances having similar properties or origins may be used, or drugs having different properties or origins may be used. Information on disease levels for methods of administering more than one such drug can also be obtained by the methods of this effort.
本発明ではまた、 得られた疾患に関する情報を元に、 遺伝子治療を施すことも 可能である。 遺伝子治療とは、 発現されたか、 または発現可能な核酸の、 被験体 への投与により行われる治療をいう。 本発明のこの実施形態において、 核酸は、 それらのコードされたタンパク質を産生し、 そのタンパク質は治療効果を媒介す る。  In the present invention, gene therapy can also be performed based on the obtained information on the disease. Gene therapy refers to therapy performed by the administration of an expressed or expressible nucleic acid to a subject. In this embodiment of the invention, the nucleic acids produce their encoded proteins, which mediate a therapeutic effect.
遺伝子治療方法もまた、 本発明において併用され得る。 例示的な方法は、 以下 のとおりである。 そのような遺伝子治療は、 例えば、 疾患レベルを改変するため に用いることができる。  Gene therapy methods can also be used in the present invention. An exemplary method is as follows. Such gene therapy can be used, for example, to alter disease levels.
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、 Go l d s p i e lら， C l i n i c a l Ph a rma c y 12 : 488— 505 (1993) ； Wuおよ ぴ Wu, B i o t h e r a p y 3 : 87— 95 (1 991) ； To l s t o s h e v, Ann. Re v. Ph a rma c o l . To i c o l . 32 : 573 一 596 (1993) ； Mu l l i g a n, S c i e n c e 260 : 926— 932 (1993) ；ならびに Mo r g a nおよび An d e r s o n， Ann. Re v. B i o c h e m. 62 ： 191-217 (1 993) ； Ma y, T I B TECH 11 (5) : 155— 215 (1993) を参照のこと。 遺伝子治療 において使用される一般的に公知の組換え DN A技術は、 Au s ub e 1ら (編) , Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y, J o hn Wi l e y & S o n s, N.Y (1993) ；およ ぴ K r i e g l e r, Ge n e Tr a n s f e r a n d Ex p r e s s i o n, A L a b o r a t o r y Ma nu a l , S t o c k t o n P r e s s， NY (1990) に記載される。 For a general review of gene therapy methods, see Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and ぴ Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tostocol. 32: 573-596 (1993); Muligan, Science 260: 926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Bioche m. 62: 191-217 (1993); May, TIB TECH 11 (5): 155—215 (1993). Gene therapy The commonly known recombinant DNA techniques used in Ausube 1 et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, AL aboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
本発明では、 いったん類似の種類 （例えば、 ヒ トに対するマウスなど） の生物、 培養細胞、 組織などに関し、 ある特定の糖鎖構造の分析結果と、 疾患レベルとが 相関付けられた場合、 対応する糖鎖構造の分析結果と、 疾患レベルとが相関付け ることができることは、 当業者は容易に理解する。 そのような事項は、 例えば、 動物培養細胞マニュアル、 瀬野ら編著、 共立出版、 1993年などに記載され支 持されており、 本明細書においてこのすベての記載を援用する。  In the present invention, once an analysis result of a specific sugar chain structure is correlated with a disease level with respect to an organism, a cultured cell, a tissue, or the like of a similar kind (for example, a mouse for a human), a response is taken if the disease level is correlated Those skilled in the art readily understand that the analysis result of the sugar chain structure can be correlated with the disease level. Such matters are described and supported, for example, in Animal Culture Cell Manual, edited by Seno et al., Kyoritsu Shuppan, 1993, and the entire description is herein incorporated by reference.
(本明細書において用いられる一般的技術）  (General techniques used in this specification)
本明細書において使用される技術は、 そうではないと具体的に指示しない限り、 当該分野の技術範囲内にある、 糖鎖科学、 マイクロフルイデイクス、 微細加工、 有機化学、 生化学、 遺伝子工学、 分子生物学、 微生物学、 遺伝学および関連する 分野における周知慣用技術を使用する。 そのような技術は、 例えば、 以下に列挙 した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に 説明されている。  The techniques used herein are within the skill of the art, unless otherwise indicated, in the art of glycoscience, microfluidics, microfabrication, organic chemistry, biochemistry, genetic engineering. It uses well known techniques in molecular biology, microbiology, genetics and related fields. Such techniques are explained fully, for example, in the literature listed below and in the literature cited elsewhere herein.
微細加工については、 例えば、 C amp b e 1 1, S. A. (1996) . T h e S c i e n c e a n d En g i n e e r i n g o f Mi c r o e l e c t r o n i c F a b r i c a t i o n, Ox f o r d Un i v e r s i t y P r e s s ； Z a u t, P. V. (1996) . Mi c r om i c r o a r r a y F a b r i c a t i o n ^ P r a c t i c a l Gu i d e t o S em i c o n du c t o r P r o c e s s i n g, S em i c o n d u c t o r S e r v i c e s ; Ma d o u, M. J. (1997) . Fun d ame n t a 1 s o f Mi c r o f a b r i c a t i o n, C R C 1 5 P r e s s ； Ra i -Ch o u dhu r y, P. (1997) . Ha n d b o o k o f Mi c r o l i t h o g r a p y, Mi c r oma c h i n i n g, & Mi c r o f a b r i c a t i o n : Mi c r o l i t h o g r a p hyな どに記載されており、 これらは本明細書において関連する部分が参考として援用 される。 For microfabrication, see, for example, Camp be 11 1, SA (1996). T he Science and Engineering of Microelectronic Fabrication, Ox ford Un iversity Press; Zaut, PV (1996). Mi crom icroarray Fabrication ^ Practical Guideto S em icon du ctor Processing, S em iconductor Services; Ma dou, MJ (1997). ame nta 1 sof Mi crofabrication, CRC 15 Press; Ra i-Chou dhu ry, P. (1997) .Handbook of Mi crolithograpy, Mi croma chining, & Mi crofabrication: Mi crolithograp hy, etc. And the relevant portions are incorporated herein by reference.
本明細書において用いられる分子生物学的手法、 生化学的手法、 微生物学的手 法、 糖鎖科学的手法は、 当該分野において周知であり慣用されるものであり、 例 えば、 Ma n i a t i s， T. e t a 1. (1989) . Mo l e c u l a r C l o n i n g ： A L a b o r a t o r y Ma nu a l, Co l d S p r i n g H a r b o rぉょぴその 3 r d E d. (2001) ； Au s ub e 1 , F . M. , e t a 1. e d s, Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y, J o hn Wi l e y & S o n s I n c. , NY, 10158 (2000) ； I nn i s, M. A. (19 90) . PGR P r o t o c o l s ： A Gu i d e t o Me t h o d s a n d Ap p l i c a t i o n s, Ac a d emi c P r e s s ； I nn i s , M. A. e t a 1. (1995) . PGR S t r a t e g i e s, A c a d e m i c P r e s s ； Sn i n s k y, J . J. e t a 1. (1 99 9 ) . PGR Ap p l i c a t i o n s ： P r o t o c o l s f o r F u n o t i o n a l Ge n omi c s, Ac a d emi c P r e s s ； Ga i t , M. J . (1985) . O l i g o nu c l e o t i d e S y n t h e s i s : A P r a c t i c a l Ap p r o a c h, I R L P r e s s ； G a i t , M. J . (1990) . O l i g o nu c l e o t i d e S y n t h e s i s ： A P r a c t i c a l Ap p r o a c h, I R L P r e s s ； E c k s t e i n, F. (1 991) . O l i g o nu c l e o t i d e s a n d An a l o g u e s : A P r a c t i c a l A p p r o a c , I R L P r e s s J Ad ams, R. L. e t a 1. (1992) . Th e B i o c h em i s t r y o f t h e Nu c l e i c Ac i d s, Ch a ma n & Ha l l ; Sh a b a r o v a， Z. e t a 1. (1994) . Adv a n c e d Or g a n i c Ch emi s t r y o f Nu c l e i c Ac i d s, We i nh e im ; B l a c k b u r n, G. M. e t a 1.The molecular biological techniques, biochemical techniques, microbiological techniques, and glycoscience techniques used in this specification are well known and commonly used in the art, and are described in, for example, Maniatis, T. Molecular Cloning: AL aboratory Manual, Cold Spring Harbor 3rd Ed. (2001); Ausube 1, F.M., eta. 1. eds, Cu rrent Protocolsin Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., NY, 10158 (2000); In nn is, MA (1990). PGR Protocols: A Gu ideto Me thodsand Ap plications, Accad mic Press; Innis, MA eta 1. (1995). PGR S trategies, Academic Press; Sn insky, J. J. eta 1. (199 9). PGR Ap plications: Protocols for Functional Genomics, Ademic Press; Gait, M. J. (1985). Oligo nu cleotide Synthesis: AP ractical Ap proach, IRLP ress; G ait, M. J. (1990). Oligo nu cleotide Synthesis: AP ractical Ap proach, IRLP ress; Eckstein, F. (1991). O ligo nu cleotidesand An alogues: AP ractical A pproac, IRL Press J Ad ams, RL eta 1. (1992) .Th e B ioch em istryofthe Nucleic Acids, Ch a man &Hall; Sha barova, Z. eta 1. (1994) .Advanced Or ganic Ch emi stryof Nu cleic Ac ids, We inh e im; B lackburn, GM eta 1.
(1996) . Nu c l e i c Ac i d s i n Ch em i s t r y a n d B i o l o g y, Ox f o r d Un i v e r s i t y P r e s s ； H e r m a n s o n, G. T. (1996) . B i o c o n j u g a t e Te c h n i qu e s, Ac a d em i c P r e s s ； Me t h o d i n E n z y mo 1 o g y 230、 242、 247、 Ac a d em i c P r e s s、 19 94 ；別冊実験医学 「遺伝子導入 &発現解析実験法」 羊土社、 1997 ；畑中、 西村ら、 糖質の科学と工学、 講談社サイェンティフイク、 1997 ；糖鎖分子の 設計と生理機能 日本化学会編、 学会出版センター、 2001などに記載されて おり、 これらは本明細書において関連する部分 （全部であり得る） が参考として 援用される。 (1996) .Nucleic Ac idsin Chem istryand Biology, Ox ford Un iversity P ress; Hermanson, GT (1996) .B ioconjugate Tech chni ques, Ac ad emic P ress; Me thodin Enzy mo 1 ogy 230, 242, 247, Ad emic Press, 1994; Separate experimental medicine "Experimental method for gene transfer and expression analysis" Yodosha, 1997; Hatanaka, Nishimura et al., Carbohydrate science and engineering, Kodansha Scientif Iku, 1997; Design and Physiological Function of Sugar Chain Molecules, described in The Chemical Society of Japan, Academic Publishing Center, 2001, etc., and the relevant portions (which may be all) are incorporated herein by reference. .
(スクリーニング） (Screening)
本明細書において、 「スクリーニング」 とは、 目的とするある特定の性質をも つ物質または生物などを、 特定の操作および/または評価方法で多数の候補から 選抜することをいう。 本明細書では、 本発明によって得られた疾患に関する情報 を用いることによって、 さらなる薬剤のスクリーニングを行うことができる。 ス クリーニングは、 インビトロ、 インビポなど実在物質を用いた系を使用してもよ く、 インシリコ （コンピュータを用いた系） の系を用いて生成されたライブラリ 一を用いてもよい。 本発明では、 所望の活性を有するスクリーニングによって得 られた化合物もまた、 本発明の範囲内に包含されることが理解される。 従って、 本発明では、 本発明の開示をもとに、 疾患を考慮したコンピュータモデリングに よる薬物が提供されることも企図される。 As used herein, the term “screening” refers to selecting a substance or an organism having a specific property of interest from a large number of candidates by a specific operation and / or evaluation method. In the present specification, further drug screening can be performed by using the information on the disease obtained by the present invention. For screening, a system using real substances such as in vitro and in vivo may be used, or a library generated using an in silico (computer-based) system may be used. In the present invention, it is understood that compounds obtained by screening having a desired activity are also included in the scope of the present invention. Therefore, in the present invention, based on the disclosure of the present invention, computer modeling considering diseases is performed. It is also contemplated that such drugs are provided.
(好ましい実施形態の説明） (Description of a preferred embodiment)
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、 この実施形態は本発明の例示で あり、 本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解さ れるべきである。 当業者はまた、 以下のような好ましい実施例を参考にして、 本 発明の範囲内にある改変、 変更などを容易に行うことができることが理解される べきである。  The description of the preferred embodiment is set forth below, but it should be understood that this embodiment is exemplary of the invention and that the scope of the invention is not limited to such preferred embodiments. It should be understood that those skilled in the art can also easily make modifications and changes within the scope of the present invention by referring to the following preferred embodiments.
1つの局面において、 本発明は、 被検体からの血淸を用いて疾患を診断する方 法であって、 （a ) 被検体からの血清に含まれる糖鎖を分析する工程；および ( b ) 分析された該糖鎖と、 疾患に関する情報とを相関付ける工程、  In one aspect, the present invention provides a method for diagnosing a disease using blood from a subject, comprising: (a) analyzing a sugar chain contained in serum from the subject; and (b) Correlating the analyzed sugar chains with information about a disease,
を包含する、 方法を提供する。 A method is provided.
あるいは、 本発明は、 被検体からの血清を用いて疾患を診断するシステムであ つて、 （a ) 被検体からの血清に含まれる糖鎖を分析する手段；および （b ) 分 析された該糖鎖と、 疾患に関する情報とを相関付ける手段、 を包含する、 システ ムを提供する。  Alternatively, the present invention provides a system for diagnosing a disease using serum from a subject, comprising: (a) means for analyzing a sugar chain contained in serum from the subject; And a means for correlating the sugar chain with information about a disease.
ここで、 被検体からの血清などの試料を提供する方法または手段は、 当該分野 において周知であり、 どのような技術を用いて調製または提供してもよい。 本発 明では、 そのような試料が何らかの形で提供されることで十分であり、 その調製 方法または手段は問わない。 そのような試料調製方法としては、 例えば、 採血な どによって、 血液を採取し、 その後遠心分離によって血清を調製することができ る。 I g Gが必要であるときは、 血清よりァフィ二ティーカラム （例えば、 プロ ティン Gカラム） などを用いて精製することができる。  Here, a method or means for providing a sample such as serum from a subject is well known in the art, and may be prepared or provided using any technique. In the present invention, it is sufficient for such a sample to be provided in some form, regardless of its preparation method or means. As such a sample preparation method, for example, blood can be collected by collecting blood, and then serum can be prepared by centrifugation. When IgG is required, it can be purified from serum using an affinity column (eg, protein G column).
好ましい実施形態において、 本発明の方法またはシステムが分析対象とする糖 鎖は、 血清レベルと I g Gレベルとでほぼ同じ挙動をすることが判明している種 であることが有利であるがそれに限らない。 血清レベルと I g Gレベルとで糖鎖 の挙動の関連性は知られておらず、 本発明により IgGを精製する必要が無くなり 簡易に疾患による糖鎖変化が解析できること、 IgG以外の血清中糖タンパク質糖 鎖も同時に解析されるために IgG以外の他の糖タンパク質糖鎖の変化も同時に検 出でき汎用性が広がることが期待できる。 本発明は、 このような対応関係を初め て示したという点で格別の効果を示す。 従って、 本発明は、 そのような予想外の 発見に基づいて診断およびテーラーメィド治療を行うことを達成したという効果 を奏する。 In a preferred embodiment, the carbohydrates analyzed by the method or system of the present invention are advantageously species that have been found to behave approximately the same at serum and IgG levels, but Not exclusively. Carbohydrates at serum and IgG levels The present invention does not know the relevance of the behavior, and the present invention eliminates the need to purify IgG, making it possible to easily analyze changes in sugar chains due to diseases. Changes in glycoprotein sugar chains other than the above can be detected at the same time, and it is expected that versatility will be expanded. The present invention shows a remarkable effect in that such a correspondence is shown for the first time. Therefore, the present invention has an effect of achieving diagnosis and tailor-made treatment based on such unexpected findings.
好ましい実施形態において、 本発明が分析対象とする糖鎖構造は、 複数の糖鎖 構造のセットを含むことが有利であり得る。 複数の糖鎖構造のセットを分析する ことによって、 疾患状態の情報との相関付けがより詳細に検討することができる からである。 血清由来の複数の糖鎖構造のセットの情報と、 疾患状態の情報とが、 相関付けることができることは従来知られておらず、 本発明は、 そのような予想 外の発見に基づいて診断おょぴテーラーメイド治療を行うことを達成したという 効果を奏する。  In a preferred embodiment, the sugar chain structure to be analyzed by the present invention may advantageously include a plurality of sets of sugar chain structures. By analyzing a plurality of sets of sugar chain structures, correlation with disease state information can be examined in more detail. It has not been known that information of a set of a plurality of sugar chain structures derived from serum and information of a disease state can be correlated, and the present invention provides a diagnostic and diagnostic method based on such unexpected findings. It has the effect of achieving tailor-made treatment.
好ましい実施形態において、 本発明が分析対象とする情報は、 慢性関節リウマ チに関する情報である。 慢性関節リウマチは、 対象となる被検体中の免疫関連状 態すなわちィムノグロプリンの変化に起因することから、 従来は、 そのィムノグ 口プリンに関連する任意の情報に基づいて診断する試みがなされていた。 本発明 では、 慢性関節リウマチの状態が、 ィムノグロブリンの特定の糖鎖に関連づけら れ、 かつ、 その特定の糖鎖の変化の一部が血清において反映されていることが見 出されたことから糖タンパク質を精製する必要が無くなり、 診断およびテーラー メイド治療において多大な利点を有する。  In a preferred embodiment, the information to be analyzed by the present invention is information on rheumatoid arthritis. Rheumatoid arthritis is caused by changes in the immune-related condition, ie, immunoglobulin, in the subject. Conventionally, an attempt has been made to make a diagnosis based on any information relating to the immunogout purine. In the present invention, it has been found that the state of rheumatoid arthritis is associated with a specific sugar chain of immunoglobulin, and that a part of the change of the specific sugar chain is reflected in serum. It eliminates the need to purify glycoproteins from glycerol and has tremendous advantages in diagnosis and tailor-made therapy.
好ましい実施形態において、 本発明の方法およびシステムが分析の対象とする 糖鎖構造は、 N結合型糖鎖であり、 より好ましくは、 末端 G a 1欠損糖鎖である c そのような糖鎖としては、 例えば、 コード番号 2 1 0 . 1、 コード番号 2 1 0 . 2およびコード番号 2 1 0 . 3などが挙げられるがそれらに限定されない。 好ましい実施形態において、 本発明の方法およびシステムが対象とする被検体 は、 哺乳動物であり、 より好ましくは、 モデル動物 （例えば、 霊長類 （サルな ど） 、 げっ歯類 （マウス、 ラットなど） など） であり得、 もっとも好ましくは、 ヒトであり得る。 モデル動物を被検体とする場合は、 他の動物 （例えば、 ヒト） における疾患の状態の情報の目安を提供することができる。 ヒトを被検体とする 場合は、 より詳細な疾患の状態の情報を提供することができ、 またヒトより得た 試料 （血清） を直接分析するのみではなく他の処理を経て用いることもできる。 好ましくは、 分析対象となる被検体は、 処置または予防などを行うことが意図さ れる被検体である。 別の実施形態では、 疾患の状態のレベルの情報を一般的に提 供するために、 処置、 予防などを行うことが意図されない被検体もまた、 分析対 象とすることができる。 In a preferred embodiment, the sugar chain structure in which the method and system of the present invention is subject to analysis is N-linked sugar chain, more preferably, a c such sugar chains is terminated G a 1-deficient sugar chain Examples include, but are not limited to, code number 210.1, code number 210.2, and code number 210.3. In a preferred embodiment, the subject targeted by the method and system of the present invention is a mammal, and more preferably, a model animal (eg, a primate (monkey, etc.), a rodent (mouse, rat, etc.)). And most preferably human. When a model animal is used as a subject, it is possible to provide an indication of information on a disease state in another animal (for example, a human). When humans are used as subjects, more detailed information on disease states can be provided, and samples (serum) obtained from humans can be used not only by direct analysis but also through other processes. Preferably, the subject to be analyzed is a subject intended to undergo treatment or prevention. In another embodiment, subjects that are not intended to be treated, prevented, etc., to generally provide information on the level of the disease state, can also be analyzed.
別の好ましい実施形態において、 本発明の方法またはシステムにおける糖鎖構 造の分析は、 複数の糖鎖構造の量的変化の情報またはその関連情報の分析を含む。 このような複数の糖鎖構造の量的変化の情報またはその関連情報の分析としては、 個々の糖鎖構造の絶対量を分析することおよび複数の糖鎖構造の相対量を分析す ることおよびそれを行う手段が挙げられるがそれらに限定されない。 本発明では、 そのような量の変化を分析することが一つの特徴であり得る。 あるいは、 標準と なる糖鎖または他の物質に対する相対量を分析してもよい。 ここで、 相関付けは、 疾患の状態と複数の糖鎖構造の量的変化の情報またはその関連情報の分析との相 関付けを含むがそれに限定されない。 そのような相関付けを行う方法および手段 は、 当該分野において公知の技術を用いて行うことができる。  In another preferred embodiment, the analysis of the glycan structure in the method or system of the present invention includes the analysis of information on the quantitative change of a plurality of glycan structures or related information thereof. The analysis of the information on the quantitative change of a plurality of glycan structures or the related information includes analyzing the absolute amount of each glycan structure and analyzing the relative amount of the plurality of glycan structures. Means for doing so include, but are not limited to. In the present invention, analyzing such a change in amount may be one feature. Alternatively, the relative amount to a sugar chain or other substance as a standard may be analyzed. Here, the correlation includes, but is not limited to, a correlation between a disease state and information on quantitative changes in a plurality of sugar chain structures or analysis of related information thereof. Methods and means for performing such correlation can be performed using techniques known in the art.
分析される糖鎖構造の量的変化の情報またはその関連情報の分析としては、 例 えば、 複数の糖鎖構造の絶対量、 相対量 （相対比） 、 ある標準物質 （例えば、 ガ ラタトース β 1, 4 - Ν-ァセチルダルコサミン β ί, 2 -マンノース a 1， 3- (ガラクトー ス β 1, 4- Ν -ァセチルダルコサミン 1, 2-マンノース α 1, 6 -) マンノース β 1, 4-Ν- ァセチルダルコサミン 1， 4- Ν-ァセチルダルコサミンなどの糖や IgG、 トランス フェリンなど特定のタンパク質） に対する相対量などが挙げられ、 その単位とし ては、 重量、 容積、 モル、 炭素原子量などが挙げられるがそれらに限定されない。 本発明の方法およびシステムにおいて糖鎖分析の対象とされる糖鎖構造は、 ァ スパラギン結合型糖鎖 （N結合型糠鎖） を含む。 ァスパラギン結合型糖鎖とは、 ァスパラギン残基に N配糖体として結合している糖鎖である。 この型の糖鎖は、 複雑で精巧な生合成経路により多様な構造に仕上げられることが知られている。 各段階の生合成中間体または種々の成熟型の糖鎖は、 細胞の機能調節、 細胞内輸 送などの成熟型タンパク質の形成過程、 細胞間認識などのタンパク質が機能する 状況、 老朽ィヒしたタンパク質の肝細胞への取り込みなどの種々の状況で役割を有 することが知られている。 しかし、 ァスパラギン結合型糖鎖の構造は、 不均一で あり、 その不均一性の意味するところは充分解明されていなかった。 特に、 特定 の糖鎖がィムノグロプリンにおいて疾患とともに変化することは知られていたが、 ィムノグロプリンにおいて疾患とともに変化する糖鎖が血清において変化する糖 鎖とは完全に一致しないが、 増減に相関があることは知られていなかった。 また、 このような糖鎖を複数のセットとして量的変化の情報またはその関連情報の分析 で分析し、 その結果を意味づけることは全く従来行われていなかつたことであり、 そのような相関付けによる検査、 診断およびテーラーメイド治療が実現されたこ とはまさしく本発明が達成した重要な効果であるといえる。 The analysis of the information on the quantitative change of the sugar chain structure to be analyzed or its related information includes, for example, the absolute amount, relative amount (relative ratio) of a plurality of sugar chain structures, a certain standard substance (for example, galatatose β 1 , 4 -Ν-Acetyldarcosamine β ί, 2 -mannose a 1,3- (galactose β 1,4-Ν-acetyldarcosamine 1,2-mannose α 1,6-) mannose β 1,4 -Ν- § cetyl Darco Sa Min 1, 4- Ν- § cetyl Darco sugars and I g G, such as Sa Min, trans Relative to a specific protein such as ferrin), and the units thereof include, but are not limited to, weight, volume, mole, and carbon atom weight. The sugar chain structure to be subjected to sugar chain analysis in the method and system of the present invention includes asparagine-linked sugar chain (N-linked bran chain). An asparagine-linked sugar chain is a sugar chain linked as an N-glycoside to an asparagine residue. It is known that this type of sugar chain can be processed into various structures by complex and elaborate biosynthetic pathways. Biosynthetic intermediates or various mature sugar chains at each stage are used to regulate the function of cells, to form mature proteins such as intracellular transport, to function in proteins such as intercellular recognition, etc. It is known to play a role in various situations, such as incorporation of proteins into hepatocytes. However, the structure of asparagine-linked sugar chains is heterogeneous, and the meaning of the heterogeneity has not been sufficiently elucidated. In particular, it was known that specific sugar chains change with disease in immunoglobulin, but sugar chains that change with disease in imnoglobulin do not completely match sugar chains that change in serum, but there is a correlation with increase / decrease. Was not known. In addition, analyzing such sugar chains as a plurality of sets by analyzing quantitative change information or related information, and meaning the results, has never been done before. The realization of the examination, diagnosis and tailor-made treatment according to the present invention can be said to be very important effects achieved by the present invention.
あるいは、 本発明が対象とする糖鎖構造は、 O結合型糖鎖 （O—ダリカンとも いう） であり得る。 O結合型糖鎖としては、 例えば、 N-ァセチルガラクトサミン、 N -ァセチルダルコサミン、 ガラクトース若しくはそれらを含む糖鎖がセリンまた はスレオニンと結合するムチン型糖鎖、 マンノースまたは N -ァセチルダルコサミ ンがセリンまたはスレオニンと結合する糖鎖、 ガラクトースがヒドロキシリジン に結合する糖鎖などが挙げられるがそれに限定されない。 O結合型糖鎖を有する 糖蛋白質もまた情報伝達または細胞間接着を制御する機能が示唆されていること カ ら、 これらムチン型糖鎖もまた、 本発明が対象とする重要な糖鎖構造であり得 る。 Alternatively, the sugar chain structure targeted by the present invention may be an O-linked sugar chain (also referred to as O-darican). Examples of the O-linked sugar chain include N-acetylgalactosamine, N-acetyldarcosamine, a mucin-type sugar chain in which galactose or a sugar chain containing them is bound to serine or threonine, mannose, or N-acetyldarcos. Examples include, but are not limited to, sugar chains in which samin binds to serine or threonine, and sugar chains in which galactose binds to hydroxylysine. Since glycoproteins having O-linked sugar chains have also been suggested to have functions of controlling signal transduction or cell-cell adhesion, these mucin-type sugar chains are also important sugar chain structures targeted by the present invention. Possible The
1つの実施形態では、 本発明では、 I g Gレベルの糖鎖分析の結果と、 血清レ ベルの糖鎖分析の結果とを相関づける方法または手段をさらに含むことが有利で あり得るが、 必ずしも必要というわけではない。 このような相関付けは、 相対的 または絶対量の比較によって行うことができる。 本発明は、 I g Gレベルの分析 結果は原理的に不要であることが特徴であるが、 このような I g Gレベルの分析 結果を含めてもよい。  In one embodiment, the present invention may advantageously further comprise a method or means for correlating the results of the glycan analysis at the IgG level with the results of the glycan analysis at the serum level, although not necessarily. It is not necessary. Such correlations can be made by comparison of relative or absolute amounts. The present invention is characterized in that an IgG G level analysis result is unnecessary in principle, but may include such an IgG G level analysis result.
別の実施形態では、 本発明は、 I g Gレベルの糖鎖分析とを行う工程または手 段をさらに包含するが、 必ずしも必要というわけではない。 I g Gの糖鎖分析は 血清と同様に行うことができる。 また、 I g Gの調製には、 当該分野において周 知の方法、 例えば、 ァフィ二ティーカラムまたはクロマトグラフィーカラムを組 み合わせを利用することができる。  In another embodiment, the present invention further comprises, but is not necessarily required to, perform a glycan analysis at the IgG level. The sugar chain analysis of IgG can be performed in the same manner as for serum. For the preparation of IgG, a method known in the art, for example, a combination of an affinity column or a chromatography column can be used.
好ましい実施形態において、 本発明において使用される糖鎖構造の分析は、 ク 口マトグラフィ一による分析を含む。 クロマトグラフィーによる分析を用いるこ とが好ましいのは、 例えば、 糖鎖の分離精製と分析とが同時に行うことができ、 定量性がよいからである。 しかも、 アミノビリジンなどによる還元アミノ化反応 による蛍光標識法など高感度分析系が確立しており、 クロマトグラフィ一の分析 装置は取り扱いが比較的容易で広く普及している。 二次元マップ法など、 パター ン分析に用いた試料をそのまま詳細な糖鎖構造解析法に利用することができる。 好ましくは、 本発明では、 少なくとも 2種類のクロマトグラフィーカラム （例え ば、 O D Sカラム、 アミドカラムなど） を用いることが有利である。 2種類の力 ラムを組み合わせることによって、 より詳細な分析を行うことができるからであ る。 本発明では 2種類の分析でほぼ完全な同定を行うことができることが判明し ている。 また、 このように複数のカラムが使用される場合は、 異なる種類 （例え ば、 疎水性カラムおよびァフィ二ティーカラムなど） のものを使用することがよ り好ましい。 好ましい実施形態において、 本発明において使用される糖鎖構造の分析は、 質 量分析を含む。 質量分析を用いることが好ましいのは、 例えば、 分析時間が短く、 分解能が高いことから情報量が多いからである。 また、 得られたデータをデジタ ル変換しやすく、 コンピュータによる処理に適しているからである。 In a preferred embodiment, the analysis of the sugar chain structure used in the present invention includes an analysis by mouth chromatography. The use of chromatographic analysis is preferred because, for example, the separation and purification of sugar chains and the analysis can be performed simultaneously, and the quantification is good. In addition, high-sensitivity analysis systems such as fluorescent labeling by reductive amination with aminoviridine have been established, and chromatographic analyzers are relatively easy to handle and are widely used. Samples used for pattern analysis, such as two-dimensional mapping, can be directly used for detailed sugar chain structure analysis. Preferably, in the present invention, it is advantageous to use at least two types of chromatography columns (eg, ODS column, amide column, etc.). This is because a more detailed analysis can be performed by combining the two types of rum. In the present invention, it has been found that almost complete identification can be performed by two types of analysis. When a plurality of columns are used as described above, it is more preferable to use different types (for example, hydrophobic columns and affinity columns). In a preferred embodiment, the analysis of the sugar chain structure used in the present invention includes a mass analysis. It is preferable to use mass spectrometry because, for example, the amount of information is large because the analysis time is short and the resolution is high. In addition, the obtained data can be easily converted to digital, which is suitable for processing by a computer.
あるいは、 本発明において、 糖鎖構造を分析する方法は、 例えば、 糖鎖アレイ、 糖鎖レプリカを利用する方法などが挙げられるがそれらに限定されない。  Alternatively, in the present invention, examples of a method for analyzing a sugar chain structure include, but are not limited to, a method using a sugar chain array and a sugar chain replica.
本癸明の診断方法を実行するコンピュータ構成あるいはそれを実現するシステ ムの例を図 1 1を参照して示す。 図 1 1は、 本発明の診断方法を実行するコンビ ユータの 500の構成例を示す。  FIG. 11 shows an example of a computer configuration for executing the diagnosis method of the present invention or a system for realizing the same. FIG. 11 shows a configuration example of a computer 500 that executes the diagnostic method of the present invention.
コンピュータ 500は、 入力部 501と、 CPU502と、 出力部 503と、 メモリ 504と、 バス 505とを備える。 入力部 501と、 CPU502と、 出 力部 503と、 メモリ 504とは、 バス 505によって相互に接続されている。 入力部 501と出力部 503とは入出力装置 506に接続されている。  The computer 500 includes an input unit 501, a CPU 502, an output unit 503, a memory 504, and a bus 505. The input unit 501, the CPU 502, the output unit 503, and the memory 504 are interconnected by a bus 505. The input unit 501 and the output unit 503 are connected to an input / output device 506.
コンピュータ 500によって実行される相関付けの処理の概略を説明する。 相関付け方法および/または処置もしくは予防の選択を実行させるプログラム An outline of the correlation process performed by the computer 500 will be described. Correlation method and / or program to perform treatment or prevention selection
(以下、 それぞれ相関付けプログラムおよび選択プログラムという） は、 例えば、 メモリ 502に格納されている。 あるいは、 相関付けプログラムおよび選択プロ グラムは、 それぞれ独立してあるいは一緒に、 フロッピー （登録商標） ディスク、 MO、 CD-ROM, CD-R, D VD— R OMのような任意のタイプの記録媒 体に記録され得る。 あるいは、 アプリケーションサーバに格納されていてもよい c そのような記録媒体に記録された相関付けプログラムおよび/または選択プログ ラムは、 出入力装置 506 (例えば、 ディスクドライブ、 ネットワーク （例えば、 インターネット） ) を介してコンピュータ 500のメモリ 504にロードされる c CPU 502が相関付けプログラムおよび/または選択プログラムを実行するこ とによって、 コンピュータ 500は、 本発明の相関付け方法および/または選択 方法の処理を実行する装置として機能する。 入力部 501を介して、 糖鎖構造の分析の結果 （例えば、 配列情報、 レベル、 量など） および疾患に関する情報などを入力する。 必要に応じて、 糖鎖と相関付 けられる状態、 障害または疾患などの副次的情報、 処置および/または予防に関 する情報も入力してもよい。 (Hereinafter referred to as a correlation program and a selection program, respectively) are stored in the memory 502, for example. Alternatively, the correlation program and the selection program can be used independently or together of any type of recording medium, such as floppy disks, MOs, CD-ROMs, CD-Rs, DVD-ROMs. Can be recorded on the body. Alternatively, correlation program and / or selected programming recorded on good c such recording medium be stored in the application server ram, input and output devices 506 (e.g., disk drives, network (e.g., the Internet)) and The computer 500 executes the correlation method and / or the selection method of the present invention by executing the correlation program and / or the selection program by the c CPU 502 loaded into the memory 504 of the computer 500 via the computer 500. Functions as a device. Through the input unit 501, the result of the analysis of the sugar chain structure (for example, sequence information, level, amount, etc.) and information on a disease are input. If necessary, secondary information such as a condition, a disorder or a disease that is correlated with the sugar chain, and information on treatment and / or prevention may also be input.
CPU502は、 入力部 501で入力された情報をもとに、 糖鎖構造に関する 情報と疾患レベルとを相関付け、 メモリ 504に相関データを格納する。 その後、 CPU 502は、 これらの情報をメモリ 504に格納し得る。 その後、 出力部 5 03は、 CPU502が選択した疾患のレベルに関する情報などを診断情報とし て出力する。 出力されたデータは、 入出力装置 506から出力され得る。  The CPU 502 correlates the information on the sugar chain structure with the disease level based on the information input at the input unit 501, and stores the correlation data in the memory 504. Thereafter, CPU 502 may store such information in memory 504. After that, the output unit 503 outputs information on the disease level selected by the CPU 502 as diagnostic information. The output data can be output from the input / output device 506.
別の局面において、 本発明は、 被検体からの血清を用いて診断することによつ て該被検体を処置、 または障害を予防する方法であって、 （a) 被検体からの血 清に含まれる糖鎖を分析する工程； (b) 分析された該糖鎖と、 疾患に関する情 報とを相関付ける工程；および （c) 該疾患に関する情報に応じて適切な処置ま たは予防のための手段を該被検体に提供する工程、 を包含する、 方法を提供する c あるいは、 本発明は、 被検体の疾患のレベルに応じて被検体を処置または予防す る方法を提供する。 この方法は、 （a) 被検体からの試料 （例えば、 血清） に含 まれる糖鎖構造を分析する工程； (b) 分析された糖鎖構造と、 疾患のレベルと を相関付ける工程；および （c) 疾患のレベルに応じた処置または予防を被検体 に施す工程を包含する。 In another aspect, the present invention relates to a method for treating a subject or preventing a disorder by diagnosing the serum using the serum from the subject, comprising: Analyzing the sugar chains contained therein; (b) correlating the analyzed sugar chains with information on the disease; and (c) performing appropriate treatment or prevention depending on the information on the disease. And c) providing the means to the subject. C) Alternatively, the present invention provides a method for treating or preventing a subject depending on the level of a disease in the subject. The method includes the steps of (a) analyzing a sugar chain structure contained in a sample (eg, serum) from a subject; (b) correlating the analyzed sugar chain structure with a disease level; and And (c) subjecting the subject to treatment or prevention depending on the level of the disease.
あるいは、 本発明は、 被検体からの血清を用いて診断することによって該被検 体を処置または予防するシステムであって、 （a) 被検体からの血清に含まれる 糖鎖を分析する手段； （b) 分析された該糖鎖と、 疾患に関する情報とを相関付 ける手段；および （c) 該疾患に関する情報に応じて適切な処置または予防のた めの手段を該被検体に提供する手段、 を包含する、 システムを提供する。 あるい は、 本発明は、 被検体の疾患のレベルに応じて被検体を処置または予防するシス テムを提供する。 このシステムは、 （a) 被検体からの試料 （例えば、 血清） に 含まれる糖鎖構造を分析する手段； （b ) 分析された糖鎖構造と、 疾患レベルと を相関付ける手段；および （C ) 疾患のレベルに応じた処置または予防を被検体 に施す手段を備える。 Alternatively, the present invention provides a system for treating or preventing a subject by diagnosing using serum from the subject, comprising: (a) means for analyzing a sugar chain contained in serum from the subject; (B) means for correlating the analyzed sugar chain with information on the disease; and (c) means for providing the subject with appropriate treatment or prevention means according to the information on the disease. Provide a system that includes Alternatively, the present invention provides a system for treating or preventing a subject depending on the level of the disease in the subject. This system: (a) converts a sample (eg, serum) from a subject Means for analyzing the sugar chain structure contained therein; (b) means for correlating the analyzed sugar chain structure with the disease level; and (C) means for subjecting the subject to treatment or prevention corresponding to the disease level. .
本発明の処置または予防のための方法およびシステムにおいて、 被検体からの 血清， I g Gなどの試料を提供する方法または手段は、 当該分野において周知で あり、 どのような技術を用いて調製または提供してもよい。 本発明では、 そのよ うな試料が何らかの形で提供されることで十分であり、 その調製方法または手段 は問わない。 そのような試料調製方法としては、 例えば、 採血などによって、 血 液を採取し、 その後、 血清を遠心分離によって調製することができる。 I g Gが 必要であるときは、 ァフィ二ティーカラム （例えば、 プロテイン Gカラム） など を用いて血清から精製することができる。  In the method and system for treatment or prevention of the present invention, a method or means for providing a sample such as serum, IgG or the like from a subject is well known in the art, and is prepared or prepared using any technique. May be provided. In the present invention, it is sufficient that such a sample is provided in some form, and its preparation method or means does not matter. As such a sample preparation method, for example, blood can be collected by collecting blood, and then serum can be prepared by centrifugation. If IgG is required, it can be purified from serum using an affinity column (eg, protein G column).
好ましい実施形態において、 本発明の方法またはシステムが分析対象とする糖 鎖は、 血清レベルと I g Gレベルとでほぼ同じ挙動をすることが判明している種 であることが有利であるがそれに限らない。 血清レベルと I g Gレベルとの糖鎖 の関係は知られておらず、 本発明は、 このような対応関係を初めて示したという 点で格別の効果を示す。 従って、 本発明は、 そのような予想外の発見に基づいて 診断およびテーラーメイド治療を行うことを達成したという効果を奏する。 好ましい実施形態において、 本発明が対象とする糖鎖構造は、 複数の糖鎖構造 のセットを含むことが有利であり得る。 複数の糖鎖構造のセットを分析すること によって、 疾患状態の情報との相関付けがより詳細に検討することができるから である。 血清由来の複数の糖鎖構造のセットの情報と、 疾患状態の情報とが、 相 関付けることができることは従来知られておらず、 本発明は、 そのような予想外 の発見に基づいて診断およびテーラーメイド治療を行うことを達成したという効 果を奏する。  In a preferred embodiment, the carbohydrates analyzed by the method or system of the present invention are advantageously species that have been found to behave approximately the same at serum and IgG levels, but Not exclusively. The relationship of the sugar chain between the serum level and the IgG level is not known, and the present invention shows a remarkable effect in that it shows such a correspondence for the first time. Therefore, the present invention has an effect of achieving diagnosis and tailor-made treatment based on such unexpected findings. In a preferred embodiment, the sugar chain structure targeted by the present invention may advantageously include a plurality of sets of sugar chain structures. By analyzing a plurality of sets of carbohydrate structures, correlation with disease state information can be examined in more detail. It has not heretofore been known that information of a set of a plurality of sugar chain structures derived from serum and information of a disease state can be correlated, and the present invention provides a diagnosis based on such unexpected findings. And the effect of achieving tailor-made treatment.
好ましい実施形態において、 本発明が対象とする疾患は、 慢性関節リウマチで ある。 慢性関節リウマチは、 対象となる被検体中の免疫関連状態すなわちィムノ グロブリンの変化に起因することから、 従来は、 そのィムノグロブリンに関連す る任意の情報に基づいて診断する試みがなされていた。 本発明では、 慢性関節リ ゥマチの状態が、 ィムノグロブリンの特定の糖鎖に関連づけられ、 かつ、 その特 定の糖鎖の変ィ匕の一部が血清において反映されていることが見出されたことから、 診断およびテーラーメイド治療において多大な利点を有する。 In a preferred embodiment, the disease targeted by the present invention is rheumatoid arthritis. Rheumatoid arthritis is an immune-related condition in the subject Conventionally, an attempt has been made to make a diagnosis based on any information related to the immunoglobulin due to the change in globulin. In the present invention, it has been found that the state of rheumatoid arthritis is associated with a specific sugar chain of immunoglobulin, and that a part of the change of the specific sugar chain is reflected in serum. As such, it has tremendous advantages in diagnosis and tailor-made treatment.
好ましい実施形態において、 本発明の方法おょぴシステムが分析の対象とする 糖鎖構造は、 N結合型糖鎖であり、 頼好ましくは、 末端 G a 1欠損糖鎖である。 そのような糖鎖としては、 例えば、 コード番号 2 1 0 . 1、 コード番号 2 1 0 . 2およびコード番号 2 1 0 . 3などが挙げられるがそれらに限定されない。  In a preferred embodiment, the sugar chain structure analyzed by the method or system of the present invention is an N-linked sugar chain, and more preferably, a sugar chain lacking a terminal G a1. Examples of such a sugar chain include, but are not limited to, code number 210.1, code number 210.2, and code number 210.3.
好ましい実施形態において、 本発明の方法およびシステムが対象とする被検体 は、 哺乳動物であり、 より好ましくは、 モデル動物 （例えば、 霊長類 （サルな ど） 、 げっ歯類 （マウス、 ラットなど） など） であり得、 もっとも好ましくは、 ヒトであり得る。 モデル動物を被検体とする場合は、 他の動物 （例えば、 ヒト） における疾患の状態の情報の目安を提供することができる。 好ましくは、 分析対 象となる被検体は、 処置または予防などを行うことが意図される被検体である。 別の実施形態では、 疾患の状態のレベルの情報を一般的に提供するために、 処置、 予防などを行うことが意図されない被検体もまた、 対象に含めることができる。 本発明の被検体を処置または予防する方法およびシステムにおいて、 糖鎖構造 の分析は、 本明細書において他の場所において詳述されるように、 種々の分析方 法および手段を用いることができ、 当業者は本明細書の開示を参照して実施する ことができる。 分析された糖鎖構造と疾患のレベルとの相関付けおよぴそのため の手段もまた、 本明細書において他の場所において詳述されるように、 種々の方 法および手段を用レ、ることができ、 当業者は本明細書の開示を参照して実施する ことができる。 この場合、 相関付けは、 未知のデータを相関付けることもできる し、 既知のデータと相関付けることも可能である。  In a preferred embodiment, the subject targeted by the method and system of the present invention is a mammal, and more preferably, a model animal (eg, a primate (monkey, etc.), a rodent (mouse, rat, etc.)). And most preferably human. When a model animal is used as a subject, it is possible to provide an indication of information on a disease state in another animal (for example, a human). Preferably, the subject to be analyzed is a subject that is intended to be treated or prevented. In another embodiment, subjects that are not intended to be treated, prevented, etc., to generally provide information on the level of the disease state, can also be included in the subject. In the method and system for treating or preventing a subject according to the present invention, the analysis of the sugar chain structure can use various analysis methods and means, as described in detail elsewhere herein. Those skilled in the art can carry out the present invention with reference to the disclosure in the present specification. The correlation between the analyzed glycan structure and the level of the disease and the means therefor can also be achieved by using various methods and means, as described in detail elsewhere herein. Those skilled in the art can implement the present invention with reference to the disclosure in the present specification. In this case, the correlation can correlate unknown data or correlate with known data.
疾患のレベルに応じた処置または予防を被検体に施すこととしては、 例えば、 その疾患に対応した薬剤を選択し、 その被検体に応じて処方することによって薬 剤を投与することが挙げられるがそれに限定されない。 このような方法は、 医師 などの人間が行うことができ、 あるいは、 このような方法は、 自動化された機械 に行わせることも可能である。 そのような機械は、 糖鎖構造を分析する手段、 糖 鎖構造と疾患のレベルとを相関付ける手段、 疾患のレベルに応じた処置または予 防を選択する手段およびそのような処置または予防に応じて処方された処方物を 提供する手段からなる群より選択される少なくとも 1つの手段を含み得る。 Treatment or prevention of a subject depending on the level of a disease includes, for example, This includes, but is not limited to, administering a drug by selecting a drug corresponding to the disease and prescribing it according to the subject. Such a method can be performed by a human, such as a physician, or the method can be performed by an automated machine. Such machines can be used to analyze carbohydrate structures, to correlate carbohydrate structures to disease levels, to select treatment or prevention depending on the level of disease, and to respond to such treatment or prevention. At least one means selected from the group consisting of means for providing a formulated formulation.
このような装置において、 糖鎖構造を分析する手段は、 糖鎖構造を分析するた めの方法を実現することができる手段であればどのようなものでも使用すること ができる。 そのような手段は、 物理学的方法 (例えば、 質量分析、 NMR、 X線 構造解析、 電子顕微鏡分析など） 、 化学的方法 （例えば、 糖特異的官能基との化 学的特異的反応の角军析、 糖鎖と特定の物質の相互作用を利用したクロマトグラフ ィ一およびそれらを組み合わせた二次元マップ法など) 、 生化学的方法 (例えば、 酵素の特異性を利用したアツセィなど、 糖鎖アレイ、 糖鎖レプリカなどを利用す る方法） 、 生物学的方法 （例えば、 微生物のある糖に対する親和性、 優先性など を調べるアツセィなど） 、 バイオインフォマティクスなどを実現するものであり 得る。  In such an apparatus, any means for analyzing the sugar chain structure can be used as long as it can implement a method for analyzing the sugar chain structure. Such means include physical methods (eg, mass spectroscopy, NMR, X-ray structural analysis, electron microscopy, etc.), chemical methods (eg, the angle of chemical-specific reaction with sugar-specific functional groups). Analysis, chromatography using the interaction of a sugar chain with a specific substance, and a two-dimensional map method combining them, etc.), biochemical methods (e.g., sugar chains such as atsey using enzyme specificity, etc.) It can realize an array, a method using a sugar chain replica, etc.), a biological method (for example, Atsushi to check the affinity and priority of a microorganism to a certain sugar), bioinformatics, and the like.
糖鎖構造と疾患のレベルとを相関付ける手段としては、 例えば、 データ処理を 行うことができるコンピュータなどが挙げられるがそれらに限定されない。 好ま しくは、 そのような相関付け手段は、 疾患に関する情報力 S格納された記録媒体を 備えていることが好ましい。 そのような情報を用いることによって、 糖鎖構造と 疾患のレベルとの相関付けが容易になり得る。  Means for correlating the sugar chain structure with the disease level include, but are not limited to, for example, a computer capable of performing data processing. Preferably, such a correlating means comprises a recording medium on which information about the disease S is stored. Use of such information may facilitate correlation of sugar chain structure with disease level.
疾患のレベルに応じた処置または予防を選択する手段としてもまた、 例えば、 データ処理を行うことができるコンピュータなどが挙げられるがそれらに限定さ れない。 好ましくは、 そのような相関付け手段は、 疾患に関する情報および/ま たは治療もしくは予防法に関する情報が格納された記録媒体を備えていることが 好ましい。 そのような情報を用いることによって、 処置または予防の選択が容易 になり得る。 Means for selecting treatment or prevention according to the level of the disease also include, but are not limited to, for example, a computer capable of performing data processing. Preferably, such correlating means comprises a recording medium on which information relating to the disease and / or information relating to treatment or prevention is stored. preferable. Use of such information may facilitate treatment or prevention choices.
このような相関付けおよび/または処置もしくは予防の選択を実行するコンビ ユータ構成の例を図 11を参照して示す。 図 1 1は、 本発明の相関付けの処理を 実行するコンピュータの 500の構成例を示す。  An example of a combo configuration that performs such correlation and / or treatment or prophylaxis selection is shown with reference to FIG. FIG. 11 shows a configuration example of a computer 500 that executes the correlation processing of the present invention.
コンピュータ 500は、 入力部 501と、 CPU502と、 出力部 503と、 メモリ 504と、 バス 505とを備える。 入力部 501と、 CPU502と、 出 力部 503と、 メモリ 504とは、 パス 505によって相互に接続されている。 入力部 501と出力部 503とは入出力装置 506に接続されている。  The computer 500 includes an input unit 501, a CPU 502, an output unit 503, a memory 504, and a bus 505. The input unit 501, the CPU 502, the output unit 503, and the memory 504 are interconnected by a path 505. The input unit 501 and the output unit 503 are connected to an input / output device 506.
コンピュータ 500によって実行される相関付けの処理の概略を説明する。 相関付け方法および/または処置もしくは予防の選択を実行させるプログラム (以下、 それぞれ相関付けプログラムおよび選択プログラムという） は、 例えば、 メモリ 502に格納されている。 あるいは、 相関付けプログラムおよび選択プロ グラムは、 それぞれ独立してあるいは一緒に、 フロッピー （登録商標） ディスク、 MO、 CD-ROM, CD-R, D VD— R OMのような任意のタイプの記録媒 体に記録され得る。 あるいは、 アプリケーションサーバに格納されていてもよい。 そのような記録媒体に記録された相関付けプログラムおよび/または選択プログ ラムは、 出入力装置 506 (例えば、 ディスクドライブ、 ネットワーク （例えば、 インターネット） ） を介してコンピュータ 500のメモリ 504にロードされる。 CPU 502が相関付けプログラムおよび/または選択プログラムを実行するこ とによって、 コンピュータ 500は、 本発明の相関付け方法および//または選択 方法の処理を実行する装置として機能する。  An outline of the correlation process performed by the computer 500 will be described. A program for executing the correlation method and / or the selection of the treatment or the prevention (hereinafter, referred to as a correlation program and a selection program, respectively) is stored in the memory 502, for example. Alternatively, the correlation program and the selection program can be used independently or together of any type of recording medium, such as floppy disks, MOs, CD-ROMs, CD-Rs, DVD-ROMs. Can be recorded on the body. Alternatively, it may be stored in an application server. The correlation program and / or the selection program recorded on such a recording medium are loaded into the memory 504 of the computer 500 via the input / output device 506 (for example, a disk drive, a network (for example, the Internet)). When the CPU 502 executes the correlation program and / or the selection program, the computer 500 functions as a device that executes the processing of the correlation method and / or the selection method of the present invention.
入力部 501を介して、 糖鎖構造の分析の結果 （例えば、 配列情報、 レベル、 量など） および疾患に関する情報などを入力する。 必要に応じて、 糖鎖と相関付 けられる状態、 障害または疾患などの副次的情報、 処置および/または予防に関 する情報も入力してもよい。 C P U 5 0 2は、 入力部 5 0 1で入力された情報をもとに、 糖鎖構造に関する 情報と疾患のレベルとを相関付け、 メモリ 5 0 4に相関データを格納する。 その 後、 C P U 5 0 2は、 これらの情報をメモリ 5 0 4に格納し得る。 C P U 5 0 2 は、 必要に応じて、 これらの情報に基づき、 適切な信号強度を選択する。 生成さ れた相関付けデータに基づいて、 '適切な処置または予防方法を選択または作成す る。 この情報をメモリ 5 0 4に格納することもできる。 Through the input unit 501, the result of the analysis of the sugar chain structure (for example, sequence information, level, amount, etc.) and information on a disease are input. If necessary, secondary information such as a condition, a disorder or a disease that is correlated with a sugar chain, and information on treatment and / or prevention may also be input. The CPU 502 correlates the information on the sugar chain structure with the disease level based on the information input at the input section 501, and stores the correlation data in the memory 504. Thereafter, the CPU 502 may store the information in the memory 504. The CPU 502 selects an appropriate signal strength based on this information as necessary. Based on the generated correlation data, 'select or create an appropriate treatment or prevention method. This information can also be stored in memory 504.
その後、 出力部 5 0 3は、 C P U 5 0 2が選択した疾患のレベルに関する情報、 適切な処置または予防方法に関する情報などを出力する。 出力されたデータは、 入出力装置 5 0 6から出力され得る。  Thereafter, the output unit 503 outputs information on the level of the disease selected by the CPU 502, information on an appropriate treatment or prevention method, and the like. The output data can be output from the input / output device 506.
本発明の方法おょぴシステムにおいて実施される処置または予防に応じて処方 された処方物を提供する方法および手段は、 当該分野において周知の方法または 手段を利用して提供することができる。 従って、 当業者は、 そのような方法およ ぴ手段がいったん選択されるべき処置または予防が選択されたならば、 そのよう な選択された処置または予防を、 必要に応じて被検体などのパラメータ （例えば、 使用目的、 対象疾患 （種類、 重篤度など） 、 症状、 患者の年齢、 体重、 性別、 既 往歴、 投与される被検体の部位の形態または種類） および投与頻度、 ならびに他 の種々の臨床検査値を考慮して、 処方し、 その処方に応じた製剤および処置を行 うことができることを理解し、 そのような手段を容易に構成および使用すること ができることも理解する。 このような手段は、 自動化することもでき、 あるいは 他の手段と一体化することもできる。 したがって、 処方物を提供する手段もまた、 上記コンピュータの一部として構成することも可能である。  Methods and means for providing a formulated formulation in response to treatment or prevention performed in the method or system of the present invention can be provided using methods or means well known in the art. Thus, those skilled in the art will appreciate that once such methods and measures have been selected for which treatment or prevention should be selected, such selected treatments or prophylaxis may be performed, (Eg, intended use, target disease (type, severity, etc.), symptom, patient age, weight, gender, medical history, type or type of site of subject being administered) and frequency of administration Understand that it is possible to formulate, take into account various laboratory data, formulate and treat the formulation, and understand that such means can be readily configured and used. Such means can be automated or integrated with other means. Thus, the means for providing the formulation can also be configured as part of the computer.
本発明の処置または予防方法およぴシステムにおいて分析される糖鎖構造は、 複数の糖鎖構造のセットを含むことが好ましい。 このような対応づけられた種の 糖鎖、 または複数の糖鎖構造のセットを分析することによって、 疾患の情報との 相関付けがより詳細に検討することができ、 それにより、 より適切な処置または 予防方法を選択することができるからである。 血清由来の複数の糖鎖構造のセッ トの情報と、 疾患の情報とが、 相関付けることができることは従来知られておら ず、 本発明は、 そのような予想外の発見に基づいて診断おょぴテーラーメイド治 療を行うことを達成したという効果を奏する。 ' The sugar chain structure analyzed in the treatment or prevention method and system of the present invention preferably includes a plurality of sets of sugar chain structures. By analyzing the sugar chains of such linked species, or a set of multiple sugar chain structures, the correlation with disease information can be examined in more detail, thereby enabling more appropriate treatment Or you can choose a preventive method. Set of multiple glycan structures derived from serum It has not been known that the information of the disease can be correlated with the information of the disease, and the present invention achieves the diagnosis and tailor-made treatment based on such unexpected findings. It has the effect of having done. '
別の実施形態において、 本発明の処置または予防方法およびシステムは、 慢性 関節リゥマチ薬を利用した方法およびシステムであることが好ましいがそれに限 定されない。 そのような処置または予防において使用され得る薬剤としては、 例 えばリゥマチの場合、 非ステロイド性消炎鎮痛剤、 ステロイド類、 免疫抑制剤、 金チオリンゴ酸ナトリゥムなどの金製剤、 メトトレキサート ·ァクタリットなど の抗リウマチ薬、 温熱療法、 関節の可動域体操や筋肉強化訓練などの運動療法、 補装具の装着、 滑膜除去や人工関節置換などの手術、 安静保温を心がけるなどの 生活注意などが挙げられるがそれらに限定されない。  In another embodiment, the treatment or prevention method and system of the present invention is preferably, but not limited to, a method and system utilizing a rheumatoid arthritis drug. Agents that may be used in such treatment or prevention include, for example, in the case of rheumatism, non-steroidal anti-inflammatory analgesics, steroids, immunosuppressants, gold preparations such as sodium gold thiomalate, and antirheumatic drugs such as methotrexate actalit. Medicine, hyperthermia, exercise therapy such as range of motion exercises and muscle strengthening exercises for the joints, wearing of prostheses, surgery such as synovial removal and artificial joint replacement, and life precautions such as keeping the body warm and resting. Not limited.
好ましくは、 分析した糖鎖構造によって疾患状態が診断された場合、 本発明に おいて選択されるべき処置または予防は、 その疾患に対して （必要に応じて患者 の状態を考慮して） 適切な薬剤を被検体に投与することが有利である。 そのよう な場合、 被検体において選択した薬剤が有効であることが予めわかっていること 力 ら、 無駄な治療または予防を施すことを回避することができる。 被検体に投与 する薬剤は、 その被検体に対して腎障害やアレルギーなどの別の好ましくない有 害反応を惹起しないことが好ましい。 そのような有害反応を惹起すると、 有効で あることが判明した薬剤といえども、 生体自身に有効に作用する効果を超える有 害作用を生じる可能性があるからである。 し力 し、 そのような有害反応が克服可 能である場合、 無視し得る場合、 有効作用によるメリットが有害作用によるデメ リットを上回ると判断された場合そのような有害反応を惹起する可能性のある薬 剤でも使用することができる。 そのような有害反応を惹起する可能性のある薬剤 を投与する場合は、 そのような有害反応を回避する処置 （例えば、 アレルギー回 避のための薬剤の投与など） をさらに行うことが好ましくあり得る。 そのような 有害反応回避処置もまた、 当業者は、 当該分野において公知の技術を用いて選択 し、 行うことができる。 Preferably, when a disease condition is diagnosed based on the analyzed sugar chain structure, the treatment or prevention to be selected in the present invention is appropriate for the disease (considering the condition of the patient as necessary). It is advantageous to administer a novel drug to the subject. In such a case, useless treatment or prevention can be avoided because the drug selected in the subject is known in advance to be effective. It is preferable that the drug administered to the subject does not cause another untoward adverse reaction such as renal disorder or allergy to the subject. When such an adverse reaction is caused, even a drug that has been found to be effective may cause harmful effects that are more than effective for the living body itself. However, if such adverse reactions can be overcome, negligible, or if the benefit of an effective effect is determined to outweigh the demerit of an adverse effect, the potential for such an adverse reaction to be elicited Certain drugs can also be used. When a drug that may cause such an adverse reaction is administered, it may be preferable to further perform a treatment to avoid such an adverse reaction (for example, administration of a drug to avoid allergy). . Such adverse reaction avoidance measures can also be selected by those skilled in the art using techniques known in the art. And can do it.
本発明の特定の実施例において、 分析される糖鎖構造はコード番号 2 1 0 . 1、 コード番号 2 1 0 . 2およびコード番号 2 1 0 . 3からなる群より選択される糖 鎖を少なくとも含み得る。 このような場合、 処置されるべき疾患としては慢性関 節リウマチを含み得る。  In a specific embodiment of the present invention, the glycan structure to be analyzed comprises at least a glycan selected from the group consisting of code No. 210.1, code No. 210.2 and code No. 210.3. May be included. In such cases, the disease to be treated may include rheumatoid arthritis.
好ましい実施形態において、 本発明の処置または予防方法おょぴシステムが対 象とする被検体は、 哺乳動物であり、 より好ましくは、 有益動物 （例えば、 家畜 (ゥシ、 ブタ、 ゥマなど） など） であり得、 もっとも好ましくは、 ヒトであり得 る。 好ましくは、 処置または予防の対象となる被検体は、 処置または予防などを 行うことが意図される被検体である。 好ましくは、 このような方法おょぴシステ ムでは、 予め処置または予防の対象となる被検体の薬剤耐性、 体質、 疾患などに 関する情報を得ていることが好ましい。 そのような情報を多く集めるほど、 より 適切な個人対応型のテーラーメイド治療を行うことが可能となるからである。 本発明の処置または予防方法およびシステムでは、 糖鎖構造の分析は、 複数の 糖鎖構造の量的変化の情報またはその関連情報の分析を含むことが好ましい。 こ のような複数の糖鎖構造の量的変化の情報またはその関連情報の分析は、 絶対量 を分析することおよび複数の糖鎖構造の相対量や特定のタンパク質の量など他の 臨床検査値との相対量を分析することを包含する。 また、 相関付けは、 疾患のレ ベルと該複数の糖鎖構造の量的変化の情報またはその関連情報との相関付けを含 むことが好ましい。  In a preferred embodiment, the subject targeted by the treatment or prevention method system of the present invention is a mammal, and more preferably, a beneficial animal (eg, a domestic animal (eg, a pig, a pig, a pig). And most preferably human. Preferably, the subject to be treated or prevented is a subject intended to be treated or prevented. Preferably, in such a method system, it is preferable to obtain in advance information on drug resistance, constitution, disease, and the like of a subject to be treated or prevented. The more information that is collected, the more appropriate and personalized tailor-made treatment can be performed. In the treatment or prevention method and system of the present invention, the analysis of the sugar chain structure preferably includes the analysis of information on the quantitative change of a plurality of sugar chain structures or information related thereto. The analysis of the information on the quantitative change of the plurality of glycan structures or the related information is performed by analyzing the absolute amount and other clinical laboratory values such as the relative amount of the glycan structures and the amount of a specific protein. Analyzing the relative amounts of Further, the correlation preferably includes a correlation between the level of the disease and information on the quantitative change of the plurality of sugar chain structures or related information thereof.
本発明の処置または予防の方法およびシステムにおける糖鎖分析の対象は、 ァ スパラギン結合型糖鎖、 ムチン型糖鎖、 糖脂質糖鎖、 プロテオダリカンなどの糖 鎖を含み得る。  The target of sugar chain analysis in the treatment or prevention method and system of the present invention may include sugar chains such as asparagine-linked sugar chains, mucin-type sugar chains, glycolipid sugar chains, and proteodaricans.
好ましい実施形態において、 本発明において使用される糖鎖構造の分析は、 質 量分析、 クロマトグラフィー、 分光学分析による分析を用いた分析などが挙げら れるがそれらに限定されない。 別の局面において、 本発明は、 被検体からの血清を用いて診断することによつ て該被検体の状態に応じた処置または予防を提示する方法であって、 （a ) 被検 体からの血清に含まれる糖鎖を分析する工程； （b ) 分析された該糖鎖と、 疾患 に関する情報とを相関付ける工程；および （c ) 該疾患に関する情報に応じて適 切な処置または予防のための手段を提示する工程、 包含する、 方法を提供する。 あるいは、 本発明は、 被検体からの血清を用いて診断することによって該被検 体の状態に応じた処置または予防を提示するシステムであって、 （a ) 被検体か らの血清に含まれる糖鎖を分析する手段； （b ) 分析された該糖鎖と、 疾患に関 する情報とを相関付ける手段；および （c ) 該疾患に関する情報に応じて適切な 処置または予防のための手段を提示する手段、 を備える、 システムを提供する。 本発明の方法おょぴシステムにおいて、 被検体からの血清， I g Gなどの試料 を提供する方法または手段は、 当該分野において周知であり、 どのような技術を 用いて調製または提供してもよい。 本発明では、 そのような試料が何らかの形で 提供されることで十分であり、 その調製方法または手段は問わない。 そのような 試料調製方法としては、 例えば、 採血などによって、 血液を採取し、 その後、 血 清を清置や遠心分離によって調製することができる。 I g Gが必要であるときは、 ァフィ二ティーカラム （例えば、 プロテイン Gカラム） などを用いて血清より精 製することができる。 In a preferred embodiment, the analysis of the sugar chain structure used in the present invention includes, but is not limited to, mass spectrometry, chromatography, analysis using spectroscopic analysis, and the like. In another aspect, the present invention provides a method for presenting a treatment or prevention according to the condition of a subject by diagnosing using serum from the subject, comprising: (B) correlating the analyzed sugar chain with information on a disease; and (c) performing appropriate treatment or prevention according to the information on the disease. Providing a means for providing, including, and providing a method for. Alternatively, the present invention provides a system for presenting a treatment or prevention depending on the condition of a subject by diagnosing using serum from the subject, wherein (a) the system is included in serum from the subject. Means for analyzing a sugar chain; (b) means for correlating the analyzed sugar chain with information on a disease; and (c) means for appropriate treatment or prevention in accordance with the information on the disease. Providing a system comprising: In the method and system of the present invention, a method or means for providing a sample such as serum or IgG from a subject is well known in the art, and can be prepared or provided by any technique. Good. In the present invention, it is sufficient that such a sample is provided in some form, and its preparation method or means does not matter. As such a sample preparation method, for example, blood is collected by blood collection or the like, and then the serum can be prepared by clarification or centrifugation. If IgG is required, it can be purified from serum using an affinity column (eg, protein G column).
血清レベルで糖鎖の挙動と疾患との関係は知られておらず、 本発明は、 このよ うな対応関係を初めて示したという点で格別の効果を示す。 従って、 本発明は、 そのような予想外の発見に基づいて診断およびテーラーメイド治療を行うことを 達成したという効果を奏する。  The relationship between the sugar chain behavior and the disease at the serum level is not known, and the present invention shows a remarkable effect in that it has shown such a correspondence for the first time. Therefore, the present invention has an effect of achieving diagnosis and tailor-made treatment based on such unexpected findings.
好ましい実施形態において、 本発明が対象とする糖鎖構造は、 複数の糖鎖構造 のセットを含むことが有利であり得る。 複数の糖鎖構造のセットを分析すること によって、 疾患状態の情報との相関付けがより詳細に検討することができるから である。 血清由来の複数の糖鎖構造のセットの情報と、 疾患状態の情報とが、 相 関付けることができることは従来知られておらず、 本発明は、 そのような予想外 の発見に基づいて診断およびテーラーメィド治療を行うことを達成したという効 果を奏する。 In a preferred embodiment, the sugar chain structure targeted by the present invention may advantageously include a plurality of sets of sugar chain structures. By analyzing a plurality of sets of carbohydrate structures, correlation with disease state information can be examined in more detail. Information on a set of multiple glycan structures derived from serum and information on disease status It is not previously known that it can be associated, and the present invention has the effect of achieving diagnosis and tailor-made treatment based on such unexpected findings.
好ましい実施形態において、 本発明が対象とする疾患は、 慢性関節リウマチで ある。 慢性関節リウマチは、 対象となる被検体中の免疫関連状態すなわちィムノ グロブリンの変化に起因することから、 従来は、 そのィムノグロブリンに関連す る任意の情報に基づいて診断する試みがなされていた。 慢性関節リゥマチの状態 In a preferred embodiment, the disease targeted by the present invention is rheumatoid arthritis. Since rheumatoid arthritis is caused by changes in the immune-related state, i.e., immunoglobulin, in the subject, conventionally, attempts have been made to diagnose based on any information related to the immunoglobulin. . Rheumatoid arthritis status
1 ィムノグロブリンの特定の糖鎖と関連づけられていたが、 本発明ではかつ、 その特定の糖鎖の変化の一部が血清において反映されていることが見出されたこ とから、 診断およびテーラーメイド治療において多大な利点を有する。 (1) Although it was associated with a specific sugar chain of immunoglobulin, in the present invention and because it was found that a part of the change of the specific sugar chain was reflected in serum, diagnosis and tailor-made It has great advantages in treatment.
好ましい実施形態において、 本発明の方法おょぴシステムが分析の対象とする 糖鎖構造は、 N結合型糖鎖であり、 より好ましくは、 末端 G a 1欠損糖鎖である。 そのような糠鎖としては、 例えば、 コード番号 2 1 0 . 1、 コード番号 2 1 0 . 2およびコード番号 2 1 0 . 3などが挙げられるがそれらに限定されない。  In a preferred embodiment, the sugar chain structure to be analyzed by the method or system of the present invention is an N-linked sugar chain, more preferably a terminal G a1 deficient sugar chain. Examples of such a bran chain include, but are not limited to, code number 20.1, code number 20.2 and code number 20.3.
好ましい実施形態において、 本発明の方法およびシステムが対象とする被検体 は、 哺乳動物であり、 より好ましくは、 モデル動物 （例えば、 霊長類 （サルな ど） 、 げっ歯類 （マウス、 ラットなど） など） であり得、 もっとも好ましくは、 ヒトであり得る。 モデル動物を被検体とする場合は、 他の動物 （例えば、 ヒト） における疾患の状態の情報の目安を提供することができる。 好ましくは、 分析対 象となる被検体は、 処置または予防などを行うことが意図される被検体である。 別の実施形態では、 疾患の状態のレベルの情報を一般的に提供するために、 処置、 予防などを行うことが意図されない被検体もまた、 対象に含めることができる。 被検体または病因からの試料に含まれる糖鎖構造を分析する方法および手段は、 本明細書において他の場所において詳述されるように、 種々の分析技術を用いる ことができ、 当業者は本明細書の開示を参照して実施することができる。 分析さ れた糖鎖構造と疾患のレベルとの相関付けおよびそのための手段もまた、 本明細 書において他の場所において詳述されるように、 種々の技術を用いることができ、 当業者は本明細書の開示を参照して実施することができる。 この場合、 相関付け は、 未知のデータを相関付けることもできるし、 既知のデータと相関付けること も可能である。 In a preferred embodiment, the subject targeted by the method and system of the present invention is a mammal, and more preferably, a model animal (eg, a primate (monkey, etc.), a rodent (mouse, rat, etc.)). And most preferably human. When a model animal is used as a subject, it is possible to provide an indication of information on a disease state in another animal (for example, a human). Preferably, the subject to be analyzed is a subject that is intended to be treated or prevented. In another embodiment, subjects that are not intended to be treated, prevented, etc., to generally provide information on the level of the disease state, can also be included in the subject. Methods and means for analyzing the carbohydrate structure contained in a sample from a subject or a pathogen can employ a variety of analytical techniques, as described in detail elsewhere herein. It can be implemented with reference to the disclosure in the specification. Correlation of the analyzed glycan structure with the level of the disease and the means therefor are also described herein. Various techniques can be used, as described in detail elsewhere herein, and can be implemented by one of ordinary skill in the art with reference to the disclosure herein. In this case, the correlation can correlate unknown data or correlate with known data.
疾患のレベルに応じた処置または予防を選択および提示することは、 いったん そのような疾患のレベルに関する情報が与えられたならば、 当業者は容易に実施 することができる。 選択おょぴ提示は、 どのような形式で行ってもよい。 好まし くは、 選択おょぴ提示の方式としては、 医師の処方箋の形式が採られ得るが、 そ れに限定されない。 提示の方式としては、 紙媒体のようなものであってもよく、 電子媒体 （例えば、 記録媒体または伝送媒体 （例えばインターネット） ） を利用 してもよい。  Selecting and presenting treatment or prevention according to the level of the disease can be easily performed by those skilled in the art, once given information about the level of such disease. The selection can be presented in any format. Preferably, the method of selecting and presenting may take the form of, but is not limited to, a physician's prescription. The presentation method may be a paper medium or an electronic medium (for example, a recording medium or a transmission medium (for example, the Internet)).
疾患のレベルに応じた処置または予防を選択およぴ提示をすることおよびその ための手段もまた、 当業者は、 いったんそのような疾患レベルに関する情報が与 えられたならば、 当業者は容易に実施することができる。 従って、 当業者は、 本 明細書の開示に従って疾患のレベルに関する情報を得ることができ、 そのような 情報に基づいて、 処置または予防の選択および提示をすることができる。 そのよ うな処置または予防としては、 例えば、 その被検体に関して有効である薬剤を選 択し、 その被検体に応じて処方することが挙げられるがそれに限定されない。 こ のような方法およびシステムは、 医師などの人間が実施することができ、 あるい は、 このような方法は、 自動化された機械に行わせることも可能である。 そのよ うな機械は、 糖鎖構造を分析する手段、 糖鎖構造と疾患レベルとを相関付ける手 段および疾患レベルに応じた処置または予防を選択する手段からなる群より選択 される少なくとも 1つの手段、 および必要に応じてそのように選択された処置ま たは予防を提示する手段を含み得る。  The choice and presentation of treatment or prevention depending on the level of the disease, and the means therefor, will also be readily apparent to those of skill in the art once given information about such disease levels. Can be implemented. Thus, one of skill in the art can obtain information regarding the level of disease in accordance with the disclosure herein and, based on such information, be able to select and present treatment or prevention. Such treatment or prevention includes, but is not limited to, for example, selecting a drug that is effective for the subject and prescribing the drug in accordance with the subject. Such methods and systems can be implemented by humans, such as physicians, or the methods can be performed by automated machines. Such a machine is at least one means selected from the group consisting of means for analyzing the sugar chain structure, means for correlating the sugar chain structure with the disease level, and means for selecting treatment or prevention according to the disease level. And means for presenting the treatment or prevention so selected, as appropriate.
選択された処置または予防を提示する手段としては、 例えば、 データ処理を行 うことができ、 かつ、 そのように処理されたデータを提示するモニターが接続さ れたコンピュータなどが挙げられるがそれらに限定されない。 好ましくは、 その ような提示手段は、 疾患に関する情報が格納された記録媒体を備えていることが 好ましい。 そのような情報を用いることによって、 薬剤に関する情報を提示する ことが容易になり得る。 Means of presenting the selected treatment or prevention include, for example, data processing and a monitor connected to present such processed data. Computer, but is not limited thereto. Preferably, such a presentation means includes a recording medium in which information on a disease is stored. By using such information, it may be easier to present information about the drug.
本発明の処置または予防の提示方法において分析される糖鎖構造は、 複数の糖 鎖構造のセットを含むことが好ましい。 血清由来の複数の糖鎖構造のセットを分 析することによって、 疾患の情報との相関付けがより詳細に検討することができ、 それにより、 より適切な処置または予防方法を選択することができるからである。 複数の糖鎖構造のセットの情報と、 疾患の情報とが、 相関付けることができるこ とは従来知られておらず、 本発明は、 そのような予想外の発見に基づいて診断お よびテーラーメイド治療を提示する方法およびシステムが提供されるという効果 を奏する。  The sugar chain structure analyzed in the treatment or prevention presentation method of the present invention preferably includes a plurality of sets of sugar chain structures. Analyzing multiple sets of carbohydrate structures from serum allows for more detailed correlation with disease information, so that more appropriate treatment or prevention methods can be selected. Because. It has not been known that information of a set of a plurality of sugar chain structures can be correlated with information of a disease, and the present invention provides diagnosis and tailor-made based on such unexpected findings. This has the effect of providing a method and system for presenting treatment.
好ましくは、 本発明では、 I g Gレベルの糖鎖分析の結果と、 血清レベルの糖 鎖分析の結果とを相関づける方法または手段をさらに含むことが有利である。 こ のような相関付けは、 相対的または絶対量の比較によって行うことができる。 従って、 好ましい実施形態では、 本発明は、 I g Gレベルの糖鎖分析を行うェ 程または手段をさらに包含する。 I g Gの糖鎖分析は血清と同様に行うことがで きる。 また、 I g Gの調製には、 当該分野において周知の方法、 例えば、 ァフィ 二ティーカラムまたはクロマトグラフィーカラムを組み合わせて利用することが できる。  Preferably, in the present invention, it is advantageous to further include a method or means for correlating the result of the sugar chain analysis at the IgG level with the result of the sugar chain analysis at the serum level. Such correlations can be made by comparison of relative or absolute amounts. Therefore, in a preferred embodiment, the present invention further includes a step or means of performing a sugar chain analysis at an IgG level. The sugar chain analysis of IgG can be performed in the same manner as for serum. For preparation of IgG, a method well known in the art, for example, a combination of an affinity column or a chromatography column can be used.
別の実施形態において、 本発明の処置または予防を提示するための方法およぴ システムは、 慢性関節リゥマチに関する方法おょぴシステムであることが好まし いがそれに限定されない。 そのような処置または予防において使用され得る薬剤 としては、 例えば、 非ステロイド性消炎鎮痛剤、 ステロイド類、 免疫抑制剤、 金 チォリンゴ酸ナトリウムなどの金製剤、 メトトレキサート ·ァクタリットなどの 抗リウマチ薬、 温熱療法、 関節の可動域体操や筋肉強化訓練などの運動療法、 補 装具の装着、 滑膜除去や人工関節置換などの手術、 安静保温を心がけるなどの生 活注意などが挙げられるがそれらに限定されない。 In another embodiment, the method and system for presenting treatment or prevention of the present invention is preferably, but not limited to, a method and system for rheumatoid arthritis. Drugs that may be used in such treatment or prevention include, for example, non-steroidal anti-inflammatory analgesics, steroids, immunosuppressants, gold preparations such as sodium gold thiomalate, antirheumatic drugs such as methotrexate aktarit, hyperthermia Exercise therapy, such as joint range of motion exercises and muscle strengthening training, Examples include, but are not limited to, wearing orthotics, performing operations such as synovial removal and artificial joint replacement, and taking care of life such as keeping the temperature at rest.
好ましくは、 分析した糖鎖構造の構造、 量、 存在形式などに関する情報から、 ある処置が有効であることが示される場合、 本発明の提示方法において提示され る。 そのような場合、 被検体において選択した薬剤投与を含む処置が有効である ことが予めわかっていることから、 無駄な治療または予防を施すことを回避する ことができる。 そのような薬剤は、 別の実施形態において、 複数の薬剤や処置の 組み合わせであってもよい。  Preferably, when information on the analyzed structure, amount, form of existence, etc. of the sugar chain structure indicates that a certain treatment is effective, the treatment is presented in the presentation method of the present invention. In such a case, since it is known in advance that the treatment including the selected drug administration is effective in the subject, it is possible to avoid giving unnecessary treatment or prevention. Such an agent, in another embodiment, may be a combination of multiple agents or treatments.
そのような薬剤は、 その被検体に対して腎障害やァレルギ一などの別の好まし くない有害反応を惹起しないことが好ましい。 そのような有害反応を惹起すると、 有効であることが判明した薬剤といえども、 生体自身に有効に作用する効果を超 える有害作用を生じる可能性があるからである。 し力 し、 そのような有害反応が 克服可能であるか、 無視し得る場合、 そのような有害反応を惹起する可能性のあ る薬剤が提示され得る。 そのような場合、 有害反応を起こし得る可能性を提示す ることが好ましい。 好ましくは、 そのような有害反応を惹起する可能性のある薬 剤を投与する場合は、 そのような有害反応を回避する処置 （例えば、 アレルギー 回避のための薬剤の投与など） を提示することが有利である。 そのような有害反 応回避処置もまた、 当業者は、 当該分野において公知の技術を用いて選択し、 行 うことができる。  Preferably, such agents do not elicit another undesirable adverse reaction, such as renal impairment or allergy, to the subject. When such an adverse reaction is caused, even a drug that has been found to be effective may cause an adverse effect that exceeds the effect of effectively acting on the living body itself. However, if such adverse reactions can be overcome or negligible, drugs that may cause such adverse reactions may be presented. In such cases, it is preferable to present the potential for adverse reactions. Preferably, when a drug that may cause such an adverse reaction is administered, measures to avoid such an adverse reaction (for example, administration of a drug to avoid allergy) should be provided. It is advantageous. Such adverse reaction avoidance measures can also be selected and performed by those skilled in the art using techniques known in the art.
本発明の特定の実施例において、 分析される糖鎖構造はコード番号 2 1 0 . 1、 コード番号 2 1 0 . 2およびコード番号 2 1 0 . 3からなる群より選択される糖 鎖を少なくとも含み得る。 このような場合、 処置されるべき疾患としては慢性関 節リゥマチを含み得る。  In a specific embodiment of the present invention, the glycan structure to be analyzed comprises at least a glycan selected from the group consisting of code No. 210.1, code No. 210.2 and code No. 210.3. May be included. In such cases, the disease to be treated may include chronic joint rheumatism.
好ましい実施形態において、 本発明の処置または予防の提示方法が対象とする 被検体は、 哺乳動物であり、 より好ましくは、 有益 1(1物 （例えば、 家畜 （ゥシ、 プタ、 ゥマなど） など） であり得、 もっとも好ましくは、 ヒ トであり得る。 好ま しくは、 処置または予防の提示方法の対象となる被検体は、 処置または予防など を行うことが意図される被検体である。 好ましくは、 このような方法では、 予め 処置または予防の対象となる被検体の薬剤耐性、 体質、 疾患などに関する情報を 得ていることが好ましい。 あるいは、 そのような情報は提示方法が実行されるた ぴに提供されてもよい。 そのような情報の提示は、 手動でもよく、 あるいは記録 媒体などから自動的に入力される形式をとつてもよい。 提示されるべき被検体に 関する生物学的情報が予めわかっている場合は、 そのような情報は記録媒体に格 鈉されて提供され得る。 このような提示方法によって、 より適切な個人対応型の テーラーメイド治療を被検体は知ることができる。 In a preferred embodiment, the subject to be treated by the method of presenting treatment or prevention of the present invention is a mammal, and more preferably, a beneficial 1 (for example, a domestic animal (eg, a domestic animal (pea, stag, poma, etc.)). And most preferably human. Alternatively, the subject to be presented with the treatment or prevention method is a subject that is intended to undergo treatment or prevention. Preferably, in such a method, it is preferable that information on drug resistance, constitution, disease, etc. of the subject to be treated or prevented is obtained in advance. Alternatively, such information may be provided once the presentation method is performed. The presentation of such information may be manual or may be in a form automatically input from a recording medium or the like. If the biological information about the subject to be presented is known in advance, such information can be provided stored on a recording medium. With such a presentation method, the subject can know a more appropriate personalized tailor-made treatment.
本発明の処置または予防の提示方法では、 糖鎖構造の分析は、 血清レベルの糖 鎖と疾患に関し相関がつけられた種の糖鎖を含むこと、 および/または複数の糖 鎖構造の量的変化の情報またはその関連情報の分析を含むことが好ましい。 その ような特定種の糖鎖の分析、 および/またはこのような複数の糖鎖構造の量的変 化の情報またはその関連情報の分析は、 絶対量を分析することおよび複数の糖鎖 構造の相対量を分析することを包含する。 また、 相関付けは、 疾患に関する情報 と該複数の糖鎖構造の量的変化の情報またはその関連情報との相関付けを含むこ とが好ましい。  In the method for presenting treatment or prevention according to the present invention, the analysis of the sugar chain structure may include the inclusion of a sugar chain of a species correlated with a serum level of the sugar chain and the disease, and / or the quantitative analysis of a plurality of sugar chain structures. Preferably, it includes analysis of the change information or its related information. The analysis of such specific types of glycans and / or the analysis of the information on the quantitative change of such a plurality of glycan structures or the related information thereof can be carried out by analyzing the absolute amount and the Analyzing relative amounts. Preferably, the correlation includes a correlation between information on a disease and information on a quantitative change of the plurality of sugar chain structures or related information thereof.
本発明の処置または予防の方法における糖鎖分析の対象は、 ァスパラギン結合 型糖鎖、 ムチン型糖鎖、 糖脂質糖鎖、 プロテオダリカンなどの糖鎖を含み得る。 好ましい実施形態において、 本発明の提示方法において使用される糖鎖構造の 分析は、 質量分析、 クロマトグラフィー、 分光学分析による分析を用いた分析な どが挙げられるがそれらに限定されない。  The target of sugar chain analysis in the treatment or prevention method of the present invention may include sugar chains such as asparagine-linked sugar chains, mucin-type sugar chains, glycolipid sugar chains, and proteodaricans. In a preferred embodiment, the analysis of the sugar chain structure used in the presentation method of the present invention includes, but is not limited to, analysis using mass spectrometry, chromatography, and spectroscopic analysis.
本発明の処置または予防方法の提示を実行するコンピュータ構成の例を図 1 1 を参照して示す。 図 1 1は、 本発明の処置または予防方法の提示の処理を実行す るコンピュータの 5 0 0の構成例を示す。  An example of a computer configuration for performing the presentation of the treatment or prevention method of the present invention is shown with reference to FIG. FIG. 11 shows a configuration example of 500 of a computer that executes a process of presenting a treatment or prevention method of the present invention.
コンピュータ 5 0 0は、 入力部 5 0 1と、 C P U 5 0 2と、 出力部 5 0 3と、 メモリ 504と、 パス 505とを備える。 入力部 501と、 CPU502と、 出 力部 503と、 メモリ 504とは、 パス 505によって相互に接続されている。 入力部 501と出力部 503とは入出力装置 506に接続されている。 The computer 500 has an input section 501, a CPU 502, an output section 503, A memory 504 and a path 505 are provided. The input unit 501, the CPU 502, the output unit 503, and the memory 504 are interconnected by a path 505. The input unit 501 and the output unit 503 are connected to an input / output device 506.
コンピュータ 500によって実行される相関付けの処理の概略を説明する。 相関付け方法および/または処置もしくは予防の選択を実行させるプログラム An outline of the correlation process performed by the computer 500 will be described. Correlation method and / or program to perform treatment or prevention selection
(以下、 それぞれ相関付けプログラムおよび選択プログラムという） は、 例えば、 メモリ 502に格納されている。 あるいは、 相関付けプログラムおよび選択プロ グラムは、 それぞれ独立してあるいは一緒に、 フロッピー （登録商標） ディスク、 MO、 CD-ROM, CD— R、 D VD— R OMのような任意のタイプの記録媒 体に記録され得る。 あるいは、 アプリケーションサーバに格納されていてもよい。 そのような記録媒体に記録された相関付けプログラムおよび/または選択プログ ラムは、 出入力装置 506 (例えば、 ディスクドライブ、 ネットワーク （例えば、 インターネット） ) を介してコンピュータ 500のメモリ 504にロードされる。 CPU 502が相関付けプログラムおよび Zまたは選択プログラムを実行するこ とによって、 コンピュータ 500は、 本発明の相関付け方法おょぴ Zまたは選択 方法の処理を実行する装置として機能する。 (Hereinafter referred to as a correlation program and a selection program, respectively) are stored in the memory 502, for example. Alternatively, the correlation program and the selection program can be used independently or together with any type of recording medium such as a floppy disk, MO, CD-ROM, CD-R, DV-ROM. Can be recorded on the body. Alternatively, it may be stored in an application server. The correlation program and / or the selection program recorded on such a recording medium are loaded into the memory 504 of the computer 500 via the input / output device 506 (for example, a disk drive, a network (for example, the Internet)). When the CPU 502 executes the correlation program and the Z or selection program, the computer 500 functions as an apparatus that executes the processing of the correlation method Z or the selection method of the present invention.
入力部 501を介して、 糖鎖構造の分析の結果 （例えば、 配列情報、 レベル、 量など） および疾患に関する情報などを入力する。 必要に応じて、 糖鎖と相関付 けられる状態、 障害または疾患などの副次的情報、 処置およびノまたは予防に関 する情報も入力してもよい。  Through the input unit 501, the result of the analysis of the sugar chain structure (for example, sequence information, level, amount, etc.) and information on disease are input. If necessary, secondary information such as a condition, a disorder or a disease that is correlated with the sugar chain, and information regarding treatment and prevention or prevention may also be input.
C P U 502は、 入力部 501で入力された情報をもとに、 糖鎖構造に関する 情報と疾患レベルとを相関付け、 メモリ 504に相関データを格納する。 その後、 CPU 502は、 これらの情報をメモリ 504に格納し得る。 CPU 502は、 必要に応じて、 これらの情報に基づき、 適切な信号強度を選択する。 生成された 相関付けデータに基づいて、 適切な処置または予防方法を選択または作成する。 この情報をメモリ 504に格納することもできる。 その後、 出力部 5 0 3は、 C P U 5 0 2が選択した疾患に関する情報、 適切な 処置または予防方法に関する情報などを出力する。 出力されたデータは、 入出力 装置 5 0 6から出力され得る。 そのような出力されたデータは、 紙媒体の形式と して被検体またはその被検体を診察する医師などに提示される力、 あるいは、 電 子媒体 （例えば、 記録媒体または伝送媒体など） として提示され得る。 そのよう な媒体での提示形式はどのようなものでも可能であるが、 当局の基準に従うこと が好ましい。 したがって、 処方箋または医療カルテの形式をとることが好ましく あり得る。 The CPU 502 correlates the information on the sugar chain structure with the disease level based on the information input at the input unit 501, and stores the correlation data in the memory 504. Thereafter, CPU 502 may store such information in memory 504. The CPU 502 selects an appropriate signal strength based on such information as necessary. Based on the generated correlation data, select or create an appropriate treatment or prevention method. This information can also be stored in memory 504. Thereafter, the output unit 503 outputs information on the disease selected by the CPU 502, information on an appropriate treatment or prevention method, and the like. The output data can be output from the input / output device 506. Such output data may be presented in the form of a paper medium, a force presented to the subject or a physician who examines the subject, or an electronic medium (eg, a recording medium or a transmission medium). Can be done. Any form of presentation in such media is possible, but it is preferred to follow regulatory standards. Therefore, it may be preferable to take the form of a prescription or medical chart.
本明細書において引用された、 科学文献、 特許、 特許出願などの参考文献は、 その全体が、 各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考とし て援用される。  The references cited in the present specification, such as scientific literature, patents, and patent applications, are incorporated herein by reference in their entirety to the same extent as if each was specifically described.
以上、 本発明を、 理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。 以下に、 実施例に基づいて本発明を説明するが、 上述の説明および以下の実施例 は、 例示の目的のみに提供され、 本発明を限定する目的で提供し のではない。 従って、 本発明の範囲は、 本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例に も限定されず、 特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されるべきで ある。 実施例  The present invention has been described above by showing preferred embodiments for easy understanding. Hereinafter, the present invention will be described based on examples, but the above description and the following examples are provided for illustrative purposes only, and not for limiting the present invention. Therefore, it is to be understood that the scope of the present invention is not limited to the embodiments specifically described herein or the examples, but only by the claims. Example
以下において記載する実施例では、 特に言及しない限り、 和光純薬から入手し た試薬を用いた。 また、 実験においては、 北海道大学および他の医療処置実施機 関において実施時に規定される基準を遵守して行った。  In the examples described below, unless otherwise specified, reagents obtained from Wako Pure Chemical Industries were used. The experiments were conducted in accordance with the standards specified at the time of implementation at Hokkaido University and other medical treatment implementation organizations.
(実施例 1 ) (Example 1)
慢性関節リウマチは、 自己免疫グロブリン G ( I g G) を認識して結合するリ ゥマトイド因子 （R F ) を産生する自己免疫疾患である。 R Fの抗原となる I g Gは、 H鎖おょぴ L鎖のそれぞれ二量体からなり、 F c部位の 2つの CH2ドメ インの As n 297に結合した 2本の N結合型糖鎖をもつ糖タンパク質であるRheumatoid arthritis is an autoimmune disease that produces rheumatoid factor (RF) that recognizes and binds to autoimmune globulin G (IgG). I g as RF antigen G is a glycoprotein consisting of a dimer of each heavy chain and light chain, and having two N-linked sugar chains linked to Asn297 of two CH2 domains at the Fc site.
(図 1) 。 I gGの糖鎖は図 2に示すような二本鎖複合型糖鎖を有し、 RA患者 の I gG糖鎖は健常人に比べ、 非還元末端の G a 1を欠損した糖鎖の割合が高い ことがわかっていた。 しかし、 リウマチ疾患によって、 このような糖鎖の構造変 化現象が他の糖タンパク質も含む全血清中の N結合型糖鎖においても観察できる かどうかはわかっていなかった。 そこで、 血清中の全糖タンパク質から遊離した N結合型糖鎖を分析し、 I gGにおける糖鎖パターンと比較した。 (Figure 1) . The IgG sugar chain has a double-stranded complex type sugar chain as shown in Fig. 2, and the ratio of IgG sugar chain in RA patients lacking non-reducing terminal G a1 is lower than that in healthy subjects. Was known to be high. However, it was not known whether rheumatic diseases could lead to such structural changes in sugar chains in N-linked sugar chains in whole serum, including other glycoproteins. Therefore, N-linked sugar chains released from all glycoproteins in serum were analyzed and compared with the sugar chain pattern in IgG.
(2次元糠鎖マップ法）  (2D bran chain map method)
本実施例で用いた二次元糖鎖マップ法を説明する。  The two-dimensional sugar chain map method used in this example will be described.
二次元糖鎖マップ法とは、 2種類の異なるクロマトグラフィーを組み合わせた 分析法であり、 本実施例では、 ODSカラム （ォクタデシルシリカ、 島津製作所 製） とアミドカラム （東ソ一製） とを使用した。 これにより、 試料から糖鎖を分 離し、 溶出位置から糖鎖構造を解析することができる。  The two-dimensional glycan map method is an analysis method combining two different types of chromatography. In this example, an ODS column (Octadecyl silica, manufactured by Shimadzu Corporation) and an amide column (Tosoh Corporation) are used. used. Thus, the sugar chain can be separated from the sample, and the sugar chain structure can be analyzed from the elution position.
特に、 構造が既知である標準糖鎖の、 2種類のカラムによる溶出位置の座標の 集積を 2次元マップという。  In particular, the accumulation of the coordinates of the elution positions of standard sugar chains of known structures using two types of columns is called a two-dimensional map.
試料の調製は以下のように行った。 まず、 分析対象となる患者 （骨折患者、 変 形関節症患者、 慢性関節リウマチ患者） および健常者より真空採血管を用いて採 血し、 清置により血清を得る。 更に血清試料から I gGを、 MAb T r a K i t (Ame r s a m B i o s c i e n c e s社製） を使用して分離した。 血清おょぴ分離した IgGは、 トリプシン、 キモトリブシン （Sigma社製） を用い てペプチド鎖の部分を短くした。 次に、 N—グリコシダーゼ F (Roche社製） を 用いて糖鎖部分をペプチドから遊離した。 プロナーゼ （Calbiochem社製） を用い てぺプチドをアミノ酸へと分解した。 次にゲル濾過で精製を行った後に蛍光標識 を行った。 蛍光標識としては、 2—アミノビリジンとシァノホウ酸ナトリウム (Aldrich社製） を使用した。 この試料をゲルろ過で精製後、 弱酸分解でシアル 酸を遊離した。 この様にして調製した蛍光標識糖鎖を高速液体クロマ The sample was prepared as follows. First, blood is collected from patients to be analyzed (fracture patients, osteoarthritis patients, rheumatoid arthritis patients) and healthy subjects using vacuum blood collection tubes, and serum is obtained by cleansing. Further, IgG was separated from the serum sample using MAb TraKit (Amersham Biosciences). For the IgG separated from the serum, the peptide chain was shortened using trypsin and chymotrypsin (Sigma). Next, the sugar chain portion was released from the peptide using N-glycosidase F (Roche). The peptides were decomposed into amino acids using Pronase (Calbiochem). Next, after purification by gel filtration, fluorescent labeling was performed. As a fluorescent label, 2-aminoviridine and sodium cyanoborate (manufactured by Aldrich) were used. After purifying this sample by gel filtration, sialic acid digestion The acid was released. The fluorescent-labeled sugar chains prepared in this way are converted to high-performance liquid chromatographs.
一 （日立ハイテクノロジーズ社製） で分離、 分析を行った。 まず、 ODSカラム(Hitachi High-Technologies Corporation) for separation and analysis. First, ODS column
(HRC-0DS 6 X 150mm, 島津製作所社製） で分離した後、 分離したピークを 夫々アミドカラム （Amide- 80 4.6 x 250mm, 東ソ一社製） にかけて分離分析し、 糖鎖を精製すると同時にその溶出位置を計算する。 0DS、 Amideの溶出位置から 2 次元マップを用いて糖鎖構造を推定し、 推定構造に基づきその構造を確認するた めに、 部分的に糖分解酵素 （i3-N-ァセチルへキソサミニダーゼ、 -ガラクトシ ダーゼ （以上、 クチナタマメ由来、 生化学工業社製） 、 - L-フコシダーゼ （ゥ シ腎臓由来、 Sigma社製） ) により逐次酵素消化を行い、 酵素消化毎に ODS力 ラム、 アミドカラムによる分析を行った （図 3) 。 部分酵素消化と再度の分析に より、 糖鎖の推定構造が正しいことを確認する。 (HRC-0DS 6X150mm, Shimadzu Corporation), and the separated peaks are applied to an amide column (Amide-80 4.6 x 250mm, manufactured by Tosoh Corporation) for separation and analysis. Calculate the elution position. In order to estimate the sugar chain structure from the elution position of 0DS and Amide using a two-dimensional map, and to confirm the structure based on the estimated structure, a partial glycolytic enzyme (i3-N-acetylhexosaminidase, -galactosidase Sequential enzymatic digestion was carried out with dase (from Gardenia bean, manufactured by Seikagaku Corporation) and -L-fucosidase (derived from red kidney, manufactured by Sigma), and each enzyme digestion was analyzed using an ODS column and an amide column. (Figure 3). Confirm that the putative structure of the sugar chain is correct by partial enzymatic digestion and re-analysis.
ODSカラムによる分析は、 以下のように行った。 流速は、 lmlZ分、 5 5°Cで行った。 溶離液としては、 A : 1 OmM リン酸ナトリウム （pH3. 8) 、 B ： 0. 5% 1 -プタノール ZAを用いた。 この二種類の溶離液を、 B 2 0%〜50% (0〜60分） で直線勾配を用いて溶離した。 分離の例示を図 4に 示す。 分析は、 蛍光分光光度計で励起光 320 nm、 検出光 400 nmを用いて 行つた。 ピリジルァミノ化糖鎖の蛍光強度は糖鎖構造に拠り変化しないことが解 つているため、 HPLCでのピーク面積をそれぞれの糖鎖構造のモル量比として扱う ことが可能である。  The analysis using the ODS column was performed as follows. The flow was performed at 55 ° C. for 1 mlZ. As the eluent, A: 1 OmM sodium phosphate (pH 3.8), B: 0.5% 1-butanol ZA was used. The two eluents were eluted with a linear gradient from 0% to 50% B2 (0 to 60 minutes). Figure 4 shows an example of separation. The analysis was performed using a fluorescence spectrophotometer with excitation light of 320 nm and detection light of 400 nm. Since it has been found that the fluorescence intensity of the pyridylamino sugar chain does not change depending on the sugar chain structure, the peak area in HPLC can be treated as a molar ratio of each sugar chain structure.
アミドカラムによる分析は、 以下のように行った。 流速は、 lmlZ分、 4 The analysis using an amide column was performed as follows. Flow rate is lmlZ min, 4
0 °Cで行つた。 溶離液としては、 A： 3 %酢酸一トリェチルァミン （ p H 7. 3) ：ァセトニトリル （35 : 65 (v/v) ) 、 B : A : 3 %酢酸一トリェチ ルァミン (pH7. 3) ：ァセトニトリル （50 ： 50 (v/v) ) を用いた。 この二種類の溶離液を、 B 0%〜60% (0〜30分） で直線勾配を用いて溶 離した。 分離は図 6のようになる。 分析は、 蛍光分光光度計で励起光 320 n m、 検出光 400 nmを用いて行った。 (結果おょぴ相関付け） Goed at 0 ° C. As eluents, A: 3% monotriethylamine acetate (pH 7.3): acetonitrile (35:65 (v / v)), B: A: 3% monotriethylamine acetate (pH 7.3): acetonitrile (pH7.3) 50: 50 (v / v)) was used. The two eluents were separated using a linear gradient from 0% to 60% B (0 to 30 minutes). Figure 6 shows the separation. The analysis was performed with a fluorescence spectrophotometer using excitation light of 320 nm and detection light of 400 nm. (Result correlation)
IgG糖鎖の 0DS力ラムでのプロファイル例を図 4に、 図 5には主な糖鎖の構造と その量比 （モル比） を示す。 血清糖鎖の 0DSカラムでのプロファイル例を図 6 Aに、 図 6 Bには 0DSで分離した各ピークの Amideカラムを用いた分析のクロマトグラム を示す。 図 7には各ピークの糖鎖構造を部分酵素消化により決める過程の例を、 図 8には血清由来の糖鎖の部分酵素消化での経緯を 2次元マップ上にまとめたも のを、 図 9には血清由来の糖鎖構造とその量比 （モル比） を示す。 図 1 0には、 特定の糖鎖 210. 1と 210. 2+210. 3に着目し、 その割合の変化をみた。 リウマチ患者 の IgG糖鎖において 210. 1が増加することは知られていたが、 本試験において血清 に於いても同様に増加し、 血清全体の糖鎖分析が疾患の診断に有用であることが 示唆された。 また、 今まで報告されていないが骨折患者の IgG糖鎖ではピーク A (210. 1) の増加とピーク D (210. 4) の減少が、 変形関節症患者では IgG糖鎖 においては顕著な変化は認められないが血清糖鎖において 210. 1の 210. 2+3との比 較での減少が観察された。 この上昇下降を指標として用いれば、 血清の糖鎖解析 によりリゥマチと変形関節症の診断に使用できる可能性があることが分かった。 従来 IgG糖鎖が各種疾患で変化し、 疾患の診断や発症機構の解明に有用であるこ とは示唆されていたが、 本試験により血清糖鎖の分析においても同様に疾患の診 断に有用であることが示唆された。 更に血清糖鎖の分析では IgG糠鎖では変化が 認、められない疾患でも糖鎖変化が観察されたことより、 複数の疾患の診断に有用 であることが示唆された。 試料の調製は血清の方が IgGよりも簡易であることも 併せ、 血清糠鎖による診断が産業上有用である。  Fig. 4 shows an example of a profile of IgG sugar chains at 0DS force ram, and Fig. 5 shows the main sugar chain structures and their quantitative ratios (molar ratios). Fig. 6A shows an example of a profile of a serum sugar chain on a 0DS column, and Fig. 6B shows a chromatogram of analysis of each peak separated by 0DS using an Amide column. Fig. 7 shows an example of the process of determining the sugar chain structure of each peak by partial enzymatic digestion, and Fig. 8 shows the history of partial enzymatic digestion of serum-derived sugar chains on a two-dimensional map. Fig. 9 shows the sugar chain structures derived from serum and their ratios (molar ratios). Figure 10 focuses on the specific sugar chains 210.1 and 210.2 + 210.3, and observes the change in their ratio. It was known that 210.1 was increased in IgG sugar chains in rheumatic patients, but in the present study it was also increased in serum, indicating that sugar chain analysis of whole serum is useful for diagnosis of disease. It was suggested. Although not reported so far, the increase in peak A (210.1) and decrease in peak D (210.4) in IgG sugar chains in fractured patients, but marked changes in IgG sugar chains in osteoarthritis patients No decrease was observed in serum sugar chains, but a decrease in 210.1 compared to 210.2 + 3 was observed. Using this rise and fall as an index, serum sugar chain analysis showed that it could be used to diagnose rheumatism and osteoarthritis. Conventionally, it has been suggested that IgG sugar chains change in various diseases, and that they are useful for diagnosis of diseases and elucidation of the onset mechanism.However, this test is also useful for diagnosis of diseases in serum sugar chain analysis. It was suggested that there is. Furthermore, in the analysis of serum sugar chains, changes were observed in IgG bran chains, and sugar chain changes were observed even in diseases that could not be detected, suggesting that it is useful for diagnosis of multiple diseases. In addition to the fact that serum is easier to prepare than IgG for sample preparation, diagnosis using serum bran chains is industrially useful.
(実施例 2 ：実際の診断における応用） (Example 2: Application in actual diagnosis)
次に、 ランダムに検体を採取し、 上述の糖鎖の分析により、 リウマチであるか' どうかを示すことができるかを調べた。  Next, samples were collected at random, and the above sugar chain analysis was performed to determine whether it was possible to indicate whether the subject was rheumatoid or not.
上述の実施例に記載されるように慢性関節リゥマチ患者と疑われる被検体およ ぴ正常被検体から血清サンプルを調製し、 上述の実施例に記載されるようなプロ トコルを用いて糖鎖分析を行った。 その結果、 上述の 2 1 0 . 1、 コード番号 2 1 0 . 2およびコード番号 2 1 0 . 3において異常が見られた被検体を慢性関節 リウマチであるかどうかを医師が確認したところ、 そうであることが明らかにな つた。 他方、 2 1 0 . 1、 コード番号 2 1 0 . 2およびコード番号 2 1 0 . 3に おいて異常が見られなかった被検体は、 慢性関節リゥマチには罹患していなかつ た。 従って、 本発明の手法は、 実際の診断に使用可能であることが明らかになつ た。 (実施例 3 ：テーラーメイド治療） Subjects and suspected rheumatoid arthritis patients as described in the above examples. 血清 A serum sample was prepared from a normal subject, and sugar chain analysis was performed using the protocol described in the above-mentioned Example. As a result, when the physician confirmed whether or not the subjects with abnormalities in the above 20.1, code number 210.2 and code number 20.3 were rheumatoid arthritis, It became clear that it was. On the other hand, subjects with no abnormalities in 20.1, code number 20.2 and code number 20.3 did not have rheumatoid arthritis. Therefore, it became clear that the method of the present invention can be used for actual diagnosis. (Example 3: Tailor-made treatment)
実施例 2に記載した診断の結果に従って、 慢性関節リウマチと診断された患者 に抗リウマチ剤非ステロイド性消炎鎮痛剤、 ステロイド類、 免疫抑制剤、 金チォ リンゴ酸ナトリウムなどの金製剤、 メトトレキサート ·ァクタリツトなどの抗リ ゥマチ薬を投与すると、 慢性関節リウマチを処置することができる。 従って、 本 発明により、 実際にテーラーメイド治療を行うことができることが明らかになる。 以上のように、 本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、 本努明は、 特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが 理解される。 本明細書において引用した特許、 特許出願および文献は、 その内容 自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対す る参考として援用されるべきであることが理解される。 産業上の利用可能性 '  According to the results of the diagnosis described in Example 2, patients diagnosed with rheumatoid arthritis can be treated with antirheumatic drugs, nonsteroidal anti-inflammatory drugs, steroids, immunosuppressants, gold preparations such as sodium gold malate, methotrexate actactritol Administration of anti-rheumatic drugs such as can treat rheumatoid arthritis. Therefore, according to the present invention, it is clear that a tailor-made treatment can be actually performed. As described above, the present invention has been exemplified by using the preferred embodiments of the present invention. However, it is understood that the scope of the present invention should be interpreted only by the appended claims. The patents, patent applications, and references cited in this specification should be incorporated by reference in their entirety, as if their contents were specifically described in this specification. It is understood that. Industrial applicability ''
本発明は、 血清全体の糖鎖構造を解析することによって、 予想外に詳細に疾患 状態を分析することが可能となり、 診断およびテーラーメイド治療が可能となつ た。  INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, by analyzing the sugar chain structure of whole serum, it is possible to analyze a disease state in unexpected detail, and diagnosis and tailor-made treatment have become possible.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1. 以下の工程： 1. The following steps:
(a) 被検体からの血清に含まれる疾患マーカーを分析する工程；および (b) 分析された該疾患マーカーと、 疾患に関する情報とを相関付ける工程、 を包含する、 被検体からの血清を用いて疾患を診断する方法。  (a) analyzing a disease marker contained in serum from a subject; and (b) correlating the analyzed disease marker with information on a disease, using a serum from the subject. To diagnose the disease.
2. 実質的に疾患マーカーを精製する工程を含まない、 請求項 1に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein the method does not substantially include purifying the disease marker.
3. 前記疾患は、 慢性関節リウマチを含む、 請求項 1に記載の方法。 3. The method of claim 1, wherein the disease comprises rheumatoid arthritis.
4. 前記疾患マーカーは、 N結合型糖鎖を含む、 請求項 1に記載の方法。 4. The method according to claim 1, wherein the disease marker includes an N-linked sugar chain.
5. 前記疾患マーカーは、 末端 G a 1欠損糖鎖を含む、 請求項 1に記載の方 法。 5. The method according to claim 1, wherein the disease marker includes a terminal G a1 deficient sugar chain.
6. 前記疾患マーカーは、 コード番号 210. 1、 コード番号 210. 2お よびコード番号 210. 3からなる群より選択される糖鎖を少なくとも含む、 請 求項 1に記載の方法。 6. The method according to claim 1, wherein the disease marker includes at least a sugar chain selected from the group consisting of code number 210.1, code number 210.2 and code number 210.3.
7. 前記被検体は、 ヒ トである、 請求項 1に記載の方法。 7. The method according to claim 1, wherein the subject is a human.
8. 血清レベルの糖鎖分析と精製された疾患マーカーレベルの糖鎖分析を行う 工程をさらに包含する、 請求項 1に記載の方法。 8. The method according to claim 1, further comprising performing a serum level sugar chain analysis and a purified disease marker level sugar chain analysis.
9. 精製された疾患マーカーレベルの糖鎖分析結果と、 血清レベルの糖鎖分析 9. Purified disease marker level glycan analysis results and serum level glycan analysis
10. 前記糖鎖の分析は、 クロマトグラフィーによる分析を含む、 請求項 8に 記載の方法。 10. The method according to claim 8, wherein the analysis of the sugar chain includes an analysis by chromatography.
1 1. 前記糖鎖の分析は、 少なくとも 2種類のクロマトグラフィー分析を含む、 請求項 8に記載の方法。 11. The method according to claim 8, wherein the sugar chain analysis comprises at least two types of chromatographic analysis.
12. 前記糖鎖の分析は、 ODSカラムおよびアミドカラムからなる群より選 択される少なくとも 1つのカラムによる分析を含む、 請求項 8に記載の方法。 12. The method according to claim 8, wherein the analysis of the sugar chain includes an analysis using at least one column selected from the group consisting of an ODS column and an amide column.
13. 少なくとも 1つの糖鎖消化酵素による消化工程をさらに包含する、 請求 項 1に記載の方法。 13. The method according to claim 1, further comprising a digestion step with at least one sugar chain digestive enzyme.
14. 前記血清は前処理なしに分析される、 請求項 1に記載の方法。 14. The method of claim 1, wherein the serum is analyzed without pretreatment.
15. 以下の工程： 15. The following steps:
(a) 被検体からの血清に含まれる疾患マ一力一を分析する工程；  (a) analyzing the disease level contained in the serum from the subject;
(b) 分析された該疾患マ一カーと、 疾患に関する情報とを相関付ける工程； および  (b) correlating the analyzed disease marker with information about the disease; and
(c) 該疾患に関する情報に応じて適切な処置または予防のための手段を該被 検体に提供する工程、  (c) providing the subject with appropriate treatment or prevention means in response to information on the disease,
を包含する、 被検体からの血清を用いて診断することによって該被検体を処置ま たは予防する方法。 A method for treating or preventing a subject by diagnosing using serum from the subject.
16. 以下： 16. Below:
77 訂正された用紙 （規則 91) 77 Corrected Form (Rule 91)
1 6. 以下： 1 6. Below:
(a) 被検体からの血清に含まれる疾患マーカーを分析する手段；および (a) means for analyzing a disease marker contained in serum from the subject; and
(b) 分析された該疾患マーカーと、 疾患に関する情報とを相関付ける手段、 を包含する、 被検体からの血清を用いて疾患を診断するシステム。 (b) a system for diagnosing a disease using serum from a subject, comprising: a means for correlating the analyzed disease marker with information on the disease.
1 7. 以下の工程： 1 7. The following steps:
(a) 被験体の血清を得る工程；  (a) obtaining the serum of the subject;
(b) 得られた血清をトリプシンまたはキモトリブシンで処理し、 トウべプチ ドを得る工程；  (b) treating the obtained serum with trypsin or chymotrypsin to obtain toupeptide;
(c) 得られた糖ペプチドを遊離させる工程；  (c) releasing the obtained glycopeptide;
(d) 遊離された糖鎖を分析する工程；および  (d) analyzing the released sugar chains; and
(e) 分析された糖鎖と、 疾患に関する情報とを相関付ける工程、  (e) correlating the analyzed sugar chains with information on the disease,
を包含する、 血清を用いて被検体の疾患を診断する方法。 A method for diagnosing a disease in a subject using serum.
1 8. 実質的に疾患マーカーを精製する工程を含まない、 請求項 1 7に記載の方 法。 18. The method of claim 17, wherein the method does not substantially include a step of purifying the disease marker.
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