[go: up one dir, main page]

WO2005026369A2 - Vecteurs d’expression d’arn interferents, leurs procedes de preparation et leurs utilisations. - Google Patents

Vecteurs d’expression d’arn interferents, leurs procedes de preparation et leurs utilisations. Download PDF

Info

Publication number
WO2005026369A2
WO2005026369A2 PCT/FR2004/002267 FR2004002267W WO2005026369A2 WO 2005026369 A2 WO2005026369 A2 WO 2005026369A2 FR 2004002267 W FR2004002267 W FR 2004002267W WO 2005026369 A2 WO2005026369 A2 WO 2005026369A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cassette
cells
vector according
vector
expression
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/002267
Other languages
English (en)
Other versions
WO2005026369A3 (fr
Inventor
Pascale Nony
Sophie Chappuis
Original Assignee
Transat
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transat filed Critical Transat
Publication of WO2005026369A2 publication Critical patent/WO2005026369A2/fr
Publication of WO2005026369A3 publication Critical patent/WO2005026369A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression

Definitions

  • the present invention relates to products and methods for modulating the expression of interfering RNA both in cultured cells and in an organism such as animal, man or plants.
  • the invention is particularly interested in interference with RNA (interfering RNA or RNAi or siRNA) and its therapeutic applications or for the screening of active substances such as drug candidates.
  • RNA interference is a post-transcriptional gene inactivation technique in which a small double-stranded RNA, hereinafter referred to as RNA interfere or RNAi or siRNA or shRNA, complementary to the targeted messenger RNA, will induce degradation of the latter after being hybridized there.
  • the power of this technique and its specificity are such that one can inactivate in an individual the allele of a gene whose mutation is associated with the development of a pathology.
  • the expression interfering RNAs means double-stranded RNA molecules (siRNA) of approximately 21 nucleotides, obtained by hybridization of two single-stranded RNA molecules generally generated by chemical synthesis.
  • siRNA double-stranded RNA molecules
  • these double-stranded RNA molecules comprise a first strand complementary to a nucleotide sequence of the target gene and a second strand complementary to the first and are capable of inhibiting the expression of said target gene.
  • RNA which is produced directly in the cell via the transcription of a DNA sequence specific for the targeted gene and cloned downstream of a promoter.
  • interfering RNAs in this case bear the name of shRNA (small hairpin RNA) because they adopt a “hairpin” structure taking into account the specific folding of the transcribed RNA.
  • shRNA small hairpin RNA
  • interfering RNAs can be directed against any gene, such as for example without limitation genes controlling cell proliferation (such as p53), or coding for transcription factors, protein kinases (such as LKB1), receivers, etc.
  • the vectors of the invention comprise one or more insulating elements, also referred to below as "insulator”, making it possible to protect the DNA molecules coding for the interfering RNAs against the regulatory sequences of cells and of the chromatinous environment, once integrated into the cellular genome.
  • insulator insulating elements
  • the chromatine structure is a major element in controlling gene transcription.
  • the chromosomes would be formed of a succession of autonomous and independent domains, presenting all the elements necessary for the correct expression of the genes which they contain. This model is supported by the identification of sequences capable of ensuring the correct expression of a transgene associated with them, regardless of their site of integration into the genome.
  • the LCR (Locus Control Region) of the ⁇ -globin locus is one such regulatory sequence.
  • the LCR located 5 'from the ⁇ -globin locus, activates transcription bi-directionally over a distance of approximately 50 Kb.
  • the folate receptor gene (Prioleau et al., 1999). This gene is transcribed in the same cells as those which express the globin genes, namely the erythrocyte line. However, transcription of the folate receptor gene precedes that of the globin genes and ceases when the latter are activated, at a specific stage of differentiation. There is therefore autonomous regulation of two juxtaposed domains transcribed in the cells of the same differentiation process but at distinct stages despite the properties and the position of the LCR of the ⁇ -globin locus.
  • the 5 ′ limit of the ⁇ -globin locus is marked by the presence of a constitutive DNase I hypersensitive site called HS4.
  • a site hypersensitive to DNase I marks so-called “open” chromatin regions, characteristic of regulatory sequences. It has been shown (Chung et al., 1993) by experiments in human K562 erythroid cells that the DNase I HS4 hypersensitive site has the properties of an insulator, that is to say that it blocks the action of an enhancer when it is placed between this enhancer and a promoter.
  • This fragment is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID N0.1 (# U78775 in the PubMed / NCBI database). More recently, it has been shown (Pikaart et al., 1998) that in cultured cells stably expressing a transgene, the presence of the HS4 insulator on either side of this transgene results in a homogeneous level. of expression in the different cell clones tested. At on the contrary, in its absence, expression is variable from one cell clone to another. The presence of one insulator therefore makes it possible to escape the effect of position following insertion into the chromatin as has previously been described in Drosophila.
  • a more particular subject of the invention is therefore a vector comprising at least one interfering RNA expression cassette and at least one element capable of isolating said cassette from the cis-functioning regulation sequences of the chromatin of a cell transfected with said vector.
  • the use of insulator elements and more particularly of the HS4 insulator makes it possible to control the homogeneous and persistent expression over time of interfering RNA molecules.
  • the element capable of isolating said cassette is advantageously the 1.2 kb fragment containing the HS4 insulator or a part of it and in particular the "core" sequence of 242 or 250 bp and their variants comprising the site of fixation of the protein factor CTCF (Bell et al. 1999).
  • This 250 bp sequence resulting from the sequence # U78775, is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO.2.
  • Two variants are represented in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4.
  • variants of the above sequences is meant sequences having a high homology with the above sequences or fragments thereof as for example described in the international patent application published under No. WO 200102553.
  • the HS4 insulator allows: (i) regulatory autonomy (enhancer blocking), and (ii) preventing the position effect and the gene extinction phenomena observed over time, of the molecule encoding RNA to which it is associated once it has been integrated into the native chromatin. These two properties are independent and are not shared by all insulators. For example, the insulators known today in mice (DMD, BEAD-1) and humans (5 ⁇ S5, DM1) only have the property of enhancer blocking, and therefore are of less interest than the HS4 insulator. . The insulators described in invertebrates (Drosophila, yeast), often also have only one of these two properties (enhancer blocking most generally) and therefore also have less interest than the HS4 insulator.
  • the vector comprises on either side of the expression cassette at least one element capable of isolating said cassette from the regulatory sequences to cis functioning of the chromatin of a cell transfected with said vector.
  • the vector comprises, on either side of the expression cassette, two tandem copies of said element.
  • the expression cassette can contain one or more transcription units.
  • Such a transcription unit comprises at least one DNA molecule encoding the interfering RNA placed under the control of a promoter.
  • the promoter is preferably chosen from the group comprising constitutive or inducible promoters, dependent on RNA polymerase III or RNA polymerase II.
  • RNA polymerase III RNA polymerase III
  • promoters dependent on RNA polymerase II such as for example the cytomegalovirus promoter (CMV promoter) (Xia H., et al., 2002 ).
  • CMV promoter cytomegalovirus promoter
  • These different promoters may or may not be regulated by tetracycline or other regulators.
  • the sequences of the CMV promoter and of the TRE-CMV promoter are represented in the sequence list in the appendix respectively under the numbers SEQ ID NO.5 and SEQ ID NO .6.
  • the vector according to the invention also comprises a selection cassette advantageously placed, like the expression cassette, between the elements capable of isolating the expression cassette from the cis-functioning regulation sequences of the chromatin of a cell transfected with said vector.
  • selection cassettes give the cultured cells resistance to an antibiotic.
  • a selection cassette is introduced by plasmid.
  • a selection gene there may be mentioned: - the neomycin resistance gene under the control of the SV40 virus promoter and of the polyadenylation site (pA) of the Thymidine kinase gene; - the hygromycin resistance gene under the control of the promoter of the SV40 virus and of the pA of the SV40 virus; - the blasticidin resistance gene under the control of the promoter of the CMV virus and of the pA of the SV40 virus.
  • the selection box can comprise, in addition to the antibiotic resistance gene, one or more other genes such as, for example, that of GPP (Green Fluorescent Protein).
  • the invention also relates to a purified DNA construct comprising an interfering RNA expression cassette and a selection cassette of the type described above and at least one element for isolating the interfering RNA expression from regulatory sequences to cis operation of chromatin.
  • the expression and selection cassettes are placed between two tandem copies of said element, preferably the HS4 insulator.
  • the organization of such a cassette is shown diagrammatically in FIG. 1 in the appendix.
  • the vectors and constructs of the invention defined above are useful for the preparation of cellular models, intended for example for analyzing the modulation of the expression of one or more target genes, according to methods of gene inactivation.
  • a process for the preparation of such cell models comprises the following steps: - the cells are transfected with the vectors of the invention, - the transfected cells are placed in the presence of the antibiotic, the resistance of which is provided by the selection cassette, the cells are selected to obtain individual cell clones which will be amplified.
  • the cells By way of examples of cells, mention may be made of mammalian cells, essentially human, but also the mouse. They can be primary, immortalized or transformed cells and from different origins (breast, liver, nerve cells, etc.).
  • the vectors of the invention can also be used in a human or animal subject, in particular in the context of therapeutic applications of interfering RNAs.
  • the invention also relates to transgenic animals comprising the genetically modified cells above.
  • a method for analyzing the modulation of the expression of one or more target genes implementing a cell model above comprises the following steps: The establishment of the cell model coding or not for an RNA interfere as described above above. - Analysis for example by the Western Blot technique (WB) of the amount of protein encoded by the gene targeted by RNA interference in cell models.
  • WB Western Blot technique
  • the WB technique can be envisaged if there is an antibody specifically directed against this protein.
  • the level of expression of an endogenous protein the expression of which must not be affected by the interfering effect, must be analyzed in order to normalize the variations of the targeted protein from one experimental point to another. Proteins such as cytoplasmic actin or beta-tubulin can for example be used, knowing that antibodies specific for these proteins are available.
  • the WB analysis requires prior lysis of the cells under conventional conditions which are compatible with maintaining the integrity of the proteins.
  • the gene targeted by RNA interference codes for a protein bringing a new property to the cell
  • the analysis of the interfering effect can be carried out by studying the loss of this property.
  • the targeted gene is the gene coding for the GFP protein
  • Analysis of the interfering effect can also be carried out by studying the variation in the level of RNA transcribed from the targeted gene, using semi-quantitative RT-PCR techniques or in real time.
  • WB analysis it is necessary to simultaneously study the variation of an endogenous gene not targeted by the interfering RNA.
  • Genes such as cytoplasmic actin or GAPD can for example be studied.
  • These techniques require generate oligonucleotides used as a primer in the reverse transcription and PCR steps.
  • the conditions for RNA extraction and the reverse transcription and PCR reactions correspond to the conditions conventionally described in the literature. However, it is necessary to determine the optimal reverse transcription and PCR conditions for each RNA studied.
  • the vectors according to the invention for carrying the molecules encoding the interfering RNAs and allowing their expression can be plasmids or viral vectors. Indeed, the sequences encoding these shRNAs are very generally carried by a plasmid but the development of viral vectors is more and more frequent. Transport of siRNA in cells is possible through the use of commercial transfection agents such as Oligofectamine (Invitrogen).
  • Oligofectamine Invitrogen
  • the disadvantage of these agents, in addition to their very high cost and the transient effect of the interfering action of the transfected molecules, is their frequent cellular toxicity as well, and above all, that their low efficiency on a large number of cell lines and cells. primary.
  • This promoter is most often dependent on RNA polymerase III in order to generate molecules of structure compatible with an interfering effect and the DNA sequence is such that RNA, once transcribed, is capable of folding back on itself. even .
  • These DNA sequences encoding shRNAs can be carried either by a plasmid or by a viral vector. The great advantage of this strategy is that one can obtain a long-term interfering effect because the sequences could possibly integrate into the cell genome. It will be possible to select these cells on the basis, for example, of the simultaneous integration of an antibiotic resistance gene. Plasmids encoding shRNA can be transfected into cells through the use of transfection agent.
  • recombinant viruses each having advantages and disadvantages are available today. It has been proposed to use recombinant adenoviruses, retroviruses and lentiviruses to transport the sequences coding for the interfering RNAs. The research carried out by the Applicant has enabled it to demonstrate the remarkable properties of recombinant vectors derived from the Adeno-Associated virus (AAV) to transport sequences coding for interfering RNAs, in particular in the cells of the nervous system.
  • AAV Adeno-Associated virus
  • the invention relates to recombinant vectors derived from
  • Adeno-Associated virus to transport molecules coding for interfering RNAs and allow their expression in mammalian cells by culture, in animals or humans.
  • AVAs can transduce post mitotic cells, which is the case for many cells in an organism such as nerve cells. This property is not shared by other viruses (adenovirus, retrovirus), with the exception of lentiviruses.
  • AAVs are able to transduce cells of the nervous system, retina and muscle, and apparently also the liver, with great efficiency.
  • serotypes 1 to 6 There are six “variants” of the AAV virus, called serotypes 1 to 6: they present different tropisms for the different cells of the nervous system, thus making it possible to envisage targeting very specifically the different cells of the brain.
  • Lentiviral vectors can also transduce cells in the nervous system.
  • Another major advantage of AAV, an interest shared with lentiviral vectors, is that it integrates into the cell genome leading to long-term expression of the transported transgene, which is not the case for adenoviruses for example. .
  • Several studies of gene transfer in cells of the central nervous system confirm this observation. This long-term expression is also linked to the absence (or almost) of inflammatory responses induced by this virus (not the case of adenovirus).
  • AAV is not the etiological agent of any disease and has a simple genome which is therefore easily manipulated.
  • one of the important characteristics of the wild AAV virus is that it is able to integrate specifically in a region of the chromosome 16 l_.l: Cloning of two tandem copies of the HS4 insulator: Two tandem copies of the HS4 insulator were isolated by EcoRI plus BamHI enzymatic digestion of the plasmid pJC13-1 (Chung et al., 1993, Cell, Vol 74, pages 505-514).
  • plasmid pSG5 (Stratagene), between the EcoRI and BamHI sites for reasons of convenience, the subsequent use of the insulator being now systematically made from this.
  • plasmid (plasmid pSG5-HS4).
  • the two tandem copies of HS4 were cloned 5 'to the antibiotic resistance cassettes.
  • Hygromycin and neomycin cassettes are preferred because prior experimental studies have shown the difficulty of obtaining individual cell clones in the cultured cells selected for the study with the blasticidine selection cassette.
  • the plasmid pSG5-HS4 is digested with EcoRI + BamHI and purified on gel to isolate the two copies of one insulator. Oligonucleotides making it possible to reconstitute restriction sites at the ends of the insulator compatible with its cloning in the various pSuper plasmids are then ligated to the corresponding fragment. After gel purification, the fragment corresponding to the insulator, to which specific oligoculeotides have been ligated at each end, can be cloned into the plasmid pSuper-Neo or pSuper-Hygro digested with the appropriate restriction enzymes and purified on gel. The plasmids thus generated can be analyzed by techniques 17
  • a copy of the core fragment is amplified by PCR from the plasmid pSG5-HS4 (described in Example 1.1), using as PCR primer a 5 'oligonucleotide creating a Bst XI restriction site, and a 3' oligonucleotide creating a restriction site Not I.
  • the amplified fragment after purification, is cloned in these same sites, upstream of the antibiotic resistance cassettes in the plasmid pSuper-Neo or the plasmid pSuper-Hygro described above, then sequence.
  • a second copy of the core fragment is amplified by PCR from the plasmid pSG5-HS4, using the same 5 'oligonucleotide creating a Bst XI restriction site as that used in the previous step and a 3' oligonucleotide creating a restriction site Sac I.
  • the fragment is cloned, after purification, in these same sites upstream of the first copy of the core fragment, in the plasmids generated previously, then sequenced.
  • the two copies of the core thus obtained are purified in the form of a single fragment by enzymatic digestion with the restriction enzymes Sac I and Not I from the plasmids previously generated.
  • the ends of the fragment of approximately 500 base pairs thus obtained are made blunt by the action of the enzyme T4 DNA polymerase.
  • the fragment is then cloned downstream of the cassette for expression of the antibiotic resistance genes and of the shRNA, in the Kpn I site of the plasmids obtained previously, after the restriction site has been made blunt by the action of the T4 DNA polymerase enzyme.
  • the description below relates more particularly to the preparation of an AAV vector according to the invention.
  • the different sequences which it is desired to transport in the recombinant AAV must be cloned between the two terminal repeat sequences of the virus (ITR) which are the only viral elements required for the replication and encapsidation of the viral genome.
  • ITR terminal repeat sequences of the virus
  • the sequences of interest are introduced between the ITRs, themselves contained in a plasmid, by the use of restriction enzyme and 'conventional techniques of molecular biology (ligation, bacterial transformation, etc.).
  • the size limit of the sequences which can be cloned between the two ITRs is approximately 4700 base pairs. Beyond that, the genome can no longer be packaged.
  • a selection cassette coding for a gene for resistance to an antibiotic or a gene such as GFP is included in the recombinant AAV vector.
  • the HS4 insulator is also included. However, beware of the genome size limit which can be 19
  • tandem copies of the 1200 bp fragment of the HS4 insulator represent a size of 4800 bp.
  • either the 1200 bp fragment will be introduced in the form of a single copy on either side of the cloned sequences, or two tandem copies of the 250 bp fragment are used.
  • the sequences encoding the viral proteins necessary for targeted integration into the AAVS1 site are optionally also introduced.
  • the elements regulating this promoter may also be introduced into the vector.
  • the cloned sequences first correspond at least to a sequence coding for a shRNA directed against a gene of interest, placed under the control of a promoter dependent on RNA polymerase III or RNA polymerase II, inducible or no.
  • shRNA is directed against the GFP gene to study the interfering effect in human HeLa cell lines that have stably integrated the GFP gene, or, it is directed against a cellular gene.
  • the plasmid carrying the studied sequences cloned between the two ITRs is transfected into human cells in culture (very generally the line 293 from the kidney), in the presence of the Rep and Cap proteins of the AAV and of so-called “helper” functions. "(AAV is a defective virus), very often brought by an adenovirus.
  • the Rep and Cap proteins and adenoviral functions can be provided by different strategies.
  • the viruses are recovered and purified.
  • the purification methods are variable, but are generally done on a gradient. The viruses will then be tested for their quality and titrated.
  • Example 2 Transfection of Cells with the Plasmid of Example 1.
  • the plasmids thus obtained are individually transfected into human MCF7 cells (mammary gland cells originating from a metastatic site) (transfection using the Lipof ectamine from Invitrogen ) in parallel with the transfection of the corresponding pSuper plasmids lacking the two tandem copies of HS4. 48 hours after transfection, the cells are placed in the presence of the antibiotic (at concentrations previously determined experimentally), the resistance of which is provided by the selection cassette. The cells are selected to obtain individual cell clones which will be amplified. The number of cell clones obtained in the presence or in the absence of the insulator is analyzed.
  • the expression of the interfering effect directed against the endogenous p53 gene is analyzed in the individual cell clones, by comparing the situation in the presence of the insulator with that in its absence. The analysis is done by Western Blot and semi-quantitative RT-PCR. Cell clones are kept in culture for a long time (at least two months), with or without 21

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

La présente invention se rapporte à un vecteur d'expression d'ARN interférent caractérisé en ce qu'il comprend un ou plusieurs éléments isolants protégeant les molécules d'ADN codant pour l'ARN interférent contre les séquences régulatrices des cellules.

Description

VECTEURS D'EXPRESSION D'ARN INTERFERENTS, LEURS PROCÉDÉS DE PRÉPARATION ET LEURS UTILISATIONS.
La présente invention concerne des produits et procédés de modulation de l'expression d 'ARN interférents tant dans des cellules en culture que dans un organisme comme l'animal, l'homme ou les plantes. L'invention s'intéresse tout particulièrement à l'interférence à l'ARN (ARN interférents ou RNAi ou encore siRNA) et ses applications thérapeutiques ou pour le criblage de substances actives comme des candidats médicaments . L'interférence à l'ARN est une technique d' inactivation génique post-transcriptionnelle dans laquelle un petit ARN double brin, désigné ci-après ARN interfèrent ou RNAi ou siRNA ou shRNA, complémentaire de l'ARN messager ciblé, va induire la dégradation de ce dernier après s'y être hybride. La puissance de cette technique et sa spécificité sont telles que l'on peut inactiver chez un individu l'allèle d'un gène dont la mutation est associée au développement d'une pathologie. Toutefois, les développements de la technologie de l'interférence à l'ARN nécessitent de disposer de moyens efficaces d'une part pour contrôler l'expression des molécules d'ARN interférents, et d'autre part pour le transport et la délivrance de ces ARN interférents dans les tissus ou cellules ciblés. La présente invention vise précisément à résoudre les problèmes ci-dessus en offrant de nouveaux vecteurs d'expression des ARN interférents. On entend au sens de l'invention par ARN interférents des molécules d'ARN double brin (siRNA) d'environ 21 nucléotides, obtenues par hybridation de deux molécules d'ARN simple brin généralement générées par synthèse chimique. Ainsi ces molécules d'ARN double brin comprennent un premier brin complémentaire d'une séquence nucléotidique du gène cible et un second brin complémentaire du premier et sont capables d'inhiber l'expression dudit gène cible. Il s'agit aussi d'ARN qui sont produits directement dans la cellule via la transcription d'une séquence d'ADN spécifique du gène ciblé et clonée en aval d'un promoteur. Ces ARN interférents portent dans ce cas le nom de shRNA (small hairpin RNA) car ils adoptent une structure en « épingle à cheveux » compte tenu du repliement spécifique de l'ARN transcrit. Il a également été proposé (Shinaga a et Ishii ; Gènes and Development, 2003, Vol : 17, Pages 1340-1345) d'exprimer un long ARN double brin présentant des propriétés interférentes suite à la restriction de sa localisation initiale dans le noyau de la cellule, et ce, grâce au plasmide utilisé. Ce grand ARN double brin peut être clivé en siRNA dans le noyau. Ces siRNA migrent alors dans le cytoplasme où ils induisent la dégradation de l'ARN ciblé.
Ces ARN interférents peuvent être dirigés contre n'importe quel gène, comme par exemple de façon non limitative des gènes contrôlant la prolifération cellulaire (tel que p53), ou codant pour des facteurs de transcription, des protéines kinases (telle que LKB1) , des récepteurs, etc.
Selon un premier aspect, les vecteurs de l'invention comprennent un ou plusieurs éléments isolants, aussi désignés ci-après « insulateur », permettant de protéger les molécules d'ADN codant pour les ARN interférents contre les séquences régulatrices des cellules et de l'environnement chromâtinien, une fois intégrées dans le génome cellulaire. En effet, la structure chromâtinienne est un élément majeur de contrôle de la transcription des gènes. Les chromosomes seraient formés d'une succession de domaines autonomes et indépendants, présentant tous les éléments nécessaires à l'expression correcte des gènes qu'ils contiennent. Ce modèle est conforté par l'identification de séquences capables d'assurer l'expression correcte d'un transgène qui leur est associé et ce, indépendamment de leur site d'intégration dans le génome. La LCR (Locus Control Région) du locus de β-globine est une telle séquence régulatrice. Chez l'homme, la souris et le poulet, la LCR, située en 5' du locus de β-globine, active de façon bidirectionnelle la transcription sur une distance d'environ 50 Kb. Chez le poulet, immédiatement en aval de ce locus, se trouve le gène du récepteur au folate (Prioleau et al., 1999) . Ce gène est transcrit dans les mêmes cellules que celles qui expriment les gènes de globines à savoir la lignée érythrocytaire . Toutefois, la transcription du gène du récepteur au folate précède celle des gènes de globines et cesse lorsque ces derniers sont activés, à un stade de différenciation précis. Il y a donc autonomie de régulation de deux domaines juxtaposés transcrits dans les cellules d'un même processus de différenciation mais à des stades distincts malgré les propriétés et la position de la LCR du locus de β-globine. Chez le poulet, la limite 5' du locus de β- globine, locus qui s'étend sur 33 kb, est marquée par la présence d'un site hypersensible à la DNase I constitutif appelé HS4. Un site hypersensible à la DNase I marque des régions de chromatine dites « ouvertes », caractéristiques de séquences régulatrices. Il a été montré (Chung et al., 1993) par des expériences dans les cellules érythroides humaines K562 que le site hypersensible à la DNase I HS4 possède les propriétés d'un insulateur, c'est-à-dire qu'il bloque l'action d'un amplificateur (enhancer) quand il se trouve placé entre cet enhancer et un promoteur. Il a également été observé par l'analyse de drosophiles transgéniques que l' insulateur HS4 prévient l'effet de position lié au site d' intégration dans la chromatine du transgène. Ainsi, l'expression du minigène whi te dans l'œil de drosophile est uniforme lorsqu'il est encadré par l' insulateur alors que son expression est hétérogène en l'absence de cette séquence. Il a ainsi été proposé dans la demande de brevet US No. 5,610,053 d'utiliser le fragment de 1,2 kb contenant le site hypersensible à la Dnase I HS4 pour isoler un gène des séquences de régulation à fonctionnement cis de la chromatine dans laquelle ce gène a été inséré. Ce fragment est généré par double digestion avec les enzymes de restriction Sacl et Sspl d'ADN génomique de poulet. Ce fragment est représenté dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID N0.1 (# U78775 dans la base PubMed/NCBI) . Plus récemment, il a été montré (Pikaart et al., 1998) que dans des cellules en culture exprimant de façon stable un transgène, la présence de l' insulateur HS4 de part et d'autre de ce transgène entraîne une homogénéité de son niveau d'expression dans les différents clones cellulaires testés. Au contraire, en son absence, l'expression est variable d'un clone cellulaire à un autre. La présence de 1' insulateur permet donc d'échapper à l'effet de position consécutive à l'insertion dans la chromatine comme cela a précédemment été décrit dans la drosophile. En outre, il a été rapporté de l'étude sur des cellules en culture, qu'en présence de 1' insulateur, l'extinction de l'expression du transgène au cours du temps ne se produit pas, alors que c'est un phénomène fréquemment observé dans les expériences de transfert de gènes, tant dans les cellules que chez l'animal (Pikaart et al., 1998). L'invention a donc plus particulièrement pour objet un vecteur comprenant au moins une cassette d'expression d'ARN interfèrent et au moins un élément capable d' isoler ladite cassette des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur. La mise en œuvre d'éléments insulateurs et tout particulièrement de l' insulateur HS4 permet de contrôler l'expression homogène et persistante dans le temps de molécules d'ARN interférents. L'élément capable d'isoler ladite cassette est avantageusement le fragment de 1,2 kb contenant 1' insulateur HS4 ou une partie de celui-ci et notamment la séquence « core » de 242 ou de 250 pb et leurs variants comprenant le site de fixation du facteur protéique CTCF (Bell et al. 1999) . Cette séquence de 250 pb, issue de la séquence #U78775, est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.2. Deux variants sont représentés dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4. On entend par variants des séquences ci- dessus, des séquences présentant une forte homologie avec les séquences ci -dessus ou des fragments de celles-ci comme par exemple décrits dans la demande de brevet internationale publiée sous le No. WO 200102553. On peut citer plus particulièrement comme variants de la séquence core les séquences SEQ ID NO .3 (US No. 5,610,053) et SEQ ID NO .4 (Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 1997, Vol 94, p575-580).
L' insulateur HS4 permet : (i) une autonomie de régulation (enhancer blocking) , et (ii) d'empêcher l'effet de position et les phénomènes d'extinction génique observés au cours du temps, de la molécule codant l'ARN à laquelle il est associé une fois celle-ci intégrée dans la chromatine native. Ces deux propriétés sont indépendantes et ne sont pas partagées par tous les insulateurs. Par exemple, les insulateurs aujourd'hui connus chez la souris (DMD, BEAD-1) et l'homme (5ΗS5, DM1) ne possèdent que la propriété d' enhancer blocking, et présentent donc moins d'intérêt que l' insulateur HS4. Les insulateurs décrits chez les invertébrés (drosophile, levure), n'ont souvent également qu'une seule de ces deux propriétés (enhancer blocking le plus généralement) et présentent donc également moins d'intérêt que l' insulateur HS4. Selon un mode de réalisation préféré, le vecteur comprend de part et d'autre de la cassette d'expression au moins un élément capable d'isoler ladite cassette des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectëe par ledit vecteur. Tout particulièrement, le vecteur comprend de part et d' autre de la cassette d'expression deux copies en tandem dudit élément. La cassette d'expression peut contenir une ou plusieurs unités de transcription. Une telle unité de transcription comprend au moins une molécule d'ADN codant l'ARN interfèrent placé sous le contrôle d'un promoteur. Le promoteur est de préférence choisi dans le groupe comprenant les promoteurs constitutifs ou inductibles, dépendants de l'ARN polymérase III ou de l'ARN polymérase II. On peut citer par exemple les promoteurs Hl et U6 dépendants de l'ARN polymérase III ainsi que les promoteurs dépendant de l'ARN polymérase II, comme par exemple le promoteur du cytomégalovirus (promoteur CMV) (Xia H., et al., 2002).
Ces différents promoteurs peuvent être régulés ou non par la tétracycline ou d'autres régulateurs. Les séquences du promoteur CMV et du promoteur TRE-CMV (régulé par la tétracycline) sont représentées dans la liste de séquence en annexe respectivement sous les numéro SEQ ID NO.5 et SEQ ID NO .6.
Le vecteur selon l'invention comprend également une cassette de sélection avantageusement placée, comme la cassette d'expression, entre les éléments capables d'isoler la cassette d'expression des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur. Ces cassettes de sélection confèrent aux cellules en culture une résistance à un antibiotique. Avantageusement, une cassette de sélection est introduite par plasmide. A titre d'exemple de gène de sélection on peut citer : - le gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur du virus SV40 et du site de polyadênylation (pA) du gène Thymidine kinase ; - le gène de résistance à l' hygromycine sous le contrôle du promoteur du virus SV40 et du pA du virus SV40 ; - le gène de résistance à la blasticidine sous le contrôle du promoteur du virus CMV et du pA du virus SV40. La casette de sélection peut comprendre outre le gène de résistance à un antibiotique, un ou plusieurs autres gènes comme par exemple celui de la GPP (Green Fluorescent Protein) . Ainsi l'invention concerne également une construction d'ADN purifiée comprenant une cassette d'expression d'ARN interfèrent et une cassette de sélection du type décrit précédemment et au moins un élément pour isoler l'expression d'ARN interfèrent des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine. Avantageusement dans cette construction d'ADN, les cassettes d'expression et de sélection sont placées entre deux copies en tandem dudit élément, de préférence l' insulateur HS4. L'organisation d'une telle cassette est schématisée sur la figure 1 en annexe. Les vecteurs et les constructions de l'invention définis précédemment sont utiles pour la préparation de modèles cellulaires, destinées par exemple à analyser la modulation de l'expression d'un ou plusieurs gènes cibles, selon des méthodes d' inactivation génique. Un procédé de préparation de tels modèles cellulaires comprend les étapes suivantes : - les cellules sont transfectées avec les vecteurs de l'invention, - les cellules transfectées sont placées en présence de l'antibiotique dont la résistance est apportée par la cassette de sélection, les cellules sont sélectionnées pour obtenir des clones cellulaires individuels qui seront amplifiés. A titre d'exemples de cellules, on peut citer les cellules de mammifères, homme essentiellement mais aussi la souris. Il peut s'agir de cellules primaires, immortalisées ou transformées et de différentes origines (sein, foie, cellules nerveuses etc..) . Les vecteurs de l'invention peuvent être aussi utilisés chez un sujet humain ou animal, notamment dans le cadre d'applications thérapeutiques des ARN interférents. Ainsi, l'invention concerne aussi des animaux transgéniques comprenant les cellules génétiquement modifiées ci-dessus.
Une méthode d'analyse de la modulation de l'expression d'un ou plusieurs gènes cibles mettant en œuvre un modèle cellulaire ci-dessus comprend les étapes suivantes : L'établissement du modèle cellulaire codant ou non pour un ARN interfèrent comme décrit ci- dessus. - L'analyse par exemple par la technique de Western Blot (WB) de la quantité de protéine codée par le gène ciblé par ARN interférence dans les modèles cellulaires . La technique de WB est envisageable s'il existe un anticorps spécifiquement dirigé contre cette protéine. En parallèle, le taux d'expression d'une protéine endogène dont l'expression ne doit pas être affectée par l'effet interfèrent, doit être analysé afin de normaliser les variations de la protéine ciblée d'un point expérimental à un autre. Des protéines telles que l'actine cytoplasmique ou la beta-tubuline peuvent par exemple être utilisées, sachant que des anticorps spécifiques de ces protéines sont disponibles. L'analyse par WB nécessite au préalable une lyse des cellules dans des conditions classiques qui sont compatibles avec le maintien de l'intégrité des protéines. Dans le cas où le gène ciblé par ARN interférence code pour une protéine apportant une nouvelle propriété à la cellule, l'analyse de l'effet interfèrent peut être réalisée en étudiant la perte de cette propriété. Par exemple, si le gène ciblé est le gène codant pour la protéine GFP, il est possible d'étudier et de quantifier le taux d'expression de cette protéine par une analyse de la fluorescence, par exemple au FACS , et donc d'analyser l'effet interfèrent .
L'analyse de l'effet interfèrent peut également être réalisée par l'étude de la variation du taux d'ARN transcrit à partir du gène ciblé et ce, grâce aux techniques de RT-PCR semi quantitative ou en temps réel. Comme dans le cas de l'analyse par WB, il est nécessaire d'étudier simultanément la variation d'un gène endogène non ciblé par l'ARN interfèrent. Des gènes tels que l'actine cytoplasmique ou GAPD peuvent par exemple être étudiés. Ces techniques nécessitent de générer des oligonucléotides utilisés comme amorce dans les étapes de reverse transcription et de PCR. Les conditions d'extractions d'ARN et les réactions de reverse transcription et de PCR correspondent aux conditions classiquement décrites dans la littérature. Il est néanmoins nécessaire de déterminer les conditions optimales de reverse transcription et de PCR pour chaque ARN étudié . L'étude des résultats obtenus après normalisation par analyse du taux de protéine et/ou d'ARN issus du gène ciblé et ce, en comparant la situation en présence de la molécule interférente de celle en l'absence, permet de déduire l'effet de l'ARN interfèrent dirigé contre le ou les gènes ciblés dans les modèles cellulaires générés.
Les vecteurs selon l'invention pour véhiculer les molécules codant les ARN interférents et permettre leur expression peuvent être des plasmides ou des vecteurs viraux. En effet, les séquences codant ces shRNA sont très généralement véhiculées par un plasmide mais le développement de vecteurs viraux est de plus en plus fréquent . Le transport des siRNA dans les cellules est possible grâce à l'utilisation d'agents de transfection commerciaux comme 1 ' Oligofectamine (Invitrogen) . L'inconvénient de ces agents, outre leur coût très élevé et l'effet transitoire de l'action interférente des molécules transfectées, est leur toxicité cellulaire fréquente ainsi, et surtout, que leur faible efficacité sur un grand nombre de lignées cellulaires et de cellules primaires. Une étude réalisée chez la souris a montré qu'il est possible d'injecter des siRNA directement dans la circulation sanguine de l'animal via une méthode appelée « méthode hydrodynamique », et ce, pour cibler directement le foie (Me Caffrey et al . , 2002, Nature, Vol 418, page 38) . Le ciblage des autres tissus par l'injection directe de siRNA n'a pas été décrit mais les inconvénients d'une telle approche, notamment l'effet transitoire pour une approche lourde et invasive, sont tels qu'il ne devrait pas être envisagé. Les molécules de type shRNA sont elles produites directement dans la cellule par transcription d'une séquence d'ADN spécifique du gène ciblé clonée en aval d'un promoteur. Ce promoteur est le plus souvent dépendant de l'ARN polymérase III afin de générer des molécules de structure compatible avec un effet interfèrent et la séquence d'ADN est telle que l'ARN, une fois transcrit, est capable de se replier sur lui- même . Ces séquences d'ADN codant des shRNA peuvent être véhiculées soit par un plasmide soit par un vecteur viral . Le grand intérêt de cette stratégie est que l'on peut obtenir un effet interfèrent à long terme car les séquences pourront éventuellement s'intégrer dans le génome cellulaire. Il sera possible de sélectionner ces cellules sur la base, par exemple, de l'intégration simultanée d'un gène de résistance à un antibiotique. Les plasmides codant les shRNA peuvent être transfectés dans les cellules grâce à l'utilisation d'agent de transfection. Mais tout comme dans le cas de la transfection des siRNA, certaines cellules s'avèrent réfractaires à la transfection, ou bien le sont avec une efficacité réduite, voir nulle. De plus, dans des perspectives d'application thérapeutique du RNAi, le ciblage efficace d'un tissu précis est une priorité majeure . Dans ces conditions, l'utilisation de vecteurs viraux pour véhiculer les séquences codant les shRNA présente un intérêt. En effet, certains d'entre eux peuvent transduire des cellules difficilement transfectables, telles que des cellules primaires. Ils peuvent également être utilisés chez l'animal pour cibler spécifiquement un tissu. Mais les vecteurs viraux ont également des inconvénients qui sont propres à chaque type de virus. Certains ont un effet transitoire (cas des adénovirus) , d'autres ne vont transduire que des cellules qui se divisent (les rétrovirus) etc. Plusieurs types de virus recombinants présentant chacun des avantages et des inconvénients sont aujourd'hui disponibles. Il a été proposé d'utiliser des adénovirus, des rétrovirus et des lentivirus recombinants pour véhiculer les séquences codant pour les ARN interférents. Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse lui ont permis de mettre en évidence les propriétés remarquables de vecteurs recombinants dérivés de l' Adeno-Associated virus (AAV) pour véhiculer des séquences codant pour les ARN interférents, notamment dans les cellules du système nerveux.
Ainsi, selon un autre aspect, l'invention se rapporte à des vecteurs recombinants dérivés de
1' Adeno-Associated virus (AAV) pour véhiculer les molécules codant pour les ARN interférents et permettre leur expression dans les cellules de mammifères en culture, chez l'animal ou l'homme. Bien entendu l'invention concerne l'utilisation combinée de ces vecteurs avec les insulateurs définis précédemment. Les AAV peuvent transduire des cellules post mitotiques, ce qui est le cas de beaucoup de cellules d'un organisme telles que les cellules nerveuses. Cette propriété n'est pas partagée par les autres virus (adénovirus, rétrovirus), à l'exception des lentivirus. Les AAV sont capables de transduire avec une grande efficacité les cellules du système nerveux, de la rétine et du muscle, et semble-t-il, également le foie. Il existe six « variants » du virus AAV, appelées sérotypes 1 à 6 : ils présentent des tropismes différents pour les différentes cellules du système nerveux, permettant ainsi d'envisager cibler très spécifiquement les différentes cellules du cerveau. Les vecteurs lentiviraux peuvent également transduire les cellules du système nerveux. Un autre intérêt majeur de l'AAV, intérêt partagé avec les vecteurs lentiviraux, est qu'il s'intègre dans le génome cellulaire conduisant à une expression à long terme du transgène véhiculé, ce qui n'est pas le cas des adénovirus par exemple. Plusieurs études de transfert de gènes dans les cellules du système nerveux central confirment cette observation. Cette expression à long terme est également liée à l'absence (ou presque) de réponses inflammatoires induites par ce virus (pas le cas de l' adénovirus) . Contrairement aux lentivirus, l'AAV n'est l'agent étiologique d'aucune maladie et présente un génome simple donc facilement manipulable. Enfin, une des caractéristiques importantes du virus AAV sauvage est qu'il est capable de s'intégrer spécifiquement dans une région du chromosome 16 l_.l : Clonage de deux copies en tandem de 1' insulateur HS4 : Deux copies en tandem de l' insulateur HS4 ont été isolées par digestion enzymatique EcoRI plus BamHI du plasmide pJC13-l (Chung et al., 1993, Cell, Vol 74, pages 505-514) . Les deux copies en tandem issues du plasmide pJC13.1 ont été clonées dans le plasmide pSG5 (Stratagène) , entre les sites EcoRI et BamHI pour des raisons de commodités, l'utilisation ultérieure de l' insulateur se faisant maintenant systématiquement à partir de ce plasmide (plasmide pSG5-HS4) . Les deux copies en tandem d'HS4 ont été clonées en 5' des cassettes de résistance aux antibiotiques. Les cassettes hygromycine et néomycine sont privilégiées car des études expérimentales préalables ont montré la difficulté d'obtenir des clones cellulaires individuels dans les cellules en culture retenues pour l'étude avec la cassette de sélection blasticidine . Pour réaliser le clonage, le plasmide pSG5-HS4 est digéré par EcoRI+BamHI et purifié sur gel pour isoler les deux copies de 1 ' insulateur. Des oligonucléotides permettant de reconstituer des sites de restriction aux extrémités de l' insulateur compatibles avec son clonage dans les différents plasmides pSuper sont alors ligués au fragment correspondant. Après purification sur gel, le fragment correspondant à 1 ' insulateur , auquel des oligoculéotides spécifiques ont été ligués à chaque extrémité, peut être clone dans le plasmide pSuper-Neo ou pSuper-Hygro digéré par les enzymes de restriction adéquates et purifié sur gel. Les plasmides ainsi générés peuvent être analysés par les techniques 17
classiques de biologie moléculaire (transformation bactérienne, miniprep d'ADN plasmidique etc..) . Une fois réalisée l'introduction de deux copies en tandem de l' insulateur en 5' des cassettes de sélection aux antibiotiques, deux copies sont alors introduites en 3 ' de la cassette codant le shRNA (figure 1) . JL.2 : Clonage de deux copies en tandem du fragment core de 1 ' insulateur HS4 :
Une copie du fragment core est amplifiée par PCR à partir du plasmide pSG5-HS4 (décrit dans l'exemple 1.1), en utilisant comme primer de PCR un oligonucléotide 5' créant un site de restriction Bst XI, et un oligonucléotide 3' créant un site de restriction Not I. Le fragment amplifié, après purification, est clone dans ces mêmes sites, en amont des cassettes de résistances aux antibiotiques dans le plasmide pSuper-Néo ou le plasmide pSuper-Hygro décrit ci-dessus, puis séquence. Une seconde copie du fragment core est amplifiée par PCR à partir du plasmide pSG5-HS4, en utilisant le même oligonucléotide 5' créant un site de restriction Bst XI que celui utilisé dans l'étape précédente et un oligonucléotide 3' créant un site de restriction Sac I. Le fragment est clone, après purification, dans ces mêmes sites en amont de la première copie du fragment core, dans les plasmides générés précédemment, puis séquence. Les deux copies du core ainsi obtenues sont purifiées sous la forme d'un seul fragment par digestion enzymatique par les enzymes de restriction Sac I et Not I à partir des plasmides précédemment générés . 18
Après purification, les extrémités du fragment d'environ 500 paires de base ainsi obtenu sont rendues franches par action de l'enzyme T4 DNA polymérase . Le fragment est alors clone en aval de la cassette d'expression des gènes de résistance aux antibiotiques et du shRNA, dans le site Kpn I des plasmides obtenus précédemment, après que le site de restriction ait été rendu franc par l'action de l'enzyme T4 DNA polymérase.
La description ci-dessous se rapporte plus particulièrement à la préparation d'un vecteur AAV selon l'invention. Les différentes séquences que l'on souhaite véhiculer dans l'AAV recombinant doivent être clonées entre les deux séquences répétées terminales du virus (ITR) qui sont les seuls éléments viraux requis pour la réplication et 1 ' encapsidation du génome viral. Les séquences d'intérêt sont introduites entre les ITR, elles-mêmes contenues dans un plasmide, par l'utilisation d'enzyme de restriction et 'des techniques classiques de biologie moléculaire (ligation, transformation bactérienne, etc.) . La taille limite des séquences qui peuvent être clonées entre les deux ITR est d'environ 4700 paires de base. Au delà, le génome ne pourra plus être encapsidé. Outre la cassette codant pour le shRNA, on inclut dans le vecteur AAV recombinant, une cassette de sélection codant pour un gène de résistance à un antibiotique ou un gène tel que GFP . On inclut également l' insulateur HS4. Il faut toutefois prendre garde à la taille limite du génome qui peut être 19
encapsidé. En effet, deux copies en tandem du fragment de 1200 pb de l' insulateur HS4 représentent une taille de 4800 pb. Aussi, soit le fragment de 1200 pb sera introduit sous la forme d'une seule copie de part et d'autre des séquences clonées, soit deux copies en tandem du fragment de 250 pb sont utilisées. Les séquences codant pour les protéines virales nécessaires à l'intégration ciblée dans le site AAVS1 sont éventuellement également introduites. Dans le cas où la séquence codant le shRNA se trouve sous le contrôle d'un promoteur inductible, les éléments régulant ce promoteur pourront également être introduits dans le vecteur. Les séquences clonées correspondent dans un premier temps au moins à une séquence codant pour un shRNA dirigé contre un gène d'intérêt, placé sous le contrôle d'un promoteur dépendant de l'ARN polymérase III ou de l'ARN polymérase II, inductible ou non. Dans les études préliminaires, le shRNA est dirigé contre le gène GFP pour étudier l'effet interfèrent dans des lignées cellulaires humaines HeLa ayant intégrées de façon stable le gène GFP, ou bien, il est dirigé contre un gène cellulaire. Une fois les séquences d'intérêt clonées, les virus AAV recombinant vont être produits. Pour cela, le plasmide véhiculant les séquences étudiées clonées entre les deux ITR est transfecté dans des cellules humaines en culture (très généralement la lignée 293 issue de rein) , en présence des protéines Rep et Cap de l'AAV et de fonctions dite « helper » (l'AAV est un virus défectif) , très souvent apportées par un adénovirus. Les protéines Rep et Cap et les fonctions adénovirales peuvent être apportées par différentes stratégies. Lorsque la production d'AAV 20
recombinant est achevée (environ 72 à 80 heures après le début de la transfection) , les virus sont récupérés et purifiés. Les méthodes de purification sont variables, mais se font très généralement sur un gradient. Les virus seront ensuite testés pour leur qualité et titrés.
Exemple 2 : Transfection de cellules avec le plasmide de l'exemple 1. Les plasmides ainsi obtenus sont transfectés individuellement dans des cellules humaines MCF7 (cellules de glandes mammaires issues d'un site mêtastatique) (transfection par utilisation de la Lipof ectamine d' Invitrogen) parallèlement à la transfection des plasmides pSuper correspondant dépourvus des deux copies en tandem d'HS4. 48 heures après transfection, les cellules sont placées en présence de l'antibiotique (aux concentrations préalablement déterminées expérimentalement) dont la résistance est apportée par la cassette de sélection. Les cellules sont sélectionnées pour obtenir des clones cellulaires individuels qui seront amplifiés. Le nombre de clones cellulaires obtenus en présence ou en l'absence de l' insulateur est analysé. De même, l'expression de l'effet interfèrent dirigé contre le gène endogène p53 est analysé dans les clones cellulaires individuels, en comparant la situation en présence de l' insulateur de celle en son absence. L'analyse est faite par Western Blot et RT-PCR semi quantitative. Les clones cellulaires sont maintenus en culture pendant une longue période (au moins deux mois) , avec ou sans 21
antibiotiques, après quoi l'effet interfèrent est réévalué . Dans le cas des AAV recombinants, une fois ceux-ci produits, ils sont utilisés dans un premier temps dans des cellules humaines en culture pour tester l'effet interfèrent qu'ils véhiculent. Les cellules sont infectées à différentes MOI (Multiplicity of Infection = nombre de virus par cellules) . Les gammes de MOI optimales ont été préalablement déterminées grâce à la transduction de ces mêmes cellules en culture par un AAV recombinant véhiculant le gène codant pour la GFP. L'analyse de l'effet interfèrent sur le gène ciblé est analysé à différent temps post- transduction, par différentes approches (Western Blot, RT-PCR semi quantitative, immunofluorescence etc..) .
22
Références Bibliographiques
Bell, A.C., West, A. G. and Felsenfeld, G. (1999) . The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators . Cell . 98: 387-396. Chung J. H., Whiteley, M. and Felsenfeld, G. (1993). A 5' élément of the chiken β-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in drosophila. Cell . 74: 505-514. Pikaart, M.J., Recillas-Targa F. and
Felsenfeld, G. (1998) . Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methylation and histone deacetylation and is prevented by insulators.
Gènes and Dev. 12: 2852-2862. Prioleau, M.-N., Nony, P., Simpson, M. and
Felsenfeld, G. (1999) . An insulator élément and condensed chromatin région separate the chicken β- globin locus from an independently regulated erythroid spécifie folate receptor gène. EMBO J. 18 : 4035-4048. Xia H., Mao, Q. , Paulson, H.L. and Davidson B.L. siRNA-mediated gène silencing in vitro and in vivo (2002). Science. Vol 20, pages 1006-1010.

Claims

23
REVENDICATIONS
1) Vecteur d'expression d'ARN interfèrent caractérisé en ce qu' il comprend un ou plusieurs éléments isolants protégeant les molécules d'ADN codant pour l'ARN interfèrent contre les séquences régulatrices des cellules.
2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression d'ARN interfèrent et au moins un élément capable d' isoler ladite cassette des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur.
3) Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'élément capable d'isoler ladite cassette est le fragment de 1,2 kb contenant 1' insulateur HS4 ou une partie de celui-ci.
4) Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'élément capable d'isoler ladite cassette est la séquence de 242 ou 250 pb ou leurs variants comprenant le site de fixation du facteur protéique CTCF capable de fixer le facteur protéique CTCF dudit fragment de 1,2 kb.
5) Vecteur selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend de part et d'autre de la cassette d'expression au moins un élément capable d' isoler ladite cassette des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur. 24
6) Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend de part et d'autre de la cassette d'expression deux copies en tandem dudit élément .
7) Vecteur selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la casette d'expression contient une ou plusieurs unités de transcription comprenant au moins une molécule d'ADN codant l'ARN interfèrent placé sous le contrôle d'un promoteur .
8) Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que le promoteur est choisi dans le groupe comprenant les promoteurs constitutifs ou inductibles, dépendants de l'ARN polymérase III ou de l'ARN polymérase II. 9) Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette de sélection.
10) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que la cassette de sélection est placée, comme la cassette d'expression, entre les éléments capables d'isoler la cassette d'expression des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur.
11) Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est dérivé d'un plasmide ou d'un vecteur viral. 25
12) Vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il dérive d'un AAV.
13) Une construction d'ADN purifiée comprenant une cassette d'expression d'ARN interfèrent, une cassette de sélection et au moins un élément pour isoler l'expression d'ARN interfèrent des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine, comme décrit dans l'une quelconque des revendications 2 à 10.
14) Procédé de préparation d'un modèle cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la transfection de cellules avec les vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, - les cellules transfectées sont placées en présence de l'antibiotique dont la résistance est apportée par la cassette de sélection, les cellules sont sélectionnées pour obtenir des clones cellulaires individuels qui seront amplifiés .
PCT/FR2004/002267 2003-09-08 2004-09-07 Vecteurs d’expression d’arn interferents, leurs procedes de preparation et leurs utilisations. WO2005026369A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0310565A FR2859482B1 (fr) 2003-09-08 2003-09-08 Vecteurs d'expression d'arn interferents, leurs procedes de preparation et leurs utilisations
FR0310565 2003-09-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2005026369A2 true WO2005026369A2 (fr) 2005-03-24
WO2005026369A3 WO2005026369A3 (fr) 2005-06-09

Family

ID=34178841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2004/002267 WO2005026369A2 (fr) 2003-09-08 2004-09-07 Vecteurs d’expression d’arn interferents, leurs procedes de preparation et leurs utilisations.

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2859482B1 (fr)
WO (1) WO2005026369A2 (fr)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5610053A (en) * 1993-04-07 1997-03-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AN D.S. ET AL.: "Efficient lentiviral vectors for short hairpin RNA delivery into human cells." HUMAN GENE THERAPY, vol. 14, 10 août 2003 (2003-08-10), pages 1207-1212, XP002277891 *
RECILLAS-TARGA F ET AL: "Position-effect protection and enhancer blocking by the chicken beta-globin insulator are separable activities" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 99, no. 10, 14 mai 2002 (2002-05-14), pages 6883-6888, XP002274806 ISSN: 0027-8424 *
YANNAKI E., TUBB J., AKER M., STAMATOYANNOPOULOS G. & EMERY D.W.: "Topological constraints governing the use of chicken HS4 chromatin insulator in oncoretrogenic vecors." MOLECULAR THERAPY, vol. 5, no. 5, mai 2002 (2002-05), pages 589-598, XP002316215 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005026369A3 (fr) 2005-06-09
FR2859482B1 (fr) 2005-11-11
FR2859482A1 (fr) 2005-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115335526B (zh) 核酶介导的rna组装和表达
Avale et al. Trans-splicing correction of tau isoform imbalance in a mouse model of tau mis-splicing
KR101605144B1 (ko) Ｃｎｓ 질환의 치료
CN113544267A (zh) 使用CRISPR-Cas进行靶向核RNA裂解和聚腺苷酸化
FR2707091A1 (fr) Vecteur rétroviral pour le transfert et l'expression de gènes dans des cellules eucaryotes.
FR2838442A1 (fr) Sirnas inhibiteurs de l'expression de genes responsables de l'inactivation de la p53 et leur utilisation dans le traitement des cancers
EP2771470B1 (fr) Unites de transcription et leur utilisation dans des vecteurs d'expression
WO2023051734A1 (fr) Système crispr-cas13f modifié et ses utilisations
JP2023532864A (ja) 導入遺伝子発現系
Wang et al. Duchenne muscular dystrophy treatment with lentiviral vector containing mini‐dystrophin gene in vivo
WO2016128679A1 (fr) Procédé de fabrication de vecteurs d'adn à partir de briques moléculaires contenant des séquences d'intérêt
WO2005005632A2 (fr) PETITS ARN INTERFERENTS SPECIFIQUES DES SOUS-UNITES α, α' ET β DE LA PROTEINE KINASE CK2 ET LEURS APPLICATIONS
WO2005026369A2 (fr) Vecteurs d’expression d’arn interferents, leurs procedes de preparation et leurs utilisations.
Watanabe et al. Functional analysis of the sea urchin‐derived arylsulfatase (Ars)‐element in mammalian cells
EP2812435B1 (fr) Unités de transcription et leur utilisation dans des vecteurs d'expression
FR2919616A1 (fr) Polynucleotides insulateurs derives de l'element d4z4 et leurs utilisations en transgenese
WO2024196855A2 (fr) Assemblage et expression d'arn à médiation par ribozyme
Gary et al. Investigation of RNA interference to suppress expression of full-length and fragment human huntingtin
Chen et al. Adeno-associated virus-mediated ILK gene silencing in the rat NAc core
EP0946724A2 (fr) Polypeptides de la famille "basic helix-loop-helix" bhlh, sequences d'acides nucleiques correspondantes
Langlois RNA-based gene therapies for myotonic dystrophy type 1
FR2852021A1 (fr) Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo
JP2025525067A (ja) 機能性核酸分子及び方法
FR2847588A1 (fr) METHODES D'EXPRESSION INDUCTIBLE D'ARNi DANS LES CELLULES, LES MOLECULES D'ACIDE NUCLEIQUE POUR SA MISE EN OEUVRE ET LES CELLULES TRANSFORMEES PAR CES MOLECULES
WO2025080780A1 (fr) Administration et expression de systèmes crispr d'édition primaire

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG MD RU TJ TM AT BE BG CH CY DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase