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WO2005120485A1 - グレリンの生理学的機能のレギュレーター及びその利用 - Google Patents

グレリンの生理学的機能のレギュレーター及びその利用 Download PDF

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WO2005120485A1
WO2005120485A1 PCT/JP2005/007465 JP2005007465W WO2005120485A1 WO 2005120485 A1 WO2005120485 A1 WO 2005120485A1 JP 2005007465 W JP2005007465 W JP 2005007465W WO 2005120485 A1 WO2005120485 A1 WO 2005120485A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
darelin
ghrelin
acid
regulator
glyceryl
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/007465
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masayasu Kojima
Yoshihiro Nishi
Kenji Kangawa
Keiichi Abe
Reiko Izumi
Junichi Nakamura
Original Assignee
Kurume University
Suntory Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2006514420A priority patent/JP5144929B2/ja
Priority to EP05734737A priority patent/EP1767198A4/en
Priority to AU2005251576A priority patent/AU2005251576B2/en
Priority to KR1020067025994A priority patent/KR101246497B1/ko
Priority to CA2569678A priority patent/CA2569678C/en
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Definitions

  • the present invention relates to regulators of the physiological function of darelin and their use in the field of medicine or food.
  • the present invention relates to a modified darellin formation promoter and a food containing them.
  • Darrelin is an endogenous ligand (peptide) of a receptor (GHS-R) that binds to growth hormone secretagogue (GHS), a synthetic non-natural substance that promotes growth hormone secretion. Hormone), which is the first substance discovered by Kojima and Samukawa et al. In the group of the present inventors. [References listed in the following reference list (hereinafter referred to as “references”) 1 and WO01 / 007475]. Initially, darelin was also purified from rat stomach, but it was also expressed in brain, lung, kidney, spleen, small and large intestine (References 2 to 7).
  • Ghrelin has also been isolated from cDNA from vertebrates other than rats, such as humans, mice, pigs, chickens, eel, sea lions, pomas, higgies, potatoes, -jimas or dogs, or has been estimated to have cDNA power ( JP-A-2004-2378).
  • Darrelin has an activity of increasing intracellular calcium ion concentration and a strong growth hormone secretion-promoting activity (References 1, 8 to 10), as well as stimulation of appetite, induction of obesity (References 11 to 14), cardiac function It has various activities such as improvement of lipase (References 15 to 17) and gastric acid secretion promoting action (Reference 18).
  • darelin has a wide range of physiological functions, regulation of that function is important not only for subjects suffering from diseases related to darelin but also for healthy subjects.
  • Darrelin which has been identified so far, is a group of peptides having about 30 or less amino acid residues, and has a structural feature that the amino acid at position 3 is substituted with an acyl group.
  • human darelin consists of 28 amino acids, and the serine side chain at position 3 is acylated with a fatty acid (n-octanoic acid; carbon number (C) 8).
  • the acylation of the amino acid at position 3 is essential for the expression of physiological activities such as an increase in intracellular calcium ion concentration and growth factor secretion promoting activity of ghrelin (1).
  • the amino acid at position 3 of the darelin molecule is usually serine (hereinafter referred to as “Ser 3 ”).
  • Ser 3 serine
  • threonine in the case of a frog is cited as an example of an amino acid (referred to as JP-A-2004-2378).
  • the acyl group used for modification of the 3-position amino acid, which is essential for the biological activity of darelin, is mainly a medium- to long-chain fatty acid residue.
  • Dallerin in mammals such as humans, pigs, sea lions, sheep, dogs, rats and mice; birds such as birds;
  • Examples of such acyl modifications include n-decanoyl (C10: 0, those without a double bond) modifications (eg, Shiga Frog, (JP-A No.
  • n-decenoyl C10: l, Modifications with a saturated bond
  • n-butanoyl C4 (eg, Pima)
  • hexanoyl C6
  • dodecanoyl C12
  • Ghrelin-acyl modification is the first example of peptide hormone lipid modification, and serine hydroxyl-group acylation has never been reported as a mammalian protein modification.
  • modified darelin ashi-dani darelin
  • unmodified darelin non-asi-dani darelin
  • a substance that modulates rougeellin at the 3-position amino acid in vivo in a living body functions as a "regulator” or “modulator” of the physiological function (activity) of darrellin) and various physiological physiological functions of ghrelin. It is expected to be useful for enhancing or suppressing the activity.
  • Such regulators can be used in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating or preventing a variety of physiological disorders related to the physiological activity of darelin. Specific examples include pharmaceutical compositions for treating diseases caused by deficiency, decrease, or excess of growth hormone.
  • it can be used for animals with anorexia and malnutrition, and animals exhibiting symptoms related to treatment such as health disorders related to excessive appetite and obesity.
  • Or fattening of livestock is also useful for promoting growth and reducing fat
  • the above-mentioned amino acids having a growth hormone secretion-promoting action also have a problem in that a single material does not consume a considerable amount and does not promote the secretion of growth hormone.
  • a method of promoting growth hormone secretion by blending various amino acids, herbs, minerals, and vitamins in a specific ratio has been proposed (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-256513), but its effect is not sufficient.
  • functional foods are typically enriched with one or more of the following ingredients: vitamins, minerals, proteins, peptides, amino acids, lipids, carbohydrates.
  • vitamins, minerals, proteins, peptides, amino acids, lipids, carbohydrates are typically enriched with one or more of the following ingredients: vitamins, minerals, proteins, peptides, amino acids, lipids, carbohydrates.
  • proteins, lipids, carbohydrates, etc. many components have been used without elucidating their physiological functions, and their evaluations are not constant.
  • Infusions or liquid diets used during treatment usually contain only minimal nutrients and are not necessarily effective in positively improving physical functioning. Therefore, the physical function For rapid and effective improvement, there is a demand for the development of infusions and liquid foods with higher functions.
  • modulators of the physiological activity of darelin are considered to be extremely useful for various uses such as the above-mentioned functional foods, infusions, liquid foods, and livestock feeds. Disclosure of the invention
  • Another object of the present invention is to provide a method for increasing or decreasing the concentration of modified darelin.
  • Another object or effect of the present invention is to make the description and the drawing power easy to understand.
  • the present inventors have studied various synthetic-type acyl-modified darelin peptides, and as a result, have found that the effect of the biological activity of darelin can be modified by changing the acyl molecule ( Reference 23).
  • the present inventors obtained the finding that ingested (exogenous) fatty acids are directly used in the living body for the acylation of the 3-position amino acid (eg, Ser (3)) of darelin. was found to be useful for controlling the physiological function of dallelin.
  • the ingestion of a medium-chain fatty acid having 6 to 12 carbon atoms as an exogenous fatty acid can increase the concentration of modified darelin (active darelin), thereby completing the present invention. .
  • the present invention provides
  • 2.Darelin's physiological functions are to increase intracellular calcium ion concentration, promote growth hormone secretion, promote eating, regulate fat accumulation, and improve cardiac function. Or a gastric acid secretion stimulating effect, the regulator according to 1,
  • an active form of Darrelin formation accelerator containing at least one medium-chain fatty acid or a derivative thereof having 6 to 12 carbon atoms;
  • the active form of Darrelin formation accelerator according to the above 5, comprising at least one kind of a medium-chain fatty acid having 8 to 10 carbon atoms or a derivative thereof,
  • a composition comprising a medium-chain fatty acid having 6 to 12 carbon atoms or a derivative thereof, and having a muscle strength-enhancing action.
  • a composition comprising a medium-chain fatty acid having 6 to 12 carbon atoms or a derivative thereof, and having a beautiful skin effect, and
  • the regulator described in the above 1 the pharmaceutical composition described in the above 3, or the functional food described in the above 4 is effectively used.
  • a method of preventing or treating disorders associated with the physiological function of dallelline comprising administering in an amount
  • the regulator of the present invention affects the acylation of the 3rd amino acid of endogenous darelin and increases or decreases the ratio of modified darelin to treat or treat various physiological disorders related to the physiological activity of darelin. It is effective for prevention, especially for the treatment of diseases caused by deficiency, decrease or excess of growth hormone, anorexia, malnutrition, etc. Further, the regulator of the present invention is also useful, for example, for improving the growth of livestock. Furthermore, it may contribute to elucidation of the mechanism of the modification of the peptide hormone darelin to acil, particularly to the characterization of the putative darelin ser Q-acyl transferase.
  • active darelin formation promoter of the present invention is safe and has no side effects, and therefore can be used in the form of a food. As a result, it is possible to take it on a daily basis. It is effective.
  • C represents the ratio of acyl-modified darelin Z total darelin. Data represent mean S.D. of darelin concentration in gastric extracts (from lmg wet weight). Statistical significance is indicated by an asterisk. *, p ⁇ 0.01; **, p ⁇ 0.001 vs. control.
  • FIG. 2 Standard stomach of mice fed a diet mixed with glyceryl trihexanoate (C6), glyceryl trioctanoate (C8), glyceryl tridecanoate (C10) or glyceryl tripalmitate (C16).
  • A represents the concentration of acyl-modified darelin measured by darelin N-RIA.
  • B represents total darelin concentration measured by ghrelin C-RIA.
  • the arrows indicate the elution positions of desyl-type darelin (I) and n-otatanyl darrelin (II).
  • peaks a, d, h, and k correspond to the peaks of desacyl ghrelin
  • peaks b, f, i, and 1 correspond to the peaks of n-otatanyl dallelin.
  • Peaks g, j and m corresponded to the peak of n-decenoyl (C10: l) ghrelin
  • peak n corresponded to the peak of n-decanoyl (C10: 0) darrelin.
  • FIG. 4 shows the time-dependent change in the stomach darrellin concentration of mice fed glyceryl trioctanoate.
  • A represents the content of the acyl-modified darelin measured by darelin N-RIA.
  • FIG. 5 shows Northern blot analysis for testing gastric darelin mRNA expression after ingestion of a glyceryl trioctanoate-containing diet. Each lane contains 2 ⁇ g of total RNA. The lower panel shows 28S and 18S ribosomal RNA internal controls.
  • FIG. 6 shows an HPLC profile of a gastric extract derived from a mouse fed with glyceryl triheptanoate.
  • Gastric extracts of mice treated with glyceryl triheptanoate were fractionated by HPLC (upper panel).
  • Darrelin concentration in each fraction (0.2 mg equivalent of gastric tissue) was monitored by C-RIA (middle panel) and N-RIA (lower panel).
  • C-RIA methicillin-associated ANC
  • N-RIA lower panel
  • darelin immunoreactivity was separated by C-RIA into three major peaks (middle panel, peaks a, b and c) and by N-RIA two major peaks (peaks d and e). ). Peaks b and d were only observed after ingestion of glyceryl triheptanoate.
  • FIG. 7 shows the final purification of n-heptanoyldarellin.
  • Stomach strength of mice receiving glyceryl triheptanoate also purified the darelin peptide.
  • Anti-rat ghrelin immunity column Samples that also eluted were subjected to HPLC. Peak a was only observed in samples from mice treated with glyceryl triheptanoate. Based on HPLC retention time and MALDI-TOF-MS analysis, peak b corresponded to n-otatanyldarellin! Arrows indicate elution positions of n-hexanoyl (1), n-otatanyl ( ⁇ ) and n-decanoyl (III) ghrelin, respectively.
  • FIG. 8A shows the results of matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry of dallelin-like peptide purified from peak a in FIG.
  • the mass ranges from 3131.0 to 3477.0 (m / z). From the average 100 mass spectra obtained in the positive ion mode (average [M + H] +: 3301.9), the molecular weight of peak a peptide was calculated to be 3300.9.
  • B Structure of n-heptanoyl (C 7: 0) ghrelin. The calculated molecular weight of n-heptanoyldarellin is 3300.86.
  • FIG. 9 shows the molecular form of plasma darelin peptide derived from mice fed a glyceryl triheptanoate mixed diet.
  • Plasma samples from control mice (A) and dalyceryl triheptanoate-treated mice (B) fed a standard diet were fractionated by HPLC and ghrelin immunoreactivity was measured by C-RIA.
  • Arrows indicate elution positions of desacyl-type darelin (I) and n-otatanyl darrelin ( ⁇ ).
  • the plasma dalelin immunoreactivity was represented by a bar graph.
  • peaks b and e correspond to deotathanildarellin
  • peaks c and g correspond to n-otatanildarellin.
  • the newly appearing peak f showed the same retention time as n-heptanoyldarellin observed in mouse stomach after glyceryl tryptanoate treatment.
  • FIG. 11 is a graph showing changes in grip strength of the dominant hand (right hand) due to ingestion of medium-chain fatty acid triglyceride.
  • Fig. 12 is a graph showing changes in the water content of the skin of the face (right side) due to ingestion of medium-chain fatty acid triglyceride.
  • Fig. 13 shows changes in the water content of the skin of the face (left side) due to ingestion of medium-chain fatty acid triglyceride.
  • FIG. 15 is a graph showing changes in the amount of water transpiration of the skin of the face (left side) due to ingestion of medium-chain fatty acid triglyceride.
  • FIG. 16 is a graph showing changes in the amount of water transpired from the skin of the left inner arm due to the intake of medium-chain fatty acid triglyceride.
  • “Darelin” is an approximately 30 amino acid residue that binds to the endogenous growth hormone secretagogue (GHS) receptor (GHS-R) and exhibits intracellular calcium ion concentration increasing activity and growth hormone secretion stimulating activity. Is a peptide hormone.
  • Darrelin is widely distributed in vertebrates and has been identified in mammals, birds, fish, and amphibians. Thus, the present invention encompasses darellin from any source.
  • Preferred sources of ghrelin include humans, pigs, sea lions, horses, wedges, egrets, rats, mice, dogs, -birds, puppies, -jimas, edible powers, and other livestock, poultry, pet fish, etc. is there.
  • darelins from these have already been isolated and their amino acid sequences are known. For example, see JP-A-2004-2378.
  • (acyl) -modified darelin refers to a peptide in which the amino acid residue at position 3 (eg, serine) of a darelin molecule is modified with an acyl group, and is also simply referred to as “acyl ghrelin”.
  • “Acylation” means replacing the side chain hydroxyl group of the amino acid at position 3 with an acyl group, preferably a fatty acid residue.
  • unmodified darelin means a peptide in which the amino acid at the 3-position is not acylated, and is also simply referred to as “deacyldarelin”.
  • the modified ghrelin that exhibits the physiological activity of dallelin is also referred to as “active ghrelin”.
  • the term "regulator" of the physiological function of ghrelin means a substance that enhances or weakens the physiological function of darellin when administered to a living body expressing RHS-R using ghrelin as a ligand.
  • Examples of the substance that enhances the physiological function of darrellin include a fatty acid having an activating effect, which has an acyl group that makes darrellin physiologically active when the 3-position amino acid of darrellin is acylated.
  • substances that weaken the physiological activity of darrellin have no effect on, or rather reduce, the physiological activity of dallelin. Fatty acids that compete with the fatty acid having the above-mentioned activity to form the 3rd amino acid of dallelin are illustrated.
  • mice In the case of mice as described in the Examples below, the intake of medium-chain fatty acids (MCFA) or medium-chain triacylglycerol (also referred to as “medium-chain triglycerides”) (MCT) was It increased the production of acyl-modified darelin without changing the ghrelin (acyl ghrelin and desacyl darellin) concentrations.
  • MCT medium-chain triglycerides
  • dalelin peptides modified with n-butyryl or n-palmitoyl groups were undetectable after ingestion of the corresponding short-chain fatty acids (SCFA) or long-chain fatty acids (LCFA).
  • SCFA short-chain fatty acids
  • LCFA long-chain fatty acids
  • n-heptanoyldarellin an unnatural form of darelin
  • the fatty acids used for d'arelin's acylylation have a constant carbon chain, that the ingested fatty acids are directly used for d'arelin's acylation, and that they catalyze d'arelin's acylation.
  • Enzymes have been shown to be more compatible with such particular fatty acids. When preferentially acylated by medium-chain fatty acids, such as human and mouse darelin, such enzymes have a greater affinity for MCFA than SCFA or LCFA.
  • mice in which dallerin is acylated by medium-chain fatty acids medium-chain fatty acids (n-hexanoic acid, n-octanoic acid and n-decanoic acid) or medium-chain triglycerides (glyceryl trihexanoate, trioctanoic acid)
  • glyceryl and glyceryl tridecanoate Ingestion of glyceryl and glyceryl tridecanoate is dependent on darellin modified by an acyl group having a carbon chain of the corresponding length (i.e., n-hexanoyldarerin, n-otatanyldarerin and n- Decanoyldarellin) was increased in the stomach.
  • the ingested fatty acids and triglycerides are involved in It is used as a lipid source to affect the concentration of acyl-modified darelin, thereby acting as a regulator of the physiological function of ghrelin. More specifically, fatty acids that bind to amino acid 3 of ghrelin and increase the physiological function of dallelin are “positive regulators”. On the other hand, fatty acids that do not affect or inhibit the physiological function of dallelin are “negative regulators”.
  • the present invention will be mainly described with reference to Darrelin in which the 3-position amino acid is serine as an example.
  • the present invention is also applied to a Darrelin homologue in which the 3-position amino acid is threonine, and the same effect is obtained. What can be obtained can be easily understood by those skilled in the art.
  • Fatty acids that can be used as the active ingredient of the regulator of the present invention include saturated or unsaturated fatty acids having 2 to 35 carbon atoms. Specific examples include butanoic acid (C4), hexanoic acid (C6), octanoic acid (C8), decanoic acid (C10), dodecanoic acid (C12), tetradecanoic acid (C14), and hexadecanoic acid having even numbers of carbon atoms.
  • C16 octadecanoic acid
  • C18 odd-numbered carbonic acid
  • C7 heptanoic acid
  • nonanoic acid C9
  • pentadecanoic acid C15
  • heptadecanoic acid C17
  • their monoenes Or polyene fatty acids More preferably, it includes, but is not limited to, fatty acids having 4 to 18 carbon atoms, further preferably fatty acids having 6 to 16 carbon atoms, and most preferably fatty acids having 6 to 12 carbon atoms.
  • the above fatty acids can be used alone or in combination of two or more.
  • the fatty acid that can be used varies depending on the target animal, but usually has 4 to 12, preferably 6 carbon atoms. ⁇ 12, more preferably 8 ⁇ 10.
  • the “positive regulator” has substantially the same meaning as the “active darelin formation promoter” because it has the above-mentioned “active darelin” concentration increasing action.
  • the fatty acids that can be used vary depending on the target animal. It is other than the fatty acids exemplified as the ureter.
  • the amino acid residue at position 3 is modified with octanoic acid (carbon number (C) 8) to promote growth hormone secretion, which is one of the physiological functions of dallelin.
  • Darelin and Darelin modified with Z or decanoic acid (carbon number (C) 10) have the effect of activating growth hormone secretion, that is, it acts as a positive regulator (active darelin), but the amino acid at position 3 Darrelin, whose residue is modified with hexanoic acid (carbon number (C) 6), is known to have no effect on growth hormone secretion, that is, to be a negative regulator.
  • a fatty acid having 8 to 10 carbon atoms can be suitably used as the active-type darelin formation promoter of the present invention.
  • octanoic acid having 8 carbon atoms has a property of easily forming an ester with the hydroxyl group of the 3-position amino acid as compared with decanoic acid having 10 carbon atoms.
  • Examples of the "fatty acid derivative" which is an active ingredient of the regulator include any form of the above-mentioned fatty acid which can release the above-mentioned fatty acid or form an ester with the hydroxyl group of the 3-position amino acid of dalerin molecule in vivo.
  • Derivatives of fatty acids are mentioned. Such derivatives may also be converted into salts or esters as appropriate for the purpose of improving solubility, gastrointestinal absorption, taste and odor.
  • a method for producing such a derivative is well known in the field of manufacturing industry for pharmaceuticals, foods, feeds, and the like, and those skilled in the art can produce an appropriate derivative according to the purpose.
  • esters with mono- or polyalcohols usually used for similar purposes are esters with mono- or polyalcohols usually used for similar purposes.
  • glycerin is a preferred alcohol.
  • glycoside it may be mono-, di- or tri-glyceride or a mixture thereof, and there is no particular limitation, but triglyceride approved as a food can be suitably used.
  • the fatty acid or a derivative thereof as an active ingredient of the regulator of the present invention can be obtained according to a method known to those skilled in the field of organic chemistry or a commercially available power source.
  • Physiological functions of darelin that can be controlled by the regulator of the present invention include all physiological functions of isildarin, for example, the effect of increasing intracellular calcium ion concentration.
  • a growth hormone secretion promoting action, a feeding promoting action, a regulation action related to fat accumulation, a cardiac function improving action or a gastric acid secretion stimulating action is deeply involved in, but not limited to, growth hormone release, appetite stimulation, obesity induction, cardiac function improvement, and gastric acid secretion.
  • the positive regulator of the present invention enhances the physiological function of darelin, and thus has a similar effect to darelin or an analog thereof. That is, a positive regulator may have effects such as promoting growth hormone secretion, stimulating appetite, inducing obesity, improving cardiac function, and stimulating gastric acid secretion.
  • the regulator of the present invention can be used for mammals, birds, fish, amphibians, etc., for example, humans, pigs, magpies, magpies, sheep, magpies, rats, mice, dogs, -petriles, magpies, -jimas, potatoes, etc. On the other hand, it can be used as a medicine that exhibits the above-mentioned effects.
  • drugs for eating disorders growth hormone secretagogues, drugs for heart disease, drugs for gastric dysfunction, drugs for protecting intestinal mucosa or agents for preventing small intestinal mucosa damage during parenteral nutrition, treatment for osteoporosis
  • an agent for reducing cachexia due to chronic diseases an agent for treating pulmonary dysfunction, and the like.
  • it is useful for preventing or treating osteoporosis, anorexia, heart disease, rheumatism and inflammatory bowel disease in humans, and promoting recovery after surgery.
  • the fatty acid or derivative thereof of the present invention is itself a physiological mechanism of the darrelin of the present invention.
  • a fatty acid or a derivative thereof formulated in a suitable form for ease of handling or application, as it acts as a regulator of function. I prefer to. Examples include solutions and suspensions in aqueous or non-aqueous media (diluents), powders, granules or tablets with physiologically acceptable or pharmaceutically acceptable carriers.
  • a pharmaceutical composition can enhance or suppress the function of darelin in various animal species described in the section “Physiological function of darelin,” for example, and exhibit the therapeutic effects described in the same section. it can.
  • the regulator of the physiological function of darelin of the present invention is formulated into a pharmaceutical composition, it is formulated by a method known per se using excipients, solvents, carriers, preservatives and the like known to those skilled in the art. Is done.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by an oral or parenteral route (for example, intradermal, subcutaneous, intravenous injection, drip, etc.) by a method known in the field of medicine or veterinary medicine.
  • an oral or parenteral route for example, intradermal, subcutaneous, intravenous injection, drip, etc.
  • the dosage of the regulator of the present invention varies depending on various factors (the selected fatty acid or its derivative, the administration route, and the subject to be treated including the disorder to be treated, age, weight, condition, etc.). , Usually determined by a physician. Based on fatty acids, a force of between O.OOlmg-1000 mg, preferably between O.OOlmg-100 mg, more preferably O.Olmg-10 mg. Such a range is not limiting. When the target is an animal other than a human, the dose is appropriately determined by a veterinarian or the like according to the target.
  • the regulator of the present invention Since the regulator of the present invention has no fear of side effects, it can be routinely used as a functional food for enhancing or suppressing appetite, eliminating obesity, improving malnutrition, and the like. In particular, it can be used to control the health of mammals through weight control and the like, and also to promote animal growth and reduce fat in meat. As described above, the regulator of the present invention is also useful in livestock raising, poultry farming, fish farming, and the like.
  • the phrase "functional food” is used in a broad sense, and is defined as a medicament, except that animals, including humans, eat in expectation of some physiological function.
  • This refers to food that can be Specifically, in the form of a preparation such as a supplement, a food containing the fatty acid of the present invention or a derivative thereof, which is a regulator of the ghrelin physiological function of the present invention, as an active ingredient, and a dallerin of the present invention in general foods
  • the food include a fatty acid or a derivative thereof, which is a regulator of physiological function, which is added as a component to add a regulator function of the physiological function of dallerin in the body to the food.
  • Such functional foods include, for example, foods for specified health functions (health promoting foods), conditional specified foods for specified health functions, food supplements, dietary supplements, and in vivo.
  • foods for specified health functions health promoting foods
  • conditional specified foods for specified health functions food supplements, dietary supplements, and in vivo.
  • examples of such foods include a label indicating that the drug is used for regulating the physiological function of dallelin (promoting the formation of active dallelin) or preventing or suppressing disorders related to the physiological function. )
  • the fatty acid or derivative thereof of the present invention can be used as a functional food as it is because it functions as a regulator of the darrelin physiological function of the present invention. It is preferred to formulate the derivative in a suitable form, including liquid and solid forms according to methods known in the art. Examples include solutions and suspensions in aqueous or non-aqueous media (diluents), powders, granules or tablets with physiologically acceptable or pharmaceutically acceptable carriers.
  • the functional food containing the fatty acid or derivative thereof of the present invention as a single component is not limited at all, and specific examples thereof include ice cream, ice milk, ratatois, sherbet, and ice confectionery.
  • alcoholic drinks such as liqueurs
  • Tea drinks such as coffee drinks and tea drinks
  • Soups such as consommé soup and potage soup
  • Puddings such as custard pudding, milk pudding, and juice pudding
  • desserts such as jelly, bavarois, and yogurt
  • Chewing gum and balloons Gums such as gum (plate gum, sugar-coated granulated gum); coating chocolate such as marble chocolate, and strawberry chocolate Over door, chocolate of chocolate or the like Tsukeka ⁇ flavors such as blueberry chocolate and melon chocolate; (including sweets, butter balls, marble, etc.)
  • the content of the regulator of the present invention in the functional food is determined by referring to the dosage described in the section of the pharmaceutical composition above and taking into account factors such as the type and form of the product and the target (species, age group) to be ingested. A person skilled in the art can appropriately determine this.
  • the "positive regulator” of the present invention specifically, the “active darelin formation promoter” is extremely useful as a functional food having an action of increasing intracellular calcium ion concentration and a function of promoting growth hormone secretion. .
  • Such functional foods can efficiently exert physiological effects such as growth hormone secretion promoting action, such as enhancement of muscle and skeleton, loss of fat, skin rejuvenation, and recovery from fatigue. No worries.
  • the active dallelin formation promoter is composed of a medium-chain fatty acid having 6 to 12 carbon atoms or a derivative thereof as described above.
  • the subject when it is a human, it includes a medium-chain fatty acid having 8 to 10 carbon atoms or a derivative thereof, and most preferably a medium-chain fatty acid or derivative thereof having 8 carbon atoms.
  • the method for preventing or treating disorders related to the physiological function of dallelin using the regulator of the present invention comprises providing the regulator itself, or a pharmaceutical composition or a functional food containing the same to a human or non-human animal. It can be carried out according to a method known in the art.
  • GHS Growth hormone secretagogue
  • GHS-R Growth hormone secretagogue receptor
  • MALDI-TOF-MS matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry
  • N-RIA N-terminal fragment of n-otatanyl ghrelin [1-11]
  • Radioimnoassay C-RIA ghrelin Radioimnoassay of C-terminal fragment of [13-28]
  • MCFA Medium chain fatty acids
  • the RIA incubation mixture consists of standard darelin or an unknown sample 1001 and RIA buffer (0.5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 0.5% ⁇ serum albumin (BSA), 0.5% Triton -X100, 80 mM sodium chloride (NaCl), 25 mM Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) and 0.05% sodium azide (NaN
  • the anti-rat ghrelin [1-11] antiserum and the anti-sagidarelin [13-28] antiserum were prepared at final dilutions of 1 / 3,000,000 and 1 / 3,000,000, respectively.
  • N-RIA N-terminal fragment of rat darelin
  • C-RIA C-terminal fragment
  • CHO-GHSR62 cells which stably express rat GHS-R (ghrelin receptor), were cultured at 4 ⁇ 10 4 cells / well in a flat-bottom 96-well plate (black) (Corning Costar
  • Plasma samples were prepared as previously described (Reference 2). Immediately remove whole blood samples from EDTA-2Na (1 mg / ml) and aprotune (1,000 kallikrein inactivator units)
  • n-palmitic acid common long-chain fatty acids (LCFA) (Sigma-Aldrich Japan Co. Ltd., Tokyo)
  • LCFA common long-chain fatty acids
  • MCT and LCT Medium- and long-chain triglycerides
  • glyceryl trihexanoate glyceryl trioctanoate
  • glyceryl tridecanoate glyceryl tripalmitate
  • n-Heptanoyl ghrelin was purified using the same method as the above-described method for purifying darellin by anti-rat ghrelin [1-1 l] IgG immunoaphytik mouth chromatography (Reference 22).
  • FLEX station Molecular Devices, Sunnyvale, CA
  • GHS-R ghrelin receptor
  • CHO-GHSR62 ghrelin receptor
  • mice weighing 20-25g were bred under controlled temperature (21-23 ° C) and under light conditions (light on 0700-1900) with free access to food and water.
  • Glyceryl triheptanoate (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Switzerland) was mixed with the standard laboratory feed at a concentration of 5% (w / w).
  • the total consumption of glyceryl triheptanoate-containing diet is approximately 13.5 g / mouse, giving each mouse a total of 675 mg of glyceryl triheptanoate.
  • the stomach was chopped and boiled for 5 minutes in quintuple volume of water to inactivate endogenous proteases.
  • the gastric tissue solution was then adjusted to 1 M acetic acid (AcOH) -20 mM HCl and homogenized with a Polytron mixer.
  • the supernatant of these extracts obtained after centrifugation at 20,000 rpm for 30 minutes was previously equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and a Sep-Pak C18 environmental oral cartridge (Waters, Milford, MA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the cartridge was filled. After washing with 10% acetonitrile (CH CN) /0.1% TFA, the peptide fraction was
  • the material was redissolved in 1M AcOH and adsorbed on an SP-Sephadex C-25 column (e.g., Pharmacia, Uppsala, Sweden) pre-equilibrated with 1M AcOH.
  • 1M AcOH, 2M pyridine and Elution with 2M pyridine-AcOH (pH 5.0) yielded three fractions, SP-I, SP-II and SP-III.
  • the freeze-dried SP-III fraction was applied to a Sephadex G-50 fine gel-filtration column (1.9 ⁇ 145 cm) (Pharmacia, Uppsala, Sweden), and then fractionated in 5 mL portions.
  • the n-heptanoyl-modified darelin was purified with a retention time of 18.4 minutes and the molecular weight was determined by mass spectrometry.
  • the amino acid sequence of the purified peptide was analyzed using a protein sequencer (494, Applied Biosystems, Foster City, CA).
  • Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry was performed using a Voyager DE-Pro spectrometer (Applied Biosystems, Foster City, CA) (Reference 25). Mass spectra were recorded in reflection mode at an acceleration voltage of 20 kV. Saturated ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid in 60% acetonitrile (CH CN) and 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)
  • n-hexanoic acid C6
  • n-octanoic acid C8
  • n-lauric acid C12
  • n-palmitic acid C16
  • Gastric peptides were extracted from the stomachs of mice fed water and normal control mice (control) fed standard diet and water. After ingestion, the concentrations of acyl-modified darelin and total (acyl-modified and de-acyl) darelin were measured. The acyl-modified darelin was measured by N-RIA, and total darelin was measured by C-RIA. The results are shown in Figure 1.
  • N-RIA is very specific for acyl-modified darelin, and the main form of acyl-dallarelin is n-octanoyldarreline, so that the concentration of acyl-modified darelin measured by N-RIA is mainly n- It reflects the Ottatanildarellin population.
  • C represents the ratio of acyl-modified darelin Z total darelin. Data represent mean SD of darelin concentration in gastric extract (from lmg wet weight). Statistical significance was indicated by asterisks. *, p * 0.01; **, p * 0.001 vs. control o
  • the gastric content of n-decanoyl ghrelin and n-hexanoyl ghrelin is lower than that of n-otanoyl darrelin, and the stomach content of n-decanoyl ghrelin and n-hexanoyl ghrelin
  • the cross-reactivity of N-RNA is 20% and 0.3%, respectively.
  • the concentration of the acyl-modified darelin measured by N-RIA mainly reflects n-otatanyldarerin.
  • mice were given n-hexanoic acid, n-octanoic acid, n-lauric acid or n-palmitic acid for 14 days, and then the gastric concentrations of acyl-modified darelin and total darelin were given with normal food and water. The concentration was compared with that obtained in control mice. Gastric concentrations of acyl-modified darelin were significantly increased in mice fed n-octanoic acid (FIG. 1A).
  • n-hexanoic acid n-decanoic acid or n-palmitic acid.
  • exogenous supplemented n-octanoic acid increased the gastric concentration of n-otatanyl dallerin without increasing the total (acyl-modified and de-acyl) dallerin peptides.
  • Ingested triacylglycerol is hydrolyzed in the lumen and is absorbed through the gastrointestinal mucosa as free fatty acids or monoglycerides. Therefore, ingested triacyldaricerol can function as a source of free fatty acids (Reference 26).
  • mice were given 5% (w / w) glyceryl trihexanoate (C6), glyceryl trioctanoate (C8), and tridecanoic acid. They were fed a diet mixed with glyceryl (C10) or glyceryl tripalmitate (C16). Two weeks later, gastric peptides were extracted.
  • the contents of acyl-modified darelin and total darelin were measured by N- and C-RIA. The result is shown in figure 2.
  • A represents the concentration of the acyl-modified darelin measured by darelin N-RIA.
  • B represents the total darelin concentration measured by darelin C-RIA.
  • C represents the ratio of the concentration of acyl-modified darelin Z total ghrelin.
  • Statistical significance is indicated by an asterisk. *, p ⁇ 0.05; **, p ⁇ 0.01 vs control.
  • FIG. 2 shows that glyceryl trioctanoate intake stimulates the production of acyl-modified darelin in gastric tissue (FIG. 2A).
  • Ingestion of glyceryl tridecanoate and glyceryl tripalmitate had no effect on the production of acyl-modified darellin (FIG. 2A).
  • glyceryl trihexanoate was used to determine the molecular form of the darelin peptide.
  • peaks &, d, h, and k correspond to desacyl darelin
  • peaks b, f, i, and 1 are n-otatanyl (C8: 0) corresponds to ghrelin
  • peaks c, g, j and m correspond to n-decenoyl (C10: l) ghrelin.
  • n-Hexanoyldarellin was extremely low in the stomach of mice fed a normal diet and was not detected by force.
  • glyceryl trihexanoate was given to the mice, the gastric concentration of n-hexanoyldarerin increased dramatically (peak. In these mice, the measured values in control mice (peak b in Figure 3 and Table 1). ), A significant decrease in the concentration of n-otanoyldarellin was also detected (peak 1 in Figure 3 and Table 1). It also increased after ingestion (data not shown).
  • the Darrelin peak eluting at the same retention time as synthetic n-butanoyl (C4: 0) ghrelin, n-dodecanoyl (C12: 0) ghrelin and n-palmitoyl (C16: 0) darellin has a Vigor was not observed in gastric extracts of mice given ril, glyceryl trilaurate or glyceryl tripalmitate. These data indicate that glyceryl tributyrate or glyceryl tripalmitate was not sufficiently converted to dallelin in mice.
  • mice Male C57BL / 6J mice received 5% (w / w) glyceryl trihexanoate (C6: 0-MCT), glyceryl trioctanoate (C8: 0-MCT) or glyceryl tridecanoate (C10: 0-MCT). The mixed diet was given for 14 days.
  • concentrations of l-ghrelin) and n-decanol ghrelin were measured by Darrelin C-RIA after HPLC fractionation. Data represent mean SD from quadruplicate samples.
  • mice fasted for 12 hours were fed a glyceryl trioctanoate-containing diet (5%, w / w).
  • a glyceryl trioctanoate-containing diet 5%, w / w.
  • the gastric concentrations of the acyl-modified darelin and total darelin after a certain period of time were measured.
  • Fig. 4 shows the results.
  • A is the content of the acyl-modified darelin measured by darelin N-RIA
  • mouse gastric mRNA was quantified by Northern blot analysis 4 days after ingestion of a diet containing glyceryl trioctanoate.
  • Fig. 5 shows the results.
  • Each lane contains 2 ⁇ g of total RNA.
  • the lower panel shows 28S and 18S ribosomal RNA internal controls.
  • FIG. 5 shows that the expression level of gastric darelin mRNA did not change after ingestion of glyceryl trioctanoate.
  • glyceryl trioctanoate increased the gastric content of n-otatanyldalerelin without changing the total darelin concentration, ingestion of glyceryl trioctanoate stimulated only the otatanyl modification step in dalerin peptide synthesis. That is,
  • mice were fed medium-chain triglycerides (MCTs), which are not present in natural dietary sources and are not synthesized in mammals, to determine whether ingested free fatty acids may be used directly for the modification of d'allelin to acyl. .
  • MCTs medium-chain triglycerides
  • n-heptanoic acid (C7: 0) which is a hydrolyzed form of glyceryl triheptanoate, is not naturally present in mammals, it is considered a non-natural free fatty acid source.
  • glyceryl triheptanoate To select glyceryl triheptanoate.
  • n-heptanoyldarerelin is easily separated from natural darelin by HPLC.
  • Fig. 6 shows the results.
  • peaks a and c corresponding to the retention time of the isolated darelin peptide correspond to de-acyl-type darelin and n-otatanyl dallerin, respectively.
  • Fig. 6 Extrapyretic darrellin immunoreactivity was observed only in mice fed dalyseryl triheptanoate, and other free fatty acids or triglycerides tested (n-hexanoic acid, n-octanoic acid, n-lauric acid, n_palmitic acid). Or the corresponding triglyceride form).
  • the retention time of peak b was between n-hexanoyldarerin and n-otatanyldarerin.
  • Peak a was observed only in samples derived from mice treated with glyceryl triheptanoate. Based on HPLC retention time and MALDI-TOF-MS analysis, peak b corresponded to n-otatanyldarellin.
  • the arrows indicate the elution positions of n-hexanoyl (1), n-otatanyl ( ⁇ ) and n-decanoyl (III) dallelin, respectively.
  • peak b in Fig. 7 was identified as n-otatanyl darelin based on the retention time in HPLC.
  • Another peak eluting at a retention time of 18.4 minutes was only observed after glyceryl triheptanoate ingestion.
  • This peak eluted with a retention time between n-hexanoyldarerin and n-otatanyldarerin.
  • the peptide at peak a was purified and subjected to amino acid sequencing analysis and mass spectrometry.
  • the purified peptide obtained from HPLC peak a (Fig. 7) consisted of 28 amino acids and was identical to the amino acid sequence of mouse ghrelin. Matritus-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry of dallelin-like peptide purified from peak a in Figure 7 was performed today. The results are shown in FIG. 8A.
  • B represents the structure of n-heptanoyl (C7: 0) ghrelin.
  • the estimated molecular weight of the peptide calculated from the m / z value of MALDI-TOF-MS was 3300.9.
  • Modification of the ghrelin n-heptanol group at the Ser 3 residue results in a molecular weight of about 3300.86 in theory (FIG. 8B). This is almost the same as the molecular weight measured by MALDI-TOF-MS. Therefore, it was concluded that the purified peptide at peak a was n-heptanoyldarellin.
  • the arrows indicate the elution positions of desacyl-type darelin (I) and n-otatanyldarrelin ( ⁇ ).
  • the plasma dalelin immunoreactivity was represented by a bar graph.
  • Plasma ghrelin immunoreactivity in control mice was separated into two main peaks (peaks a and b in Fig. 9A) and one small peak (peak c in Fig. 9A).
  • Plasma darellin immunoreactivity in glyceryl triheptanoate-treated mice was separated into two main peaks (peaks d and e in FIG. 9B) and two minor peaks (peaks 1 and g in FIG. 9B).
  • peaks b and e correspond to de-otanoyldarellin
  • peaks c and g correspond to n-otatanyldarerin.
  • the newly appearing peak f showed the same retention time as n-heptanoyldarellin observed in the mouse stomach after glyceryl tryptanoate treatment.
  • Peaks a and d are believed to be the C-terminal portion of the darelin peptide generated by protease digestion, but the exact molecular form has not yet been determined.
  • n-heptanoyl ghrelin to stimulate GHS-R (ghrelin receptor) activity was tested using ghrelin calcium mobilization atsey.
  • N-Ottanoyl darrelin black circle
  • n-heptanoyl ghrelin open circle
  • time course of fluorescence induced by n-hexanoyldarerin closed triangles
  • Peptide (1 X 10- 8 M) was example mosquitoes ⁇ at time point indicated by the arrow.
  • the results are shown in FIG.
  • n-Heptanoyldarellin induces an increase in [Ca2 + ] in GHS-R-expressing cells, and the time course of these [Ca2 + ] i changes is Similar to the changes induced by (Fig. 10).
  • n-heptanyl ghrelin for GHS-R, calculated from the area under the curve (AUC) of the response curve, is about 60% of that of n-otatanyl ghrelin. It is three times higher than that of nildalelin ( Figure 10). Therefore, n-heptanoyldarerin has GHS-R stimulating activity.
  • the present invention also opens the way to the molecular mechanism of the modification of d'arelin to acyl and the identification of the enzyme responsible for the modification.
  • the experimental results suggest that darellin ser acyltransferase, which functions in mice, can catalyze the rasyl modification of n-hexanoyl, n-heptanyl, n-otatanyl and n-decanoyl darellin.
  • This type of enzyme was not able to catalyze the modification of darellin to acyl after ingestion of glyceryl tripalmitate, long-chain triacylglyceride (LCT) and glyceryl tributyrate, short-chain triacylglyceride (SCT).
  • LCT long-chain triacylglyceride
  • SCT short-chain triacylglyceride
  • This is a medium-chain (C6: 0 to C10: 0) acyltransferase that has an affinity for MCT (MCFA) for the enzyme modification of darelin in mice. It shows what is possible.
  • the present invention relates to the use of exogenous or metabolically produced MCFs. Some of this was converted to medium chain acyl-CoA, which was used to modify ghrelin to acyl. Suggests the possibility of
  • Lacol (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) was used as an enteral nutritional supplement.
  • the tricaprylin content in Lacol is 1500 mg Z200 ml (tricaprylin is a medium chain fatty acid triglyceride (MCT) that is glycerin and octanoic acid (carbon number (C) 8).
  • MCT medium chain fatty acid triglyceride
  • C carbon number 8
  • Lacol was administered to low-birth weight infants (BMI 10) at 900 ml / day (6.75 g as tricaprylin) for 18 days. Was measured.
  • the modified darelin content in blood was measured with darelin C-RIA and N-RIA as in Example 1.
  • Table 2 shows the measurement results of the content of modified darelin (acyl ghrelin) in blood (fmolZmL). As is evident from Table 2, administration of enteral nutrition containing 6.75 g of MCT to low-weight children for 18 days increased the content of modified darelin in the blood.
  • Actor M-2 (RIKEN Vitamin Co., Ltd.) was used as the edible fat. Actor M-2 has a medium-chain fatty acid triglyceride (MCT) (octanoic acid (carbon number (C) 8)) content of 99.99%.
  • MCT medium-chain fatty acid triglyceride
  • Muscle strength was measured with a dominant hand using a grip meter (Tanita Corporation). The measurement was performed twice at intervals of about 1 minute, and the average value was used as an individual value.
  • Actor M-2 (RIKEN Vitamin Co., Ltd.) was used as the edible fat. Actor M-2 has a medium-chain fatty acid triglyceride (MCT) (octanoic acid (carbon number (C) 8)) content of 99.99%.
  • MCT medium-chain fatty acid triglyceride
  • FIGS. 12 to 15 The measurement results of the skin of the face are shown in FIGS. 12 to 15, and the measurement results of the skin of the inner arm are shown in FIG.
  • Ingestion of edible oils and fats containing MCT containing high octanoic acid reduced the amount of water transpiration and increased the skin moisture content. This suggests that the barrier function of the skin is improved, that the evaporation of water is suppressed, and that the necessary water is maintained.
  • Matsukura S, Kangawa K, Nakazato M. Ghrelin a novel growth hormone-releasing acylated peptide, is synthesized in a distinct endocrine cell type in the

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Abstract

　炭素数が２～３５である脂肪酸またはその誘導体を含み、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇作用、成長ホルモン分泌促進作用、摂食促進作用、脂肪蓄積に関連した調節作用、心機能改善作用または胃酸分泌刺激作用等のグレリンの生理学的機能を調節するためのレギュレーターおよびその利用。

Description

明 細 書
グレリンの生理学的機能のレギュレーター及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、ダレリンの生理学的機能のレギュレーター、および医薬または食品等の 分野におけるそれらの利用に関する。また、本発明は、修飾型ダレリンの形成促進剤 、およびそれらを含む食品に関する。
背景技術
[0002] ダレリン (Ghrelin)は、成長ホルモン分泌促進性の合成非天然物質である、成長ホ ルモン分泌促進物質（growth hormone secretagogue: GHS)と結合するレセプター（ GHS-R)の内因性リガンド（ペプチドホルモン）であり、本発明者らのグループうちの児 島、寒川らのが最初に発見した物質である [後出文献リストに掲載されて 、る文献 (以 下、「文献」という） 1および WO01/007475]。当初、ダレリンはラットの胃力も精製され たが、脳、肺、腎臓、脾臓、小腸および大腸にも発現していることが分力 ている (文 献 2〜7)。また、ラット以外の脊椎動物、例えばヒト、マウス、ブタ、ニヮトリ、ゥナギ、ゥ シ、ゥマ、ヒッジ、力エル、 -ジマスまたはィヌからもグレリンが単離、あるいは cDNA 力 推定されている（特開 2004-2378号公報)。ダレリンは細胞内カルシウムイオン濃 度の上昇活性および強力な成長ホルモン分泌促進活性を有する (文献 1、 8〜10)こと に加えて、食欲の刺激、肥満の誘導 (文献 11〜14)、心機能の改善 (文献 15〜17)、胃 酸分泌促進作用 (文献 18)等様々な活性を有する。このように、ダレリンは広範な生理 学的機能を有することから、その機能の調節はダレリンに関連する疾患に罹患した被 検体のみならず、健常な被検体にとっても重要である。
[0003] これまでに同定されたダレリンは、アミノ酸残基が約 30以下の一群のペプチドであり 、 3位アミノ酸がァシル基で置換されているという構造上の特徴を有する。例えばヒト ダレリンはアミノ酸 28個からなり、 3位のセリン側鎖が脂肪酸 (n—オクタン酸。炭素数 (C) 8)でァシル化されている。 3位アミノ酸のァシル化は、グレリンの細胞内カルシゥ ムイオン濃度の上昇、成長因子分泌促進活性等の生理学的な活性の発現に必須で ある (1)。なお、ダレリン分子の 3位アミノ酸は通常セリンである（これを以下、「Ser3」ま たは「ser(3)」と表す）力 例のアミノ酸の例として、ゥシガエルの場合のスレオニンが挙 げられる（特開 2004-2378号公報)。
[0004] ダレリンの生物活性に必須の、 3位アミノ酸の修飾に利用されるァシル基は主として 中鎖〜長鎖脂肪酸残基である。ヒト、ブタ、ゥシ、ヒッジ、ィヌ、ラット、マウス等のほ乳 類、 -ヮトリ等の鳥類、ゥナギ、 -ジマス、テラビア、ナマズ等の魚類、力エル等の両 生類のダレリンは n-オタタノィル基で修飾されている（文献 1、文献 19、および特開 2004-2378号公報）力 別の型のァシル修飾を有するダレリンペプチドの小集団があ る。そのようなァシル修飾の例としては、 n-デカノィル (C10:0、二重結合がないもの） 修飾 (例、ゥシガエル、（特開 2004-2378号公報）、 n-デセノィル (C10:l、不飽和結合 がーつあるもの)修飾が挙げられる (文献 20〜22)。また、 n-ブタノィル (C4) (例、ゥマ） 、へキサノィル (C6)、ドデカノィル (C12)修飾も知られている（特開 2004-2378号公報
) o
[0005] グレリンのァシル修飾はペプチドホルモンの脂質修飾の最初の例であり、セリンのヒ ドロキシル基のァシルイ匕は哺乳動物タンパク質の修飾としては報告されたことがない
。生体内にはァシルイ匕ダレリン（以下、「修飾型ダレリン」と称することもある）と非ァシ ルイ匕ダレリン (以下、「非修飾型ダレリン」と称することもある）が存在する力 ダレリン 3 位アミノ酸残基へのァシル基転移を触媒する推定酵素は、おそらく新規のァシルトラ ンスフェラーゼであり、ダレリン産生の調節に重要と思われる。しかしながら、そのよう な酵素は未だ発見されて ヽな ヽ。
[0006] ダレリンの強力な生理活性に着目して、医療、畜産、食品等広範な分野で応用が 試みられている。具体的には、摂食障害治療薬、成長ホルモン分泌促進薬等として の利用が提案されている [WO01/007475、特開 2004-2378号公報、 WO2002/060472 ]。これらの出願は、いずれも、合成したダレリン誘導体または類似体の使用を前提と している。しかし、非修飾型ダレリンを用いる場合には、生体内でァシルイ匕ダレリンに 変換される必要があり、また、修飾型ダレリンを用いる場合には、ァシルイ匕ダレリンの 効率的な製造方法が確立されて 、な 、と 、う問題がある。
[0007] 従って、生理学的活性を医学、獣医学、畜産等の広範な分野での有効利用のため には、ダレリンの生理学的活性を調節するための、確実で効率のよい方法の開発が 待たれている。
[0008] 例えば、生体内でダレリンの 3位アミノ酸のァシルイ匕を調節する物質はダレリンの生 理学的機能 (活性)の「レギュレーター」または「モジュレーター」 )として機能し、グレリ ンの種々の生理学的活性の増強または抑制に有用であることが期待される。そのよう なレギュレーターは、ダレリンの生理学的活性に関連した種々の生理学的障害を治 療または予防するための医薬組成物の製造に用いることができる。具体例として、成 長ホルモンの欠損または減少、あるいは過剰に起因する疾患を治療するための医薬 糸且成物が挙げられる。また、食欲不振、栄養不良状態にある動物や、対照的に過剰 な食欲に関連する健康障害、肥満等の処置に関連する症状を呈する動物に用いる ことができる。または家畜の肥育'成育を促進し、脂身を低減するためにも有用である
[0009] 日常的に摂取しうる形態である機能性食品として、 L-アルギニン等の成長ホルモ ン分泌促進作用を有するアミノ酸を配合したドリンク剤（モーメンタム社;商品名『PM フォーミュラ』)やサプリメント (フォアモアー社;商品名『HGHブースト』、ピュアサプリ メント社『身長応援サプリメント』)等が市販されている。しかし、生体内でダレリンの 3 位アミノ酸のァシルイ匕を調節しうる機能性食品や、修飾型ダレリンの形成を促進する ものは、全く知られていない。
また、上記の成長ホルモン分泌促進作用を有するアミノ酸は、単品素材では相当 量の摂取を行わな 、と成長ホルモンの分泌を促進しな ヽと 、う問題もある。各種のァ ミノ酸、ハーブ、ミネラル、ビタミンを特定の比率で配合することによって成長ホルモン の分泌を促す方法も提案されているが (特開 2004-256513号公報）、その効果は十分 でない。
さらに、機能性食品には通常、ビタミン、ミネラル、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、 脂質、炭水化物等の成分の 1種以上が強化されている。しかしながら、特定のタンパ ク質、脂質、炭水化物などを除いて多くの成分はその生理学的機能が未解明のまま 用いられており、その評価も一定していない。
治療の間に用いる点滴または流動食は、通常、最小の栄養成分を含有しているに すぎず、積極的な身体機能の改善には必ずしも有効ではない。従って、身体機能の 迅速で効果的な改善のために、より高い機能を有する点滴や流動食等の開発が望 まれている。このように、ダレリンの生理学的活性のモジュレーターは、上記の機能性 食品、点滴、流動食、家畜の飼料など、様々な用途に極めて有用と考えられる。 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明の目的は、ダレリンの 3位アミノ酸の生体内でのァシルイ匕を調節する物質を 提供し、該物質を用いてダレリンの生理学的機能を制御する方法を提供することであ る。
本発明の別の目的は、修飾型ダレリンの濃度を上昇または減少させる方法を提供 することである。
本発明のさらに別の目的は、ダレリンの生理学的活性の調節を通して治療効果や 健康増進効果を発揮する医薬組成物または食品を提供することである。
本発明の他の目的または効果は、明細書および図面力も容易に理解されるであろ 課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、種々の合成型ァシル修飾ダレリンペプチドに関して検討した結果、 ダレリンの生物学的活性の効力力 ァシル分子を変更することにより改変されるとの 知見を得ている (文献 23)。今回、本発明者らは、摂取した (外来性の)脂肪酸が生体 内でダレリンの 3位アミノ酸 (例、 Ser(3))のァシルイ匕に直接用いられるとの知見を得、 外来性脂肪酸そのものが、ダレリンの生理学的機能のコントロールに有用であること を見出した。特に、外来性脂肪酸として炭素数 6〜12の中鎖脂肪酸を摂取すること により、修飾型ダレリン (活性型ダレリン)の濃度を上昇させることができるという知見を 得、本発明を完成するに至った。
[0012] 従って、本発明は、
1.炭素数が 2〜35である脂肪酸またはその誘導体を含むダレリンの生理学的機能 のレギュレーター、
2.ダレリンの生理学的機能が、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇作用、成長ホル モン分泌促進作用、摂食促進作用、脂肪蓄積に関連した調節作用、心機能改善作 用または胃酸分泌刺激作用である、 1記載のレギュレーター、
3.上記 1または 2に記載のレギュレーターを含有する医薬組成物、
4.上記 1または 2のレギュレーターを含有する機能性食品、
5.炭素数 6〜 12の中鎖脂肪酸またはその誘導体の少なくとも 1種を含む活性型ダレ リン形成促進剤、
6.炭素数 8〜10の中鎖脂肪酸またはその誘導体の少なくとも 1種を含む、上記 5に 記載の活性型ダレリン形成促進剤、
7.上記 5または 6の ヽずれかに記載の活性型ダレリン形成促進剤を含有する機能性 TOゝ
8.炭素数 6〜12の中鎖脂肪酸またはその誘導体を含有し、筋力増強作用を有する ことを特徴とする組成物、
9.炭素数 6〜12の中鎖脂肪酸またはその誘導体を含有し、美肌作用を有することを 特徴とする組成物、および
10.ダレリンの生理学的機能に関連する障害の予防または処置を必要とする被検体 に、上記 1に記載のレギュレーター、上記 3に記載の医薬組成物または上記 4に記載 の機能性食品を有効な量で投与することを含む、ダレリンの生理学的機能に関連す る障害の予防または治療方法、
などに関する。
発明の効果
本発明のレギュレーターは、内因性ダレリンの 3位アミノ酸のァシル化に影響を与え 、修飾型ダレリンの比率を増大または減少することにより、ダレリンの生理学的活性に 関連した種々の生理学的障害の治療または予防、特に、成長ホルモンの欠損または 減少、あるいは過剰に起因する疾患の治療、食欲不振、栄養不良などの治療に有効 である。また、本発明のレギュレーターは、例えば家畜の成育を改善するためにも有 用である。さらにはペプチドホルモン、ダレリンのァシル修飾の機構の解明、特に推 定のダレリン ser Q-ァシルトランスフェラーゼの特徴付けにも貢献しうる。
修飾型ダレリンのうち、生理学的活性を有する修飾型ダレリン（「活性型ダレリン」と も呼称)の比率を増大させる活性型ダレリン形成促進剤は、例えば、ダレリンの細胞 内カルシウムイオン濃度上昇作用や成長ホルモン分泌促進作用等を増強させること ができ、その結果、筋肉'骨格の増強、脂肪の減少、皮膚の若返り、疲労回復などの 生理効果を発揮しうる。このような本発明の活性型ダレリン形成促進剤は、安全で副 作用がないことから、食品の形態で用いることができ、その結果、 日常的な摂取が可 能となり、効率的に上記の生理効果を発揮する。
図面の簡単な説明
[図 l]n-へキサン酸 (C6)、 n-オクタン酸 (C8)、 n-ラウリン酸 (C12)または n-パルミチン酸 (C16)と水を与えたマウスおよび標準的な餌と水を与えた正常コントロールマウス (コン トロール)の胃におけるダレリン濃度を示す。 Aはダレリン N-RIA (n=8)により測定した ァシル修飾型ダレリン濃度を表す。 N-RIAはァシル修飾型ダレリンに非常に特異的で あり、ァシル化グレリンの主な形態は n-オタタノィルグレリンなので、 N- RIAにより測定 したァシル修飾型ダレリン濃度は主に n-オタタノィルダレリン集団を反映して 、る。 B はダレリン C-RIA (n=8)により測定した総ダレリン濃度を表す。総ダレリン濃度は、ァシ ル型および脱ァシル型の両グレリンを含む。 Cはァシル修飾型ダレリン Z総ダレリン の比を表す。データは、胃抽出物におけるダレリン濃度の平均値士 S.D.を表す (湿重 量 lmgから)。統計学的有意差はアスタリスクで示した。 *, p< 0.01 ; **, p< 0.001対 コントローノレ。
[図 2]トリへキサン酸グリセリル (C6)、トリオクタン酸グリセリル (C8)、トリデカン酸グリセリ ル (C10)またはトリパルミチン酸グリセリル (C16)と混合した餌を与えたマウスの胃と標 準的な実験用飼料 (コントロール)を与えたマウスの胃におけるダレリン濃度 (n= 8)を 示す。 Aはダレリン N-RIAにより測定したァシル修飾型ダレリン濃度を表す。 Bはグレリ ン C-RIAにより測定した総ダレリン濃度を表す。データは胃抽出物におけるダレリン 濃度の平均値士 S.D.を表す (湿重量 lmg)(n= 5)。 Cはァシル修飾型ダレリン Z総ダレ リン濃度の比を表す。データは計算した比の平均値士 S.D.を表す (n= 5)。統計学的 有意差はアスタリスクにより示した。 *, p< 0.05; **, p< 0.01対コントロール。
[図 3]トリへキサン酸グリセリル (C6:0- MCT)、トリオクタン酸グリセリル (C8:0- MCT)、トリ デカン酸グリセリル (C10:0-MCT)を含有する飼料または標準実験用飼料 (コントロー ル)を与えたマウスの胃力も得たダレリンペプチドの分子形態を示す。マウス胃由来の ペプチド抽出物を HPLCにより分画し、 C-RIAによりダレリン免疫反応性について測 定した。アツセィチューブは胃糸且織 0.2mgからのペプチド抽出物を等量ずつ含有して いた。黒棒グラフはダレリン C-RIAにより測定した免疫反応性ダレリン（ir-ダレリン)濃 度を表す。矢印は脱ァシル型ダレリン (I)および n-オタタノィルダレリン (II)の溶出位置 を表す。合成ダレリンの保持時間に基づき、ピーク a、 d、 hおよび kは脱ァシル型グレリ ンのピークに対応し、ピーク b、 f、 iおよび 1は n-オタタノィルダレリンのピークに対応し、 ピーク g、 jおよび mは n-デセノィル (C10:l)グレリンのピークに対応し、ピーク nは n- デカノィル（C10:0)ダレリンのピークに対応していた。
[図 4]トリオクタン酸グリセリンを与えたマウスの胃のダレリン濃度の時間依存性の変化 を示す。 Aはダレリン N-RIAにより測定したァシル修飾型ダレリン含量を表す。 Bはグ レリン C-RIAにより測定した総ダレリン含量を表す。絶食 12時間後、トリオクタン酸ダリ セリル (5%w/w)含有飼料をマウスに与えた。矢印で示す時点 (0時間)で開始する。胃 サンプルを、記載した時点で標準実験用飼料を与えたコントロールマウス（黒丸）およ びトリオクタン酸グリセリルを与えたマウス（白丸)から単離した。各点は平均値士 S.D. で示している (n= 8)。統計学的有意差はアスタリスクで示した。 *、 p< 0.05; **、 p< 0.01および ***、 p< 0.001対コントロール。
[図 5]トリオクタン酸グリセリル含有飼料の摂取後の胃ダレリン mRNA発現を試験するノ ザンブロット分析を示す。各レーンは全 RNAを 2 μ g含む。下方のパネルは 28Sおよび 18Sリボソーム RNA内部コントロールを示す。
[図 6]トリヘプタン酸グリセリルを与えたマウス由来の胃抽出物の HPLCプロフィールを 示す。トリヘプタン酸グリセリルで処置したマウスの胃抽出物を HPLCにより分画した（ 上方パネル)。各画分 (胃組織 0.2mg当量)におけるダレリン濃度を C- RIA (中央パネル) および N-RIA (下方パネル)によりモニターした。棒グラフで表すように、ダレリン免疫 反応性は、 C-RIAにより 3つの主なピーク (中央パネル、ピーク a、 bおよび c)に分離し、 N-RIAにより 2つの主なピーク (ピーク dおよび e)に分離した。ピーク bおよび dはトリヘプ タン酸グリセリルの摂取後にのみ観察された。
[図 7]n-ヘプタノィルダレリンの最終精製を示す。トリヘプタン酸グリセリルを摂取した マウスの胃力もダレリンペプチドを精製した。抗ラットグレリンィムノアフィ-ティカラム 力も溶出したサンプルを HPLCに供した。ピーク aはトリヘプタン酸グリセリルで処置し たマウス由来のサンプルにおいてのみ観察された。 HPLCの保持時間および MALDI-TOF-MS分析に基づくと、ピーク bは n-オタタノィルダレリンに対応して!/、た。 矢印はそれぞれ、 n-へキサノィル (1)、 n -オタタノィル (Π)および n-デカノィル (III)グレリ ンの溶出位置を表す。
[図 8]Aは図 7のピーク aから精製したダレリン様ペプチドのマトリックス支援レーザー 脱離イオン化飛行時間型質量分析の結果を示す。質量は、 3131.0〜3477.0 (m/z)の 範囲に及ぶ。陽イオンモード (平均 [M+H]+ : 3301.9)で得た平均 100質量スペクトルか ら、ピーク aペプチドの分子量は 3300.9であると計算した。 B. n-ヘプタノィル (C 7:0)グ レリンの構造。 n-ヘプタノィルダレリンの分子量計算値は 3300.86である。
[図 9]トリヘプタン酸グリセリル混合飼料を与えたマウス由来の血漿ダレリンペプチドの 分子形態を示す。標準飼料を与えたコントロールマウス (A)およびトリヘプタン酸ダリ セリル処置マウス (B)の血漿サンプルを HPLCにより分画し、 C- RIAによりグレリン免疫 反応性を測定した。矢印は脱ァシル型ダレリン (I)および n-オタタノィルダレリン (Π)の 溶出位置を表す。血漿ダレリンの免疫反応性は棒グラフで表した。図中、ピーク bお よび eは脱オタタノィルダレリンに対応し、ピーク cおよび gは n-オタタノィルダレリンに 対応する。新たに現れたピーク fはトリぺプタン酸グリセリル処置の後にマウス胃で観 察された n—ヘプタノィルダレリンと同一の保持時間を示した。
[図 10]GHS-R-発現細胞での n-オタタノィルダレリン (黒丸)、 n-ヘプタノィルグレリン（ 白丸)および n-へキサノィルダレリン (黒三角)により誘導される蛍光のタイムコースを示 す。ペプチド (1 X 10— 8M)は矢印により示される時点でカ卩えた。
圆 11]中鎖脂肪酸トリグリセリド摂取による利き手 (右手)の握力の変化を示す図であ る。
圆 12]中鎖脂肪酸トリグリセリド摂取による、顔 (右頰)の皮膚の水分含量の変化を示 す図である。
圆 13]中鎖脂肪酸トリグリセリド摂取による、顔 (左頰)の皮膚の水分含量の変化を示 す図である。
圆 14]中鎖脂肪酸トリグリセリド摂取による、顔 (右頰)の皮膚の水分蒸散量の変化を 示す図である。
[図 15]中鎖脂肪酸トリグリセリド摂取による、顔 (左頰)の皮膚の水分蒸散量の変化を 示す図である。
[図 16]中鎖脂肪酸トリグリセリド摂取による、左内腕の皮膚の水分蒸散量の変化を示 す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本明細書中で用いる用語を以下に説明する。
「ダレリン」とは、内因性成長ホルモン分泌促進因子 (GHS)の受容体 (GHS-R)と結 合し細胞内のカルシウムイオン濃度上昇活性および成長ホルモンの分泌刺激活性 を示す約 30アミノ酸残基のペプチドホルモンである。ダレリンは、脊椎動物に広範囲 に分布しており、ほ乳類、鳥類、魚類、両生類などで同定されている。従って、本発 明は、任意の起源に由来するダレリンを包含する。
好ましいグレリンの起源はヒトの他、ブタ、ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ゥサギ、ラット、マウス、 ィヌ、 -ヮトリ、ゥナギ、 -ジマス、食用力エル等の、家畜、家禽、ペット魚類等である。 これらを起源とする数種のダレリンは、既に単離され、そのアミノ酸配列が既知である 。例えば、特開 2004— 2378号公報参照。
[0016] 本明細書中、「（ァシル)修飾型ダレリン」とは、ダレリン分子の 3位アミノ酸残基 (例、 セリン）がァシル基で修飾されたペプチドを意味し、単に「ァシルグレリン」とも称する。 「ァシル化」は、 3位アミノ酸の側鎖水酸基をァシル基、好ましくは脂肪酸残基で置換 することを意味する。また、「非修飾型ダレリン」とは 3位アミノ酸がァシルイ匕されていな いペプチドを意味し、単に「脱ァシルダレリン」とも称する。また、既述したように、ダレ リンの生理学的な活性を表す修飾型グレリンを「活性型グレリン」とも称する。
[0017] グレリンの生理学的機能の「レギュレーター」とは、グレリンをリガンドとする RHS-Rを 発現している生体に投与したとき、ダレリンの生理学的機能を強める、あるいは弱める 物質を意味する。ダレリンの生理学的機能を強める物質としては、ダレリンの 3位アミ ノ酸をァシルイ匕したときダレリンが生理学的に活性となるァシル基を有する、活性ィ匕 作用を有する脂肪酸が例示できる。一方、ダレリンの生理学的活性を弱める物質とし ては、ダレリンの生理学的活性になんら影響しないか、むしろ低下させるであって、上 記活性ィ匕作用を有する脂肪酸と競合してダレリンの 3位アミノ酸をァシルイ匕する脂肪 酸が例示できる。
[0018] 後述の実施例に記載のごとぐマウスの場合、中鎖脂肪酸 (MCFA)または中鎖トリア シルグリセロール（「中鎖トリグリセリド」とも 、う） (MCT)の 、ずれかの摂取は、総グレリ ン (ァシルグレリンと脱ァシルダレリン)濃度を変化させずにァシル修飾型ダレリンの産 生を増大した。マウスに MCFAまたは MCTのいずれかを与えた場合、非修飾 (初期） 型ダレリン分子に結合したァシル基の炭素鎖長は摂取した MCFAまたは MCTの炭素 鎖長に対応していた。対照的に、 n-プチリル基または n-パルミトイル基により修飾さ れたダレリンペプチドは、対応する短鎖脂肪酸 (SCFA)または長鎖脂肪酸 (LCFA)の 摂取後には検出されな力つた。さらに、 n-ヘプタン酸またはトリヘプタン酸グリセリル 摂取後のマウスの胃で n-ヘプタノィルダレリン (非天然形態のダレリン)が製造されて いた。これらの知見は、ダレリンのァシルイ匕に利用される脂肪酸は炭素鎖が一定であ ること、摂取した脂肪酸がダレリンのァシル修飾に直接利用されること、そしてダレリン のァシル修飾を触媒すると推定される酵素が、そのような特定の脂肪酸により親和性 である可能性を示している。ヒトダレリンやマウスダレリンのように、中鎖脂肪酸によつ て優先的にァシル化される場合、そのような酵素は、 SCFAまたは LCFAよりも MCFA に、より親和性である。
[0019] 中鎖脂肪酸によりダレリンがァシルイ匕されるマウスの場合、中鎖脂肪酸 (n-へキサン 酸、 n-オクタン酸および n-デカン酸)または中鎖トリグリセリド (トリへキサン酸グリセリル 、トリオクタン酸グリセリルおよびトリデカン酸グリセリル)の摂取は、対応する長さの炭 素鎖を有するァシル基により修飾されたダレリン (すなわち、 n-へキサノィルダレリン、 n-オタタノィルダレリンおよび n-デカノィルダレリン)の胃中濃度を上昇させた。また、ト リヘプタン酸グリセリル (哺乳動物細胞によっては合成できない)の摂取は、 n-ヘプタノ ィル修飾を有する非天然形態のダレリンの産生をもたらした。しかし、脂肪酸の摂取 によるダレリンの総生産 (ァシル修飾型および脱ァシル型のダレリン)は有意には上昇 しな力つた。これらの知見は、摂取した中鎖脂肪酸および中鎖トリグリセリドがダレリン のァシル修飾のための直接の脂質源であることを示している。
[0020] このように、摂取した脂肪酸およびトリグリセリドは、ダレリンのァシル修飾における 脂質源として利用されてァシル修飾型ダレリンの濃度に影響を及ぼすことから、グレリ ンの生理学的機能のレギュレーターとして機能することになる。より詳細には、グレリ ンの 3位アミノ酸に結合してダレリンの生理学的機能を高める脂肪酸は「正のレギユレ 一ター」である。一方、ダレリンの生理学的機能に影響しないか、阻害する脂肪酸は「 負のレギュレーター」である。
[0021] 以下、主として、 3位アミノ酸がセリンであるダレリンを例に挙げて本発明を説明する 力 3位アミノ酸がスレオニンであるダレリン同族体についても、本発明を適用し、同 様の効果を得ることができることは、当業者ならば容易に理解しうることである。
[0022] (1)グレリンの生理学的機能のレギュレーター
上記定義に従い、「ダレリンの生理学的機能のレギュレーター」として、ダレリン分子 の 3位アミノ酸 (例、 Ser(3))のヒドロキシル基とエステルを形成しうる脂肪酸部分を有 することにより、ダレリンの少なくとも 1つの機能を調節する物質を挙げることができる。
[0023] 本発明のレギュレーターの活性成分として使用できる脂肪酸には、炭素数 2〜35 の飽和または不飽和脂肪酸が含まれる。具体例として、炭素数が偶数のブタン酸（ C4)、へキサン酸（C6)、オクタン酸（C8)、デカン酸（C10)、ドデカン酸（C12)、テトラ デカン酸（C14)、へキサデカン酸（C16)、ォクタデカン酸（C18)、炭素数が奇数のぺ ンタン酸（C5)、ヘプタン酸（C7)、ノナン酸（C9)、ペンタデカン酸（C15)、ヘプタデカ ン酸 (C17)、それらのモノエンまたはポリェン脂肪酸等が挙げられる。より好ましくは 炭素数 4〜18、さらに好ましくは炭素数 6〜16の脂肪酸、最も好ましくは炭素数 6〜1 2の脂肪酸が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明のレギュレーターと しては、上記の脂肪酸を一種単独で、または複数種を混合して用いることができる。
[0024] レギュレーター力 ダレリンの生理学的機能を高める（上昇させる）「正のレギユレ一 ター」である場合、使用できる脂肪酸は、対象動物により異なるが、通常、炭素数が 4 〜12、好ましくは 6〜 12、より好ましくは 8〜 10のものである。
なお、「正のレギュレーター」は、上記の「活性型ダレリン」濃度上昇作用を有するこ と力ゝら、「活性型ダレリン形成促進剤」と、ほぼ同意義である。
[0025] レギュレーター力 ダレリンの生理学的機能を抑制する「負のレギュレーター」である 場合、使用できる脂肪酸は、対象動物により異なる力 通常、上記のポジティブレギ ユレ一ターとして例示した脂肪酸以外のものである。
[0026] 上記の例示は決定的なものではなぐ好適な範囲は対象動物により異なることが明 らかであり、上記のものよりも長い、または短い炭素鎖を有する脂肪酸により、ダレリン の生理学的活性を有する、または有さない修飾型ダレリンを生じ得る。そのような脂 肪酸またはその誘導体も本発明の範囲に包含される。
[0027] ヒトを対象とした場合、ダレリンの生理学的機能の一つである成長ホルモン分泌促 進作用につ 、て、 3位アミノ酸残基がオクタン酸 (炭素数 (C) 8)で修飾されたダレリン および Zまたはデカン酸 (炭素数 (C) 10)で修飾されたダレリンは成長ホルモン分泌 を活性化させる作用がある、すなわち正のレギュレーター (活性型ダレリン）として作 用するが、 3位アミノ酸残基がへキサン酸 (炭素数 (C) 6)で修飾されたダレリンは成長 ホルモン分泌に影響を与えない、すなわち負のレギュレーターであることが知られて いる。
この場合、本発明の活性型ダレリン形成促進剤として、炭素数が 8〜10の脂肪酸を 好適に用いることができる。中でも炭素数が 8のオクタン酸は、炭素数が 10のデカン 酸に比べて 3位のアミノ酸の水酸基とエステルを形成しやすい性質を有することから 、効率的な活性型ダレリン形成促進剤として用いることができる。
[0028] なお、上記は、ダレリンの生理学的作用の一つである成長ホルモン分泌促進作用 についてヒトを対象として好適な活性型ダレリン形成促進剤について説明したが、活 性型ダレリンは、対象動物やダレリンの生理学的作用により異なることは明らかであり 、上記のものよりも長い、または短い炭素鎖を有する脂肪酸が活性型ダレリン形成促 進剤となり得る。そのような脂肪酸またはその誘導体も本発明の範囲に包含される。
[0029] レギュレーターの活性成分である「脂肪酸の誘導体」の例としては、上記脂肪酸を 遊離するか、または生体内でダレリン分子の 3位アミノ酸の水酸基とエステルを形成し 得る任意の形態の、上記脂肪酸の誘導体が挙げられる。そのような誘導体は、また、 溶解性、消化管力 の吸収性、味や臭いの改善を目的として適宜塩やエステルの形 に変換してもよい。そのような誘導体の製造方法は医薬、食品、飼料等に関する製造 業の分野で周知であり、当業者ならば、 目的に応じて適当な誘導体を製造することが できる。 [0030] 「脂肪酸の誘導体」の好ましい例は、通常、類似の目的のために用いられるモノー またはポリ アルコールとのエステルである。特に、グリセリンは好ましいアルコール である。グリコシドの場合、モノ—、ジ—またはトリ—グリセリドまたはその混合物であつ てもよく、特に制限はないが、食品として認可されているトリグリセリドを好適に用いる ことができる。
[0031] 本発明のレギュレーターの活性成分としての脂肪酸またはその誘導体は、有機化 学の分野の当業者に公知の方法に従って製造することができる力、または市販の供 給源力 入手することができる。
[0032] (2)グレリンの生理学的機能
本発明のレギュレーターにより制御しうるダレリンの生理学的機能には、ァシルダレ リンの全生理学的機能が含まれ、例えば、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇作用
、成長ホルモン分泌促進作用、摂食促進作用、脂肪蓄積に関連した調節作用、心機 能改善作用または胃酸分泌刺激作用が挙げられる。特に成長ホルモンの放出、食 欲の刺激、肥満の誘発、心機能の改善、胃酸分泌などに深く関与しているが、これら に限定されない。本発明の正のレギュレーターはダレリンの生理学的機能を高めるこ とから、ダレリンまたはその類似体と同様の効果を表す。即ち、正のレギュレーターは 成長ホルモンの分泌促進、食欲の刺激、肥満の誘導、心機能の改善、胃酸の分泌 刺激等の効果を示しうる。
[0033] (3)グレリンの ¾学的機能のレギュレーターの禾 llffl i (^靠 成 )
本発明のレギュレーターは、ほ乳類、鳥類、魚類、両生類など、例えば、ヒト、ブタ、 ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ゥサギ、ラット、マウス、ィヌ、 -ヮトリ、ゥナギ、 -ジマス、力エル等 に対し、上記の効果を発現する医薬として使用することができる。
具体的には、摂食障害治療薬、成長ホルモン分泌促進薬、心疾患治療薬、胃機能 性疾患治療剤、腸管粘膜保護剤もしくは経静脈栄養時の小腸粘膜障害予防剤、骨 粗鬆症治療剤、慢性疾患による悪液質の減少剤、肺機能不全治療剤等として有用 である。特に、ヒトにおける骨粗鬆症、食欲不振、心疾患、リウマチおよび炎症性腸疾 患の予防または治療、および外科手術後の回復を促進するのに有用である。
[0034] 本発明の脂肪酸またはその誘導体は、それ自体が本発明のダレリンの生理学的機 能のレギュレーターとして機能するのでそのままで用いることができる力 取り扱いま たは適用の簡便さのため、脂肪酸またはその誘導体を適切な形態（当該分野で公知 の方法に従う液体および固体形態を含む)で処方することが好ま 、。例としては、 水性または非水性媒体 (希釈剤）中の液剤および懸濁剤、生理学的に許容可能また は製薬上許容可能なキャリアを有する散剤、顆粒剤または錠剤が挙げられる。そのよ うな医薬組成物は、例えば上記「ダレリンの生理学的機能」の項に記載の様々な動物 種におけるダレリンの機能を昂進または抑制することができ、同項に記載の治療効果 を挙げることができる。
[0035] 本発明のダレリンの生理学的機能のレギュレーターを医薬組成物中に処方する場 合、当業者既知の賦形剤、溶媒、担体、保存剤等を使用し、 自体既知の方法で製剤 化される。
本発明の医薬組成物は、医学または獣医学の分野で既知の方法により、経口また は非経口経路 (例えば、皮内、皮下、静脈内注射、点滴など)で投与することができる
[0036] 本発明のレギュレーターの投与量は、種々の因子 (選択した脂肪酸またはその誘導 体、投与経路、および処置する障害、年齢、体重、状態などを含む処置する被検体） に応じて変化し、通常は医師により決定される。脂肪酸に基づいて、 O.OOOlmg-1000 mgの間、好ましくは O.OOlmg- 100 mgの間、より好ましくは O.Olmg- 10mgである力 この ような範囲は限定的なものではない。また、対象がヒト以外の動物である場合は、投 与量は対象に応じて獣医師等により適宜決定される。
[0037] (4)グレリンの生理学的機能のレギュレーターの利用 2 (機能性食品）
本発明のレギュレーターは、副作用の恐れがないので機能性食品として、 日常的 に食欲の増進または抑制、肥満の解消、栄養不良の改善などのために用いることが できる。特に、体重のコントロールなどを通じて哺乳動物の健康状態をコントロールす るため、さらには動物の成長促進、食肉中の脂身の低減等のためにも使用できる。こ のように、本発明のレギュレーターは畜産、養鶏、魚類の養殖等においても有用であ る。
[0038] 本明細書中、「機能性食品」という語句は広義で用いられており、医薬品として定義 されて 、るものを除 、てヒトを含む動物が何らかの生理学的機能を期待して食するこ とができる食品を指す。具体的には、サプリメントのような製剤の形態で、本発明のグ レリン生理学的機能のレギュレーターである本発明の脂肪酸またはその誘導体を有 効成分とする食品、ならびに一般の食品に本発明のダレリン生理学的機能のレギュ レーターである脂肪酸またはその誘導体を 1成分として配合して、その食品に生体の ダレリンの生理学的機能のレギュレーター作用を付加してなる食品を挙げることがで きる。このような機能性食品としては、例えば、特定保健用食品（health promoting food)や条件付き特定保健機能用食品、栄養補助剤 (food supplement),栄養補助食 品（dietary supplement)の他、生体内のダレリンの生理学的機能を調節する（活性型 ダレリンの形成を促進する）、または生理学的機能に関連する障害を予防ないし抑制 するために用いられる旨の表示を付してなる食品が例示できる。 )
[0039] 本発明の脂肪酸またはその誘導体は、それ自体が本発明のダレリン生理学的機能 のレギュレーターとして機能するのでそのままで機能性食品として用いることができる 力 取り扱いまたは適用の簡便さのため、脂肪酸またはその誘導体を適切な形態（当 該分野で公知の方法に従う液体および固体形態を含む)で処方することが好まし 、。 例としては、水性または非水性媒体 (希釈剤）中の液剤および懸濁剤、生理学的に 許容可能または製薬上許容可能なキャリアを有する散剤、顆粒剤または錠剤が挙げ られる。
[0040] また、上記の本発明の脂肪酸またはその誘導体を 1成分として配合した機能性食 品の対象は何ら制限されないが、具体的には、アイスクリーム、アイスミルク、ラタトァ イス、シャーベット、氷菓等の冷菓類;乳飲料、乳酸菌飲料、清涼飲料 (果汁入りを含 む)、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜，果実飲料、スポーツ飲料、粉末飲料等 の飲料類；リキュールなどのアルコール飲料；コーヒー飲料、紅茶飲料等の茶飲料類 ；コンソメスープ、ポタージュスープ等のスープ類;カスタードプリン、ミルクプリン、果 汁入りプリン等のプリン類、ゼリー、ババロア及びヨーグルト等のデザート類；チューィ ンガムや風船ガム等のガム類 (板ガム、糖衣状粒ガム）；マーブルチョコレート等のコ 一ティングチョコレートの他、イチゴチョコレート、ブルーベリーチョコレート及びメロン チョコレート等の風味を付カ卩したチョコレート等のチョコレート類；ノヽードキャンディー（ ボンボン、バターボール、マーブル等を含む）、ソフトキャンディー（キャラメル、ヌガー 、グミキャンディー、マシュマロ等を含む）、ドロップ、タフィ等のキャラメル類；ノヽードビ スケット、クッキー、おかき、煎餅等の焼き菓子類;セパレートドレッシング、ノンオイル ドレッシング、ケチャップ、たれ、ソースなどのソース類；ストロベリージャム、ブルーべ リージャム、マーマレード、リンゴジャム、杏ジャム、プレザーブ等のジャム類；赤ワイン 等の果実酒；ハム、ソーセージ、焼き豚等の畜肉加工品；魚肉ハム、魚肉ソーセージ 、魚肉すり身、蒲鋅、竹輪、はんぺん、薩摩揚げ、伊達巻き、鯨ベーコン等の水産練 り製品；チーズ等の酪農製品類;うどん、冷麦、そうめん、ソバ、中華そば、スパゲッテ ィ、マカロニ、ビーフン、はるさめ及びワンタン等の麵類;その他、各種総菜及び麩、 田麩等の種々の加工食品を挙げることができる。
機能性食品中の本発明のレギュレーターの含量は、上記医薬組成物の項に記載 した投与量を参照し、製品の種類、形態、摂取する対象 (種、年齢層）等の因子を考 慮して当業者が適宜決定することができる。
[0041] 本発明の「正のレギュレーター」、具体的に「活性型ダレリン形成促進剤」は、細胞 内カルシウムイオン濃度の上昇作用や成長ホルモン分泌促進作用を有する機能性 食品として、極めて有用である。このような機能性食品は、成長ホルモン分泌促進作 用を介する作用、例えば、筋肉'骨格の増強、脂肪の減少、皮膚の若返り、疲労回復 などの生理効果を効率よく発揮することができ、副作用の心配もない。
活性型ダレリン形成促進剤は、上記したように、炭素数 6〜12の中鎖脂肪酸または その誘導体からなる。特に対象がヒトである場合、炭素数 8〜10の中鎖脂肪酸または その誘導体、最も好ましくは 8の中鎖脂肪酸またはその誘導体を含む。
[0042] (5)グレリンの生理学的機能のレギュレーターの利用 3 (予防または治療方法)
本発明のレギュレーターを用いてダレリンの生理学的機能に関連する障害を予防 または治療する方法は、レギュレーターそのもの、あるいはそれを含有する医薬組成 物または機能性食品をヒトまたはヒト以外の動物に与えることにより、当分野で公知の 方法に従って実施することができる。
[0043] 実施例
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明 の範囲を制限するものではな 、。 mm.
GH :成長ホルモン
GHS：成長ホルモン分泌促進物質
GHS-R：成長ホルモン分泌促進物質受容体
Ir:免疫反応性
RIA：ラジオィムノアッセィ
CHO：チャイニーズノヽムスター卵巣
[Ca2+]i：細胞内カルシウム濃度
AcOH :酢酸
HPLC：高速ェキタイクロマトグラフィー
RP:逆相
MALDI-TOF-MS：マトリックス支援レーザー脱離イオンィ匕飛行時間型質量分析 N-RIA:n-オタタノィルグレリンの N-末端フラグメント [1-11]のラジオィムノアッセィ C-RIA:グレリンの C-末端フラグメント [13-28]のラジオィムノアッセィ
MCFA:中鎖脂肪酸
MCT :中鎖トリグリセリド
LCFA:長鎖脂肪酸
LCT:長鎖トリグリセリド
SCT:単鎖トリグリセリド
実施例 1
( 1)材料および方法
1)グレリンのラジ才ィムノアッセィ
ダレリンに特異的な RIAは文献記載の方法に従って行った (文献 2)。ラットダレリン の N末端 (Ser3での Q-n-オタタノィルイ匕を有する Gly1- Lys11)フラグメントおよび C末端 (Gln13-Arg28)フラグメントに対する 2種類のポリクローナル抗体をゥサギ中で惹起させ た。 RIAインキュベーション混合物は、標準ダレリンまたは未知のサンプル 100 1と、 0.5%正常ゥサギ血清を含む RIA緩衝液 (50mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.4)、 0.5% ゥシ血清アルブミン (BSA)、 0.5%Triton- X100、 80mM 塩化ナトリウム (NaCl)、 25mM エチレンジァミン四酢酸 2ナトリウム (EDTA-2Na)および 0.05%アジ化ナトリウム (NaN
3
》で希釈した抗血清 200 1とから構成した。抗ラットグレリン [1-11]抗血清および抗ゥ サギダレリン [13-28]抗血清は、それぞれ、最終希釈倍率 1/3,000,000および
1/20,000で用いた。 4°Cで 12時間インキュベーションした後、 1251-標識したリガンド 100 μ 1(20,000 cpm)をカ卩えてさらに 36時間インキュベーションした。次いで、抗ゥサギヤギ 抗体を 100 1カ卩えた。 4°Cで 24時間インキュベーションした後、 3,000rpmで 30分間遠 心分離することにより遊離トレーサーおよび結合型トレーサーを分離した。ペレットの 放射活性をガンマカウンター (ARC- 600, Aloka, Tokyo)で定量した。アツセィは全て 4 °Cで 2連で行った。
[0045] 両方のタイプの抗血清は、ヒト、マウスおよびラットダレリンと完全な交差反応性を示 した。ダレリンの Ser3 n-オタタノィルイ匕部位を特異的に認識する抗ラットグレリン [1-11] 抗血清は脱ァシル型ダレリンを認識しなカゝつた。 N-RIAの n-デカノィルダレリンおよび n-へキサノィルダレリンに対する交差反応性は、それぞれ、 20%および 0.3%である。 抗ラットグレリン [13-28]抗血清は、ダレリンペプチドの脱ァシル型および全ァシル型 の両方を等しく認識した。以下の項では、ラットダレリンの N末端フラグメント [1-11]に 対する抗血清を用いる RIAシステムを N-RIAと称し、他方、 C末端フラグメント [13-28] に対する抗血清を用いる RIAシステムを C- RIAと称する。
[0046] 2)グレリンのカルシウム動員アツセィ
アツセィ前に、ラット GHS- R (グレリンレセプター)を安定に発現する CHO- GHSR62細 胞 (1)を 4 X 104細胞/ゥエルで平底 96ゥヱルプレート (黒色）（Corning Costar
Corporation, Cambridge, MA)に 12〜15時間、プレーティングした。次いで、細胞を、 1 %ゥシ胎仔血清 (FCS)を補充したアツセィ緩衝液 (ノ、ンタスの平衡塩類溶液 (HBSS) 、 10mM HEPES、 2.5mMプロべネシッド)に溶解した 4 M Fluo- 4- AM蛍光指示色素 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)と共に 1時間プレインキュペートした。アツセィ 緩衝液で 4回洗浄した後、 0.01%ゥシ血清アルブミンを有する塩基性緩衝液 100 1 に溶解した各サンプルを、調製した細胞に加えた。 FLEXステーション (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて細胞内カルシウム濃度の変化を測定した。
[0047] 3)グレリンアツセィのための胃サンプルの調製 マウスおよびラットのいずれかから回収した胃をリン酸緩衝ィ匕生理食塩水 (pH7.4)で 2回洗浄した。各サンプルの湿重量を測定した後、全胃組織を細力べ刻み、内因性プ 口テアーゼを不活ィ匕するために 10倍容量の水中で 5分間煮沸した。氷上で冷却した 後、煮沸したサンプルを 1M酢酸- 20mM塩酸 (HC1)に調節した。ペプチドをポリトロン ミキサー（PT 6100, Kinematica AG., Littan- Luzern, Switzerland)を用いるホモジネ ーシヨンの後、抽出した。 15,000rpm(12,000 X g)で 15分間遠心分離した後、単離した 抽出物の上清を凍結乾燥し、 -80°Cで保存した。凍結乾燥サンプルは、ダレリン RIA またはカルシウム動員アツセィに先立って、それぞれ、 RIA緩衝液またはカルシウム 動員アツセィ緩衝液に再溶解した。
[0048] 4)ダレリンアツセィ用血漿サンプルの調製
血漿サンプルを、既述した通りに調製した (文献 2)。全血サンプルを直ちに EDTA-2Na (1 mg/ml)およびァプロチュン (1,000カリクレイン不活化剤単位
(inactivator unit)/ml)を含む冷ポリプロピレンチューブに移し、 4°Cで遠心分離した。 血漿の分離直後に、塩化水素をサンプルに終濃度 0.1Nで加え、次いで等量の生理 食塩水で希釈した。サンプルを 0.1%トリフルォロ酢酸（TFA)および 0.9%塩ィ匕ナトリウ ム (NaCl)で予め平衡化した Sep- Pak C18カートリッジ (Waters, Milford, MA)に充填し た。カートリッジを 0.9%塩化ナトリウム (NaCl)および 5%ァセトニトリル（CH CN)/0.1%
3 トリフルォロ酢酸（TFA)で洗浄し、次いで 60% CH CN/0.1%TFAで溶離した。次い
3
で、溶出液を凍結乾燥し、残留物質を 1M酢酸 (AcOH)に再溶解し、 1M酢酸 (AcOH)で予め平衡化した SP- Sephadex C- 25カラム (H+-形態， Pharmacia, Uppsala, Sweden)に吸着させた。 1M AcOH, 2Mピリジンおよび 2Mピリジン- AcOH (pH 5.0)を 用いて連続的に溶離することにより、 3つの画分、 SP-I、 SP-IIおよび SP-IIIを得た。 SP- III画分をエバポレートし、 1M AcOHに再溶解し、 C18 RP- HPLC (Symmetry 300, 3.9 X 150mm, Waters)により分離した（10〜60% CH CN/0.1%TFAの線形勾配、流
3
速 1.0 ml/分、 40分間）。 500 リットルずつ分画した。各画分中のグレリンペプチド含 量を、上記のダレリン C- RIAにより測定した。
[0049] 5)遊離脂肪酸またはトリァシルグリセロール（中鎖トリグリセリド)摂取後のダレリンの 濃度およびァシル修飾 体重 20〜25gの雄性 C57BL/6Jマウス (10〜12週齢)を、制御した温度 (21〜23°C)お よび光条件 (light on 0700-1900)の下で、自由に餌および水を摂取させて飼育した。 中鎖脂肪酸 (MCFAs)、すなわち、 n-へキサン酸、 n-オクタン酸および n-ラウリン酸 (Sigma- Aldrich Japan Co. Ltd., Tokyo)を 5mg/mlで水に溶解した。 n-パルミチン酸（ 一般的な長鎖脂肪酸 (LCFA) (Sigma-Aldrich Japan Co. Ltd., Tokyo))を標準的な実 験用飼料 (CLEA Rodent Diet CE- 2, CLEA Japan, Osaka)に濃度 1% (w/w)で混合し て食餌中に含まれるこの脂質と他の中鎖脂肪酸の総取込量を平衡ィ匕した。中鎖およ び長鎖トリグリセリド (MCTおよび LCT)であるトリへキサン酸グリセリル、トリオクタン酸 グリセリル、トリデカン酸グリセリルおよびトリパルミチン酸グリセリル（Wako Pure Chemical, Osaka, Japan)を標準実験用飼料に濃度 5%(w/w)で混合した。遊離脂肪 酸またはトリァシルグリセリドを含有する食品を摂取した後、一定の時点 (0〜14日)で 処置マウス力 全胃組織を回収した。これらのマウス力 の新し 、組織サンプルをさ いの目に切り、 10倍体積の水中で 5分間煮沸した。次いで、冷却後、組織含有溶液 を 1M酢酸に調節した後、 Polytronミキサーでホモジナイズした。 15,000rpmで 15分間 遠心分離した後、得られた上清を凍結乾燥した。凍結乾燥物質を RIA緩衝液に溶解 し、グレリン C- RIAおよび N- RIAにかけた。種々のァシル基により修飾されたグレリン ペプチドの形態を解明するために、抽出した胃ペプチドを Sep-Pak Plus C18カートリ ッジ (Waters, Milford, MA)を用いて回収し、 C18 RP- HPLC (Symmetry 300, 3.9 X 150 mm, Waters)に供した（10〜60% CH CN/0.1% TFAの線形勾配、流速 1.0ml/分
3
、 40分間）。 500 /z lずつ分画した。各画分中のダレリンペプチド含量を、上記のように ダレリン C-RIAおよび N-RIAにより測定した。抽出の間、ダレリンの分解は観察されな かった。
6)ノザンブロット分析
TRIzol試薬 (Invitrogen, Carlsbad CA, USA)を用いて、酸グァ-ジンチオシァネート —フエノールクロ口ホルム抽出法 (文献 24)により雄性 C57BL/6Jマウス (12週齢)の胃か ら全 RNAを抽出した。全 RNA2 μ gをホルムアルデヒド含有 1%ァガロースゲルで電気 泳動し、次いで Zeta- Probeブロッテイングメンブレン (Bio- Rad Laboratories, Hercules, CA)に移した。メンブレンを 50%ホルムアミド、 5 X SSPE、 5 Xデンハート溶液、 1%ド デシル硫酸ナトリウム (SDS)および変性サケ精子 100 μ g/mlを含有するハイブリダィゼ ーシヨン緩衝液中で32 P標識ラットダレリン cDNAプローブを用いてハイブリダィズさせ た。 37°Cでー晚ハイブリダィゼーシヨンした後、メンブレンを洗浄し、 BioMax-MSフィ ルム (Eastman Kodak, Rochester, NY)に 12時間、 - 80°Cで暴露させた。グレリン mRNA レベルを、バイオイメージングアナライザー（Bioimaging analyzer) BAS 2000 (Fujix, ToKyoJapan)を用い飞疋量しに。
[0051] 7) n-ヘプタノィルグレリンの精製
n-ヘプタノィルグレリンを、既述の抗ラットグレリン [1-1 l]IgGィムノアフィ-ティーク口 マトグラフィ一によるダレリン精製 (文献 22)と同じ方法を用いて精製した。精製の間、 FLEXステーション (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて、ラット GHS- R (グレリ ンレセプター）（CHO- GHSR62)を安定に発現する細胞株内の細胞内カルシウム濃度 における変化を測定することによりダレリン活性をアツセィした。また、ダレリン C-RIA システムを用いてサンプル中のダレリン免疫反応性をモニターした。
[0052] 体重 20〜25gの雄性 C57BL/6Jマウスを、制御温度下 (21〜23°C)および光条件下 (light on 0700-1900)で、自由に餌および水を摂取させて飼育した。トリヘプタン酸グ リセリル (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Switzerland)を標準実験用飼料に 5%(w/w)の 濃度で混合した。マウスにトリヘプタン酸グリセリル含有飼料を与えた 4日後、マウス 力 胃 (合計 1,000 mg)を回収した (n=7)。トリヘプタン酸グリセリル含有飼料の総消費 はおよそ 13.5 g/マウスであり、各マウスが摂取したトリヘプタン酸グリセリルは合計 675mgになる。胃を細力べ刻み、内因性のプロテアーゼを不活性ィ匕するために 5倍体 積の水の中で 5分間煮沸した。次いで、胃組織溶液を 1M酢酸 (AcOH)-20 mM HC1 に調節し、 Polytronミキサーでホモジナイズした。 20,000rpmで 30分間遠心分離した 後に得た、これらの抽出物の上清を、 0.1%トリフルォロ酢酸 (TFA)で予め平衡ィ匕した Sep-Pak C18エンバイ口メンタル環境カートリッジ (Waters, Milford, MA)のカートリッジ に充填した。 10%ァセトニトリル (CH CN)/0.1%TFAで洗浄した後、ペプチド画分を
3
60% CH CN /0.1% TFAで溶離した。溶出液をエバポレートし、凍結乾燥した。残留物
3
質を 1M AcOHに再溶解し、 1M AcOHで予め平衡化した SP- Sephadex C- 25カラム 丁开態、 Pharmacia, Uppsala, Sweden)に吸着させた。 1M AcOH, 2Mピリジンおよ び 2Mピリジン- AcOH (pH 5.0)での連続溶離により、 3つの画分、 SP-I、 SP-IIおよび SP- IIIを得た。凍結乾燥した SP- III画分を Sephadex G- 50ファインゲル (fine gel)-ろ過 カラム（1.9 X 145cm) (Pharmacia, Uppsala, Sweden)に力けた後、 5 mLづっ分画した。 各画分の一部を CHO-GHSR62細胞を用いるグレリンカルシウム-動員アツセィにかけ た。 Sep-Pak C18ライトカートリッジを用いて回収した、単離した活性画分 (47〜51番） の半分を凍結乾燥し、 100 mMリン酸緩衝液 (1.0 ml、 pH 7.4)に溶解し、抗ラットグレリ ン [1-11] IgG免疫親和性クロマトグラフィーに供した。吸着した物質を 10%CH CN
3
/0.1%ΤΡΑ(500 /ζ 1)で溶離した。溶出液をエバポレートし、次いで RP- HPLC (Symmetry 300, 3.9 X 150 mm, Waters, Milford, MA)により分離した。 n-ヘプタノィル 修飾型ダレリンを、保持時間 18.4分で精製し、質量分析法により分子量を決定した。 精製ペプチドのアミノ酸配列をタンパク質配列決定機 (494, Applied Biosystems, Foster City, CA)で解析した。
[0053] 8) n-ヘプタノィルダレリンの質量分光分析
Voyager DE- Pro分光機 (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、マトリック ス支援レーザー脱離イオンィ匕飛行時間型質量分析 (MALDI-TOF-MS)を行った (文 献 25)。質量スペクトルは加速電圧 20 kVで反射モードで記録した。 60%ァセトニトリル (CH CN)および 0.1%トリフルォロ酢酸（TFA)中の飽和 α -シァノ -4-ヒドロキシ桂皮酸
3
を作業マトリックス溶液として用いた。最終精製サンプル約 lpmolをマトリックス溶液と 混合し、サンプルプローブ上に載せ、風乾した後、分析した。全質量スペクトルを、平 均 100スペクトルの陽イオンモードで得た。
[0054] (2)実験および結果
1) n-オタタノィルダレリンの胃含量に対する遊離脂肪酸摂取の影響
ダレリンのァシル修飾型に対する遊離脂肪酸摂取の影響を試験するために、 n-へ キサン酸 (C6)、 n-オクタン酸 (C8)、 n-ラウリン酸 (C12)または n-パルミチン酸 (C16)と水 を与えたマウスおよび標準的な餌と水を与えた正常コントロールマウス (コントロール） の胃から胃ペプチドを抽出した。摂取後、ァシル修飾型ダレリンおよび総 (ァシル修飾 型および脱ァシル型)ダレリンの濃度を測定した。ァシル修飾型ダレリンは N-RIAによ り測定し、総ダレリンは C- RIAにより測定した。結果を図 1に示す。 [0055] Aはダレリン N-RIA (n=8)により測定したァシル修飾型ダレリン濃度を表す。 N-RIA はァシル修飾型ダレリンに非常に特異的であり、ァシルイ匕ダレリンの主な形態は n-ォ クタノィルダレリンなので、 N-RIAにより測定したァシル修飾型ダレリン濃度は主に n- オタタノィルダレリン集団を反映している。 Bはダレリン C- RIA (n=8)により測定した総 ダレリン濃度を表す。総ダレリン濃度は、ァシル型および脱ァシル型の両グレリンを含 む。 Cはァシル修飾型ダレリン Z総ダレリンの比を表す。データは、胃抽出物におけ るダレリン濃度の平均値士 S.D.を表す (湿重量 lmgから)。統計学的有意差はァスタリ スクで示した。 *, pく 0.01 ; **, pく 0.001対コン卜ロール o
[0056] 図 1から、 n-デカノィルグレリンおよび n-へキサノィルグレリンの胃含量は n-オタタノ ィルダレリンと比較して低ぐ n-デカノィル修飾型ダレリンおよび n-へキサノィル修飾 型ダレリンに対する N-RNAの交差反応性は、それぞれ、 20%および 0.3%であること が分かる。これは、 N-RIAにより測定したァシル修飾型ダレリンの濃度が主に n-オタタ ノィルダレリンを反映していることを意味する。実験期間の間 (0〜14日）、脂肪酸摂取 群およびコントロール群の間で、マウス体重または合計食餌消費量の 、ずれにも顕 著な差異は観察されなカゝつた。
[0057] マウスに n-へキサン酸、 n-オクタン酸、 n-ラウリン酸または n-パルミチン酸を 14日間 与えた後、ァシル修飾型ダレリンおよび総ダレリンの胃濃度を通常の餌および水を与 えたコントロールマウスにおける濃度と比較した。ァシル修飾型ダレリンの胃濃度は、 n-オクタン酸を与えたマウスにおいて顕著に上昇した (図 1A)。胃中のァシル修飾型 ダレリンの平均濃度は、それぞれ、通常の飼料を与えたコントロールラットでは 1,795 ftnol/湿重量 lmgであり (n=8)、 n-オクタン酸含有飼料を与えたマウスでは 2,455ftnol/ 湿重量 lmgであった（n=8)。 C-RIAにより測定した総ダレリン濃度には顕著な差異は 観察されなかった（図 1B)。すなわち、 n-オタタノィルダレリン/総ダレリンの比は、 n- オクタン酸を与えたマウスで上昇した (図 1C)。 n-へキサン酸、 n-デカン酸または n-パ ルミチン酸を与えたマウスの胃におけるァシル修飾型ダレリンまたは総ダレリンの!/ヽ ずれの含量についても、顕著な変化は検出されな力つた。このように、外来性の補充 n-オクタン酸は、総 (ァシル修飾型および脱ァシル型)ダレリンペプチドを上昇させるこ となく n-オタタノィルダレリンの胃濃度を上昇させた。これらの結果は、摂取した n-オタ タン酸がダレリンのァシル修飾を刺激したことを示唆している。
[0058] 2)ァシル修飾型ダレリンの胃含量に対する中〜長鎖トリアシルグリセロール（トリダリ セリド)摂取の影響
経口摂取したトリァシルグリセロールは、管腔内で加水分解され、胃腸粘膜を介し て遊離脂肪酸またはモノグリセリドとして吸収される。従って、摂取したトリァシルダリ セロールは遊離脂肪酸原として機能しうる (文献 26)。摂取したトリァシルグリセロール がダレリンのァシル修飾に用いられるか否かを試験するために、マウスに 5%(w/w)の トリへキサン酸グリセリル (C6)、トリオクタン酸グリセリル (C8)、トリデカン酸グリセリル (C10)またはトリパルミチン酸グリセリル (C16)と混合した餌を与えた。 2週間後、胃ぺプ チドを抽出した。マウスの胃と標準的な実験用飼料 (コントロール)を与えたマウスの胃 におけるダレリン濃度 (n= 8)を示す。ァシル修飾型ダレリンおよび総ダレリンの含量は 、 N-および C-RIAにより測定した。結果を図 2に示す。
[0059] Aはダレリン N-RIAにより測定したァシル修飾型ダレリン濃度を表す。 Bはダレリン C-RIAにより測定した総ダレリン濃度を表す。データは胃抽出物におけるダレリン濃 度の平均値士 S.D.を表す (湿重量 lmg)(n= 5)。 Cはァシル修飾型ダレリン Z総グレリ ン濃度の比を表す。データは計算した比の平均値士 S.D.を表す (n= 5)。統計学的有 意差はアスタリスクにより示した。 *, p< 0.05; **, p< 0.01対コントロール。
[0060] 図 2は、トリオクタン酸グリセリル摂取が胃組織内のァシル-修飾型ダレリンの産生を 刺激することを示している (図 2A)。対照的に、トリへキサン酸グリセリルの摂取は、ァ シル修飾型ダレリンの産生をわずかに抑制した。し力しながら、トリへキサン酸ダリセリ ルを与えたマウスは、 n-へキサノィルダレリンの濃度の上昇を示した (図 2A、表 1)。トリ デカン酸グリセリルおよびトリパルミチン酸グリセリルの摂取は、ァシル修飾型ダレリン の産生に影響を及ぼさな力つた（図 2A)。さらに、ダレリン（脱ァシル型ダレリンおよび ァシル修飾型ダレリン)の総胃濃度における顕著な変化は、独立した 5つのマウス群 では観察できな力つた（図 2B)。ァシル修飾型ダレリン Z総ダレリンのモル比はトリへ キサン酸グリセリル処置マウスで顕著に減少し、トリデカン酸グリセリル処置マウスで 増加した (図 2C)。実験期間の間 (0〜2週)、トリァシルグリセロール投与群およびコン トロール群の間では体重または総食餌消費量に顕著な差異は観察されな力つた。 [0061] 3)トリグリセロール摂取後のダレリンペプチドの分子形態
トリァシルグリセロール（トリァシルグリセリン）の摂取後、ダレリンペプチドがどのよう な分子形態で存在するかを明らかにするために、トリへキサン酸グリセリル
(C6:0- MCT)、トリオクタン酸グリセリル (C8:0- MCT)、トリデカン酸グリセリル
(C10:0-MCT)を含有する飼料または標準実験用飼料 (コントロール)を与えたマウスの 胃抽出物を HPLCにより分画し、 C-RIAによりダレリン免疫反応性を測定した。この分 析により、トリへキサン酸グリセリル、トリオクタン酸グリセリルおよびトリデカン酸グリセリ ルを摂取したマウスからの胃抽出物中のダレリンの分子形態が明らかになった（図 3) 。合成ァシル修飾型ダレリンペプチドについて観察された保持時間に基づくと、ピー ク&、 d、 hおよび kは脱ァシル型ダレリンに対応し、ピーク b、 f、 iおよび 1は n-オタタノィル (C8:0)グレリンに対応し、ピーク c、 g、 jおよび mは n-デセノィル (decenoyl) (C10:l)グレ リンに対応する。
[0062] トリオクタン酸グリセリルの摂取は、 n-オタタノィルダレリンの産生を刺激した (図 3の ピーク 0。 n-オタタノィル /総ダレリンのモル比は処置マウスでの 60%を超える (表 1)。こ の高い n-オタタノィルダレリン比は、通常の餌と水を与えたマウスでは観察されなかつ た (表 1)。 n-オタタノィルダレリンの胃含量は、 n-オクタン酸摂取後にも上昇し、トリオク タン酸グリセリルおよび n-オクタン酸は両方とも n-オタタノィルダレリンの産生を刺激 することが分った。
[0063] n-へキサノィルダレリンは、通常の餌を与えたマウスの胃では極めて低濃度し力検 出されなかった。しかし、マウスにトリへキサン酸グリセリルを与えた場合、 n-へキサノ ィルダレリンの胃濃度は劇的に上昇した (ピーク 。これらのマウスでは、コントロール マウスにおける測定値 (図 3のピーク bおよび表 1)と比較して、 n-オタタノィルダレリン 濃度の顕著な減少も検出された（図 3のピーク 1¾よび表 1)。 n-へキサノィルダレリン の量は n-へキサン酸摂取後にも上昇した（データは示さず)。
[0064] また、マウスにトリデカン酸グリセリルを与えた場合、 n-デカノィルダレリンの胃濃度 は上昇した（ピーク n)。
[0065] さらに、合成 n-ブタノィル (C4:0)グレリン、 n-ドデカノィル (C12:0)グレリンおよび n-パ ルミトイル (C16:0)ダレリンと同じ保持時間で溶離するダレリンピークは、トリ酪酸グリセ リル、トリラウリン酸グリセリルまたはトリパルミチン酸グリセリルを与えたマウスの胃抽出 物では観察されな力つた。これらのデータは、トリ酪酸グリセリルまたはトリパルミチン 酸グリセリルは 、ずれもマウスにぉ 、てダレリンに変換されな力つたことを示して 、る。 表 1 :中鎖 (C6:0〜C10:0)トリグリセリド摂取後のマウス胃における脱ァシル型ダレリン ペプチドおよびァシル修飾型ダレリンペプチドの濃度（fmolZmL)
[0066] [表 1]
Figure imgf000028_0001
雄性 C57BL/6Jマウスに、 5%(w/w)トリへキサン酸グリセリル (C6:0- MCT)、トリオクタ ン酸グリセリル (C8:0-MCT)またはトリデカン酸グリセリル（C10:0-MCT)を混合した餌 を 14日間与えた。胃サンプル (湿重量 0.2mg)由来の脱ァシル型ダレリン、 n-へキサノ ィルグレリン (C6:0-グレリン)、 n-オタタノィルグレリン (C8:0-グレリン)、 n-デセノィルグ レリン (C10:l-グレリン)および n-デカノィルグレリン (C10:0-グレリン)の濃度は、 HPLC 分画後にダレリン C-RIAにより測定した。データは、 4連サンプルの平均値士 S.D.を 表す。
a) :p< 0.001、 b) :p< 0.05および c) :p< 0.01対コントロール。
( *：精製後、同じ画分に n-デセノィルダレリンとは別の少なくとも 2つの未確認のダレ リン分子が観察された。 )
[0067] 4)トリオクタン酸グリセリル摂取後のァシル修飾型ダレリン産生の時間経過（タイムコ ース）
トリオクタン酸グリセリル摂取後の n-オタタノィルダレリン産生の時間依存性の変化 を調べるために、 12時間絶食させたマウスにトリオクタン酸グリセリル含有飼料 (5%、 w/w)を与えた。次いで、一定時間後のァシル修飾型ダレリンおよび総ダレリンの胃濃 度を測定した。結果を図 4に示す。
[0068] Aはダレリン N-RIAにより測定したァシル修飾型ダレリン含量、 Bはダレリン C- RIAに より測定した総ダレリン含量を表す。絶食 12時間後、トリオクタン酸グリセリル (5%w/w) 含有飼料をマウスに与えた。矢印は開始時点 (0時間)を示している。胃サンプルを、 記載した時点で標準実験用飼料を与えたコントロールマウス (黒丸)およびトリオクタ ン酸グリセリルを与えたマウス（白丸)から単離した。各点は平均値士 S.D.で示してい る (n=8)。統計学的有意差はアスタリスクで示した。 *、 p< 0.05; **、 p< 0.01および 、 pく 0.001対コン卜ロール o
[0069] 図から明らかに、トリオクタン酸グリセリル摂取 3時間後にァシル修飾型ダレリンの胃 含量が上昇していた。トリオクタン酸グリセリルを連続的に与えると、マウス胃の n-オタ タノィルダレリン濃度は上昇した。濃度は徐々に上昇して摂取開始 24時間後に最大 レベルとなった。摂取 14日後のァシル修飾型ダレリンの胃濃度は、通常の餌を与えた マウスよりも顕著に高いままであった (図 4A)。対照的に、これらの条件下では、 C-RIA により測定した総ダレリンの胃含量に顕著な変化は観察されな力つた (図 4B)。
[0070] 5)トリオクタン酸グリセリル摂取後のダレリン mRNA発現
MCTの摂取がダレリン mRNAの発現に影響を与えるか否かを調べるために、トリオク タン酸グリセリル含有飼料の摂取の 4日後にノザンブロット分析によりマウス胃 mRNA を定量した。結果を図 5に示す。
各レーンは全 RNAを 2 μ g含む。下方のパネルは 28Sおよび 18Sリボソーム RNA内部 コントロールを示す。
図 5は、トリオクタン酸グリセリル摂取後、胃ダレリン mRNAの発現レベルが変化しな いことを示している。また、トリオクタン酸グリセリルは総ダレリン濃度を変化させること なく n-オタタノィルダレリンの胃含量を上昇させたことから、トリオクタン酸グリセリルの 摂取は、ダレリンペプチド合成におけるオタタノィル修飾工程のみを刺激したことにな る。
[0071] 6)トリヘプタン酸グリセリル摂取後のダレリンペプチドの分子形態
摂取した遊離脂肪酸がダレリンのァシル修飾に直接使用される可能性を調べるた めに、マウスに、天然の食餌源には存在せず、哺乳動物体内でも合成されない中鎖 トリグリセリド (MCT)を与えた。トリヘプタン酸グリセリルの加水分解型である n-ヘプタン 酸 (C7:0)が天然では哺乳動物体内に存在しないことから、非天然の遊離脂肪酸原と してトリヘプタン酸グリセリルを選択した。なお、 n-ヘプタノィルダレリンは天然ダレリン 力も HPLCにより簡単に分離されると思われる。結果を図 6に示す。
[0072] トリヘプタン酸グリセリルで処置したマウスの胃抽出物を HPLCにより分画した (上方 パネル)。各画分 (胃組織 0.2mg当量)におけるダレリン濃度を C- RIA (中央パネル)およ び N-RIA (下方パネル)によりモニターした。棒グラフで表すように、ダレリン免疫反応 性は、 C-RIAにより 3つの主なピーク (中央パネル、ピーク a、 bおよび c)に分離し、 N-RIAにより 2つの主なピーク (ピーク dおよび e)に分離した。ピーク bおよび dはトリヘプ タン酸グリセリルの摂取後にのみ観察された。
[0073] 検出された幾つかの免疫反応性ピーク中、単離されたダレリンペプチドの保持時間 に相当するピーク aおよびピーク cは、それぞれ、脱ァシル型ダレリンおよび n-オタタノ ィルダレリンに対応していた (図 6)。ピー外のダレリン免疫反応性はトリヘプタン酸ダリ セリルを与えたマウスでのみ観察され、試験した他の遊離脂肪酸またはトリグリセリド (n-へキサン酸、 n-オクタン酸、 n-ラウリン酸、 n_パルミチン酸または対応するトリグリセ リド形)のいずれを与えたマウスでも観察されな力つた。ピーク bの保持時間は、 n-へ キサノィルダレリンと n-オタタノィルダレリンの間であった。
[0074] ダレリン N- RIAにより測定した HPLC画分は、ピーク dおよび eで見 、だされた 2つの ァシル修飾型ダレリンの免疫反応性を示した。 HPLCにおける合成 n-オタタノィルグ レリンの保持時間に基づき、ピーク eは n-オタタノィルダレリンに対応していた。ピーク dの保持時間は、上記の C-RIA分析におけるピー外の保持時間と同一であった。 N- RIAにより測定したピーク dの濃度（74.9 ftnol/チューブ)は、 C-RIAにより測定した ピーク bから推測される濃度 (466.3ftnol/チューブ)よりも低い。これらのデータは、ピー ク d (およびピーク b)の免疫反応性ダレリンが恐らく n-オタタノィル基で修飾されていな いことを示している。上記の知見に基づくと、免疫反応性のピーク bおよび dは、おそ らく n-ヘプタノィルダレリンである。同じダレリン免疫反応性のピーク (ピーク bおよび d) を、 n-ヘプタン酸を与えたマウスの胃抽出物力 も検出した (データは示さず)。
[0075] 7) n—ヘプタノィルグレリンの精製
摂取したトリヘプタン酸グリセリルがダレリンの n-ヘプタノィル修飾に直接用いられる か否かを確認するために、トリヘプタン酸グリセリル含有飼料を 4日間与えたマウスの 胃組織力ゝらァシル修飾型ダレリンを精製した。抗ラットグレリンィムノアフィ-ティカラム 力も溶出したサンプルを HPLCに供した。結果を図 7に示す。
[0076] ピーク aはトリヘプタン酸グリセリルで処置したマウス由来のサンプルにおいてのみ 観察された。 HPLCの保持時間および MALDI- TOF- MS分析に基づくと、ピーク bは n- オタタノィルダレリンに対応していた。矢印はそれぞれ、 n-へキサノィル (1)、 n-オタタノ ィル (Π)および n-デカノィル (III)ダレリンの溶出位置を表す。
[0077] 処置マウスの胃由来のダレリンペプチドの最終精製により、図 7のピーク bを HPLCに おける保持時間から、 n-オタタノィルダレリンと同定した。保持時間 18.4分で溶離する 他のピーク (図 7のピーク a)は、トリヘプタン酸グリセリル摂取後にのみ観察された。こ のピークは、 n-へキサノィルダレリンと n-オタタノィルダレリンの間の保持時間で溶出 した。このピーク aのペプチドを精製し、アミノ酸配列決定分析および質量分析にかけ た。
[0078] HPLCのピーク a (図 7)から得た精製ペプチドは 28アミノ酸からなり、マウスグレリンの アミノ酸配列と同一であった。図 7のピーク aから精製したダレリン様ペプチドのマトリツ タス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析に今日した。結果を図 8Aに示 す。
結果は、質量が、 3131.0〜3477.0 (m/z)の範囲に及ぶことを示している。陽イオンモ ード (平均 [M+H]+ : 3301.9)で得た平均 100質量スペクトルから、ピーク aペプチドの分 子量は 3300.9であると計算した。 B. n-ヘプタノィル (C7:0)グレリンの構造。 n-ヘプタノ ィルグレリンの分子量計算値は 3300.86である。
[0079] Bは n-ヘプタノィル (C7:0)グレリンの構造を示す。 MALDI- TOF- MSの m/z値から計 算したペプチドの推定分子量は 3300.9であった。 Ser3残基でのグレリンの n-ヘプタノ ィル基における修飾は、理論上約 3300.86の分子量を生じる (図 8B)。これは、 MALDI-TOF-MSで測定した分子量とほぼ同じである。従って、ピーク aにおける精製 ペプチドは n-ヘプタノィルダレリンであると結論された。最終精製工程では、さらなる ピークは観察されな力つた力 これは摂取したトリヘプタン酸グリセリル力も加水分解 された n-ヘプタノィル基がダレリンの Ser3残基に直接転移され得ることを示している。
[0080] 8)トリヘプタン酸グリセリル摂取後の循環ダレリンペプチドの分子形態 トリヘプタン酸グリセリル摂取後にマウスの胃で合成された非天然型 n-ヘプタノィル ダレリンが循環中に分泌されて 、る力否かを試験するために、トリヘプタン酸グリセリ ル含有飼料を 4日間与えたマウスの血漿由来のァシル修飾型ダレリンの分子形態を 決定した。即ち、標準飼料を与えたコントロールマウス (A)およびトリヘプタン酸グリセ リル処置マウス (B)から回収した血漿サンプルを HPLCにより分画し、 C- RIAによりグレ リン免疫反応性を測定した。結果を図 9に示す。
矢印は脱ァシル型ダレリン (I)および n-オタタノィルダレリン (Π)の溶出位置を表す。 血漿ダレリンの免疫反応性は棒グラフで表した。
[0081] コントロールマウスにおける血漿グレリン免疫反応性は 2つの主ピーク (図 9Aにおけ るピーク aおよび b)と 1つの小さいピーク (図 9Aのピーク c)に分離した。トリヘプタン酸グ リセリル処置マウスにおける血漿ダレリン免疫反応性は 2つの主ピーク (図 9Bにおける ピーク dおよび e)と 2つの小さいピーク (図 9Bのピーク 1¾よび g)に分離した。
図中、ピーク bおよび eは脱オタタノィルダレリンに対応し、ピーク cおよび gは n-オタ タノィルダレリンに対応する。新たに現れたピーク fはトリぺプタン酸グリセリル処置の 後にマウス胃で観察された n—ヘプタノィルダレリンと同一の保持時間を示した。 ピーク aおよび dは、プロテアーゼ消化により生じたダレリンペプチドの C末端部分で あると考えられるが、正確な分子形態は未だ決定されて 、な 、。
[0082] 18.0〜18.5分に溶出するピーク fは、トリヘプタン酸グリセリル処置マウス由来のサン プルにおいてのみ観察された。この分析により、トリヘプタン酸グリセリルを与えたマウ スの胃力 精製した n-ヘプタノィルダレリンの保持時間と同じ保持時間を有する血漿 ダレリン分子が存在することが明らかになった (図 9Bにおけるピーク £)。これらの結果 は、 n-ヘプタノィルダレリンは、トリヘプタン酸グリセリル摂取によりインビボで人工的 に製造された非天然形ダレリンである力 確かに循環中に放出されることを示してい る。
[0083] 9) n-ヘプタノィルグレリンの活性
グレリンカルシウム動員アツセィを用いて、 n-ヘプタノィルグレリンの GHS-R (グレリ ンレセプター)活性を刺激する活性を試験した。
GHS-R-発現細胞での n-オタタノィルダレリン (黒丸)、 n-ヘプタノィルグレリン(白丸） および n-へキサノィルダレリン (黒三角)〖こより誘導される蛍光のタイムコースを示す。 ペプチド (1 X 10— 8M)は矢印により示される時点でカ卩えた。結果を図 10に示す。 n-ヘプタノィルダレリンは、 GHS-R-発現細胞における [Ca2+]の上昇を誘発し、これ らの [Ca2+]i変化のタイムコースは、 n-オタタノィルダレリンにより誘発される変化と類似 して 、た（図 10)。反応曲線の曲線下面積 (AUC)から計算される n-ヘプタノィルグレリ ンの GHS-Rに対するァゴニスト活性は、およそ n-オタタノィルグレリンの約 60%である 力 値は n-へキサノィルダレリンの値より 3倍高い (図 10)。従って、 n-ヘプタノィルダレ リンは GHS- R刺激活性を有する。
[0084] (3)アシノレ化のメカニズム
実験の結果、摂取した中鎖脂肪酸 (MCFA)および中鎖トリアシルグリセリド (MCT)が 、総ダレリン mRNA発現および総ペプチド濃度を上昇させることなくダレリンのァシル 修飾を刺激することが明らかになった。これは、外来性 MCFAおよび MCTが、ダレリン のァシル修飾に直接用いられることを示している。また、合成 n-ヘプタン酸の摂取に より、生体内で非天然の n-ヘプタノィルダレリンが産生された。この結果は、吸収され た MCFAがダレリンのァシルイ匕修飾における脂肪酸の直接的な供給原として働きうる ことを裏付けるものである。
[0085] 本発明はまたダレリンのァシル修飾の分子メカニズムおよび該修飾を担う酵素の同 定への道を拓くものである。実験結果はマウス内で機能するダレリン ser ァシルトラ ンスフェラーゼは、 n-へキサノィル、 n-ヘプタノィル、 n-オタタノィルおよび n-デカノィ ルのダレリンのァシル修飾を触媒しうることを示唆している。この種の酵素は、トリパル ミチン酸グリセリル、長鎖トリアシルグリセリド (LCT)およびトリ酪酸グリセリル、短鎖トリ ァシルグリセリド（SCT)摂取後にはダレリンのァシル修飾を触媒しな力つた。これは、 マウスにおけるダレリンのァシル修飾を触媒する酵素力 ダレリンのァシル修飾にお Vヽて MCT(MCFA)に対して親和性を有する中鎖 (C6:0〜C10:0)ァシルトランスフェラー ゼでありうることを示すものである。
[0086] 大多数のァシルトランスフェラーゼは、ァシル -CoAをァシル修飾の脂質源として使 用するので (文献 27,文献 28)、本発明は、外来性の、または代謝的に産生された MCFのうちの一部が中鎖ァシル -CoAへと変換され、グレリンのァシル修飾に用いら れる可能性を示唆している。
[0087] 実施例 2 :ヒトにおける試験
(1)中鎖脂肪酸トリグリセリド (MCT)投与の、ヒト修飾型ダレリン濃度への影響
1)材料および方法
経腸栄養剤として、ラコール (大塚製薬株式会社)を用いた。ラコール中のトリカプリ リン含有量 1500mgZ200mlである（トリカプリリンは、グリセリンとオクタン酸 (炭素数 (C) 8)力 なる中鎖脂肪酸トリグリセリド (MCT)である)。
ラコールを、低体重児（BMI 10)に対して、 1日当たり 900ml (トリカプリリンとして 6 . 75g)を 18日間投与し、投与前および投与 18日目に血中の修飾型ダレリン (ァシル ダレリン)含量を測定した。血中の修飾型ダレリン含量は、実施例 1と同様に、ダレリン C - RI Aおよび N - RI Aにより測定した。
[0088] 2)結果
血中の修飾型ダレリン (ァシルグレリン)含量 (fmolZmL)の測定結果を表 2に示す 。表 2より明らかなように、低体重児に対して、 MCT6. 75gを含む経腸栄養剤を、 18 日間投与することにより、血中の修飾型ダレリン含量が上昇した。
活性型の修飾型ダレリンの生理学的機能の一つに成長ホルモンの放出がある。成 長ホルモンは細胞の増殖.分裂、生体の成長、組織の新陳代謝などに深く関わって いる。 MCTの投与により低体重児の成長を促す効果があることが示唆された。
[表 2]
Figure imgf000034_0001
(2)中鎖脂肪酸トリグリセリド (MCT)含有食用油脂の摂取による筋力への影響 1)材料および方法
食用油脂として、アクター M— 2 (理研ビタミン株式会社)を用いた。アクター M— 2 中の中鎖脂肪酸トリグリセリド (MCT) (オクタン酸 (炭素数 (C) 8) )含有量は 99. 99% である。
5名の健康な成人男女に、「アクター M— 2」を 1回 5gずつ、朝食時と夕食時の 1日 2回 (計 lOg)摂取させ、摂取前、摂取 7日目、 14日目に、筋力を評価した。筋力は、 握力計 (株式会社タニタ)を用いて、利き手の握力を測定した。測定は約 1分の間隔 をおいて 2回実施し、その平均値を個別の値とした。
2)結果 (N = 5、平均 ±標準偏差）
結果を図 11に示す。図 11より明らかなように、特段の運動トレーニングを負荷する ことなぐオクタン酸高含有の MCTを含む食用油脂を摂取することにより、握力（筋力 )が増カロした。
[0090] (3)中鎖脂肪酸トリグリセリド含有食用油脂の摂取による皮膚への影響
1)材料および方法
食用油脂として、アクター M— 2 (理研ビタミン株式会社)を用いた。アクター M— 2 中の中鎖脂肪酸トリグリセリド (MCT) (オクタン酸 (炭素数 (C) 8) )含有量は 99. 99% である。
5名の健康な成人男女に、「アクター M— 2」を 1回 5gずつ、朝食時と夕食時の 1日 2回 (計 lOg)摂取させ、摂取前、摂取 7日目、 14日目に、顔の皮膚 (右頰、左頰)お よび内腕の皮膚について、皮膚バリア機能評価した。皮膚バリア機能は、 21°C60% RH環境下にて、水分含量と水分蒸散量を測定して評価した。水分含量は、 Corneo meter CM825 (Courage+Khazaka Electronic Gmbh社）〖こより、水分蒸散量は、 Te wameter TM210 (Courage+Khazaka Electronic Gmbh社）により測定した。測定は 、顔の皮膚は近接した 5箇所にて実施し、その平均値を個別の値とし、内腕の皮膚は 、左上腕部内側の近接した 2箇所にて実施し、その平均値を個別の値とした。
2)結果 (N = 5、平均 ±標準偏差）
顔の皮膚の測定結果を、図 12〜15に、内腕の皮膚の測定結果を図 17に示す。ォ クタン酸高含有の MCTを含む食用油脂を摂取することにより、水分蒸散量は低下し 、皮膚水分含量は上昇した。これは、皮膚のバリア機能が向上し、水分の蒸散を抑え て必要な水分を保持して 、ることを示唆して 、る。
[0091] «リスト
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Claims

請求の範囲
[1] 炭素数が 2〜35である脂肪酸またはその誘導体を含むダレリンの生理学的機能の レギュレーター。
[2] ダレリンの生理学的機能力 細胞内カルシウムイオン濃度の上昇作用、成長ホルモ ン分泌促進作用、摂食促進作用、脂肪蓄積に関連した調節作用、心機能改善作用 または胃酸分泌刺激作用である、請求項 1記載のレギュレーター。
[3] 請求項 1または 2に記載のレギュレーターを含有する医薬組成物。
[4] 請求項 1または 2のレギュレーターを含有する機能性食品。
[5] 炭素数 6〜 12の中鎖脂肪酸またはその誘導体の少なくとも 1種を含む活性型グレリ ン形成促進剤。
[6] 炭素数 8〜10の中鎖脂肪酸またはその誘導体の少なくとも 1種を含む、請求項 5に 記載の活性型ダレリン形成促進剤。
[7] 請求項 5または 6の ヽずれかに記載の活性型ダレリン形成促進剤を含有する機能性
TOo
[8] 炭素数 6〜12の中鎖脂肪酸またはその誘導体を含有し、筋力増強作用を有するこ とを特徴とする組成物。
[9] 炭素数 6〜12の中鎖脂肪酸またはその誘導体を含有し、美肌作用を有することを 特徴とする組成物。
[10] ダレリンの生理学的機能に関連する障害の予防または処置を必要とする被検体に 、請求項 1に記載のレギュレーター、請求項 3に記載の医薬組成物、または請求項 4 に記載の機能性食品を有効な量で投与することを含む、ダレリンの生理学的機能に 関連する障害の予防または治療方法。
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