[go: up one dir, main page]

WO2006004067A1 - ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 - Google Patents

ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006004067A1
WO2006004067A1 PCT/JP2005/012252 JP2005012252W WO2006004067A1 WO 2006004067 A1 WO2006004067 A1 WO 2006004067A1 JP 2005012252 W JP2005012252 W JP 2005012252W WO 2006004067 A1 WO2006004067 A1 WO 2006004067A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
brevibacillus
sequence
strain
spa
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/012252
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akihiko Kosugi
Kazuyoshi Yajima
Original Assignee
Kaneka Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corporation filed Critical Kaneka Corporation
Priority to CA002570253A priority Critical patent/CA2570253A1/en
Priority to EP05755845A priority patent/EP1767640A4/en
Priority to JP2006528867A priority patent/JPWO2006004067A1/ja
Priority to US11/630,334 priority patent/US8597908B2/en
Publication of WO2006004067A1 publication Critical patent/WO2006004067A1/ja
Priority to US14/066,231 priority patent/US8889389B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein A-like protein having an immunoglobulin binding ability using a bacterium belonging to the genus Brevibacillus. More specifically, the present invention is directed to causing a Brevibacillus bacterium to secrete and express a large amount of a protein A-like protein by genetic recombination technology, and subjecting the expressed protein A-like protein to degradation by a protease or the like. It is related to separating and recovering the protein A-like protein with high purity, and effectively using the separated and recovered protein A-like protein for applications such as column fat for antibody purification.
  • Antibody (also referred to as immunoglobulin or Ig) proteins have been used as pharmaceuticals for a long time because they have a function of capturing and eliminating harmful antigens in the living body.
  • Ig immunoglobulin
  • Protein A is one of the cell wall proteins produced by the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus, and is apparently having a molecular weight of about 42,000. Its structure consists of seven functional domains (ammo terminal force also signal sequence S, immunoglobulin binding domain E, immunoglobulin binding domain D, immunoglobulin binding domain A, immunoglobulin binding domain B, immunoglobulin binding domain C).
  • Staphylococcus' auureus bacterial cell wall binding domain X Staphylococcus' auureus bacterial cell wall binding domain X (see Non-Patent Documents 1, 2, and 3).
  • Each of the five immunoglobulin-binding domains of protein A domains E, D, A, B, and C
  • can bind at the Fc portion in the immunoglobulin molecule see Non-Patent Document 3).
  • the relative affinity of this protein A for the immunoglobulin-binding domain is determined by pH, Staphylococcus aureus strain (Cheung, A. et al. Infec. Immun. 1987. 55: 843-847), and class (I g G, IgM, IgA , IgD, IgE) and subclasses (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 , IgAl, IgA2) is known to depend on many factors such as, in particular human in class Imunogu Roblin IgGl , IgG2, IgG4 and mouse IgG2a, IgG2b, IgG3 Fc part shows strong binding.
  • Protein A with the above properties can be used for various diagnostics, pharmaceuticals, and basic research because it can bind to immunoglobulin without compromising its antigen-binding ability, affinity, and properties as an immunoglobulin. It is widely used as a ligand for purification carriers for immunoglobulins, especially IgG.
  • a serum inhibitory factor (consisting of a specific antigen, antibody, antiglobulin, and immune complex) that inhibits the tumor cytotoxic effect of sensitized peripheral blood lymphocytes is adsorbed to protein A to cause tumors.
  • protein A also has the function of activating polyclonal antibody synthesis, so it is expected to be used in various biotechnology fields as well as the original purified spore ligand. Yes.
  • Bacillus subtilis which is a Gram-positive bacterium, like Staphylococcus aureus
  • Bacillus subtilis which is a Gram-positive bacterium, like Staphylococcus aureus
  • it is secreted into the medium by adding a signal sequence of Bacillus subtilis secreted protein to the N terminus of protein A.
  • E. coli production systems approximately 47-10 Omg / L
  • the protein A produced by Bacillus subtilis is degraded by the extracellular protease inherent in Bacillus subtilis. Therefore, it has not been achieved yet to suppress the degradation of protein A, which has been attempted to use several types of extracellular protease-deficient strains of Bacillus subtilis (Non-patent Document 5) as a host.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application No. 07-187019
  • Patent Document 2 US Patent No. US5151350
  • Patent Document 3 European Patent No. EP0107509
  • Patent Document 4 US Patent No. US4617266
  • Patent Document 5 European Patent No. EP0124374
  • Non-patent literature l Lofdahl, S et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. 80: 697-701.
  • Non-Patent Document 2 Shuttleworth, H. L et al. Gene. 1987. 58: 283-295.
  • Non-Patent Document 3 Uhlen, M. et al. J. Bio. Chem. 1984. 259: 1695-1702.
  • Non-Patent Document 4 Nilsson, B et al. Protein Eng. 1987. 1: 107-113.
  • Non-Patent Document 5 Fahnestock, S. R et al. Appl. Envron. Microbiol. 1987. 53: 379-384.
  • Non-Patent Document 6 Cruido, M et al., J. Basic Microbiology. 1991. 31: 337-345.
  • Non-Patent Document 7 Sjostrom, J, -E et al. J. bacteriol. 1975. 123: 905-915.
  • Non-Patent Document 8 Bjorck, Shira. 1984. J. Immunol. 133, 969-974.
  • Non-Patent Document 9 Kastern, W. et al. J Biol Chem. 1992. 267: 12820-12825
  • Non-Patent Document 10 Udaka, S. et al. Method Enzymol. 1993. 217: 23-33.
  • An object of the present invention is to provide a protein A production technique that is more efficient than production methods using Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • the present invention by using a Brevibacillus genus bacterium as a host, protein A, which greatly exceeds the production amount reported when a microorganism such as Escherichia coli or Bacillus subtilis is used as the host, is added to the culture solution. Can be secreted and purified to high purity without impairing the immunoglobulin binding function. Therefore, the present invention eliminates the low productivity of Protein A and the complexity of the purification process, which contributes to the high price to date.
  • the present invention includes one or more of the following objects.
  • the present invention provides a DNA sequence comprising a DNA sequence encoding a protein A-like protein or a partial sequence thereof, and a promoter operable in Brevibacillus bacteria operably linked to the sequence. .
  • the present invention provides an expression vector comprising the DNA sequence.
  • the present invention provides a Brevibacillus bacterium transformant comprising the expression vector.
  • the present invention includes culturing the transformant and recovering a protein A-like protein secreted and produced by the transformant or a protein having a partial sequence thereof.
  • a method for producing a protein or a protein having a partial sequence thereof is provided.
  • the present invention provides a method for producing a protein A-like protein or a protein having a partial sequence thereof by the production method, and immobilizing the protein-like protein or a protein having a partial sequence thereof on an appropriate substrate. There is provided a method for producing an immunoglobulin adsorbent.
  • FIG. 1 is a view showing the base sequence and amino acid sequence of protein A of Staphylococcus 'aureus' Cowan I strain (numbers indicate the number of amino acid residues).
  • FIG. 2 is a diagram showing the gene sequence and amino acid sequence of protein A of the Staphylococcus aureus strain (numbers indicate the number of amino acid residues).
  • FIG. 3 is a view showing a protein A (SPA) expression vector (Spa-pNH301).
  • SPA protein A
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence from the promoter sequence of the protein A (SPA) expression vector (Spa-pNH301) to the region encoding protein A (SPA).
  • SPA protein A
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis of puffin A (SPA) produced by Brevibacillus choshinensis HPD31-OK strain.
  • SPA puffin A
  • FIG. 6 is a view showing the results of an antibody binding test of puffin A (SPA) produced by Brevibacillus choshinensis HPD31-OK strain.
  • SPA puffin A
  • FIG. 7 is a diagram showing a protein A (SPA ′) expression vector (Spa′—pNK3260).
  • FIG. 8 shows a promoter sequence of protein A (SPA,) expression vector (Spa, pNK3260), a Shine-Dalgarno sequence, a signal peptide and protein A (SPA ').
  • SPA protein A
  • FIG. 9 shows the results of SDS-PAGE analysis of the behavior and accumulation of peptin A (SPA,) produced by Brevibacillus choshinensis HPD31—OK strain in the culture medium.
  • SPA peptin A
  • the present inventors secrete and express active protein A in a large amount of culture medium by using Brevibacillus genus bacteria that are Gram-positive bacteria. It has been found that the problem of low productivity in E. coli and Bacillus subtilis and the problem of degradation of expressed protein A in Bacillus subtilis are effectively improved. That is, by using Brevibacillus bacteria, the expression level obtained with Bacillus subtilis can be easily secured and further accumulated in the medium.
  • the present invention will be described in detail based on embodiments.
  • protein A is one of the cell wall proteins produced by the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus.
  • protein A is derived from the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
  • the staphylococcus cauleus' Cowan I strain QCM2179) (Non-patent document 2), the amino acid sequence shown in Fig. 2 (SEQ ID NO: 4) (Non-patent document 6, Finck- Barbancon, V. et al. FEMS Microbiol. Lett. 1992.
  • Non-patent Document 7 derived from Woods46 strain (Non-patent document 3), derived from 8325-4 strain (Non-patent document 3), and This refers to the cloned plasmid DNA, ie, the spa gene product encoded by pSPl, pSP3, etc. (Non-patent Document 7)
  • the protein A-like protein referred to in the present invention includes protein A or a protein substantially the same as protein A. Protein A-like proteins also have at least 60% when compared to the amino acid sequence of protein A using a sequence comparison algorithm known to those skilled in the art and aligned for maximum match, A protein having an amino acid sequence having an amino acid residue identity of preferably 80%, more preferably 90-95%, and most preferably at least 99%, and having an immunoglobulin binding activity is included.
  • the amino acid sequences having identity are preferably 50 residues or longer, and more Preferably, it is 100 residues or more, more preferably 150 residues or more, and in the most preferred embodiment, it has identity over its full length.
  • BLAST algorithm An example of an algorithm that is suitable for determining percent sequence identity is the BLAST algorithm, which is described in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). ing. Software for performing BLAST analyzes is available to the public through the National Center for Biotechnology Information (http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • the protein A-like protein is, for example, an amino acid sequence encoded by a DNA that is neutralized under stringent conditions to DNA having a sequence complementary to the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. It can be a powerful protein.
  • hybridization conditions under the stringent conditions are: preferably about 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), about 0.5 M NaPO, ImM EDTA at about 50 ° C. Isesi
  • FIG. 1 SEQ ID NOs: 1 and 2
  • FIG. 2 SEQ ID NOs: 3 and 4
  • Protein A-like protein includes, for example, those obtained by rearranging the immunoglobulin binding domains (E, D, A, B, C) constituting protein A in an arbitrary permutation.
  • the "protein A-like protein” includes, for example, protein G (Non-patent Document 8) possessed by Streptococcal bacteria of groups C and G, or Peptostreptococcus magnus (Peptostreptococcus magnus). Protein L (Non-patent Document 9) and V, and protein having the same immunoglobulin binding function as Protein A are also included.
  • the “partial sequence” of a protein A-like protein refers to a protein that is composed of any part of the amino acid sequence constituting the protein A-like protein and has an immunoglobulin binding activity.
  • the amino acid sequence shown after the 24th Ala of SEQ ID NO: 8 obtained by removing a part of the above-mentioned sidinal sequence S and cell wall binding domain X from protein A see “Example 1” SPA ”. See FIGS. 3 and 4, SEQ ID NOs: 7 and 8.) and protein A force 31st of SEQ ID NO: 19 obtained by removing all of signal sequence S and cell wall binding domain X described above.
  • Each of the amino acid sequences shown after Ala correspond to “partial sequences” of protein A-like proteins. To do.
  • amino acid sequence constituting the immunoglobulin binding domain of the above proteins G and L can also be mentioned as a "partial sequence”.
  • the immunoglobulin A binding domain of protein A referred to in this specification is, for example, from 37 amino acid residues to 327 amino acid residues (domain E force C is also shown in FIG. 1), and the 37 amino acid residue in FIG. 355 amino acid residues from the group (domain E force C).
  • the DNA sequence encoding the protein A-like protein used in the present invention may be any amino acid sequence capable of translating the DNA sequence and constituting a protein A-like protein.
  • a DNA sequence can be obtained by a commonly used known method such as polymer It can be obtained using the 'chain' reaction (hereinafter abbreviated as PCR) method.
  • PCR 'chain' reaction
  • the DNA sequence must be identical to the original DNA sequence as long as it encodes the same amino acid when translated in the genus Brevibacillus where the codon can be replaced with a degenerate codon. No sex.
  • the “expression vector” of the present invention includes a DNA sequence encoding a protein A-like protein or a partial sequence thereof, and a promoter capable of functioning in Brevibacillus bacteria operably linked to the sequence.
  • the promoter may be any one that can function in bacteria of the genus Brevibacillus, but is not limited to Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus genus, Staphylococcus genus, Streptococcus genus, Streptomyces genus, Corynebacterium genus Middle wall protein (MWP), a promoter derived from bacteria such as (Corynebacterium) that can operate in bacteria belonging to the genus Brevibacillus, outer wall protein (OWP) (non-patented) Reference 10) or a promoter of a gene encoding Brevibacillus choshinensis HPD31 cell wall protein HWP (Ebisu.
  • the P5 promoter region “MWP-P5” of the Brevibacillus brevis cell wall protein MWP shown in Example 1 (see FIGS. 3 and 4, SEQ ID NOs: 7 and 8), and the Brevibacillus shown in Example 5 are used.
  • Each of the P2 promoter region “MWP-P2” (see FIGS. 7 and 8, SEQ ID NOS: 18 and 19) of the brevis cell wall protein MWP corresponds to a “promoter that can function in Brevibacillus bacteria”.
  • the "expression vector” preferably further includes a Shine-Dalgarno sequence and a signal sequence that can function in Brevibacillus bacteria downstream of the promoter.
  • the expression vector may optionally include a marker sequence.
  • the "Schein Dalgarno sequence" following the above promoter sequence includes Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Corynebacterium Preferred is a Shine-Dalgarno sequence derived from bacteria such as Brevibacillus and capable of operating in Brevibacillus bacteria. More preferred is a protein middle wall protein (MWP), an outer wall protein (OWP) which is the same protein, or a Shine-Dalgarno sequence existing upstream of a gene encoding Brevibacillus choshinensis HPD31 cell wall protein HWP.
  • the DNA sequence encoding the secretory signal peptide following the Shine Dalgarno sequence is not particularly limited as long as it is a DNA sequence encoding the following secretory signal peptide.
  • secretory signal peptides include Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus genus, Staphylococcus genus, Streptococcus genus, Streptomyces genus, Corynebacterium genus, and Brevibacillus genus.
  • a secretion signal peptide is more preferred. Further, the amino acid sequence of a conventional secretory signal peptide may be improved.
  • signal peptide of middle w all protein Met- Lys- Lys- Val- Val- Asn- Ser- Val- Leu- Ala- er- Ala- Leu- Ala- Leu- Thr- Val — Ala— Pro— Met -Ala- Phe -Ala (SEQ ID NO: 11) Met-Lys-Lys-Are -Are-Val-Val-Asn-Asn-Ser-Val-Leu-Leu-Leu-Leu- Leu— Leu— Ala— Ser -Ala -Leu- Ala -Leu- Thr-Val -Ala -Pro -Met- Ala-Phe-Ala (SEQ ID NO: 12)
  • a secretory signal peptide added or eliminated may be used.
  • the secretory signal peptide used in the secretory protein of the genus Brevibacillus can be used.
  • the signal peptide inherent to the protein A Figs. 1 and 2), that is, Met-Lys-Lys-Lys-Asn — lie— Tyr— Ser— lie— Arg— Lys— Leu— Gly— Val— Gly— lie— Ala-Ser-Val-Thr-Leu-Gly-Thr-Leu-Leu-lie-Ser-Gly-Gly-Val-Thr-Pro-Ala-Ala-Asn-Ala!
  • a DNA sequence encoding the above promoter sequence, Shine-Dalgarno sequence, and secretory signal peptide can obtain, for example, Brevibacillus bacteria.
  • Brevibacillus brevis 47 JCM6285
  • JP-A-60-58074 Brevibacillus brevis 47K
  • FERM BP-23008 see Non-Patent Document 10
  • Brevibacillus brevis 47-5 FERM BP— 1664
  • Brevibacillus choshinensis HPD31 FERM BP—1087) (see Japanese Laid-Open Patent Publication No.
  • Brevibacillus choshinensis HPD31—S (FERM BP— 6623), or Brevibacillus thyonusinensis HPD31 — It can be obtained by specifically increasing the chromosomal DNA of OK (FERM BP-4573) (see JP-A-6-296485) as a saddle type by a known PCR method.
  • any of the above promoters, any of the above Shine-Dalgarno sequences, any of the above signal peptide sequences, and the protein A-like protein or part of the protein A-like protein is preferred. It is preferred that the DNA sequence encoding the target sequence is operably linked in a Brevibacillus bacterium.
  • a plasmid vector is preferable as the vector.
  • plasmid vectors useful for expression of genes of the genus Brevibacillus include, for example, pUB110, which is known as a Bacillus subtilis vector, or pHY500 (JP-A-2-31682), pNY700 (JP-A-4-278091). No. gazette), pHY4831 (J. Bacteriol. 1987. 1239-1245), pNU200 (Takashige Takashi, Journal of Japanese Society of Agricultural Chemistry 1987. 61: 669-676), pNU100 (Appl. Microbiol. Biotech nol., 1989, 30 : 75-80), pNU211 (J.
  • JP 2002-238569 A is a shuttle vector of Escherichia coli and Brevibacillus spp. Being limited to these There.
  • an expression vector containing a promoter that functions in bacteria of the genus Brevibacillus, a Shine-Dalgarno sequence, and a DNA sequence encoding the target protein, or a gene fragment containing each of these sequences is directly integrated into the chromosome for expression.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 9-135693 Japanese Patent Laid-Open No. 9-135693
  • Such a method is a known method already used in Bacillus subtilis and yeast.
  • the protein A-like protein or a protein consisting of a partial sequence thereof may be produced in either a secreted form or a non-secreted form. However, it is secreted into the culture medium for ease of separation and purification. Is preferred ⁇ .
  • DNA encoding a signal peptide that functions in the genus Brevibacillus is added upstream of DNA encoding the polypeptide or It is preferable to connect.
  • the present invention also provides a Brevibacillus genus transformant transformed with the above expression vector.
  • any Brevibacillus bacterium can be used as a host cell.
  • Brevibacillus spp. But not limited to Brevibacillus agn, B. Dorstelensis, B. brevis, B. centrosporu s, B. choshinensis, B. formosus, B. invocatus, B. laterosporus, B. limnophilus, B. p arabrevis Including B. reuszeri and B. thermoruber.
  • the bacterium belonging to the genus Brevibacillus is Brevibacillus brevis 47 (JCM6285), Brevibacillus brevis 47K (FE RM BP-2308), Brevibacillus brevis 47-5Q (JCM8970), Brevibacillus choshinensis HPD31 strain (FERM BP 1087) and Brevibacillus thyotusinensis HPD31—OK strain (FERM BP-4573) are also selected from the group of forces.
  • Brevibacillus brevis 47 strain Brevibacillus brevis 47-5Q strain
  • Brevibacillus choshinensis HPD31 strain Brevibacillus choshinensis HPD31-S strain are suitable.
  • a mutant strain such as a protease-deficient strain or a high-expressing strain of the aforementioned Brevibacillus bacterium may be used. More specifically, Brevibacillus thiocinensis HPD31-OK (Japanese Patent Laid-Open No. 6-296485), a protease mutant derived from Brevibacillus choshinensis HPD31, and Breviba obtained as a human salivary amylase high-producing strain. Bacillus brevis 47K (Konishi, H. et al. Appl Microbio 1. Biotechnol. 1990. 34: 297-302) can be used. Alternatively, a mutant of any strain contained in the Brevibacillus genus bacteria group may be used.
  • Brevibacillus brevis 47K (FERM BP-2308), Brevi Bacillus brevis 47-5 (FERM BP-1664), Brevibacillus choshinensis HPD31 (FERM BP-1087), Brevibacillus choshinensis HPD31- S (FE RM BP-6623), and Brevibacillus choshinensis HPD31— OK (FERM BP— 4573) is registered with the Patent Organism Depositary (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (IPO D; Tsukuba Sakai Higashi 1-chome 305-8566 Ibaraki) Have been deposited.
  • Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • Brevibacillus brevis 47 JCM6285
  • Brevibacillus brevis 47-5Q strain JCM8970
  • JCM BioResource Center
  • heterologous protein When a heterologous protein is highly expressed in microorganisms including Brevibacillus bacteria, it often forms an inactive protein without being correctly folded, especially when a protein with many disulfide bonds is highly expressed. Often insolubilized inside and outside the cell.
  • the target protein when the target protein is expressed, the decrease in the secretion efficiency of the target protein insoluble protein can be suppressed by the action of chaperone protein, disulfide-binding heterozygous enzyme and Z or proline isomeric enzyme. It is known. Widely tried
  • V is a method in which a protein having disulfide acid reducing activity such as PDI (protein disulfide isomerase) and / or DsbA is allowed to act (JP-A 63-294796, JP-A-5-336986) ).
  • PDI protein disulfide isomerase
  • a gene encoding a protein having disulfide redox activity is introduced into a host organism, and the target protein and a protein having disulfide redox activity are expressed simultaneously to produce a protein having a positive U-disulfide bond.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2000-83670, Special Table 2001-514490, etc. Japanese Patent Laid-Open No. 2000-83670, Special Table 2001-514490, etc.
  • transformation of host cells of the genus Brevibacillus used in the present invention can be carried out by the known method of Takahahi et al. (Takahashi. W et al. J. Bacteriol. 1983. 156: 1130-1134), Takaahi et al. By the method (Takagi. H. et al. 1989. Agric. Biol. Chem, 53: 3099-3100) or Okamoto et al. (Okamoto. A. et al. 1997. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61: 202-203) Can be implemented.
  • the medium used for culturing the obtained transformant is not particularly limited as long as it can produce a protein A-like protein or a protein comprising a partial sequence thereof with high efficiency and high yield.
  • carbon sources and nitrogen sources such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract and casamino acid can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate salt, magnesium salt, manganese salt, zinc salt and iron salt are added as necessary.
  • auxotrophic host cells nutrient substances required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloram fecol, neomycin may be added.
  • protease inhibitors namely Phenylmethane sulfonyl fluoride (PMSF), Benzamidine, 4- (2 -aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride (AEBSF), Anti pain, hymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenedi It is also possible to add aminetetra acetic acid (EDTA) and Z or other commercially available protease inhibitors at appropriate concentrations.
  • PMSF Phenylmethane sulfonyl fluoride
  • AEBSF 4- (2 -aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride
  • EDTA aminetetra acetic acid
  • Z commercially available protease inhibitors at appropriate concentrations.
  • the culture temperature is about 15-42 ° C, preferably about 28-37 ° C, and it is desirable to perform aerobic culture under aeration and stirring conditions. You can cultivate anaerobically ⁇
  • a protein A-like protein or a protein having a partial arrangement ability thereof is produced in large amounts outside the cell body, that is, in the culture supernatant. Since it accumulates, the active protein can be collected and purified from the culture supernatant.
  • the protein remaining in the microbial cells and on the surface of the bacterium can be extracted by crushing the bacterium by a known method such as a method using ultrasonic wave, French press, alkali or SDS treatment.
  • the obtained protein is obtained by known protein purification methods such as salting out using ammonium sulfate sodium sulfate, concentration with ethanol or acetone, gel filtration, ion exchange, hydroxyapatite, It can be effectively purified using various chromatography utilizing the antibody binding activity and Z or chromatography utilizing the affinity of the protein.
  • the Brevibacillus genus bacterial transformant transformed with the "expression vector" of the present invention can stably express the protein and secrete and accumulate it in a large amount in the culture supernatant. Specifically, by culturing in an appropriate medium, active protein A, which appears in the molecular weight of about 40,000 to 50,000 in SDS-PAGE, can be secreted and accumulated in a large amount in the culture supernatant.
  • active protein A which appears in the molecular weight of about 40,000 to 50,000 in SDS-PAGE, can be secreted and accumulated in a large amount in the culture supernatant.
  • at least about 15 Omg / L culture solution preferably about 200 mg / L culture solution, more preferably about 500 mg / L culture solution, most preferably about lOOOmg / L or more. Can achieve the quantity.
  • the production volume can vary depending on the culture conditions.
  • the “substrate” for immobilizing the protein-like protein or the protein having a partial arrangement ability thereof includes an inorganic substrate such as activated carbon, glass beads, and silica gel, and a crosslinked polyvinyl chloride.
  • -Synthetic polymers such as alcohol, cross-linked polyacrylate, cross-linked polyacrylamide, cross-linked polystyrene, or organic base materials such as resin, crystalline cellulose, cross-linked cellulose, cross-linked agarose, cross-linked dextrin, cellulose, poly Butyl alcohol, Ethylene acetate Butyl copolymer saponification product, Polyacrylamide, Polyacrylic acid, Polymethacrylic acid, Polymethyl methacrylate, Polyacrylic acid grafted polyethylene, Polyacrylamide grafted polyethylene, Glass, and these Although composite base materials, such as organic mono-organic and organic mono-inorganic obtained by a combination, are mentioned as a representative example, this invention is not limited only to these.
  • the substrate is made of water, nylon 6, nylon 6, 6, nylon 11, polyethylene, poly (salt vinylidene), poly (butyl chloride), poly (vinylinol acetate), polystyrene, styrene divininolebenzene.
  • Polymer, styrene divinylbenzene, poly (trifluoroethylene), poly (black trifluoroethylene), poly (ethylene terephthalate), polypropylene, poly (methyl acrylate), polyacrylic ester, poly (Methyl methacrylate), polymethacrylic acid ester, cross-linked polyatalylate, cross-linked polyamide and the like are selected from the group consisting of synthetic polymer compounds.
  • any of a spherical shape, a granular shape, a flat membrane shape, a fibrous shape, a hollow fiber shape, and the like can be used effectively.
  • the average particle size is preferably about 5 ⁇ m to 1000 ⁇ m, more preferably about 20 to 800 ⁇ m, most preferably about 30 to 600 ⁇ m.
  • protein A-like protein or a protein comprising a partial sequence thereof is immobilized on the substrate by covalent or non-covalent bonding, such as affinity, association, antigen-antibody reaction, It can be carried out by hydrogen bonding, condensation or the like.
  • covalent or non-covalent bonding such as affinity, association, antigen-antibody reaction
  • it can be carried out by hydrogen bonding, condensation or the like.
  • molecular modifications such as addition, substitution and deletion of amino acid residues by means well known to those skilled in the art.
  • the protein A-like protein can be easily immobilized on the substrate.
  • the immunoglobulin-adsorbing carrier obtained by the production method of the present invention can be suitably used as a carrier for purifying immunoglobulin, particularly IgG. It can also be applied to disease treatment, such as removal of IgG with plasma power.
  • Staphylococcus aureus strain ATCC6538P was cultured at 37 ° C in the T2 liquid medium (polypeptone 1%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, fish extract 0.5%, pH 7.0) did.
  • the bacterial cells were collected from the obtained culture broth by centrifugation and washed twice with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). The cells were suspended in the same buffer, lysed with 1% SDS, heated at 60 ° C for 30 minutes, and then extracted with total methods such as phenol extraction and ethanol precipitation.
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Ncol and BamHI, and then separated and recovered from an agarose gel.
  • the Brevibacillus expression vector pNH301 (Shiga. Y. et al. Appl. Environ. Mi crobiol. 1992. 58: 525-531.) was also digested with restriction enzymes Ncol and BamHI and purified and recovered. Then, dephosphorylation treatment was performed by alkaline phosphatase treatment. [0057] The above-mentioned DNA fragment encoding SPA treated with restriction enzyme and the above-mentioned expression vector pNH301 were ligated using T4DNA ligase V to construct SPA expression plasmid Spa-pNH301 (Figs. 3, 4; SEQ ID NO: 7, 8). In Fig. 3 and Fig.
  • MWP-P5 is Brevibacillus brevis cell wall protein MWP P5 promoter region
  • SDM is Brevibacillus brevis cell wall protein MWP SD sequence
  • SP is Brevibacillus brevis cell wall
  • spa means the DNA sequence encoding “SPA”
  • Nm means the neomycin metagene coding region
  • RepZpUB110 means the replication origin of vector pNH301.
  • FIG. 4 "1 3 5 35” Oyobi "1 3 5 10"
  • their respective, Brevibacillus' brevis cell wall protein 35 area of P5 promoter MWP and - 10 means region.
  • This Spa-pNH301 was used to transform Brevibacillus brevis 47K or Brevibacillus choshinensis HPD31 ⁇ koji strain by a known method.
  • Each of the Brevibacillus choshinensis HPD31—OK strain having only the transformant obtained in Example 1 and the control vector PNH301 was used as a production medium 3 YC (polypeptone S 3%, yeast extract 0.5 %, Glucose 3%, MgSO7 ⁇ ⁇ 0.0
  • the culture was performed at 30 ° C under aerobic conditions for 3 days. After removing the cells from the culture by centrifugation (10,000 rpm, 4 ° C, 5 minutes), the cells were subjected to SDS-PAGE under reducing conditions using a 10-20% gradient gel by a conventional method. After electrophoresis, the gel was stained with CBB to detect the SPA band ( Figure 5). As a result of SDS-PAGE analysis, a large amount of SPA was confirmed in the culture supernatant.
  • Genomic DNA prepared from Staphylococcus aureuska described in Example 1 is used as a cage, and two oligonucleotides, primers 5 and TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAGCT-3 '(SEQ ID NO: 5), 5'-CGCGGATCCTTATAGTTCGCGACGACG-3' (sequence) (Number 9)
  • a DNA fragment is amplified by PCR using 5'-CGCGGATCCTCAACGTATATAAGTTAAAAT-3 '(SEQ ID NO: 10).
  • the obtained DNA fragment encoding protein A is ligated between Ncol of PNH301 and BamHI by the method described in Example 1.
  • a transformant is obtained by transforming the obtained plasmid into Brevibacillus brevis 47K or Brevibacillus choshinenensis HPD31-OK strain. After the transformant is cultured by the culture method described in Example 2, the protein A secreted into the culture medium is confirmed.
  • Example 1 Measurement of antibody binding ability of protein A produced by Brevibacillus genus To confirm that the SPA produced by the transformant obtained in Example 1 has antibody binding ability, mouse anti-human IgG antibody and Binding studies were performed using alkaline phosphatase-labeled Usagi anti-mouse IgG antibody.
  • the MWP P5 promoter contained in pNH326 (lshihara. T et al., 1995. J. Bacteriol, 177: 745-749) was converted to the MWP P2 promoter, and the Brevibacillus expression vector pNK3260 was constructed as follows.
  • PCR was performed using pNH326 as a saddle and two oligonucleotide primers 5'-GGAATTCTG ATTTC ACTTTTTGC ATTCTAC A-3 '(SEQ ID NO: 13) and 5'- AGTGCACTCGCAC TTACTGT-3' (SEQ ID NO: 14).
  • the portion of pNH326 excluding the P5 promoter of MWP was amplified, and its ends were digested with restriction enzymes EcoRI and Hindlll.
  • TTCGGTACCCCGGGTTCGAAATCGATAAGCTTCTGT-3 ′ (SEQ ID NO: 15) was prepared according to a standard method, and its ends were digested with restriction enzymes Muni and Hindlll. These two DNA fragments were ligated using T4DNA ligase to construct pNK3260.
  • the Brevibacillus expression vector pNK3260 constructed in Example 4 was similarly digested with restriction enzymes Ncol and BamHI, purified and recovered, and subjected to dephosphorylation treatment with alkaline phosphatase treatment.
  • MWP-P2 is the P2 promoter region of Brevibacillus brevis cell wall protein MWP
  • SDM is the SD sequence of Brevibacillus brevis cell wall protein MWP
  • SP is Brevibacillus brevis.
  • a modified signal peptide sequence in which the signal peptide sequence of the cell wall protein MWP is partially modified, “spa,” is the DNA sequence encoding SPA
  • “Nm” is the neomycin metagene coding region
  • rRep / pUBHOj is a replica of the vector pNK3260 Means the starting point.
  • P2-35” and “P2-10” mean the 35 and 10 regions of the P2 promoter of Brevibacillus brevis cell wall protein MWP, respectively.
  • Example 6 Peristalsis in an adherent of protein A secreted and expressed by Brevibacillus bacteria
  • the transformant obtained in Example 5 was added to the production medium 3YC (polypeptone S 3%, yeast exhalation 0.5%, glucose 3%, MgSO ⁇ 7 ⁇ . 0.01%, CaCl ⁇ 7 ⁇ O 0.01 %, M
  • lane number 1 is The molecular weight marker
  • lane number 2 is Repligen protein A (rPA-50) 0.52 / zg used as a control
  • lane number 3 is SPA, expression vector 24 hours after the start of culture.
  • the target SPA ' was expressed in a large amount 48 hours after the start of culture (lane number 4), and the concentration of SPA' continued to increase thereafter. Finally, it accumulated in the culture supernatant at a concentration of about 2 g / L. The concentration of SPA 'in the culture supernatant was measured using the ChemiDoc XRS system (Bio-Rad), using the Repligen protein A (rPA-50) 0.52 ⁇ g band migrated in lane number 2 as a control. did.
  • Example 7 Confirmation of the N-terminal amino acid west R row of protein A cattle bovine by a trophoblastic body
  • the human IgG binding activity of SPA prepared above was evaluated as follows. First, 5 ⁇ g / m SPA, was diluted with PBS buffer (Takara Bio) so that it was L, and 100 L was dispensed into a 96-well immunoplate (NU NC). After reacting at 37 ° C for 1 hour, the plate was washed twice with PBS buffer (250 L), and 250 L of 3% ushi serum albumin ZPBS solution was added and blocked at 4 ° C. Next, add 25 g / ml human IgG (Sigma) solution 100 1 prepared in PBS buffer containing 0.1% BSA and react at 37 ° C for 1.5 hours. Washed with PBS buffer containing% Tween 20.
  • productivity exceeding the expression level of recombinant protein A in Escherichia coli and Bacillus subtilis previously reported could be achieved. It shows that productivity problems can be solved.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

　本発明は、プロテインＡ様蛋白質の生産のための効率的で経済的な方法に関する。プロテインＡ様蛋白質の遺伝子組換え技術を用いた生産は、大腸菌、枯草菌などの宿主が使用されているが生産性の低さにより高価格の大きな原因となっている。従って大腸菌や枯草菌以外の組換えＤＮＡ技術を用いたプロテインＡ様蛋白質の安価で大量な生産を可能にする技術の早急な確立が強く望まれている。本発明は、プロテインＡ様蛋白質の大量生産方法であり、組換えブレビバチルス属細菌により該蛋白質を培養液中へ大量に分泌発現させ、培養液中からその蓄積された該プロテインＡ様蛋白質を分離回収することからなる方法などを提供する。                                                                                                 

Description

ブレビバチルス属細菌を用いたプロテイン A様蛋白質の生産方法 技術分野
[0001] 本発明は、ブレビバチルス属細菌を使用した、ィムノグロブリン結合能を有するプロ ティン A様蛋白質の製造方法に関する。詳細には、本発明は、遺伝子組換え技術に より、ブレビバチルス属細菌にプロテイン A様蛋白質を多量に分泌発現させること、そ の発現されたプロテイン A様蛋白質を、プロテアーゼ等による分解を受けることなく高 純度で分離回収すること、及び、その分離回収されたプロテイン A様蛋白質を、抗体 精製用のカラム榭脂等の用途へ有効に使用することに関する。
関連出願の相互参照
[0002] 日本国特許出願 2004— 198831号（2004年 7月 6日出願）の明細書、請求の範 囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによつ て本出願に合体される。
背景技術
[0003] 抗体 (ィムノグロブリン、または Igとも呼ばれる）蛋白質は生体における有害な抗原 の補足及び排除機能を有するため古くから医薬品として利用されてきた。近年では 遺伝子工学技術や細胞融合技術の進歩により特異的な抗原に反応する抗体を分子 設計し、動物細胞内で発現させることにより均一で高い抗原性を有するモノクローナ ル抗体の作製が可能となった。これらの抗体蛋白質は細胞培養液中に分泌されるこ とから、比較的容易に分離精製回収することができる。
[0004] 一般的に、ィムノアッセィゃィムノブロット解析に利用される抗体蛋白質の場合、通 常の蛋白質精製において利用される方法、すなわち硫酸アンモニゥムによる沈殿法 やイオン交換クロマトグラフィー等を用いることによって、血清、腹水または細胞培養 液のような天然生体サンプルから、十分な収量や純度で得ることができる。
[0005] 一方、高純度を必要とする医薬品または診断薬等に利用される抗体蛋白質の場合 、上記のような方法を用いて分離精製するには、様々な分離抽出条件の検討や数多 くの他のクロマトグラフィーとの併用を必要とし、また、それぞれの抗体蛋白質に関し て精製条件の最適化が必要となり、非常な労力を要する。従って、高純度を必要とす る抗体蛋白質の精製の場合、他の夾雑物質から簡便に分離精製するために、抗体 蛋白質を特異的に吸着することが可能なァフィユティークロマトグラフィーを用いるの が一般的である。
[0006] 抗体結合能を有するァフィユティークロマトグラフィーとして最も良く利用されている の力 プロテイン A、プロテイン G及びプロテイン Lなどの蛋白質を適当な榭脂に固定 化した担体によるクロマトグラフィーである。これらの蛋白質の中で特に精製用担体の リガンドとしてよく利用されて ヽるのがプロテイン Aである。プロテイン Aはグラム陽性 細菌スタフイロコッカス ·ァゥレウス（Staphylococcus aureus)によって生産される 細胞壁蛋白質の 1種であり、約 42, 000の分子量であることが明ら力となっている。そ の構造は 7つの機能ドメイン (ァミノ末端力もシグナル配列 S、ィムノグロブリン結合ドメ イン E、ィムノグロブリン結合ドメイン D,ィムノグロブリン結合ドメイン A、ィムノグロブリ ン結合ドメイン B、ィムノグロブリン結合ドメイン C、スタフイロコッカス 'ァウレウス細菌細 胞壁結合ドメイン X) (非特許文献 1、 2、 3参照)から構成されている。プロテイン Aの 5 つのィムノグロブリン結合ドメイン（ドメイン E、 D、 A、 B、 C)は、それぞれィムノグロブリ ン分子内の Fc部分で結合することができる (非特許文献 3参照)。
[0007] このプロテイン Aのィムノグロブリン結合ドメインに対する相対親和性は、 pH、スタフ イロコッカス.ァゥレウス菌株種（Cheung, A.ら Infec. Immun. 1987. 55:843- 847)、また ィムノグロブリンのクラス（IgG, IgM, IgA, IgD, IgE)及びサブクラス（IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2)などの多くの因子に依存することが知られ、特にィムノグ ロブリンのクラスではヒト IgGl、 IgG2、 IgG4及びマウス IgG2a、 IgG2b, IgG3の Fc 部分と強い結合を示す。以上のような性質を持つプロテイン Aは、ィムノグロブリンとし ての抗原結合能力、親和力や性質を損なうことなくィムノグロブリンに結合することが できるため、様々な診断、医薬品及び基礎研究に用いられるィムノグロブリン、特に I gGに対し精製用担体のリガンドとして広く使用されている。
[0008] また最近では、感作末梢血リンパ球の腫瘍細胞毒性作用を阻害する血清阻止因 子 (特異抗原、抗体、抗グロブリン及び免疫複合体で構成される）を、プロテイン Aに 吸着させ腫瘍患者の血清力も除去するといつた、癌治療への応用にも興味が持たれ ている（特許文献 1—3参照)。さらに IgG結合活性とは別にプロテイン Aは多クローン 抗体合成を活性ィ匕する働きも有していることから、当初の精製榭脂リガンド用途だけ でなく様々なバイオテクノロジー分野における使用用途が期待されている。
初期のプロテイン Aの生産方法にお!、てはスタフイロコッカス ·ァゥレウス株の培養 液力 直接、分離精製を行ってきたが、この菌自身の病原性の問題や不純物の混入 の問題により、現在では大腸菌 (Escherichia coli) (特許文献 1 - 3)やグラム陽性 細菌である枯草菌（Bacillus subtilis) (特許文献 4— 5)を用 、た組換え DNA技術 を用いた生産方法へ移行している。ところが、大腸菌における組換え型プロテイン A の生産性は極めて低ぐまた、発現蛋白質の多くがインクルージョンボディーを形成 したり、細胞内で分解されるため、分離回収が容易ではない (非特許文献 4)。一方、 スタフイロコッカス .ァウレウスと同様にグラム陽性細菌である枯草菌を用いたプロティ ン Aの生産では、プロテイン Aの N末端へ枯草菌分泌蛋白質のシグナル配列を付カロ することで培地中へ分泌発現させる方法が取られており、大腸菌での生産系と比較 した場合、分離精製等が容易であり、生産性も高いことが報告されている (約 47— 10 Omg/L) (Fahnestock, S, R.ら J. Bacteriol. 1986. 165:796-804)。ところが、枯草菌に お!、て生産されたプロテイン Aは、枯草菌が本来持つ菌体外プロテアーゼによる分 解を受ける。そのため、枯草菌の数種の菌体外プロテアーゼ欠損株 (非特許文献 5) を宿主として用いることも試みられてきた力 プロテイン Aの分解を抑えることは未だ 達成できていない。
特許文献 1 :日本国特願平 07— 187019号公報
特許文献 2：米国特許番号 US5151350号公報
特許文献 3：欧州特許番号 EP0107509号公報
特許文献 4：米国特許番号 US4617266号公報
特許文献 5：欧州特許番号 EP0124374号公報
非特許文献 l : Lofdahl, Sら. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. 80:697-701.
非特許文献 2 : Shuttleworth, H. Lら. Gene. 1987. 58:283-295.
非特許文献 3 : Uhlen, M.ら. J. Bio. Chem. 1984. 259:1695-1702.
非特許文献 4 : Nilsson, Bら. Protein Eng. 1987. 1:107-113. 非特許文献 5 : Fahnestock, S. Rら. Appl.Envron. Microbiol. 1987. 53:379-384. 非特許文献 6 : Brigido, Mら， J. Basic Microbiology. 1991. 31: 337-345.
非特許文献 7 : Sjostrom, J, - Eら. J. bacteriol. 1975. 123:905-915.
非特許文献 8 : Bjorck,しら. 1984. J. Immunol. 133, 969-974.
非特許文献 9 : Kastern, W.ら. J Biol Chem. 1992. 267: 12820-12825
非特許文献 10 : Udaka, S.ら. Method Enzymol. 1993. 217:23-33.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] このような背景から、大腸菌や枯草菌を用いた生産方法を上回る、効率の良いプロ ティン Aの生産技術の確立が、強く望まれていた。
[0011] 本発明は、大腸菌や枯草菌を用いた生産方法を上回る、効率の良いプロテイン A の生産技術の提供を一つの課題とする。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明者は、プロテイン Aのような機能蛋白質を安定、大量に生産する技術を確立 するため、ブレビバチルス属細菌を宿主に使い鋭意研究を行った結果、プロテイン A を効率良く培養液中へ大量に分泌発現、そして安定に蓄積させ、容易に高純度で 分離回収できることを見 、だした。
発明の効果
[0013] 本発明に従えば、ブレビバチルス属細菌を宿主に用いることにより、大腸菌ゃ枯草 菌などの微生物を宿主とした場合に報告されている生産量を大幅に上回るプロティ ン Aを培養液中へ分泌生産させ、ィムノグロブリン結合機能を損なわずに容易に高 純度にまで精製することができる。従って、本発明により、現在まで高価格の一因とな つて 、たプロテイン Aの低生産性や、精製工程の複雑さが解消される。
[0014] 本発明は、以下の 1または複数の対象を含む。
(1)本発明は、プロテイン A様蛋白質またはその部分的配列をコードする DNA配列 、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス属細菌で機能しうるプロ モーターを含む、 DNA配列を提供する。 (3)本発明は、前記 DNA配列を含む、発現ベクターを提供する。
(4)本発明は、前記発現ベクターを含む、ブレビバチルス属細菌形質転換体を提供 する。
(6)本発明は、前記形質転換体を培養すること、および該形質転換体によって分泌 生産されるプロテイン A様蛋白質、またはその部分的配列を有する蛋白質を回収す ることを含む、プロテイン A様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質の製造 方法を提供する。
(7)本発明は、前記製造方法によってプロテイン A様蛋白質またはその部分的配列 を有する蛋白質を製造すること、および該プロテイン様蛋白質またはその部分的配 列を有する蛋白質を適当な基材に固定化すること、を含む、ィムノグロブリン吸着担 体の製造方法を提供する。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、スタフイロコッカス'ァウレウス'コワン（Cowan) I株のプロテイン Aの塩基 配列とアミノ酸配列とを示す図である (番号はアミノ酸残基数を示す)。
[図 2]図 2は、スタフイロコッカス ·ァウレウス株のプロテイン Aの遺伝子配列とアミノ酸 配列とを示す図である (番号はアミノ酸残基数を示す)。
[図 3]図 3は、プロテイン A(SPA)発現ベクター（Spa—pNH301)を示す図である。
[図 4]図 4は、プロテイン A(SPA)発現ベクター（Spa— pNH301)のプロモーター配 列からプロテイン A (SPA)をコードする領域までの塩基配列およびアミノ酸配列を示 す図である。
[図 5]図 5は、ブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD31— OK株により生産されたプ 口ティン A (SPA)の SDS— PAGEによる解析結果を示す図である。
[図 6]図 6は、ブレビバチルス.チョウシネンシス HPD31— OK株により生産されたプ 口ティン A (SPA)の、抗体結合試験の結果を示す図である。
[図 7]図 7は、プロテイン A (SPA' )発現ベクター（Spa'— pNK3260)を示す図であ る。
[図 8]図 8は、プロテイン A (SPA，）発現ベクター（Spa，一 pNK3260)のプロモータ 一配列、シャインダルガノ配列、シグナルペプチドおよびプロテイン A (SPA' )をコー ドする DNA配列を示す図である。
[図 9]図 9は、ブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD31— OK株により生産されたプ 口ティン A (SPA，）の培養液中での挙動およびその蓄積量を、 SDS— PAGEにより 解析した結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明者らは、組換え DNA技術が利用できる細菌の中でも、グラム陽性細菌であ るブレビバチルス属細菌を用いることで、活性型のプロテイン Aを大量に培養液中へ 分泌発現させることができ、大腸菌及び枯草菌における低生産性の問題、並びに枯 草菌における発現したプロテイン Aの分解に対する問題が効果的に改善されることを 発見した。すなわち、ブレビバチルス属細菌を用いることで、枯草菌で得られる発現 量を容易に確保し、さらにこれを培地中へ蓄積させることができる。以下、実施形態 に基づ!/、て本発明につ 、て詳しく説明する。
[0017] 1.プロテイン A
プロテイン Aは、前述のように、グラム陽性細菌スタフイロコッカス'ァウレウスによつ て生産される細胞壁蛋白質の 1種であり、例えば、図 1 (配列番号 2)にて示されるアミ ノ酸配列からなるスタフイロコッカス ·ァゥレウス 'コワン（Cowan) I株 QCM2179)由 来のもの（非特許文献 2)、図 2 (配列番号 4)にて示されるアミノ酸配列力 なるもの（ 非特許文献 6、 Finck- Barbancon,V.ら FEMS Microbiol. Lett. 1992. 91:1- 8) )、 Woo ds46株由来のもの（非特許文献 3)、 8325— 4株由来のもの（非特許文献 3)、およ び既にクロー-ングされているプラスミド DNAすなわち pSPlや pSP3等（非特許文 献 7)にコードされている spa遺伝子産物等を指す。
[0018] 本発明にいうプロテイン A様蛋白質には、プロテイン A、またはプロテイン Aと実質 的に同一の蛋白質が含まれる。また、プロテイン A様蛋白質には、当業者にとって公 知の配列比較アルゴリズムを使用して、プロテイン Aのアミノ酸配列と比較され、そし て最大の一致のためにアラインメントされるときに、少なくとも 60%、好ましくは 80%、 より好ましくは 90— 95%、そして最も好ましくは少なくとも 99%のアミノ酸残基の同一 性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ィムノグロブリン結合活性を有する蛋白質が含 まれる。ここで、同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは 50残基長以上であり、より 好ましくは 100残基長以上であり、さらに好ましくは 150残基長以上であり、最も好ま しい実施態様では、完全長に渡り同一性を有する。
[0019] パーセント配列同一性を決定するために好適であるアルゴリズムの例は、 BLASTァ ルゴリズムであり、これは Altschul et al.， J. Mol. Biol. 215: 403- 410(1990)に記載され ている。 BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、 National Center for Biotechnol ogy Information(http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公衆が利用可能である。
[0020] プロテイン A様蛋白質は、例えば、配列番号 1または配列番号 3に示した DNA配列 に対して相補的な配列を有する DNAに、ストリンジェント条件下でノヽイブリダィズする DNAによってコードされるアミノ酸配列力もなる蛋白質であり得る。該ストリンジェント 条件下のハイブリダィゼーシヨン条件の例は：好ましくは約 7%のドデシル硫酸ナトリ ゥム（SDS)、約 0. 5Mの NaPO 、 ImMの EDTA中で約 50°Cでハイブリダィゼーシ
4
ヨン、および約 2XSSC、約 0. 1%の SDS中で 50°Cの洗浄；より望ましくは約 7%のド デシル硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5Mの NaPO、約 ImMの EDTAで 50°Cでハイ
4
ブリダィゼーシヨン、および約 1XSSC、約 0. 1%の SDSで約 50°Cの洗浄；より望まし くは約 7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5Mの NaPO、約 ImMの EDTA
4
で約 50°Cでハイブリダィゼーシヨン、および約 0. 5XSSC、約 0. 1%の SDSで約 50 °Cの洗浄；より好ましくは約 7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5Mの NaPO
4
、約 ImMの EDTAで約 50°Cでハイブリダィゼーシヨン、および約 0. 1XSSC、約 0. 1 %の SDSで約 50°Cの洗浄；並びになおより好ましくは約 7%のドデシル硫酸ナトリ ゥム（SDS)、約 0. 5Mの NaPO、約 ImMの EDTAで約 50°Cで、約 0. 1XSSC、約
4
0. 1%の SDSで約 65°Cの洗浄である。もっとも、該条件は、ヌクレオチド鎖の長さ、 該配列、および異なる環境パラメーターに依存して異なり得る。より長い配列は、より 高 、温度で特異的にノ、イブリダィズする。核酸のハイブリダィゼーシヨンの詳細なガ イドは、例 は Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of princi pies of hybridization and the starategy of nucleic acid probe assay" Elsvier, New Yor kに見出される。
[0021] このように、図 1 (配列番号 1および 2)および図 2 (配列番号 3および 4)にて示される プロテイン Aをコードする DNA配列、およびプロテイン Aのアミノ酸配列を知ることに より、「プロテイン A様蛋白質」、およびそれをコードする DNA配列の存在を認識する ことは、遺伝子工学分野の技術者にとって容易である。
[0022] 「プロテイン A様蛋白質」には、例えば、プロテイン Aを構成するィムノグロブリン結 合ドメイン (E、 D、 A、 B、 C)を任意の順列に並べ替えたものも含まれる。
[0023] さらに、「プロテイン A様蛋白質」には、例えば、グループ C及び Gのストレプトコッカ ス属細菌 (Streptococcal)の有するプロテイン G (非特許文献 8)、またはぺプトストレプ トコッカス ·マグ-ウス（Peptostreptococcus magnus)のプロテイン L (非特許文献 9)と V、つたプロテイン Aと同様なィムノグロブリン結合機能を有する蛋白質も含まれる。
[0024] 2.プロテイン A様蛋白質の部分的配列
プロテイン A様蛋白質の「部分的配列」とは、上記プロテイン A様蛋白質を構成する アミノ酸配列の任意の一部分力 構成されるものであって、かつ、ィムノグロブリン結 合活性を有する蛋白質を指し、具体的には、例えば、プロテイン Aから先述のシダナ ル配列 Sおよび細胞壁結合ドメイン Xの一部を除いて得られる、配列番号 8の 24番目 の Ala以降で示されるアミノ酸配列（実施例 1の「SPA」に対応。図 3および 4、配列番 号 7および 8参照。 )、および、プロテイン A力 先述のシグナル配列 Sおよび細胞壁 結合ドメイン Xの全部を除いて得られる、配列番号 19の 31番目の Ala以降で示され るアミノ酸配列（実施例 5の「SPA'」に対応。図 7および 8、配列番号 18および 19参 照。）のそれぞれが、プロテイン A様蛋白質の「部分的配列」に対応する。
[0025] さらに上記プロテイン Gや Lが有するィムノグロブリン結合ドメインを構成するアミノ酸 配列も「部分的配列」として挙げることができる。
[0026] 本明細書にいうプロテイン Aのィムノグロブリン結合ドメインとは、例えば、図 1にお ける 37アミノ酸残基から 327アミノ酸残基位 (ドメイン E力も C)、図 2における 37ァミノ 酸残基から 355アミノ酸残基 (ドメイン E力 C)のことを指す。
[0027] 3.プロテイン A様蛋白質をコードする DNA配列
本発明に用いられる、プロテイン A様蛋白質をコードする DNA配列は、その DNA 配列を翻訳したアミノ酸配列力 プロテイン A様蛋白質を構成するものであればいず れでも良い。そのような DNA配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラ ーゼ 'チェーン 'リアクション (以下、 PCRと略す)法を利用して取得できる。また、公知 の化学合成法で合成することも可能であり（Nucleic acids Res.1984. 12:4359)、さらに 、 DNAライブラリ一力ら得ることもできる。当該 DNA配列は、コドンが縮重コドンで置 換されて ヽても良ぐブレビバチルス属内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコード して 、る限り、本来の DNA配列と同一である必要性は無 、。
[0028] 4.発現ベクター
本発明の「発現ベクター」は、プロテイン A様蛋白質またはその部分的配列をコード する DNA配列、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス属細菌で 機能しうるプロモーターを含む。当該プロモーターは、ブレビバチルス属細菌で機能 しうるものであればいかなるものでも良いが、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、ス タフイロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Streptomyces)、コリネバ クテリゥム属（Corynebacterium)等細菌由来でブレビバチルス属細菌内にて作動可 能なプロモーターが好ましぐブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質 middle wall pr otein (MWP)、同蛋白質である outer wall protein (OWP) (非特許文献 10)また は、ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31細胞壁蛋白質 HWP (Ebisu. Sら. J. Ba cteriol. 1990. 172: 1312- 1320)をコードする遺伝子のプロモーターがより好ましい。実 施例では、実施例 1に示すブレビバチルス ·ブレビス細胞壁蛋白質 MWPの P5プロ モーター領域「MWP— P5」（図 3、 4、配列番号 7、 8参照）、および、実施例 5に示す ブレビバチルス ·ブレビス細胞壁蛋白質 MWPの P2プロモーター領域「MWP— P2」 (図 7、 8、配列番号 18、 19参照）のそれぞれが、「ブレビバチルス属細菌で機能しう るプロモーター」に対応する。
[0029] また、「発現ベクター」は、該プロモーターの下流に、ブレビバチルス属細菌で機能 しうるシャインダルガノ配列及びシグナル配列をさらに含むのが好まし 、。発現べクタ 一は、所望によりマーカー配列を含んでもよい。
[0030] 上記のプロモーター配列に続く「シャインダルガノ配列」は、大腸菌、枯草菌、ブレ ビバチルス属、スタフイロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Strepto myces)、コリネバタテリゥム属（Corynebacterium)等細菌由来でブレビバチルス属細 菌内にて作動可能なシャインダルガノ配列が好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁 蛋白質 middle wall protein (MWP)、同蛋白質である outer wall protein (O WP)、または、ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31細胞壁蛋白質 HWPをコー ドする遺伝子の上流に存在するシャインダルガノ配列がより好ましい。
[0031] 上記のシャインダルガノ配列に続く、分泌シグナルペプチドをコードする DNA配列 は、以下の分泌シグナルペプチドをコードする DNA配列であれば特に制限は無ぐ ブレビバチルス 'ブレビス内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、 本来の DNA配列と同一である必要性は無い。分泌シグナルペプチドとしては、例え ば、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフイロコッカス属、ストレプトコッカス属、 ストレプトミセス属（Streptomyces)、コリネバタテリゥム属（Corynebacterium)等細菌由 来で、ブレビバチルス属細菌内にて作動可能な分泌シグナルペプチドが好ましぐブ レビバチルス属細菌細胞壁蛋白質 middle wall protein (MWP)、同蛋白質であ る outer wall protein (OWP)または、ブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD31 細胞壁蛋白質 HWPの分泌シグナルペプチドがより好ましい。また従来の分泌シグナ ルペプチドのアミノ酸配列を改良したものでも構わない。具体的に言えば middle w all protein (MWP)のシグナルペプチド、 Met— Lys— Lys— Val— Val— Asn— S er— Val— Leu— Ala— er— Ala— Leu— Ala— Leu— Thr— Val— Ala— Pro— Met -Ala- Phe - Ala (配列番号 11 )を Met - Lys - Lys - Are -Are— Val— V al― Asn― Asn— S er— Val― Leu— Leu— Leu— Leu— Leu— Leu― Ala— Ser -Ala -Leu- Ala -Leu- Thr - Val -Ala -Pro -Met- Ala - Phe - Ala (配 列番号 12)の下線部ように塩基性や疎水性アミノ酸残基など付加または消失させた 分泌シグナルペプチドでも構わな ヽ。また従来力ゝらブレビバチルス属の分泌蛋白質 にお 、て使われて 、る分泌シグナルペプチドでも構わな 、。さらに該プロテイン Aが 本来有するシグナルペプチド（図 1、 2)、すなわち、 Met - Lys - Lys - Lys - Asn — lie— Tyr— Ser— lie— Arg— Lys— Leu— Gly— Val— Gly— lie— Ala— Ser— Val— Thr— Leu— Gly— Thr— Leu— Leu— lie— Ser— Gly—Gly— Val— Thr— Pro - Ala - Ala - Asn - Alaでも構わな!/ヽ。
[0032] 上記のプロモーター配列、シャインダルガノ配列、および分泌シグナルペプチドを コードする DNA配列は、例えば、ブレビバチルス属細菌力も得ることができる。好ま しくは、ブレビバチルス'ブレビス 47 (JCM6285) (特開昭 60— 58074号公報参照） 、ブレビバチルス'ブレビス 47K(FERM BP— 2308) (非特許文献 10参照）、ブレ ビバチルス.ブレビス 47— 5 (FERM BP— 1664)、ブレビバチルス.チョウシネンシ ス HPD31 (FERM BP— 1087) (特開平 4 278091号公報参照）、ブレビバチル ス'チョウシネンシス HPD31— S (FERM BP— 6623)、またはブレビバチルス 'チヨ ゥシネンシス HPD31— OK (FERM BP— 4573) (特開平 6— 296485号公報参照 )の染色体 DNAを铸型として、公知の PCR法で特異的に増やすことにより取得でき る。
[0033] 本発明の「発現ベクター」においては、上記の任意のプロモーターと、上記の任意 のシャインダルガノ配列、上記の任意のシグナルペプチド配列と、該プロテイン A様 蛋白質またはプロテイン A様蛋白質の部分的配列をコードする DNA配列とが、ブレ ビバチルス属細菌内にお 、て作動可能に連結されて 、ることが好まし 、。
[0034] ベクターとしては、プラスミドベクターが好ましい。ブレビバチルス属細菌の遺伝子 の発現に有用なプラスミドベクターとして具体的には、例えば、枯草菌ベクターとして 公知である pUB110、または pHY500(特開平 2— 31682号公報)、 pNY700 (特開 平 4— 278091号公報）、 pHY4831(J. Bacteriol. 1987. 1239- 1245)、 pNU200(鵜 高重三、 日本農芸化学会誌 1987. 61: 669-676)、 pNU100(Appl. Microbiol. Biotech nol., 1989, 30:75-80)、 pNU211(J. Biochem., 1992, 112:488- 491)、 pNU211R2L 5(特開平 7— 170984号公報)、 pNH301 (Shiga. Y.ら. Appl. Environ. Microbiol. 19 92. 58:525— 531.)、 pNH326、 pNH400 (Ishihara. Tら、 1995. J. Bacteriol, 177:745- 749)、 11丁210 (特開平6— 133782号公報）、 11丁1101^21^5( 1. Microbiol. Bi otechnoL, 1994, 42:358-363)、または大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルべ クタ一である pNC02 (特開 2002— 238569号公報）が使用可能であるが、これらに 限定されることはない。また、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーターとシャイ ンダルガノ配列と目的蛋白質をコードする DNA配列とを含んだ発現ベクター、また は、それらの各配列を含む遺伝子断片を染色体中へ直接組み込み、発現させる方 法 (特開平 9— 135693号公報)を用いても良い。そのような方法は、枯草菌や酵母 で既に用いられて 、る公知な方法である。 [0035] 本発明において、プロテイン A様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質は、 分泌形態または非分泌形態のいずれで生産されても良いが、分離精製の容易さから 培養液中へ分泌させる形態が好まし ヽ。
[0036] プロテイン A様蛋白質またはその部分的配列力 なる蛋白質が分泌形態で生産さ れる場合、該ポリペプチドをコードする DNAの上流にブレビバチルス属で機能する シグナルペプチドをコードする DN Aを付加または連結するのが好ましい。
[0037] 5.形質転換体
本発明はまた、上記発現ベクターで形質転換されている、ブレビバチルス属細菌形 質転換体を提供する。
[0038] 宿主細胞としては、任意のブレビバチルス属細菌を使用し得る。ブレビバチルス属 糸田菌は、限定されないが Brevibacillus agn、 B.Dorstelensis、 B. brevis、 B. centrosporu s、 B. choshinensis、 B. formosus、 B. invocatus、 B. laterosporus、 B. limnophilus、 B. p arabrevis、 B. reuszeri、 B. thermoruberを含む。好ましくは、ブレビバチルス属細菌が 、ブレビバチルス ·ブレビス 47株 (JCM6285)、ブレビバチルス ·ブレビス 47K株（FE RM BP— 2308)、ブレビバチルス'ブレビス 47— 5Q株 (JCM8970)、ブレビバチ ルス ·チョウシネンシス HPD31株（FERM BP 1087)およびブレビバチルス ·チヨ ゥシネンシス HPD31— OK株（FERM BP— 4573)力もなる群より選択される。特 に上記のブレビバチルス ·ブレビス 47株、ブレビバチルス ·ブレビス 47— 5Q株ゃブレ ビバチルス ·チョウシネンシス HPD31株、ブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD31 —S株が適している。
[0039] 生産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠 損株や高発現株のような変異株を使用しても良い。具体的に挙げれば、ブレビバチ ルス ·チョウシネンシス HPD31由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルス ·チ ヨウシネンシス HPD31— OK (特開平 6— 296485号公報）や、ヒト唾液アミラーゼ高 生産株として取得されたブレビバチルス'ブレビス 47K(Konishi, H.ら. Appl Microbio 1. Biotechnol. 1990. 34:297-302)が使用できる。また前記ブレビバチルス属細菌群に 含まれる 、ずれかの株の変異体を使用してもょ 、。
[0040] 上記微生物のうち、ブレビバチルス'ブレビス 47K (FERM BP— 2308)、ブレビ バチルス'ブレビス 47— 5 (FERM BP— 1664)、ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31 (FERM BP— 1087)、ブレビバチルス.チョウシネンシス HPD31— S (FE RM BP— 6623)、及びブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD31— OK(FERM BP— 4573)は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (IPO D；〒 305-8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1 1中央第 6)に、上記それぞれの受託 番号にて寄託されている。また、ブレビバチルス'ブレビス 47 (JCM6285)及びブレ ビバチルス'ブレビス 47— 5Q株 (JCM8970)は、独立行政法人理化学研究所 バイ オリソースセンター微生物材料開発室 (JCM ;干 351-0198 埼玉県和光巿広沢 2— 1 )カゝら人手することができる。
[0041] 6.蛋白質の発現調節
ブレビバチルス属細菌を含めた微生物において異種蛋白質を高発現させた場合、 正しくフォールデイングされずに不活性型の蛋白質を形成することが多ぐ特にジス ルフイド結合の多い蛋白質を高発現させた場合、細胞内外にて不溶性化することも 多い。一方で、目的蛋白質を発現させる際、シャペロン蛋白質やジスルフイド結合異 性ィ匕酵素および Zまたはプロリン異性ィ匕酵素などを作用させることによって、目的蛋 白質の不溶性ィ匕ゃ分泌効率の低下を抑えられることが知られている。広く試みられて
V、る方法は、 PDI (プロテインジスルフイドイソメラーゼ）および/または DsbAなどの ジスルフイド酸ィ匕還元活性を有する蛋白質を作用させる方法 (特開昭 63— 294796 号公報、特開平 5— 336986号公報)である。
[0042] さらに、ジスルフイド酸化還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を宿主生物 に導入し、目的蛋白質とジスルフイド酸化還元活性を有する蛋白質とを同時に発現さ せて正 Uヽジスルフイド結合を有する蛋白質を生産する方法も知られて!/ヽる（特開 20 00— 83670号公報、特表 2001— 514490号公報等）。
[0043] 本発明に プロテイン A様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質の発現 の場合も、過度な蛋白質合成が行われることによる宿主細胞への負担を軽減し、蛋 白質分泌をスムーズに行わせるために、当該蛋白質発現の際、数種類のシャペロン 蛋白質、ジスルフイド結合酸化還元酵素、および Zまたはジスルフイド異性化酵素の ようなフォールデイングを促進する酵素を同時発現させることも可能である。具体的に 挙げれば、ブレビバチルス属細菌において当該蛋白質発現時に、蛋白質のジスルフ イド結合に関与し、プロテインジスルフイドイソメラーゼの類縁と考えられて 、る大腸菌 の DsbA (Bardwell, J.C.A.ら. Cell. 1991. 67 : 582-589、 Kamitani. Sら. EMBO. J. 199 2. 11:57- 62.)および Zまたは、 DnaK、 DnaJ、 GrpE (特開平 9 180558号公報） などのシャペロン蛋白質を同時に発現させることもできる。その他、ポリペプチドの正 確なジスルフイド結合に関与している酵素 PDI (特願 2001— 567367号公報）、ジス ルフイド酸化還元酵素（特開 2003— 169675号公報）（Kontinen, V, P.ら Molecular Microbiology. 1993. 8:727-737)、および Zまたはジスルフイド異性化酵素のようなフ オールデイングを促進する酵素を当該蛋白質と同時に発現させ、更に分泌効率を向 上させることちでさる。
[0044] 7.形質転換体
本発明にお 、て用いられるブレビバチルス属細菌の宿主細胞の形質転換は、公知 の Takahahiらの方法（Takahashi. Wら. J. Bacteriol. 1983. 156: 1130- 1134)や、 Tak agiらの方法（Takagi. H.ら. 1989. Agric. Biol. Chem, 53:3099- 3100)、または Okam otoらの方法 (Okamoto. A.ら 1997. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61:202-203)により 実施することができる。
[0045] 得られた形質転換体の培養に用いる培地は、プロテイン A様蛋白質またはその部 分的配列からなる蛋白質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無 い。具体的にはグルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス 、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナト リウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要 に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄 養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラム フエ-コール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。さらに、菌体内外 に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的蛋白質の分解、低分子化を抑 えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち Phenylmethane sulfonyl fluor ide (PMSF)、 Benzamidine、 4- (2- aminoethyl)- benzenesulfonyl fluoride (AEBSF)、 Anti pain、し hymostatin、 Leupeptin、 Pepstatin A、 Phosphoramidon、 Aprotinin、 Ethylenedi aminetetra acetic acid (EDTA)、および Zまたは、その他市販されているプロテア一 ゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良 、。
[0046] 培養温度は約 15— 42°C、好ましくは約 28— 37°Cであり、通気攪拌条件で好気的 に培養を行うことが望まし ヽが、必要であれば通気を遮断し嫌気的に培養してもよ ヽ
[0047] 8.プロテイン A様蛋白質の取得
本発明の実施形態によれば、形質転換されたブレビバチルス属細菌を培養するこ とにより、プロテイン A様蛋白質またはその部分的配列力 なる蛋白質は、菌体外、 すなわち培養上清中に大量に蓄積されるので、培養上清中から活性型の当該蛋白 質を採取、精製することが出来る。また菌体内、及び菌表層に残った当該蛋白質も、 公知の方法、例えば超音波やフレンチプレス、アルカリや SDS処理などを利用した 方法により菌を破砕し抽出出来る。得られた当該蛋白質は、公知の蛋白質精製方法 、例えば硫酸アンモ-ゥムゃ硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、エタノールやアセトン 等による濃縮、及び、ゲル濾過、イオン交換、ハイドロキシアパタイト、当該蛋白質の もつ抗体結合活性を利用した各種クロマトグラフィーおよび Zまたは、当該蛋白質が 有する親和性を利用したクロマトグラフィーなどを用いて、効果的に精製することがで きる。
[0048] 本発明の「発現ベクター」により形質転換されたブレビバチルス属細菌形質転換体 は、当該蛋白質を安定に発現し、大量に培養上清中へ分泌蓄積することができる。 具体的には、適当な培地で培養することによって、 SDS— PAGEにおいて分子量 4 万から 5万付近に現れる活性型のプロテイン Aを培養上清中へ大量に分泌、蓄積さ せることができる。実施形態による当該蛋白質の生産方法によれば、少なくとも約 15 Omg/L培養液、好ましくは約 200mg/L培養液、より好ましくは約 500mg/L培養液 、もっとも好ましくは約 lOOOmg/L以上の生産量を達成できる。もっとも、生産量は、 培養条件等によって変化しうる。
[0049] 9.プロテイン様蛋白質の基材への固定
本発明におけるプロテイン様蛋白質またはその部分的配列力 なる蛋白質を固定 する「基材」としては、活性炭、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機基材、架橋ポリビ -ルアルコール、架橋ポリアタリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなど の合成高分子、または榭脂、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋ァガロース、 架橋デキストリンなどの多糖類力 なる有機基材、セルロース、ポリビュルアルコール 、エチレン 酢酸ビュル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメ タクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフトイ匕ポリエチレン、ポリアクリル アミドグラフトイ匕ポリエチレン、ガラス、さらには、これらの組み合わせによって得られう る有機一有機、有機一無機などの複合基材が代表例として挙げられるが、本発明は これらのみに限定されるものではない。好ましくは、該基材は水、ナイロン 6、ナイロン 6, 6、ナイロン 11、ポリエチレン、ポリ（塩ィ匕ビユリデン）、ポリ（塩化ビュル）、ポリ（酢 酸ビニノレ）、ポリスチレン、スチレン ジビニノレベンゼン共重合体、スチレン ジビニ ルベンゼン、ポリ（トリフルォロエチレン）、ポリ（クロ口トリフィルォロエチレン）、ポリ（テ レフタル酸エチレン）、ポリプロピレン、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリアクリル酸エステ ル、ポリ (メタクリル酸メチル）、ポリメタクリル酸エステル、架橋ポリアタリレート、架橋ポ リアミドなどの合成高分子化合物力もなる群より選択される。基材の形状としては、球 状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状等いずれも有効に用いられるが、吸着性能面 から球状または粒状がより好ましく用いられる。水不溶性多孔質体が球状または粒状 である場合、平均粒径は約 5 μ mカゝら 1000 μ mであることが好ましぐより好ましくは 約 20〜800 μ m、最も好ましくは約 30〜600 μ mである。
[0050] 本発明にお 、て、プロテイン A様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質の 該基材への固定化は、共有または非共有結合、例えばァフィ-ティ、会合、抗原抗 体反応、水素結合、コンジユゲーシヨンなどにより実施しうる。また、当業者に周知の 手段により、当該蛋白質に対してアミノ酸残基の付加、置換、欠失などの分子改変を 施し、該基材への固定ィ匕を容易にすることも可能である。例えば、プロテイン A様蛋 白質の分子内にシスティン残基を導入することによって、プロテイン A様蛋白質を前 記基材に容易に固定ィ匕することができる。
[0051] 本発明の製造方法によって得られるィムノグロブリン吸着担体は、ィムノグロブリン、 特に IgGの精製用担体として好適に用いられ得る。また、血漿力もの IgGの除去等、 疾病治療への応用も可能である。 実施例
[0052] 以下、参考例及び実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、これらが本発 明の範囲を制限するものでない。本発明の実施にあたり、組換え DNAの作製や操 作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。 (1) T. Maniatis, E. F . Fritsch, J. Sambrook著、 「モレキュラ^ ~ ·クロー-ング/ァ 'ラボラトリ^ ~ ·マニュアル（ Molecularし loning/A Laboratory Manual)」、第 2feU1989)、 Cold bpnng Harbor Lab oratory刊 (米国)。 (2)村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第 3版 (1996) 、丸善株式会社刊。
[0053] (実施例 1) スタフイロコッカス'ァウレウス ATCC6538P株由来のプロテイン Aを コードする DNA配列のクローニング
スタフイロコッカス.ァゥレウス ATCC6538P株を、 T2液体培地（ポリペプトン 1%、 イーストエキストラタト 0. 2%、グルコース 1%、魚肉エキス 0. 5%、 pH7. 0)で 3 7°C—晩振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により回収後、 10mM のトリス—塩酸緩衝液 (pH8. 0)で 2度洗浄した。菌体を同緩衝液に懸濁後、 1%SD Sで溶菌し、 60°Cにて 30分間加熱後、フエノール抽出及びエタノール沈殿等の定法 により全ゲノム DNAを抽出した。
[0054] 次に、プロテイン A遺伝子の DNA配列情報 (非特許文献 6)を基に、 2つのオリゴヌ クレオチド、プライマー 5し TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAG CT— 3' (配列番号 5)と 5'— CGGGATCCCTAAAATACAGTTGTACCGATGAATGGA TT-3' (配列番号 6)を調製した。上記のゲノム DNAを铸型とし、これら 2つのオリゴヌ クレオチドプライマ一を用いて PCRを行 、、プロテイン Aからシグナルシーケンス（Sド メイン)及び細胞壁結合ドメイン (Xドメイン)の一部を除！ヽた部分 (これ以降 SPAと称 する）をコードする DNA断片 (約 1. 2kbp (キロ塩基対)）を増幅した。
[0055] 得られた DNA断片は、制限酵素 Ncol及び BamHIにより消化した後、ァガロース ゲルより分離回収した。
[0056] 一方、ブレビバチルス発現ベクターである pNH301 (Shiga. Y.ら. Appl. Environ. Mi crobiol. 1992. 58:525-531.)もまた同様に制限酵素 Ncol及び BamHIにより消化後、 精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸ィ匕処理を行った。 [0057] 制限酵素処理した SPAをコードする上記 DNA断片と上記発現ベクター pNH301 とを T4DNAライゲースを用 V、て連結し、 SPA発現プラスミド Spa - pNH301を構築 した（図 3、 4 ;配列番号 7、 8)。図 3および図 4において、「MWP— P5」はブレビバチ ルス'ブレビス細胞壁蛋白質 MWPの P5プロモーター領域、「SDM」はブレビバチル ス ·ブレビス細胞壁蛋白質 MWPの SD配列、「SP」はブレビバチルス ·ブレビス細胞 壁蛋白質 MWPのシグナルペプチド配列、「spa」は「SPA」をコードする DNA配列、 「Nm」はネオマイシン而性遺伝子コード領域、「RepZpUB110」はベクター pNH3 01の複製開始点を意味する。また図 4において、「135— 35」ぉょび「135— 10」は、そ れぞれ、ブレビバチルス'ブレビス細胞壁蛋白質 MWPの P5プロモーターの 35領 域および— 10領域意味する。公知の方法により、この Spa— pNH301を用いてブレ ビバチルス ·ブレビス 47K、またはブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD31 - ΟΚ株 の形質転換を行った。
[0058] ( m2) ブレビバチルス通細菌によるプロテイン Aの 現試験
実施例 1にて得られた形質転換体、及びその対照となるベクター PNH301のみを 有するブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— OK株のそれぞれを、生産培地 3 YC (ポリペプトン S 3%、酵母エキス 0. 5%、グルコース 3%、 MgSO · 7Η Ο 0. 0
4 2
1%、 CaCl · 7Η Ο 0. 01%、 MnSO ·4Η Ο 0. 001%、 FeSO · 7Η Ο 0. 001
2 2 4 2 4 2
%, ZnSO · 7Η Ο 0. 0001% ρΗ7. 0)にネオマイシン 60mg/Lを添カ卩した培地
4 2
にて、 30°Cで、好気的条件下、 3日間培養を行った。培養液は遠心分離（10,000rp m、 4°C、 5分間）により菌体を除去した後、定法により、 10— 20%グラジェントゲルを 用いた還元条件下での SDS— PAGEに供した。電気泳動後、ゲルを CBB染色する ことにより、 SPAのバンドを検出した（図 5)。 SDS— PAGEによる解析の結果、その 培養上清液中に大量の SPAを確認することが出来た。
[0059] なお、プロテイン Aの細胞壁結合ドメイン (Xドメイン)を含めた完全長型のプロティ ン Aを発現させる場合には、以下の方法を採用することができる。実施例 1で記載し たスタフイロコッカス ·ァウレウスカも調製したゲノム DNAを铸型とし、 2つのオリゴヌク レオチド、プライマー 5し TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAGCT -3' (配列番号 5)と、 5'- CGCGGATCCTTATAGTTCGCGACGACG- 3' (配列番号 9) または 5'- CGCGGATCCTCAACGTATATAAGTTAAAAT- 3' (配列番号 10)とを用 い、 PCRにより DNA断片を増幅する。得られたプロテイン Aをコードする DNA断片 は、実施例 1にて記載された方法により PNH301の Ncolと BamHIとの間へ連結す る。得られたプラスミドをブレビバチルス ·ブレビス 47Kまたはブレビバチルス ·チョウ シネンシス HPD31— OK株へ形質転換することで形質転換体を取得する。この形質 転換体を実施例 2に記載された培養方法にて培養した後、培養液中へ分泌されたプ 口ティン Aを確認する。
[0060] (実施例 3)
ブレビバチルス属細菌により生産されたプロテイン Aの抗体結合能の測定 実施例 1で得られた形質転換体により生産された SPAが抗体結合能を有するカゝ確認するた め、マウス抗ヒト IgG抗体及びアルカリフォスファターゼ標識ゥサギ抗マウス IgG抗体 を用いて結合試験を行った。
[0061] 実施例 1にて得られた、 Spa— pNH301、及びその対照となる pNH301をそれぞ れ有するブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— OK株を、実施例 2と同様に培 養し、それぞれの培養上清液を SDS— PAGEに供した後、定法により PVDFメンブ ランへ転写し、 3%スキムミルクにてブロッキングを行い、 Fahnestockら（Fahnestock. S . Rら. J. Bacteriol. 1986. 165:796-804.)らの方法に準じて抗体結合試験を行った。 検出は ^AP発色キット (バイオラッド社製)を用い、その取扱い説明書に従って実施 した。その結果、比較対照であるベクター PNH301のみを有する形質転換体ではバ ンドは認められなかった。一方、 SPA発現ベクター Spa— pNH301を有する形質転 換体では、 SPAと同じ移動度、すなわち SDS— PAGE上、 CBB染色で濃いバンド の認められた 42kDa付近に強い発色が認められた（図 6)。図 6において、「M」は分 子量マーカー、 「C」はベクター pNH301を有するブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— OK株、 Spaは SPA発現ベクター Spa— pNH301を有するブレビバチル ス'チョウシネンシス HPD31— OK株のレーンを示す。これらの結果から、 SPA発現 ベクター Spa— pNH301を有するブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— OK 株により生産された分子量約 42kDaの蛋白質は、抗体結合活性を有することが確認 された。 [0062] (実施例 4) ブレビバチルス発現ベクター ΌΝΚ3260の構築
pNH326 (lshihara. Tら、 1995. J. Bacteriol, 177:745- 749)に含まれる MWPの P5 プロモーターを MWPの P2プロモーターに変換して、ブレビバチルス発現ベクター p NK3260を以下のように構築した。
[0063] まず、 pNH326を铸型として、 2つのオリゴヌクレオチドプライマー 5'- GGAATTCTG ATTTC ACTTTTTGC ATTCTAC A-3 ' (配列番号 13)および 5'- AGTGCACTCGCAC TTACTGT- 3' (配列番号 14)を用いて PCRを行い、 pNH326のうち MWPの P5プロ モーターを除く部分を増幅し、その末端を制限酵素 EcoRIと Hindlllとで消化した。 次に、 MWPの P2プロモーターを含む 2本鎖 DNA断片 5'- GGTACCAATTGGCGC
Figure imgf000021_0001
TTCGGTACCCCGGGTTCGAAATCGATAAGCTTCTGT-3' (配列番号 15)を定法 に従い調製し、その末端を制限酵素 Muniおよび Hindlllで消化した。これら 2つの DNA断片を T4DNAライゲースを用いて連結し、 pNK3260を構築した。
[0064] (実施例 5) スタフイロコッカス -ァウレウス'コワン I株（TCM2179)由来のプロテイン Aをコードする DNA配列のクローニング
実施例 1と同様に、スタフイロコッカス ·ァゥレウス 'コワン I株 (JCM2179)から全ゲノ ム DNAを抽出した。次に、プロテイン A遺伝子の DNA配列情報 (非特許文献 2)を 基に、 2つのオリゴヌクレオチドプライマー 5'- TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGC AACACGATGAAGCTCAACAA-3' (配列番号 16)と 5'— CGGGATCCCTATTTTGG
7)を調製した。上記のゲノム DNAを铸型とし、これら 2つのオリゴヌクレオチドプライ マーを用いて PCRを行 、、プロテイン Aからシグナルシーケンス（Sドメイン）及び細 胞壁結合ドメイン (Xドメイン)を除 ヽた部分 (これ以降 SPA'と称する）をコードする D NA断片（約 0. 9kbp)を増幅した。得られた DNA断片は、制限酵素 Ncol及び Bam HIにより消化した後、ァガロースゲルより分離回収した。
[0065] 一方、実施例 4で構築したブレビバチルス発現ベクター pNK3260もまた同様に制 限酵素 Ncol及び BamHIにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理 により脱リン酸ィ匕処理を行った。
[0066] 制限酵素処理後の、 SPA，をコードする上記 DNA断片と上記発現ベクター pNK3 260とを T4DNAライゲースを用いて連結し、 SPA，発現プラスミド Spa，— pNK326 0を構築した（図 7、 8 ;配列番号 18、 19)。図 7および図 8において、「MWP— P2」は ブレビバチルス'ブレビス細胞壁蛋白質 MWPの P2プロモーター領域、「SDM」はブ レビバチルス ·ブレビス細胞壁蛋白質 MWPの SD配列、「SP，」はブレビバチルス ·ブ レビス細胞壁蛋白質 MWPのシグナルペプチド配列を一部改変した改変型シグナル ペプチド配列、「spa，」は SPA，をコードする DNA配列、「Nm」はネオマイシン而性 遺伝子コード領域、 rRep/pUBHOjはベクター pNK3260の複製開始点を意味 する。また図 8において、「P2— 35」および「P2— 10」は、それぞれ、ブレビバチルス 'ブレビス細胞壁蛋白質 MWPの P2プロモーターの 35領域および 10領域意味 する。
[0067] 公知の方法により、この Spa，—pNK3260を用いてブレビバチルス 'チョウシネンシ ス HPD31— OK株の形質転換を行った。
[0068] 施例 6) ブレビバチルス通細菌により分泌発現されたプロテイン Aの谘着液中 の举動
実施例 5にて得られた形質転換体を、生産培地 3YC (ポリペプトン S 3%、酵母ェ キス 0. 5%、グルコース 3%、 MgSO · 7Η Ο 0. 01%、 CaCl · 7Η O 0. 01%、 M
4 2 2 2
nSO -4H O 0. 001%、 FeSO - 7H O 0. 001%、 ZnSO - 7H O 0. 0001%
4 2 4 2 4 2 pH7. 0)にネオマイシン 60mg/Lを添カ卩した培地にて、 30°Cの、好気的条件下で培 養した。培養開始から、 24、 48、 72、 78時間後に培養液を分取し、遠心分離（10,0 00rpm、 4°C、 5分間）により菌体を除去した後、定法により、 10— 20%グラジェント ゲルを用いた還元条件下での SDS— PAGEに供した。電気泳動後、ゲルを CBB染 色することにより、 SPA'のバンドを検出した（図 9)。図 9において、「レーン番号 1」は 分子量マーカーを、「レーン番号 2」は対照として用いた Repligen社製プロテイン A ( rPA- 50) 0. 52 /z gを、「レーン番号 3」は培養開始から 24時間経過後の SPA，発 現ベクター Spa，一 pNK3260を有するブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— OK株の培養上清 1 μ 1を、「レーン番号 4」は培養開始力も 48時間経過後の同培養 上清 1 / lを、「レーン番号 5」は培養開始から 72時間経過後の同培養上清 1 /z lを、「 レーン番号 6」は培養開始から 78時間経過後の同培養上清 1 μ 1を、それぞれ泳動し たレーンを示す。
[0069] SDS— PAGEによる解析の結果、 目的とする SPA'は、培養開始後 48時間目（レ ーン番号 4)には大量に発現し、それ以降も SPA'の濃度は上昇しつづけ、最終的に 培養上清中に約 2g/Lの濃度で蓄積していた。培養上清中の SPA'の濃度は、レー ン番号 2で泳動した Repligen社製プロテイン A (rPA— 50) 0. 52 μ gのバンドを対照 として、 ChemiDoc XRSシステム（Bio— Rad社）により測定した。
[0070] 施例 7)形皙転橼体により牛 されたプロテイン Aの N末端アミノ酸西 R列の確認
図 9に示した SDS— PAGEゲル中のレーン番号 6において、分子量 33kDa付近に 見られる SPA'のバンドについて、その N末端から 10残基のアミノ酸配列を、定法に 従い解析した。その結果、配列番号 2に示したプロテイン Aのアミノ酸配列の 37番目 の Ala以降の配列と一致し、分泌シグナル配列が正確に除去されて 、ることが確認さ れた。
[0071] ( 施例 8)形皙転橼体により牛産されたプロテイン Aの杭体結合活件
実施例 6と同様に 78時間培養して得られた培養液の上清 1Lを、陽イオン交換クロ マトグラフィー（CM— Sepharose :アマシャムバイオサイエンス）に供し、 pH7. 0に おいて 0— 1M塩ィ匕ナトリウムの濃度勾配により分離した。次に SPA'画分を回収し、 疎水クロマトグラフィー（Phenyl— Sepharose：アマシャムバイオサイエンス）に供し、 pH7. 0において 1— 0M硫酸アンモ-ゥムの濃度勾配により分離した。さらに、 SPA ，画分を回収し、ゲルろ過クロマトグラフィー（HiLoad 16/60 Superdex 75 pg ： アマシャムバイオサイエンス）に供し、 SPA，画分を回収した。以上の精製操作に より、 SDS— PAGEにおいて単一バンドを示す、約 lOOmgの SPA，を調製した。
[0072] 上記で調製した SPA，のヒト IgG結合活性を以下の様に評価した。まず、 5 μ g/m Lとなるように SPA，を PBS緩衝液（タカラバイオ）で希釈し、 96穴ィムノプレート（NU NC)に 100 Lずつ分注した。 37°Cで 1時間反応させた後に、 PBS緩衝液（250 L)にて二回洗浄し、 3%ゥシ血清アルブミン ZPBS溶液を 250 Lカ卩え、 4°Cでー晚 ブロッキングした。次に、 0. 1% BSAを含有する PBS緩衝液で調製した 25 g/m Lヒト IgG (シグマ）溶液 100 1をカ卩えて、 37°Cで、 1. 5時間反応後、 0. 01%Twee n20を含む PBS緩衝液で洗浄した。これに、 PBS緩衝液にて 2000倍に希釈した H RP標識プロテイン L (0. 3mgZml ;シグマ社)溶液を 100 1カ卩え、 37°Cで、 1. 5時 間反応後、 0. 01%Tween20を含む PBS緩衝液で洗浄した。さらに、発色基質 [2, 2， -アジノジ（3—ェチルベンゾチアゾリンー 6—スルフォン酸）アンモ-ゥム塩]溶液 (シグマ社)を 100 1カ卩え、暗所にて 20分間反応後、 405nmにおける吸光度を測定 した。この時、対照として Repligen社製プロテイン A(rPA— 50)についても同様の操 作を行い、測定値を比較したところ、上記で調製した SPA，の単位質量当たりのヒト Ig G結合活性は、上記 Repligen社製プロテイン Aの約 97%であり、両者はほぼ同等の 活性を有することが確認された。
以上の結果から、実施例によるプロテイン Aの生産方法によれば、従来報告されて いた大腸菌、枯草菌における組換え型プロテイン Aの発現量を上回る生産性を達成 でき、従来問題となっていた低生産性の問題を解決できることを示している。

Claims

請求の範囲
[1] プロテイン A様蛋白質またはその部分的配列をコードする DNA配列、およびその 配列に作動可能に連結されたブレビバチルス (Brevibacillus)属細菌で機能しうる プロモーターを含む、 DNA配列。
[2] 該プロモーターが、ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質のプロモーターであり、 該プロモーターの下流に、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャインダルガノ配列 、及びブレビバチルス属細菌で機能しうる分泌シグナルペプチドをコードする DNA 配列をさらに含む、請求項 1記載の DNA配列。
[3] 請求項 1または 2記載の DNA配列を含む、発現ベクター。
[4] 請求項 3記載の発現ベクターを含む、ブレビバチルス属細菌形質転換体。
[5] 該ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス'ブレビス（Brevibacillus brevis) 47 株 (JCM6285)、ブレビバチルス'ブレビス 47K株（FERM BP— 2308)、ブレビバ チルス ·ブレビス 47— 5Q株 (JCM8970)、ブレビバチルス ·チョウシネンシス（Brevib acillus choshinensis) HPD31 (FERM BP— 1087)株およびブレビバチルス' チョウシネンシス HPD31— OK株（FERM BP— 4573)、並びにこれらの株由来の 変異体からなる群より選択される、請求項 4記載の形質転換体。
[6] 請求項 4または 5に記載の形質転換体を培養すること、および該形質転換体によつ て分泌生産されるプロテイン A様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質を回 収することを含む、プロテイン A様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質の 製造方法。
[7] 請求項 6記載の製造方法によってプロテイン A様蛋白質またはその部分的配列を 有する蛋白質を製造すること、および該プロテイン様蛋白質またはその部分的配列 を有する蛋白質を適当な基材に固定化すること、を含む、ィムノグロブリン吸着担体 の製造方法。
PCT/JP2005/012252 2004-07-06 2005-07-01 ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 WO2006004067A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002570253A CA2570253A1 (en) 2004-07-06 2005-07-01 Process for producing protein a-like protein with use of brevibacillus genus bacaterium
EP05755845A EP1767640A4 (en) 2004-07-06 2005-07-01 PROCESS FOR PREPARING A PROTEIN-A-like PROTEIN USING A BACTERIUM OF THE GENUS BREVIBACILLUS
JP2006528867A JPWO2006004067A1 (ja) 2004-07-06 2005-07-01 ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法
US11/630,334 US8597908B2 (en) 2004-07-06 2005-07-01 Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium
US14/066,231 US8889389B2 (en) 2004-07-06 2013-10-29 Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-198831 2004-07-06
JP2004198831 2004-07-06

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/630,334 A-371-Of-International US8597908B2 (en) 2004-07-06 2005-07-01 Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium
US14/066,231 Division US8889389B2 (en) 2004-07-06 2013-10-29 Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006004067A1 true WO2006004067A1 (ja) 2006-01-12

Family

ID=35782871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/012252 WO2006004067A1 (ja) 2004-07-06 2005-07-01 ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US8597908B2 (ja)
EP (2) EP2251425B1 (ja)
JP (4) JPWO2006004067A1 (ja)
CA (1) CA2570253A1 (ja)
WO (1) WO2006004067A1 (ja)

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008146906A1 (ja) 2007-05-30 2008-12-04 Kaneka Corporation ホルミル基含有多孔質担体、それを用いた吸着体、およびそれらの製造方法
EP2099932A4 (en) * 2006-12-06 2009-11-18 Repligen Corp NUCLEIC ACIDS ENCODING THE RECOMBINANT PROTEIN A
WO2010001960A1 (ja) * 2008-07-03 2010-01-07 株式会社カネカ 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法
WO2010064437A1 (ja) 2008-12-03 2010-06-10 株式会社カネカ ホルミル基含有多孔質担体、それを用いた吸着体、およびそれらの製造方法
WO2010110288A1 (ja) 2009-03-24 2010-09-30 株式会社カネカ 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
JP2010246569A (ja) * 2004-07-06 2010-11-04 Kaneka Corp ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法
WO2011118699A1 (ja) 2010-03-24 2011-09-29 株式会社カネカ 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
WO2012133349A1 (ja) 2011-03-25 2012-10-04 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用タンパク質
WO2012133342A1 (ja) 2011-03-25 2012-10-04 株式会社カネカ 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド
US8592555B2 (en) 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
WO2014038686A1 (ja) 2012-09-10 2014-03-13 株式会社カネカ 吸着体
WO2014046278A1 (ja) 2012-09-21 2014-03-27 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド
US8754196B2 (en) 2011-06-08 2014-06-17 Emd Millipore Corporation Chromatography matrices including novel Staphylococcus aureus protein A based ligands
WO2015056681A1 (ja) 2013-10-15 2015-04-23 株式会社カネカ 多孔質セルロースビーズの製造方法およびそれを用いた吸着体
WO2015056680A1 (ja) 2013-10-15 2015-04-23 株式会社カネカ 多孔質セルロースビーズの製造方法
WO2015056679A1 (ja) 2013-10-15 2015-04-23 株式会社カネカ 多孔質セルロースビーズの製造方法及びそれを用いた吸着体
US10072050B2 (en) 2008-12-24 2018-09-11 Emd Millipore Corporation Caustic stable chromatography ligands
US10435732B2 (en) 2014-06-09 2019-10-08 Kaneka Corporation Method for producing recombinant proteins using recombinant brevibacillus

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111139207B (zh) * 2019-09-04 2022-06-24 湖南省微生物研究院 一种短短芽孢杆菌基因重组菌株及其制备方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59113890A (ja) * 1982-10-27 1984-06-30 レプリゲン・コ−ポレ−シヨン プロテインａ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物
JPS59205996A (ja) * 1983-04-28 1984-11-21 ジェネックス・コーポレイション 蛋白質ａの生産方法
JPS6058074A (ja) * 1983-09-09 1985-04-04 Juzo Udaka バチルス・ブレビスを形質転換する方法
JPH03251185A (ja) * 1990-02-28 1991-11-08 Juzo Udaka 耐熱性β―アミラーゼの製造方法
JPH04278091A (ja) * 1991-03-05 1992-10-02 Higeta Shoyu Kk 高発現ベクター及び該高発現ベクター　を保有する微生物並びに該微生物を　用いる有用物質の製造法
JPH06296485A (ja) * 1993-02-22 1994-10-25 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 変異バチルス・ブレビス菌
JPH07265094A (ja) * 1994-02-10 1995-10-17 Juzo Udaka 抗体蛋白をコードする組換えｄｎａおよび抗体蛋白の製造法

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6211688A (ja) * 1985-07-10 1987-01-20 Daicel Chem Ind Ltd レ−ザ−記録用フイルム
JPS62111688A (ja) * 1985-11-07 1987-05-22 Sekisui Chem Co Ltd プロテインａ様物質の遺伝子，該遺伝子を含有する組み換えプラスミド，および該組み換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞
SE459662B (sv) 1986-03-21 1989-07-24 Pharmacia Ab Hybrid-dna-molekyl som kodar foer ett protein med samma igg specificitet som protein g, plasmid innehaallande densamma samt foerfarande foer framstaellning av proteinet
JPS6356277A (ja) * 1986-08-26 1988-03-10 Higeta Shoyu Kk 新規バチルス・ブレビス及びその利用
US5260373A (en) * 1987-03-13 1993-11-09 Repligen Corporation Immobilized immunoglobulin-binding proteins
JPS63294796A (ja) 1987-05-27 1988-12-01 Sagami Chem Res Center タンパク質の再賦活化方法
EP0326046A3 (en) 1988-01-25 1990-06-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of human epidermal growth factor
JP2584697B2 (ja) 1991-08-23 1997-02-26 オリエンタル酵母工業株式会社 ＩｇＧ精製用組換え型プロテインＡ
JPH0638741A (ja) 1992-03-31 1994-02-15 Kumamoto Pref Gov ヒラメ成長ホルモンの製造法
JP3433807B2 (ja) 1992-03-31 2003-08-04 鵜高 重三 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするｄｎａを保有する発現ベクターを組み込んだバチルス・ブレビスを用いる有用物質の製造法
JPH05328970A (ja) 1992-06-03 1993-12-14 Hiroo Ikezawa スフィンゴミエリナ−ゼの製造法
JPH05336986A (ja) 1992-06-05 1993-12-21 Takara Shuzo Co Ltd タンパク質の再賦活化剤
JP2727391B2 (ja) 1992-07-23 1998-03-11 ヒゲタ醤油株式会社 高発現ベクター及び該高発現ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法
JPH0658074A (ja) 1992-08-04 1994-03-01 Kopurosu:Kk 立坑構築用円形ケーシングの土砂かき寄せ装置
JPH0759580A (ja) 1992-09-04 1995-03-07 Nippondenso Co Ltd ヒトカルシトニン前駆体ペプチドの製造法
JP3489865B2 (ja) 1993-02-22 2004-01-26 住友製薬株式会社 ヒト成長ホルモンの製造法
AU6046294A (en) 1993-02-22 1994-09-14 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Process for producing human growth hormone
JPH06253883A (ja) 1993-03-01 1994-09-13 Higeta Shoyu Co Ltd Ｃ型肝炎ウィルスエンベロ−プ蛋白質の 製造法
JPH07107980A (ja) 1993-09-30 1995-04-25 Toyota Central Res & Dev Lab Inc カビプロテインジスルフィドイソメラーゼの高効率製造法
JPH07187019A (ja) 1993-12-27 1995-07-25 Nissan Motor Co Ltd 自動車の車体構造
JPH07184642A (ja) 1993-12-27 1995-07-25 Toagosei Co Ltd ホスホリパーゼｃの生産方法
US5665570A (en) 1994-02-10 1997-09-09 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody-encoding recombinant DNA and its use
JPH09135693A (ja) 1995-09-13 1997-05-27 Higeta Shoyu Co Ltd 形質転換微生物及び該微生物を用いた 異種遺伝子産物の製造法
SE9503925D0 (sv) * 1995-11-07 1995-11-07 Pharmacia Biotech Ab Separationsmedium för IgG
JPH09180558A (ja) 1995-12-27 1997-07-11 Hitachi Cable Ltd 低摩擦ケーブルの製造方法
DK0941349T3 (da) * 1996-11-18 2004-02-09 Novozymes Biotech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider i surfactinmutanter af Bacillusceller
JPH10225294A (ja) 1997-02-14 1998-08-25 Higeta Shoyu Co Ltd 融合タンパク質、それをコードするｄｎａ、そのｄｎａを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、融合タンパク質の製造法、抗トレポネーマ・パリダム抗体の測定法及び測定用試薬、梅毒感染診断薬並びに抗トレポネーマ・パリダム抗体の製造法
JPH10218895A (ja) 1997-02-14 1998-08-18 Higeta Shoyu Co Ltd 改変タンパク質、それをコードするｄｎａ、そのｄｎａを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、改変タンパク質の製造法、抗トレポネーマ・パリダム抗体の測定法及び測定用試薬、梅毒感染診断薬並びに抗トレポネーマ・パリダム抗体の製造法
GB9703406D0 (en) 1997-02-19 1997-04-09 Chiron Spa Expression of heterologous proteins
JPH11178574A (ja) 1997-12-22 1999-07-06 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 新規コラーゲン様タンパク質
JP2000083670A (ja) 1998-09-09 2000-03-28 Hsp Kenkyusho:Kk ＤｓｂＡ／ＤｓｂＢ／ＤｓｂＣ／ＤｓｂＤ発現プラスミド
JP2001078771A (ja) 1999-09-07 2001-03-27 Higeta Shoyu Co Ltd 新規タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該タンパク質の製造法
AU2001241125A1 (en) * 2000-03-14 2001-09-24 Itoham Foods Inc. Process for producing polypeptide having disulfide bond
JP3532510B2 (ja) * 2000-07-21 2004-05-31 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 組換え豚丹毒菌防御抗原の回収精製法
JP3753945B2 (ja) 2001-02-14 2006-03-08 ヒゲタ醤油株式会社 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクター
JP2003079379A (ja) 2001-09-13 2003-03-18 Itoham Foods Inc 成長ホルモンの高発現用ｄｎａおよびその使用
JP2003135068A (ja) 2001-10-31 2003-05-13 National Agricultural Research Organization ウシ腫瘍壊死因子の製造方法
JP2003135060A (ja) 2001-10-31 2003-05-13 National Agricultural Research Organization ウシインターロイキン−１βの製造方法
JP2003169675A (ja) 2001-12-04 2003-06-17 Higeta Shoyu Co Ltd 新規ジスルフィド酸化還元酵素
SE0200943D0 (sv) * 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
JP2004129576A (ja) 2002-10-10 2004-04-30 Juzo Udaka 超耐熱性エンドグルカナーゼの製造法
JP4153808B2 (ja) 2003-03-14 2008-09-24 八鹿鉄工株式会社 除雪機の除雪部昇降機構
CA2546083C (en) 2003-11-11 2014-01-21 Higeta Shoyu Co., Ltd. Novel brevibacillus choshinensis and method for producing protein using the microorganism as host
EP2251425B1 (en) * 2004-07-06 2016-04-20 Kaneka Corporation Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59113890A (ja) * 1982-10-27 1984-06-30 レプリゲン・コ−ポレ−シヨン プロテインａ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物
JPS59205996A (ja) * 1983-04-28 1984-11-21 ジェネックス・コーポレイション 蛋白質ａの生産方法
JPS6058074A (ja) * 1983-09-09 1985-04-04 Juzo Udaka バチルス・ブレビスを形質転換する方法
JPH03251185A (ja) * 1990-02-28 1991-11-08 Juzo Udaka 耐熱性β―アミラーゼの製造方法
JPH04278091A (ja) * 1991-03-05 1992-10-02 Higeta Shoyu Kk 高発現ベクター及び該高発現ベクター　を保有する微生物並びに該微生物を　用いる有用物質の製造法
JPH06296485A (ja) * 1993-02-22 1994-10-25 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 変異バチルス・ブレビス菌
JPH07265094A (ja) * 1994-02-10 1995-10-17 Juzo Udaka 抗体蛋白をコードする組換えｄｎａおよび抗体蛋白の製造法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOFDAHL S. ET AL: "Gene for staphylococcal protein A", PROC.NATL.ACAD.SCI. USA, vol. 80, no. 3, 1983, pages 697 - 701, XP008095034 *
See also references of EP1767640A4 *
UDAKA J. ET AL: "Ishu Tanpakushitsu no Seisan Gijutsu Bacillus brevis ni yoru Seisan o Chushin ni", BIO INDUSTRY, vol. 9, no. 2, 1992, pages 23 - 31, XP008092297 *
UHLEN M. ET AL: "Complete sequence of the staphylococcal gene encoding protein A. A gene evolved through multiple duplications", J.BIOL.CHEM., vol. 259, no. 3, 1984, pages 1695 - 1702, XP008092291 *

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010246569A (ja) * 2004-07-06 2010-11-04 Kaneka Corp ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法
US7691608B2 (en) 2006-12-06 2010-04-06 Repligen Corporation Nucleic acids encoding recombinant protein A
EP2099932A4 (en) * 2006-12-06 2009-11-18 Repligen Corp NUCLEIC ACIDS ENCODING THE RECOMBINANT PROTEIN A
WO2008146906A1 (ja) 2007-05-30 2008-12-04 Kaneka Corporation ホルミル基含有多孔質担体、それを用いた吸着体、およびそれらの製造方法
JP2015077152A (ja) * 2008-07-03 2015-04-23 株式会社カネカ 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法
JP5763920B2 (ja) * 2008-07-03 2015-08-12 株式会社カネカ 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法
WO2010001960A1 (ja) * 2008-07-03 2010-01-07 株式会社カネカ 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法
US9920112B2 (en) 2008-08-11 2018-03-20 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
US8592555B2 (en) 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
WO2010064437A1 (ja) 2008-12-03 2010-06-10 株式会社カネカ ホルミル基含有多孔質担体、それを用いた吸着体、およびそれらの製造方法
US9149794B2 (en) 2008-12-03 2015-10-06 Kaneka Corporation Formyl group-containing porous support, adsorbent using same, method for producing same, and method for producing the adsorbent
US9932415B2 (en) 2008-12-03 2018-04-03 Kaneka Corporation Formyl group-containing porous support, adsorbent using same, method for producing same, and method for producing the adsorbent
US11084851B2 (en) 2008-12-24 2021-08-10 Emd Millipore Corporation Caustic stable chromatography ligands
US10072050B2 (en) 2008-12-24 2018-09-11 Emd Millipore Corporation Caustic stable chromatography ligands
WO2010110288A1 (ja) 2009-03-24 2010-09-30 株式会社カネカ 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
WO2011118699A1 (ja) 2010-03-24 2011-09-29 株式会社カネカ 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
WO2012133342A1 (ja) 2011-03-25 2012-10-04 株式会社カネカ 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド
WO2012133349A1 (ja) 2011-03-25 2012-10-04 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用タンパク質
US9234010B2 (en) 2011-06-08 2016-01-12 Emd Millipore Corporation Chromatography matrices including novel Staphylococcus aureus protein A based ligands
US9018305B2 (en) 2011-06-08 2015-04-28 Emd Millipore Corporation Chromatography matrices including novel Staphylococcus aureus protein a based ligands
US8895706B2 (en) 2011-06-08 2014-11-25 Emd Millipore Corporation Chromatography matrices including novel Staphylococcus aureus protein A based ligands
US8754196B2 (en) 2011-06-08 2014-06-17 Emd Millipore Corporation Chromatography matrices including novel Staphylococcus aureus protein A based ligands
US9376474B1 (en) 2011-06-08 2016-06-28 Emd Millipore Corporation Chromatography matrices including novel Staphylococcus aureus protein a based ligands
WO2014038686A1 (ja) 2012-09-10 2014-03-13 株式会社カネカ 吸着体
WO2014046278A1 (ja) 2012-09-21 2014-03-27 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド
WO2015056680A1 (ja) 2013-10-15 2015-04-23 株式会社カネカ 多孔質セルロースビーズの製造方法
WO2015056681A1 (ja) 2013-10-15 2015-04-23 株式会社カネカ 多孔質セルロースビーズの製造方法およびそれを用いた吸着体
WO2015056679A1 (ja) 2013-10-15 2015-04-23 株式会社カネカ 多孔質セルロースビーズの製造方法及びそれを用いた吸着体
US10435732B2 (en) 2014-06-09 2019-10-08 Kaneka Corporation Method for producing recombinant proteins using recombinant brevibacillus

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016063844A (ja) 2016-04-28
JP2014064589A (ja) 2014-04-17
EP1767640A1 (en) 2007-03-28
EP1767640A4 (en) 2008-03-26
JPWO2006004067A1 (ja) 2008-04-24
US20140080179A1 (en) 2014-03-20
US20070243582A1 (en) 2007-10-18
EP2251425B1 (en) 2016-04-20
US8889389B2 (en) 2014-11-18
JP2010246569A (ja) 2010-11-04
US8597908B2 (en) 2013-12-03
EP2251425A1 (en) 2010-11-17
CA2570253A1 (en) 2006-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8889389B2 (en) Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium
Rigi et al. A comprehensive review on staphylococcal protein A (SpA): Its production and applications
CN1160462C (zh) 利用革兰氏阳性菌表达重组蛋白质
EP3153581B1 (en) Method for producing recombinant proteins using recombinant brevibacillus
AU729449B2 (en) Materials and methods relating to the attachment and display of substances on cell surfaces
WO2007071996A2 (en) Twin-arginine translocation (tat) streptomyces signal sequences
JP3040817B2 (ja) ＩｇＧ結合タンパク質
JPWO2015190458A1 (ja) 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法
JP2015077152A (ja) 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法
EP2129782A1 (en) Modified microorganism
EP1981978B1 (en) Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins
RU2758604C2 (ru) Рекомбинантный белок GM, обладающий способностью связывать α2-макроглобулин и его применение в качестве лиганда в аффинной хроматографии для выделения α2-макроглобулина из сыворотки крови человека
JP4049408B2 (ja) グラム陽性菌菌体表面へのタンパク質の固定化方法
JP5806897B2 (ja) ポリペプチド及び組換え微生物
JP4196232B2 (ja) ポリペプチドの精製方法およびキット試薬
Freudl Staphylococcus carnosus and other Gram-positive bacteria
JP2006320220A (ja) プロテインａ融合ポリペプチドの製造に利用するｄｎａ配列、組換え発現ベクター、形質転換体、およびその融合ポリペプチドの製造方法
JP2010220539A (ja) 胞子形成能が欠損した細菌、及びそれを用いたタンパク質製造方法
US20070110761A1 (en) Protein purification means
CN101280335A (zh) 牛分支杆菌免疫原性分泌型蛋白的筛选鉴定方法
Nijland Heterologous expression and secretion of Clostridium perfringens β-toxoid by
Kirillova et al. Recombinant Cry9A is able to form crystals in sporulating cells of Bacillus thuringiensis

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006528867

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2570253

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005755845

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11630334

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005755845

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 11630334

Country of ref document: US