WO2006036003A1

WO2006036003A1 - 生体特異的親和性を有する物質を結合した微粒子及びその使用

Info

Publication number: WO2006036003A1
Application number: PCT/JP2005/018399
Authority: WO
Inventors: Yukio Nagasaki; Tomoko Jomura; Yoshinori Katsuyama; Tadahito Takahashi; Kazunori Kataoka
Original assignee: Yukio Nagasaki; Tomoko Jomura; Yoshinori Katsuyama; Tadahito Takahashi; Kazunori Kataoka
Priority date: 2004-09-28
Filing date: 2005-09-28
Publication date: 2006-04-06
Also published as: JPWO2006036003A1

Abstract

一対の生体特異的親和性(bio-specific　affinity)を有する物質の一方の構成員を、表面に結合した微粒子であって、該表面にさらに、ポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が直接結合されている微粒子、並びにその微粒子の生体関連物質の精製等への使用が開示される。かような微粒子を使用することにより、効率のよい高い生体関連物質の精製方法等が提供できる。

Description

生体特異的親和性を有する物質を結合した微粒子及びその使用

技術分野

本発明は、一対の生体特異的親和性（bio - specific affinity) 明

を有する物質の一方の構成員、例えば、抗体もしくは抗原、核酸等が結合した微粒子の、生物試料中に含まれる該構成員に対書

するもう一方構成員を検出、分離 · 精製するための使用、並びに該微粒子に関する。背景技術

従来、血液、体液、生体組織から得られる破砕液、抽出液、無細胞タンパク質合成液などの試料（以下、これらを総称して「生物試料」と呼ぶ）中の特定の目的物質を、効率よく検出するか、または高収率で分離 · 精製するための多種多様な方法、手段およびァプローチが存在する。

一般的なアプローチの例として、分離担体に対する特異的親和性を利用する場合には、例えば、目的薬物に対して特異的に結合し得る抗体、目的配列を有する核酸に相補的な配列を有する核酸、あるいは目的物が細胞である場合には該細胞に特異的に発現する因子もしくはレセプターに特異的に結合しる抗体もしくはリガンドを水不溶性固相担体に固定した分離単体が使用されている。通常、このような分離担体をカラムに充填後、当該抗体、リガンド等と親和性を有し、特異的に結合し得る物質を含む生物試料をカラムに添加することにより、該物質を分離担体と接触させ、当該抗体、リガンド等と該物質の複合体を形成させ、適宜、バッファ一等で洗浄の後、続いて、例えば非常にイオン強度が高いバッファー、界面活性剤溶液、または非常に p Hが高いかもしくは低いバッファ一により、複合体を解離させて該物質を溶出させ、取得することを含んでなるァフィ二ティークロマトグラフィ一が汎用されている。このァフィニティークロマトグラフィーは、目的とする物質と固相に固定化された、例えば、リガンドとの間の特異的な相互作用を利用する非常に選択的であり、かつ効果的な精製方法である。

しかしながら、この方法では回収率が悪く、また非常に時間がかかり、場合によっては精製した生体分子が変性して活性を失ってしまう可能性があるため、使用に際し、低温室、クロマトチャンバ一等の特殊な施設の使用を必要とするという欠点があった。

一方、別法として、ミクロスフエア等の微粒子担体上で、上記複合体を形成させ、遠心分離等により分離担体を回収し、必要に応じ、適宜、バッファ一等で洗浄した後、次いで必要に応じて、例えば、非常にイオン強度が高いバッファー、または非常に p Hが高いかもしくは低いバッファーに上記複合体をさらすことにより、親和性により分離担体上に結合した目的物質を解離、溶出させる方法もある。

このような微粒子担体を用いて、目的物質、例えば特定のタンパク質を分離回収し、電気泳動、ウェスタンプロット等で検出する方法は、特に免疫沈降法（immunoprecipitation) と呼ばれ、細胞抽出液等から微量タンパク質を検出する上で、非常に有用な手段である。しかしながら、この方法は、固相担体として用いるミクロスフエア表面へ、夾雑物が非特異吸着し、分離効率が悪くなることがよくある。

近年、生体関連物質の検出、分離に関する従来技術を実施する際の煩雑さの解消、および分離効率の向上を目的として、このような微粒子担体による検出法や分離法が注目され、種々の微粒子が提案されている。例えば、特開平 1 0 — 1 9 5 0 9 9 号公報（または EP 787988A2 ,以下、文献 1 とレ、う）に記載されたミクロスフィァ、特開平 1 1 一 1 9 1 5 0 9号公報（以下、文献 2 とレヽう）もしくは特開平 1 1 一 1 9 1 5 1 0号公報（以下、文献 3 という）に記載された磁性粒子、さらに、本発明者等の一部による出願に基づく WO 2 0 0 4 / 0 5 6 8 9 5 A1 (以下、文献 4 という）に記載されたポリオキシエチレン鎖の一端でラテックス粒子に結合子し、該鎖の他端にリガンド等を担持しうるラテックス粒子が挙げられる。

文献 1 には、スチレンーグリシジルメタクリレート重合体にスぺーサーを介して生理活性を有する物質を結合したミクロスフィァが記載されている。このミクロスフィァは該生理活性を有する物質に対して親和性を有する生物試料中の物質と効率よく特異的に結合し得ること等に利点を有することが示唆されている。文献 2 には磁性体とは異種の金属酸化物で被覆された磁性体からなり、表面に核酸が吸着せしめられた磁性粒子が、また、文献 3 には、磁性を有する金属または金属化合物からなる粒子をポリマーで被覆した磁性ポリマー粒子であって、表面に特定の抗体が吸着せしめられた磁性粒子が、記載されている。また、文献 3では、さらに、かような磁性粒子を、 0 . 5 %ゥシ血清アルブミン（ B S A ) と、 0 . 1 %のポリエチレングリ一ルとを含むリン酸生理食塩緩衝液の溶液に振動分散させた後、室温で 3 0分間ゆるく振とうして、前記抗体が吸着されてレ、ない粒子表面をアルブミンでブロッキング処理した微粒子も記载されている。

しかしながら、目的以外の、すなわち、興味の対象でなレ、、タンパク質、脂質、無機塩等が一般に混在する生体試料中から、例えば、文献 1 〜 3のいずれかに記載の微粒子を用いて特定の物質を単離 z精製するには、共存する分子の微粒子表面への非特異吸着が特異的反応と共に生じると同時に、粒子が容易に凝集、沈殿することがあり、分離効率、回収率が低下する場合があつた。

明の開示

文献 3 の粒子表面をアルブミンでブ口ッキング処理した微粒子は前記の非特異的吸着をある程度抑制でき、また、文献 4 に記載された粒子では、当該非特異的吸着をより一層抑制することができる。しかし、文献 3に記載の微粒子にあっては、さらに当該非特異的吸着をより一層抑制でき、または、文献 4に記載の微粒子にあっては、別の調製方法で取得でき、もしくは異なる構造を有するが、該微粒子と同等もしくはそれ以上の非特異的吸着特性を有する微粒子を提供できると、当該技術分野の進歩に寄与するであろう。

例えば、文献 1 、文献 2または文献 3 (また、文献 3で引用されている文献に記載された磁性体を含むポリマー粒子を含む）に記載された、リガンドもしくは抗体等が場合によりスぺーサ一を介して結合した微粒子が、ポリエチレングリコール（以下「PE G」と略記することもある）鎖が水性媒体中で自由に運動しうるよう〖こポリエチレングリコールセグメントを含有するボリマー誘導体を、さらに微粒子表面に結合させると、上記の非特異的吸着を有意に低下させることができることが、見出された。こちら《；、市販されている微粒子から容易に作製できる点にも利点がある。

こうして、本発明は、

第一の態様として . 一対の生体特異的親和性（ bio - sp ecific affinity) を有する物質の一方の構成員を、直接もしくはスぺ一サーを介して表面に結合した微粒子であって、該表面にさらに、ポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が直接結合されており、かつ、該誘導体中のポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で自由に運動しうる形態にある微粒子を、前記生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を含有し、そして該微粒子に非特異的に結合しうる物質の存在が疑われる試料と水性媒体中で接触させる段階、及び

該微粒子上の該一方の構成員を該もう一方の構成員と選択的に結合を形成させる段階、を含んでなる一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員ともう一方構成員との特異的結合対の形成方法、

または、

前記微粒子の、前記生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を含有し、そして該微粒子に非特異的に結合しうる物質の存在が疑われる試料中の該もう一方の構成員と微粒子上の該一方の構成員との選択的な結合を形成させる担体のための使用、

を提供する。

また、別の態様の本発明として、前記微粒子の内の特定の微粒子の、従来の微粒子の改質による製造方法、及び特定の微粒子も提供される。

発明の詳細な記述

本発明にいう、一対の生体特異的親和性を有する物質は、限定されるものでないが、抗体と抗原（またはハプテン）、薬物（またはリガンド）とそのレセプター（レセプターを発現している細胞を含む）、ある一本鎖才リゴもしくはポリヌクレオチドとその相補的ヌクレオチド配歹 IJを有するポリヌクレオチド、酵素とその基質、及び糖とレクチン等を挙げることができる。本発明で使用する微粒子には、前記物質間の対を形成するいずれか一方構成員である化合物もしくは物質が、微粒子表面の特性に応じてそれらの表面に物理的もしくは化学的に結合される。結合は、さらにスぺーサーを介して達成されてもよい。かような、スぺーサ一には、例えば、献 1 に記載されるようなエチレンダリコールジグリシジルエーテル等の両末端が官能基を有するように修飾された化合物の官能基を利用して一対の生体特異的親和性を有する物質の一構成員と微粒子が結合、特に、共有結合されていてもよい。エチレングリコールは、ジ一、トリー、テトラーエチレングリコール等のオリゴエチレングリコーノレであることができ、また、官能基は、グリシジル基に代え、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基またはスルホ基等であることができる。抗体等の高分子量の分子を微粒子に結合させる場合には、該分子に対する抗原との結合特性に悪影響を及ぼさない限り、抗体を直接微粒子に結合させることができる。

このような微粒子には、前記の文献 1 、文献 2、文献 3及ぴそれらの中で引用されている公知の微粒子からなる群より選ばれ、本発明の目的に使用できるものであれば、如何なる微粒子も包含される。したがって、引用することにより、文献 1 〜 3 の記載事項は、本明細書の内容となる。かかる、微粒子は、本発明の目的上、それらの平均粒径が、 0 . 0 2 μη！〜 5 mm , 好ましくは 0 . 0 5 μπ！〜 1 0 0 μπιである。

本発明によれば、該微粒子は、ポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導^が直接結合（物理的、例えば、イオン結合、水素結合、疎水結合等またはこれらの複数種の結合により、または化学、特に、共有結合により）されており、力つ、該誘導体中のポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で自由に運動しうる形態にある。水性媒体中とは、緩衝剤の溶液、生物試料、例えば、血液、尿、体液、細胞破砕物含有緩衝液、細胞抽出液等、の本発明の目的に沿うそれらの水性溶液，希釈液、水性縣濁液、等をいう。ポリエチレンク、' リコール鎖がかような水性媒体中で自由に運動しうる形態にあるとは、微粒子に非結合（または非付着）末端側のポリエチレングリコール鎖が水性媒体中に溶解した状態にあり、好ましく W；、微粒子に結合した前記構成員が結合していない微粒子表面をポリエチレンダリコール鎖からなるブラシ構造体が実質的に被覆しうるような状態にあることを意味する。表面に複数のポリエチレングリコール鎖を有するポリエチレングリコール鎖が k性媒体中でブラシ構造を有しうることは当該技術分野で周知であり、本明細書では、そのような周知の意味で用いている。

該ポリエチレンダリコール誘導体は、その中のポリエチレングリコールセグメントが、重合度 2 〜 1 0 O 0 0、好ましくは 4 0〜 5 0 0 を有し、そして前記微粒子表面にポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で自由に運動しうる形態で保持もしくは固定されるように結合できる部位乃至領域を構成する残基もしくは分子の部分を有する。このような部位乃至領域は、オリゴーもしくはポリアミンからなるセグメントであり、ポリェチレングリコールとポリアミンのブ口ック共重合体であることができる。ポリアミンセグメントは、下記一般式（ 1 ) 及ぴ（ 2 ) で表されるポリマーセグメントであること： ^できる。

一般式（ 1 ) ：

式中、 mは 1 〜 1 0 の整数を表し、 n は 1〜： L 0 0 の整数を表し、そして 1 ェ及ぴ1 ₂ は、互いに独立して、水素原子もしくは炭素原子数が 1 〜 5 のアルキル基である。

一般式（ 2 ) ：

式中、 X + y は 1 〜 3 0までの整数であり、 R¹〜！ I⁴ は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が 1〜 5 のアルキル基を表す。

このようなポリエチレンダリコール誘導体が表面に結合された、微粒子（以下、 P E G修飾微粒子ともいう）で、特に好ましいものは一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員が、直接もしくはスぺーサーを介して表面に結合しており、そしてポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で運動しうる形態でポリエチレンダリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が表面に直接結合した微粒子であって、該微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にるラテックス粒子であり、かつ、ラテックス表面にカルボキシル基が存在するものであり、そしてポリマー誘導体がポリエチレングリコールセグメント及ぴポリアミンセグメントを有する共重合体であつて、ポリエチレングリコールセグメントが、重合度 2〜 1 0 0 0 0からなり、かつ、ポリアミンセグメントが、一般式（ 2 ) ；

式中、 X + y は；！〜 3 0までの整数であり、 R¹〜！ ⁴ は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が 1〜 5 のァノレキノレを表す、で表されるポリァミンである、微粒子を挙げることができる

P E G修飾微粒子はヽ一例を挙げれば、水性媒体中に分 ¾している、一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員が直接もしくはスぺーサ一を介して表面に結合された微粒子を、該水性媒体中でポリェチレングリコーノレセグメントを含有するポリマー誘導体と接触させる段階、及ぴ該微粒子表面に該ポリマー誘導体を結合させる段階、を含んでなる一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員を、直接もしくはスぺーサ一を介して表面に結合した微粒子表面の改質方法により、都合よく製造できる。この改質方法では、該微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子であるカまたは磁性体をシリカもしくは金属アルコキシドで被覆した形態にある無機粒子であり、好ましくは、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子であつて、かつ、ラッテックス表面にカルボキシル基が存在するものであり、他方、ポリマー誘導体がポリエチレングリコールセグメント及ぴポリァミンセグメントを有する共重合体であって、ポリエチレングリコールセグメントが、重合度 2〜 1 0 0 0 0 からなり、かつ、ポリアミンセグメントが、下記一般式（ 1 ) 及び（ 2 ) ：

( 1 )

式中、 mは 1 〜 1 0の整数を表し、 n は 1〜 1 0 0の整数を表し、そして及び R ₂ は、互いに独立して、水素原子もしくは炭素原子数が 1 〜 5のアルキル基である；

( 2 )

式中、 x+y は 1〜 3 0までの整数であり、 Ri〜 R4 は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が 1 〜 5のアルキル基を表す、のポリアミンのいずれかであり、好ましくは、一般式（2 ) で表されるポリアミンを使用するのがよい。上記の微粒子とポリマー誘導体と接触させる段階、及び該微粒子表面に該ポリマー誘導体を結合させる段階は、水性媒体中で、一方の構成員のもう一方の構成員に対する結合特性に悪影響を及ぼさない条件下、例えば、室温以下の温度で、単に、ポリマー誘導体が、該微粒子表面にイオン結合、水素結合、疎水結合等の物理的結合またはこれらの 2種以上の結合がもたらされる条件下で、または該微粒子表面にカルボキシル基等の官能基が存在する場合には、縮合脱水剤（例えば、 1 ーェチルー 3 - ( 3 —ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド（ ED C)、 N

— ヒドロキシスクシンイミド（NHS) 等）の存在する緩和な条件下で、該官能基と、例えば、ポリマー誘導体中に存在するァミノ基との間でアミド結合を形成させる条件下で行うことができる。

P E G修飾微粒子は、該微粒子上の一方の構成員と特異的親和性を有し、特異的な対合物、もしくは複合体を形成するもう一方の構成員と、それらを含み、かつ、該微粒子に非特異的に結合しうる物質の存在が疑われる試料、特に、生物試料、例えば、血液、尿、体液、細胞破砕物含有緩衝液、細胞抽出液等それ等自体、またはそれらの希釈もしくは緩衝化された水性媒体中で接触させると、該微粒子上の該一方の構成員を該もう一方の構成員と選択的に結合が形成できるので、該試料中での、 ― 対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員ともう一方構成員との特異的結合対の形成方法に使用できる。このような使用は、該試料中に存在するもう一方の構成員を検出すること、精製すること、または該結合を形成する物質のスクリーニング方法を提供するのに使用できる。

例えば、もう一方の構成員たる物質を含有する試料から、該物質を精製する場合には、上記の特異的結合対を形成したのち、結合物を遠心により、また、使用する粒子が磁性粒子である場合には、磁界を印加することにより集め、水もしくは適当な緩衝液等で洗浄し、非特異的に吸着した夾雑物を洗い流した後、結合物をイオン強度が高い緩衝液、界面活性剤溶液、 p Hが高いかもしくは低い緩衝液を用いて処理、例えば、当該溶液中でのインキュベーション、することにより該特異的結合対を形成した複合体から目的の物質を単離することができる。

また、例えば、特定のレセプターに特異的に結合する薬物をスクリーニングする場合には、興味のあるレセプターを発現している動物細胞、微生物細胞、およびそれらの破砕物から取得されるレセプタータンパク質が結合した微粒子を調製し、該微粒子とスクリーニングにかけるべき化合物もしくは物質と適当な緩衝剤溶液中でインキュベートする。次いで、洗浄により、特異的に結合した複合体が得られたなら、該複合体から、特異的に結合していた化合物もしくは物質を同定する。こうして同定された化合物もしくは物質を、当該レセプターを担持する細胞もしくは該細胞を有する動物を用いる in vitro もしくは in vivo試験に供し、それらが本来レセプターに対するリガンドのアンタゴニストもしくはァゴニストである力こついて評価し、目的化合物であるか否かを決定すればよい。こうして、本発明によれば、 P E G修飾微粒子を使用する該試料中に存在するもう一方の構成員の検出方法もしくは分離もしくは精製方法、または該結合を形成する物質のスクリーニング方法が提供される。

該試料中での、微粒子上に結合された一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員ともう一方構成員との特異的結合対の形成方法は、限定されるものでないが、室温中、試料中に添加した P E G修飾微粒子を適当な時間、通常、 1 〜 2 4時間、インキュベートすることにより、実施できる。

上述したとおり、本発明に従う精製方法等が実施される場合には、表面に特異的リガンドを結合した微粒子、好ましくは、磁性粒子に、試料中から前記生体特異的親和性を有する物質を選択的に結合させ、磁気分離と洗浄とを行って非特異的結合した夾雑物を除き、磁性粒子から目的物質を分離する操作を行えばよい。前記 PE G修飾微粒子は、生理学的条件下での分散性に優れ、高イオン強度、あるいはタンパク等の夾雑物下でも沈降しにくい性質を持ち、その結果、リガンド等の特異的親和性を有する分子との結合効率が極めて高く、精製の収率、純度を向上させることができる。なお、微粒子に磁性を付与する磁性体は、本発明の目的に沿う限りいかなる種類もしくは起源によるものであっても使用できるが、磁気応答性を有する金属酸化物、限定されるものでないが、例えば、鉄、コバルト、ニッケル等の金属酸化物が挙げられ、特に、マグネタイト、マグへマィト、マンガン酸亜鉛フエライト等の強磁性酸化鉄を好ましいものとして挙げることができる。

前記 PEG修飾微粒子は、磁性粒子修飾用 PEG溶液と非修飾微粒子、抽出用緩衝液、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液よりなる生体物質を高純度で単離するための試薬キットとして供することもできる。

図面の簡単な説明

図 1 は、本発明の P E G修飾磁性粒子（A)、 BSA ( B)、ゼラチン（C ) を用いた場合の細胞抽出液処理後の分散性の比較を示す写真である。

図 2は、本発明の P E G修飾磁性粒子（A) BSA ( B)、ゼラチン（C ) でコーティングした磁性粒子を用いて行った免疫沈降法の結果を示す。それぞれ左が銀染色、右がウェスタンプロットの結果を示す写真である。

図 3は、本発明の磁性粒子と BSA コーティングした磁性粒子を用いた場合の、 α—フエトプロテイン（APT) を同じ濃度を含有する細胞抽出液からの回収率の比較結果を示すウェスタンプ口ットの結果を示す写真である。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を具体例に基づいてより具体的に述べる。ただし、本発はこれらの例にのみ限定されるものではない。

製造例 1 ： (オリゴアミン-ポリエチレンダリコール共重合体（以下、 NX-PEG ( 1 ) と略記する）の製造）

アルゴン雰囲気下のナスフラスコに、溶媒として脱水テトラヒドロフラン（以下、 THF と略記する） 20mL、開始剤として 2 -メトキシエタノール lmmol ( 80.4 μ L) を入れ、そこにカリゥムナフタレン lmmol ( 0.35mol/L THF溶液 2.86mL) を加えてマグネチックスターラーにより 1 0分間攪拌後、アルコキシド化した開始剤に対して、蒸留エチレンォキシド（以下、 EO と略記する） 114mmol (約 5.7mL) を冷やしたガラス製シリンジによって加え、常温で 2 4時間攪拌し E0の開環重合を行った。時間後、 4- (ブロモメチル）安息香酸メチル 5mmol ( lmol/L THF 溶液 1. 15mg) を停止剤として反応系に加え、室温で 2時間攪拌することによって重合反応を停止した。上記反応物を 20倍量のジェチルエーテルに対して滴下し、再沈法によって未反応物およびオリゴマーを除去した。次いで、沈殿物を適量のクロ口ホルムに溶解したのち飽和食塩水に対して抽出操作を行い、系内の塩を除去した。クロ口ホルム相を回収し、減圧下で溶媒を除去したのち、ベンゼンに再溶解し後凍結乾燥することによつて末端にメチルエステルを有するポリマー（以下、

MeO -PEG-Methylbenzoate と略記する）が得られた。次いで、 50mLナスフラスコに、上記 MeO -PEG-Methylbenzoate lg( 263 μ mol) および PEG の 100倍モル量に相当するペンタエチレンへキサミン（以下、 PEHAと略記する） 6.2mL ( 263mmol) を入れ、湯浴中 120°Cで 24時間攪拌し、 PEG末端にオリゴアミンを導入した。反応液を少量のメタノールに溶解したのち、冷却したイソプロピルアルコール（以下、 IPA と略記する）に滴下する IPA再沈法によって未反応の PEHAを除去し、さらに未反応物を完全に除くため、沈殿物を遠心分離（4°C以下、 5,O00rpm、 20分）により回収し、再度少量のメタノールに溶解し、 IPA再沈による精製を計 3回繰り返し、最終的にベンゼン凍結乾燥によって目的物であるポリマー誘導体

( MeO-PEG-Phenyl-N5 (以下、 N 5 -PEG と略記する））を得た。

製造例 2 ： (NX-PEG ( 2 ) の製造）

片末端に 1級アミンを有する MeO-PEG-NH₂ (日本油脂株式会社製： SUNBRIGHT MEPA-50H) lg ( 196 μ mol) と、分子内に 2つのメチノレエステルを有するコノヽク酸ジメチル 12.8mL ( PEGの 500倍モル量に相当）を 50mLナスフラスコに加え、湯浴中 120°Cで 24時間攪拌を行った後、反応液を少量のメタノールに溶解し、 IPA再沈を行った。沈殿物は遠心分離（ 4°C以下、 5，O00rpm、 20 分）により回収し、再度少量のメタノールに溶解し、 IPA再沈による精製を計 3回繰り返すことによって未反応のコハク酸ジメチルを完全に除去した。沈殿物をベンゼン凍結乾燥によって回収し、片末端に有する PEG 誘導体 ( MeO-PEG-NHC O C H ₂ C H ₂ COOCHs) を得た。

該 PEG誘導体 500mg (102 mol) と PEHA 11.9mL (PEG の 500倍モル量）を脱水クロ口ホルムを含む 50mLナスフラスコに加え、湯浴中 120°Cで 24時間攪拌し、 PEG末端へのオリゴァミンの導入を行った。時間後、反応液を少量のメタノールに溶解し、 IPA再沈を行い、沈殿物は遠心分離（4°C以下、 5，000rpm、 20分）により回収した。再度少量のメタノールに溶解し、 IPA再沈による精製を計 3回繰り返す事によって未反応の PEHAを完全に除去した。沈殿物をベンゼン凍結乾燥によつて回収し、 PEG末端へのオリゴァミンが導入された目的物 (以下、 MeO -PEG-N5 と略記する）を得た。

(磁性粒子の PEG コーティングの方法および分散性評価）磁性粒子への抗体担持方法：

表面にカルボキシル基を有する磁性粒子（磁性体がポリスチレンをベースとする樹脂に被覆されている：固形分濃度 10% /PBS分散液； JSR社、東京、製） 150 1を 50mM 2-モルホリノエタンスノレホン酸（以下、 MES と略記する）ノッファー (pH5.0) 1.0 mlに分散させた後、磁性粒子を磁石にて回収し上清を除去した。この操作をさらに 1 回繰り返し、磁性粒子の洗浄を行った。 50mM MESバッファー（pH5.0) 1.0 mlを加え磁性粒子を分散させた後、室温にて 1 5分間静置し、次いで、上清を除去した後、 50mM MESバッファー 360 1を加え、再度磁性粒子を、分散させた。ここに 50mg/ml N-ヒドロキシスルホスクシンィミド（S-NHS) 7.5 1を加えて攪拌し、さらに 50mg/ml 1-ェチル -3-(3-ジメチルァミノ）カルボジイミド 7.5 μ 1を加えて浸拌した。これを 20分間振とうし、上清を除去した後、 lOOmM MESバッファー（pH6.0) を 714μ 1加えて分散させ、ここに抗フエトプロテイン（AFP) マウスモノクロ一ナル抗体溶液 36μ 1を添加し、攪拌した。これを回転させながら 2時間室温にて反応させた。反応終了後 lOmM Phosphate Buffer (l50r M NaCl pH7.5) (PBS) 1 mlにて抗体が固定された磁性粒子を 2回洗浄し、 1500 μ 1 の PBS に分散した。 PEG コーティング方法：

抗体の固相化後、余乗 uの力ルボキシル活性サイトのブロッキングを、 N5-PEG を用レ、て行った。抗体を固相化した磁性粒子分散液（ 1 %) を 200 1 分取し上清を除去した後 1 %濃度の N5-PEGの PBS溶液を 200μ 1力！]え、攪拌後、室温にて 1時間振とうし、 4°Cにてー晚静置した。未結合ポリマーを除去するために PBSにて 2回洗挣した後、 PBS 100 μ 1を加えて磁性粒子を分散させた。

分散性の比較：

PEG コーティングの方法に準拠し BSA及びゼラチンを用いたコーティングを行った二。それぞれ、 PEGヽ BSA及ぴゼラチンでコーティングを行つ广こ磁性粒子を用いて、細胞抽出液で処理した際の分散性の比較を行った。磁性粒子分散液 50 1をエツペンドルフチューブに取り、上清を除去後、細胞抽出液（NIH 3T3) ΙΟΟμ Ι を添加、携拌し、 1時間室温にて振とうして反応させた。上清を除去後 20mM Tris-HCl 150mM NaCl (pH8.0)， 0.05% Tween20 (TBST)にて 1 回洗浄後の分散性を比較した。

図 1 に示すように、従来技術である BSA、あるいはゼラチンを用いた処理系に比べ、本発明の P E G修飾微粒子は、水性媒体中での分散安定性が、著しく向上することが明らかである。

(生体特異的親和性磁生粒子を用いた特異的結合タンパク質の免疫沈降）

抗体結合後 PEGでコ一ティング処理した磁性粒子を用いて以下の操作を行った。また、比較として、それぞれ、 BSA及ぴゼラチンコーティングした磁性粒子を用いた。磁性粒子分散液

50 μ 1をエツペンドルフチューブに取り、上清を除去後、 AFP を 100IU/mlとなるように添加した M IH3T3細胞抽出液 100 μ 1 を加え、分散後、室温にて振とう反^した。上清を除去後 TBST200 M 1にて 3回洗浄し SDS'PA GE sample buffer

(Laemmli )25 μ 1を加えた。沸騰水にて 3分間処理後、上清を SDS-PAGE (ポリアクリルアミド 10^ο/οゲル）にて分離した。さらに銀染色することによりタンパク質のバンドを、ウェスタンプロット法にて AFPの活性の確認を行った。銀染色法はアマシャム社より購入した銀染色キットを后いて常法により行った。ウェスタンプロット法は、 TRANS-BLOT SD SEMI DRY

TRANSFER CELL (パイオラッド社）を用いて、 SDS -PAGE 電気泳動後のゲルからポリビニリデンジフルオラィド（ PVDF) 膜へ蛋白を転写することにより実施した。転写条件は、 1 c m ²あたり 1 mAの定電流で、 2時間行つた。その後、 1 % BSA/PBS 溶液中で 30分間ブロッキングを行い、さらに 5000倍希釈した抗 AFP ゥサギ抗体（1 % BSA/PBS溶液）室温にて 1時間振とう反応した。 TBSTにて 3回洗浄後、 1 ⁰ BSA/PBS溶液にて 5000 倍希釈したアル力リフォスファターゼ標識抗ゥサギ抗体（ャギ）を加え、 4°Cにて一晚静置反応した。 TBSTにて 3回洗浄した後、 5-bromo -4-chloro " 3-mdolyl-phosphate/Nitro blue

terazolium ( B CIP/NBT)基質溶液中で反応させた。

図 2に示すように、本発明の P E 0修飾磁性微粒子を用いることにより、従来技術の BSA、ゼラチンに比べ、非特異な夾雑物の量が減少するのと同時に、図 3に示すように、同じ濃度の細胞抽出液からのタンパク質の回収率が著しく向上した。

産業上の利用可能性

上述したように、本発明の、例えば、リガンドを固定した PE G 修飾磁性微粒子は、従来の磁性粒子に比べて、非特異的な夾雑物を含まず、また、高収率、高純度の生体物質の分離精製法に使用できる。したがって、本発明は医療産業で利用できる。

Claims

請求の範囲

1 . 一対の生体特異的親和性（bio - sp ecific affinity) 有する物質の一方の構成員を、直接もしくはスぺーサーを介して表面に結合した微粒子であって、該表面にさらに、ポリエレンダリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が直揍洁合されており、かつ、該誘導体中のポリエチレンダリコール鎖が水性媒体中で自由に運動しうる形態にある微粒子を、前記体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を含有し、して該微粒子に非特異的に結合しうる物質の存在が疑われる試料と水性媒体中で接触させる段階、及び

該微粒子上の該一方の構成員を該もう一方の構成員と選択的に結合を形成させる段階

を含んでなる一対の生体特異的親和性を有する物質の一 ^の構成員ともう一方構成員との特異的結合対の形成方法。

2 . —対の生体特異的親和性（bio - sp ecific affinity) を有する物質の一方の構成員を、直接もしくはスぺーサーを介して表面に結合した微粒子であって、該表面にさらに、ポリエレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が直接結合されており、かつ、該誘導体中のポリエチレングリコール鎮が水性媒体中で運動しうる形態にある微粒子の、前記生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を含有し、そして該微粒子に非特異的に結合しうる物質の存在が疑われる試料中の該もう一方の構成員と微粒子上の該一方の構成員との選択的な結合を形成させる担体のための使用。

3 . 微粒子の平均粒径が、 0 . 0 2 μ ！〜 5 mmである、請求項 1記載の方法。

4 . 微粒子の平均粒径が、 0 . 0 2 μη！〜 5 mmである、請求項 2記載の使用。

5 . 選択的に結合を形成させることが、試料中の一対の生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を検出すること、精製すること、または該結合を形成する物質のスクリーニングを目的にするものである請求項 1 または 3記載の方法。

6 . 選択的に結合を形成させることが、試料中の一対の生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を検出すること、精製すること、または該結合を形成する物質のスクリーユングを目的にするものである請求項 2または 4記載の使用。

7 . ポリエチレングリコール誘導体のポリエチレングリコールセグメントが、重合度 2 〜 1 0 0 0 0からなる請求項 1 、 3 及ぴ 5のいずれか一項に記載の方法。

8 . ポリエチレングリコール誘導体のポリエチレングリコールセグメントが、重合度 2 〜 1 0 0 0 0からなる請求項 2、 4 及ぴ 6のいずれか一項に記載の方法。

9 . ポリエチレングリコール誘導体が、ポリアミンセグメントを有するプロック共重合体である請求項 1 、 3 、 5及び 7のいずれか一項に記載の方法。

1 0 · ポリエチレングリコール誘導体が、ポリアミンセグメントを有するブロック共重合体である請求項 2、 4、 6及ぴ 8 のいずれか一項に記載の使用。

1 1 . ポリアミンセグメントが、下記一般式（ 1 )及び（ 2 ) で表される請求項 9記載の方法：

( l )

式中、 mは 1 〜： L 0の整数を表し、 n は：！〜 1 0 0の整数を表し、そして及び R ₂ は、互いに独立して、水素原子もしくは炭素原子数が 1 〜 5のアルキル基である；

( 2 )

式中、 x+y は 1 〜 3 0までの整数であり、 Ri〜R4 は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が 1 - 5 のァノレキノレ基を表す。

1 2 . ポリアミンセグメントが、下記一般式（ 1 )及び（ 2 ) で表される請求項 1 0記載の使用：

( 1 ) 式中、 mは 1〜 1 0の整数を表し、 n は 1 〜 1 0 0の整数を表し、そして及び R ₂ は、互いに独立して、水素原子もしくは炭素原子数が 1〜 5のアルキル基である；

(CH₂CH₂NR¹)_X-R²

(CH₂CH₂NR³)_y-R⁴

( 2 )

式中、 x+ y は 1 〜 3 0までの整数であり、 Ri〜！ 4 は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が 1 〜 5のアルキル基を表す。

1 3. 微粒子が、磁性体を含んでなる、請求項 1、 3、 5、 7、 9及び 1 1 のいずれか一項に記載の方法。

1 4. 微粒子が、磁性体を含んでなる、請求項 2、 4、 6、 8， 1 0及び 1 2のいずれか一項に記載の使用。

1 5. 微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子、または磁性体をシリカもしくは金属アルコキシドで被覆した形態にある無機粒子である請求項

1 、 3、 5、 7、 9、 1 1及び 1 3のいずれか一項に記載の方法。

1 6. 微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子、または磁性体をシリカもしくは金属アルコキシドで被覆した形態にある無機粒子である請求項

2、 4、 6、 8、

1 0、 1 2及び 1 4のいずれか一項に記載の使用。

1 7. 水性媒体中に分散している、一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員が直接もしくはスぺーサーを介して表面に結合された微粒子を、該水性媒体中でポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体と接触させる段階、及び、

該微粒子表面に該ポリマー誘導体を結合させる段階、

を含んでなる一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員を、直接もしくはスぺーサーを介して表面に結合した微粒子表面の改質方法。

1 8 . 該微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子、または磁性体をシリカもしくは金属アルコキシドで被覆した形態にある無機粒子であり、ポリマー誘導体がポリエチレンダリコールセグメント及ぴポリァミンセグメントを有する共重合体であって、ポリエチレングリコールセグメントが、重合度 2〜 1 0 0 0 0力、らなり、かつ、ポリアミンセグメントが、下記一般式（ 1 ) 及び（ 2 ) :

( 1 )

式中、 mは 1 〜 1 0の整数を表し、 n は：！〜 1 0 0の整数を表し、そしてェ及ぴ1 ₂ は、互いに独立して、水素原子もしくは炭素原子数が 1 〜 5のアルキル基である；

( 2 )

式中、 x + y は 1 〜 3 0 までの整数であり、 Ri〜 R 4 は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が 1 〜 5 のァノレキノレ基を表す、のポリアミンのいずれかである、請求項 1 5記載の改質方法。

1 9 . 該微粒子が、磁性体を包埋した形態もし < は表層に有する形態にあるラテックス粒子であって、かつ、ラテックス表面に力ルポキシル基が存在するものであり、そしてポリマー誘導体がポリエチレングリコーノレセグメント及びポアミンセグメントを有する共重合体であって、ポリエチレングリコールセグメントが、重合度 2 〜； 1 0 0 0 0 力らなり、かつ、ポリアミンセグメントが、一般式（ 2 ) で表される請求項 1 8記載の改質方法

2 0 . 一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員力直接もしくはスぺーサーを介して表面に結合しており、そしてポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で運動しうる形態でポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が表面に直接結合した微粒子であって、

該微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子であり、かつ、ラテックス表面にカルボキシル基が存在するものであり、そしてポリマー誘導体がポリエチレンダリコールセグメント及びポリァミンセグメントを有する共重合体であって、ポリエチレングリコールセグメントが、重合度 2〜 1 0 0 0 0からなり、かつ、ポリアミンセグメントが、一般式（ 2 ) ； (CHsCHsNR¹)^²

Nヽ (CH₂CH₂NR³)_y—R⁴

( 2 )

式中、 X + y は：！〜 3 0 までの整数であり、 R¹〜 R4 は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が 1 〜 5 のアルキル基を表す、で表されるポリアミンである、微粒子。