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WO2011089908A1 - 細胞観察装置及び細胞培養方法 - Google Patents

細胞観察装置及び細胞培養方法 Download PDF

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Publication number
WO2011089908A1
WO2011089908A1 PCT/JP2011/000287 JP2011000287W WO2011089908A1 WO 2011089908 A1 WO2011089908 A1 WO 2011089908A1 JP 2011000287 W JP2011000287 W JP 2011000287W WO 2011089908 A1 WO2011089908 A1 WO 2011089908A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
image
optical system
imaging optical
culture
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/000287
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
清田泰次郎
魚住孝之
Original Assignee
株式会社ニコン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ニコン filed Critical 株式会社ニコン
Priority to CN201180006626.8A priority Critical patent/CN102712890B/zh
Priority to JP2011550859A priority patent/JP5510463B2/ja
Publication of WO2011089908A1 publication Critical patent/WO2011089908A1/ja
Priority to US13/552,839 priority patent/US8947518B2/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/0088—Inverse microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/32—Micromanipulators structurally combined with microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements

Definitions

  • the present invention relates to a cell observation apparatus and a cell culture method.
  • Non-Patent Document 1 The procedure for establishing artificial pluripotent stem cells (iPS cells) is disclosed in Non-Patent Document 1, for example.
  • a feeder cell layer is formed on the bottom surface of a culture container containing a culture solution, human adult skin cells (fibroblasts) are seeded thereon, and then the cells are applied to the cells.
  • 4 genes called Yamanaka factor are introduced (retroviral vector for introducing 4 genes is added).
  • a cell colony in which only 4 genes are introduced Non-iPS cell colony
  • IPS cell colony appears, and only the latter of these is picked with a syringe to establish an iPS cell line.
  • picking of cell colonies is performed manually by a skilled researcher while looking through the eyepiece of the microscope.
  • the researcher sets the observation magnification of the microscope to the low magnification side, observes a relatively wide range of the culture vessel, and searches for iPS cell colonies.
  • setting the microscope observation magnification to the high magnification side, confirming that the cell colony is an iPS cell colony The observation magnification is returned to the low magnification side, and the tip of the syringe is inserted into the dish to pick a cell colony.
  • the present invention provides a cell observation apparatus and a cell culture method that are effective for reducing the labor required when a user performs operations (injection, patch clamp, picking, etc.) on cells existing in a culture vessel.
  • the cell observation apparatus includes an observation stage for supporting a cell culture vessel, an observation stage for observing a positional relationship between an operation needle for operating the cell in the culture vessel and the cell in the culture vessel.
  • an observation stage for observing a positional relationship between a macro imaging optical system for acquiring a wide-area image of the culture container in FIG. 5, an operation needle for operating a cell in the culture container, and a cell in the culture container, A micro imaging optical system that acquires an image; and a control unit that controls the operation needle that operates the cells in the culture vessel, and the micro imaging optical system faces the macro imaging optical system with the observation stage interposed therebetween Placed on the side.
  • the control means controls the operating needle so as to pick the target cell from the culture container based on the partial image, and seeds the picked target cell in another culture container. Good.
  • the cell culture method of the present invention is a cell culture method for culturing cells using the cell observation device of the present invention, wherein the picked target cells are seeded in the separate culture container, Repeating a step of transporting another culture vessel to an incubator and a step of culturing the seeded target cells by the incubator for a certain period and then returning the other culture vessel to the cell observation device. To increase the number of target cells.
  • the cell observation apparatus of the present invention includes an observation stage that supports a cell culture container, a macro imaging optical system that acquires a wide-area image of the culture container in the observation stage, and a micro that acquires a partial image of the culture container.
  • an observation stage that supports a cell culture container
  • a macro imaging optical system that acquires a wide-area image of the culture container in the observation stage
  • a micro that acquires a partial image of the culture container.
  • the cell culturing method of the present invention is a cell culturing method for culturing cells, wherein a macro imaging step for macro-observing a culture container containing the cells being cultured and acquiring a wide area image, and from the wide area image, A micro imaging step of identifying a position of the cell, micro-observing the cell, obtaining a partial image in the wide area image, a determination step of determining the state of the cell based on the partial image, and the determination step As a result of determining the state of the cells, in order to pick good cells from the culture container, a picking step for controlling the operation needle based on the wide area image and the partial image, and the good picked by the operation needle After inoculating various cells into the other culture container, transporting the other culture container to an incubator; and Ri certain period, and a culture step of culturing the good cells the seeded, increasing the number of the good cells by repeating the above steps.
  • the present invention it is possible to realize a cell observation apparatus and a cell culture method that are effective for reducing the labor required when a user performs operations on cells existing in a culture vessel.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the configuration of the mechanical part of the system.
  • this system includes an inverted microscope 10 for observing cells in the culture container 30, a manipulator 20 for operating the cells in the culture container 30, and an electrically powered storage that supports the storage container 40.
  • a stage 60, a manipulator controller 21 for driving the manipulator 20, and a stage controller 12 for driving the observation stage 11 of the inverted microscope 10 are provided.
  • the system also includes a computer (not shown) (the computer will be described later).
  • the inverted microscope 10 includes a transmission type and electric observation stage 11 that supports the culture vessel 30, a macro imaging optical system (stereoscopic microscope) 14 that acquires an entire image of the culture vessel 30 from the upper front of the culture vessel 30, and a culture A micro-imaging optical system (magnifying microscope) 18 that acquires an enlarged image of a part of the container 30 from the lower front of the culture container 30 and an oblique illumination optical system 15 that illuminates the entire culture container 30 from an oblique direction above the culture container 30.
  • a transmission type and electric observation stage 11 that supports the culture vessel 30, a macro imaging optical system (stereoscopic microscope) 14 that acquires an entire image of the culture vessel 30 from the upper front of the culture vessel 30, and a culture A micro-imaging optical system (magnifying microscope) 18 that acquires an enlarged image of a part of the container 30 from the lower front of the culture container 30 and an oblique illumination optical system 15 that illuminates the entire culture container 30 from an oblique direction above the culture container 30.
  • an epi-illumination fluorescent illumination optical system 17 that irradiates a part of the culture vessel 30 through the objective lens 18e of the micro imaging optical system 18 from the lower front of the culture vessel 30 and the focal point of the objective lens 18e with respect to the culture vessel 30
  • a focus knob 13 is provided for manual adjustment by the user.
  • the culture vessel 30 is a dish having a diameter of 100 mm, for example.
  • a feeder cell layer is formed on the bottom surface of the culture vessel 30, and the feeder cell layer is filled with a culture solution.
  • human feeder skin cells fibroblasts
  • a retroviral vector for introducing 4 genes called Yamanaka factor is added to these cells.
  • a fluorescent gene that emits fluorescence of a specific color (here, green) only when differentiation ability is expressed after the introduction of the four genes is introduced into these cells in advance.
  • the focal plane of the objective lens 18e of the micro imaging optical system 18 is positioned in the vicinity of the bottom surface of the culture vessel 30 (in the vicinity of the feeder cell layer).
  • the observation stage 11 holds the culture vessel 30 fixed by a holder suitable for the shape of the culture vessel 30. Therefore, even if the culture container 30 is temporarily removed from the observation stage 11 for exchanging the culture medium, the posture and arrangement position of the culture container 30 with respect to the observation stage 11 are reproduced.
  • the observation stage 11 is connected to the stage controller 12, and when the user operates the stage controller 12, the observation stage 11 moves the culture vessel 30 along the mounting table of the observation stage 11 according to the operation content ( XY direction).
  • observation stage 11 and the stage controller 12 may be directly connected, it is assumed here that they are indirectly connected via a computer control circuit (FIG. 2) for the sake of explanation.
  • the micro imaging optical system 18 includes an electric revolver 18d holding a plurality of objective lenses, an optical path bending mirror 18c, an imaging optical system 18b, and an imaging device 18a, and a field of the objective lens 18e in the culture vessel 30.
  • An enlarged image for example, a 10 times image
  • the optical axis of the objective lens 18 e of the micro imaging optical system 18 is perpendicular to the reference plane of the observation stage 11.
  • the revolver 18d holds a plurality of objective lenses having different magnifications, and switches the objective lens 16e of the micro imaging optical system 18 to another objective lens. Thereby, the observation magnification of the micro imaging optical system 18 is switched between 10 times and 4 times, for example.
  • the macro imaging optical system 14 includes an imaging lens 14b and an imaging element 14a, and acquires a reduced image (for example, an image of 0.5 times) of the entire culture vessel 30.
  • the imaging lens 14b conjugates the vicinity of the culture vessel 30 and the imaging surface of the imaging device 14a, and forms the entire image of the culture vessel 30 with sufficient contrast on the imaging surface without performing focus adjustment. be able to. Note that the optical axis of the imaging lens 14 b coincides with the optical axis of the objective lens 18 e of the micro imaging optical system 18.
  • the oblique illumination optical system 15 includes an oblique illumination light source 15a composed of a white light source and the like, and an illumination lens 15b, and illuminates the entire culture vessel 30 from the oblique direction with a substantially uniform illuminance. Note that the optical axis of the illumination lens 15 b intersects the optical axis of the macro imaging optical system 14 in the vicinity of the mounting stage of the observation stage 11.
  • the scattered light generated in the culture vessel 30 enters the macro imaging optical system 14 and the objective lens 18e of the micro imaging optical system 18, but is cultured. It is assumed that the non-scattered light (direct light) generated in the container 30 hardly enters the objective lens 18e of the macro imaging optical system 14 and the micro imaging optical system 18.
  • the micro imaging optical system 18 acquires an enlarged dark field image (hereinafter referred to as “micro dark field image”) of the partial region of the culture vessel 30 described above. be able to. Further, when the oblique illumination light source 15a is turned on, the macro imaging optical system 14 can acquire a reduced dark field image of the entire culture vessel 30 (hereinafter referred to as “macro dark field image”). .
  • the epi-illumination fluorescent illumination optical system 17 includes an excitation light source 17a, an illumination lens 17b, and a fluorescence block 17c, and irradiates the aforementioned partial region with the excitation light via the objective lens 18e of the micro imaging optical system 18.
  • the emission wavelength of the excitation light source 17a is set to a wavelength for exciting the fluorescent substance expressed in the cell
  • the detection wavelength of the fluorescent block 17c is the wavelength of the fluorescence emitted by the fluorescent substance (here, green). Is set to the same wavelength.
  • the micro imaging optical system 18 can acquire an enlarged fluorescent image (hereinafter referred to as “micro fluorescent image”) of the partial region of the culture vessel 30 described above.
  • the fluorescent block 17c of the incident-light fluorescent illumination optical system 17 is configured to be detachable with respect to the optical path of the micro imaging optical system 18, and the insertion / removal is performed by an electric mechanism (not shown).
  • the micro imaging optical system 18 acquires a micro dark field image
  • the fluorescent block 17c is detached from the optical path
  • the micro imaging optical system 18 acquires a micro fluorescent image
  • the fluorescent block 17c is inserted into the optical path.
  • the manipulator 20 is, for example, a hydraulic manipulator, and is equipped with an operation needle for operating the cells in the culture vessel 30.
  • the syringe 22 is attached as an operation needle. Note that the tip of the syringe 22 can be replaced with a new one as necessary.
  • the manipulator 20 is provided on a common base with the inverted microscope 10 at a position removed from the inverted microscope 10, supports the pump portion of the syringe 22, and points the tip of the syringe 22 obliquely downward.
  • the manipulator 20 rotates the syringe 22 around a rotation axis 20a parallel to the optical axis of the macro imaging optical system 14, or shifts the syringe 22 in a direction along the rotation axis 20a.
  • the manipulator 20 can set the combination of the rotational position and the shift position of the syringe 22 to a predetermined observation state (state indicated by a solid line in FIG. 1) as necessary.
  • the manipulator 20 can set the combination of the rotational position and the shift position of the syringe 22 to a predetermined retracted state (state indicated by a dotted line in FIG. 1) as necessary.
  • FIG. 1 is a state in which the tip of the syringe 22 is disposed on the optical axis of the macro imaging optical system 14 and the tip of the syringe 22 is located above the top of the culture vessel 30.
  • the syringe 22 is in this observation state, there is no possibility that the syringe 22 will contact the culture vessel 30 even if the observation stage 11 is moved in the XY direction. Further, if the shift position of the syringe 22 is displaced downward from this observation state, the tip of the syringe 22 can be immersed in the culture solution in the culture vessel 30.
  • FIG. 1 is a state in which the entire syringe 22 is completely detached from the inverted microscope 10.
  • the storage portion of the storage container 40 is disposed below the tip of the syringe 22 in the retracted state (storage position indicated by reference numeral 40a in FIG. 1).
  • manipulator 20 is connected to the manipulator controller 21, and when the user operates the manipulator controller 21, the syringe 22 is driven according to the operation content.
  • manipulator 20 and the manipulator controller 21 may be directly connected, it is assumed here that it is indirectly connected through a control circuit (FIG. 2) of the computer for explanation.
  • the pump portion of the syringe 22 may be manually operated directly by the user, but here it is assumed that it is electrically driven and driven by the manipulator 20 for explanation.
  • the user performs inhalation of the liquid (here, the culture solution containing cells is referred to as “liquid”) into the syringe 22 and discharge of the liquid from the syringe 22 by operating the manipulator controller 21. It will be.
  • the storage stage 60 holds the storage container 40 by a holder suitable for the shape of the storage container 40.
  • a plurality of storage portions 40-1 to 40-8 are formed side by side in the XY plane with each opening facing upward.
  • the liquid can be stored in the storage portion (effective storage portion) disposed at the storage position 40a. Further, when the storage stage 60 moves the storage container 40 in the XY direction, the effective storage portion can be switched between the storage portions 40-1 to 40-8.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the computer of this system.
  • the computer 50 of this system includes a control circuit 52, a CPU 51, a storage memory 53, a work memory 54, and an interface circuit 55.
  • control circuit 52 includes the observation stage 11 shown in FIG. 1, the revolver 18d, the image sensors 14a and 18a, the fluorescent block 17c, the oblique illumination light source 15a, the excitation light source 17a, the accommodation stage 60, The stage controller 12 and the manipulator controller 21 are connected.
  • the computer 50 is preinstalled with an operation program for the CPU 51.
  • This operation program is stored in the storage memory 53, read onto the work memory 54 as necessary, and executed by the CPU 51.
  • the computer 50 is connected to input / output devices such as a keyboard 56, a mouse 57, and a display 58 via an interface circuit 55.
  • the user can input various instructions to the CPU 51 of the computer 50 via the keyboard 56 or the mouse 57.
  • transmission / reception of information between the computer 50 and the user is performed by a known GUI using a keyboard 56, a mouse 57, and a display 58.
  • Information input from the user to the computer 50 includes an observation schedule of the culture vessel 30, an instruction to start observation, and an instruction to start picking support.
  • the observation schedule indicates the observation frequency of the culture vessel 30 and is set to “every 24 hours”, for example. This observation schedule is stored in the storage memory 53.
  • the observation start instruction is an instruction input when preparation of the culture vessel 30 is completed and culture is started, and is an instruction for causing the CPU 51 to perform an observation process (described later).
  • the picking support start instruction is an instruction input when picking necessary cells (here, iPS cell colonies) after culturing has been performed for a sufficient period of time. This is an instruction to execute (described later).
  • FIG. 3 is a flowchart of the observation process performed by the CPU 51. Hereafter, each step of FIG. 3 is demonstrated in order. It is assumed that the tip of the syringe 22 is removed from the syringe 22 when the observation process is executed.
  • Step S11 The CPU 51 reads out the observation schedule stored in the storage memory 53 and compares the observation schedule with the current date and time to determine whether or not the observation time has come. When the observation time has come, the process proceeds to step S12, and when the observation time has not come, the process waits.
  • Step S12 The CPU 51 instructs the control circuit 52 to perform tiling photography with oblique illumination.
  • the control circuit 52 drives the fluorescent block 17c as necessary to disengage it from the optical path of the micro imaging optical system 18, and drives the revolver 18d as necessary to set the objective lens for 10 ⁇ observation to the micro imaging optical system. Insert into 18 optical paths.
  • the control circuit 52 turns on the oblique illumination light source 15a, and repeatedly drives the imaging device 18a while moving the observation stage 11 stepwise in the XY directions, whereby a plurality of individual regions of the culture vessel 30 are individually copied. A micro dark field image is acquired and the oblique illumination light source 15a is turned off.
  • the CPU 51 assigns coordinate information (container coordinate information) on the culture container of the corresponding partial region to each of the plurality of micro dark field images acquired by the control circuit 52, and then the micro dark field images are displayed. Write to the storage memory 53. In writing, the CPU 51 gives the current date information (observation date information) to each of these micro dark field images.
  • Step S13 The CPU 51 gives an instruction to the control circuit 52 to perform tiling photography using an excitation light source.
  • the control circuit 52 drives the fluorescent block 17 c and inserts it into the optical path of the micro imaging optical system 18.
  • the control circuit 52 turns on the excitation light source 17a and repeatedly drives the imaging device 18a while moving the observation stage 11 in the same movement pattern as in step S13, thereby individually copying each partial region of the culture vessel 30. A plurality of micro fluorescent images are acquired, and the excitation light source 17a is turned off.
  • the CPU 51 assigns coordinate information (container coordinate information) on the culture vessel of the corresponding partial region to each of the plurality of micro fluorescent images acquired by the control circuit 52, and then saves the micro fluorescent images. Write to memory 53. In writing, the CPU 51 gives the current date information (observation date information) to these micro fluorescent images.
  • the high-luminance portion of the micro fluorescent image is expressed by the same color as the color corresponding to the detection wavelength of the fluorescent block 17c (here, green).
  • Step S14 The CPU 51 determines whether or not an end instruction has been input from the user. If not, the process returns to step S11. If an end instruction has been input, the flow ends.
  • the CPU 51 acquires a micro dark field image and a micro fluorescent image relating to each partial region of the culture vessel 30 each time the observation time comes, and writes them into the storage memory 53.
  • the history of the micro dark field image and the history of the micro fluorescent image are gradually accumulated for each partial region of the culture vessel 30.
  • FIG. 4 and 5 are flowcharts of picking support processing by the CPU 51.
  • FIG. Hereafter, each step of FIG. 4, FIG. 5 is demonstrated in order.
  • the user attaches / replaces the tip of the syringe 22 as necessary.
  • the user attaches the tip of the syringe 22 at the start of the picking support process. Suppose that they are used continuously as they are.
  • Step S20 The CPU 51 reads out images for each partial area (a plurality of micro dark field images and a plurality of micro fluorescent images) stored in the storage memory 53, and creates a time-lapse moving image for each partial area based on these images. And stored in the storage memory 53.
  • the time-lapse moving image of each partial area is created as follows. That is, the CPU 51 synthesizes a plurality of micro dark field images and a plurality of micro fluorescent images related to the target partial region with a common observation date and time into a single image, and a plurality of images obtained thereby. The composite images are connected in order of observation date and time.
  • the time-lapse moving image created in this way is the time-lapse moving image of the partial area.
  • the CPU 51 gives an instruction to the control circuit 52 to set each part of the system to the initial state.
  • the control circuit 52 drives the manipulator 20 as necessary, sets the syringe 22 to the observation state, drives the observation stage 11 as necessary, and centers the culture vessel 30 on the optical axis of the macro imaging optical system 14.
  • This optical axis is simply referred to as “optical axis”.
  • control circuit 52 drives the fluorescent block 17c as necessary to detach it from the optical path of the micro imaging optical system 18, and drives the revolver 18d as necessary to micro-imaging the objective lens for 10 ⁇ observation. It is inserted into the optical path of the optical system 18.
  • control circuit 52 drives the housing stage 60 as necessary, and sets an effective housing portion as the first housing portion (the housing portion 40-1).
  • Step S21 The CPU 51 instructs the control circuit 52 to start displaying a live image.
  • the control circuit 52 turns on the oblique illumination light source 15a, and starts to continuously drive both the imaging element 18a of the micro imaging optical system 18 and the imaging element 14a of the macro imaging optical system 18. Thereby, the micro dark field image and the macro dark field image start to be acquired in parallel and continuously.
  • the CPU 51 starts to sequentially output the micro dark field images sequentially acquired by the control circuit 52 to a predetermined area on the display 58 as indicated by reference numeral 58b in FIG. 6, and the macro dark field images sequentially acquired by the control circuit 52. Images are sequentially output to other predetermined areas on the display 58 as indicated by reference numeral 58c in FIG.
  • a live image 58b of a micro dark field image (hereinafter referred to as “micro live image 58b”) and a live image 58c of a macro dark field image (hereinafter referred to as “macro live image 58c”). .) Will start appearing at the same time.
  • the CPU 51 displays a magnification change button 58b 'in the vicinity of the micro live image 58b on the display 58.
  • the magnification change button 58 b ′ is a button for the user to input an observation magnification change instruction to the computer 50.
  • the dark field image 22 ′ of the syringe 22 is also shown in the micro live image 58 b and the macro live image 58 c.
  • the dark field image at the tip of the syringe 22 is the micro live image 58b and the macro live image 58c. Located in the center of each.
  • the dark field image of the culture vessel 30 moves on the micro live image 58b and the macro live image 58c, and the syringe 22
  • the dark field image 22 ′ does not move.
  • Step S22 The CPU 23 reads the micro-fluorescence images stored in the storage memory 53 for each partial area and has the latest observation date and time, performs size reduction processing on them, and arranges them in container coordinate order. Thus, a tiling fluorescence image is created. This tiling fluorescence image is used as a guide image.
  • the CPU 51 performs a luminance reduction process on the tiling fluorescent image and then superimposes it on the macro live image 58c (reference numeral 58d in FIG. 6). However, in this superimposed display, the CPU 51 adjusts the superimposed position of the tiling fluorescent image 58d so that the container center in the tiling fluorescent image 58d matches the container center in the macro live image 58c.
  • the degree is visualized at the same time.
  • the region to be expressed in green (the region emitting fluorescence) in the tiling fluorescence image 58d is represented by a solid color (the same applies to the other drawings). The user can easily find a cell colony that seems to be an iPS cell colony on such a macro live image 58c.
  • the CPU 51 in this step highlights the partial region arranged at the optical axis position among the plurality of micro fluorescent images (plural partial regions) constituting the tiling fluorescent image 58d as a cell extraction source candidate. To do.
  • the enhancement of the partial area is performed by thickening the outline of the partial area as shown in FIGS.
  • the current extraction source candidate designation can be canceled and the selected partial area can be designated as a new extraction source candidate.
  • the user designates the partial area by operating the mouse 57 or the keyboard 56 and moving the cursor (not shown) on the display 58 to the partial area to be designated, and then clicking the mouse 57 (or By pressing the enter key of the keyboard 56).
  • the CPU 51 in this step reads out the time-lapse moving image of the extraction source candidate from the storage memory 53 and writes it in the moving image display area of the work memory 54 as the history of the extraction source candidate. Then, the CPU 51 starts displaying a still image of a predetermined frame (for example, the latest frame) of the time-lapse moving image as a sample image in a predetermined area on the display 58 as indicated by reference numeral 58a in FIG.
  • a predetermined frame for example, the latest frame
  • the CPU 51 displays a playback button 58a 'in the vicinity of the sample image 58a (a sample image of a time-lapse moving image) on the display 58.
  • the playback button 58 a ′ is a button for the user to input a playback instruction for a time-lapse moving image to the computer 50.
  • the CPU 51 in this step creates a container image of the storage container 40 and displays it on the surplus area of the display 58 as indicated by reference numeral 58e in FIG.
  • the container image 58e is an image schematically representing the arrangement of the plurality of storage portions of the storage container 40.
  • the CPU 51 highlights the plurality of storage units constituting the container image 58e that are arranged at the above-described storage position 40a as the current discharge destination candidates.
  • the emphasis of the accommodating portion is performed by thickening the outline of the accommodating portion as shown in FIG.
  • the user designates the accommodation unit by operating the mouse 57 or the keyboard 56 and moving the cursor (not shown) on the display 58 to the accommodation unit to be designated, and then clicking the mouse 57 (or By pressing the enter key of the keyboard 56).
  • Step S23 The CPU 51 determines whether or not there is a new designation of the extraction source candidate. If there is a new designation, the process proceeds to step S24, and if there is no new designation, the process proceeds to step S26. To do.
  • Step S24 The eye CPU 51 arranges the newly designated extraction source candidate on the optical axis based on the newly designated container coordinates of the extraction source candidate and the coordinates of the observation stage 11 at the current time.
  • the target coordinates are calculated, and a driving instruction for the observation stage 11 is given to the control circuit 52 together with the target coordinates.
  • the control circuit 52 drives the observation stage 11 so that the actual coordinates of the observation stage 11 coincide with the target coordinates, and arranges the center of the newly designated extraction source candidate on the optical axis.
  • Step S25 The CPU 51 updates the tiling fluorescent image 58d on the display 58, the time-lapse moving image on the moving image display area, and the sample image 58a on the display 58 as follows.
  • the CPU 51 cancels the highlighting of the tiling fluorescence image 58d at the current time, and starts highlighting of the extraction source candidate newly designated on the tiling fluorescence image 58.
  • the CPU 51 shifts the overlapping position of the tiling fluorescence image 58d on the macro live image 58c in accordance with the displacement of the observation stage 11 in step S24, so that the tiling fluorescence image 58d is centered on the container of the macro live image 58c. Match the container center.
  • the CPU 51 reads out the newly designated time-lapse moving image of the extraction source candidate from the storage memory 53 and overwrites it on the moving image display area of the work memory 54. Then, the CPU 51 starts displaying a predetermined frame (for example, the latest frame) of the time-lapse moving image instead of the currently displayed sample image 58a.
  • a predetermined frame for example, the latest frame
  • FIG. 8 shows an example of the screen after updating in this step.
  • the extraction source candidate On the macro live image 58c shown in FIG. 8, a partial region deviating from the center of the container is designated as the extraction source candidate, and what is shown in the micro live image 58b is the micro dark field image of the extraction source candidate.
  • the sample image 58a shows the history of the extraction source candidates (here, the state during the latest observation).
  • Step S26 The CPU 51 determines whether or not there is a new designation of the discharge destination candidate. If there is a new designation, the process proceeds to step S27, and if there is no new designation, the process proceeds to step S29. .
  • Step S27 The CPU 51 arranges the newly designated discharge destination candidate at the accommodation position 40a described above based on the newly designated discharge destination candidate number and the coordinates of the accommodation stage 60 at the present time. 60 target coordinates are calculated, and an instruction to drive the accommodation stage 60 is given to the control circuit 52 together with the target coordinates.
  • the control circuit 52 drives the storage stage 11 so that the actual coordinates of the storage stage 60 coincide with the target coordinates, and places the newly specified discharge destination candidate at the storage position 40a.
  • Step S28 The CPU 51 cancels the highlighting of the container image 58e at the current time, and starts highlighting of the newly designated discharge destination candidate.
  • symbol 58e of FIG. 8 has shown the example of the container image 58e after the update by this step.
  • Step S29 The CPU 51 determines whether or not an instruction to change the observation magnification has been input. If it has been input, the process proceeds to step S30, and if not, the process proceeds to step S31.
  • Step S30 The CPU 51 instructs the control circuit 52 to change the observation magnification.
  • the control circuit 52 switches the observation magnification of the micro imaging optical system 18 by driving the revolver 18d.
  • Step S31 The CPU 51 determines whether or not a time-lapse moving image playback instruction has been input. If it has been input, the process proceeds to step S32. If not, the process proceeds to step S33.
  • Step S32 The CPU 51 displays (reproduces and displays) the time-lapse moving image written on the moving image display area instead of the sample image 58a.
  • the user observes the growth process of the cell colonies existing in the extraction source candidate (such as the temporal change of the fluorescence emission amount) and accurately determines whether or not the cell colonies are iPS cell colonies. Judgment can be made.
  • the stage controller 12 is operated while viewing the micro live image 58b, and the iPS cell colony is slowly moved toward the tip of the syringe 22 as indicated by an arrow in FIG. And close.
  • Step S33 The CPU 51 determines whether or not the stage controller 12 has been operated via the control circuit 52. If it has been operated, the process proceeds to step S34, and if it has not been operated, the process proceeds to step S35. .
  • Step S34 The CPU 51 gives the drive signal generated by the stage controller 12 to the observation stage 11 via the control circuit 52. As a result, the observation stage 11 is driven as desired by the user. However, here, it is assumed that the moving range of the observation stage 11 is limited to a very small range that does not remove the tip of the syringe 22 from the extraction source candidate in the culture vessel 30. When the user determines that the iPS cell colony has sufficiently approached the tip of the syringe 22 on the micro live image 58b, the user stops driving the observation stage 11 and starts operating the manipulator controller 21.
  • Step S35 The CPU 51 determines whether or not the manipulator controller 21 has been operated via the control circuit 52. If it has been operated, the process proceeds to step S36, and if it has not been operated, the process proceeds to step S39. .
  • Step S36 The CPU 51 gives the drive signal generated by the manipulator controller 21 to the manipulator 20 via the control circuit 52.
  • the manipulator 20 is driven as desired by the user. For example, the user shifts the syringe 22 downward to bring the tip of the syringe 22 into contact with the iPS cell colony, inhales the iPS cell colony into the syringe 22, sets the syringe 22 in the retracted state, and then the syringe.
  • the iPS cell colony is discharged from 22 to the outside.
  • Step S37 Based on the drive signal generated by the manipulator controller 21, the CPU 51 determines whether or not the liquid has been discharged from the retracted syringe 22 (whether or not the picking has been completed). If completed), the process proceeds to step S38. If not ejected (if picking has not been completed), the process proceeds to step S39.
  • Step S38 As shown in FIG. 10, the CPU 51 further emphasizes and displays (for example, reverse display) the extraction source candidate on the tiling fluorescence image 58d, and gives the extracted mark 58d 'to the extraction candidate. Further, the CPU 51 further emphasizes and displays (for example, reverse display) the discharge destination candidates on the container image 58e, and gives a discharged mark 58e 'to the discharge destination candidates.
  • the CPU 51 further emphasizes and displays (for example, reverse display) the extraction source candidate on the tiling fluorescence image 58d, and gives the extracted mark 58d 'to the extraction candidate.
  • the CPU 51 further emphasizes and displays (for example, reverse display) the discharge destination candidates on the container image 58e, and gives a discharged mark 58e 'to the discharge destination candidates.
  • the CPU 51 relates the relationship between the extracted mark 58d ′ and the discharged mark 58e ′.
  • the CPU 51 recognizes the number of times of picking with respect to the culture vessel 30 from the number of executions of this step up to the present time, and uses a number representing the number of times for both the extracted mark 58d 'and the discharged mark 58e'. Therefore, the user can intuitively know on which part of the cells the cells in which partial regions are accommodated on the display 58.
  • the extracted mark 58d ′ provided on the tiling fluorescence image 58d is not changed on the tiling fluorescence image 58d even if the superimposed position of the tiling fluorescence image 58d in the macro live image 58c is changed thereafter.
  • the user can avoid mistakes such as redesignating an extracted partial region as an extraction source candidate, or mistakes of accommodating cells extracted from different cell colonies in the same accommodation unit.
  • the partial area may be designated as a new extraction source candidate. it can.
  • the storage part can be designated as a new discharge destination candidate.
  • Step S39 The CPU 51 determines whether or not an end instruction has been input from the user. If not input, the CPU 51 returns to Step S23, and if input, ends the flow. Therefore, the user can repeat the picking of the cell colonies until the discharged mark 58e 'is given to all the accommodating parts of the container image 58e.
  • this system includes the macro imaging optical system 14 and the micro imaging optical system 18 that observe the culture vessel 30 from opposite sides, and the oblique illumination optical system that illuminates the culture vessel 30 from an oblique direction, as shown in FIG. 15, it is possible to simultaneously observe a rough state (macro dark field image) of the entire culture container 30 and a detailed state (micro dark field image) of a part of the culture container 30.
  • the computer 50 of the present system displays both the live image of the macro dark field image (macro live image 58c) and the live image of the micro dark field image (micro live image 58b) side by side on the display 58 at the same time.
  • the objective lens There is no need to switch the objective lens between searching a cell colony that seems to be an iPS cell colony from a plurality of cell colonies in the culture vessel 30 and observing the cell colony in detail. It is only necessary to move the line of sight on the display 58 between the macro live image 58c and the micro live image 58b.
  • the computer 50 of this system stores in advance the time-lapse moving image of each partial area of the culture vessel 30 in the storage memory 53.
  • the computer 50 reads the time-lapse moving image of the partial area (extraction source candidate) located on the optical axis of the micro imaging optical system 18 from the storage memory 53 and displays it on the display 58 together with the micro live image 58b. Can confirm the detailed state of the cell colony and the history of the cell colony at the same time.
  • the computer 50 of the present system displays the latest tiling fluorescence image 58d of the culture vessel 30 on the macro live image 58c, the user can present the current cell colonies scattered in the culture vessel 30. The appearance (texture, size, etc.) and the recent degree of fluorescence emission of these cell colonies can be observed simultaneously.
  • the computer 50 of the present system drives the observation stage 11 in accordance with the designation of the extraction source candidate by the user and automatically arranges the extraction source candidate on the optical axis (step S24). It is possible to minimize the user's operation.
  • the computer 50 of the present system determines whether or not the liquid is discharged from the retracted syringe 22 via the manipulator controller 21, and if it is discharged, the extraction destination candidate on the tiling fluorescent image 58d is determined. Since highlighting (reverse display) is performed, the user can intuitively know which partial region of cells has already been extracted on the tiling fluorescence image 58d.
  • the characteristic configuration in the second embodiment is a configuration in which the cell observation system is automated. Specifically, the wide-area image (the entire image of the culture vessel) acquired by the macro imaging optical system 14 and the micro imaging optics The syringe 22 is configured to be automatically controlled by the manipulator 20 based on the partial image (image of the cell of interest) acquired by the system 18.
  • the inverted microscope 10, the manipulator 20, and the storage stage 60 are arranged on the same base.
  • the observation position in the culture container 30 is changed by moving the culture container 30 in the XY plane using the observation stage 11.
  • the observation stage 11 is provided with observation position detection means 4 including an X direction position detection encoder 4X and a Y direction position detection encoder 4Y, and detects the XY coordinates of the observation stage 11.
  • the observation position coordinates (corresponding to the cell coordinate system) (X, Y) in the culture vessel 30 are detected.
  • the vertical movement of the objective lens 18 e by the focus knob 13 is detected by the observation position detection means 4 configured by the Z-direction position detection encoder 4 ⁇ / b> Z.
  • An observation position coordinate Z is detected.
  • the coordinate data (X, Y, Z) of the observation position in the culture vessel 30 is detected, and the coordinate data is registered in the memory of a CPU 51 (personal computer PC, etc., hereinafter referred to as PC) as a control device.
  • PC personal computer PC, etc., hereinafter referred to as PC
  • the manipulator 20 includes a motor that changes the rotation angle ⁇ of the syringe 22 (operation needle), a motor that changes the swing angle ⁇ of the syringe 22, and a motor that changes the movement amount Z of the syringe 22 in the optical axis direction. Yes.
  • the coordinate system of the manipulator 20 is detected by a manipulator coordinate detection unit configured by position detection encoders in the X ′ direction, the Y ′ direction, and the Z ′ direction disposed on the manipulator 20. Then, the coordinates of the tip of the syringe 22 fixed to the manipulator 20 are registered in the memory of the PC 51 as coordinate data (X ′, Y ′, Z ′).
  • a needle tip position detecting means 100 for detecting the tip of the syringe 22 fixed to the manipulator 20 is disposed in the vicinity of the manipulator 20.
  • the needle tip position detecting means 100 is a camera (hereinafter referred to as a low magnification camera 100) using a low magnification imaging lens and an imaging device (for example, a CCD camera). It is desirable to use a lens having a numerical aperture of 0.2 or more and a field number of 1.5 mm or more in order to accurately position the tip of the syringe 22 at the set position in the observation field of the objective lens 18e.
  • the needle tip position detecting means 100 may be constituted by a simple optical sensor that detects whether or not the needle tip has reached a predetermined position coordinate instead of the camera.
  • the coordinate data of the set position in the field of view of the objective lens 18e and the coordinate data of the tip of the syringe 22 are relatively associated with the set position in the field of view of the low magnification camera 100 via the PC 51.
  • the syringe 22 The tip is set at a set position in the field of view of the low magnification camera 100 and then driven by the manipulator 20 via the control means of the PC 51 to be positioned at the set position in the field of view of the objective lens 18e.
  • the calibration of the coordinate position of the tip of the synringe 22 is performed.
  • the culture vessel 30 is not placed on the observation stage 11.
  • the coordinate data of the set position in the field of view of the macro imaging optical system 14 and the coordinate data of the tip of the syringe 22 are relatively associated with the set position in the field of view of the low magnification camera 100 via the PC 51, and this As a result, the tip of the syringe 22 is set at the set position in the field of view of the low-power camera 100 and then driven by the manipulator 20 via the control means of the PC 51 to the set position in the field of view of the macro imaging optical system 14. Positioned.
  • the manipulator 20 is controlled by the control means provided in the PC 51 so that the distal end of the syringe 22 is within the observation field of the objective lens 18e from the set position in the field of view of the camera 100. Is set to a predetermined position of the culture vessel 30. The set position is in the vicinity of the center of the visual field and is an observation position suitable for entering the experiment operation.
  • the home position of the coordinate system (X, Y, Z) of the inverted microscope 10 is initially set (S1).
  • the focusing of the objective lens 18e of the inverted microscope 10 is performed.
  • beads having a diameter of several ⁇ m such as polystyrene mounted on a cover glass are used, and the beads are focused on the center of the visual field of the objective lens 18e.
  • the operator moves the bead to the center of the visual field of the objective lens 18e (using a crosshair for taking a photograph in the optical system) and operates the observation stage 11 and the focus knob 13 to align the bead. To burn.
  • the observation position detection means 4 (4X, 4Y, 4Z) for detecting the XY movement of the observation stage 11 and the vertical movement of the objective lens 18e transmits the detected coordinate data (X0, Y0, Z0) to the PC 51. Then, the PC 51 registers the coordinate data (X0, Y0, Z0) in the memory as home position data.
  • the focus knob 13 for moving the observation stage 11 and the objective lens 18e may be electric or manual.
  • observation is performed with the distal end position of the syringe 22 at the set position in the field of view of the low magnification camera 100 (often set at the center position of the field of view) and the high magnification (for example, 40 times) objective lens 18e.
  • the correlation between the set position in the observed visual field and the tip position of the syringe 22 (often set at the center of the visual field) is pre-registered in the memory of the PC 51.
  • the coordinate data of the manipulator 20 at this time is registered in the PC 51. Is done.
  • the tip of the syringe 22 is moved to a predetermined set position within the field of view of the objective lens 18e, the coordinate data of the manipulator 20 at this time is registered in the PC 51. With these two coordinate data, the correlation between the set position in the field of view of the low magnification camera 100 and the set position in the field of view of the objective lens 18e is determined by the PC 51.
  • the operator moves the tip of the syringe 22 to the set position within the field of view of the objective lens 18e by using the manipulator 20, and moves the manipulator 20 in each of X′Y′Z ′ directions so that the tip of the syringe 22 is in focus.
  • Move (S2) moves the tip of the syringe 22 to the set position within the field of view of the objective lens 18e by using the manipulator 20, and moves the manipulator 20 in each of X′Y′Z ′ directions so that the tip of the syringe 22 is in focus.
  • the manipulator coordinate detecting means 22 transmits the detected coordinate data (X′0, Y′0, Z′0) of the manipulator 20 to the PC 51, and the PC 51 registers it in the memory (S3).
  • a registration method a method using a manual switch may be used, or there may be an automatic focusing device for detecting the coordinates of the tip of the syringe 22 set at the set position in the field of view of the objective lens 18e.
  • a method based on a focus signal generated by the autofocus device may be used.
  • the operator moves the tip of the syringe 22 to the set position within the field of view of the low magnification camera 100 using the manipulator 20 and moves the manipulator 20 so that the low magnification camera 100 is focused on the tip of the syringe 22.
  • Drive (S4) the operator moves the tip of the syringe 22 to the set position within the field of view of the low magnification camera 100 using the manipulator 20 and moves the manipulator 20 so that the low magnification camera 100 is focused on the tip of the syringe 22.
  • the manipulator coordinate detecting means 22 transmits the detected coordinate data (X′1, Y′1, Z′1) of the manipulator 20 to the PC 51, and the PC 51 registers it in the memory (S5).
  • a registration method a method using a manual switch may be used, or, if the low magnification camera 100 has an autofocus device, a method based on a focus signal generated by the autofocus device may be used.
  • the amount of movement ( ⁇ , ⁇ , Z) of the tip of the syringe 22 is calculated by the PC 51.
  • the initial setting operation that is, calibration is completed.
  • the manipulator 20 is driven by the control means of the PC 51, and the tip of the syringe 22 is set at the set position in the field of view of the objective lens 18e. Set automatically.
  • FIG. 14 is a configuration diagram of the cell production system.
  • the cell production system of FIG. 14 is configured by connecting an incubator 300 and a cell observation system 103 (the system of the first embodiment or the second embodiment) with a culture container transport robot 200.
  • the space 400 in which the cell production system exists is managed under a certain culture environment (including culture environment conditions such as temperature, humidity, and carbon dioxide).
  • This cell production system acquires a wide area image by observing the culture vessel 103 in which cells are cultured with the macro imaging optical system 14, specifies the position of the cell from the wide area image with the micro imaging optical system 18, and Is micro-observed, and a partial image in the wide area image is acquired. Thereafter, the cell state is determined based on the partial image, and as a result of determining the cell state, good cells are picked from the culture vessel 103. Picking is performed by controlling the front end of the synringe 22 based on the wide area image and the partial image. Then, the cells picked by the synringe 22 are seeded in a new culture container 103, and then the new culture container 103 is transported to the incubator 300. The seeded cells are cultured for a certain period in an incubator. By repeating this routine, good cells can be cultured and increased.
  • the picking control by the syringe 22 is performed as follows. That is, based on the wide-area image obtained by the macro imaging optical system, the XY coordinate position of the tip of the syringe 22 is matched with the XY coordinate position of the cell, and the tip is determined based on the partial image obtained by the micro imaging optical system.
  • the cell is driven toward the XYZ coordinate position of the cell, and the cell is picked by the syringe 22. More specifically, it is as follows.
  • the computer 50 in FIG. 2 automatically controls the manipulator 20 based on cell images acquired from the macro imaging optical system 14 and the micro imaging optical system 18 by executing a predetermined program, In addition to picking up the cells of interest, control is performed to culture and grow the cells.
  • the processing of the computer 50 will be described based on FIG.
  • Step 41 The wide-area cell image acquired by the macro imaging optical system 14 is stored in the storage memory 53 of FIG.
  • the CPU 51 reads out the stored cell image and performs iPS cell colony identification processing based on the plurality of time-lapsed cell images.
  • the iPS cell colony identification process includes a process of detecting the coordinate position (XY coordinate value) of the target cell based on the wide area image and a process of determining a noise component that is not of the target cell. For example, as described in the first embodiment, fluorescence may be read to identify an iPS cell colony, or in the case of non-invasive detection, an iPS cell colony is obtained from morphological information based on a phase difference observation image. May be specified.
  • Candidate attention cells are identified based on a wide-area cell image. That is, the cells in the culture vessel include bubbles that become noise, dead cells, initial colony cells before cell colony formation, and the like.
  • the bright field observation image for example, transmission observation image, phase difference observation image, observation image by oblique illumination
  • the macro imaging optical system 14 is scattered in the culture vessel. Extract morphological information of individual cells. From the extracted morphological information of each cell, for example, cell area information, cell long side length information, circularity information, etc., cells that do not satisfy a predetermined condition are excluded from the candidates. In this way, iPS cell colonies in good condition can be included in the candidate cells.
  • the above processing may be performed based on a wide-area cell image, and a cell that becomes noise may be specified as a candidate cell.
  • the subsequent process is a process of leaving only cells that may pick up cells that cause noise. Therefore, in that case, the culture can be continued without using a new culture vessel.
  • Step 42 A process of specifying a cell of interest (iPS cell colony) from the candidate cells specified in step 41 is executed.
  • the coordinate position (XY coordinate value) of the cell of interest is obtained based on the wide area image, the observation stage 11 is driven based on the coordinate position, and the image of the cell of interest is acquired by the micro imaging optical system 18 (a plurality of cells of interest are If present, an image of each cell of interest is acquired). And the process which determines the growing state of an attention cell based on the acquired partial image (image of an attention cell) is made.
  • fluorescence may be read to identify an iPS cell colony, or in the case of non-invasive detection, iPS cells are obtained from morphological information based on phase difference observation images. Colonies may be identified.
  • a high-definition phase difference observation image acquired by the micro imaging optical system 18 is used.
  • a known contour extraction process for example, binarization process or differentiation process
  • the extracted contour line When the dispersion value of the brightness intensity of the cell image is determined to be lower than the predetermined dispersion value (recognized as a uniform cell colony), the iPS cell colony within the outline is regarded as a good cell. There is a way.
  • steps 41 and 42 are set in advance in the observation schedule. For example, while time-lapse observation imaging is being performed, steps S41 and S42 are executed at predetermined time intervals, or predetermined processing is performed. Steps S41 and S42 are executed after the number of times of shooting has elapsed. This processing timing is set empirically based on the culture time of the iPS cell colony.
  • Step 43 When the iPS cell colony that is the target cell is detected, the manipulator 20 is automatically controlled based on the macro image 58d and the micro image 58b as shown in FIG. Specifically, first, based on the image information of the macro image 58 d, the dark field image 22 ′ of the syringe reflected on the macro image is detected, and the coordinate system of the manipulator 20 is calculated by the manipulator coordinate detection means 22. And control which sets the coordinate position of the front-end
  • the micro imaging optical system can catch the tip, so that precise control of the manipulator 20 is performed based on the image information of the micro image 58b. Since the image information of the micro image 58b is a higher definition image than the macro image 58d, the coordinate position (XYZ coordinate value) of the cell of interest and the coordinate position (XYZ coordinate value) of the tip of the syringe are in units of micrometers. Can be controlled.
  • Step 44 The tip of the syringe approaches the target cell, and the target cell is picked up (sucked into the syringe).
  • Step 45 The manipulator 20 is automatically controlled, and the picked-up target cell is seeded in the new culture vessel 103 of FIG. 11 and transferred.
  • Step 46 A new culture vessel is transferred from the cell observation system 500 in FIG. 11 to the incubator 300 by the transfer robot 200 in FIG.
  • the transfer robot 200 holds the new culture vessel 103 by the articulated transfer arm 210 and transfers the culture vessel 103 from the opening of the incubator 300 to the room where the environment is maintained.
  • Step 47 The culture vessel 103 conveyed by the incubator 300 is maintained in an optimum environment for culturing iPS cell colonies and cultured for a predetermined period.
  • An imaging device (such as a CCD camera) in the incubator 300 takes a time-lapse image of the culture vessel 103 and acquires an image of an iPS cell colony. Based on this image, the growth status of iPS cell colonies is sequentially analyzed.
  • the iPS cell colonies cultured in the incubator 300 are sent again to the cell observation system 500 by the culture container transport robot 200 after a predetermined period. Then, as described above, the flowchart of FIG. 14 is repeatedly executed to analyze the state of cell growth, and cell culture is repeatedly executed. Thereby, only good iPS cell colonies can be grown.
  • the number of partial areas that can be simultaneously specified as extraction source candidates is set to 1, but may be more than one.
  • the computer 50 causes the user to designate one of the plurality of extraction source candidates being designated, and drives the observation stage 11 so that the newly designated extraction source candidate is arranged on the optical axis. That's fine.
  • one oblique illumination optical system 15 is shared by the macro imaging optical system 14 and the micro imaging optical system 18.
  • the oblique illumination optical system dedicated to the macro imaging optical system 14 and a micro A dedicated oblique illumination optical system may be used for the imaging optical system 18.
  • at least one of the oblique illumination optical system of the macro imaging optical system 14 and the oblique illumination optical system of the micro imaging optical system 18 may be an incident dark field illumination optical system.
  • the macro imaging optical system 14 and the micro imaging optical system 18 are disposed to face each other with the observation stage 11 interposed therebetween.
  • the present invention is not limited to this, and for example, both imaging optical systems are on one side of the observation stage 11. May be arranged.
  • the micro imaging optical system is disposed at the position of the macro imaging optical system 14 shown in FIG. 1, the macro imaging optical system is disposed at the position of the light shielding illumination optical system 15, and the micro imaging optical system is arranged. What is necessary is just to arrange
  • the macro imaging optical system that acquires a wide-area image of the culture vessel is composed of a low-resolution CCD sensor
  • the micro-imaging optical system that acquires a partial image in the wide-area image of the culture vessel is It consists of a high-resolution CCD sensor.
  • the picking of the cells in the culture container has been described, but it is also useful when a predetermined drug is dropped on the cells.
  • the computer 50 determines whether or not there is a picking completion notification based on the operation content of the manipulator controller 21. If the part is not motorized, the user must voluntarily input a picking completion notification.
  • the picking completion notification is input via the keyboard 56, mouse 57, or an input device prepared separately. Alternatively, it is performed via a specific operation unit provided in the manipulator controller 21.
  • the micro imaging optical system 18 of the above-described embodiment detects only one type of micro fluorescent image
  • the micro imaging optical system 18 may be modified to simultaneously detect a plurality of types of micro fluorescent images having different wavelengths.
  • the computer 50 creates a color micro-fluorescence image by synthesizing a plurality of types of micro-fluorescence images obtained by the micro-imaging optical system 18 with different colors, and processes the image as described above before displaying the display 58. Will be displayed.
  • At least a part of the operation of the CPU 51 may be executed by the control circuit 52.
  • the CPU 51 may cause at least a part of the operation of the control circuit 52 to be executed.
  • the inverted microscope 10, the manipulator 20, and the accommodation stage 60 of the system of the above-described embodiment may be arranged inside the culture apparatus.
  • the culture device is a device that maintains the surrounding environment (carbon dioxide concentration, temperature, humidity, etc.) of the culture vessel as set in advance.
  • SYMBOLS 30 Culture container, 10 ... Inverted microscope, 20 ... Manipulator, 40 ... Container, 60 ... Storage stage, 21 ... Manipulator controller, 11 ... Observation stage, 18 ... Micro imaging optical system 18, 14 ... Macro imaging optical system, 15 ... oblique illumination optical system, 22 syringes ..., 12 ... stage controller

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Abstract

　培養容器内に存在する細胞への操作をユーザが行う際の手間を軽減する。そのために本発明の細胞観察装置は、細胞の培養容器（３０）を支持する観察ステージ（１１）と、観察ステージにおける培養容器の広域画像を取得するマクロ撮像光学系（１４）と、広域画像内の部分画像を取得するミクロ撮像光学系（１８）と、培養容器内の細胞を操作する操作針（２２）を制御する制御手段（２０）とを備え、ミクロ撮像光学系が観察ステージを挟みマクロ撮像光学系に対向する側に配置される。

Description

細胞観察装置及び細胞培養方法
　本発明は、細胞観察装置及び細胞培養方法に関する。
　人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立する手順は、例えば非特許文献１に開示されている。非特許文献１の手順では、先ず、培養液を収容する培養容器の底面にフィーダー細胞層を形成しておき、そこへヒト成人皮膚細胞（線維芽細胞）を播種した後、それらの細胞に対して山中因子と呼ばれる４遺伝子を導入する（４遺伝子を導入するためのレトロウィルスベクターを添加する）。その後、培養液の交換を行いながら培養を続けると、フィーダー細胞上に、４遺伝子が導入されただけの細胞コロニー（Ｎｏｎ－ｉＰＳ細胞コロニー）と、４遺伝子の導入後に分化能の発現した細胞コロニー（ｉＰＳ細胞コロニー）とが現れるので、このうち後者のみをシリンジでピッキングし、ｉＰＳ細胞株の樹立を図っている。
　この手順の中で、細胞コロニーのピッキングは、熟練した研究者が顕微鏡の接眼レンズを覗きながら手動で行っている。その際、研究者は、顕微鏡の観察倍率を低倍側にセットして培養容器の比較的広い範囲を観察し、ｉＰＳ細胞コロニーを探索する。そして、ステージを移動させてその細胞コロニーを対物レンズの光軸近傍に配置した後、顕微鏡の観察倍率を高倍側へセットし、細胞コロニーがｉＰＳ細胞コロニーであることを確認してから、顕微鏡の観察倍率を低倍側へ戻し、シリンジの先端をディッシュへ挿入して細胞コロニーをピッキングしている。
Center for iPS Research and Application, Institute for Integrated Cell-Material Sciences, "Generation of Human induced Pluripotent Stem Cells", Kyoto University, March 5, 2009
　しかしながら、細胞コロニーがＮｏｎ－ｉＰＳ細胞コロニーであった場合には、顕微鏡の観察倍率を低倍側へ再セットし、ｉＰＳ細胞コロニーと思われる細胞コロニーを探索し直す必要があった。
　そこで本発明は、培養容器内に存在する細胞への操作（インジェクション、パッチクランプ、ピッキングなど）をユーザが行う際の手間を軽減するのに有効な細胞観察装置及び細胞培養方法を提供する。
　本発明の細胞観察装置は、細胞の培養容器を支持する観察ステージと、前記培養容器内の細胞を操作する操作針と前記培養容器内の細胞との位置関係を観察するために、前記観察ステージにおける前記培養容器の広域画像を取得するマクロ撮像光学系と、前記培養容器内の細胞を操作する操作針と前記培養容器内の細胞との位置関係を観察するために、前記広域画像内の部分画像を取得するミクロ撮像光学系と、前記培養容器内の細胞を操作する前記操作針を制御する制御手段とを備え、前記ミクロ撮像光学系が前記観察ステージを挟み前記マクロ撮像光学系に対向する側に配置される。
　なお、前記制御手段は、前記部分画像に基づき、目的の細胞を前記培養容器からピッキングするように前記操作針を制御し、前記ピッキングされた前記目的の細胞を別の培養容器に播種してもよい。
　また、本発明の細胞培養方法は、本発明の細胞観察装置を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、前記ピッキングされた前記目的の細胞を前記別の培養容器に播種した後に、前記別の培養容器をインキュベータに搬送するステップと、前記インキュベータにより一定期間、前記播種された前記目的の細胞を培養し、その後に前記別の培養容器を前記細胞観察装置に戻すステップと、を繰り返すことにより前記目的の細胞の数を増やす。
　また、本発明の細胞観察装置は、細胞の培養容器を支持する観察ステージと、前記観察ステージにおける前記培養容器の広域画像を取得するマクロ撮像光学系と、前記培養容器の部分画像を取得するミクロ撮像光学系と、前記培養容器内の細胞を操作する操作針を制御する際には、前記マクロ撮像光学系によるマクロ画像の取得と、前記ミクロ撮像光学系によるミクロ画像の取得との双方を同時に行うように制御する制御手段とを備える。
　また、本発明の細胞培養方法は、細胞を培養する細胞培養方法において、培養中の前記細胞を収容している培養容器をマクロ観察し、広域画像を取得するマクロ撮像ステップと、前記広域画像から前記細胞の位置を特定し、前記細胞をミクロ観察し、前記広域画像内の部分画像を取得するミクロ撮像ステップと、前記部分画像に基き前記細胞の状態を判定する判定ステップと、前記判定ステップで前記細胞の状態を判定した結果、良好な細胞を前記培養容器からピッキングするために、前記広域画像および前記部分画像に基づき操作針を制御するピッキングステップと、前記操作針にてピッキングされた前記良好な細胞を前記別の培養容器に播種した後に、前記別の培養容器をインキュベータに搬送するステップと、前記インキュベータにより一定期間、前記播種された前記良好な細胞を培養する培養ステップとを有し、上記ステップを繰り返すことにより前記良好な細胞の数を増やす。
　本発明によれば、培養容器内に存在する細胞への操作をユーザが行う際の手間を軽減するのに有効な細胞観察装置及び細胞培養方法が実現する。
本システムの機械的部分の構成を説明する図である。 本システムのコンピュータを説明する図である。 ＣＰＵ５１による観察処理のフローチャートである。 ＣＰＵ５１によるピッキング支援処理のフローチャート（前半）である。 ＣＰＵ５１によるピッキング支援処理のフローチャート（後半）である。 ディスプレイ５８の初期の表示画面を示す図である。 マクロライブ画像５８ｃ及びタイリング蛍光画像５８ｄを説明する図である。 ディスプレイ５８の更新後の表示画面を示す図である。 マニピュレータの操作中におけるディスプレイ５８の表示画面を示す図である。 抽出済みマーク及び排出済みマークを説明する図である。 第２実施形態のシステムの構成図（主に機械部分）である。 第２実施形態のシステムの構成図（主に回路部分）である。 初期設定作業のフローチャートである。 細胞生産システムの構成図である。 細胞生産システムのフローチャートである。
　［第１実施形態］
　以下、本発明の実施形態として細胞観察システムの実施形態を説明する。
　図１は、本システムの機械的部分の構成を説明する図である。図１に示すとおり本システムには、培養容器３０内の細胞を観察するための倒立顕微鏡１０と、培養容器３０内の細胞を操作するためのマニピュレータ２０と、収容容器４０を支持する電動の収容ステージ６０と、マニピュレータ２０を駆動するためのマニピュレータコントローラ２１と、倒立顕微鏡１０の観察ステージ１１を駆動するためのステージコントローラ１２とが備えられる。なお、本システムには不図示のコンピュータも備えられる（コンピュータの説明は後述する。）。
　倒立顕微鏡１０には、培養容器３０を支持する透過型かつ電動の観察ステージ１１と、培養容器３０の全体画像を培養容器３０の上方正面から取得するマクロ撮像光学系（実体顕微鏡）１４と、培養容器３０の一部の拡大画像を培養容器３０の下方正面から取得するミクロ撮像光学系（拡大顕微鏡）１８と、培養容器３０の全体を培養容器３０の上方斜め方向から照明する斜光照明光学系１５と、ミクロ撮像光学系１８の対物レンズ１８ｅを介して培養容器３０の一部へ培養容器３０の下方正面から励起光を照射する落射蛍光照明光学系１７と、培養容器３０に対する対物レンズ１８ｅの焦点調節をユーザが手動で行うためのフォーカスノブ１３とが備えられる。
　培養容器３０は、例えば、径が１００ｍｍのディッシュである。培養容器３０の底面にはフィーダー細胞層が形成されており、フィーダー細胞層上は培養液で満たされている。また、フィーダー細胞層には、予めヒト成人皮膚細胞（線維芽細胞）が播種され、それらの細胞には、山中因子と呼ばれる４遺伝子を導入するためのレトロウィルスベクターが添加されている。なお、これらの細胞には、４遺伝子の導入後に分化能が発現した場合にのみ特定色（ここでは緑色）の蛍光を発する蛍光遺伝子も予め導入されている。
　この培養容器３０では、フィーダー細胞層の表面に接着した細胞が増殖して細胞コロニーを形成する。この細胞コロニーを観察するために、前述した焦点調節では、ミクロ撮像光学系１８の対物レンズ１８ｅの焦点面を培養容器３０の底面近傍（フィーダ細胞層の近傍）に位置させる。
　観察ステージ１１は、培養容器３０の形状に適したホルダによって培養容器３０を固定保持している。よって、培養液の交換などのために培養容器３０が観察ステージ１１から一時的に外されたとしても、観察ステージ１１に対する培養容器３０の姿勢及び配置位置は再現される。また、観察ステージ１１は、ステージコントローラ１２に接続されており、ユーザがステージコントローラ１２を操作すると、観察ステージ１１は、その操作内容に応じて培養容器３０を観察ステージ１１の載置台に沿う方向（ＸＹ方向）へ移動させる。
　なお、観察ステージ１１とステージコントローラ１２とは直接的に接続されていてもよいが、ここでは説明上、コンピュータの制御回路（図２）を介して間接的に接続されているものと仮定する。
　ミクロ撮像光学系１８は、複数の対物レンズを保持した電動のレボルバ１８ｄと、光路折り曲げミラー１８ｃと、結像光学系１８ｂと、撮像素子１８ａとを備え、培養容器３０のうち対物レンズ１８ｅの視野によって捕らえられた領域（部分領域）の拡大画像（例えば１０倍の画像）を取得する。なお、ミクロ撮像光学系１８の対物レンズ１８ｅの光軸は、観察ステージ１１の基準面に対して垂直である。
　レボルバ１８ｄは、倍率の異なる複数の対物レンズを保持しており、ミクロ撮像光学系１８の対物レンズ１６ｅを他の対物レンズに切り替える。これによって、ミクロ撮像光学系１８の観察倍率が例えば１０倍と４倍との間で切り替わる。
　マクロ撮像光学系１４は、結像レンズ１４ｂと、撮像素子１４ａとを備え、培養容器３０の全体の縮小画像（例えば０．５倍の画像）を取得する。結像レンズ１４ｂは、培養容器３０の近傍と撮像素子１４ａの撮像面とを共役に結んでおり、焦点調節を行わなくともその撮像面上へ十分なコントラストで培養容器３０の全体像を形成することができる。なお、結像レンズ１４ｂの光軸は、ミクロ撮像光学系１８の対物レンズ１８ｅの光軸と一致している。
　斜光照明光学系１５は、白色光源などからなる斜光照明用光源１５ａと、照明レンズ１５ｂとを備え、培養容器３０の全体を斜め方向からほぼ均一の照度で照明する。なお、照明レンズ１５ｂの光軸は、観察ステージ１１の載置台の近傍でマクロ撮像光学系１４の光軸と交差している。
　斜光照明用光源１５ａから射出し照明レンズ１５ｂを経由した光のうち、培養容器３０で発生した散乱光は、マクロ撮像光学系１４、及びミクロ撮像光学系１８の対物レンズ１８ｅへ入射するが、培養容器３０で発生した非散乱光（直接光）は、マクロ撮像光学系１４、及びミクロ撮像光学系１８の対物レンズ１８ｅへ殆ど入射しないものとする。
　よって、斜光照明用光源１５ａがオンされているとき、ミクロ撮像光学系１８は、培養容器３０の前述した部分領域の拡大暗視野画像（以下、「ミクロ暗視野画像」と称す。）を取得することができる。また、斜光照明用光源１５ａがオンされているとき、マクロ撮像光学系１４は、培養容器３０の全体の縮小暗視野画像（以下、「マクロ暗視野画像」と称す。）を取得することができる。
　落射蛍光照明光学系１７は、励起光源１７ａと、照明レンズ１７ｂと、蛍光ブロック１７ｃとを備え、ミクロ撮像光学系１８の対物レンズ１８ｅを介して前述した部分領域へ励起光を照射する。なお、励起光源１７ａの発光波長は、細胞内に発現した蛍光物質を励起するための波長に設定されており、蛍光ブロック１７ｃの検出波長は、その蛍光物質の発光する蛍光の波長（ここでは緑色の波長）と同じに設定されている。
　よって、励起光源１７ａがオンされているとき、ミクロ撮像光学系１８は、培養容器３０の前述した部分領域の拡大蛍光画像（以下、「ミクロ蛍光画像」と称す。）を取得することができる。
　なお、落射蛍光照明光学系１７の蛍光ブロック１７ｃは、ミクロ撮像光学系１８の光路に対して挿離可能に構成されており、その挿脱は不図示の電動機構によって行われる。ミクロ撮像光学系１８がミクロ暗視野画像を取得する際には、蛍光ブロック１７ｃは光路から離脱され、ミクロ撮像光学系１８がミクロ蛍光画像を取得する際には、蛍光ブロック１７ｃは光路へ挿入される。
　マニピュレータ２０は、例えば油圧式のマニピュレータであって、培養容器３０内の細胞を操作するための操作針を装着している。ここでは、操作針としてシリンジ２２が装着されるものと仮定する。なお、シリンジ２２の先端部は、必要に応じて新しいものに交換することが可能である。
　マニピュレータ２０は、倒立顕微鏡１０から外れた位置にて倒立顕微鏡１０と共通のベース上に設けられており、シリンジ２２のポンプ部分を支持し、シリンジ２２の先端を斜め下方に向けている。マニピュレータ２０は、マクロ撮像光学系１４の光軸と平行な回転軸２０ａの周りにシリンジ２２を回転させたり、その回転軸２０ａに沿った方向へシリンジ２２をシフトさせたりする。
　また、マニピュレータ２０は、シリンジ２２の回転位置及びシフト位置の組み合わせを、必要に応じて予め決められた観察状態（図１に実線で示す状態）に設定することが可能である。また、マニピュレータ２０は、シリンジ２２の回転位置及びシフト位置の組み合わせを、必要に応じて予め決められた退避状態（図１に点線で示す状態）に設定することが可能である。
　図１に実線で示した観察状態は、シリンジ２２の先端がマクロ撮像光学系１４の光軸上に配置され、かつシリンジ２２の先端が培養容器３０の最上部より上方に位置した状態である。シリンジ２２がこの観察状態にあるときには、仮に観察ステージ１１をＸＹ方向に移動させても、シリンジ２２が培養容器３０に接触する可能性は無い。また、この観察状態からシリンジ２２のシフト位置を下方へ変位させれば、シリンジ２２の先端を培養容器３０内の培養液へ浸けることができる。
　図１に点線で示した退避状態は、シリンジ２２の全体が倒立顕微鏡１０から完全に外れるような状態である。前述した収容ステージ６０は、退避状態におけるシリンジ２２の先端の下方（図１に符号４０ａで示す収容位置）に収容容器４０の収容部を配置している。
　また、マニピュレータ２０は、マニピュレータコントローラ２１に接続されており、ユーザがマニピュレータコントローラ２１を操作すると、その操作内容に応じてシリンジ２２を駆動する。
　なお、マニピュレータ２０とマニピュレータコントローラ２１とは直接的に接続されていてもよいが、ここでは説明上、コンピュータの制御回路（図２）を介して間接的に接続されているものと仮定する。
　また、シリンジ２２のポンプ部分は、ユーザによって直接的に手動操作されてもよいが、ここでは説明上、電動化されており、マニピュレータ２０によって駆動されるものと仮定する。この場合、ユーザは、シリンジ２２への液体（ここでは、細胞を含んだ培養液のことを「液体」という。）の吸入、シリンジ２２からの液体の排出を、それぞれマニピュレータコントローラ２１の操作により行うことになる。
　収容ステージ６０は、収容容器４０の形状に適したホルダによって収容容器４０を固定保持している。収容容器４０には、複数の収容部４０－１～４０－８が各々の開口を上方へ向けた状態でＸＹ面内に並んで形成されている。
　したがって、シリンジ２２が退避状態にあるときにシリンジ２２から液体を排出させれば、収容位置４０ａに配置された収容部（有効な収容部）へその液体を収容することができる。また、収容ステージ６０が収容容器４０をＸＹ方向へ移動させると、有効な収容部を収容部４０－１～４０－８の間で切り替えることができる。
　図２は、本システムのコンピュータを説明する図である。図２に示すとおり本システムのコンピュータ５０は、制御回路５２と、ＣＰＵ５１と、保存用メモリ５３と、作業用メモリ５４と、インタフェース回路５５とを備える。
　このうち制御回路５２は、図１に示した観察ステージ１１と、レボルバ１８ｄと、撮像素子１４ａ、１８ａと、蛍光ブロック１７ｃと、斜光照明用光源１５ａと、励起光源１７ａと、収容ステージ６０と、ステージコントローラ１２と、マニピュレータコントローラ２１とに接続されている。
　また、コンピュータ５０には、ＣＰＵ５１の動作プログラムが予めインストールされている。この動作プログラムは、保存用メモリ５３に格納されており、必要に応じて作業用メモリ５４上に読み出され、ＣＰＵ５１によって実行される。
　また、コンピュータ５０には、インタフェース回路５５を介してキーボード５６、マウス５７、ディスプレイ５８などの入出力器が接続される。ユーザは、キーボード５６又はマウス５７を介してコンピュータ５０のＣＰＵ５１へ各種の指示を入力することができる。なお、コンピュータ５０とユーザとの間の情報の送受は、キーボード５６、マウス５７、ディスプレイ５８を利用した周知のＧＵＩにて行われるものとする。
　ユーザからコンピュータ５０に対して入力される情報には、培養容器３０の観察スケジュールや、観察の開始指示、ピッキング支援の開始指示などがある。
　観察スケジュールは、培養容器３０の観察頻度を示すものであり、例えば、「２４時間毎」などと設定されている。この観察スケジュールは、保存用メモリ５３へ格納される。
　観察の開始指示は、培養容器３０の準備が完了し、培養を開始する際に入力される指示であって、ＣＰＵ５１に対して観察処理（後述）を実行させるための指示である。
　ピッキング支援の開始指示は、培養が十分な期間に亘って行われた後に必要な細胞（ここではｉＰＳ細胞コロニー）のピッキングを行う際に入力される指示であって、ＣＰＵ５１に対してピッキング支援処理（後述）を実行させるための指示である。
　図３は、ＣＰＵ５１による観察処理のフローチャートである。以下、図３の各ステップを順に説明する。なお、観察処理の実行時には、シリンジ２２の先端はシリンジ２２から外されているものとする。
　ステップＳ１１：ＣＰＵ５１は、保存用メモリ５３に格納された観察スケジュールを読み出し、その観察スケジュールを現在の日時と比較することにより、観察時期が到来したか否かを判別する。観察時期が到来した場合にはステップＳ１２へ移行し、観察時期が到来していなかった場合には待機する。
　ステップＳ１２：ＣＰＵ５１は、斜光照明によるタイリング撮影を行うよう制御回路５２へ指示する。制御回路５２は、蛍光ブロック１７ｃを必要に応じて駆動し、ミクロ撮像光学系１８の光路から離脱させると共に、レボルバ１８ｄを必要に応じて駆動し、１０倍観察用の対物レンズをミクロ撮像光学系１８の光路に挿入する。この状態で制御回路５２は斜光照明光源１５ａを点灯し、観察ステージ１１をＸＹ方向にステップ移動させながら撮像素子１８ａを繰り返し駆動することにより、培養容器３０の各部分領域を個別に写した複数のミクロ暗視野画像を取得し、斜光照明光源１５ａを消灯する。
　ＣＰＵ５１は、制御回路５２が取得した複数のミクロ暗視野画像の各々に対し、対応する部分領域の培養容器上の座標の情報（容器座標情報）を付与してから、それらのミクロ暗視野画像を保存用メモリ５３へ書き込む。なお、書き込みに当たり、ＣＰＵ５１は、これらのミクロ暗視野画像の各々に対し、現在の日時の情報（観察日時情報）を付与する。
　ステップＳ１３：ＣＰＵ５１は、励起光源によるタイリング撮影を行うよう制御回路５２へ指示を与える。制御回路５２は、蛍光ブロック１７ｃを駆動し、ミクロ撮像光学系１８の光路へ挿入する。この状態で制御回路５２は励起光源１７ａを点灯し、観察ステージ１１をステップＳ１３と同じ移動パターンで移動させながら撮像素子１８ａを繰り返し駆動することにより、培養容器３０の各部分領域を個別に写した複数のミクロ蛍光画像を取得し、励起光源１７ａを消灯する。
　ＣＰＵ５１は、制御回路５２が取得した複数のミクロ蛍光画像の各々に対し、対応する部分領域の培養容器上の座標の情報（容器座標情報）を付与してから、それらのミクロ蛍光画像を保存用メモリ５３へ書き込む。なお、書き込みに当たり、ＣＰＵ５１は、これらのミクロ蛍光画像に対し、現在の日時の情報（観察日時情報）を付与する。なお、ここでは、ミクロ蛍光画像のうち輝度の高い部分は、蛍光ブロック１７ｃの検出波長に対応する色（ここでは緑色）と同じ色で表現されるものと仮定する。
　ステップＳ１４：ＣＰＵ５１は、ユーザから終了指示が入力されたか否かを判別し、入力されなかった場合にはステップＳ１１に戻り、終了指示が入力された場合にはフローを終了する。
　したがってＣＰＵ５１は、観察時期の到来する度に、培養容器３０の各部分領域に関するミクロ暗視野画像及びミクロ蛍光画像を取得し、保存用メモリ５３へ書き込む。これによって、ミクロ暗視野画像の履歴及びミクロ蛍光画像の履歴が培養容器３０の部分領域毎に徐々に蓄積される。
　図４、図５は、ＣＰＵ５１によるピッキング支援処理のフローチャートである。以下、図４、図５の各ステップを順に説明する。なお、ピッキング支援処理の途中で、ユーザはシリンジ２２の先端を必要に応じて装着・交換するが、ここでは説明を簡略化するため、シリンジ２２の先端はピッキング支援処理の開始に当たって装着された後、そのまま連続使用されるものと仮定する。
　ステップＳ２０：ＣＰＵ５１は、保存用メモリ５３に格納された部分領域毎の画像（複数のミクロ暗視野画像及び複数のミクロ蛍光画像）を読み出し、それらの画像に基づき部分領域毎のタイムラプス動画像を作成して保存用メモリ５３へ格納する。なお、個々の部分領域のタイムラプス動画像の作成は、次のとおり行われる。すなわち、ＣＰＵ５１は、着目している部分領域に関する複数のミクロ暗視野画像及び複数のミクロ蛍光画像のうち、観察日時が共通するもの同士を１枚の画像に合成し、それによって得られた複数の合成画像を観察日時の順番に連結する。これによって作成されたタイムラプス動画像が、その部分領域のタイムラプス動画像である。
　また、ＣＰＵ５１は、システムの各部を初期状態に設定するよう制御回路５２へ指示を与える。制御回路５２は、マニピュレータ２０を必要に応じて駆動し、シリンジ２２を観察状態に設定すると共に、観察ステージ１１を必要に応じて駆動し、培養容器３０の中心をマクロ撮像光学系１４の光軸（＝ミクロ撮像光学系１８の対物レンズ１８ｅの光軸）上に配置する。以下、この光軸を単に「光軸」と称す。
　また、制御回路５２は、蛍光ブロック１７ｃを必要に応じて駆動し、ミクロ撮像光学系１８の光路から離脱させると共に、レボルバ１８ｄを必要に応じて駆動し、１０倍観察用の対物レンズをミクロ撮像光学系１８の光路に挿入する。
　また、制御回路５２は、収容ステージ６０を必要に応じて駆動し、有効な収容部を１番目の収容部（収容部４０－１）に設定する。
　ステップＳ２１：ＣＰＵ５１は、ライブ画像の表示を開始するよう制御回路５２へ指示を与える。
　制御回路５２は、斜光照明用光源１５ａを点灯し、ミクロ撮像光学系１８の撮像素子１８ａと、マクロ撮像光学系１８の撮像素子１４ａとの双方を連続駆動し始める。これによって、ミクロ暗視野画像とマクロ暗視野画像とが並行かつ連続的に取得され始める。
　ＣＰＵ５１は、制御回路５２が順次に取得するミクロ暗視野画像を、図６に符号５８ｂで示すとおりディスプレイ５８上の所定領域へ順次に出力し始めると共に、制御回路５２が順次に取得するマクロ暗視野画像を、図６に符号５８ｃで示すとおりディスプレイ５８上の別の所定領域へ順次に出力し始める。
　したがって、ディスプレイ５８上には、ミクロ暗視野画像のライブ画像５８ｂ（以下、「ミクロライブ画像５８ｂ」と称す。）と、マクロ暗視野画像のライブ画像５８ｃ（以下、「マクロライブ画像５８ｃ」と称す。）とが同時に表示され始める。
　また、ＣＰＵ５１は、ディスプレイ５８におけるミクロライブ画像５８ｂの近傍に、倍率変更ボタン５８ｂ’を表示する。倍率変更ボタン５８ｂ’は、観察倍率の変更指示をユーザがコンピュータ５０へ入力するためのボタンである。
　なお、この時点ではシリンジ２２が観察状態に設定されているので、ミクロライブ画像５８ｂ及びマクロライブ画像５８ｃには、シリンジ２２の暗視野像２２’も写っている。ミクロライブ画像５８ｂの中心が光軸に対応し、マクロライブ画像５８ｃの中心が光軸に対応していると仮定すると、シリンジ２２の先端の暗視野像は、ミクロライブ画像５８ｂ及びマクロライブ画像５８ｃの各々の中心に位置する。この状態で観察ステージ１１がのみ駆動された場合（マニピュレータ２０は駆動されなかった場合）には、ミクロライブ画像５８ｂ及びマクロライブ画像５８ｃ上で培養容器３０の暗視野像が移動し、シリンジ２２の暗視野像２２’は移動しない。
　ステップＳ２２：ＣＰＵ２３は、保存用メモリ５３に部分領域毎に格納されたミクロ蛍光画像のうち、観察日時が最新であるものを読み出し、それらに対してサイズ縮小処理を施してから容器座標順に並べることにより、タイリング蛍光画像を作成する。このタイリング蛍光画像は、ガイド画像として使用される。
　ＣＰＵ５１は、このタイリング蛍光画像に対して輝度低減処理を施してから、マクロライブ画像５８ｃ上に重畳表示する（図６の符号５８ｄ）。但し、この重畳表示に当たりＣＰＵ５１は、タイリング蛍光画像５８ｄにおける容器中心がマクロライブ画像５８ｃにおける容器中心に一致するよう、タイリング蛍光画像５８ｄの重畳位置を調整する。
　したがって、マクロライブ画像５８ｃ上には、図７に拡大して示すとおり、培養容器３０内に点在する細胞コロニーの現在の様子（テクスチャーやサイズなど）と、それら細胞コロニーの最近の蛍光発光の程度とが同時に可視化される。なお、図７では、タイリング蛍光画像５８ｄのうち緑色に表現されるべき領域（蛍光発光していた領域）を、塗りつぶしで表した（他の各図も同様。）。ユーザは、このようなマクロライブ画像５８ｃ上で、ｉＰＳ細胞コロニーと思われる細胞コロニーを簡単に見出すことができる。
　また、本ステップのＣＰＵ５１は、タイリング蛍光画像５８ｄを構成する複数のミクロ蛍光画像（複数の部分領域）のうち、光軸位置に配置されている部分領域を、細胞の抽出元候補として強調表示する。以下、部分領域の強調は、図６、図７に示すとおり部分領域の輪郭線の太線化によって行われるものとする。
　なお、このタイリング蛍光画像５８ｄ上で強調されていない部分領域をユーザが選択すると、現時点における抽出元候補の指定を解除し、選択された部分領域を新たな抽出元候補として指定することができる。
　なお、ユーザによる部分領域の指定は、ユーザがマウス５７又はキーボード５６を操作し、ディスプレイ５８上のカーソル（不図示）を指定したい部分領域上へ移動させてから、マウス５７をクリック操作する（又はキーボード５６のエンターキーを押下する）ことによって行われる。
　その一方で、本ステップのＣＰＵ５１は、抽出元候補の履歴として、その抽出元候補のタイムラプス動画像を保存用メモリ５３から読み出して作業用メモリ５４の動画表示用領域に書き込む。そして、ＣＰＵ５１は、そのタイムラプス動画像の所定フレーム（例えば最新フレーム）の静止画像をサンプル画像として図６に符号５８ａで示すとおりディスプレイ５８上の所定領域へ表示し始める。
　また、ＣＰＵ５１は、ディスプレイ５８におけるサンプル画像５８ａ（タイムラプス動画像のサンプル画像）の近傍に、再生ボタン５８ａ’を表示する。再生ボタン５８ａ’は、タイムラプス動画像の再生指示をユーザがコンピュータ５０へ入力するためのボタンである。
　また、本ステップのＣＰＵ５１は、収容容器４０の容器画像を作成し、それを図６に符号５８ｅで示すとおりディスプレイ５８の余剰領域へ表示する。容器画像５８ｅは、収容容器４０の複数の収容部の配列を模式的に表す画像である。
　また、ＣＰＵ５１は、容器画像５８ｅを構成する複数の収容部のうち前述した収容位置４０ａに配置されているものを、現在の排出先候補として強調表示する。以下、収容部の強調は、図６に示すとおり収容部の輪郭線の太線化によって行われるものとする。
　なお、この容器画像５８ｅ上で強調されていない収容部をユーザが選択すると、現時点における排出先候補の指定を解除し、選択された収容部を新たな排出先候補として指定することができる。
　なお、ユーザによる収容部の指定は、ユーザがマウス５７又はキーボード５６を操作し、ディスプレイ５８上のカーソル（不図示）を指定したい収容部上へ移動させてから、マウス５７をクリック操作する（又はキーボード５６のエンターキーを押下する）ことによって行われる。
　ステップＳ２３：ＣＰＵ５１は、抽出元候補の新たな指定があった否かを判別し、新たな指定があった場合にはステップＳ２４へ移行し、新たな指定が無かった場合にはステップＳ２６へ移行する。
　ステップＳ２４： ＣＰＵ５１は、新たに指定された抽出元候補の容器座標と、現時点における観察ステージ１１の座標とに基づき、新たに指定された抽出元候補を光軸上に配置するための観察ステージ１１の目標座標を算出し、その目標座標と共に観察ステージ１１の駆動指示を制御回路５２へ与える。制御回路５２は、観察ステージ１１の実際の座標が目標座標に一致するよう観察ステージ１１を駆動し、新たに指定された抽出元候補の中心を光軸上に配置する。
　ステップＳ２５：ＣＰＵ５１は、ディスプレイ５８上のタイリング蛍光画像５８ｄと、動画表示用領域上のタイムラプス動画像と、ディスプレイ５８上のサンプル画像５８ａとを次のとおり更新する。
　ＣＰＵ５１は、タイリング蛍光画像５８ｄの現時点における強調表示を解除し、タイリング蛍光画像５８上で新たに指定された抽出元候補の強調表示を開始する。
　また、ＣＰＵ５１は、ステップＳ２４における観察ステージ１１の変位に応じて、マクロライブ画像５８ｃ上におけるタイリング蛍光画像５８ｄの重畳位置をずらすことにより、マクロライブ画像５８ｃの容器中心に、タイリング蛍光画像５８ｄの容器中心を一致させる。
　また、ＣＰＵ５１は、新たに指定された抽出元候補のタイムラプス動画像を保存用メモリ５３から読み出し、作業用メモリ５４の動画表示用領域へ上書きする。そして、ＣＰＵ５１は、そのタイムラプス動画像の所定フレーム（例えば最新フレーム）を、表示中のサンプル画像５８ａの代わりに表示し始める。
　なお、図８は、本ステップによる更新後の画面の例を示している。図８に示すマクロライブ画像５８ｃ上では、容器中心から外れた部分領域が抽出元候補として指定されており、ミクロライブ画像５８ｂに写っているのは、その抽出元候補のミクロ暗視野画像であり、サンプル画像５８ａに写っているのは、その抽出元候補の履歴（ここでは最新観察時の様子）である。
　ステップＳ２６：ＣＰＵ５１は、排出先候補の新たな指定があったか否かを判別し、新たな指定があった場合にはステップＳ２７へ移行し、新たな指定が無かった場合にはステップＳ２９へ移行する。
　ステップＳ２７：ＣＰＵ５１は、新たに指定された排出先候補の番号と、現時点における収容ステージ６０の座標とに基づき、新たに指定された排出先候補を前述した収容位置４０ａへ配置するための収容ステージ６０の目標座標を算出し、その目標座標と共に収容ステージ６０の駆動指示を制御回路５２へ与える。制御回路５２は、収容ステージ６０の実際の座標が目標座標に一致するよう収容ステージ１１を駆動し、新たに指定された排出先候補を収容位置４０ａへ配置する。
　ステップＳ２８：ＣＰＵ５１は、容器画像５８ｅの現時点における強調表示を解除し、新たに指定された排出先候補の強調表示を開始する。なお、図８の符号５８ｅは、本ステップによる更新後の容器画像５８ｅの例を示している。
　ステップＳ２９：ＣＰＵ５１は、観察倍率の変更指示が入力されたか否かを判別し、入力された場合にはステップＳ３０へ移行し、入力されなかった場合にはステップＳ３１へ移行する。
　ステップＳ３０：ＣＰＵ５１は、観察倍率を変更するよう制御回路５２へ指示する。制御回路５２は、レボルバ１８ｄを駆動することにより、ミクロ撮像光学系１８の観察倍率を切り替える。
　ステップＳ３１：ＣＰＵ５１は、タイムラプス動画像の再生指示が入力されたか否かを判別し、入力された場合にはステップＳ３２へ移行し、入力されなかった場合にはステップＳ３３へ移行する。
　ステップＳ３２：ＣＰＵ５１は、動画表示領域上に書き込まれているタイムラプス動画像を、サンプル画像５８ａの代わりに表示（再生表示）する。この再生表示により、ユーザは、抽出元候補内に存在している細胞コロニーの生育過程（蛍光発光量の経時変化など）を観察し、その細胞コロニーがｉＰＳ細胞コロニーであるか否かを的確に判断することができる。ユーザがその細胞コロニーをｉＰＳ細胞コロニーと判断した場合には、ミクロライブ画像５８ｂを見ながらステージコントローラ１２を操作し、図９に矢印で示すとおりｉＰＳ細胞コロニーをシリンジ２２の先端の側へとゆっくりと近接させればよい。
　ステップＳ３３：ＣＰＵ５１は、ステージコントローラ１２が操作されたか否かを、制御回路５２を介して判別し、操作された場合にはステップＳ３４へ移行し、操作されていない場合にはステップＳ３５へ移行する。
　ステップＳ３４：ＣＰＵ５１は、ステージコントローラ１２の生成する駆動信号を、制御回路５２を介して観察ステージ１１へ与える。これによって、観察ステージ１１は、ユーザの所望したとおりに駆動される。但し、ここでは、観察ステージ１１の移動範囲は、培養容器３０における抽出元候補からシリンジ２２の先端が外れない程度の微小範囲に制限されるものと仮定する。ユーザは、ミクロライブ画像５８ｂ上でｉＰＳ細胞コロニーがシリンジ２２の先端に十分に近づいたと判断すると、観察ステージ１１の駆動を止めてマニピュレータコントローラ２１の操作を開始する。
　ステップＳ３５：ＣＰＵ５１は、マニピュレータコントローラ２１が操作されたか否かを、制御回路５２を介して判別し、操作された場合にはステップＳ３６へ移行し、操作されていない場合にはステップＳ３９へ移行する。
　ステップＳ３６：ＣＰＵ５１は、マニピュレータコントローラ２１の生成する駆動信号を、制御回路５２を介してマニピュレータ２０へ与える。これによって、マニピュレータ２０は、ユーザの所望したとおりに駆動される。例えば、ユーザは、シリンジ２２を下方へシフトさせることでシリンジ２２の先端をｉＰＳ細胞コロニーへ接触させ、そのｉＰＳ細胞コロニーをシリンジ２２へ吸入し、そのシリンジ２２を退避状態に設定してから、シリンジ２２からｉＰＳ細胞コロニーを外部へ排出する。
　ステップＳ３７：ＣＰＵ５１は、マニピュレータコントローラ２１の生成する駆動信号に基づき、退避状態のシリンジ２２から液体が排出されたか否か（ピッキングが完了したか否か）を判別し、排出された場合（ピッキングが完了した場合）にはステップＳ３８へ移行し、排出されなかった場合（ピッキングが完了していなかった場合）にはステップＳ３９へ移行する。
　ステップＳ３８：ＣＰＵ５１は、図１０に示すとおり、タイリング蛍光画像５８ｄ上の抽出元候補を更に強調して表示（例えば反転表示）し、その抽出候補へ抽出済みマーク５８ｄ’を付与する。また、ＣＰＵ５１は、容器画像５８ｅ上の排出先候補を更に強調して表示（例えば反転表示）し、その排出先候補へ排出済みマーク５８ｅ’を付与する。
　ここで、抽出済みとなった抽出元候補と排出済みとなった排出先候補との対応関係を明確にするために、ＣＰＵ５１は、抽出済みマーク５８ｄ’と排出済みマーク５８ｅ’との間に関連性を持たせる。例えば、ＣＰＵ５１は、現時点までの本ステップの実行回数などから培養容器３０に対するピッキングの回数を認識し、その回数を表す数字を、抽出済みマーク５８ｄ’及び排出済みマーク５８ｅ’の双方に使用する。したがって、ユーザは、どの部分領域の細胞がどの収容部に収容されたのかをディスプレイ５８上で直感的に知ることができる。
　なお、タイリング蛍光画像５８ｄ上に付与された抽出済みマーク５８ｄ’は、その後、マクロライブ画像５８ｃにおけるタイリング蛍光画像５８ｄの重畳位置が変化した場合であっても、タイリング蛍光画像５８ｄ上の同じ部分領域に付与され続ける。したがってユーザは、抽出済みの部分領域を抽出元候補として再指定するというミスや、異なる細胞コロニーから抽出した細胞を同じ収容部へ収容するというミスなどを回避することができる。
　なお、抽出済みマーク５８ｄ’の表示後、タイリング蛍光画像５８ｄ上で抽出済みマーク５８ｄ’の付与されていない部分領域をユーザが選択すると、その部分領域を新たな抽出元候補として指定することができる。
　また、排出済みマーク５８ｅ’の表示後、容器画像５８ｅ上で排出済みマーク５８ｅ’の付与されていない収容部をユーザが選択すると、その収容部を新たな排出先候補として指定することができる。
　ステップＳ３９：ＣＰＵ５１は、ユーザから終了指示が入力されたか否かを判別し、入力されなかった場合にはステップＳ２３へ戻り、入力された場合にはフローを終了する。したがって、ユーザは、容器画像５８ｅの全ての収容部に排出済みマーク５８ｅ’が付与されるまで、細胞コロニーのピッキングを繰り返すことができる。
　以上、本システムは、図１に示したとおり、培養容器３０を互いに反対の側から観察するマクロ撮像光学系１４及びミクロ撮像光学系１８と、培養容器３０を斜め方向から照明する斜光照明光学系１５とを備えるので、培養容器３０の全体の大まかな様子（マクロ暗視野画像）と、培養容器３０の一部の詳細な様子（ミクロ暗視野画像）とを同時に観察することが可能である。
　しかも、本システムのコンピュータ５０は、マクロ暗視野画像のライブ画像（マクロライブ画像５８ｃ）とミクロ暗視野画像のライブ画像（ミクロライブ画像５８ｂ）との双方をディスプレイ５８へ同時に並べて表示するので、ユーザは、培養容器３０の中の複数の細胞コロニーの中からｉＰＳ細胞コロニーと思われる細胞コロニーを探索するときと、その細胞コロニーを詳細に観察するときとの間で、対物レンズを切り替える必要が無く、ディスプレイ５８上の視線を、マクロライブ画像５８ｃとミクロライブ画像５８ｂとの間で動かすだけで済む。
　また、本システムのコンピュータ５０は、培養容器３０の各部分領域のタイムラプス動画像を保存用メモリ５３へ予め記憶しておく。そして、コンピュータ５０は、ミクロ撮像光学系１８の光軸上に位置する部分領域（抽出元候補）のタイムラプス動画像を保存用メモリ５３から読み出し、ミクロライブ画像５８ｂと共にディスプレイ５８へ表示するので、ユーザは、細胞コロニーの詳細な様子と、その細胞コロニーの履歴とを同時に確認することができる。
　また、本システムのコンピュータ５０は、培養容器３０の最新のタイリング蛍光画像５８ｄをマクロライブ画像５８ｃ上へ重畳表示するので、ユーザは、培養容器３０内に点在する複数の細胞コロニーの現在の様子（テクスチャーやサイズなど）と、それら細胞コロニーの最近の蛍光発光の程度とを同時に観察することができる。
　また、本システムのコンピュータ５０は、ユーザによる抽出元候補の指定に応じて観察ステージ１１を駆動し、その抽出元候補を光軸上に自動的に配置するので（ステップＳ２４）、ステージコントローラ１２をユーザが操作する手間を最小限にすることができる。
　また、本システムのコンピュータ５０は、退避状態のシリンジ２２から液体が排出されたか否かを、マニピュレータコントローラ２１を介して判別し、排出された場合にはタイリング蛍光画像５８ｄ上の抽出先候補を強調表示（反転表示）するので、ユーザは、タイリング蛍光画像５８ｄ上でどの部分領域の細胞が抽出済みであるかを直感的に知ることができる。
　　［第２実施形態］
　以下、図１１～図１５を参照して本発明の実施形態として別の細胞観察システムの実施形態を説明する。なお、第2実施形態において、第1実施形態と同一符号の部材は構成、動作ともに第１実施形態と同じであるため説明を省略する。
　図１１、図１２は、本システムの構成図である。第２実施形態で特徴的な構成は、細胞観察システムが自動化されている構成であり、具体的にはマクロ撮像光学系１４で取得した広域画像（培養容器の全体の画像）と、ミクロ撮像光学系１８で取得した部分画像（注目細胞の画像）とに基づき、シリンジ２２をマニピュレータ２０が自動制御する構成となっている。
　倒立顕微鏡１０とマニピュレータ２０と収容ステージ６０とは同一基盤上に配置されている。培養容器３０における観察位置の変更は、観察ステージ１１を用いて培養容器３０をＸＹ面内で移動させることにより行われる。図１２に示すとおり、観察ステージ１１には、Ｘ方向位置検出エンコーダ４Ｘ及びＹ方向位置検出エンコーダ４Ｙで構成された観察位置検出手段４が設けられており、観察ステージ１１のＸＹ座標を検出することによって、培養容器３０における観察位置座標（細胞の座標系に相当する）（Ｘ、Ｙ）が検出される。また、培養容器３０における観察位置のＺ座標については、フォーカスノブ１３による対物レンズ１８ｅの上下動をＺ方向位置検出エンコーダ４Ｚで構成された観察位置検出手段４で検出することによって、培養容器３０における観察位置座標Ｚが検出される。これで、培養容器３０における観察位置の座標データ（Ｘ、Ｙ、Ｚ）が検出され、その座標データが制御装置であるＣＰＵ５１（パーソナルコンピュータＰＣ等、以後ＰＣと記す）のメモリに登録される。
　マニピュレータ２０は、シリンジ２２（操作針）の回転角度φを変化させるモータとシリンジ２２の首振り角度θを変化させるモータとシリンジ２２の光軸方向の移動量Ｚを変化させるモータとを有している。
　マニピュレータ２０の座標系は、マニュピレータ２０に配置されたＸ’方向、Ｙ’方向及びＺ’方向の位置検出エンコーダから構成されるマニュピレータ座標検出手段によって検出される。そして、マニュピレータ２０に固定されているシリンジ２２の先端の座標が、座標データ（Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’）としてＰＣ５１のメモリに登録される。
　また、図１に示すとおり、マニピュレータ２０の近傍には、マニピュレータ２０に固定されているシリンジ２２の先端を検出する針先端位置検出手段１００が配置されている。針先端位置検出手段１００は、低倍の撮像レンズと撮像素子（例えば、ＣＣＤカメラ等）とを用いたカメラ（以下、低倍のカメラ１００と記す）であり、低倍のカメラ１００のレンズとしては、開口数が０．２以上、視野数が１．５ｍｍ以上のレンズを用いることが、対物レンズ１８ｅの観察視野内のセット位置にシリンジ２２の先端を高精度に位置決めするために望ましい。また、針先端位置検出手段１００は、カメラに代えて、針先が所定の位置座標に来たか否かを検出する単なる光センサによって構成されても良い。
　対物レンズ１８ｅの視野内のセット位置の座標データ及びシリンジ２２の先端の座標データと、低倍のカメラ１００の視野内のセット位置とをＰＣ５１を介して相対的に関連付け、この結果、シリンジ２２の先端は、低倍のカメラ１００の視野内のセット位置にセットされた後、ＰＣ５１の制御手段を介してマニピュレータ２０で駆動され、対物レンズ１８ｅの視野内のセット位置に位置決めされる。このようにしてシンリンジ２２の先端の座標位置のキャリブレーションが行われる。なお、このキャリブレーション時には、培養容器３０は観察ステージ１１には載置されていない。また、対物レンズ１８ｅとして、様々な倍率の複数の対物レンズが使用される場合には、それぞれの対物レンズに関してキャリブレーションが行われる。
　同様に、マクロ撮像光学系１４の視野内のセット位置の座標データ及びシリンジ２２の先端の座標データと、低倍のカメラ１００の視野内のセット位置とをＰＣ５１を介して相対的に関連付け、この結果、シリンジ２２の先端は、低倍のカメラ１００の視野内のセット位置にセットされた後、ＰＣ５１の制御手段を介してマニピュレータ２０で駆動され、マクロ撮像光学系１４の視野内のセット位置に位置決めされる。
　以下で説明する初期設定作業後、マニピュレータ２０は、ＰＣ５１内に設けられた制御手段によって制御されて、シリンジ２２の先端が低倍のカメラ１００の視野内のセット位置から対物レンズ１８ｅの観察視野内のセット位置へ移動し、培養容器３０の所定位置に設定される。なお、セット位置は、視野中心近傍であり、実験動作に入るために適した観察位置とする。
　（初期設定作業）
　次に、シリンジ２２の先端の位置決め手順について図１３に示すＰＣ５１のフローチャートを参照しつつ説明する。
　まず、倒立顕微鏡１０の座標系（Ｘ、Ｙ、Ｚ）のホームポジションが初期設定される（Ｓ１）。
　図１３に示すように、倒立顕微鏡１０の対物レンズ１８ｅの焦点合わせが行われる。この焦点合わせでは、カバーガラスに載せられたポリスチレンなどの数μｍの直径を持つビーズが使用され、対物レンズ１８ｅの視野中心にそのビーズを合焦させる。具体的に、操作者は、対物レンズ１８ｅの視野中心位置にビーズを移動し（光学系内の写真撮影用の十字線などを利用）、観察ステージ１１とフォーカスノブ１３を操作してビーズに合焦させる。この状態で、観察ステージ１１のＸＹ移動及び対物レンズ１８ｅの上下動を検出する観察位置検出手段４（４Ｘ、４Ｙ、４Ｚ）は、検出された座標データ（Ｘ０、Ｙ０、Ｚ０）をＰＣ５１に伝達し、ＰＣ５１はこの座標データ（Ｘ０、Ｙ０、Ｚ０）をホームポジションデータとしてメモリへ登録する。なお、観察ステージ１１および対物レンズ１８ｅを動かすフォーカスノブ１３は電動でも手動でも良い。
　次に、対物レンズ１８ｅの視野内におけるシリンジ２２の先端位置と、低倍のカメラ１００の視野内におけるシリンジ２２の先端位置との相対位置関係をマニピュレータ２０の座標系（Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’）により決める初期設定作業について説明する。
　この初期設定作業により、低倍のカメラ１００の視野内のセット位置のシリンジ２２の先端位置（視野中心位置にセットされることが多い）と、高倍（例えば、４０倍）の対物レンズ１８ｅにより観察される観察視野内のセット位置のシリンジ２２の先端位置（視野中心にセットされることが多い）との相関関係が、ＰＣ５１のメモリに事前登録される。
　具体的には、操作者がマニピュレータ２０を操作して、シリンジ２２の先端を低倍のカメラ１００の視野内の所定のセット位置に移動させると、この時のマニピュレータ２０の座標データがＰＣ５１に登録される。またシリンジ２２の先端を対物レンズ１８ｅの視野内の所定のセット位置に移動させると、この時のマニピュレータ２０の座標データがＰＣ５１に登録される。これら２つの座標データにより、低倍のカメラ１００の視野内のセット位置と対物レンズ１８ｅの視野内のセット位置との相関関係がＰＣ５１により決められる。
　更に具体的に説明する。操作者は、シリンジ２２の先端を対物レンズ１８ｅの視野内のセット位置にマニピュレータ２０を使って移動し、シリンジ２２の先端に焦点が合うようにマニピュレータ２０をＸ’Ｙ’Ｚ’それぞれの方向に移動する（Ｓ２）。
　この時、マニュピレータ座標検出手段２２は、検出されたマニピュレータ２０の座標データ（Ｘ’０、Ｙ’０、Ｚ’０）をＰＣ５１に伝達し、ＰＣ５１はこれをメモリへ登録する（Ｓ３）。なお、登録の方法としては、手動のスイッチを用いた方法でも良いし、あるいは、対物レンズ１８ｅの視野内のセット位置にセットされたシリンジ２２の先端の座標を検出するための自動焦点装置があれば、その自動焦点装置が発する合焦信号に基づく方法でも良い。
　次に、操作者はシリンジ２２の先端を低倍のカメラ１００の視野内のセット位置にマニピュレータ２０を使って移動させ、シリンジ２２の先端に低倍のカメラ１００の焦点が合うようにマニピュレータ２０を駆動する（Ｓ４）。
　この時、マニュピレータ座標検出手段２２は、検出されたマニピュレータ２０の座標データ（Ｘ’１、Ｙ’１、Ｚ’１）をＰＣ５１に伝達し、ＰＣ５１はこれをメモリへ登録する（Ｓ５）。なお、登録の方法としては、手動のスイッチを用いた方法でも良いし、あるいは、低倍のカメラ１００に自動焦点装置があれば、その自動焦点装置が発する合焦信号に基づく方法でも良い。
　以上の２つのマニピュレータ２０の座標データを用いて、シリンジ２２の先端の移動量（φ、θ、Ｚ）がＰＣ５１で算出される。
　低倍のカメラ１００の視野内のセット位置から対物レンズ１８ｅの視野内のセット位置までの先端の移動量データは、マニピュレータ２０の各座標の差分データ、すなわち、
　　δＸ’＝Ｘ’１－Ｘ’０、
　　δＹ’＝Ｙ’１－Ｙ’０、
　　δＺ’＝Ｚ’１－Ｚ’０、
　としてそれぞれ演算され、移動量データ（δＸ’、δＹ’、δＺ’）としてＰＣ５１のメモリに登録される（Ｓ６）。以上で初期設定作業を終了する。
　以上のように初期設定作業すなわちキャリブレーションが終了する。
　これで、低倍のカメラ１００の視野内のセット位置にシリンジ２２の先端をセットすれば、ＰＣ５１の制御手段によってマニピュレータ２０が駆動され、シリンジ２２の先端が対物レンズ１８ｅの視野内のセット位置に自動的にセットされる。
　（細胞画像の自動認識によるマニピュレータ２０の自動制御の説明）
　図１４は、細胞生産システムの構成図である。図１４の細胞生産システムは、インキュベータ３００と細胞観察システム１０３（第1実施形態又は第２実施形態のシステム）とを、培養容器搬送ロボット２００にて連結されて構成されている。この細胞生産システムの存在する空間４００は、一定の培養環境下に（温度、湿度、二酸化炭素などの培養環境条件を含む）、管理されている。
　この細胞生産システムは、細胞を培養している培養容器１０３をマクロ撮像光学系１４によってマクロ観察することで広域画像を取得し、ミクロ撮像光学系１８によって広域画像から細胞の位置を特定し、細胞をミクロ観察し、広域画像内の部分画像を取得する。その後、部分画像に基づき細胞の状態を判定し、細胞の状態を判定した結果、良好な細胞を培養容器１０３からピッキングする。ピッキングは、シンリンジ２２の先端を、広域画像および部分画像に基づき制御することで行われる。そして、シンリンジ２２にてピッキングされた細胞は、新たな培養容器１０３に播種され、その後に新たな培養容器１０３がインキュベータ３００へと搬送される。播種された細胞は、インキュベータにより一定期間、培養される。このルーチンを繰り返すことで、良好な細胞を培養し、増やすことができる。
　シリンジ２２によるピッキング制御は、次のとおり行われる。すなわち、マクロ撮像光学系にて得られた広域画像に基づき、シリンジ２２の先端のＸＹ座標位置を細胞のＸＹ座標位置に一致させ、ミクロ撮像光学系にて得られた部分画像に基づき、先端を細胞のＸＹＺ座標位置に向けて駆動し、シリンジ２２にて細胞をピッキングする。更に具体的には、下記の通りである。
　図１５に示すように、図２のコンピュータ５０は、所定のプログラムを実行することで、マクロ撮像光学系１４とミクロ撮像光学系１８から取得される細胞画像に基づきマニピュレータ２０を自動制御して、注目細胞をピックアップすると共に、細胞を培養し増殖する制御を実行する。図１５に基づき、コンピュータ５０の処理を説明する。
　ステップ４１：マクロ撮像光学系１４により取得された広域の細胞画像は、図２の保存用メモリ５３に保存されている。ＣＰＵ５１は、この保存された細胞画像を読み出し、タイムラプス撮影された複数の細胞画像に基づき、ｉＰＳ細胞コロニーの特定処理を行う。
　ｉＰＳ細胞コロニーの特定処理は、広域画像に基づき注目細胞の座標位置（ＸＹ座標値）を検出する処理と注目細胞のでないノイズ成分を判定する処理とが含まれる。例えば第１実施形態で説明したように蛍光を読み取り、ｉＰＳ細胞コロニーを特定しても良いし、あるいは、非浸襲で検出する場合には位相差観察画像に基づいて形態的情報からｉＰＳ細胞コロニーを特定してもよい。
　候補となる注目細胞は、広域の細胞画像に基づいて特定される。すなわち、培養容器内の細胞にはノイズとなる気泡、死滅細胞、細胞コロニー形成前の初期のコロニー細胞などが存在する。これらのノイズ成分を除去するために、マクロ撮像光学系１４で取得された明視野観察画像（例えば、透過観察画像、位相差観察画像、斜光照明による観察画像など）に基づいて、培養容器に散らばった細胞個々の形態的情報を抽出する。抽出された細胞個々の形態的情報、例えば、細胞面積情報や細胞長辺の長さ情報、円形度情報などから、所定の条件を満たさない細胞をノイズとして候補から除外する。このようにすれば、状態の良いｉＰＳ細胞コロニーを、候補細胞に含めることができる。
　逆に、広域の細胞画像に基づいて上記処理を行い、ノイズとなる細胞の方を候補細胞として特定しても良い。但し、その場合には、以降の処理は、ノイズとなる細胞をピックアップして良い細胞のみを残す処理となる。よって、その場合には新たな培養容器を使わずに培養を継続することができる。
　ステップ４２：ステップ４１にて特定された候補細胞から注目細胞（ｉＰＳ細胞コロニー）を特定する処理が実行される。
　広域画像に基づき注目細胞の座標位置（ＸＹ座標値）が求められ、その座標位置に基づき観察ステージ１１が駆動され、ミクロ撮像光学系１８によって注目細胞の画像が取得される（複数の注目細胞が存在すればそれぞれの注目細胞の画像が取得される）。そして、取得された部分画像（注目細胞の画像）に基づき注目細胞の育成状態を判定する処理がなされる。例えば、第１実施形態で説明したように蛍光を読み取り、ｉＰＳ細胞コロニーを特定しても良いし、あるいは、非浸襲で検出する場合には位相差観察画像に基づいて形態的情報からｉＰＳ細胞コロニーを特定してもよい。
　なお、ｉＰＳ細胞コロニーの形態的情報を用いる場合には、ミクロ撮像光学系１８によって取得された高精細な位相差観察画像が使用される。その具体的な特定方法としては、例えば、ｉＰＳ細胞コロニー用の公知の輪郭線抽出処理（例えば二値化処理や微分処理）を位相差観察画像に対して施し、それによって抽出された輪郭線内の細胞画像の明るさ強度の分散値が所定の分散値より低いと認定された場合に（均一性のある細胞コロニーと認定）、その輪郭線内のｉＰＳ細胞コロニーを良好な細胞とみなす、といった方法がある。
　これにより、培養容器内の良好なｉＰＳ細胞コロニーが特定される。このようなステップ４１，４２の処理タイミングは、観察スケジュールにて予め設定されており、例えば、タイムラプス観察撮影が行われている中、所定時間の間隔でステップＳ４１、４２が実行されたり、あるいは所定の撮影回数経過後にステップＳ４１、４２が実行されたりする。この処理タイミングは、ｉＰＳ細胞コロニーの培養時間等に基づき経験的に設定される。
　ステップ４３：　注目細胞であるｉＰＳ細胞コロニーが検出されると、図６に示すようにマクロ画像５８ｄとミクロ画像５８ｂに基づきマニピュレータ２０が自動制御される。具体的には、まずマクロ画像５８ｄの画像情報に基づき、マクロ画像上に映りこんだシリンジの暗視野像２２’が検出され、マニピュレータ２０の座標系がマニュピレータ座標検出手段２２により算出される。そして、ステップ４１にて求めた注目細胞である座標位置（ＸＹ座標値）にシリンジの先端の座標位置をセットする制御が行われる。その後、注目細胞の座標位置（ＸＹ座標値）からＺ方向にシリンジが駆動される。シリンジの先端が注目細胞の位置から所定範囲内に入り込むと、ミクロ撮像光学系がその先端を捉えることができるので、ミクロ画像５８ｂの画像情報に基づきマニピュレータ２０の精密な制御がなされる。ミクロ画像５８ｂの画像情報は、マクロ画像５８ｄより高精細画像となっているため、注目細胞の座標位置(ＸＹＺ座標値)とシリンジの先端の座標位置（ＸＹＺ座標値）とをマイクロメートル単位にて制御できる。
　ステップ４４：　シリンジの先端が注目細胞に近づき、注目細胞がピックアップされる（シリンジ内に吸い込まれる）。
　ステップ４５：マニピュレータ２０が自動制御され、ピックアップされた注目細胞は、図１１の新たな培養容器１０３に播種され、移し替えられる。
　ステップ４６：　新たな培養容器は、図１５の搬送ロボット２００によって図１１の細胞観察システム５００から新たな培養容器１０３がインキュベータ３００に搬送される。搬送ロボット２００は、多関節の搬送アーム２１０によって新たな培養容器１０３を把持して、インキュベータ３００の開口部から環境維持された室内へと培養容器１０３を搬送する。
　ステップ４７：インキュベータ３００によって搬送された培養容器１０３は、ｉＰＳ細胞コロニーを培養する最適な環境に維持され、所定の期間、培養される。インキュベータ３００内にある撮像装置（ＣＣＤカメラなど）は、培養容器１０３をタイムラプス撮影し、ｉＰＳ細胞コロニーの画像を取得する。この画像に基づき、ｉＰＳ細胞コロニーの育成状況が逐次に分析される。
　インキュベータ３００によって培養されたｉＰＳ細胞コロニーは、所定期間経過後に、培養容器搬送ロボット２００によって、再度、細胞観察システム５００に送られる。そして、上述したように図１４のフローチャートが繰り返し実行されて細胞の育成状況が分析され、細胞培養が繰り返し実行される。これによって、良好なｉＰＳ細胞コロニーだけを増殖させることができる。
　［実施形態の補足］
　なお、上述した実施形態のシステムでは、抽出元候補として同時に指定可能な部分領域の個数を１としたが、複数としてもよい。その場合、コンピュータ５０は、指定中の複数の抽出元候補の中の１つをユーザに改めて指定させ、改めて指定された抽出元候補が光軸上に配置されるように観察ステージ１１を駆動すればよい。
　また、上述した実施形態のシステムでは、観察ステージ１１の粗調整を自動で行い、観察ステージ１１の微調整を手動で（ステージコントローラ１２により）行ったが、観察ステージ１１の全ての調整を手動で（ステージコントローラ１２により）行ってもよい。
　その場合、ユーザがタイリング蛍光画像５８ｄ上で抽出元候補を指定すると、マクロライブ画像５８ｃの内容は変化しないまま、タイリング蛍光画像５８ｄの重畳位置のみがシフトするので、ユーザは、マクロライブ画像５８ｃ及びタイリング蛍光画像５８ｄを目視し、タイリング蛍光画像５８ｄの細胞コロニー群の蛍光像にマクロライブ画像５８ｃの細胞コロニー群の暗視野像が重ね合わさるよう、観察ステージ１１を手動で駆動すればよい。
　また、上述した実施形態のシステムでは、マクロ撮像光学系１４とミクロ撮像光学系１８とに１つの斜光照明光学系１５を共用したが、マクロ撮像光学系１４に専用の斜光照明光学系と、ミクロ撮像光学系１８に専用の斜光照明光学系とを使用してもよい。なお、その場合は、マクロ撮像光学系１４の斜光照明光学系とミクロ撮像光学系１８の斜光照明光学系との少なくとも一方を、落射暗視野照明光学系としてもよい。
　また、本実施形態のシステムでは、マクロ撮像光学系１４とミクロ撮像光学系１８とが観察ステージ１１を挟み対向配置されているが、それに限られず、例えば、両撮像光学系とも観察ステージ１１の片側に配置されていても良い。具体的には図１に示すマクロ撮像光学系１４の位置に、ミクロ撮像光学系を配置し、また、遮光照明光学系１５の位置に、マクロ撮像光学系を配置し、また、ミクロ撮像光学系１８の位置に、透過照明光学系を配置すればよい。
　また、本実施形態のシステムでは、培養容器の広域画像を取得するマクロ撮像光学系は低解像度のＣＣＤセンサから構成され、培養容器の広域画像の中の部分画像を取得するミクロ撮像光学系は、高解像度のＣＣＤセンサから構成されている。これにより、ミクロ撮像光学系では撮像画像をトリミングすることで十分な部分画像を取得できる。
　また、本実施形態のシステムでは、培養容器内の細胞をピッキングすることについて説明したが、細胞に所定の薬剤を滴下したりする場合にも、有用である。
　また、上述した実施形態のシステムでは、シリンジ２２のポンプ部分が電動化されていたので、コンピュータ５０は、ピッキングの完了通知の有無を、マニピュレータコントローラ２１の操作内容によって判別したが、シリンジ２２のポンプ部分が電動化されていない場合には、ピッキングの完了通知をユーザが自主的に入力する必要がある。
　なお、ピッキングの完了通知の入力は、前述したキーボード５６、マウス５７、或いは、別途用意された入力器を介して行われる。或いは、マニピュレータコントローラ２１に設けられた特定の操作部を介して行われる。
　また、上述した実施形態のミクロ撮像光学系１８は、１種類のミクロ蛍光画像しか検出しなかったが、波長の異なる複数種類のミクロ蛍光画像を同時に検出するよう変形されてもよい。その場合、コンピュータ５０は、ミクロ撮像光学系１８は取得した複数種類のミクロ蛍光画像を互いに異なる色で合成することでカラーのミクロ蛍光画像を作成し、それを上述したとおり処理してからディスプレイ５８へ表示することになる。
　また、上述した実施形態では、細胞のピッキングを行う際のシステムの動作を説明したが、このシステムは、ピッキング以外の操作（インジェクション、パッチクランプなど）にも適用が可能である。
　また、上述した実施形態のシステムでは、ＣＰＵ５１の動作の少なくとも一部を制御回路５２に実行させてもよい。また、上述した実施形態のシステムでは、制御回路５２の動作の少なくとも一部をＣＰＵ５１に実行させてもよい。
　また、上述した実施形態のシステムの倒立顕微鏡１０、マニピュレータ２０、収容ステージ６０は、培養装置の内部に配置されてもよい。なお、培養装置とは、培養容器の周辺環境（二酸化炭素濃度、温度、湿度など）を予め設定されたとおりに保つ装置のことである。
　３０…培養容器、１０…倒立顕微鏡、２０…マニピュレータ、４０…収容容器、６０…収容ステージ、２１…マニピュレータコントローラ、１１…観察ステージ、１８…ミクロ撮像光学系１８、１４…マクロ撮像光学系、１５…斜光照明光学系、２２シリンジ…、１２…ステージコントローラ
 

Claims (22)

  1. 　細胞の培養容器を支持する観察ステージと、
    　前記培養容器内の細胞を操作する操作針と前記培養容器内の細胞との位置関係を観察するために、前記観察ステージにおける前記培養容器の広域画像を取得するマクロ撮像光学系と、
    　前記培養容器内の細胞を操作する操作針と前記培養容器内の細胞との位置関係を観察するために、前記広域画像内の部分画像を取得するミクロ撮像光学系と、
    　前記培養容器内の細胞を操作する前記操作針を制御する制御手段とを備え、
    　前記ミクロ撮像光学系が前記観察ステージを挟み前記マクロ撮像光学系に対向する側に配置されたこと
    　を特徴とする細胞観察装置。
  2. 　請求項１に記載の細胞観察装置において、
    　前記制御手段は、前記広域画像および前記部分画像に基づき、前記培養容器内の細胞をピッキングできる位置に前記操作針を制御すること
    　を特徴とする細胞観察装置。
  3. 　請求項１に記載の細胞観察装置において、
    　前記制御手段は、前記広域画像の画像解析に基き前記培養容器内の細胞のうち注目すべき細胞である注目細胞を決定し、前記注目細胞の位置座標を算出して前記広域画像および前記部分画像に基き前記操作針を制御する
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  4. 　請求項2又は請求項３に記載の細胞観察装置において、
    　前記制御手段は、前記操作針の制御に際して、前記広域画像に基づき操作対象の前記細胞の位置座標に移動し、前記部分画像に基き前記細胞の位置座標に前記操作針を合せ込む
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  5. 　請求項１に記載の細胞観察装置において、
    　前記ミクロ撮像光学系と前記マクロ撮像光学系とは同軸に構成されている
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  6. 　請求項１に記載の細胞観察装置において、
    　前記培養容器の底部側に前記ミクロ撮像光学系が配置されている
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  7. 　請求項２に記載の細胞観察装置において、
    　前記制御手段は、前記部分画像に基づき、目的の細胞を前記培養容器からピッキングするように前記操作針を制御し、前記ピッキングされた前記目的の細胞を別の培養容器に播種する
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  8. 　請求項７に記載の細胞観察装置を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、
    　前記ピッキングされた前記目的の細胞を前記別の培養容器に播種した後に、前記別の培養容器をインキュベータに搬送するステップと、
    　前記インキュベータにより一定期間、前記播種された前記目的の細胞を培養し、その後に前記別の培養容器を前記細胞観察装置に戻すステップと、
    　を繰り返すことにより前記目的の細胞の数を増やす
    　ことを特徴とする細胞培養方法。
  9. 　請求項８に記載の細胞培養方法において、
    　前記目的とする細胞はｉＰＳ細胞である
    　ことを特徴とする細胞培養方法。
  10. 　細胞の培養容器を支持する観察ステージと、
    　前記観察ステージにおける前記培養容器の広域画像を取得するマクロ撮像光学系と、
    　前記培養容器の部分画像を取得するミクロ撮像光学系と、
    　前記培養容器内の細胞を操作する操作針を制御する際には、前記マクロ撮像光学系によるマクロ画像の取得と、前記ミクロ撮像光学系によるミクロ画像の取得との双方を同時に行うように制御する制御手段と
    　を備えたことを特徴とする細胞観察装置。
  11. 　請求項１０に記載の細胞観察装置において、
    　前記マクロ撮像光学系及び前記ミクロ撮像光学系の光軸に対して非平行な照明光束で前記観察ステージ上の前記培養容器を照明する斜光照明光学系と、
    　を備えたことを特徴とする細胞観察装置。
  12. 　請求項１１に記載の細胞観察装置において、
    　前記制御手段は、
    　前記斜光照明光学系がオンされている期間に前記マクロ撮像光学系が取得するマクロ暗視野画像と、それと同じ期間に前記ミクロ撮像光学系が取得するミクロ暗視野画像との双方をリアルタイム表示する
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  13. 　請求項１２に記載の細胞観察装置において、
    　前記培養容器の細胞に励起光を照射する励起光照明光学系と、
    　前記励起光が照射された前記培養容器の各部から前記ミクロ撮像光学系を介してミクロ蛍光画像を取得し、それら各部の履歴を予め記憶する記憶手段を更に備え、
    　前記制御手段は、
    　前記培養容器のうち前記ミクロ撮像光学系の光軸上に位置する部分の履歴を前記記憶手段から読み出し、リアルタイム表示中のミクロ暗視野画像と共に表示する表示部を含む
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  14. 　請求項１３に記載の細胞観察装置において、
    　前記制御手段は、
    　前記履歴を動画像として表示する表示部を含む
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  15. 　請求項１３又は請求項１４に記載の細胞観察装置において、
    　前記制御手段は、
    　前記培養容器の各部の最新のミクロ蛍光画像を前記記憶手段から読み出し、それらを繋ぎ合わせてなるガイド画像を、リアルタイム表示中のマクロ暗視野画像上へ重畳表示する表示部を含む
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  16. 　請求項１５に記載の細胞観察装置において、
    　前記制御手段は、
    　前記培養容器における操作対象候補が前記ガイド画像上で指定された場合には、その操作対象候補が前記ミクロ撮像光学系の光軸上に位置するよう前記観察ステージを自動調整する
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  17. 　請求項１５に記載の細胞観察装置において、
    　前記制御手段は、
    　前記培養容器における操作対象候補が前記ガイド画像上で指定され、かつその操作対象候補に対する操作の完了通知が入力された場合には、前記ガイド画像上の前記操作対象候補を強調表示する
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  18. 　請求項１４に記載の細胞観察装置において、
    　前記表示部は、前記広域画像および前記部分画像および前記動画像を同時に表示する
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  19. 　請求項１４に記載の細胞観察装置において、
    　前記表示部に表示された前記広域画像から所望する細胞が指定されると、前記指定された細胞の前記動画像が表示される
    　ことを特徴とする細胞観察装置。
  20. 　細胞を培養する細胞培養方法において、
    　培養中の前記細胞を収容している培養容器をマクロ観察し、広域画像を取得するマクロ撮像ステップと、
    　前記広域画像から前記細胞の位置を特定し、前記細胞をミクロ観察し、前記広域画像内の部分画像を取得するミクロ撮像ステップと、
    　前記部分画像に基き前記細胞の状態を判定する判定ステップと、
    　前記判定ステップで前記細胞の状態を判定した結果、良好な細胞を前記培養容器からピッキングするために、前記広域画像および前記部分画像に基づき操作針を制御するピッキングステップと、
    　前記操作針にてピッキングされた前記良好な細胞を前記別の培養容器に播種した後に、前記別の培養容器をインキュベータに搬送するステップと、
    　前記インキュベータにより一定期間、前記播種された前記良好な細胞を培養する培養ステップとを有し、
    　上記ステップを繰り返すことにより前記良好な細胞の数を増やす
    　ことを特徴とする細胞培養方法。
  21. 　請求項２０に記載の細胞培養方法において、
    　前記ピッキングステップでは、前記マクロ撮像ステップにて得られた前記広域画像に基づき、前記操作針のＸＹ座標位置を前記細胞のＸＹ座標位置に一致させ、前記ミクロ撮像ステップにて得られた前記部分画像に基づき、前記操作針を前記細胞のＸＹＺ座標位置に向けて駆動し、前記操作針にて前記細胞をピッキングする
    　ことを特徴とする細胞培養方法。
  22. 　請求項２０に記載の細胞培養方法において、
    　前記細胞はｉＰＳ細胞である
    　ことを特徴とする細胞培養方法。
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