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WO2011093039A1 - 生乳検査方法及び生乳検査装置 - Google Patents

生乳検査方法及び生乳検査装置 Download PDF

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Publication number
WO2011093039A1
WO2011093039A1 PCT/JP2011/000292 JP2011000292W WO2011093039A1 WO 2011093039 A1 WO2011093039 A1 WO 2011093039A1 JP 2011000292 W JP2011000292 W JP 2011000292W WO 2011093039 A1 WO2011093039 A1 WO 2011093039A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
raw milk
current value
somatic cells
electrodes
electrode
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/000292
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
綾野賢
二階堂祐子
岡桂子
Original Assignee
株式会社クラレ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社クラレ filed Critical 株式会社クラレ
Publication of WO2011093039A1 publication Critical patent/WO2011093039A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/04—Dairy products
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/49—Systems involving the determination of the current at a single specific value, or small range of values, of applied voltage for producing selective measurement of one or more particular ionic species

Definitions

  • the present invention relates to a method for inspecting raw milk of mammals, particularly dairy cows, and a raw milk inspection apparatus for performing the inspection.
  • mastitis of livestock is a major issue. Milk from livestock infected with mastitis has a reduced commercial value due to a decrease in lactose percentage, an increase in salinity, and other changes in milk components. Infection with mastitis also damages livestock animals and breast tissue, leading to reduced lactation capacity and reduced productivity. Therefore, it is very important to detect mastitis and start treatment while the infection level is low.
  • the number of somatic cells in milk is generally used as an indicator of infection.
  • the number of somatic cells in milk is the total number of blood-derived cells including white blood cells and mammary epithelial cells.
  • the rapid increase in the number of somatic cells indicates that leukocytes have moved from blood to milk due to the invasion of bacteria into the breast and proliferated, and that white blood cells have increased in milk. It is useful as an indicator of milk in livestock infected with mastitis.
  • somatic cells can be measured with high reliability by microscopic observation or a cell sorter, the devices used for these measurements are usually expensive, large-sized, and complicated to operate.
  • the number of somatic cells is measured at a specific laboratory. Therefore, when the results of somatic cell counts are revealed, the milk of livestock infected with mastitis is mixed with normal milk, and the milk of livestock infected with mastitis deteriorates the quality of large quantities of milk in the same tank. As a result, the milk of the tank unit is discarded.
  • the milk of livestock with low infectivity is diluted with normal milk, early detection of mastitis is difficult. Therefore, a simple method and apparatus that can measure the number of somatic cells during milking is desired.
  • Patent Document 1 discloses a mastitis comprising a milk heating means, a reactive oxygen species sensor, and a mastitis diagnosis means as an apparatus capable of accurately diagnosing mastitis by a simple method.
  • a diagnostic device is disclosed.
  • the apparatus focuses on the amount of active oxygen generated from neutrophils that increase when infected with mastitis, and determines whether or not mastitis is infected based on the current value detected by the active oxygen sensor.
  • the apparatus described in Patent Document 1 has a problem in sensitivity because the current value based on the amount of active oxygen is small.
  • an object of the present invention is to easily and highly sensitively test whether the milk of a mammal infected with mastitis is raw.
  • the present invention that has solved the above problems includes a step of applying a voltage to raw milk of a mammal (A), and a step of measuring a current generated when an easily oxidizable substance is oxidized by the applied voltage (B). Is a method for inspecting raw milk.
  • the present invention also includes at least one set of electrodes including a working electrode including a hydrophilic compound exposed on the surface, and a counter electrode; A circuit for applying a constant voltage between the electrodes; And a means for measuring a current generated when an easily oxidizable substance in raw milk is oxidized by an applied voltage.
  • the present invention it is possible to easily and highly sensitively check whether the milk is a mammal infected with mastitis.
  • FIG. 3 is a sectional view taken along line III-III in FIG. 2. It is a top view which shows the sensor which abbreviate
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the current value obtained in Example 1 and the ascorbic acid concentration. It is a graph which shows the relationship between the electric current value obtained in Example 1, and the number of somatic cells.
  • Healthy milk cow's raw milk contains about 1.5 to 2.0 mg / 100 mL of ascorbic acid (reducible vitamin C) biosynthesized in the body. It has been reported that the amount of ascorbic acid in raw milk decreases as the suspicion of latent mastitis in dairy cows increases (see Non-Patent Document 1). The present inventors pay attention to this phenomenon and electrochemically oxidize an easily oxidizable substance typified by ascorbic acid in raw milk. From the oxidation current value, the raw milk of a mammal infected with mastitis It was found that it can be determined whether or not. Further, the present inventors have found that the oxidation current value is correlated with the number of somatic cells, and the number of somatic cells can be estimated from the oxidation current value.
  • the method for inspecting raw milk of the present invention includes the step (A) and the step (B) described above (method A).
  • Step (A) In step (A), a voltage is applied to the milk of the mammal.
  • Step (A) can be performed, for example, by immersing an electrode including a working electrode and a counter electrode in raw milk and applying a voltage between the electrodes.
  • the working electrode preferably contains a hydrophilic compound exposed on the surface.
  • the hydrophilic compound functions as an electrode catalyst, and the sensitivity of current measurement can be improved.
  • the kind of the hydrophilic compound is not particularly limited as long as it has an electrode catalytic action, and may be appropriately determined according to the kind of the easily oxidizable substance.
  • the hydrophilic compound preferably has a cationic group and more preferably has an amino group from the viewpoint of electrocatalysis. Specific examples include cysteine, aminoethanethiol, aminobutanethiol, aminononanethiol, and the like. Since a material such as gold is usually used for the working electrode, the hydrophilic compound preferably has a sulfur atom-containing group (particularly a thiol group) from the viewpoint of affinity with the working electrode. In particular, cysteine is preferred.
  • the applied voltage may be appropriately selected according to the kind of the easily oxidizable substance so that the easily oxidizable substance is oxidized, and is preferably in the range of +0.1 to + 0.6V. With an applied voltage in this range, ascorbic acid can be oxidized among easily oxidizable substances.
  • mammals those raised as livestock are preferred, and examples include dairy cows and goats.
  • Step (A) By applying voltage in step (A), the easily oxidizable substance is oxidized, and an oxidation current flows between the working electrode and the counter electrode.
  • Step (B) can be performed by measuring the value of the oxidation current flowing between the working electrode and the counter electrode.
  • the easily oxidizable substance is a substance that exists in raw milk and is easily oxidized electrochemically, and its concentration is correlated with mastitis.
  • ascorbic acid is preferable.
  • the current value measured in step (B) has a correlation with the concentration of the easily oxidizable substance. Therefore, since there is a correlation between the mastitis and the concentration of the easily oxidizable substance, it can be determined from the magnitude of the current value whether the milk is milk of a mammal infected with mastitis. For example, when the easily oxidizable substance is ascorbic acid, when the current value is small, it can be determined that the milk is raw milk of a mammal infected with mastitis.
  • the current value of raw milk in a healthy dairy cow is about 50 to 70 nA per square millimeter of electrode area, but the current of raw milk in a dairy cow infected with mastitis. The value is about 20 to 50 nA per square millimeter of electrode area.
  • the current value can be measured with a known ammeter such as a galvanometer, for example.
  • the raw milk inspection method of the present invention can be carried out by a simple operation.
  • the oxidation current value of an easily oxidizable substance is measured. Since this oxidation current value is larger than the current value based on active oxygen, the raw milk can be inspected with high sensitivity. .
  • the method of the present invention also has an advantage that the inspection can be performed even after the time after milking has elapsed (usually, the method of the present invention can be performed for about 24 hours from immediately after milking).
  • the raw milk inspection method of the present invention further includes the following step (C) (Method B).
  • step (C) the number of somatic cells in the raw milk is calculated from the measured current value. Since the concentration of the easily oxidizable substance is related to mastitis, the oxidation current value indicating the concentration of the easily oxidizable substance is also related to the number of somatic cells. For example, when the easily oxidizable substance is ascorbic acid, there is a negative correlation between the oxidation current value and the number of somatic cells. Therefore, a calibration curve can be created for raw milk by obtaining a somatic cell value by a conventional method and a current value by the method of the present invention. Step (C) can be performed by converting the number of somatic cells from the measured current value using this calibration curve.
  • the number of somatic cells in raw milk of healthy dairy cows is 20,000 to 100,000 per mL
  • the number of somatic cells in raw milk of dairy cows infected with mastitis is , 300,000 pieces / mL or more. Therefore, when the number of somatic cells converted from the measured current value is 300,000 cells / mL or more, it can be determined that the milk is milk of a dairy cow infected with mastitis.
  • a dairy cow has four breasts, but mastitis is infected with each breast independently, and all four breasts are infected with mastitis.
  • the amount of oxidizable substances in raw milk is slightly different for each cow, and there are individual differences. Therefore, if raw milk obtained from another breast of the same individual is used as a comparison target, the influence of individual differences in the amount of oxidizable substances can be eliminated, and a more accurate examination can be performed.
  • the steps (A) and (B) are further performed on raw milk obtained from another breast of the mammal (the same individual), And (D) comparing the current values obtained from the raw milk of each breast (Method C).
  • the examined raw milk contains raw milk of the breast infected with mastitis.
  • the easily oxidizable substance is ascorbic acid
  • it can be determined that raw milk having a small current value is raw milk of a breast infected with mastitis.
  • the steps (A) and (B) are further performed on raw milk obtained from another breast of the mammal (the same individual),
  • the method includes a step (E) of obtaining a difference between current values obtained from raw milk of each breast (Method D).
  • step (E) When there is a large difference in current values obtained in step (E), it can be determined that raw milk infected with mastitis is included in the examined raw milk.
  • the magnitude of the difference in the current value obtained from the raw milk of each breast is related to the number of somatic cells.
  • a preferred embodiment of the method (D) further includes a step (F) of calculating the number of somatic cells in raw milk obtained from each breast from the difference in current values obtained in the step (E) ( Method E).
  • a calibration curve can be created for raw milk by determining the difference between the somatic cell value by the conventional method and the current value by the method of the present invention.
  • Step (F) can be performed by converting the number of somatic cells from the difference in the measured current values using this calibration curve.
  • Method E may further include comparing the calculated number of somatic cells in the raw milk of each breast.
  • the steps (A) to (C) are further performed on raw milk obtained from another breast of the mammal (the same individual), And (G) comparing the number of somatic cells in raw milk obtained from each breast (Method F).
  • step (G) if the number of somatic cells is compared, and there is a large difference in the number of somatic cells, it can be determined that the examined raw milk contains raw milk from a breast infected with mastitis. At this time, it can be determined that raw milk having a large number of somatic cells is raw milk of a breast infected with mastitis.
  • the present invention is an examination method of raw milk, but can also be applied as a mastitis diagnosis method.
  • the raw milk test apparatus of the present invention includes a working electrode including a hydrophilic compound exposed on the surface, at least one set of electrodes including a counter electrode, a circuit for applying a constant voltage between the electrodes, and easy oxidation in raw milk. Means for measuring a current generated when the sex substance is oxidized by the applied voltage (apparatus A).
  • inspection method of this invention mentioned above can be performed with the raw milk test
  • a set of electrodes includes a working electrode and a counter electrode, but may further include a reference electrode.
  • the electrodes may be in two or more sets to allow simultaneous measurement of two or more raw milks, particularly two or more raw milks obtained from different breasts of the same mammal (same individual).
  • a conductive material such as gold, silver, silver chloride, platinum, copper, aluminum, and stainless steel can be used for the electrode.
  • the hydrophilic compound contained in the working electrode is as described above. From the viewpoint of sensitivity, the working electrode preferably contains the hydrophilic compound as a layer having a thickness of 20 mm or less. In order to form a hydrophilic compound layer on the surface of the working electrode, a coating solution containing the hydrophilic compound may be applied on the working electrode by a known method such as a dipping method, an ink jet method, or an injection method, and dried.
  • the circuit electrically connects the working electrode and the counter electrode. If an internal power supply or an external power supply is connected directly or indirectly to this circuit, a voltage can be applied.
  • the circuit is preferably configured so that a voltage of about +0.1 to +0.6 V can be applied.
  • the means for measuring the current generated when the oxidizable substance in raw milk is oxidized by the applied voltage is preferably a means capable of measuring a current of about 0.01 to 10 ⁇ A, such as a galvanometer. Any known ammeter can be used.
  • the raw milk inspection apparatus of the present invention preferably has means for notifying the measurement result.
  • the means include a display unit such as a monitor and a lamp, and a speaker.
  • the raw milk test apparatus of the present invention calculates the number of somatic cells in the raw milk from the current value measured at the applied voltage at which the oxidizable substance is oxidized. It is preferable to further include an arithmetic unit for calculation (apparatus B). With the apparatus B, the above method B can be carried out.
  • the calculation unit includes, for example, a CPU and a storage unit such as a memory and a hard disk. A calibration curve indicating the correlation between the number of somatic cells and the current value is input to the storage unit, and the number of somatic cells is calculated by the CPU.
  • the raw milk inspection apparatus of the present invention may have a calculation unit for determining whether the milk is a mammal infected with mastitis from the current value or the number of somatic cells.
  • the calculation unit includes a CPU, a storage unit, and the like, and a correlation between the current value or the number of somatic cells and mastitis infection is input to the storage unit.
  • This calculation unit may be a calculation unit that calculates the number of somatic cells.
  • a preferred embodiment of the raw milk test apparatus includes a storage unit for storing a measured current value in addition to the electrode, the circuit, and the current measuring unit, and a current value obtained by newly measuring. And a data processing unit for comparing the stored current values (device C). According to the apparatus of this embodiment, the method C can be performed by sequentially measuring raw milk obtained from another breast of the same individual.
  • the storage unit for storing the measured current value in addition to the electrode, the circuit, and the current measuring unit, and the current value obtained by newly measuring.
  • apparatus D the method D can be performed by sequentially measuring raw milk obtained from another breast of the same individual.
  • the calculation unit can be constituted by a CPU or the like, for example.
  • the device D may further include a calculation unit that calculates the number of somatic cells in raw milk from the difference between the newly obtained current value obtained by measurement and the stored current value (device E).
  • the method E can be performed by sequentially measuring raw milk obtained from another breast of the same individual.
  • the calculation unit includes, for example, a CPU and a storage unit such as a memory and a hard disk. A calibration curve indicating a correlation between the number of somatic cells and the difference between the current values is input to the storage unit, and the number of somatic cells is calculated by the CPU.
  • a CPU of a calculation unit that obtains the difference between the current values may be used.
  • the apparatus E may further include a data processing unit that compares the calculated number of somatic cells in the raw milk of each breast.
  • Another preferred embodiment of the raw milk test apparatus of the present invention is a memory for storing the calculated number of somatic cells, in addition to the electrode, the circuit, the current measuring means, and the calculation unit for calculating the number of somatic cells. And a data processing unit for comparing the number of somatic cells newly obtained by measurement and the stored number of somatic cells (apparatus F).
  • the method F can be performed by sequentially measuring raw milk obtained from another breast of the same individual.
  • Another preferable embodiment of the raw milk inspection apparatus of the present invention is an apparatus including the electrode, the circuit, and the current measuring means, and the apparatus includes two or more sets of the electrodes, and each set It further includes a data processing unit that compares the current values measured with respect to the electrodes (device G).
  • the method C can be performed in one measurement by using each set of electrodes for each raw milk obtained from another breast of the same individual.
  • Another preferable embodiment of the raw milk inspection apparatus of the present invention is an apparatus including the electrode, the circuit, and the current measuring means, and the apparatus includes two or more sets of the electrodes, and each set It further includes a calculation unit for obtaining a difference between the current values measured with respect to the electrodes (apparatus H).
  • the above method D can be carried out in one measurement by using each set of electrodes for each raw milk obtained from another breast of the same individual.
  • the calculation unit can be constituted by a CPU or the like, for example.
  • the apparatus H may further include a calculation unit that calculates the number of somatic cells in raw milk from the difference between the obtained current values (apparatus I).
  • the method E can be carried out in one measurement by using each set of electrodes for each raw milk obtained from another breast of the same individual.
  • the calculation unit includes, for example, a CPU and a storage unit such as a memory and a hard disk. A calibration curve indicating a correlation between the number of somatic cells and the difference between the current values is input to the storage unit, and the number of somatic cells is calculated by the CPU.
  • a CPU of a calculation unit that obtains the difference between the current values may be used.
  • Another preferable embodiment of the raw milk test apparatus of the present invention is an apparatus including the electrode, the circuit, the current measuring means, and a calculation unit for calculating the number of somatic cells, wherein the apparatus includes the A data processing unit that includes two or more sets of electrodes and compares the number of somatic cells calculated for each set of electrodes is further included (apparatus J).
  • the method F can be performed in one measurement by using each set of electrodes for each raw milk obtained from another breast of the same individual.
  • the storage unit that stores the measured current value and the storage unit that stores the calculated number of somatic cells can be configured by a memory, a hard disk, or the like.
  • the storage unit that stores the calibration curve of the calculation unit may be used as these storage units, or separately
  • a storage unit may be provided.
  • the data processing unit can be configured by a CPU or the like, and when the raw milk inspection apparatus has a calculation unit that calculates the number of somatic cells in raw milk, the CPU or the like of the calculation unit may be used as the data processing unit.
  • a separate data processing unit may be provided. Therefore, the calculation unit that calculates the number of somatic cells may function as the storage unit and the data processing unit, or the storage unit and the data processing unit may be provided separately.
  • the raw milk inspection apparatus of the present invention can be reduced in size and cost, and can easily and rapidly inspect raw milk with high sensitivity.
  • the present invention is a raw milk inspection apparatus, but can also be applied as a mastitis diagnosis apparatus.
  • Fig. 1 shows a specific example of a raw milk inspection device.
  • the raw milk inspection apparatus 1 ⁇ / b> A includes a sensor 2, a connector 5, and a main body 6, and the sensor 2 is detachable from the main body 6 at the connector 5.
  • the sensor 2 includes electrodes, and by making the sensor 2 detachable, the measurement can be easily repeated simply by replacing the sensor 2.
  • This configuration corresponds to the devices A to F described above.
  • the sensor 2 is of a substantially rectangular plate type having an examination room 20 for holding raw milk, and the plate type sensor can easily optimize the electrode arrangement and the like.
  • Raw milk is introduced into the examination room 20 by capillary action.
  • the volume of the examination room 20 is preferably 0.01 to 5 mL, and more preferably 0.05 to 1 mL.
  • a more preferable volume of the examination chamber 20 is 0.1 to 0.3 mL.
  • the senor 2 includes a substantially rectangular base plate 21 and three working electrodes 31, a reference electrode 32, and a counter electrode 33 supported by one surface (one surface in the thickness direction) 21 a of the base plate 21.
  • An electrode and a substantially rectangular cover plate 22 fixed to one surface 21a of the base plate 21 with the electrodes 31 to 33 interposed therebetween are provided.
  • one of the longitudinal directions of the base plate 21 (upper right direction in FIG. 2) is referred to as the front, and the other (lower left direction in FIG. 2) is referred to as the rear.
  • (Lower right direction in FIG. 2) is called the right side, and the other (upper left direction in FIG. 2) is called the left side.
  • the width of the cover plate 22 is the same as the width of the base plate 21, but the length of the cover plate 22 is set shorter than the length of the base plate 21 so as to expose the rear end portion of the one surface 21 a of the base plate 21. Yes.
  • the size of the base plate 21 is, for example, 60 mm long, 30 mm wide, and 1 mm thick.
  • the size of the cover plate 22 is, for example, 50 mm long, 30 mm wide, and 3 mm thick.
  • the material of the base plate 21 and the cover plate 22 is not particularly limited as long as it is insulative.
  • acrylic resin polylactic acid resin, polyglycolic acid resin, styrene resin, methacryl-styrene Copolymer resin (MS resin), polycarbonate resin, polyester resin such as polyethylene terephthalate, polyvinyl alcohol resin, ethylene-vinyl alcohol copolymer resin, thermoplastic elastomer such as styrene elastomer, vinyl chloride resin, poly Examples thereof include silicone resins such as dimethylsiloxane, vinyl acetate resins, and polyvinyl butyral resins.
  • the material of the base plate 21 is preferably selected as appropriate in consideration of adhesion with an electrode material described later
  • the material of the cover plate 22 is preferably selected as appropriate in consideration of adhesion with the base plate 21. .
  • a groove 23 is formed in the end surface of the cover plate 22 along the base plate 21, and the inspection chamber 20 is configured by the groove 23 and one surface 21 a of the base plate 21.
  • the examination room 20 is automatically filled with raw milk from the opening 23a by capillary action. That is, the opening 23 a of the groove 23 constitutes an introduction port to the examination room 20.
  • the width of the groove 23 is preferably 1 to 50 mm, the depth is 0.05 to 5 mm, and the length is preferably 2 to 100 mm, more preferably the width of the groove 23 is 3 to 30 mm.
  • the depth is 0.1 to 3 mm, and the length is 10 to 70 mm.
  • the width of the groove 23 may be 10 mm, the depth may be 0.5 mm, and the length may be 40 mm.
  • the groove 23 can be formed by machining, injection molding, or the like, and the base plate 21 and the cover plate 22 can be joined by heat fusion, laser fusion, solution adhesion technique, or the like.
  • the capillary phenomenon since the capillary phenomenon is used, it is possible to fill the examination room 20 with the raw milk in a short time, for example, within 5 seconds, simply by immersing the end of the sensor 2 on the opening 23a side in the raw milk. .
  • the sensor 2 does not necessarily need to utilize a capillary phenomenon, and an examination room may be provided by a through hole that penetrates the cover plate in the thickness direction. At this time, the sensor 2 corresponds to the spotting method.
  • the working electrode 31, the reference electrode 32, and the counter electrode 33 are arranged in the left-right direction, and each extends linearly in the front-rear direction from the rear end of the base plate 21 to a predetermined position.
  • a circular first electrode part (positive electrode part) 31a is provided at the tip of the working electrode 31, and a circular second electrode part (negative electrode part) larger than the first electrode part 31a is provided at the tip of the counter electrode 33.
  • 33a is provided.
  • the tip 32a of the reference electrode 32 has a small circular shape.
  • the first electrode portion 31 a and the second electrode portion 33 a and the tip 32 a of the reference electrode 32 all face the internal space of the examination room 20.
  • portions of the electrodes 31 to 33 that are not covered with the cover plate 22 constitute wide terminal portions 31b to 33b, and these terminal portions 31b to 33b are inserted into the connector 5 with the sensor 2. When attached, it is electrically connected to a terminal (not shown) of the connector 5.
  • the hydrophilic compound 4 (eg, cysteine) is immobilized. This immobilization can be performed, for example, by immersing the electrode in a solution of the hydrophilic compound 4.
  • the reference electrode 32 is used as a reference electrode.
  • a voltage of, for example, 1 V DC is applied uniformly between the working electrode 31 and the counter electrode 33 and between the reference electrode 32 and the counter electrode 33.
  • an additional voltage of, for example, 0.3 V is applied to the working electrode 31 in a superimposed manner, the oxidizable substance is oxidized on the first electrode portion 31 a to cause hydrolysis, and the working electrode 31 and the counter electrode 33 are oxidized. Current flows between them.
  • the area of the second electrode portion 33a is preferably larger than the area of the first electrode portion 31a.
  • “the area of the second electrode portion 33a” and “the area of the first electrode portion 31a” are the areas when the second electrode portion 33a and the first electrode portion 31a are viewed from a direction orthogonal to the base plate 21.
  • the area of the first electrode portion 31a is preferably 0.7 to 500 mm 2 , and more preferably 4 to 100 mm 2 .
  • the electrodes 31 to 33 can be formed by vapor deposition, sputtering, electrolytic plating, electroless plating, silk screen printing, metal paste injection, or the like. By adopting such an industrially established method, the electrodes 31 to 33 can be formed with high accuracy, and the reproducibility of measured values can be improved in mass production.
  • the conductive material used for the electrodes include gold, silver, silver chloride, platinum, copper, aluminum, and stainless steel.
  • the working electrode 31 is made of gold
  • the reference electrode 32 is made of silver / silver chloride
  • the counter electrode 33 is made of platinum.
  • each electrode 31 to 33 is 0.5 to 20 mm, the length is 1 to 100 mm, and the thickness is 0.003 to 300 ⁇ m. More preferably, the width of each electrode 31 to 33 is 1 to 10 mm, The length is 2 to 20 mm, and the thickness is 0.02 to 200 ⁇ m.
  • an uneven structure or the like may be provided in the electrode portion.
  • the apparatus body 6 calculates the number of somatic cells contained in the raw milk based on the current flowing between the working electrode 31 and the counter electrode 33.
  • the apparatus main body 6 is configured such that the current flowing between the working electrode 31 and the counter electrode 33 when a voltage is applied between the working electrode 31 and the reference electrode 32 via the power supply 65 and the voltage application circuit 62.
  • a calculation unit 64 that calculates the number of somatic cells from the current value. The number of somatic cells calculated by the calculation unit 64 is displayed on the display unit 61.
  • the power source 65 may be an internal power source such as a battery or a battery, or may be an external power source such as a household power source.
  • a galvanometer or the like can be used as the ammeter 63.
  • the calculation unit 64 includes a CPU, a storage unit (RAM), and the like.
  • the storage unit stores a calibration curve that associates the current value with the number of somatic cells, and can also store the measured current value and the calculated number of somatic cells.
  • the computing unit 64 calculates the number of somatic cells according to the current value sent from the ammeter 63. Further, the calculation unit 64 can compare the current value and the number of somatic cells obtained by the new measurement with the stored current value and the number of somatic cells.
  • the calculation unit 64 may be configured to calculate the difference between the current value newly measured and the stored current value, and the storage unit stores the current value difference and the number of somatic cells. It is also possible to store a calibration curve that relates to the number of somatic cells and calculate the somatic cell count by the calculation unit 64. When a plurality of types of sensors 2 having different sensitivities are used, a calibration curve may be stored in the storage unit for each sensor 2.
  • the sensor 2 is attached to each connector 5 arranged in the sampling container for raw milk.
  • the on button 6a is pressed to turn on the power switch.
  • the measurement button 6c is pushed to make it measurable.
  • raw milk is filled in the sampling container, raw milk is filled into the examination room 20 from the opening 23a of the sensor 2 by capillary action. If it does so, the easily oxidizable substance in the raw milk hold
  • the calculated number of somatic cells is displayed on the display unit 61.
  • a configuration in which the oxidation current value is displayed instead of the number of somatic cells is also possible. It is also possible to input a reference somatic cell number into the apparatus main body 6 in advance, and when the calculated somatic cell number exceeds the reference somatic cell number, the lamp can be turned on or notified by voice.
  • the measurement is performed by the new sensor 2, and the measurement result of the newly obtained somatic cell count is compared with the measurement result of the previous somatic cell count. Can do.
  • the off button 6b is pressed, and thereby the power is turned off.
  • the raw milk inspection apparatus 1A of this specific example is suitable for batch measurement, and the examiner etc. quickly uses the raw milk sampled by the dairy farmers, the raw milk collected and delivered to the certification association, etc., the raw milk sampled in units of tanks, etc. Effective when measuring.
  • the raw milk inspection apparatus 1A can have outer dimensions of, for example, a height of 120 mm, a width of 80 mm, and a weight of about 300 g so as to be excellent in portability.
  • FIG. 6 shows another specific example of the raw milk inspection apparatus of the present invention.
  • This raw milk inspection apparatus 1B is composed of four sensors 2 corresponding to the number of dairy cow quarters and an apparatus main body 6 connected to these sensors 2 by a cable 71.
  • the apparatus main body 6 is provided with four display sections 61 corresponding to each sensor 2 and various push buttons 6a to 6c.
  • This configuration corresponds to the above-described apparatuses G to J. According to this configuration, the raw current obtained from four breasts of the same individual is simultaneously measured for the oxidation current value of an easily oxidizable substance, and the number of somatic cells is determined. Can be found and compared. Since raw milk obtained from four breasts of the same individual can be compared simultaneously, in this configuration, it is not necessary to provide a storage unit that stores the measured current value and a storage unit that stores the calculated number of somatic cells.
  • the base plate on which the electrode part was formed was immersed in a 50 mM cysteine aqueous solution for 3 hours to form a cysteine self-assembled film on the surface of the first electrode part.
  • polyethylene terephthalate resin Kerpton, Kurapet KS710B-8S
  • it has a length of 40mm, width of 10mm, and depth of 0.5mm by injection molding method, length 50mm, width 30mm, thickness 3mm
  • a cover plate was formed.
  • a base plate and a cover plate were welded using a laser resin welding machine (Miyachi Technos, model: ML-5220B) to obtain a sensor plate.
  • Example 1 [Current measurement of raw milk sample]
  • the sensor plate obtained in Production Example 1 was connected to a main body having a power source, a voltage application circuit, and a microammeter. Twenty kinds of raw milk samples were dropped on the sensor plate obtained in Production Example 1, and a current flowing when a voltage of +0.3 V (vs. silver / silver chloride reference electrode) was applied to the first electrode part was measured. Further, the concentration of ascorbic acid contained in the same raw milk sample was quantified by high performance liquid chromatography. The relationship between the current value obtained from each raw milk sample and the ascorbic acid concentration is shown in FIG. From the result of FIG. 7, it can be seen that the higher the ascorbic acid concentration contained in the raw milk, the larger the current value obtained. This is because ascorbic acid in raw milk is oxidized near the surface of the first electrode portion by the applied voltage.
  • the content of ascorbic acid or the number of somatic cells in the raw milk sample can be indirectly quantified from the amount of current, and based on these results. Thus, mastitis can be diagnosed.
  • Example 2 [Comparison by quarter] Raw milk samples were collected for each quarter from two dairy cows (dairy cow A and dairy cow B) suspected of having mastitis infection, and the current value of each sample was measured using the apparatus of Example 1. The number of somatic cells contained in the same sample was measured by the same direct microscopic method as in Example 1. The measurement results of the current value and the number of somatic cells are shown in Table 1. In dairy cow A, the rear left quarter milk and in dairy cow B the left front quarter milk show significantly higher somatic cell counts, and mastitis infection is suspected. At this time, it can be seen that the current value of the raw milk in each abnormal quarter shows a low value exceeding the range of variation between the normal quarters. In this way, abnormal quarters that are suspected of infection can be detected more accurately by comparing each quarter.
  • Table 2 shows the results obtained by selecting four types of the 20 types of raw milk used in Example 1 and measuring the current values of these four types of raw milk using the sensor plate obtained in Production Example 2. When an unmodified working electrode was used, only a small current flowed regardless of the ascorbic acid concentration, and an accurate test could not be performed.
  • Table 2 shows the results of measuring current values for four types of raw milk using the sensor plate obtained in Production Example 3. Also in this case, since the current value was low, an accurate inspection could not be performed. This is presumed that when the electrode was modified with hydrophobic 1-propanethiol, the ionic ascorbic acid did not easily approach the electrode in the raw milk, so the amount of current did not increase.
  • the present invention is used for examining whether or not a mammal infected with mastitis is raw milk, and can also be used for diagnosis of mastitis infection in mammals.

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Abstract

　本発明は、乳房炎に感染した哺乳動物の生乳かどうかを、簡便かつ高感度に検査する方法と、当該方法に使用可能な装置を提供する。本発明の方法は、哺乳動物の生乳に電圧を印加する工程（Ａ）、及び印加電圧によって易酸化性物質が酸化される際に生じる電流を測定する工程（Ｂ）を含む生乳の検査方法である。当該方法は、親水性化合物を表面に露出して含む作用極、及び対極を含む少なくとも１組の電極と、該電極間に一定の電圧を印加する回路と、生乳中の易酸化性物質が印加電圧によって酸化される際に生じる電流を測定する手段とを含む、本発明の生乳検査装置によって実施できる。

Description

生乳検査方法及び生乳検査装置
　本発明は、哺乳動物、特に乳牛の生乳を検査する方法及び当該検査を行うための生乳検査装置に関する。
　酪農において、家畜の乳房炎が大きな課題となっている。乳房炎に感染した家畜の乳は、乳糖率低下、塩分濃度増加、その他乳成分の変化により、商品価値が低下する。また、乳房炎への感染は家畜個体や乳房組織にダメージを与えて泌乳能力低下を引き起こし、生産性を低下させる。そのため、感染度の低いうちに乳房炎を発見し、治療を開始することがきわめて重要である。
　現在、感染の指標として一般に乳中の体細胞数が用いられている。乳中の体細胞数とは、白血球を初めとする血液由来細胞と、乳腺上皮細胞との総数である。体細胞数の急激な増加は、乳房内に菌が侵入して増殖することにより、血中から乳中へ白血球が移行して乳中に白血球が増加していることを表しており、乳中の白血球、中でも感染初期に増える好中球の増加を検知することは、乳房炎に感染した家畜の乳の指標として有用である。
　体細胞数は顕微鏡観察やセルソーターによって信頼性の高い値が測定可能であるが、これらの測定に用いられる装置は高額で大型であったり、あるいは操作が煩雑であったりするため、通常は、ある程度集乳された段階で特定の検査機関において体細胞数が測定される。したがって、体細胞数測定結果が判明した時には乳房炎に感染した家畜の乳が正常な乳に混合された状態にあり、乳房炎に感染した家畜の乳によって同じタンク内の大量の乳の品質低下が招かれ、その結果タンク単位の乳の廃棄が行われることになる。また、感染度の低い家畜の乳は正常な乳に希釈されるため、乳房炎の早期の発見は困難である。そのため、搾乳時に体細胞数が測定できる、簡便な方法と装置が望まれている。
　そこで、特許文献１には、簡便な方法で正確に乳房炎の診断が可能な装置として、乳汁加熱手段と、活性酸素種センサと、乳房炎診断手段とを備えたことを特徴とする乳房炎診断装置が開示されている。当該装置は、乳房炎に感染すると増加する好中球から発生する活性酸素量に着目し、活性酸素センサが検出した電流値に基づき乳房炎に感染しているか否かを判断するものである。しかし、特許文献１に記載の装置では、活性酸素量に基づく電流値が小さく、感度に問題があった。
　一方、過去に、生乳中のアスコルビン酸（還元性ビタミンＣ）量が、乳牛の潜在性乳房炎の疑いが増大するにつれて、減少することが報告されている（非特許文献１参照）。
特開２００５－１０６４９０号公報
ビタミン、1959年、vol.16、676-679頁
　上記問題点に鑑み、本発明は、乳房炎に感染した哺乳動物の生乳かどうかを、簡便かつ高感度に検査することを目的とする。
　上記課題を解決した本発明は、哺乳動物の生乳に電圧を印加する工程（Ａ）、及び
　印加電圧によって易酸化性物質が酸化される際に生じる電流を測定する工程（Ｂ）
を含む生乳の検査方法である。
　本発明はまた、親水性化合物を表面に露出して含む作用極、及び対極を含む少なくとも１組の電極と、
　該電極間に一定の電圧を印加する回路と、
　生乳中の易酸化性物質が印加電圧によって酸化される際に生じる電流を測定する手段と
を含む、生乳検査装置である。
　本発明によれば、乳房炎に感染した哺乳動物の生乳かどうかを、簡便かつ高感度に検査することができる。
本発明の生乳検査装置の一例を示す平面図である。 図１に示した生乳検査装置を構成するセンサを示す斜視図である。 図２のIII－III線断面図である。 カバープレートを省略したセンサを示す平面図である。 図１に示した生乳検査装置のブロック図である。 本発明の生乳検査装置の別の一例を示す平面図である。 実施例１で得られた電流値とアスコルビン酸濃度の関係を示すグラフである。 実施例１で得られた電流値と体細胞数の関係を示すグラフである。
　健康な乳牛の生乳中には、体内で生合成されるアスコルビン酸（還元性ビタミンＣ）が約１．５～２．０ｍｇ／１００ｍＬ含まれている。生乳中のアスコルビン酸量は、乳牛の潜在性乳房炎の疑いが増大するにつれて、減少することが報告されている（非特許文献１参照）。本発明者らは、この現象に着目して、生乳中のアスコルビン酸に代表される易酸化性物質を電気化学的に酸化し、酸化電流値より、乳房炎に感染している哺乳動物の生乳か否かを判定できることを見出した。また、酸化電流値が、体細胞数と相関があり、酸化電流値より体細胞数を概算できることを見出した。
　まず、本発明の生乳の検査方法について説明する。本発明の生乳の検査方法は、前記の工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を含む（方法Ａ）。
工程（Ａ）
　工程（Ａ）では、哺乳動物の生乳に電圧を印加する。工程（Ａ）は、例えば、生乳に、作用極及び対極を含む電極を浸し、電極間に電圧を印加することにより行うことができる。
　作用極は、親水性化合物を表面に露出して含むことが好ましい。この場合、親水性化合物が電極触媒として機能し、電流測定の感度を向上させることができる。
　親水性化合物の種類は、電極触媒作用を有する限り特に制限はなく、易酸化性物質の種類に応じて適宜決定すればよい。親水性化合物は、電極触媒作用の観点から、カチオン性基を有することが好ましく、アミノ基を有することがより好ましい。具体的には、システイン、アミノエタンチオール、アミノブタンチオール、アミノノナンチオール等が例示される。作用極には、通常、金等の材料が用いられることから、作用極との親和性の観点から、親水性化合物は、硫黄原子を含む基（特に、チオール基）を有することが好ましく、具体的にはシステインが好ましい。
　印加電圧は、易酸化性物質の種類に応じて、易酸化性物質が酸化されるように適宜選択すればよく、＋０．１～＋０．６Ｖの範囲にあることが好ましい。この範囲の印加電圧においては、易酸化性物質の中でもアスコルビン酸を酸化することができる。
　哺乳動物としては、家畜として飼育されるものが好ましく、例としては、乳牛、山羊等が挙げられる。
工程（Ｂ）
　工程（Ｂ）では、印加電圧によって易酸化性物質が酸化される際に生じる電流を測定する。
　工程（Ａ）における電圧印加によって、易酸化性物質が酸化され、作用極－対極間に酸化電流が流れる。工程（Ｂ）は、作用極－対極間を流れる酸化電流の値を測定することにより実施することができる。
　本発明において易酸化性物質は、生乳中に存在し、電気化学的に容易に酸化される物質であって、その濃度が乳房炎と相関のある物質である。易酸化性物質としては、アスコルビン酸が好ましい。
　工程（Ｂ）で測定される電流値は、易酸化性物質の濃度と相関がある。従って、乳房炎と易酸化性物質の濃度に相関があるため、電流値の大小から、乳房炎に感染した哺乳動物の生乳かどうかを判断することができる。例えば、易酸化性物質がアスコルビン酸であった場合には、前記の電流値が小さいときは、乳房炎に感染した哺乳動物の生乳であると判断することができる。具体的には、アスコルビン酸を電気化学的に酸化する場合、健康な乳牛の生乳の電流値は、電極面積１平方ミリメートルあたり５０～７０ｎＡ程度であるが、乳房炎に感染した乳牛の生乳の電流値は、電極面積１平方ミリメートルあたり２０～５０ｎＡ程度である。
　電流値は、例えば、ガルバノメータ等の公知の電流計で測定することができる。
　以上のように、本発明の生乳検査方法は、簡便な操作により実施することができる。本発明の生乳検査方法においては、易酸化性物質の酸化電流値を測定するが、この酸化電流値は、活性酸素に基づく電流値よりも大きいため、高感度で生乳の検査を行うことができる。
　また、従来の方法では、活性酸素を利用して乳房炎の感染を検査していた。しかし、活性酸素の寿命は短く、測定可能な時間が限られており、搾乳後すぐに測定を行う必要があった。しかし、アスコルビン酸に代表される易酸化性物質は、生乳中に活性酸素よりも長寿命で存在する。そのため、本発明の方法は、搾乳後時間が経過しても検査を実施できるという利点も有する（通常、本発明の方法は、搾乳直後から２４時間程度まで実施可能である）。
　従来は、生乳中の体細胞数より乳房炎に感染した哺乳動物の生乳かどうかが判断されていた。よって、乳房炎に感染した哺乳動物の生乳かどうかを判断するにあたり、体細胞数が把握されることが好ましい。従って、本発明の生乳の検査方法は、以下の工程（Ｃ）をさらに含むことが好ましい（方法Ｂ）。
工程（Ｃ）
　工程（Ｃ）では、測定された電流値から前記生乳中の体細胞数を算出する。易酸化性物質の濃度は、乳房炎と関連するものであるから、易酸化性物質の濃度を示す酸化電流値は、体細胞数とも関連する。例えば、易酸化性物質がアスコルビン酸であった場合には、その酸化電流値と体細胞数には、負の相関がある。よって、生乳に対して、従来方法により体細胞数値と、本発明の方法により電流値をそれぞれ求め、検量線を作成することができる。工程（Ｃ）は、この検量線を用いて、測定された電流値から体細胞数を換算することにより行うことができる。
　一例として乳牛の生乳を検査する場合、健康な乳牛の生乳中の体細胞数は、２万～１０万個／ｍＬであるのに対し、乳房炎に感染した乳牛の生乳中の体細胞数は、３０万個／ｍＬ以上である。従って、測定された電流値から換算された体細胞数が３０万個／ｍＬ以上である場合には、乳房炎に感染した乳牛の生乳であると判断できる。
　また、例えば、乳牛は４つの乳房を有しているが、乳房炎には各乳房が独立して感染し、４つの乳房すべてが乳房炎に感染していることは確率的にゼロに近い。また、生乳中の易酸化性物質量は、若干乳牛ごとに異なっており、個体差がある。そこで、同じ個体の別の乳房から得られる生乳を比較対象とすれば、易酸化性物質量の個体差の影響をなくすことができ、より正確な検査を行うことができる。
　そこで、本発明の生乳の検査方法の好適な一実施態様は、前記哺乳動物（同じ個体）の別の乳房から得られる生乳に対して前記工程（Ａ）及び（Ｂ）をさらに実施し、さらに、各乳房の生乳から得られる電流値を比較する工程（Ｄ）を含む（方法Ｃ）。
　工程（Ｄ）で、電流値を比較して、電流値に大きな差があった場合には、検査した生乳の中に乳房炎に感染した乳房の生乳が含まれていると判断できる。例えば、易酸化性物質がアスコルビン酸であった場合には、電流値の小さな生乳が、乳房炎に感染した乳房の生乳であると判断できる。
　本発明の生乳の検査方法の別の好適な一実施態様は、前記哺乳動物（同じ個体）の別の乳房から得られる生乳に対して前記工程（Ａ）及び（Ｂ）をさらに実施し、さらに、各乳房の生乳から得られる電流値の差を求める工程（Ｅ）を含む（方法Ｄ）。
　工程（Ｅ）で得られる電流値の差が大きい場合には、検査した生乳の中に乳房炎に感染した乳房の生乳が含まれていると判断できる。
　また、工程（Ｅ）で、各乳房の生乳から得られる電流値の差の大きさは、体細胞数とも関連する。例えば、易酸化性物質がアスコルビン酸であった場合には、その酸化電流値の差の大きさと体細胞数には、正の相関がある。そこで、方法（Ｄ）の好適な一実施態様は、工程（Ｅ）で得られた電流値の差から、各乳房から得られる生乳中の体細胞数を算出する工程（Ｆ）をさらに含む（方法Ｅ）。生乳に対して、従来方法により体細胞数値と、本発明の方法により電流値の差をそれぞれ求めることにより、検量線を作成することができる。工程（Ｆ）は、この検量線を用いて、測定された電流値の差から体細胞数を換算することにより行うことができる。方法Ｅは、算出された各乳房の生乳中の体細胞数を比較する工程をさらに含んでいてもよい。
　本発明の生乳の検査方法の別の好適な一実施態様は、前記哺乳動物（同じ個体）の別の乳房から得られる生乳に対して前記工程（Ａ）～（Ｃ）をさらに実施し、さらに、各乳房から得られる生乳中の体細胞数を比較する工程（Ｇ）を含む（方法Ｆ）。
　工程（Ｇ）で、体細胞数を比較して、体細胞数に大きな差があった場合には、検査した生乳の中に乳房炎に感染した乳房の生乳が含まれていると判断できる。このとき、体細胞数が大きい生乳が、乳房炎に感染した乳房の生乳であると判断できる。
　本発明においては、測定する各個体について、健康な状態での、生乳の電流値及び／又は体細胞数を把握しておくと有益である。
　本発明は、生乳の検査方法であるが、乳房炎診断方法として応用することもできる。
　次に、本発明の生乳検査装置について説明する。本発明の生乳検査装置は、親水性化合物を表面に露出して含む作用極、及び対極を含む少なくとも１組の電極と、該電極間に一定の電圧を印加する回路と、生乳中の易酸化性物質が印加電圧によって酸化される際に生じる電流を測定する手段とを含む（装置Ａ）。本発明の生乳検査装置により、上述した本発明の生乳検査方法を行うことができる。
　１組の電極は、作用極及び対極を含むが、参照極をさらに含んでいてもよい。電極は、２以上の生乳、特に同じ哺乳動物（同じ個体）の別の乳房から得られた２以上の生乳を同時に測定可能にするために、２組以上であってもよい。電極には、金、銀、塩化銀、白金、銅、アルミニウム、ステンレス等の導電性材料を用いることができる。
　作用極が含む親水性化合物については、前述の通りである。感度の観点から、作用極は、前記親水性化合物を厚さ２０Å以下の層として含むことが好ましい。作用極の表面上に親水性化合物の層を形成するには、ディッピング法、インクジェット法、インジェクション法等の公知方法により親水性化合物を含む塗布液を作用極上に塗布し、乾燥すればよい。
　前記回路は、作用極と対極とを電気的に接続する。この回路に内部電源又は外部電源を直接的又は間接的に接続すれば、電圧を印加することができる。当該回路は、＋０．１～＋０．６Ｖ程度の電圧を印加できるように構成されることが好ましい。
　生乳中の易酸化性物質が印加電圧によって酸化される際に生じる電流を測定する手段には、特に制限はなく、０．０１～１０μＡ程度の電流を測定できる手段であることが好ましく、ガルバノメータ等の公知の電流計を用いることができる。
　本発明の生乳検査装置は、測定結果を通知する手段を有することが好ましい。当該手段としては、例えば、モニター、ランプ等の表示部、スピーカーなどが挙げられる。
　生乳中の体細胞数が把握されることが好ましいことから、本発明の生乳検査装置は、前記易酸化性物質が酸化される印加電圧で測定した電流値から、前記生乳中の体細胞数を算出する演算部をさらに含むことが好ましい（装置Ｂ）。装置Ｂにより、上記方法Ｂを実施することができる。演算部は、例えば、ＣＰＵと、メモリ、ハードディスク等の記憶部などを含む。記憶部には、体細胞数と電流値との相関を示す検量線が入力されており、ＣＰＵにより体細胞数が計算される。
　本発明の生乳検査装置は、電流値又は体細胞数から乳房炎に感染した哺乳動物の生乳かどうかを判断するための演算部を有していてもよい。この演算部は、例えば、ＣＰＵと記憶部等を有し、当該記憶部には、電流値又は体細胞数と乳房炎感染との相関が入力される。この演算部は、体細胞数を算出する演算部であってもよい。
　前述のように、同じ哺乳動物（同じ個体）の別の乳房から得られる生乳を比較対象とすれば、易酸化性物質量の個体差の影響をなくすことができ、より正確な検査を行うことができる。そこで、本発明の生乳検査装置の好ましい一実施態様は、前記電極と、前記回路と、前記電流測定手段に加え、測定した電流値を記憶する記憶部、及び新たに測定して得られる電流値と記憶した電流値を比較するデータ処理部をさらに含む（装置Ｃ）。当該実施態様の装置によれば、同じ個体の別の乳房から得られる生乳を逐次測定することにより、上記方法Ｃを実施することができる。
　本発明の生乳検査装置の別の好ましい一実施態様は、前記電極と、前記回路と、前記電流測定手段に加え、測定した電流値を記憶する記憶部、及び新たに測定して得られる電流値と記憶した電流値との差を求める演算部をさらに含む（装置Ｄ）。当該実施態様の装置によれば、同じ個体の別の乳房から得られる生乳を逐次測定することにより、上記方法Ｄを実施することができる。演算部は、例えば、ＣＰＵ等より構成できる。
　装置Ｄは、求めた新たに測定して得られる電流値と記憶した電流値との差から、生乳中の体細胞数を算出する演算部をさらに含んでいてもよい（装置Ｅ）。この場合、同じ個体の別の乳房から得られる生乳を逐次測定することにより、上記方法Ｅを実施することができる。当該演算部は、例えば、ＣＰＵと、メモリ、ハードディスク等の記憶部などを含む。記憶部には、体細胞数と電流値の差との相関を示す検量線が入力されており、ＣＰＵにより体細胞数が計算される。当該ＣＰＵには、前記電流値の差を求める演算部のＣＰＵを用いてもよい。装置Ｅは、算出された各乳房の生乳中の体細胞数を比較するデータ処理部をさらに有していてもよい。
　本発明の生乳検査装置の別の好ましい一実施態様は、前記電極と、前記回路と、前記電流測定手段と、前記体細胞数を算出する演算部に加え、算出した体細胞数を記憶する記憶部、及び新たに測定して得られる体細胞数と記憶した体細胞数を比較するデータ処理部をさらに含む（装置Ｆ）。当該実施態様の装置によれば、同じ個体の別の乳房から得られる生乳を逐次測定することにより、上記方法Ｆを実施することができる。
　本発明の生乳検査装置の別の好ましい一実施態様は、前記電極と、前記回路と、前記電流測定手段を含む装置であって、当該装置が、前記電極を２組以上含み、かつ各組の電極に対して測定した電流値を比較するデータ処理部をさらに含む（装置Ｇ）。当該実施態様の装置によれば、同じ個体の別の乳房から得られる生乳それぞれに対し、各組の電極を用いることにより、１回の測定で上記方法Ｃを実施することができる。
　本発明の生乳検査装置の別の好ましい一実施態様は、前記電極と、前記回路と、前記電流測定手段を含む装置であって、当該装置が、前記電極を２組以上含み、かつ各組の電極に対して測定した電流値の差を求める演算部をさらに含む（装置Ｈ）。当該実施態様の装置によれば、同じ個体の別の乳房から得られる生乳それぞれに対し、各組の電極を用いることにより、１回の測定で上記方法Ｄを実施することができる。演算部は、例えば、ＣＰＵ等より構成できる。
　装置Ｈは、求めた電流値の差から生乳中の体細胞数を算出する演算部をさらに含んでいてもよい（装置Ｉ）。このとき、同じ個体の別の乳房から得られる生乳それぞれに対し、各組の電極を用いることにより、１回の測定で上記方法Ｅを実施することができる。当該演算部は、例えば、ＣＰＵと、メモリ、ハードディスク等の記憶部などを含む。記憶部には、体細胞数と電流値の差との相関を示す検量線が入力されており、ＣＰＵにより体細胞数が計算される。当該ＣＰＵには、前記電流値の差を求める演算部のＣＰＵを用いてもよい。
　本発明の生乳検査装置の別の好ましい一実施態様は、前記電極と、前記回路と、前記電流測定手段と、前記体細胞数を算出する演算部を含む装置であって、当該装置が、前記電極を２組以上含み、かつ各組の電極に対して算出した体細胞数を比較するデータ処理部をさらに含む（装置Ｊ）。当該実施態様の装置によれば、同じ個体の別の乳房から得られる生乳それぞれに対し、各組の電極を用いることにより、１回の測定で上記方法Ｆを実施することができる。
　測定した電流値を記憶する記憶部、及び算出した体細胞数を記憶する記憶部は、メモリ、ハードディスク等により構成することができる。体細胞数を算出する演算部が、検量線が記憶される記憶部を有する場合には、当該演算部の検量線が記憶される記憶部を、これらの記憶部として用いてもよいし、別途記憶部を設けてもよい。データ処理部は、ＣＰＵ等により構成することができ、生乳検査装置が生乳中の体細胞数を算出する演算部を有する場合には、演算部のＣＰＵ等をデータ処理部として用いてもよいし、別途データ処理部を設けてもよい。従って、体細胞数を算出する演算部が、これらの記憶部及びデータ処理部として機能してもよいし、記憶部及びデータ処理部を別に設けてもよい。
　本発明の生乳検査装置は、小型化及び低コスト化が可能であり、簡易かつ迅速に高感度で生乳の検査を行うことができる。
　本発明は、生乳検査装置であるが、乳房炎診断装置として応用することもできる。
　以下、本発明の生乳検査装置の具体例を示す。
　図１に、生乳検査装置の具体例を示す。生乳検査装置１Ａは、センサ２、コネクタ５及び本体６を含み、センサ２は、コネクタ５において、本体６と着脱自在となっている。センサ２は後述のように電極を含み、センサ２を着脱自在とすることによって、センサ２を交換するだけで容易に測定を繰り返すことができるようになっている。この構成は、上述の装置Ａ～Ｆに対応している。
　次に、図２～図４を参照して、センサ２の構成について詳細に説明する。このセンサ２は、生乳を保持するための検査室２０を有する略長方形状のプレートタイプのものであり、プレートタイプのセンサは、電極の配置等を容易に最適化することができる。検査室２０には毛細管現象により生乳が導入される。検査室２０の容積は、０．０１～５ｍＬが好ましく、０．０５～１ｍＬがより好ましい。さらに好ましい検査室２０の容積は、０．１～０．３ｍＬである。
　具体的に、センサ２は、略長方形状のベースプレート２１と、このベースプレート２１の一方面（厚み方向の片側の面）２１ａに支持された、作用極３１、参照極３２、及び対極３３の３つの電極と、これらの電極３１～３３を挟んでベースプレート２１の一方面２１ａに固定された略長方形状のカバープレート２２とを有している。なお、以下では、説明の便宜のために、ベースプレート２１の長手方向の一方（図２では右上方向）を前方、他方（図２では左下方向）を後方というとともに、ベースプレート２１の短手方向の一方（図２では右下方向）を右方、他方（図２では左上方向）を左方という。
　カバープレート２２の幅は、ベースプレート２１の幅と同じであるが、カバープレート２２の長さは、ベースプレート２１の一方面２１ａの後端部を露出させるようにベースプレート２１の長さよりも短く設定されている。ベースプレート２１のサイズは、例えば、長さ６０ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚み１ｍｍであり、カバープレート２２のサイズは、例えば、長さ５０ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚み３ｍｍである。
　ベースプレート２１及びカバープレート２２の材質は、絶縁性のものであれば特に制限されるものではないが、例えば、アクリル系樹脂、ポリ乳酸系樹脂、ポリグリコール酸系樹脂、スチレン系樹脂、メタクリル－スチレン系共重合樹脂（ＭＳ樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン－ビニルアルコール系共重合樹脂、スチレン系エラストマーなどの熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン系樹脂、酢酸ビニル系樹脂、ポリビニルブチラール系樹脂等を挙げることができる。ベースプレート２１の材質としては、後述する電極材料との接着性を考慮して適宜選択することが好ましく、カバープレート２２の材質としては、ベースプレート２１との接着性を考慮して適宜選択することが好ましい。
　カバープレート２２には、ベースプレート２１に沿ってカバープレート２２の端面に開口する溝２３が形成されており、溝２３とベースプレート２１の一方面２１ａによって検査室２０が構成されている。そして、検査室２０には、開口２３ａから毛細管現象により生乳が自動的に充填される。すなわち、溝２３の開口２３ａは、検査室２０への導入口を構成している。毛細管現象を利用するには、溝２３の幅は１～５０ｍｍ、深さは０．０５～５ｍｍ、長さは２～１００ｍｍであることが好ましく、より好ましくは、溝２３の幅は３～３０ｍｍ、深さは、０．１～３ｍｍ、長さは１０～７０ｍｍである。例えば、溝２３の幅を１０ｍｍ、深さを０．５ｍｍ、長さを４０ｍｍとしてもよい。
　溝２３の形成は、機械切削加工や射出成型等により行うことができ、ベースプレート２１とカバープレート２２との接合は、熱融着、レーザー融着、溶液接着技術等により行うことができる。このような工業生産技術として確立された方法を適用することにより、検査室２０の容積の精度、すなわちセンサ２への生乳導入量の精度を高めることができる。これにより、同一生乳であれば検査室２０内の易酸化性物質量を一定とすることができ、測定精度を高めることが可能になる。
　本具体例では、毛細管現象を利用しているため、センサ２の開口２３ａ側の端部を生乳に浸すだけで、短時間で、例えば５秒以内に生乳を検査室２０に充填させることができる。なお、センサ２は必ずしも毛細管現象を利用したものである必要はなく、カバープレートを厚み方向に貫通する貫通孔によって検査室が設けられてもよい。このとき、センサ２はスポッティング方式に対応したものとなる。
　作用極３１、参照極３２、及び対極３３は、左右方向に並んでおり、それぞれがベースプレート２１の後端部から所定位置まで前後方向に直線状に延びている。本具体例では、作用極３１の先端に円形状の第１電極部（正極部）３１ａが設けられ、対極３３の先端に第１電極部３１ａよりも大きな円形状の第２電極部（負極部）３３ａが設けられている。また、参照極３２の先端３２ａも小さな円形状になっている。第１電極部３１ａ及び第２電極部３３ａ並びに参照極３２の先端３２ａは全て検査室２０の内部空間に臨んでいる。また、各電極３１～３３におけるカバープレート２２で覆われていない部分は、幅広の端子部３１ｂ～３３ｂを構成しており、これらの端子部３１ｂ～３３ｂが、センサ２がコネクタ５に差し込まれて取り付けられたときに、コネクタ５の端子（図示せず）と電気的に接続される。
　第１電極部３１ａの表面３１ｃ上には、親水性化合物４（例、システイン）が固定化されている。この固定化は、例えば、親水性化合物４の溶液に、電極を浸漬して行うことができる。参照極３２は、基準極として使用される。作用極３１と対極３３との間及び参照極３２と対極３３との間には、例えば直流１Ｖの電圧が均等に印加される。その上で、作用極３１に重畳的に例えば０．３Ｖの追加電圧が印加されると、第１電極部３１ａ上で易酸化性物質が酸化されて加水分解を起こし、作用極３１と対極３３との間に電流が流れる。作用極３１と対極３３との間に流れる電流量を測定することにより、生乳中の易酸化性物質量、ひいては生乳中の体細胞数を測定することが可能となる。なお、酸化電流を効率よく検出するために、第２電極部３３ａの面積は第１電極部３１ａの面積よりも大きくなっていることが好ましい。ここで、「第２電極部３３ａの面積」及び「第１電極部３１ａの面積」とは、第２電極部３３ａ及び第１電極部３１ａをベースプレート２１と直交する方向から見たときの面積をいう。第１電極部３１ａの面積は、０．７～５００ｍｍ2であることが好ましく、４～１００ｍｍ2であることがより好ましい。
　電極３１～３３の形成法は、蒸着、スパッタリング、電解メッキ、無電解メッキ、シルクスクリーン印刷、金属ペーストのインジェクション法等を用いることができる。このような工業的に確立された方法を採用することにより、電極３１～３３を高精度に形成することが可能となり、大量生産において、測定値の再現性を高めることが可能となる。電極に用いられる導電性材料としては金、銀、塩化銀、白金、銅、アルミニウム、ステンレス等を挙げることができる。本具体例では、易酸化性物質としてアスコルビン酸を検出するために、作用極３１を金、参照極３２を銀／塩化銀、対極３３を白金で構成している。
　好ましくは、各電極３１～３３の幅は０．５～２０ｍｍ、長さは１～１００ｍｍ、厚みは０.００３～３００μｍであり、より好ましくは、各電極３１～３３の幅は１～１０ｍｍ、長さは２～２０ｍｍ、厚みは０.０２～２００μｍである。
　なお、電極の表面積を増大させるために、例えば、電極部分に凹凸構造等を設けてもよい。
　次に、図５を参照して、装置本体６の構成について詳細に説明する。装置本体６は、作用極３１と対極３３との間に流れる電流に基づいて生乳中に含まれる体細胞数を算出するものである。具体的に、装置本体６は、電源６５と、電圧印加回路６２を介して作用極３１と参照極３２との間に電圧を印加したときに、作用極３１と対極３３との間に流れる電流を検出する電流計６３と、電流値から体細胞数を算出する演算部６４とを備えており、演算部６４で算出された体細胞数が表示部６１に表示される。
　電源６５は、電池やバッテリー等の内部電源であってもよいし、家庭用電源等の外部電源であってもよい。電流計６３には、ガルバノメータ等を用いることができる。演算部６４は、ＣＰＵや記憶部（ＲＡＭ）等からなっている。記憶部には、電流値と体細胞数とを関係づける検量線が記憶されており、測定した電流値及び算出した体細胞数を記憶することもできる。演算部６４は、電流計６３から送られる電流値に応じた体細胞数を算出する。また、演算部６４では、新たな測定により得られる電流値及び体細胞数を、記憶した電流値及び体細胞数と比較することができる。これとは別に、演算部６４によって、新たに測定して得られる電流値と記憶した電流値との差が算出されるよう構成することもでき、前記記憶部に電流値の差と体細胞数とを関係づける検量線を記憶させ、演算部６４によって、体細胞数が算出されるように構成することもできる。なお、感度の異なる複数種類のセンサ２を使用する場合には、センサ２毎に検量線を記憶部に記憶させておけばよい。
　次に、生乳検査装置１Ａを使用して体細胞数を測定する方法を説明する。生乳のサンプリング容器に配置された各コネクタ５に、センサ２を取り付ける。次に、入ボタン６ａを押して、電源スイッチをＯＮにする。搾乳が開始される際には、測定ボタン６ｃを押して測定可能な状態にしておく。サンプリング容器内に生乳が満たされると、毛細管現象により、センサ２の開口２３ａから検査室２０に生乳が充填される。そうすると、検査室２０に保持された生乳中の易酸化性物質が反応し、その酸化電流が装置本体６に送られて、体細胞数が算出される。算出された体細胞数は、表示部６１に表示される。体細胞数の代わりに酸化電流値を表示するような構成も同様に可能である。なお、装置本体６に予め基準体細胞数を入力しておき、算出した体細胞数が基準体細胞数を超えたときには、ランプを点灯させたり、音声で報知したりすることも可能である。
　搾乳及び体細胞数の測定が完了すると、ミルカー等と生乳サンプリング容器を洗浄した後、次の測定に備え、測定に使用したセンサ２を新しいセンサ２と交換する。
　体細胞数の測定結果を装置本体６に記憶させれば、新しいセンサ２により測定を行い、新たに得られた体細胞数の測定結果と、以前の体細胞数の測定結果とを比較することができる。なお、測定を終了したい場合には、切ボタン６ｂを押し、これにより電源がＯＦＦとなる。
　本具体例の生乳検査装置１Ａは、バッチ測定に適したものであり、酪農家がサンプリングした生乳、検定協会等に集配された生乳、タンク単位でサンプリングされた生乳等を、検定員等が迅速測定する際に効果を発揮する。生乳検査装置１Ａは、携帯性に優れるように、外形寸法を例えば高さ１２０ｍｍ、幅８０ｍｍとし、重量を３００ｇ程度とすることが可能である。
　図６に、本発明の生乳検査装置の別の具体例を示す。この生乳検査装置１Ｂは、乳用牛の分房数に対応した４つのセンサ２と、これらのセンサ２とケーブル７１によって接続された装置本体６とからなる。装置本体６には、各センサ２に対応した４つの表示部６１と各種の押しボタン６ａ～６ｃが設けられている。
　この構成は、上述の装置Ｇ～Ｊに対応し、この構成によれば、同じ個体の４つの乳房から得られた生乳について、同時に易酸化性物質の酸化電流値を測定し、体細胞数を求め、比較することができる。同じ個体の４つの乳房から得られた生乳を同時に比較できるため、この構成では、測定した電流値を記憶する記憶部、及び算出した体細胞数を記憶する記憶部を設けなくてもよい。
　以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
[生乳検査装置のセンサプレートの製造]
〔製造例１〕
　ポリエチレンテレフタレート樹脂（クラレ社製、クラペットKS710B-8S）を使用し、射出成形法により長さ60mm、幅30mm、厚み1mmのベースプレートを形成した。次に、ベースプレートにマスキングを施し、蒸着装置（アルバック社製、型式：UEP）を用いて、作用極(金)、参照極（銀/塩化銀）、対極（白金）を図４に示すパターンで形成した。具体的には、第１電極部の直径は6mmであり、第２電極部の直径は8mmである。次に、電極部を形成した前記ベースプレートを濃度50mMのシステイン水溶液に３時間浸漬し第１電極部表面にシステイン自己組織化膜を形成した。次に、ポリエチレンテレフタレート樹脂（クラレ社製、クラペットKS710B-8S）を使用し、射出成形法により長さ40mm、幅10mm、深さ0.5mmの溝を有する、長さ50mm、幅30mm、厚み3mmのカバープレートを形成した。次に、レーザー樹脂溶着機（ミヤチテクノス社製、型式：ML-5220B)を使用して、ベースプレートとカバープレートを溶着し、センサプレートを得た。
〔製造例２〕
　製造例１において、第１電極部表面が化合物で修飾されていないセンサプレートを用いた以外は、製造例１と同様にしてセンサプレートを得た。
〔製造例３〕
　製造例１において第１電極部表面を、システインに代えて親水性化合物に該当しない１－プロパンチオールで修飾した以外は、製造例１と同様にしてセンサプレートを得た。
〔実施例１〕
[生乳サンプルの電流測定]
　製造例１で得られたセンサプレートを、電源と電圧印加回路と微小電流計とを有する本体と接続した。製造例１で得られたセンサプレートに２０種の生乳サンプルを滴下し、第１電極部に＋0.3V（対銀/塩化銀参照極）の電圧を印加したときに流れる電流を測定した。また同じ生乳サンプルに含まれるアスコルビン酸濃度を、高速液体クロマトグラフィー法により定量した。各生乳サンプルから得られた電流値とアスコルビン酸濃度の関係を図７に示す。図７の結果から、生乳に含まれるアスコルビン酸濃度が高いほど得られる電流値が大きくなることがわかる。これは、生乳中のアスコルビン酸が印加電圧によって第１電極部表面付近で酸化されるためである。
[生乳サンプルの体細胞数測定]
　また同じ生乳サンプルに含まれる体細胞数を、Burker-Turk型血球計算盤を用いた直接鏡検法によって測定した。各生乳サンプルから得られた電流値と体細胞数の関係を図８に示す。図８の結果から生乳サンプルに含まれる体細胞数が多いほど得られる電流値は低くなることがわかる。これは、生乳中の体細胞の増加によって生乳に含まれるアスコルビン酸が酸化され、結果として生乳中のアスコルビン酸濃度が低下するためである。
　以上のように、図７又は図８の結果を検量線として用いれば、電流量から生乳サンプル中のアスコルビン酸の含有量又は体細胞数を間接的に定量することができ、これらの結果に基づいて、乳房炎の診断も可能となる。
〔実施例２〕
[分房ごとの比較]
　乳房炎感染が疑われる乳牛２頭（乳牛Ａ、乳牛Ｂ）から分房ごとに生乳サンプルを採取し、実施例１の装置を用いて各サンプルの電流値を測定した。また同じサンプルに含まれる体細胞数を実施例１と同様の直接鏡検法によって測定した。電流値と体細胞数の測定結果を表１に示す。乳牛Ａでは左後の分房乳、乳牛Ｂでは左前の分房乳が顕著に高い体細胞数を示しており、乳房炎感染が疑われる。このとき各異常分房の生乳の電流値は、正常分房間のばらつきの範囲を超えて低い値を示していることがわかる。このように分房ごとの比較を行うことで感染の疑われる異常分房をより正確に検知することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔比較例１〕
　実施例１で用いた２０種の生乳のうち４種を選び出し、製造例２で得られたセンサプレートを用いてこの４種類の生乳について電流値を測定した結果を表２に示す。修飾されていない作用極を用いた場合は、アスコルビン酸濃度に関わらず小さな電流しか流れておらず、正確な検査が行えなかった。
〔比較例２〕
　製造例３で得られたセンサプレートを用いて４種類の生乳について電流値を測定した結果を表２に示す。この場合も、電流値が低いため、正確な検査が行えなかった。これは、疎水性である１－プロパンチオールで電極を修飾すると、生乳中においてイオン性のアスコルビン酸が電極に近づきにくいため、電流量が上がらなかったものと推測される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明は、乳房炎に感染した哺乳動物の生乳かどうかの検査に用いられるものであり、哺乳動物の乳房炎の感染の診断に用いることもできる。

Claims (19)

  1. 　哺乳動物の生乳に電圧を印加する工程（Ａ）、及び
    　印加電圧によって易酸化性物質が酸化される際に生じる電流を測定する工程（Ｂ）
    を含む生乳の検査方法。
  2. 　測定された電流値から前記生乳中の体細胞数を算出する工程（Ｃ）をさらに含む請求項１に記載の生乳の検査方法。
  3. 　前記哺乳動物の別の乳房から得られる生乳に対して前記工程（Ａ）及び（Ｂ）をさらに実施し、さらに、各乳房の生乳から得られる電流値を比較する工程（Ｄ）を含む請求項１に記載の生乳の検査方法。
  4. 　前記哺乳動物の別の乳房から得られる生乳に対して前記工程（Ａ）及び（Ｂ）をさらに実施し、さらに、各乳房の生乳から得られる電流値の差を求める工程（Ｅ）を含む請求項１に記載の生乳の検査方法。
  5. 　前記工程（Ｅ）で得られた電流値の差から、各乳房から得られる生乳中の体細胞数を算出する工程（Ｆ）をさらに含む請求項４に記載の生乳の検査方法。
  6. 　前記哺乳動物の別の乳房から得られる生乳に対して前記工程（Ａ）～（Ｃ）をさらに実施し、さらに、各乳房から得られる生乳中の体細胞数を比較する工程（Ｇ）を含む請求項２に記載の生乳の検査方法。
  7. 　前記易酸化性物質が、アスコルビン酸である請求項１に記載の生乳の検査方法。
  8. 　親水性化合物を表面に露出して含む作用極、及び対極を含む少なくとも１組の電極と、
    　該電極間に一定の電圧を印加する回路と、
    　生乳中の易酸化性物質が印加電圧によって酸化される際に生じる電流を測定する手段と
    を含む、生乳検査装置。
  9. 　前記易酸化性物質が酸化される印加電圧で測定した電流値から、前記生乳中の体細胞数を算出する演算部をさらに含む請求項８に記載の生乳検査装置。
  10. 　測定した電流値を記憶する記憶部、及び
    　新たに測定して得られる電流値と記憶した電流値を比較するデータ処理部をさらに含む請求項８に記載の生乳検査装置。
  11. 　測定した電流値を記憶する記憶部、及び
    　新たに測定して得られる電流値と記憶した電流値との差を求める演算部をさらに含む請求項８に記載の生乳検査装置。
  12. 　求めた新たに測定して得られる電流値と記憶した電流値との差から、生乳中の体細胞数を算出する演算部をさらに含む請求項１１に記載の生乳検査装置。
  13. 　算出した体細胞数を記憶する記憶部、及び
    　新たに測定して得られる体細胞数と記憶した体細胞数を比較するデータ処理部をさらに含む請求項９に記載の生乳検査装置。
  14. 　前記電極を２組以上含み、かつ
    　各組の電極に対して測定した電流値を比較するデータ処理部を
    さらに含む請求項８に記載の生乳検査装置。
  15. 　前記電極を２組以上含み、かつ
    　各組の電極に対して測定した電流値の差を求める演算部を
    さらに含む請求項８に記載の生乳検査装置。
  16. 　求めた電流値の差から生乳中の体細胞数を算出する演算部をさらに含む請求項１５に記載の生乳検査装置。
  17. 　前記電極を２組以上含み、かつ
    　各組の電極に対して算出した体細胞数を比較するデータ処理部を
    さらに含む請求項９に記載の生乳検査装置。
  18. 　前記親水性化合物が、カチオン性基を有する化合物である請求項８に記載の生乳検査装置。
  19. 　前記易酸化性物質が、アスコルビン酸である請求項８に記載の生乳検査装置。
     
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