[go: up one dir, main page]

WO2013060995A1 - Procede de preparation du facteur h humain - Google Patents

Procede de preparation du facteur h humain Download PDF

Info

Publication number
WO2013060995A1
WO2013060995A1 PCT/FR2012/052461 FR2012052461W WO2013060995A1 WO 2013060995 A1 WO2013060995 A1 WO 2013060995A1 FR 2012052461 W FR2012052461 W FR 2012052461W WO 2013060995 A1 WO2013060995 A1 WO 2013060995A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
factor
nucleic acid
sequence
sequence seq
acid encoding
Prior art date
Application number
PCT/FR2012/052461
Other languages
English (en)
Inventor
Toufik ABACHE
Original Assignee
Lfb Biotechnologies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lfb Biotechnologies filed Critical Lfb Biotechnologies
Priority to JP2014537698A priority Critical patent/JP2014532401A/ja
Priority to EP12794376.9A priority patent/EP2771354A1/fr
Priority to CA2850295A priority patent/CA2850295A1/fr
Priority to US14/353,595 priority patent/US20140271603A1/en
Publication of WO2013060995A1 publication Critical patent/WO2013060995A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing recombinant human factor H in a human cell line, with improved yield.
  • Factor H is a plasma protein present in human plasma at an average rate of 500 mg / L. It is produced primarily by liver cells constitutively, but also locally produced by other cells, such as retinal pigment epithelial cells, endothelial cells, platelets or mesenchymal stem cells.
  • factor H The main function of factor H is the regulation of activation of the alternative complement pathway.
  • the factor H is involved in this regulation by three mechanisms: (i) the regulation of the activity of factor I, which allows the inactivation of the protein C3b (iC3b); (ii) inhibition of C3 convertase formation alternates by competition with factor B for C3b binding; (iii) the acceleration of the dissociation of the C3 convertase of the alternate pathway (C3bBb) (decay acceleration activity).
  • Factor H can act either in the blood fluid phase to maintain a low level of activated C3 molecules (C3b), or at cell surfaces with polyanions, such as glycosaminoglycans, heparan sulfate or sialic acid, to protect host cells from cell lysis induced by complement activation.
  • C3b activated C3 molecules
  • polyanions such as glycosaminoglycans, heparan sulfate or sialic acid
  • the HF1 gene having 102,494 base pairs (bp) and 23 exons (NCBI RefSeq: NG_007259.1), is located in the RCA gene cluster (regttlator of complement activaiion) on locus lq32, Chrl. Because of alternative splicing, two mRNAs are transcribed from the HF1 gene, one having 3696 bp and encoding the FH protein and the other having 1347 bp and encoding the FH-1 (FH-like 1 protein) protein. .
  • Factor H protein (1213 aa, 155 kDa) is a single chain glycoprotein composed of 20 short repeats (SCR) domains (also called CCP or SHUSHI).
  • SCR short repeats
  • SHUSHI 20 short repeats domains
  • the FHL-1 protein (449 amino acids, 42 kDa) has the first 7 SCR domains plus 4 C-terminal hydrophobic amino acids.
  • the human factor H has a polymorphism at position 402 of its amino acid sequence, characterized by the substitution of a tyrosine (Y) by a histidine (H). This substitution itself results from a nucleotide replacement at the level of the HF1 gene, where a T nucleotide is replaced by a C.
  • SCR domains are present in many proteins, such as proteins of the FH family (FHR1, FHR2, FHR3, FHR4), proteins of the RCA family (CRI, CR2, C4BP, CD55, CD46) or pathogens (vaccinia virus, ”).
  • SCR domain is composed of approximately 60 amino acids separated by a short linker sequence (3-8 amino acids for human FH).
  • the SCR domains consist mainly of beta strands and each have two S-S bridges distributed at each end of the domain. Sequence homology analyzes show that 4 conserved cysteines are involved in the formation of two intraday S-S bridges and that a tryptophan (W) in the SCR domain is highly conserved.
  • Recombinant human factor H has been produced in the baculovirus system (Sharma and Pangburn, Gene 1994, June 10: 143 (2): 301-2) and in COS cells (Sanchez-Corral et al., Am., J. Hum Genet., 71: 1285-1295, 2002). More recently, recombinant human factor H has been produced in photobioreactor physcomitrella foam (Buttner-Mainik et al., Plant biotechnol, J.
  • the present invention relates to the use of a human cell line for carrying out a method for preparing recombinant human factor H with a yield greater than the amount of endogenous factor H produced by said cell line.
  • the present invention relates to the use of a human cell line for carrying out a recombinant human factor H preparation method, represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or a sequence having at least 99%, in particular 99.4%, in particular 99.7% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • a protein represented by such a sequence may be the Y402 variant or the human H factor H402 variant or another human H-factor variant, such as a variant mentioned in the website https://www.unipi.org/ ' uniprot / P08603.
  • the present invention relates to the use of a human cell line for carrying out a recombinant human factor H preparation method, represented by the sequence SEQ ID NO: 1, with a higher yield the amount of endogenous factor H produced by said cell line.
  • the recombinant human factor H represented by the sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to the variant Y402, in which the amino acid at position 402 is a tyrosine.
  • the present invention relates to the use of a human cell line for carrying out a recombinant human factor H preparation method, represented by the sequence SEQ ID NO: 13, with a yield of greater than the amount of endogenous factor H produced by said cell line.
  • the recombinant human factor H represented by the sequence SEQ ID NO: 13 corresponds to the variant H402, in which the amino acid at position 402 is a histidine.
  • This cell line may be a line that does not produce H factor, a line producing H factor in an undetectable amount, or a line producing endogenous factor H.
  • the amount of endogenous H-factor produced by a cell line is determined by the ELISA method with a judiciously chosen pair of antibodies that can detect minimal concentrations of 5 ng / ml of Factor H in the cell supernatant.
  • Commercial dosing kits are also available (eg Kit HK342 Hycult).
  • the present invention relates to the use of a human cell line producing endogenous factor H for the implementation of a recombinant human factor H preparation method, represented by the sequence SEQ ID NO: 1, with a yield greater than the amount of endogenous factor H produced by said cell line.
  • a factor H producing line is meant a cell line for which it is possible to detect the presence of endogenous factor H in the cellular supernatant by conventional protein detection methods such as ELISA and Western Blot.
  • Some human cell lines such as the PER.C6® cell line or the HEK 293F line, produce human factor H endogenously.
  • endogenous factor H productivity by these cells is relatively low; it is approximately 70 ⁇ g / L for the PER.C6® cell line, after 48H of culture, and about 11 ⁇ g / L of H factor secreted in the culture medium for the HEK 293F cell line after 7 days. days of culture.
  • the present invention relates to the use of a human cell line, with a yield greater than 10 mg / L, particularly greater than 20 mg / L, or 30 mg / L, or 40 mg / L, or 50 mg / L, more particularly greater than 60 mg / L, or 70 mg / L, or 80 mg / L, or 90 mg / L, especially 100 mg / L of culture medium .
  • the mode of production used to produce recombinant factor H is one of the following modes: “batch”, “Fedbatch” or “culture with filtration-retention” or a mode that derives from one of these 3 modes of production, one By “yield” is meant the amount of recombinant H-factor produced per volume of final culture medium to be processed in post-production (also referred to as Downstream Process or DSP).
  • yield means the quantity of factor H produced per volume of culture medium initially contained. in the production enclosure.
  • the "batch" production mode is characterized by a constant volume.
  • the inoculum is added to the medium and the culture is allowed to proceed. Biomass evolves according to the characteristic growth curve of the line used for production. We intervene on the speed of rotation, the aeration (02 and CO2) or the adjustment of the pH, but no nutritive medium is added during culture and nothing is removed.
  • a final amount of 10 mg recombinant proteins produced in a culture medium of final volume of one liter, which is identical to the initial volume, corresponds to a production yield of 10 mg / L
  • the "Fedbatch" production mode is characterized by a variable volume.
  • the production is done initially as a normal batch in a given volume.
  • Fresh medium is then added to maintain the cells in the desired state (stable cell viability, exponential phase, stationary phase). It is it is possible to adapt the "feed” to never exceed the desired limit values (example: glucose concentration ⁇ 4 g / L).
  • the feed strategy depends on the line used for production.
  • the biomass In the exponential phase, the biomass accumulates rapidly, allowing the product to accumulate very quickly in a reduced volume. In stationary phase the biomass is kept constant allowing a progressive accumulation of product in a reduced volume.
  • a final amount of 30 mg of recombinant H-factor produced in 1.5 liters of final volume of culture medium, which is initially one liter, corresponds to a production yield of 20 mg / L.
  • the "culture with filtration-retention" production mode (also known as the XD process) is characterized by an increase in biomass in a constant volume. It is a mixed mode in the batch and fed-batch modes for which the addition of the fresh medium is compensated by the withdrawal of an equivalent volume of supernatant without the recombinant factor H which will be retained via a filtration membrane whose cut-off point is less than the size of the recombinant protein. The removed supernatant is removed. The volume thus remains constant while the biomass accumulates rapidly, which also makes it possible to accumulate recombinant factor H.
  • a final amount of 60 mg of the recombinant factor H produced in one liter of final volume of culture medium corresponds to a production yield of 60 mg / ml. L.
  • the "culture with perfusion" mode of production is characterized by constant volume and biomass.
  • the addition of the fresh medium is compensated for by the withdrawal of an equivalent volume of supernatant but in this mode of production the withdrawn supernatant contains the recombinant Factor H and is thus conserved which leads to a high volume. final to treat in DSP higher than the initial volume without accumulation of the protein of interest.
  • the present invention is based on the unexpected finding made by the inventors that human factor H codon optimization makes it possible to increase the productivity of recombinant human factor H in several human cell lines.
  • Codon optimization aims to replace natural codons by codons whose transfer RNA (tRNA) carrying the amino acids are most common in the cell type considered.
  • tRNA transfer RNA
  • the mobilization of frequently encountered tRNAs has the major advantage of increasing the translation speed of the messenger RNAs (mRNAs) and therefore of increasing the final titre (JM Carton et al., Protein Expr Purif, 2007).
  • Sequence optimization also plays on the prediction of mRNA secondary structures that could slow down reading by the ribosomal complex. Sequence optimization also has an impact on the percentage of G / C that is directly related to the half-life of the mRNAs and therefore to their potential to be translated (Chechetkin, J. of Theoretical Biology 242, 2006 922-934 ).
  • Codon optimization can be done by substitution of natural codons using codon frequency (Codon Usage Table) tables for mammals and more specifically for Homo sapiens.
  • codon frequency Codon Usage Table
  • nucleic acid encoding the sequence SEQ ID NO: 1 is represented by:
  • the percentage identity between two nucleic acid sequences can be calculated according to the following formula:
  • sequence SEQ ID NO: 2 or a sequence having at least 75%, preferably at least 85%, especially 90%>, especially 95% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 2 is a sequence obtained by codon optimization from the natural nucleic acid sequence encoding human factor H.
  • the natural nucleic acid encoding the Y402 variant of human factor H is represented by the sequence SEQ ID NO: 8.
  • the natural nucleic acid encoding the human H factor H402 variant is represented by the sequence SEQ ID NO: 17.
  • nucleic acid encoding the human factor H precursor further comprising a nucleic acid is chosen from:
  • nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 5 and coding the natural signal peptide of the factor H, or
  • nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3 or by a sequence having at least 85%, in particular 90%, especially 95% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, and coding the signal peptide of H factor, (optimized natural PS) or
  • nucleic acid encoding a natural signal peptide of a protein different from the factor H, or
  • nucleic acid encoding the signal peptide encoded by the sequence SEQ ID NO: 4 (PCT / FR2011 / 050544) or by a sequence having at least 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 4.
  • the natural signal peptide of a protein different from human factor H may be a signal peptide chosen from the signal peptides of all the proteins which are secreted in eukaryotes and in particular in mammals and more particularly in humans, such as those of immunoglobulins. growth factors such as ⁇ , hormones such as insulin, enzymes such as trypsinogen, coagulation factors such as prothrombin.
  • sequence SEQ ID NO: 3 or a sequence having at least 85%, in particular 90%, particularly 95% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3 is a sequence obtained by codon optimization from FIG. sequence SEQ ID NO: 5.
  • the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 4 or by a sequence having at least 85%, especially 90%, particularly 95% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 4 encodes an artificial signal peptide.
  • nucleic acid encoding the human H-factor precursor comprising the nucleic acid encoding the signal peptide and the nucleic acid encoding the human factor H, is subject to optimization. of codons.
  • nucleic acid encoding the recombinant human factor H precursor comprises or consists of:
  • nucleic acid encoding a signal peptide, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 3 or a sequence exhibiting at least 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, and
  • nucleic acid encoding the factor H represented by the sequence SEQ ID NO: 1, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 2 or a sequence having at least 75%, preferably 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 2,
  • nucleic acid encoding the recombinant human factor H precursor comprises or consists of the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3 and the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2.
  • nucleic acid encoding the precursor factor H is represented by the sequence SEQ ID NO: 6 or a sequence having at least 85%, especially 90%), particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6.
  • nucleic acid encoding the precursor factor H is represented by the sequence SEQ ID NO: 6.
  • sequence SEQ ID NO: 6 corresponds to codon optimization of the human H-factor precursor which comprises its natural signal peptide.
  • nucleic acid encoding the recombinant human factor H precursor comprises or consists of:
  • nucleic acid encoding a signal peptide, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 3 or a sequence exhibiting at least 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, and
  • nucleic acid encoding the factor H represented by the sequence SEQ ID NO: 13, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 14 or a sequence having at least 75%, preferably 85%, especially 90%, especially 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 14,
  • nucleic acid encoding the recombinant human factor H precursor comprises or consists of the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 3 and the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 14.
  • nucleic acid encoding the precursor factor H is represented by the sequence SEQ ID NO: 15 or a sequence having at least 85%, especially 90%), particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15.
  • a nucleic acid encoding a recombinant human factor H precursor comprises or consists of:
  • nucleic acid coding for human factor H which has been the subject of codon optimization
  • nucleic acid encoding an artificial signal peptide, which does not correspond to the natural signal peptide of human factor H, but may confer a secretion capacity that is better or similar to that of the human H factor natural signal peptide.
  • nucleic acid encoding the recombinant human factor H precursor comprises or consists of:
  • nucleic acid encoding a signal peptide, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 4 or a sequence exhibiting at least 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 4, and
  • nucleic acid encoding the sequence SEQ ID NO: 1, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 2 or a sequence exhibiting at least 75%, preferably at least 85%, especially 90%, especially 95% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 2,
  • the nucleic acid encoding the recombinant human factor H precursor comprises or consists of the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 4 and the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the nucleic acid encoding the recombinant human factor H precursor is represented by the sequence SEQ ID NO: 7 or a sequence having at least 85%, in particular 90%, especially 95% sequence identity with the sequence. SEQ ID NO: 7,
  • nucleic acid encoding the precursor factor H is represented by the sequence SEQ ID NO: 7.
  • nucleic acid encoding the recombinant human factor H precursor comprises or consists of:
  • nucleic acid encoding a signal peptide, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 4 or a sequence exhibiting at least 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 4, and
  • nucleic acid encoding the factor H represented by the sequence SEQ ID NO: 13, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 14 or a sequence having at least 75%, preferably 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 14,
  • nucleic acid encoding the recombinant human factor H precursor comprises or consists of the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 4 and the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 14.
  • nucleic acid encoding the precursor factor H is represented by the sequence SEQ ID NO: 24 or a sequence having at least 85%, especially 90%), particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 24.
  • a nucleic acid encoding the human factor H precursor comprising or consisting of the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 5 and the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 8 can be used as a control of the productivity an optimized nucleic acid encoding the Y402 variant as described in the present invention. More particularly, this control nucleic acid may be the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 9.
  • a nucleic acid encoding the human H-factor precursor comprising or consisting of the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 5 and the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 17, may be used as a control for a optimized nucleic acid encoding the H402 variant as described in the present invention.
  • control nucleic acid may be the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 18.
  • the human factor H as defined above is produced in the PER.C6® cell line or the HEK 293F cell line.
  • the PER.C6® cell line is derived from human primary retinal cells in which an Ad5 adenoviral DNA fragment that contains both the El A gene and the E1B gene is inserted into the cells by a vector.
  • This adenoviral DNA fragment makes it possible to confer immortality to the cells in which it is inserted, via the E1B protein which inhibits p53.
  • the El A protein has a tropism for the hCMV viral promoter and allows its transactivation and the potentiation of the gene sequence that will be inserted 3 'of the latter and which may be the H factor.
  • the PER.C6® cell line produces, endogenously, both the human H-factor H402 variant and the Y402 variant.
  • the present invention particularly relates to the use of the PER.C6® cell line for the implementation of a recombinant human factor H preparation method, represented by the sequence SEQ ID NO: 1, with a yield greater than the amount of endogenous factor H produced by said cell line.
  • the present invention relates to the use of the PER.C6® cell line for the implementation of a process for the preparation of recombinant human factor H, represented by the sequence SEQ ID NO: 1, in which the acid The nucleic acid encoding the precursor factor H is represented by the sequence SEQ ID NO: 6, 7 or 9.
  • the present invention also particularly relates to the use of the HEK 293F cell line for the implementation of a process for the preparation of human factor H recombinant, represented by the sequence SEQ ID NO: 1, with a yield greater than the amount of endogenous factor H produced by said cell line.
  • the HEK 293F cell line produced endogenously only the human factor H variant Y402.
  • the present invention relates to the use of the HEK 293F cell line for carrying out a recombinant human factor H preparation method, represented by the sequence SEQ ID NO: 1, wherein the nucleic acid encoding the precursor of the factor H is represented by the sequence SEQ ID NO: 6 or 7.
  • the present invention also relates to the use of a human cell line, such as the PER.C6® or HEK 293F cell line for carrying out a recombinant human factor H preparation method, wherein the nucleic acid Factor H precursor coding is a genomic nucleic acid comprising artificial or natural human factor H or other human gene introns and human H factor natural exons.
  • a human cell line such as the PER.C6® or HEK 293F cell line for carrying out a recombinant human factor H preparation method, wherein the nucleic acid Factor H precursor coding is a genomic nucleic acid comprising artificial or natural human factor H or other human gene introns and human H factor natural exons.
  • the present invention also relates to the nucleic acid encoding recombinant human factor H, such as the Y402 variant of factor H represented by the sequence SEQ ID NO: 1 or the variant H factor H402 represented by the sequence SEQ ID NO: 13.
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 13 do not contain the sequence corresponding to that of the signal peptide of Factor H.
  • the invention relates to a nucleic acid encoding recombinant human factor H having the sequence SEQ ID NO: 1, comprising a nucleic acid represented by:
  • the invention relates to a nucleic acid encoding recombinant human factor H of sequence SEQ ID NO: 1, comprising or consisting of:
  • nucleic acid encoding a signal peptide, said nucleic acid being selected from the sequence SEQ ID NO: 3 or a sequence having at least 85%>, especially 90% o, particularly 95%> of sequence identity with the SEQ ID sequence NO: 3, and a nucleic acid encoding the factor represented by the sequence SEQ ID NO: 1, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 2 or a sequence having at least 75%, preferably 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • nucleic acid encoding recombinant human factor H of sequence SEQ ID NO: 1 is represented by the sequence SEQ ID NO: 6 or a sequence having at least 85%, in particular 90%, particularly 95% sequence identity. with the sequence SEQ ID NO: 6.
  • the invention relates to a nucleic acid encoding recombinant human factor H of sequence SEQ ID NO: 1, comprising or consisting of:
  • nucleic acid encoding a signal peptide, said nucleic acid being selected from the sequence SEQ ID NO: 4 or a sequence exhibiting at least 85%, especially 90%), particularly 95% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 4, and
  • nucleic acid encoding the factor represented by the sequence SEQ ID NO: 1, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 2 or a sequence having at least 75%, preferably 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • nucleic acid encoding recombinant human factor H of sequence SEQ ID NO: 1 is represented by the sequence SEQ ID NO: 7 or a sequence having at least 85%, in particular 90%, particularly 95% sequence identity. with the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the invention relates to a nucleic acid encoding recombinant human factor H of sequence SEQ ID NO: 13, comprising or consisting of:
  • nucleic acid encoding a signal peptide, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 3 or a sequence exhibiting at least 85%, especially 90%), particularly 95% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, and
  • nucleic acid encoding the factor represented by the sequence SEQ ID NO: 1, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 14 or a sequence having at least 75%, preferably 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 14.
  • nucleic acid encoding recombinant human factor H of sequence SEQ ID NO: 13 is represented by the sequence SEQ ID NO: 15 or a sequence having at least 85%, especially 90%>, especially 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15.
  • the invention relates to a nucleic acid encoding recombinant human factor H of sequence SEQ ID NO: 13, comprising or consisting of:
  • nucleic acid encoding a signal peptide, said nucleic acid being selected from the sequence SEQ ID NO: 4 or a sequence exhibiting at least 85%, especially 90%), particularly 95% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 4, and
  • nucleic acid encoding the factor represented by the sequence SEQ ID NO: 1, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 14 or a sequence having at least 75%, preferably 85%, especially 90%, particularly 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 14.
  • nucleic acid encoding recombinant human factor H of sequence SEQ ID NO: 1 is represented by the sequence SEQ ID NO: 24 or a sequence having at least 85%, in particular 90%, particularly 95% sequence identity. with the sequence SEQ ID NO: 24.
  • SEQ ID NO: 16 consists of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 19.
  • SEQ ID NO: 21 consists of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 20.
  • SEQ ID NO: 22 consists of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 20.
  • SEQ ID NO: 23 consists of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 19.
  • SEQ ID NO: 19 corresponds to the optimized FH 402H sequence 2.
  • SEQ ID NO: 20 corresponds to the optimized FH 402Y sequence 2.
  • the present invention also relates to an expression vector comprising or consisting of a nucleic acid as defined above.
  • the present invention also relates to human cells, in particular transformed, producing human recombinant factor H with a yield greater than the amount of endogenous factor H produced by said cells.
  • the invention relates to human cells having a yield greater than 10 mg / l, particularly 30 mg / l, more particularly 50 mg / l, especially 100 mg / l of culture medium.
  • the invention relates to human cells transformed with a vector as defined above.
  • the invention relates to human cells producing recombinant factor H represented by the sequence SEQ ID NO: 1 with a yield greater than the amount of endogenous factor H produced by said cells.
  • human cells of the invention are selected from PER.C6® and HEK 293F.
  • the human cells of the invention form a cell clone.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of recombinant human factor H, represented by the sequence SEQ ID NO: 1, in a human cell line with a yield greater than the amount of endogenous factor H produced by said cell line, said method comprising the step of culturing said cell-transformed cell line comprising a nucleic acid encoding the human H-factor precursor.
  • the vector comprising such a nucleic acid may be any expression vector for eukaryotic cell lines known to those skilled in the art.
  • the transformation of the cell line can be carried out by electroporation, AMAXA type nucleofection, a "gene gun” (gun gene) or else using a transfection agent known to man of the art, such as cationic agents of liposomes or polymers such as fectin or PEI agent.
  • a transfection agent known to man of the art, such as cationic agents of liposomes or polymers such as fectin or PEI agent.
  • the method according to the present invention comprises the following steps:
  • the expression vector may contain an antibiotic resistance gene to allow selection of transfected cells upon establishment of cells stably producing the protein of interest.
  • the method according to the present invention comprises the following steps:
  • step (iv) optionally separating the endogenous form and the recombinant form of the purified factor H in step (iii).
  • the purification of human factor H is carried out by chromatographic techniques in one, two or more steps.
  • the one-step purification may be an ion exchange column or an affinity column (heparin, factor H ligand or anti-factor H antibody).
  • the purification in two steps may be a cation exchange column chromatography step followed by an anion exchange column chromatography step or an anion exchange column chromatography step followed by a column chromatography step cation exchange chromatography or an ion exchange column chromatography step followed by an affinity column chromatography step or an affinity column chromatography step followed by a chromatographic column chromatography step; ions.
  • Purification in addition to two steps can be achieved by a combination of these different chromatographies.
  • a step of diafiltration, ultrafiltration or gel filtration may be carried out in addition. The purity of a product after such purification can reach 99% purified product.
  • the vector for the transformation of the cell line comprises a nucleic acid encoding the precursor of human factor H, represented by the sequence SEQ ID NO: 1, said nucleic acid comprising:
  • nucleic acid encoding a signal peptide, said nucleic acid being selected from the sequence SEQ ID NO: 3 and a sequence having at least 85%, especially 90%>, especially 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, and a nucleic acid encoding the sequence SEQ ID NO: 1, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 2 and a sequence having at least 75%, preferably at least 85%, especially 90%, especially 95%> sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 2,
  • nucleic acid encoding a signal peptide, said nucleic acid being selected from the sequence SEQ ID NO: 4 and a sequence having at least 85%>, especially 90%>, particularly 95%> sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 4, and
  • nucleic acid encoding the sequence SEQ ID NO: 1, said nucleic acid being chosen from the sequence SEQ ID NO: 2 and a sequence having at least 75%, preferably at least 85%, especially 90%, especially 95%> sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the vector for transforming the cell line comprises a nucleic acid, which comprises:
  • the vector for transforming the cell line comprises a nucleic acid, which comprises:
  • the cell line used in the method according to the present invention may be the PER.C6® or HEK 293F cell line.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant H factor having a purity greater than 90%> preferably greater than 95%>.
  • said recombinant human factor H retains the biological activity of a plasma human factor H.
  • the biological activity of human plasma H-factor includes regulation of Factor I activity, inhibition of alternating C3 convertase formation and acceleration of C3 convertase dissociation.
  • said recombinant human factor H retains the biological activity of a plasma human factor H to accelerate the dissociation of C3 convertase.
  • the amount of dissociated C3 convertase can be determined as a function of the concentration of FH added.
  • the IC50 is determined from the equation calculated for a variable slope sigmoid.
  • said recombinant human factor H retains the biological activity of a plasma H factor to regulate factor I activity.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising only a recombinant human factor H variant as an active substance, said variant being a variant mentioned in the website http: //www.uniprot.org/uniprot/P08603.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising only the recombinant human Factor Y402 variant represented by the sequence SEQ ID NO: 1, without the human factor H H402 variant.
  • the recombinant human Factor Y402 variant can be produced by the HEK 293F cell line which endogenously produces only the Y402 variant.
  • the production of the recombinant variant Y402 can also be carried out by the PER.C6® cell line which endogenously produces both the Y402 variant and the H402 variant, followed by purification or separation which makes it possible to separate the Y402 variant. H402 variant.
  • the PER.C6® cell line can also be modified so as not to endogenously produce the H402 variant.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising only the variant H402 of human factor H, without the variant Y402 represented by the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the human recombinant H-factor H402 variant can be produced by the PER.C6® cell line or the HEK 293F cell line. Purification or separation is necessary to separate the H402 variant from the Y402 variant.
  • the PER.C6® and HEK 293F cell lines can also be modified so as not to endogenously produce the Y402 variant.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the variant H402 and the variant Y402 as active substance.
  • a pharmaceutical composition according to the present invention also comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising greater than 99.5% of a human factor H variant and less than 0.5% of another human factor H variant.
  • Figure 1 stands for endogenous H-factor assay in PER.C6® and HEK cells
  • Figure 2 means generation of PER.C6 stable pools stably expressing recombinant H-factor (here, for example, H-variant factor H402)
  • Figure 3 shows the kinetics of recombinant H-factor (H402) production in stable PER.C6® pools in batch mode.
  • Figure 4 is an ELISA assay of recombinant H-Factor produced in HEK 293F cells in batch mode for 7 days.
  • Figure 5 is an ELISA assay of recombinant Factor H produced in PER.C6® stable pools in batch mode for 7 days.
  • Figure 6A is Analysis of recombinant Factor H produced in the supernatant of PER.C6® and HEK 293F cells by SDS-PAGE
  • Figure 6B is Analysis of recombinant Factor H produced in the supernatant of PER.C6® and HEK 293F cells by Western Blot.
  • FIG. 6C illustrates the comparison of the electrophoretic profile of the purified recombinant human H factor produced in the PERC6 and HEK cells with that of the purified plasma human factor (LFB batch) in SDS-PAGE and Coomassie blue staining after treatment with a reducing agent or not (DTT).
  • Figure 6D illustrates the analysis of purified recombinant human H-factor produced in PERC6 and HEK cells and purified human plasma H-factor (LFB lot) by Western Blot using a polyclonal anti-factor H antibody (The Binding Site , ref: PC030).
  • Figure 7A stands for Purification of H-Factor on Heparin column followed by a diafiltration step.
  • Figure 7B illustrates the SDS-PAGE and Coomassie-blue staining analysis of the one-step chromogenic cation exchange (SP-Sepharose) purification steps of recombinant human H-factor produced in PERC6 cells.
  • Figure 7C illustrates the SDS-PAGE and Coomassie blue staining analysis of the two-step purification steps of ion exchange chromatography (SP-sepharose and then Q-sepharose) of recombinant human H-factor produced in HEK cells.
  • Figure 8A means Determination of the acceleration activity of C3 convertase dissociation in the presence of supernatant (Sn) of PER.C6® and HEK 293F cells containing recombinant human factor H (variant Y402 or H402 variant).
  • Figure 8B describes Determination of C3 convertase deletion acceleration activity of purified recombinant human Factor H produced in PER.C6® and HEK 293F cells and plasma human factor H.
  • Figure 9A and 9B illustrate the analysis of the purified recombinant human H-factor produced in PERC6 and HEK cells by molecular sieving.
  • 95 ⁇ g of the purified recombinant human H factor produced in PERC6 (FIG. 9A) and 50 ⁇ g of the purified recombinant human H factor produced in HEK (FIG. 9B) were separately injected on a gel filtration column (GE Healthcare, Superdex 200 10 / 300 GL, ref: 17-5175-01).
  • a majority peak (99% and 97% respectively for PERC6 and HEK) with a size of 377-378 kDa corresponding to human factor H is observed.
  • Figure 10 A and 10B illustrate Pelectro capillary electrophoresis focusing of purified recombinant human H-factor produced in PERC6 cells ( Figure 10A) and HEK cells ( Figure 10B).
  • Figure 11A and 11B illustrate the analysis of the purified recombinant human H-factor produced in PERC6 and HEK cells by SDS gel electrophoresis under non-reducing conditions ( Figure 11A) or under reducing conditions ( Figure 11B).
  • Figures 12A, 12B, 12C and 12D illustrate the analysis of the cofactor activity of Factor I (FI) of recombinant human FHs PERC6 and HEK and formulated human plasma Factor (FH form.) Or IX PBS buffers (FH dess). 10 ⁇ g of C3b protein and 140 ⁇ g of factor I are incubated at 37 ° C. for 30 min in the presence of increasing amounts of factor H (50, 100, 250, 500 and 1000 ng). The different samples are deposited in SDS-PAGE in order to quantify the bands corresponding to the chains a 'and ⁇ of the molecule C3b as well as fragments cleaved at' 1 and a'2 of the chain '.
  • FI cofactor activity of Factor I
  • FH form. recombinant human FHs PERC6 and HEK and formulated human plasma Factor
  • IX PBS buffers FH dess
  • FIG. 13 shows the dose-response curve of inhibition of lysis of sheep red blood cells by the Human plasma factor H (PB03 or LP03) or recombinant (PERC6 or HEK).
  • Sequence optimization was done by the synthetic gene provider algorithm with optimization for Homo sapiens avoiding the restriction sites necessary for molecular cloning 1.2 Transfection of the pcDNA2001neo vectors containing the Factor H sequences into the PER.C6® cells to generate stable pools.
  • Electroporation will be performed with the following vectors:
  • MD1Y means the vector comprising the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 9.
  • MD2Y means the vector comprising the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 6.
  • MD3Y means the vector comprising the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 7.
  • MD1H corresponds to the vector comprising the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 18.
  • MD2H corresponds to the vector comprising the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 15
  • MD3H corresponds to the vector comprising the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 24.
  • the cells for stable pool transfection resulting from suspension culture from suspended cells stored in cryotube in serum-free medium, are PER.C6 SF cells adapted in Permab medium (Hyclone, ThermoFisher Scientific) and with stirring. . They were cultured for 3 weeks with agitation at 125rpm.
  • the cells are suspended in past 5 E 5 hp / mL by a complete change of Permab environment.
  • the volume is adapted to the number of cuvettes planned during electroporation.
  • cell concentration and viability are determined.
  • the cells must be in an exponential growth phase and have a viability greater than 90%.
  • Permab medium (3mM L-Glutamine) is preheated to room temperature.
  • the cell culture is resuspended and a count of 1 mL is performed.
  • the concentration in cells viable divided by the starting one (6E5 cv / mL) provides the percentage recovery of viability.
  • a container at 5E5 cv / mL is inoculated by total medium change and addition of Permab (3 mM L-Glutamine) and G418 at 125 ⁇ g / mL. All of the cells are centrifuged at 300 g for 5 min before adding the selection medium.
  • the cells are passed twice a week (Monday and Friday) by complete renewal of the selection medium.
  • the volume and the container are adapted so as to obtain a concentration of 3E5 cv / mL at each passage. After 2-3 weeks the cell viability improves. When this reaches about 50%, cultures in agitated conditions can be initiated. In this case, the starting concentration is 5E5 cv / mL.
  • cryopreservation is carried out at 5E6 cv / ampoule.
  • the volume of the container used for the batch is 250 ml with an initial working volume of 30 ml. Any change in container volume automatically leads to an adaptation of the volumes and values stated in this protocol.
  • the cells are seeded at a concentration of 1 E 6 cv / ml by complete renewal of the culture medium.
  • the cells are incubated for 7 days at a temperature of 36.5 ° C. with stirring for 125 rpm without renewal or addition of medium.
  • a sample is taken every day between the 3rd and 7th day of culture in order to determine the viability, cell density and production of recombinant Factor H.
  • the cells were centrifuged at 3000g for 15 minutes. The cell pellet is removed and the cell supernatant containing the recombinant factor H is filtered in 0.22 ⁇ and then frozen at -20 ° C.
  • the HEK 293F cells are subcultured at a cell concentration of 7 E 5 vc / ml.
  • the cell density and viability of HEK 293F cells are determined on the day of transfection.
  • the culture volume corresponding to 30 E 6 cv / ml is centrifuged.
  • the supernatant is removed and the cell pellet is taken up in 28 ml of F17 culture medium (Invitrogen), transferred to a 250 ml Erlenmeyer flask and incubated at 37 ° C.
  • transfection agent Fectin or PEI
  • DNA corresponding to the vector pCEP4 containing one of the Factor H sequences are prepared in OptiMEM medium (Invitrogen) of the following way:
  • the cells are then incubated at 37 ° C. with shaking at 125 rpm.
  • Positive transfection control a vector expressing GFP (Green Fluorescent Protein) is also transfected under the same conditions. 24h post-transfection transfection efficiency is determined by fluorescence microscopy (ratio of cells expressing GFP on total number of cells).
  • HEK 293F cells are transfected under the same conditions but in the absence of an expression vector. This control makes it possible to determine the post-transfection viability and whether there is a toxicity related to the transient production of the exogenous protein (the recombinant factor H).
  • the cells are kept in culture for 7 days without adding or renewing culture medium.
  • the cell density and viability is determined daily between the 5 th and 7 th day.
  • the cells were centrifuged at 3000g for 15 minutes. The cell pellet is removed and the cell supernatant containing the recombinant factor H is filtered in 0.22 ⁇ and then frozen at -20 ° C.
  • Cell viability test Cell density and viability are determined using an automated cell culture assay (Cedex, Innovatis - Roche Applied Science). The measure of viability is based on the counting of cells having incorporated trypan blue.
  • Sample Preparation The equivalent of 1 g of protein is mixed in vol / vol with Laemli 2X buffer. The mixture is heated for 5 minutes at 95 ° C to denature the proteins.
  • the proteins are then deposited in the wells of a linear gel 10% Bis-Tris / HCl pH 6.4.
  • the migration is carried out in the presence of a MOPS buffer (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, pH 7.7).
  • MOPS buffer 50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, pH 7.7.
  • the proteins are separated at a constant voltage of 200 volts for 60 minutes.
  • the gel is washed 3 times 5 minutes with distilled water and then stained with a solution of coomassie blue overnight. The excess is removed by successive washings with distilled water. A photo of the gel is then taken using an imager.
  • the gel is transferred into a buffer containing 40 mM of 6-amino-hexanoic acid, 25 mM Tris pH 9.8.
  • the membrane is saturated overnight at 4 ° C. in a PBS buffer containing 1% BSA and 0.1% Tween20. The membrane is then washed with physiological saline containing 0.1% tween 20.
  • the factor H is revealed using an anti-factor H monoclonal antibody (MCA 508G, Serotec) at a concentration of 0 ⁇ g / ml. ml incubated at room temperature for 60 minutes, followed by a secondary anti-mouse IgG antibody coupled to peroxidase at the concentration of 80 ng / ml incubated at room temperature for 60 minutes.
  • MCA 508G anti-factor H monoclonal antibody
  • the labeled proteins are then revealed using an enzymatic chemiluminescence kit and detected using an imager equipped with a photon detector.
  • BSA Sigma - Ref .: A7030 or Jackson Immuno Research Laboratories, Ref .: 001-000-162 or a quality BSA
  • 5 - Dilution buffer PBS buffer - Tween 20 0.1% (vol / vol) - BSA 0.1% (w / vol) Buffer for the dilution of the standard, the samples to be assayed and the revealing antibody. Dissolve the saturation buffer 1 / 10th in washing buffer.
  • the samples are prediluted so as to obtain a concentration close to that of the first point of range. Then dilute 1 ⁇ 2 to 1 ⁇ 2 on 8 points.
  • HRP Conjugate Marking (HorseRadish Peroxidase) Distribute 100 ⁇ per well of the revealing antibody.
  • Enzymatic reaction Distribute 100 ⁇ per well of TMB containing the substrate at a regular time interval and away from any intense light.
  • the linear regression line of the standard curve is defined by the pairs (Log (OD at 450 nm-OD white), log of the concentration of factor H in ng / ml).
  • the result is the average of all the results obtained for the same sample in the linear zone of the line obtained for the range of the standard.
  • the recombinant human factor H produced in the PER.C6® line is purified by one-step ion exchange chromatography.
  • the recombinant human factor H produced in the HEK 293 line is purified by two-stage ion exchange chromatography.
  • the presence of the purified recombinant human H factor is revealed by SDS-PAGE gel which is stained with Coomassie blue and Western blot according to part 1.5 described above.
  • the recombinant human factor H thus purified is analyzed by molecular sieving, by electrofocusing in capillary electrophoresis or by capillary electrophoresis in SDS gel according to the methods described below.
  • recombinant human factor H 50 to 100 ⁇ g of recombinant human factor H are injected onto a Superdex 200 10/300 GL gel filtration column (GE Healthcare, ref: 17-5175-01) previously balanced in PBSIX buffer.
  • the separation is carried out at a constant rate of 0.4 ml / min on a FPLC apparatus coupled to a UV detector (GE Healthcare, Akta Prime).
  • FIGS. 9A and 9B The result of the molecular sieving analysis is illustrated by FIGS. 9A and 9B.
  • the chromatogram obtained with the purified recombinant FH produced by the HEK 293F cell line shows a major peak with a retention time of 27.88 min corresponding to the FH (Fig. 9A).
  • the chromatogram obtained with the purified recombinant FH produced by the PER.C6 cell line shows a major peak with a retention time of 27.89 min corresponding to the FH and a minor peak emerging at 21.07 min corresponding to aggregated forms. recombinant FH (Fig. 9B).
  • Determination of isoforms of recombinant FH is performed by capillary electrophoresis using the Advanced cIEF Starter Kit (Beckman Coulter, A80976) and the PA800 capillary electrophoresis apparatus with a UV detector (Beckman Coulter).
  • 10 ⁇ of each sample are then mixed with 240 mix consisting of 200 ⁇ of 3M urea, 12 ⁇ of Pharmalyte 3-10 carrier ampholytes, 20 ⁇ of cathodic stabilizer, 2 ⁇ of anodic stabilizer and 2 ⁇ of pi markers between 4.1 and 10.
  • Sample preparations are injected onto an eCAP TM capillary (Beckman Coulter, 477441) using the pre-programmed method Basic pH Gradient Separation Method met.
  • a mixture of 5 markers (from 4,1 to 10) is injected at the beginning and at the end of the analysis sequence.
  • Determination of the molecular weights of the recombinant FH is performed by capillary electrophoresis using the SDS-MW Analysis kit (Beckman Coulter, 390953) and the PA800 capillary electrophoresis apparatus with a UV detector (Beckman Coulter). 200 ⁇ g of each sample of recombinant FH to be analyzed are mixed with 150 ⁇ l of sample buffer (100 mM Tris-HCl pH 9.0, 1% SDS) and centrifuged on Centricon YM-10 (Millipore, PN 4205) at 4000 g for 10 minutes. The operation is repeated twice (addition of 150 ⁇ l of sample buffer and centrifugation at 4000 g 5 min) then the volume is completed at 100 ⁇ with sample buffer.
  • sample buffer 100 mM Tris-HCl pH 9.0, 1% SDS
  • 50 ⁇ of the sample is taken and mixed with 45 ⁇ of sample buffer, 2 ⁇ of 10 kD internal standard, 5 ⁇ l of 250 mM iodoacetamide and heated to 70 ° C. C for 10 min.
  • the remaining 50 ⁇ are mixed with 45 ⁇ sample buffer, 2 ⁇ 10 kD internal standard, 5 ⁇ 2-mercaptoethanol and heated at 70 ° C for 10 min.
  • a standard solution of molecular weight is also prepared by mixing 85 ⁇ of sample buffer, 2 ⁇ of SDS-MW size marker (10 to 225 kD) and 5 ⁇ of 2-mercaptoethano 1.
  • the samples thus prepared are analyzed by injection on a capillary 50 ⁇ ID bare-fused silica 2 using the pre-programmed method SDS MW Conditioning-PA800 plus-met.
  • the molecular weight of the samples is determined by the 32 Karat software.
  • the integration of the peaks makes it possible to calculate the percentage that each peak of the sample represents.
  • the electrophoretic profile shows the presence of a very large peak (> 95%) which corresponds to the purified human factor H whose size is 173 - 176 kDa under non-reducing conditions (FIG. 11A) and 143-148 kDa under conditions. reducers (Figure 11B).
  • Na2CO3 5.3 g in 500 ml of PPI water (for injection) 0.1 M
  • NaHCO3 4.2 g in 500 ml of 0.1 M PPI water Add 30 ml of the Na 2 CO 3 solution to 70 ml of the NaHCO 3 solution and optionally adjust the pH to 9.6. Store at 4 ° C for 2 months. Wash pads
  • This buffer serves as a base for saturation, dilution and wash buffers.
  • the H-factor ranges are made from a plasma pool (ECQ 1) and a reference batch or any sample containing factor H to be assayed.
  • the antigenic concentration Elisa or OD 280 serves as a basis for establishing the ranges by successive, non-independent dilutions.
  • the choice of the dosing method is as follows:
  • Absorbance values obtained in duplicate for each concentration in the H factor range for the reference substance, ECQ or any other sample are averaged after removal of the outliers.
  • the elimination of one point per range and concentration level is acceptable.
  • the choice of the point (s) to be eliminated makes it possible to improve the value of the correlation coefficient (R2) and the accuracy of the 95% confidence interval of TEC 50 obtained.
  • X is the logarithm of the concentration (g / ml).
  • the standard deviation of the IC50 is given for a 95% confidence interval.
  • the ⁇ . ⁇ of the range of all samples must be at least 0.35. Any lower value automatically results in the rejection of the test.
  • the average value of the IC50 of the plasma pool is 0.058 ⁇ g / ml.
  • the assay is valid with a tolerance of two standard deviations giving an average value of 0.058 ⁇ 0.030 ⁇ g / ml. Any new ECQ should be tested in parallel with the old one on at least ten assays to determine its characteristics.
  • the average IC50 of the reference substance and the confidence interval are determined after validation.
  • the value of the correlation coefficient must be at least 0.99 for each sample.
  • the co-factor activity of FH is determined in a liquid phase C3b cleavage test.
  • C3b (1 (g) and F1 (140 ng) are incubated alone or in the presence of FH (250 ng) in a volume of 100 ⁇ l in 20 mM imidazole buffer, 75 mM NaCl, pH 7.3 for 30 min. at 37 ° C.
  • the reaction is stopped by addition of Laemmli sample buffer supplemented with DTT, then the various samples are subjected to polyacrylamide gel electrophoresis as described above, after staining with Coomassie blue, the gels are scanned and analysis by the Quantity-one software to determine the relative intensities of each of the bands present in each track.
  • C3b has a molecular weight of 176 kDa and is composed of 2 chains connected by a disulfide bridge: the chain has 101 kDa and the chain ⁇ 75 kDa.
  • the chain a ' is cleaved by the factor I in 2 fragments called a'I (63 kDa) and a'2 (39 kDa), the ⁇ chain (75 kDa) remains unchanged.
  • the relative intensities are normalized with respect to the intensity of the ⁇ band present in the control C3b alone.
  • the percentage of inactivation of C3b is then calculated by the ratio between the chains cleaved ((a 'I + a'2) / 2) and the total chains a': ( ⁇ '+ (( ⁇ ' 1 + ⁇ '2) / 2)) ( Figure 12).
  • FIG. 12D shows that the recombinant FH produced by the PER.C6 and HEK 293F lines have a similar IF factor co-factor and that this activity is comparable to that of plasma human FH.
  • the vector pCDNA2001neo-MD1 comprises the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 8, which corresponds to the natural sequence of this human factor H.
  • the vector pUC57-MD1 sent by Genscript contains the synthesis gene corresponding to the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 8 (MD1, natural sequence of human factor H). Digestion of the pUC57-MD1 vector with NotI and BamHI restriction enzymes produced 2 fragments of 3000 bp and 3700 bp. These two fragments are separated by gel purification and nucleospin extraction.
  • the vector pCDNA2001-neo is digested with NotI and BamHI restriction enzymes, which produces 2 fragments of 25bp and 5533bp. After extraction with nucleospin and dephosphorylation, the 3700 bp fragment corresponding to the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 8 (MD1) is inserted into the pCDNA2001-neo digested vector.
  • the vector thus obtained is transformed into TOP 10 bacteria.
  • the insertion of the DNA fragment corresponding to MD1 is verified by Screening PCR, using primers CMV1 (SEQ ID NO: 5'-CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3 * ) and MD1-lrev (SEQ ID NO: 11 5 * - GGTAAACACTTCACAACTTCACATATAG-3 * ), which gives a band of 758bp. Screening PCR positive bacterial clones are then sequenced to verify the H factor transcription unit contained within the expression vector.
  • the vectors pCDNA2001neo-MD2 and pCDNA2001neo-MD3 respectively comprise the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, which correspond to the optimized sequence of human factor H and the optimized sequence of human factor H with the optimized signal peptide MB7.
  • the vectors pUC57-MD2 and pUC57-MD3 sent by Genscript contain the synthesis genes corresponding respectively to the nucleic acid represented by the sequence SEQ ID NO: 2 (MD2) and SEQ ID NO: 3 (MD3). They are digested with NotI and BamHI restriction enzymes, which generate 2 nucleic acid fragments of 3000 and 3700bp. For each vector, these two fragments are separated by gel purification and nucleospin extraction.
  • the vector pCDNA2001-neo is digested with the restriction enzymes NotI and BamHI, which generates 2 fragments of 25 and 5533 bp. After extraction by nucleospin and dephosphorylation, the 3700 bp fragment corresponding to the MD2 or MD3 coding sequence is inserted into the pCDNA2001-neo digested vector.
  • the vector thus obtained is transformed into TOP 10 bacteria.
  • Example 4 Generation of stable PER.C6® pools transfected with pCDNA2001neo-MD1 or pCDNA2001neo-MD2 or pCDNA2001neo-MD3. ( Figure 2).
  • the PER.C6® cells are transfected with the vector pCDNA2001neo-MD1 or the vector pCDNA2001neo-MD2 or pCDNA2001neo-MD3 to generate stable pools according to the protocol described in the part above (Example 1.2)
  • Example 5 ELISA Assay of Recombinant Factor H (Variants Y402 and H402) Produced in the Culture Supernatant of PER.C6® and HEK 293F Cells ( Figures 3, 4 and 5).
  • the culture supernatant is first diluted to l / 500th point from which a dilution series is made in 1 ⁇ 2 1 ⁇ 2 of 8 points. Each point of the range and the samples to be assayed are made in duplicate. The assay is carried out according to the protocol described in the above part (example 1.6).
  • Example 6 Characterization by SDS-PAGE and Western blot of recombinant factor H present in the culture supernatant or purified (variants Y402 and H402) (FIGS. 6A, 6B and 7).
  • a volume corresponding to 1 g of recombinant factor H is diluted to 1 ⁇ 2 in 2x Laemmli buffer, heated at 95.degree. 5 minutes and then deposited on a linear gel of 10% polyacrylamide. After migration, the gel is treated either for staining of proteins with coomassie blue or for nitrocellulose membrane transfer followed by immunolabeling (Western Blot) as described in the above (example 1.5).
  • Example 7 Determination of the acceleration activity of the dissociation of the recombinant factor H C3 convertase (variants Y402 and H402).
  • the recombinant factor H is diluted to a final concentration of 20 ⁇ g / ml. From this tube a range is achieved by the following successive dilutions: 1/2; 1/10; 1/4; 1/4; 1/4; 1/40.
  • This decreasing concentration range of factor H is added to the C3 convertase complex formed in the wells of a 96-well plate which is then incubated for 32 to 34 minutes at + 34 ° C. After several washes, the factor B remaining complexed with the immobilized C3 molecule at the bottom of the well is then assayed by an immunoenzymatic reaction of the ELISA type.
  • Factor I (FI) cofactor activity of recombinant human FH produced in the PERC6 or HEK line and that of formulated plasma FH or in PBS IX (desalted) buffers are measured according to the method described in section 1.8.2. 10 ⁇ g of C3b protein and 140 ⁇ g of factor I are incubated at 37 ° C. for 30 min in the presence of increasing amounts of factor H (50, 100, 250, 500 and 1000 ng). The different samples are deposited in SDS-PAGE in order to quantify the bands corresponding to the chains a 'and ⁇ of the molecule C3b as well as to cleaved fragments ⁇ '1 and ⁇ '2 of the chain'. The percentage of inactivated C3b molecules is then calculated by the ratio of the amount of cleaved chains to the total amount of chain.
  • This test makes it possible to measure the functional activity of the C-terminal portion of the purified human recombinant factor H during the development of therapeutic batches by evaluating its ability to protect sheep red blood cells from lysis induced by a depleted or factor-deficient serum. H functional.
  • This test is adapted from the "Sanchez-Corral" method to measure the anti-hemolytic activity of factor H present in the plasma of patients with hemolytic uremic syndrome. (P. Sanchez-Corral, C. Gonzalez-Rubio, S. Rodriguez of Cordoba and M. Lopez-Trascasa, Molecular Immunology 41 (2004) 81-84).
  • H factor depleted serum and a human plasma pool is produced in equal proportion to create the conditions for a specific lysis.
  • the addition of purified human recombinant H factor ensures the protection of sheep red blood cells (absence of cell lysis) against complement-induced lysis
  • the inhibition of lysis of sheep red cells by rCFH is dose-dependent and reaches its 100% inhibition at a dose of 4 ⁇ g. There is no difference between the 2 rCFH but an inhibitory activity substantially higher than that of plasma CFH.
  • the blank control comprises the + 50mM EDTA reaction buffer and corresponds to the spontaneous lysis of sheep red blood cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, plus particulièrement le facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou un variant possédant un pourcentage d'homologie d'au moins 99% avec la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DU FACTEUR H HUMAIN
La présente invention concerne un procédé de préparation de facteur H humain recombinant dans une lignée cellulaire humaine, avec un rendement amélioré.
Le facteur H est une protéine plasmatique présente dans le plasma humain à un taux moyen de 500 mg/L. Il est produit principalement par les cellules du foie de façon constitutive, mais également produit localement par d'autres cellules, telles que les cellules épithéliales du pigment de la rétine, les cellules endothéliales, les plaquettes ou les cellules souches mésenchymateuses.
La fonction principale du facteur H est la régulation de l'activation de la voie alterne du complément. Le facteur H est impliqué dans cette régulation par trois mécanismes: (i) la régulation de l'activité du facteur I, qui permet l'inactivation de la protéine C3b (iC3b); (ii) l'inhibition de la formation de la C3 convertase alterne par compétition avec le facteur B pour la liaison au C3b ; (iii) l'accélération de la dissociation de la C3 convertase de la voie alterne (C3bBb) (decay accélération activity).
Le facteur H peut agir soit dans la phase fluide sanguine pour maintenir un niveau bas de molécules C3 activées (C3b), soit au niveau des surfaces cellulaires présentant des polyanions, tels que des glycosaminoglycanes, le sulfate d'héparane ou l'acide sialique, pour protéger les cellules hôtes vis-à-vis de la lyse cellulaire induite par l'activation du complément.
Le gène HFl ayant 102,494 paires de bases (pb) et 23 exons (NCBI RefSeq: NG_007259.1), est localisé dans le cluster de gènes RCA (regttlator of complément activaiion) sur le locus lq32, Chrl . En raison de l'épissage alternatif, deux ARNm sont transcrits à partir du gène HFl, l'un ayant 3696 pb et codant la protéine FH et l'autre ayant 1347 pb et codant la protéine FHL-1 (FH-like 1 protein).
La protéine facteur H (FH) (1213 aa, 155 kDa) est une glycoprotéine simple chaîne, constituée de 20 domaines répétés SCR (short consensus repeats) (également appelés CCP ou SHUSHI). La protéine FHL-1 (449 acides aminés, 42 kDa) possède les 7 premiers domaines SCR plus 4 acides aminés hydrophobes en C-terminal.
Naturellement, le facteur H (FH) humain présente un polymorphisme en position 402 de sa séquence en acides- aminés, caractérisé par la substitution d'une tyrosine (Y) par une histidine (H). Cette substitution elle-même résulte d'un remplacement de nucléotide au niveau du gène HFl, où un nucléotide T est remplacé par un C. Les domaines SCR sont présents dans de nombreuses protéines, telles que des protéines de la famille du FH (FHRl, FHR2, FHR3, FHR4), des protéines de la famille RCA (CRI, CR2, C4BP, CD55, CD46) ou des protéines de pathogènes (vaccinia virus,...)
Un domaine SCR est composé d'environ 60 acides aminés séparés par une courte séquence linker (3 - 8 acides aminés pour le FH humain). Les domaines SCR sont constitués principalement de brins beta et possèdent chacun deux ponts S-S répartis à chaque extrémité du domaine. Les analyses d'homologie de séquences montrent que 4 cystéines conservées sont impliquées dans la formation de deux ponts S-S intra-domaine et qu'un tryptophane (W) dans le domaine SCR est hautement conservé.
En raison du fort intérêt thérapeutique pharmacologique, de nombreuses études ont été effectuées dans les différents systèmes de production in vitro de protéine dans le but d'améliorer la productivité de facteur H humain recombinant Le facteur H humain recombinant a été produit dans le système de baculovirus (Sharma et Pangburn, Gene 1994, June 10 : 143 (2) : 301-2) et dans les cellules COS (Sanchez-Corral et al, Am. J. Hum. Genêt., 71 : 1285-1295, 2002). Plus récemment, le facteur H humain recombinant a été produit dans la mousse physcomitrella en photobioréacteur (Buttner-Mainik et al, Plant biotechnol. J.
2010 Aug 17) ainsi que dans la levure Pichia pastoris (Schmidt CQ et al, Protein Expr. Purif.
2011 Apr. 76(2) 254-63).
Malgré ces nombreux efforts, à ce jour, la productivité atteinte pour du facteur H humain recombinant n'est toujours pas satisfaisante pour un usage thérapeutique chez l'homme. Par conséquent, il existe toujours un grand besoin de développer une méthode de production de haute performance pour du facteur H humain.
L'un des buts de la présente invention est de proposer l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la production de facteur H humain recombinant.
L'un des autres buts de la présente invention est de mettre à disposition un procédé de préparation de facteur H humain recombinant.
La présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou une séquence ayant au moins 99%, notamment 99,4%, notamment 99,7% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1.
Une protéine représentée par une telle séquence peut être le variant Y402 ou le variant H402 du facteur H humain ou un autre variant de facteur H humain, tel qu'un variant mentionné dans le site internet htt ://wwvv.unipi t.org/'uniprot/P08603.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
Le facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 correspond au variant Y402, dans lequel l'acide aminé en position 402 est une tyrosine.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 13, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
Le facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 13 correspond au variant H402, dans lequel l'acide aminé en position 402 est une histidine.
Cette lignée cellulaire peut être une lignée ne produisant pas de facteur H, une lignée produisant du facteur H en une quantité non détectable, ou une lignée produisant du facteur H endogène.
La quantité de facteur H endogène produite par une lignée cellulaire est déterminée par la méthode ELISA avec un couple d'anticorps judicieusement choisi qui permet de détecter des concentrations minimales de 5 ng/ml de Facteur H dans le surnageant cellulaire. Des kits commerciaux de dosage sont également disponibles (ex : Kit HK342 Hycult).
Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine produisant du facteur H endogène, pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
Par « une lignée produisant du facteur H », on entend une lignée cellulaire pour laquelle il est possible de détecter la présence de facteur H endogène dans le surnageant cellulaire par les méthodes classiques de détection de protéines tel que l'ELISA et le Western Blot. Certaines lignées cellulaires humaines, telles que la lignée cellulaire PER.C6® ou la ligne HEK 293F, produisent du facteur H humain par voie endogène. Cependant, la productivité de facteur H endogène par ces cellules est relativement faible ; elle est d'environ 70 μg/L pour la lignée cellulaire PER.C6®, au bout de 48H de culture, et d'environ 11 μg/L de facteur H sécrété dans le milieu de culture pour la lignée cellulaire HEK 293F après 7 jours de culture.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine, avec un rendement supérieur à 10 mg/L, particulièrement supérieur à 20 mg/L, ou à 30 mg/L, ou à 40 mg/L, ou à 50 mg/L, plus particulièrement supérieur à 60 mg/L, ou à 70 mg/L, ou à 80 mg/L, ou à 90 mg/L, notamment à 100 mg/L de milieu de culture.
Lorsque le mode de production utilisé pour produire du facteur H recombinant est un des modes suivants : « batch », « Fedbatch » ou «culture avec filtration-rétention» ou un mode qui dérive de l'un de ces 3 modes de production, on entend par « rendement » la quantité de facteur H recombinant produit par volume de milieu de culture final qui va être traité en postproduction (nommé également Downstream Process ou DSP).
Lorsque le mode de production utilisé pour produire du Facteur H recombinant est un mode «culture continu en perfusion » ou qui dérive de ce mode de production, on entend par « rendement » la quantité de facteur H produit par volume de milieu de culture contenue initialement dans l'enceinte de production.
Le mode de production « batch » est caractérisé par un volume constant. L'inoculum est ajouté au milieu et on laisse se dérouler la culture. La biomasse évolue selon la courbe de croissance caractéristique de la lignée utilisée pour la production. On intervient sur la vitesse de rotation, sur l'aération (02 et C02) ou encore l'ajustement du pH, mais aucun milieu nutritif n'est ajouté en cours de culture et rien n'est retiré.
A titre d'exemple illustratif, une quantité finale de protéines recombinantes de 10 mg produit dans un milieu de culture de volume final d'un litre, qui est identique au volume initial, correspond à un rendement de production de 10 mg/L,
Le mode de production « Fedbatch » (culture dite alimentée) est caractérisé par un volume variable. La production se fait dans un premier temps sous forme d'un batch normal dans un volume donné. Du milieu frais est ensuite ajouté pour maintenir les cellules dans l'état souhaité (viabilité cellulaire stable, phase exponentielle, phase stationnaire). Il est possible d'adapter le « feed » pour ne jamais dépasser les valeurs limites souhaitées (exemple : concentration de glucose < 4 g/L).
La stratégie de « feed » dépend de la lignée utilisée pour la production. En phase exponentielle, la biomasse s'accumule rapidement, permettant d'accumuler également du produit très rapidement dans un volume réduit. En phase stationnaire la biomasse est maintenue constante permettant une accumulation progressive de produit dans un volume réduit.
A titre d'exemple illustratif, une quantité finale de 30 mg de facteur H recombinant produit dans 1,5 litre de volume final de milieu de culture, qui est initialement un litre, correspond à un rendement de production de 20 mg/L.
Le mode de production « culture avec fïltration-rétention » (connu aussi sous le terme de XD process) est caractérisé par un accroissement de la biomasse dans un volume constant. C'est un mode mixte en les modes batch et fed-batch pour lequel l'ajout du milieu frais est compensé par le retrait d'un volume équivalent de surnageant sans le Facteur H recombinant qui va être retenu par l'intermédiaire d'une membrane de fîltration dont le seuil de coupure est inférieur à la taille de la protéine recombinante. Le surnageant retiré est éliminé. Le volume reste ainsi constant alors que la biomasse s'accumule rapidement permettant d'accumuler également du Facteur H recombinant.
A titre d'exemple illustratif, une quantité finale de 60 mg du facteur H recombinant produit dans un litre de volume final de milieu de culture, qui est identique au volume initial de milieu de culture, correspond à un rendement de production de 60 mg/L.
Le mode de production « culture avec perfusion » est caractérisé par un volume et une biomasse constants. Comme pour le mode fïltration-rétention, l'ajout du milieu frais est compensé par le retrait d'un volume équivalent de surnageant mais dans ce mode de production le surnageant retiré contient le Facteur H recombinant et est donc conservé ce qui conduit à un volume final à traiter en DSP supérieur au volume initial sans accumulation de la protéine d'intérêt.
A titre d'exemple, une quantité finale de 90 mg du facteur H recombinant produit dans 10 litres de volume final de milieu de culture, qui est initialement un litre, correspond à un rendement de production de 90 mg/L. Avantageusement, les acides nucléiques codant respectivement le facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 13, ont fait l'objet d'une optimisation de codons.
La présente invention est basée sur la constatation inattendue faite par les Inventeurs que l'optimisation de codons de facteur H humain permet d'augmenter la productivité de facteur H humain recombinant dans plusieurs lignées cellulaires humaines.
L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés à pour avantage majeur d'accroître la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007). L'optimisation de séquence joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourrait ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de séquence a également un impact sur le pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à leur potentiel d'être traduit (Chechetkin, J. of theoretical biology 242, 2006 922-934).
L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence.
Dans un mode de réalisation plus avantageux, l'acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par :
(i) la séquence ID NO : 2,
(ii) une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques peut être calculé selon la formule suivante :
le nombre des résidus identiques x 100
le nombre des résidus de la séquence la plus courte
La séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%>, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2 est une séquence obtenue par l'optimisation de codons à partir de la séquence d'acide nucléique naturel codant le facteur H humain.
L'acide nucléique naturel codant le variant Y402 du facteur H humain est représenté par la séquence SEQ ID NO : 8.
L'acide nucléique naturel codant le variant H402 du facteur H humain est représenté par la séquence SEQ ID NO : 17.
Dans un autre mode de réalisation plus avantageux, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain comprenant en outre un acide nucléique est choisi parmi :
- un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et codant le peptide signal naturel du facteur H, ou
- un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et codant le peptide signal du facteur H, (PS naturel optimisé) ou
- un acide nucléique codant un peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H, ou
- un acide nucléique codant le peptide signal codé par la séquence SEQ ID NO : 4 (PCT/FR2011/050544) ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4.
Le peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H humain peut être un peptide signal choisi parmi les peptides signaux de toutes les protéines qui sont sécrétées chez les eucaryotes et notamment chez les mammifères et plus particulièrement chez l'homme comme ceux des immunoglobulines, de facteurs de croissance comme ΓΕΡΟ, des hormones comme l'insuline, d'enzymes comme le trypsinogène, de facteurs de la coagulation tel que la prothrombine.
La séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3 est une séquence obtenue par l'optimisation de codons à partir de la séquence SEQ ID NO : 5.
L'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4 code un peptide signal artificiel.
La présence d'un peptide signal permet de conférer une meilleure sécrétion de protéine recombinante dans le milieu de culture. Dans un mode de réalisation, l'ensemble de l'acide nucléique codant le précurseur de facteur H humain, comprenant l'acide nucléique codant le peptide signal et l'acide nucléique codant le facteur H humain, fait l'objet de l'optimisation de codons.
Dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par :
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et
- un acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1.
Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2.
Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6.
La séquence SEQ ID NO: 6 correspond à une optimisation de codons du précurseur du facteur H humain qui comprend son peptide signal naturel.
Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par :
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et
- un acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 13, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 14,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 13.
Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 14.
Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 15 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15.
Dans un autre mode de réalisation, un acide nucléique codant un précurseur de facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par :
- un acide nucléique codant le facteur H humain et ayant fait l'objet de l'optimisation de codons, et
- un acide nucléique codant un peptide signal artificiel, qui ne correspond pas au peptide signal naturel de facteur H humain, mais peut conférer une capacité de sécrétion meilleure ou similaire à celle du peptide signal naturel du facteur H humain.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1.
Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2. Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%>, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7.
Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par :
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
- un acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 13, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 14,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 13.
Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 14.
Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 24 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 24.
Un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain comprenant ou constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 8 peut être utilisé comme un contrôle de la productivité d'un acide nucléique optimisé codant le variant Y402 tel que décrit dans la présente invention. Plus particulièrement, cet acide nucléique de contrôle peut être l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 9.
Un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain comprenant ou constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 17, peut être utilisé comme un contrôle pour un acide nucléique optimisé codant le variant H402 tel que décrit dans la présente invention.
Plus particulièrement, cet acide nucléique de contrôle peut être l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 18.
Dans un mode de réalisation avantageux de la présente invention, le facteur H humain tel que défini ci-dessus est produit dans la lignée cellulaire PER.C6® ou la lignée cellulaire HEK 293F.
La lignée cellulaire PER.C6® est issue de cellules rétinales primaires humaines dans lesquelles un fragment d'ADN adénoviral Ad5 qui contient à la fois le gène El A et le gène E1B est inséré dans les cellules par un vecteur. Ce fragment d'ADN adénoviral permet de conférer l'immortalité aux cellules dans lesquelles il est inséré, par l'intermédiaire de la protéine E1B qui inhibe la p53. La protéine El A quand à elle a un tropisme pour le promoteur viral hCMV et permet sa transactivation et la potentialisation de la séquence génique qui sera insérée en 3' de ce dernier et qui pourra être le Facteur H.
La lignée cellulaire PER.C6® produit, par voie endogène, à la fois le variant H402 du facteur H humain et le variant Y402.
La présente invention concerne particulièrement l'utilisation de la lignée cellulaire PER.C6® pour la mise œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation de la lignée cellulaire PER.C6® pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6, 7 ou 9.
La présente invention concerne aussi particulièrement l'utilisation de la lignée cellulaire HEK 293F pour la mise œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
La lignée cellulaire HEK 293F produit par voie endogène uniquement le variant Y402 de facteur H humain.
Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation de la lignée cellulaire HEK 293F pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou 7.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine, telle que la lignée cellulaire PER.C6® ou HEK 293F pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est un acide nucléique génomique comprenant des introns artificiels ou naturels de facteur H humain ou d'un autre gène humain et des exons naturels de facteur H humain.
La présente invention concerne également l'acide nucléique codant un facteur H humain recombinant, tel que le variant Y402 du facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 ou le facteur H variant H402 représenté par la séquence SEQ ID NO : 13.
Les SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 13 ne contiennent pas la séquence correspondant à celle du peptide signal du Facteur H.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique codant le facteur H humain recombinant ayant la séquence SEQ ID NO : 1, comprenant un acide nucléique représenté par :
(i) la séquence SEQ ID NO : 2, ou
(ii) une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1, comprenant ou constitué par:
un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%>, notamment 90%o, particulièrement 95%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1, comprenant ou constitué par:
un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 13, comprenant ou constitué par:
un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et
un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 14.
Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 13 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 15 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%>, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 13, comprenant ou constitué par:
un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 14.
Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 24 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 24.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 16 est constituée de la SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 19.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 21 est constituée de la SEQ ID NO : 4 et de la SEQ ID NO : 20.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 22 est constituée de la SEQ ID NO : 3 et de la SEQ ID NO : 20.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 23 est constituée de la SEQ ID NO : 3 et de la SEQ ID NO : 19.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 19 correspond à la séquence FH 402H optimisé 2.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 20 correspond à la séquence FH 402Y optimisé 2.
La présente invention concerne aussi un vecteur d'expression comprenant ou constitué par un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet des cellules humaines, notamment transformées, produisant du facteur H recombinant humain avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par lesdites cellules. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne des cellules humaines ayant un rendement supérieur à 10 mg/L, particulièrement à 30 mg/L, plus particulièrement à 50 mg/L, notamment à 100 mg/L de milieu de culture.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne des cellules humaines transformées par un vecteur tel que défini ci-dessus.
Dans un mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne des cellules humaines produisant du facteur H recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par lesdites cellules.
Dans un mode de réalisation encore plus particulier, des cellules humaines de l'invention sont choisies parmi PER.C6® et HEK 293F.
Dans un mode de réalisation particulier, les cellules humaines de l'invention forment un clone cellulaire.
La présente invention concerne aussi un procédé de la préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans une lignée cellulaire humaine avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire, ledit procédé comprenant l'étape de culture de ladite lignée cellulaire transformée par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain.
Le vecteur comprenant un tel acide nucléique peut être un quelconque vecteur d'expression pour les lignées cellulaires eucaryotes connues de l'homme du métier.
La transformation de la lignée cellulaire peut être mise en œuvre par des techniques d'électroporation, de nucléofection type AMAXA, un "pistolet à gène" (gène gun) ou encore à l'aide d'un agent de transfection connu de l'homme de métier, tel que des agents cationiques des liposomes ou des polymères tel que la fectine ou l'agent PEI.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes :
(i) la transformation d'une lignée cellulaire par un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, pour obtenir une lignée cellulaire transformée,
(ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée, pour obtenir l'expression du facteur H dans le milieu de culture. Ledit vecteur d'expression peut contenir un gène de résistance aux antibiotiques pour permettre la sélection des cellules transfectées lors de l'établissement de cellules produisant de façon stable la protéine d'intérêt.
Dans un mode de réalisation plus particulier, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes :
(i) la transformation d'une lignée cellulaire, par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur de la protéine facteur H humain, pour obtenir une lignée cellulaire transformée,
(ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée pour obtenir l'expression de facteur H dans le milieu de culture,
(iii) la purification du facteur H humain à partir du milieu de culture, et
(iv) éventuellement la séparation de la forme endogène et de la forme recombinante du facteur H purifié à l'étape (iii).
La purification du facteur H humain est mise en œuvre par des techniques de chromatographie en une, deux ou plusieurs étapes. La purification en une étape peut-être une colonne échangeuse d'ions ou une colonne d'affinité (héparine, ligand du facteur H ou anticorps anti-facteur H). La purification en deux étapes peut-être une étape de chromatographie sur colonne échangeuse de cations suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'anions ou une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'anions suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse de cations ou une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions suivi d'une étape de chromatographie sur colonne d'affinité ou une étape de de chromatographie sur colonne d'affinité suivi d'une une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions. La purification en plus de deux étapes peut-être réalisé par une combinaison de ces différentes chromatographies. Une étape de diafîltration, d'ultrafîltration ou de gel filtration peut-être réalisée en complément. La pureté d'un produit après une telle purification peut atteindre 99% de produit purifié.
Plus particulièrement, le vecteur pour la transformation de la lignée cellulaire comprend un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique comprenant :
(i) un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 et une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%>, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et - un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant au moins 75 %, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2,
ou
(ii) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 et une séquence ayant au moins 85%>, notamment 90%>, particulièrement 95%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant au moins 75%>, de préférence au moins 85%>, notamment 90%>, particulièrement 95%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
Dans un mode de réalisation avantageux, le vecteur pour la transformation de la lignée cellulaire comprend un acide nucléique, qui comprend :
(i) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, ou
(ii) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2.
Dans un mode de réalisation plus avantageux, le vecteur pour la transformation de la lignée cellulaire comprend un acide nucléique, qui comprend :
(i) l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 6, ou
(ii) l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 7.
La lignée cellulaire utilisée dans le procédé selon la présente invention peut être la lignée cellulaire PER.C6® ou HEK 293F.
La présente invention a également pour objectif de fournir un facteur H recombinant possédant une pureté supérieure à 90%> de préférence supérieure à 95%>.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit facteur H humain recombinant conserve l'activité biologique d'un facteur H humain plasmatique. L'activité biologique du facteur H humain plasmatique comprend la régulation de l'activité du facteur I, l'inhibition de la formation de la C3 convertase alterne et l'accélération de la dissociation de la C3 convertase.
Les méthodes pour déterminer les activités biologiques ci-dessus sont connues de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit facteur H humain recombinant conserve l'activité biologique d'un facteur H humain plasmatique pour accélérer la dissociation de la C3 convertase.
La quantité de C3 convertase dissociée peut être déterminée en fonction de la concentration de FH ajouté. L'IC50 est déterminée à partir de l'équation calculée pour une sigmoïde à pente variable.
Dans un autre mode de réalisation plus particulier, ledit facteur H humain recombinant conserve l'activité biologique d'un facteur H plasmatique pour réguler l'activité du facteur I.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant uniquement un variant de facteur H humain recombinant en tant que substance active, ledit variant étant un variant mentionné dans le site internet http ://www.uniprot.org/uniprot/ P08603.
Particulièrement, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant uniquement le variant Y402 de facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , sans le variant H402 de facteur H humain.
Le variant Y402 de facteur H humain recombinant peut être produit par la lignée cellulaire HEK 293F qui produit par voie endogène uniquement le variant Y402.
La production du variant Y402 recombinant peut être également mise en œuvre par la lignée cellulaire PER.C6® qui produit par voie endogène à la fois le variant Y402 et le variant H402, suivie par une purification ou une séparation qui permet de séparer le variant Y402 du variant H402. La lignée cellulaire PER.C6® peut également être modifiée pour ne pas produire par voie endogène le variant H402.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant uniquement le variant H402 du facteur H humain, sans le variant Y402 représenté par la séquence SEQ ID NO : 1.
Le variant H402 du facteur H humain recombinant peut être produire par la lignée cellulaire PER.C6® ou la lignée cellulaire HEK 293F. Une purification ou une séparation est nécessaire afin de séparer le variant H402 du variant Y402. Les lignées cellulaires PER.C6® et HEK 293F peuvent également être modifiées pour ne pas produire par voie endogène le variant Y402.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant le variant H402 et le variant Y402 en tant que substance active.
Une composition pharmaceutique selon la présente invention comprend également un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant plus de 99,5% d'un variant de facteur H humain et moins de 0,5% d'un autre variant de facteur H humain.
La présente invention est illustrée par les figures et les exemples ci-après. Ces figures et exemples ne visent en aucun cas la limitation de la portée de la présente invention.
Figures
Figure 1 signifie dosage de facteur H endogène dans les cellules PER.C6® et HEK
293F
Figure 2 signifie génération de pools stables PER.C6® exprimant de façon stable le facteur H recombinant (ici exemple pour le facteur H variant H402)
Figure 3 signifie cinétique de la production de facteur H recombinant (H402) dans les pools stables PER.C6® en mode batch.
Figure 4 signifie dosage par ELISA du Facteur H recombinant produit dans les cellules HEK 293F en mode batch pendant 7 jours.
Figure 5 signifie dosage par ELISA du Facteur H recombinant produit dans les pools stables PER.C6® en mode batch pendant 7 jours.
Figure 6A signifie Analyse du Facteur H recombinant produit dans le surnageant des cellules PER.C6® et HEK 293F par SDS-PAGE
Figure 6B signifie Analyse du Facteur H recombinant produit dans le surnageant des cellules PER.C6® et HEK 293F par Western Blot.
Figure 6C illustre la comparaison du profil électrophorétique du facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 et HEK avec celui du facteur humain plasmatique purifié (lot LFB) en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie après traitement ou non par un agent réducteur (DTT). Figure 6D illustre l'analyse du facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 et HEK et du facteur H humain plasmatique purifié (lot LFB) par Western Blot à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-facteur H (The Binding Site, réf : PC030).
Figure 7A signifie Purification du Facteur H sur colonne Héparine suivi d'une étape de diafîltration.
Figure 7B illustre l'analyse en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie des étapes de purification en une étape de chromato graphie échangeuse de cations (SP-sepharose) du facteur H humain recombinant produit dans par les cellules PERC6. Le surnageant de départ (piste 2), les différentes fractions obtenues au cours du procédé de purification (pistes 3-7, piste 3 : surnageant acidifié, piste 4 : fraction non retenue (FNA), piste 5 : lavage, piste 6 : eluât SPpiste 7 : eluât NaCl 2M) et le produit final (FH recombinant humain Y402) purifié, concentré et filtré (piste 8 : bande majoritaire à 120,6 kDa, 98,4%)) ont été déposés. Le produit final a également été déposé en conditions réductrices (piste 9 bande majoritaire à 143,5 kDa, 93,9%)). Les pistes 1 et 10 sont des témoins de masse.
Figure 7C illustre l'analyse en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie des étapes de purification en deux étapes de chromatographie échangeuse d'ions (SP-sepharose puis Q-sepharose) du facteur H humain recombinant produit dans par les cellules HEK. Le surnageant de départ (piste 2), les différentes fractions obtenues au cours du procédé de purification (pistes 3-7 et 10-14 : piste 3 : surnageant acidifié, piste 4 : fraction non retenue (FNA) 1ère chromatographie, piste 5 : lavage 1ère chromatographie, piste 6 : eluât 1ère chromatographie, piste 7 : eluât NaCl 2M 1ère chromatographie, piste 10 : eluât 1ère chromatographie, piste 11 : fraction non retenu (FNA) 2ème chromatographie, piste 12 : lavage 2ème chromatographie, piste 13 : éluât 2ème chromatographie, piste 14 : eluât NaCl 2M 2ème chromatographie) et le produit final (FH recombinant humain Y402) purifié, concentré et filtré (piste 15) ont été déposés. Le produit final a également été déposé en conditions réductrices (piste 16). Les pistes 1, 8, 9 et 17 sont des témoins de masse.
Figure 8A signifie Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase en présence de surnageant (Sn) des cellules PER.C6® et HEK 293F contenant du facteur H humain recombinant (variant Y402 ou variant H402).
Figure 8B décrit Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase du Facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PER.C6® et HEK 293F et du Facteur H humain plasmatique. Figure 9A et 9B illustrent l'analyse du facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 et HEK par tamisage moléculaire. 95 μg du facteur H humain recombinant purifié produit dans PERC6 (Figure 9 A) et 50 μg du facteur H humain recombinant purifié produit dans HEK (Figure 9B) ont été injectés séparément sur une colonne de gel filtration (GE Healthcare, Superdex 200 10/300 GL, réf : 17-5175-01). Un pic majoritaire (99% et 97% respectivement pour PERC6 et HEK) d'une taille de 377-378 kDa correspondant au facteur H humain est observé.
Figure 10 A et 10B illustrent Pelectro focalisation par électrophorèse capillaire du facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 (Figure 10A) et HEK (Figure 10B).
Figure 11A et 11B illustrent l'analyse du facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 et HEK par électrophorèse capillaire en gel SDS en conditions non-réductrices (Figure 11 A) ou en conditions réductrices (Figure 11B).
Figures 12 A, 12B, 12C et 12D illustrent l'analyse de l'activité cofacteur du Facteur I (FI) des FH humains recombinants PERC6 et HEK et du facteur H humain plasmatique formulé (FH form.) ou en tampons PBS IX (FH dess). 10μg de protéine C3b et 140ng de facteur I sont incubés à 37°C pendant 30min en présence de quantités croissantes de facteur H (50, 100, 250, 500 et 1000 ng). Les différents échantillons sont déposés en SDS-PAGE afin de quantifier les bandes correspondants aux chaînes a' et β de la molécule C3b ainsi qu'aux fragments clivés a' 1 et a'2 de la chaîne '. Le pourcentage de molécules C3b inactivées est ensuite calculé par le rapport entre la quantité de chaînes a' clivées et la quantité totale de chaîne '.Figure 13 montre la courbe dose-réponse de l'inhibition de la lyse des globules rouges de mouton par le facteur H humain plasmatique (PB03 ou LP03) ou recombinant (PERC6 ou HEK).
Exemples
Exemple 1: Matériels et Méthodes
1.1 Optimisation de l'acide nucléique codant le facteur H humain
L'optimisation de séquence à été faite par l'algorithme du fournisseur de gène de synthèses avec optimisation pour Homo sapiens en évitant les sites de restrictions nécessaires au clonage moléculaire 1.2 Transfection des vecteurs pcDNA2001neo contenant les séquences du Facteur H dans les cellules PER.C6® pour générer des pools stables.
La transfection en pools stables est réalisée en parallèle avec le vecteur pcDNA2001neo vide (= sans séquence de Facteur H). Les transfections en pool stables sont effectuées selon le nouveau protocole décrit ci-dessous.
L'électroporation sera effectuée avec les vecteurs suivants:
Figure imgf000023_0001
MD1Y signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 9.
MD2Y signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 6.
MD3Y signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 7.
MD1H correspond au vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 18.
MD2H correspond au vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 15
MD3H correspond au vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 24.
- Pré-culture des cellules
Les cellules pour la transfection en pool stable, issues de la culture en suspension à partir de cellules en suspension stockées en cryotube dans du milieu sans sérum, sont des cellules PER.C6 SF adaptées en milieu Permab (Hyclone, ThermoFisher Scientifïc) et sous agitation. Elles ont été cultivées durant 3 semaines sous agitation à 125rpm.
Deux jours avant électroporation, les cellules sont passées en suspension à 5E5 cv/mL par un changement complet du milieu Permab. Le volume est adapté au nombre de cuvettes planifié lors de l'électroporation. Le jour de l'électroporation, la concentration cellulaire et la viabilité sont déterminées. Les cellules doivent être en phase exponentielle de croissance et avoir une viabilité supérieure à 90%.
Avant l'électroporation, le milieu Permab (3 mM L-Glutamine) est préchauffé à température ambiante.
- Electroporation
Les étapes suivantes sont effectuées dans 6 cuvettes :
Pré-aliquoter 60 mL dans un T150 et préchauffer à 37 °C (soit 10 mL par cuvette)
Les étapes suivantes sont effectuées dans chaque cuvette :
Centrifuger 6E6 cv à 300g durant 5 minutes et jeter le surnageant
Re-suspendre les cellules en agitant le tube un dizaine de fois
Ajouter 400 de milieu Permab (3 mM L-Glutamine) à température ambiante, sans laisser les cellules plus de 15 minutes.
- Ajouter 8 μg d'ADN dans un tube Eppendorf 1,5 mL stérile
- Ajouter délicatement 400 de suspension cellulaire sur les 8 μg d'ADN
Transférer la suspension ADN/Cellules dans une cuvette d'électroporation 4mm. Vérifier l'absence de bulles au fond de la cuvette.
Après avoir transféré la cuvette dans la chambre à électroporation, appliquer le programme suivant de BioRad Gene Puiser Xcell :
Voltage (v)
Durée de la pulsation (msec)
Nombre de pulsations
Intervalle de pulsations (sec)
Cuvette (mm)
Ecarter les amas blancs flottant en surface (débris cellulaires) et prélever délicatement la suspension cellulaire à l'aide d'une pipette de 1 mL.Ajouter les cellules directement dans les 60 mL de milieu préchauffé à 37°C. Ne pas le faire au goutte à goutte afin d'éviter la formation de précipités.
Recommencer les étapes suivantes jusqu'à l'obtention des 6 cuvettes pour la génération du pool stable PER.C6®.
Sélection et génération d'un pool stable
48 heures après la transfection, l'efficacité de transfection est évaluée. La culture cellulaire est resuspendue et un comptage sur 1 mL est effectué. La concentration en cellules viables divisée par celle de départ (6E5 cv/mL) permet d'obtenir le pourcentage de recouvrement de la viabilité.
Un récipient à 5E5 cv/mL est ensemencé par changement total du milieu et ajout de Permab (3 mM L-Glutamine) et G418 à 125 μg/mL. La totalité des cellules est centrifugée à 300g pendant 5 min avant l'ajout du milieu de sélection.
Les cellules sont passées deux fois par semaine (le lundi et le vendredi) par renouvellement complet du milieu de sélection. Le volume et le contenant sont adaptés de manière à obtenir une concentration de 3E5 cv/mL à chaque passage. Après 2-3 semaines la viabilité cellulaire s'améliore. Lorsque celle-ci atteint environ 50 %, des cultures en conditions agitées peuvent être initiées. Dans ce cas, la concentration de départ est de 5E5 cv/mL. Lorsque la culture atteint plus de 85 % de viabilité, une cryoconservation est effectuée à 5E6 cv/ampoule.
Ensemencement de la culture en Batch pour production de Facteur H recombinant:
Le volume du récipient utilisé pour le Batch est de 250 ml avec un volume initial de travail de 30 ml. Tout changement de volume de récipient entraîne automatiquement une adaptation des volumes et valeurs énoncés dans ce protocole.
Les cellules sont ensemencées à une concentration de 1E6 cv/ml par renouvellement complet du milieu de culture. Les cellules sont incubées pendant 7 jours à une température de 36.5°C en agitation 125 rpm sans renouvellement ou ajout de milieu. Un prélèvement est réalisé tous les jours entre le 3eme et 7eme jour de culture afin de déterminer la viabilité, la densité cellulaire et la production de Facteur H recombinant.
Le 7eme jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Le culot cellulaire est éliminé et le surnageant cellulaire contenant le facteur H recombinant est filtré en 0.22 μιη puis congelé à -20°C.
1.3: Transfection transitoire dans les cellules HEK 293F pour production transitoire de Facteur H recombinant.
Pre-culture des cellules:
La veille de la transfection transitoire, les cellules HEK 293F sont repiquées à une concentration cellulaire de 7E5 vc/ml.
Transfection transitoire :
La densité cellulaire et la viabilité des cellules HEK 293F sont déterminées le jour de la transfection. Le volume de culture correspondant à 30E6 cv/ml est centrifugé. Le surnageant est éliminé et le culot de cellules est repris dans 28 ml de milieu de culture F17 (Invitrogen), transféré dans un erlen de 250 ml et incubé à 37 °C.
Formation du complexe agent de transfection / ADN en rapport 2: 1 : L'agent de transfection (Fectine ou PEI) et l'ADN correspondant au vecteur pCEP4 contenant une des séquences du Facteur H sont préparés dans du milieu OptiMEM (Invitrogen) de la façon suivante:
- Ajout de 3(^g dADN dans 1 ml d'OptiMEM
- Ajout de 60 μΐ de Fectine ou 60 μΐ de PEI dans 1 ml d'OptiMEM.
Ces deux préparations sont incubées séparément pendant 5 minutes à température ambiante puis la solution contenant l'agent de transfection est ajoutée délicatement à celle contenant l'ADN. Le mélange est incubé pendant 25 minutes à température ambiante avant d'être ajouté au 28 ml de cellules HEK 293F préalablement préparées.
Les cellules sont alors incubées à 37°C en agitation à 125 rpm.
Témoin positif de transfection: un vecteur exprimant la GFP (Green Fluorescent Protein) est également transfecté dans les mêmes conditions. 24h post-transfection l'efficacité de transfection est déterminée par microscopie à fluorescence (rapport nombre de cellules exprimant la GFP sur nombre total de cellules).
Témoin de croissance: des cellules HEK 293F sont transfectées dans les mêmes conditions mais en l'absence de vecteur d'expression. Ce témoin permet de déterminer la viabilité post-transfection et si il y a une toxicité lié à la production transitoire de la protéine exogène (le facteur H recombinant).
Production transitoire de facteur H:
Les cellules sont maintenues en culture durant 7 jours sans ajout ou renouvellement de milieu de culture. La densité cellulaire et la viabilité est déterminé tous les jours entre le 5eme et le 7ème jour.
Le 7eme jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Le culot cellulaire est éliminé et le surnageant cellulaire contenant le facteur H recombinant est filtré en 0.22 μιη puis congelé à -20°C.
1.4 Test de viabilité de cellules La densité cellulaire et la viabilité sont déterminées à l'aide d'un automate analyse de culture cellulaire (Cedex, Innovatis - Roche Applied Science). La mesure de la viabilité est basée sur le comptage des cellules ayant incorporées du bleu trypan.
1.5 Caractérisation du facteur H humain recombinant
SDS-PAGE:
- Préparation des échantillons: l'équivalent de ^g de protéine est mélangé en vol/vol avec du tampon Laemli 2X. Le mélange est chauffé 5 minutes à 95°C afin de dénaturer les protéines.
Les protéines sont alors déposées dans les puits d'un gel linéaire 10 % Bis-Tris /Hcl pH 6.4. La migration est réalisée en présence d'un tampon MOPS (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, pH 7.7).Les protéines sont séparées à un voltage constant de 200 volts pendant 60 minutes.
Coloration au bleu de coomassie:
Après migration, le gel est lavé 3 fois 5minutes avec de l'eau distillée puis coloré avec une solution de bleu de coomassie durant la nuit. L'excès est éliminé par des lavages successifs avec de l'eau ditsillée. Une photo du gel est alors prise à l'aide d'un imageur.
Révélation par Western Blot:
Après migration, le gel est transféré dans un tampon contenant 40mM d'acide Amino- 6-hexanoïque, Tris 25mM pH 9.8.
Sur un appareil de transfert semi-sec (TE77, Amersham Pharmacia), un sandwich est réalisé de l'anode vers la cathode de la façon suivante:
- 6 papiers whatman pré-incubés dans du tampon Tris 0.3M pH 10.4
- 3 papiers whatman pré-incubés dans du tampon Tris 25mM pH 10.4
- 1 membrane de nitrocellulose (RPN 303E, GE Healtcare) pré-incubés dans du tampon Tris 25mM pH 10.4
- le gel pré-incubé dans le tampon 40mM d'acide Amino-6-hexanoïque, Tris 25mM pH 9.8
- 9 papiers whatman pré-incubés dans le tampon 40mM d'acide Amino-6-hexanoïque, Tris 25mM pH 9.8 Le transfert est réalisé à intensité constante de 0.8mA/cm2 de membrane pendant 60 minutes.
Après transfert, la membrane est saturée sur la nuit à 4°c dans un tampon PBS contenant 1% de BSA et 0.1% de tween20. La membrane est ensuite lavée avec de l'eau physiologique contenant 0.1 % de tween 20. Le facteur H est révélé à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-facteur H (MCA 508G, Serotec) à la concentration de 0^g/ml incubé à température ambiante pendant 60 minutes, suivi d'un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la Peroxidase à la concentration de 80ng/ml incubé à température ambiante pendant 60 minutes. Les protéines marquées sont alors révélées à l'aide d'un kit enzymatique de chimiluminescence et détectées à l'aide d'un imageur équipé d'un détecteur photonique.
1.6 Dosage de facteur H humain dans le milieu de culture par ELIS A
TAMPON ET SOLUTIONS:
1- Tampon de coating : PBS
Dissoudre le contenu d'un sachet de sels pour tampon PBS, pH 7.4 (Sigma : P-3813 ou sels de qualité équivalente) dans un litre d'eau PPL
2- Anticorps de coating: Immunoglobulines de mouton anti-Facteur H humain (The Binding Site - Réf : PC030
Extemporanément, diluer l'anticorps dans le tampon de coating pour obtenir une concentration comprise entre 3,5 et 5,5 μg/ml.
3 - Tampon de saturation: Tampon PBS - BSA 1 % (p/vol)
Pour une plaque, dissoudre 0,15 g de BSA (BSA : Sigma - Réf. : A7030 ou Jackson Immuno Research Laboratories, Réf. : 001-000-162 ou une BSA de qualité
équivalente) dans 15 ml de tampon PBS.
4- Tampon de lavage: Tampon PBS - Tween 20 0,1 % (vol/vol)
Ajouter 1 ml de Tween 20 à 1 litre de PBS.
5 - Tampon de dilution: Tampon PBS - Tween 20 0,1 % (vol/vol) - BSA 0,1 % (p/vol) Tampon pour la dilution du standard, des échantillons à doser et de l'anticorps de révélation. Dissoudre le tampon de saturation au l/10ème en tampon de lavage. 6 - Solution standard: Calibrateur Facteur H humain NL (The Binding Site, Réf. : RP030
Reprendre le lyophilisât par le volume d'eau PPI indiqué par le fournisseur et attendre 30 min, puis répartir en fractions aliquotes de 20μ1 et les congeler à -70°C.
Diluer le standard au l/7000ème (pour un std à 700 mg/L), pour obtenir une solution mère de 100 ng/ml, soit :
1ère prédilution au l/70ème : 5μ1 de Std + 345μ1 de tampon de dilution,
2ème prédilution au l/100ème : 5μ1 de la 1ère prédilution + 495 μΐ de tampon de dilution.
Puis diluer de ½ en ½ dans le tampon de dilution sur 7 points,
Le blanc est réalisé avec le tampon de dilution.
7 - Echantillons
Les échantillons sont prédilués de façon à obtenir une concentration proche de celle du premier point de gamme. Puis diluer de ½ en ½ sur 8 points.
8- Anticorps monoclonal anti Facteur H: Immunoglobulines monoclonales de souris purifiées anti-Facteur H humain (SEROTEC - Réf : MCA508G .
Extemporanément diluer l'anticorps dans le tampon de dilution au l/5000eme, soit pour 1 plaque : 2 μΐ dans 10 ml de tampon de dilution.
9 - Anticorps de révélation: Immunoglobulines de chèyre anti-IgG de souris marquées à la peroxydase (Jackson Immuno Research Laboratories, Réf. : 115-035-062).
Extemporanément diluer les anticorps dans le tampon de dilution au l/10000ème (l/50ème puis l/200ème) soit pour une plaque :
l/50ème : 2 μΐ dans 98 μΐ de tampon dilution, puis l/200ème : 50 μΐ dans 10 ml de tampon dilution.
10- Solution de révélation: TMB Kit
Mélanger extemporanément volume à volume la solution de substrat de la peroxydase (3,3 ',5,5 '-tetramethylbenzidine) et la solution de peroxyde.
11- Solution d'arrêt: Acide sulfurique 4 N ou 2 M (Fisher Scientific, Ref : 0379D). MODE OPERATOIRE
Sensibilisation de la phase solide
Dans une plaque de microtitration, distribuer 100 μΐ par puits d'anticorps de coating dilué
Recouvrir d'une feuille adhésive.
Incuber une nuit à + 4° C et vider la plaque par retournement. Saturation de la phase solide
Distribuer 120 μΐ par puits de solution de saturation.
Recouvrir d'une feuille adhésive.
Incuber lh à 20° C.
Laver 3 fois en tampon de lavage. Capture de l'antigène
Distribuer 100 μΐ par puits de tampon de dilution (blanc), de chaque dilution du standard et des échantillons.
Recouvrir d'une feuille adhésive.
Incuber 1 heure 30 à 20° C.
Laver 5 fois en tampon de lavage. Reconnaissance de l'antigène par l'anticorps monoclonal
Distribuer 100 μΐ par puits de l'anticorps monoclonal.
Recouvrir d'une feuille adhésive.
Incuber 1 heure 30 à 20° C.
Laver 5 fois en tampon de lavage. Marquage par le conjugué HRP (HorseRadish Peroxidase) Distribuer 100 μΐ par puits de l'anticorps de révélation.
Recouvrir d'une feuille adhésive.
Incuber 1 heure à 20° C.
Laver 5 fois en tampon de lavage. Réaction enzymatique Distribuer 100 μΐ par puits de TMB contenant le substrat à intervalle de temps régulier et loin de toute lumière intense.
Incuber à température ambiante entre 5 - 15 minutes..
Ce temps doit être identique pour tous les points de dosage.
Arrêt de la réaction
Distribuer 100 μΐ d'H2S04 4N par puits à intervalle de temps régulier.
Lire les densités optiques (DO) à 450 nm.
EXPLOITATION DES RESULTATS
La droite de régression linéaire de la courbe standard est définie par les couples (Log (DO à 450 nm-DO blanc), Log de la concentration de Facteur H en ng/ml).
Le résultat est la moyenne de tous les résultats obtenus pour un même échantillon dans la zone linéaire de la droite obtenu pour la gamme du standard.
1.7 Caractérisation du facteur H humain recombinant purifié
Le facteur H humain recombinant produit dans la lignée PER.C6® est purifié par chromatographie échangeuse d'ions en une étape.
Le facteur H humain recombinant produit dans la lignée HEK 293 est purifié par chromatographie échangeuse d'ions en deux étapes.
Les résultats de l'analyse en SDS-PAGE des étapes de purification du Facteur H recombinant produit par les cellules PER.C6® ou HEK 293 sont illustrés aux figures 7B et 7C.
La présence du facteur H humain recombinant purifié est révélée par gel SDS-PAGE qui est coloré par bleu de Coomassie et par Western blot selon la partie 1.5 décrite ci-dessus.
Les résultats de l'analyse du FH humain recombinant purifié par SDS-PAGE ou par Western-blot sont illustrés respectivement par les figures 6C et 6D.
Le facteur H humain recombinant ainsi purifié est analysé par tamisage moléculaire, par électrofocalisation en électrophorèse capillaire ou par électrophorèse capillaire en gel SDS selon les méthodes décrites ci-après.
Tamisage moléculaire
1.Mode opératoire
50 à 100 μg de facteur H humain recombinant sont injectés sur une colonne de gel filtration Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare, réf : 17-5175-01) préalablement équilibrée en tampon PBSIX. La séparation est réalisée un débit constant de 0,4ml/min sur un appareil FPLC couplé à un détecteur UV (GE Healthcare, Akta Prime).
Le résultat de l'analyse par tamisage moléculaire est illustré par les figures 9 A et 9B.
2. Résultats
Le chromatogramme obtenu avec le FH recombinant purifié produit par la lignée cellulaire HEK 293F présente un pic majeur ayant un temps de rétention de 27,88 min qui correspond au FH (Fig. 9A)
Le chromatogramme obtenu avec le FH recombinant purifié produit par la lignée cellulaire PER.C6 présente un pic majeur ayant un temps de rétention de 27, 89 min qui correspond au FH et un pic mineur qui sort à 21,07 min correspondant à des formes agrégées du FH recombinant (Fig. 9B).
Electrofocalisation en électrophorèse capillaire
1 mode opératoire
La détermination des iso formes des FH recombinants est réalisée par électrophorèse capillaire en utilisant le kit Advanced cIEF Starter kit (Beckman Coulter, A80976) et l'appareil d' électrophorèse capillaire PA800 avec un détecteur UV (Beckman Coulter).
75 μg de chaque échantillon de FH recombinant à analyser sont dessalés par centrifugation sur Zeba Desalt Spin columns (Pierce), séchés au Speedvac à température ambiante puis repris par un volume d'eau ultra-pure de sorte à obtenir une concentration en protéine de 5 à 10 mg/ml.
10 μΐ chaque échantillon sont ensuite mélangés avec 240 de mix constitué de 200 μΐ d'urée 3M, 12 μΐ de Pharmalyte 3-10 carrier ampholytes, 20 μΐ de stabiliseur cathodique, 2 μΐ de stabiliseur anodique et 2 μΐ de marqueurs de pi compris entre 4,1 et 10.
Les préparations d'échantillons sont injectés sur un capillaire eCAP™ (Beckman Coulter, 477441) en utilisant la méthode pré-programmée Basic pH Gradient Séparation Method met. Afin de vérifier la linéarité de la migration en fonction des pi, un mélange de 5 marqueurs (de pi 4,1 à 10) est injecté en début et en fin de séquence d'analyse.
2 Analyse des résultats et calcul des pl
Après intégration des pics de l'électrophérogramme le logiciel 32 Karat calcule automatiquement les valeurs de pl de l'échantillon. Le résultat est illustré aux figures 10A et 10B. L'analyse montre la présence de plusieurs iso formes dont le pi expérimental varie faiblement (entre 5.53 et 6.01 et entre 5.86 et 6.13 pour PERC6 et HEK respectivement) avec des valeurs proche du pi théorique du FH humain qui est de 6.12 (voir le tableau ci-après).
Figure imgf000033_0001
Electrophorèse capillaire en gel SDS :
1. Mode opératoire :
La détermination des masses moléculaires des FH recombinants est réalisée par électrophorèse capillaire en utilisant le SDS-MW Analysis kit (Beckman Coulter, 390953) et l'appareil d' électrophorèse capillaire PA800 avec un détecteur UV (Beckman Coulter). 200 μg de chaque échantillon de FH recombinant à analyser sont mélanger avec 150 μΐ de tampon échantillon (100 mM Tris-HCl pH 9,0, 1% SDS) et centrifugé sur Centricon YM- 10 (Millipore, PN 4205) à 4000 g pendant 10 min. L'opération est répétée 2 fois (ajout de 150 μΐ de tampon échantillon et centrifugation à 4000 g 5 min) puis le volume est compléter à 100 μΐ par du tampon échantillon.
Pour l'analyse en conditions non-réduites, 50 μΐ de l'échantillon sont prélevés et mélangés avec 45 μΐ de tampon échantillon, 2 μΐ de standard interne 10 kD, 5 μΐ d'iodo-acétamide à 250 mM et chauffer à 70°C pendant 10 min. Pour l'analyse en conditions réduites, les 50 μΐ restants sont mélangés avec 45 μΐ de tampon échantillon, 2 μΐ de standard interne 10 kD, 5 μΐ de 2-mercaptoéthanol et chauffés à 70°C pendant 10 min.
Une solution se standard de poids moléculaire est également préparée en mélangeant 85 μΐ de tampon échantillon, 2 μΐ de SDS-MW marqueur de taille (10 à 225 kD) et 5 μΐ de 2- mercaptoéthano 1. Les échantillons ainsi préparés sont analysés par injection sur un capillaire 50 μηι I.D. bare-fused silica 2 en utilisant la méthode pré-programmée SDS MW Conditioning- PA800 plus-met.
A partir de la courbe de calibration standard, le poids moléculaire des échantillons est déterminé par le logiciel 32 Karat. L'intégration des pics permet de calculer le pourcentage que représente chaque pic de l'échantillon.
2. Analyse des résultats :
A partir de la courbe de calibration du standard, le poids moléculaire des échantillons est déterminé à l'aide du logiciel 32 Karat. L'intégration des pics de permet de calculer les proportions de chaque pic de l'échantillon. Le résultat est illustré aux figures 11 A et 11B et le tableau ci-après.
Le profil électrophorétique montre la présence d'un pic très majoritaire (>95%) qui correspond au facteur H humain purifié et dont la taille est de 173 - 176 kDa en conditions non réductrices (Figure 11A) et de 143-148 kDa en conditions réductrices (Figure 11B).
HEK PER.C6
Conditions pM
16 29 66 173 48 176 non (kDa)
réductrices Aire% 0,5 0,6 1,2 97,7 0,3 99,7 pM
Conditions 16 36 66 145 46 143
(kDa)
réductrices
Aire% 0,8 0,6 1,0 95,6 1,3 98,7
1.8 Caractérisation de l'activité biologique du facteur H humain recombinant
1.8.1 Activité anti-C3 convertase (C3 convertase Decav-accelerating activitv) TAMPONS ET SOLUTIONS
Tampon de recouvrement
Tampon carbonate 0.1M - pH 9.6
Na2C03 : 5.3 g dans 500 ml d'eau PPI (pour préparations injectables) 0.1 M
NaHC03 : 4.2 g dans 500 ml d'eau PPI 0.1 M Ajouter 30 ml de la solution Na2C03 à 70 ml de la solution NaHC03 et ajuster éventuellement le pH à 9.6. Conserver à 4° C pendant 2 mois. Tampons de lavage
a) Tampon PBS pH 7.4 (Sigma) + Tween 20 0.1 % (= Tampon A)
Dissoudre 0.1 ml de Tween 20 dans 100 ml de tampon PBS pH 7.4.
Conserver à + 4° C (2 jours maximum).
b) Tampon phosphate de Sodium 10 mM , NaCl 25 mM , pH 7.2 ± 0.05 (= Tampon B) Dissoudre dans un litre d'eau PPI : 1.56 g de NaH2P04, 2H20.
Dissoudre dans un litre d'eau PPI : 3.58 g de Na2HP04,12 H20.
Ajouter environ 66 ml de la solution de Na2HP04 à 34 ml de la solution de NaH2P04. Ajuster le pH à 7.30. Ajouter le NaCl nécessaire pour obtenir une concentration finale à 25 mM. Ce tampon peut être conservé à 4°C pendant 1 mois.
Ce tampon sert de base pour les tampons de saturation, de dilution et de lavage.
Pour obtenir le tampon de lavage (= Tampon C) :
Dissoudre 0.1 ml de Tween 20 dans 100 ml du tampon B.
Conserver à + 4° C (2 jours maximum). Tampon de saturation
Préparer un volume suffisant à partir du tampon B. Ajouter 1 % de BSA (m/v).
Conservation maximum de 2 jours à + 4° C. Tampon de dilution D
Préparer le volume nécessaire avec du tampon B auquel on ajoute du Tween 20 à la concentration de 0.05 % et de la BSA à la concentration de 4 % (m/v) .
Conservation maximum de 2 jours à + 4° C. Tampon de dilution E
Préparer le tampon de dilution E à partir de PBS pH 7.4 auquel on ajoute 0.1 % de BSA (m/v).
Conservation maximum de 2 jours à + 4° C. Solution de C12 20 mM, NaCl 25 mM Peser 0.475 g de C12 qsp 100ml d'une solution de NaCl 25 mM (conservation maximum de 3 mois à + 4° C). Tampon substrat
Tampon citrate 0.1 M + H202 30%.
Tampon citrate :
Dissoudre dans un litre d'eau PPI 29 g de citrate de sodium et 4.1 g d'acide citrique.
Ajuster si besoin le pH à 5.5.
Conserver à + 4° C pendant 3 mois maximum.
Ajouter extemporanément 10 μΐ de H202 30 % à 10 ml de tampon citrate le jour de son utilisation et conserver à l'abri de la lumière. Solution d'arrêt.
Solution d'acide sulfurique 4N (2M) a préparer ou prête à l'emploi.
Préparer un litre : 100 ml H2S04 18M + 900 ml d'eau PPL
Stocker à température ambiante pendant 6 mois maximum.
MODE OPERATOIRE
Recouvrement des plaques
Diluer le C3b dans le volume nécessaire à l'essai dans le tampon de recouvrement pour avoir une concentration finale à 2.5 μg/ml (10 ml pour une plaque de 96 puits). Ex : pour le lot D28449 à 1 mg/ml, diluer 25 μΐ dans 10 ml de tampon de tampon de recouvrement.
Distribuer 100 μΐ de la solution préparée dans chaque puits.
Recouvrir la plaque d'un adhésif.
Incuber la plaque l H à l H 15 à + 34° C puis une nuit à + 4° C.
Lavages
Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3x280 μΐ de tampon de lavage C). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération.
Vider par retournement.
Saturation
Distribuer 300 μΐ de tampon de saturation par puits.
Incuber 1 H à 1 H 15 à + 34° C.
Vider par retournement.
Etape de la génération de la convertase. Préparer la solution suivante (10 ml pour une plaque de 96 puits) :
- Solution de C12 20 mM, NaCl 25 mM : 750 μΐ (concentration finale C12 : 1.5 mM)
- Facteur B Calbiochem (1 mg/ml) : 40 μΐ (concentration finale : 4 μ§/ι 1)
- Facteur D Calbiochem (0.1 mg/ml) : 30 μΐ (concentration finale : 0.3 μg/ml)
- Tampon de dilution D : 9180 μΐ.
Déposer 100 μΐ / puits et incuber 2 heures à + 34° C.
Lavages.
Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280 μΐ de tampon de lavage C). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération.
Vider par retournement.
Préparation des gammes de facteur H.
Les gammes de facteur H sont faites à partir d'un pool plasma (ECQ 1) et d'un lot de référence ou de tout échantillon contenant du facteur H à doser. La concentration antigénique Elisa ou la DO 280 sert de base à l'établissement des gammes par des dilutions successives non indépendantes. Le choix de la méthode de dosage est la suivante :
- Technique en Elisa pour le Pool Plasma et les échantillons de pureté intermédiaire.
- Mesure de la DO 280 pour le lot de référence, un PV ou un produit final réhydraté.
- Incuber 32 à 34 minutes maximum à + 34° C.
Lavages
Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280 μΐ de tampon de lavage 3.3.2 b). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération.
Vider par retournement.
Incubation de l'anticorps anti-facteur B humain
Pour 10 ml de tampon de dilution E, ajouter 5 μΐ de l'anticorps anti-facteur B humain (Calbiochem réf. 341272) puis distribuer 100 μΐ/puits (dilution au 1/2000).
Incuber l H à l H 15 à 34° C
Lavages
Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280 μΐ de tampon de lavage A). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération.
Vider par retournement.
Incubation de l'anticorps anti-IgG (H+L) de chèvre marquée à la péroxydase. Les dilutions s'effectuent avec le tampon de dilution E :
- prédilution au 1/40 (10 μΐ d'anticorps + 390 μΐ de tampon) - dilution au 1/500 (20 μΐ de la prédilution + 9980 μΐ de tampon).
Distribuer 100 μΐ/puits et incuber à température ambiante pendant 25-30 mn à l'abri de la lumière.
Lavages.
Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3x280 μΐ de tampon de lavage A). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération.
Vider par retournement.
Réaction enzymatique.
Distribuer 100 μΐ de TMB par puits avec une pipette multicanaux, à intervalle régulier. Incuber la plaque 5 à 15 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière.
Arrêt de la réaction.
Distribuer 100 μΐ de la solution d'arrêt dans chaque puits, à intervalle régulier.
Lecture.
Lire extemporanément la plaque à 450 nm sur un lecteur de microplaque après une légère agitation.
EXPLOITATION DES RESULTATS.
Elimination des points aberrants.
Les valeurs d'absorbance obtenues en double pour chaque concentration de la gamme de facteur H pour la substance de référence, l'ECQ ou pour tout autre échantillon sont moyennées après élimination des valeurs aberrantes. Par exemple, pour les valeurs en duplicate des échantillons, de la substance de référence ou de l'ECQ, on accepte l'élimination d'un point par gamme et par niveau de concentration. Le choix du ou des points à éliminer permet d'améliorer la valeur du coefficient de corrélation (R2) et la précision de l'intervalle de confiance à 95 % de TEC 50 obtenu.
Utilisation du logiciel Prism (Logi Labo).
Ce logiciel permet de déterminer la valeur de l'IC50 de chaque échantillon dans un système modélisé non linéaire (sigmoïde à pente variable). L'équation de calcul de ce modèle est la suivante :
Y : Bottom + ( Top -Bottom)/(l+10A((Log IC50-X)* Hillslope)
X est le logarithme de la concentration ^g/ml).
Y est la réponse (D.O).
Y débute à la ligne de base (Bottom) et va au sommet (Top) selon une forme sigmoïdale. Hillslope est la pente. La valeur moyenne d'absorbance de chaque dilution obtenue pour l'ECQ ou échantillon (gamme en double) est entrée dans la base de données pour chaque concentration correspondante.
L'analyse des données est agrémentée de la fonction « Runs test » qui permet d'estimer la déviation de l'essai par rapport au modèle choisi.
L'écart-type de l'IC50 est donné pour un intervalle de confiance de 95 %.
L'étude des courbes permet de visualiser l'ensemble des échantillons entre eux et de les comparer à l'ECQ.
Critères d'acceptation du dosage.
Le Δϋ.Ο de la gamme de tous les échantillons (référence et ECQ compris) doit être au minimum de 0.35. Toute valeur inférieure entraîne automatiquement le rejet de l'essai.
L'acceptation de cette condition permet ensuite de déterminer la valeur respective de leur IC50.
La valeur moyenne de l'IC50 du pool plasma est de 0.058 μg/ml.
Le dosage est valide avec une tolérance de deux écart-type ce qui donne une valeur moyenne de 0.058 ± 0.030 μg/ml. Tout nouvel ECQ doit être testé en parallèle de l'ancien sur au moins dix dosages afin d'en déterminer ses caractéristiques.
La moyenne des IC50 de la substance de référence et l'intervalle de confiance sont déterminés après la validation.
La valeur du coefficient de corrélation doit être au minimum de 0.99 pour chaque échantillon.
Le résultat pour le surnageant de culture PER.C6® ou HEK293F contenant du FH humain recombinant est illustré à la figure 8 A et le tableau ci-après.
Figure imgf000039_0001
Le résultat de l'activité du facteur H purifié est montré à la figure 8B et le tableau ci- après.
Figure imgf000040_0001
1.8.2 Activité cofacteur du Facteur I : Mode opératoire
L'activité co-facteur du FH est déterminée dans un test de clivage du C3b en phase liquide. Le C3b (l(^g) et le FI (140 ng) sont incubés seuls ou en présence de FH (250 ng) dans un volume de 100 μΐ en tampon imidazole 20 mM, NaCl 75 mM, pH 7,3 pendant 30 min à 37°C. La réaction est arrêtée par addition de tampon échantillon de Laemmli additionné de DTT puis les différents échantillons sont soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide comme décrit ci-dessus. Après coloration au bleu de Coomassie, les gels sont scannés et analyses par le logiciel Quantity-one pour déterminer les intensités relatives de chacune des bandes présentes dans chaque piste.
Tableau récapitulatif des mélanges réalisés
Figure imgf000040_0002
Résultats:
Le C3b a un poids moléculaire de 176 kDa et il est composé de 2 chaînes reliées par un pont disulfure: la chaîne a' de 101 kDa et la chaîne β de 75 kDa. La chaîne a' est clivée par le facteur I en 2 fragments appelés a'I (63 kDa) et a'2 (39 kDa), la chaîne β (75 kDa) reste inchangée.
Afin de pouvoir comparer les résultats obtenus, les intensités relatives sont normalisées par rapport à l'intensité de la bande β présente dans la piste du témoin C3b seul.
On calcule alors le pourcentage d'inactivation du C3b.par le rapport entre les chaînes a' clivées ((a' I + a'2)/2) et les chaînes a' totales : (α' + ((α' 1 + α'2)/2)) (Figure 12).
L'analyse des résultats présentés sur la figure 12D montre que les FH recombinants produits par les lignées PER.C6 et HEK 293F ont une activité co-facteur du FI similaire et que cette activité est comparable à celle du FH humain plasmatique.
Exemple 2: Construction de vecteur comprenant pCDNA2001néo-MDl
Le vecteur pCDNA2001néo-MDl comporte l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 8, qui correspond à la séquence naturelle de ce facteur H humain.
Le vecteur pUC57-MDl envoyé par Genscript contient le gène de synthèse correspondant à l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 8 (MD1, séquence naturelle du facteur H humain). La digestion du vecteur pUC57-MDl par les enzymes de restriction Notl et BamHI produit 2 fragments de 3000pb et 3700pb. Ces deux fragments sont séparés par purification sur gel et extraction nucléospin.
Le vecteur pCDNA2001-néo est digéré par les enzymes de restriction Notl et BamHI, qui produit 2 fragments de 25pb et de 5533pb. Après extraction par nucléospin et déphosphorylation, le fragment de 3700 pb correspondant à l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 8 (MD1) est inséré dans le vecteur pCDNA2001-néo digéré.
Après ligation, le vecteur ainsi obtenu est transformé dans des bactéries TOP 10.
L'insertion du fragment d'ADN correspondant à MD1 est vérifiée par PCR de Screening, en utilisant les amorces CMV1 (SEQ ID NO : 10 5'- CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3*) et MDl-lrev (SEQ ID NO : 11 5*- GGTAAACACTTCACAACTTCACATATAG-3*), qui donne une bande de 758pb. Les clones bactériens positifs en PCR de criblage sont ensuite séquencés pour vérifier l'unité de transcription du facteur H contenue au sein du vecteur d'expression.
Exemple 3: Construction des vecteurs pCDNA2001néo-MD2 et pCDNA2001néo- MD3 comprenant les séquences d'acides nucléiques du facteur H optimisé MD2 et MD3
Les vecteurs pCDNA2001néo-MD2 et pCDNA2001néo-MD3 comportent respectivement l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 2 et la SEQ ID NO: 3, qui correspondent à la séquence optimisée de facteur H humain et la séquence optimisée du facteur H humain avec le peptide signal optimisé MB7.
Les vecteurs pUC57-MD2 et pUC57-MD3 envoyés par Genscript contiennent les gènes de synthèses correspondant respectivement à l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 2 (MD2) et la SEQ ID NO: 3 (MD3). Ils sont digérés par les enzymes de restrictions Notl et BamHI, ce qui génère 2 fragments d'acide nucléique de 3000 et de 3700pb. Pour chaque vecteur, ces deux fragments sont séparés par purification sur gel et extraction nucléospin.
Le vecteur pCDNA2001-néo est digéré par les enzymes de restrictions Notl et BamHI, ce qui génère 2 fragments de 25 et de 5533pb. Après l'extraction par nucléospin et la déphosphorylation, le fragment de 3700 pb correspondant à la séquence codante MD2 ou MD3 est insérée dans le vecteur pCDNA2001-néo digéré.
Après la ligation, le vecteur ainsi obtenu est transformé dans des bactéries TOP 10.
L'insertion de fragment de MD2 ou MD3 est vérifiée par PCR de Screening, en utilisant les amorces CMV1 (SEQ ID NO : 10 5*-CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG- 3*)/MD2-lrev (SEQ ID NO : 12 5*-TGTCACACTCGCGGTAGTTG-3*), qui donne une bande de 706pb.
Exemple 4: Génération de pools stables PER.C6® transfectés par pCDNA2001néo-MDl ou pCDNA2001néo-MD2 ou pCDNA2001néo-MD3. (figure 2).
Les cellules PER.C6® sont transfectées par le vecteur pCDNA2001néo-MDl ou le vecteur pCDNA2001néo-MD2 ou pCDNA2001néo-MD3 pour générer des pools stables selon le protocole décrit dans la partie ci-dessus (Exemple 1.2)
Il n'y pas de différence significative de viabilité entre les cellules transformées par différents vecteurs.
Exemple 5: Dosage par ELIS A du Facteur H recombinant (variants Y402 et H402) produits dans le surnageant de culture des cellules PER.C6® et HEK 293F (figures 3, 4 et 5).
Le surnageant de culture est préalablement dilué au l/500eme, point à partir duquel une gamme de dilution est réalisée de ½ en ½ sur 8 points. Chaque point de la gamme et des échantillons à doser sont réalisés en duplicate. Le dosage est réalisé selon le protocole décrit dans la partie ci-dessus (exemple 1.6). Exemple 6: Caractérisation par SDS-PAGE et Western blot du facteur H recombinant présent dans le surnageant de culture ou purifié (variants Y402 et H402) (figures 6A, 6B et 7).
A partir de la concentration de facteur H recombinant déterminée par ELISA ou mesure d'absorbance à 280nm (protéine purifiée), un volume correspondant à ^g de facteur H recombinant est dilué au ½ dans du tampon Laemmli 2x, chauffé à 95°C pendant 5 minutes puis déposé sur un gel linéaire de 10% polyacrylamide. Après migration, le gel est traité soit pour une coloration des protéines au bleu de coomassie soit pour un transfert sur membrane de nitrocellulose suivi d'un immunomarquage (Western Blot) tel que décrit dans ci-dessus (exemple 1.5).
Exemple 7: Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase du facteur H recombinant (variants Y402 et H402).
A partir de la concentration de facteur H recombinant déterminée par ELISA ou mesure d'absorbance à 280nm (protéine purifiée), le facteur H recombinant est dilué à une concentration finale de 20 μg/ml. A partir de ce tube une gamme est réalisée par les dilutions successives suivantes: 1/2; 1/10; 1/4; 1/4; 1/4; 1/4; 1/40. Cette gamme de concentration décroissante de facteur H est ajouté au complexe C3 convertase formé dans les puits d'une plaque 96 puits qui est alors incubée 32 à 34 minutes à +34°C. Après plusieurs lavages, le facteur B restant complexé avec la molécule C3 immobilisée au fond du puits est alors dosé par une réaction immuno-enzymatique de type ELISA. Les valeurs d'absorbances obtenues en fonction de la concentration de facteur H ajoutée sont alors traitées tel qu'indiqué dans le protocole décrit ci-dessus (exemple 1.8). L'activité déterminée dans le surnageant d'extrait cellulaire ou après la purification est montré respectivement dans la figure 8A (surnageant) et 8B (purifié).
Exemple 8 : Détermination de l'activité cofacteur du facteur I des FH humains recombinants
L'activité cofacteur du Facteur I (FI) des FH humains recombinants produits dans la lignée PERC6 ou HEK et celle du FH plasmatique formulé ou en tampons PBS IX (dessalé) sont mesurées selon la méthode décrite dans la partie 1.8.2. 10μg de protéine C3b et 140ng de facteur I sont incubés à 37°C pendant 30min en présence de quantités croissantes de facteur H (50, 100, 250, 500 et 1000 ng). Les différents échantillons sont déposés en SDS-PAGE afin de quantifier les bandes correspondants aux chaînes a' et β de la molécule C3b ainsi qu'aux fragments clivés α' 1 et α'2 de la chaîne '. Le pourcentage de molécules C3b inactivées est ensuite calculé par le rapport entre la quantité de chaînes a' clivées et la quantité totale de chaîne '.
Les résultats sont illustrés par les figures 12A, 12B, 12C et 12D.
Exemple 9 : Test de dosage de l'activité anti-hémolytique du facteur H humain sur des globules rouges de mouton (Test Sanchez-Corral)
Ce test permet de mesurer l'activité fonctionnelle de la partie C-terminale du facteur H recombinant humain purifié lors du développement de lots thérapeutiques en évaluant sa capacité à protéger des globules rouges de mouton de la lyse induite par un sérum dépiété ou déficient en facteur H fonctionnel. Ce test est adapté de la méthode « Sanchez-Corral » permettant de mesurer l'activité anti-hémolytique du facteur H présent dans le plasma de patients atteints du syndrome hémolytique urémique. (P. Sanchez-Corral, C. Gonzàlez-Rubio, S. Rodriguez de Cordoba and M. Lopez-Trascasa. Molecular Immunology 41 (2004) 81-84).
Dans ce cadre, un mélange de sérum dépiété en facteur H et d'un pool plasma humain est réalisé en proportion égale afin de créer les conditions d'une lyse spécifique. L'ajout de facteur H recombinant humain purifié assure la protection des globules rouges de mouton (absence de lyse cellulaire) vis-à-vis d'une lyse induite par le complément
Sans CFH, la lyse spontanée des hématies est de 30%.
L'inhibition de la lyse des hématies de mouton par le rCFH est dose-dépendante et atteint son 100% d'inhibition à la dose de 4 μg. Il n'y a pas de différence entre les 2 rCFH mais une activité inhibitrice sensiblement supérieure à celle du CFH plasmatique.
A 40 μΐ d'une suspension d'hématies de mouton (lxlO8 hématies/ml) sont ajoutés successivement 20 μΐ du tampon de réaction (Hepes 10 mM, NaCl 144 mM, MgC12 7 mM, EGTA 10 mM, pH 7.2), 2 μΐ de FH ou de PBS, puis 9 μΐ d'un pool de plasma humain suivi de 9 μΐ de plasma humain dépiété en FH. Après incubation 30 min à 37°C, 400 μΐ de tampon HBS-EDTA (Hepes 10 mM, NaCl 144 mM, EDTA 2 mM, pH 7.2) froid pour arrêter la réaction. Après centrifugation 5 min à 1730 g, 200 μΐ de surnageant sont prélevés, déposés dans une plaque de microtitration afin de mesurer l'absorbance à 414 nm.
Le pourcentage de lyse est déterminé selon la formule : O^ ^rfr Tube réaction -DO^ ^rfr Tube blanc
(— ) X100 Le témoin « 100% lyse » correspond à la lyse maximale des globules rouges de mouton observée en présence d'eau.
Le témoin blanc comprend le tampon de réaction + 50mM EDTA et correspond à la lyse spontanée des globules rouges de mouton.
Le résultat de ce test est illustré au tableau ci-après et à la figure
Figure imgf000045_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
2. Utilisation d'une lignée cellulaire humaine produisant le facteur H endogène pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou un variant possédant un pourcentage d'homologie d'au moins 99% avec la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
3. Utilisation d'une lignée cellulaire selon la revendication 1 ou 2, avec un rendement supérieur à 10 mg/L, particulièrement à 30 mg/L, plus particulièrement à 50 mg/L, notamment à 100 mg/L de milieu de culture.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle les codons de facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 sont optimisés par rapport aux codons naturels de facteur H humain.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle l'acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par :
(i) la séquence SEQ ID NO : 2,
(ii) une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
6. Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend en outre un acide nucléique choisi parmi : - un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et codant le peptide signal naturel du facteur H,
- un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et codant le peptide signal du facteur H,
- un acide nucléique codant un peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H, ou
- un acide nucléique codant le peptide signal codé par la séquence SEQ ID NO : 4 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95%) d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4.
7. Utilisation selon la revendication 6, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend :
(i) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 et une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et
- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou
(ii) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1.
8. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend :
(i) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, ou
(ii) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2.
9. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par :
(i) la séquence SEQ ID NO : 6 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, ou
(ii) la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1.
10. Utilisation selon la revendication 9, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6, ou la séquence SEQ ID NO : 7.
11. Acide nucléique codant le facteur H humain recombinant ayant la séquence SEQ ID NO : 1 , comprenant un acide nucléique représenté par :
(i) la séquence SEQ ID NO : 2, (ii) une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
12. Acide nucléique codant le facteur H humain recombinant selon la revendication 11 , comprenant :
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 et une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et
- un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
13. Acide nucléique codant le facteur H humain recombinant selon la revendication 12, représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6.
14. Acide nucléique codant le facteur H humain recombinant selon la revendication 11, comprenant :
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 et une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
- un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
15. Acide nucléique codant le facteur H humain recombinant selon la revendication 14, représenté par la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7.
16. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 11 à 15.
17. Cellules humaines, notamment transformées, produisant du facteur H recombinant humain avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par lesdites cellules.
18. Cellules humaines selon la revendication 17, ayant un rendement supérieur à 10 mg/L, particulièrement à 30 mg/L, plus particulièrement à 50 mg/L, notamment à 100 mg/L de milieu de culture.
19. Cellules humaines, transformées par un vecteur selon la revendication 17 ou 18.
20. Cellules humaines selon la revendication 19, produisant du facteur H recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par lesdites cellules.
21. Cellules humaines selon l'une des revendications 17 à 20, lesdites cellules étant choisies parmi PER.C6® et HEK 293F.
22. Cellules humaines selon l'une des revendications 17 à 21, lesdites cellules formant un clone cellulaire.
23. Procédé de la préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans une lignée cellulaire humaine avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire, ledit procédé comprenant l'étape de : (i) culture de ladite lignée cellulaire transformée par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain.
24. Procédé selon la revendication 23, dans lequel ledit procédé comprend les étapes suivantes :
(i) la transformation d'une lignée cellulaire par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, pour obtenir une lignée cellulaire transformée,
(ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée, pour obtenir l'expression du facteur H dans le milieu de culture.
25. Procédé selon la revendication 24, dans lequel ledit procédé comprend les étapes suivantes :
(i) la transformation d'une lignée cellulaire, par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur de la protéine facteur H humain, pour obtenir une lignée cellulaire transformée,
(ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée pour obtenir l'expression de facteur H dans le milieu de culture,
(iii) la purification du facteur H humain à partir du milieu de culture, et
(iv) éventuellement la séparation de la forme endogène et de la forme recombinante du facteur H purifié à l'étape (iii).
26. Procédé selon les revendications 23-25, dans lequel le vecteur comprend un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique comprenant :
(i) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 et une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et
- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou
(ii) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 et une séquence ayant d'au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant d'au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
27. Utilisation ou procédé selon l'une des revendications 1 à 26, dans lequel ladite lignée cellulaire est la lignée cellulaire PER.C6 ou la lignée cellulaire HEK 293F.
28. Facteur H recombinant caractérisé en ce qu'il possède une pureté supérieure à 90% de préférence supérieure à 95%.
29. Facteur H recombinant selon la revendication 28, caractérisé en ce que ledit facteur H recombinant conserve l'activité biologique d'un facteur H plasmatique.
30. Facteur H recombinant selon la revendication 29, caractérisé en ce que ledit facteur H recombinant conserve l'activité biologique d'un facteur H plasmatique pour accélérer la dissociation de la C3 convertase.
31. Facteur H recombinant selon la revendication 29, caractérisé en ce que ledit facteur H recombinant conserve l'activité biologique d'un facteur H plasmatique pour réguler le facteur I.
32. Composition pharmaceutique comprenant en tant que substance active un facteur H recombinant tel que défini dans l'une des revendications 28 à 31 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
PCT/FR2012/052461 2011-10-25 2012-10-25 Procede de preparation du facteur h humain WO2013060995A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014537698A JP2014532401A (ja) 2011-10-25 2012-10-25 ヒトｈ因子の製造方法
EP12794376.9A EP2771354A1 (fr) 2011-10-25 2012-10-25 Procede de preparation du facteur h humain
CA2850295A CA2850295A1 (fr) 2011-10-25 2012-10-25 Procede de preparation du facteur h humain
US14/353,595 US20140271603A1 (en) 2011-10-25 2012-10-25 Method for preparing human factor h

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1159686A FR2981661B1 (fr) 2011-10-25 2011-10-25 Procede de preparation du facteur h humain
FR11/59686 2011-10-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013060995A1 true WO2013060995A1 (fr) 2013-05-02

Family

ID=47263414

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2012/052461 WO2013060995A1 (fr) 2011-10-25 2012-10-25 Procede de preparation du facteur h humain

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20140271603A1 (fr)
EP (1) EP2771354A1 (fr)
JP (1) JP2014532401A (fr)
CA (1) CA2850295A1 (fr)
FR (1) FR2981661B1 (fr)
WO (1) WO2013060995A1 (fr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201821089D0 (en) * 2018-12-21 2019-02-06 Gyroscope Therapeutics Ltd Codon-optimised complement factor I

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007038995A1 (fr) * 2005-09-19 2007-04-12 Csl Behring Gmbh Facteur h pour le traitement de néphropathies chroniques et sa production
WO2008045548A2 (fr) * 2006-10-12 2008-04-17 Copernicus Therapeutics Inc. Cftr à optimisation par codon
WO2010004004A1 (fr) * 2008-07-09 2010-01-14 Profibrix Bv Fibrinogène recombiné
WO2011058285A1 (fr) * 2009-11-16 2011-05-19 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Procede de fabrication d'une preparation de facteur h
WO2011077102A1 (fr) * 2009-12-24 2011-06-30 The University Court Of The University Of Edinburgh Facteur h recombinant et variantes et conjugués de celui-ci
WO2011114063A2 (fr) * 2010-03-17 2011-09-22 Lfb Biotechnologies Nouveau peptide signal, et son utilisation pour la production de proteines recombinantes

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2894145B1 (fr) * 2005-12-07 2008-10-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation de facteur h du complement a titre de medicament
WO2008135963A2 (fr) * 2007-05-02 2008-11-13 Hemogem Inc. Fibrinogène pour traitement d'hémorragies traumatiques et de pathologies plaquettaires

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007038995A1 (fr) * 2005-09-19 2007-04-12 Csl Behring Gmbh Facteur h pour le traitement de néphropathies chroniques et sa production
WO2008045548A2 (fr) * 2006-10-12 2008-04-17 Copernicus Therapeutics Inc. Cftr à optimisation par codon
WO2010004004A1 (fr) * 2008-07-09 2010-01-14 Profibrix Bv Fibrinogène recombiné
WO2011058285A1 (fr) * 2009-11-16 2011-05-19 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Procede de fabrication d'une preparation de facteur h
WO2011077102A1 (fr) * 2009-12-24 2011-06-30 The University Court Of The University Of Edinburgh Facteur h recombinant et variantes et conjugués de celui-ci
WO2011114063A2 (fr) * 2010-03-17 2011-09-22 Lfb Biotechnologies Nouveau peptide signal, et son utilisation pour la production de proteines recombinantes

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUTTNER-MAINIK ET AL., PLANT BIOTECHNOL. J., 17 August 2010 (2010-08-17)
CARTON JM ET AL., PROTEIN EXPR PURIF, 2007
CHECHETKIN, J. OFTHEORETICAL BIOLOGY, vol. 242, 2006, pages 922 - 934
KIM C H ET AL: "Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cells", GENE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 199, no. 1-2, 15 October 1997 (1997-10-15), pages 293 - 301, XP004126394, ISSN: 0378-1119, DOI: 10.1016/S0378-1119(97)00384-3 *
P.SANCHEZ-CORRAL; C. GONZÀLEZ-RUBIO; S. RODRIGUEZ DE CORDOBA; M. LOPEZ-TRASCASA, MOLECULAR IMMUNOLOGY, vol. 41, 2004, pages 81 - 84
PILAR SÁNCHEZ-CORRAL ET AL: "Structural and Functional Characterization of Factor H Mutations Associated with Atypical Hemolytic Uremic Syndrome", THE AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, vol. 71, no. 6, 1 December 2002 (2002-12-01), pages 1285 - 1295, XP055027775, ISSN: 0002-9297, DOI: 10.1086/344515 *
SANCHEZ-CORRAL ET AL., AM. J. HUM. GENET., vol. 71, 2002, pages 1285 - 1295
SCHMIDT CQ ET AL., PROTEIN EXPR. PURIF., vol. 6, no. 2, 7 April 2011 (2011-04-07), pages 254 - 63
SHARMA; PANGBURN, GENE, vol. 143, no. 2, 10 June 1994 (1994-06-10), pages 301 - 2
STEPHAN FATH ET AL: "Multiparameter RNA and Codon Optimization: A Standardized Tool to Assess and Enhance Autologous Mammalian Gene Expression", PLOS ONE, vol. 6, no. 3, 3 March 2011 (2011-03-03), pages E17596, XP055027693, DOI: 10.1371/journal.pone.0017596 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2981661B1 (fr) 2015-06-19
CA2850295A1 (fr) 2013-05-02
EP2771354A1 (fr) 2014-09-03
JP2014532401A (ja) 2014-12-08
US20140271603A1 (en) 2014-09-18
FR2981661A1 (fr) 2013-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2337796B1 (fr) Proteines recombinantes a activite hemostatique capables d&#39;induire l&#39;agregation plaquett aire
CA2934558A1 (fr) Proteines recombinantes possedant une activite de facteur h
CA3104868A1 (fr) Molecules d&#39;amelioration de signaux wnt specifiques au tissu et leurs utilisations
Kovalčíkova et al. TMEM70 facilitates biogenesis of mammalian ATP synthase by promoting subunit c incorporation into the rotor structure of the enzyme
CA2506331A1 (fr) Proteine specifique des cellules pancreatiques beta des ilots de langerhans et ses applications
FR3024453A1 (fr) Procede de production de variants ayant un fc presentant une sialylation amelioree
Saint Martín et al. Identification of Dp71e, a new dystrophin with a novel carboxy‐terminal end
Li et al. Identification of cathepsin B from large yellow croaker (Pseudosciaena crocea) and its role in the processing of MHC class II-associated invariant chain
WO2013060995A1 (fr) Procede de preparation du facteur h humain
CA2459945A1 (fr) Methodes de criblage de molecules utiles pour la prevention des maladies cardio-vasculaires
EP3532503A1 (fr) Variants de polypeptide fc presentant une demi-vie augmentee
WO2002000878A2 (fr) Dynamine mitochondriale humaine msp1, ses isoformes msp1-x, et leur utilisation en therapeutique
WO2019150050A1 (fr) Dimères de variants du facteur x
EP2496252A1 (fr) Production de facteur ix recombinant dans une lignee cellulaire hepatocytaire humaine
FR2983212A1 (fr) Aptameres anti-fh, procede pour leur obtention et utilisations
WO1995022616A1 (fr) Modele animal de la maladie d&#39;alzheimer, preparation et utilisations
Boehm Regulation of mitochondrial RNA expression by FASTK proteins
WO2023012264A2 (fr) Activateur pharmacologique et/ou genetique pour son utilisation pour preserver et regenerer la structure et la fonction musculaire en bloquant la senescence
WO2001005966A1 (fr) Acides nucleiques codant pour des peptides possedant l&#39;activite biologique de la sorbine
FR2822831A1 (fr) Nouvelle proteine d&#39;ancrage des cholinesterases, acides nucleiques correspondants et leur application a la preparation de medicaments
Wang Amino acid racemase responsible for the biosynthesis of D-aspartate and D-serine signaling molecules in Aplysia californica central nervous system
FR2848573A1 (fr) Compositions et methodes pour la detection et le traitement de pathologies neurodegeneratives
WO2012085447A1 (fr) Procédé de dosage d&#39;anticorps dirigés contre le facteur viii
EP2384441A1 (fr) Peptides isoles de facteur vii de lapin
WO2001055219A2 (fr) PROTEINE DE FUSION scsCNTFR/NNT-1

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12794376

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2850295

Country of ref document: CA

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2012794376

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012794376

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14353595

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014537698

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE