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WO2018169065A1 - 細胞構造体の製造方法 - Google Patents

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WO2018169065A1
WO2018169065A1 PCT/JP2018/010535 JP2018010535W WO2018169065A1 WO 2018169065 A1 WO2018169065 A1 WO 2018169065A1 JP 2018010535 W JP2018010535 W JP 2018010535W WO 2018169065 A1 WO2018169065 A1 WO 2018169065A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biocompatible polymer
cells
polymer block
cell
cell structure
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2018/010535
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
中村　健太郎
里江 半戸
理志 五條
大介 上
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Corp
Kyoto Prefectural PUC
Original Assignee
Fujifilm Corp
Kyoto Prefectural PUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujifilm Corp, Kyoto Prefectural PUC filed Critical Fujifilm Corp
Priority to JP2019506310A priority Critical patent/JP6964313B2/ja
Priority to EP18767668.9A priority patent/EP3597731B1/en
Publication of WO2018169065A1 publication Critical patent/WO2018169065A1/ja
Priority to US16/573,126 priority patent/US20200032183A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/32—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
    • C12N2535/10—Patterned coating

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell structure, comprising a biocompatible polymer block and cells, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are disposed in gaps between the plurality of cells.
  • Regenerative medicine is being put to practical use to regenerate living tissues and organs that have fallen into dysfunction or dysfunction.
  • Regenerative medicine is a new medicine that regenerates the same form and function as the original tissue using the three factors of cells, scaffolding, and growth factors from living tissues that cannot be recovered only by the natural healing ability of the living body.
  • Technology In recent years, treatment using cells is gradually being realized. For example, cultured epidermis using autologous cells, cartilage treatment using autologous chondrocytes, bone regeneration treatment using mesenchymal stem cells, cardiomyocyte sheet treatment using myoblasts, corneal regeneration treatment using corneal epithelial sheets, and Examples include nerve regeneration treatment.
  • Patent Document 1 describes a cell structure including a polymer block having biocompatibility and cells, and a plurality of the polymer blocks arranged in the gaps between the plurality of cells.
  • nutrients can be delivered from the outside to the inside of the cell structure.
  • the cell structure has a sufficient thickness, and the cells are uniformly present in the structure.
  • high cell survival activity has been demonstrated using a polymer block made of recombinant gelatin or a natural gelatin material.
  • Patent Document 2 includes a polymer block having biocompatibility and at least one kind of cell, and a plurality of the polymer blocks are arranged in a gap between the plurality of cells. Cell structures have been described.
  • Patent Document 3 includes a biocompatible polymer block that does not contain glutaraldehyde and at least one kind of cell, and a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a gap between a plurality of cells.
  • a cell structure for cell transplantation wherein the tap density of the biocompatible polymer block is 10 mg / cm 3 or more and 500 mg / cm 3 or less, or the square root of the cross-sectional area in the two-dimensional cross-sectional image of the polymer block ⁇
  • a cell structure for cell transplantation having a perimeter value of 0.01 or more and 0.13 or less is described.
  • Patent Documents 1 to 3 described above a cell structure including a polymer block having bioaffinity and a cell, wherein a plurality of the polymer blocks are arranged in a gap between the plurality of cells, A small-scale manufacturing method is described in which one is manufactured in one well.
  • Patent Document 4 a plurality of depressions forming a compartment in which a culture object is cultured are formed on the surface of the culture substrate, and the culture substrate surface between the depressions adjacent to each other is a non-flat surface.
  • a culture substrate characterized by the above is described, and spheroid culture using the culture substrate is described.
  • a culture surface in which a plurality of depressions that form a compartment in which a culture of sputum is cultured is formed, a container body having the culture surface on the bottom surface, and placed on top of the plurality of depressions.
  • a permeable lid that closes the opening of the dent, and the culture surface has a non-flat surface at the top between the dents adjacent to each other, and the permeable lid is in the culture solution in the container body.
  • the cell structures When used for the repair / regeneration of biological tissue, it may be desired to simultaneously produce, for example, 1,000 or more cell structures in large quantities.
  • a method for culturing a large amount of cell mass a method in which the cell mass is suspended in a medium and stirred is known.
  • the suspension agitation culture method is used for the production of the cell structure, (1) the formation efficiency of the cell structure is poor (that is, the polymer block and the cell existing individually without forming the cell structure. (2) The ratio of the polymer block to cells of the cell structure obtained is different for each cell structure, and (3) the individual size of the cell structure is different. It became clear by examination of the present inventors.
  • the cell structures When cell structures are used for repair and regeneration of living tissue, in order to obtain an excellent therapeutic effect, the cell structures must be uniform (for example, the ratio, shape or size of the polymer block to cells is uniform). It is desirable to be.
  • An object of the present invention is to provide a cell structure comprising a biocompatible polymer block and a cell, wherein a plurality of the biocompatible polymer blocks are disposed in gaps between the plurality of cells. It is to provide a method that can be produced uniformly and in large quantities.
  • the present inventors have found that the first culture container having a culture surface having a plurality of depressions and a side wall portion standing on the outer periphery of the culture surface is biocompatible.
  • a cell structure is formed by adding a mixture of a functional polymer block, cells and liquid medium and allowing to stand, and then the cell structure is stirred and cultured in a second culture vessel equipped with stirring means.
  • a biocompatible polymer block, a cell and a liquid medium are placed in a first culture container having a culture surface on which a plurality of depressions are formed and a side wall portion standing on the outer periphery of the culture surface. Adding the mixture such that the liquid level of the mixture exceeds the culture surface;
  • B) The first culture vessel in the step (A) is allowed to stand, and the biocompatible polymer block and the cells are contained in the recess, and a plurality of the above-described cells are provided in the gaps between the plurality of cells.
  • a method for producing a cell structure comprising:
  • the first culture vessel is allowed to stand until the free biocompatible polymer block is 30% by mass or less of the total biocompatible polymer block.
  • a method for producing the described cell structure (3) The first culture vessel is allowed to stand in step (B) for a time such that the ratio of the number of cell structures produced after step (C) to the number of depressions is 70% or more.
  • the depth of the depression is 2 to 100 times the size of the biocompatible polymer block, and the diameter of the depression is 2 to 100 times the size of the bioaffinity polymer block.
  • (7) The method for producing a cell structure according to any one of (1) to (6), wherein the time for allowing the first culture vessel to stand is 2 to 24 hours.
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence
  • n Xs independently represent any of the amino acids
  • n Ys each independently represent an amino acid.
  • N represents an integer of 3 to 100
  • m represents an integer of 2 to 10.
  • the n Gly-XY may be the same or different.
  • Gelatin is A peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; A peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and having biocompatibility; or 80% or more of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 A peptide having an amino acid sequence having the following sequence identity and having biocompatibility; The method for producing a cell structure according to (9) or (10), wherein
  • a cell comprising a biocompatible polymer block and a cell, wherein a plurality of the biocompatible polymer blocks are disposed in gaps between the plurality of cells.
  • the structure can be manufactured uniformly and in large quantities in a short time.
  • FIG. 1 is a perspective view of a first culture vessel.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of a first example of the first culture vessel (the upper surface of the region between the depressions, that is, the uppermost part of the depressions is non-flat).
  • FIG. 2 (a) shows an example without a cell adhesion inhibitor layer
  • FIG. 2 (b) shows an example with a cell adhesion inhibitor layer.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of a second example of the first culture vessel (the upper surface of the region between the depressions, that is, the uppermost part of the depressions is flat).
  • FIG. 3 (a) shows an example without a cell adhesion inhibitor layer
  • FIG. 3 (b) shows an example with a cell adhesion inhibitor layer.
  • FIG. 1 is a perspective view of a first culture vessel.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of a first example of the first culture vessel (the upper surface of the region between the depressions, that is, the upper
  • FIG. 4 is a partially enlarged view of FIG.
  • FIG. 5 is a partially enlarged view of FIG.
  • FIG. 6 shows laser beam irradiation spots.
  • FIG. 7 shows a liquid temperature profile under condition A of the example.
  • FIG. 8 shows a liquid temperature profile under condition B of the example.
  • FIG. 9 shows a liquid temperature profile under condition C of the example.
  • FIG. 10 shows the manufacturing process and results of Example 1.
  • FIG. 11 shows the manufacturing process and results of Example 2.
  • FIG. 12 shows the manufacturing process and results of Comparative Example 1.
  • FIG. 13 shows the manufacturing process and results of Comparative Example 2.
  • FIG. 14 shows the manufacturing process and results of Comparative Example 3.
  • the method for producing a cell structure comprises: (A) A mixture of a biocompatible polymer block, a cell and a liquid medium is mixed in a first culture container having a culture surface in which a plurality of depressions are formed and a side wall portion standing on the outer periphery of the culture surface. Adding so that the liquid level of the cell exceeds the culture surface; (B) The first culture vessel in the step (A) is allowed to stand, and the biocompatible polymer block and the cells are included in the recess, and a plurality of biocompatible polymers are provided in the gaps between the plurality of cells. A step of forming a cell structure in which the block is disposed; and (C) the contents of the first culture vessel obtained in step (B) are stirred and cultured in a second culture vessel equipped with stirring means. Process; including.
  • a biocompatible polymer block, a cell and a liquid medium are provided in a first culture container having a culture surface in which a plurality of depressions are formed and a side wall portion standing on the outer periphery of the culture surface. Is added so that the liquid level of the mixture exceeds the culture surface, and in one step, the biocompatible polymer block, the cells and the liquid medium are placed in all the depressions of the first culture vessel. Can be added. Thereby, according to the method of this invention, a cell structure can be manufactured in a short time.
  • a cell structure in which a plurality of biocompatible polymer blocks are disposed in a gap between a plurality of cells in the depression of the first culture container, the biocompatible polymer block and cells being included.
  • the contents of the first culture vessel are stirred and cultured in a second culture vessel equipped with stirring means.
  • the cell structure obtained after the step of stirring and culturing is uniform in, for example, at least one of the ratio, shape and size between the polymer block having bioaffinity and the cells. Note that “at least one of the ratio, shape and size is uniform” does not mean only when at least one of the ratio, shape and size is completely the same, but will be described later. It means that at least one or more of the above ratios, shapes and sizes are uniform as compared with the case where a cell structure is produced under the conditions shown in Comparative Examples 1 to 3.
  • cell culture is agitated and cultured, so that sufficient nutrition and oxygen can be delivered to cells in the cell structure while preventing fusion and collapse of the cell structures.
  • a cell structure having excellent properties can be produced.
  • the cell structure is formed on the upper surface between the depressions on the culture surface.
  • the macromolecular block and cells that do not form the cell structure are incorporated into the cell structure to form a larger cell structure. Can do.
  • the adhesion between the polymer block contained in the cell structure and the cells is strengthened by the physical force by stirring.
  • the mixture of the biocompatible polymer block, the cells and the liquid medium is added to the first culture container so that the liquid level of the mixture exceeds the culture surface, and the cells
  • the first culture container used in the present invention is a culture container having a culture surface in which a plurality of depressions are formed and a side wall portion standing on the outer periphery of the culture surface.
  • the example of the 1st culture container used by this invention is demonstrated with reference to FIGS.
  • the culture container has a container body 10 and a lid 12.
  • the container body 10 has a disk-shaped bottom plate portion 14 and an annular side wall portion 16.
  • the bottom plate portion 14 may be made of a synthetic resin material such as polystyrene or glass, for example.
  • the bottom plate portion 14 can be manufactured, for example, by injection molding using a synthetic resin material.
  • the shape of the container may be a shape other than a disk shape or a square shape.
  • the side wall portion 16 stands from the outer peripheral edge of the bottom plate portion 14.
  • the diameter of the bottom plate portion 14 can be, for example, 30 mm to 500 mm
  • the thickness of the bottom plate portion 14 can be, for example, 0.5 mm to 10 mm
  • the height of the side wall portion 16 can be, for example, 20 mm to 100 mm.
  • the lid 12 is formed in a shape corresponding to the opening above the container body 10.
  • the lid 12 can be used by covering the container body 10 in order to maintain a cell culture environment.
  • a plurality of depressions 20 are formed in the well formation region 24 on the upper surface of the bottom plate portion 14 (that is, a region where a compartment in which the culture object is cultured is formed). ing.
  • the inner surface of the recess 20 is a smooth concave surface.
  • the depression 20 forms a compartment (well) in which the culture object is cultured.
  • the cell adhesion inhibitor layer 30 is provided.
  • the culture surface 26 means a surface including the uppermost part of the well formation region 24 (see FIGS. 2 to 5).
  • the depth of the recess is not particularly limited, but is preferably 2 to 100 times the size of the biocompatible polymer block, more preferably 2 to 10 times the size of the biocompatible polymer block. More preferably, it is 3 to 10 times the size of the biocompatible polymer block.
  • the depth of the recess is not particularly limited, but is preferably 10 to 2000 ⁇ m, more preferably 20 to 1000 ⁇ m, still more preferably 30 to 700 ⁇ m, still more preferably 50 to 500 ⁇ m, and most preferably 100 to 400 ⁇ m.
  • the diameter of the recess is not particularly limited, but is preferably 2 to 100 times the size of the biocompatible polymer block, more preferably 3 to 50 times the size of the biocompatible polymer block, More preferably, it is 5 to 10 times the size of the biocompatible polymer block.
  • the diameter of the recess is not particularly limited, but is preferably 10 to 2000 ⁇ m, more preferably 50 to 1500 ⁇ m, still more preferably 100 to 1500 ⁇ m, still more preferably 200 to 1000 ⁇ m, and most preferably 400. ⁇ 1000 ⁇ m. It is preferable that the depth and the diameter of the dent are in the above ranges from the viewpoint of obtaining a cell structure excellent in strength and shape maintenance performance in relation to the cell size.
  • all the hollow parts of a culture container do not need to have said depth and diameter, and at least one hollow part is said depth and diameter. It may have.
  • the depth of the recess means the height between the lowermost part and the uppermost part of the recess.
  • the diameter of the hollow portion means a length connecting the uppermost points of the hollow portion.
  • the uppermost part of a hollow part is selected so that the length which tied the point of the uppermost part of the hollow part may become the shortest.
  • the shape of the depression may be uniform or non-uniform, but is preferably uniform.
  • the depth and the diameter of the recess are preferably uniform, and the depth and the diameter of all the recesses are preferably substantially the same.
  • the depression 20 can be formed, for example, by irradiating the well formation region 24 with laser light. As shown in FIG. 6, laser irradiation is performed by irradiating the upper surface of the bottom plate portion 14 installed on the xy plane with laser light in the z-axis direction.
  • laser light is irradiated at regular intervals (for example, 800 ⁇ m) to form a plurality of depressions 20 aligned in the x axis direction.
  • the laser beam is irradiated at regular intervals (for example, 800 ⁇ m) while the irradiation unit is scanned in the negative direction of the x-axis.
  • a plurality of depressions 20 arranged in the x-axis direction are formed.
  • the irradiation unit is scanned by a certain distance (for example, 400 ⁇ m) in the y-axis direction. By repeating this, a plurality of depressions 20 regularly arranged on the upper surface of the bottom plate part 14 are formed.
  • the center coordinate (x, y) of the irradiation spot A is the origin (0, 0)
  • the center of the irradiation spot B close to the irradiation spot A is (0.8, 0)
  • the center of the irradiation spot C is (0.4, 0.4)
  • the center of the irradiation spot D is ( ⁇ 0.4, 0.4).
  • a CO 2 laser is used as the laser light source, and the laser beam can be irradiated with pulses at an output of 10 W and an irradiation speed of 6100 mm / min, but is not particularly limited.
  • the opening shape of the hollow portion 20 is flattened into a substantially elliptical shape. The flatness of the opening shape is considered to be caused by the direction in which the synthetic resin material is poured into the mold when the container body 10 is molded.
  • the distance between the adjacent depressions 20, the diameter / depth of the depressions 20, and the width of the culture substrate surface between the depressions 20 adjacent to each other ⁇ Height can be adjusted.
  • the well forming region 24 can also be manufactured by injection molding a synthetic resin material using a mold having a convex portion forming a plurality of hollow portions 20 and a concave portion forming a region between the hollow portions. .
  • the plurality of depressions 20 and the area between the depressions are formed simultaneously with the formation of the well formation region 24.
  • the area of the depression is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, and most preferably 100% with respect to the total area of the culture surface. preferable. It is preferable from the viewpoint of the effect of the present invention that the ratio of the area of the recesses is in the above range.
  • the area of the dent means the area when the dent is observed in two dimensions when the dent is observed from above, and means the area defined by the diameter of the dent described above in this specification. To do. As shown in FIG. 2 or FIG. 4, when there is no flat part on the culture surface, the area of the depression is 100% with respect to the total area of the culture surface.
  • the two depressions 20 adjacent to each other are formed via a region between the depressions.
  • the surface of the culture substrate between the recesses 20 adjacent to each other may be flat or non-flat, but is preferably non-flat.
  • the culture surface and the surface of the depression are preferably treated for suppressing cell adhesion.
  • the treatment for suppressing cell adhesion include coating with a cell adhesion inhibitor (see FIG. 2 (b) and FIG. 3 (b)).
  • the cell adhesion inhibitor plays a role of inhibiting cells from adhering to the upper surface of the bottom plate portion 14, particularly the inner surface of the recess portion 20.
  • the cell adhesion inhibitor for example, phospholipid polymer, MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine), polyhydroxyethyl methacrylate, polyethylene glycol or the like is used.
  • Bioaffinity polymer block (2-1) Bioaffinity polymer Bioaffinity refers to significant adverse reactions such as long-term and chronic inflammatory reactions when in contact with the living body. Does not provoke.
  • the biocompatible polymer used in the present invention is not particularly limited as to whether or not it is degraded in vivo as long as it has affinity for the living body, but is preferably a biodegradable polymer.
  • Specific examples of non-biodegradable materials include polytetrafluoroethylene (PTFE), polyurethane, polypropylene, polyester, vinyl chloride, polycarbonate, acrylic, stainless steel, titanium, silicone, and MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine). Can be mentioned.
  • biodegradable materials include naturally occurring peptides, polypeptides such as recombinant peptides or chemically synthesized peptides (eg, gelatin described below), polylactic acid, polyglycolic acid, and lactic acid / glycolic acid copolymers. (PLGA), hyaluronic acid, glycosaminoglycan, proteoglycan, chondroitin, cellulose, agarose, carboxymethylcellulose, chitin, and chitosan.
  • a recombinant peptide is particularly preferable.
  • biocompatible polymers may be devised to enhance cell adhesion.
  • cell adhesion substrate fibronectin, vitronectin, laminin
  • cell adhesion sequence expressed in one letter of amino acid, RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, RYVVLPR, Sequence, LGTIPG sequence, RNIAEIIKDI sequence, IKVAV sequence, LRE sequence, DGEA sequence, and HAV sequence
  • a method such as “hydrophilic treatment” can be used.
  • polypeptide including recombinant peptide or chemically synthesized peptide is not particularly limited as long as it has biocompatibility.
  • gelatin, collagen, elastin, fibronectin, pronectin, laminin, tenascin, fibrin, fibroin, enteractin, thrombosis Spongein and retronectin are preferred, and gelatin, collagen and atelocollagen are most preferred.
  • the gelatin for use in the present invention is preferably natural gelatin, recombinant gelatin or chemically synthesized gelatin, and more preferably recombinant gelatin.
  • natural gelatin means gelatin made from naturally derived collagen.
  • a chemically synthesized peptide or chemically synthesized gelatin means an artificially synthesized peptide or gelatin.
  • the peptide such as gelatin may be synthesized by solid phase synthesis or liquid phase synthesis, but is preferably solid phase synthesis.
  • Solid-phase synthesis of peptides is known to those skilled in the art. For example, Fmoc group synthesis method using Fmoc group (Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl group) as amino group protection, and Boc group (tert-Butyl group) as amino group protection Boc group synthesis method using Oxy Carbonyl group).
  • the preferred embodiment of the chemically synthesized gelatin can be applied to the contents described in (2-3) gelatin described later in this specification. Gelatin, particularly recombinant gelatin, will be described later in this specification.
  • the hydrophilicity value “1 / IOB” value of the biocompatible polymer used in the present invention is preferably from 0 to 1.0. More preferably, it is 0 to 0.6, and still more preferably 0 to 0.4.
  • IOB is an index of hydrophilicity / hydrophobicity based on an organic conceptual diagram representing the polarity / non-polarity of an organic compound proposed by Satoshi Fujita. Details thereof can be found in, for example, “Pharmaceutical Bulletin”, vol.2, 2, pp .163-173 (1954), “Area of Chemistry” vol.11, 10, pp.719-725 (1957), “Fragrance Journal”, vol.50, pp.79-82 (1981), etc. Yes.
  • methane (CH 4 ) is the source of all organic compounds, and all other compounds are all methane derivatives, with certain numbers set for the number of carbon atoms, substituents, transformations, rings, etc. Then, the score is added to obtain an organic value (OV) and an inorganic value (IV), and these values are plotted on a diagram with the organic value on the X axis and the inorganic value on the Y axis. It is going.
  • the IOB in the organic conceptual diagram refers to the ratio of the inorganic value (IV) to the organic value (OV) in the organic conceptual diagram, that is, “inorganic value (IV) / organic value (OV)”.
  • hydrophilicity / hydrophobicity is represented by a “1 / IOB” value obtained by taking the reciprocal of IOB. The smaller the “1 / IOB” value (closer to 0), the more hydrophilic it is.
  • the hydrophilicity is high and the water absorption is high, so that it effectively acts to retain nutrient components.
  • the hydrophilicity / hydrophobicity index represented by the Grand average of hydropathicity (GRAVY) value is preferably 0.3 or less, preferably minus 9.0 or more, More preferably, it is 0.0 or less and minus 7.0 or more.
  • Grand average of hydropathicity (GRAVY) values are based on Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A .; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005) .pp.
  • the biocompatible polymer used in the present invention may be cross-linked or non-cross-linked, but is preferably cross-linked.
  • a cross-linked biocompatible polymer it is possible to obtain an effect of preventing instantaneous degradation when cultured in a medium or transplanted to a living body.
  • crosslinking methods include thermal crosslinking, crosslinking with aldehydes (eg, formaldehyde, glutaraldehyde, etc.), crosslinking with condensing agents (carbodiimide, cyanamide, etc.), enzyme crosslinking, photocrosslinking, UV crosslinking, hydrophobic interaction, Hydrogen bonding, ionic interaction, and the like are known, and the above-described crosslinking method can also be used in the present invention.
  • the crosslinking method used in the present invention is more preferably thermal crosslinking, ultraviolet crosslinking, or enzyme crosslinking, and particularly preferably thermal crosslinking.
  • the enzyme When performing cross-linking with an enzyme, the enzyme is not particularly limited as long as it has a cross-linking action between polymer materials.
  • trans-glutaminase and laccase most preferably trans-glutaminase can be used for cross-linking.
  • a specific example of a protein that is enzymatically cross-linked with transglutaminase is not particularly limited as long as it has a lysine residue and a glutamine residue.
  • the transglutaminase may be derived from a mammal or a microorganism. Specifically, transglutaminase derived from a mammal sold as an Ajinomoto Co., Ltd.
  • Human-derived blood coagulation factors Factor XIIIa, Haematologic Technologies, Inc.
  • Factor XIIIa Haematologic Technologies, Inc.
  • guinea pig liver-derived transglutaminase goat-derived transglutaminase
  • rabbit-derived transglutaminase from Oriental Yeast Kogyo Co., Ltd. Etc.
  • the reaction temperature at the time of performing crosslinking is not particularly limited as long as crosslinking is possible, but is preferably ⁇ 100 ° C. to 500 ° C., more preferably 0 ° C. to 300 ° C., and still more preferably. It is 50 ° C to 300 ° C, more preferably 100 ° C to 250 ° C, and further preferably 120 ° C to 200 ° C.
  • gelatin As the biocompatible polymer, gelatin is preferable.
  • the gelatin may be natural gelatin, recombinant gelatin, or chemically synthesized gelatin.
  • the recombinant gelatin referred to in the present invention means a polypeptide or protein-like substance having an amino acid sequence similar to gelatin produced by a gene recombination technique.
  • the gelatin that can be used in the present invention preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY that is characteristic of collagen (X and Y each independently represents any of amino acids).
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • two or more cell adhesion signals are contained in one molecule.
  • gelatin used in the present invention gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen can be used.
  • EP1014176, US Pat. No. 6,992,172, International Publication WO2004 / 85473, International Publication WO2008 / 103041, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • Preferred as the gelatin used in the present invention is the gelatin of the following embodiment.
  • Recombinant gelatin has excellent biocompatibility due to the inherent performance of natural gelatin, and is not naturally derived, so there is no concern about bovine spongiform encephalopathy (BSE) and excellent non-infectivity. Recombinant gelatin is more uniform than natural gelatin and its sequence is determined, so that strength and degradability can be precisely designed with less blur due to crosslinking or the like.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • the molecular weight of gelatin is not particularly limited, but is preferably 2000 or more and 100000 or less (2 kDa or more and 100 kDa or less), more preferably 2500 or more and 95000 or less (2.5 kDa or more and 95 kDa or less), and further preferably 5000 or more and 90000 or less. (5 kDa or more and 90 kDa or less), and most preferably 10000 or more and 90000 or less (10 kDa or more and 90 kDa or less).
  • Gelatin preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • Gly-XY Gly represents glycine
  • X and Y represent any amino acid (preferably any amino acid other than glycine).
  • the sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen, is a very specific partial structure in the amino acid composition and sequence of gelatin / collagen compared to other proteins. In this part, glycine accounts for about one third of the whole, and in the amino acid sequence, it is one in three repeats.
  • Glycine is the simplest amino acid, has few constraints on the arrangement of molecular chains, and greatly contributes to the regeneration of the helix structure upon gelation.
  • the amino acids represented by X and Y are rich in imino acids (proline, oxyproline), and preferably account for 10% to 45% of the total.
  • imino acids proline, oxyproline
  • 80% or more of the amino acid sequence of gelatin, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more of the amino acids are Gly-XY repeating structures.
  • polar amino acids are charged and uncharged at 1: 1.
  • the polar amino acid specifically refers to cysteine, aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and arginine, and among these polar uncharged amino acids are cysteine, asparagine, glutamine, serine. Refers to threonine and tyrosine.
  • the proportion of polar amino acids is 10 to 40%, preferably 20 to 30%, of all the constituent amino acids.
  • the proportion of uncharged amino acids in the polar amino acid is preferably 5% or more and less than 20%, preferably less than 10%.
  • any one amino acid among serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine preferably two or more amino acids are not included in the sequence.
  • the minimum amino acid sequence that acts as a cell adhesion signal in a polypeptide is known (for example, “Pathophysiology”, Vol. 9, No. 7 (1990), page 527, published by Nagai Publishing Co., Ltd.).
  • the gelatin used in the present invention preferably has two or more of these cell adhesion signals in one molecule.
  • Specific sequences include RGD sequences, LDV sequences, REDV sequences, YIGSR sequences, PDSGR sequences, RYVVLPR sequences, LGITIPG sequences, RNIAEIIKDI sequences, which are expressed in one-letter amino acid notation in that many types of cells adhere.
  • IKVAV sequences IKVAV sequences, LRE sequences, DGEA sequences, and HAV sequences are preferred. More preferred are RGD sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, LGTIPG sequence, IKVAV sequence and HAV sequence, and particularly preferred is RGD sequence. Of the RGD sequences, an ERGD sequence is preferred.
  • gelatin having a cell adhesion signal the amount of cell substrate produced can be improved. For example, in the case of cartilage differentiation using mesenchymal stem cells as cells, production of glycosaminoglycan (GAG) can be improved.
  • GAG glycosaminoglycan
  • the number of amino acids between RGD is not uniform between 0 and 100, preferably between 25 and 60.
  • the content of the minimum amino acid sequence is preferably 3 to 50, more preferably 4 to 30, and particularly preferably 5 to 20 per protein molecule from the viewpoint of cell adhesion / proliferation. Most preferably, it is 12.
  • the ratio of the RGD motif to the total number of amino acids is preferably at least 0.4%. Where gelatin contains 350 or more amino acids, it is preferred that each stretch of 350 amino acids contains at least one RGD motif.
  • the ratio of RGD motif to the total number of amino acids is more preferably at least 0.6%, more preferably at least 0.8%, more preferably at least 1.0%, more preferably at least 1.2%. And most preferably at least 1.5%.
  • the number of RGD motifs in the peptide is preferably at least 4, more preferably at least 6, more preferably at least 8, more preferably 12 or more and 16 or less per 250 amino acids.
  • a ratio of 0.4% of the RGD motif corresponds to at least one RGD sequence per 250 amino acids.
  • a gelatin of 251 amino acids must contain at least two RGD sequences in order to meet at least 0.4% characteristics.
  • the gelatin in the present invention comprises at least 2 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably comprises at least 3 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably at least 4 RGD per 250 amino acids. Contains an array. Further embodiments of gelatin in the present invention include at least 4 RGD motifs, preferably at least 6, more preferably at least 8, and even more preferably 12 or more and 16 or less.
  • Gelatin may be partially hydrolyzed.
  • the gelatin used in the present invention is represented by the formula 1: A-[(Gly-XY) n ] m -B.
  • n Xs independently represents any of amino acids
  • n Ys independently represents any of amino acids.
  • m is preferably an integer of 2 to 10, more preferably an integer of 3 to 5.
  • n is preferably an integer of 3 to 100, more preferably an integer of 15 to 70, and most preferably an integer of 50 to 65.
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence.
  • the n Gly-XY may be the same or different.
  • the gelatin used in the present invention has the formula: Gly-Ala-Pro-[(Gly-XY) 63 ] 3 -Gly (wherein 63 Xs independently represent any of amino acids) 63 Y's each independently represents any amino acid, wherein 63 Gly-XY may be the same or different.
  • the naturally occurring collagen referred to here may be any naturally occurring collagen, but is preferably type I, type II, type III, type IV, or type V collagen. More preferred is type I, type II, or type III collagen.
  • the collagen origin is preferably human, bovine, porcine, mouse or rat, more preferably human.
  • the isoelectric point of gelatin used in the present invention is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 10, and still more preferably 7 to 9.5.
  • the isoelectric point of gelatin was measured according to an isoelectric focusing method (see Maxey, CR (1976; Phitogr. Gelatin 2, Editor Cox, PJ Academic, London, Engl.). It can be carried out by measuring the pH after passing the gelatin solution through a mixed crystal column of cation and anion exchange resin.
  • the gelatin is not deaminated.
  • the gelatin has no telopeptide.
  • gelatin is a substantially pure polypeptide prepared with a nucleic acid encoding an amino acid sequence.
  • gelatin used in the present invention (1) a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (2) a peptide having a bioaffinity consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, or (3) described in SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5. Means, particularly preferably 1 to 3.
  • the recombinant gelatin used in the present invention can be produced by a genetic recombination technique known to those skilled in the art. For example, in EP1014176A2, US Pat. No. 6,992,172, International Publication WO2004 / 85473, International Publication WO2008 / 103041, etc. It can be produced according to the method described. Specifically, a gene encoding the amino acid sequence of a predetermined recombinant gelatin is obtained, and this is incorporated into an expression vector to produce a recombinant expression vector, which is introduced into an appropriate host to produce a transformant. . Recombinant gelatin is produced by culturing the obtained transformant in an appropriate medium. Thus, the gelatin used in the present invention can be prepared by recovering the recombinant gelatin produced from the culture.
  • the block (lumps) made of the above-described biocompatible polymer is used.
  • the shape of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited. For example, amorphous, spherical, particulate (granule), powder, porous, fiber, spindle, flat and sheet, preferably amorphous, spherical, particulate (granule), powder And porous.
  • An indeterminate shape indicates that the surface shape is not uniform, for example, an object having irregularities such as rocks.
  • illustration of said shape is not different, respectively, For example, it may become an indefinite form as an example of the subordinate concept of a particulate form (granule).
  • the shape of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited as described above, but the tap density is preferably 10 mg / cm 3 or more and 500 mg / cm 3 or less, more preferably 20 mg / cm 3. It is 400 mg / cm 3 or less, more preferably 40 mg / cm 3 or more and 220 mg / cm 3 or less, and particularly preferably 50 mg / cm 3 or more and 150 mg / cm 3 or less.
  • the tap density is a value that indicates how many blocks can be densely packed in a certain volume. It can be seen that the smaller the value, the more densely packed, that is, the more complicated the block structure.
  • the tap density of the biocompatible polymer block represents the complexity of the surface structure of the biocompatible polymer block and the amount of voids formed when the biocompatible polymer block is collected as an aggregate. it is conceivable that. The smaller the tap density, the more voids between the biocompatible polymer blocks and the larger the cell engraftment area.
  • a biocompatible polymer block can appropriately exist between cells, and when a cell structure is formed, nutrients can be delivered to the inside of the structure. It is considered that it is preferable to be within the range.
  • the tap density as used in this specification can be measured as follows.
  • a container hereinafter referred to as a cap
  • a funnel is attached to the cap and the block is poured from the funnel so that the block accumulates in the cap.
  • tap the cap part 200 times on a hard place such as a desk, remove the funnel and clean with a spatula.
  • the mass is measured with the cap fully filled.
  • the degree of crosslinking of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited, but is preferably 2 or more, more preferably 2 or more and 30 or less, still more preferably 4 or more and 25 or less, and particularly preferably 4 It is 22 or less.
  • the method for measuring the degree of cross-linking of the biocompatible polymer block is not particularly limited.
  • the TNBS (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid) method described in Examples below will be used.
  • Forma 2 (As-Ab) / 14600 ⁇ V / w (Formula 2) shows the amount of lysine (molar equivalent) per 1 g of the biocompatible polymer block.
  • Ab is the blank absorbance
  • V is the amount of the reaction solution (g)
  • w is the biocompatible polymer block mass (mg).
  • the water absorption rate of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited, but is preferably 300% or more, more preferably 400% or more, further preferably 500% or more, particularly preferably 700% or more, and most preferably 800. % Or more.
  • the upper limit of water absorption is not particularly limited, but is generally 4000% or less, or 2000% or less.
  • the method for measuring the water absorption rate of the biocompatible polymer block is not particularly limited, and for example, it can be measured by the method described in Examples below. Specifically, a biocompatible polymer block of about 15 mg is filled in a 3 cm ⁇ 3 cm nylon mesh bag at 25 ° C., swollen in ion exchange water for 2 hours, and then air-dried for 10 minutes. In this stage, the mass is measured, and the water absorption rate can be obtained according to (Equation 4).
  • the size of one biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ m or more and 700 ⁇ m or less, more preferably 10 ⁇ m or more and 700 ⁇ m or less, further preferably 10 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less, Preferably they are 20 micrometers or more and 200 micrometers or less, More preferably, they are 20 micrometers or more and 150 micrometers or less, Especially preferably, they are 53 micrometers or more and 106 micrometers or less.
  • the size of one biocompatible polymer block does not mean that the average value of the sizes of a plurality of biocompatible polymer blocks is in the above range. It means the size of each biocompatible polymer block obtained by sieving the block.
  • the size of one block can be defined by the size of the sieve used to separate the blocks.
  • a block remaining on the sieve when the passed block is passed through a 106 ⁇ m sieve after passing through a 180 ⁇ m sieve can be a block having a size of 106 to 180 ⁇ m.
  • the block remaining on the sieve when the block passed through the sieve of 106 ⁇ m and the passed block is passed through the sieve of 53 ⁇ m can be a block having a size of 53 to 106 ⁇ m.
  • a block remaining on the sieve when the passed block is passed through a sieve of 53 ⁇ m and passed through a sieve of 25 ⁇ m can be made a block having a size of 25 to 53 ⁇ m.
  • the method for producing the bioaffinity polymer block is not particularly limited.
  • the solid material containing the bioaffinity polymer porous material of the bioaffinity polymer
  • the biocompatible polymer block can be obtained by pulverizing the material and the like using a pulverizer (such as a new power mill).
  • a solid (eg, a porous body) containing a biocompatible polymer can be obtained, for example, by lyophilizing an aqueous solution containing a biocompatible polymer.
  • an amorphous biocompatible polymer block having a nonuniform surface shape can be produced by pulverizing a solid containing a biocompatible polymer.
  • A The difference between the temperature of the highest liquid temperature in the solution and the temperature of the lowest liquid temperature in the solution is 2.5 ° C. or less, and Cooling the biocompatible polymer solution to an unfrozen state at a temperature below the melting point of the solvent, (B) a method comprising freezing the solution of the biocompatible polymer obtained in step (a), and (c) lyophilizing the frozen biocompatible polymer obtained in step (b).
  • B a method comprising freezing the solution of the biocompatible polymer obtained in step (a), and (c) lyophilizing the frozen biocompatible polymer obtained in step (b).
  • the difference between the highest temperature in the solution and the lowest temperature in the solution is 2.5 ° C. or less ( (Preferably 2.3 ° C. or less, more preferably 2.1 ° C. or less), that is, by reducing the temperature difference, the variation in the size of the porous pores obtained is reduced.
  • the lower limit of the difference between the temperature of the highest liquid temperature in the solution and the temperature of the lowest liquid temperature in the solution is not particularly limited, and may be 0 ° C. or higher, for example, 0.1 ° C. or higher. 0.5 degreeC or more, 0.8 degreeC or more, or 0.9 degreeC or more may be sufficient.
  • the cooling in the step (a) is preferably performed, for example, via a material having a lower thermal conductivity than water (preferably, Teflon (registered trademark)), and the portion having the highest liquid temperature in the solution is on the cooling side.
  • a material having a lower thermal conductivity than water preferably, Teflon (registered trademark)
  • Teflon registered trademark
  • the difference between the temperature of the highest liquid temperature in the solution and the temperature of the lowest liquid temperature in the solution immediately before the generation of heat of solidification is 2.5 ° C. or less, More preferably, it is 2.3 degrees C or less, More preferably, it is 2.1 degrees C or less.
  • the “temperature difference immediately before the generation of solidification heat” means a temperature difference when the temperature difference becomes the largest between 1 second and 10 seconds before the generation of solidification heat.
  • the temperature of the lowest liquid temperature in the solution is a solvent melting point of ⁇ 5 ° C. or lower, more preferably a solvent melting point of ⁇ 5 ° C. or lower and a solvent melting point of ⁇ 20 ° C. or higher. More preferably, the solvent melting point is ⁇ 6 ° C. or lower and the solvent melting point is ⁇ 16 ° C. or higher.
  • the solvent having a solvent melting point is a solvent for a biocompatible polymer solution.
  • step (b) the biocompatible polymer solution obtained in step (a) is frozen.
  • the cooling temperature for freezing in the step (b) is not particularly limited and depends on the equipment to be cooled, but preferably from 3 ° C. from the temperature of the lowest liquid temperature in the solution.
  • the temperature is 30 ° C lower, more preferably 5 ° C to 25 ° C lower, still more preferably 10 ° C to 20 ° C lower.
  • step (c) the frozen biocompatible polymer obtained in step (b) is lyophilized.
  • Freeze-drying can be performed by a conventional method.
  • freeze-drying can be performed by vacuum drying at a temperature lower than the melting point of the solvent and further vacuum drying at room temperature (20 ° C.).
  • the biocompatible polymer block can be produced by pulverizing the porous body obtained in the step (c).
  • any cell can be used as long as it can perform cell transplantation, which is the purpose of the cell structure of the present invention, and the type thereof is not particularly limited. Further, one type of cell may be used, or a plurality of types of cells may be used in combination.
  • the cells to be used are preferably animal cells, more preferably vertebrate cells, and particularly preferably human cells. Vertebrate-derived cells (particularly human-derived cells) may be any of universal cells, somatic stem cells, progenitor cells, or mature cells. For example, embryonic stem (ES) cells, reproductive stem (GS) cells, or induced pluripotent stem (iPS) cells can be used as the universal cells.
  • ES embryonic stem
  • GS reproductive stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • somatic stem cells for example, mesenchymal stem cells (MSC), hematopoietic stem cells, amniotic cells, umbilical cord blood cells, bone marrow-derived cells, myocardial stem cells, adipose-derived stem cells, or neural stem cells can be used.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • progenitor cells and mature cells include skin, dermis, epidermis, muscle, heart muscle, nerve, bone, cartilage, endothelium, brain, epithelium, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, oral cavity, cornea, bone marrow, umbilical cord Cells derived from blood, amniotic membrane, or hair can be used.
  • human-derived cells examples include ES cells, iPS cells, MSCs, chondrocytes, osteoblasts, osteoprogenitor cells, mesenchymal cells, myoblasts, cardiomyocytes, cardioblasts, neurons, hepatocytes, Beta cells, fibroblasts, corneal endothelial cells, vascular endothelial cells, corneal epithelial cells, amniotic cells, umbilical cord blood cells, bone marrow derived cells, or hematopoietic stem cells can be used.
  • the origin of the cell may be either an autologous cell or an allogeneic cell.
  • myocardial cells in heart diseases such as severe heart failure and severe myocardial infarction, myocardial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, skeletal muscle-derived cells (especially satellite cells), bone marrow cells (especially myocardial cells) can be preferably used.
  • transplanted cells can be appropriately selected in other organs. For example, transplantation of neural progenitor cells or cells that can differentiate into nerve cells to cerebral ischemia / cerebral infarction, vascular endothelial cells or cells that can differentiate into vascular endothelial cells to myocardial infarction / skeletal muscle ischemia Examples include transplantation.
  • cells used for cell transplantation for diabetic organ damage can be mentioned.
  • cells for cell transplantation treatment that have been variously studied for diseases such as kidney, pancreas, peripheral nerves, eyes, and blood circulation disorders of the extremities. That is, attempts have been made to transplant insulin-secreting cells into the pancreas whose insulin secreting ability has been reduced, transplantation of bone marrow-derived cells for limb circulation disorders, and such cells can be used.
  • vascular cells can also be used.
  • the vascular cell means a cell related to angiogenesis, and is a cell constituting blood vessels and blood, and a progenitor cell and a somatic stem cell that can differentiate into the cell.
  • vascular cells include cells that do not naturally differentiate into cells that constitute blood vessels and blood, such as universal cells such as ES cells, GS cells, or iPS cells, and mesenchymal stem cells (MSC). I can't.
  • the vascular system cell is preferably a cell constituting a blood vessel.
  • specific examples of cells constituting blood vessels include vascular endothelial cells and vascular smooth muscle cells.
  • Vascular endothelial cells may be either venous endothelial cells or arterial endothelial cells.
  • Vascular endothelial progenitor cells can be used as progenitor cells for vascular endothelial cells.
  • Vascular endothelial cells and vascular endothelial progenitor cells are preferred.
  • As cells constituting blood blood cells can be used, white blood cells such as lymphocytes and neutrophils, monocytes, and hematopoietic stem cells which are stem cells thereof can be used.
  • the non-vascular cell means a cell other than the above-mentioned vascular cell.
  • ES cells iPS cells, mesenchymal stem cells (MSC), myocardial stem cells, cardiomyocytes, fibroblasts, myoblasts, chondrocytes, myoblasts, hepatocytes or nerve cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • myocardial stem cells cardiomyocytes
  • fibroblasts fibroblasts
  • myoblasts myoblasts
  • chondrocytes myoblasts
  • hepatocytes or nerve cells can be used.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • chondrocyte, myoblast, myocardial stem cell, cardiomyocyte, hepatocyte or iPS cell can be used.
  • cardiac stem cell cardiac muscle cell or myoblast.
  • the culture surface has a plurality of depressions and a side wall portion standing on the outer periphery of the culture surface.
  • a mixture of the biocompatible polymer block, cells and liquid medium is added to the first culture container so that the liquid level of the mixture exceeds the culture surface.
  • the type of the liquid medium is not particularly limited and can be appropriately selected according to the type of cells to be used.
  • a growth medium or a differentiation medium may be used.
  • the growth medium include, but are not particularly limited to, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) + 10% FBS (fetal bovine serum), Takara Bio: MSCGM BulletKit (trademark), Lonza: EGM-2 + ECFC serum supplement.
  • the differentiation medium include Takara Bio: Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium: Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium, Takara Bio: Mesenchymal Stem Cell Osteoblast Differentiation Medium: Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium, and the like. There is no particular limitation.
  • step (B) of the method for producing a cell structure of the present invention the first culture vessel of step (A) is allowed to stand, and the hollow portion contains a biocompatible polymer block and cells.
  • a cell structure in which a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in the gaps between the cells is formed.
  • the released biocompatible polymer block is 30% by mass or less (more preferably 10% by mass or less, more preferably 5% by mass or less) of the total biocompatible polymer block,
  • the first culture vessel can be allowed to stand until it is most preferably 0% by mass).
  • the free biocompatible polymer block is 0% by mass of the total biocompatible polymer block is a state where there is no free biocompatible polymer block.
  • the first culture vessel is allowed to stand in step (B) for a time such that the ratio of the number of cell structures manufactured after step (C) to the number of depressions is 70% or more. .
  • the time for allowing the first culture vessel to stand is preferably 2 to 24 hours, more preferably 3 to 16 hours.
  • the biocompatible polymer block and the cell are sufficiently adhered, and the biocompatible polymer block and the cell are separated when subjected to the stirring culture process. This can be suppressed, and a cell structure can be efficiently formed.
  • the standing time is set to 24 hours or less, the cell structures can be prevented from fusing with each other, and a large number of uniform cell structures can be obtained.
  • Step (B) can be carried out in a CO 2 incubator as desired, and can be carried out generally at 30 to 45 ° C., preferably 35 ° C. to 40 ° C. (for example, 37 ° C.).
  • step (C) of the method for producing a cell structure of the present invention the contents of the first culture container obtained in step (B) are stirred and cultured in a second culture container equipped with stirring means.
  • the contents of the first culture container include a liquid medium, a cell structure, a biocompatible polymer block that does not form a cell structure, and cells that do not form a cell structure.
  • the operation of transferring the contents of the first culture vessel obtained in the step (B) to the second culture vessel equipped with a stirring means is not particularly limited, but can be performed by a conventional method, for example, using a pipette Then, the contents of the first culture container can be transferred to the second culture container equipped with stirring means.
  • the second culture container is a container for stirring culture, and is equipped with stirring means.
  • stirring means a stirring blade, a stirrer, or a means for rotating or vibrating the container itself can be used.
  • a commercially available culture vessel for example, a brand name 30 mL single use bioreactor (Able BWV-S03A) or the like) can also be used.
  • the medium used in the stirring culture in step (C) can be the same medium as the liquid medium described in step (A).
  • the medium used in the stirring culture in step (C) may be the same medium as the liquid medium used in step (A) or a different medium, but is preferably the same medium.
  • the medium used in the step (C) is the same medium as the liquid medium used in the step (A)
  • the step (C) the medium may be replaced with a new medium and then stirred and cultured.
  • the time for stirring and culturing the contents of the first culture vessel in the step (C) is preferably 12 hours to 93 hours, and more preferably 18 hours to 48 hours.
  • the cell structure produced by the method of the present invention includes a biocompatible polymer block and cells.
  • a biocompatible polymer block and cells using a biocompatible polymer block and cells, a plurality of biocompatible polymer blocks are three-dimensionally arranged in a gap between a plurality of cells. This enables nutrient delivery from the outside to the inside of the cell structure.
  • the cell structure may be referred to as a mosaic cell mass (a mosaic cell mass).
  • a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a gap between a plurality of cells.
  • a “gap between cells” is configured. It is not necessary that the space is closed by the cells to be closed, as long as it is sandwiched between the cells. Note that there is no need for a gap between all cells, and there may be a place where the cells are in contact with each other.
  • the gap distance between the cells via the biocompatible polymer block that is, the gap distance when selecting a cell and a cell that is present at the shortest distance from the cell is not particularly limited.
  • the size is preferably the size of the polymer block, and the preferred distance is also within the preferred size range of the biocompatible polymer block.
  • the biocompatible polymer block is sandwiched between cells, but there is no need for cells between all the biocompatible polymer blocks, and the biocompatible polymer blocks are in contact with each other. There may be.
  • the distance between the biocompatible polymer blocks via the cells that is, the distance when the biocompatible polymer block and the biocompatible polymer block existing at the shortest distance from the biocompatible polymer block are selected are particularly Although not limited, it is preferably the size of a cell mass when one to several cells are used, for example, 10 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less, preferably 10 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less. More preferably, it is 10 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • the ratio of the cell and the biocompatible polymer block in the cell structure is not particularly limited, but preferably the ratio of the biocompatible polymer block per cell is preferably 0.0000001 ⁇ g or more and 1 ⁇ g or less, Preferably it is 0.000001 microgram or more and 0.1 microgram or less, More preferably, it is 0.00001 microgram or more and 0.01 microgram or less, Most preferably, it is 0.00002 microgram or more and 0.006 microgram or less.
  • the ratio of the cells to the biocompatible polymer block within the above range, the cells can be present more uniformly.
  • the component in the biocompatible polymer block is not particularly limited, and examples include components contained in the liquid medium.
  • the thickness or diameter of the cell structure to be produced is preferably 10 ⁇ m or more and 1 cm or less, more preferably 10 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less, still more preferably 15 ⁇ m or more and 1500 ⁇ m or less, and most preferably 20 ⁇ m or more and 1300 ⁇ m or less.
  • regions composed of biocompatible polymer blocks and regions composed of cells are arranged in a mosaic pattern.
  • the “thickness or diameter of the cell structure” in the present specification indicates the following.
  • the length of the line segment that divides the cell structure so that the distance from the outside of the cell structure becomes the shortest in a straight line passing through the point A is shown. Minute A.
  • a point A having the longest line segment A is selected in the cell structure, and the length of the line segment A at that time is defined as the “thickness or diameter of the cell structure”.
  • the cell structure produced by the production method of the present invention can be used for cell transplantation.
  • the sheet-like cell structure of the present invention can be used for the purpose of cell transplantation at a disease site such as heart disease such as severe heart failure or severe myocardial infarction, or cerebral ischemia / cerebral infarction. It can also be used for diseases such as diabetic kidneys, pancreas, liver, peripheral nerves, eyes, and limb circulation disorders.
  • a disease site such as heart disease such as severe heart failure or severe myocardial infarction, or cerebral ischemia / cerebral infarction. It can also be used for diseases such as diabetic kidneys, pancreas, liver, peripheral nerves, eyes, and limb circulation disorders.
  • an incision, an endoscope, or the like can be used as an implantation method.
  • CBE3 Recombinant peptide (recombinant gelatin)
  • the following CBE3 was prepared as a recombinant peptide (recombinant gelatin) (described in International Publication No. WO2008 / 103041).
  • CBE3 Molecular weight: 51.6 kD Structure: GAP [(GXY) 63 ] 3
  • the amino acid sequence of CBE3 does not include serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine.
  • CBE3 has an ERGD sequence.
  • GAP GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP) 3 GAP (GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP) 3 GAP (GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKG
  • PTFE thickness / cylindrical container A cylindrical cup-shaped container made of polytetrafluoroethylene (PTFE) having a bottom surface thickness of 3 mm, a diameter of 51 mm, a side surface thickness of 8 mm, and a height of 25 mm was prepared.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the cylindrical cup has a curved surface as a side surface, the side surface is closed with 8 mm PTFE, and the bottom surface (flat plate shape) is also closed with 3 mm PTFE.
  • the upper surface has an open shape. Therefore, the inner diameter of the cylindrical cup is 43 mm.
  • this container is referred to as a PTFE thick / cylindrical container.
  • a cylindrical cup-shaped container made of aluminum (aluminum) having a thickness of 1 mm and a diameter of 47 mm was prepared.
  • the cylindrical cup has a curved surface as a side surface, the side surface is closed with 1 mm aluminum, and the bottom surface (flat plate shape) is also closed with 1 mm aluminum.
  • the upper surface has an open shape.
  • Teflon registered trademark
  • the inner diameter of the cylindrical cup is 45 mm.
  • a 2.2 mm glass plate is bonded to the bottom of the container in addition to aluminum.
  • this container is referred to as an aluminum glass plate / cylindrical container.
  • the CBE3 aqueous solution was poured into a PTFE thick / cylindrical container, an aluminum glass plate / cylindrical container, and the CBE3 aqueous solution was cooled from the bottom using a cooling shelf in a vacuum freeze dryer (TF5-85ATNNN: Takara Seisakusho).
  • TF5-85ATNNN Takara Seisakusho
  • the combination of the container, the final concentration of the CBE3 aqueous solution, the amount of liquid, and the shelf temperature was prepared as described below.
  • Condition A PTFE thick cylindrical container, final concentration of CBE3 aqueous solution 4% by mass, amount of aqueous solution 4mL.
  • the frozen product is then dried for 24 hours at -20 ° C after returning the shelf temperature to -20 ° C.
  • the shelf temperature is increased to 20 ° C with vacuum drying continued. Then, vacuum drying was further performed at 20 ° C. for 48 hours until the degree of vacuum was sufficiently reduced (1.9 ⁇ 10 5 Pa), and then the product was taken out from the vacuum freeze dryer. Thereby, a porous body was obtained.
  • Condition B Aluminum / glass plate / cylindrical container, final concentration of CBE3 aqueous solution 4% by mass, amount of aqueous solution 4mL. Set the shelf temperature to -10 ° C, cool to -10 ° C for 1 hour, then -20 ° C for 2 hours, further -40 ° C for 3 hours, and finally freeze at -50 ° C for 1 hour It was. The frozen product is then dried for 24 hours at -20 ° C after returning the shelf temperature to -20 ° C. After 24 hours, the shelf temperature is increased to 20 ° C with vacuum drying continued. Then, vacuum drying was further performed at 20 ° C. for 48 hours until the degree of vacuum was sufficiently reduced (1.9 ⁇ 10 5 Pa), and then the product was taken out from the vacuum freeze dryer. Thereby, a porous body was obtained.
  • Condition C PTFE thick / cylindrical container, final concentration of 4 mass% of CBE3 aqueous solution, 10 mL of aqueous solution.
  • Set the shelf temperature to -10 ° C cool to -10 ° C for 1 hour, then -20 ° C for 2 hours, further -40 ° C for 3 hours, and finally freeze at -50 ° C for 1 hour It was.
  • the frozen product is then dried for 24 hours at -20 ° C after returning the shelf temperature to -20 ° C.
  • the shelf temperature is increased to 20 ° C with vacuum drying continued.
  • vacuum drying was further performed at 20 ° C. for 48 hours until the degree of vacuum was sufficiently reduced (1.9 ⁇ 10 5 Pa), and then the product was taken out from the vacuum freeze dryer. Thereby, a porous body was obtained.
  • condition A, condition B, and condition C the liquid temperature falls below 0 ° C., which is the melting point, in the shelf temperature ⁇ 10 ° C. setting section (before lowering to ⁇ 20 ° C.), and in this state It can be seen that freezing has not occurred (unfrozen / supercooled).
  • the temperature difference between the cooling surface liquid temperature and the non-cooling surface liquid temperature was 2.5 ° C. or less.
  • “temperature difference” means “non-cooling surface liquid temperature” ⁇ “cooling surface liquid temperature”.
  • the term “temperature difference immediately before” as used in the present invention refers to the highest temperature among the temperature differences that can be detected between 1 second and 20 seconds before the event (solidification heat generation, etc.). Yes.
  • the porous body-derived block of Condition A that has been crosslinked for 48 hours is referred to as E
  • the porous body-derived block of Condition B that has been crosslinked for 48 hours is referred to as F.
  • E and F are small temperature difference blocks made from a porous material produced by a freezing process with a small temperature difference.
  • the difference in the crosslinking time did not affect the performance in the evaluation of the present application, those that were crosslinked for 48 hours were used as representatives.
  • E and F there was no difference in performance.
  • the biocompatible polymer block obtained in Reference Example 3 is also referred to as “petal block”.
  • biocompatible polymer blocks prepared under Condition A, size 53 to 106 ⁇ m, and crosslinking time 48 hours were used.
  • the tap density is a value indicating how many blocks can be densely packed in a certain volume. The smaller the value, the less densely packed, that is, the block density It can be said that the structure is complicated.
  • the tap density was measured as follows. First, a funnel having a cap (diameter 6 mm, length 21.8 mm cylindrical shape: capacity 0.616 cm 3 ) was prepared, and the mass of the cap alone was measured. After that, a cap was attached to the funnel, and the block was poured from the funnel so that the block accumulated in the cap.
  • the cap part was struck 200 times on a hard place such as a desk, the funnel was removed, and it was rubbed with a spatula. The mass was measured with the cap fully filled. The mass of only the block was calculated from the difference from the mass of only the cap, and the tap density was determined by dividing by the volume of the cap. As a result, the tap density of the biocompatible polymer block of Reference Example 3 was 98 mg / cm 3 .
  • the cross-linking degree of the biocompatible polymer block of Reference Example 3 was 4.2.
  • Example 1 Production of a large number of cell structures (mosaic cell clusters) (multiwell dish container + agitation culture process) Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) are suspended in a growth medium (Takara Bio: MSCGM BulletKit (trademark)), and the biocompatible polymer block (53-106 ⁇ m) prepared in Reference Example 3 is added thereto, EZSPHERE (registered trademark) dish, which is a 90 mm dish that is non-cell-adherent, with hMSC (1.2 ⁇ 10 8 cells) and biocompatible polymer block (25 mg) suspended in a 23 mL medium.
  • EZSPHERE registered trademark
  • Type 903 (spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, number of spheroid wells to about 6,000 wells.
  • the bottom surface is a culture surface having a recess, and has a side outer wall portion standing on the periphery of the culture surface. AGC Sowed in technograss). At this time, a mixture of biocompatible polymer block, cells and liquid medium was added to the 90 mm dish beyond the culture surface.
  • the 90 mm dish was allowed to stand at 37 ° C. for 5 hours in a CO 2 incubator (at this point, there was no free biocompatible polymer block). Then, all the contents were transferred to a 30 mL single-use bioreactor (Able BWV-S03A) (second culture vessel equipped with stirring means) with a pipette, left to stand for 10 minutes, and the supernatant was removed and fresh. The medium was changed to 30 mL, and stirring culture was performed at a rotation speed of 70 rpm for 24 hours. As a result, we succeeded in producing about 6,000 uniform cell structures at the same time without fusing or disrupting the cell structures. The manufacturing process and results are shown in FIG. As a result of measuring 1169 cell structures, the minimum value was 23.89 ⁇ m, the maximum value was 909.40 ⁇ m, the average value was 419.51 ⁇ m, and the standard deviation was 625.81 ⁇ m.
  • Example 2 Production of a large number of cell structures (mosaic cell clumps) (multiwell dish container + agitation culture process) Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) are suspended in a growth medium (Takara Bio: MSCGM BulletKit (trademark)), and the biocompatible polymer block (53-106 ⁇ m) prepared in Reference Example 3 is added thereto, EZSPHERE (registered trademark) dish, which is a 90 mm dish that is non-cell-adherent, with hMSC (1.2 ⁇ 10 8 cells) and biocompatible polymer block (25 mg) suspended in a 23 mL medium.
  • EZSPHERE registered trademark
  • Type 903 (spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, number of spheroid wells to about 6,000 wells.
  • the bottom surface is a culture surface having a recess, and has a side outer wall portion standing on the periphery of the culture surface. AGC Sowed in technograss). At this time, a mixture of biocompatible polymer block, cells and liquid medium was added to the 90 mm dish beyond the culture surface.
  • the 90 mm dish was allowed to stand at 37 ° C. for 23 hours in a CO 2 incubator (at this point, there was no free biocompatible polymer block). Then, all the contents were transferred to a 30 mL single-use bioreactor (Able BWV-S03A) (second culture vessel equipped with stirring means) with a pipette, left to stand for 10 minutes, and the supernatant was removed and fresh. The medium was changed to 30 mL, and stirring culture was performed at a rotation speed of 50 rpm for 21 hours. As a result, we succeeded in producing about 6,000 uniform cell structures at the same time without fusing or disrupting the cell structures. The manufacturing process and results are shown in FIG. As a result of measuring 317 cell structures, the minimum value was 23.89 ⁇ m, the maximum value was 953.95 ⁇ m, the average value was 415.56 ⁇ m, and the standard deviation was 498.80 ⁇ m.
  • Type 903 (spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, number of spheroid wells to about 6,000 wells.
  • the bottom surface is a culture surface having a recess, and has a side outer wall portion standing on the periphery of the culture surface. AGC Sowed in technograss). At this time, a mixture of biocompatible polymer block, cells and liquid medium was added to the 90 mm dish beyond the culture surface.
  • Type 903 (spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, number of spheroid wells to about 6,000 wells.
  • the bottom surface is a culture surface having a recess, and has a side outer wall portion standing on the periphery of the culture surface. AGC Sowed in technograss). At this time, a mixture of biocompatible polymer block, cells and liquid medium was added to the 90 mm dish beyond the culture surface.
  • FIG. 14 shows the result of stirring culture for 48 hours.
  • the size of the obtained cell structure was evaluated. 70% or more is the same size (same size means that it is within ⁇ 50% of the median size), A is greater than 40% and less than 70% is B, 40% or less In some cases, C was designated. That is, A is superior in size uniformity, B is inferior to A, and C is further inferior to B.
  • Table 1 The evaluation results are shown in Table 1.
  • Comparative Example 3 a multi-well was not used, and fusion avoidance was not measurable on the evaluation index. As shown in Table 1, the production methods of Examples 1 and 2 were excellent in fusion avoidance and size uniformity.

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Abstract

本発明の課題は、細胞構造体を、短時間に、均一かつ大量に製造することができる方法を提供することである。本発明によれば、窪み部が複数形成された培養面および上記培養面の外周縁に立設される側壁部を有する第一の培養容器に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を、上記混合物の液面が上記培養面を超えるように添加する工程；第一の培養容器を静置して、上記窪み部において細胞構造体を形成する工程；および第一の培養容器の内容物を、撹拌手段を備えた第二の培養容器において、撹拌培養する工程を含む、細胞構造体の製造方法が提供される。

Description

細胞構造体の製造方法
　本発明は、生体親和性高分子ブロックおよび細胞を含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体の製造方法に関する。
　現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を図る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織を、細胞、足場および成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。近年では、細胞を使った治療が徐々に実現されつつある。例えば、自家細胞を用いた培養表皮、自家軟骨細胞を用いた軟骨治療、間葉系幹細胞を用いた骨再生治療、筋芽細胞を用いた心筋細胞シート治療、角膜上皮シートによる角膜再生治療、および神経再生治療などが挙げられる。これらの新たな治療は、従来の人工物による代替医療（例えば、人工骨補填剤やヒアルロン酸注射など）とは異なり、生体組織の修復・再生を図るものであり、高い治療効果を得られる。実際、自家細胞を用いた培養表皮や培養軟骨などの製品が市販されてきた。
　特許文献１には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献１に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献１の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されている。
　また、特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞移植用細胞構造体が記載されている。
　さらに特許文献３には、グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞移植用細胞構造体であって、生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ３以上５００ｍｇ／ｃｍ３以下であるか、または高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である、細胞移植用細胞構造体が記載されている。
　上記した特許文献１から３においては、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体を、１ウェル内に１つずつ製造するという小スケールでの製造方法が記載されている。
　一方、特許文献４には、被培養物が培養される隔室を形成する窪み部が培養基材表面に複数形成されており、互いに近接する窪み部の間の培養基材表面が非平坦面であることを特徴とする培養基材が記載されており、この培養基材を用いてスフェロイド培養を行うことが記載されている。
　また、特許文献５には、 被培養物が培養される隔室を形成する窪み部が複数形成された培養面と、培養面を底面に備える容器本体と、複数の窪み部の上部に載置され窪み部の開口を塞ぐ透液性蓋体とを備え、培養面は、互いに近接する窪み部の間の頂部が非平坦面からなり、透液性蓋体は、容器本体内の培養液中に浸漬された状態で窪み部の間の頂部との距離が、窪み部内で培養された被培養物の外径寸法よりも小さくなるよう配置されていることを特徴とする、スフェロイド培養を行うための細胞培養容器が記載されている。
国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号 特開２０１４－１２１１４号公報 国際公開ＷＯ２０１４／１３３０８１号 国際公開ＷＯ２０１２／０３６０１１号 特開２０１５－７３５２０号公報
　生体組織の修復・再生に用いる場合には、大量に、例えば１，０００個以上の細胞構造体を同時に製造することが望まれる場合がある。細胞塊を大量に培養する方法としては、細胞塊を培地に浮遊させて撹拌する方法が知られている。しかし、細胞構造体の製造に浮遊撹拌培養法を用いた場合、（１）細胞構造体の形成効率が悪い（すなわち、細胞構造体を形成せずに、個々に存在する高分子ブロックと細胞の割合が大きい）、（２）得られる細胞構造体の高分子ブロックと細胞の比率が細胞構造体ごとに異なる、および（３）細胞構造体の個々の大きさが異なる等の問題を有することが本発明者らの検討によって明らかになった。細胞構造体を生体組織の修復および再生に用いる場合、優れた治療効果を得るためには、細胞構造体が均一（例えば、高分子ブロックと細胞との比率、形状または大きさ等が均一）であることが望ましい。
　本発明の課題は、生体親和性高分子ブロックおよび細胞を含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を、短時間に、均一かつ大量に製造することができる方法を提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、窪み部が複数形成された培養面および培養面の外周縁に立設される側壁部を有する第一の培養容器に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を添加して静置することにより細胞構造体を形成し、次いで、上記の細胞構造体を、撹拌手段を備えた第二の培養容器において撹拌培養することによって、細胞構造体を、短時間に、均一かつ大量に製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　（Ａ）窪み部が複数形成された培養面および上記培養面の外周縁に立設される側壁部を有する第一の培養容器に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を、上記混合物の液面が上記培養面を超えるように添加する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の第一の培養容器を静置して、上記窪み部において、上記生体親和性高分子ブロックおよび上記細胞を含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を形成する工程；および
（Ｃ）工程（Ｂ）で得た上記第一の培養容器の内容物を、撹拌手段を備えた第二の培養容器において、撹拌培養する工程；
を含む、細胞構造体の製造方法。
（２）　工程（Ｂ）において、遊離している生体親和性高分子ブロックが全生体親和性高分子ブロックの３０質量％以下になるまで、第一の培養容器を静置する、（１）に記載の細胞構造体の製造方法。
（３）　窪み部の個数に対する工程（Ｃ）後に製造された細胞構造体の個数の比率が７０％以上となるような時間だけ、工程（Ｂ）において第一の培養容器を静置する、（１）または（２）に記載の細胞構造体の製造方法。
（４）　上記生体親和性高分子ブロックの大きさが、１μｍ～７００μｍである、（１）から（３）のいずれか一に記載の細胞構造体の製造方法。
（５）　培養面および窪み部の表面が、細胞接着抑制のための処理がなされている、（１）から（４）のいずれか一に記載の細胞構造体の製造方法。
（６）　窪み部の深さが上記生体親和性高分子ブロックの大きさの２～１００倍であり、窪み部の口径が上記生体親和性高分子ブロックの大きさの２～１００倍である、（１）から（５）のいずれか一に記載の細胞構造体の製造方法。
（７）　第一の培養容器を静置する時間が、２時間～２４時間である、（１）から（６）のいずれか一に記載の細胞構造体の製造方法。
（８）　工程（Ｃ）における第一の培養容器の内容物を撹拌培養する時間が、１２時間～９３時間である、（１）から（７）のいずれか一に記載の細胞構造体の製造方法。
（９）　生体親和性高分子が、ゼラチンである、（１）から（８）のいずれか一に記載の細胞構造体の製造方法。
（１０）　ゼラチンが、下記式で示される、（９）に記載の細胞構造体の製造方法。
式：Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
（１１）　ゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（９）または（１０）に記載の細胞構造体の製造方法。
　本発明の細胞構造体の製造方法によれば、生体親和性高分子ブロックおよび細胞を含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を、短時間に、均一かつ大量に製造することができる。
図１は、第一の培養容器の斜視図である。 図２は、第一の培養容器の第一の例（窪み部の間の領域の上面、即ち、窪み部の最上部が非平坦）の断面図である。図２（ａ）は、細胞接着抑制剤層がない例を示し、図２（ｂ）は、細胞接着抑制剤層がある例を示す。 図３は、第一の培養容器の第二の例（窪み部の間の領域の上面、即ち、窪み部の最上部が平坦）の断面図である。図３（ａ）は、細胞接着抑制剤層がない例を示し、図３（ｂ）は、細胞接着抑制剤層がある例を示す。 図４は、図２（ａ）の部分拡大図である。 図５は、図３（ａ）の部分拡大図である。 図６は、レーザー光の照射スポットを示す。 図７は、実施例の条件Ａの液温プロファイルを示す。 図８は、実施例の条件Ｂの液温プロファイルを示す。 図９は、実施例の条件Ｃの液温プロファイルを示す。 図１０は、実施例１の製造工程および結果を示す。 図１１は、実施例２の製造工程および結果を示す。 図１２は、比較例１の製造工程および結果を示す。 図１３は、比較例２の製造工程および結果を示す。 図１４は、比較例３の製造工程および結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明による細胞構造体の製造方法は、
（Ａ）窪み部が複数形成された培養面および培養面の外周縁に立設される側壁部を有する第一の培養容器に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を、混合物の液面が培養面を超えるように添加する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の第一の培養容器を静置して、窪み部において、生体親和性高分子ブロックおよび細胞を含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を形成する工程；および
（Ｃ）工程（Ｂ）で得た第一の培養容器の内容物を、撹拌手段を備えた第二の培養容器において、撹拌培養する工程；
を含む。
　本発明の製造方法においては、窪み部が複数形成された培養面および培養面の外周縁に立設される側壁部を有する第一の培養容器に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を、上記混合物の液面が上記培養面を超えるように添加することにより、一工程において上記第一の培養容器の全ての窪み部に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地を添加することができる。これにより、本発明の方法によれば、短時間で細胞構造体を製造することができる。
　本発明においては、第一の培養容器の窪み部において、生体親和性高分子ブロックおよび細胞を含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を形成した後に、第一の培養容器の内容物を、撹拌手段を備えた第二の培養容器において、撹拌培養する。撹拌培養する工程の後に得られる細胞構造体は、例えば、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞との比率、形状および大きさの少なくとも一以上が均一である。なお、「比率、形状および大きさの少なくとも一以上が均一である」とは、上記の比率、形状および大きさの少なくとも一以上が完全に同一である場合のみを意味するわけではなく、後記する比較例１～３に示す条件下で細胞構造体を製造した場合と比較して、上記の比率、形状および大きさの少なくとも一以上が均一であることを意味する。
　本発明においては、細胞構造体を撹拌培養することにより、細胞構造体同士の融合および崩壊を防ぎながら、細胞構造体中の細胞への十分な栄養・酸素の送達が可能となるため、細胞生存性に優れた細胞構造体を製造することができる。
　生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を、混合物の液面が第一の培養容器の培養面を超えるように添加した場合、培養面の窪み部の間の上面に細胞構造体を形成していない高分子ブロックおよび細胞が存在することがある。このような場合であっても、細胞構造体を撹拌培養することにより、細胞構造体を形成していない高分子ブロックおよび細胞を細胞構造体に取り込ませて、より大きな細胞構造体を形成することができる。さらに、撹拌による物理的な力によって、細胞構造体に含まれる高分子ブロックと細胞との接着が強固になる。
　上記の通り、本発明の方法においては、第一の培養容器に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を、混合物の液面が培養面を超えるように添加すること、そして細胞構造体を形成させた後の第一の培養容器の内容物を、撹拌手段を備えた第二の培養容器において、撹拌培養するという構成を採用することによって、細胞構造体を、短時間に、均一かつ大量に製造することが可能になった。
（１）第一の培養容器
　本発明で用いる第一の培養容器は、窪み部が複数形成された培養面および上記培養面の外周縁に立設される側壁部を有する培養容器である。
　本発明で用いる第一の培養容器の例を、図１から図６を参照して説明する。
  図１に示す例においては、培養容器は、容器本体１０および蓋１２を有する。
　容器本体１０は、円板状の底板部１４および環状の側壁部１６を有している。底板部１４は、例えばポリスチレンなどの合成樹脂材、またはガラスから構成されていてもよい。底板部１４は、例えば、合成樹脂材料を用いた射出成形により製造することができる。
　容器の形状は、円板状以外の形状でもよく、四角などの形状でもよい。側壁部１６は、底板部１４の外周縁から起立している。底板部１４の直径は、例えば３０ｍｍ～５００ｍｍ、底板部１４の厚さは、例えば０．５ｍｍ～１０ｍｍ、側壁部１６の高さは、例えば２０ｍｍ～１００ｍｍとすることができるが、特に限定されない。
  蓋１２は、容器本体１０の上方の開口部に対応した形状に形成されている。蓋１２は、細胞の培養環境を維持するために、容器本体１０に被せて使用することができる。
  底板部１４の上面のウェル形成領域２４（すなわち、被培養物が培養される隔室が形成される領域）には、図２または図３に示したように、複数の窪み部２０が形成されている。窪み部２０の内面は、滑らかな凹面になっている。窪み部２０は、被培養物が培養される隔室（ウェル）を形成する。
　図２（ａ）および図３（ａ）に示す例においては、細胞接着抑制剤層が存在しない。図２（ｂ）および図３（ｂ）に示す例においては、細胞接着抑制剤層３０が、設けられている。
　培養面２６とは、ウェル形成領域２４の最上部を含む表面を意味する（図２～図５を参照）。
　窪み部の深さは、特に限定されないが、好ましくは生体親和性高分子ブロックの大きさの２～１００倍であり、より好ましくは生体親和性高分子ブロックの大きさの２～１０倍であり、さらに好ましくは生体親和性高分子ブロックの大きさの３～１０倍である。
　窪み部の深さは、特に限定されないが、好ましくは１０～２０００μｍであり、より好ましくは２０～１０００μｍであり、さらに好ましくは３０～７００μｍであり、さらに好ましくは５０～５００μｍであり、最も好ましくは１００～４００μｍである。
　窪み部の口径は、特に限定されないが、好ましくは生体親和性高分子ブロックの大きさの２～１００倍であり、より好ましくは生体親和性高分子ブロックの大きさの３～５０倍であり、さらに好ましくは生体親和性高分子ブロックの大きさの５～１０倍である。
　窪み部の口径は、特に限定されないが、好ましくは１０～２０００μｍであり、より好ましくは５０～１５００μｍであり、さらに好ましくは１００～１５００μｍであり、さらに好ましくは２００～１０００μｍであり、最も好ましくは４００～１０００μｍである。
　窪み部の深さおよび口径を上記の範囲とすることは、細胞の大きさとの関係において、強度および形状維持性能に優れた細胞構造体を得るという観点から好ましい。
　なお、窪み部が、上記の深さおよび口径を有する場合、培養容器の全ての窪み部が、上記の深さおよび口径を有する必要はなく、少なくとも一部の窪み部が上記の深さおよび口径を有するものであってもよい。
　窪み部の深さとは、図４および図５に示す通り、窪み部の最下部と最上部との間の高さを意味する。窪み部の口径は、図４および図５に示す通り、窪み部の最上部の点を結んだ長さを意味する。なお、図５に示す通り、窪み部の最上部が平坦である場合には、窪み部の最上部の点を結んだ長さが最短になるように、窪み部の最上部を選択する。
　窪み部の形状（深さおよび口径を含む）は、均一でもよいし不均一でもよいが、好ましくは均一である。窪み部の深さおよび口径は、均一であることが好ましく、すべての窪み部の深さおよび口径は、実質的に同一であることが好ましい。
  窪み部２０は、例えば、ウェル形成領域２４に対してレーザ光を照射することにより形成することができる。レーザ照射は、図６に示したように、ｘ－ｙ面上に設置された底板部１４の上面に対して、レーザ光をｚ軸方向に照射して行う。
  まず、レーザ照射装置の照射部をｘ軸の正方向に走査させつつ、一定の間隔（例えば８００μｍ）ごとにレーザ光を照射して、ｘ軸方向に並んだ複数の窪み部２０を形成する。続けて、照射部をｙ軸方向に一定の距離（例えば４００μｍ）だけ走査させた後、照射部をｘ軸の負方向に走査させつつ、一定の間隔（例えば８００μｍ）ごとにレーザ光を照射して、ｘ軸方向に並んだ複数の窪み部２０を形成する。同様に、照射部をｙ軸方向に一定の距離（例えば４００μｍ）だけ走査させる。これを繰り返して、底板部１４の上面に規則的に配列された複数の窪み部２０を形成する。
　図６に示したように、照射スポットＡの中心座標（ｘ，ｙ）を原点（０，０）とすると、照射スポットＡに近接した照射スポットＢの中心は、（０．８，０）、照射スポットＣの中心は、（０．４，０．４）、照射スポットＤの中心は、（－０．４，０．４）に位置する。このように、照射スポットＡ，Ｂのｘ座標と照射スポットＣ，Ｄのｘ座標とをずらすことにより、ウェル形成領域２４に複数の窪み部２０を稠密に形成することができる。窪み部２０は、ウェル形成領域２４の単位面積あたり、１０個／ｃｍ２～１００００個／ｃｍ２、形成するのが好ましい。さらに好ましくは、２０個／ｃｍ２～８０００個／ｃｍ２、さらに好ましくは２０個／ｃｍ２～３０００個／ｃｍ２であり、さらに好ましくは５０個／ｃｍ２～１０００個／ｃｍ２であり、さらに好ましくは１００個／ｃｍ２～５００個／ｃｍ２であり、特に好ましくは１００個／ｃｍ２～３００個／ｃｍ２である。
　レーザ光源には、ＣＯ２レーザを用い、レーザ光は、出力１０Ｗ、照射速度６１００ｍｍ／ｍｉｎでパルス照射することができるが、特に限定されない。
  なお、照射スポットの形状は、円形であるのに対して、窪み部２０の開口形状は、略楕円形に偏平している。この開口形状の偏平は、容器本体１０の成形時において金型に合成樹脂材を流し込む方向に起因するものと考えられる。
  底板部１４の上面にレーザ光が照射されると、底板部１４を構成する合成樹脂材が溶解して、窪み部２０が形成される。
  レーザ光の照射位置や出力量などの照射条件を調節することにより、近接する窪み部２０間の距離、窪み部２０の径・深さ、互いに近接する窪み部２０間の培養基材表面の幅・高さなどを調節できる。
　ウェル形成領域２４は、複数の窪み部２０を形成する凸部、および窪み部の間の領域を形成する凹部を備えた金型を用いて、合成樹脂材料を射出成形して製造することもできる。複数の窪み部２０および窪み部の間の領域は、ウェル形成領域２４の成形と同時に形成される。金型を用いて射出成型によりウェル形成領域２４を製造することにより、より均一性の高い窪み部２０を形成することができる。
　窪み部の面積が、培養面の全面積に対して７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、１００％であることが最も好ましい。窪み部の面積の割合を上記の範囲とすることは、本発明の効果の観点から好ましい。
　窪み部の面積とは、窪み部を上方から観察した場合に窪み部を二次元で捉えたときの面積を意味し、本明細書中上記した窪み部の口径で規定される領域の面積を意味する。図２または図４に示すように、培養面上に平坦部が存在しない場合には、窪み部の面積が、培養面の全面積に対して１００％になる。
　互いに隣り合った２個の窪み部２０は、窪み部の間の領域を介して形成されている。互いに近接する窪み部２０間の培養基材表面は、平坦でも非平坦でもよいが、好ましくは非平坦である。
　培養面および窪み部の表面は、細胞接着抑制のための処理がなされていることが好ましい。これにより、細胞構造体を培養した後、剥離しやすくすることができる。細胞接着抑制のための処理としては、細胞接着抑制剤により被膜することが挙げられる（図２（ｂ）および図３（ｂ）を参照）。細胞接着抑制剤は、細胞が底板部１４の上面、特に、窪み部２０の内面に接着するのを抑制する役割を果たす。細胞接着抑制剤としては、例えば、リン脂質ポリマー、ＭＰＣ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、またはポリエチレングリコールなどが用いられる。
（２）生体親和性高分子ブロック
（２－１）生体性親和性高分子
　生体性親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、およびＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、または「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
　リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチンまたは化学合成ゼラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。
　化学合成ペプチドまたは化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチドまたはゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記の（２－３）ゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。
　ゼラチン、特にリコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
　本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ４）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図－基礎と応用－」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
　本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。
　本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
　本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。
（２－２）架橋
　本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際および生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、または酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
　酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として販売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
　架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、－１００℃～５００℃であり、より好ましくは０℃～３００℃であり、更に好ましくは５０℃～３００℃であり、更に好ましくは１００℃～２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃～２００℃である。
（２－３）ゼラチン
　生体親和性高分子としては、ゼラチンが好ましい。ゼラチンとしては、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチン、または化学合成ゼラチンの何れでもよい。
　本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列（ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、US特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のゼラチンである。
　リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度および分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
　ゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
　ゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸にはイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。好ましくは、ゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙの繰り返し構造である。
　一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０～４０％であり、好ましくは２０～３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１種のアミノ酸、好ましくは２種以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
　一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを１分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
　本発明で用いるゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０～１００の間、好ましくは２５～６０の間で均一でないことが好ましい。
　この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３～５０個が好ましく、さらに好ましくは４～３０個、特に好ましくは５～２０個である。最も好ましくは１２個である。
　本発明で用いるゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。ゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。ペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは少なくとも６、更に好ましくは少なくとも８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、少なくとも０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明におけるゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明におけるゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
　ゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
　好ましくは、本発明で用いるゼラチンは、式１：Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２～１０の整数を示し、より好ましくは３～５の整数を示す。ｎは３～１００の整数が好ましく、１５～７０の整数がさらに好ましく、５０～６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
　より好ましくは、本発明で用いるゼラチンは、　式：Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
　繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、またはV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、またはIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
　本発明で用いるゼラチンの等電点は、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～１０であり、さらに好ましくは７～９．５である。ゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に従って、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
　好ましくは、ゼラチンは脱アミン化されていない。
　好ましくは、ゼラチンはテロペプタイドを有さない。
　好ましくは、ゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
　本発明で用いるゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである
　「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるゼラチンを調製することができる。
（２－４）生体親和性高分子ブロック
　本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状および多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状（顆粒）の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は上記の通り特に限定されるものではないが、タップ密度が、好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ３以上５００ｍｇ／ｃｍ３以下であり、より好ましくは２０ｍｇ／ｃｍ３以上４００ｍｇ／ｃｍ３以下であり、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｃｍ３以上２２０ｍｇ／ｃｍ３以下であり、特に好ましくは５０ｍｇ／ｃｍ３以上１５０ｍｇ／ｃｍ３以下である。
　タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であることが分かる。生体親和性高分子ブロックのタップ密度とは、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、および生体親和性高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。タップ密度が小さい程、生体親和性高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在でき、細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。
　本明細書でいうタップ密度は、以下のように測定できる。測定のために（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ３）の容器（以下、キャップと記載する）を用意する。まず、キャップのみの質量を測定する。その後、キャップにロートを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込む。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにする。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定する。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めることができる。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの架橋度は、特に限定されないが、好ましくは２以上であり、さらに好ましくは２以上３０以下であり、さらに好ましくは４以上２５以下であり、特に好ましくは４以上２２以下である。
　生体親和性高分子ブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載のＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定することができる。具体的には、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ３水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合して３７℃で３時間反応させた後に反応停止したサンプルと、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ３水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合した直後に反応停止させたブランクとをそれぞれ調製し、純水で希釈したサンプルおよびブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、および（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出することができる。
（式２）　（As-Ab）／１４６００×V／ｗ　
（式２）は、生体親和性高分子ブロック１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗは生体親和性高分子ブロック質量（ｍｇ）を示す。）
（式３）　１－（サンプル（式２）/未架橋の高分子（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの吸水率は、特に限定されないが、好ましくは３００％以上、より好ましくは４００％以上、さらに好ましくは５００％以上、特に好ましくは７００％以上、最も好ましくは８００％以上である。なお吸水率の上限は特に限定されないが、一般的には４０００％以下、または２０００％以下である。
　生体親和性高分子ブロックの吸水率の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載の方法により測定することができる。具体的には、２５℃において３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させ、それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って吸水率を求めることができる。
（式４）
　吸水率＝（ｗ２－ｗ１－ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
　本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１μｍ以上７００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上７００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上３００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、特に好ましくは５３μｍ以上１０６μｍ以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
　ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６～１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３～１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５～５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
（２－５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
　生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物（生体親和性高分子の多孔質体など）を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物（多孔質体など）は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。
　上記の通り、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより、表面形状が均一でない不定形の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
　生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができる。
　生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、または０．９℃以上でもよい。
　工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して行うことが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
　好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前～１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
　好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点－５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点－５℃以下かつ溶媒融点－２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点－６℃以下かつ溶媒融点－１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
　工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結されるための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
　工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
　本発明では好ましくは、上記工程（ｃ）で得られた多孔質体を粉砕することによって、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
（３）細胞
　本発明で用いる細胞は、本発明の細胞構造体の目的である、細胞移植を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、または成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、または神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞および成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、または毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、または造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞または他家細胞の何れでも構わない。
　例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患においては、自家および他家から摘出した心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、骨格筋由来細胞（特にサテライト細胞）、骨髄細胞（特に心筋様細胞に分化させた骨髄細胞）などを好適に使用することができる。更に、他の臓器においても、適宜移植細胞を選択することができる。例えば、脳虚血・脳梗塞部位への神経前駆細胞または、神経細胞に分化可能な細胞の移植、心筋梗塞部位・骨格筋虚血部位への血管内皮細胞または血管内皮細胞に分化可能な細胞の移植などを挙げることができる。
　また、糖尿病性の臓器障害に対する細胞移植に使用される細胞が挙げられる。例えば、腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対して、種々検討されている細胞移植治療法用の細胞が挙げられる。即ち、インスリン分泌能が低下した膵臓にインスリン分泌細胞を移植する試みや、四肢の血行障害に対する骨髄由来細胞の移植などが検討されており、このような細胞を使用することができる。
　また本発明においては、血管系細胞を使用することもできる。本明細書において、血管系細胞とは、血管形成に関連する細胞を意味し、血管および血液を構成する細胞、およびその細胞に分化することができる前駆細胞、体性幹細胞である。ここで、血管系細胞には、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、またはｉＰＳ細胞等の万能細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のような、血管および血液を構成する細胞に自然には分化しない細胞は含まれない。血管系細胞として、好ましくは血管を構成する細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）では、血管を構成する細胞の具体例としては、血管内皮細胞および血管平滑筋細胞を挙げることができる。血管内皮細胞は、静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の何れでもよい。血管内皮細胞の前駆細胞としては、血管内皮前駆細胞を使用することができる。好ましくは血管内皮細胞および血管内皮前駆細胞である。血液を構成する細胞としては、血球細胞が使用でき、リンパ球や好中球などの白血球細胞、単球細胞、それらの幹細胞である造血幹細胞を使用できる。
　本明細書において、非血管系細胞とは、上記の血管系細胞以外の細胞を意味する。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心筋幹細胞、心筋細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、肝細胞または神経細胞を使用することができる。好ましくは、ＭＳＣ、軟骨細胞、筋芽細胞、心筋幹細胞、心筋細胞、肝細胞またはｉＰＳ細胞を使用することができる。より好ましくは、ＭＳＣ、心筋幹細胞、心筋細胞または筋芽細胞である。
（４）細胞構造体の製造方法
　本発明の細胞構造体の製造方法の工程（Ａ）においては、窪み部が複数形成された培養面および培養面の外周縁に立設される側壁部を有する第一の培養容器に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を、上記混合物の液面が培養面を超えるように添加する。
　液体培地の種類は特に限定されず、使用する細胞の種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、増殖培地、または分化培地でもよい。
　増殖培地としては、ＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle Medium）＋１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）、タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標）、Ｌｏｎｚａ：ＥＧＭ－２＋ＥＣＦＣ serum supplementなどを挙げることができるが、特に限定されない。
　分化培地としては、タカラバイオ：間葉系幹細胞軟骨細胞分化培地：Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium、タカラバイオ：間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地：Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Mediumなどを挙げることができるが、特に限定されない。
　本発明の細胞構造体の製造方法の工程（Ｂ）においては、工程（Ａ）の第一の培養容器を静置して、窪み部において、生体親和性高分子ブロックおよび細胞を含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を形成する。
　工程（Ｂ）においては、好ましくは、遊離している生体親和性高分子ブロックが全生体親和性高分子ブロックの３０質量％以下（より好ましくは１０質量％以下、さらに好ましくは５質量％以下、最も好ましくは０質量％）になるまで、第一の培養容器を静置することができる。なお、遊離している生体親和性高分子ブロックが全生体親和性高分子ブロックの０質量％であるとは、遊離している生体親和性高分子ブロックが存在しない状態である。
　また、窪み部の個数に対する工程（Ｃ）後に製造された細胞構造体の個数の比率が７０％以上となるような時間だけ、工程（Ｂ）において第一の培養容器を静置することが好ましい。
　工程（Ｂ）においては、第一の培養容器を静置する時間は、２時間～２４時間であることが好ましく、３時間～１６時間であることがより好ましい。静置する時間を２時間以上とすることにより、生体親和性高分子ブロックおよび細胞の接着が十分なものとなり、撹拌培養する工程に供した場合に、生体親和性高分子ブロックと細胞が分離することを抑制でき、細胞構造体を効率的に形成することが可能になる。静置する時間を２４時間以下とすることにより、細胞構造体同士が融合することを抑制することができ、均一な細胞構造体を大量個数得ることが可能となる。
　工程（Ｂ）は、所望によりＣＯ２インキュベーター内で行うことができ、一般的には３０～４５℃、好ましくは３５℃～４０℃（例えば、３７℃）で行うことができる。
　本発明の細胞構造体の製造方法の工程（Ｃ）においては、工程（Ｂ）で得た第一の培養容器の内容物を、撹拌手段を備えた第二の培養容器において、撹拌培養する。
　第一の培養容器の内容物としては、液体培地、細胞構造体、細胞構造体を形成していない生体親和性高分子ブロック、および細胞構造体を形成していない細胞が含まれる。
　工程（Ｂ）で得た第一の培養容器の内容物を、撹拌手段を備えた第二の培養容器に移す作業は、特に限定されないが、常法により行うことができ、例えば、ピペットを用いて第一の培養容器の内容物を、撹拌手段を備えた第二の培養容器に移すことができる。
　第二の培養容器は、撹拌培養を行うための容器であり、撹拌手段を備えている。撹拌手段としては、撹拌羽根、スターラー、または容器自体を回転または振動させる手段などを使用することができる。第二の培養容器としては、市販の培養容器（例えば、商品名30mLシングルユースバイオリアクター（エイブル社ＢＷＶ-Ｓ０３Ａ）など）を使用することもできる。
　工程（Ｃ）における撹拌培養で使用する培地は、工程（Ａ）において記載した液体培地と同様の培地を使用することができる。工程（Ｃ）における撹拌培養で使用する培地は、工程（Ａ）で使用した液体培地と同一の培地でもよいし、異なる培地でもよいが、好ましくは同一の培地である。工程（Ｃ）において使用する培地が、工程（Ａ）で使用した液体培地と同一の培地である場合、工程（Ｃ）においては、新しい培地に交換してから、攪拌培養してもよい。
　工程（Ｃ）における第一の培養容器の内容物を撹拌培養する時間は、１２時間～９３時間が好ましく、１８時間～４８時間がより好ましい。上記の時間だけ攪拌培養することにより、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞との比率、形状および大きさが均一である細胞構造体を製造しやすくなる。
　また、撹拌培養における撹拌速度は、２０～２００ｒｐｍが好ましく、６０～９０ｒｐｍがより好ましい。ｒｐｍは、回毎分 (revolutions per minute)であり、１ｒｐｍ＝１ｍｉｎ－１である。
（５）細胞構造体
　本発明の方法で製造される細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含む。本発明においては、生体親和性高分子ブロックと細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させる。これにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能となる。本明細書において、細胞構造体は、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。
　細胞構造体の少なくとも一部の領域においては、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。生体親和性高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、生体親和性高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も生体親和性高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
　また、生体親和性高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての生体親和性高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、生体親和性高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した生体親和性高分子ブロック間の距離、即ち、生体親和性高分子ブロックとその生体親和性高分子ブロックから最短距離に存在する生体親和性高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１～数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上５００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上２００μｍ以下である。
　細胞構造体における、細胞と生体親和性高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞１個当りの生体親和性高分子ブロックの比率が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、より好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。細胞と生体親和性高分子ブロックの比率を上記範囲とすることにより、細胞をより均一に存在させることができる。下限を上記範囲とすることにより、所望の用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する生体親和性高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、生体親和性高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、液体培地に含まれる成分が挙げられる。
　製造される細胞構造体の厚さまたは直径は、好ましくは１０μｍ以上１ｃｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下である。細胞構造体の厚さまたは直径を上記の範囲内とすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達がより良好になる。
　本発明の細胞構造体においては、好ましくは、生体親和性高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域とがモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さまたは直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さまたは直径」とする。
（６）細胞構造体の用途
　本発明の製造方法により製造される細胞構造体は、細胞移植のために使用することができる。具体的には、本発明のシート状細胞構造体は、例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患、脳虚血・脳梗塞といった疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。また、糖尿病性の腎臓、膵臓、肝臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対しても用いることができる。
　移植方法としては、切開、内視鏡といったものが使用可能である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
［参考例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
　リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：　ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：－０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[参考例２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[PTFE厚・円筒形容器]
　底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
[アルミ硝子板・円筒形容器]
　厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ（アルミニウム）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子板・円筒形容器と呼称する。
[温度差の小さい凍結工程、および乾燥工程]
　PTFE厚・円筒形容器、アルミ硝子板・円筒形容器、にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５－８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
条件Ａ：
　ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、－１０℃になるまで冷却し、－１０℃で１時間、その後－２０℃で２時間、さらに－４０℃で３時間、最後に－５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を－２０℃設定に戻してから－２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件Ｂ：
　アルミ・硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、－１０℃になるまで冷却し、－１０℃で１時間、その後－２０℃で２時間、さらに－４０℃で３時間、最後に－５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を－２０℃設定に戻してから－２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件Ｃ：
　ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。棚板温度の設定は、－１０℃になるまで冷却し、－１０℃で１時間、その後－２０℃で２時間、さらに－４０℃で３時間、最後に－５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を－２０℃設定に戻してから－２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
[各凍結工程での温度測定]
　条件Ａ～条件Ｃのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
　その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図７～図９の通りとなった。
　図７、図８および図９から条件Ａ、条件Ｂおよび条件Ｃでは棚板温度－１０℃設定区間（－２０℃に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が２．５℃以下となっていた。なお、本明細書において、「温度差」とは、「非冷却面液温」－「冷却面液温」を意味する。その後、棚板温度を－２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。
　以下に、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃについて、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差、棚板温度を－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本発明で言う「直前の温度差」とは、イベント（凝固熱発生等）の１秒前～２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。
条件Ａ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．１℃
－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差：０．２℃
凝固熱発生直前の温度差：１．１℃
条件Ｂ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．０℃
－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差：０．１℃
凝固熱発生直前の温度差：０．９℃
条件Ｃ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．８℃
－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差：１．１℃
凝固熱発生直前の温度差：２．１℃
 [参考例３] 生体親和性高分子ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
　参考例２で得られた条件Ａおよび条件ＢのＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ－２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５～５３μｍ、５３～１０６μｍ、１０６～１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、生体親和性高分子ブロック（ＣＢＥ３ブロック）を得た。
　以下、４８時間架橋を施した条件Ａの多孔質体由来ブロックをＥ、４８時間架橋を施した条件Ｂの多孔質体由来ブロックをＦと称する。ＥおよびＦは温度差の小さい凍結工程により製造した多孔質体から作られた温度差小ブロックである。なお、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られなかったため、以後、４８時間架橋したものを代表として使用した。また、ＥおよびＦでは性能に差が見られなかった。以下、参考例３で得られた生体親和性高分子ブロックを「花弁状ブロック」とも称する。以下の参考例、実施例および比較例では、条件Ａ、サイズ５３～１０６μｍ、架橋時間４８時間で作製した生体親和性高分子ブロックを使用した。
 [参考例４] 生体親和性高分子ブロックのタップ密度測定
　タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ３）が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
　その結果、参考例３の生体親和性高分子ブロックのタップ密度は９８ｍｇ/ｃｍ３であった。
[参考例５] 生体親和性高分子ブロックの架橋度測定
　参考例３で架橋したブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。測定はＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いた。
＜サンプル調製＞
　ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４％ＮａＨＣＯ３水溶液（１ｍＬ）および１質量％のＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、混合物を３７℃で３時間振とうさせた。その後、３７質量％塩酸（１０ｍＬ）および純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、サンプルとした。
＜ブランク調整＞
　ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ３水溶液（１ｍＬ）および１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、直後に３７質量％塩酸（３ｍＬ）を加え、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（７ｍＬ）および純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、ブランクとした。
　純水で１０倍希釈したサンプル、および、ブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、および（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。
（式２）　（As-Ab）／１４６００×V／ｗ　
（式２）は、リコンビナントペプチド１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗはリコンビナントペプチド質量（ｍｇ）を示す。）
（式３）　１－（サンプル（式２）/未架橋リコンビナントペプチド（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。
　その結果、参考例３の生体親和性高分子ブロックの架橋度は、４．２であった。
[参考例６] 生体親和性高分子ブロックの吸水率測定
　参考例３で作製した生体親和性高分子ブロックの吸水率を算出した。
　２５℃において、３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って、吸水率を求めた。
（式４）
　吸水率＝（ｗ２－ｗ１－ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
　その結果、参考例３のブロックの吸水率は、７８６％であった。
 [実施例１]　細胞構造体（モザイク細胞塊）の大量個数作製（マルチウェルディッシュ容器＋撹拌培養工程）
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに参考例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＭＳＣ（１．２×１０８cells）と生体親和性高分子ブロック（２５ｍｇ）が２３ｍＬの培地に懸濁された状態で、細胞非接着性の９０ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュType９０３（スフェロイドウェル口径800μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数～約６,０００ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。この際、９０ｍｍディッシュには、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を培養面を超えて添加した。
　上記の９０ｍｍディッシュをＣＯ２インキュベーターで３７℃で５時間静置した（この時点で、遊離している生体親和性高分子ブロックが存在しない状態であった）。その後、内容物を全てピペットで、商品名30mLシングルユースバイオリアクター（エイブル社ＢＷＶ-Ｓ０３Ａ）（撹拌手段を備えた第二の培養容器）に移し、１０分間静置したのちに上清を除き新しい培地３０ｍＬに変更し、回転速度７０ｒｐｍで２４時間撹拌培養を実施した。結果、細胞構造体の融合や崩壊なく、約６，０００個の均一な細胞構造体を同時に作ることに成功した。製造工程および結果を図１０に示す。細胞構造体の直径は、１１６９個を測定した結果、最小値が２３．８９μｍ、最大値が９０９．４０μｍ、平均値は４１９．５１μｍであり、標準偏差は６２５．８１μｍであった。
[実施例２]細胞構造体（モザイク細胞塊）の大量個数作製（マルチウェルディッシュ容器＋撹拌培養工程）
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに参考例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＭＳＣ（１．２×１０８cells）と生体親和性高分子ブロック（２５ｍｇ）が２３ｍＬの培地に懸濁された状態で、細胞非接着性の９０ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュType９０３（スフェロイドウェル口径800μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数～約６,０００ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。この際、９０ｍｍディッシュには、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を培養面を超えて添加した。
　上記の９０ｍｍディッシュをＣＯ２インキュベーターで３７℃で２３時間静置した（この時点で、遊離している生体親和性高分子ブロックが存在しない状態であった）。その後、内容物を全てピペットで、商品名30mLシングルユースバイオリアクター（エイブル社ＢＷＶ-Ｓ０３Ａ）（撹拌手段を備えた第二の培養容器）に移し、１０分間静置したのちに上清を除き新しい培地３０ｍＬに変更し、回転速度５０ｒｐｍで２１時間撹拌培養を実施した。結果、細胞構造体の融合や崩壊なく、約６，０００個の均一な細胞構造体を同時に作ることに成功した。製造工程および結果を図１１に示す。細胞構造体の直径は、３１７個を測定した結果、最小値が２３．８９μｍ、最大値が９５３．９５μｍ、平均値は４１５．５６μｍであり、標準偏差は４９８．８０μｍであった。
[比較例１]　マルチウェルディッシュ容器のみでの細胞構造体の大量個数作製（短時間培養）
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに参考例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＭＳＣ（１．２×１０８cells）と生体親和性高分子ブロック（２５ｍｇ）が２３ｍＬの培地に懸濁された状態で、細胞非接着性の９０ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュType９０３（スフェロイドウェル口径800μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数～約６,０００ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。この際、９０ｍｍディッシュには、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を培養面を超えて添加した。
　上記の９０ｍｍディッシュをＣＯ２インキュベーターで３７℃で５時間静置して取り出したところ、細胞構造体を形成していない個々の細胞が多数確認され、細胞構造体の形状が不均一であった。結果を図１２に示す。従って、この工程だけでは均一な細胞構造体を得るには至らないことが分かった。細胞構造体の直径は、１７２１個を測定した結果、最小値が２３．８９μｍ、最大値が５８７．９６μｍ、平均値は３６７．６０μｍであり、標準偏差は６４５．８６μｍであった。
[比較例２]　マルチウェルディッシュ容器のみでの細胞構造体の大量個数作製（長時間培養）
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに参考例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＭＳＣ（１．２×１０８cells）と生体親和性高分子ブロック（２５ｍｇ）が２３ｍＬの培地に懸濁された状態で、細胞非接着性の９０ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュType９０３（スフェロイドウェル口径800μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数～約６,０００ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。この際、９０ｍｍディッシュには、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を培養面を超えて添加した。
　上記の９０ｍｍディッシュをＣＯ２インキュベーターで３７℃で４９時間静置したところ、細胞構造体で融合が認められ、形状および大きさが均一かつ大量個数の細胞構造体を得ることはできなかった。（図１３）
[比較例３]　撹拌培養のみでの細胞構造体の大量個数作製
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに参考例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＭＳＣ（１．２×１０８cells）と生体親和性高分子ブロック（２５ｍｇ）が３０ｍＬの培地に懸濁された状態で、商品名30mLシングルユースバイオリアクター（エイブル社ＢＷＶ-Ｓ０３Ａ）（撹拌手段を備えた培養容器）に入れて、回転速度５５ｒｐｍで２４時間または４８時間撹拌培養を実施した。結果、不均一な細胞構造体（例えば、形状および大きさが不均一な細胞構造体または生体親和性高分子ブロックを含まず、細胞のみからなる細胞塊）が数十個存在するだけで、実施例１および２のような均一な細胞構造体を大量個数得ることはできなかった（図１４）。なお、図１４は、４８時間撹拌培養した結果を示す。
[試験例１]　細胞構造体の均一性評価
　実施例１および２ならびに比較例１、２および３で得られた細胞構造体について、細胞構造体の均一性を、融合回避性およびサイズ均一性の指標を用いて評価した。
　融合回避性は、マルチウェルの個数に対する製造された細胞構造体の数の比率が７０％以下の場合をＢ、７０％より高く１００％までの場合をＡとした。即ち、融合回避性はＡの方がＢより優れている。評価の結果を表１に示す。
　サイズ均一性については得られた細胞構造体のサイズを評価した。７０％以上が同一サイズ（同一サイズとは中央値サイズの±５０％に収まっていることを言う）である場合をＡとし、４０％より大きく７０％未満の場合をＢとし、４０％以下である場合をＣとした。即ち、サイズ均一性はＡが優れており、ＢはＡよりも劣り、ＣはさらにＢよりも劣っている。評価の結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　なお、比較例３についてはマルチウェルを使用せず、融合回避性が評価の指標上、測定不能であることから、サイズ均一性のみをもって評価した。
　表１に示す通り、実施例１および２の製造方法は、融合回避性およびサイズ均一性に優れていた。
１０　容器本体
１２　蓋
１４　底板部
１６　側壁部
２０　窪み部
２４　ウェル形成領域
２６　培養面
３０　細胞接着抑制剤層
Ａ　照射スポット
Ｂ　照射スポット
Ｃ　照射スポット
Ｄ　照射スポット

Claims (11)

  1. （Ａ）窪み部が複数形成された培養面および前記培養面の外周縁に立設される側壁部を有する第一の培養容器に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地の混合物を、前記混合物の液面が前記培養面を超えるように添加する工程；
    （Ｂ）工程（Ａ）の第一の培養容器を静置して、前記窪み部において、前記生体親和性高分子ブロックおよび前記細胞を含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を形成する工程；および
    （Ｃ）工程（Ｂ）で得た前記第一の培養容器の内容物を、撹拌手段を備えた第二の培養容器において、撹拌培養する工程；
    を含む、細胞構造体の製造方法。
  2. 工程（Ｂ）において、遊離している生体親和性高分子ブロックが全生体親和性高分子ブロックの３０質量％以下になるまで、第一の培養容器を静置する、請求項１に記載の細胞構造体の製造方法。
  3. 窪み部の個数に対する工程（Ｃ）後に製造された細胞構造体の個数の比率が７０％以上となるような時間だけ、工程（Ｂ）において第一の培養容器を静置する、請求項１または２に記載の細胞構造体の製造方法。
  4. 前記生体親和性高分子ブロックの大きさが、１μｍ～７００μｍである、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
  5. 培養面および窪み部の表面が、細胞接着抑制のための処理がなされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
  6. 窪み部の深さが前記生体親和性高分子ブロックの大きさの２～１００倍であり、窪み部の口径が前記生体親和性高分子ブロックの大きさの２～１００倍である、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
  7. 第一の培養容器を静置する時間が、２時間～２４時間である、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
  8. 工程（Ｃ）における第一の培養容器の内容物を撹拌培養する時間が、１２時間～９３時間である、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
  9. 生体親和性高分子が、ゼラチンである、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
  10. ゼラチンが、下記式で示される、請求項９に記載の細胞構造体の製造方法。
    式：Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
    式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
  11. ゼラチンが、
    配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
    配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
    配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
    の何れかである、請求項９または１０に記載の細胞構造体の製造方法。
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