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WO2018131064A1 - ナノポアを用いた電流計測装置及び電流計測方法 - Google Patents

ナノポアを用いた電流計測装置及び電流計測方法 Download PDF

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Publication number
WO2018131064A1
WO2018131064A1 PCT/JP2017/000417 JP2017000417W WO2018131064A1 WO 2018131064 A1 WO2018131064 A1 WO 2018131064A1 JP 2017000417 W JP2017000417 W JP 2017000417W WO 2018131064 A1 WO2018131064 A1 WO 2018131064A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tank
solution
nanopore
electrode
current
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/000417
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
一真 松井
佑介 後藤
玲奈 赤堀
崇秀 横井
満 藤岡
Original Assignee
株式会社日立ハイテクノロジーズ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日立ハイテクノロジーズ filed Critical 株式会社日立ハイテクノロジーズ
Priority to JP2018561113A priority Critical patent/JP6877466B2/ja
Priority to US16/476,860 priority patent/US11448638B2/en
Priority to GB1909581.9A priority patent/GB2573433B/en
Priority to CN201780080594.3A priority patent/CN110121645B/zh
Priority to PCT/JP2017/000417 priority patent/WO2018131064A1/ja
Publication of WO2018131064A1 publication Critical patent/WO2018131064A1/ja

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44791—Microapparatus

Definitions

  • the present invention relates to a current measuring apparatus and a current measuring method for measuring an ionic current when a subject passes through a nanopore.
  • nanopore sequencers are attracting attention as a method for directly and directly measuring DNA base sequences without performing extension reactions or fluorescent labels.
  • the nanopore sequencer measures the ion current passing through the nanopore embedded in the thin film.
  • the method of blocking the nanopore is different depending on the difference in the base constituting the DNA, and the current value is different, so that the base sequence can be determined.
  • the bionanopore method uses a pore of a modified protein (Mycobacterium smegmatis porin A (MspA), etc.) embedded in a lipid bilayer as a detection part.
  • MspA Mycobacterium smegmatis porin A
  • the solid-state nanopore method uses a pore processed into an inorganic material as a detection part. It is a thing. Compared to the bionanopore method, the solid-state nanopore method has attracted attention as a method that can be read at low cost because it has less reagent dependency and pretreatment steps.
  • FIG. 26 shows an ideal current waveform during the nanopore sequence.
  • the ionic current when DNA does not pass is called the base current
  • the ionic current when DNA passes is called the blocking current. If noise is included in the base current, the noise is superimposed on the blocking current. Therefore, research and development for reducing the noise included at the stage of measuring the base current is underway.
  • Non-Patent Document 1 refers to rectangular wave noise (hereinafter referred to as random telegraph noise (RTN)) included in the base current.
  • FIG. 27 is a diagram illustrating an experimental result of a base current having an RTN. If such an RTN is included in the base current, there is a problem that a signal analysis error occurs because the RTN that is a square wave noise is superimposed on the blocking current that is a square wave signal.
  • RTN random telegraph noise
  • Non-Patent Document 2 refers to a method for reducing RTN in the bionanopore system.
  • RTN is amplified by the interaction between the lipid bilayer membrane and the pore of the modified protein.
  • the cause of RTN generated in the solid-state nanopore system has not been clarified, and the reduction method has not been known.
  • the current measuring device of the present invention has, as one aspect, a first tank, a second tank, a nanopore communicating with the first tank and the second tank, and the first tank and the second tank.
  • the current measurement method of the present invention has, as one aspect, two nanopores introduced into at least one of the first tank and the second tank separated by the thin film on the wall of the nanopore provided in the thin film.
  • the RTN of the ionic current passing through the nanopore provided in the inorganic material thin film can be reduced.
  • the figure which shows the experimental result of Clf value when changing pH and measuring The figure which shows the example of a base electric current when opening a nanopore with a 1st solution.
  • the “first solution” refers to a solution containing group 2 element ions or an acidic solution.
  • the “second solution” refers to a solution containing a group element ion or a solution having a higher pH when the first solution is an acidic solution having a pH of 5.5 or lower.
  • the “third solution” refers to a solution having a different electrolyte type and concentration from the first solution, and may be a solution equivalent to the second solution.
  • RTN is considered to be noise generated by taking two or more discrete current values corresponding to each state by transitioning between two or more states.
  • RTN observed in current measurement of a semiconductor device has a current value corresponding to two states of an electron coupling state and a dissociation state due to electron coupling or dissociation occurring in a film defect formed in an interlayer insulating film. Therefore, it is considered that RTN occurs.
  • the number of defects is single, it is generally considered that a transition is made between two levels.
  • RTN reported in a nanopore sequencer often transits a plurality of levels, and corresponds to a composite RTN.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a state in which RTN is generated
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an embodiment in which RTN is reduced and measured.
  • the solid state nanopores (hereinafter simply referred to as nanopores) 2 formed on the thin film 3 are also free from protons, cations, It was considered that the same phenomenon was confirmed by the binding or separation of ions such as anions. That is, if the ion that binds or dissociates is denoted by X, the desorption / adsorption spot of the ion to which it is bound is denoted by R, and the combined state is denoted by RX, the reaction that repeats this bound or dissociated state is It can be expressed as.
  • reaction spot where ions such as protons, cations, and anions are bonded or dissociated is explained.
  • the surface is oxidized to expose silanol groups and the like. The group becomes a reaction spot.
  • RTN is generated by repeating desorption and adsorption of protons (H + ) and cations (M + ) in the solution 1.
  • the order of cations that are easily adsorbed to the silanol group is determined by the selection coefficient, as an example, when contacting with a solution containing a group II ion (M 2+ ) or an acidic solution (first solution) once, Since the nanopore wall is covered with M 2+ or H + and these cations 9 are strongly adsorbed, the adsorption of other cation species 5 such as Li + , Na + , K + , Rb + , Cs + and proton 4 is suppressed, RTN can be reduced.
  • M 2+ group II ion
  • first solution acidic solution
  • the ion adsorption prevention structure is provided in a region where the distance from the nanopore wall or nanopore is 100 nm or less, for example. It is desirable that It is necessary to select whether the ion adsorption preventing structure has an anion adsorption preventing structure or a cation adsorption preventing structure or both depending on the material of the wall surface forming the thin film and the nanopore. For example, when the surface has an amino group or the like, it has a function of exchanging anions and desorbs and adsorbs anions such as Cl ions and Br ions contained in the solution.
  • the surface has a carboxyl group, a silanol group or the like, it has a function of exchanging cations and desorbs and adsorbs cations such as Cs ions and Na ions contained in the solution. Furthermore, for each of the anion adsorption prevention structure and the cation adsorption prevention structure, it is necessary to select an element as a material of the ion adsorption prevention structure according to the selection coefficient. In the case of an anion adsorption preventing structure, a structure having PO 4 , SO 4 , ClO 4 , I, NO 3 or the like is preferable.
  • silicon nitride, silicon oxide, hafnium oxide, molybdenum disulfide, and graphene are often used for the material of the thin film 3 used in the nanopore, and these materials contain oxygen element or have the property of being surface oxidized.
  • the surface is negatively charged (for example, silicon nitride, silicon oxide, silanol group, graphene, carboxyl group and hydroxyl group are easily negatively charged), so it adsorbs cations. Often has properties. For this reason, it is generally preferable to select a cation adsorption preventing structure as the ion adsorption preventing structure in the nanopore.
  • the cation adsorption preventing structure may be formed of, for example, calcium carbonate, calcium oxide or calcium silicate containing a group II element in the thin film material or on the thin film surface, or the surface of a thin film such as SiN or SiO 2. It may also be formed by precipitating a compound containing a group 2 element or by chemically modifying calcium carbonate or the like by mineralization.
  • a more preferable method for forming a cation adsorption preventing structure is a method in which a first solution containing a cation 9 that is easily adsorbed on the wall surface forming the nanopore as shown in FIG.
  • this method the surface structure of the nanopore wall surface can be easily changed.
  • this technique can suppress RTN without largely changing the thickness or pore diameter of the nanopore, and can be applied without changing sensor characteristics such as base resolution when measuring a living body polymer such as DNA as an object.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of the current measuring device according to the present embodiment, in which the wall surface where the nanopore 2 of the thin film 3 is formed and the vicinity thereof are covered with the ion adsorption preventing structure 8 to measure the current. It shows a state.
  • the thin film 3 having the nanopores 2 is disposed in the first tank 11 on the one side and the second tank 12 on the other side and is in contact with the solution 1.
  • the first tank 11 and the second tank 12 are formed in a thin film. 3 and separated through the nanopore 2.
  • the first tank 11 and the second tank 12 are filled with the solution 1 containing the electrolyte, and the first electrode 13 and the second electrode 14 are provided in the first tank 11 and the second tank 12, respectively.
  • the first electrode 13 is in contact with the solution in the first tank 11, and the second electrode 14 is in contact with the solution in the second tank 12.
  • the electrodes such as the first electrode 13 and the second electrode 14 are preferably made of a material capable of performing an electron transfer reaction (Faraday reaction) with the electrolyte in the solution 1, and are typically halogenated. It is made of silver or alkali silver halide. From the viewpoint of potential stability and reliability, it is preferable to use silver / silver silver chloride for the electrode.
  • the electrode may be made of a material that becomes a polarization electrode, for example, gold or platinum. In that case, in order to secure a stable ionic current, it is preferable to add a substance capable of assisting an electron transfer reaction such as potassium ferricyanide or potassium ferrocyanide to the solution. Or it is preferable to fix
  • all the electrodes may be made of the above-mentioned material, or the material may be coated on the surface of a base material such as copper or aluminum.
  • the shape of the electrode is not particularly limited, but a shape that increases the surface area in contact with the solution is preferable.
  • the electrode is joined to the wiring and an electrical signal is sent to the measurement circuit.
  • the power supply device 15 may be connected to the personal computer 17 so that the applied voltage can be controlled, and the ammeter 16 may be connected to a device such as a personal computer to store the measured current as data. .
  • the ammeter 16 may include an amplifier that amplifies a current flowing between the electrodes by applying a voltage and an ADC (Analog-to-Digital Converter).
  • the nanopore 2 in the present embodiment is provided in a thin film 3 of an inorganic material
  • the inorganic material may be any material that can be formed by a semiconductor microfabrication technique.
  • silicon nitride, silicon oxide, hafnium oxide, disulfide is used.
  • RTN occurs due to adsorption / desorption of ions, and therefore this embodiment can be applied to such a two-dimensional material film.
  • the structure 10 for supporting the thin film 3 for example, a device supporting a SiN thin film having a thickness of 1 ⁇ m or less and an area of 100 ⁇ m 2 or less with a silicon support substrate having a thickness of 725 ⁇ m is used.
  • the nanopores 2 provided in the thin film 3 may be formed by a semiconductor process so that mass production is possible, or may be formed by a TEM electron beam so that the pore diameter becomes small. More preferably, the nanopore 2 formed by dielectric breakdown by applying a high voltage to the thin film 3 may be used so that the nanopore 2 having a small pore diameter can be formed accurately, quickly and inexpensively.
  • RTN handled in this embodiment is generated by desorption and adsorption of a cation having an atomic radius of 1 nm or less, it is more prominent when measuring a current passing through a nanopore 2 having a size of about 100 times or less of the cation and having a relatively small size. This phenomenon is seen in Therefore, particularly when the diameter of the nanopore 2 is 0.1 nm (design limit) or more and 100 nm or less and the length is 0.1 nm (design limit) or more and 100 nm or less, the effect of reducing RTN is exhibited, and the diameter of the nanopore 2 is 0.
  • the length is 1 nm (design limit) or more and 10 nm or less and the length is 0.1 nm (design limit) or more and 50 nm or less, the effect of reducing the RTN is more remarkable, and the diameter of the nanopore 2 is 0.1 nm (design limit) )
  • the thickness is 5 nm or less and the length is 0.1 nm (design limit) or more and 20 nm or less, the reduction effect becomes more remarkable.
  • the diameter of the nanopore 2 is 0.1 nm (design limit) to 5 nm and the length is 0.1 nm (design limit) to 20 nm, measurement is performed without using the RTN suppression procedure of this embodiment. As shown in an experimental result (FIG.
  • this method is particularly effective when applied to relatively small nanopores having a diameter of 0.1 nm (design limit) to 100 nm and a length of 0.1 nm (design limit) to 100 nm.
  • the diameter of the nanopore is preferably determined more strictly depending on the measurement content. For example, when analyzing a biological polymer or a bead having a diameter of about 10 nm, it is 100 nm or less, preferably 50 nm or less, specifically about 0.9 nm. More than 10 nm or less.
  • the diameter of the nanopore used for analyzing ssDNA (single-stranded DNA) having a diameter of about 1.4 nm is preferably about 1.4 nm to 10 nm, more preferably about 1.4 nm to 2.5 nm.
  • the diameter of the nanopore used for analysis of dsDNA (double-stranded DNA) having a diameter of about 2.6 nm is preferably about 3 nm to 10 nm, more preferably about 3 nm to 5 nm.
  • the thickness of the nanopore is preferably determined more strictly depending on the measurement content, and is preferably 0.1 nm or more and 200 nm or less, and more preferably 0.1 nm or more and 100 nm or less.
  • the size is at least twice, preferably at least three times, more preferably at least five times the monomer unit constituting the biological polymer.
  • the thickness is preferably 3 or more bases, for example, about 1 nm or more.
  • the thickness of the nanopore is thin in order to grasp the shape of the biological polymer and the constituent material (type of base in the case of DNA).
  • the nanopore thickness is preferably 200 nm or less, more preferably 100 nm or less.
  • the distance between the bases is as short as about 0.5 nm, so the thickness of the nanopore is preferably 30 nm or less. Preferably it is 10 nm or less. This makes it possible to analyze the shape and constituent materials of biological polymers with high resolution.
  • the shape of the nanopore is basically circular, but it can also be elliptical or polygonal.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view showing a measurement example using the measurement apparatus of this embodiment.
  • FIG. 6 shows an example in which a blocking polymer current is measured by passing a biological polymer 51 such as DNA through the nanopore 2.
  • the biological polymer 51 to be analyzed may be an object that changes electrical characteristics, particularly resistance, when passing through the nanopore 2, and is composed of nucleic acid. Specifically, RNA (single-stranded RNA or double-stranded RNA), DNA (single-stranded DNA or double-stranded DNA), PNA (peptide nucleic acid), oligonucleotide, aptamer, and combinations thereof (for example, hybrids) Nucleic acid).
  • the living body polymer 51 may be present in the living body or may be derived from what is present in the living body.
  • polymers that contain non-naturally occurring sequences or components such as sequences such as poly (A) and poly (T), artificially synthesized polymer molecules, nucleic acids prepared by nucleic acid amplification techniques such as PCR, Also included are nucleic acids that have been cloned into vectors. Methods for preparing these biopolymers are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately select a preparation method according to the type of biopolymer.
  • the analysis of the biological polymer refers to the characteristic analysis of the nucleic acid constituting the biological polymer.
  • sequence order of nucleic acid monomers constituting biological polymer for example, analysis of sequence order of nucleic acid monomers constituting biological polymer (sequencing), determination of nucleic acid length, detection of single nucleotide polymorphism, determination of number of biological polymer, structural polymorphism in biological polymer (copy number) Polymorphism, insertion, deletion, etc.).
  • the procedure may be to pour the solution above and below the thin film and measure the current.
  • the nanopore may be provided on the thin film by a semiconductor process or the like, and then an ion adsorption preventing structure may be provided by surface modification using a chemical reaction or the like in the liquid phase, and the current may be measured.
  • a solution is poured into the top and bottom of the thin film, the nanopores are opened by dielectric breakdown, an ion adsorption prevention structure is provided by surface modification using a chemical reaction in the liquid phase, and the current is measured. Also good.
  • a more preferable method of forming the cation adsorption preventing structure is a method in which a first solution which is a solution containing a group II ion or an acidic solution as shown in FIG. 4 is brought into contact with a wall having nanopores. .
  • a first solution which is a solution containing a group II ion or an acidic solution as shown in FIG. 4 is brought into contact with a wall having nanopores.
  • the surface structure of the nanopore wall surface can be easily changed to form a cation adsorption preventing structure.
  • this method can suppress RTN without significantly changing the nanopore thickness or pore diameter, and can be applied without changing sensor characteristics such as base resolution when measuring a biological polymer such as DNA.
  • FIG. 7 is a schematic cross-sectional view showing an example of a procedure for forming an ion adsorption preventing structure on the nanopore wall surface by liquid contact.
  • a first solution 21 that is a solution containing a group II ion or an acidic solution is introduced into the first tank 11 and the second tank 12 of the measuring device,
  • the surface of the thin film 3 and the wall surface of the nanopore 2 are brought into contact with the first solution 21 to form the ion adsorption preventing structure 8, and then, for example, a sample is injected into the first tank 11 and the ion current flowing through the nanopore 2 is measured. do it.
  • a voltage such as 0.1 V or more for a time such as 1 second or more.
  • a more preferable method of measuring the current by forming a cation adsorption preventing structure on the nanopore wall surface is a combination of a method of changing the surface state of the wall surface by liquid contact and a method of opening the nanopore by dielectric breakdown.
  • FIG. 8 is a schematic cross-sectional view for explaining this current measuring method.
  • An example of a specific measurement procedure is as shown in FIG. 8 (A), after the first solution 21 is filled in the first tank 11 and the second tank 12 on both sides of the thin film 3, as shown in FIG.
  • the nanopore 2 is opened in the thin film 3 by dielectric breakdown by applying a potential difference of 1 [V] or more between the first electrode 13 and the second electrode 14, and then ions that pass through the nanopore 2.
  • the procedure is to measure the current.
  • dielectric breakdown occurs in this way, a higher voltage can be applied, so that the surface state of the film can be changed and maintained for a long time, and the pores of the nanopore 2 and the formation of the cation adsorption preventing structure 8 can be performed simultaneously. Therefore, a thin film having the nanopore 2 and the cation adsorption preventing structure 8 can be manufactured more easily.
  • the direction of the voltage applied at the time of changing the surface state and the nanopore It is desirable to match the direction of the voltage when measuring the passing ion current.
  • the potential of the second electrode 14 is set to 0 [V]
  • a positive voltage + V 1 [V] is applied to the first electrode 13.
  • the ion current is measured by applying a positive voltage + V 2 [V] to the first electrode 13 even when measuring the ion current passing through the nanopore 2. It is desirable.
  • the first electrode 13 may be a negative voltage by reversing the direction of the voltage. For example, when the potential of the second electrode 14 is set to 0 [V] in FIG. When energy is applied to the surface of the film by applying a negative voltage ⁇ V 1 [V] to 13, the first electrode 13 is also negative when measuring the ionic current passing through the nanopore 2. It is desirable to measure the ion current by applying a voltage ⁇ V 2 [V].
  • a candidate for the first solution 21 is a solution containing a group 2 element such as Mg, Ca, Sr, or Ba, or an acidic solution.
  • the former is a method in which a group 2 element is adsorbed on the surface of the nanopore 2 and the latter is adsorbed on the nanopore 2 surface.
  • ionizing anions can be used, and it is preferable to select the anion based on the compatibility with the electrode material. For example, when silver halide is used as an electrode material, it is preferable to use halide ions such as I, Br, and Cl as anions.
  • the anion may be an organic anion represented by glutamate ion or the like.
  • cations generally having a large selection coefficient in cation exchange resins and the like for example, ions of group 2 elements.
  • ions of group 2 elements for example, ions of group 2 elements.
  • the concentration is preferably high. It has been found that if the lower limit value is 10 mM, the effect of reducing RTN can be obtained, and it is desirable to adjust it to 10 mM or more and the saturation concentration or less.
  • the concentration of [H + ] contained in the first solution 21 is preferably 10 ⁇ 5.5 M or more and a saturation concentration or less.
  • an acidic solution containing a group 2 element may be used, or a solution such as HCl containing neither an alkali metal element nor a group 2 element may be used.
  • an organic cation composed of an organic substance can be used, and for example, an ionized cation represented by an ammonium ion can be used.
  • the second solution needs to have a higher pH than that of the first solution, and is preferably pH 5.5 or more.
  • the upper limit of the pH value is determined as follows.
  • the upper limit of the pH value of the measurement solution is determined by the tolerance limit of the device and the tolerance limit of the biological polymer to be measured.
  • a silicon wafer typically used in semiconductor nanopores is used as a substrate, and the vicinity of pH 14 where the etching of silicon is started is the tolerance limit of the device.
  • Such etching rates are known (Lloyd D. Clark, et al.
  • CsOH Cesium Hydroxide
  • Silicon nitride which is often employed as a thin film material, is not etched even at a pH of a high alkali region, but silicon or silicon oxide as a base is etched, so that the upper limit of pH is 14 It is preferable to set. That is, the concentration of [H + ] contained in the second solution is preferably 10 ⁇ 14 M or more and 10 ⁇ 5.5 M or less. For other semiconductor materials, it is similarly determined by the device tolerance limit of the material.
  • the pH be 12 or less.
  • the pH may be set to a higher alkali side from the initial state, or the concentration of the pH adjusting agent may be increased.
  • the concentration of the pH adjusting agent is preferably as high as possible, preferably 50 mM or more, more preferably 100 mM or more.
  • the type of group element contained in the second solution is, for example, that when water is used as a solvent, the electrical conductivity of an aqueous 1 mol / kg alkali chloride solution is 25 ° C., LiCl: 7.188 Sm ⁇ 1 , NaCl: 8 405 Sm ⁇ 1 , KCl: 10.84 Sm ⁇ 1 , RbCl: 10.04 Sm ⁇ 1 , CsCl: 10.86 Sm ⁇ 1 , and thus K, Rb, Cs, etc., which have high electrical conductivity Cs that can amplify the electrical conductivity by increasing the concentration because of its highest solubility in water.
  • K and Rb particularly Cs
  • K and Rb have a large selection coefficient, and there is a concern about a trade-off that RTN is easily amplified.
  • the procedure of replacing the first solution with the second solution containing Cs makes it possible to achieve both amplification of the amount of signal and reduction of RTN during biological polymer analysis.
  • a lower limit of the electrolyte concentration from the viewpoint of the signal-to-noise ratio.
  • Venta, K., et al. Differentiation of hor Short, Single-Stranded DNA Homopolymers in Solid-State Nanopores, ACS Nano, 7, 4629 (2013) It is clear that the difference is about 500 pA. This block current difference depends on the electrical conductivity of the nanopore.
  • the lower limit of the electrolyte concentration is defined by the noise derived from the amplifier, but Adrian Balan, et al. Improving Signal-to-Noise Performance for DNA Translocation in Solid-State Nanopores at MHz Bandwidths, Nano Lett. 14, 7215, (2014 ),
  • the amplifier-derived noise is about 1 pA in the frequently used frequency range (5 to 10 kHz). Therefore, since 5 is often defined as a statistically significant signal-to-noise ratio, the lower limit of the electrolyte concentration needs to be 10 mM.
  • the surface state of the film can be largely changed by applying energy to the thin film while the first solution is contained, 0.1 V or more is applied to the thin film in the first solution. It is desirable to introduce the second solution after applying the above voltage. More preferably, it is a procedure in which a high voltage is applied to the thin film in contact with the first solution to open the nanopore by dielectric breakdown, and then the second solution is introduced. In this case, a higher voltage is applied. Therefore, the surface state of the film can be effectively changed to form a cation adsorption preventing structure, and RTN can be suppressed for a long time.
  • the concentration of the first solution after the introduction of the second solution is preferably 20% or less, more preferably Is 10% or less, specifically 0.01% to 1%.
  • the concentration of the first solution can be sufficiently reduced.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram showing an example of a method of replacing the first solution with the second solution.
  • the capacity of the solution tank is set to about 100 ⁇ L, and an inlet 31a and an outlet 31b are provided in the solution tank as shown in FIG.
  • the second solution 22 is introduced from the injection port 31a by a pipette 32 or the like.
  • the first solution 21 can be overflowed from the discharge port 31b. Therefore, when the overflowed solution is recovered, the concentration of the first solution 21 can be reduced more efficiently.
  • the concentration of the first solution 21 can be more efficiently increased. Can be reduced.
  • the second solution 22 may be poured after all the first solution 21 has been collected, which can prevent the first solution 21 from remaining.
  • bubbles are likely to be generated in the vicinity of the nanopore 2 when the solution is introduced. Therefore, the second solution 22 is introduced when the second solution 22 is poured while leaving the first solution 21 in the vicinity of the nanopore 2. Generation of bubbles at the time can be suppressed.
  • the first solution containing the ions of the group 2 element or acidic is filled only in one of the first tank 11 and the second tank 12 so as not to prepare a large amount.
  • the tank may be filled with a third solution having a different electrolyte type and concentration from the first solution 21.
  • the cation adsorption preventing structure 8 can be provided by contact with the wall surface of the nanopore, so that the effect of reducing RTN can be obtained.
  • the third solution contains ions of a group element. After the first solution and the third solution are in contact with the walls of the thin film and the nanopore, the second solution is added to the first solution. A solution should be introduced.
  • FIG. 10 is a schematic cross-sectional view showing a configuration example of a measuring device suitable for carrying out the above procedure.
  • the first tank 11 is filled with a first solution 21 that is a solution containing group element ions or an acidic solution
  • the second tank 12 is filled with a third solution 23 containing group element ions.
  • the second solution 22 containing ions of group elements such as Cs may be introduced only into the first tank 11 after the cation adsorption preventing structure 8 is formed. Since the third solution 23 filled in the second tank 12 already contains a group 1 element, there is no need to newly introduce the second solution 22.
  • Such a configuration simplifies the apparatus configuration because the solution introduction mechanism only needs to be provided in the first tank 11 that fills the first solution.
  • the first tank 11 is filled with a first solution 21 which is a solution containing a group II element ion or an acidic solution
  • the second tank 12 is filled with a third group element ion containing a group element ion.
  • a high voltage is applied to the thin film 3 in a state where the solution 23 is filled to provide the nanopore 2 by dielectric breakdown, and then the second solution 22 is introduced only into the first tank 11.
  • a high voltage is applied by the thin film 3
  • the direction of the voltage applied when the surface state is changed and the direction of the voltage when measuring the ion current passing through the nanopore 2 are matched. It is preferable.
  • the first tank 11 is filled with the first solution 21 and the second tank 12 is filled with the third solution 23.
  • the potential of the first electrode 13 provided in the first tank 11 is 0 [V] as a reference
  • the second electrode 14 provided in the second tank 12 is positive. Energy is given to the surface of the film by applying voltage + V 1 [V].
  • the second solution 22 is introduced into the first tank 11 and a positive voltage + V 2 [V] is applied to the second electrode 14. It is desirable to measure ion current with Further, when obtaining the blocking current of the biological polymer, it is desirable to include the biological polymer 51 in the first tank 11.
  • FIG. 11 is a schematic cross-sectional view illustrating a configuration example of a measurement device including a nanopore array.
  • the first tank 11 and the second tank 12 are separated by a thin film 3 on which a plurality of nanopores 2 are formed.
  • the first tank 11 constitutes one common tank for the plurality of nanopores 2.
  • the second tank 12 is divided into a plurality of individual tanks corresponding to individual nanopores.
  • One first electrode (common electrode) 13 is arranged in the common tank, and one individual electrode is arranged in each individual tank.
  • a solution filled in each individual tank provided independently for each nanopore 2 of the thin film 3 and a solution filled in a common tank common to each nanopore 2 are formed.
  • An existing configuration is possible.
  • the solutions individually filled in the nanopores 2 are arranged so that their potentials are different from each other, and the individual tanks are partitioned from each other by insulating partition walls 41.
  • the material of the insulating partition wall 41 may be solid, liquid, or gas.
  • a resin such as PMMA, and preferably has a high chemical resistance such as polyimide or Teflon ( Registered trademark).
  • the partition wall 41 is a liquid and the solvent of the solution individually filled in each nanopore 2 is water, for example, an organic solvent that is not mixed with water may be used.
  • the partition walls 41 may be insulated by a gas such as air or N 2.
  • the configuration in which the common solution is provided in this way has an advantage that the solution introduction mechanism becomes simpler than the configuration in which all the solutions filling the upper and lower sides of the nanopore 2 are individual solutions.
  • the individual solution filled in the individual tank partitioned by the partition wall 41 is the third solution 23, and the common solution filled in the common tank is the first solution 21.
  • the second solution 22 may be introduced only into the solution 21. When obtaining the blocking current of the biological polymer, it is desirable to include the biological polymer in the second solution 22.
  • the group 1 element contained in the third solution is Cs.
  • the Cs ion concentration it is preferable to set a lower limit to the electrolyte concentration from the viewpoint of the signal-to-noise ratio.
  • the lower limit of the electrolyte concentration needs to be 10 mM.
  • there is no factor that hinders the upper limit of the electrolyte concentration and a saturation concentration can be allowed. That is, the Cs ion concentration of the measurement solution is 10 mM or more and the saturation concentration or less. Preferably, it becomes 0.1M or more and saturation concentration or less.
  • the interval at which the plurality of nanopores are arranged can be 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, preferably 0.5 ⁇ m to 4 ⁇ m, depending on the electrode used, the capability of the electrical measurement system, the processing limit of the semiconductor process, and the like.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing a configuration example of a measuring apparatus having a mechanism for introducing the second solution 22 into the first solution 21.
  • the solution tank into which at least the first solution 21 is introduced has an inlet 31a for introducing the second solution 22, so that the first solution 21 can be discharged to the outside by introducing the second solution 22.
  • a discharge port 31b may be provided.
  • a discharge channel 102 may be provided from the discharge port 31 b, and the discharge channel 102 may be connected to the waste liquid tank 103.
  • the injection channel 104 is preferably connected to the inlet 31a for introducing the second solution 22, and the injection channel 104 is connected to the third tank 105 for storing the second solution 22. Is desirable.
  • the fluid control unit 101 may be configured to be sent out by a pump, or may be configured by a valve or a valve.
  • the fluid control unit 101 may be provided in any of the injection flow path 104, the discharge flow path 102, the third tank 105, and the waste liquid tank 103.
  • the fluid control section 101 may be provided in the discharge flow path 102 and the waste liquid tank 103.
  • the second solution 22 may be transported by setting the waste liquid tank 103 and the discharge channel 102 to a negative pressure.
  • the fluid control unit 101 feeds the solution at a flow rate of 10 mL / s or less, for example.
  • the thin film 3 can be prevented from being broken by turbulent flow or water pressure in the vicinity of the thin film 3 by flowing at a relatively slow inflow rate of preferably 100 ⁇ L / s or less, more preferably 10 ⁇ L / s or less.
  • the fluid control unit 101 may be connected to and controlled by the personal computer 17 so that the second solution 22 can be introduced into the solution tank having the first solution 21 at an arbitrary timing.
  • the mechanism for introducing the second solution 22 may be a mechanism for introducing the both sides of the thin film 3. desirable. More preferably, the first solution 21 is filled only on one side of the thin film 3, for example, the first tank 11, and the second solution 12 is filled with the third solution 23. With this configuration, there is an advantage that the mechanism for introducing the second solution 22 into the third solution 23 is not necessary, and the device mechanism is simplified.
  • the third solution 23 filled individually preferably contains a group element, and more preferably, the group element is Cs.
  • FIG. 13 is a schematic view showing another configuration example of the measuring apparatus having a mechanism for introducing the second solution 22 into the first solution 21. As shown in FIG. It is more desirable to prepare a fourth tank 106 for storing the first solution 21 as in this example and to have a mechanism for introducing the first solution 21 in the same manner as the second solution 22. .
  • FIG. 14 is a schematic diagram illustrating another configuration example of the measuring apparatus according to the present embodiment.
  • the thin film 3 having the nanopores 2 is desirably arrayed as shown in FIG. 14 so that the throughput can be improved.
  • the solution individually filled in the plurality of individual tanks provided in the second tank 12 may be the first solution 21 or the like, but preferably the third solution 23 is filled. With this configuration, there is no need for a mechanism for introducing the second solution 22 into the third solution 23, and the apparatus mechanism is simplified.
  • the third solution 23 filled in the individual tank preferably contains a group element, and more preferably, the group element is Cs.
  • the first solution 21 is introduced from the fourth tank 106 to the first tank 11 through the injection channel 104 using the fluid control unit 101 a.
  • the first solution 21 may be introduced into the discharge channel 102 or the waste liquid tank 103.
  • the nanopores 2 of the thin film 3 come into contact with the first solution 21 and an ion adsorption preventing structure is formed on the wall surfaces of the plurality of nanopores 2.
  • the second solution 22 is introduced from the third tank 105 to the first tank 11 through the injection channel 104 using the fluid control unit 101b.
  • the first solution 21 filling the first tank 11 is introduced into the waste liquid tank 103 via the discharge channel 102, and the inside of the first tank 11 is mostly the second solution 22. Is replaced by
  • the second solution 22 may be introduced up to the discharge channel 102 or the waste liquid tank 103.
  • the solution introduction procedure in the measurement apparatus having the third tank 105 and the fourth tank 106 and having the array device has been shown.
  • the solution may be introduced by the following procedure.
  • the solution introduction procedure described with reference to FIG. 14 is merely an example, and it is not always necessary to follow the above procedure.
  • the amount of the first solution 21 and the second solution 22 introduced is not limited to the above.
  • the nanopore 2 was opened before the first solution 21 was introduced.
  • the first solution was introduced into the thin film 3 not having the nanopore 2, and the dielectric breakdown occurred. More preferably, the nanopore 2 is opened.
  • the material of the solution tank such as the first tank 11, the second tank 12, the third tank 105, the fourth tank 106, and the waste liquid tank 103 may be PMMA, for example, Teflon with excellent chemical resistance, etc. It may be comprised.
  • the capacity of each solution tank is, for example, 100 mL or less.
  • the material of the flow channel such as the injection flow channel 104 and the discharge flow channel 102 may be, for example, PMMA, or Teflon having excellent chemical resistance.
  • the injection channel 104 and the discharge channel 102 for example, those having a total length of 1 m or less and a diameter of 1 cm or less are used.
  • Solutions such as the first solution 21, the second solution 22, and the third solution 23 can be provided together with instructions describing the use procedure, the amount used, and the like.
  • a solvent that can stably disperse the biological polymer and that does not dissolve the electrode in the solvent and does not inhibit the electron transfer with the electrode can be used.
  • water, alcohols (methanol, ethanol, isopropanol, etc.), acetic acid, acetone, acetonitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and the like can be mentioned.
  • nucleic acid is a measurement target as a biological polymer
  • the most preferable solvent is water.
  • Each solution may be provided in a state where each solution tank is filled with a liquid, or a pack or a liquid tank in which each solution is enclosed is provided, and the first to fourth tanks are provided as necessary. It may be in the form of replenishment or replacement.
  • Each solution may be provided in a ready-to-use state (liquid), may be provided as a concentrate for dilution with an appropriate solvent at the time of use, or may be reconstituted with an appropriate solvent at the time of use. It may be in a solid state (for example, powder) for constituting.
  • a ready-to-use state liquid
  • It may be in a solid state (for example, powder) for constituting.
  • the form and preparation of such solutions can be understood by those skilled in the art.
  • the current measurement system and the solution introduction system are not necessarily provided in the same apparatus.
  • the current measurement apparatus and the solution introduction apparatus may be separated and provided as separate apparatuses. Good.
  • RTN is desorption and adsorption phenomenon of ions at and near the wall having nanopores, for example, in the SiN thin film generally used in nanopores
  • RTN is desorption and adsorption of cations on the silanol group surface. It is thought that it originates from the phenomenon caused by.
  • the selectivity coefficient of silanol group is Li ⁇ Na ⁇ K ⁇ Rb ⁇ Cs ⁇ 2 group element (Ca, Ba, etc.), and the surface of silanol group is difficult to adsorb to the silanol group such as Li.
  • the cationic species such as Ca and Ba that are easily adsorbed to the silanol group are stabilized in the state of being adsorbed on the surface of the silanol group.
  • FIG. 15 is a diagram showing an example of the base current in a solution containing a group 1 element.
  • the first tank 11 and the second tank 12 of the measuring apparatus shown in FIG. 8 are each filled with a neutral solution containing LiCl, NaCl, KCl, RbCl, CsCl at a concentration of 1 M, and a SiN thin film having a thickness of about 5 to 10 nm.
  • nanopores 2 of about 1 to 10 nm were opened by dielectric breakdown.
  • a voltage of 0.2 V was applied between the first electrode 13 and the second electrode 14, and the ionic current flowing through the nanopore was measured. From the results of FIG. 15, it was found that RTN was amplified in the relationship Li ⁇ Na ⁇ K ⁇ Rb ⁇ Cs, and it was found that this hypothesis is supported.
  • the RTN reported in the nanopore sequencer generally transitions between a plurality of levels, and corresponds to a composite RTN including a large number of RTNs that transition between two levels. It is known that the power spectrum density of an RTN that makes a two-level transition is a Lorentz type that attenuates in proportion to 1 / f 2 in logarithmic display, and is called 1 / f 2 noise.
  • the power spectral density is a superposition of a plurality of Lorentz curves, and 1 / f ⁇ ( It attenuates in proportion to 0 ⁇ ⁇ 2, ⁇ ⁇ 1) and can be expressed by the following formula (Heerema SJ, et al., 1 / f noise in graphene nanopores, Nanotech. 26 (7), 074001 (2015)) .
  • FIG. 17 is a diagram showing experimental results of C lf values measured with various elements.
  • 1M LiCl adjusted to neutral 1M NaCl, 1M KCl, 1M RbCl, 1M CsCl, a C lf after opening the nanopore by dielectric breakdown in the SiN film with a 1M MgCl 2, 1M CaCl 2
  • N 3
  • Clf was found to be Li ⁇ Na ⁇ K ⁇ Rb ⁇ Cs for the group 1 element
  • Clf was decreased for the group 2 elements such as Ca and Ba as compared with Cs. This result supports our hypothesis of RTN.
  • the electric conductivity is high particularly when the group element contained is K, Rb or Cs.
  • Cs has high solubility in water, and electrical conductivity can be increased by increasing the concentration.
  • the RTN contained in the measurement solution was Li ⁇ Na ⁇ K ⁇ Rb ⁇ Cs. That is, in the conventional method, there is a trade-off that when the signal amount is amplified by Cs, the RTN is amplified, and it has been confirmed that the RTN reduction method of the present embodiment can achieve both.
  • FIG. 18 is a diagram showing experimental results of C lf values when measurement was performed while changing pH. As shown in FIG. 18, it was found that C lf significantly decreased at pH 5.5 or lower as compared with neutral conditions of about pH 7-8 . This result still supports the above hypothesis.
  • FIG. 19 shows an example of the base current when the nanopore is opened with 1M MgCl 2 , 1M CaCl 2 , 1M SrCl 2 , 1M BaCl 2 or 1M CsCl (pH 1) which is an acidic solution as described above.
  • the applied voltage at the time of measuring the base current is 0.3V. From FIG. 19, it was confirmed from the current waveform that there was an effect of reducing RTN.
  • Mg has a smaller selection coefficient of silanol groups and tends to easily generate RTN among the four types of Mg, Ca, Sr, and Ba. Therefore, Mg, Ca, Sr, and Ba are more likely. RTN can be reduced.
  • Clf tends to decrease as the pH decreases, as shown in FIG. 18, and it is preferable to select a smaller pH within a range of pH 5.5 or lower.
  • FIG. 20 shows a state after applying a high voltage to the SiN film through the solution containing the ions of the group 2 element shown in FIG. 19 or an acidic solution to form nanopores by dielectric breakdown, and then introducing the 1M CsCl (pH 8) solution.
  • the base current is shown.
  • the applied voltage at the time of measuring the base current is 0.3V.
  • RTN is suppressed even after the introduction of Cs that easily generates RTN, so that the nanopore wall is covered with a group II element or H to prevent desorption and adsorption of other cation species such as Cs. It turns out that you can.
  • the mechanism of RTN generation was verified and the suppression method was clarified.
  • FIG. 21 is a diagram illustrating a result of verifying the lower limit of the concentration of the group 2 element when the RTN is reduced with the group 2 element.
  • Figure 21 opening the nanopore 1M CsCl containing no CaCl 2, 1M CsCl containing 10 mM CaCl 2, 1M CsCl containing 100 mM CaCl 2, 1M CsCl containing 1M CaCl 2, by breakdown of four conditions of,
  • the base current after introducing a solution of 1M CsCl not containing CaCl 2 is shown.
  • the applied voltage at the time of measuring the base current is 0.3V.
  • the Group 2 element when the Group 2 element is included in the solution, if it contains 10 mM or more, there is an RTN suppressing effect, and it is desirable to adjust the concentration of the Group 2 element to 10 mM or more and the saturation concentration or less.
  • FIG. 22 is a diagram showing the result of verification of the direction of the applied voltage.
  • a positive high voltage (+5 to 10 V) is applied to the SiN film via a CaCl 2 solution to form nanopores by dielectric breakdown, and then a positive voltage (+0.2 V) and a negative voltage ( ⁇ 0 .2V) shows the base current.
  • the direction of the applied voltage is the same as that at the time of nanopore formation in the case of a positive voltage, and is opposite to that at the time of nanopore formation in the case of a negative voltage.
  • FIG. 22A it has been found that the generation of RTN can be suppressed more when a positive voltage is applied than when a negative voltage is applied.
  • FIG. 22A it has been found that the generation of RTN can be suppressed more when a positive voltage is applied than when a negative voltage is applied.
  • a positive high voltage (+5 to 10 V) is applied to the SiN film through the CaCl 2 solution, nanopores are formed by dielectric breakdown, a CsCl solution is introduced, and a positive voltage (+0. 2V) and a base current when a negative voltage ( ⁇ 0.2V) is applied.
  • a positive voltage (+0. 2V) and a base current when a negative voltage ( ⁇ 0.2V) is applied.
  • the occurrence of RTN can be suppressed by setting the applied voltage at the time of ion current measurement to the same direction as at the time of nanopore formation.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of verifying the noise reduction effect when the first solution is disposed only on one side of the thin film, out of the two solutions disposed on both sides of the thin film.
  • FIG. 23 shows that 1M CaCl 2 solution is filled on one side, 1M CsCl solution is filled on the other side, nanopores are opened by dielectric breakdown, and 1M CsCl solution is placed in a solution bath containing 1M CaCl 2 solution.
  • the base current is shown when the ion current is measured after introduction.
  • the cation adsorption preventing structure 8 can be provided by contact with the nanopore wall surface, so that the effect of reducing RTN can be obtained. found.
  • FIG. 24 is a diagram showing the experimental results at this time.
  • the solution at the time of opening the nanopore by dielectric breakdown was a 1M CaCl 2 solution on the negative voltage side and a 1M CsCl solution on the high voltage side (+5 to 10V).
  • FIG. 25 is a diagram showing a result of suppressing the RTN by forming an ion adsorption preventing structure by bringing the first solution into contact with the already formed nanopore.
  • FIG. 25A shows a base current when RTN is generated by measuring with a CsCl solution before providing an ion adsorption preventing structure
  • FIG. 25B introduces a CaCl 2 solution to form an ion adsorption preventing structure.
  • FIG. 25A shows a base current when RTN is generated by measuring with a CsCl solution before providing an ion adsorption preventing structure
  • FIG. 25B introduces a CaCl 2 solution to form an ion adsorption preventing structure.
  • 25C shows the base current when RTN is suppressed while introducing the CsCl solution again and maintaining the ion adsorption preventing structure.
  • a method for forming the cation adsorption preventing structure is, for example, a carbonic acid containing a group II element in the material of the thin film or on the surface. It may be formed of calcium, calcium oxide, calcium silicate, etc., or a compound containing a group II element is deposited on the surface of a thin film such as SiN or SiO 2 , or calcium carbonate is chemically modified by mineralization. You can also make it.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.

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Abstract

第一の槽１１と，第二の槽１２と，第一の槽と第二の槽を連通するナノポア２を有し第一の槽と前記第二の槽の間に配置された薄膜３と，第一の槽に設けられた第一の電極１３と，第二の槽に設けられた第二の電極１４と，を備え，ナノポアの壁面は，第一の槽及び／又は第二の槽に充填される溶液１に含まれるイオンの脱離吸着を防止するイオン吸着防止構造８を有し，第一の電極と第二の電極の間に電圧を印加することでナノポアを通過するイオン電流を計測する。

Description

ナノポアを用いた電流計測装置及び電流計測方法
　本発明は，被検体がナノポアを通過するときのイオン電流を計測する電流計測装置及び電流計測方法に関する。
　次世代ＤＮＡシーケンサの分野では，伸長反応や蛍光ラベルを行うことなく，ＤＮＡの塩基配列を電気的に直接計測する手法としてナノポアシーケンサが注目されている。ナノポアシーケンサでは，薄膜に埋め込まれたナノポアを通過するイオン電流を計測する。このとき，ＤＮＡがナノポアを通過すると，ＤＮＡを構成する塩基の違いによってナノポアの塞がり方が異なり電流値に違いが生じるため，塩基配列を決定できる。
　ナノポアシーケンス方式には，ナノポアを構成する材料によって主にバイオナノポア方式とソリッドステートナノポア方式の２種類がある。バイオナノポア方式は脂質二重膜に埋め込まれた改変タンパク質（Mycobacterium smegmatis porin A（MspA）等）のポアを検出部としたものであり，ソリッドステートナノポア方式は無機材料に加工したポアを検出部としたものである。バイオナノポア方式と比較してソリッドステートナノポア方式は試薬依存度及び前処理工程が少なく，低コストに読み取れる方式として注目されている。
Bezrukov, S. M., et al., Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel, Phys. Rev. Lett. 70(15), p.2352-2355 (1993). Morton, D., et al., Tailored Polymeric Membranes for Mycobacterium Smegmatis Porin A (MspA) Based Biosensors, J Mater Chem B Mater Biol Med. 3(25), p.5080-5086 (2015).
　図２６は，ナノポアシーケンス時の理想的な電流波形を示したものである。ＤＮＡ非通過時のイオン電流をベース電流と呼び，ＤＮＡ通過時のイオン電流を封鎖電流と呼ぶ。ここでベース電流にノイズが含まれると，封鎖電流にはそのノイズが重畳されるため，ベース電流を計測した段階で含まれるノイズの低減に向けた研究開発が進められている。
　非特許文献１は，ベース電流に含まれる矩形波のノイズ（以下，ランダム・テレグラフ・ノイズ（ＲＴＮ）とよぶ）について言及したものである。図２７は，ＲＴＮを有するベース電流の実験結果を示す図である。ベース電流にこのようなＲＴＮが含まれると，矩形波の信号である封鎖電流に対して矩形波のノイズであるＲＴＮが重畳されるため，信号解析エラーが生じるという問題がある。
　非特許文献２は，バイオナノポア方式におけるＲＴＮの低減方法について言及したものである。バイオナノポア方式においては脂質二重膜と改変タンパク質のポアとの相互作用によってＲＴＮが増幅することを示した。しかし，ソリッドステートナノポア方式において発生するＲＴＮについては，その原因が明らかになっておらず低減方法も不明であった。
　本発明の電流計測装置は，一態様として，第一の槽と，第二の槽と，第一の槽と第二の槽を連通するナノポアを有し第一の槽と第二の槽の間に配置された薄膜と，第一の槽に設けられた第一の電極と，第二の槽に設けられた第二の電極と，を備え，ナノポアの壁面は，第一の槽及び／又は第二の槽に充填される溶液に含まれるイオンの脱離吸着を防止するイオン吸着防止構造を有し，第一の電極と第二の電極の間に電圧を印加することでナノポアを通過するイオン電流を計測するものである。
　また，本発明の電流計測方法は，一態様として，薄膜に設けられたナノポアの壁面に，当該薄膜によって分離された第一の槽と第二の槽のうち少なくとも一方の槽に導入された二族元素のイオンを含む溶液又は酸性の溶液である第一の溶液を接液する工程と，第一の槽に設けられた第一の電極と第二の槽に設けられた第二の電極の間に電圧を印加してナノポアを通過するイオン電流を計測する工程と，を有する。
　本発明によると，無機材料の薄膜に設けられたナノポアを通過するイオン電流のＲＴＮを低減することができる。
　上記した以外の課題，構成及び効果は，以下の実施形態の説明により明らかにされる。
ＲＴＮが発生している様子を示す模式図。 ＲＴＮを低減して計測する一実施例を示す模式図。 ＲＴＮが発生している様子を示す模式図。 ＲＴＮを低減して計測する一実施例を示す模式図。 電流計測装置の構成例を示す断面模式図。 電流計測装置を用いた計測例を示す断面模式図。 接液によってイオン吸着防止構造を形成する手順の一例を示す断面模式図。 イオン吸着防止構造を形成する他の手順の一例を示す断面模式図。 第二の溶液で第一の溶液を置換する方法の例を示す説明図。 電流計測装置の構成例を示す断面模式図。 ナノポアアレイを備える電流計測装置の構成例を示す断面模式図。 電流計測装置の構成例を示す概略図。 電流計測装置の他の構成例を示す概略図。 電流計測装置の他の構成例を示す模式図。 一族元素を含む溶液でのベース電流の例を示す図。 ベース電流波形から取得したパワースペクトル密度の実験結果を示す図。 各種元素で計測したときのＣlf値の実験結果を示す図。 ｐＨを変えて計測したときのＣlf値の実験結果を示す図。 第一の溶液でナノポアを開孔したときのベース電流の例を示す図。 ＲＴＮ低減手順を施したときのベース電流の実験結果を示す図。 第一の溶液中の二族元素の濃度の下限について検証した結果を示す図。 印加電圧の方向を変えてベース電流を計測したときの実験結果を示す図。 第一の溶液を薄膜の片側にのみ配置したときのノイズ低減効果について検証した結果を示した図。 陽イオン吸着防止構造を設けて生体ポリマを計測した結果を示す図。 ＲＴＮの防止手順を施したときのベース電流の実験結果を示す図。 理想的なベース電流と封鎖電流を示す図。 ＲＴＮを有するベース電流の実験結果を示す図。
　本実施の形態を説明するための全図において同一機能を有するものには同一の符号を付すようにし，その繰り返しの説明は可能な限り省略するようにしている。また，本発明は以下に示す実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。本発明の思想ないし趣旨から逸脱しない範囲で，その具体的構成を変更し得ることは当業者であれば容易に理解される。
　図面等において示す各構成の位置，大きさ，形状，範囲などは，発明の理解を容易にするため，実際の位置，大きさ，形状，範囲などを表していない場合がある。このため，本発明は，必ずしも，図面等に開示された位置，大きさ，形状，範囲などに限定されない。
　本明細書で引用した刊行物，特許公報は，そのまま本明細書の説明の一部を構成する。
　本明細書において単数形で表される構成要素は，特段文脈で明らかに示されない限り，複数形を含むものとする。
　以下の説明で，「第一の溶液」とは，二族元素のイオンを含む溶液又は酸性溶液を指す。「第二の溶液」とは，一族元素のイオンを含む溶液，あるいは第一の溶液がｐＨ５．５以下の酸性溶液である場合には，それよりｐＨが高い溶液を指す。また，「第三の溶液」とは，第一の溶液とは電解質の種類や濃度が異なる溶液を指し，第二の溶液と同等の溶液であってもよい。
　ここでは，まずＲＴＮの発生メカニズムの推定と検証を行い，発生メカニズムに基づいた解決方法を検討した。一般にＲＴＮはある２つ以上の状態を遷移することで，各状態に対応した２つ以上の離散的な電流値をとることにより発生するノイズだと考えられている。例えば半導体デバイスの電流計測において観察されるＲＴＮは，層間絶縁膜に形成された膜欠陥に電子の結合又は乖離が生じ，電子の結合状態と乖離状態の２つの状態に対応した電流値をとることで，ＲＴＮが発生すると考えられている。上記欠陥の数が単一である場合は一般に２準位を遷移すると考えられるが，複数欠陥を有する場合ではこうした２準位を遷移するＲＴＮが多数含まれ，複数の準位を遷移する複合ＲＴＮとして観測される。ナノポアシーケンサで報告されているＲＴＮは一般に複数の準位を遷移する場合が多く，複合ＲＴＮに該当する。
　図１はＲＴＮが発生している様子を示す模式図，図２はＲＴＮを低減して計測する一実施例を示す模式図である。我々は，図１に示すとおり，薄膜３に作られたソリッドステートナノポア（以下，単にナノポアという）２についてもナノポア形成時などに生じた欠陥に対して，溶液１中に含まれるプロトン，カチオン，アニオンなどのイオンが結合又は乖離することで同様の現象が確認されると考えた。すなわち，結合又は乖離するイオンをＸと表記し，結合する先のイオンの脱離吸着スポットをＲと表記し，両者が結合した状態をＲＸと表記すると，この結合又は乖離した状態を繰返す反応は
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
と表すことができる。このような現象が生じる表面では上記のＲＴＮが発生する。そのため図２に示すように，イオン吸着防止構造８を，ナノポア２を形成している薄膜の壁面及びその近傍に設けることにより，Ｘの吸着が生じずＲＴＮを抑制できる。上記の仮説の検証は，後述の実験結果で説明する。
　プロトン，カチオン，アニオンなどのイオンが結合又は乖離する反応スポットをより具体的に説明すると，ナノポアで一般的に用いられるＳｉＮ膜などでは表面が酸化されてシラノール基などが露出しており，このシラノール基が反応スポットになる。図３に示すように，こうした部位には
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
といった反応が生じ，特に溶液１中のプロトン（Ｈ＋）とカチオン（Ｍ＋）が脱離吸着を繰返すことでＲＴＮを発生させる。
　このとき図４に示すように，シラノール基に対して吸着しやすい陽イオン９が溶液１中に含まれ一度強く吸着すると，陽イオンの脱離や吸着や交換といった反応が抑制されるため，ＲＴＮを低減できる。このように，イオンが脱離吸着するナノポア壁面の反応スポットに選択係数が大きく吸着しやすいイオンを予め吸着させておくことで，他のイオンの脱離吸着を防ぐ表面構造をイオン吸着防止構造という。
　シラノール基に対して吸着しやすい陽イオンの順序は選択係数によって決定するため，一例としては二族元素のイオン（Ｍ2＋）を含む溶液又は酸性溶液（第一の溶液）に一度接液すると，ナノポア壁面をＭ2＋又はＨ＋で覆いこれらの陽イオン９が強く吸着するため，Ｌｉ＋，Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｒｂ＋，Ｃｓ＋など他のカチオン種５やプロトン４の吸着を抑制し，ＲＴＮを低減できる。
　ＲＴＮとして観測されるイオンの脱離吸着は，電流が集中するナノポア壁面及びナノポアの近傍において発生することから，イオン吸着防止構造は，例えばナノポア壁面やナノポアからの距離が１００ｎｍ以下の領域に設けられていることが望ましい。イオン吸着防止構造は，薄膜及びナノポアを形成する壁面の材質によって陰イオン吸着防止構造又は陽イオン吸着防止構造又はその両方を有するかを選択する必要がある。例えば，表面にアミノ基などを有する場合，陰イオンを交換する機能を有し，溶液中に含まれるＣｌイオンやＢｒイオンなどの陰イオンを脱離吸着する。一方で表面にカルボキシル基やシラノール基などを有する場合，陽イオンを交換する機能を有し，溶液中に含まれるＣｓイオンやＮａイオンなどの陽イオンを脱離吸着する。さらに陰イオン吸着防止構造と陽イオン吸着防止構造のそれぞれについて，選択係数に従ってイオン吸着防止構造の素材となる元素を選ぶ必要があり，陽イオン吸着防止構造であれば二族元素やＨなどを選び，陰イオン吸着防止構造であればＰＯ4やＳＯ4やＣｌＯ4やＩやＮＯ3などを有する構造であるとよい。
　一般にナノポアで用いられる薄膜３の材料には窒化ケイ素，酸化ケイ素，酸化ハフニウム，二硫化モリブデン，グラフェンが用いられることが多く，これらの材料は酸素元素を含んでいるか表面酸化される性質があり，多くの場合で表面が負に帯電する性質（例えば窒化ケイ素，酸化ケイ素であればシラノール基，グラフェンであればカルボキシル基やヒドロキシル基が負に帯電しやすい）を持つことから，陽イオンを吸着する性質を有する場合が多い。そのため，ナノポアでは一般にイオン吸着防止構造には陽イオン吸着防止構造を選ぶことが好ましい。陽イオン吸着防止構造は，例えば薄膜材料中あるいは薄膜表面に二族元素を含ませた炭酸カルシウムや酸化カルシウムやケイ酸カルシウムなどによって形成されていてもよく，あるいはＳｉＮやＳｉＯ2などの薄膜の表面に二族元素を含む化合物などを析出させたり，鉱化作用によって炭酸カルシウムなどを化学修飾することによって形成されていてもよい。
　より好ましい陽イオン吸着防止構造の形成方法は，図４で示したような，ナノポアを形成している壁面に吸着しやすい陽イオン９を含む第一の溶液を接液させるという方法であり，この方法を用いることで簡易にナノポア壁面の表面構造を変えることができる。またこの手法はナノポアの厚みや孔径などを大きく変えることなくＲＴＮを抑制することができ，被検体としてＤＮＡなどの生体ポリマを計測する際の塩基分解能などのセンサ特性を変えずに適用できる。
　続いて，本実施例で用いるＲＴＮを抑制して計測する手順を詳しく説明する。図５は，本実施例による電流計測装置の構成例を示す断面模式図であり，薄膜３のナノポア２が形成されている壁面及びその近傍を，イオン吸着防止構造８で覆って電流を計測する様子を示している。
　ナノポア２を有する薄膜３は片面が第一の槽１１，もう一方の面が第二の槽１２に配置されて溶液１に接液し，第一の槽１１と第二の槽１２は，薄膜３によって分離され，ナノポア２を通じて連通している。第一の槽１１，第二の槽１２には電解質を含む溶液１が充填されており，第一の電極１３と第二の電極１４がそれぞれ第一の槽１１，第二の槽１２に設けられていて，第一の電極１３は第一の槽１１内の溶液に接し，第二の電極１４は第二の槽１２内の溶液に接している。第一の電極１３と第二の電極１４の間に電源装置１５によって電圧を印加することで，ナノポア２を通過する電流を電流計１６によって計測できる。
　第一の電極１３や第二の電極１４などの電極は，溶液１中の電解質と電子授受反応（ファラデー反応）を行うことが可能な材質で作製されることが好ましく，典型的にはハロゲン化銀又はハロゲン化アルカリ銀で作製されたものである。電位安定性及び信頼性の観点からは，銀／銀塩化銀を電極に使用することが好ましい。電極は，分極電極となる材質で作製されてもよく，例えば金や白金などで作製されてもよい。その場合は，安定的なイオン電流を確保するために溶液に電子授受反応を補助することができる物質，例えばフェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウムなどを添加することが好ましい。あるいは，電子授受反応を行うことが可能な物質，例えばフェロセン類をその分極電極表面に固定化することが好ましい。
　電極の構造は，電極全てが前記材質で構成されていてもよく，あるいは前記材質が銅，アルミニウムなどの下地材の表面に被覆されていてもよい。電極の形状は特に限定されるものではないが，溶液と接液する表面積が大きくなる形状が好ましい。電極は配線と接合されて，測定回路へと電気信号が送られる。電源装置１５は印加電圧を制御できるようにパソコン１７と繋げていてもよく，電流計１６についてもパソコンなどの装置に繋ぐことで，計測した電流をデータとして保存する計測システムとなっていてもよい。電流計１６は，電圧の印加によって電極間に流れる電流を増幅するアンプとＡＤＣ（Analog to Digital Converter）を有していてもよい。
　本実施例におけるナノポア２は無機材料の薄膜３中に設けられており，無機材料は半導体微細加工技術で形成できる材質であればよく，典型的には窒化ケイ素，酸化ケイ素，酸化ハフニウム，二硫化モリブデン，グラフェンなどであり，好ましくは半導体プロセスで量産可能なＳｉの化合物である窒化ケイ素や酸化ケイ素などである。ただしＤＮＡ計測時の塩基分解能が高いグラフェンなどの膜でもあっても，イオンの吸脱着によるＲＴＮは発生することから，このような２次元材料の膜にも本実施例は適用可能である。薄膜３を支持する構造１０としては，例えば７２５μｍの厚さのシリコンの支持基板で，厚さ１μｍ以下，面積１００μｍ2以下のＳｉＮ薄膜を支持したデバイスを使用する。
　薄膜３中に設けられるナノポア２は，大量生産ができるよう半導体プロセスによって形成されていてもよく，孔径が小さくなるようにＴＥＭの電子線で形成されていてもよい。より好ましくは，孔径の小さなナノポア２を精度良く，素早く，安価に形成できるように，薄膜３に高電圧を与えることで絶縁破壊によって形成されたナノポア２を用いるとよい。
　本実施例で扱うＲＴＮは原子半径１ｎｍ以下の陽イオンの脱離吸着によって生じるため，陽イオンのサイズの１００倍程度以下の，比較的寸法が小さなナノポア２を通過する電流を計測する際により顕著に見られる現象である。そのため特にナノポア２の直径が０．１ｎｍ（設計限界）以上１００ｎｍ以下，長さが０．１ｎｍ（設計限界）以上１００ｎｍ以下である場合において，ＲＴＮの低減効果を発揮し，ナノポア２の直径が０．１ｎｍ（設計限界）以上１０ｎｍ以下，長さが０．１ｎｍ（設計限界）以上５０ｎｍ以下である場合には更に顕著にＲＴＮの低減効果が得られ，ナノポア２の直径が０．１ｎｍ（設計限界）以上５ｎｍ以下，長さが０．１ｎｍ（設計限界）以上２０ｎｍ以下である場合にはその低減効果はより一層顕著になる。例えば，ナノポア２の直径が０．１ｎｍ（設計限界）以上５ｎｍ以下，長さが０．１ｎｍ（設計限界）以上２０ｎｍ以下である場合に，本実施例のＲＴＮ抑制手順を用いずに計測を行うと，後述の実験結果（図１５）で示すようにベース電流１ｎＡに対してＲＴＮによって１ｎＡの変動が生じるため，計測精度を著しく低下させ，センサとして使うことは極めて困難になる。そのため，本手法は特に直径が０．１ｎｍ（設計限界）以上１００ｎｍ以下，長さが０．１ｎｍ（設計限界）以上１００ｎｍ以下の比較的小さなナノポアにおいて適用することが有効である。
　また計測内容によってナノポアの直径はより厳密に定めることが好ましく，例えば直径１０ｎｍ程度の生体ポリマやビーズなどを分析する場合には１００ｎｍ以下，好ましくは５０ｎｍ以下であり，具体的にはおよそ０．９ｎｍ以上１０ｎｍ以下などである。例えば直径が約１．４ｎｍであるｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）の分析に用いるナノポアの直径は，好ましくは１．４ｎｍ～１０ｎｍ程度，より好ましくは１．４ｎｍ～２．５ｎｍ程度である。また，例えば直径が約２．６ｎｍであるｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）の分析に用いるナノポアの直径は，好ましくは３ｎｍ～１０ｎｍ程度，より好ましくは３ｎｍ～５ｎｍ程度である。
　同様に計測内容によってナノポアの厚さについても，より厳密に定めることが好ましく０．１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるとよく，より好ましくは０．１ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。被検体として生体ポリマなどを分析する場合には，生体ポリマを構成するモノマ単位の２倍以上，好ましくは３倍以上，より好ましくは５倍以上の大きさとする。例えば生体ポリマが核酸から構成されている場合には，厚さは塩基３個以上の大きさ，例えば約１ｎｍ以上とすることが好ましい。一方でナノポアセンサの分解能という観点でみると，生体ポリマの形状や構成物質（ＤＮＡであれば塩基の種類等）を把握するためには，ナノポアの厚さは薄いことが好ましい。例えば生体ポリマの大きさが１～１０μｍ程度の連鎖球菌などを計測し，その直鎖状に連なった形状を把握するためには，ナノポアの厚さは２００ｎｍ以下にすることが好ましく，より好ましくは１００ｎｍ以下である。さらに生体ポリマが核酸から構成されているＤＮＡの塩基種などを解析するためには，塩基毎の間隔が０．５ｎｍ程度と短いことから，ナノポアの厚さは３０ｎｍ以下にすることが好ましく，より好ましくは１０ｎｍ以下である。これにより，生体ポリマの形状や構成物質などを高分解能で解析可能となる。また，ナノポアの形状は，基本的には円形であるが，楕円形や多角形とすることも可能である。
　本実施例の電流計測装置を用いた計測例としては，ナノポア２を流れる電流値から溶液中に含まれるイオン種を同定するなどがあり，本手法によってＲＴＮを抑制することで測定精度を向上させることができる。図６は，本実施例の計測装置を用いた計測例を示す断面模式図である。図６は，ＤＮＡなどの生体ポリマ５１をナノポア２に通して封鎖電流を計測する例を示している。
　こうした計測において計測信号にＲＴＮが含まれるとＲＴＮによる変動と封鎖電流による変動の区別がつかなくなるため，ＲＴＮ低減効果は特に封鎖電流計測の場において発揮される。分析する対象となる生体ポリマ５１は，ナノポア２通過時に電気的特性，特に抵抗値を変化させる対象物であればよく，核酸から構成されるものである。具体的には，ＲＮＡ（一本鎖ＲＮＡ若しくは二本鎖ＲＮＡ），ＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ若しくは二本鎖ＤＮＡ），ＰＮＡ（ペプチド核酸），オリゴヌクレオチド，アプタマー，並びにそれらの組み合わせ（例えば，ハイブリッド核酸）である。
　生体ポリマ５１は，生体に存在するものであってもよいし，生体に存在するものから誘導されるものであってもよい。例えば，自然には存在しない配列や構成要素を含むポリマ，例えばpoly（Ａ），poly（Ｔ）などの配列，人為的に合成されたポリマ分子，ＰＣＲなどの核酸増幅技術によって調製された核酸，ベクターにクローニングされている核酸なども含まれる。これらの生体ポリマの調製方法は，当技術分野で周知であり，当業者であれば生体ポリマの種類に応じて適宜調製方法を選択することができる。本実施例において，生体ポリマの分析とは，生体ポリマを構成する核酸の特性解析を指す。例えば，生体ポリマを構成する核酸のモノマの配列順序の分析（配列決定），核酸の長さの決定，一塩基多型の検出，生体ポリマ数の決定，生体ポリマ中の構造多型（コピー数多型，挿入，欠失など）の検出などを指す。
　薄膜のナノポアにイオン吸着防止構造を設けて電流を計測する手順は複数あり，例えば，イオン吸着防止構造を設けた後に，薄膜の上下に溶液を流し込み，電流を計測するという手順であってもよい。あるいは，薄膜に半導体プロセス等によってナノポアを設けた後に，液相中での化学反応等を用いた表面修飾によってイオン吸着防止構造を設け，電流を計測するという手順であってもよい。あるいは，薄膜の上下に溶液を流し込み，絶縁破壊によってナノポアを開孔した後，液相中での化学反応等を用いた表面修飾によってイオン吸着防止構造を設け，電流を計測するという手順であってもよい。
　陽イオン吸着防止構造のより好ましい形成方法は，図４で示したような二族元素のイオンを含む溶液又は酸性溶液である第一の溶液を，ナノポアを有する壁面に接液させるという方法である。この方法を用いることで簡易にナノポア壁面の表面構造を変え，陽イオン吸着防止構造を形成することができる。またこの方法は，ナノポアの厚みや孔径などを大きく変えることなくＲＴＮを抑制することができ，ＤＮＡなどの生体ポリマを計測する際の塩基分解能などのセンサ特性を変えずに適用できる。
　図７は，接液によってナノポア壁面にイオン吸着防止構造を形成する手順の一例を示す断面模式図である。最初に，薄膜３に半導体プロセス等によってナノポア２を設けた後に，図７（Ａ）に示すように，その薄膜３を用いて計測装置を組み立てる。次に，図７（Ｂ）に示すように，計測装置の第一の槽１１及び第二の槽１２に二族元素のイオンを含む溶液又は酸性溶液である第一の溶液２１を導入し，薄膜３の表面及びナノポア２の壁面を第一の溶液２１に接液させてイオン吸着防止構造８を形成し，その後例えば第一の槽１１に試料を注入してナノポア２を流れるイオン電流を計測すればよい。このように接液によって表面状態を変える場合，膜表面にエネルギーを与えることによって膜の表面状態を大きく変更することができイオン吸着防止構造８をより効率的に形成できるため，接液後に膜に０．１Ｖ以上などの電圧を１秒以上などの時間印加することが望ましい。
　ナノポア壁面に陽イオン吸着防止構造を形成して電流計測を行うより好ましい方法は，接液によって壁面の表面状態を変える方法と，絶縁破壊によってナノポアを開孔する方法とを組み合わせることである。図８は，この電流計測方法を説明する断面模式図である。具体的な計測手順の一例は，図８（Ａ）に示すように第一の溶液２１を薄膜３の両側の第一の槽１１及び第二の槽１２に満たした後に，図８（Ｂ）に示すように，第一の電極１３と第二の電極１４の間に１［Ｖ］以上の電位差を与えることによって絶縁破壊によって薄膜３にナノポア２を開孔し，その後ナノポア２を通過するイオン電流を計測する，という手順である。このように絶縁破壊すると，より高電圧を与えられるため膜の表面状態を変更し長時間維持することが可能になり，またナノポア２の開孔と陽イオン吸着防止構造８の形成を同時に行うことができるため，より簡易にナノポア２と陽イオン吸着防止構造８とを有する薄膜を製作できる。
　上記で述べたような手順で，薄膜に対して電圧印加によるエネルギーを与えることで表面状態を変えてイオン吸着防止構造を形成する場合には，表面状態変更時に与えた電圧の向きと，ナノポアを通過するイオン電流計測時における電圧の向きは一致させることが望ましい。具体的には，例えば図７（Ｂ）において第二の電極１４の電位を０［Ｖ］と基準としたとき，第一の電極１３に対して正の電圧＋Ｖ1［Ｖ］を与えることで膜の表面にエネルギーを与えた場合には，ナノポア２を通過するイオン電流を計測する際にも第一の電極１３に対して正の電圧＋Ｖ2［Ｖ］を与えることでイオン電流を計測することが望ましい。
　図８（Ｂ）のように絶縁破壊で薄膜にナノポアを開孔する場合でも同様であり，第二の電極１４の電位を０［Ｖ］と基準としたとき，第一の電極１３に対して正の電圧＋Ｖ1［Ｖ］を与えることで絶縁破壊によって薄膜にナノポアを開孔した場合には，ナノポア２を通過するイオン電流を計測する際にも第一の電極１３に対して正の電圧＋Ｖ2［Ｖ］を与えることでイオン電流を計測することが望ましい。
　また電圧の向きを逆にして第一の電極１３を負の電圧としてもよく，例えば図７（Ｂ）において第二の電極１４の電位を０［Ｖ］と基準としたとき，第一の電極１３に対して負の電圧－Ｖ1［Ｖ］を与えることで膜の表面にエネルギーを与えた場合には，ナノポア２を通過するイオン電流を計測する際にも第一の電極１３に負の電圧－Ｖ2［Ｖ］を与えてイオン電流を計測することが望ましい。
　このように表面状態変更時，すなわちイオン吸着防止構造形成時に与えた電圧の向きと，ナノポア２を通過するイオン電流計測時における電圧の向きを一致させる理由を以下で説明する。例えば第一の溶液２１に二族元素を含むＣａＣｌ2水溶液を用いることとし，図７（Ｂ）において第二の電極１４の電位を０［Ｖ］と基準として，第一の電極１３に対して正の電圧＋Ｖ1［Ｖ］を与えることで膜の表面にエネルギーを与えた場合には，溶液中に電離している正に帯電したＣａ2＋イオンは第二の電極１４側へと引き付けられるため，図７（Ｂ）に図示した薄膜３の上側において反応が進みやすく，薄膜３の下側に比べて上側の方が陽イオン吸着防止構造８のロバスト性が向上する。
　その後，ナノポア２を通過するイオン電流を計測する際に，仮に第一の電極１３に対して負の電圧－Ｖ2［Ｖ］を与えたとすると，薄膜３の上側に吸着したＣａ2＋イオンが第一の電極１３に引き付けられて脱離することで陽イオン吸着防止構造８が失われ，ＲＴＮが発生しやすくなる。また第一の電極１３に対して負の電圧－Ｖ2［Ｖ］を与えたとき，薄膜３の下側では溶液中に含まれる陽イオンが第一の電極１３側へと強く引き付けられるのに対して，薄膜３の下側の陽イオン吸着防止構造８のロバスト性は薄膜３上側と比べて低いために，ＲＴＮが発生しやすくなる。そのため，上記の例ではナノポア２を通過するイオン電流を計測する際には，第一の電極１３に対して正の電圧＋Ｖ2［Ｖ］を与えることが好ましい。
　第一の溶液２１の候補としてはＭｇ，Ｃａ，Ｓｒ，Ｂａなどの二族元素を含む溶液又は酸性溶液であり，前者は二族元素を，後者はプロトンをナノポア２表面に吸着させる方法である。第一の溶液２１に含まれるアニオンとしては，電離するアニオン類を用いることができ，電極の材質との相性によって選定することが好ましい。例えば電極材質としてハロゲン化銀を用いた場合，Ｉ，Ｂｒ，Ｃｌなどのハロゲン化物のイオンをアニオンとして用いることが好ましい。またアニオンは，グルタミン酸イオン等に代表される有機アニオン類であってもよい。
　陽イオンを吸着させる場合には，陽イオン交換樹脂等において一般に選択係数が大きいとされる陽イオンを用いることが望ましく，例えば二族元素のイオンなどを用いるとよい。このうち特に選択係数が大きなカチオンとしてＣａ，Ｓｒ，Ｂａなどを選ぶと，より膜表面に吸着しやすくＲＴＮを低減できる。このような二族元素のカチオンなどを溶液中に含ませる場合には，その濃度は濃いことが望ましい。下限値は１０ｍＭであればＲＴＮの低減効果が得られることが判明しており，１０ｍＭ以上飽和濃度以下に調整することが望ましい。
　プロトンを吸着させる場合には，ＲＴＮ低減効果が高まるｐＨ５．５以下の酸性溶液を用いることが好ましく，ｐＨ１などのより低いｐＨに調整することがより望ましい。すなわち，第一の溶液２１に含まれる［Ｈ＋］濃度は１０-5.5Ｍ以上飽和濃度以下とするのが好ましい。このとき二族元素を含む酸性溶液であってもよく，あるいはアルカリ金属元素も二族元素も含まないＨＣｌなどの溶液であってもよい。
　一方で，第一の溶液２１を用いてＲＴＮを低減してＤＮＡなどの生体ポリマを計測する場合，溶液中に二族元素が含まれるとＤＮＡなどの生体ポリマと強く相互作用してＴｍ値が大きく変動することが知られており，立体構造を形成してＤＮＡなどの生体ポリマがナノポアを通過する挙動が変化したり，ナノポアを通過できなくなる可能性がある。またｐＨが小さい酸性溶液はＤＮＡの脱プリン反応などを引き起こすことが知られており，もとの構造を維持できなくなる。
　そのため，ナノポア壁面に第一の溶液を接液させた後，第一の溶液に対して一族元素のイオンを含む第二の溶液を導入し，第一の溶液の濃度を下げることが望ましい。このように新たに第二の溶液を導入しても，一族元素の選択係数が小さいために陽イオン吸着防止構造は維持されて一族元素の吸着を防ぎ，ＲＴＮを抑制した状態を維持できる。第二の溶液に含まれる一族元素の代替カチオンには，有機物から構成される有機カチオン類を用いることができ，例えばアンモニウムイオンなどに代表される電離するカチオンを用いることもできる。
　第一の溶液がｐＨ５．５以下の酸性溶液である場合には，第二の溶液は第一の溶液と比較してｐＨが高い必要があり，ｐＨ５．５以上であるとよい。ｐＨ値の上限は以下のように決定する。測定溶液のｐＨ値の上限は，デバイスの耐性限界及び測定対象とする生体ポリマの耐性限界によって決定される。半導体ナノポアにおいて典型的に用いられるシリコンウェハーを基板として用い，シリコンのエッチングが開始されるｐＨ１４付近がデバイスの耐性限界である。このようなエッチングレートは既知である（Lloyd D. Clark, et al. Cesium Hydroxide (CsOH): A Useful Etchant for Micromachining Silicon, Technical Digest, Solid-State Sensor and Actuator Workshop, IEEE, 1988.）。なお，しばしば薄膜材質として採用される窒化ケイ素は，高アルカリ領域のｐＨにおいてもエッチングされることはないが，土台としてのシリコン又は酸化ケイ素がエッチングされていくため，ｐＨの上限値としては１４を設定することが好ましい。すなわち，第二の溶液に含まれる［Ｈ＋］濃度は１０-14Ｍ以上１０-5.5Ｍ以下とするのが好ましい。他の半導体材質では，その材質のデバイス耐性限界によって同様に決定される。
　一方，生体ポリマ（特にＤＮＡなど）は，溶液中の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）が０．３Ｍ以上の場合に，長鎖が切断されることが確認されている。濃度依存性があることが分かっている，カチオン種の異なる水酸化物溶液でも同様の結果となる。生体ポリマがＤＮＡの場合，ｐＨ１２以下にすることが望まれる。ところで，測定溶液は，大気に触れていると大気中の二酸化炭素と反応して徐々にｐＨが酸性側へと移行してしまう現象が発生する。この二酸化炭素の影響を少なくするためには，ｐＨを，初期状態からより高いアルカリ側へ設定しておくか，又は，ｐＨ調整剤の濃度を高濃度にすればよい。ｐＨ調整剤の濃度は高いほど好ましく，好ましくは５０ｍＭ以上，より好ましくは１００ｍＭ以上である。
　また第二の溶液に含まれる一族元素の種類は，溶媒として水を用いた場合に例えば１ｍｏｌ／ｋｇの塩化アルカリ水溶液の電気伝導度は２５℃において，ＬｉＣｌ：７．１８８Ｓｍ-1，ＮａＣｌ：８．４０５Ｓｍ-1，ＫＣｌ：１０．８４Ｓｍ-1，ＲｂＣｌ：１１．０４Ｓｍ-1，ＣｓＣｌ：１０．８６Ｓｍ-1であることが知られていることから，電気伝導度が高いＫ，Ｒｂ，Ｃｓなどが好ましく，より好ましくは水への溶解度が最も大きいため濃度を大きくすることで電気伝導度を増幅できるＣｓである。一方で一族元素のうちＫとＲｂ，特にＣｓは選択係数が大きく，ＲＴＮが増幅しやすいというトレードオフが懸念されていた。しかし，第一の溶液からＣｓを含む第二の溶液へ置換するという手順により，生体ポリマ解析時の信号量の増幅とＲＴＮの低減を両立できる。
　イオン濃度については，信号対ノイズ比の観点から，電解質濃度の下限を設けることが好ましい。Venta, K., et al., Differentiation of Short, Single-Stranded DNA Homopolymers in Solid-State Nanopores, ACS Nano, 7, 4629 (2013)によると１Ｍのイオンを含んだ溶液下では塩基間の封鎖電流量差が５００ｐＡ程度であることが明らかとなっている。この封鎖電流量差はナノポアの電気伝導度に正に依存し，溶媒として水を用いた場合，Ralph M. M. Smeets, et al. Salt Dependence of Ion Transport and DNA Translocation through Solid-State Nanopores, Nano Lett. 6, 89, 2006に開示されているように，電気伝導度は１ｍＭ程度までは電解質濃度に概ね線形に応答することが知られる。したがって，電解質濃度を１桁減少すると封鎖電流量差も１桁減少する。そのため，塩基間の封鎖電流量差は，１００ｍＭでは５０ｐＡ，１０ｍＭでは５ｐＡ，１ｍＭでは０．５ｐＡと減少していく。一方で，計測時に発生する高周波の電流ノイズとしてはデバイス由来のノイズとアンプ由来のノイズの２種類に大別することができるが，容量を低減する等の対策によってデバイス由来のノイズを低減してもアンプ由来のノイズ以下にまで低減することは困難である。したがって，アンプ由来ノイズによって電解質濃度の下限は定義されるが，Adrian Balan, et al. Improving Signal-to-Noise Performance for DNA Translocation in Solid-State Nanopores at MHz Bandwidths, Nano Lett. 14, 7215, (2014)に開示されているように，しばしば用いられる周波数域（５～１０ｋＨｚ）において，アンプ由来ノイズは約１ｐＡである。よって，統計的に有意な信号対ノイズ比として５がしばしば定義されることから，電解質濃度の下限は１０ｍＭである必要がある。一方，電解質濃度の上限を妨げる要件はなく，飽和濃度まで許容することができる。すなわち，測定溶液のイオン濃度は，１０ｍＭ以上，飽和濃度以下となる。
　第二の溶液の導入手順については，第一の溶液が含まれた状態で薄膜にエネルギーを与えることによって膜の表面状態を大きく変更できるため，第一の溶液中の薄膜に０．１Ｖ以上などの電圧を印加した後に第二の溶液を導入することが望ましい。より好ましくは，第一の溶液に接液した状態で薄膜に高電圧を印加して絶縁破壊によりナノポアを開孔した後に，第二の溶液を導入するという手順であり，この場合，より高電圧を与えられるため膜の表面状態を効果的に変更して陽イオン吸着防止構造を形成でき，長時間ＲＴＮの抑制が可能になる。
　第二の溶液を導入する際には第一の溶液の濃度を十分に低減させることが望ましく，第二の溶液導入後の第一の溶液の濃度は２０％以下になることが好ましく，より好ましくは１０％以下であり，具体的には０．０１％～１％などであるとよい。導入手順の詳細については，例えば第一の溶液の溶液量を１００μＬ程度にしておき，第二の溶液を１０００μＬ程度導入すると，十分に第一の溶液の濃度を低減させることができる。
　図９は，第二の溶液で第一の溶液を置換する方法の例を示す説明図である。例えば溶液槽の容量を１００μＬ程度としておき，図９に示すように溶液槽に注入口３１ａ及び排出口３１ｂを設ける。第一の槽１１及び第二の槽１２に第一の溶液２１を注入し，薄膜３及びナノポア２の壁面を第一の溶液２１に接液させて陽イオン吸着防止構造８を形成した後，ピペット３２等によって第二の溶液２２を注入口３１ａから導入する。この操作により第一の溶液２１を排出口３１ｂから溢れさせることができるため，溢れた溶液を回収すると，より効率よく第一の溶液２１の濃度を低減できる。あるいは，もともとは１００μＬ入っていた溶液槽内の第一の溶液２１を回収して１０μＬ程度まで減少させた後に第二の溶液２２を１０００μＬ程度導入すると，より効率よく第一の溶液２１の濃度を低減できる。第一の溶液２１を全て回収してから第二の溶液２２を流し込んでもよく，この方がより第一の溶液２１の残存を防止できる。一方で，溶液を導入する際にナノポア２近傍では気泡が発生しやすいため，ナノポア２の近傍の第一の溶液２１を残して第二の溶液２２を流し込んだ方が，第二の溶液２２導入時の気泡の発生を抑制できる。また第一の溶液２１が十分に第二の溶液２２に置換されたかを判別できるように，溶液槽に濃度を計測できるモニタを有していてもよい。
　二族元素のイオンを含むあるいは酸性の第一の溶液は，多量に用意せずに済むように第一の槽１１及び第二の槽１２のうち一方の槽にのみ満たされており，他方の槽は第一の溶液２１とは電解質の種類や濃度が異なる第三の溶液で満たしてもよい。このように片側の槽にのみ第一の溶液を満たしても，ナノポアの壁面との接液により陽イオン吸着防止構造８を設けることができるため，ＲＴＮの低減効果が得られる。またこのような配置にすると，特にナノポアをアレイ化した構造において，多量に第一の溶液を用意せずに済み，溶液の価格が第一の溶液＞第三の溶液である場合には低コスト化できるといった利点がある。より好ましくは，第三の溶液には一族元素のイオンが含まれており，第一の溶液と第三の溶液を薄膜及びナノポアの壁面に接液させた後，第一の溶液へ第二の溶液を導入するのがよい。
　図１０は，上記手順を実施するに適した計測装置の構成例を示す断面模式図である。第一の槽１１には二族元素のイオンを含む溶液あるいは酸性の溶液である第一の溶液２１が満たされ，第二の槽１２には一族元素のイオンを含む第三の溶液２３が満たされている。この場合，Ｃｓ等の一族元素のイオンを含む第二の溶液２２は，陽イオン吸着防止構造８を形成した後で第一の槽１１にのみ導入すればよい。第二の槽１２に満たされている第三の溶液２３には既に一族元素が含まれているため，新たに第二の溶液２２を導入する必要がない。このような構成にすると，溶液の導入機構を第一の溶液を満たす第一の槽１１にのみ設ければ済むため，装置構成が簡単になる。
　より好ましい手順は，第一の槽１１に二族元素のイオンを含む溶液あるいは酸性の溶液である第一の溶液２１が満たされ，第二の槽１２には一族元素のイオンを含む第三の溶液２３が満たされている状態で，薄膜３に高電圧を印加して絶縁破壊によりナノポア２を設けた後に，第一の槽１１にのみ第二の溶液２２を導入するという手順である。この場合，薄膜３により高電圧を与えられるため効率的に膜の表面状態を変更して陽イオン吸着防止構造８を形成し，長時間ＲＴＮの抑制が可能になる。このように膜に対して電圧印加によるエネルギーを与えることで表面状態を変える場合には，表面状態変更時に与えた電圧の向きと，ナノポア２を通過するイオン電流計測時における電圧の向きは一致させることが好ましい。
　具体的な計測手順の一例を挙げると，絶縁破壊によりナノポア２を開孔する際に，第一の槽１１には第一の溶液２１を満たし，第二の槽１２には第三の溶液２３を満たして，第一の槽１１に設けられた第一の電極１３の電位を０［Ｖ］と基準としたとき，第二の槽１２に設けられた第二の電極１４に対して正の電圧＋Ｖ1［Ｖ］を与えることで膜の表面にエネルギーを与える。この後，ナノポア２を通過するイオン電流を計測する際には第一の槽１１へ第二の溶液２２を導入し，第二の電極１４に対して正の電圧＋Ｖ2［Ｖ］を与えることでイオン電流を計測することが望ましい。また生体ポリマの封鎖電流を取得する際には，第一の槽１１に生体ポリマ５１を含ませることが望ましい。
　またより好ましくは，第三の溶液２３を用いる上記の構成を，ナノポア２をアレイ化した構造において適用するとよい。図１１は，ナノポアアレイを備える計測装置の構成例を示す断面模式図である。第一の槽１１と第二の槽１２は，複数のナノポア２が形成された薄膜３によって分離されている。第一の槽１１は複数のナノポア２に対して１つの共通槽を構成する。一方，第二の槽１２は，個々のナノポアに対応する複数の個別槽に分割されている。共通槽には１個の第一の電極（共通電極）１３が配置され，各個別槽には個別電極が１個ずつ配置される。
　ナノポアアレイでは，図１１に示すように薄膜３の各ナノポア２に対して独立して設けられた個別槽に各々満たされる溶液と，各ナノポア２に対して共通の共通槽に満たされる溶液とが存在する構成が考えられる。このとき各ナノポア２に個別に満たされる溶液は互いの電位が異なるように配置されることが望ましく，各個別槽は絶縁性の隔壁４１によって互いに仕切られている。この絶縁性の隔壁４１の素材は固体，液体，気体のいずれであってもよく，例えば固体である場合にはＰＭＭＡなどの樹脂で仕切られており，好ましくは耐薬品性の高いポリイミドやテフロン（登録商標）などであるとよい。また隔壁４１が液体である場合であって，各ナノポア２に個別に満たされる溶液の溶媒が水である場合には，例えば水と混合しない有機溶媒などを用いるとよい。また隔壁４１を空気やＮ2などの気体にすることで絶縁されていてもよい。
　このように共通の溶液を設ける構成は，ナノポア２の上下に満たす溶液を全て個別溶液とする構成と比較して，溶液の導入機構が簡単になるという利点があり，また共通の溶液にのみ生体ポリマを含ませるだけで，全てのナノポアで同時に生体ポリマの封鎖電流を取得できるという利点がある。このとき図１１に示す構成のとおり，隔壁４１で仕切られた個別槽に満たす個別溶液を第三の溶液２３とし，共通槽に満たす共通溶液を第一の溶液２１とすることで，第一の溶液２１にのみ第二の溶液２２を導入すればよく，生体ポリマの封鎖電流を取得する際には第二の溶液２２に生体ポリマを含ませることが望ましい。
　また生体ポリマ解析時の信号量を大きくするためには，第三の溶液に含まれる一族元素はＣｓであることが望ましい。Ｃｓイオン濃度については，信号対ノイズ比の観点から，電解質濃度に下限を設けることが好ましい。本実施例の場合，電解質濃度の下限は１０ｍＭである必要がある。一方，電解質濃度の上限を妨げる要因はなく，飽和濃度まで許容することができる。すなわち，測定溶液のＣｓイオン濃度は，１０ｍＭ以上，飽和濃度以下となる。好ましくは０．１Ｍ以上飽和濃度以下となる。図１１に示すようなナノポアアレイ構造では，計測のスループットを飛躍的に上昇させることができるという利点がある。このナノポアアレイ構造では，ナノポア２を規則的に配列することが好ましい。複数のナノポアを配置する間隔は，使用する電極，電気測定系の能力や半導体プロセスの加工限界などに応じて，０．１μｍ～１０μｍ，好ましくは０．５μｍ～４μｍとすることができる。
　続いて，上記で述べた第一の溶液へ第二の溶液を導入する手順を含んだ電流計測を実現するための装置の構成例を詳しく説明する。
　図１２は，第一の溶液２１へ第二の溶液２２を導入する機構を有する計測装置の構成例を示す概略図である。少なくとも第一の溶液２１が導入される溶液槽には第二の溶液２２を導入する注入口３１ａがあり，第二の溶液２２を導入することによって第一の溶液２１を外部に排出できるように排出口３１ｂが設けられているとよい。排出口３１ｂからは排出用流路１０２が設けられていてもよく，さらに排出用流路１０２が廃液槽１０３へと繋がっていてもよい。また第二の溶液２２を導入する注入口３１ａには注入用流路１０４が繋がっているとよく，注入用流路１０４は第二の溶液２２を格納する第三の槽１０５に繋がっていることが望ましい。
　また，第二の溶液２２を輸送する流体制御部１０１を有していることが望ましい。流体制御部１０１は具体的にはポンプによって送り出す構成になっていてもよく，バルブや弁で構成されていてもよい。また流体制御部１０１は注入用流路１０４，排出用流路１０２，第三の槽１０５，廃液槽１０３のいずれに設けられていてもよく，例えば排出用流路１０２，廃液槽１０３に設けて，廃液槽１０３や排出用流路１０２を陰圧にすることで，第二の溶液２２を輸送する機構になっていてもよい。流体制御部１０１は例えば１０ｍＬ／ｓ以下の流量で溶液を流し込む。好ましくは１００μＬ／ｓ以下，より好ましくは１０μＬ／ｓ以下の比較的ゆっくりした流入速度で流し込むことで，薄膜３近傍の乱流や水圧によって薄膜３が壊れることを防止できる。この流体制御部１０１は，第二の溶液２２を任意のタイミングで第一の溶液２１を有する溶液槽へと導入できるようにパソコン１７などと接続されて制御されていてもよい。
　図１２の例では，薄膜３の両側に満たされている溶液をいずれも第一の溶液２１としているため，第二の溶液２２を導入する機構は薄膜３の両側に導入する機構であることが望ましい。より好ましくは，薄膜３の片側，例えば第一の槽１１にのみ第一の溶液２１を満たし，第二の槽１２には第三の溶液２３を満たす構成であるとよい。この構成であれば，第三の溶液２３に第二の溶液２２を導入する機構は無くてもよいという利点があり，装置機構が簡単になる。個別に満たされる第三の溶液２３は，好ましくは一族元素を含み，より好ましくはその一族元素がＣｓであるとよい。
　図１３は，第一の溶液２１へ第二の溶液２２を導入する機構を有する計測装置の他の構成例を示す概略図である。本例のように第一の溶液２１を格納する第四の槽１０６を用意しておき，第二の溶液２２と同様に第一の溶液２１を導入する機構を有していることがより望ましい。
　この構成が好ましい理由を以下で説明する。例えば本実施例の計測システムをあるユーザーのもとで用いるとき，図１２に示した構成にすると，薄膜３の両側に溶液を導入しておき，薄膜３の両側の液槽に溶液が満たされた状態で販売元からユーザーのもとに届ける場合がある。しかし，薄膜３の両側の液槽に溶液を満たした状態で出荷又は長時間放置されると，薄膜３の両側を満たす溶液の電位差によって薄膜３に孔が開くなどの問題が生じたり（Matsui, K., Yanagi, I., Goto, Y. & Takeda, K. Prevention of dielectric breakdown of nanopore membranes by charge neutralization. Sci. Rep. 5, 17819 (2015)），満たした溶液によって薄膜３が酸化又はエッチングされて孔が開くなどの問題が生じる。そのため，図示の例のように薄膜３の片側にのみ溶液を導入した状態や，いずれの槽にも溶液が導入されていない乾燥状態で出荷することがより好ましい。この場合，溶液を薄膜３の片側あるいは両側に導入するのはユーザーのもとで行うことになる。そのため，図１３のように第一の溶液２１を格納する第四の槽１０６を用意することで，ユーザーのもとで薄膜３の両側に溶液を満たす機構を実現できるようになる。第三の槽１０５と注入用流路１０４の間及び第四の槽１０６と注入用流路１０４の間には，それぞれ流体制御部１０１ａ，１０１ｂが設けられる。
　図１４は，本実施例の計測装置の他の構成例を示す模式図である。ナノポア２を有する薄膜３は，スループットを向上できるように図１４のようにナノポア２がアレイ化されていることが望ましい。第二の槽１２に設けられた複数の個別槽に個別に満たされている溶液は第一の溶液２１などとしてもよいが，好ましくは第三の溶液２３を満たすとよい。この構成であれば，第三の溶液２３に第二の溶液２２を導入する機構は無くてもよく，装置機構が簡単になる。個別槽に満たされる第三の溶液２３は，好ましくは一族元素を含み，より好ましくはその一族元素がＣｓであるとよい。
　図１４に示した計測装置に溶液を導入する手順の一例について説明する。まず図１４に示した状態から，流体制御部１０１ａを用いて第四の槽１０６から注入用流路１０４を介して第一の槽１１まで第一の溶液２１を導入する。このとき第一の溶液２１は，排出用流路１０２又は廃液槽１０３にまで導入されてもよい。この操作により薄膜３のナノポア２は第一の溶液２１に接液し，複数のナノポア２の壁面にイオン吸着防止構造が形成される。ここで第一の槽１１に配置された第一の電極（共通電極）１３と，第二の槽１２を区画した複数の個別槽に配置された複数の第二の電極（個別電極）１４の間に電圧を印加することで，イオン吸着防止構造を効率的に形成するのが好ましい。その後，流体制御部１０１ｂを用いて第三の槽１０５から注入用流路１０４を介して第一の槽１１まで第二の溶液２２を導入する。このとき，第一の槽１１を満たしていた第一の溶液２１は，排出用流路１０２を介して廃液槽１０３に導入され，第一の槽１１の内部は大部分が第二の溶液２２で置換される。このとき第二の溶液２２は，排出用流路１０２又は廃液槽１０３にまで導入されてもよい。
　以上では第三の槽１０５と第四の槽１０６を有し，かつアレイデバイスを有する計測装置における溶液導入手順を示したが，例えば図１２，図１３に示した計測装置において，本手順と同様の手順で溶液を導入してもよい。また図１４を用いて説明した溶液導入手順は単なる一例であり，必ずしも上記の手順によらなくてもよい。例えば第一の溶液２１や第二の溶液２２を導入する量などは上記の限りではない。また図１４の例では第一の溶液２１が導入される前にナノポア２が開孔されていたが，ナノポア２を有していない薄膜３に対して第一の溶液を導入して，絶縁破壊によってナノポア２を開孔することがより好ましい。
　第一の槽１１，第二の槽１２，第三の槽１０５，第四の槽１０６，廃液槽１０３などの溶液槽の素材は例えばＰＭＭＡであってもよく，耐薬品性にすぐれたテフロンなどで構成されていてもよい。各溶液槽の容量は例えば１００ｍＬ以下のものを使用する。注入用流路１０４や排出用流路１０２などの流路の素材は例えばＰＭＭＡであってもよく，耐薬品性に優れたテフロンなどであってもよい。注入用流路１０４や排出用流路１０２としては，例えば全長１ｍ以下で直径１ｃｍ以下のものを使用する。
　第一の溶液２１，第二の溶液２２，第三の溶液２３などの溶液は，使用手順や使用量などを記載した説明書と共に提供され得る。溶液の溶媒としては，生体ポリマを安定に分散可能であり，かつ電極が溶媒に溶解せず，電極との電子授受を阻害しない溶媒を用いることができる。例えば，水，アルコール類（メタノール，エタノール，イソプロパノールなど），酢酸，アセトン，アセトニトリル，ジメチルホルムアミド，ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。生体ポリマとして核酸を測定対象とする場合，最も好ましい溶媒は水である。各溶液は，各溶液槽に液体が満たされた状態で提供する形態であってもよいし，各溶液を封入したパックや液槽が提供され，第一から第四の槽に必要に応じて補充や交換をする形態であってもよい。また各溶液は，即時使用可能な状態（液体）で提供されてもよいし，使用時に適当な溶媒で希釈するための濃縮液として提供されてもよいし，あるいは，使用時に適当な溶媒で再構成するための固形状態（例えば粉末など）であってもよい。そのような溶液の形態及び調製は，当業者であれば理解することができる。
　電流を計測するシステムと溶液を導入するシステムとは，必ずしも同一の装置内に設けられている必要はなく，例えば電流計測装置と溶液導入装置とが分離されていて個別の装置として提供されてもよい。
　以下に，本実施例の効果を検証した実験例を示す。
　前述のように，ＲＴＮはナノポアを有する壁面及びその近傍におけるイオンの脱離吸着現象に由来すると仮定すると，例えば一般にナノポアで用いられるＳｉＮ薄膜では，ＲＴＮがシラノール基表面での陽イオンの脱離吸着によって生じる現象に由来すると考えられる。一般にシラノール基の選択係数はＬｉ＜Ｎａ＜Ｋ＜Ｒｂ＜Ｃｓ＜二族元素（Ｃａ，Ｂａ等）となることが知られており，Ｌｉなどのシラノール基に吸着しづらいカチオン種ではシラノール基表面からの脱離状態で安定化し，一方でＣａやＢａなどのシラノール基に吸着しやすいカチオン種ではシラノール基表面に吸着した状態で安定化すると考えられる。
　図１５は，一族元素を含む溶液でのベース電流の例を示す図である。図８に示した計測装置の第一の槽１１及び第二の槽１２にそれぞれ濃度１ＭのＬｉＣｌ，ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＲｂＣｌ，ＣｓＣｌを含む中性溶液を満たし，膜厚５～１０ｎｍ程度のＳｉＮ薄膜に絶縁破壊により１～１０ｎｍ程度のナノポア２を開孔した。その後，第一の電極１３と第二の電極１４の間に０．２Ｖの電圧を印加し，ナノポアを通過して流れるイオン電流を計測した。図１５の結果から，Ｌｉ＜Ｎａ＜Ｋ＜Ｒｂ＜Ｃｓの関係でＲＴＮが増幅していくことが判明し，本仮説を支持することが分かった。
　ところでＲＴＮを評価する際にはベース電流の波形だけでなく，パワースペクトル密度も用いられることがある。ナノポアシーケンサで報告されているＲＴＮは一般に複数の準位を遷移する場合が多く，２準位を遷移するＲＴＮが多数含まれた複合ＲＴＮに該当する。２準位遷移するＲＴＮのパワースペクトル密度は，対数表示において１／ｆ2に比例して減衰するローレンツ型であることが知られており，１／ｆ2ノイズと呼ばれている。一方で複合ＲＴＮでは様々な時定数を持った１／ｆ2ノイズが重ね合わさった状態で観測されるため，パワースペクトル密度は複数のローレンツ曲線の重ね合わせになり，対数表示において１／ｆα（０＜α＜２，α≒１）に比例して減衰し，下記の式で表せる（Heerema S. J., et al., 1/f noise in graphene nanopores, Nanotech. 26(7), 074001 (2015)）。
［式１］
　　Ｓ(ｆ)＝Ｃlf・Ｉ2／ｆα
　　　ｆ：周波数
　　　Ｓ(ｆ)：パワースペクトル密度
　　　Ｃlf：低周波ノイズ係数
　　　Ｉ：電流値
　　　α：係数
　このときＣlfを比較することでノイズ量を評価でき，Ｃlfが大きいほどノイズが大きいことを意味する。よって図１５に示したベース電流波形から図１６のようなパワースペクトル密度を取得し，パワースペクトル密度からＣlf＝Ｓ(１Ｈｚ)／Ｉ2を算出することで，ノイズ量を定量的に評価できる。
　図１７は，各種元素で計測したときのＣlf値の実験結果を示す図である。図１７では，中性に調整した１Ｍ　ＬｉＣｌ，１Ｍ　ＮａＣｌ，１Ｍ　ＫＣｌ，１Ｍ　ＲｂＣｌ，１Ｍ　ＣｓＣｌ，１Ｍ　ＭｇＣｌ2，１Ｍ　ＣａＣｌ2を用いてＳｉＮ薄膜に絶縁破壊によりナノポアを開孔した後のＣlfを実験回数Ｎ＝３回取得し，その平均値を比較した。結果，一族元素についてはＣlfがＬｉ＜Ｎａ＜Ｋ＜Ｒｂ＜Ｃｓとなることが判明し，またＣｓと比較してＣａやＢａなどの二族元素ではＣlfが減少することが判明した。この結果は我々によるＲＴＮの仮説を支持するものである。
　またＤＮＡ計測溶液は，中性に調整された一族元素を含む溶液を用いることが一般的であり，特に含有する一族元素がＫ，Ｒｂ，Ｃｓであるときに電気伝導度が高いことが判明していて，中でもＣｓは水に対する溶解度も高く，濃度を大きくすることでより電気伝導度を高めることができる。しかしながら，図１５や図１７に示すとおり計測溶液に含まれるＲＴＮはＬｉ＜Ｎａ＜Ｋ＜Ｒｂ＜Ｃｓとなることが判明した。すなわち従来の手法ではＣｓによって信号量の増幅を実現するとＲＴＮが増幅するという二律背反があり，本実施例のＲＴＮ低減法によって初めて両立されることを確認できた。
　続いて，ＲＴＮの発生メカニズムの仮説が正しいとすると，ｐＨが低い条件では飽和に存在するＨがシラノール基に吸着した状態で安定化すると考えられる。そこで１Ｍ　ＣｓＣｌのｐＨを１～８の範囲で変えてＳｉＮ薄膜に絶縁破壊によりナノポアを開孔した後のＣlfを実験回数Ｎ＝３回取得し，その平均値を比較した。図１８は，ｐＨを変えて計測したときのＣlf値の実験結果を示す図である。図１８に示されている通り，ｐＨ７～８程度の中性条件と比較して，ＣlfはｐＨ５．５以下で大幅に減少することが判明した。この結果はやはり上記の仮説を支持するものである。
　次に，ＲＴＮが低減する条件についてまとめると，図１７及び図１８から二族元素又は酸性溶液でＲＴＮが減少することが分かる。図１９は，上記で述べた二族元素である１Ｍ　ＭｇＣｌ2，１Ｍ　ＣａＣｌ2，１Ｍ　ＳｒＣｌ2，１Ｍ　ＢａＣｌ2又は酸性溶液である１Ｍ　ＣｓＣｌ（ｐＨ１）でナノポアを開孔したときのベース電流の例を示す図である。ベース電流測定時の印加電圧は０．３Ｖである。図１９から，確かにＲＴＮの低減効果があることが電流波形からも確かめることができた。二族元素の中で比較すると，ＭｇはＭｇ，Ｃａ，Ｓｒ，Ｂａの４種類の中ではシラノール基の選択係数が小さくＲＴＮは発生しやすい傾向にあるため，Ｃａ，Ｓｒ，ＢａであればよりＲＴＮを低減できる。また酸性溶液でよりＲＴＮを低減するには，図１８で示したとおりｐＨが小さくなるほどＣlfが小さくなる傾向があり，ｐＨ５．５以下の範囲でより小さいｐＨを選ぶことが好ましい。
　図２０は，図１９に示した二族元素のイオンを含む溶液又は酸性溶液を介してＳｉＮ膜に高電圧を与え，絶縁破壊によってナノポアを形成した後に，１Ｍ　ＣｓＣｌ（ｐＨ８）の溶液導入後のベース電流を示している。ベース電流測定時の印加電圧は０．３Ｖである。図２０に示すとおり，ＲＴＮを発生させやすいＣｓを導入した後もＲＴＮを抑制していることから，ナノポア壁面を二族元素又はＨで覆い，Ｃｓなどの他のカチオン種の脱離吸着を防止できることが判明した。以上の実験を通じて，ＲＴＮの発生メカニズムの検証を行うとともにその抑制方法が判明した。
　図２１は，二族元素でＲＴＮを低減した場合における，二族元素の濃度の下限について検証した結果を示す図である。図２１は，ＣａＣｌ2を含まない１Ｍ　ＣｓＣｌ，１０ｍＭ　ＣａＣｌ2を含む１Ｍ　ＣｓＣｌ，１００ｍＭ　ＣａＣｌ2を含む１Ｍ　ＣｓＣｌ，１Ｍ　ＣａＣｌ2を含む１Ｍ　ＣｓＣｌ，という４つの条件で絶縁破壊によってナノポアを開孔し，その後ＣａＣｌ2を含まない１Ｍ　ＣｓＣｌの溶液を導入した後のベース電流を示したものである。ベース電流測定時の印加電圧は０．３Ｖである。この結果から明らかなように，二族元素を溶液中に含ませる場合には，１０ｍＭ以上含むとＲＴＮ抑制効果があり，二族元素の濃度は１０ｍＭ以上飽和濃度以下に調整することが望ましい。
　図２２は，印加電圧の向きについて検証した結果を示した図である。図２２（Ａ）はＣａＣｌ2の溶液を介してＳｉＮ膜に正の高電圧（＋５～１０Ｖ）を与えて絶縁破壊によってナノポアを形成した後に，正電圧（＋０．２Ｖ）及び負電圧（－０．２Ｖ）を与えたときのベース電流を示している。ここで印加電圧の向きは，正電圧の場合にはナノポア形成時と同じ向き，負電圧の場合にはナノポア形成時と逆向きである。図２２（Ａ）に示すとおり，負電圧印加時と比較して正電圧印加時に，よりＲＴＮの発生を抑制できることが判明した。また図２２（Ｂ）はＣａＣｌ2の溶液を介してＳｉＮ膜に正の高電圧（＋５～１０Ｖ）を与え，絶縁破壊によってナノポアを形成した後に，ＣｓＣｌの溶液を導入し，正電圧（＋０．２Ｖ）及び負電圧（－０．２Ｖ）を与えたときのベース電流を示している。この場合にも，イオン電流計測時の印加電圧はナノポア形成時と同じ向きにすることでＲＴＮの発生を抑制できているのが分かる。この結果から明らかなように，イオン吸着防止構造を形成したときに印加した電圧の方向と，ナノポアを通過するイオン電流計測時における電圧の印加方向は一致させることが望ましいことが判明した。
　図２３は，薄膜の両側に配置される２つの溶液のうち，第一の溶液を薄膜の片側にのみ配置したときのノイズ低減効果について検証した結果を示した図である。図２３は，１Ｍ　ＣａＣｌ2の溶液を片側に，１Ｍ　ＣｓＣｌの溶液をもう一方の側に満たして，絶縁破壊によってナノポアを開孔し，１Ｍ　ＣａＣｌ2の溶液を含む溶液槽に１Ｍ　ＣｓＣｌの溶液を導入してイオン電流を計測したときのベース電流を示している。この結果から明らかなように，第一の溶液を片側にのみ満たした場合でも，ナノポア壁面との接液により陽イオン吸着防止構造８を設けることができるため，ＲＴＮの低減効果が得られることが判明した。
　図２３の実験と同様に第一の溶液を薄膜の片側にのみ配置し，かつ図２２の実験と同様にイオン吸着防止構造構成時の印加電圧の方向とナノポアを通過するイオン電流計測時における印加電圧の方向とを一致させ，生体ポリマとしてｓｓＤＮＡを計測した。図２４は，このときの実験結果を示した図である。この実験では，絶縁破壊によりナノポアを開孔する際の溶液を，負電圧側を１Ｍ　ＣａＣｌ2の溶液，高電圧側（＋５～１０Ｖ）を１Ｍ　ＣｓＣｌの溶液とした。ナノポア開孔後には１Ｍ　ＣａＣｌ2の溶液を含む溶液槽（負電圧を印加する側）にＤＮＡを含む１Ｍ　ＣｓＣｌの溶液を導入し，高電圧側に＋０．２Ｖを印加した。このとき図２４に示すように，ＤＮＡは負に帯電しているため，高電圧側へと泳動されてナノポアを通過して封鎖電流を発生させる。この結果から明らかなように，片側にのみ第一の溶液を満たし，かつイオン吸着防止構造構成時の印加電圧の方向とナノポアを通過するイオン電流計測時における印加電圧の方向とを一致させ，生体ポリマを計測できることが判明した。
　図２４までの実験では，絶縁破壊によってナノポアを形成する際に第一の溶液を用いることでイオン吸着防止構造を形成しＲＴＮを抑制した。図２５は，既に形成されているナノポアに対して第一の溶液を接液させることでイオン吸着防止構造を形成し，ＲＴＮを抑制した結果を示す図である。図２５（Ａ）はイオン吸着防止構造を設ける前のＣｓＣｌの溶液で計測しＲＴＮが発生したときのベース電流，図２５（Ｂ）はＣａＣｌ2の溶液を導入してイオン吸着防止構造を形成しＲＴＮを抑制したときのベース電流，図２５（Ｃ）は再度ＣｓＣｌの溶液を導入しイオン吸着防止構造を維持したままＲＴＮを抑制したときのベース電流である。この結果から明らかなように，イオン吸着防止構造を持たない薄膜に対して，第一の溶液を導入しても，イオン吸着防止構造を構築してＲＴＮを抑制できることが判明した。
　以上の実験例では，膜表面にシラノール基を有するＳｉＮ膜での実験結果を例示したが，当然のことながら陽イオンの脱離吸着現象はＳｉＮ膜に限定されるものではなく，膜の材質がグラフェンなどであってもカルボキシル基表面などで同様に陽イオンの脱離吸着現象によるＲＴＮは発生し，本手法を適用できる。また以上の実験例では，溶液を接液させることによって陽イオン吸着防止構造を設けたが，陽イオン吸着防止構造の形成方法は，例えば薄膜の材料中あるいは表面に二族元素を含ませた炭酸カルシウムや酸化カルシウムやケイ酸カルシウムなどによって形成されていてもよく，あるいはＳｉＮやＳｉＯ2などの薄膜の表面に二族元素を含む化合物などを析出させたり，鉱化作用によって炭酸カルシウムなどを化学修飾することによっても製作できる。
　なお，本発明は上記した実施例に限定されるものではなく，様々な変形例が含まれる。例えば，上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり，必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また，ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり，また，ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また，各実施例の構成の一部について，他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
２　ナノポア
３　薄膜
８　イオン吸着防止構造
１１　第一の槽
１２　第二の槽
１３　第一の電極
１４　第二の電極
１５　電源装置
２１　第一の溶液
２２　第二の溶液
２３　第三の溶液
４１　隔壁
５１　生体ポリマ
１０１　流体制御部
１０５　第三の槽
１０６　第四の槽

Claims (23)

  1. 　第一の槽と，
    　第二の槽と，
    　前記第一の槽と前記第二の槽を連通するナノポアを有し，前記第一の槽と前記第二の槽の間に配置された薄膜と，
    　前記第一の槽に設けられた第一の電極と，
    　前記第二の槽に設けられた第二の電極と，を備え，
    　前記ナノポアの壁面は，前記第一の槽及び／又は前記第二の槽に充填される溶液に含まれるイオンの脱離吸着を防止するイオン吸着防止構造を有し，
    　前記第一の電極と前記第二の電極の間に電圧を印加することで前記ナノポアを通過するイオン電流を計測する，電流計測装置。
  2. 　前記イオン吸着防止構造は前記溶液に含まれるイオンのうち陽イオンが脱離吸着することを防止する，請求項１に記載の電流計測装置。
  3. 　前記薄膜はＳｉを含む材質である，請求項１に記載の電流計測装置。
  4. 　前記ナノポアは直径が０．１ｎｍ以上１００ｎｍ以下，長さが０．１ｎｍ以上１００ｎｍ以下である，請求項１に記載の電流計測装置。
  5. 　前記第一の槽又は前記第二の槽に被検体である生体ポリマを導入し，当該生体ポリマが前記ナノポアを通過するときのイオン電流の変化を計測する，請求項１に記載の電流計測装置。
  6. 　薄膜に設けられたナノポアの壁面に，当該薄膜によって分離された第一の槽と第二の槽のうち少なくとも一方の槽に導入された二族元素のイオンを含む溶液又は酸性の溶液である第一の溶液を接液する工程と，
    　前記第一の槽に設けられた第一の電極と前記第二の槽に設けられた第二の電極の間に電圧を印加して前記ナノポアを通過するイオン電流を計測する工程と，
    を有する電流計測方法。
  7. 　前記ナノポアは前記第一の電極と前記第二の電極の間に電圧を印加して前記薄膜を絶縁破壊することによって開孔したナノポアである，請求項６に記載の電流計測方法。
  8. 　前記ナノポアを開孔する際，前記第一の槽と前記第二の槽のうち少なくとも一方の槽に前記第一の溶液が満たされている，請求項７に記載の電流計測方法。
  9. 　前記第一の電極と前記第二の電極の間に電圧を印加して前記薄膜を絶縁破壊することによって前記ナノポアを開孔するときの電圧の方向と，前記第一の電極と前記第二の電極の間に電圧を印加して前記ナノポアを通過する電流を計測するときの電圧の方向とが一致している，請求項８に記載の電流計測方法。
  10. 　前記二族元素がＣａ，Ｓｒ，Ｂａのいずれかである，請求項６に記載の電流計測方法。
  11. 　前記二族元素のイオン濃度が１０ｍＭ以上飽和濃度以下である，請求項６に記載の電流計測方法。
  12. 　前記イオン電流を計測する工程の前に，前記第一の溶液が導入された槽に一族元素のイオンを含む第二の溶液を導入する工程を有する，請求項６に記載の電流計測方法。
  13. 　前記第二の溶液を導入する前に，前記第一の電極と前記第二の電極の間に電圧を印加する工程を有する，請求項１２に記載の電流計測方法。
  14. 　前記第二の溶液を導入する前に前記第一の電極と前記第二の電極の間に電圧を印加するときの電圧の方向と，前記第一の電極と前記第二の電極の間に電圧を印加して前記ナノポアを通過する電流を計測するときの電圧の方向とが一致している，請求項１３に記載の電流計測方法。
  15. 　前記第二の溶液に含まれる一族元素がＣｓであって，そのイオン濃度が１０ｍＭ以上飽和濃度以下である，請求項１２に記載の電流計測方法。
  16. 　前記第一の溶液は前記第一の槽と前記第二の槽のうち一方の槽に導入され，他方の槽には一族元素のイオンを含む第三の溶液が導入される，請求項６に記載の電流計測方法。
  17. 　前記第三の溶液に含まれる一族元素がＣｓであって，そのイオン濃度が１０ｍＭ以上飽和濃度以下である，請求項１６に記載の電流計測方法。
  18. 　前記ナノポアは前記第一の電極と前記第二の電極の間に電圧を印加して前記薄膜を絶縁破壊することによって開孔したナノポアであり，
    　前記ナノポアを開孔する際，前記第一の槽と前記第二の槽のうち少なくとも一方の槽に前記第一の溶液として酸性の溶液が満たされており，
    　前記イオン電流を計測する工程の前に，前記第一の溶液を含む液槽に前記第一の溶液よりも［Ｈ＋］濃度が小さく，かつ一族元素のイオンを含む第二の溶液を導入する工程を有する，請求項６に記載の電流計測方法。
  19. 　前記第一の溶液に含まれる［Ｈ＋］濃度が１０-5.5Ｍ以上飽和濃度以下である，請求項１８に記載の電流計測方法。
  20. 　前記第二の溶液に含まれる［Ｈ＋］濃度が１０-14Ｍ以上１０-5.5Ｍ以下である，請求項１８に記載の電流計測方法。
  21. 　前記第一の槽及び前記第二の槽には二族元素のイオンを含む溶液又は酸性の溶液である第一の溶液が満たされており，
    　一族元素のイオンを含む第二の溶液が入った第三の槽と，
    　前記第三の槽と前記第一の槽又は前記第二の槽とを接続する注入用流路と，
    　前記第二の溶液を前記第三の槽から前記注入用流路を介して前記第一の槽又は前記第二の槽に注入するための流体制御部と，
    を有する請求項１に記載の電流計測装置。
  22. 　一族元素のイオンを含む第二の溶液を入れる第三の槽と，
    　二族元素のイオンを含む溶液又は酸性の溶液である第一の溶液を入れる第四の槽と，
    　前記第三の槽及び前記第四の槽と前記第一の槽又は前記第二の槽とを接続する注入用流路と，
    　前記第一の溶液を前記第四の槽から前記注入用流路を通して前記第一の槽又は前記第二の槽に注入するための第一の流体制御部と，
    　前記第二の溶液を前記第三の槽から前記注入用流路を通して前記第一の槽又は前記第二の槽に注入するための第二の流体制御部と，
    を有する請求項１に記載の電流計測装置。
  23. 　前記薄膜は前記ナノポアを複数有し，
    　前記第二の槽は複数の前記ナノポアのそれぞれに対応する複数の個別槽に分割され，
    　前記複数の個別槽には前記第二の電極がそれぞれ設けられ，
    　前記複数の個別槽には一族元素のイオンを含む第三の溶液が満たされており，
    　二族元素のイオンを含む溶液又は酸性の溶液である第一の溶液を入れる第四の槽と，
    　前記第四の槽と前記第一の槽とを接続する注入用流路と，
    　前記第一の溶液を前記第四の槽から前記注入用流路を通して前記第一の槽に注入するための流体制御部と，
    を有する請求項１に記載の電流計測装置。
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