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WO2018131705A1 - 腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法及び腫瘍状態の評価方法 - Google Patents

腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法及び腫瘍状態の評価方法 Download PDF

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WO2018131705A1
WO2018131705A1 PCT/JP2018/000792 JP2018000792W WO2018131705A1 WO 2018131705 A1 WO2018131705 A1 WO 2018131705A1 JP 2018000792 W JP2018000792 W JP 2018000792W WO 2018131705 A1 WO2018131705 A1 WO 2018131705A1
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WO
WIPO (PCT)
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tumor
marker gene
cancer
tumor marker
somatic mutation
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/000792
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English (en)
French (fr)
Inventor
史朗 北野
山田　岳史
吾郎 高橋
拓磨 岩井
幸樹 武田
Original Assignee
凸版印刷株式会社
学校法人日本医科大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 凸版印刷株式会社, 学校法人日本医科大学 filed Critical 凸版印刷株式会社
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Publication of WO2018131705A1 publication Critical patent/WO2018131705A1/ja
Priority to US16/506,489 priority patent/US11746382B2/en

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    • G16B40/20—Supervised data analysis

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the presence or absence of a somatic mutation of a tumor marker gene in a tumor tissue relatively noninvasively, and a method for evaluating a tumor state.
  • a RAS gene mutation can be mentioned as a predictor of the therapeutic effect of cetuximab or panitumumab, which are anti-EGFR (epidermal growth factor receptor) antibody drugs, which are molecular target drugs in the treatment of colorectal cancer.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • EGFR point mutation or deficiency may be mentioned.
  • BCR-ABL fusion genes, EML4-ALK fusion genes in EGFR-negative lung cancer patients, etc. have been tested in actual clinical settings as predictors of imatinib response in leukemia.
  • somatic mutation in tumor tissue is used as an index, so the oncogene genotype in a tumor tissue sample collected by biopsy is examined.
  • somatic mutations since it does not matter when somatic mutations occur, it is desirable to monitor somatic mutations, which are predictors of therapeutic effects, over time and to grasp the cancer state in real time.
  • most patients who receive chemotherapy have tumors deep in the body, such as the lungs and liver. Therefore, biopsy from these sites is very invasive for the patient, and it is difficult to perform biopsy over time.
  • the amount of cfDNA in serum and plasma is very small, such as about 10 3 copies, and the percentage of allele of the tumor marker gene in it is as small as about 0.1%. For this reason, even in cancer patients in which a somatic mutation of a tumor marker gene is detected in the primary tissue, the somatic mutation is not always detected from cfDNA.
  • Peripheral blood contains CTC (peripheral blood circulating tumor cells, peripheral blood circulating cancer cells) and the like, and it has already been reported that there is a correlation between the number of CTCs and patient prognosis.
  • the detection frequency of CTC varies greatly depending on the detection technology.
  • the average number of CTCs detected from stage IV colorectal cancer patients by J &J's cell search approved by the FDA is only 5 (see, for example, Non-Patent Document 4).
  • a liquid biopsy targeting a body fluid sample that can be collected relatively non-invasively, such as blood is a biopsy that enables real-time status grasp while reducing the burden on cancer patients.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting the presence or absence of a somatic mutation in a tumor marker gene in a tumor tissue with higher accuracy and a method for evaluating a tumor state.
  • the present inventors have made the somatic mutation of the tumor marker gene in the tumor tissue of the subject more by using the DNA of the peripheral blood mononuclear cell layer (PBMC layer) instead of the DNA in plasma or serum as a test sample.
  • PBMC layer peripheral blood mononuclear cell layer
  • the method for detecting a somatic mutation of a tumor marker gene includes a recovery step of recovering a peripheral blood mononuclear cell layer from a blood sample collected from a subject, and the peripheral blood mononuclear cell layer And a mutation detection step of examining whether or not a tumor marker gene-derived nucleic acid having a somatic mutation is detected from the DNA contained in.
  • the subject has undergone surgical excision or antitumor therapy of the tumor part at the time of collection of the blood sample, or surgical excision of the tumor part prior to the collection of the blood sample or You may have received anti-tumor therapy.
  • the peripheral blood mononuclear cell layer may be collected from the blood sample by Ficoll density gradient centrifugation.
  • the detection of the tumor marker gene-derived nucleic acid having the somatic mutation may be performed in the mutation detection step by a real-time PCR method, a digital PCR method, a next-generation sequencer method, or an electrochemical detection method.
  • the tumor marker gene may be a KRAS gene.
  • the method for evaluating a tumor state according to the second aspect of the present invention is a method for detecting a somatic mutation of a tumor marker gene according to the first aspect, from a DNA contained in the peripheral blood mononuclear cell layer of the subject.
  • a tumor marker gene-derived nucleic acid having a somatic mutation is detected, and on the basis of the detection result of the tumor marker gene-derived nucleic acid having a somatic mutation, for the subject, onset or relapse of a tumor Assess presence or absence or sensitivity to molecular target drugs.
  • the tumor of the subject is It may be assessed that it is insensitive to a molecular targeting drug that targets the encoded tumor marker or that it is likely to have acquired resistance.
  • the subject may have undergone surgical excision treatment or anti-tumor therapy of a tumor portion in the past with respect to a primary lesion in which a tumor marker gene has a somatic mutation.
  • a nucleic acid derived from a tumor marker gene having the somatic mutation is detected from DNA contained in a blood mononuclear cell layer, it is evaluated that the tumor of the subject is likely to have relapsed or newly metastasized. Also good.
  • the nucleic acid derived from the tumor marker gene having the somatic mutation may not be detected from DNA contained in plasma or serum collected from the blood sample, or from the blood sample Peripheral blood circulating cancer cells may not be detected.
  • the tumor marker gene may be a KRAS gene
  • the molecular target drug may be an EGFR inhibitor.
  • the tumor is metastatic medulloblastoma, gastrointestinal stromal tumor, elevated dermal fibrosarcoma, colorectal cancer, colon cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, chronic myeloproliferative Disease, acute myeloid leukemia, thyroid cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, head and neck cancer, brain tumor, hepatocellular carcinoma, hematologic malignancy, or these It may be a precancer that causes other cancers.
  • the method for detecting a somatic mutation of a tumor marker gene By the method for detecting a somatic mutation of a tumor marker gene according to the above aspect of the present invention, the presence or absence of a somatic mutation of a tumor marker gene in a tumor tissue of a cancer patient is detected with high sensitivity from a relatively minimally invasive blood sample. be able to. For this reason, the method for evaluating a tumor state according to the above-described aspect of the present invention using the detection method described above is used for biopsy of the tumor state of a cancer patient, particularly about the possibility of tumor relapse and the effectiveness of a molecular target drug. Therefore, the evaluation can be performed relatively non-invasively and accurately without requiring an invasive and heavy examination.
  • Example 1 it is a figure which shows the digital PCR result (KRAS_G12V), FAM: KRAS variant (G12V), and VIC: KRAS wild type of DNA in PBMC of patient A.
  • Example 1 it is a figure which shows the digital PCR result (KRAS_G12V), FAM: KRAS variant (G12V), and VIC: KRAS wild type of DNA in PBMC of patient B.
  • Example 1 it is a figure which shows the digital PCR result (KRAS_G12V) of DNA in PBMC of patient C, FAM: KRAS variant (G12V), and VIC: KRAS wild type.
  • Example 1 it is the figure which showed the time-dependent change of the density
  • a method for detecting a somatic mutation of a tumor marker gene according to an embodiment of the present invention is a method for detecting a somatic mutation of a tumor marker gene.
  • detection method As a test sample, DNA of a PBMC layer is used.
  • somatic mutation of the tumor marker gene in cfDNA can be detected with higher sensitivity than when DNA contained in serum or plasma is used.
  • the detection method includes a recovery step of recovering a PBMC layer from a blood sample collected from a subject, and a tumor having a somatic mutation from DNA contained in the recovered PBMC layer. And a mutation detection step for examining whether or not a marker gene-derived nucleic acid is detected.
  • the buffy coat layer is used for CTC detection and the like, but since it contains a lot of blood cell components like the PBMC layer, it is not used for searching for somatic mutation of the tumor marker gene in cfDNA.
  • the PBMC layer excludes leukocyte components and the like, it contains a large amount of mononuclear cell components such as lymphocytes. Not selected.
  • PBMC layer DNA causes more somatic mutations than using serum or plasma DNA.
  • the ability to detect with high sensitivity is a finding found for the first time by the present inventors.
  • a tumor marker gene is a gene whose expression level is significantly different in a tumor group between a patient group (cancer patient group) that has developed a tumor and a group that has not developed a tumor such as a healthy group.
  • the tumor marker gene used in the present embodiment may be a gene whose expression level is lower in the cancer patient group than in the healthy group, but the expression level in the cancer patient group is higher than that in the healthy group. Is preferred.
  • the tumor marker gene used in the present embodiment is different from a wild type and a mutant with a somatic mutation in the preferable treatment method in anti-tumor treatment. Tumor marker genes that are clinically required for type discrimination are preferred.
  • tumor marker genes examples include RAS gene, EGFR gene, BCR-ABL fusion gene, EML4-ALK fusion gene and the like. In the detection method according to this embodiment, it is particularly preferable to detect somatic mutations in the KRAS gene.
  • the method for recovering the PBMC layer from the blood sample collected from the subject is not particularly limited, and is appropriately selected from known methods used for separating the PBMC layer from the blood. be able to.
  • Examples of the method for separating the PBMC layer from blood include a method using Ficoll density gradient centrifugation, “BD Vacutainer CPT cell preparation tube” (manufactured by Becton Dickinson, Japan), and the like. These methods can be performed by a conventional method.
  • Ficoll for example, a reagent manufactured by GE Healthcare Japan can be used.
  • Ficoll density gradient centrifugation method Ficoll is added to a blood sample to perform centrifugation.
  • the PBMC layer is formed so as to be sandwiched between the Ficoll layer and the plasma / serum layer.
  • DNA contained in the recovered PBMC layer is extracted, and whether or not this DNA contains a tumor marker gene-derived nucleic acid having a somatic mutation (a nucleic acid derived from a tumor marker gene having a somatic mutation).
  • DNA can be extracted from the PBMC layer by a conventional method.
  • detection of the tumor marker gene-derived nucleic acid in DNA extracted from the PBMC layer and determination of the genotype of the detected tumor marker gene-derived nucleic acid can be performed by conventional methods.
  • the tumor marker gene-derived nucleic acid includes the full length of genomic DNA of the tumor marker gene or a portion thereof, or an amplification product obtained by artificially amplifying these by polymerase chain reaction (PCR) or the like.
  • the detection of the tumor marker gene-derived nucleic acid can be performed by, for example, a real-time PCR method, a digital PCR method, a next-generation sequencer method, or an electrochemical detection method.
  • the electrochemical detection method is the most versatile and simple method in DNA measurement.
  • a real-time PCR method or a digital PCR method is preferable for detecting a nucleic acid derived from a tumor marker gene in DNA extracted from a PBMC layer in view of highly sensitive quantitative detection of DNA.
  • a method for quantifying the amount of DNA using a next-generation sequencer can also be used for detecting a nucleic acid derived from a tumor marker gene.
  • the primer should be designed so that the PCR product length is about 100 to 200 bp or less than 100 bp. Is preferred.
  • the presence or status (genotype) of a tumor marker gene-derived nucleic acid in DNA extracted from a PBMC layer can be determined by detection using digital PCR.
  • it can be determined by detection using digital PCR.
  • BioRad's droplet digital PCR (ddPCR) technology Hindson, et.al., Analytical Chemistry, 2011, vol. 83 (22), pp. 8604-8610) and RainDance Technologies digital PCR device “RainDrop” By using “Digital PCR System”, it can be detected with high sensitivity.
  • the surfactant concentration in the PCR master mix it is preferable that ethylene glycol or glycerol used as a storage solution for DNA extender or the like has a final concentration of 0.15% or less, or Triton-X has a final concentration of 0.0003% or less.
  • the surfactant exceeds the final concentration, the number of emulsions is drastically reduced, making it difficult to detect PCR products with high sensitivity.
  • the gene site to be amplified can be arbitrarily selected from either the non-gene region or the gene region.
  • PCR using the nucleic acids and nucleic acid fragments extracted from PBMC layer as a template after increasing the absolute amount of allyl copy number of the tumor marker genes that may be included in the nucleic acid, about 10 6 copies of It is also preferable to perform a known mutation detection method after dilution. Furthermore, the method may be combined with the digital PCR described above.
  • Other methods include, for example, amplifying a DNA fragment of a region containing somatic mutations in a tumor marker gene by real-time PCR using a nucleic acid extracted from a PBMC layer as a template. There is a method of detecting with high sensitivity whether or not an aggregate has been formed by contacting a probe that can specifically hybridize with the genotype of the somatic mutation to be detected.
  • the probe is detectably labeled with, for example, a radioisotope ( 3 H, 32 P, 33 P, etc.), a fluorescent agent (rhodamine, fluorescene, etc.), or a color former.
  • the probe may also be an antisense oligomer such as PNA, morpholino-phosphoramidates, LNA.
  • the base length of the probe is about 8 to about 100 nucleotides, preferably about 10 to about 75 nucleotides, more preferably about 15 to about 50 nucleotides, and further preferably about 20 to about 30 nucleotides. is there.
  • the presence and status of tumor marker gene-derived nucleic acids in the PBMC layer can be analyzed using an invader method (Michael Olivier, Mutation Research 573: 103-110, 2005).
  • an allele probe and an invader oligo are hybridized so as to partially form a triple base with respect to double-stranded DNA or mRNA prepared by PCR or the like.
  • a part of the 5 ′ end of the allele probe is designed to have a sequence (flap portion) that is non-complementary to the double-stranded DNA or mRNA, but the invader oligo is completely against them. It has a complementary sequence.
  • the two allele probes are designed to be complementary to the wild type and the mutant type, respectively, and hybridize competitively with the double-stranded DNA or mRNA as described above, thereby completely hybridizing.
  • a part of the flap endonuclease that is a triple base is recognized, and the flap part of the allele probe hybridizes to a self-complementary FRET cassette existing in the reaction system.
  • the flap endonuclease cleaves the target mutation, and the fluorescence-modified DNA fragment in the FRET cassette is released, which is separated from the quencher in the FRET.
  • the flap part of the allele probe once cleaved can be re-hybridized to another FRET cassette, and the mutation can be detected with a very high sensitivity that the signal is amplified.
  • a ligase chain reaction known in the art can be used to amplify a fragment containing a region encoding a mutation site in a tumor marker gene (eg, Wu, et.al., Genomics, 1989, (See vol.4, pp.560-569).
  • a technique known as allele-specific PCR can also be used (see, for example, Ruano and Kidd, Nucleic Acids Research, 1989, vol. 17, pp. 8392). According to the technique, primers are used that hybridize at the 3 'end to somatic mutations of a particular tumor marker gene. In the absence of specific somatic mutations, no amplification products are observed.
  • Amplification Reference Mutation System (ARMS) (see, for example, Newton et.al., Nucleic Acids Research, 1989, vol. 17, pp. 7) can also be used.
  • a sequence analysis method based on the Sanger method is used to directly determine the base sequence of the tumor marker gene genomic DNA or mRNA in the PBMC layer, or amplification products thereof. The method of doing is mentioned.
  • the base sequence can also be determined via PCR.
  • restriction fragment length polymorphism (RFLP) probes for the gene or surrounding marker genes can be used to score allelic alterations or insertions in the polymorphic fragment.
  • SSCP Single-stranded DNA conformation polymorphism
  • the detection method according to the present embodiment can be performed more easily by making a kit of a reagent used for detecting the tumor marker gene-derived nucleic acid in the nucleic acid extracted from the PBMC layer.
  • the kit includes a document describing a protocol for detecting a nucleic acid derived from a tumor marker gene in a PBMC layer and determining its genotype, and a reagent for recovering the PBMC layer from a blood sample such as Ficoll. It may be.
  • the blood sample used in the detection method according to the present embodiment may be collected from any subject, but the subject suspected of developing a tumor, or at or before the time of collection of the blood sample, It is preferably a blood sample collected from a subject who has developed cancer or a subject who has received a definitive diagnosis of having developed cancer.
  • patients who have undergone surgical resection or antitumor therapy of the tumor part at the time of blood sample collection, or who have undergone surgical resection or antitumor therapy of the tumor part prior to the blood sample collection More preferably, it is a patient.
  • the tumor state evaluation method according to an embodiment of the present invention (hereinafter, also referred to as “evaluation method according to the present invention”) is performed by the detection method according to the above-described embodiment of the present invention. Whether or not a tumor marker gene-derived nucleic acid having a somatic mutation is detected from the DNA contained in the DNA (examination step), based on the detection result, for the subject, the presence or absence of tumor onset or relapse, or The sensitivity to the molecular target drug is evaluated (evaluation process). In the tumor state evaluation method according to the present embodiment, the tumor marker gene-derived nucleic acid having the somatic mutation is further detected from DNA contained in plasma or serum collected from the blood sample before or after the test step.
  • the nucleic acid derived from the tumor marker gene having the somatic mutation may not be detected from DNA contained in plasma or serum collected from the blood sample.
  • it may be further determined whether or not peripheral blood circulating cancer cells are detected from the blood sample before or after the inspection step (peripheral blood circulating cancer cell detection step). ). In this case, peripheral blood circulating cancer cells may not be detected from the blood sample. These steps may be performed in parallel with the inspection step.
  • the detection method according to the present embodiment detects, with high sensitivity, tumor tissue that is present in the body of a subject and whose tumor marker gene is a somatic mutation type from blood that can be collected in a minimally invasive manner. can do.
  • the possibility that a tumor tissue whose tumor marker gene is a somatic variant is present in the body of the subject is evaluated with high accuracy. be able to.
  • the nucleic acid in the PBMC layer can sometimes detect the nucleic acid derived from the tumor marker gene having the same mutation type as the tumor tissue.
  • a tumor in which the tumor marker gene is a somatic mutation is present in the subject. Assess that the organization is likely to exist. Conversely, when no nucleic acid derived from a tumor marker gene having a somatic mutation in the nucleic acid contained in the subject's PBMC layer is detected, the tumor marker gene is a somatic variant in the subject's body. It can be evaluated that there is a low possibility that a certain tumor tissue exists.
  • the subject has not received a definitive diagnosis of cancer in the past or has undergone surgical resection of the tumor from the primary lesion, derived from a tumor marker gene with somatic mutation
  • nucleic acid When nucleic acid is detected, it can be evaluated that there is a high possibility that a tumor has developed.
  • a tumor marker gene-derived nucleic acid having a somatic mutation if a tumor marker gene-derived nucleic acid having a somatic mutation is detected, the tumor is likely to relapse, ie, metastasis or recurrence has occurred. it can.
  • CT computer tomography
  • the tumor marker gene-derived nucleic acid having a somatic mutation is detected from the nucleic acid contained in the PBMC layer. It is small and suitable for monitoring, and it has excellent detection sensitivity, enabling more accurate evaluation. For this reason, the evaluation method according to the present embodiment, in particular, has undergone surgical excision treatment or antitumor therapy of the tumor part at the time of blood sample collection, or surgical excision of the tumor part prior to the blood sample collection. Preferably, it is performed on a blood sample taken from a cancer patient who has undergone treatment or anti-tumor therapy.
  • Specific tumor markers such as CEA and CA-19 are used for blood samples collected from these cancer patients to determine whether tumors have recurred or metastasized, and somatic mutations have been introduced into the tumor tissue. Higher reliability can be expected with relatively high accuracy than the case based only on.
  • blood collection for a tumor marker test is performed about once a month. Therefore, it is possible to perform the evaluation method according to the present embodiment over time using the remaining blood sample of the tumor marker test.
  • the blood sample used in this embodiment has undergone surgical excision treatment or anti-tumor therapy of the tumor part, or has undergone surgical excision treatment or anti-tumor therapy of the tumor part before blood collection
  • the type of tumor of the subject is not particularly limited. Further, it may be a primary tumor, a metastatic tumor, or a recurrent tumor. Furthermore, the tumor may exist in a plurality of locations in the body of the subject.
  • tumors include brain, liver, kidney, bladder, breast, stomach, ovary, colorectal, prostate, pancreas, breast, lung, vulva, thyroid, colorectal, esophagus, and liver cancer, sarcoma, glioblasts Tumors, head and neck cancers, leukemias and lymphoid malignancies.
  • neuroblastoma intestinal cancer (eg rectal cancer, colon cancer, familial colorectal polyposis cancer and hereditary non-polyposis colorectal cancer), esophageal cancer, lip cancer, laryngeal cancer, hypopharyngeal cancer, tongue cancer , Salivary gland cancer, stomach cancer, adenocarcinoma, medullary thyroid cancer, papillary thyroid cancer, kidney cancer, renal parenchymal cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, endometrial cancer, choriocarcinoma, pancreatic cancer, prostate cancer, Testicular cancer, breast cancer, ureteral cancer, melanoma, brain tumor (eg glioblastoma, astrocytoma, meningioma, medulloblastoma and peripheral neuroectodermal tumor), Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, bar Kit lymphoma, acute lymphoblastic leukemia
  • the excised tumor of the subject from whom the blood sample provided for this embodiment is collected includes metastatic medulloblastoma, gastrointestinal stromal tumor, elevated dermal fibrosarcoma, colorectal cancer, colon cancer, lung cancer
  • Non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, chronic myeloproliferative disease, acute myeloid leukemia, thyroid cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, head and neck Cancer, brain tumor, hepatocellular carcinoma, hematological malignancy, or precancer that causes these cancers are preferred, colorectal cancer, colorectal cancer, lung cancer, hepatocellular carcinoma, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, kidney cancer, head and neck cancer Or cervical cancer is more preferred.
  • the blood sample used in this embodiment has undergone surgical excision treatment or anti-tumor therapy of the tumor part, or has undergone surgical excision treatment or anti-tumor therapy of the tumor part before blood collection
  • the antitumor therapy that the subject is receiving is not particularly limited. Specific examples include chemotherapy and radiation therapy. Chemotherapy and radiation therapy may be combined.
  • the chemotherapeutic agent used for chemotherapy is not particularly limited, and may be a compound having cytotoxicity or cell division inhibitory property.
  • an antimetabolite such as fluorouracil, capecitabine, cytarabine, fludarabine, 5-fluoro-2′-deoxyuridine, tegafur gimeracil oteracil potassium (TS-1), gemcitabine, hydroxyurea, or
  • DNA fragmentation agents such as bleomycin;
  • DNA cross-linking agents such as chlorambucil, cisplatin, cyclophosphamide, or nitrogen mustard;
  • intercalating agents such as adriamycin (doxorubicin)
  • V protein synthesis inhibitors such as L-asparaginase, cycloheximide, puromycin, or diphtheria toxins;
  • topoisomerase I toxins such as camptothecin, or topo (Vii) topo
  • folinic acid leucovorin
  • oxaliplatin oxaliplatin
  • irinotecan daunarubicin
  • taxotere folinic acid
  • molecular targeted drugs such as cetuximab, panitumumab, bevacizumab, gefitinib, erlotinib, regorafenib, crizotinib, sunitinib, sorafenib, everolimus, trastuzumab, lapatinib, and rituximab.
  • chemotherapeutic agents only one type may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the chemotherapy is fluorouracil, leucovorin, oxaliplatin, capecitabine, tegafur gimeracil otera.
  • Chemotherapy with one or more chemotherapeutic agents selected from syl potassium, irinotecan, bevacizumab, cetuximab, and panitumumab is preferred.
  • the tumor marker gene to be detected for somatic mutation is preferably treated in antitumor treatment depending on whether the tumor tissue is a wild type or a mutant that has undergone somatic mutation. Due to differences in methods, it is preferable to use a gene that is clinically required to differentiate the genotype of the tumor tissue, more preferably a RAS gene, an EGFR gene, a BCR-ABL fusion gene, or an EML4-ALK fusion gene. Preferably, the KRAS gene is particularly preferable.
  • the sensitivity to the molecular target drug targeting the tumor marker encoded by the tumor marker gene to be used is further evaluated based on the detection result of the somatic mutation of these tumor marker genes. It is preferable.
  • a KRAS gene mutation is used as a predictor of the therapeutic effect of an EGFR inhibitor, a cancer patient having a KRAS gene having a wild type tumor tissue, and a cancer patient having a KRAS gene having a somatic mutation type tumor tissue
  • the administration of different types of molecular targeted drugs is recommended.
  • a tumor tissue in which the KRAS gene is a wild type is sensitive to an EGFR inhibitor such as cetuximab (also known as antibody 225), but a tumor tissue in which the KRAS gene is a somatic mutant is not. Sensitive.
  • cetuximab is administered to cancer patients whose KRAS gene is a wild type, and other molecular targeted drugs such as panitumumab for cancer patients whose KRAS gene is a somatic mutation. Is selected. Therefore, the evaluation method according to the present embodiment is performed using the KRAS gene as a tumor marker gene, the genotype of the KRAS gene in the tumor tissue in the subject's body is detected more accurately, and the tumor in the subject's body based on this detection result.
  • the sensitivity of a tissue to a molecular target drug targeting KRAS and the response when the molecular target drug is administered can be evaluated with high accuracy, and a treatment method suitable for the subject can be selected based on the evaluation result. . That is, the evaluation obtained by the evaluation method according to the present embodiment is clinically very useful for predicting the therapeutic effect of a chemotherapeutic agent.
  • the mutation coincidence rate of the KRAS gene is only about 90% in the primary lesion and the metastatic lesion (liver), and in 10% of patients, the metastatic lesion is different from cetuximab used in the primary lesion It is insensitive and will not respond. For this reason, it is important to quickly detect the genotype of the tumor marker gene in the metastatic lesion and evaluate the subject's presence or absence of relapse of the tumor and the sensitivity of the molecular target drug based on the detection result.
  • the sensitivity to molecular target drugs may change due to the somatic mutation of the tumor marker gene in the tumor tissue.
  • a tumor tissue that initially expresses a wild-type KRAS gene may undergo somatic mutation and acquire resistance to an EGFR inhibitor such as cetuximab. Therefore, after the acquisition of resistance, the evaluation method according to this embodiment is performed over time for cancer patients so that changes to other molecular targeted drugs can be performed quickly, and the genotype of the tumor tissue is detected, It is also important to monitor the possibility of acquiring resistance to a molecular targeting agent that targets a tumor marker encoded by a tumor marker gene.
  • the tumor in the subject's body is encoded by the tumor marker gene. It is evaluated that it is highly insensitive to a molecular targeting agent that targets a tumor marker to be acquired or has acquired resistance. Conversely, when no nucleic acid derived from a tumor marker gene having somatic mutation in the nucleic acid contained in the subject's PBMC layer is detected, the tumor in the subject's body is the tumor encoded by the tumor marker gene Assess that it is highly likely that the marker is sensitive to a molecular targeting agent or does not acquire resistance.
  • the subject's PBMC layer When the tumor marker gene-derived nucleic acid having the somatic mutation is detected from the DNA contained in, the tumor is evaluated to have a high possibility of recurrence or new metastasis. Conversely, when no nucleic acid derived from a tumor marker gene having the somatic mutation is detected from the DNA contained in the subject's PBMC layer, the subject is unlikely to have a recurrence or a new metastasis. And evaluate.
  • Example 1 It was investigated whether or not somatic variant KRAS gene-derived nucleic acid was detected from the nucleic acid in the PBMC layer of three patients with recurrent colorectal cancer (patients A to C).
  • Patient A was diagnosed with ascending colon cancer and metastatic liver tumor on May 23, 2014, and started mFOLFOX6 chemotherapy (fluorouracil folinic acid and oxaliplatin) on June 12, 2014. From 19th to 23rd October 2015, FOLFOX chemotherapy (fluorouracil, folinic acid, oxaliplatin) and bevacizumab were combined.
  • FOLFOX chemotherapy fluorouracil, folinic acid, oxaliplatin
  • bevacizumab were combined.
  • CT in patient A, on July 28, 2015, which was the day before the blood collection date, an increase in tumor tissue in the liver metastases was confirmed (not shown).
  • Patient B undergoes surgery to surgically remove rectal cancer (Stage III) on 4 November 2009, receives mFOLFOX6 chemotherapy (20 courses) from 30 November to 24 September 2009, 2010 On October 27, 2013, chemotherapy (internal use) was started in which TS-1 was used in combination with TS-1. Multiple lung metastases were identified on April 27, 2012, and mFOLFOX6 chemotherapy and bevacizumab (biweekly administration) were administered from May 27, 2012 to March 30, 2014. May 14, 2014 Received FOLFIRI chemotherapy from December 29, 2015, and received combination therapy of irinotecan and TS-1 from January 6 to May 29, 2016. As a result of CT, in Patient B, SD (disease stabilization) was held on May 27, 2015, before the blood collection date, but on August 10, 2016, progression of the disease was observed. .
  • SD disease stabilization
  • PBMC layer was separated from a portion of peripheral blood by Ficoll density gradient centrifugation according to the following procedure.
  • the method of subjecting whole blood samples to Ficoll density gradient centrifugation is the most commonly used method for monocytic cell separation.
  • a whole blood sample was collected into a blood collection tube, and then whole blood was diluted 1: 1 with a PBS buffer in a class II safety cabinet.
  • the 50 mL plastic tube containing Ficoll was then fixed at a fixed angle and the diluted whole blood sample was carefully layered on top of Ficoll.
  • the tube was centrifuged at 20 ° C. and 833 ⁇ g (2,125 rpm) for 20 minutes (using Thermo-Scientific-Sorvall-X1R). At this time, the acceleration of the centrifuge was set to a maximum of “9” and the deceleration was performed at “0” (no brake). By centrifugation, PBMC was collected between the Ficoll layer and the plasma layer.
  • the tube was removed from the centrifuge, and the PBMC layer between the Ficoll layer and the plasma layer was carefully removed and dispensed into a new 15 mL plastic tube.
  • PBS buffer was added to the 15 mL tube to wash the cells in the PBMC layer
  • the 15 mL tube was set in a centrifuge and 425 ⁇ g (1,518 rpm) for 10 minutes (acceleration and deceleration were each (9 steps) Centrifugation was performed. Thereafter, the supernatant was discarded, and the cells were washed again with PBS buffer. Then, the supernatant was discarded, and the cells were suspended in an appropriate amount of PBS buffer.
  • the prepared suspension was designated as prepared PBMCs.
  • DNA was extracted and purified from the obtained prepared PBMCs.
  • DNA extraction / purification was performed using a QIAamp (registered trademark) DNA Mini (Qiagen) kit according to the instructions attached to the kit.
  • QIAamp registered trademark
  • DNA Mini Qiagen
  • the DNA concentration contained in the prepared PBMCs was measured using a commercially available kit (product name: Qubit 2.0, manufactured by Life Technologies) to calculate the DNA concentration.
  • Isolation and purification of cfDNA from plasma sample Isolation and purification of cfDNA from plasma sample was performed using QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen) according to the instructions attached to the kit.
  • the amount of the prepared plasma supplied to the kit was 1 mL, and the final elution from the spin column was performed using 50 ⁇ L of TE buffer.
  • Quantification of cfDNA The quantification of cfDNA was performed using Qubit (registered trademark) Fluorometer (manufactured by Life Technologies). All samples to be measured were used by diluting the isolated DNA 200 times with a predetermined reaction solution.
  • Figures 1-3 show the results of digital PCR on DNA in PBMCs of patients A-C.
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity of FAM
  • the horizontal axis represents the fluorescence intensity of VIC.
  • dots in a circled area are dots indicating detection of somatic mutation in the KRAS gene.
  • CA19-9 and CEA in plasma were measured by the CLEIA method (chemiluminescence enzyme immunoassay).
  • the standard value for CA19-9 was 37 U / mL or less, and the standard value for CEA was 5.0 ng / mL or less.
  • CTC concentration recovery apparatus product name: “ClearCell FX system”, manufactured by ClearBridge
  • 7.5 mL of peripheral blood from patients A to C was used, and the number of CTCs was counted.
  • DNA was also isolated from these formalin-fixed paraffin-embedded sections (FFPE sections) as tissue specimens collected from metastases and primary lesions of patients A to C. DNA isolation and purification from FFPE sections were performed using QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) according to the instructions attached to the kit. Three FFPE sections sliced to 10 ⁇ m were used per sample, and the DNA extracted therefrom was eluted in 100 ⁇ L of TE buffer.
  • QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Qiagen
  • Table 1 shows the number of copies per unit volume of the KRAS gene and the rate of somatic mutation (%) in DNA extracted and purified from the prepared PBMCs of patients A to C by digital PCR. Somatic cell variant KRAS gene-derived nucleic acids were detected in the DNA of the PBMC layers of patients A to C. The copy number of KRAS gene contained in the PBMC layer and the rate of somatic mutation varied from patient to patient. Since the detection limit of the QUANTSTUDIO (registered trademark) 3D digital PCR system is 0.1%, all three cases are within the detection range of the analyzer, so the KRAS gene mutation can be detected from the PBMC layer of cancer patients. I found out.
  • QUANTSTUDIO registered trademark
  • KRAS gene genotype contained in DNA extracted from tissue sections of primary and metastatic lesions of each patient, and somatic cell variant KRAS gene-derived nucleic acid from plasma DNA (cfDNA) and PBMC layer DNA Table 2 shows the detection results.
  • WT means that somatic variant KRAS gene-derived nucleic acid was not detected
  • ⁇ means that no tissue sections of metastases were obtained and the genotype was not examined. means.
  • mutant-type KRAS gene was detected in all DNA in the PBMC layer.
  • both of the two types of metastases were also detected from the DNA of the PBMC layer, and from the nucleic acid of the PBMC layer, It was confirmed that the same somatic mutation type KRAS gene as that of the metastatic lesion could be detected.
  • the DNA of the PBMC layer reflects the genotype of the tumor tissue rather than the DNA in plasma.
  • the genotype of the metastasis of patient A has not been confirmed, since the somatic mutation detected in the DNA of the PBMC layer was the same genotype (G12V) as the primary foci, the genotype of the metastasis was also Like the primary lesion and the PBMC layer, it is highly likely that it is a G12V mutant. Further, as shown in FIG. 4 to FIG. 6, even when the blood concentration of CEA and CA19-9 in the patient is not stable, the tumor state evaluation method of the present invention obtains a stable result regarding the tumor state. It is also possible to identify variants of tumor marker genes in tumor tissue.

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Abstract

腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法は、被検者から採取された血液試料から末梢血単核細胞層を回収する回収工程と、前記末梢血単核細胞層に含まれるＤＮＡから、体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べる変異検出工程と、を有する。

Description

腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法及び腫瘍状態の評価方法
　本発明は、腫瘍組織における腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の有無を、比較的非侵襲的に検出する方法、及び腫瘍状態の評価方法に関する。
　本願は、２０１７年１月１６日に、日本に出願された特願２０１７－００５１０２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　抗がん剤の治療効果の予測因子として、シグナル伝達に関与する癌遺伝子上の体細胞変異が注目を集めている。例えば、大腸がん治療における分子標的薬である抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）抗体薬であるセツキシマブやパニツムマブの治療効果の予測因子として、ＲＡＳ遺伝子変異が挙げられる。また、肺がん治療におけるゲフィチニブ、エルロチニブ等の低分子化合物の分子標的薬の治療効果の予測因子として、ＥＧＦＲの点突然変異や欠損等が挙げられる。また、白血病におけるイマチニブ奏功性の予測因子として、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子や、ＥＧＦＲ陰性肺がん患者におけるＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子等も、実際の臨床現場にて検査が行われている。
　分子治療薬の治療効果の予測のためには、一般的に、腫瘍組織の体細胞変異が指標となることから、生検により採取された腫瘍組織サンプル中の癌遺伝子の遺伝子型を検査する。また、体細胞変異がいつ生じてもおかしくはないため、治療効果の予測因子となる体細胞変異は、経時的にモニタリングし、リアルタイムに癌の状態を把握することが望ましい。しかしながら、化学療法を受ける患者の大半は肺や肝臓などの体の深部に腫瘍が存在する。そのため、これらの部位からの生検は患者にとって非常に大きな侵襲であり、経時的に生検を行うことは困難である。
　一方で近年、がん患者では健常者に比べて、血中のｃｆ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ）ＤＮＡ量が多く、血中のｃｆＤＮＡ量が腫瘍マーカーとして期待できることが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。また、大腸がんに対する抗ＥＧＦＲ抗体薬の薬剤耐性獲得の有無が、腫瘍組織中のＫＲＡＳ遺伝子の体細胞変異と同様に、血中のｃｆＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子の体細胞変異とも相関することも報告されている。すなわち、血中のｃｆＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子の体細胞変異を検出することによって腫瘍の状態を把握できることも報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献２及び３参照。）。通常の生検では繰り返し生検が難しい場合においても、血液を組織の代理検体とすることにより、体細胞変異のモニタリングが可能になりつつある。
　しかし、血清や血漿中のｃｆＤＮＡ量は、１０３コピー程度と非常に少ない上に、その中の腫瘍マーカー遺伝子のアリルの割合も０．１％程度と少ない。このため、原発巣組織で腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異が検出されるがん患者でも、当該体細胞変異がｃｆＤＮＡから検出されるとは限らない。また、末梢血中にはＣＴＣ（末梢血循環腫瘍細胞、末梢血循環がん細胞）などが含まれており、ＣＴＣの個数と患者予後に相関があることは既に報告されているが、がん種や検出技術によってＣＴＣの検出頻度は大きく異なる。例えば、ＦＤＡで認可されているＪ＆Ｊ社のセルサーチでステージIVの大腸がん患者から検出されるＣＴＣの数の平均はたったの５個である（例えば、非特許文献４参照。）。このように、血液等の比較的非侵襲的に採取可能な体液試料を対象とするリキッドバイオプシーは、がん患者の負担を低減させつつリアルタイムの状態の把握を可能にする生検であるが、リキッドバイオプシーによって腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出を行うためには、検出精度をより充分に高める必要がある。
国際公開第２０１４／１４８５５７号
Schwarzenbach，et al.，Nature Review，2011，vol.11，p.426－437. Misale，et al.，Nature，2012，vol.486(7404)，p.532－536. Diaz，et al.，Nature，2012，vol.486(7404)，p.537－540. Cohen, et al.，JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY，2008，vol.26(19)，p.3213－3221.
　本発明は、腫瘍組織における腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の有無を、血液試料からより高精度に検出する方法、及び腫瘍状態の評価方法を提供することを目的とする。
　本発明者等は、血漿や血清中のＤＮＡではなく、末梢血単核細胞層（ＰＢＭＣ層）のＤＮＡを供試試料とすることにより、被験者の腫瘍組織における腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異をより高精度に検出できることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明の第一態様に係る腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法は、被検者から採取された血液試料から末梢血単核細胞層を回収する回収工程と、前記末梢血単核細胞層に含まれるＤＮＡから、体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べる変異検出工程と、を有する。
　上記第一態様において、前記被験者が、前記血液試料の採取時点において腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けているか、又は前記血液試料の採取時以前に腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けたことがあってもよい。
　上記第一態様において、前記回収工程において、前記血液試料からの末梢血単核細胞層の回収を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法により行ってもよい。
　上記第一態様において、前記変異検出工程において、前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出を、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シーケンサー法、又は電気化学的検出方法により行ってもよい。
　上記第一態様において、前記腫瘍マーカー遺伝子がＫＲＡＳ遺伝子であってもよい。
　本発明の第二態様に係る腫瘍状態の評価方法は、上記第一態様に係る腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法により、前記被検者の前記末梢血単核細胞層に含まれるＤＮＡから、前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べ、前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出結果に基づいて、前記被験者について、腫瘍の発症若しくは再燃の有無、又は分子標的薬に対する感受性を評価する。
　上記第二態様において、前記被験者の前記末梢血単核細胞層に含まれるＤＮＡから前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出された場合に、前記被験者の腫瘍は、前記腫瘍マーカー遺伝子がコードする腫瘍マーカーを標的とする分子標的薬に対して非感受性であるか、又は耐性を獲得した可能性が高いと評価してもよい。
　上記第二態様において、前記被験者が、過去に、腫瘍マーカー遺伝子が体細胞変異を有する原発巣に対して、腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けたことがあり、前記被験者の末梢血単核細胞層に含まれるＤＮＡから前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出された場合に、前記被験者の腫瘍が再発又は新たな転移が生じている可能性が高いと評価してもよい。
　上記第二態様において、前記血液試料から回収された血漿又は血清に含まれるＤＮＡからは、前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されていなくてもよいか、又は、前記血液試料から末梢血循環がん細胞が検出されていなくてもよい。
　上記第二態様において、前記腫瘍マーカー遺伝子がＫＲＡＳ遺伝子であり、前記分子標的薬がＥＧＦＲ阻害剤であってもよい。
　上記第二態様において、前記腫瘍が、転移性髄芽腫、消化管間質腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫、結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、慢性骨髄増殖性疾患、急性骨髄性白血病、甲状腺癌、すい臓癌、膀胱癌、腎臓癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頚部癌、脳腫瘍、肝細胞癌、血液悪性腫瘍、又はこれらの癌を引き起こす前癌であってもよい。
　本発明の上記態様に係る腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法により、がん患者の腫瘍組織における腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の有無を、比較的低侵襲な血液試料から高感度に検出することができる。このため、当該検出方法を利用した本発明の上記態様に係る腫瘍状態の評価方法により、がん患者の腫瘍状態、特に、腫瘍の再燃の可能性や、分子標的薬の奏功性について、生検等の侵襲的で負担の大きい検査を要することなく、比較的非侵襲的に精度よく評価することができる。
実施例１において、患者ＡのＰＢＭＣ中ＤＮＡのデジタルＰＣＲ結果(ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ)、ＦＡＭ：ＫＲＡＳ変異型（Ｇ１２Ｖ）、ＶＩＣ：ＫＲＡＳ野生型を示す図である。 実施例１において、患者ＢのＰＢＭＣ中ＤＮＡのデジタルＰＣＲ結果(ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ)、ＦＡＭ：ＫＲＡＳ変異型（Ｇ１２Ｖ）、ＶＩＣ：ＫＲＡＳ野生型を示す図である。 実施例１において、患者ＣのＰＢＭＣ中ＤＮＡのデジタルＰＣＲ結果(ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ)、ＦＡＭ：ＫＲＡＳ変異型（Ｇ１２Ｖ）、ＶＩＣ：ＫＲＡＳ野生型を示す図である。 実施例１において、患者Ａの血漿中のＣＥＡ及びＣＡ１９－９の濃度の経時的変化を示した図である。 実施例１において、患者Ｂの血漿中のＣＥＡ及びＣＡ１９－９の濃度の経時的変化を示した図である。 実施例１において、患者Ｃの血漿中のＣＥＡ及びＣＡ１９－９の濃度の経時的変化を示した図である。
＜腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法＞
　本発明の一実施形態に係る腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法（以下、「本発明に係る検出方法」ということがある。）は、腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異を検出するための供試試料として、ＰＢＭＣ層のＤＮＡを用いることを特徴とする。ＰＢＭＣ層のＤＮＡを用いることによって、血清や血漿に含まれるＤＮＡを用いる場合よりも、ｃｆＤＮＡ中の腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異をより高感度に検出することができる。本実施形態に係る検出方法は、具体的には、被検者から採取された血液試料からＰＢＭＣ層を回収する回収工程と、回収されたＰＢＭＣ層に含まれるＤＮＡから、体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べる変異検出工程と、を有する。
　一般的に、ｃｆＤＮＡ中の腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異を検出する際には、白血球由来の正常なＤＮＡ、つまり野生型遺伝子由来核酸の混入による変異型遺伝子由来核酸の検出感度の低下を防ぐため、血球成分を除いた血清又は血漿中のＤＮＡから遺伝子変異を検出する。また、バフィーコート層は、ＣＴＣの検出等に供されているが、ＰＢＭＣ層と同様に血球成分を多く含むため、ｃｆＤＮＡ中の腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の探索には用いられていない。同様に、ＰＢＭＣ層には、白血球成分などは除かれているものの、リンパ球などの単核球成分が多分に含まれているため、一般的な液体生検における遺伝子解析試料には、通常は選択されない。血球由来のＤＮＡを多く含むＰＢＭＣ層は体細胞変異の検出には適さないという従来の知見とは異なり、ＰＢＭＣ層のＤＮＡを用いるほうが、血清や血漿のＤＮＡを用いるよりも、体細胞変異をより高感度に検出できることは、本発明者らにおいて初めて見出された知見である。
　腫瘍マーカー遺伝子とは、腫瘍を発症している患者群（がん患者群）と、健常者群のような腫瘍を発症していない群とにおいて、腫瘍組織において発現量が顕著に異なる遺伝子である。本実施形態において用いられる腫瘍マーカー遺伝子は、がん患者群のほうが健常者群よりも発現量が少なくなる遺伝子であってもよいが、がん患者群のほうが健常者群よりも発現量が多くなる遺伝子が好ましい。なかでも、本実施形態において用いられる腫瘍マーカー遺伝子は、野生型と体細胞変異を起こした変異型とで、抗腫瘍治療において好ましい治療方法に相違があるために、がん患者の腫瘍組織の遺伝子型の鑑別が臨床上要求される腫瘍マーカー遺伝子が好ましい。このような腫瘍マーカー遺伝子としては、ＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子等が挙げられる。
　本実施形態に係る検出方法においては、特にＫＲＡＳ遺伝子の体細胞変異の検出をすることが好ましい。
　被検者から採取された血液試料からＰＢＭＣ層を回収する方法は、特に限定されるものではなく、血液からＰＢＭＣ層を分離するために使用されている公知の方法の中から適宜選択して用いることができる。血液からＰＢＭＣ層を分離する方法としては、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法、「ＢＤ　Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ　ＣＰＴ細胞調製チューブ」（日本ベクトンディッキンソン社製）を用いる方法等が挙げられる。これらの方法は常法により行うことができる。なお、Ｆｉｃｏｌｌは、例えば、ＧＥヘルスケアジャパン社製の試薬を利用することができる。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法では、血液試料にＦｉｃｏｌｌを添加して遠心分離処理を行う。これにより、Ｆｉｃｏｌｌ層と血漿・血清層の間に挟まれるようにしてＰＢＭＣ層が形成される。
　次いで、回収されたＰＢＭＣ層に含まれるＤＮＡを抽出し、このＤＮＡ中に体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸（体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子に由来する核酸）が含まれているかどうかを検出する。ＰＢＭＣ層からのＤＮＡの抽出は、常法により行うことができる。また、ＰＢＭＣ層から抽出されたＤＮＡ中の腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出や、検出された腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定は、常法により行うことができる。なお、腫瘍マーカー遺伝子由来核酸とは、腫瘍マーカー遺伝子のゲノムＤＮＡの全長若しくはその部分、又はこれらをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等によって人工的に増幅させた増幅産物等が挙げられる。
　腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出は、例えば、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シーケンサー法、又は電気化学的検出方法等により行うことができる。電気化学的検出方法は、ＤＮＡ測定において最も汎用性が高く簡便な方法である。
　本実施形態においてＰＢＭＣ層から抽出されたＤＮＡ中の腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出には、ＤＮＡの定量的検出を高感度に行える点から、リアルタイムＰＣＲ法やデジタルＰＣＲ法が好ましい。また、デジタルＰＣＲと同様の理論により、次世代シーケンサーを用いたＤＮＡ量の定量方法も、腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出に利用することができる。但し、ＰＢＭＣ層中のＤＮＡは、血清又は血漿中のＤＮＡと同様に断片化がおきているおそれがあるため、ＰＣＲ産物長が１００～２００ｂｐ程度、若しくは１００ｂｐ以下になるようにプライマーを設計することが好ましい。
　例えば、ＰＢＭＣ層から抽出されたＤＮＡ中の腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の存在やそのステイタス（遺伝子型）は、デジタルＰＣＲを用いて検出することによって決定できる。特にデジタルＰＣＲを用いて検出することによって決定できる。特にバイオラッド社のドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）の技術（Hindson，et.al.，Analytical　Chemistry，2011，vol.83（22），pp. 8604－8610）やRainDance Technologies社のデジタルＰＣＲ装置「RainDrop Digital PCR System」を利用することにより、高感度に検出することができる。ドロップレットの数が多ければ多いほど、解析精度が高くなる。０．０１％の突然変異を検出する性能を担保するためには、一つの突然変異を検出するために１０，０００ドロップレットが必要である。充分な検出感度を担保するために、ＰＣＲのマスターミックス中の界面活性剤濃度を規定することが好ましい。例えば、ＤＮＡ伸長酵素などの保存液として用いられるエチレングリコール又はグリセロールは、終濃度で０．１５％以下に、又はＴｒｉｔｏｎ－Ｘは、終濃度０．０００３％以下であることが好ましい。当該界面活性剤が前記終濃度以上になると、エマルジョン数が激減し、高感度にＰＣＲ産物を検出することが困難になる。この場合、増幅する遺伝子箇所は、非遺伝子領域と遺伝子領域とのどちらでも任意の選択が可能である。
　また、ＰＢＭＣ層から抽出された核酸及び核酸断片を鋳型として用いるＰＣＲにより、当該核酸中に含まれるであろう腫瘍マーカー遺伝子のアリルコピー数の絶対量を増加させた後、１０６コピー数程度に希釈してから、公知の突然変異検出方法を行うことも好ましい。さらに、当該方法を、前記のデジタルＰＣＲと組み合わせてもよい。
　その他の方法としては、例えば、ＰＢＭＣ層から抽出された核酸を鋳型として用いるリアルタイムＰＣＲ等により、腫瘍マーカー遺伝子中の体細胞変異を含む領域のＤＮＡ断片を増幅し、得られた増幅産物に対して検出する目的の体細胞変異の遺伝子型に特異的にハイブリダイズ可能なプローブを接触させて会合体が形成されたか否かを高感度に検出する方法が挙げられる。
　前記プローブは、例えば放射性同位元素（３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ等）、蛍光剤（ローダミン、フルオレセン等）、又は発色剤で検出可能に標識される。また、当該プローブは、アンチセンスオリゴマー、例えばＰＮＡ、モルホリノ－ホスホロアミデート類、ＬＮＡであってもよい。なお、当該プローブの塩基長さは、約８ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０ヌクレオチドから約７５ヌクレオチド、より好ましくは約１５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド、さらに好ましくは約２０ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドである。
　ＰＢＭＣ層中の腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の存在やそのステイタスは、インベーダー法（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｏｌｉｖｉｅｒ，　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５７３：１０３－１１０，　２００５）を使用して分析することができる。インベーダー法とは、ＰＣＲなどによって調製された二本鎖ＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡに対して、部分的に三重塩基を形成するように、アレルプローブとインベーダーオリゴとがハイブリダイゼーションを行う。ここで、アレルプローブの５’末端の一部は、前記二本鎖ＤＮＡやｍＲＮＡと非相補的な配列（フラップ部）を有するように設計されているが、インベーダーオリゴは完全にそれらに対して相補的な配列を有している。２種のアレルプローブは、それぞれ野生型、変異型に対して相補的になるように設計されており、上記二本鎖ＤＮＡやｍＲＮＡに対し競合的にハイブリダイゼ－ションを行い、完全相補でハイブリダイゼーションした際に、フラップエンドヌクレアーゼが一部三重塩基になっている部分を認識し、アレルプローブのフラップ部が、同反応系に存在する自己相補型ＦＲＥＴカセットにハイブリダイゼーションする。この時に、前記の一部三重塩基になる部分が形成され、目的の突然変異をフラップエンドヌクレアーゼが切断し、ＦＲＥＴカセット内の蛍光修飾されたＤＮＡ断片が遊離して、ＦＲＥＴ内の消光物質と乖離するために蛍光を発する。理論上、一度切断されたアレルプローブのフラップ部は、別のＦＲＥＴカセットに再度ハイブリダイゼーションすることができ、シグナルが増幅される非常に高感度に突然変異を検出できる手法である。
　当該分野で知られているリガーゼ連鎖反応を、腫瘍マーカー遺伝子中の変異部位をコードする領域を含む断片を増幅させるために使用することができる（例えば、Wu，et.al.，Genomics，1989，vol.4，pp.560－569を参照。）。また、アレル特異的ＰＣＲとして知られている技術を使用することもできる（例えば、Ruano　and　Kidd，Nucleic　Acids　Research，1989，vol.17，pp.8392を参照。）。当該技術によれば、特定の腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異にその３’末端でハイブリダイズするプライマーが使用される。特定の体細胞変異が存在していない場合は、増幅産物は観察されない。また、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲＭＳ）（例えば、Newton　et.al.，Nucleic　Acids　Research，1989，vol.17，pp.7参照。）も使用することができる。
　ＰＢＭＣ層中の腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出や、検出された腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定には、遺伝子変異を検出する場合や、遺伝子の挿入及び欠失を検出する場合に使用されるその他の方法も利用することができる。当該方法としては、具体的には、例えば、サンガー法を基礎とするシークエンス解析法を利用し、ＰＢＭＣ層中の腫瘍マーカー遺伝子のゲノムＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はこれらの増幅産物等の塩基配列を直接決定する方法が挙げられる。また、塩基配列の決定は、ＰＣＲを介して行うこともできる。その他、遺伝子又は周りのマーカー遺伝子に対する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを、多型断片におけるアレルの改変又は挿入をスコア付けするために使用することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析もまた、アレルの塩基変化変異体を検出するために使用することができる（Orita　 et.al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences，USA，1989，vol.86，pp.2766－2770、及びGenomics，1989，vol.5，pp.874－879）。
　なお、ＰＢＭＣ層から抽出された核酸中の腫瘍マーカー遺伝子由来核酸を検出するために使用される試薬をキット化することにより、本実施形態に係る検出方法をより簡便に行うことができる。当該キットには、ＰＢＭＣ層中の腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出やその遺伝子型の決定方法についてのプロトコルが記載された書面や、Ｆｉｃｏｌｌ等の血液試料からＰＢＭＣ層を回収するため試薬などが含まれていてもよい。
　本実施形態に係る検出方法に供される血液試料は、いずれの被験者から採取されたものであってもよいが、腫瘍の発症が疑われる被験者や、血液試料の採取時点又はそれ以前に、がんを発症している被験者、又はがんを発症していたと確定診断を受けた被験者から採取された血液試料であることが好ましい。なかでも、血液試料の採取時点において腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けている患者、又は血液試料の採取時以前に腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けたことがある患者であることがより好ましい。
＜腫瘍状態の評価方法＞
　本発明の一実施形態に係る腫瘍状態の評価方法（以下、「本発明に係る評価方法」ということがある。）は、本発明の上記実施形態に係る検出方法により、被検者のＰＢＭＣ層に含まれるＤＮＡから、体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べ（検査工程）、その検出結果に基づいて、前記被験者について、腫瘍の発症若しくは再燃の有無、又は分子標的薬に対する感受性を評価する（評価工程）。
　本実施形態に係る腫瘍状態の評価方法では、さらに、検査工程の前又は後に、血液試料から回収された血漿又は血清に含まれるＤＮＡから前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べてもよい（血漿血清検出工程）。この場合、前記血液試料から回収された血漿又は血清に含まれるＤＮＡからは、前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されなくてもよい。
　本実施形態に係る腫瘍状態の評価方法では、さらに、検査工程の前又は後に、前記血液試料から末梢血循環がん細胞が検出されるか否かを調べてもよい（末梢血循環がん細胞検出工程）。この場合、前記血液試料から末梢血循環がん細胞が検出されなくてもよい。また、これらの工程は、検査工程と並行して行ってもよい。　
　多くの腫瘍患者において、ｃｆＤＮＡに占める、腫瘍組織に由来する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の量は少ない。そのため、検出感度の点から、腫瘍組織の腫瘍マーカー遺伝子の遺伝子型が体細胞変異型であったとしても、血清や血漿中のＤＮＡから体細胞変異型の腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出できない場合が多い。これに対して、本実施形態に係る検出方法は、被験者の体内に存在している、腫瘍マーカー遺伝子が体細胞変異型である腫瘍組織を、低侵襲的に採取可能な血液から高感度に検出することができる。つまり、本発明の上記実施形態に係る検出方法の検出結果に基づいて、被験者の体内に、腫瘍マーカー遺伝子が体細胞変異型である腫瘍組織が存在している可能性を、高精度に評価することができる。後記実施例で示すように、腫瘍マーカー遺伝子が体細胞変異型である腫瘍組織を有するがん患者において、血漿中の核酸からは野生型の腫瘍マーカー遺伝子由来核酸しか検出できない場合や、血中からＣＴＣが検出されない場合であっても、ＰＢＭＣ層の核酸からは、当該腫瘍組織と同じ変異型の腫瘍マーカー遺伝子由来核酸を検出できる場合がある。
　例えば、被検者のＰＢＭＣ層に含まれる核酸に体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出された場合には、当該被験者の体内には、当該腫瘍マーカー遺伝子が体細胞変異型である腫瘍組織が存在している可能性が高い、と評価する。逆に、被検者のＰＢＭＣ層に含まれる核酸に体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されなかった場合には、当該被験者の体内には、当該腫瘍マーカー遺伝子が体細胞変異型である腫瘍組織が存在している可能性は低い、と評価できる。
　被検者が、過去にがんの確定診断を受けたことがない場合や、原発巣に対して腫瘍部分の外科的切除処置を受けていた場合には、体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出された場合に、腫瘍が発症した可能性が高いと評価できる。また、抗腫瘍療法により寛解していた被験者では、体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出された場合には、腫瘍が再燃、つまり、転移又は再発が生じている可能性が高いと評価できる。
　腫瘍切除後のがん患者においては、再発や転移が生じた場合には速やかに検出し適切な治療を施すことが重要である。このため、再発や転移の有無について、定期的に検査が行われる。この際、被検者への侵襲性やコスト等の点から、臨床実務上、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）を高頻度に使うことはあまりされておらず、ＣＥＡやＣＡ－１９などのごく一般的な腫瘍マーカーをモニタリングする方法が用いられている。しかし、これらの腫瘍マーカーは、腫瘍が存在していても異常値を示さない場合がある。また健常者や腫瘍以外の疾患への罹患によっても、しばしば基準値を超えてしまうことがあり、確度が低いという問題がある。
　これに対して、本実施形態に係る評価方法では、ＰＢＭＣ層に含まれる核酸から体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出を行うため、ＣＴに比較してがん患者に対する負担やコストが小さく、モニタリングに適している上に、検出感度に優れており、より確度の高い評価ができる。このため、本実施形態に係る評価方法は、特に、血液試料の採取時点において腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けている、又は血液試料の採取時以前に腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けたことがあるがん患者から採取された血液試料に対して行うことが好ましい。これらのがん患者から採取された血液試料に対して行うことにより、腫瘍の再発や転移の有無や、腫瘍組織における体細胞変異の導入の有無について、ＣＥＡやＣＡ－１９等の特定の腫瘍マーカーにのみ基づく場合よりも、比較的高い確度で信頼性の高い評価が期待できる。通常、がん治療においては、腫瘍マーカー検査のための採血が、月に１回程度の頻度で行われている。そこで、腫瘍マーカー検査の血液サンプルの残余分を使用して経時的に本実施形態に係る評価方法を行うことも可能である。
　本実施形態に供される血液試料が、腫瘍部分の外科的切除処置若しくは抗腫瘍療法を受けている被検者、又は採血時以前に腫瘍部分の外科的切除処置若しくは抗腫瘍療法を受けたことがある被検者から採取されたものである場合、被検者の腫瘍の種類は特に限定されない。また、原発性腫瘍であってもよく、転移性腫瘍であってもよく、再発性腫瘍であってもよい。さらに、腫瘍が、被検者の体内の複数個所に存在していてもよい。当該腫瘍には、脳、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、乳房、肺、外陰部、甲状腺、結腸直腸、食道、及び肝臓の癌、肉腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、白血病並びにリンパ性悪性疾患が含まれる。より詳細には、神経芽細胞腫、腸癌（例えば、直腸癌、大腸癌、家族性大腸ポリポーシス癌及び遺伝性非ポリポーシス大腸癌）、食道癌、口唇癌、喉頭癌、下咽頭癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺動脈乳頭癌、腎臓癌、腎実質癌、卵巣癌、頸癌、子宮体癌、子宮内膜癌、絨毛癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌、乳癌、尿管癌、メラノーマ、脳腫瘍（例えば、膠芽細胞腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫及び末梢神経外胚葉性腫瘍）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病骨（ＡＭＬ）、慢性髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ細胞白血病、肝細胞癌、胆嚢癌、気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜メラノーマ、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｅｏｍａ）、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫及び形質細胞腫が含まれ得る。本実施形態に供される血液試料が採取される被検者の切除された腫瘍としては、転移性髄芽腫、消化管間質腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫、結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、慢性骨髄増殖性疾患、急性骨髄性白血病、甲状腺癌、すい臓癌、膀胱癌、腎臓癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頚部癌、脳腫瘍、肝細胞癌、血液悪性腫瘍、又はこれらの癌を引き起こす前癌が好ましく、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、頭頸部癌、又は子宮頸癌がより好ましい。
　本実施形態に供される血液試料が、腫瘍部分の外科的切除処置若しくは抗腫瘍療法を受けている被検者、又は採血時以前に腫瘍部分の外科的切除処置若しくは抗腫瘍療法を受けたことがある被検者から採取されたものである場合、当該被験者が受けている抗腫瘍療法としては、特に限定されるものではない。具体的には、化学療法、放射線治療等が挙げられる。化学療法と放射線治療とを組み合わせてもよい。
　化学療法に使用される化学治療剤としては、特に限定されず、細胞毒性又は細胞分裂阻害性を有する化合物であり得る。具体的には、（ｉ）代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム（ＴＳ－１）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、又はメトトレキセート；（ｉｉ）ＤＮＡ断片化剤、例えば、ブレオマイシン；（ｉｉｉ）ＤＮＡ架橋剤、例えば、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、又はナイトロジェンマスタード；（ｉｖ）インターカレート剤、例えばアドリアマイシン（ドキソルビシン）、又はミトキサントロン；（ｖ）タンパク合成阻害剤、例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、又はジフテリア毒素；（ｖｉ）トポイソメラーゼＩ毒、例えばカンプトセシン、又はトポテカン；（ｖｉｉ）トポイソメラーゼＩＩ毒、例えばエトポシド（ＶＰ－１６）、又はテニポシド；（ｖｉｉｉ）微小管関連剤、例えばコルセミド、コルヒチン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔｅｘｅｌ）、ビンブラスチン、又はビンクリスチン；（ｉｘ）キナーゼ阻害剤、例えば、フラボピリドール、スタウロスポリン、ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ５７１４８Ｂ）、又はＵＣＮ－０１（７－ヒドロキシスタウロスポリン）；（ｘ）様々な治験薬、例えばチオプラチン（ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ）、ＰＳ－３４１、フェニルブチレート、ＥＴ－１８－ＯＣＨ３、又はファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ－７３９７４９、Ｌ－７４４８３２）；ポリフェノール類、例えばケルセチン、レスベラトロール、ピセタノール、エピガロカテキン没食子酸塩、テアフラビン類、フラバノール類、プロシアニジン類、ベツリン酸及びその誘導体；（ｘｉ）ホルモン、例えばグルココルチコイド又はフェンレチニド；（ｘｉｉ）抗ホルモン、例えばタモキシフェン、フィナステライド、又はＬＨＲＨアンタゴニストが含まれる。また、フォリン酸（ロイコボリン）、オキサリプラチン、イリノテカン、ダウナルビシン、タキソテール、及びマイトマイシンＣも含まれる。さらに、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシヅマブ、ゲフィニチブ、エルロチニブ、レゴラフェニブ、クリゾチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、トラスツズマブ、ラパチニブ、及びリツキシマブ等の分子標的薬も含まれる。これらの化学療法剤のうち１種のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。本実施形態に係る評価方法において、血液試料を採取される被験者が採血時点又はそれ以前に化学療法を受けている場合、当該化学療法は、フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン、カペシタビン、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、イリノテカン、ベバシズマブ、セツキシマブ、及びパニツムマブから選択される１種以上の化学療法剤による化学療法であることが好ましい。
　本実施形態に係る評価方法においては、体細胞変異を検出する対象の腫瘍マーカー遺伝子を、腫瘍組織が野生型と体細胞変異を起こした変異型とのいずれであるかによって抗腫瘍治療において好ましい治療方法に相違があるために腫瘍組織の遺伝子型の鑑別が臨床上要求される遺伝子とすることが好ましく、ＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子、又はＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子とすることがより好ましく、ＫＲＡＳ遺伝子がとすることが特に好ましい。本実施形態に係る評価方法においては、さらに、これらの腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出結果に基づいて、使用する腫瘍マーカー遺伝子がコードする腫瘍マーカーを標的とした分子標的薬に対する感受性を評価することが好ましい。
　例えばＥＧＦＲ阻害剤の治療効果の予測因子としてＫＲＡＳ遺伝子変異が用いられており、ＫＲＡＳ遺伝子が野生型の腫瘍組織を有するがん患者と、ＫＲＡＳ遺伝子が体細胞変異型の腫瘍組織を有するがん患者とでは、異なる種類の分子標的薬の投与が推奨されている。例えば、セツキシマブ（抗体２２５としてもまた公知である）等のＥＧＦＲ阻害剤に対して、ＫＲＡＳ遺伝子が野生型である腫瘍組織は感受性であるが、ＫＲＡＳ遺伝子が体細胞変異型である腫瘍組織は非感受性である。このため、一般的に、セツキシマブはＫＲＡＳ遺伝子が野生型であるがん患者に対して投与され、ＫＲＡＳ遺伝子が体細胞変異型であるがん患者に対しては、パニツムマブ等の他の分子標的薬が選択される。そこで、ＫＲＡＳ遺伝子を腫瘍マーカー遺伝子として本実施形態に係る評価方法を行い、被験者の体内の腫瘍組織のＫＲＡＳ遺伝子の遺伝子型をより確度よく検出し、この検出結果に基づいて当該被験者の体内の腫瘍組織の、ＫＲＡＳを標的とする分子標的薬に対する感受性及び当該分子標的薬を投与した場合の奏効性を高精度に評価することができ、この評価結果によって、当該被験者に適した治療方法を選択できる。つまり、本実施形態に係る評価方法により得られる評価は、化学療法剤の治療効果の予測に臨床上非常に有用である。
　がんの不均一性から、原発巣に腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異が存在しても、転移巣に同一の変異があるとは限らない。実際に、大腸がんでは、原発巣と転移巣（肝臓）とにおけるＫＲＡＳ遺伝子の変異一致率は約９０％しかなく、１０％の患者では、原発巣で使用していたセツキシマブに対し転移巣は非感受性であり、奏功しないことになる。このため、転移巣の腫瘍マーカー遺伝子の遺伝子型を迅速に検出し、当該検出結果に基づいて、被験者の腫瘍の再燃の有無や分子標的薬の感受性を評価することが重要である。
　また、腫瘍組織に腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異が生じることによって、分子標的薬に対する感受性が変化することがある。例えば、当初は野生型のＫＲＡＳ遺伝子が発現している腫瘍組織であっても、体細胞変異が生じ、セツキシマブ等のＥＧＦＲ阻害剤に対して耐性を獲得してしまう場合がある。そこで、耐性獲得後には速やかに他の分子標的薬への変更を行えるように、がん患者に対して本実施形態に係る評価方法を経時的に行い、腫瘍組織の遺伝子型を検出して、腫瘍マーカー遺伝子がコードする腫瘍マーカーを標的とする分子標的剤に対する耐性獲得の可能性をモニタリングすることも重要である。
　例えば、検査工程において、被検者のＰＢＭＣ層に含まれる核酸に体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出された場合には、当該被験者の体内にある腫瘍は、当該腫瘍マーカー遺伝子がコードする腫瘍マーカーを標的とする分子標的剤に対して非感受性である又は耐性を獲得した可能性が高いと評価する。逆に、被検者のＰＢＭＣ層に含まれる核酸に体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されなかった場合には、当該被験者の体内にある腫瘍は、当該腫瘍マーカー遺伝子がコードする腫瘍マーカーを標的とする分子標的剤に対して感受性である又は耐性を獲得していない可能性が高いと評価する。
　例えば、過去に、腫瘍マーカー遺伝子が体細胞変異を有する原発巣に対して、腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けたことがある被験者の場合、検査工程において、当該被験者のＰＢＭＣ層に含まれるＤＮＡから当該体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出された場合に、腫瘍が再発又は新たな転移が生じている可能性が高いと評価する。逆に、当該被験者のＰＢＭＣ層に含まれるＤＮＡから当該体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されなかった場合に、当該被験者では腫瘍が再発又は新たな転移が生じている可能性が低いと評価する。
　以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下の試験は、日本医科大学付属病院内の倫理審査委員会で承認されており、全ての患者からは本研究を包含するインフォームドコンセントを得て行った。
［実施例１］
　３名の再発性大腸癌患者（患者Ａ～Ｃ）のＰＢＭＣ層の核酸から、体細胞変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べた。
（臨床サンプル）
　既に原発巣は切除されており、かつ新たに転移巣（肝臓）がある再発性大腸癌患者３名（患者Ａ～Ｃ）の末梢血６～９ｍＬを、転移巣の外科的切除手術の術前又は術後に採血した。患者Ａの採血日は２０１５年７月２９日、患者Ｂ、Ｃの採血日は２０１５年７月２２日で、ＰＢＭＣ分離以降の遺伝子変異検出まで同日に行った。
　患者Ａは、２０１４年５月２３日に上行結腸癌、転移性肝腫瘍と診断され、２０１４年６月１２日にｍＦＯＬＦＯＸ６化学療法（フルオロウラシル・フォリン酸・オキサリプラチン）を開始し、２０１４年７月１９日～２０１５年１０月２３日に、ＦＯＬＦＯＸ化学療法（フルオロウラシル・フォリン酸・オキサリプラチン）とベバシズマブとの併用療法を行った。ＣＴの結果、患者Ａでは、採血日の前日である２０１５年７月２８日には、肝転移巣における腫瘍組織の増大が確認された（図示せず。）。
　患者Ｂは、２００９年１１月４日に直腸癌（ステージIII）を外科的に切除する手術を受け、２００９年１１月３０日～９月２４日にｍＦＯＬＦＯＸ６化学療法（２０コース）を受け、２０１０年１０月２７日からＴＳ－１にＰＳＫを併用する化学療法（内服）を開始した。２０１２年４月２７日に多発肺転移が同定され、２０１２年６年２７日～２０１４年３月３０日にｍＦＯＬＦＯＸ６化学療法とベバシズマブ（隔週投与）との併用療法を行い、２０１４年５月１４日～２０１５年１２月２９日にＦＯＬＦＩＲＩ化学療法を受け、２０１６年１月６日～５月２９日にイリノテカンとＴＳ－１の併用療法を受けた。ＣＴの結果、患者Ｂでは、採血日以前の２０１５年５月２７日には、ＳＤ（病状安定化）を保持していたが、２０１６年８月１０日には、病状の進行が認められた。
　患者Ｃは、２０１１年１月１８日に直腸癌に対して手術した。また、同時性肝転移に対して、ＦＯＬＦＯＸ化学療法とパニツムマブ（隔週投与）との併用療法を行った。その後、２０１２年５月２日に、肝転移に対して肝の部分切除手術を受け、２０１２年１２月５日～２０１５年４月１６日にはＦＯＬＦＯＸ化学療法とセツキシマブ（隔週投与）との併用療法を行った。その後、セツキシマブに対する耐性を獲得してしまったため、２０１５年５月１３日からは、ＦＯＬＦＩＲＩ化学療法とベバシズマブの併用療法を行った。ＣＴの結果、患者Ｃでは、２０１５年７月１日には、いずれもＳＤ（病状安定化）を保持していた。
（末梢血からのＰＢＭＣの分離）
　再発性大腸癌患者（患者Ａ～Ｃ）について、末梢血の一部からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法によりＰＢＭＣ層の分離を、以下の手順にて行った。全血試料をＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心にかける方法は、単球細胞の分離に最もよく使用される方法である。
　具体的には、まず、採血管に全血試料を分取した後、クラスII安全キャビネット内で、ＰＢＳバッファーで全血を１：１に希釈した。次いで、Ｆｉｃｏｌｌを入れた５０ｍＬ容プラスチックチューブを一定角度に固定し、希釈した全血試料をＦｉｃｏｌｌの上に慎重に積層した。このチューブを２０℃、８３３×ｇ（２，１２５ｒｐｍ）で ２０分間遠心処理（Thermo Scientific Sorvall X1R を使用）した。この時、遠心分離機の加速は最大「９」にセットし、減速は「０」 (ブレーキ無し)で行った。遠心処理により、ＰＢＭＣはＦｉｃｏｌｌ層と血漿層の間に集められた。この積層状態を保持したまま、当該チューブを遠心分離機から取り外し、Ｆｉｃｏｌｌ層と血漿層の間にあるＰＢＭＣ層を注意深く取り出し、新しい１５ｍＬ容のプラスチックチューブへ分取した。この１５ｍＬ容チューブにＰＢＳバッファーを添加してＰＢＭＣ層中の細胞を洗浄した後、当該１５ｍＬ容チューブを遠心分離機にセットして４２５×ｇ（１，５１８ｒｐｍ）で１０分間（加速・減速はそれぞれ９段階）遠心処理した。その後、上清を捨て、再度細胞をＰＢＳバッファーで洗浄した後、上清を捨て、細胞を適当な量のＰＢＳバッファーへ懸濁した。調製した懸濁液を調製ＰＢＭＣｓとした。
（調製ＰＢＭＣｓからのＤＮＡの精製）
　得られた調製ＰＢＭＣｓからＤＮＡを抽出・精製した。ＤＮＡの抽出・精製は、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）　ＤＮＡ Ｍｉｎｉ（キアゲン社製）キットを用い、当該キットに付属のインストラクションに従って行った。
　また、調製ＰＢＭＣｓに含まれるＤＮＡ濃度を、市販のキット（製品名：Ｑｕｂｉｔ２．０、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて蛍光測定し、ＤＮＡ濃度を算出した。
（末梢血からの血漿の分離）
　大腸癌患者３名（Ａ～Ｃ）から採取した末梢血の一部を遠心分離処理（１，５００ｒｐｍ、１０分間）した。得られた粗血漿成分をさらに遠心分離処理（１，５００ｒｐｍ、１０分間）した後、細胞断片を除去した上清部を回収し、これを血漿試料とした。
（血漿試料からのｃｆＤＮＡの単離精製）
　血漿からのｃｆＤＮＡの単離精製は、ＱＩＡａｍｐ　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、当該キットに付属されているインストラクションに従って行った。当該キットに供した調製血漿の量は１ｍＬとし、スピンカラムからの最終溶出は、ＴＥ緩衝液５０μＬを用いて行った。
（ｃｆＤＮＡの定量）
　ｃｆＤＮＡの定量は、Ｑｕｂｉｔ（登録商標) Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行った。測定するサンプルは全て、単離したＤＮＡを所定の反応液で２００倍に希釈して用いた。
（デジタルＰＣＲによるＫＲＡＳ遺伝子変異の検出定量）
　ＱＵＡＮＴＳＴＵＤＩＯ（登録商標）　３ＤデジタルＰＣＲシステムにより、各患者の調製ＰＢＭＣｓ及び血漿試料から抽出精製したＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子の体細胞変異を検出した。検出には、ＦＡＭ（登録商標）で標識したプローブをＫＲＡＳ変異型（Ｇ１２Ｖ）のアリルに特異的にハイブリダイズ可能なプローブとして用い、ＶＩＣ（登録商標）で標識したプローブをＫＲＡＳ野生型のアリルに特異的にハイブリダイズ可能なプローブとして用いた。また、図示はしないが、ＫＲＡＳ変異型（Ｇ１２Ｄ）の検出も同様に行った。 
　図１～３に、患者Ａ～ＣのＰＢＭＣｓ中のＤＮＡに対するデジタルＰＣＲ結果を示す。図中、縦軸がＦＡＭの蛍光強度を、横軸がＶＩＣの蛍光強度を示す。
　図中、丸で囲われた領域のドットが、ＫＲＡＳ遺伝子の体細胞変異の検出を示すドットである。
（血漿中のＣＥＡ及びＣＡ１９－９の測定）
　血漿中のＣＡ１９－９、ＣＥＡを、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）により測定した。ＣＡ１９－９の基準値は、３７Ｕ／ｍＬ以下、ＣＥＡの基準値は５．０ｎｇ／ｍＬ以下とした。
　図４～６に、患者Ａ～Ｃの血漿中のＣＥＡ濃度及びＣＡ１９－９濃度の測定結果を示す。図中、右軸がＣＥＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、左軸がＣＡ１９－９濃度（Ｕ／ｍＬ）を示す。
（ＣＴＣの個数の計測）
　ＣＴＣ濃縮回収装置（製品名：「ＣｌｅａｒＣｅｌｌ ＦＸ システム」、ＣｌｅａｒＢｒｉｄｇｅ社製）を用い、患者Ａ～Ｃの末梢血７．５ｍＬを供し、ＣＴＣの個数を計測した。
　ＣＴＣは、患者Ａ～Ｃの３名全員の末梢血からは、１個も検出できなかった。
（ＦＦＰＥ切片からのＤＮＡの単離精製）
　患者Ａ～Ｃの転移巣及び原発巣から採取した組織標本として、これらのホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ切片）からもＤＮＡ単離を行った。ＦＦＰＥ切片からのＤＮＡ単離精製は、ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　ＦＦＰＥ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（キアゲン社)を用いて、当該キットに付属されているインストラクションに従って行った。１サンプルにつき、１０μｍにスライスされたＦＦＰＥ切片を３枚用い、これから抽出したＤＮＡをＴＥ緩衝液１００μＬに溶出した。
（ダイレクトシークエンシング）
　原発巣や転移巣の手術標本として上記ＦＦＰＥ切片から抽出したＤＮＡに含まれるＫＲＡＳ遺伝子由来核酸、並びに原発巣の外科的切除手術の術前又は術後に採取された血漿中のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸の塩基配列解析は、ダイレクトシークエンシングにて行った。より詳細には、ＫＲＡＳ遺伝子の塩基配列に特異的なプライマーを用い、ビッグダイターミネーター法によるサイクルシークエンシングを常法により行った。
　表１に、デジタルＰＣＲによる、患者Ａ～Ｃの調製ＰＢＭＣｓから抽出・精製されたＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子の単位体積量当たりのコピー数及び体細胞変異の割合（％）を示す。患者Ａ～ＣのＰＢＭＣ層のＤＮＡには、体細胞変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出された。ＰＢＭＣ層に含まれているＫＲＡＳ遺伝子のコピー数や体細胞変異の割合は患者によって様々であった。ＱＵＡＮＴＳＴＵＤＩＯ（登録商標）　３Ｄ デジタルＰＣＲシステムの検出可能限界は０．１％であるため、３症例ともに解析装置の検出範囲内であることから、がん患者のＰＢＭＣ層からＫＲＡＳ遺伝子変異が検出可能であることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、各患者の原発巣と転移巣の組織切片から抽出したＤＮＡ中に含まれるＫＲＡＳ遺伝子の遺伝子型と、血漿のＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及びＰＢＭＣ層のＤＮＡからの体細胞変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出結果を表２に示す。表２中、「ＷＴ」は、体細胞変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されなかったことを意味し、「－」は転移巣の組織切片を取得せず、遺伝子型を調べなかったことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　この結果、３症例全てにおいて、血漿中のＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）では野生型のＫＲＡＳ遺伝子しか検出されなかったのに対して、ＰＢＭＣ層のＤＮＡではいずれも変異型のＫＲＡＳ遺伝子が検出された。特に、転移巣の遺伝子型が確認できた患者Ｂにおいて、転移巣の２種類の変異型（Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ）の両方が、ＰＢＭＣ層のＤＮＡからも検出されており、ＰＢＭＣ層の核酸からは、転移巣と同じ体細胞変異型のＫＲＡＳ遺伝子が検出できることが確認された。また、患者Ｃでは、転移巣が確認された時点ではセツキシマブを投与していたが、ＰＢＭＣ層のＤＮＡから遺伝子型を測定した時点では、薬剤耐性が獲得されてしまったためにベバシズマブの投与に切り換えられていることから、ＰＢＭＣ層の遺伝子型と同様に、転移巣もＧ１２Ｖの体細胞変異型である可能性が極めて高い。このため、患者Ｃの結果からも、ＰＢＭＣ層のＤＮＡは、血漿中のＤＮＡよりも、腫瘍組織の遺伝子型が反映されており、ＰＢＭＣ層のＤＮＡを供試試料とすることによって、腫瘍組織の腫瘍マーカー遺伝子の遺伝子型をより高感度に検出できることが明らかである。患者Ａの転移巣の遺伝子型は確認できていないが、ＰＢＭＣ層のＤＮＡ中から検出された体細胞変異は、原発巣と同じ遺伝子型（Ｇ１２Ｖ）であったことから、転移巣の遺伝子型も、原発巣やＰＢＭＣ層と同様にＧ１２Ｖの変異型である可能性が高い。また、図４～図６に示されるように、患者のＣＥＡ及びＣＡ１９－９の血中濃度が安定しない場合でも、本発明の腫瘍状態の評価方法によれば、腫瘍状態について安定した結果を得ることが可能であり、また腫瘍組織の腫瘍マーカー遺伝子の変異型をも特定することができる。

Claims (11)

  1. 　被検者から採取された血液試料から末梢血単核細胞層を回収する回収工程と、
    　前記末梢血単核細胞層に含まれるＤＮＡから、体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べる変異検出工程と、
    を有する、腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法。
  2. 　前記被験者が、前記血液試料の採取時点において腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けているか、又は前記血液試料の採取時以前に腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けたことがある、請求項１に記載の腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法。
  3. 　前記回収工程において、前記血液試料からの末梢血単核細胞層の回収を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法により行う、請求項１又は２に記載の腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法。
  4. 　前記変異検出工程において、前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出を、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シーケンサー法、又は電気化学的検出方法により行う、請求項１～３のいずれか一項に記載の腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法。
  5. 　前記腫瘍マーカー遺伝子がＫＲＡＳ遺伝子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の腫瘍マーカー遺伝子の体細胞変異の検出方法により、前記被検者の前記末梢血単核細胞層に含まれるＤＮＡから、前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べ、
    　前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸の検出結果に基づいて、前記被験者について、腫瘍の発症若しくは再燃の有無、又は分子標的薬に対する感受性を評価する、腫瘍状態の評価方法。
  7. 　前記被験者の前記末梢血単核細胞層に含まれるＤＮＡから前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出された場合に、
    　前記被験者の腫瘍は、前記腫瘍マーカー遺伝子がコードする腫瘍マーカーを標的とする分子標的薬に対して非感受性であるか、又は耐性を獲得した可能性が高いと評価する、請求項６に記載の腫瘍状態の評価方法。
  8. 　前記被験者が、過去に、腫瘍マーカー遺伝子が体細胞変異を有する原発巣に対して、腫瘍部分の外科的切除処置又は抗腫瘍療法を受けたことがあり、
    　前記被験者の末梢血単核細胞層に含まれるＤＮＡから前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出された場合に、
    　前記被験者の腫瘍が再発又は新たな転移が生じている可能性が高いと評価する、請求項６又は７に記載の腫瘍状態の評価方法。
  9. 　前記血液試料から回収された血漿又は血清に含まれるＤＮＡからは、前記体細胞変異を有する腫瘍マーカー遺伝子由来核酸が検出されていないか、又は、
    　前記血液試料から末梢血循環がん細胞が検出されていない、請求項６～８のいずれか一項に記載の腫瘍状態の評価方法。
  10. 　前記腫瘍マーカー遺伝子がＫＲＡＳ遺伝子であり、前記分子標的薬がＥＧＦＲ阻害剤である、請求項６～９のいずれか一項に記載の腫瘍状態の評価方法。
  11. 　前記腫瘍が、転移性髄芽腫、消化管間質腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫、結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、慢性骨髄増殖性疾患、急性骨髄性白血病、甲状腺癌、すい臓癌、膀胱癌、腎臓癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頚部癌、脳腫瘍、肝細胞癌、血液悪性腫瘍、又はこれらの癌を引き起こす前癌である、請求項６～１０のいずれか一項に記載の腫瘍状態の評価方法。
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