WO2018135633A1

WO2018135633A1 - 細胞培養装置及び細胞培養方法

Info

Publication number: WO2018135633A1
Application number: PCT/JP2018/001631
Authority: WO
Inventors: 英俊高山; 俊後藤
Original assignee: 富士フイルム株式会社
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2018-07-26
Also published as: KR102318710B1; JP6968104B2; US20190322977A1; CN110168067A; EP3556842A4; US11180726B2; EP3556842A1; EP4039792A1; KR20190094233A; JPWO2018135633A1

Abstract

細胞培養装置は、細胞を供給する細胞供給部と、培地を供給する培地供給部と、未分化細胞を分化誘導するための添加剤を供給する添加剤供給部と、処理対象物を撹拌する撹拌部と、処理対象物に含まれる成分を分離する分離部と、細胞を培養する培養容器と、を有するとともに、細胞供給部、撹拌部、分離部及び培養容器を経由する循環ルートを形成する第１の流路と、培地供給部と第１の流路とを接続する第２の流路と、添加剤供給部と第１の流路とを接続する第３の流路と、第１の流路、第２の流路及び第３の流路を介した送液を制御する制御部と、を含む。

Description

細胞培養装置及び細胞培養方法

　開示の技術は、細胞培養装置及び細胞培養方法に関する。

　細胞培養に関する処理を実施する細胞培養装置に関する技術として、例えば以下の技術が知られている。

　例えば、特開２０１５－１００３０９号公報には、細胞を自動で培養する自動培養装置と、培養された細胞の状態に関する情報を管理する細胞管理部と、を有する自動培養システムと、自動培養装置で培養された細胞の状態を記憶する記憶部と、発注者の元に設置された外部コンピュータと、を備える細胞管理システムが記載されている。

　国際公開第２０１３／１８７３５９号には、円筒形状の培養槽と、培養槽の底部の内面の中央から直立する支柱と、支柱の上部分に回転可能に取り付けられる取付部にその上部が固着され支柱を回転中心として回転する撹拌翼と、を備える細胞培養装置が記載されている。

　特表２０１６－５２９８９７号公報には、並進可能なベッド及び可動マルチチャネルピペットを含むロボット液体処理システムを用いて幹細胞を培養するためのオートメーション化された方法が記載されている。

　胚性幹細胞（Embryonic Stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem cell；ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞を、再生医療用途または創薬支援用途に適用する場合、多能性幹細胞から所望の細胞を作製する分化誘導を行う必要がある。分化誘導の手法として多能性幹細胞に化学的刺激または物理的刺激を与える手法が挙げられる。また、生体内において分化細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉と呼ばれる三つの胚葉のいずれかから発生する。これに倣い、多能性幹細胞から分化細胞を得る場合、第一段階として、胚葉への分化誘導を行う。

　上記のような分化誘導に必要とされる一連の処理を、閉鎖系において連続的に実施することにより大量の分化細胞を生産することを可能とした細胞培養装置についてこれまで提案された例はなく、分化細胞の培養スケールを大きくすることは困難とされていた。また、人手が介在する培養手法においては、生物学的な汚染のリスクが高まるとともに、培養によって得られる細胞の均質性が低下するおそれがある。

　開示の技術は、上記した点に鑑みてなされたものであり、多能性幹細胞の分化誘導に必要とされる一連の処理を、閉鎖系において連続的に実施可能とすることを目的とする。

　開示の技術に係る細胞培養装置は、細胞を供給する細胞供給部と、培地を供給する培地供給部と、未分化細胞を分化誘導するための添加剤を供給する添加剤供給部と、処理対象物を撹拌する撹拌部と、処理対象物に含まれる成分を分離する分離部と、細胞を培養する培養容器と、を有するとともに、上記細胞供給部、上記撹拌部、上記分離部及び上記培養容器を経由する循環ルートを形成する第１の流路と、上記培地供給部と上記第１の流路とを接続する第２の流路と、上記添加剤供給部と上記第１の流路とを接続する第３の流路と、上記第１の流路、上記第２の流路及び上記第３の流路を介した送液を制御する制御部と、を含む。

　上記分離部は、上記未分化細胞と死細胞とを膜分離する第１のフィルタ膜、上記未分化細胞が分化細胞に分化される前の中間体と上記未分化細胞とを膜分離する第２のフィルタ膜、及び上記中間体と上記分化細胞とを膜分離する第３のフィルタ膜のうちの少なくとも１つを有していてもよい。

　上記分離部は、上記第１のフィルタ膜、上記第２のフィルタ膜、及び上記第３のフィルタ膜のうちの少なくとも２つを含む複数のフィルタ膜を有していてもよく、この場合、上記制御部は、上記複数のフィルタ膜のいずれかに上記細胞を含む細胞懸濁液を選択的に通過させる制御を行ってもよい。

　上記第１のフィルタ膜、上記第２のフィルタ膜及び上記第３のフィルタ膜の各々の膜面に設けられた開口のサイズは、互いに異なっていてもよい。

　上記制御部は、上記添加剤と上記培地との混合物にせん断応力を加えるための送液を行った後に、上記細胞を含む細胞懸濁液と上記混合物とを合流させて上記撹拌部に移送する制御を行うことが好ましい。

　細胞培養装置は、上記第１の流路の途中の、上記細胞供給部と上記撹拌部との間に設けられた貯留容器を更に含んでいてもよい。この場合、上記制御部は、上記貯留容器と上記撹拌部との間で上記混合物を循環させることにより上記混合物にせん断応力を加えた後に、上記細胞懸濁液と上記混合物とを上記貯留容器内において合流させて上記撹拌部に移送する制御を行ってもよい。また、上記制御部は、配管中に上記混合物を流すことにより上記混合物にせん断応力を加えた後に、上記細胞懸濁液と上記混合物とを上記貯留容器内において合流させて上記撹拌部に移送する制御を行ってもよい。

　上記制御部は、上記混合物の粘度が所定の粘度になるまで上記混合物にせん断応力を加えるための送液を連続的に行ってもよい。

　上記添加剤供給部は、Ｗｎｔシグナル活性化剤を含む第１の添加剤を供給する第１の添加剤供給部と、Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む第２の添加剤を供給する第２の添加剤供給部と、を含んでいてもよい。

　細胞培養装置は、上記培養容器を収容し、上記培養容器の周囲温度を一定に保つインキュベータと、上記インキュベータの内部と外部との温度差によって上記第１の流路に沿って生じる温度勾配を緩和する温度勾配緩和機構と、を更に含んでいてもよい。

　開示の技術に係る細胞培養方法は、上記の細胞培養装置を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、上記制御部が、上記培地供給部から供給される上記細胞、上記添加剤供給部から供給される上記添加剤及び上記培地供給部から供給される上記培地を含む混合物を、上記撹拌部及び上記分離部を経由して上記培養容器に移送する制御を行う、というものである。

　開示の技術によれば、多能性幹細胞の分化誘導に必要とされる一連の処理を、閉鎖系において連続的に実施することが可能となる。

開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示すブロック図である。開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置において実施される、多能性幹細胞の分化誘導のための処理の流れの一例を示すフローチャートである。開示の技術の実施形態に係る第１の添加剤を添加する処理を行う場合における細胞培養装置の動作を示す図である。開示の技術の実施形態に係る培地交換処理を行う場合における細胞培養装置の動作を示す図である。開示の技術の実施形態に係る第１の添加剤を再添加する場合における細胞培養装置の動作を示す図である。開示の技術の実施形態に係る培地交換処理を行う場合における細胞培養装置の動作を示す図である。開示の技術の実施形態に係る第２の添加剤を添加する場合における細胞培養装置の動作を示す図である。開示の技術の実施形態に係る培地交換処理を行う場合における細胞培養装置の動作を示す図である。開示の技術の実施形態に係る第２の添加剤を再添加する場合における細胞培養装置の動作を示す図である。開示の技術の実施形態に係る培地交換処理を行う場合における細胞培養装置の動作を示す図である。開示の技術の他の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示すブロック図である。開示の技術の他の実施形態に係る細胞培養装置の部分的な構成を示す図である。開示の技術の他の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示すブロック図である。

　以下、開示の技術の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。

[第１の実施形態]
　図１は、開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置１００の構成の一例を示すブロック図である。細胞培養装置１００は、多能性幹細胞を分化細胞に分化誘導するために必要とされる複数の処理を自動で行い、所望の分化細胞を生産する細胞培養装置である。

　多能性幹細胞は、自己複製能と、外胚葉、中胚葉および内胚葉のいずれにも分化し得る多分化能とを有する細胞である。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（Embryonic Germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（Embryonal Carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（Multipotent Adult Progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（Adult Pluripotent Stem cell；ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell）などが挙げられる。分化細胞は、多能性幹細胞が分化し、特定の形態及び機能を有する細胞である。本実施形態に係る細胞培養装置１００を用いて生産される分化細胞としては、特に限定されないが、例えば、心筋細胞、神経細胞などが挙げられる。

　細胞培養装置１００は、細胞供給部１１、第１の添加剤供給部１２、第２の添加剤供給部１３及び培地供給部１４を備える。また、細胞培養装置１００は、貯留容器２０、撹拌部３０、粘度測定部４１、４２、分離部５０、培養容器７０及び制御部８０を備える。

　細胞供給部１１は、細胞培養装置１００において培養される細胞を含む細胞懸濁液を、細胞培養装置１００の流路内に供給する。細胞供給部１１の流出口の近傍には、開閉バルブＶ１が設けられている。開閉バルブＶ１は、細胞供給部１１から細胞懸濁液を供給する場合に開状態に制御され、それ以外の場合は閉状態に制御される。

　第１の添加剤供給部１２は、多能性幹細胞の分化誘導に必要な、Ｗｎｔシグナル活性化剤を含む第１の添加剤を細胞培養装置１００の流路内に供給する。第１の添加剤供給部１２の流出口の近傍には、開閉バルブＶ２が設けられている。開閉バルブＶ２は、第１の添加剤供給部１２から第１の添加剤を供給する場合に開状態に制御され、それ以外の場合は閉状態に制御される。

　第２の添加剤供給部１３は、多能性幹細胞の分化誘導に必要な、Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む第２の添加剤を細胞培養装置１００の流路内に供給する。第２の添加剤供給部１３の流出口の近傍には、開閉バルブＶ３が設けられている。開閉バルブＶ３は、第２の添加剤供給部１３から第２の添加剤を供給する場合に開状態に制御され、それ以外の場合は閉状態に制御される。

　培地供給部１４は、細胞の培養に使用する新鮮な培地（培養液）を細胞培養装置１００の流路内に供給する。培地供給部１４の流出口の近傍には、開閉バルブＶ４が設けられている。開閉バルブＶ４は、培地供給部１４から培地を供給する場合に開状態に制御され、それ以外の場合は閉状態に制御される。

　貯留容器２０は、細胞供給部１１から供給される細胞懸濁液、第１の添加剤供給部１２から供給される第１の添加剤、第２の添加剤供給部１３から供給される第２の添加剤及び培地供給部１４から供給される培地を一次的に貯留しておくための容器である。貯留容器２０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。

　撹拌部３０は、流路Ｆ２を介して流入する処理対象物を撹拌及び混合する処理を行う処理部である。撹拌部３０は、駆動部を有しないスタティックミキサとしての構成を有していることが好ましく、例えば、管状体と、管状体の内部に固定設置され、管状体の内部にらせん状の流路を形成する撹拌エレメントと、を含んで構成され得る。なお、撹拌部３０は、撹拌翼を回転駆動することにより撹拌及び混合を行うものであってもよい。

　分離部５０は、流路Ｆ３を介して流入する処理対象物（細胞懸濁液）に含まれる成分を分離する処理を行う処理部である。分離部５０は、第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、第３のフィルタ部５３を含んで構成されている。第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、第３のフィルタ部５３は、それぞれ、細胞懸濁液が通過する膜面に形成された開口のサイズが互いに異なるフィルタ膜を備えている。すなわち、第１のフィルタ部５１が備えるフィルタ膜の開口サイズが最も小さく、第３のフィルタ部５３が備えるフィルタ膜の開口サイズが最も大きい。第２のフィルタ部５２が備えるフィルタ膜の開口サイズは、第１のフィルタ部５１が備えるフィルタ膜の開口サイズよりも大きく且つ第３のフィルタ部５３が備えるフィルタ膜の開口サイズよりも小さい。第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、及び第３のフィルタ部５３は、それぞれ、流路Ｆ３を介して流入する処理対象物（細胞懸濁液）に対してフィルタ膜による膜分離処理を行う。

　第１のフィルタ部５１は、多能性幹細胞が分化を開始する前の培養の初期段階において使用される。第１のフィルタ部５１は、生存している未分化細胞と死細胞とを膜分離するのに好適な開口サイズのフィルタ膜を有する。多能性幹細胞において、生存している未分化細胞は、複数の細胞の凝集体である細胞塊を形成し、死細胞は細胞塊から離脱して単一細胞となる。従って、膜分離処理によって生存している未分化細胞と死細胞とを分離することが可能である。第１のフィルタ部５１は、生存している未分化細胞（細胞塊）と死細胞とを含む細胞懸濁液の中から死細胞を除去し、未分化細胞を残す目的で使用される。

　第２のフィルタ部５２は、多能性幹細胞が心筋細胞等の分化細胞に分化する前の中間体（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化した段階で使用される。第２のフィルタ部５２は、中間体に分化しない未分化細胞と中間体とを膜分離するのに好適な開口サイズのフィルタ膜を有する。中間体のサイズは、未分化細胞のサイズよりも大きいので、膜分離処理によって未分化細胞と中間体とを分離することが可能である。第２のフィルタ部５２は、未分化細胞と中間体とを含む細胞懸濁液の中から未分化細胞を除去し、中間体を残す目的で使用される。

　第３のフィルタ部５３は、多能性幹細胞が心筋細胞等の分化細胞に分化した段階で使用される。第３のフィルタ部５３は、分化細胞に移行しない中間体と、分化細胞とを膜分離するのに好適な開口サイズのフィルタ膜を有する。心筋細胞等の分化細胞のサイズは、外胚葉、中胚葉、内胚葉等の中間体のサイズよりも大きいので、膜分離処理によって分化細胞と中間体とを分離することが可能である。第３のフィルタ部５３は、分化細胞と中間体とを含む細胞懸濁液の中から中間体を除去し、分化細胞を残す目的で使用される。

　第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、及び第３のフィルタ部５３は、それぞれ、処理対象物（細胞懸濁液）がフィルタ膜の膜面に沿って流れるタンジェンシャルフローフィルタの構成を有していてもよい。また、第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、及び第３のフィルタ部５３は、それぞれ、処理対象物（細胞懸濁液）の流れ方向が、フィルタ膜の膜面に対して交差する方向となるデッドエンドフローフィルタの構成を有していてもよい。

　第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、及び第３のフィルタ部５３には、それぞれ回収容器６１、６２及び６３が接続されている。第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、及び第３のフィルタ部５３において、フィルタ膜を透過した濾液は、それぞれ、回収容器６１、６２及び６３に回収される。

　本実施形態に係る細胞培養装置１００において、第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、及び第３のフィルタ部５３は、培養期間中における所定のタイミングで選択的に使用される。すなわち、流路Ｆ３を介して分離部５０に流入する処理対象物（細胞懸濁液）は、第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、及び第３のフィルタ部５３のいずれかのフィルタ膜を通過する。

　第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、及び第３のフィルタ部５３の流入口の近傍には、それぞれ、開閉バルブＶ８、Ｖ９及びＶ１０が設けられている。開閉バルブＶ８は、第１のフィルタ部５１による膜分離処理を行う場合に開状態に制御され、それ以外の場合は、閉状態に制御される。開閉バルブＶ９は、第２のフィルタ部５２による膜分離処理を行う場合に開状態に制御され、それ以外の場合は、閉状態に制御される。開閉バルブＶ１０は、第３のフィルタ部５３による膜分離処理を行う場合に開状態に制御され、それ以外の場合は、閉状態に制御される。

　ここで、分化誘導のための細胞培養において生じる、死細胞（シングルセル）（～２０μｍ）、未分化細胞の一例であるｉＰＳ細胞の凝集体（５０～１５０μｍ）、中間体の一例である中胚葉の凝集体（５００～６００μｍ）及び分化細胞の一例である心筋細胞の凝集体（２００～３００μｍ）を、第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２、及び第３のフィルタ部５３において膜分離する場合における、各フィルタ部のフィルタ膜の好ましい開口サイズ及び膜分離後の移送先を、下記の表１に例示する。

　なお、第１のフィルタ部５１のフィルタ膜のより好ましい開口サイズは３０μｍであり、第２のフィルタ部５２のフィルタ膜のより好ましい開口サイズは１７０μｍであり、第３のフィルタ部５３のフィルタ膜のより好ましい開口サイズは４００μｍである。

　培養容器７０は、細胞を培養するための容器である。培養容器７０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器やプラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。培養容器７０は、例えば、温度３０℃～４０℃（好ましくは３７℃）且つＣＯ_２濃度２％～１０％（好ましくは５％）に制御され且つ密閉されたインキュベータ７１内に収容されている。

　粘度測定部４１は、細胞供給部１１に収容される細胞懸濁液の粘度を測定し、測定結果を制御部８０に通知する。同様に、粘度測定部４２は、貯留容器２０に収容される液体の粘度を測定し、測定結果を制御部８０に通知する。

　本実施形態に係る細胞培養装置１００は、細胞供給部１１、貯留容器２０、撹拌部３０、分離部５０及び培養容器７０をこの順序で経由する循環ルートを形成する循環流路Ｆ０を有する。循環流路Ｆ０は、流路Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４及びＦ５を含んで構成されている。流路Ｆ１は、細胞供給部１１の流出口と貯留容器２０の流入口とを接続する流路である。流路Ｆ２は、貯留容器２０の流出口と撹拌部３０の流入口とを接続する流路である。流路Ｆ３は、撹拌部３０の流出口と分離部５０の流入口とを接続する流路である。流路Ｆ４は、分離部５０の流出口と培養容器７０の流入口とを接続する流路である。流路Ｆ５は、培養容器７０の流出口と細胞供給部１１の流入口とを接続する流路である。なお、循環流路Ｆ０は、開示の技術における第１の流路の一例である。

　第１の添加剤供給部１２は、流路Ｆ１１を介して循環流路Ｆ０（流路Ｆ１）に接続され、第２の添加剤供給部１３は、流路Ｆ１２を介して循環流路Ｆ０（流路Ｆ１）に接続されている。培地供給部１４は、流路Ｆ１３を介して循環流路Ｆ０（流路Ｆ１）に接続されている。なお、流路Ｆ１３は、開示の技術における第２の流路の一例である。流路Ｆ１１及びＦ１２は、開示の技術における第３の流路の一例である。

　貯留容器２０と撹拌部３０との間に設けられた流路Ｆ２には開閉バルブＶ５及びＶ６が設けられている。開閉バルブＶ５及びＶ６は、それぞれ、貯留容器２０から撹拌部３０に向けて送液を行う場合に開状態に制御され、それ以外の場合に閉状態に制御される。

　また、撹拌部３０と分離部５０との間に設けられた流路Ｆ３には開閉バルブＶ７が設けられている。開閉バルブＶ７は、撹拌部３０から分離部５０に向けて送液を行う場合に開状態に制御され、それ以外の場合に閉状態に制御される。

　細胞培養装置１００は、撹拌部３０の流出口と貯留容器２０の流入口とを直結する流路Ｆ２０を有する。すなわち、流路Ｆ２０の一端は、流路Ｆ１に接続され、流路Ｆ２０の他端は、流路Ｆ３に接続されている。流路Ｆ２０には、開閉バルブＶ１３及びＶ１４が設けられている。開閉バルブＶ１３及びＶ１４は、撹拌部３０から貯留容器２０に向けて送液を行う場合に開状態に制御され、それ以外の場合に閉状態に制御される。

　細胞培養装置１００は、流路Ｆ１～Ｆ５、Ｆ１１～Ｆ１２及びＦ２０を介した送液を行う複数のポンプ（図示せず）を備えている。なお、細胞供給部１１、第１の添加剤供給部１２、第２の添加剤供給部１３、培地供給部１４、貯留容器２０、撹拌部３０、分離部５０、培養容器７０の各々の内部の圧力を調整することによって、これらの各要素間における送液を行ってもよい。

　制御部８０は、開閉バルブＶ１～Ｖ１４の開閉制御及びポンプ（図示せず）の駆動制御を行うことにより、流路Ｆ１～Ｆ５、Ｆ１１～Ｆ１２及びＦ２０を介した送液の制御を行う。

　本実施形態に係る細胞培養装置１００において実施される多能性幹細胞の分化誘導のための処理は、多能性幹細胞をＷｎｔシグナル活性剤を含む培地中で培養する第１の工程と、第１の工程で得られた細胞をＷｎｔシグナル阻害剤を含む培地中で培養する第２の工程と、を含む。なお、上記の第１の工程及び第２の工程を含む分化誘導の方法の詳細は、例えば、国際公開第２０１３／１１１８７５号に記載されている。

　図２は、細胞培養装置１００において実施される、多能性幹細胞の分化誘導のための処理の流れの一例を示すフローチャートである。

　ステップＳ１において、Ｗｎｔシグナル活性剤を含む第１の添加剤を添加した培地中で細胞を培養する。

　第１の添加剤を添加した培地中での培養の開始から所定時間が経過した後、ステップＳ２において培地交換を行う。なお、培養を開始してから最初に行われる培地交換処理を培地交換［１］とする。培養開始から培地交換［１］が完了するまでの期間は、例えば０．５日～２日程度である。

　ステップＳ３において、Ｗｎｔシグナル活性剤を含む第１の添加剤を培地中に再添加する。

　第１の添加剤を再添加してから所定時間が経過した後、ステップＳ４において培地交換を行う。なお、第１の添加剤を再添加した後に行われる培地交換処理を培地交換［２］とする。

　ステップＳ５において、第１の添加剤の再添加及び培地交換［２］を含む一連の処理を１単位とする処理サイクルのサイクル数が、所定のサイクル数に達したか否かを判定する。処理サイクル数が、所定のサイクル数に達するまで、第１の添加剤の再添加及び培地交換［２］を含む一連の処理が繰り返し行われる。第１の添加剤の再添加及び培地交換［２］を含む一連の処理の１サイクル期間は、例えば１日～５日程度である。

　ステップＳ６において、Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む第２の添加剤を添加した培地中で細胞を培養する。

　第２の添加剤を添加してから所定時間が経過した後、ステップＳ７において培地交換を行う。なお、第２の添加剤を添加してから最初に行われる培地交換処理を培地交換［３］とする。第２の添加剤を添加してから培地交換［２］が完了するまでの期間は、例えば０．５日～２日程度である。

　ステップＳ８において、Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む第２の添加剤を培地中に再添加する。

　第２の添加剤を再添加してから所定時間が経過した後、ステップＳ９において培地交換を行う。なお、第２の添加剤を再添加した後に行われる培地交換処理を培地交換［４］とする。

　ステップＳ１０において、第２の添加剤の再添加及び培地交換［４］を含む一連の処理を１単位とする処理サイクルのサイクル数が、所定のサイクル数に達したか否かを判定する。処理サイクル数が、所定のサイクル数に達するまで、第２の添加剤の再添加及び培地交換［４］を含む一連の処理が繰り返し行われる。第２の添加剤の再添加及び培地交換［４］を含む一連の処理の１サイクル期間は、例えば１日～５日程度である。

　以下に、上記の各ステップに対応する細胞培養装置１００の動作について説明する。なお、説明の煩雑さを回避する観点から、以下の説明では、開閉バルブＶ１～Ｖ１４の開閉制御に関し、これらの開閉バルブＶ１～Ｖ１４を開状態に制御する場合のみについて言及する。開閉バルブＶ１～Ｖ１４を開状態に制御された後、適宜閉状態に制御されるものとする。

＜第１の添加剤の添加＞
　図３は、図２に示すステップＳ１において実施される処理、すなわち、第１の添加剤を添加する処理を行う場合における細胞培養装置１００の動作を示す図である。図３において、処理対象物（細胞懸濁液、培地、添加剤及びこれらの混合物）の各処理部への供給順序が示されている。なお、細胞供給部１１には、細胞培養装置１００を用いて分化誘導を行う多能性幹細胞を含む細胞懸濁液が収容されているものとする。また、細胞供給部１１に収容された細胞懸濁液の粘度が粘度測定部４１によって測定され、測定結果が制御部８０に通知されているものとする。

　ステップＡ１において、制御部８０は、開閉バルブＶ２及びＶ４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、Ｗｎｔシグナル活性化剤を含む第１の添加剤が、第１の添加剤供給部１２から貯留容器２０に供給されるとともに、新鮮な培地が、培地供給部１４から貯留容器２０に供給される。これにより、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、貯留容器２０に収容される。貯留容器２０に収容された第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、粘度測定部４２によって測定され、測定結果が制御部８０に通知される。

　ここで、貯留容器２０に収容されている第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、細胞供給部１１に収容されている細胞懸濁液の粘度よりも高いことが想定される。第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物及び細胞懸濁液は、後に混合されることになるが、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物と細胞懸濁液との粘度差が大きいと良好な混合状態が得られない場合がある。従って、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度を、細胞懸濁液の粘度と同等にした後、両者を混合することが好ましい。第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、チキソ性を有しており、せん断応力を加えることで粘度を低下させることが可能である。そこで、制御部８０は、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えるための送液を行った後に、細胞懸濁液と上記混合物とを合流させて撹拌部３０に移送する制御を行う。具体的には、制御部８０は、貯留容器２０と撹拌部３０との間で第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物を循環させることにより上記の混合物にせん断応力を加える。

　すなわち、ステップＡ２において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、貯留容器２０に収容されている第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、撹拌部３０において撹拌されることで、せん断応力が加えられ、粘度が低下する。

　続いて、ステップＡ３において、制御部８０は、開閉バルブＶ１３及びＶ１４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、撹拌部３０を通過した第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、流路Ｆ２０を経由して貯留容器２０に戻される。貯留容器２０に収容された第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、粘度測定部４２によって測定され、測定結果が制御部８０に通知される。制御部８０は、粘度測定部４２から通知される混合物の粘度と、粘度測定部４１から通知される細胞懸濁液の粘度との差分値が所定値以下になるまで、貯留容器２０と撹拌部３０との間で上記の混合物を循環させる送液を連続して行う。なお、制御部８０は、粘度測定部４１から通知される細胞懸濁液の粘度とは無関係に粘度測定部４２から通知される混合物の粘度の値が所定値以下になるまで、貯留容器２０と撹拌部３０との間で上記の混合物を循環させる送液を連続して行ってもよい。また、貯留容器２０と撹拌部３０との間で上記の混合物を循環させる送液を、予め定められたサイクル数に達するまで連続して行ってもよい。

　第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えるための送液が完了すると、ステップＡ４において、制御部８０は、開閉バルブＶ１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞供給部１１に収容されている細胞懸濁液が、流路Ｆ１を経由して貯留容器２０に移送され、粘度調整がなされた第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物と合流する。

　ステップＡ５において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、貯留容器２０から流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、撹拌部３０において撹拌、混合される。第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えて粘度調整を実施しておくことで、細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物において良好な混合状態を得ることができる。

　ステップＡ６において、制御部８０は、開閉バルブＶ７及びＶ８を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、撹拌部３０から流路Ｆ３を経由して分離部５０の第１のフィルタ部５１に供給される。細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、第１のフィルタ部５１において膜分離処理が施され、生存している細胞と死細胞とが分離される。第１のフィルタ部５１のフィルタ膜を透過した死細胞を含む濾液は回収容器６１に回収される。

　ステップＡ７において、制御部８０は、開閉バルブＶ１１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、死細胞が除去された細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、第１のフィルタ部５１から流路Ｆ４を経由して培養容器７０に供給される。多能性幹細胞がＷｎｔシグナル活性化剤を含む第１の添加剤が添加された培地とともに培養容器７０に収容されることで、分化誘導のための培養が開始される。

＜培地交換［１］＞
　図４は、図２に示すステップＳ２において実施される処理、すなわち、培地交換［１］を行う場合における細胞培養装置１００の動作を示す図である。図４において、処理対象物（細胞懸濁液、培地、添加剤及びこれらの混合物）の各処理部への供給順序が示されている

　ステップＢ１において、制御部８０は、開閉バルブＶ１２を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより使用済み培地を含む細胞懸濁液が、培養容器７０から流路Ｆ５を経由して細胞供給部１１に移送される。

　ステップＢ２において、制御部８０は、開閉バルブＶ１及びＶ４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、使用済み培地を含む細胞懸濁液が、細胞供給部１１から流路Ｆ１を経由して貯留容器２０に移送されるとともに、新鮮な培地が、培地供給部１４から貯留容器２０に供給される。

　ステップＢ３において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、新鮮な培地が追加された細胞懸濁液が、貯留容器２０から流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。新鮮な培地が追加された細胞懸濁液は、撹拌部３０において撹拌、混合される。

　ステップＢ４において、制御部８０は、開閉バルブＶ７及びＶ８を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、新鮮な培地が追加された細胞懸濁液が、撹拌部３０から流路Ｆ３を経由して分離部５０の第１のフィルタ部５１に供給される。新鮮な培地が追加された細胞懸濁液は、第１のフィルタ部５１において膜分離処理が施され、使用済み培地及び新鮮な培地を含む混合物の一部が、死細胞とともに除去される。第１のフィルタ部５１のフィルタ膜を透過した死細胞を含む濾液は回収容器６１に回収される。

　ステップＢ５において、制御部８０は、開閉バルブＶ１１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、膜分離処理済みの細胞懸濁液が、第１のフィルタ部５１から流路Ｆ４を経由して培養容器７０に供給され、培地交換処理が完了する。

＜第１の添加剤の再添加＞
　図５は、図２に示すステップＳ３において実施される処理、すなわち、第１の添加剤を再添加する場合における細胞培養装置１００の動作を示す図である。図５において、処理対象物（細胞懸濁液、培地、添加剤及びこれらの混合物）の各処理部への供給順序が示されている。

　ステップＣ１において、制御部８０は、開閉バルブＶ２及びＶ４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、Ｗｎｔシグナル活性化剤を含む第１の添加剤が、第１の添加剤供給部１２から貯留容器２０に供給されるとともに、新鮮な培地が、培地供給部１４から貯留容器２０に供給される。これにより、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、貯留容器２０に収容される。貯留容器２０に収容された第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、粘度測定部４２によって測定され、測定結果が制御部８０に通知される。

　ここで、貯留容器２０に収容されている第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、培養容器７０に収容されている細胞懸濁液の粘度よりも高いことが想定される。第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物及び細胞懸濁液は、後に混合されることになるが、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物と細胞懸濁液との粘度差が大きいと良好な混合状態が得られない場合がある。従って、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度を、細胞懸濁液の粘度と同等にした後、両者を混合することが好ましい。第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、チキソ性を有しており、せん断応力を加えることで粘度が低下させることが可能である。そこで、制御部８０は、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えるための送液を行った後に、細胞懸濁液と上記混合物とを合流させて撹拌部３０に移送する制御を行う。具体的には、制御部８０は、貯留容器２０と撹拌部３０との間で第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物を循環させることにより上記の混合物にせん断応力を加える。

　すなわち、ステップＣ２において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、貯留容器２０に収容されている第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、撹拌部３０において撹拌されることで、せん断応力が加えられ、粘度が低下する。

　続いて、ステップＣ３において、制御部８０は、開閉バルブＶ１３及びＶ１４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、撹拌部３０を通過した第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、流路Ｆ２０を経由して貯留容器２０に戻される。貯留容器２０に収容された第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、粘度測定部４２によって測定され、測定結果が制御部８０に通知される。制御部８０は、粘度測定部４２から通知される混合物の粘度の値が所定値以下になるまで、貯留容器２０と撹拌部３０との間で上記の混合物を循環させる送液を連続して行う。なお、制御部８０は、貯留容器２０と撹拌部３０との間で上記の混合物を循環させる送液を、予め定められたサイクル数に達するまで連続して行ってもよい。

　第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えるための送液が完了すると、ステップＣ４において、制御部８０は、開閉バルブＶ１２を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより細胞懸濁液が、培養容器７０から流路Ｆ５を経由して細胞供給部１１に移送される。

　ステップＣ５において、制御部８０は、開閉バルブＶ１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞供給部１１に収容されている細胞懸濁液が、流路Ｆ１を経由して貯留容器２０に移送され、粘度調整がなされた第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物と合流する。

　ステップＣ６において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、貯留容器２０から流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、撹拌部３０において撹拌、混合される。第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えて粘度調整を実施しておくことで、細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物において良好な混合状態を得ることができる。

　ステップＣ７において、制御部８０は、開閉バルブＶ７及びＶ９を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、撹拌部３０から流路Ｆ３を経由して分離部５０の第２のフィルタ部５２に供給される。細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、第２のフィルタ部５２において膜分離処理が施され、中間体（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化しない未分化細胞及び死細胞と、中間体とが分離される。第２のフィルタ部５２のフィルタ膜を透過した未分化細胞及び死細胞を含む濾液は回収容器６２に回収される。

　ステップＣ８において、制御部８０は、開閉バルブＶ１１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、未分化細胞及び死細胞が除去され、中間体が残された細胞懸濁液、第１の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、第２のフィルタ部５２から流路Ｆ４を経由して培養容器７０に供給される。

＜培地交換［２］＞
　図６は、図２に示すステップＳ４において実施される処理、すなわち、培地交換［２］を行う場合における細胞培養装置１００の動作を示す図である。図６において、処理対象物（細胞懸濁液、培地、添加剤及びこれらの混合物）の各処理部への供給順序が示されている。

　ステップＤ１において、制御部８０は、開閉バルブＶ１２を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより使用済み培地を含む細胞懸濁液が、培養容器７０から流路Ｆ５を経由して細胞供給部１１に移送される。

　ステップＤ２において、制御部８０は、開閉バルブＶ１及びＶ４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、使用済み培地を含む細胞懸濁液が、細胞供給部１１から流路Ｆ１を経由して貯留容器２０に移送されるとともに、新鮮な培地が、培地供給部１４から貯留容器２０に供給される。

　ステップＤ３において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、新鮮な培地が追加された細胞懸濁液が、貯留容器２０から流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。新鮮な培地が追加された細胞懸濁液は、撹拌部３０において撹拌、混合される。

　ステップＤ４において、制御部８０は、開閉バルブＶ７及びＶ９を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、新鮮な培地が追加された細胞懸濁液が、撹拌部３０から流路Ｆ３を経由して分離部５０の第２のフィルタ部５２に供給される。新鮮な培地が追加された細胞懸濁液は、第２のフィルタ部５２において膜分離処理が施され、使用済み培地及び新鮮な培地を含む混合物の一部が、死細胞及び未分化細胞とともに除去される。第２のフィルタ部５２のフィルタ膜を透過した死細胞及び未分化細胞を含む濾液は回収容器６２に回収される。

　ステップＤ５において、制御部８０は、開閉バルブＶ１１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、膜分離処理済みの細胞懸濁液が、第２のフィルタ部５２から流路Ｆ４を経由して培養容器７０に供給され、培地交換処理が完了する。

＜第２の添加剤の添加＞
　図７は、図２に示すステップＳ６において実施される処理、すなわち、第２の添加剤を添加する場合における細胞培養装置１００の動作を示す図である。図７において、処理対象物（細胞懸濁液、培地、添加剤及びこれらの混合物）の各処理部への供給順序が示されている。

　ステップＥ１において、制御部８０は、開閉バルブＶ３及びＶ４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む第２の添加剤が、第２の添加剤供給部１３から貯留容器２０に供給されるとともに、新鮮な培地が、培地供給部１４から貯留容器２０に供給される。これにより、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、貯留容器２０に収容される。貯留容器２０に収容された第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、粘度測定部４２によって測定され、測定結果が制御部８０に通知される。

　ここで、貯留容器２０に収容されている第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、培養容器７０に収容されている細胞懸濁液の粘度よりも高いことが想定される。第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物及び細胞懸濁液は、後に混合されることになるが、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物と細胞懸濁液との粘度差が大きいと良好な混合状態が得られない場合がある。従って、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度を、細胞懸濁液の粘度と同等にした後、両者を混合することが好ましい。第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、チキソ性を有しており、せん断応力を加えることで粘度を低下させることが可能である。そこで、制御部８０は、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えるための送液を行った後に、細胞懸濁液と上記混合物とを合流させて撹拌部３０に移送する制御を行う。具体的には、制御部８０は、貯留容器２０と撹拌部３０との間で第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物を循環させることにより上記の混合物にせん断応力を加える。

　すなわち、ステップＥ２において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、貯留容器２０に収容されている第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、撹拌部３０において撹拌されることで、せん断応力が加えられ、粘度が低下する。

　続いて、ステップＥ３において、制御部８０は、開閉バルブＶ１３及びＶ１４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、撹拌部３０を通過した第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、流路Ｆ２０を経由して貯留容器２０に戻される。貯留容器２０に収容された第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、粘度測定部４２によって測定され、測定結果が制御部８０に通知される。制御部８０は、粘度測定部４２から通知される混合物の粘度の値が所定値以下になるまで、貯留容器２０と撹拌部３０との間で上記の混合物を循環させる送液を連続して行う。なお、制御部８０は、貯留容器２０と撹拌部３０との間で上記の混合物を循環させる送液を、予め定められたサイクル数に達するまで連続して行ってもよい。

　第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えるための送液が完了すると、ステップＥ４において、制御部８０は、開閉バルブＶ１２を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより細胞懸濁液が、培養容器７０から流路Ｆ５を経由して細胞供給部１１に移送される。

　ステップＥ５において、制御部８０は、開閉バルブＶ１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞供給部１１に収容されている細胞懸濁液が、流路Ｆ１を経由して貯留容器２０に移送され、粘度調整がなされた第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物と合流する。

　ステップＥ６において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、貯留容器２０から流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、撹拌部３０において撹拌、混合される。第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えて粘度調整を実施しておくことで、細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物において良好な混合状態を得ることができる。

　ステップＥ７において、制御部８０は、開閉バルブＶ７及びＶ９を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、撹拌部３０から流路Ｆ３を経由して分離部５０の第２のフィルタ部５２に供給される。細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、第２のフィルタ部５２において膜分離処理が施され、中間体（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化しない未分化細胞及び死細胞と、中間体とが分離される。第２のフィルタ部５２のフィルタ膜を透過した未分化細胞及び死細胞を含む濾液は回収容器６２に回収される。

　ステップＥ８において、制御部８０は、開閉バルブＶ１１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、未分化細胞及び死細胞が除去され、中間体が残された細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、第２のフィルタ部５２から流路Ｆ４を経由して培養容器７０に供給される。

＜培地交換［３］＞
　図８は、図２に示すステップＳ７において実施される処理、すなわち、培地交換［３］を行う場合における細胞培養装置１００の動作を示す図である。図８において、処理対象物（細胞懸濁液、培地、添加剤及びこれらの混合物）の各処理部への供給順序が示されている。

　ステップＧ１において、制御部８０は、開閉バルブＶ１２を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより使用済み培地を含む細胞懸濁液が、培養容器７０から流路Ｆ５を経由して細胞供給部１１に移送される。

　ステップＧ２において、制御部８０は、開閉バルブＶ１及びＶ４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、使用済み培地を含む細胞懸濁液が、細胞供給部１１から流路Ｆ１を経由して貯留容器２０に移送されるとともに、新鮮な培地が、培地供給部１４から貯留容器２０に供給される。

　ステップＧ３において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、新鮮な培地が追加された細胞懸濁液が、貯留容器２０から流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。新鮮な培地が追加された細胞懸濁液は、撹拌部３０において撹拌、混合される。

　ステップＧ４において、制御部８０は、開閉バルブＶ７及びＶ９を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、新鮮な培地が追加された細胞懸濁液が、撹拌部３０から流路Ｆ３を経由して分離部５０の第２のフィルタ部５２に供給される。新鮮な培地が追加された細胞懸濁液は、第２のフィルタ部５２において膜分離処理が施され、使用済み培地及び新鮮な培地を含む混合物の一部が、死細胞及び未分化細胞とともに除去される。第２のフィルタ部５２のフィルタ膜を透過した死細胞及び未分化細胞を含む濾液は回収容器６２に回収される。

　ステップＧ５において、制御部８０は、開閉バルブＶ１１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、膜分離処理済みの細胞懸濁液が、第２のフィルタ部５２から流路Ｆ４を経由して培養容器７０に供給され、培地交換処理が完了する。

＜第２の添加剤の再添加＞
　図９は、図２に示すステップＳ８において実施される処理、すなわち、第２の添加剤を再添加する場合における細胞培養装置１００の動作を示す図である。図９において、処理対象物（細胞懸濁液、培地、添加剤及びこれらの混合物）の各処理部への供給順序が示されている。

　ステップＨ１において、制御部８０は、開閉バルブＶ３及びＶ４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む第２の添加剤が、第２の添加剤供給部１３から貯留容器２０に供給されるとともに、新鮮な培地が、培地供給部１４から貯留容器２０に供給される。これにより、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、貯留容器２０に収容される。貯留容器２０に収容された第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、粘度測定部４２によって測定され、測定結果が制御部８０に通知される。

　すなわち、ステップＨ２において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、貯留容器２０に収容されている第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、撹拌部３０において撹拌されることで、せん断応力が加えられ、粘度が低下する。

　続いて、ステップＨ３において、制御部８０は、開閉バルブＶ１３及びＶ１４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、撹拌部３０を通過した第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、流路Ｆ２０を経由して貯留容器２０に戻される。貯留容器２０に収容された第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、粘度測定部４２によって測定され、測定結果が制御部８０に通知される。制御部８０は、粘度測定部４２から通知される混合物の粘度の値が所定値以下になるまで、貯留容器２０と撹拌部３０との間で上記の混合物を循環させる送液を連続して行う。なお、制御部８０は、貯留容器２０と撹拌部３０との間で上記の混合物を循環させる送液を、予め定められたサイクル数に達するまで連続して行ってもよい。

　第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えるための送液が完了すると、ステップＨ４において、制御部８０は、開閉バルブＶ１２を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより細胞懸濁液が、培養容器７０から流路Ｆ５を経由して細胞供給部１１に移送される。

　ステップＨ５において、制御部８０は、開閉バルブＶ１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞供給部１１に収容されている細胞懸濁液が、流路Ｆ１を経由して貯留容器２０に移送され、粘度調整がなされた第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物と合流する。

　ステップＨ６において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、貯留容器２０から流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、撹拌部３０において撹拌、混合される。第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えて粘度調整を実施しておくことで、細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物において良好な混合状態を得ることができる。

　ステップＨ７において、制御部８０は、開閉バルブＶ７及びＶ１０を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、撹拌部３０から流路Ｆ３を経由して分離部５０の第３のフィルタ部５３に供給される。細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、第３のフィルタ部５３において膜分離処理が施され、分化細胞に移行しない中間体（外胚葉、中胚葉、内胚葉）、中間体に分化しない未分化細胞及び死細胞と、分化細胞とが分離される。第３のフィルタ部５３のフィルタ膜を透過した中間体、未分化細胞及び死細胞を含む濾液は回収容器６３に回収される。

　ステップＨ８において、制御部８０は、開閉バルブＶ１１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、中間体、未分化細胞及び死細胞が除去され、分化細胞が残された細胞懸濁液、第２の添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、第３のフィルタ部５３から流路Ｆ４を経由して培養容器７０に供給される。

＜培地交換［４］＞
　図１０は、図２に示すステップＳ９において実施される処理、すなわち、培地交換［４］を行う場合における細胞培養装置１００の動作を示す図である。図１０において、処理対象物（細胞懸濁液、培地、添加剤及びこれらの混合物）の各処理部への供給順序が示されている。

　ステップＩ１において、制御部８０は、開閉バルブＶ１２を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより使用済み培地を含む細胞懸濁液が、培養容器７０から流路Ｆ５を経由して細胞供給部１１に移送される。

　ステップＩ２において、制御部８０は、開閉バルブＶ１及びＶ４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、使用済み培地を含む細胞懸濁液が、細胞供給部１１から流路Ｆ１を経由して貯留容器２０に移送されるとともに、新鮮な培地が、培地供給部１４から貯留容器２０に供給される。

　ステップＩ３において、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、新鮮な培地が追加された細胞懸濁液が、貯留容器２０から流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。新鮮な培地が追加された細胞懸濁液は、撹拌部３０において撹拌、混合される。

　ステップＩ４において、制御部８０は、開閉バルブＶ７及びＶ１０を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、新鮮な培地が追加された細胞懸濁液が、撹拌部３０から流路Ｆ３を経由して分離部５０の第３のフィルタ部５３に供給される。新鮮な培地が追加された細胞懸濁液は、第３のフィルタ部５３において膜分離処理が施され、使用済み培地及び新鮮な培地を含む混合物の一部が、中間体（外胚葉、中胚葉、内胚葉）、未分化細胞及び死細胞とともに除去される。第３のフィルタ部５３のフィルタ膜を透過した中間体、未分化細胞、死細胞は回収容器６２に回収される。

　ステップＩ５において、制御部８０は、開閉バルブＶ１１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、膜分離処理済みの細胞懸濁液が、第３のフィルタ部５３から流路Ｆ４を経由して培養容器７０に供給され、培地交換処理が完了する。

　以上のように、細胞培養装置１００は、循環ルートを形成する環状流路Ｆ０の途中に設けられた処理部（撹拌部３０及び分離部５０）、培養容器７０、細胞供給部１１を有する。また、循環ルートを形成する環状流路Ｆ０には、分化誘導に必要な添加剤を供給する第１の添加剤供給部１２及び第２の添加剤供給部１３並びに新鮮な培地を供給する培地供給部１４が接続されている。また、細胞培養装置１００は、細胞培養装置１００に設けられた各流路を介した送液を制御する制御部８０を有する。上記の構成を有する細胞培養装置１００によれば、多能性幹細胞の分化誘導に必要とされる一連の処理を、閉鎖系において連続的に実施することが可能となる。

　また、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、分離部５０が、第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２及び第３のフィルタ部５３を含んで構成され、これらのフィルタ部は、それぞれ、開口のサイズが互いに異なるフィルタ膜を備える。第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２及び第３のフィルタ部５３は、培養期間中における所定のタイミングで選択的に使用される。これにより、培養期間中に生じる、死細胞、未分化細胞、中間体及び分化細胞を、適切に分離することが可能となる。

　また、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、添加剤を添加または再添加する場合、制御部８０は、添加剤と新鮮な培地との混合物にせん断応力を加えるための送液を行った後に、細胞懸濁液と上記の混合物とを合流させて撹拌部３０に移送する制御を行う。すなわち、添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度を、細胞懸濁液の粘度に近づけた後に、上記の混合物と細胞懸濁液との混合を行う。これにより、細胞懸濁液、添加剤及び新鮮な培地を含む混合物を混合する場合に、良好な混合状態を得ることができる。

　なお、本実施形態では、分離部５０が、第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２及び第３のフィルタ部５３の３種類のフィルタ部を有する場合を例示したが、この態様に限定されるものではない。分離部５０は、第１のフィルタ部５１、第２のフィルタ部５２及び第３のフィルタ部５３のうちの少なくとも１つを含んでいればよい。

　また、本実施形態では、分離部５０による分離手段として、膜分離処理を行うフィルタ部を例示したが、この態様に限定されるものではない。分離部５０による分離手段として、膜分離手段に代えて、または膜分離手段と併用して、遠心分離手段、加振分離手段、電解分離手段及び磁気分離手段を用いることも可能である。

　また、本実施形態では、細胞培養装置１００が貯留容器２０を備える場合を例示したが、貯留容器２０を省略することも可能である。貯留容器２０を省略する場合、流路を形成する配管に貯留容器としての機能を担わせるようにしてもよい。

［第２の実施形態］
　図１１は、開示の技術の第２の実施形態に係る細胞培養装置１００Ａの構成を示すブロック図である。上記の第１の実施形態に係る細胞培養装置１００においては、添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えるために、上記の混合物を貯留容器２０と撹拌部３０との間で循環させる場合を例示した。第２の実施形態に係る細胞培養装置１００Ａにおいては、添加剤と新鮮な培地との混合物にせん断応力を加えるための送液経路が、第１の実施形態に係る細胞培養装置１００と異なる。

　第２の実施形態に係る細胞培養装置１００Ａは、添加剤と新鮮な培地との混合物にせん断応力を加えるための送液経路として、貯留容器２０の流出口と流入口とを接続する流路Ｆ２１を有する。制御部８０は、流路Ｆ２１を構成する配管中に添加剤及び新鮮な培地を含む混合物を流すことにより上記の混合物にせん断応力を加えた後に、細胞懸濁液と上記の混合物とを貯留容器２０内において合流させて撹拌部３０に移送する。

　具体的には、制御部８０は、添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が貯留容器２０に収容されている状態において、開閉バルブＶ５、Ｖ１３及びＶ１４を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、貯留容器２０に収容されている添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が貯留容器２０から流出し、流路Ｆ２１を経由して貯留容器２０に戻る。添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、流路Ｆ２１に流れる間、流路Ｆ２１を構成する配管内の壁面との摩擦によって、上記の混合物にせん断応力が加えられ、上記の混合物の粘度が低下する。

　貯留容器２０に収容された添加剤及び新鮮な培地を含む混合物の粘度は、粘度測定部４２によって測定され、測定結果が制御部８０に通知される。制御部８０は、粘度測定部４２から通知される混合物の粘度と、粘度測定部４１から通知される細胞懸濁液の粘度との差分値が所定値以下になるまで、上記の混合物を流路Ｆ２１を介して循環させる送液を連続して行う。なお、制御部８０は、粘度測定部４２から通知される混合物の粘度の値が所定値以下になるまで、上記の混合物を流路Ｆ２１を介して循環させる送液を連続して行ってもよい。また、上記の混合物を流路Ｆ２１を介して循環させる送液を、予め定められたサイクル数に達するまで連続して行ってもよい。

　添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えるための送液が完了すると、制御部８０は、開閉バルブＶ５、Ｖ１３及びＶ１４を閉状態に制御し、開閉バルブＶ１を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞供給部１１に収容されている細胞懸濁液が、流路Ｆ１を経由して貯留容器２０に移送され、粘度調整がなされた添加剤及び新鮮な培地を含む混合物と合流する。

　その後、制御部８０は、開閉バルブＶ５及びＶ６を開状態に制御するとともに所定のポンプを駆動する。これにより、細胞懸濁液、添加剤及び新鮮な培地を含む混合物が、貯留容器２０から流路Ｆ２を経由して撹拌部３０に移送される。細胞懸濁液、添加剤及び新鮮な培地を含む混合物は、撹拌部３０において撹拌、混合される。添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えて粘度調整を実施しておくことで、細胞懸濁液、添加剤及び新鮮な培地を含む混合物において良好な混合状態を得ることができる。

　なお、添加剤及び新鮮な培地を含む混合物にせん断応力を加えるための手法として、貯留容器２０をプラスチックフィルム等の柔軟な材料で構成し、添加剤及び新鮮な培地を含む混合物を収容した貯留容器２０に外部から力を加える方法を用いることも可能である。

［第３の実施形態］
　開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置において、インキュベータ７１の内部の温度Ｔ１は、例えば３７℃一定に保たれており、インキュベータ７１の外部の温度Ｔ２は、室温（例えば２５℃）である。従って、インキュベータ７１の内部に収容された培養容器７０に細胞懸濁液を流入させる場合、及びインキュベータ７１の外部に細胞懸濁液を流出させる場合に、細胞は、１２℃の温度差による熱衝撃を受ける。この熱衝撃により、細胞はダメージを受けるおそれがある。

　図１２は、開示の技術の第３の実施形態に係る細胞培養装置の部分的な構成を示す図である。第３の実施形態に係る細胞培養装置は、培養容器７０を収容するインキュベータ７１の内部と外部との温度勾配を緩和する温度勾配緩和機構９１及び９２を備えている。

　温度勾配緩和機構９１は、複数の加熱ユニット９１ａ、９１ｂ、９１ｃ及び９１ｄを含んで構成されている。加熱ユニット９１ａ、９１ｂ、９１ｃ及び９１ｄは、インキュベータ７１内に収容された培養容器７０に流入する細胞懸濁液が通過する流路Ｆ４に設けられている。加熱ユニット９１ａ、９１ｂ、９１ｃ及び９１ｄは、それぞれ、独立に加熱温度の設定を行うことが可能であり、互いに異なる温度で流路Ｆ４を流れる細胞懸濁液を加熱する。加熱ユニット９１ａ、９１ｂ、９１ｃ及び９１ｄの設定温度をそれぞれ、Ｔ１ａ、Ｔ１ｂ、Ｔ１ｃ及びＴ１ｄとすると、Ｔ２（２５℃）＜Ｔ１ｄ＜Ｔ１ｃ＜Ｔ１ｂ＜Ｔ１ａ＜Ｔ１（３７℃）となるように、各加熱ユニットの温度設定がなされる。これにより、流路Ｆ４を流れる細胞懸濁液の温度は、緩やかにインキュベータ７１の内部の温度Ｔ１（３７℃）に向けて上昇する。すなわち、温度勾配緩和機構９１によってインキュベータ７１の内外の温度差による細胞懸濁液の時間あたりの温度変化である温度勾配が緩和される。温度勾配は例えば０．１（℃／ｓ）以下であることが好ましい。なお、本実施形態では、４つの加熱ユニット９１ａ、９１ｂ、９１ｃ及び９１ｄによって温度勾配緩和機構９１を構成する場合を例示したが、所望の温度勾配を実現できるように、加熱ユニットの数は適宜増減することが可能である。

　一方、温度勾配緩和機構９２は、複数の冷却ユニット９２ａ、９２ｂ、９２ｃ及び９２ｄを含んで構成されている。冷却ユニット９２ａ、９２ｂ、９２ｃ及び９２ｄは、インキュベータ７１内に収容された培養容器７０から流出する細胞懸濁液が通過する流路Ｆ５に設けられている。冷却ユニット９２ａ、９２ｂ、９２ｃ及び９２ｄは、互いに独立に冷却温度の設定を行うことが可能であり、互いに異なる温度で流路Ｆ５を流れる細胞懸濁液を冷却する。冷却ユニット９２ａ、９２ｂ、９２ｃ及び９２ｄの設定温度をそれぞれ、Ｔ２ａ、Ｔ２ｂ、Ｔ２ｃ及びＴ２ｄとすると、Ｔ２（２５℃）＜Ｔ２ｄ＜Ｔ２ｃ＜Ｔ２ｂ＜Ｔ２ａ＜Ｔ１（３７℃）となるように、各冷却ユニットの温度設定がなされる。これにより、流路Ｆ５を流れる細胞懸濁液の温度は、緩やかにインキュベータ７１の外部の温度Ｔ２（２５℃）に向けて下降する。すなわち、温度勾配緩和機構９２によってインキュベータ７１の内外の温度差による細胞懸濁液の時間あたりの温度変化である温度勾配が緩和される。温度勾配は、例えば０．１（℃／ｓ）以下であることが好ましい。なお、本実施形態では、４つの冷却ユニット９２ａ、９２ｂ、９２ｃ及び９２ｄによって温度勾配緩和機構９２を構成する場合を例示したが、所望の温度勾配を実現できるように、冷却ユニットの数は適宜増減することが可能である。

　以上のように、開示の技術の第３の実施形態に係る細胞培養装置によれば、温度勾配緩和機構９１及び９２によってインキュベータ７１の内外の温度差による細胞懸濁液の温度変化の温度勾配が緩和される。これにより、インキュベータ７１の内外の温度差によって細胞が受けるダメージを軽減または解消することが可能となる。

［第４の実施形態］
　図１３は、開示の技術の第４の実施形態に係る細胞培養装置１００Ｂの構成を示す図である。第４の実施形態に係る細胞培養装置１００Ｂは、細胞状態測定部９０を更に有する。細胞状態測定部９０は、培養容器７０内に収容されている細胞を撮像するカメラを備え、撮像によって得られる画像を制御部８０に供給する。

　制御部８０は、細胞状態測定部９０から供給される画像から培養容器７０内に収容されている細胞の状態を検出する。制御部８０は、画像から検出した細胞の状態に基づいて、図２に示す各処理ステップへの移行可否を判定する。

　このように、培養容器７０内に収容されている細胞の画像に基づいて各処理ステップへの移行可否を判定することで、分化誘導に必要とされる各処理を適切なタイミングで実施することができ、分化細胞の生産性を高めることができる。

　なお、２０１７年１月２０日に出願された日本国特許出願２０１７－００８９１１の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。また、本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims

　細胞を供給する細胞供給部と、
　培地を供給する培地供給部と、
　未分化細胞を分化誘導するための添加剤を供給する添加剤供給部と、
　処理対象物を撹拌する撹拌部と、
　処理対象物に含まれる成分を分離する分離部と、
　前記細胞を培養する培養容器と、を有するとともに、
　前記細胞供給部、前記撹拌部、前記分離部及び前記培養容器を経由する循環ルートを形成する第１の流路と、
　前記培地供給部と前記第１の流路とを接続する第２の流路と、
　前記添加剤供給部と前記第１の流路とを接続する第３の流路と、
　前記第１の流路、前記第２の流路及び前記第３の流路を介した送液を制御する制御部と、
　を含む細胞培養装置。
　前記分離部は、
　前記未分化細胞と死細胞とを膜分離する第１のフィルタ膜、前記未分化細胞が分化細胞に分化される前の中間体と前記未分化細胞とを膜分離する第２のフィルタ膜、及び前記中間体と前記分化細胞とを膜分離する第３のフィルタ膜のうちの少なくとも１つを有する
　請求項１に記載の細胞培養装置。
　前記分離部は、前記第１のフィルタ膜、前記第２のフィルタ膜、及び前記第３のフィルタ膜のうちの少なくとも２つを含む複数のフィルタ膜を有し、
　前記制御部は、前記複数のフィルタ膜のいずれかに前記細胞を含む細胞懸濁液を選択的に通過させる制御を行う
　請求項２に記載の細胞培養装置。
　前記第１のフィルタ膜、前記第２のフィルタ膜及び前記第３のフィルタ膜の各々の膜面に設けられた開口のサイズが互いに異なる、
　請求項２または請求項３に記載の細胞培養装置。
　前記制御部は、前記添加剤と前記培地との混合物にせん断応力を加えるための送液を行った後に、前記細胞を含む細胞懸濁液と前記混合物とを合流させて前記撹拌部に移送する制御を行う
　請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
　前記第１の流路の途中の、前記細胞供給部と前記撹拌部との間に設けられた貯留容器を更に含み、
　前記制御部は、前記貯留容器と前記撹拌部との間で前記混合物を循環させることにより前記混合物にせん断応力を加えた後に、前記細胞懸濁液と前記混合物とを前記貯留容器内において合流させて前記撹拌部に移送する制御を行う
　請求項５に記載の細胞培養装置。
　前記第１の流路の途中の、前記細胞供給部と前記撹拌部との間に設けられた貯留容器を更に含み、
　前記制御部は、配管中に前記混合物を流すことにより前記混合物にせん断応力を加えた後に、前記細胞懸濁液と前記混合物とを前記貯留容器内において合流させて前記撹拌部に移送する制御を行う
　請求項５に記載の細胞培養装置。
　前記制御部は、前記混合物の粘度が所定の粘度になるまで前記混合物にせん断応力を加えるための送液を連続的に行う
　請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
　前記添加剤供給部は、
　Ｗｎｔシグナル活性化剤を含む第１の添加剤を供給する第１の添加剤供給部と、
　Ｗｎｔシグナル阻害剤を含む第２の添加剤を供給する第２の添加剤供給部と、
　を含む
　請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
　前記培養容器を収容し、前記培養容器の周囲温度を一定に保つインキュベータと、
　前記インキュベータの内部と外部との温度差によって前記第１の流路に沿って生じる温度勾配を緩和する温度勾配緩和機構と、
　を更に含む請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
　請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置を用いて前記細胞を培養する細胞培養方法であって、
　前記制御部が、前記培地供給部から供給される前記細胞、前記添加剤供給部から供給される前記添加剤及び前記培地供給部から供給される前記培地を含む混合物を、前記撹拌部及び前記分離部を経由して前記培養容器に移送する制御を行う
　細胞培養方法。