[go: up one dir, main page]

WO2018139955A1 - Способ специфической идентификации последовательностей днк - Google Patents

Способ специфической идентификации последовательностей днк Download PDF

Info

Publication number
WO2018139955A1
WO2018139955A1 PCT/RU2017/050104 RU2017050104W WO2018139955A1 WO 2018139955 A1 WO2018139955 A1 WO 2018139955A1 RU 2017050104 W RU2017050104 W RU 2017050104W WO 2018139955 A1 WO2018139955 A1 WO 2018139955A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
target
segment
probe
specific
fluorophore
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2017/050104
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Виталий Евгеньевич ВЕДЕРНИКОВ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to EP17894457.5A priority Critical patent/EP3575406A4/en
Publication of WO2018139955A1 publication Critical patent/WO2018139955A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Definitions

  • the invention relates to the field of molecular biology and medicine, and can be used in clinical diagnostics for the detection of target DNA.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • Real-Time Polymerase chain reaction
  • Common detection schemes based on Real-Time PCR such as TaqMan, Molecular Beacon, have significant limitations on the degree of multiplexing: one channel of the detecting amplifier is one target, i.e., as a rule, no more than six desired sequences can be determined simultaneously ( by the number of channels of the amplifier).
  • a promising direction in the development of PCR technology is the development of approaches to increase the degree of multiplexing of a diagnostic test.
  • US5691142 describes a method in which a probe with a 5'-segment that is not complementary to the target sequence and a primer adjacent to it from the 5'-segment adjacent to the 3'-segment is used, as a result of which a Taq polymerase cleavable structure is formed .
  • the released 5'-segment hybridizes with an oligonucleotide (also part of the reaction mixture) having a hairpin structure, with the formation of a structure cleaved by the exonuclease activity of Taq polymerase.
  • the accumulation of a cleaved hairpin oligonucleotide determines a positive signal.
  • the disadvantage of this method is the low efficiency of signal amplification.
  • US 7381532 describes a method in which a cleavable structure is also formed as a result of the interaction of the primer and the probe with a 5'-segment that is not complementary to the target sequence. By the presence of the signal from the freed 5'-segment, the presence of the desired sequence is judged, while the detection is carried out due to the FRET system with two labels or due to further amplification.
  • US6893819 describes a method in which the probe (s) are cleaved during DNA polymerization to release a non-complementary target sequence of the 5'-segment. The disadvantage of this method is the linear increase of the signal, which can in some cases complicate the differentiation of the signal from the background.
  • probes with even one fluorescent label are used, differentiation of multiple targets can be achieved by analyzing the melting curve, while classical detection schemes such as TaqMan TM allow only one target to be determined using a single fluorescent label.
  • US2008241838 describes a method in which a probe is cleaved during DNA polymerization to release a non-complementary target sequence of a 5 ′ segment bearing a fluorescent label. The released 5'-segment then hybridizes with the "capture" probe.
  • This method requires that the "capture” probe has a shorter length than the split probe and is immobilized on the solid phase. The listed restrictions are necessary to reduce the likelihood of hybridization of the undigested initial probe with an "exciting" one.
  • the disadvantages of the method are the need for detection on the solid phase, which makes it impossible to use it in single-phase systems, such as PCR with the detection of amplification products in real time.
  • Patent RU2566562 describes a method (prototype) for which a reaction PCR mixture as specific components on one target contains:
  • fissile target-specific probe including, in addition to a specific 3'-segment, a non-complementary target sequence, a 5'-segment without fluorescent labels;
  • a signal probe having a complementary region with a 5'-segment of a cleavable target-specific probe, carrying a quencher at the 5'-end and a fluorophore in the internal position;
  • the target-specific probe is cleaved with the release of the 5'-segment, which hybridizes to a signal probe and then lengthens on it due to polymerase with the formation of a duplex.
  • the single-stranded signal probe straightens, which leads to increased fluorescence as a result of the spatial removal of the fluorophore and quencher included in its composition.
  • a cleavable target-specific probe at the 5'-end carries fluorophore
  • the signal probe carries a fluorescence quencher at the 3'-end.
  • the target-specific probe is cleaved with the release of the 5'-segment that carries the fluorophore, which hybridizes to the signal probe and then lengthens on it due to polymerase with the formation of a duplex with a higher melting point compared to the target-specific probe duplex / signal probe, which eliminates the possibility of false-positive results.
  • the fluorophore of the released 5'-segment and the fluorescence quencher which is part of the signal probe, converge, which leads to a decrease in fluorescence recorded by the detecting amplifier.
  • the reaction products are melted.
  • the melting point of the corresponding duplex is determined by the size of the signal probe, the sequence of which is selected individually by the developer for each target.
  • the degree of multiplexing (the number of detected targets in one tube) depends on the number of channels of the amplifier and on the number of duplexes, which differ in melting temperature, for each channel.
  • the degree of multiplexing of a diagnostic test based on real-time PCR can be increased by increasing the number of amplifier detection channels, but this technology has reached the ceiling; Thus, modern amplifiers have no more than 7 channels and a significant increase in their number is not expected.
  • a promising direction in the development of PCR technology is the development of approaches to increase the degree of multiplexing of a diagnostic test within a limited number of detection channels, that is, to determine two or more targets in one channel. Disclosure of invention
  • the problem to which the claimed invention is directed is to develop a method for the specific identification of DNA sequences, including for determining nucleotide polymorphisms, based on PCR with the detection of amplification products in real time, which allows to identify more than one target in one channel of the amplifier with fluorescence detection.
  • the developed method is a multiplex duplex-mediated analysis based on fissile probes (MDA).
  • Another objective to which the claimed invention is directed is the development of a kit based on MDA to detect one or more of the desired DNA sequences.
  • MDA consists in using a target-specific probe, which is cleaved by PCR in the presence of the desired DNA sequence (target) with the release of the 5'-segment, which forms detectable duplexes at the stage of melting with a signal probe.
  • target corresponds to a duplex with a specific melting point, detected in a specific channel of the amplifier, due to which the differentiation of the targets is carried out.
  • MDA the number of stages of signal generation is reduced in comparison with the prototype RTOSE technology, which makes it possible to simplify system optimization and achieve a higher degree of multiplexing by expanding the melting temperature range for duplexes.
  • the task is achieved by developing a method for the specific identification of at least one DNA sequence, which includes the following steps:
  • PCR polymerase chain reaction
  • thermostable enzyme with 5'—> 3 'DNA polymerase and 5'—> 3' exonuclease activity
  • each of the identified DNA sequences i.e. as specific components on one target (in qualitative terms) includes at least
  • one oligonucleotide signal probe complementary to the 5'-segment of the target-specific probe and containing a label that is identical or close in the absorption and emission spectra of the tag contained on the 3'-segment of the target-specific probe;
  • the target-specific probe when hybridized with an identifiable DNA sequence, is cleaved by the indicated enzyme with the release of the 5'-segment and uncoupling of the tags included in the target-specific probe, and the 5'-segment, in turn, hybridizes with a signal probe, forming a duplex with it;
  • the 3'-segment of the target-specific probe and the signal probe contain a fluorescence quencher or a reporter fluorophore as a label
  • the 5'-segment of the target-specific probe is a fluorophore, for which the emission spectrum overlaps with the absorption spectrum of this fluorescence quencher or reporter fluorophore
  • the 3'-segment of the target-specific probe and the signal probe contain a fluorophore
  • the 5'-segment of the target-specific probe contains a fluorescence quencher or reporter fluorophore, for which the absorption spectrum overlaps the emission spectrum of this fluorophore.
  • the melting of the reaction mixture is carried out in increments of 0.01 to 1 ° C.
  • the melting of the reaction mixture is carried out in increments of 0.5 ° C.
  • the melting of the reaction mixture is carried out in the temperature range from 0 ° C to 100 ° C.
  • the melting temperature of the duplex formed by the 5'-segment of the target-specific probe and the signal probe for at least one of the identifiable DNA sequences is lower than the melting temperature of the primers included in the reaction mixture.
  • At least one of the dyes carboxyfluorescein (FAM), 6-carboxyrodamine (R6G), carboxy-X-rhodamine (ROX), tetramethylcarboxyrodamine (TAMRA), 6-carboxy- is used as a fluorophore or reporter fluorophore.
  • FAM carboxyfluorescein
  • R6G 6-carboxyrodamine
  • ROX carboxy-X-rhodamine
  • TAMRA tetramethylcarboxyrodamine
  • 6-carboxy- is used as a fluorophore or reporter fluorophore.
  • a BHQ and / or RTQ series fluorescence quencher is used as a fluorescence quencher.
  • Taq DNA polymerase is used as a thermostable enzyme having 5'—> 3 'DNA polymerase and 5'—> 3' exonuclease activity.
  • the signal probe is immobilized to a solid phase.
  • the reaction mixture comprises at least
  • the reaction mixture comprises at least
  • duplexes formed by signal probes and their corresponding 5'-segments of target-specific probes have the same melting temperature, and differentiation of different identifiable DNA sequences is carried out due to their detection in different channels of the amplifier.
  • a linker consisting of at least 1-10 nucleoside monophosphates providing separate hybridization of two fragments, the length of the 3'-segment coinciding with the hybridization site of the indicated DNA sequence selected for identification of polymorphism in it, while the target is specific oligonucleotide the probe, in the case of complete complementarity of its Z'-segment and the indicated DNA sequence, including in the part of the 5'-fragment (S) corresponding to the desired allelic variant of polymorphism, is cleaved by the indicated rent with the release of the 5'-segment and the uncoupling of the tags included in the target-specific probe, which subsequently provides signal generation at the melting stage;
  • the target-specific probe is cleaved by the indicated enzyme on the L linker to release the 5'-segment associated with 5 ' -fragment (S), without separation of the labels that make up the target-specific probe, which subsequently at the melting stage does not lead to signal generation,
  • the 5'-fragment (S) of the Z'-segment of the target-specific probe and the signal probe contain a fluorescence quencher or reporter fluorophore as a label
  • the 5'-segment of the target-specific probe is a fluorophore for which the emission spectrum overlaps absorption spectrum of a fluorescence quencher or reporter fluorophore
  • the 5'-fragment (S) of the Z'-segment of the target-specific probe and the signal probe contain a fluorophore
  • the 5'-segment of the target-specific probe contains a fluorescence quencher or reporter fluorophore, for which the absorption spectrum overlaps the emission spectrum of this fluorophore.
  • the reaction mixture comprises at least
  • duplexes formed by signal probes and corresponding 5'-segments of target-specific probes corresponding to them have different melting points, according to which differentiated identifiable polymorphisms in the DNA sequence are differentiated.
  • the reaction mixture comprises at least
  • duplexes formed by signal probes and their corresponding 5'-segments of target-specific probes have the same melting temperature, and differentiation of different identifiable polymorphisms in the DNA sequence is carried out by their detection in different channels of the amplifier.
  • the reaction mixture comprises at least
  • the reaction mixture comprises at least
  • the 5'-segments of which are unique in sequence that is, they can form duplexes only with the corresponding signal probes complementary to them, but are identical in melting temperature and contain different fluorescence quencher or reporter fluorophore, the absorption spectrum of which covers the emission spectrum of the 3'-segment of the 3'-segment of this the same target-specific probe, while differentiation of the allelic variants in one channel of the amplifier is carried out according to the melting points of duplexes.
  • the linker L in the composition of the target-specific probe consists of 4-10 inosine monophosphates.
  • a 5'-segment that is not complementary to the identifiable DNA sequence, the sequence of which is selected so that the duplex that it forms with the signal probe in the PCR process has a predetermined melting point, and containing a label, and an oligonucleotide signal probe complementary to the 5'-segment of the target-specific probe and containing a label that is identical or close in the absorption and emission spectra of the tag contained on the 3'-segment of the target-specific probe;
  • the target-specific probe when hybridized with an identifiable DNA sequence, is cleaved by a thermostable enzyme with 5'—> 3 'DNA polymerase and 5'—> 3' exonuclease activity, with the release of the 5'-segment and dissociation of the constituent the target-specific probe of the tags, and the 5'-segment, in turn, hybridizes with the signal probe, forming a duplex with it;
  • the Z'-segment of the target-specific probe and the signal probe contain a fluorescence quencher or reporter fluorophore as a label
  • the 5'-segment of the target-specific probe is a fluorophore, for which the emission spectrum overlaps the absorption spectrum, respectively, of this quencher fluorescence or reporter fluorophore
  • the 3'-segment of the target-specific probe and the signal probe contain a fluorophore
  • the 5'-segment of the target-specific probe contains a fluorescence quencher or reporter fluorophore, for which the absorption spectrum overlaps the emission spectrum of this fluorophore.
  • a pair of probes for the specific identification of DNA sequences during PCR is characterized in that the melting point of the duplex formed by the 5'-segment of the target-specific probe and a signal probe for at least one of the identifiable DNA sequences is lower than the melting temperature primers used for PCR.
  • the signal probe is immobilized to a solid phase.
  • the probes when a pair of probes is used to identify one or more polymorphisms in a DNA sequence, are characterized in that
  • the z'-segment of the target-specific oligonucleotide probe consists of
  • an allele-detecting 5'-fragment that carries a label, the hybridization site of which contains the analyzed polymorphic site, and the sequence of which is complementary to one allelic variant, subject to specific identification and
  • Z'-fragment (D) the sequence of which is complementary to the DNA site adjacent to the site containing the identified polymorphism
  • linker consisting of at least 1-10 nucleoside monophosphates, providing separate hybridization of the two fragments
  • the length of the 3'-segment coincides with the hybridization site of the identified indicated DNA sequence, the selected polymorphism identification in it,
  • the target-specific oligonucleotide probe in the case of complete complementarity of its 3'-segment and the indicated DNA sequence, including in the part of the 5'-fragment (S) corresponding to the desired allelic variant of polymorphism, is cleaved by an enzyme having 5'—> 3 'DNA polymerase and 5'—> 3' exonuclease activity, with the release of the 5'-segment and uncoupling of the labels that make up the target-specific probe, which subsequently provides signal generation at the melting stage;
  • the target-specific probe is cleaved by an enzyme with 5'—> 3 'polymerase DNA and 5'—> 3 'exonuclease activity, on the L linker with the release of the 5'-segment associated with the 5'-fragment (S), without separation of the labels that make up the target-specific probe, which subsequently does not lead to signal generation at the melting stage,
  • the 5'-fragment (S) of the Z'-segment of the target-specific probe and the signal probe contain a fluorescence quencher or reporter fluorophore as a label
  • the 5'-segment of the target-specific probe is a fluorophore for which the emission spectrum overlaps absorption spectrum, respectively, of this fluorescence quencher or reporter fluorophore
  • the 5'-fragment (S) of the Z'-segment of the target-specific probe and the signal probe contain a fluorophore
  • the 5'-segment of the target-specific probe contains a fluorescence quencher or reporter fluorophore, for which the absorption spectrum overlaps the emission spectrum of this fluorophore.
  • one oligonucleotide signal probe complementary to the 5'-segment of the target-specific probe and containing a label that is identical or close in the absorption and emission spectra of the tag contained on the 3'-segment of the target-specific probe;
  • the probes are designed in such a way that, during PCR, the target-specific probe, when hybridized with an identifiable DNA sequence, is capable of being cleaved by the indicated enzyme with the release of the 5'-segment and uncoupling of the tags included in the target-specific probe, and the 5'-segment in turn, hybridizes with a signal probe, forming a duplex with it;
  • the 3'-segment of the target-specific probe and the signal probe contain a fluorescence quencher or a reporter fluorophore as a label
  • the 5'-segment of the target-specific probe is a fluorophore for which the emission spectrum covers the absorption spectrum of this fluorescence quencher or reporter fluorophore
  • the 3'-segment of the target-specific probe and the signal probe contain a fluorophore
  • the 5'-segment of the target-specific probe contains a fluorescence quencher or reporter fluorophore, for which the absorption spectrum overlaps CTD emission of the fluorophore.
  • the proposed kit is characterized in that upon melting of the reaction mixture obtained by mixing the components of the kit, without preliminary PCR, duplexes are not detected. In particular cases, this characteristic of the kit can be used to identify the kit of the invention.
  • the kit includes at least two different target-specific probes
  • the kit includes at least
  • - MDA allows specific determination of DNA sequences, including in multiplex format, with the possibility of determining more than one target in one channel of the amplifier;
  • a high degree of multiplexing is achieved due to the wide range of melting temperatures for duplexes formed by signal probes and detachable 5'-segments of target-specific probes, which provides a higher degree of multiplexing in comparison with the prototype technology; such a significant expansion of the range of melting temperatures is possible due to the fact that during MDA, duplexes with a melting temperature substantially lower than the melting temperature of the primers can be used, with the achievement of high sensitivity and specificity of the method;
  • the present invention is a new method for specific determination of nucleotide sequences of DNA, including in multiplex format, followed by implementation in the form of a set.
  • DNA suitable for analysis using MDA is a DNA sample obtained by extraction from a variety of biological material, including, but not limited to, smears, saliva, urine, blood serum, blood plasma, and organ tissues.
  • Various methods can be used for DNA extraction, including, but not limited to, on the basis of alcohol deposition, on the basis of sorption, on the basis of thermal lysis, which make it possible to obtain a matrix suitable for PCR, in addition, a DNA matrix for analysis can be obtained in the result of a reverse transcription reaction from an RNA matrix, which can also be extracted from a variety of biological material, including the methods listed above; or DNA for analysis can be obtained by any other available methods.
  • Fig. 1. The principle of multiplex duplex-mediated analysis based on split probes (MDA) as an example of one of the combinations of labels.
  • a fissile target-specific probe including, in addition to a specific 3'-segment (a) carrying a quencher (Q), a non-complementary target DNA, a 5'-segment ( ⁇ ) carrying a fluorophore (F),
  • B Cleavage of the target-specific probe with the separation of the fluorophore (F) and the quencher (Q) in its composition due to the exonuclease activity of Taq polymerase.
  • B - Melting of reaction products - stepwise heating of the reaction mixture from 25 ° C to 95 ° C: (4) - the duplex formed by the cleavage of the target-specific probe gives a fluorescent signal after melting,
  • a - MDA for two targets implies the use of two cleavable probes (M1) and (M2), including various specific 3'-segments (a1 and a2, respectively) and non-complementary target DNA 5'-segments ( ⁇ 1 and ⁇ 2, respectively), as well as two signal probes ( ⁇ 1) and ( ⁇ 2). If both targets are present in the analyzed sample, the corresponding detected duplexes with different melting points (TT1 and TT2) are formed.
  • Fig. 3. The principle of differentiation of targets according to the melting temperature of duplexes and fluorophore.
  • B is a graph of melting curves after mathematical processing, an example of differentiation of 6 targets by the melting temperatures of duplexes (T1-T6) in the fluorophore channel F1.
  • the combination of 5 fluorophores (F1-F5) and 6 melting points of duplexes (T1-T6) allows us to differentiate 30 targets in one tube.
  • Fig. 4. Schematic diagram of the determination of polymorphisms based on MDA as an example of one of the combinations of labels.
  • a fissile target-specific probe including, in addition to the specific 3'-segment (a), a non-complementary target sequence, the 5'-segment ( ⁇ ) carrying the fluorophore F;
  • the Z'-segment (a) is divided into an allele-detecting fragment (S) carrying a Q fluorescence quencher and a 3'-fragment (D) connected via a linker from nucleoside monophosphates (L); within the fragment S, a polymorphic site is marked with a black square,
  • Fig. 5. MDA results for the detection of Neisseria gonorrhoeae (NG) and Trichomonas vaginalis (TV) DNA in the following samples:
  • the proposed method for the specific identification of DNA target sequences - multiplex duplex-mediated analysis is carried out by means of a polymerase chain reaction with the detection of results in real time in the presence of target-specific probes having non-complementary sequences of the target DNA 5'-segments, and their corresponding signal probes complementary to 5'-segments (Fig. 1A).
  • the target-specific probe in the 5'-segment and the 3'-segment carries one mark, the signal probe has one mark.
  • the specific probe is cleaved due to the 5'—> 3 'exonuclease activity of DNA polymerase with the release of the 5'-segment (Fig. 1 B).
  • the reaction products are melted, and the detection is carried out by approaching or uncoupling of the labels that make up the 5'-segment of the target-specific probe and signal probe.
  • the unsplit target-specific probe due to the presence of two interacting tags in its composition (and arranged so that this interaction is ensured), does not form detectable duplexes with a signal probe (Fig. 1 B (5)).
  • the degree of multiplexing depends on the number of channels of the amplifier used and on the number of duplexes, which differ in melting temperature, for each channel of the amplifier.
  • the number of duplexes per channel depends on the selected basic artificial oligonucleotides - pairs of cleavable 5'-segments and signal probes to them, while (within the same channel) these pairs should differ in temperature of the duplexes formed by them by at least 4 ° C, more preferably , at least 5 ° C for reliable differentiation of targets.
  • a 5-channel amplifier 30 targets can be determined in one tube, provided that 6 targets are identified in one channel (Fig. 3).
  • the use of the invention allows with high specificity and sensitivity to detect a variety of nucleotide sequences in a multiplex format, even in the case of using an amplifier with fluorescence detection, having only one fluorescent channel.
  • the reaction mixture for PCR as specific components on one target contains:
  • Fig. 1A (1) a fissile target-specific probe
  • Fig. 1A (1) which includes, in addition to a specific 3'-segment (Fig. 1A a), a non-complementary target sequence 5'-segment (Fig. 1A ⁇ ), while both segments carry label
  • the probes and primers are single-stranded deoxyribo (oligo) nucleotides.
  • Probes and primers used in the present invention mainly contain modified or unmodified nucleoside monophosphates. In some cases, probes and primers may also include ribonucleotides.
  • blocking from the extension of the 3'-end can be achieved by traditional methods.
  • blocking can be accomplished by adding to the 3'-hydroxyl group the last nucleotide of a chemical group, such as biotin, phosphate group, alkyl group, non-nucleotide linker, phosphorothionate or alkanediol.
  • blocking can be accomplished by removing the 3'-hydroxyl group of the last nucleotide or by using a nucleotide lacking a 3'-hydroxyl group, such as a dideoxynucleotide.
  • the target-specific probe in the 5'-segment carries a fluorophore, and in the 3'-segment there is a fluorescence quencher, the absorption spectrum of which overlaps the emission spectrum of this fluorophore, while the distance between the labels must be such that the fluorescence is quenched;
  • the signal probe includes a fluorescence quencher, the absorption spectrum of which also overlaps the emission spectrum of this fluorophore (in the entire system, the fluorescence quencher can be replaced by a reporter fluorophore);
  • the target-specific probe in the 5'-segment carries a fluorescence quencher, and in the 3'-segment - a fluorophore, for which the emission spectrum overlaps the absorption spectrum of this fluorescence quencher, while the distance between the labels must be such that the fluorescence is quenched;
  • the signal probe includes a fluorophore, for which the emission spectrum also overlaps the absorption spectrum of this fluorescence quencher (in the entire system, the fluorescence quencher can be replaced by a reporter fluorophore).
  • a target-specific probe in the 5'-segment carries a fluorophore, and in the 3'-segment there is a fluorescence quencher, the signal probe includes a fluorescence quencher
  • the principle of MDA operation consider the principle of MDA operation.
  • the fragment limited by primers is amplified (Fig. 1A (3)), while the target-specific probe (Fig. 1A (1)), in the presence of the target DNA in the sample, hybridizes within the framework of the amplicon, it is cleaved on the matrix due to the exonuclease activity of the enzyme, as a result of which the 5'-segment non-hybridizing to the matrix is cleaved together with the fluorophore, and the fluorophore and quencher of the 3'-segment are separated (Fig. 1 B).
  • Any thermostable is suitable for the reaction.
  • an enzyme with 5'—> 3 'polymerase DNA and 5'—>3' exonuclease (flap-endonuclease) activity for example, Taq DNA polymerase.
  • the duplexes are melted (Fig. 1B), formed by the cleaved 5'-segment of the target-specific probe and a signal probe.
  • Fig. 1B the duplexes are in a hybridized state; thus, the fluorophore and the quencher are spatially close, therefore, the magnitude of the recorded fluorescence signal is minimal.
  • the temperature of the reaction mixture was raised to 95 ° C.
  • the duplexes are destroyed due to the separation of chains, and the fluorophore and quencher also separate, which leads to increased fluorescence if the target-specific probe hybridized onto the matrix (in the presence of the target DNA in the sample) (Fig.
  • the TT of the duplex depends on the length and sequence of the signal probe, which, in turn, is set by the developer.
  • several targets can be determined - by the number of duplexes distinguished by TT (Fig. 2A).
  • Target discrimination is achieved through the use of systems with signal probes of different lengths and sequences (complementary to the 5'-segments of the split probes that are not hybridized to the matrix) and, therefore, differing in Tm of the duplexes formed by them (Fig. 2B). Since the detected duplex is formed only in the case of cleavage of the target-specific probe on the matrix, its detection indicates the presence of the desired DNA sequence in the sample.
  • each target corresponds to a combination of a fluorophore and a duplex with a certain melting point (Fig. 4).
  • Fig. Figure 2B shows an example with the determination of two DNA targets in one channel, the discrimination of which is due to 5-segments of target-specific probes differing in sequence (Fig. 2A ⁇ 1 and ⁇ 2) and, accordingly, according to the melting temperature of duplexes formed with signal probes ( Fig. 2 Tm1 and Tm2).
  • Fig.ZA The principle of target differentiation by the melting temperature of duplexes and fluorophore is shown in Fig.ZA.
  • Fig.ZA the differentiation of 30 targets by 6 melting points of duplexes (T1-T6) and 5 fluorophores (F1-F5) (Fig. ZA), as well as a graph of melting curves after mathematical processing demonstrating the differentiation of 6 targets by the melting temperatures of duplexes (T1-T6) in the fluorophore channel F1 (Fig. ST).
  • the claimed invention can be implemented, including on the solid phase, in which case, the signal probe must be immobilized on the solid phase.
  • the MDA principle is suitable for the determination of single nucleotide polymorphisms, insertions and deletions. This requires the following modifications of the structure of the target-specific probe: firstly, the 3'-segment must be divided into the allele-detecting fragment (S) and 3'-fragment (D), and to connect them through the linker from nucleoside monophosphates (L), secondly, enter the label within the fragment S (Fig. 4A).
  • the allele-detecting fragment is located at the 5'-end of the 3'-segment of the target-specific probe and is selected so that the desired polymorphism is within the region of its hybridization, followed by a linker from the 3'-end of 3-10 nucleoside monophosphates, for example, five inosine monophosphates, which then combines with the 3'-fragment, which provides reliable hybridization of the probe on the matrix.
  • Inosine monophosphate is known to form relatively weak bonds with other bases compared to the canonical Watson-Crick interactions.
  • the inosine linker forms a bubble structure, thus providing a better functional separation of the two fragments of the 3'-segment of the target-specific probe.
  • Fragments S and D are selected so that the annealing temperature of the S fragment is 15–20 ° C lower than the annealing temperature of the D fragment.
  • a longer D fragment initiates hybridization of the probe under PCR conditions and ensures accurate positioning of the allele-detecting fragment opposite to the hybridization site.
  • the specificity of the polymorphism detection is determined by a short S-fragment; one can choose the conditions under which its hybridization under PCR conditions occurs only with the target sequence without mismatches.
  • the allele-detecting fragment and the matrix are fully consistent under PCR conditions, it hybridizes, followed by cleavage of the 5'-segment of the target-specific probe with separation of the fluorophore and quencher (Fig.
  • the proposed solution differs from the prototype in the original arrangement of the fluorescent labels in the composition of the split probe and in the absence of the enzymatic duplex formation step, which greatly simplifies the analysis and increases its efficiency by eliminating the kinetics of the duplex formation reaction.
  • the proposed detection scheme allows you to select duplexes in a wide temperature range, starting from 35 ° C, while in the prototype technology the melting temperature of the duplex is limited from below to the melting temperature of the detachable segment.
  • the expansion of the melting temperature range of duplexes for the proposed solution allows to increase the degree of multiplexing in comparison with the prototype technology in 1, 5-2 times.
  • the temperature of primer annealing usually lies in the range of 55-65 ° ⁇ , respectively, for the implementation of the prototype technology, the detachable segment of the target-specific probe must have a melting point in the specified range to ensure its elongation on the signal probe in terms of PCR.
  • the resulting duplex always has a higher melting point compared to the split-off segment, due to its enzymatic formation.
  • the difference in the melting temperature of the detachable segment and the formed duplex should be at least 4 ° C, more preferably at least 5 ° C, for reliable differentiation of the signal from the duplex formed by the uncleaved target-specific probe and the signal probe (especially important for the implementation of the technology with labeled cleaved segment).
  • the range of duplexes formed is limited from below Tm + 5, where Tm is the melting temperature of the primers, and for the proposed solution there is no such restriction
  • target-specific probes are cleaved during PCR, which leads to the formation of a large number of priming single-stranded oligonucleotides with a high melting point (not lower than Tm primers), which, in turn, can hybridize non-specifically and lengthen under PCR with target-specific primers and with each other.
  • An increase in the number of prime TT oligonucleotides during PCR significantly complicates the optimization of the reaction due to the need to exclude the interference of cleaved segments and target-specific systems.
  • kits for specifically determining DNA sequences include:
  • Fig. 1A (1) a fissile target-specific probe
  • Fig. 1A (1) which includes, in addition to a specific 3'-segment (Fig. 1a), a non-complementary target sequence 5'-segment (Fig. 1 ⁇ ), while both segments carry label
  • Each set depending on the number of different targets for the determination of which it is intended, contains the necessary number of different specific components.
  • the set also includes non-specific components necessary for the analysis, the composition of which is understandable for specialists in this field, and may vary depending on the features of the analysis.
  • components of the kit include, in particular, but not limited to, thermostable DNA polymerase having 5'—> 3 'exonuclease activity, deoxyribonucleotide triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Mg 2+ ions , buffer solution providing necessary reaction conditions, etc.
  • the kit has the following property: without preliminary PCR, duplexes corresponding to DNA targets are not detected, since an unsplit target-specific probe forms an undetectable duplex with a signal probe, upon melting of which a signal is not generated, due to the presence of two interacting labels with overlapping absorption and emission spectra. Since the kit according to this invention is made to implement the above detection method of the present invention (MDA), a general description is omitted to avoid unnecessary duplication, which complicates this description.
  • MDA detection method of the present invention
  • the target DNA refers to the DNA or DNA fragment that is detected (seek to identify) in the test sample.
  • fluorophore As a fluorophore, reporter fluorophore, or fluorescence quencher, various fluorescent dyes such as Cy2 TM (506), YO-PR0 TM -1 (509), YOYO TM -1 (509) can be used in the present invention, but not limited to.
  • a non-fluorescent “dark” quencher molecule capable of damping fluorescence over a wide wavelength range or at a specific wavelength can be used in the present invention.
  • quenchers are BHQ (Black Hole Quencher 1) and DABCYL (4 - ((4- (dimethylamino) phenyl) azo) benzoic acid).
  • reporter fluorophore is used herein for FRET tags (Fluorescence Resonance Energy Transfer) used as an acceptor in donor-acceptor pairs for which fluorescence can be measured separately at the corresponding wavelength. If fluorescence is not measured at the acceptor wavelength, then the reporter fluorophore can be considered a quencher.
  • FRET tags Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • a fluorescent dye is used as a fluorophore
  • rhodamine dye is used as a quencher.
  • Labeled oligonucleotide probes are synthesized by chemical addition of a fluorophore (quencher or reporter fluorophore) to oligonucleotides, the sequences of which are selected in accordance with the requirements of the method.
  • the fluorescent label can be attached to both the extreme and internal sites of the signal probe and segments of the target-specific probe.
  • the fluorescent label of the 3'-segment of the target-specific oligonucleotide probe is attached to the allele-detecting fragment (S) (see Fig. 4).
  • the distance between the marks included in the segments of one target-specific probe, as well as the distance between the marks of the duplex formed by the 5'-segment of the target-specific probe and the signal probe, must be such that the fluorescence is suppressed.
  • a suitable DNA polymerase having 5'-> 3 'exonuclease activity in the present invention is a thermostable DNA polymerase obtained from a number of bacterial species, including Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga neurotromota, Thermotoga nephromitoga, Thermotoga Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus baros
  • reaction mixture in the context of the present invention is understood the totality of the reaction components necessary for the MDA, both in the form of individual components of the kit, and in the form of a mixture obtained by combining the components of the kit.
  • MDA multiplex duplex-mediated analysis based on split probes
  • the target-specific probe in the 5'-segment carries a fluorophore, and in the 3'-segment - a fluorescence quencher, the signal probe includes a fluorescence quencher;
  • the target-specific probe in the 5'-segment carries a fluorescence quencher, and in the 3'-segment the fluorophore, the signal probe includes a fluorophore.
  • NG Neisseria gonorrhoeae
  • TV Trichomonas vaginalis
  • PCR was performed.
  • the 30 ⁇ p reaction mixture contained 50 mM Tris-S04, pH 8.0; 10 tM (NH4) 2S04; 3.5 tM MgCI2; 30 tM KCI; 0.01% Tween-20; 0.25 tM of each dNTP; 3 rM primers NG-F (5'-GTATGGTTTCAAG ACGCTTCAC-3 ', SEQ ID NO: 1), NG-R (5'-AGCCATGAATGAACAGCTTGA-3', SEQ ID NO: 2), TV-F (5'- TCCTTCCTAGCTAATTTCCGT- 3 ', SEQ ID NO: 3), TV-R (5'-CAAGAATGGTGTAACTCGACCT-3 ⁇ SEQ ID NO: 4), no 3 pM target
  • the reaction was carried out using a fluorescence detection amplifier CFX-96, Bio-Rad. Cycling parameters: “hot start” for 3 minutes. at 94 ° C; 45 cycles in the mode of 94 ° C for 10 sec., 60 ° C for 20 sec.
  • duplexes were melted in the range of 25–95 ° ⁇ with a step of 0.5 ° ⁇ and a heating time of 10 seconds at each step. Reading fluorescence was carried out on the ROX channel.
  • Targets NG corresponded to a duplex with a melting point of 51 ° C (Tm1), and the target TV duplex with a melting point of 60 ° C (Tm2) (Fig. 5).
  • NG and TV DNA The detection of NG and TV DNA was carried out on a sample of 315 clinical samples; an example of the obtained melting graphs for a sample carrying NG and TV DNA is shown in Fig. 2B.
  • the 30 ⁇ l reaction mixture contained 50 mM Tris-S04, pH 8.0; 10 mM (NH4) 2S04; 3.5 mM MgCI 2 ; 30 mM KCI; 0.01% Tween-20; 0.25 mM of each dNTP; 3 pcM primers FTO-F (5'-CATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTG-3 ⁇ SEQ ID NO: 13), FTO-R (5'-CCTCCATTTCTGACTGTTAC-3 ⁇ SEQ ID NO: 14), no 3 pcM allele-specific probes FTO-W (5'-ROX- TCGA CTACACTCG 7TTTTG WITH PBX ACBAA ATTC 1111 ITCTAGGTTCCTTGCGACT-3 ', SEQ ID NO: 15), FTO-M (5'-ROX-

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в клинической диагностике in vitro. Для этого предложен способ специфической идентификации последовательностей ДНК - мультиплексный дуплекс- опосредованный анализ (МДА), осуществляемый посредством проведения полимеразной цепной реакции в присутствии зондов, имеющих оригинальную конструкцию (рис. 1). МДА позволяет специфично определять последовательности ДНК, в том числе в мультиплексном формате, с возможностью определения до десяти мишеней в одном канале амплификатора. При проведении МДА достигается высокая степень мультиплексирования с достижением высокой чувствительности и специфичности метода. Изобретение также может быть использовано для определения нуклеотидных полиморфизмов.

Description

СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК
Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицине, и может быть использовано в клинической диагностике для детекции ДНК-мишеней.
Уровень техники
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (Real-Time) за счет возможности проведения количественных оценок, высокой специфичности и чувствительности является одной из широко используемых технологий для решения различных генодиагностических задач. Распространенные схемы детекции на основе Real-Time ПЦР, такие как TaqMan, Molecular Beacon, имеют существенные ограничения по степени мультиплексирования: один канал детектирующего амплификатора - одна мишень, т.е., как правило, одновременно может быть определено не более шести искомых последовательностей (по числу каналов амплификатора). Перспективным направлением развития технологии ПЦР является разработка подходов, позволяющих повысить степень мультиплексирования диагностического теста.
Существует ряд способов для специфического определения искомой последовательности ДНК с использованием зондов, имеющих некомплементарный последовательности-мишени 5'-сегмент и комплементарный последовательности 3'- сегмент, обеспечивающий специфичность.
Например, в патенте US5691142 описывается способ, в котором используется зонд с 5'-сегментом, некомплементарным последовательности-мишени и примыкающий к нему праймер со стороны 5'-сегмента вплотную к З'-сегменту, в результате чего образуется структура, расщепляемая Taq-полимеразой. После отщепления высвободившийся 5'- сегмент гибридизуется с олигонуклеотидом (также входит в состав реакционной смеси), имеющим шпилечную структуру, с образованием структуры, расщепляемой за счет экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. По накоплению расщепленного шпилечного олигонуклеотида определяется положительный сигнал. Недостатком способа является низкая эффективность амплификации сигнала.
В патенте US7381532 описывается способ, в котором также образуется расщепляемая структура в результате взаимодействия праймера и зонда с 5'-сегментом, некомплементарным последовательности-мишени. По наличию сигнала от высвободившегося 5'-сегмента судят о наличии искомой последовательности, при этом детекцию осуществляют за счет системы FRET с двумя метками или же за счет дальнейшей амплификации. В патенте US6893819 описывается способ, в котором осуществляется расщепление зонда(-ов) в процессе полимеризации ДНК с высвобождением некомплементарного последовательности-мишени 5'-сегмента. Недостатком способа является линейное нарастание сигнала, что может в ряде случаев затруднить дифференциацию сигнала от фона.
В случае использования зондов даже с одной флуоресцентной меткой можно добиться дифференциации множества мишеней за счет анализа кривой плавления, тогда как классические схемы детекции, такие как TaqMan™, позволяют определить с использованием одной флуоресцентной метки лишь одну мишень.
В заявке US2008241838 описан способ, в котором осуществляется расщепление зонда в процессе полимеризации ДНК с высвобождением некомплементарного последовательности-мишени 5'-сегмента, несущего флуоресцентную метку. Высвобожденный 5'-сегмент затем гибридизуется с "захватывающим" зондом. Для данного способа требуется, чтобы "захватывающий" зонд имел меньшую длину по сравнению с расщепляемым зондом и был иммобилизован на твердой фазе. Перечисленные ограничения необходимы для снижения вероятности гибридизации нерасщепленного исходного зонда с "захватывающим". Недостатками способа являются необходимость детекции на твердой фазе, что делает невозможным его использование в однофазных системах, таких как ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени.
В патенте RU2566562 описан способ (прототип), для которого реакционная ПЦР смесь в качестве специфических компонентов на одну мишень содержит:
- расщепляемый мишень-специфичный зонд, включающий, помимо специфичного З'-сегмента, некомплементарный последовательности-мишени 5'-сегмент без флуоресцентных меток;
- сигнальный зонд, имеющий комплементарный участок с 5'-сегментом расщепляемого мишень-специфичного зонда, несущий гаситель на 5'-конце и флуорофор во внутреннем положении;
- пару праймеров.
В процессе прохождения ПЦР происходит расщепление мишень-специфичного зонда с высвобождением 5'-сегмента, который гибридизуется на сигнальный зонд, а затем удлиняется на нем за счет полимеразы с образованием дуплекса. При образовании дуплекса одноцепочечный сигнальный зонд расправляется, что приводит к повышению флуоресценции в результате пространственного удаления флуорофора и гасителя, входящих в его состав.
Описан и другой вариант реализации способа, наиболее близкий к заявляемому изобретению, заключающийся в ином расположении меток при том же составе олигонуклеотидов: расщепляемый мишень-специфичный зонд на 5'-конце несет флуорофор, сигнальный зонд несет на 3'- конце гаситель флуоресценции. В процессе прохождения ПЦР происходит расщепление мишень-специфичного зонда с высвобождением 5'-сегмента, несущего флуорофор, который гибридизуется на сигнальный зонд, а затем удлиняется на нем за счет полимеразы с образованием дуплекса, обладающего большей температурой плавления по сравнению с дуплексом мишень-специфичный зонд/сигнальный зонд, что исключает возможность появления ложноположительных результатов. При образовании дуплекса флуорофор высвобожденного 5'-сегмента и гаситель флуоресценции, входящий в состав сигнального зонда, сближаются, что приводит к понижению флуоресценции, регистрируемому детектирующим амплификатором.
После ПЦР проводится плавление продуктов реакции. По наличию дуплекса с определенной температурой плавления можно судить о присутствии соответствующей мишени. Температура плавления соответствующего дуплекса задается размером сигнального зонда, последовательность которого подбирается разработчиком для каждой мишени индивидуально. Степень мультиплексирования (количество детектируемых мишеней в одной пробирке) зависит от количества каналов амплификатора и от количества дуплексов, различающихся по температуре плавления, на каждый канал.
Недостатком способа является энзиматический этап образования дуплекса, так как ограничивает диапазон допустимых температур плавления дуплексов и усложняет в целом систему за счет необходимости оптимизации реакции образования дуплекса в рамках основного протокола ПЦР. Однако, данный способ коммерциализирован компанией Seegene, Южная Корея и на его основе разработана линейка мультиплексных тестов для выявления ряда инфекционных заболеваний человека.
На основе ПЦР в реальном времени разработано и реализуется на рынке множество тестов в мультиплексном формате.
Интерес к мультиплексному анализу обусловлен несколькими факторами - это снижение трудозатрат, увеличение скорости выполнения анализа, экономия реактивов, экономия биоматериала, экономия приборного времени.
Рост интереса к мультиплексному формату можно наблюдать по растущему числу публикаций на тему мультиплексной ПЦР и по увеличению количества выпускаемых тестов в мультиплексном формате на основе ПЦР в реальном времени в линейках производителей тест-систем.
Степень мультиплексирования диагностического теста на основе ПЦР в реальном времени может быть повышена за счет увеличения числа каналов детекции амплификатора, однако эта технология достигла потолка; так, современные амплификаторы имеют не более 7 каналов и существенного увеличения их числа не ожидается. Таким образом, перспективным направлением развития технологии ПЦР является разработка подходов, позволяющих повысить степень мультиплексирования диагностического теста в рамках ограниченного числа каналов детекции, то есть позволяющих определять в одном канале две мишени и более. Раскрытие изобретения
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа специфической идентификации последовательностей ДНК, в том числе для определения нуклеотидных полиморфизмов, на основе ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени, позволяющего идентифицировать более одной мишени в одном канале амплификатора с флуоресцентной детекцией. Разрабатываемый способ представляет собой мультиплексный дуплекс-опосредованный анализ на основе расщепляемых зондов (МДА).
Другой задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка набора на основе МДА для выявления одной или нескольких искомых последовательностей ДНК.
Поставленная задача решается за счет реализации МДА, заключающегося в использовании мишень-специфичного зонда, который расщепляется в процессе ПЦР в присутствии искомой последовательности ДНК (мишени) с высвобождением 5'-сегмента, образующего детектируемые дуплексы на этапе плавления с сигнальным зондом. Каждой мишени соответствует дуплекс с определенной температурой плавления, детектируемый в определенном канале амплификатора, за счет чего и осуществляется дифференциация мишеней. В МДА сокращается количество этапов генерации сигнала по сравнению с прототипной технологией РТОСЕ, что позволяет упростить оптимизацию системы и достичь более высокой степени мультиплексирования за счет расширения диапазона температур плавления для дуплексов.
Более конкретно, решение поставленной задачи осуществляется за счет разработки способа специфической идентификации, по меньшей мере, одной последовательности ДНК, включающего следующие этапы:
а) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), для которой реакционная смесь включает
термостабильный фермент, обладающий 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью,
а также, для выявления каждой из идентифицируемых последовательностей ДНК, т.е. в качестве специфических компонентов на одну мишень (в качественном отношении), включает, по меньшей мере,
одну пару праймеров, один олигонуклеотидный мишень-специфичный зонд, имеющий
З'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку ДНК и содержащий метку, и
5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку,
один олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень- специфичного зонда и содержащий метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на З'-сегменте мишень- специфичного зонда;
при этом в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, расщепляется указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизуется с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
б) проведение плавления реакционной смеси в диапазоне температур, включающем температуру плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень- специфичного зонда и сигнальным зондом, подразумевающее пошаговое изменение температуры реакционной смеси со считыванием флуоресцентного сигнала на каждом шаге, при этом сигнал при плавлении дуплекса генерируется за счет разобщения меток, имеющих перекрывающиеся спектры поглощения и испускания, входящих в состав отщепленного 5'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнального зонда, а нерасщепленный мишень-специфичный зонд образует недетектируемый дуплекс с сигнальным зондом, при плавлении которого сигнал не генерируется, за счет присутствия в его составе двух взаимодействующих меток с перекрывающимися спектрами поглощения и испускания; при этом дифференциация дуплексов, соответствующих идентифицируемым различающимся участкам последовательностей ДНК, осуществляется по двум параметрам - канал детекции и/или температура плавления; при этом возможны следующие варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК:
1 ) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывается со спектром поглощения, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора, 2) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора. В некоторых вариантах воплощения изобретения осуществляют определение от 1 до
10 идентифицируемых последовательностей ДНК в одном канале амплификатора.
В некоторых вариантах воплощения изобретения проведение плавления реакционной смеси осуществляют с шагом от 0,01 до 1 °С.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения проведение плавления реакционной смеси осуществляют с шагом 0,5 °С.
В частных вариантах воплощения изобретения проведение плавления реакционной смеси осуществляют в диапазоне температур от 0 °С до 100 °С.
В некоторых вариантах воплощения изобретения температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, по меньшей мере, для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, ниже температуры плавления праймеров, входящих в реакционную смесь.
В некоторых вариантах воплощения изобретения в качестве флуорофора или репортерного флуорофора используют, по меньшей мере, один из красителей карбоксифлуоресцеин (FAM), 6-карбоксиродамин (R6G), карбокси-Х-родамин (ROX), тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'- диметоксифлуоресцеин (6-JOE), тиадикарбоцианин (Су5™).
В некоторых вариантах воплощения изобретения в качестве гасителя флуоресценции используют гаситель флуоресценции серии BHQ и/или RTQ.
В частных вариантах воплощения изобретения в качестве термостабильного фермента, обладающего 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью, используют Taq ДНК полимеразу.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения сигнальный зонд иммобилизован на твердую фазу.
В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере, двух различающихся последовательностей ДНК, реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
З'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, но содержат одинаковые флуорофоры, и
5'-сегменты которых различаются по температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам З'-сегментов мишень-специфичных зондов, при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют разную температуру плавления, по которой осуществляют дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК.
В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере, двух различающихся последовательностей ДНК реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
З'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК и содержат при этом разные флуорофоры, и 5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора З'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам З'-сегментов соответствующих комплементарных им мишень-специфичных зондов;
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют одинаковую температуру плавления, а дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.
В частных вариантах воплощения изобретения осуществляют специфическую идентификацию, по меньшей мере, одного полиморфизма в последовательности ДНК; в таких вариантах воплощения З'-сегмент мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда состоит из
аллель-детектирующего 5'-фрагмента (S), несущего метку, участок гибридизации которого содержит анализируемый полиморфный сайт, и последовательность которого комплементарна одному аллельному варианту, подлежащему специфической идентификации и З'-фрагмента (D), последовательность которого комплементарна участку ДНК, прилегающему к сайту, содержащему идентифицируемый полиморфизм ,
соединенных линкером, состоящим из, по меньшей мере, 1 -10 нуклеозидмонофосфатов, обеспечивающих раздельную гибридизацию двух фрагментов, при этом по длине З'-сегмент совпадает с участком гибридизации указанной последовательности ДНК, выбранным для идентификации в нем полиморфизма, при этом мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, в случае полной комплементарности его З'-сегмента и указанной последовательности ДНК, в том числе в части 5'-фрагмента (S), соответствующего искомому аллельному варианту полиморфизма, расщепляется указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, что в дальнейшем обеспечивает генерацию сигнала на этапе плавления;
напротив, в случае неполной комплементарности З'-сегмента мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда в части 5'-фрагмента (S) и указанной последовательности ДНК, мишень-специфичный зонд расщепляется указанным ферментом по линкеру L с высвобождением 5'-сегмента, связанного с 5'-фрагментом (S), без разобщения меток, входящих в состав мишень-специфичного зонда, что в дальнейшем на этапе плавления не приводит к генерации сигнала,
при этом возможны следующие варианты сочетания меток:
1 ) 5'-фрагмент (S) З'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'- сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) 5'-фрагмент (S) З'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере, двух полиморфизмов в последовательности ДНК, по одному аллелю для каждого полиморфизма, реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
5'-фрагменты (S) З'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из аллелей, подлежащих специфической идентификации, но содержат одинаковые флуорофоры, и 5'-сегменты которых различаются по температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 5'-фрагментов (S) З'-сегментов мишень- специфичных зондов,
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют разную температуру плавления, по которой осуществляют дифференциацию различающихся идентифицируемых полиморфизмов в последовательности ДНК.
В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере, двух полиморфизмов в последовательности ДНК, по одному аллелю для каждого полиморфизма, реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
5'-фрагменты (S) З'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из аллелей, подлежащих специфической идентификации и содержат при этом разные флуорофоры, и
5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'- сегмента этого же мишень-специфичного зонда,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 5'-фрагментов (S) З'-сегментов соответствующих комплементарных им мишень-специфичных зондов;
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют одинаковую температуру плавления, а дифференциацию различающихся идентифицируемых полиморфизмов в последовательности ДНК осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.
В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере двух аллельных вариантов одного полиморфизма в последовательности ДНК, реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда, 5'-фрагменты (S) З'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из идентифицируемых аллельных вариантов и содержат при этом одинаковые флуорофоры, а З'-фрагменты (D) - идентичны по последовательности, и 5'-сегменты различаются температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора, при этом дифференциацию аллельных вариантов осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.
В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере двух аллельных вариантов одного полиморфизма в последовательности ДНК, реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
5'-фрагменты (S) З'-сегменты каждого из которых комплементарны одному из идентифицируемых аллельных вариантов и содержат при этом разные флуорофоры, а З'-фрагменты (D) - идентичны по последовательности, и
5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'- сегмента этого же мишень-специфичного зонда, при этом по температурам плавления дуплексов осуществляют дифференциацию аллельных вариантов в одном канале амплификатора.
В частных вариантах воплощения линкер L в составе мишень-специфичного зонда состоит из 4-10 инозинмонофосфатов.
Решение поставленной задачи также осуществляется за счет разработки оригинальных зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого предложена пара зондов, состоящая из
олигонуклеотидного мишень-специфичного зонда, имеющего
З'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и
5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом в процессе ПЦР, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку, и олигонуклеотидного сигнального зонда, комплементарного 5'-сегменту мишень- специфичного зонда и содержащего метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на З'-сегменте мишень-специфичного зонда;
выполненных таким образом, что
в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, расщепляется термостабильным ферментом, обладающим 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью, с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизуется с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
при этом возможны следующие варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК:
1) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения, соответственно, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
В некоторых вариантах воплощения изобретения пара зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК в процессе ПЦР характеризуется тем, что температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, по меньшей мере, для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, ниже температуры плавления праймеров, используемых для проведения ПЦР.
В некоторых частных вариантах воплощения сигнальный зонд иммобилизован на твердую фазу.
В частных вариантах воплощения, когда пара зондов применяется для идентификации одного или более полиморфизмов в последовательности ДНК, зонды характеризуются тем, что
З'-сегмент мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда состоит из
аллель-детектирующего 5'-фрагмента (S), несущего метку, участок гибридизации которого содержит анализируемый полиморфный сайт, и последовательность которого комплементарна одному аллельному варианту, подлежащему специфической идентификации и
З'-фрагмента (D), последовательность которого комплементарна участку ДНК, прилегающему к сайту, содержащему идентифицируемый полиморфизм,
соединенных линкером, состоящим из, по меньшей мере, 1 -10 нуклеозидмонофосфатов, обеспечивающих раздельную гибридизацию двух фрагментов,
при этом по длине З'-сегмент совпадает с участком гибридизации идентифицируемой указанной последовательности ДНК, выбранным идентификации в нем полиморфизма,
при этом мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, в случае полной комплементарности его З'-сегмента и указанной последовательности ДНК, в том числе в части 5'-фрагмента (S), соответствующего искомому аллельному варианту полиморфизма, расщепляется ферментом, обладающим 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью, с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, что в дальнейшем обеспечивает генерацию сигнала на этапе плавления;
напротив, в случае неполной комплементарности З'-сегмента мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда в части 5'-фрагмента (S) и указанной последовательности ДНК, мишень-специфичный зонд расщепляется ферментом, обладающим 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью, по линкеру L с высвобождением 5'- сегмента, связанного с 5'-фрагментом (S), без разобщения меток, входящих в состав мишень-специфичного зонда, что в дальнейшем на этапе плавления не приводит к генерации сигнала,
при этом возможны следующие варианты сочетания меток:
1 ) 5'-фрагмент (S) З'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'- сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения, соответственно, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) 5'-фрагмент (S) З'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора. Решение поставленной задачи также осуществляется за счет разработки набора для специфической идентификации, по меньшей мере, одной последовательности ДНК в образце способом, описанным выше; при этом набор включает, по меньшей мере, термостабильный фермент, обладающий 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью,
а также, для выявления каждой из идентифицируемых последовательностей ДНК, по меньшей мере,
одну пару праймеров,
один мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, имеющий
З'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и
5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку,
один олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень- специфичного зонда и содержащий метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на З'-сегменте мишень- специфичного зонда;
при этом зонды выполнены таким образом, что в процессе прохождения ПЦР мишень- специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, способен расщепляться указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизующеготся с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
при этом возможны следующие варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК:
1) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора, 2) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
Предложенный набор характеризуется тем, что при плавлении реакционной смеси, получаемой в результате смешивания компонентов набора, без предварительного проведения ПЦР, дуплексы не детектируются. В частных случаях, эта характеристика набора может быть использована для идентификации набора по изобретению.
В некоторых вариантах воплощения набор включает, по меньшей мере, два различающихся мишень-специфичных зонда,
З'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, но содержат одинаковые флуорофоры, и
5'-сегменты которых содержат одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора, но различаются по температуре плавления так, чтобы обеспечить возможность осуществить дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК по температуре плавления. В некоторых вариантах воплощения набор включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
З'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК и содержат при этом разные флуорофоры так, чтобы обеспечить возможность дифференциации различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК по спектрам испускания флуорофоров, и
5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора З'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда.
При осуществлении настоящего изобретения достигаются следующие технические результаты:
- МДА позволяет специфично определять последовательности ДНК, в том числе в мультиплексном формате, с возможностью определения более чем одной мишени в одном канале амплификатора;
- отсутствие необходимости в проведении стадии энзиматического образования дуплекса;
- для МДА достигается высокая степень мультиплексирования за счет широкого диапазона температур плавления для дуплексов, образуемых сигнальными зондами и отщепляемыми 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, что обеспечивает более высокую степень мультиплексирования по сравнению с прототипной технологией; такое существенное расширение диапазона температур плавления возможно благодаря тому, что при проведении МДА можно использовать дуплексы с температурой плавления существенно ниже температуры плавления праймеров, с достижением высокой чувствительности и специфичности метода;
- МДА позволяет определять различные полиморфизмы в ДНК, в том числе однонуклеотидные полиморфизмы, делеции и инсерции, при этом для проведения такого анализа не требуется введение в систему дополнительного зонда (в отличие от способа- протитипа);
- возможность реализации способа в двух форматах: без иммобилизации сигнального зонда или с его иммобилизацией на твердую фазу;
- разработан набор для проведения специфической идентификации последовательностей ДНК, в том числе для определения нуклеотидных полиморфизмов.т
Подробное раскрытие изобретения
Настоящее изобретение является новым способом специфического определения нуклеотидных последовательностей ДНК, в том числе в мультиплексном формате с последующей реализацией в виде набора.
ДНК, пригодной для проведения анализа с помощью МДА, является образец ДНК, полученный путем экстракции из разнообразного биологического материала, в том числе, но не ограничиваясь, из мазков, слюны, мочи, сыворотки крови, плазмы крови, тканей органов. Для экстракции ДНК могут быть использованы различные методы, в том числе, но не ограничиваясь, на основе спиртового осаждения, на основе сорбции, на основе температурного лизиса, позволяющие получить матрицу, пригодную для ПЦР, кроме того матрица ДНК для проведения анализа может быть получена в результате реакции обратной транскрипции с матрицы РНК, которая может быть также экстрагирована из разнообразного биологического материала, в том числе перечисленными выше методами; или ДНК для анализа может быть получена любыми другими доступными методами.
Краткое описание рисунков
Рис.1. - Принцип мультиплексного дуплекс-опосредованного анализа на основе расщепляемых зондов (МДА) на примере одного из вариантов сочетания меток.
А - Состав системы МДА:
(1 ) - расщепляемый мишень-специфичный зонд, включающий, помимо специфичного З'-сегмента (а), несущего гаситель (Q), некомплементарный ДНК-мишени 5'- сегмент (β), несущий флуорофор (F),
(2) - сигнальный зонд, комплементарный β и несущий в своем составе гаситель Q,
(3) - пара праймеров, ограничивающих амплифицируемый фрагмент, в рамках которого гибридизуется мишень-специфичный зонд.
Б - Расщепление мишень-специфичного зонда с разобщением флуорофора (F) и гасителя (Q) в его составе за счет экзонуклеазной активности Taq полимеразы. В - Плавление продуктов реакции - ступенчатый нагрев реакционной смеси с 25°С до 95°С: (4) - дуплекс, образуемый в результате расщепления мишень-специфичного зонда, дает флуоресцентный сигнал после его плавления,
(5) - дуплекс, образуемый нерасщепленным мишень-специфичным зондом и сигнальным зондом, не дает сигнала после его плавления. Рис.2. - Дифференциация двух мишеней в одном канале детектирующего амплификатора.
А - МДА для двух мишеней подразумевает использование двух расщепляемых зондов (М1) и (М2), включающих различные специфичные З'-сегменты (а1 и а2, соответственно) и некомплементарные ДНК-мишени 5'-сегменты (β1 и β2, соответственно), а также двух сигнальных зондов (Ζ1 ) и (Ζ2). В случае присутствия в анализируемом образце обеих мишеней образуются соответствующие им детектируемые дуплексы с различными температурами плавления (Тт1 и Тт2).
Б - График отрицательной производной флуоресценции по температуре кривой плавления для образца, содержащего две анализируемые мишени. Каждой из мишеней соответствует дуплекс с определенной температурой плавления (Тт1 и Тт2, соответственно). Приведен пример одновременного качественного определения ДНК Mycoplasma hominis (Mh) и Mycoplasma genitalium (Mg).
Рис. 3. - Принцип дифференциации мишеней по температуре плавления дуплексов и флуорофору.
А - дифференциация 30 мишеней по 6 температурам плавления дуплексов (Т1-Т6) и 5 флуорофорам (F1 -F5).
Б - график кривых плавления после математической обработки, пример дифференциации 6 мишеней по температурам плавления дуплексов (Т1 -Т6) в канале флуорофора F1 .
Комбинирование 5 флуорофоров (F1 -F5) и 6 температур плавления дуплексов (Т1-Т6) позволяет дифференцировать 30 мишеней в одной пробирке.
Рис. 4. - Принципиальная схема определения полиморфизмов на основе МДА на примере одного из вариантов сочетания меток.
А - Состав системы для определения полиморфизмов на основе МДА
(1 ) - расщепляемый мишень-специфичный зонд, включающий, помимо специфичного З'-сегмента (а), некомплементарный последовательности-мишени 5'-сегмент (β), несущий флуорофор F; З'-сегмент (а) разбит на аллель- детектирующий фрагмент (S), несущий гаситель флуоресценции Q и З'-фрагмент (D), соединенные через линкер из нуклеозидмонофосфатов (L); в пределах фрагмента S черным квадратом отмечен полиморфный сайт,
(2) - сигнальный зонд, комплементарный β и несущий в своем составе гаситель Q, (3) - пара праймеров, ограничивающих амплифицируемый фрагмент, в рамках которого гибридизуется мишень-специфичный зонд.
Б - Расщепление мишень-специфичного зонда с разобщением флуорофора (F) и гасителя (Q) в его составе при полной комплементарности аллель-детектирующего фрагмента (S) и матрицы (ДНК-мишени) за счет экзонуклеазной активности Taq полимеразы;
В - Расщепление мишень-специфичного зонда по линкеру (L) без разобщения флуорофора (F) и гасителя (Q) в его составе при наличии мисматча между аллель- детектирующим фрагментом (S) и матрицей (ДНК-мишенью) за счет экзонуклеазной активности Taq полимеразы;
Г - Плавление продуктов реакции - ступенчатый нагрев реакционной смеси с 25°С до 95°С:
(4) - дуплекс, образуемый в случае варианта Б, дает флуоресцентный сигнал,
(5) - дуплекс, образуемый нерасщепленным мишень-специфичным зондом и сигнальным зондом, не дает сигнал,
(6) - дуплекс, образуемый в случае варианта В, не дает флуоресцентный сигнал.
Рис. 5. - результаты МДА по выявлению ДНК Neisseria gonorrhoeae (NG) и Trichomonas vaginalis (TV) в следующих образцах:
1 - положительный образец на NG,
2 - положительный образец на TV,
3 - положительный образец на NG и TV,
4 - отрицательный контрольный образец.
Рис. 6. - результаты МДА по определению полиморфизма RS9939609 (Т/А), расположенного в гене FTO человека в следующих образцах:
1 - гомозигота дикого типа (W/W),
2 - мутантная гомозигота (ММ),
3 - гетерозигота W/M,
4 - отрицательный контрольный образец. Предлагаемый способ специфической идентификации последовательностей ДНК- мишеней - мультиплексный дуплекс-опосредованный анализ (МДА) осуществляют посредством проведения полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в реальном времени в присутствии мишень-специфичных зондов, имеющих некомплементарные последовательности ДНК-мишени 5'-сегменты, и соответствующих им сигнальных зондов, комплементарных 5'-сегментам (Рис. 1А). Мишень-специфичный зонд в 5'-сегменте и З'-сегменте несет по одной метке, сигнальный зонд имеет в своем составе одну метку. В процессе прохождения ПЦР в присутствии искомой последовательности ДНК-мишени специфичный зонд расщепляется за счет 5'— >3' экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы с высвобождением 5'-сегмента (Рис. 1 Б). После ПЦР проводится плавление продуктов реакции, при этом детекция осуществляется за счет сближения или разобщения меток, входящих в состав 5'-сегмента мишень- специфичного зонда и сигнального зонда. Нерасщепленный мишень-специфичный зонд, за счет присутствия в его составе двух взаимодействующих меток (и расположенных так, чтобы обеспечивалось это взаимодействие), не образует детектируемых дуплексов с сигнальным зондом (Рис.1 В (5)). По наличию дуплекса, образуемого высвобожденным 5'- сегментом и сигнальным зондом, с определенной температурой плавления (предварительно задается в процессе разработки с использованием методов и приемов, хорошо известных специалистам в данной области), можно судить о присутствии соответствующей мишени. Степень мультиплексирования (количество детектируемых мишеней в одной пробирке) зависит от количества каналов используемого амплификатора и от количества дуплексов, различающихся по температуре плавления, на каждый канал амплификатора. Количество дуплексов на канал зависит от подобранных базовых искусственных олигонуклеотидов - пар отщепляемых 5'-сегментов и сигнальных зондов к ним, при этом (в рамках одного канала) указанные пары должны отличаться по температурам образуемых ими дуплексов не менее чем на 4°С, более предпочтительно, не менее чем на 5°С для надежной дифференциации мишеней. Например, для 5-ти канального амплификатора в одной пробирке может быть определено 30 мишеней, при условии определения 6-ти мишеней в одном канале (Рис. 3). Использование изобретения позволяет с высокой специфичностью и чувствительностью детектировать разнообразные нуклеотидные последовательности в мультиплексном формате даже в случае использования амплификатора с флуоресцентной детекцией, имеющего всего один флуоресцентный канал.
Реакционная смесь для ПЦР в качестве специфических компонентов на одну мишень содержит:
- расщепляемый мишень-специфичный зонд (Рис. 1А (1)), включающий, помимо специфичного З'-сегмента (Рис. 1А а), некомплементарный последовательности-мишени 5'-сегмент (Рис. 1А β), при этом оба сегмента несут метку;
- сигнальный зонд, комплементарный негибридизующимуся на матрицу 5'-сегменту расщепляемого мишень-специфичного зонда, несущий метку и блокированный с З'-конца (Рис. 1А (2));
- пару праймеров, ограничивающих амплифицируемый фрагмент, в рамках которого гибридизуется мишень-специфичный зонд (Рис. 1А (3)).
Предпочтительно, зонды и праймеры представляют собой молекулы одноцепочечных дезоксирибо(олиго)нуклеотидов. Зонды и праймеры, используемые в данном изобретении, преимущественно, содержат модифицированные или немодифицированные нуклеозидмонофосфаты. В некоторых случаях зонды и праймеры также могут включать и рибонуклеотиды.
В мишень-специфичном и сигнальном зондах (в случае введения внутренней метки (поскольку метки необязательно располагаются на конце зондов)) блокировка от удлинения З'-конца может быть достигнута традиционными методами. Например, блокирование можно осуществить путем добавления к З'-гидроксильной группе последнего нуклеотида химической группировки, такой как биотин, фосфатная группа, алкильная группа, ненуклеотидный линкер, фосфоротионат или алкандиол. Альтернативно, блокирование может быть выполнено посредством удаления З'- гидроксильной группы последнего нуклеотида или путем использования нуклеотида, лишенного З'-гидроксильной группы, такого как дидезоксинуклеотид.
В зондах возможны следующие сочетания меток:
1 . мишень-специфичный зонд в 5'-сегменте несет флуорофор, а в З'-сегменте - гаситель флуоресценции, спектр поглощения которого перекрывает спектр испускания этого флуорофора, при этом расстояние между метками должно быть таким, чтобы обеспечивалось гашение флуоресценции; в состав сигнального зонда входит гаситель флуоресценции, спектр поглощения которого также перекрывает спектр испускания этого флуорофора (во всей системе гаситель флуоресценции может быть заменен на репортерный флуорофор);
2. мишень-специфичный зонд в 5'-сегменте несет гаситель флуоресценции, а в З'-сегменте - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения этого гасителя флуоресценции, при этом расстояние между метками должно быть таким, чтобы обеспечивалось гашение флуоресценции; в состав сигнального зонда входит флуорофор, для которого спектр испускания также перекрывает спектр поглощения этого гасителя флуоресценции (во всей системе гаситель флуоресценции может быть заменен на репортерный флуорофор).
На примере первого сочетания меток (мишень-специфичный зонд в 5'-сегменте несет флуорофор, а в З'-сегменте - гаситель флуоресценции, в состав сигнального зонда входит гаситель флуоресценции) рассмотрим принцип работы МДА.
На первом этапе, в процессе прохождения полимеразной цепной реакции происходит амплификация фрагмента, ограниченного праймерами (Рис. 1А (3)), при этом мишень-специфичный зонд (Рис. 1А (1)), в случае присутствия в образце ДНК-мишени, гибридизуется в рамках ампликона и расщепляется на матрице за счет экзонуклеазной активности фермента, в результате чего негибридизующийся на матрицу 5'-сегмент вместе с флуорофором отщепляется, при этом флуорофор и гаситель З'-сегмента разобщаются (Рис. 1 Б). Для проведения реакции подходит любой термостабильный фермент, обладающий 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной (flap- эндонуклеазной) активностью, например, Taq ДНК полимераза.
На втором этапе проводится плавление дуплексов (Рис. 1 В), образуемых отщепленным 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом. При 25°С все дуплексы находятся в гибридизованном состоянии, таким образом, флуорофор и гаситель пространственно сближены, поэтому величина регистрируемого флуоресцентного сигнала минимальна. Начиная с 25°С, температуру реакционной смеси повышают до 95°С. При постепенном нагревании реакционной смеси дуплексы разрушаются за счет разделения цепей, при этом флуорофор и гаситель также разобщаются, что приводит к повышению флуоресценции, в случае, если мишень- специфичный зонд гибрид изовался на матрицу (в случае присутствия в образце ДНК- мишени) (рис.1 В (4) внизу)), которую фиксирует амплификатор с детектирующей системой в режиме реального времени. Нерасщепленный мишень-специфичный зонд, за счет присутствия в его составе и флуорофора, и гасителя не образует детектируемых дуплексов с сигнальным зондом (рис.1 В (5) внизу). Плавление может проводиться и в обратном направлении, т.е. с понижением температуры до 25°С, начиная с 95°С, при этом конечный результат будет тем же. В результате обработки кривых плавления с помощью программного обеспечения амплификатора, производится построение графиков зависимости производной флуоресценции от температуры, определяются температуры плавления (Тт) дуплексов. Тт дуплекса зависит от длины и последовательности сигнального зонда, которая, в свою очередь, задается разработчиком. В одном канале амплификатора может быть определено несколько мишеней - по числу различаемых по Тт дуплексов (Рис. 2А). Дискриминация мишеней осуществляется за счет использования систем с различными по длине и последовательности сигнальными зондами (комплементарными негибридизующимся на матрицу 5'-сегментам расщепляемых зондов), и, следовательно, отличающимися по Тт образуемых ими дуплексов (Рис. 2Б). Поскольку детектируемый дуплекс образуется только в случае расщепления мишень-специфичного зонда на матрице, его выявление свидетельствует о присутствии в образце искомой последовательности ДНК. Таким образом, каждой мишени соответствует комбинация флуорофора и дуплекса с определенной температурой плавления (Рис. 4). На Рис. 2Б приведен пример с определением двух ДНК-мишеней в одном канале, дискриминация которых осуществляется за счет различающихся по последовательности 5'-сегментов мишень- специфичных зондов (Рис. 2А β1 и β2) и, соответственно, по температуре плавления образуемых с сигнальными зондами дуплексов (Рис. 2 Tm1 и Тт2).
Принцип дифференциации мишеней по температуре плавления дуплексов и флуорофору приведен на Рис.ЗА. В качестве примера приведена дифференциация 30 мишеней по 6 температурам плавления дуплексов (Т1 -Т6) и 5 флуорофорам (F1 -F5) (Рис. ЗА), а также график кривых плавления после математической обработки демонстрирующий дифференциацию 6 мишеней по температурам плавления дуплексов (Т1-Т6) в канале флуорофора F1 (Рис. ЗБ).
Заявляемое изобретение может быть реализовано, в том числе на твердой фазе, в таком случае, сигнальный зонд должен быть иммобилизован на твердую фазу.
Принцип МДА подходит для определения однонуклеотидных полиморфизмов, инсерций и делеций. Для этого требуются следующие модификации структуры мишень- специфичного зонда: во-первых, З'-сегмент необходимо разбить на аллель- детектирующий фрагмент (S) и З'-фрагмент (D), при этом соединить их через линкер из нуклеозидмонофосфатов (L), во-вторых, метку ввести в пределах фрагмента S (Рис. 4А). Аллель-детектирующий фрагмент располагается с 5'-конца З'-сегмента мишень- специфичного зонда и подбирается так чтобы искомый полиморфизм находился в пределах участка его гибридизации, за ним с З'-конца следует линкер, из 3-10 нуклеозидмонофосфатов, например, пяти инозинмонофосфатов, который далее соединяется с З'-фрагментом, обеспечивающим надежную гибридизацию зонда на матрице. Известно, что инозинмонофосфат образует относительно слабые связи с другими основаниями по сравнению с каноническими уотсон-криковскими взаимодействиями. Предположительно, в условиях гибридизации инозиновый линкер образует пузырьковую структуру, таким образом обеспечивая лучшее функциональное разделение двух фрагментов З'-сегмента мишень-специфичного зонда. Фрагменты S и D подбираются таким образом, чтобы температура отжига S-фрагмента была на 15-20°С ниже температуры отжига D-фрагмента. Более длинный D-фрагмент инициирует гибридизацию зонда в условиях проведения ПЦР и обеспечивает точное позиционирование аллель-детектирующего фрагмента напротив участка его гибридизации. Специфичность выявления полиморфизма определяется коротким S- фрагментом, можно подобрать условия, при которых его гибридизация в условиях ПЦР происходит только с целевой последовательностью без мисматчей. При полном соответствии аллель-детектирующего фрагмента и матрицы в условиях ПЦР происходит его гибридизация, с последующим отщеплением 5'-сегмента мишень-специфичного зонда с разобщением флуорофора и гасителя (Рис 4Б) и образованием детектируемого дуплекса на этапе плавления (Рис. 4Г). Напротив, при не полном соответствии аллель- детектирующего фрагмента и матрицы в условиях ПЦР не происходит его гибридизация, зонд при этом расщепляется без разобщения флуорофора и гасителя (Рис. 4В), соответственно, детектируемый на этапе плавления дуплекс не образуется (Рис. 4Г). Нерасщепленный мишень-специфичный также не дает детектируемого на этапе плавления дуплекса (Рис. 4Г). В предлагаемом способе принципиально изменена схема определения однонуклеотидных и других полиморфизмов относительно прототипной технологии. В МДА дифференциация аллельных вариантов реализуется на принципе гибридизации, тогда как в прототипном способе - на принципе специфического удлинения олигонуклеотида на матрице. Для специфического удлинения олигонуклеотида на матрице в прототипном способе предложено использовать технологию PNA-Mediated PCR Clamping, что подразумевает введение в систему дополнительного зонда на основе PNA - пептидо-нуклеиновой кислоты, блокирующего неспецифическую амплификацию при наличии мисматча на З'-конце отщепляемого 5'-сегмента мишень-специфичного зонда. Использование дополнительного зонда приводит к усложнению и удорожанию прототипного решения для определения полиморфизмов.
Таким образом, предлагаемое решение отличается от прототипа оригинальным расположением флуоресцентных меток в составе расщепляемого зонда и отсутствием этапа энзиматического образования дуплекса, что значительно упрощает анализ и повышает его эффективность за счет исключения кинетики реакции образования дуплекса. Кроме того, предлагаемая схема детекции позволяет подбирать дуплексы в широком диапазоне температур, начиная с 35°С, тогда как в прототипной технологии температура плавления дуплекса ограничена снизу температурой плавления отщепляемого сегмента. Расширение диапазона температур плавления дуплексов для предлагаемого решения позволяет увеличить степень мультиплексирования по сравнению с прототипной технологией в 1 ,5-2 раза. Так, при проведении ПЦР, температура отжига праймеров (Тт) обычно лежит в диапазоне 55-65°С, соответственно, для реализации прототипной технологии отщепляемый сегмент мишень-специфичного зонда должен иметь температуру плавления в указанных пределах, чтобы было обеспечено его удлинение на сигнальном зонде в условиях проведения ПЦР. Образуемый дуплекс всегда имеет большую температуру плавления по сравнению с отщепляемым сегментом, за счет его энзиматического образования. Отличие температуры плавления отщепляемого сегмента и образуемого дуплекса должно быть не менее 4°С, более предпочтительно, не менее 5°С для надежной дифференциации сигнала от дуплекса, образуемого нерасщепленным мишень-специфичным зондом и сигнальным зондом (особенно важно для вариантов реализации технологии с меченым отщепляемым сегментом). В итоге, для прототипной технологии диапазон образуемых дуплексов ограничен снизу Тт+5, где Тт - температура плавления праймеров, а для предлагаемого решения такого ограничения нет
В прототипной технологии во время проведения ПЦР отщепляются 5'-сегменты мишень-специфичных зондов, что приводит к образованию большого числа праймирующих одноцепочечных олигонуклеотидов с высокой температурой плавления (не ниже Тт праймеров), которые, в свою очередь, могут неспецифично гибридизоваться и удлиняться в условиях ПЦР с мишень-специфичными праймерами и между собой. Увеличение числа праймирующих олигонуклеотидов с высокими Тт в процессе ПЦР существенно усложняет оптимизацию реакции за счет необходимости исключения интерференции отщепляемых сегментов и мишень-специфичных систем. Напротив, при реализации предлагаемого решения можно подобрать последовательности сигнальных зондов/отщепляемых 5'-сегментов с температурами плавления значительно ниже Тт отжига праймеров, а это существенно снижает вероятность неспецифической гибридизации и удлинения образующихся в процессе реакции одноцепочечных праймирующих олигонуклеотидов, что может обеспечить более высокую чувствительность предлагаемого решения относительно прототипной технологии.
В другом аспекте данного изобретения предложен набор для специфического определения последовательностей ДНК. В состав набора в качестве специфических компонентов на одну мишень входят:
- расщепляемый мишень-специфичный зонд (Рис. 1А (1)), включающий, помимо специфичного З'-сегмента (Рис. 1 а), некомплементарный последовательности-мишени 5'- сегмент (Рис. 1 β), при этом оба сегмента несут метку;
- сигнальный зонд, комплементарный негибридизующимуся на матрицу 5'-сегменту расщепляемого мишень-специфичного зонда, несущий метку и блокированный с З'-конца (Рис. 1А (2));
- пара праймеров, ограничивающих амплифицируемый фрагмент, в рамках которого гибридизуется мишень-специфичный зонд (Рис. 1А (3))
в необходимых для проведения анализа количествах.
Каждый набор, в зависимости от количества различных мишеней, для определения которых он предназначен, содержит необходимое количество различных специфических компонентов.
Помимо этого, в набор также входят неспецифические компоненты, необходимые для проведения анализа, состав которых понятен для специалистов в данной области, и может различаться в зависимости от особенностей проведения анализа. К таким компонентам набора относятся, в частности, но не ограничиваясь, термостабильная ДНК- полимераза, обладающая 5'— >3' экзонуклеазной активностью, дезоксирибонуклеотид- трифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), ионы Mg2+, буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции и др.
Набор обладает следующим свойством: без предварительного проведения ПЦР не детектируются дуплексы, соответствующие ДНК-мишеням, так как нерасщепленный мишень-специфичный зонд образует недетектируемый дуплекс с сигнальным зондом, при плавлении которого сигнал не генерируется, за счет присутствия в его составе двух взаимодействующих меток с перекрывающимися спектрами поглощения и испускания. Поскольку набор по данному изобретению составлен для осуществления описанного выше способа детекции по настоящему изобретению (МДА), общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания. Термины и определения
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Под ДНК-мишенью (идентифицируемой ДНК, искомой ДНК, определяемой ДНК, ДНК-матрицей) в данном документе подразумевается ДНК или фрагмент ДНК, который выявляют (стремятся выявить) в исследуемом образце.
В качестве флуорофора, репортерного флуорофора или гасителя флуоресценции в данном изобретении могут быть использованы, но не ограничиваясь ими, различные флуоресцентные красители, такие как: Су2™ (506), YO-PR0™-1 (509), YOYO™-1 (509), кальцеин (517), FITC (флуоресцеинизотиоцианат) (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), родамин 1 10 (520), Oregon Green™ (орегон зеленый) 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (родаминовый зеленый) (527), родамин 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PR0™-1 (533), TOTOI (533), JOE (2',7'-диметокси-4',5'-дихлорофлуоресцеин) (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (тетраметилродамин-изотиоцианат) (572), Magnesium Orange™ (575), фикоэритрин R&B (575), родамин-фаллоидин (575), Calcium Orange™ (576), пиронин У (580), родамин В (580), TAMRA (тетраметилродамин) (582), Rhodamine Red™ (родамин красный) (590), Су3.5™ (596), ROX (6-карбокси-Х-родамин) (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), техасский красный (615), нильский красный (628), YO-PR0™-3 (631 ), YOYO™-3 (631 ), R-фикоцианин (642), С-фикоцианин (648), TO-PR0™-3 (660), ТОТОЗ (660), DiD DilC(5) (665), Су5™ (670), тиадикарбоцианин (671) и Су5.5 (694), HEX (556), ТЕТ (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), РАМ (карбоксифлуоресцеин) (520), флуоресцеин (520), флуоресцеин-СЗ (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) и Quasar 705 (610). Числа в скобках представляют собой длину волны, соответствующую максимуму излучения, в нанометрах. Подходящие пары флуорофор- гаситель описаны в ряде публикаций, которые указаны ниже: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971 ); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New У ork, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971 ); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Pluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; патенты США N°N°3996345 и 43517.
Стоит отметить, что в настоящем изобретении может быть использована нефлуоресцентная "темновая" молекула-гаситель, способная гасить флуоресценцию в широком диапазоне длин волн или на конкретной длине волны. Примерами таких гасителей являются BHQ (Black Hole Quencher 1) и DABCYL (4-((4- (диметиламино)фенил)-азо) бензойная кислота). Термин "репортерный флуорофор" в данном описании используется для FRET-меток (Fluorescence Resonance Energy Transfer), используемых в качестве акцептора в парах донор-акцептор, для которого флуоресценция может измеряться отдельно на соответствующей длине волны. Если измерение флуоресценции не осуществляется на длине волны акцептора, то репортерный флуорофор можно считать гасителем. Например, в качестве флуорофора используют флуоресцентный краситель, а в качестве гасителя - родаминовый краситель.
Меченые олигонуклеотидные зонды синтезируют путем химического присоединения флуорофора (гасителя или репортерного флуорофора) к олигонуклеотидам, последовательности которых подобраны в соответствии с требованиями метода. При создании зонда по данному изобретению флуоресцентная метка может присоединяться как к крайним, так и к внутренним сайтам сигнального зонда и сегментам мишень-специфичного зонда. Для идентификации полиморфизмов в последовательности ДНК флуоресцентная метка З'-сегмента мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда присоединяется к аллель-детектирующему фрагменту (S) (см. Рис.4). При этом расстояние между метками, входящими в сегменты одного мишень- специфичного зонда, а также расстояние между метками дуплекса, образуемого 5'- сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, должно быть таким, чтобы обеспечивалось гашение флуоресценции.
Подходящей ДНК-полимеразой, обладающей 5'— >3' экзонуклеазной активностью, в данном изобретении является термостабильная ДНК-полимераза, полученная из ряда бактериальных видов, включая Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritime, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus и Aquifex aeolieus. Наиболее предпочтительно, чтобы для реализации данного изобретения использовалась Taq полимераза.
Под реакционной смесью в контексте данного изобретения понимают совокупность компонентов реакции, необходимых для проведения МДА, как в виде отдельных компонентов набора, так и в виде смеси, полученной в результате объединения компонентов набора.
Нижеследующие примеры приведены в целях иллюстрирования способа согласно настоящему изобретению и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Примеры
ПРИМЕР 1
Оценка применимости мультиплексного дуплекс-опосредованного анализа на основе расщепляемых зондов (МДА). Оценку проводили в отношении того, позволяет ли новый подход, во-первых, обеспечить специфичный хорошо детектируемый сигнал от мишени и во-вторых, возможно ли в одном канале одновременно выявлять и дифференцировать как минимум 2 мишени. Для МДА проверялось два варианта сочетания меток в зондах:
1 . мишень-специфичный зонд в 5'-сегменте несет флуорофор, а в З'-сегменте - гаситель флуоресценции, в состав сигнального зонда входит гаситель флуоресценции;
2. мишень-специфичный зонд в 5'-сегменте несет гаситель флуоресценции, а в З'-сегменте флуорофор, в состав сигнального зонда входит флуорофор.
Пример 1.1 .
Одновременное выявление ДНК Neisseria gonorrhoeae (NG) и Trichomonas vaginalis (TV) с использованием амплификатора, имеющего один канал для флуоресцентной детекции. На первом этапе была проведена ПЦР. Реакционная смесь объемом 30 мкп содержала 50 mM Tris-S04, рН 8,0; 10 тМ (NH4)2S04; 3,5тМ MgCI2; 30 тМ KCI; 0,01 % Tween-20; по 0,25 тМ каждого dNTP; по 3 рМ праймеров NG-F (5'- GTATGGTTTCAAG ACGCTTCAC-3' , SEQ ID NO: 1 ), NG-R (5'- AGCCATGAATGAACAGCTTGA-3', SEQ ID NO: 2), TV-F (5'-TCCTTCCTAGCTAATTTCCGT- 3', SEQ ID NO: 3), TV-R (5'-CAAGAATGGTGTAACTCGACCT-3\ SEQ ID NO: 4), no 3 pM мишень-специфичных зондов NG-Z (5'-ROX-TCGACTACACTCGnJJJ(J- BHQ2)CCTTGCAGTTAGGCTTCTCCGTCT-3\ SEQ ID NO: 5), TV-Z (5'-ROX-AC7C7y4CGAC7CG7CA7CGTTTA(T-BHQ2)GGTCGCCCTCGGAGTCTTTGAATCG-3', SEQ ID NO: 6), no 3 pM сигнальных зондов ZS2 5'-ACGAGTGTAGTCGA-BHQ2-3' (SEQ ID NO: 7), ZS3 5'-CGATGACGAGTCGTAGAGT-BHQ2-3' (SEQ ID NO: 8); 2,5 e.a. ДНК-полимеразы в комплексе с антителами к ее активному центру (TaqAB полимераза производства ООО «Компания Алкор-Био») и 5 мкл ДНК, экстрагированной из клинического образца с помощью набора «Экстра-ДНК-Био» производства ООО «Компания Алкор-Био».
В последовательностях зондов курсивом выделены участки мишень-специфичных зондов, с которыми гибридизуются сигнальные зонды; жирным шрифтом выделены мишень-специфичные З'-сегменты, гибридизующиеся с целевой ДНК.
Реакцию проводили с использованием амплификатора с флуоресцентной детекцией CFX-96, Bio-Rad. Параметры циклирования: «горячий старт» в течение 3 мин. при 94°С; 45 циклов в режиме 94°С в течении 10 сек., 60°С в течении 20 сек.
На втором этапе было проведено плавление дуплексов в диапазоне 25-95°С с шагом 0,5°С и продолжительностью прогрева на каждом шаге 10 сек. Считывание флуоресценции проводили по каналу ROX.
В результате обработки кривых плавления с помощью программного обеспечения амплификатора, производилось построение графиков зависимости производной флуоресценции от температуры с последующим определением температур плавления дуплексов. Мишени NG соответствовал дуплекс с температурой плавления 51 °С (Tm1), а мишени TV дуплекс с температурой плавления 60°С (Тт2) (Рис. 5).
Выявление ДНК NG и TV проводили на выборке из 315 клинических образцов, пример полученных графиков плавления для образца, несущего ДНК NG и TV, приведен на Рис. 2Б.
Из приведенных данных на Рис. 5 следует, что при наличии в образце одной мишени TV или NG регистрируется только соответствующий пик, а при отсутствии в образце искомой ДНК (отрицательный контроль) никаких пиков не регистрируется; все это свидетельствует о специфичности сигнала. При наличии в образце ДНК и TV, и NG регистрируется два хорошо различимых пика, соответствующих искомым мишеням, что подтверждает возможность одновременной детекции двух мишеней в одном канале амплификатора. Кроме того, показана принципиальная возможность использования дуплексов с температурой плавления существенно ниже температуры плавления праймеров: в приведенном примере температура плавления праймеров около 60°С, тогда как температура плавления дуплекса для NG на ~15°С ниже. Последнее указывает на расширение диапазона температур плавления для дуплексов по сравнению с прототипной технологией.
Пример 1 .2.
Отличается от 1.1. тем что был использован второй вариант сочетания меток в зондах, соответственно, были использованы следующие зонды:
NG-Z 5'-ВН02-6 С7 С С7С676ТТТТ(Т-РОХ)ССТТССАСТТАСССТТСТСССТСТ-3'
(SEQ ID NO: 9), TV-Z 5'-ВН02-6 7С6 С7С67С С6ТТТА(Т-РОХ)ССТСССССТСССАСТСТТТС AATCG-3' (SEQ ID NO: 10), ZS2 5'- CACGAGTGTAGTC -ROX-3' (SEQ ID NO: 1 1 ),
ZS3 5'- CGTGACGAGTCGATC -ROX-3' (SEQ ID NO: 12).
В последовательностях зондов курсивом выделены участки мишень-специфичных зондов, с которыми гибридизуются сигнальные зонды; жирным шрифтом выделены мишень-специфичные З'-сегменты, гибридизующиеся с целевой ДНК.
Полученные результаты полностью совпали с данными, полученными в эксперименте, описанному в Примере 1 .1 ., что подтверждает взаимозаменяемость двух вариантов сочетания меток в зондах. ПРИМЕР 2
Оценка применимости МДА для определения полиморфизмов (рис. 4) на примере RS9939609 (Т/А), расположенного в гене FTO человека (рис. 6). В анализ были взяты 4 образца: гомозигота дикого типа (Т/Т), мутантная гомозигота (А/А), гетерозигота (Т/А) и отрицательный контроль. Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 50 мМ Tris-S04, рН 8,0; 10 мМ (NH4)2S04; 3,5 мМ MgCI2; 30 мМ KCI ; 0,01 % Tween-20; по 0,25 мМ каждого dNTP; по 3 пкМ праймеров FTO-F (5'-CATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTG-3\ SEQ ID NO: 13), FTO-R (5'-CCTCCATTTCTGACTGTTAC-3\ SEQ ID NO: 14), no 3 пкМ аллель- специфичных зондов FTO-W (5'-ROX- TCGA CTACACTCG 7TTTTG С АТС ACBAA ATTC 1111 ITCTAGGTTCCTTGCGACT-3', SEQ ID NO: 15), FTO-M (5'-ROX-
GA TCGACTCGTCACGJJJGAAJJJRGJGAJGCM 1111 ATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAA -3', SEQ ID NO: 16), no 3 пкМ сигнальных зондов ZS2 5'-CACGAGTGTAGTC-BHQ2-3' (SEQ ID NO: 1 1 ), ZS3 5'-CGTGACGAGTCGATC-BHQ2-3' (SEQ ID NO: 12); 2,5 e.a. ДНК- полимеразы в комплексе с антителами к ее активному центру (Taq АВ полимераза производства ООО «Компания Алкор-Био») и 5 мкл ДНК, экстрагированной из клинического образца с помощью набора «Экстра-ДНК-Био» производства ООО «Компания Алкор-Био». Реакцию проводили с использованием амплификатора с флуоресцентной детекцией CFX-96, Bio-Rad. Параметры циклирования: «горячий старт» в течение 3 мин. при 94°С; 45 циклов в режиме 94°С в течение 10 сек., 60°С в течение 20 сек. На втором этапе было проведено плавление дуплексов в диапазоне 25-95°С с шагом 0,5°С и продолжительностью прогрева на каждом шаге 10 сек. Считывание флуоресценции проводили по каналу ROX. В последовательностях зондов курсивом выделены участки мишень-специфичных зондов, с которыми гибридизуются сигнальные зонды; жирным шрифтом выделены З'-фрагменты (D), аллель-детектирующие фрагменты (S) выделены подчеркиванием, в рамках S черным фоном отмечен полиморфный сайт, линкер - 5 инозинмонофосфатов (I) . В результате обработки кривых плавления с помощью программного обеспечения амплификатора производилось построение графиков зависимости производной флуоресценции от температуры с последующим определением температур плавления дуплексов. Аллелю дикого типа (W) соответствует дуплекс с температурой плавления 44,5°С, а мутантному аллелю (М) - дуплекс с температурой плавления 54,5°С (рис. 6).
Из приведенных данных на Рис.6 следует, что при наличии в образце гомозиготы (W или М) регистрируется только соответствующий пик, а при отсутствии в образце искомой ДНК (отрицательный контроль) никаких пиков не регистрируется; все это свидетельствует о специфичности сигнала. При наличии в образце гетерозиготы (W/M) в образце регистрируется два хорошо различимых пика, соответствующих искомым аллельным вариантам. Таким образом, МДА подходит для определения полиморфизмов.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1 . Способ специфической идентификации, по меньшей мере, одной последовательности ДНК, включающий следующие этапы:
а) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), для которой реакционная смесь включает
термостабильный фермент, обладающий 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью,
а также, для выявления каждой из идентифицируемых последовательностей ДНК включает, по меньшей мере,
одну пару праймеров,
один олигонуклеотидный мишень-специфичный зонд, имеющий
З'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку ДНК и содержащий метку, и
5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку,
один олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень- специфичного зонда и содержащий метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на З'-сегменте мишень- специфичного зонда;
при этом в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, расщепляется указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизуется с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
б) проведение плавления реакционной смеси в диапазоне температур, включающем температуру плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень- специфичного зонда и сигнальным зондом, подразумевающее пошаговое изменение температуры реакционной смеси со считыванием флуоресцентного сигнала на каждом шаге, при этом сигнал при плавлении дуплекса генерируется за счет разобщения меток, имеющих перекрывающиеся спектры поглощения и испускания, входящих в состав отщепленного 5'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнального зонда, а нерасщепленный мишень-специфичный зонд образует недетектируемый дуплекс с сигнальным зондом, при плавлении которого сигнал не генерируется, за счет присутствия в его составе двух взаимодействующих меток с перекрывающимися спектрами поглощения и испускания; при этом дифференциация дуплексов, соответствующих идентифицируемым различающимся участкам последовательностей ДНК, осуществляется по двум параметрам - канал детекции и/или температура плавления; при этом возможны следующие варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК:
1 ) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывается со спектром поглощения, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
2. Способ по п.1 , в котором осуществляют определение от 1 до 10 идентифицируемых последовательностей ДНК в одном канале амплификатора.
3. Способ по п.1 , в котором проведение плавления реакционной смеси осуществляют с шагом от 0,01 до 1 °С.
4. Способ по п.1 , в котором проведение плавления реакционной смеси осуществляют с шагом 0,5 °С.
5. Способ по п.1 , в котором проведение плавления реакционной смеси осуществляют в диапазоне температур от 0 °С до 100 °С.
6. Способ по п.8, в котором температура плавления дуплекса, образуемого 5'- сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, по меньшей мере, для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, ниже температуры плавления праймеров, входящих в реакционную смесь.
7. Способ по п.1 , в котором в качестве флуорофора или репортерного флуорофора используют, по меньшей мере, один из красителей карбоксифлуоресцеин (FAM), 6-карбоксиродамин (R6G), карбокси-Х-родамин (ROX), тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'- диметоксифлуоресцеин (6-JOE), тиадикарбоцианин (Су5™).
8. Способ по п.1 , в котором в качестве гасителя флуоресценции используют гаситель флуоресценции серии BHQ и/или RTQ.
9. Способ по п.1 , в котором в качестве термостабильного фермента, обладающего 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью, используют Taq ДНК полимеразу.
10. Способ по п.1 , в котором сигнальный зонд иммобилизован на твердую фазу.
1 1 . Способ по любому из пп.1 -10, в котором осуществляют идентификацию, по меньшей мере, двух различающихся последовательностей ДНК, при этом реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
З'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, но содержат одинаковые флуорофоры, и 5'-сегменты которых различаются по температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам З'-сегментов мишень-специфичных зондов, при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют разную температуру плавления, по которой осуществляют дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК.
12. Способ по любому из пп.1 -10, в котором осуществляют идентификацию, по меньшей мере, двух различающихся последовательностей ДНК, при этом реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
З'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК и содержат при этом разные флуорофоры, и 5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора З'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам З'-сегментов соответствующих комплементарных им мишень-специфичных зондов;
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют одинаковую температуру плавления, а дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.
13. Способ специфической идентификации, по меньшей мере, одного полиморфизма в последовательности ДНК способом по любому из пп.1 -10, в котором З'-сегмент мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда состоит из аллель-детектирующего 5'-фрагмента (S), несущего метку, участок гибридизации которого содержит анализируемый полиморфный сайт, и последовательность которого комплементарна одному аллельному варианту, подлежащему специфической идентификации и
З'-фрагмента (D), последовательность которого комплементарна участку ДНК, прилегающему к сайту, содержащему идентифицируемый полиморфизм ,
соединенных линкером, состоящим из, по меньшей мере, 1 -10 нуклеозидмонофосфатов, обеспечивающих раздельную гибридизацию двух фрагментов, при этом по длине З'-сегмент совпадает с участком гибридизации указанной последовательности ДНК, выбранным для идентификации в нем полиморфизма, при этом мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, в случае полной комплементарности его З'-сегмента и указанной последовательности ДНК, в том числе в части 5'-фрагмента (S), соответствующего искомому аллельному варианту полиморфизма, расщепляется указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, что в дальнейшем обеспечивает генерацию сигнала на этапе плавления;
напротив, в случае неполной комплементарности З'-сегмента мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда в части 5'-фрагмента (S) и указанной последовательности ДНК, мишень-специфичный зонд расщепляется указанным ферментом по линкеру L с высвобождением 5'-сегмента, связанного с 5'-фрагментом (S), без разобщения меток, входящих в состав мишень-специфичного зонда, что в дальнейшем на этапе плавления не приводит к генерации сигнала,
при этом возможны следующие варианты сочетания меток:
1 ) 5'-фрагмент (S) З'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'- сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) 5'-фрагмент (S) З'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
Способ по п.13, в котором осуществляют идентификацию, по меньшей мере, двух полиморфизмов в последовательности ДНК, по одному аллелю для каждого полиморфизма, при этом реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
5'-фрагменты (S) З'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из аллелей, подлежащих специфической идентификации, но содержат одинаковые флуорофоры, и
5'-сегменты которых различаются по температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 5'-фрагментов (S) З'-сегментов мишень- специфичных зондов,
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют разную температуру плавления, по которой осуществляют дифференциацию различающихся идентифицируемых полиморфизмов в последовательности ДНК.
15. Способ по п.13, в котором осуществляют идентификацию, по меньшей мере, двух полиморфизмов в последовательности ДНК, по одному аллелю для каждого полиморфизма, при этом реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
5'-фрагменты (S) З'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из аллелей, подлежащих специфической идентификации и содержат при этом разные флуорофоры, и
5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'- сегмента этого же мишень-специфичного зонда,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 5'-фрагментов (S) З'-сегментов соответствующих комплементарных им мишень-специфичных зондов;
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют одинаковую температуру плавления, а дифференциацию различающихся идентифицируемых полиморфизмов в последовательности ДНК осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.
16. Способ по п.13, в котором осуществляют идентификацию, по меньшей мере двух аллельных вариантов одного полиморфизма в последовательности ДНК, при этом реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
5'-фрагменты (S) З'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из идентифицируемых аллельных вариантов и содержат при этом одинаковые флуорофоры, а З'-фрагменты (D) - идентичны по последовательности, и 5'-сегменты различаются температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора, при этом дифференциацию аллельных вариантов осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.
17. Способ по п.13, в котором осуществляют идентификацию, по меньшей мере двух аллельных вариантов одного полиморфизма в последовательности ДНК, при этом реакционная смесь включает, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
5'-фрагменты (S) З'-сегменты каждого из которых комплементарны одному из идентифицируемых аллельных вариантов и содержат при этом разные флуорофоры, а З'-фрагменты (D) - идентичны по последовательности, и 5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора З'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда, при этом по температурам плавления дуплексов осуществляют дифференциацию аллельных вариантов в одном канале амплификатора.
18. Способ по любому из пп.13-17, в котором линкер L в составе мишень- специфичного зонда состоит из 4-10 инозинмонофосфатов.
19. Пара зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК в процессе ПЦР, состоящая из
олигонуклеотидного мишень-специфичного зонда, имеющего
З'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и 5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом в процессе ПЦР, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку, и
олигонуклеотидного сигнального зонда, комплементарного 5'-сегменту мишень- специфичного зонда и содержащего метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на З'-сегменте мишень-специфичного зонда;
выполненных таким образом, что
в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, расщепляется термостабильным ферментом, обладающим 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью, с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизуется с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
при этом возможны следующие варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК:
1) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
20. Пара зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК в процессе ПЦР по п.19, характеризующаяся тем, что температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, по меньшей мере, для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, ниже температуры плавления праймеров, используемых для проведения ПЦР.
21 . Пара зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК в процессе ПЦР по п.19, характеризующаяся тем, что сигнальный зонд иммобилизован на твердую фазу.
22. Пара зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК в процессе ПЦР по любому из пп.19-21 , где идентификацию осуществляют в отношении одного или более полиморфизмов в последовательности ДНК, характеризующаяся тем, что
З'-сегмент мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда состоит из
аллель-детектирующего 5'-фрагмента (S), несущего метку, участок гибридизации которого содержит анализируемый полиморфный сайт, и последовательность которого комплементарна одному аллельному варианту, подлежащему специфической идентификации и
З'-фрагмента (D), последовательность которого комплементарна участку ДНК, прилегающему к сайту, содержащему идентифицируемый полиморфизм,
соединенных линкером, состоящим из, по меньшей мере, 1 -10 нуклеозидмонофосфатов, обеспечивающих раздельную гибридизацию двух фрагментов,
при этом по длине З'-сегмент совпадает с участком гибридизации на идентифицируемой указанной последовательности ДНК, выбранным для идентификации в нем полиморфизма,
при этом мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, в случае полной комплементарности его З'-сегмента и указанной последовательности ДНК, в том числе в части 5'-фрагмента (S), соответствующего искомому аллельному варианту полиморфизма, расщепляется ферментом, обладающим 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью, с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, что в дальнейшем обеспечивает генерацию сигнала на этапе плавления;
напротив, в случае неполной комплементарности З'-сегмента мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда в части 5'-фрагмента (S) и указанной последовательности ДНК, мишень-специфичный зонд расщепляется ферментом, обладающим 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью, по линкеру L с высвобождением 5'- сегмента, связанного с 5'-фрагментом (S), без разобщения меток, входящих в состав мишень-специфичного зонда, что в дальнейшем на этапе плавления не приводит к генерации сигнала,
при этом возможны следующие варианты сочетания меток:
1 ) 5'-фрагмент (S) З'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'- сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения, соответственно, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора, 2) 5'-фрагмент (S) З'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
23. Набор для специфической идентификации, по меньшей мере, одной последовательности ДНК в образце способом по п.1 , включающий, по меньшей мере,
термостабильный фермент, обладающий 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью,
а также, для выявления каждой из идентифицируемых последовательностей ДНК, по меньшей мере,
одну пару праймеров,
один мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, имеющий
З'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и
5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку,
один олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень- специфичного зонда и содержащий метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на З'-сегменте мишень- специфичного зонда;
при этом зонды выполнены таким образом, что в процессе прохождения ПЦР мишень- специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, способен расщепляться указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизующеготся с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
при этом возможны следующие варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК:
1) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) З'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
24. Набор по п.23, характеризующийся тем, что при плавлении реакционной смеси, получаемой в результате смешивания компонентов набора, без предварительного проведения ПЦР, дуплексы не детектируются.
25. Набор по п.23, в котором флуорофор или репортерный флуорофор выбран из карбоксифлуоресцеина (FAM), 6-карбоксиродамина (R6G), карбокси-Х- родамина (ROX), тетраметилкарбоксиродамина (TAMRA), 6-карбокси-4',5'- дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеина (6-JOE).
26. Набор по п.23, в котором гаситель флуоресценции выбран из BHQ-1 , BHQ-2, BHQ-3.
27. Набор по п.23, в котором термостабильный фермент, обладающий 5'— >3' ДНК полимеразной и 5'— >3' экзонуклеазной активностью, представляет собой Taq ДНК полимеразу.
28. Набор по п.23, в котором, по меньшей мере, для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, зонды выполнены таким образом, что температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, ниже температуры плавления праймеров, входящих в реакционную смесь.
29. Набор по любому из п. п.23-28, включающий, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
З'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, но содержат одинаковые флуорофоры, и
5'-сегменты которых содержат одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора, но различаются по температуре плавления так, чтобы обеспечить возможность осуществить дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК по температуре плавления.
30. Набор по любому из п. п.23-28, включающий, по меньшей мере,
два различающихся мишень-специфичных зонда,
З'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК и содержат при этом разные флуорофоры так, чтобы обеспечить возможность дифференциации различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК по спектрам испускания флуорофоров, и
5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерныи флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора З'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда.
PCT/RU2017/050104 2017-01-25 2017-10-05 Способ специфической идентификации последовательностей днк Ceased WO2018139955A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17894457.5A EP3575406A4 (en) 2017-01-25 2017-10-05 SPECIFIC IDENTIFICATION PROCESS OF DNA SEQUENCES

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017102365A RU2665631C2 (ru) 2017-01-25 2017-01-25 Способ специфической идентификации последовательностей днк
RU2017102365 2017-01-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018139955A1 true WO2018139955A1 (ru) 2018-08-02

Family

ID=62974865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/050104 Ceased WO2018139955A1 (ru) 2017-01-25 2017-10-05 Способ специфической идентификации последовательностей днк

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP3575406A4 (ru)
EA (1) EA035333B1 (ru)
RU (1) RU2665631C2 (ru)
WO (1) WO2018139955A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540345A (zh) * 2021-11-03 2022-05-27 武汉蓝沙医学检验实验室有限公司 一种发夹结构的标签荧光探针和荧光检测方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2707949C1 (ru) * 2018-12-03 2019-12-02 Закрытое акционерное общество "Синтол" (ЗАО "Синтол") Многоканальный капиллярный генетический анализатор

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US43517A (en) 1864-07-12 Improvement in water-elevators
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US5691142A (en) 1992-12-07 1997-11-25 Third Wavetechnologies, Inc. Detection of target nucleic acid molecules using synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
US6893819B1 (en) 2000-11-21 2005-05-17 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US7381532B2 (en) 1999-10-29 2008-06-03 Stratagene California Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
US20080241838A1 (en) 2006-12-29 2008-10-02 Applera Corporation, Applied Biosystems Group Methods and systems for detecting nucleic acids
RU2566562C2 (ru) 2011-01-11 2015-10-27 Сиджен, Инк. Детекция нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней в анализе с расщеплением и удлинением рто

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9803382D0 (en) * 1998-02-19 1998-04-15 Secr Defence Detection system
EP2059614A4 (en) * 2006-08-15 2010-06-30 Zygene Biotech Llc ANTISONDON PROBE COMPOSITIONS AND METHODS OF DETECTION OF DNA OR RNA
WO2010013317A1 (ja) * 2008-07-30 2010-02-04 株式会社Ｊ－Ｂｉｏ２１ 核酸プローブセットおよびその使用方法
ES2396044T3 (es) * 2008-07-31 2013-02-18 Oxitec Limited Amplificación y detección de múltiplex
WO2011027966A2 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Seegene, Inc. Td probe and its uses
GB201106254D0 (en) * 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
JP7063886B2 (ja) * 2016-09-15 2022-05-09 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー マルチプレックスリアルタイムｐｃｒを実施する方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US43517A (en) 1864-07-12 Improvement in water-elevators
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US5691142A (en) 1992-12-07 1997-11-25 Third Wavetechnologies, Inc. Detection of target nucleic acid molecules using synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
US7381532B2 (en) 1999-10-29 2008-06-03 Stratagene California Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
US6893819B1 (en) 2000-11-21 2005-05-17 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US20080241838A1 (en) 2006-12-29 2008-10-02 Applera Corporation, Applied Biosystems Group Methods and systems for detecting nucleic acids
RU2566562C2 (ru) 2011-01-11 2015-10-27 Сиджен, Инк. Детекция нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней в анализе с расщеплением и удлинением рто

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Indicators", 1972, PERGAMON PRESS
BERLMAN: "Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules", 1971, ACADEMIC PRESS
GRIFFITHS: "Color and Constitution of Organic Molecules", 1976, ACADEMIC PRESS
HAUGLAND, R.P.: "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", 1996, MOLECULAR PROBES
LIAO Y. ET AL.: "Combination of fluorescence color and melting temperature as a twodimensional label for homogeneous multiplex PCR detection", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 41, no. 7, 2013, pages 1 - 11, XP055558092 *
PRINGSHEIM: "Pluorescence and Phosphorescence", 1949, INTERSCIENCE PUBLISHERS
See also references of EP3575406A4
WELLER S. A. ET AL.: "Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 66, no. 7, 2000, pages 2853 - 2858, XP055531692 *
WHITE ET AL.: "Fluorescence Analysis: A Practical Approach", 1970, MARCEL DEKKER

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540345A (zh) * 2021-11-03 2022-05-27 武汉蓝沙医学检验实验室有限公司 一种发夹结构的标签荧光探针和荧光检测方法
CN114540345B (zh) * 2021-11-03 2024-04-09 武汉蓝沙医学检验实验室有限公司 一种发夹结构的标签荧光探针和荧光检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
EA035333B1 (ru) 2020-05-28
RU2665631C2 (ru) 2018-09-03
EP3575406A4 (en) 2021-02-24
RU2017102365A3 (ru) 2018-07-26
EP3575406A1 (en) 2019-12-04
EA201792628A2 (ru) 2018-07-31
EA201792628A3 (ru) 2018-08-31
RU2017102365A (ru) 2018-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11884965B2 (en) Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
CN112592964B (zh) 用于进行核酸多重检测的方法
AU769219B2 (en) High specificity primers, amplification methods and kits
CN110452962A (zh) 利用不同检测温度的靶核酸序列检测
JP2004511227A (ja) 核酸の同種内検出用の特異的二本鎖プローブおよびその適用方法
US20140017689A1 (en) Method for detecting nucleic acids
KR20120107488A (ko) Ｔｓｇ프라이머 타겟 검출
CN111100935A (zh) 一种细菌耐药基因检测的方法
US20120258447A1 (en) Real-time multiplexing detection of target nucleic acid sequences with elimination of false signals
CN109988865B (zh) 一种检测呼吸道病毒的方法
RU2665631C2 (ru) Способ специфической идентификации последовательностей днк
US20230265490A1 (en) Compositions and methods for multiplex detection of mirna and other polynucleotides
CN113046420A (zh) 一种不对称扩增多个靶核酸的方法
US12209272B2 (en) Multiple analysis method for amplicon by using fluorescence-based multiple melting analysis
US7101673B2 (en) Method for detecting a nucleic acid comprising asymmetrical amplification
CN114645079A (zh) 一种检测孕妇样品中胎儿游离dna存在或比例的方法和试剂盒
RU2780587C2 (ru) Детекция нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием разных температур детекции
JP2025513004A (ja) サンプル内の３個のターゲット核酸を検出する方法
CN114686574A (zh) 一种检测核苷酸大片段缺失的方法和试剂盒
HK1174946A (en) Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17894457

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017894457

Country of ref document: EP

Effective date: 20190826