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WO2024147456A1 - 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩 및 이를 이용한 지질 나노 입자 제조 방법 - Google Patents

스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩 및 이를 이용한 지질 나노 입자 제조 방법 Download PDF

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WO2024147456A1
WO2024147456A1 PCT/KR2023/016813 KR2023016813W WO2024147456A1 WO 2024147456 A1 WO2024147456 A1 WO 2024147456A1 KR 2023016813 W KR2023016813 W KR 2023016813W WO 2024147456 A1 WO2024147456 A1 WO 2024147456A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lipid nanoparticles
phase solution
oil phase
solution
aqueous solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/KR2023/016813
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이상훈
서희원
전찬희
김동훈
김주희
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inventage Lab Inc
Original Assignee
Inventage Lab Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020230145133A external-priority patent/KR20240109572A/ko
Application filed by Inventage Lab Inc filed Critical Inventage Lab Inc
Priority to CN202380090452.0A priority Critical patent/CN120529963A/zh
Priority to EP23914920.6A priority patent/EP4628201A1/en
Publication of WO2024147456A1 publication Critical patent/WO2024147456A1/ko
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Pending legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F25/00—Flow mixers; Mixers for falling materials, e.g. solid particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30—Micromixers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures

Definitions

  • the present invention relates to a chip for manufacturing lipid nanoparticles containing a spiral structure and a method for manufacturing lipid nanoparticles using the same.
  • Lipid nanoparticles are effective drug delivery systems for biologically active compounds such as cell-impermeable therapeutic nucleic acids, proteins, and peptides.
  • vaccines are subdivided into “first generation”, “second generation” and “third generation” vaccines, and genetic vaccines, i.e. vaccines for genetic vaccination, are usually understood as “third generation” vaccines.
  • Genetic vaccines typically consist of genetically engineered nucleic acid molecules that allow expression in vivo of peptides or protein (antigen) fragments characteristic for pathogens or tumor antigens. When administered to a patient, genetic vaccines are expressed after uptake by target cells. Expression of the administered nucleic acid results in the production of the encoded protein. When these proteins are recognized as foreign by the patient's immune system, an immune response is triggered.
  • DNA as well as RNA can be used as nucleic acid molecules for administration.
  • DNA is known to be relatively stable and easy to handle.
  • DNA carries the risk of unwanted insertion of administered DNA fragments into the patient's genome, potentially resulting in mutagenic events such as loss of function of the damaged gene.
  • RNA is quite unstable and can be easily degraded by ubiquitous RNases, resulting in problems of impermeability, fragility and immunogenicity.
  • lipid nanoparticle formulations have been used as an efficient method for mRNA vaccination that can induce adaptive immune responses.
  • the mixer unit may have a width of a valley formed by a spiral trace on the peripheral surface of 0.1 mm to 0.5 mm.
  • Figure 5 is a cross-sectional view of the mixer portion of the chip for producing lipid nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows the results of an experiment on the fluid flow in the mixer unit of the chip for producing lipid nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • the nucleic acid-lipid particle of US 9364435 B2 comprises (a) nucleic acid, (b) cationic lipid, (c) non-cationic lipid and (d) fusible lipid, wherein, based on the total content of lipids in the particle, the above It is disclosed as comprising 50 mol% to 85 mol% of cationic lipid, 13 mol% to 49.5 mol% of non-cationic lipid, and 0.5 mol% to 2 mol% of fusible lipid. .
  • the chip for producing lipid nanoparticles is for mixing the aqueous solution and the oil phase solution by a microfluidic method, and lipid nanoparticles can be formed through a self-assembly process at the interface where the aqueous solution and the oil phase solution come into contact.
  • a mixed solution containing lipid nanoparticles can be prepared by self-assembly of lipids and mRNA at the interface of the two fluids. You can.
  • the mixer unit is connected to a discharge unit, and the discharge unit may be connected to the other end of the mixer unit connected to the oil phase solution supply unit and the aqueous solution supply unit.
  • the oil-phase solution supply unit 100 and the aqueous-phase solution supply unit 200 are located with respect to the z-axis and extend vertically in the y-axis direction. , can be coupled to the mixer unit 300 in the x-axis direction.
  • the characteristics of the spiral structure change, and when the characteristics of the spiral structure change,
  • the flow of fluid flowing within the mixer unit 300 varies, and the scope of the present invention with respect to the spacing 350, depth 370, and width 360 of the mixer unit 300 and the mixer unit 300 described later.
  • the mixer unit 300 includes a mixing section 380 in which the oil phase solution and the aqueous solution are mixed, and a stabilization section 390 in which the mixed solution in which the oil phase solution and the aqueous solution are completely mixed is stabilized, and the mixing section ( The length ratio of 380) and the stabilization section 390 may be 1:1 to 1:5.
  • the oil phase solution and the aqueous phase solution that move to the mixer unit 300 form an interface, and lipid nanoparticles are formed on the interface.
  • the oil phase solution and the aqueous phase solution are mixed to form a mixed solution.
  • the mixing effect of the oil phase solution and the aqueous phase solution can be further enhanced by the fluid flow as shown in FIG. 8 within the mixer unit 300.
  • the length ratio of the mixing section 380 and the stabilizing section 390 may be 1:1 to 1:5, 1:1 to 1:4, or 1:2 to 1:4.
  • the oil phase solution and the water phase solution are completely mixed within the length range, and then the completely mixed mixed solution moves within the stabilization section. In the above fluid flow, the formation of lipid nanoparticles and stabilization of the formed lipid nanoparticles proceed simultaneously.
  • Section B of FIG. 9 passes through section A to check the degree of mixing of the two solutions. A greener part is confirmed compared to section A, confirming that it contains more of the relatively complete mixed solution.
  • Section C in FIG. 9 confirms the stabilization section, and it can be confirmed through color that the solution is in a completely mixed solution state.
  • Figure 1 shows the mixing of fluids on a chip for producing lipid nanoparticles on KR 10-2361123 B1.
  • nucleic acid is mixed with a solvent to prepare an aqueous solution.
  • the solvent is a citric acid solution at pH 3.0, but is not limited to the above example, and any solvent capable of producing lipid nanoparticles by mixing nucleic acids can be used without limitation.
  • the nucleic acids include RNA, DNA, short interfering RNA (siRNA), messenger RNA (mRNA) aptamer, antisense oligodeoxynucleotide (ODN), antisense RNA, ribozyme, and DNAzyme. and mixtures thereof, preferably mRNA, but is not limited to the above examples.
  • the nucleic acid is used to prevent or treat disease, and as an example, it synthesizes a spike protein to combat the COVID-19 virus, such as the COVID-19 vaccine. Without being limited to the above examples, any nucleic acid for preventing or treating disease can be used.
  • step S200 an oily solution is prepared by dissolving ionized lipids, non-ionizable lipids, neutral lipids, and soluble lipids in an organic solution.
  • the ionized lipid may be ALC-0315 (Genevant), ALC-0159 (Genevant), DLinDAP, Dlin-MC3-DMA, or SM102 (Albutus).
  • the ionized lipid is not limited to examples, and any ionized lipid that can be used in the production of lipid nanoparticles can be used without limitation.
  • the non-ionized lipid may be included together with the fusion lipid to increase the stability of the lipid nanoparticle.
  • Lipid nanoparticles are intended to allow nucleic acids to reach the target tissue or organ, but there is a problem that they are destroyed after injection into the body before reaching the target tissue or organ. To prevent this problem, non-ionized lipids and fusible lipids may be included.
  • the non-ionized lipids include distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dioleolphosphatidyl ethanolamine (DOPE), bis(diphenylphosphino)ethane (DPPE), diacyl phosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, and diacylphosphatidylserine ( diacylphosphatidylserine) and mixtures thereof, preferably DSPC, but is not limited to the above examples.
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • DOPE dioleolphosphatidyl ethanolamine
  • DPPE bis(diphenylphosphino)ethane
  • diacyl phosphatidylcholine diacylphosphatidylethanolamine
  • diacylphosphatidylserine diacylphosphatidylserine and mixtures thereof, preferably DSPC, but is not limited to the above examples.
  • the fusion lipid may be selected from the group consisting of cholesterol, tocopherol, and mixtures thereof, preferably cholesterol, but is not limited to the above examples.
  • the neutral lipid is included to control the size of the particles and act as a steric barrier to prevent aggregation during storage.
  • polyethylene glycol 2000 distearoylphosphatidylethanolamine PEG (2000) DSPE
  • DMG-PEG DMG-PEG
  • PEG-DMPE DMG-DMPE
  • DPPE-PEG DPG-PEG
  • PEG-DOPE PEG-DOPE
  • mixtures thereof preferably DMG-PEG, but is not limited to the above examples.
  • the organic solution used to prepare the oil phase solution is alcohol, and may specifically be methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, etc., preferably ethanol, but is not limited to the above examples and can uniformly dissolve ionized lipids. Any organic solvent that can be used can be used without limitation.
  • step S300 the aqueous solution and the oil phase solution prepared in steps S100 and S200 are injected into the oil phase solution supply unit 100 and the aqueous phase solution supply unit 200 to flow.
  • the flows for the oil phase solution and the aqueous phase solution respectively injected into the oil phase solution supply unit 100 and the aqueous phase solution supply unit 200 flow in directions facing each other, and at the intersection of the two flows, the mixer unit 300 ), and can be mixed within the mixer unit 300 by forming a laminar flow within the mixer unit 300.
  • the aqueous solution and the oil phase solution injected into the mixer unit 300 form a laminar flow at the intersection and are mixed within the mixer unit 300, and nucleic acids in the aqueous solution, ionized lipids in the oil phase solution, and non-ionized Lipids, neutral lipids, and fusible lipids can be combined to form lipid nanoparticles through a self-assembly process by electrostatic attraction. That is, lipid nanoparticles are produced by mixing an aqueous solution and an oil phase solution, and the oil phase solution can be used in a state in which all four types of lipids are mixed.
  • the nucleic acid is specifically mRNA, and as described above, mRNA is anionic, and ionized lipids are cationic, so a binding force is generated by mutual electrostatic attraction, which can form lipid nanoparticles.
  • the oil phase solution and the aqueous solution may flow and mix along a spiral trace on the peripheral surface of the mixer unit 300 to form a mixed solution, and at this time, the mixing section 380 where the oil phase solution and the aqueous solution are mixed. ) and the stabilization section 390, where the mixed solution forming lipid nanoparticles flows through the mixing section 380 and stabilizes along a spiral trajectory. That is, within the mixing section 380, the oil phase solution and the aqueous solution form an interface along a spiral trace on the circumferential surface of the mixer unit 300, and on the interface, the lipids of the oil phase solution and the nucleic acids of the aqueous solution form a magnetic field. Lipid nanoparticles can be formed through the assembly process. As described above, the interface between the oil phase solution and the water phase solution can be formed along a spiral trajectory on the peripheral surface of the mixer unit 300 by the flow as shown in FIG. 8.
  • the flow rate ratio when supplying the oil phase solution and the aqueous phase solution to the oil phase solution supply unit and the aqueous solution supply unit, respectively, may be 1:1 to 1:5, 1:1 to 1:4, and 1:2 to 1:4.
  • the total flow rate of the oil phase solution and the aqueous phase solution may be 5 mL/min to 50 mL/min, the total flow rate may be 10 mL/min to 45 mL/min, and the total flow rate may be 15 mL/min to 40 mL/min.
  • the oil phase solution and the aqueous phase solution can be completely mixed in a short time within the mixing section 380 of the mixer unit 300, thereby producing uniform lipid nanoparticles.
  • Figure 10 is for confirming the length of the mixing section 380 in the mixer unit 300 according to the total flow rate of the oil phase solution and the aqueous solution of the present invention.
  • the mixing section 380 of the mixer section 300 ) and the length ratio of the stabilization section 390 is within the range of 1:1 to 1:5, forming a complete mixed solution.
  • Figures 11 to 15 show the results of confirming the experimental results of flow in the same sections A to C as in Figure 9 while changing the total flow rate from 4 mL/min to 68 mL/min.
  • the total flow rate of the oil phase solution and the water phase solution is 4 mL/min
  • mixing is performed within the section of 0 mm to 2 mm, which is the introduction part of the mixing unit 300, until a complete mixed solution is formed. Because the index is significantly lowered, there is a problem in that it is not easy to form lipid nanoparticles in the mixed solution.
  • the mixing speed of the oil phase solution and the aqueous phase solution in part A of the mixer unit 300 is relatively slow, so that the lipid nanoparticles are contained in the mixed solution. There is a problem in that the formation of particles is not easy.
  • the lipid nanoparticles formed in step S400 may further include post-treatment steps of dilution and filtration.
  • the chip for producing lipid nanoparticles of the present invention may be formed on a material selected from the group consisting of a glass substrate, silicon wafer, or polymer film, but examples of the material are not limited to the above examples, and may be a material capable of forming microchannels. are all available.
  • the polymer film is polyimide, polyethylene, fluorinated ethylene propylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate, polysulfone ( Polysulfone) and mixtures thereof, but is not limited to the above examples.
  • aluminum is deposited on a silicon wafer using an e-beam evaporator, and photoresist is patterned on the aluminum using a photolithography technique. Afterwards, aluminum is etched using the photoresist as a mask, and after removing the photoresist, the silicon is etched using DRIE (deep ion reactive etching) using aluminum as a mask. After removing the aluminum, glass is anodized on the wafer to seal it. Thus, it can be manufactured.
  • DRIE deep ion reactive etching
  • the present invention relates to a chip for manufacturing lipid nanoparticles containing a spiral structure and a method for manufacturing lipid nanoparticles using the same.

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Abstract

본 발명은 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩 및 이를 이용한 지질 나노 입자 제조 방법에 관한 것으로, 핵산을 포함하는 수상 용액 및 지질을 포함하는 유상 용액의 혼합 효율을 높여, 수상 용액과 유상 용액의 계면에서 자기 조립 과정을 통해 균일한 지질 나노 입자를 형성할 수 있다. 또한, 상기 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩을 이용하여 균일한 형상 및 직경을 갖는 지질 나노 입자의 효율적인 제조가 가능한 제조 방법에 관한 것이다.

Description

스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩 및 이를 이용한 지질 나노 입자 제조 방법
본 발명은 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩 및 이를 이용한 지질 나노 입자 제조 방법에 관한 것이다.
지질 나노입자(LNP)는 세포 불투과성인 치료용 핵산, 단백질, 및 펩타이드와 같은 생물학적 활성 화합물에 대한 효과적인 약물 전달 시스템이다.
보통, 백신은 "1세대", "2세대" 및 "3세대" 백신으로 세분되며, 유전자 백신, 즉, 유전자 백신 접종을 위한 백신은 보통 "3세대" 백신으로 이해된다. 유전자 백신은 전형적으로, 생체 내에서 병원체 또는 종양 항원에 대해 특징적인 펩티드 또는 단백질(항원) 단편의 발현을 가능하게 하는 유전자 조작 핵산 분자로 이루어진다. 유전자 백신은 환자에 투여 시, 표적 세포에 의한 흡수 후에 발현된다. 투여된 핵산의 발현은 암호화된 단백질의 생산을 가져온다. 이러한 단백질이 환자의 면역계에 의해 이물질로 인식되는 경우, 면역 반응이 촉발된다.
유전자 백신 접종의 맥락에서, DNA 뿐만 아니라 RNA도 투여를 위한 핵산 분자로서 이용될 수 있다. DNA는 상대적으로 안정적이고 다루기 용이하다고 알려져 있다.
그러나 DNA 이용은 손상된 유전자의 기능 상실에서와 같은 돌연변이 유발성 사건을 잠재적으로 초래하는 투여된 DNA 단편의 환자의 게놈 내로의 원치 않는 삽입 위험을 안고 있다.
유전자 백신 접종을 위해 DNA 대신 RNA를 이용함으로써, 원치 않는 게놈 통합 및 항-DNA 항체의 생성 위험은 최소화되거나 방지된다. 그러나 RNA는 편재하는 RN아제에 의해 용이하게 분해될 수 있는 상당히 불안정하여, 불투과성, 취약성 및 면역원성의 문제를 갖는다.
지난 수년간 많은 발전이 이루어졌음에도 적응 면역 반응을 유발할 수 있는 mRNA 백신 접종을 위한 효율적인 방법으로, 지질 나노입자 제제를 이용하였다.
상기 지질 나노입자 제제는 생체내 핵산 전달을 개선할 수 있다.
상기 지질 나노입자를 이용한 약물 전달 시스템은 이온화 지질, 비이온화 지질(non-Ionizable lipid), 중성지질 및 융합성 지질을 포함하는 다성분 제제이다. 양이온성의 이온화 지질은 음이온성 핵산에 결합하는 반면, 다른 성분은 지질 나노입자의 안정한 자가 조립을 지원한다.
상기 지질 나노입자는 최적의 약물:지질 비율로 제조되어, 혈청에서 분해 및 제거로부터 핵산을 보호하고, 전신 또는 국소 전달에 적합하며, 핵산의 세포 내 전달을 제공할 수 있다.
상기 지질 나노입자는 종래 제조 방법으로 제조 시, 제조된 입자의 크기가 균일하지 못해, 별도의 분류 공정을 필요로 하는 등의 생산 효율이 저하되는 문제가 있다.
이러한 문제를 해결하고, 직경이 균일한 지질 나노 입자를 생산하여 생산 효율을 높일 수 있는 지질 나노 입자를 제조하기 위한 칩 및 제조 방법에 대한 개발이 필요하다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
US 10,835,878
본 발명의 목적은 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩 및 이를 이용한 지질 나노 입자 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 핵산을 포함하는 수상 용액 및 지질을 포함하는 유상 용액의 혼합 효율을 높여, 수상 용액과 유상 용액의 계면에서 자기 조립 과정을 통해 균일한 지질 나노 입자를 형성할 수 있는 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩을 이용하여 균일한 형상 및 직경을 갖는 지질 나노 입자의 효율적인 제조가 가능한 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지질 나노 입자 제조용 칩에 관한 것으로, 유상 용액 공급부; 수상 용액 공급부; 및 스파이럴 구조를 포함하는 믹서부를 포함하고, 상기 믹서부는 상기 유상 용액 공급부 및 상기 수상 용액 공급부에 연결되고, 상기 유상 용액 공급부를 통해 공급되는 유상 용액과, 상기 수상 용액 공급부를 통해 공급되는 수상 용액이 혼합되어 지질 나노 입자를 형성할 수 있다.
또한, 상기 믹서부는 둘레면에 나선 궤적을 따라 교대로 형성된 산부와 골부를 포함할 수 있다.
또한, 상기 믹서부의 단면은 산부에 의한 외경이 1mm 내지 2mm이며, 골부에 의한 내경이 0.5mm 내지 0.6mm일 수 있다.
또한, 상기 믹서부는 둘레면의 나선 궤적의 간격(Pitch)이 1mm 내지 3mm일 수 있다.
또한, 상기 믹서부는 산부 및 골부의 깊이(Depth)가 0.1mm 내지 0.5mm일 수 있다.
또한, 상기 믹서부는 둘레면의 나선 궤적에 의해 형성된 골부의 폭(Width)이 0.1mm 내지 0.5mm일 수 있다.
또한, 상기 믹서부는 유상 용액 및 수상 용액이 혼합되는 혼합 구간과, 상기 유상 용액 및 수상 용액이 완전히 혼합된 혼합 용액이 안정화되는 안정화 구간을 포함하며, 상기 혼합 구간 및 안정화 구간의 길이 비가 1:1 내지 1:5일 수 있다.
또한, 상기 믹서부는 배출부와 연결되며, 상기 배출부는 유상 용액 공급부 및 수상 용액 공급부와 연결된 믹서부의 다른 일단에 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 지질 나노 입자의 제조 방법은 핵산을 포함하는 수상 용액을 제조하는 단계; 지질을 유기 용액에 용해하여 유상 용액을 제조하는 단계; 상기 수상 용액 및 유상 용액을 제1항에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩 상의 유상 용액 공급부 및 수상 용액 공급부로 공급하는 단계; 및 상기 유상 용액 공급부 및 수상 용액 공급부로 공급된 유상 용액 및 수상 용액이 믹서부 내에서 혼합되어 지질 나노 입자를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 유상 용액 및 수상 용액은 믹서부의 둘레면 상의 나선 궤적을 따라 유동하여 혼합되어 혼합 용액을 형성하며, 상기 혼합 용액이 나선 궤적을 따라 유동하며 안정화될 수 있다.
또한, 상기 유상 용액 및 수상 용액은 믹서부의 둘레면 상의 나선 궤적을 따라 계면을 형성하고, 상기 계면 상에서 유상 용액의 지질과 수상 용액의 핵산이 자기 조립 과정을 통해 지질 나노 입자가 형성될 수 있다.
또한, 상기 유상 용액 및 수상 용액은 믹서부를 유동하며 혼합 용액을 형성하는 혼합 구간과 상기 혼합 용액이 안정화되는 안정화 구간을 이동하며, 상기 혼합 구간 및 안정화 구간의 길이 비가 1:1 내지 1:5일 수 있다.
또한, 상기 유상 용액 및 수상 용액을 유상 용액 공급부 및 수상 용액 공급부로 각각 공급할 때의 유량비가 1:1 내지 1:5일 수 있다.
또한, 상기 유상 용액 및 수상 용액의 총 유량은 5mL/min 내지 50mL/min일 수 있다.
또한, 상기 지질 나노 입자를 형성하는 단계 이후, 희석 및 여과하는 후처리 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 핵산을 포함하는 수상 용액 및 지질을 포함하는 유상 용액의 혼합 효율을 높여, 수상 용액과 유상 용액의 계면에서 자기 조립 과정을 통해 균일한 지질 나노 입자를 형성할 수 있다.
또한, 상기 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩을 이용하여 균일한 형상 및 직경을 갖는 지질 나노 입자의 효율적인 제조가 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 종래 지질 나노 입자 제조용 칩에 대한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩에 대한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩 및 믹서부가 결합되는 부분에 대한 확대도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부에 대한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부의 단면에 대한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부 내 혼합 구간과 안정화 구간에 대한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부로 주입되는 유상 용액 및 수상 용액의 흐름에 대한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부 단면에서의 유상 용액 및 수상 용액의 흐름에 대한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부 내 유체 흐름에 대한 실험 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부 내 유상 용액 및 수상 용액의 총 유량의 변화에 따른 유체 흐름에 대한 실험 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부 내 유체 흐름에 대한 실험 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부 내 유체 흐름에 대한 실험 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부 내 유체 흐름에 대한 실험 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부 내 유체 흐름에 대한 실험 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩의 믹서부 내 유체 흐름에 대한 실험 결과이다.
본 발명은 유상 용액 공급부; 수상 용액 공급부; 및 스파이럴 구조를 포함하는 믹서부를 포함하고, 상기 믹서부는 상기 유상 용액 공급부 및 상기 수상 용액 공급부에 연결되고, 상기 유상 용액 공급부를 통해 공급되는 유상 용액과, 상기 수상 용액 공급부를 통해 공급되는 수상 용액이 혼합되어 지질 나노 입자를 형성하는 지질 나노 입자 제조용 칩에 관한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
mRNA는 전령 리보핵산(messenger RiboNucleic Acid)의 줄임말로 유전정보를 가진 DNA가 mRNA가 되고 이를 이용하여 단백질이 합성되는 과정에서 DNA와 단백질을 연결해주는 중간체이다.
코로나 19에 의해 mRNA 백신의 관심 및 개발이 집중되고 있다. mRNA 백신은 다른 유형의 백신에 비해 몇 가지 이점이 있다.　mRNA 백신의 가장 큰 장점은 mRNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)가 플랫폼 기술에 해당되어, 코로나 19와 같이 변이가 많이 발생하는 바이러스에 대항하여, 빠른 기술 개발이 가능하다는 것이다.　
구체적으로, 보호 단백질 항원(protective protein antigen)을 식별하고 상기 항원에 대한 유전자를 시퀀싱하여, mRNA를 제조할 수 있다.　이러한 방식을 이용하여 신규 mRNA를 제조하고, 종래 mRNA 백신의 제형 설계 및 제조 공정을 이용할 경우, 신속한 mRNA 백신의 제조가 가능하다. 이는 서로 다른 항원을 코딩하는 mRNA가 화학적, 물리적으로 매우 유사하기 때문에 새로운 mRNA 백신의 제형 설계 및 제조 공정은 종래 mRNA 백신의 제형 및 제조 공정과 동일한 단계로 진행될 수 있음을 의미한다.
인산염 그룹의 음전하 때문에 mRNA는 일반적으로 비경구용으로 사용되는 pH 범위에서 다가 음이온성 거대분자이다. 상기와 같이, 음전하를 띠는 mRNA의 전기적인 성질을 이용해, 양전하를 띠는 이온화 지질(ionisable lipid 또는 cationic lipid)를 이용하여 지질 나노입자를 제조할 수 있다. 구체적으로, 이온화 지질은 양전하를 띠는 지질로, 음전하를 띠는 mRNA와 전기적인 인력을 통해 서로 강하게 결합하게 된다. 상기 이온화 지질 이외에, 추가로 비이온화 지질(non-Ionizable lipid), 중성지질 및 융합성 지질을 포함하여 지질 나노입자를 형성하게 된다.
US 9364435 B2의 핵산-지질 입자는 (a) 핵산, (b) 양이온성 지질, (c) 비양이온성 지질 및 (d) 융합성 지질을 포함하며, 입자 내 지질의 총 함량을 기준으로, 상기 양이온성 지질을 50 mol% 내지 85 mol%로 포함하고, 상기 비양이온성 지질을 13 mol% 내지 49.5 mol%로 포함하고, 융합성 지질을 0.5 mol% 내지 2 mol%로 포함하는 것으로 개시하고 있다.
또한, EP 2279254 B1의 핵산-지질 입자는 입자 내 지질의 총 함량을 기준으로, 상기 양이온성 지질을 50 mol% 내지 65 mol%로 포함하고, 상기 비양이온성 지질을 49.5 mol% 이하로 포함하고, 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 30 mol% 내지 40 mol%로 포함하며, 융합성 지질을 0.5 mol% 내지 2 mol%로 포함하는 것으로 개시하고 있다.
상기와 같이 핵산를 포함하는 지질 나노 입자를 제조하기 위해선, 핵산을 포함하는 수상 용액과 지질을 포함하는 유상 용액을 이용하여 제조하는 것으로, 상기 수상 용액 및 유상 용액을 혼합할 수 있는 지질 나노 입자 제조용 칩을 사용하고 있다.
상기 지질 나노 입자 제조용 칩은, 미세 유체법에 의해 상기 수상 용액과 유상 용액을 혼합하기 위한 것으로, 상기 수상 용액과 유상 용액이 접하게 되는 계면 상에서 자기 조립 과정에 의해 지질 나노 입자가 형성될 수 있다. 구체적으로 후술하는 바와 같이, 수상 용액의 흐름과 유상 용액의 흐름을 혼합하게 함에 따라, 두 유체의 계면에서 지질과 mRNA의 자기 조립(self-assembly)에 의해 지질 나노 입자를 포함하는 혼합액을 제조할 수 있다.
상기 지질 나노 입자를 제조하기 위한 종래 칩은, WO 2018/190423과 같이 이차원적 굴곡의 유로를 가진 유로 구조체로, 배플을 엇갈리게 배치한 구조일 수 있다.
상기 배플을 엇갈리게 배치한 구조의 유로 구조체는, 배플의 폭, 길이 및 배치를 조정함에 따라, 용액의 희석 속도를 제어하여 나노 입자의 직경에 대한 조절이 가능한 것을 특징으로 한다.
또는, KR 10-2361123 B1과 같이 원환체 혼합 엘리먼트들을 통해 분기된(bifurcated) 유체 흐름을 갖는 유체 혼합기를 이용하는 방안도 제안되고 있다. 상기 유체 혼합기는 도 1과 같은 칩의 구조로, 후술하는 본 발명의 지질 나노 입자 제조용 칩에 비해, 유상 용액 및 수상 용액의 완전한 혼합이 나타나지 않아, 지질 나노 입자의 생산 효율이 상대적으로 낮거나, 입자의 균일한 정도에서 차이가 나타난다.
즉, 종래 다양한 지질 나노 입자를 제조하기 위한 칩이 개발되었으나, 종래 지질 나노 입자를 제조하기 위한 칩은, 유상 용액과 수상 용액이 계면을 형성하며 혼합되어야 하나, 유상 용액과 수상 용액의 혼합이 상대적으로 용이하지 않은 문제가 있다.
이에 본 발명에서는, 신규한 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩을 제공하는 것으로, 상기 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자용 칩을 이용하는 경우, 핵산을 포함하는 수상 용액 및 지질을 포함하는 유상 용액의 혼합 효율을 높여, 수상 용액과 유상 용액의 계면에서 자기 조립 과정을 통해 균일한 지질 나노 입자를 형성할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩은 유상 용액 공급부; 수상 용액 공급부; 및 스파이럴 구조를 포함하는 믹서부를 포함하고, 상기 믹서부는 상기 유상 용액 공급부 및 상기 수상 용액 공급부에 연결되고, 상기 유상 용액 공급부를 통해 공급되는 유상 용액과, 상기 수상 용액 공급부를 통해 공급되는 수상 용액이 혼합되어 지질 나노 입자를 형성할 수 있다.
상기 믹서부는 배출부와 연결되며, 상기 배출부는 유상 용액 공급부 및 수상 용액 공급부와 연결된 믹서부의 다른 일단에 연결될 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 지질 나노 입자 제조용 칩은 도 2와 같다. 도 2에 의하면, 유상 용액 공급부(100), 수상 용액 공급부(200), 스파이럴 구조를 포함하는 믹서부(300) 및 배출부(400)를 포함할 수 있다.
상기 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)는 믹서부(300)의 일단에 각 결합될 수 있다. 상기 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)를 통해, 유상 용액 및 수상 용액이 믹서부(300) 내부로 유입될 수 있으며, 상기 믹서부(300) 내에서 유상 용액 및 수상 용액이 혼합되며, 지질 나노 입자를 형성할 수 있다.
상기 도 2에 의한 본 발명의 지질 나노 입자 제조용 칩은, 보다 구체적으로, 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)가 z축을 기준으로 하여, 위치하고, y축 방향으로 수직하게 연장된 후, x 축 방향의 믹서부(300)에 결합될 수 있다.
상기 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)는 동일하게 z 축을 기준으로 위치하여 유상 용액과 수상 용액이 각 주입될 수 있도록 하며, 상기 유상 용액 및 수상 용액이 각 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)를 통해 흐르게 되어 유상 용액의 흐름과 수상 용액의 흐름이 만나는 부분에서 수직하게 믹서부(300)와 연결되어, 상기 유상 용액의 흐름과 수상 용액의 흐름이 모두 믹서부(300)의 내부로 이동하게 된다.
상기 유상 용액의 흐름과 수상 용액의 흐름이 마주치게 되는 부분 및 상기 부분에서 수직하게 믹서부(300)에 연결되는 부분에 대한 확대도가 도 3과 같다.
상기 유상 용액 및 수상 용액의 각 흐름과 믹서부(300) 내에서의 혼합 용액의 흐름에 대한 설명은 후술하도록 한다.
상기 도 3에 의하면, 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)는 서로 마주보는 방향에서 접하게 되며, 상기 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)가 접한 부분에서 수직하게 믹서부(300)와 연결된다.
본 발명의 믹서부(300)는 상술한 바와 같이 스파이럴 구조를 포함하는 것을 구조적인 특징으로 하며, 구체적으로 상기 스파이럴 구조는, 둘레면에 나선 궤적을 따라 교대로 형성된 산부(310)와 골부(320)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 스파이럴 구조는, 둘레면이 나선 궤적에 의해 산부(310) 및 골부(320)가 반복하여 형성된 것을 특징으로 하며, 산부(310)에 의한 외부 직경과 골부(320)에 의한 내부 직경의 차이가 나타나게 된다. 즉, 도 5와 같이, 산부(310)에 의해 단면의 원에 대한 직경(Diameter, 330)을 특정할 수 있으며, 골부(320)는 나선 궤적에 의해 움푹하게 들어가는 부분으로, 상기 골부(320)에 의한 단면의 원에 대한 직경(340)도 특정할 수 있다.
상기 믹서부(300)의 단면은 산부(310)에 의한 외경(330)이 1mm 내지 2mm이며, 골부(320)에 의한 내경(340)이 0.5mm 내지 0.6mm일 수 있으며, 산부(310)에 의한 외경(330)이 1mm 내지 1.8mm이며, 골부(320)에 의한 내경(340)이 0.51mm 내지 0.59mm일 수 있으며, 산부(310)에 의한 외경(330)이 1mm 내지 1.5mm이며, 골부(320)에 의한 내경(340)이 0.52mm 내지 0.58mm일 수 있다. 후술하는 바와 같이 상기 믹서부(300) 내에서 유상 용액 및 수상 용액의 흐름이 발생할 때, 믹서부(300)의 외경(330)을 따른 흐름이 발생하며, 내경(340)을 따라 흐르는 흐름이 발생할 수 있다. 즉, 믹서부(300) 내에서 유상 용액 및 수상 용액의 혼합이 발생할 때, 믹서부(300)의 외경(330)을 따라 흐르며 혼합이 발생하기도 하며, 내경(340)을 따라 흐르는 흐름도 발생하며, 상기 외경(330)을 따라 흐르는 흐름과 내경(340)을 따라 흐르는 흐름이 유체의 이동에 따라 혼합이 되면서, 완전히 혼합된 혼합 용액으로 형성되게 된다. 이는, 본 발명의 믹서부(300) 내로 주입된 유상 용액 및 유상 용액의 흐름은, 스파이럴 구조의 형상에 의한 흐름에 의해서만 혼합이 발생하는 것이 아니며, 상기 믹서부(300)의 둘레면을 따라 흐르는 흐름과 중심부에서 일직선으로 흐르는 흐름 간의 혼합이 발생하게 된다.
상기 본 발명의 믹서부(300)는 도 4와 같이 둘레면의 나선 궤적의 간격(Pitch, 350), 산부(310) 및 골부(320)의 깊이(Depth, 370) 및 둘레면의 나선 궤적에 의해 형성된 골부의 폭(Width, 360)을 특정할 수 있다. 구체적으로, 둘레면의 나선 궤적의 간격(Pitch, 350)이 1mm 내지 3mm이며, 산부(310) 및 골부(320)의 깊이(Depth, 370)가 0.1mm 내지 0.5mm이며, 둘레면의 나선 궤적에 의해 형성된 골부의 폭(Width, 360)이 0.1mm 내지 0.5mm일 수 있고, 둘레면의 나선 궤적의 간격(Pitch, 350)이 1.5mm 내지 2.5mm이며, 산부(310) 및 골부(320)의 깊이(Depth, 370)가 0.2mm 내지 0.4mm이며, 둘레면의 나선 궤적에 의해 형성된 골부의 폭(Width, 360)이 0.2mm 내지 0.4mm일 수 있다.
상기 간격(Pitch, 350)은 스파이럴 구조에 의해 둘레면의 특정 지점에서 둘레면을 따라 회전 이동시켜, 시작한 지점과 동일한 지점까지의 길이를 의미하는 것이다. 상기 깊이(Depth, 370)는 믹서부(300)의 단면 상에서 산부(310)와 골부(320)의 간격을 의미하는 것이다. 골부의 폭(Width, 360)은 스파이럴 구조의 반복되는 간격을 의미하는 것으로, 골부의 폭(360)에 따라 나선 궤적이 특정 구간 내에서 반복되는 횟수의 차이가 나타나게 된다.
상기와 같은 스파이럴 구조인 믹서부(300)의 간격(350), 깊이(370) 및 폭(360)의 차이에 따라, 스파이럴 구조의 특징이 달라지게 되며, 스파이럴 구조의 특징이 변화되는 경우, 상기 믹서부(300) 내에서 흐르는 유체의 흐름이 달라지게 되며, 상기 믹서부(300)의 간격(350), 깊이(370) 및 폭(360)에 대한 본 발명의 범위와 후술하는 믹서부(300)의 혼합 구간과 안정화 구간 상의 길이 비 범위 내에서 유상 용액 및 수상 용액의 혼합에 의해 균일한 지질 나노 입자를 형성할 수 있도록 한다.
상기 믹서부(300)는 유상 용액 및 수상 용액이 혼합되는 혼합 구간(380)과, 상기 유상 용액 및 수상 용액이 완전히 혼합된 혼합 용액이 안정화되는 안정화 구간(390)을 포함하며, 상기 혼합 구간(380) 및 안정화 구간(390)의 길이 비가 1:1 내지 1:5일 수 있다.
유체의 흐름에 대한 것은 구체적으로 도 6 내지 8과 같다.
구체적으로 도 7은 상술한 바와 같이 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)를 통해, 유상 용액 및 수상 용액이 주입되면, 상기 유상 용액 및 수상 용액이 서로 마주보는 방향으로 흐르게 되고, 상기 유상 용액의 흐름과 수상 용액의 흐름이 접하는 부분에서 믹서부(300)로 연결되어 상기 유상 용액의 흐름과 수상 용액의 흐름이 계면을 형성하며 믹서부(300)로 이동하게 된다.
상기 믹서부(300)로 이동하게 된 유상 용액 및 수상 용액은 계면을 형성하며, 상기 계면 상에서 지질 나노 입자가 형성되고, 동시에 유상 용액 및 수상 용액은 혼합되어, 혼합 용액을 형성하게 된다. 이때, 상기 유상 용액 및 수상 용액은 믹서부(300) 내에서 도 8과 같은 유체의 흐름에 의해 혼합 효과를 더욱 높일 수 있다.
즉, 상기 본 발명의 믹서부(300)는 상술한 바와 같이 스파이럴 구조인 것을 특징으로 하며, 스파이럴 구조인 믹서부(300)의 둘레부를 따라, 유체의 흐름이 발생하게 되며, 상기 유체의 흐름은, 유상 용액 및 수상 용액의 혼합 효율을 높여줄 수 있고, 계면 상에서 균일한 지질 나노 입자의 형성을 촉진할 수 있다.
상기 믹서부(300)를 따라 혼합되는 유상 용액 및 수상 용액은, 믹서부(300) 내에서 유상 용액 및 수상 용액이 혼합되는 혼합 구간(380)과, 상기 유상 용액 및 수상 용액이 완전히 혼합된 혼합 용액이 안정화되는 안정화 구간(390)을 지나며, 균일한 지질 나노 입자를 형성할 수 있다.
상술한 바와 같이, 유상 용액 및 수상 용액은 믹서부(300) 내에서 완전히 혼합되어 혼합 용액을 형성하고, 상기 혼합 용액을 형성할 때, 유상 용액 내의 지질과 수상 용액의 핵산이 자기 조립에 의하 지질 나노 입자를 형성하기는 하나, 상기 지질 나노 입자의 안정화를 위해, 믹서부(300) 내에서 완전히 혼합된 혼합 용액의 흐름 내에서 안정화되는 단계가 진행된다.
상기 혼합 구간(380) 및 안정화 구간(390)의 길이 비가 1:1 내지 1:5이며, 1:1 내지 1:4이며, 1:2 내지 1:4일 수 있다. 상기 길이 범위 내에서 유상 용액 및 수상 용액이 완전히 혼합되고, 이후 안정화 구간 내에서 완전히 혼합된 혼합 용액이 이동하게 된다. 상기와 같은 유체의 흐름 내에서, 지질 나노 입자의 형성과 형성한 지질 나노 입자의 안정화가 동시에 진행된다.
상기 유체의 혼합에 대해서, 보다 자세히 살펴보면, 도 9와 같다. 도 9는 본 발명의 지질 나노 입자 제조용 칩 내 믹서부(300)의 구간 별로 유상 용액 및 수상 용액의 혼합되는 것을 염색 용액을 통해 확인한 것이다. 유상 용액을 대신하여 노란색 용액을 이용하였으며, 수상 용액을 대신하여 파란색 용액을 이용하였으며, 상기 용액이 완전히 혼합되면 초록색 용액으로 색상을 통해 혼합 여부를 확인하였다.
구체적으로 상기 도 9에 표시한 3군데 부분에서의 유동의 실험 결과 값(experiment)이다. 실험에 사용된 작동 유체는 수상 용액으로는 탈이온수(Deionized Water)를 사용하였으며, 노란색 염료를 50 μM 농도로 희석한 용액을 사용하였으며, 유상 용액으로는 에탄올에 파란색 염료를 50 μM 농도로 희석한 용액을 사용하였다. 두 용액의 믹서부 내부에서의 용액 간의 접촉면의 촬영은 믹서부의 윗면과 수직한 방향에서 촬영하였다. 촬영한 이미지의 화소(Pixel)에 기반한 강도(Intensity)를 이미지의 가로 방향(x축)을 n개수로 나누고 세로방향(y축)을 m개수로 나누어 각각의 이미지에서 n-by-m Pixel을 통하여 분석하였다. 측정하고자 하는 위치에서 각각의 유량에 맞는 유체의 흐름이 시간에 따라 변하지 않는 정상상태(Steady State)로 안정화되었을 때 촬영을 하였으며, 추가적으로 보다 정확한 상대적인 분석을 위하여 유상 용액이 흐를 때와 탈이온수만 흐를 때를 촬영하였고, 유상 용액만 흐를 때를 100% Mixing, 즉 완전히 혼합이 진행된 상태 값으로 반영하고 탈이온수만 흐를 때를 0% Mixing, 아직 Mixing이 진행되지 않은 상태로 값을 반영하였다.
도 9의 A 구간은 믹서부(300)의 시작 부분에서 용액의 혼합을 확인한 것으로, A 구간은 노란색 용액과 파란색 용액이 혼합되는 구간으로, 노란색 용액 및 파란색 용액도 확인이 되며, 상기 두 용액이 혼합되어 초록색을 나타내는 부분도 확인된다.
상기 도 9의 B 구간은 A 구간을 통과하여 두 용액의 혼합 정도를 확인하는 것으로, A 구간에 비해 보다 초록색을 나타내는 부분이 확인되어, 상대적으로 완전한 혼합 용액이 더 포함되어 있는 것을 확인할 수 있다.
상기 도 9의 C 구간은 안정화 구간을 확인한 것으로, 완전히 혼합된 용액 상태인 것을 색상을 통해 확인할 수 있다.
반면 도 1은, KR 10-2361123 B1 상의 지질 나노 입자 제조용 칩에 대한 유체의 혼합에 대한 것으로, 본 발명과 같이 유상 용액 및 수상 용액이 주입된 후, 혼합되는 과정에서 상기 칩의 전체 구간 내에서 완전한 혼합이 나타나지 않음을 확인할 수 있어 본 발명의 지질 나노 입자 제조용 칩에 비해 유상 용액 및 수상 용액의 완전한 혼합 정도에서 차이가 나타남을 확인할 수 있다.
도 1의 지질 나노 입자 제조용 칩을 사용하면, 상술한 바와 같이 유상 용액 및 수상 용액의 완전한 혼합이 나타나지 않거나, 아니면 완전한 혼합을 위해선 칩 내 원환체 혼합 엘리먼트가 추가로 결합되어야 한다. 즉, 상기 유상 용액 및 수상 용액이 완전히 혼합되지 못하는 경우는, 유상 용액 및 수상 용액의 혼합되는 과정 상에서 지질 나노 입자가 형성되기는 하나, 본 발명의 지질 나노 입자 제조용 칩과 달리 안정화 구간을 거치지 않아, 지질 나노 입자 간에 충돌이 발생하기도 하고 뭉침이 발생할 수도 있어 균일한 지질 나노 입자로의 제조가 용이하지 않은 문제가 발생할 수 있다. 또한, 완전한 혼합을 위해, 원환체 혼합 엘리먼트가 추가로 결합되는 경우는, 칩의 사이즈가 커지게 되어 비용적인 측면에서 바람직하지 못하다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 지질 나노 입자의 제조 방법은 핵산을 포함하는 수상 용액을 제조하는 단계(S100); 지질을 유기 용액에 용해하여 유상 용액을 제조하는 단계(S200); 상기 수상 용액 및 유상 용액을 상술한 지질 나노 입자 제조용 칩 상의 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)로 공급하는 단계(S300); 및 상기 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)로 공급된 유상 용액 및 수상 용액이 믹서부(300) 내에서 혼합되어 지질 나노 입자를 형성하는 단계(S400)를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 S100 단계는, 핵산을 용매에 혼합하여, 수상 용액을 제조한다. 상기 용매는 시트르산 용액으로, pH 3.0인 것이나, 상기 예시에 제한되지 않고, 핵산을 혼합하여, 지질 나노입자를 제조할 수 있는 용매는 제한 없이 모두 사용 가능하다.
상기 핵산은 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), mRNA(messenger RNA) 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 mRNA이나, 상기 예시에 국한되지 않는다.
상기 핵산은 질병을 예방 또는 치료하기 위한 용도이며, 일 예시로, 코로나 19 백신과 같이 코로나 19 바이러스에 대항하기 위한 스파이크 단백질을 합성하게 한다. 상기 예시에 국한되지 않고, 질병의 예방 또는 치료를 위한 핵산은 모두 사용이 가능하다.
상기 S200 단계는, 이온화 지질, 비이온화 지질(non-Ionizable lipid), 중성지질 및 융합성 지질을 유기 용액에 용해하여 유상 용액을 제조하는 것이다.
상기 이온화 지질은 ALC-0315(제네반트), ALC-0159(제네반트), DLinDAP, Dlin-MC3-DMA 또는 SM102(알뷰투스) 등을 이용할 수 있다. 상기 이온화 지질은 예시에 국한되지 않고 지질 나노입자의 제조에 이용될 수 있는 이온화 지질은 제한 없이 모두 사용 가능하다.
상기 비이온화 지질은 융합성 지질과 함께 지질 나노입자의 안정성을 높이기 위해 포함될 수 있다. 지질 나노입자는 목적하는 조직이나 기관에 핵산을 도달하게 하기 위한 것이나, 체내 주입 후, 목적하는 조직이나 기관에 도달하기 전에 파괴되는 문제가 있다. 이러한 문제를 방지하고자, 비이온화 지질 및 융합성 지질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 비이온화 지질은 DSPC(distearoylphosphatidylcholine), DOPE(dioleolphosphatidyl ethanolamine), DPPE(bis(diphenylphosphino)ethane), 디아실포스파티딜콜린(diacyl phosphatidylcholine), 디아실포스파티딜에탄올아민(diacylphosphatidylethanolamine), 디아실포스파티딜세린(diacylphosphatidylserine) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 DSPC이지만, 상기 예시에 국한되지 않는다.
상기 융합성 지질은 콜레스테롤, 토코페롤 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 콜레스테롤이나 상기 예시에 국한되지 않는다.
상기 중성지질은 입자의 크기를 조절하고, 보관 중 응집을 방지하는 입체 장벽 역할을 하기 위해 포함되는 것으로, 구체적으로 폴리에틸렌글리콜 2000 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(PEG(2000) DSPE), DMG-PEG, PEG-DMPE, DPPE-PEG, DPG-PEG, PEG-DOPE 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 DMG-PEG이지만, 상기 예시에 국한되지 않는다.
상기 유상 용액을 제조하기 위해 사용되는 유기 용액은 알코올이며, 구체적으로 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올 등 일 수 있으나, 바람직하게는 에탄올이지만, 상기 예시에 국한되지 않고 이온화 지질을 균일하게 용해시킬 수 있는 유기 용매는 제한 없이 모두 사용 가능하다.
상기 S300 단계는, 상기 S100 및 S200 단계에서 제조한 수상 용액 및 유상 용액을, 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)로 주입하여 흐르게 하는 것이다. 상기 유상 용액 공급부(100) 및 수상 용액 공급부(200)로 각각 주입된 유상 용액 및 수상 용액에 대한 흐름은 상술한 바와 같이, 서로 마주보는 방향으로 흐르게 되며, 상기 두 흐름의 교차점에서 믹서부(300)로 연결되어, 믹서부(300) 내에서 층류(laminar flow)를 형성하여 믹서부(300) 내에서 혼합될 수 있다.
상기 S400 단계는, 믹서부(300)로 주입된 수상 용액과 유상 용액이 교차점에서 층류를 형성하여 믹서부(300) 내에서 혼합되고, 상기 수상 용액 내 핵산, 상기 유상 용액 내 이온화 지질, 비이온화 지질, 중성지질 및 융합성 지질이 정전기적 인력에 의한 자기 조립 과정을 통해, 결합되어 지질 나노 입자를 형성할 수 있다. 즉, 수상 용액과 유상 용액을 혼합하여 지질 나노 입자를 제조하며, 상기 유상 용액에는 4종의 지질이 모두 혼합된 상태를 이용할 수 있다.
상기 핵산은 구체적으로 mRNA이며, mRNA는 앞서 설명한 바와 같이 음이온성이며, 이온화 지질은 양이온성으로 상호간 정전기적 인력에 의해 결합되는 힘이 발생하게 되며, 이로 인해 지질 나노 입자를 형성할 수 있다.
상기 S400 단계에서, 상기 유상 용액 및 수상 용액은 믹서부(300)의 둘레면 상의 나선 궤적을 따라 유동하여 혼합되어 혼합 용액을 형성할 수 있고, 이때 유상 용액 및 수상 용액이 혼합되는 혼합 구간(380)과, 상기 혼합 구간(380)을 통과하며 지질 나노 입자를 형성한 혼합 용액이 나선 궤적을 따라 유동하며 안정화되는 안정화 구간(390)을 통과하게 된다. 즉, 상기 혼합 구간(380) 내에서는, 상기 유상 용액 및 수상 용액은 믹서부(300)의 둘레면 상의 나선 궤적을 따라 계면을 형성하고, 상기 계면 상에서 유상 용액의 지질과 수상 용액의 핵산이 자기 조립 과정을 통해 지질 나노 입자가 형성할 수 있다. 상기 믹서부(300)의 둘레면 상에서 나선 궤적을 따라 유상 용액과 수상 용액이 계면을 형성하는 것은 상술한 바와 같이 도 8과 같은 흐름에 의해 형성될 수 있다.
상기 유상 용액 및 수상 용액을 유상 용액 공급부 및 수상 용액 공급부로 각각 공급할 때의 유량비가 1:1 내지 1:5이며, 1:1 내지 1:4이며, 1:2 내지 1:4일 수 있다. 상기 범위 내에서 혼합하여 사용 시, 입자의 크기가 균일한 지질 나노입자로의 제조가 가능하다. 보다 구체적으로 상기 범위 미만으로 포함하는 경우, 후 공정의 진행 시 에탄올의 함량이 많아 지질 나노입자의 형태 유지가 어려운 문제가 있으며, 상기 범위를 초과하여 포함하는 경우, 수상 용액이 다량 포함됨에 따라, 수상 용액 내 지질 입자의 움직임이 제한되어 직경이 너무 작은 입자를 형성하는 문제가 있다.
상기 유상 용액 및 수상 용액의 총 유량은 5mL/min 내지 50mL/min이며, 총 유량은 10mL/min 내지 45mL/min이며, 총 유량은 15mL/min 내지 40mL/min일 수 있다. 상기 총유량 범위 내에서, 상기 믹서부(300)의 혼합 구간(380) 내에서 완전이 유상 용액과 수상 용액이 빠른 시간에 완전히 혼합될 수 있어, 균일한 지질 나노 입자를 제조할 수 있다.
도 10는 본 발명의 유상 용액 및 수상 용액의 총 유량에 따른 믹서부(300) 내 혼합 구간(380)의 길이를 확인하기 위한 것으로, 상기 범위 내에서는, 믹서부(300)의 혼합 구간(380) 및 안정화 구간(390)의 길이비가 1:1 내지 1:5인 범위 내에서 완전한 혼합 용액을 형성하는 것을 확인할 수 있다.
도 11 내지 도 15는 총 유량을 4mL/min 내지 68mL/min으로 변경하며 도 9와 동일한 A 내지 C 구간에서의 유동의 실험 결과 값(experiment)을 확인한 결과이다. 상기 도 14의 실험 결과와 같이 확인해보면, 유상 용액 및 수상 용액의 총 유량을 4mL/min인 경우는 완전한 혼합 용액을 형성하기까지, 믹싱부(300)의 도입부인 0mm 내지 2mm의 구간 내에서 mixing index가 현저히 낮아지기 때문에 혼합 용액 내에서 지질 나노 입자의 형성이 용이하지 않은 문제가 있다.
또한, 유상 용액 및 수상 용액의 총 유량이 52mL/min이거나, 68mL/min인 경우에서도 믹서부(300)의 A 부분에서 유상 용액 및 수상 용액의 혼합되는 속도가 상대적으로 느려 혼합 용액 내에서 지질 나노 입자의 형성이 용이하지 않은 문제가 있다.
반면, 유상 용액 및 수상 용액의 총 유량이 20mL/min이거나, 36mL/min인 경우는 믹서부(300)의 A 부분에서 폭발적인 두 용액의 혼합이 발생하고, 빠르게 혼합이 되는 것을 확인할 수 있으며, 완전한 혼합 용액을 형성하는 구간이 짧아, 혼합 구간 내에서 균일한 직경을 갖는 지질 나노 입자를 형성할 수 있다.
상기 S400 단계에서 형성된 지질 나노 입자는 이후, 희석 및 여과하는 후처리 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 지질 나노 입자 제조용 칩은, 유리 기판, 실리콘 웨이퍼 또는 고분자 필름으로 이루어진 군으로부터 선택된 소재에 형성될 수 있으나, 상기 소재의 예시는 상기 예시에 국한되지 않고, 마이크로 채널의 형성이 가능한 소재는 모두 사용 가능하다.
상기 고분자 필름은 폴리이미드(Polyimide), 폴리에틸렌(Polyethylene), 플루오르화에틸렌프로필렌(Fluorinated ethylene propylene), 폴리프로필렌(Polypropylene), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(Polyethylene terephthalate), 폴리에틸렌 나프탈레이트(Polyethylene naphthalate), 폴리술폰(Polysulfone) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 상기 예시에 국한되지 않는다.
일 예시로, 실리콘 웨이퍼에 e-beam evaporator를 이용하여 알루미늄을 증착하며, 포토리소그래피(photolithography) 기법을 이용하여 포토레지스트(photoresist)를 알루미늄 위에 패터닝한다. 이후, 포토레지스트를 마스크로 이용하여 알루미늄 식각(etching)하고, 포토레지스트를 제거한 후 알루미늄을 마스크로 하여 실리콘을 DRIE(deep ion reactive etching)로 에칭하고, 알루미늄 제거 후 웨이퍼 위에 유리를 양극 접합하여 밀봉하여, 제조할 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명은 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩 및 이를 이용한 지질 나노 입자 제조 방법에 관한 것이다.

Claims (15)

  1. 유상 용액 공급부;
    수상 용액 공급부; 및
    스파이럴 구조를 포함하는 믹서부를 포함하고,
    상기 믹서부는 상기 유상 용액 공급부 및 상기 수상 용액 공급부에 연결되고, 상기 유상 용액 공급부를 통해 공급되는 유상 용액과, 상기 수상 용액 공급부를 통해 공급되는 수상 용액이 혼합되어 지질 나노 입자를 형성하는
    지질 나노 입자 제조용 칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 믹서부는 둘레면에 나선 궤적을 따라 교대로 형성된 산부와 골부를 포함하는
    지질 나노 입자 제조용 칩.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 믹서부의 단면은 산부에 의한 외경이 1mm 내지 2mm이며, 골부에 의한 내경이 0.5mm 내지 0.6mm인
    지질 나노 입자 제조용 칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 믹서부는 둘레면의 나선 궤적의 간격(Pitch)이 1mm 내지 3mm인
    지질 나노 입자 제조용 칩.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 믹서부는 산부 및 골부의 깊이(Depth)가 0.1mm 내지 0.5mm인
    지질 나노 입자 제조용 칩.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 믹서부는 둘레면의 나선 궤적에 의해 형성된 골부의 폭(Width)이 0.1mm 내지 0.5mm인
    지질 나노 입자 제조용 칩.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 믹서부는 유상 용액 및 수상 용액이 혼합되는 혼합 구간과, 상기 유상 용액 및 수상 용액이 완전히 혼합된 혼합 용액이 안정화되는 안정화 구간을 포함하며,
    상기 혼합 구간 및 안정화 구간의 길이 비가 1:1 내지 1:5인
    지질 나노 입자 제조용 칩.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 믹서부는 배출부와 연결되며,
    상기 배출부는 유상 용액 공급부 및 수상 용액 공급부와 연결된 믹서부의 다른 일단에 연결되는
    지질 나노 입자 제조용 칩.
  9. 핵산을 포함하는 수상 용액을 제조하는 단계;
    지질을 유기 용액에 용해하여 유상 용액을 제조하는 단계;
    상기 수상 용액 및 유상 용액을 제1항에 따른 지질 나노 입자 제조용 칩 상의 유상 용액 공급부 및 수상 용액 공급부로 공급하는 단계; 및
    상기 유상 용액 공급부 및 수상 용액 공급부로 공급된 유상 용액 및 수상 용액이 믹서부 내에서 혼합되어 지질 나노 입자를 형성하는 단계를 포함하는
    지질 나노 입자의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 유상 용액 및 수상 용액은 믹서부의 둘레면 상의 나선 궤적을 따라 유동하여 혼합되어 혼합 용액을 형성하며,
    상기 혼합 용액이 나선 궤적을 따라 유동하며 안정화되는
    지질 나노 입자의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 유상 용액 및 수상 용액은 믹서부의 둘레면 상의 나선 궤적을 따라 계면을 형성하고, 상기 계면 상에서 유상 용액의 지질과 수상 용액의 핵산이 자기 조립 과정을 통해 지질 나노 입자가 형성되는
    지질 나노 입자의 제조 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 유상 용액 및 수상 용액은 믹서부를 유동하며 혼합 용액을 형성하는 혼합 구간과 상기 혼합 용액이 안정화되는 안정화 구간을 이동하며,
    상기 혼합 구간 및 안정화 구간의 길이 비가 1:1 내지 1:5인
    지질 나노 입자의 제조 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 유상 용액 및 수상 용액을 유상 용액 공급부 및 수상 용액 공급부로 각각 공급할 때의 유량비가 1:1 내지 1:5인
    지질 나노 입자의 제조 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 유상 용액 및 수상 용액의 총 유량은 5mL/min 내지 50mL/min인
    지질 나노 입자의 제조 방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 지질 나노 입자를 형성하는 단계 이후,
    희석 및 여과하는 후처리 단계를 추가로 포함하는
    지질 나노 입자의 제조 방법.
PCT/KR2023/016813 2023-01-04 2023-10-27 스파이럴 구조를 포함하는 지질 나노 입자 제조용 칩 및 이를 이용한 지질 나노 입자 제조 방법 Pending WO2024147456A1 (ko)

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