BRPI0613123A2 - enxerto sem células - Google Patents

Abstract

ENXERTO SEM CéLULAS. A presente invenção refere-se a um enxerto sem células, que compreende (i) uma matriz coesiva, formadora de estruturas com porosidade aberta feita a partir de material biologicamente e farmaceuticamente aceitável e (ii) soro. Em uma das modalidades particularmente preferidas, a matriz contém adicionalmente um gel. Em virtude de um segundo aspecto, é proposto um método de produzir tal enxerto sem células, pelo que a matriz e o gel, se um é provido, são colocados em contato com o soro. O enxerto pode, opcionalmente, ser secado com o soro. Alternativamente, a matriz e o gel, se um é provido, estão em estado seco antes de serem colocados em contato com o soro. Em virtude de um terceiro aspecto, finalmente, a invenção propõe o uso do enxerto sem células para a regeneração de tecidos e em particular para a regeneração cartilagem e/ou osso.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENXERTO SEM CÉLULAS".

A presente invenção refere-se ao enxerto sem células pararegenerar tecido e, em particular, para regenerar cartilagem, um método deproduzir o mesmo e o uso do enxerto para regenerar tecido.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A cartilagem é uma forma de tecido mesodérmico derivado dotecido conjuntivo, que é criado por células precursoras multipotentes,indiferenciadas, mesenquimais. É feita uma distinção entre três tipos decartilagem, hialina, elástica e fibrocartilagem. Cartilagem hialina é semdúvida a forma mais comum de cartilagem e é encontrada nas superfíciesdas articulações, por exemplo. Defeitos de cartilagem causados pordesgaste ou lesão constituem um problema médico muito difundido. Devidoà densidade da cartilagem da inflamação convencional do corpo e sistemade restauração, ela tem apenas uma baixa capacidade de autocura. Por sereste o caso, métodos e técnicas têm sido desenvolvidos no passado, e emparticular durante os últimos poucos anos, como um meio de substituição deáreas condrais como também osteocondrais na cartilagem da articulação.

Por exemplo, a cartilagem das articulações têm sido substituídas por perios,pericôndrio, enxertos osteocondrais alogênicos e autólogos, meniscosalogênicos ou próteses feitas de materiais sintéticos.

Em situações que envolvem enxerto autólogo de condrócitos, oscondrócitos retirados do paciente são cultivados em cultura de célula edevolvidos para o paciente novamente. Eles podem ser devolvidos na formade vários tipos diferentes de transplantes. Exemplos desses são soluções deinjeção que são injetadas na articulação, matrizes injetadas com célulascartilaginosas e similares.

A especificação de Patente WO 97/15655, por exemplo, descrevetecidos artificiais que compreendem matrizes extracelulares tridimensionaise células manipuladas geneticamente, e as matrizes são capazes de liberarimunossupressores ou fatores de diferenciação de células. Essas matrizespreferivelmente tomam a forma de uma lã de polímero, através das quaisuma suspensão de célula, que pode ser suspensa em uma solução defibrinogênio, é distribuída. Fatores ou componentes da matriz extracelularcorrespondente, necessários para o processo de crescimento e / oudiferenciação, podem também ser adicionados à matriz. A fim de manter as5 células na matriz, as suspensões de células podem ser solidificadasadicionando trombina, dessa maneira resultando no enxerto acabado.

A especificação de Patente DE 44 31 598 descreve um métodode produzir um implante de culturas de células, por meio do qual asestruturas de apoio, tridimensionais, às quais as células são aplicadas, sãoprimeiro encapsuladas e depois perfundidas com uma solução nutriente.Microcorpos reabsorvíveis são incorporados nas estruturas de apoio, queliberam fatores influenciando a formação do tecido à medida que sãoreabsorvidos.

A especificação de Patente DE 43 06 661 descreve umaestrutura de apoio tridimensional, feita preferivelmente de uma lã depolímero, na qual as células são incorporadas. A estrutura de apoio é depoisperfundida com solução nutriente a fim de promover o crescimento dascélulas e a formação de uma matriz extracelular pelas células. A fim deevitar a migração das células ou extenuação, a estrutura de apoio éencapsulada com agarose.

A especificação de Patente DE 10139 783 também descreve ouso de células mesenquimais em fluido sinovial. Se desejado, essacomposição pode também ser aplicada para um apoio, tal como uma lã ouum plástico, e usada como um enxerto nessa forma. De outra maneira, asuspensão de células em fluido sinovial é injetada como tal na articulaçãorelevante.

Alternativamente, as estruturas da matriz são sintetizadas demodo a realmente não conterem nenhuma célula. Por exemplo, aespecificação de patente US 2003/0003153 descreve membranas de matrizenrijecidas contendo uma ou mais proteínas de formação de estruturaapropriadas para crescimento de células. Proteínas apropriadas são ocolágeno, por exemplo. As matrizes resultantes em forma de membranapodem ser injetadas com células, ou enxertadas como elas são. No últimocaso, supõe-se que as células do próprio tecido do corpo vão migrar paradentro da estrutura da matriz. Isso é feito por meio de uma perfuração oumicrofragmentação Pridie convencional, por exemplo. Com essas técnicas,são feitas pequenas perfurações ou fraturas no osso da articulação até amedula óssea. O sangue flui através das perfurações no defeito, comoresultado do que o defeito é preenchido com um enxerto de sangue. Oenxerto contém células precursoras mesenquimais, que, estimuladas porímpetos apropriados, são capazes de formar um tecido de substituição tipouma cartilagem, a chamada fibrocartilagem. Se um material de matriz écolocado sobre a perfuração Pridie, as células do sangue são capazes demigrar para dentro desse material da matriz, onde elas ficam instaladas.

As especificações de Patente DE 199 57 388 e WO 2005/014027usam esse efeito e o aumentam, incorporando fatores de crescimento ediferenciação (DE 199 57 388) ou quimiocinas (WO 2005/014027), naestrutura da matriz como meio de recrutar. Todos os fatores se destinam aresultar em aumento do recrutamento das células precursorasmesenquimais de formação de cartilagem, sendo que o principal objetivo éregenerar a cartilagem mais rapidamente.

As especificações de Patente WO 02/00272, finalmente,descrevem a possibilidade de produzir enxertos apropriados a partir dosangue e um componente de polímero. O problema subjacente abordado poresse documento é o fato de que o enxerto de sangue, que forma comopadrão usar a técnica de perfuração Pridie, contrai sobre a coagulação edessa maneira muda a forma. O polímero adicionado previne essa mudançade forma e, dessa maneira, permite verdadeira cura assumir uma forma. Afim de produzir o enxerto, um polímero é mixado com sangue ou umcomponente de sangue tal como eritrócitos, leucócitos, monócitos,plaquetas, fibrinogênio, trombina e plasma rico em plaquetas, e introduzidono defeito. Se usar um componente de sangue, entretanto, a presença dematerial capaz de coagular é um fator significativo em termos de alcançar oefeito desejado.Enxertos feitos a partir de quitosana e condrócitos podem serusados como uma alternativa. Uma vez que as células são introduzidas nodefeito como descrito acima, a adição de substâncias com propósitos deatração e / ou fatores de diferenciação e crescimento pode ser dispensada.

As tecnologias descritas acima têm desvantagens porque, se opróprio enxerto contém células, elas são muitas vezes danificadas devido àmanipulação durante o manuseio, e se células são usadas para o enxerto,em particular células autólogas, elas têm que ser produzidas por processode cultura longo, e devem ser cuidadosamente controladas para evitarcontaminação, e finalmente, não existe possibilidade de armazenamento.

Em paralelo, o recrutamento de enxertos sem células de célulasmesenquimais através de uma purfuração Pridie, com ou sem assubstâncias usadas para fins de atração, provou não ser satisfatório. Acolonização é lenta, é iniciada por poucas células e é também nãoespecífica. Isto significa que diferentes tipos de células são descarregadosno enxerto a partir do sangue saindo da prefuração Pridie e alipermanecendo. Entretanto, é somente a colonização por células precursorasmesenquimais que faz a diferenciação para condrócitos que é desejada. Nocaso de enxertos convencionais, entretanto, isto não é garantido.

Entre outras coisas, portanto, o objetivo da invenção é propor umenxerto que é simples de produzir, pode ser prontamente armazenado e ésimples de aplicar. Além do mais, será desejável aumentar as taxas derecrutamento por meio do enxerto, obter melhor seletividade para o tipo decélulas recrutadas e dispostas no enxerto, e dispensar tanto quanto possívelo uso de fatores de crescimento estranhos ao corpo e opcionalmente atéfatores de crescimento recombinantes, que representam alérgenos empotencial.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção supera esses e outros problemas conhecidos datécnica anterior. Com essa finalidade, um enxerto sem circular é proposto,compreendendo (i) uma matriz formadora de estrutura coesiva com umaporosidade aberta feita de um material biologicamente e farmaceuticamenteaceitável (ii) e soro. Em uma modalidade particularmente preferida, a matrizadicionalmente contém um gel.

Em virtude de um segundo aspecto, é proposto um método deproduzir tal enxerto sem células, pelo que a matriz e o gel, se um é provido,são colocados em contato com o soro. Opcionalmente, o enxerto pode sersecado com o soro. Alternativamente, a matriz e o gel, se um é provido,pode estar no estado seco antes de ser colocado em contato com o soro.

Com base em um terceiro aspecto, a invenção finalmente refere-se ao uso do enxerto sem células para regenerar tecido e em particular pararegenerar cartilagem e / ou osso.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra o efeito quimiotático de CDMP1, CDMP2,SDFI-α e IL8 sobre as células tronco mesenquimais de seres humanos invitro;

A figura 2 mostra o efeito quimiotático de soro humano do sanguesobre células tronco mesenquimais de seres humanos in vitro.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como explicado acima, a invenção refere-se a um enxerto semcélulas que compreende (i) uma matriz coesiva, de formação de estruturacom porosidade aberta feita de um material biologicamente efarmaceuticamente aceitável e (ii) soro. De maneira surpreendente, usar osoro nó enxerto sem células, proposto pela invenção, permite a eficiência dorecrutamento de células precursoras mesenquimais da medula óssea,através das quais o sangue flui, para ser aumentadas por diversos fatores.

Esse aumento surpreendente na eficiência do recrutamento por sua veztorna óbvia a necessidade de introduzir células diferenciadas ou célulasprecursoras no enxerto separadamente, o que facilita e diminui o manuseiodo enxerto e também permite o armazenamento.

O soro do sangue pode ser facilmente obtido de uma maneiraconvencional. Por preferência, ele pode ser tirado diretamente do pacientedurante o transplante. O material autólogo pode, portanto, ser implantado nopaciente, mas não há necessidade de adicionar outro, potencialmentealergênico θ / ou fatores imunoativos.

A matriz do enxerto sem células, proposto pela invenção, é umamatriz formadora de estrutura, coesiva, de porosidade aberta. A expressão"coesiva" neste contexto deverá ser interpretada como significando a matrizque permite o enxerto ser manuseado sem se desfazer em partes individuaisou bits. Não é necessário que todas as partes da matriz sejam ligadas umasàs outras por ligações ou interações químicas. Uma articulação mecânica naforma de tecelagem, pisoagem, torção ou os similares é suficiente.

A expressão "formação de estrutura" neste contexto deverá serinterpretada como significando a propriedade da matriz funcionar como umaformadora de estrutura para as células migrarem para a matriz do tecido afim de serem produzidas. A matriz também atua como uma armação ou redeque as células são capazes de colonizar e onde elas encontram ponto deapoio, de modo a não serem arrastadas para fora da matriz por fluido ousangue sinovial, por exemplo.

Finalmente, "porosidade aberta" no contexto da invenção deveráser interpretada como significando que os espaços entre as estruturas doarcabouço da matriz são accessíveis para uma substância e, em particular,para uma troca de fluído com a área em torno da matriz. O tamanho de porodos poros é preferivelmente dimensionado de modo que a penetração oucirculação é também possível pelas células. Entretanto, a expressãoporosidade aberta, como usada no contexto da invenção, destina-se tambéma significar uma estrutura tal como a predominante em géis. É aqui que asestruturas do arcabouço da matriz são providas pelo esqueleto da estruturaanterior. Dispostos entre elas estão bolsas e fluido de hidrato, em que ascélulas podem penetrar e que permitem uma troca de fluido. Estruturas degel apropriadas devem portanto também ser interpretadas como matrizescom porosidade aberta dentro do contexto da invenção.

As estruturas de arcabouço com porosidade aberta sãopreferivelmente selecionadas a partir de tecidos trançado ou não trançado(em particular estruturas de lã e feltro), membranas, esponjas, bucha,espumas de células abertas, lã, tranças, feixes de fibras ordenados oualeatórios, materiais de cerâmica porosos, esponjosas e géis, como tambémcombinações desses. A matriz preferivelmente tem uma estrutura de lã oufeltro. Combinações de estruturas diferentes, por exemplo em umadisposição em camadas, são também possíveis e estão incluídas no escopoda invenção.

Em princípio, o material da matriz pode ser qualquer materialapropriado, biológicamente e farmaceuticamente aceitável. O material deorigem usado na matriz proposta pela invenção pode ser reabsorvível ounão reabsorvível. Materiais reabsorvíveis são preferidos. A matriz épreferivelmente um material selecionado do grupo que compreendepolímeros naturais e sintéticos, tais como colágeno, ácido hialurônico,quitosana, quitina, polissacarídeos, celuloses e seus derivados, proteínas,polipeptídeos, ácido poliglicólico, ácido polilático, poli(glicolídeo, lactato),caprolactam, materiais de cerâmica tais como óxidos, carbonetos, nitretos ecarbonitretos de metais, em particular oxido de silicone, oxido de titânio eoxido de cálcio; minerais tais como halogenetos, em particular fluoretos,hidróxidos, sulfatos de metais, preferivelmente metais fisiologicamenteinofensivos tais como fosfato de cálcio, apatita, hidroxila apatita; metaiscomo titânio, alumínio, ouro, prata, aço inoxidável e misturas dos mesmos.

Mais especificamente preferidos são ácido poliglicólico (PGA), ácidopolilático, colágeno ou ácido hialurônico.

Com relação aos ácidos poliglicólicos, é preferível usar ácidospoliglicólicos puros com pesos moleculares de > 20.000, preferivelmente3,000 a 70,000 g/mol, mais especialmente preferivelmente cerca de 50,000g/mol. O material da matriz pode ser uma lã de ácido poliglicólico, tal comoaquela vendida pela Alpha Research Switzerland GmbH sob a marcaregistrada PGA-Soft Felt7. No caso deste produto, o tempo de reabsorção invivo é cerca de 40 a 60 dias. Depois de sete dias in vitro, a resistênciamecânica é ainda cerca de 50% do valor inicial como resultado da hidrólise.

Em uma modalidade particularmente preferida, o enxerto decélula livre contém um gel em adição à matriz. O gel é aplicado em pelomenos um lado da matriz e / ou pelo menos parcialmente penetra nela. Porpreferência, o gel penetra nela totalmente. Se a matiz contém tal gel, aprópria matriz preferivelmente tem uma estrutura diferente daquela de umgel. Mais especialmente preferivelmente são usadas estruturas mais rígidas,como explicitamente especificado acima, com a exceção dos géis. Dessamaneira, o gel é preferivelmente de uma rigidez menor do que a da matriz.Mais preferivelmente, estruturas de lã e feltro são usadas, nas quais um gelé introduzido.

O gel pode ser um hidro-gel natural ou sintético. Épreferivelmente de uma rigidez menor do que a da matriz. Por exemplo, ogel pode ser selecionado de polissacarídeos, polipeptídeos, ácidohialurônico, fibrina, colágeno, alginato, agarose e quitosana, como tambémsais, derivados e misturas dos mesmos. Sais apropriados são os sais deálcale e alcalinos-terrosos dos ditos géis, por exemplo. Os mais preferidossão: ácido hialurônico ou um sal de ácido hialurônico tal como Nahialuronato.

Em termos de qualidade do ácido hialurônico, as qualidadesproduzidas por fermentação podem ser usadas. Alternativamente, é tambémpossível usar o ácido hialurônico obtido de animais. A média de pesomolecular das qualidades usadas é geralmente entre 250 e 6.000 kDa,preferivelmente 1.000 a 2.000 kDa, mais preferivelmente aproximadamente1.200 kDa. Produtos de ácido hialurônico apropriados estão comercialmentedisponíveis. Uma qualidade de ácido hialurônico apropriada é TRBChemedika AG vendida sob a marca registrada Ostenil®, por exemplo. Essematerial é certificado pela EC e portanto apropriado para fins farmacêuticos.

Os géis podem ser obtidos de fontes, precipitações oupolimerização de um formador de gel apropriado em uma soluçãofisiologicamente apropriada. Exemplos de tais soluções apropriadas são aágua, tal como soluções aquosas de sais (por exemplo halogeneto de álcalee alcalino-terroso (Cl, Br, I), carbonatos, fosfatos, citratos, acetatos e ossimilares), ácidos orgânicos, substâncias de tampão e misturas dasmesmas. Alternativamente, soluções mais complexas podem ser usadas,tais como meios de cultura ou fluidos do corpo, ou soluções derivadas delestais como fluido sinovial ou soro. A quantidade de formador de gel usada éselecionada de modo que uma viscosidade adequada do gel seja obtida. Nocaso do ácido hialurônico, essa está usualmente dentro da faixa de 0,5-50mg/ml, preferivelmente 0,5-20 mg/ml, mais preferivelmente 10 mg/ml.

O enxerto mais preferido é aquele com uma matriz feita de lã oufeltro PGA, em que o gel de ácido hialurônico é incorporado.

As dimensões do enxerto sem células proposto pela invenção,geralmente depende das dimensões da faixa a ser tratada e do requisito detamanho do enxerto. As dimensões podem ser adaptadas como requeridopelo médico que está administrando o tratamento. Para lesões no tecido decartilagem, especialmente na articulação do joelho, essas dimensões sãousualmente na faixa de 10 a 50 mm de comprimento, 10 a 50 mm de largurae 0,5 a 3 mm de espessura, preferivelmente 10 a 30 mm de comprimento, 10a 30 mm de largura e 1 a 2 mm de espessura. Mais preferivelmente seriamtamanhos de 20 χ 20 mm de largura e comprimento 1,1 a 2 mm deespessura. As dimensões podem ser adaptadas para formatos não-quadrados, por exemplo, retangular, redondo, oval, poliédrico etc.

A vantagem da combinação de matriz e gel no enxerto semcélulas proposto pela invenção é que o gel forma uma barreira mecânicacom respeito às células de maneira diferente dos precursoresmesenquimais, ou células do sangue que penetram a perfuração Pridie oufraturas similares. Isso permite uma migração seletiva das célulasprecursoras mesenquimais no enxerto. Somente esses se estabelecem namatriz, portanto, e se diferenciam das células do tecido desejado. Ocrescimento de outras células sobre as células formadoras de tecidodesejadas é portanto evitado ou significativamente reduzido.

Ao mesmo tempo, o gel promove a retenção das célulasdesejadas sob estresse mecânico antes das formas da biomatriz natural dacartilagem ao redor da última. Isso permite que o estresse seja aliviado maiscedo, desde que o paciente tenha recebido o enxerto.

O segundo elemento necessário para o enxerto sem célulasproposto pela invenção é o soro, usualmente soro de ser humano. Este podeser autólogo, alogênico ou heterológico. Por soro, para a finalidade dainvenção, entende-se uma parte do sangue que permanece líquida uma vezque o sangue tenha coagulado. O soro não contém nenhuma célula desangue e, ao contrário do plasma sangüíneo, nenhum fibrinogênio. Osoutros elementos do plasma sangüíneo são também encontrados no soro.

Esses são: gordura, ácidos graxos, glicerina, açúcar, sais, metais eproteínas do plasma. As proteínas do plasma incluem, por exemplo,proteínas de transporte, enzimas, proenzimas, inibidores de enzimas, osistema de complemento, imunoproteínas, mediadores de inflamação e ossimilares.

O soro a ser usado para a finalidade da invenção pode sermodificado adicionando pelo menos um elemento e / ou removendo pelomenos um componente do soro. Em uma modalidade preferida, o soro não émodificado. Mais especialmente preferido é um soro autólogo. Este pode serobtido tirando o sangue do paciente e obtendo o soro usando os métodosconvencionais. Obtido dessa maneira, o soro pode ser colocado em contatocom a matriz e com o gel, se um for provido, e assim incorporado noenxerto, opcionalmente pelo médico que está administrando o tratamento,diretamente no sítio do enxerto.

Alternativamente, um soro modificado é usado. Se a modificaçãoenvolve adicionar pelo menos um constituinte, pode ser preferível selecionaro último a partir do grupo que compreende os fatores do crescimento, fatoresde diferenciação (sobre este assunto veja a especificação de patente DE199 57 388, que é incorporada aqui a seguir por referência), hormônios,citocinas, moléculas de adesão celular, quimiocinas inevitáveis de fatoresquimiotáticos, tais como descrito na especificação de patente WO2005/014027, que é incorporada aqui a seguir a título de referência,enzimas, inibidores de enzimas, coenzimas, minerais, gorduras, lipídeos,sacarídeos, substâncias farmacêuticas tais como antibióticos, analgésicos,inibidores de inflamação e imunossupressores, substâncias de tampão,estabilizadores, em particular estabilizadores criogênicos, e vitaminas,preferivelmente hormônios, quimiocinas, fatores de crescimento e fatores dediferenciação. Os hormônios, as quimiocinas, os fatores de crescimento ediferenciação são preferivelmente selecionados a partir de insulina, PDGF,IGF, GMCSF, GDF5, GDF6, FGF, BMP2, BMP4, BMP7, IL8, SDF1-a e EGF.

Mais preferido é insulina. A matriz e / ou o gel podem também sermodificados pela incorporação dos elementos listados acima ou misturasdos mesmos.

Alternativamente, elementos específicos tais como enzimas,imunoproteínas, proenzimas, açúcares etc., por exemplo, podem serseletivamente removidos por meio de cromatografia de afinidade, porexemplo. O soro pode também ser diluído. Para este fim, o soro é misturadocom a quantidade desejada de líquido fisiologicamente aceitável, tal comotampão de citrato, PBS ou os similares.

O enxerto sem células descrito acima pode ser produzido por ummétodo em que a matriz e, se um for provido, o gel, é posto em contato como soro. Esse contato pode ser feito por aplicação em gotas, amolecimento,impregnação ou saturação. Por preferência, se o gel é provido, ele éincorporado na matriz primeiro que tudo e / ou aplicado nela, depois do queo processo de fazer contato com o soro ocorre. Se o enxerto de célula livrecontém outros elementos tais como listado acima, esses podem serincorporados em uma ou mais da matriz, gel e soro.

O método proposto pela invenção pode incluir uma etapa desecagem. A vantagem de se usar uma etapa de secagem é que o enxertopode ser armazenado por mais tempo em forma seca. Se a matriz e o gel,caso um seja fornecido, são secados antes de ser postos em contato com osoro, esta estrutura pode ser reconstituída embebendo-se ou amaciando-sequando colocada em contato com o soro, transformando-se desse modo emum estado pronto para uso. Alternativamente, se a estrutura incluindo amatriz, o gel, se um for fornecido, e o soro for secada, pode ser reconstituídaembebendo-se ou amaciando-se no soro ou alguma outra solução adequadafarmaceuticamente e fisiologicamente aceitável, como descrito acima emrelação à formação do gel, por exemplo solução salina fisiologicamenteaceitável, e assim transformada em um estado pronto para uso. Se o enxertoproposto pela invenção contém outros elementos, estes também podem serincorporados na solução usada para reconstituir o enxerto sem células aoestado pronto para uso. Isto pode ser desejável em particular se os outroselementos são proteínas ou co-fatores não-estáveis.

No caso das modalidades preferidas feitas a partir de lã de ácidopoliglicólico com gel de ácido hialurônico descrito acima, lã com tamanho de20 mm χ 20 mm χ 1,1 mm são usadas com cerca de 400 μΙ de solução deácido hialurônico (10 mg/ml) incorporada ao material em uma soluçãofisiologicamente adequada ou já incorporada no soro. No caso de lãs de 20nim. χ 20 mm χ 2 mm, cerca de 730 μΙ de ácido hialurônico solução sãousadas. Se enxertos destas dimensões são desidratados por liofilização, porexemplo, eles podem ser reconstituídos embebendo-os em 1 a 2 ml desolução. No caso de matrizes secadas sem soro, elas são preferivelmentereconstituídas com soro ou soro diluído, enquanto que matrizes secadascontendo soro são preferivelmente reconstituídas em solução salinafisiológica.

Concentrações adequadas de soro são de 1 a 100% em volumedo volume de gel e fluido contidos na matriz. Preferivelmente, no caso dematrizes sem gel, concentrações de soro de 10 a 100%, preferivelmente 50a 100% e mais preferivelmente 100% do volume fluido são usadas,incorporadas dentre outras coisas por forças capilares. A fim de reduzir aconcentração do soro abaixo de 100%, pode ser usado soro diluído comuma solução salina fisiologicamente aceitável.

No caso de matrizes com gel, conteúdos do soro de 0,01 a 50%em volume, ou mais forte, preferivelmente 0,5 a 20% em volume, e maispreferivelmente 1 a 10% em volume de soro podem ser usados comreferência ao volume total de gel, soro e opcionalmente líquidofarmaceuticamente aceitável.

O enxerto sem células proposto pela invenção pode ser usadopara regenerar tecidos e, em particular, para regenerar cartilagens e/ouossos. É usado preferivelmente para regenerar tecidos mesenquimais. Maispreferivelmente, é usado para regenerar cartilagens e/ou ossos, emparticular usando o método de perfuração de Pridie ou microfratura. Oenxerto atua como uma capa inteligente que é introduzida nas cartilagensexatamente sob medida após a perfuração Pridie ou microfratura a fim derestaurar a superfície da articulação. O material da matriz, preferivelmentematerial de feltro, confere estabilidade mecânica e atua como uma estruturacondutora, a qual promove uma distribuição homogênea e tridimensional dascélulas dos pacientes migrando a partir da medula óssea e dos ossosesponjosos. O gel, tal como o ácido hialurônico, atua como uma barreira demodo a evitar a migração interna de células de glóbulos vermelhos eleucócitos. O soro, preferivelmente soro autólogo, promove a migração dascélulas, especialmente células precursoras mesenquimais, no enxerto econseqüentemente no defeito. A maturação ou diferenciação das célulasprecursoras mesenquimais que migraram para o enxerto para formarcondrócitos e daí construir um tecido regenerativo cartilaginoso, é induzidapelo ácido hialurônico, soro e o fluido sinovial presentes na articulação. Demaneira supreendente, descobriu-se que o uso do soro aumenta o númerode recuperação significativamente.

Os exemplos fornecidos abaixo pretendem meramente ilustrar ainvenção e não devem ser interpretados como sendo restritivos de formaalguma.

EXEMPLO 1

Recrutamento de células tronco mesenquimais de sereshumanos através de fatores de crescimento e diferenciação, quimiocinas esoro humano in vitro.

A Isolamento e cultivo de células tronco mesenquimais deseres humanos através de meios de cultura e fatores de diferenciação,quimiocinas e soro humano in vitro.

O modo pelo qual as células tronco mesenquimais de sereshumanos (MSC) são isoladas da medula óssea já foi descrito [DE 103 339011. Um máximo de 3 ml de pontilhado de medula óssea são misturadoscom 10 ml de PBS e centrifugados por 10 min e a 310 g a temperaturaambiente. A plaqueta das células é ressuspensa e lavada de novo com PBS.As células são colocadas em 20 ml de meio DME (com 10-20% FBS, 2%HEPES, 4 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml deestreptomicina). Cada 5 ml dessa suspensão de células é introduzido em 20ml de um gradiente de densidade Percoll com uma densidade de 1,073 g/ml.

As células são centrifugadas a 900 g por 32 min. A fase superior étransferida para um novo tubo centrífugo. Essa é centrifugada a 310 g por 6minutos depois de se adicionar 2,5 vezes o volume de PBS. A plaqueta decélulas é colocada em um meio DME. 1,5* 105 -3.5* 105 células/cm 2 sãotransferidas para uma cultura em um frasco de cultura de células eincubadas a 37°C, 5% CO2. O meio é trocado pela primeira vez depois de 72horas, e depois a cada 3-4 dias. Isoladas desta forma, as células crescemconfluentemente depois de 2-3 semanas e são depois transferidas para umnovo vaso de cultura através de tripsinização em uma densidade celular de6.000 células/cm2 de superfície de cultura (passagem 1). Após cerca deuma semana, as células são tripsinizadas de novo (passagem 2). Ahomogeneidade dessa cultura de células tronco mesenquimais humanas éverificada através de análise de FACS, na qual a conexão de endoglina deantígenos de superfície e ALCAM deve ser indentificada e os antígenos desuperfície CD34, CD 45 e CD 14 não são identificados.

B Testando a atividade quimioestática dos fatores de crescimentoe diferenciação (CDMP 1, CDMP2) e quimiocinas (SDF 1-a, IL8) em célulastronco mesenquimais humanas in vitro

O efeito quimioestático dos fatores de crescimento ediferenciação, tal como proteína- 1 morfogenética derivada de cartilagens(CDNP I ou fator-5 de crescimento e diferenciação, GDF5) e proteína-2morfogenética derivada de cartilagens (SDNP2 ou fator-6 de crescimento ediferenciação, GDF6) em células tronco mesenquimais e precursoras já foidescrito [DE 199 57 388]. O efeito quimioestático ou uso de quimiocinas, talcomo fator-1a derivado do estroma (SDF1-a) ou interleucina-8 (IL8) pararecrutar células tronco mesenquimais e precursoras também foi descrito [DE103 33 901].

A atividade quimioestática é testada nas assim chamadasplacas de quimiotaxia de 96 cavidades (ChemoTx system, Neuroprobe,USA). O princípio do teste está baseado na transferência da solução a sertestada, na solução, em uma quantidade e concentração definidas para umacavidade. A cavidade é depois coberta por meio de uma membrana comporos (o tamanho dos poros nesse caso é de 8 μιτι), de modo que a faceinferior da membrana é molhada pela solução contendo a soluçãoquimioestática.

Uma quantidade definida da suspensão celular que não contéma substância a ser testada é colocada na face superior da membrana remotada cavidade. Depois de poucas horas, uma concentração gradiente dasubstância a ser testada se desenvolve, começando a partir da cavidademais baixa até a membrana. Se a substância a ser testada équimioestaticamente ativa, as células da suspensão celular migram atravésdos poros da membrana até a face mais baixa da membrana e até acavidade inferior. As células migradas são tingidas e seu número édeterminado com a ajuda de um microscópio.

Para fins de controle, as cavidades inferiores são providas com osolvente da substância a ser testada, coberta com a membrana e revestidacom a suspensão de células. Contando-se microscópicamente as células naface mais baixa da membrana (superfície: 25 mm2) e na cavidade inferior, ascélulas que migraram espontaneamente, devido à substância quimioestáticasem estímulo, são determinadas. A fim de determinar a contagem de célulasrecrutadas pela substância quimioestática, o número de células migradasespontaneamente é subtraído.

Antes de iniciar o teste dos fatores de crescimento ediferenciação e quimiocinas mencionados acima, células troncomesenquimais humanas de medula óssea foram deslocadas por 24 horascom meio dietético (meio DME + 1% de penicilina / estreptomicina + 0,5% dealbumina de soro bovino (BSA). Os fatores de crescimento e diferenciação eas quimiocinas foram colocados em um meio dietético em quantidadesdiferentes para se obter soluções definidas respectivamente de 250 nM, 500nM, 750 nM e 1000 nM dos fatores. 36 μΙ das respectivas soluções foramcolocados em triplicata em cavidades inferiores das placas de quimiotaxia de96 cavidades, e cobertas com a membrana de modo que a membrana daface mais baixa foi molhada pelas soluções. O meio dietético foi usado comoo controle.

40 μΙ de meio dietético com 30.000 células tronco mesenquimaishumanas foram colocadas na face superior da membrana. Depoisde 20horas de cultivo no gabinete de procriação a 37°C, 5% de CO2, a membranafoi removida e colocada em etanol/acetona gelado (1: 1 v/v) por 3 minutos, afim de fixar as células. A membrana da face superior foi completamentelimpa por meio de um chumaço de algodão para remover as célulasaderentes. As células na face mais baixa da membrana foram tingidas comsolução de Hemacolor (Merck, Darmstadt). Nenhuma célula pôde serdetectada no reservatório inferior.

As células dispostas na face mais baixa da membrana foramcontadas contando-as sob o microscópio. O número de células troncorecrutadas por CDMP1, CDMP2, SDF1-a e IL8, em diferentesconcentrações, foi determinado depois de se subtrair as células migradas noconjunto de controle (sem o fator quimioestático). Os valores médios dacontagem de células com desvios padrões são exibidos na Fig. 1 para osrespectivos fatores. A CDMP1 foi capaz de induzir um máximo de 156 MSC(750 nM CDMP1) por 25 mm2 para migrar. CDMP2 recrutou um máximo de38 MSC (500 nM CDMP2) por 25 mm2, SDF1- α um máximo de 79 MSC(750 nM SDF1- a) por 25 mm2 e IL8 um máximo de 814 MSC (500 nM IL8)por 25 mm2.

CTestando a atividade quimioestática do soro humano dosangue em células tronco mesenquimais de seres humanos in vitro

Supreendentemente, o teste do soro humano através do métodode teste descrito em B mostrou que o soro humano tem um efeitoquimioestático significativamente mais forte em células precursoras e célulastronco mesenquimais de seres humanos in vitro do que fatores decrescimento e diferenciação e quimiocinas. A contagem de célulasprecursoras e células tronco mesenquimais de seres humanos recrutadasem média pelo soro humano, em diferentes formulações (em meio dietéticoou em ácido hialurônico), junto com desvios padrão correspondentes, sãoexibidos na Fig. 2. Dependendo da formulação, um mínimo de 2.135 (PGA -HA Iyo. + HS) e um máximo de 10.332 (5% de HS-HA - meio) de célulasprecursoras e células tronco mesenquimais de seres humanos foramrecrutadas pelo soro humano. Testes em ácido hialurônico sem sorohumano no meio dietético como um fator quimioestático exibiram em média24 (HA meio) e em média 48 (PGA - Ha lyo. + NaCI) de células precursorase células tronco mesenquimais de seres humanos as quais foramrecrutadas.

As diferentes formulações de soro humano a seguir foram usadasno método de teste descrito para recrutar células precursoras e troncomesenquimais de seres humanos. O soro humano foi obtido a partir deamostras de sangue completas (n=5) sem anticoagulantes, baseado emcoagulação natural, misturado em partes iguais e usado para produzir asdiferentes formulações de soro. A fim de produzir os conjuntos de teste "5%de meio HS" e "10% de meio HS", o meio dietético foi deslocado com sorohumano, resultando em 5 % e 10% de soluções. O conjunto de teste "meioHA" compreende o meio dietético e o ácido hialurônico obtidos porfermentação (Ostenil®, TRB Chemedica AG) com um peso molecular médiode 1,200 kDa em partes iguais. Os conjuntos de teste "1% de meio HS-HA","5% de meio HS-HA" e " 20% de meio HS-HA" contêm "meio HA" ao qual osoro humano foi adicionado, resultando em soluções de 1%, 5% e 10% deforça.

A fim de obter o conjunto de teste "PGA - 10% Hs-HA, Iyo.", 270μΙ de ácido hialurônico obtido por fermentação (Osternil®, TRB ChemedicaAG) foram misturados com 30 μΙ de soro humano e aplicados a uma lã(PGA-Soft Feltro®, Alpha Research Switzerland GmbH) incluindo ácidopoliglicólico (PGA) com dimensões de 20 mm χ 15 mm χ 1,1 mm. A lãembebida com a mistura de soro - ácido hialurônico foi congelada por 1 horaa -20°C e depois congelada - secada por 16 horas no liofilizador. Parareconstituí-la, a lã congelada - secada foi colocada em 1 ml de soluçãosalina fisiológica por 10 minutos, de modo a obter-se aproximadamente80-100 μΙ de solução de soro - ácido hialurônico através da centrifugação por10 minutos a 2.000 rpm. Diluindo a solução com o meio dietético em partesiguais, foi produzida a formulação "PGA - 10% de HS-HA, lyo." e usadadiretamente para testar a atividade quimioestática.

A fim de formar o conjunto de teste "PGA-Ha, lyo. + HS", 300 μΙde ácido hialurônico obtido por fermentação (Ostenil®, TRB Chemedica AG)foram aplicados em uma lã (PGA-Soft FeltroO, Alpha Research SwitzerlandGmb11) compreendendo ácido poliglicólico (PGA) com dimensões de 20 mmχ 15 mm χ 1,1 mm. A lã embebida com o ácido hialurônico foi congelada por1 hora a -20°C e depois congelada -secada por 16 horas no liofilizador. Parareconstituir, a lã congelada - secada foi colocada em 1 ml de soro humanopor 10 minutos, de modo a obter-se aproximadamente 80-100 μΙ solução desoro de ácido hialurônico por meio de centrifugação por 10 minutos a 2.000rpm. Diluindo a solução com meio dietético em partes iguais, a formulação"PGA - HA, Iyo.+ HS" foi produzida e usada diretamente para testar aatividade quimioestática.

A fim de formar o conjunto de teste "PGA-Ha, lyo. + NaCP", 300μΙ de ácido hialurônico obtido por fermentação (Ostenil®, TRI3 ChemedicaAG) foram aplicados a uma lã (PGA-Soft Felt®, Alpha Research SwitzerlandGmbH) compreendendo ácido poliglicólico (PGA) com dimensões de 20 mmχ 15 mm χ 1,1 mm. A lã embebida com o ácido hialurônico foi congelada por1 hora a -20°C e depois congelada - secada por 16 horas no liofilizador. Parareconstituir, a lã congelada - secada foi colocada em 1 ml de solução salinafisiológica por 10 minutos, a fim de obter aproximadamente 80-100 μΙ desolução de ácido hialurônico por meio de centrifugação durante 10 minutos a2.000 rpm. Diluindo-se a solução com meio dietético em partes iguais, aformulação "PGA -HA, Iyo.+ NaCI" foi produzida e usada diretamente paratestar a atividade quimioestática.

EXEMPLO DA MODALIDADE 2

A lã de ácido poliglicólico comercialmente disponível sob a marcaregistrada PDA-Soft Felt® vendida por Alpha Research Switzerland GmbHfoi cortada até as dimensões de 20 mm χ 15 mm χ 1,1 mm. 0 material foiimpregnado com uma mistura de ácido hialurônico contendo 10% de sorocomo descrito no exemplo 1 e depois secado. A secagem ocorreuinicialmente a -20°C e depois, durante por 16 horas, no liofilizador. A lã foireconstituída embebendo com 1 a 2 ml de solução salina fisiológica por 10 min.

Em um conjunto de teste alternativo, a lã foi impregnada comácido hialurônico puro, 10 mg/ml.dissolvidos em solução salina fisiológica.Preparado desta forma, o material foi secado como descrito acima. Ele foireconstituído embebendo em 1 a 2 ml de soro por 10 min. Ambas as lãspodem ser usadas diretamente para enxertos.

Claims (18)

1. Enxerto sem células, compreendendo (i) uma matriz coesiva,matriz formadora de estruturas com porosidade aberta de um materialbiológicamente e farmacêuticamente aceitável e (ii) soro.

2. Enxerto sem células de acordo com a reivindicação 1, em queo material da matriz é reabsorvível ou não reabsorvível.

3. Enxerto sem células de acordo com a reivindicação 1 ou 2, emque a matriz tem uma estrutura selecionada de tecidos ou não-tecidos(particularmente estruturas de lã e feltro), membranas, esponjas, chumaços,espuma de células abertas, lã, tranças, feixes de fibras ordenados oualeatórios, materiais de cerâmica porosos, esponjosos e gel, como tambémcombinações dos mesmos.

4. Enxerto sem células de acordo com uma das reivindicaçõesanteriores, em que a matriz é um material selecionado a partir do grupo queconsiste em polímeros naturais e sintéticos, tais como colágeno, ácidohialurônico, quitosana, quitina, polissacarídeos, celuloses e seus derivados,proteínas, polipeptídeos, ácido poliglicóico, ácido polilático, poli(glicolídeo,lactato), caprolactam, materiais de cerâmica tais como óxidos, carbonetos,nitretos e carbonitretos de metais, em particularóxido de silicone, oxido detitânio e oxido de cálcio; minerais tais como halogenideos, em particularfluoretos, hidróxidos, fosfatos, sulfatos de metais, fosfato de cálcio, apatita,apatita de hidroxila; metais tais como titânio, alumínio, ouro, prata, açoinoxidável e suas misturas.

5. Enxerto sem células de acordo com uma das reivindicaçõesanteriores em que adicionalmente contém um gel , o qual é aplicado a umlado da matriz e/ou ao menor penetra nela.

6. Enxerto sem células de acordo com a reivindicação 5, onde ogel é um hidrogel natural ou sintético.

7. Enxerto sem células de acordo com a reivindicação 5 ou 6, emque o gel é de uma firmeza menor que a matriz.

8. Enxerto sem células de acordo com uma das reivindicações 5a 7, em que o gel é selecionado a partir de polissacarídeos, polipeptídeos,ácido hialurônico, fibrina, colágeno, alginato, agarose e quitosana, comotambém misturas dos mesmos, e preferivelmente é ácido hialurônico.

9. Enxerto sem células de acordo com uma das reivindicaçõesanteriores, em que o soro é autólogo, alogênico ou heterólogo e éopcionalmente modificado adicionando pelo menos um elemento e/ouremovendo pelo menos um componente do soro.

10. Enxerto sem células de acordo com uma das reivindicaçõesanteriores, adicionalmente contendo um ou mais elementos selecionados dogrupo compreendendo fatores de crescimento, fatores de diferenciação,hormônios, quimiocinas, citosinas, moléculas de adesão celular, fatoresquimioestáticos, enzimas, inibidores enzimáticos, coenzimas, minerais,gorduras, lipídios, sacarídeos, substâncias farmacêuticas tais comoantibióticos, analgésicos, antiinflamatórios e imunossupressores,substâncias de tampão, estabilizadores, em particular estabilizadorescriogênicos, e vitaminas, preferivelmente hormônios, fatores de crescimentoe fatores de diferenciação.

11. Enxerto sem células de acordo com a reivindicação 10, emque os hormônios, fatores de crescimento e diferenciação são insulina,PDGF, IGF, GMCSF, GDF5, GDF6, FGF, BMP2, BMP4, BMP7, IL8, SDF1-ae EGF e combinações dos mesmos.

12. Método de produção de um enxerto sem células de acordocom alguma das reivindicações anteriores, pelo que a matriz e o gel, se umé fornecido, são colocados em contato com o soro.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o contatoé efetuado pela aplicação de gotas, amaciamento, impregnação ouembebendo-se.

14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que ogel é inicialmente incorporado na matriz e/ou aplicado a ela, e depoiscolocado em contato com o soro.

15. Método de acordo com uma das reivindicações 12 a 14, emque a combinação de gel, se um é provido e a matriz, assim como outrosconstituintes opcionais, é secada antes ou depois do contato.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o enxertoé reconstituído a partir do estado secado.

17. Uso de um enxerto sem células como definido em uma dasreivindicações 1 a 11 para regenerar tecido.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17 para a regeneração dotecido mesenquimal, em particular cartilagem e/ou osso.