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CN1074484A - 制备7-aca和7-adac的新的生物方法 - Google Patents

制备7-aca和7-adac的新的生物方法 Download PDF

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CN1074484A CN92113331A CN92113331A CN1074484A CN 1074484 A CN1074484 A CN 1074484A CN 92113331 A CN92113331 A CN 92113331A CN 92113331 A CN92113331 A CN 92113331A CN 1074484 A CN1074484 A CN 1074484A
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A·M·施蒂彭
L·克罗福德
J·A·兰波塞克
P·C·麦阿达
C·D·里斯
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Abstract

由一种新的生物方法制备用于生产头孢菌素抗 菌素，7-氨基-头孢菌烷酸(7-ACA)和7-氨基去乙 酰基头孢菌烷酸(7-ADAC)的重要中间产物，其中 在己二酸盐原料存在下培养已转化的产黄青霉菌菌 株从而产生己二酰-6-APA(6-氨基青霉菌烷酸)； 然后由转化了下列基因的产黄青霉菌在原位表达这 些基因：1)一种扩展酶基因，2)一种羟基化酶基因，3) 一种酰基转移酶基因。

Description

本发明涉及制备商品头孢菌素抗菌素的合成方法的领域，头孢菌素目前有相当数量的品种，这些治疗药物目前正处于其第四代产品。由于商品头孢菌素中存在各种各样的侧链以及头孢菌素具有的显著的经济价值，获得制备关键性中间产物的更经济和更有效的方法变得越来越重要，这些关键性中间产物便于迅速合成各种头孢菌素。
这些关键性中间产物之一是7-氨基-头孢菌烷酸（7-ACA），可用下列通式表示：
Figure 921133316_IMG1
目前，7-ACA是从头孢菌素C制备的。头孢菌素C本身是一种发酵产物，它几乎是目前市场上销售的所有头孢菌素的起始点。但是，在大多数情况下生产这些各种类型的商品头孢菌素的合成操作过程基本上是由7-氨基头孢菌烷酸开始的，从头孢菌素C上裂解7-氨基己二酰侧链可以衍生得到7-氨基头孢菌烷酸。典型的头孢菌素是从7-ACA合成得到的，因而它具有3-乙酰甲醛侧链，包括头孢氨噻，氨基苯乙酰头孢菌素，先锋霉素I，吡啶硫乙酰头孢菌素。
另一种关键性中间产物是7-氨基脱乙酰基头孢菌烷酸（7-ADAC），可用下列通式表示：
Figure 921133316_IMG2
目前，7-ADAC也是通过移走7-D-α-氨基己二酰侧链，并将3-乙酰基甲醛侧链转变为3-羟甲基而从头孢菌素C制备的。在合成含有在C-3位置进行修饰取代的头孢菌素时7-ADAC是一种有用的中间化合物。
现在，本领域内技术人员选择化学方法用于裂解7-氨基己二酰侧链。基本的亚氨基-卤化物方法需要将7-氨基己二酰侧链上的氨基和羧基团封闭，并且目前已用几种方法完成这一过程。但是，正如目前使用的，化学裂解方法有严重的不足。这些缺点是需要多个步骤并且方法复杂，非常低的操作温度，昂贵的试剂，该方法产生大量的副产物导致污物处理问题，以及在化学处理开始前对高度不纯的起始材料进行纯化。因此，需要不断地探索一种微生物学或发酵方法，该方法要比目前使用的化学方法能更经济地实现对头孢菌素进行酶促脱酰基从而得到7-氨基头孢菌烷酸。
但是，已有大量事实证明探索一种成功的微生物方法的工作没有取得成效。正如在文献中清楚地描述，这是由于头孢菌素C的氨基己二酰侧链的结构，尤其是立体化学结构造成的，尽管利用各种各样的微生物产生的青霉素转酰酶进行酶促裂解已成功地将青霉素进行脱酰基化。另一方面，在文献中报道的成功的头孢菌素C的一步法酶促脱酰基化反应经常是不能重复的或者仅能得到十分有限的产量。
因此，本发明特别涉及制备关键性头孢菌素中间产物7-ACA的领域，更具体地说，属于制备7-ACA的生物方法的领域。
至今，已证明探索制备7-ACA的成功的生物方法的工作没有成效，当然是指一种商业规模方法。例如，如果通过直接发酵和/或酶促处理青霉素G可以制备6-氨基青霉菌烷酸（6-APA），从而只需要进行环扩展即能得到7-ADCA，不幸的是已发现在这些微生物的正常的代谢途径中执行环扩展的头孢霉菌和链霉菌的酶不接受6-APA作为底物。在本领域中将这些酶统称为DAOCS或延伸酶，该酶的定义是能够催化青霉素型分子中存在的penam环结构扩展为Ceph-3-em环，如在头孢菌素中存在的环结构。在下文中，将这些酶统称为“延伸酶”。
延伸酶作用的底物是青霉素N，该底物进行环扩展并羟基化，得脱乙酰基头孢菌烷酸（DAC）。这里，只需切割（D）-α-氨基己二酰侧链而得到7-ADAC，但已证明该侧链对酶促裂解具有顽强的抗性，仅得到令人难于满意的低产量。
根据本发明可以获得一种有效的生物方法，其中采用高效价新的发酵方法生产青霉素化合物（具有己二酰侧链），所说的青霉素化合物是为产生青霉素化合物的同一微生物在原位产生的延伸酶所接受的底物，该微生物已进行转化从而表达所说的延伸酶。然后该延伸酶作用于青霉素化合物进行环扩展产生高产量的头孢菌素化合物。
由延伸酶的原位作用而产生的己二酰-7-ADCA具有一个3-甲基（-CH3）侧链，而最终产物7-ACA具有一个3-乙酰基氧甲基[CH3OC（O）CH3]侧链。为了将3-甲基转变为3-乙酰基氧甲基侧链，根据本发明，在原位进一步表达出除活性延伸酶外的另外两位活性酶。它们依次是羟基化酶和乙酰基转移酶，两种都是已进行转化的产生青霉素化合物的微生物的基因表达产物。该羟化酶将己二酰-7-ADCA的3-甲基侧链转化为3-羟甲基，乙酰基转移酶将该3-羟甲基侧链转化为7-ACA的3-乙酰基氧甲基侧链。
在本发明方法的最后的关键步骤的重要性是利用另一种酶系将青霉素化合物的侧链（现在是一种头孢菌素化合物）以惊人的高产量移走。包括本发明在内的这种独特总生物方法的意外的结果是以惊人的高产量产生7-ACA，并且具有重大的经济价值，提供了一种替换目前使用的化学和生化处理方法的手段。
本发明的新的生物方法提供了一种特定的具有显著效益的制备7-ACA的方法，从经济价值考虑可以用该方法替代目前的化学合成法。本领域内技术人员不断地努力探求这样一种生物方法，但他们屡次遭受失败。例如，EP-A-O422890公开了编码构巢曲霉的活性异青霉素N：酰基CoA酰基转移酶的DNA以及其在产生青霉素的真菌中生产有用的头孢菌素中的应用，到目前为止，本领域内技术尚未能完成此项工作。但是上面所描述的方法是通过断裂或替代乙酰基转移酶基因并同时加入编码来自产生头孢菌素的有机体的表异构酶和延伸酶的基因;而且显然实际上并没有取得有效的转化和表达结果，再者，即使成功地进行转化，仍然不能用作本发明目的，因为仍然存在怎样移走O-α-氨基己二酰侧链的问题。本领域内技术人员试图从产生青霉素的真菌培养物中生产商品头孢菌素中间产物的方法中获得有效结果的这样一个失败的计划是与本发明方法取得的结果完全相反的。
本发明方法的第一个酶促生物方法步骤是由延伸酶作用的对己二酰-6-APA进行环扩展，该延伸酶是经过转化的非重组产黄青霉菌宿主的延伸酶基因的表达产物。在现有技术中已研究了该延伸酶的用途。例如Cantwell等人在Curr    Genet（1990）17∶213-221上已提出了通过对青霉素V进行环扩展，然后酶促水解得到的去乙酸基头孢菌素V而形成7-ADCA的7-ADCA生物方法。该方案是以能够获得来自S.clavuligerus[Kovacevic等人，J.Bacteriol.（1989）171∶754-760;和Ingolia等人，U.S.5，070，020]的一种克隆青霉素N延伸酶基因（cefE）为基础的。但是，由于延伸酶对其天然底物青霉素N起作用，而不作用于青霉素V，因而该方案中需要遗传工程步骤以产生能将青霉素V进行环扩展的经过修饰的延伸酶基因。Cantwell等人没有获得所要求的修饰作用，但是，他们仅在用来自Streptomyces    clavuligerus的cefE基因转化产黄青霉菌并且获得了低水平地表达DAOCS（延伸酶）酶的工作中取得成功。
本领域内技术人员已对该延伸酶包括其活性和遗传序列进行了充分的研究。例如，在Wolfe的U.S.4，510，246和4，536，476中已从包括Streptomyces    clavuligerus在内的产生β-内酰胺的原核生物的无细胞提取物中分别分离到了环化酶，表异构酶和环延伸酶，并且提供了稳定的酶试剂。Dotzlaf    U.S.5，082，772（EP-A-0366354）中描述了一种来自S.clavuligerus的离体的纯化的延伸酶，并对其进行定性，包括其末端残其和氨基酸组成，据说其分子量约为34，600道尔顿。但是与其相反，在U.S.4，536，476中发现同样的酶其分子量为29，000道尔顿。EP-A-02337.15公开了从S.clavuligerus获得的延伸酶基因的分离和限制性内切酶图谱的特性以及在丧失了头孢菌素生产能力的S.clavuligerus中编码重组延伸酶的DNA的表达（产生活性延伸酶）。在U.S.5，070，020（EP-A-0341892）中Ingolia等人公开了从S.clavuligerus获得的编码延伸酶的DNA序列以及描述了用含有所说DNA序列的表达载体转化产黄青霉菌菌株的方法，从而获得了表达的延伸酶。虽然该文献暗示该酶能用于扩展除青霉素N以外的底物，但没有实例证明这种扩展作用。
上面描述的著作其注意力集中于来自原核的S.clavuligerus的延伸酶。用真核支顶头孢菌（也称为产黄支顶孢菌）菌株也可以表达出明显地具有相同环扩展活性的酶。但是，在这样的菌株中是由双功能基因（cefEF）表达活性延伸酶的，该基因也表达活性DACS（羟化酶），该酶的天然功能是将延伸酶的去酸基头孢菌烷酸（DAOC）产物转化为去乙酰基头孢菌素C（DAC）。该表达结果是单一的，但却是双功能的延伸酶/羟化酶。虽然曾为了将这两种基因活性产物分离开作了许多努力，但还没有取得成功。例如，EP-A-0281391公开了从产黄支顶头孢菌ATCC11550获得的DAOCS/DACS基因的分离以及DNA序列的鉴定，并得到了相应酶的氨基酸序列。转化青霉菌并表达酶，但是，没有证实将青霉素G和V转变为相应头孢菌素的计划。再者，尽管提示利用遗传工程技术提供了快速地将编码DAOCS和DACS的遗传信息分离开并且将它们分别表达的方法，但是没有提供实例证实这种分离。
本领域内技术人员对支顶头孢菌的DAOCS/DACS（延伸酶/羟化酶）酶，包括其活性，特征以及遗传序列进行了充分的研究。例如，在Demain    U.S.4，178，210;4，248，966;和4，307，192中用能将环进行表异构化和扩展而得到头孢菌素抗生素产物的无细胞抽提物处理各种青霉素型起始材料。Wu-Kuang    Yeh的U.S.4，753，881中描述了支顶头孢菌酶的等电点，分子量，氨基酸残基，羟化酶与延伸酶的活性比例和肽片段。
本领域内技术人员已经描述了支顶头孢菌的乙酰基转移酶的活性，特征，限制性图谱，核苷酸和氨基酸序列。例如，参见EP-A-0437378和EP-A-0450758。
上述讨论的现有技术仅解决了本发明的一个方面，即用表达延伸酶和延伸酶/羟化酶的基团转化产黄青霉菌菌株并获得表达的这些酶。但是，现有技术仅利用表达的酶对青霉素N，而不是对青霉素G和V进行环扩展。即使在这种情况下，青霉素N具有一个不能通过酶促裂解而留下一个游离氨基的7-位侧链。本发明也是基于惊人的发现：利用产黄青霉菌可以高效率地增加己二酰侧链，单位表达的延伸酶可以高效率地利用该种化合物作为底物进行环扩展得到己二酰7-ADCA，同样在原位表达的羟化酶和乙酰基转移酶能利用己二酰-7-ADCA作为底物以生产7-ACA的3-去乙氧基甲基侧链，并且然后利用另一种酶可以高效率地移走己二酰侧链得到7-ACA。虽然现有技术中发现了本发明中分离到的各种片段，但没有暗示用本发明的方法将这些片段结合可以获得意想不到的结果。
例如，本领域内已知生产6-己二酰青霉菌烷酸的方法;见Ballio，A.等人，Nature（1960）185，97-99。仅是在体外进行的酶促扩展6-己二酰青霉菌烷酸，也是本领域内已知的;见Baldwin等人，Tetrahedron（1987）43，3009-3014;和EP-A-0268343。并且酶促裂解己二酰侧链也是本领域内已知的;见例如，Matsuda等人，J.Bact.（1987）169，5815-5820。
己二酰侧链有下列结构：COOH-（CH2）4-CO-，而与之在结构上密切相关的两种侧链是：戊二酰，具有下列通式：
COOH-（CH2）3-CO-，以及（D）-α-氨基己二酰，具有下列通式：COOH-CH（NH2）-（CH2）3-CO-。酶促裂解戊二酰侧链是本领域内已知的。见，例如，Shibuya等人，Agric.Biol.Chem.（1981）45，1561-1567，和U.S.3，960，662;Matsuda和Komatsu，J.Bact.（1985）163，1222-1228;Matsuda等人，J.Bact.（1987）169，5815-5820;Jap.53-086084（1978-Banyu Pharmaceutical Co.Ltd.）;和Jap.52-128293（1977-Banyu Pharmacelltical Co.Ltd.）。而且EP-A-0453048描述了提高由假单孢菌SY-77-1产生的戊二酰转酰基酶的己二酰-裂解活性。通过在α-亚基的特定位点处取代不同的氨基酸，可以观察到（从己二酰-丝氨酸上）裂解己二酰的效率提高了3-5倍以上。应该注意到虽然EP-A-0453048以明显的事实表述了一种转酰基酶具有改善了的对己二酰侧链的作用活性，但没有首先描述产生己二酰-头孢菌素的任何方法（化学的或者与本说明书中描述的方法相类似的生物方法）。
如果有（D）-α-氨基己二酰侧链存在，本领域内技术人员知道首先利用（D）-氨基酸氧化酶酶促移走氨基团并缩短侧链长度，留下戊二酰（GL-7）侧链，通过第二种酶（戊二酰转酰基酶）移走戊二酰侧链。在Matsuda    U.S.3，960，662;EP-A-0275901;Jap.61-218057（1988-Komatsu，Asahi    Chemical    Industry    Co.）;WO    90/12110（1990-Wong，Biopure    Corp.）;和EP-A-0436355，Isogai等人，也在Bio/Technology（1991）9，188-191上公开了这样的二步裂解方法。
本领域内技术人员也已知进行一步法裂解（D）-α-氨基己二酰侧链，尤其是利用重组技术。见例如：
一步法裂解（D）-α-氨基己二酰侧链：
-Jap.53-94093（Meiji，假单孢菌菌种.BN-188）;
-Jap.52-143289（＝US4，141，790，Meiji，曲霉菌种）;
-US4，774，179（Asahi    1988，假单孢菌菌种SE-83和SE-495），＝Jap.61-21097和Jap.61-152286;
-Fr.Pat.2，241，557（Aries    1975，蜡状芽孢杆菌荧光变种）;
-Jap.52-082791（Toyo    Jozo    1977，巨大芽孢杆菌NRRL    B5385）;
-EP-A-0321849（Hoechst，假单孢菌，枯草杆菌，γ-戊二酰转肽酶）;
-EP-A-0322032，EP-A-0405846，和U.S.5，104，800（Merck，巨大芽孢杆菌）;
-EP-A-0283218和U.S.4，981，789（Merck，Arthrobacter    viscosus）;
一步重组体：Ceph    C→7-ACA：
-Jap.60-110292（Asahi    1985，Comamonas，具有来自Comamonas菌种SY-77-1的重组体E.coli，一步转变）;
-Jap.61-152-286（Asahi    1986，假单孢菌，含有来自假单孢菌菌种SE83的重组体E.Coli，所描述和要求保护的遗传序列，一步法已在U.S.4，774，179中要求保护）;
-Jap.63-74488（Asahi    1988，变异三角酵母，Comamonas，表达D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA转酰基酶构建体的重组E.Coli）。
-EP-A-0475652（Fujisawa，头孢菌素C转酰基酶和利用重组技术生产该酶）。
生产7-ADAC的方法的各个方面都是本领域内已知的。例如，见U.S.3，304，236和3，972，774（Eli    lilly    &    Co.）;EP-A-0454478（Shionogi    &    Co.Ltd.）;和已公开的日本申请0453，499（Shionogi    &    Co.，Ltd.）。
作为参考文献的是未决申请系列No.07/933，469，申请日1992年8月28日（Attorney    Docket    No.18532    IA），该文献公开了制备7-ADCA的生物方法，该方法是基于按照本文描述的制备7-ADCA和7-ACA的生物方法相同的方式在产黄青霉菌转化体中表达活性延伸酶。但是，在本发明生物方法中，利用其他的转化体表达其他的酶促活性物，以便获得完全不同的重组体代谢途径产生独特的最终产物，在该未决申请中没有暗示这样的转化。
为了有利于更好地理解本发明的方法和上述讨论的现有技术的含意，紧接着在下文中描述了该代谢途径中产生己二酰-6-APA，己二酰-7-ADCA，己二酰-7-ACA，和7-ACA，中间产物的各个阶段，以及执行所涉及的转化的酶。
本发明涉及制备7-氨基去乙酰基头孢菌烷酸（7-ADAC）的新的生物方法，该方法包括下列步骤：
1）将产生异青霉素N的产黄青霉菌菌株培养于能维持其生生长的培养基中，在所说的培养基中加入己二酸盐原料（包括能为所说产黄青霉菌菌株同化和利用的一种或多种己二酸，或其盐和酯）以便产生己二酰-6-氨基青霉菌烷酸（己二酰-6-APA），从而产生所说的己二酰-6-APA;
2）由相应基因进行原位表达而进行下列的酶促转变：
a）由延伸酶将己二酰-6-APA进行原位环扩展而形成己二酰-7-氨基去乙酸基头孢菌烷酸（己二酰-7-ADCA），其中所说的产黄青霉菌菌株已用编码能以己二酰-6-APA作为底物的活性延伸酶的DNA进行转化，于是该基因表达后，由所说菌株产生的所说己二酰-6-APA在此后进行原位环扩展而形成己二酰-7-ADCA;
b）己二酰-7-ADCA的3-甲基侧链在原位由羟基化酶进行羟基化而形成己二酰-7-氨基脱乙酰基头孢菌烷酸（己二酰-7-ADAC），其中所说的产黄青霉菌菌株已由编码能接受己二酰-7-ADCA作为底物的活性羟基化酶的DNA进行转化，此后进行表达，由所说菌株产生的所说的己二酰-7-ADCA再在原位进行羟基化而形成己二酰-7-ADCA;以及
3）将所说的己二酰-7-ADAC与己二酰酰胺酶接触，从而移走己二酰侧链，并形成7-ADAC产物;然后分离所说产物。
本发明进一步涉及制备7-氨基头孢菌烷酸（7-ACA）的新生物方法，该方法包括下列步骤：
1）将能产生异青霉素N的产黄青霉菌菌株培养于能供应其生长的培养基中，将己二酸盐原料加入所说培养基，该己二酸盐原料包括能为所说的产黄青霉菌菌株同化和利用的一种或多种己二酸，或其盐和酯，从而产生己二酰-6-氨基青霉菌烷酸（己二酰-6-APA），产生所说的己二酸-6-APA;
2）由相应的基因进行原位表达完成下列酶促转变：
a）由延伸酶将己二酰-6-APA在原位进行环扩展形成己二酰-7-氨基脱乙酸基头孢菌烷酸（己二酰-7-ADCA），其中所说的产黄青霉菌已用编码能接受所说的己二酰-6-APA作为底物的活性延伸酶的DNA进行转化，在其表达后，再将所说菌株产生的己二酰-6-APA在原位进行环扩展而形成己二酰-7-ADCA;
b）由羟化酶在原位将己二酰-7-ADCA的3-甲基侧链进行羟基化而形成己二酰-7-氨基去乙酰基头孢菌烷酸（己二酰-7-ADAC），其中所说的产黄青霉菌已用编码能接受所说的己二酰-7-ADCA作为底物的活性羟基化酶的DNA进行转化，在其基因表达后，再在原位将所说菌株产生的己二酰-7-ADCA进行羟基化而形成己二酰-7-ADAC;
c）由酰基转移酶在原位将己二酰-7-ADAC进行酰基化而产生己二酰-7-氨基头孢菌烷酸（己二酰-7-ACA），其中所说的产黄青霉菌菌株已用编码能接受己二酰-7-ADAC作为底物的活性酰基转移酶的DNA进行转化，在该基因表达后，再在原位将所说菌株产生的己二酰-7-ADAC酰基化而形成己二酰-7-ACA;
3）将所说己二酰-7-ACA与己二酰酰胺酶接触，从而移走己二酰侧链，形成7-ACA产物;以及然后分离所说产物。
在本文中使用的，下列术语具有指定的含意：
“7-ACA”是指3-[（乙酰氧基）-甲基]-7-氨基-8-氧代-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸;
“己二酰-6-APA”是指[2S-（2α，5α，6β）]-3，3-二甲基-7-氧代-6-[己烷-1，6-二酰基）氨基]-4-硫代-1-氮杂双环[3.2.0]庚烷-2-羧酸;
“己二酰-7-ADCA”是指3-甲基-7-[（己烷-1，6-二酰基）氨基]3-甲基-8-氧代-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸;和
“己二酰-7-ADAC”是指3-羟甲基-7-[（己烷-1，6-二酰基）氨基]-3-甲基-8-氧代-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸。
尤其是，本发明涉及如上文中描述的制备7-氨基脱乙酰基头孢菌烷酸（7-ADAC）和7-氨基头孢菌烷酸（7-ACA）的新生物方法，该方法中使用的己二酸盐原料是己二酸二钠，并且其中编码活性延伸酶，羟化酶，和酰基转移酶的DNA都来源于支顶头孢菌，其中的己二酰转酰基酶来源于假单孢菌菌种。
本发明进一步涉及重组DNA表达载体，该载体包括来源于支顶头孢菌的编码活性延伸酶，羟化酶和酰基转移酶的DNA，以及启动编码所说酶的基因进行表达的启动子，这些载体包括下文中描述的质粒pPEN/CEPH-1，pPENCACT和pTS-8。
本发明进一步涉及用重组DNA表达载体转化的产黄青霉菌宿主细胞，该重组载体含有来源于支顶头孢菌的编码活性延伸酶，羟化酶和酰基转移酶的DNA，以及启动编码所说酶的DNA进行表达的启动子，包括产黄青霉菌IPNS基因的启动子。尤其是，本发明涉及用重组DNA表达载体，包括下文中描述的质粒pPEN/CEPH-1，pPenCACT和pTS-8，转化的产黄青霉菌宿主细胞。
本发明还涉及在适合于基因表达的条件下培养重组产黄青霉菌宿主细胞的方法，其中所说的重组宿主细胞包括重组DNA表达载体，该载体含有来自支顶头孢菌的编码活性延伸酶，羟化酶和酰基转移酶的DNA，和启动编码所说酶的DNA进行表达的启动子包括产黄青霉菌IPNS基因的启动子。特别是，本发明涉及在适合于基因表达的条件下培养重组产黄青霉菌宿主细胞的方法，其中所说的重组宿主细胞包括重组DNA表达载体，包括如下文中描述的质粒pPEN/CEPH-1，pPenCACT和pTS-8。
本发明涉及的第一个方面是一种制备7-氨基头孢菌烷酸（7-ACA）和7-氨基脱乙酰基头孢菌烷酸（7-ADAC），以及制备商品合成头孢菌素中的关键中间产物的新的生物方法，这些中间产物可用下列结构式表示：
Figure 921133316_IMG4
除头孢菌素核以外，7-ACA的明显特征是7-氨基团和3-乙酰基氧基甲基团（或常称之为3-乙酸氧基甲基）。7-氨基团是一种可以转变成任何一种侧链衍生物的基团，从而形成用于合成各种商品头孢菌素的基本结构。为了合成商品头孢菌素常将3-乙酰基氧基甲基团转变为其他侧链。
本发明方法的7-ACA最终产物和己二酰-7-ACA中间产物与头孢菌素C形成对比，它是另一种关键性头孢菌素中间产物，可用下列结构式表示：
Figure 921133316_IMG5
对于该中间产物，7-（D）-α-氨基己二酰侧链不适合用于进一步合成衍生物，并且必须将它裂解得到可接受的7-氨基团。不幸的是，已证实不论是用化学或生化方法移走7-（D）-α-氨基己二酰侧链都是很困难的。
用于本说明书中，特别是在优选实施例部分详细描述时所使用的下列术语具有指定的含意：
7-ACA    7-氨基头孢菌烷酸
7-ADAC    7-氨基脱乙酰基头孢菌烷酸
7-ADCA    7-氨基脱乙酸基头孢菌烷酸
6-APA    6-氨基青霉菌烷酸
DAOC    脱乙酸头孢菌烷酸
DAOCS    DAOC合成酶
DAC    脱乙酰基头孢菌素C
DACS    DAC合成酶
IPNS    异青霉素N合成酶
Tris    三[羟甲基]氨基甲烷
EDTA    乙二胺四乙酸
DEPC    二乙基高碳酸盐
TE    Tris/EDTA缓冲液
SSC    盐（氯化钠），柠檬酸钠缓冲液
SDS    十二烷基磺酸钠
PEG    聚乙二醇
产黄青霉菌培养物
本发明方法的第一个步骤包括将能产生异青霉素N的产黄青霉菌菌株培养于能维持其生长的培养基中，以及向所说的培养基中加入己二酸盐原料，该己二酸盐原料包括一种或多种能为所说的产黄青霉菌菌株同化和利用的己二酸，或其盐和酯，而产生己二酰-6-APA。也可将己二酸盐养料在用产黄青霉菌接种后加入培养基中，但优选的方法是在接种的同时已经存在于培养基中。
除青霉菌以外的其他属如构巢曲霉，以及青霉属内除产黄青霉菌种以外的其他种都产生异青霉素N。但是，利用公知的技术对产黄菌种进行改进已得到了有史以来产生异青霉素N量最高的菌种。然而从实用角度考虑，本发明局限于产黄青霉菌菌株，尽管该方法可用于其他菌种是显而易见的。任何已寄存的产黄青霉菌菌种或其他公众可得到的这样的菌种来源都适用于作为完成本发明方法的起始材料。
供应能产生异青霉素N的产黄青霉菌菌株生长的培养基属于本领域普通技术熟知的类型。例如，培养是采用深层通气发酵方法完成的，使用的培养基选自于许多种可利用的合适基质。典型的培养基利用如蔗糖，葡萄糖，和淀粉作为碳源;以黄豆粉和粗燕麦粉，棉籽油，花生饼粉，以及各种氨基酸，其混合物和胨作为氮源。生产上要求突出产量和容易分离，因而对于各种情况优选的基质是以糖蜜作为碳源以及以黄豆粉和氨基酸作氮源。
通常向培养基中加入无机营养盐，包括能提供下列离子成份的盐：钠，钾，铵，钙，磷酸盐，硫酸盐，氯化物，溴化物，硝酸盐，碳酸盐，铁，亚铁，镁，锰等。微量元素通常也是产黄青霉菌生长，分化和代谢所必须的，并且可以将微量元素直接加入到培养基中，除非其供应量实际上已污染了培养基中其他成分。
如果只需要生产少量己二酰-7-ACA，和最终的7-ACA，可以在小体积设备如1升振荡烧瓶中培养产黄青霉菌菌株。如果需要更大量的己二酰-7-ACA，在深层通气发酵条件下可以使用大容量发酵罐。
在进行大规模地制备己二酰-7-ACA时，将产黄青霉菌孢子维持于琼脂斜面上。从斜面上获取孢子用于接种小体积的营养培养基。培养营养培养基产生该微生物的大量的，新鲜的活性生长的培养物。然后将该营养生长物作为大规模发酵基质的种菌。在特定情况下还需要进一步的营养生长以得到的培养物作为发酵培养基的种菌。当发酵基质体积显著大于第一步营养生长培养基时，常常需要这样的第二个营养生长步骤。按照这种方式，首先在小体积的营养培养基中培养该微生物的孢子以获得作为大体积营养培养基的种菌。然后更大体积的营养培养基供应足够浓度的微生物以起动在大容量发酵罐中快速地发酵。营养基质的组成与发酵基质相同或者还含有其他成分以刺激该微生物以小规模进行生长和分化。
用于本发明方法的产黄青霉菌菌株最有效的培养温度约20至30℃，而当温度取22°-28℃最好约25℃时获得最大产量。
当在大容量发酵罐中培养产黄青霉菌菌株约10-30天，较好为15-25天一段时期后即产生最大量的己二酰-7-ACA。但是，在小容量设备如250ml振荡烧瓶中培养时，该微生物的生长更快速并在更短时间即4-15天，常常是5-7天内产生己二酰-7-ACA。
如果大容量发酵罐中最终PH达到8.0或者更高，对己二酰-7-ACA的生产常带来不利的影响。在这种情况下，需要在整个发酵过程中监测培养基的PH值。假如监测显示在最大生产量的己二酰-7-ACA出现之前PH将达到该水平，则通过向发酵基质中加入适当的酸或缓冲剂就可容易地调低PH值。
己二酰-7-ACA产生后利用色谱法测试发酵液样品。
对于大多数深层通气发酵，将灭菌空气通过培养基使产黄青霉菌菌株得到更有效的生长并且提高己二酰-7-ACA的生产量。压入培养基中空气的体积通常至少为每分钟通入每体积培养基约0.2体积的空气。但是提高空气传递的速率常能对己二酰-7-ACA的生产带来有利的效益。
除产生己二酰-7-ACA外，产黄青霉菌菌株通常将产生许多副产物和代谢物。由于其中一些产物是酸不稳定的，因而在从发酵基质中回收己二酰-7-ACA时需要在酸性PH值下处理整个发酵液一段较短时期以便破坏某些同时产生的杂质。过滤后的发酵液进行处理然后从其中回收己二酰-7-ACA发酵产物，可选择性地在离子交换树脂上进行色谱分析而与发酵基质中的其它成分分离开，并且如果需要在进行随后的酶促裂解己二酰侧链步骤前，利用色谱法进行再次纯化。也可以在裂解侧链步骤完成后进行这样的离子交换色谱分析。给分离带来麻烦的最大副产物之一是己二酰-6-APA，可以利用化学方法或酶促方法降解该副产物以便使分离更容易。首先，将经过过滤的发酵液进行初步的分离操作，该步骤包括用水不混溶性有机溶剂如正-丁醇或戊基乙酸盐进行初步的提取而移走杂质。然后将经过提取的培养液按预备的方法用活性炭进行色谱分析进行再次纯化。
加入己二酸盐原料
优选的是，在按照上面描述制备产黄青霉菌发酵培养基时，即在接种之前，将己二酸盐原料加入到发酵培养基的其他成份中。也可以是在接种后某个时刻例如：在接种后1，2和/或3天加入己二酸盐原料。己二酸盐原料的定义是一种或多种能为所培养的产黄青霉菌菌株同化和利用而产生己二酰-6-APA的己二酸，或其盐或酯。可以以单独方式或联合使用己二酸，盐和酯。优选的是二钠盐，但钾盐和钾与钠的盐混合物也是合适的。也可以使用甲基酯，但乙基酯是水不溶性的。所使用的己二酸盐或酯必须是能为产黄青霉菌菌株同化和利用而生产己二酰-6-APA。例如，己二酸本身是合适的，虽然它是水不溶性的，但如果有适当的PH条件可以形成一种可同化的盐。
合适的延伸酶和/或羟化酶
经过培养并按照上面所说供给其己二酸盐原料以便产生己二酰-6-APA的产黄青霉菌菌株也可以是已用编码活性延伸酶和羟化酶的DNA进行转化，然后进行表达后，所说的己二酰-6-APA在原位进行环扩展而形成己二酰-7-ADCA，并且3-甲基侧链也被转化为3-羟甲基。
通过用己二酸盐培养产黄青霉菌而在胞内产生己二酰-6-APA。在该细胞内结构，即在原位，已转化的产黄青霉菌也表达编码活性延伸酶和羟化酶的DNA，然后该酶作用于己二酰-6-APA底物，使之进行环扩展而形成己二酰-7-ADCA，然后羟基化该产物，形成己二酰-7-ADAC（己二酰-7-氨基去乙酰基头孢菌烷酸）。
本发明新生物方法其范围包括用任何编码活性延伸酶和羟化酶的DNA转化上面描述的产黄青霉菌菌株类型，在其表达之后，将己二酰-6-PAP在原位进行环扩展形成己二酰-7-ADCA，然后羟基化形成己二酰-7-ADAC。因此，用于转化产黄青霉菌的DNA表达的酶不仅具有本领域内熟知的延伸酶活性即能免将异青霉素N进行环扩展形成DAOC，而且能够将己二酰-6-APA进行环扩展形成己二酰-7-ADCA。而且，该羟化酶能够将己二酰-7-ADCA进行羟基化而产生己二酰-7-ADAC。
这两种可选择的方法被看作是本发明范围内有关提供延伸酶和羟化酶活性物方式的合适实施方式。在一个优选实施例中，延伸酶和羟化酶的作用是通过用于转化产黄青霉菌的顶头孢菌的一个单一，但实际上有双重功能的基因表达的活性来完成的。该基因同时表达活性延伸酶和羟化酶，被认为是延伸酶/羟化酶基因，而其基因产物是延伸酶/羟化酶。通常，如用来自顶头孢菌的编码延伸酶/羟化酶活性的DNA转化产黄青霉菌时，表达该酶活性将由单一启动子序列控制，表明存在一个单一基因。
在本发明的另一个同样合适的实施例中，包括用分隔开的编码延伸酶和羟化酶活性的基因而不是单个的延伸酶/羟化酶基因的DNA转化产黄青霉菌宿主。应该注意到分隔开的延伸酶和羟化酶基因以及它们编码的相应的酶促活性物存在于如S.clavuligerus的原核微生物中，而不存在于如顶头孢菌的真核微生物中，在真核生物中编码单个延伸酶/羟化酶基因和酶，如已在上面观察到的。
在Kovacevic等人J.Bacteriol.，173（1），398-400（1991）和EP-A-0465189中描述的分离所说酶的方法部分中公开了原核羟化酶序列和编码该酶的核苷酸序列。本领域内熟练的技术人员将意识到，利用熟知的操作方法或自动的DNA合成仪可以从羟化酶序列合成编码羟化酶的DNA。换言之，DNA化合物，或编码羟化酶的同样氨基酸序列的其他序列，或片段或其具有等羟化酶活性的衍生物与启动子和其他调节序列结合使用时可用于制备各种克隆和表达载体，然后用于转化产黄青霉菌宿主以便表达出羟化酶，从而完成本发明方法。也可以利用该DNA化合物作为探针，用于筛选可能含有有效的羟化酶的待选菌株的基因文库，以便通过杂交鉴别同源的序列。通过使用本发明方法的真正的己二酰-7-ADCA底物和用HPLC分离羟化产物而证实鉴别出的任何假定的活性羟化酶。
当利用本发明的这个实施例即利用仅表达羟化酶活性的单个基因时，必需要分别提供编码该活性延伸酶的DNA，以便利用合适的表达载体转化产黄青霉菌，该表达载体允许原位表达该延伸酶功能以提供本发明方法中的环扩展步骤。许多延伸酶是已知的，并且期望由于侧链的相似性许多延伸酶将在本发明的新方法中起作用。
本发明的其他有效的实施例是基于下面事实：编码一种以上活性延伸酶和/或一种以上活性羟化酶的DNA可用于转化非重组产黄青霉菌菌株。利用这样的实施例可以获得增加了活性的延伸酶和/或羟化酶，因为其表达的酶蛋白的量增加了。
已经注意到在现有技术中描述的章节中，通过限制性核酸内切酶图谱已对来自Streptomyces    clavuligerus    ATCC27064的延伸酶进行了详细的序列分析和定性。但是，已报道来自S.clavuligerus    NRRL3585的同样的酶显示出具有不同的分子量，但还没有分析其序列。并且也是在上面描述的作为现有技术的部分中，来自顶头孢菌ATCC11550的DAOCS/DACS酶已进行了序列分析[Samson等人，Bio/Technology（1987）5∶1207-1214，和EP-A-0281391]。
在现有技术中已鉴定的这些延伸酶可用于本发明的新生物方法中。还证明来源于S.clavuligerus或顶头孢菌，或甚至于来自不同属的微生物的其他尚未鉴别的延伸酶也适用于完成本发明的新生物方法。鉴定这种新菌株和有效微生物属的方法以及分离假定的延伸酶和使之适用于本发明方法的步骤是简单的并且是本领域内技术人员熟知的。筛选待选新菌株和有效微生物属的无细胞提取物可以按可靠的能重复的方式进行，即将所说的提取物加到有已知DAOCS辅助因子存在的己二酰-6-APA底物中，该辅助因子包括亚铁（Fe2+）离子，抗坏血酸盐，酮戊二酸盐和三磷酸腺嘌呤（ATP）。通过按照类似于下文中进一步详细描述的方式供给未转化的产黄青霉菌己二酸盐原料可以产生足够量的己二酰-6-APA。如果形成己二酰-7-ADCA和/或己二酰-7-ADAC，则存在所需要的延伸酶（或延伸酶/羟化酶），可用色谱法检测其存在。
利用熟知的重组技术，根据来自S.clavuligerus和产黄青霉菌的延伸酶基因的核苷酸序列可以制备DNA探针，例如用于筛选待选微生物中DNA含量以生产适用于本发明方法的延伸酶。
延伸酶，羟化酶和延伸酶/羟化酶的可能的来源
已描述的延伸酶是能催化Penam环结构（存在于青霉素型分子中）扩展为ceph-3-cm环（存在于头孢菌素中）的酶。因此任何产生含有cephem环的代谢物的有机体可能是编码延伸酶的DNA来源。同样，任何产生含有3-羟甲基团的头孢菌素的有机体可能是编码羟化酶-（或延伸酶/羟化酶）的DNA源。这样的有机体的例子列于下表中，该表仅是为了举例不应认为是全部：
真菌：
顶头孢菌
头孢菌菌种
Emericellopsis
拟青霉菌属
帚霉菌属
双型异孢菌属（Diheterospora）
螺旋粉孢菌属（Spiroidium）
Anoxiopsis
放线菌：
Streptomyces    clavuligerus
利波曼氏链霉菌
S.wadayamensis
S.todorominensis
菲律宾头霉素链霉菌（S.filipinensis    cephamycini）
异型链霉菌（S.heteromorphus）
S.Panayens.S
灰色链霉菌
卡特兰链霉菌属
Lactamdurans诺卡氏菌（Nocardia    lactamdurans）
其他细菌：
黄杆菌菌种
反硝化产碱菌
大疱支动杆菌（Mycoplana    bullata）
雷特普罗威登斯菌
Lysobacter    lactamgenus
上文中列举的生物体的延伸酶和羟化酶仅是用于进一步研究的候选物，并不可能它们全都适用于本发明的新方法。
编码活性延伸酶的DNA片段的分离：
一旦按照上面描述的方法检测出存在所需要的延伸酶，用于分离编码活性延伸酶的DNA的方法也是简单的并是本领域内熟知的。根据已知序列和编码延伸酶的基因的部分序列构建DNA探针，该探针能与要分离的编码所需酶的DNA进行杂交。构建这样的探针是基于对编码延伸酶的氨基酸和核苷酸碱基序列以及相关特定微生物的优选密码子的了解。应用于Streptomyces    clavuligerus    ATCC27064的基因组DNA的该类型的典型步骤将在下文中作详细描述。
分离编码活性延伸酶的DNA的过程是用重组DNA技术中熟知的限制性切割和连接步骤来完成。为了产生和分离合适的限制性片段，需要有所使用的微生物的基因组的限制性内切酶图谱。已经能够得到S.clavuligerus和顶头孢菌的限制性图谱，因此，对于前者，可以使用限制性酶BamHI和SalI，通过电泳后提供所需的1.8～2.2Kb大小的片段。
酰基转移酶的来源和分离编码所说活性酶的DNA片段
顶头孢菌DAC酰基转移酶基因的克隆可以按照本领域内熟知的重组技术进行，用一般的术语紧接着在下文中描述。
为了克隆酰基转移酶基因，首先必须制备不具备将脱乙酰基头孢菌烷酸（DAC）转化为头孢菌素C能力的顶头孢菌突变体。这样的方法包括将顶头孢菌细胞与诱变剂如N-亚硝基胍（NTG），亚硝酸接触或紫外光照射，然后在合适的生长培养基上使其恢复并利用例如色谱法或生物学方法分析积累的DAC。
在识别编码酰基转移酶的基因时鉴别出合适的突变体后接着的步骤是从产生头孢菌素C的菌株中分离顶头孢菌DNA。利用限制性内切酶消化或机械切割将分离到的DNA裂解成合适大小的片段后，将其掺入到质粒，或粘性质粒，以及还含有合适的显性标记基因（如潮雷素和腐草霉素抗性基因）的转化载体中。该载体还应该含有有利于最后回收所所插入DNA的DNA序列，如λ（噬菌体）CoS位点，该位点的存在可以通过体外包装然后感染大肠杆菌而重新获得克隆的DNA，这一过程可用已完善建立的方法来完成。
随后用含有基因组DNA任意片段的载体转化酰基转移酶阴性突变菌株的原生质体，根据对抗生素的抗性选择转化子。然后用转化子分析其恢复产生头孢菌素C的能力，这表明含有酰基转移酶基因的载体成功地补充了产生头孢菌素C的能力。然后培养怀疑其含有克隆的基因拷贝的突变体，利用上面综述的方法分离其DNA并重新获得载体DNA。利用标准方法和容易获得的载体将该DNA亚克隆到E.coli中，然后再转化酰基转移酶阴性的突变体可以证实该载体是否真正含有酰基转移酶基因。然后按照本文中研究实施例中描述，利用分子遗传学领域内普通技术人员通常使用的技术分离该基因，进行序列分析以及加工处理。
根据本领域内也熟知的另一种方法，Matsuda等人在EP-A-0450758中公开了分离到的并进行序列分析的编码顶头孢菌的活性酰基转移酶的基因，以及推测的酶本身的氨基酸序列。这些可选用的方法包括分离酰基转移酶，对N-末端氨基酸进行序列分析，以及从这些信息推测编码该酶上这一部分的核苷酸序列。换言之从这些信息可以产生与整个编码序列进行杂交的探针，以便于分离该编码序列。
转化产黄青霉菌菌株
一旦获得编码活性延伸酶/羟化酶，延伸酶和羟化酶，以及酰基转移酶的DNA片段，可以将其与含有启动子，转译活化序列，抗性标记，调节序列，粘性质粒前体的DNA片段，以及其他任何允许或促进转化，启动基因产物表达，和促进转化子分离的DNA片段一起插入到质粒或其他表达载体中。然后将由此构建的表达载体用于完成产黄青霉菌菌株的转化以及活性延伸酶/羟化酶，延伸酶和羟化酶，和酰基转移酶基因的胞内表达。用于实现转化和表达的技术是本领域内熟知的，在下文中将对该典型方法进一步作详细描述。
如已在上面详细描述的，已转化的产黄青霉菌菌株在胞内表达活性延伸酶/羟化酶，延伸酶和羟化酶以及酰基转移酶，然后在原位分别作用于己二酰-6-APA底物，将其进行环延伸形成己二酰-7-ADCA，水解后一产物得到己二酰-7-ADAC，然后将其酰基化形成己二酰-7-ACA。
新的转化子
作为本发明优选实施例，表达由延伸酶/羟化酶和延伸酶/羟化酶+酰基转移酶基因编码的活性酶的特定的产黄青霉菌转化子就其与现有技术如在Cantwell等有（1990）Current    Genetics，17，213-221，EP-A-0281391和EP-A-0437378中的相似构建体相比而言是新的。Cantwell构建体具有置于产黄青霉菌异青霉素N合成酶（IPNS）启动子控制下的Streptomyces    clavuligerus延伸酶基因并且由此不同于丧失了任何编码羟化酶或酰基转移酶活性的DNA的本发明中的构建体。
Ingolia等人在EP-A-0281391中描述了含有编码产黄青霉菌延伸酶/羟化酶双功能酶的DNA并且被青霉菌IPNS启动子启动表达的产黄青霉菌转化载体。在这些构建体之一（pPS62）中，延伸酶/羟化酶基因融合到潮霉素磷酸转移酶基因的下游并位于该基因的阅读框架内。该基因产物，一种潮霉素磷酸转移酶∷延伸酶/羟化酶融合蛋白，不同于本发明的产品，一种基本上相同于顶头孢菌中产生的酶的延伸酶/羟化酶。利用外延系列分子操作手段构建在EP-A-028391中描述的其他载体，包括使用合成DNA接头。最后的构建体（pPS61）利用青霉菌IPNS启动子的1.2Kb    NcoI片段以表达延伸酶/羟化酶基因，并以构巢曲霉乙酰胺酶基因作为转化青霉菌的选择性标志。分别编码精氨酸和亮氨酸的延伸酶/羟化酶基因上的9和10位密码子序列可以从CGTCTC变化成CGCCTA，而并不改变所编码的氨基酸序列。
在本发明的构建体中，将1.2Kb    NcoI    IPNS启动子片段融合到延伸酶/羟化酶基因而并不改变天然延伸酶/羟化酶基因序列。在本发明的构建体中使用的IPNS启动子与天然启动子相比具有两个分隔开的四碱基重复序列，一个位于ATG起始密码子上游的SalI位点760bp处，另一个位于起始密码子上游的XbaI位点5bp处并位于5′未转译前导序列内。这些变化不会影响延伸酶/羟化酶基因的高水平表达。
该载体中的另一个不同点位于所使用的选择性标志中。在EP-A-0281391中描述的构建体使用乙酰胺酶和潮霉素作为选择性标志。这与用于本发明中的含有腐草霉素抗性标志的延伸酶/羟化酶青霉菌转化载体（pPEN/CEPH-1）相反。用pPEN/CEPH-1载体转化的并能表达延伸酶/羟化酶活性的产黄青霉菌菌株记作PC200。其分类学特征通常包括产生宽阔性分布的菌落，具有蓝绿到绿色，光滑柔软是黄色小滴;背面有黄色素扩散至琼脂中;分生孢子头部有整个区域都光滑的分枝，分生孢子椭园形至球形，3-4μm长。该产黄青霉菌的合适的培养条件是使用含有下列成分的固体培养基，包括乳糖，单水解物1.5%（w/v）;玉米浸提液0.5%（v/v）;蛋白胨0.5%（w/v）;NaCl0.4%（w/v）;MgSO4·7H2O 0.05%（w/v）;KH2PO40.06%（w/v）;FeCl3-6H2O 0.0005%（w/v）;CuSO4-5H2O 0.0002%（w/v）;琼脂3.0%（w/v）;溶于1升蒸馏水中PH4.8。刚描述的并记作PC200的产黄青霉菌已寄存于美国典型培养物保藏中心（ATCC），12301    Parklawn    Drive，Rockville，Maryland20852，保藏号为ATCC74186（保藏日为：1992年9月23日）
本发明中能产生己二酰-7-ACA的第二种新的产黄青霉菌转化体由于已用一个单个载体（pTS-8）转化，故既能表达活性延伸酶/羟化酶，也能表达酰基转移酶，该载体含有编码这两种酶的DNA。因此，该载体不同于在EP-A-0437378中提到的青霉菌转化载体，青霉菌转化载体含有要么单独编码顶头孢霉乙酰转移酶要么与编码突变延伸酶/羟化酶多肽的DNA序列相连的DNA。在PTS-8构建体中，分别由黄色青霉菌的IPNS启动子的不同拷贝激发延伸酶/羟化酶和乙酰转移酶基因的表达，用IPNS启动子的第三拷贝驱动作为可选择标记的腐草霉素抗性基因的转录。
在本发明的一个可替换的实施方案中，可以把延伸酶/羟化酶和乙酰转移酶插入到不同的载体中并以连续的方式引入宿主青霉菌菌株。把编码延伸酶/羟化酶和乙酰转移酶酶活性的DNA片段引入到青霉菌菌株中的顺序仅从实践的观点上看是重要的。优选地，应在乙酰转移酶插入之前，用延伸酶/羟化酶基因转化青霉菌，因为酶在体内是以该次序发挥作用的。因此，可通过检测己二酰-7-ADAC产物来监测延伸酶/羟化酶的表达。己二酰-7-ADAC是乙酰转移酶的底物，由己二酰-7-ACA产生表明随后导入的乙酰转移酶编码基因的表达。在体外，用一种适宜的检测方法检测乙酰转移酶，首先可以用乙酰转移酶基因转化青霉菌，并用上述的体外检测方法确定其表达，然后继续导入延伸酶/羟化酶基因。因此，两种路线均是本发明生产7-ACA的优选实施方案。
然而优选的实施例有通过构建一个单独的质粒载体同时导入的全部三种酶活性，上述的质粒载体含有编码顶头孢霉的延伸酶/羟化酶和乙酰转移酶活性。已经把用上述单独质粒载体pTS-8转化的并能表达延伸酶/羟化酶及乙酰转移酶活性的黄色青霉菌菌株鉴定为PC300。其毒性特征与在上面进一步描述的PC200的毒性特征一样。PC300可接受的培养条件与上文所述的PC200的一样。命名为PC300的黄色青霉菌菌株已寄存在美国典型培养物收集中心（ATCC），（12301.Parklawn    Drive，Rockville，Maryland    20852），寄存号为ATCC74187（寄存日期：1992.9.23）。
作为本发明的优选实施方案，用表达S.clavuligerus延伸酶基因活性的pPenFTSO载体转化的特定黄色青霉菌，就构建来说是一种新的不同于现有技术（Cantwell    et    al.（1990）Curren    Genetic）的构建方式。在两种构建中，用体外诱变连接启动子和延伸酶基因。在Cantwell构建中，在延伸酶基因的ATG处操作导入一个NdeI位点，通过XbaI/NdeI接头使之与IPNS启动子3′末端的XbaI位点相连。在本发明的构建中，在延伸酶基因的ATG处产生一个NcoI位点，并连接到IPNS接头之3′末端的NcoI位点上。在这些构建中，这样就产生了下列启动子-基因接点周围的序列：
Xbal    NcoI
IPNS  启动子    5'    TCTAGACACCATGG    3'    SEQ  ID  NO:1
Strep  延伸酶    5'    GTGAGAGTTGATGGAC    3'    SEQ  ID  NO:2
Cantwell    5'    TCTAGACACTATGGAC    3'    SEQ  ID  NO:3
本发明    5'    TCTAGACACCATGGAC    3'    SEQ  ID  NO:4
Cantwell构建用一个T代替一个C，而在本发明的构建体中则保留C;因此，IPNS启动子序列直接连接到ATG起始密码子上，发现所得的序列正好与天然产生的IPNS基因准确匹配。虽然仅有一个核苷酸碱基不同，但现有技术的启动子有可能导致较低的转译效率，并且进而导致较低水平的延伸酶基因表达。
在上述构建中，启动子或基因的区域中还包括其它不同点。Cantwell构建包含IPNS启动子的5′BamHI到XbaI    3′区域，而本发明的载体则包含启动子的5′NcoI到NcoI3′区域[Diezat    al.，（1990）J.Biol.Chem.265.16358-16365]。这样便导致在Cantwell构建体中IPNS启动子的5′末端增加了约250bp。然而该区域是在IPNS基因上游ACV合成酶基因的阅读框架中。
Cantwell构建体也包含从ATG到BamHI位点3′的链霉菌基因，而本发明的载体则包含该基因的ATG到SalI位点3′[Koracevic    et    al.（1989）J.Bacteriol.171，754-760]。这样导致在Cantwell构建体上增加了约1000bp的3′末端序列。本发明的构建体仍包含延伸酶基因到ATG之BamHI5′的上游区域;但通过IPNS启动子，该上游区域与延伸酶的阅读框架分开。
本发明的pPenFTSO构建体与在现有技术中描述的构建体的另一区别涉及所使用的选择性标记。青霉菌IPNS启动子的用途：融合在本发明构建体中的腐草青霉基因趋向于选择多拷贝整合或在允许高水表达的位点整合，因此，很可能产生以高水平表达延伸酶基因之较高百分比的转化体。
己二酰侧链的裂解
本发明新的生物加工方法的最后一步是从己二酰-7-ADAC或己二酰-7-ACA上裂解己二酰侧链，此需要用己二酰酰胺酶处理前面步骤的产物。如上文已经说明的，本发明的显著成就是能够在一次发酵培养中完成所有逐渐导致生成己二酰-7-ADAC和己二酰-7-ACA的步骤。该成就在未分离和部分纯化本方法各步骤的中间产物方面，提供了进一步改善的效率。但在该最后的步骤中，通过天然的或重组的黄色青霉基因表达，使己二酰酰胺酶系统不存在，即在原发酵培养物中还未在原位产生。
如果以分批的方式完成本发明的新的生物加工过程，则然后需要分离及部分纯化第一步的产物，而在此之前的步骤已在上文描述过。
然而，本发明的方法可以按任何引起己二酰-7-ADAC或己二酰-7-ACA与己二酰酰胺酶接触，以便可发生使上述化合物酶以促转化成7-ADAC或7-ACA的方式完成。在此“接触”的定义是广义的。可能使用粗制己二酰-7-ADAC或己二酰-7-ACA的无细胞培养液作高供料流，并用粗制的己二酰酰胺酶培养液以分批的方式处理之。由于它不需要任何实质上的纯化的起始反应物，因此，这样也能实现相当的效率。当然，变化是可能的。例如，在反应物相互接触之前，可以将反应物纯化到任何所需的程度。也可能不以分批方式而以连续的方式完成该方法。可以在保持本方法技术的前提下，以各种方式改变反应物本身的接触。因此，可以使用固定化酶，例如，以柱的形式使己二酰-7-ADAC或己二酰-7-ACA通过含己二酰酰基转移酶的柱。也可以把固定化酶作为悬浮液加到己二酰-7-ADAC或己二酰-7-ACA溶液中。上述固定化酶系统提供了易于酶复性及多次使用的优点。上述工艺技术的另一实例涉及膜反应器。接触反应物的优选方法是通过固定化酶柱。
在裂解步骤中使用己二酰酰胺酶
已知有许多酶对己二酰侧链有特异性。在下文描述实施例中将详细说明用从RAEV    Corp.购得的己二酰酰胺酶获得的结果。文献已经报道了从头孢菌素型分子上除去己二酰侧链的其他七种酶。七种酶中的六种来自假单胞菌种，而第七种来自芽孢杆菌菌种。一些假单胞杆菌酶之间存在某些相似性，但在其物理/生物学特性方面全部七种间存在一定程度的区别。它们的一些特征概括如下：
酶    参考文献    近似的分子量
(假单孢杆菌和    (亚单位)
芽孢杆菌菌株)
P.SY-77-1    Shibuya,et.al.    明显地与下面的
(Toyo  Jozo)    (1981)    GK  16  相同
P.GK16    Matsuda,Komatsu    16,000
(Asahi)    (1985)    54,000
P.SE83(acyI)    Matsuda,et  al.    38,200
(Asahi)    (1987)    19,900
P.SE83(acyII)    Matsuda,et  al.    25,400
(Asahi)    (1987)    58,200
P.diminuta  N176    Aramori,et  al.    58,000
(Fujisawa) (1991a)*26,000
P.diminuta  V22    Aramori,et  al.    7
(Fujisawa) (1991a)*7
Bacillus  latero-    Aramori,et  al.    70,000
sporus J1(Fuji.) (1991b)**(monomeric)
Pseudomonas  sp.    16,000
(RAEV  Corp.)    54,000
*Aramori et al.,J.Ferment.Bioeng.(1991)72:232-243.
**Aramori et al.,J.Bacteriol.(1991)173:7848-7855.
在本发明的新的生物生产方法中使用了上述所有的己二酰酰胺酶。通过检测针对己二酰-7-ACA和己二酰-7-ADAC的候选酶，根据在实际底物上它所发挥的作用，即可很容易地发现用于本发明方法的其它己二酰酰胺酶。阳性结果给出一种可靠的且可再现的候选酶确定可用于本发明方法的检测方法。使用由Szewczuk和Wellman-Bednawska在Clin.Chim.Acta（1978）84，19-26中报道的改进方法，从己二酰酐与7-ACA的反应制备上述底物。也可以采用Agric.Biol.Chem.（1981）45（7），1561-1567中描述的戊二酰-7-ACA的方法。可以根据在J.Macromol.Sci.Chem.（1990）A27，397-412中，由Albertson和Lundmark描述的方法制备己二酰酐。可从几个商业途径，包括Sigma    Chemical.Co.获得7-ACA。
如果需要使用一种快速的比色方法完成候选酶的粗略筛选，可用一种比色底物如己二酰-PNA（对-硝基苯胺）作为己二酰-7-ACA底物的替代物。可以在Szewczuk等人（Clinica    Chimica    Acta，84（1978）19-26）描述的有关γ-谷氨酰PABA方法基础上建立上述方法。侧链的裂解提供一种其存在和浓度很容易使用比色计确定的颜色变化。关于这些及其它适宜的比色方法的详述资料可参见Marelli，L.P.（1968）J.Pharm.Sci.57∶2172-2173;Szasz，G.（1969）Clin.Chem.15∶124-136;Szewczuk，A    et    al.（1980）Anal.Biochem.103∶166-169;及Reyes，F.et    al.（1989）J.Pharma.Pharmacol.41∶136-137。
将上面表中列出的acyⅡ和GK16酶的大亚单位与RAEV酶的N-末端氨基酸序列相比较。比较结果如下（括号内者表明大致与最后的测定相同）：
RAEV-SEQ    ID    NO∶5
(S)  N  (S)  (G)  A  V  A  P  G  K  T  A  N  G  N  A  L  (L)  L  Q  N  (P)
GK16  -  SEQ  ID  NO:6
S  N  S  W  A  V  A  P  G  K  T  A  N  G  N  A  L  L  L  Q  N  P
acyII  -  SEQ  ID  NO:7
S  N  N  W  A  V  A  P  G  R  T  A  T  G  R  P  I  L  A  G  D  P
从所示序列看，明显地这三种肽是相关的。但与上述者有相似N-末端序列的蛋白质未必有己二酰酰胺酶活性，象由节杆菌菌株生产的青霉素G酰基转移酶的情况。另一方面，有些用于本发明的己二酰酰胺酶与上述N-末端序列没有显示出显著的同源性。例如，在上表中列出的Asahi    acyI和Fujisawa    B.laterosporus    J    I酰基转移酶均显示有某些己二酰-7-ACA酰基转移酶活性，但与上面列出的其它酶没有任何序列同源性。因此，通过一种候选酶是否能够从己二酰-7-ACA上裂解己二酰侧链，来确定就用于该新的生物加工方法之最后步骤中的己二酰酰胺酶而论的本发明的范围，可容易而且可靠地确定上述详述的材料。
下面将详述本发明的具体优选实施方案，但这些仅为了说明，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
黄色青霉菌的培养条件
在含有LCSB培养基的平皿上保持这些方法中所用的黄色青霉菌株，LCSB培养基由乳糖，单水合物，1.5%（w/v）;玉米浆，0.5%（w/v）;胨，0.5%（w/v）;NaCl，0.4%（w/v）;MgSO4-7H2O，0.05%（w/v）;KH2PO4，0.06%（w/v）;FeCl3-6H2O，0.0005%（w/v）;CuSO4-5H2O，0.0002%（w/v）;琼脂，3.0%（w/v）;1升蒸馏水（PH4.8）组成。在25℃，65%的相对湿度下培养12天后，移去单个菌落，并加到含玻璃珠的带螺旋帽试管中的2ml无菌水内。通过涡流旋转浸渍生长的培养物，用悬浮液接种稻米培养瓶。稻米培养瓶内含25g/250ml的Uncle Ben′s转化米，即天然长粒并已用3到4体积的蒸馏水冲洗了7分钟的米，每隔30秒混合之，然后将水放出，直到米吸收了约25%的水。在25℃和65%的湿度下，经12天后，用50mL无菌水洗掉米上的孢子。用孢子悬浮液接种液体培养基，并且也用孢子悬浮液提供用于在4℃贮存的培养物亲液物。把孢子加到等体积的脱脂牛奶中并在无菌安瓶中冻干。
对在震荡培养瓶中的菌株进行两阶段发酵，然后用于生产青霉素或生产作为RNA或DNA源的菌丝体。把1×108个孢子加到含50m/500mL培养基的培养瓶中以开始种子菌培养阶段，培养基由在1升蒸馏水中的葡萄糖，3.0%（w/v）;Pharmameedia，1.0%（w/v）;玉米浆，3.0%（w/v）;硫酸铵，0.2%（w/v）;CaCO30.5%（w/v）;无水磷酸二氢钾，0.05%（w/v）;乳糖，1.0%（w/v）;初级干酵母，1.0%（w/v）组成。在直径为70mm振幅为220rpm的旋转震荡器上，于25℃和65%相对湿度下培养。培养48小时后，通过把2mL的营养种子菌转移到含35mL/500mL培养基的培养瓶中以开始生产阶段，培养基含下列组份：KH2PO4，0.05%（w/v）;K2SO4;0.5%（w/v）;（NH4）2SO4，1.0%（w/v）;乳糖，12.0%（w/v），Pharmamedia，2.75%（w/v）;CaCO3（沉淀的），1.0%（w/v）;猪油，1.0%（v/v），在1升蒸馏水中，PH6.6。接着在接种前高压消毒，加入25%的无菌己二酸钠（PH6.6），直到己二酸钠的终浓度为2.5%。接种后保温培养，然后在与种子阶段同样的条件下保持5到7天。
当需要以菌丝体产生用于转化的原生质体或作为DNA源时，使菌株在含50mL/250mL完全培养基（CM）的培养瓶中生长，该完全培养基（CM）由在1升蒸馏水中的50mL的20×clutterbuck′s盐（120gNa2NO3，10.4g KCl，10.4g MgSO4-7H2O，3.04g KH2PO4），2.0mL Vogel′s Trace Elements（0.3M柠檬酸;0.2M ZnSO4;25mM Fe（NH4）2（SO4）2-6H2O;10mM CuSO4;3mM MnSO4;8mM硼酸;2mM Na2MoO4-2H2O），5g胰化胨，5g酵母提取物，10g葡萄糖组成。在220rpm的旋转震荡器上，于25℃培养。
实施例2
顶头孢霉的培养条件
在含完全培养基的斜面上培养顶头孢霉菌株，完全培养基由在1升蒸馏水中的蔗糖，20g;琼脂20g;胨，4g;酵母提取物，4g;NaNO3，3g;KH2PO3，0.5g;K2HPO4，0.5g;KCl，0.5g;MgSO4/7H2O，0.5g;FeSO4/7H2O，0.01g组成，PH6.6。在28℃，66%的相对湿度下生长10天后，把6ml无菌水加到斜面上，并从琼脂表面上刮下生长的培养物。把所得的悬浮液转移到含玻璃珠的无菌螺旋帽试管中。旋转几分钟以浸渍生长的培养基后，用3.5ml的所得悬浮液接种液体培养基。也用该悬浮液提供可于4℃贮存的培养物亲液物。将浸渍的生长培养基悬液离心，把颗粒再悬浮在5%脱脂牛奶中，并在无菌安瓶中分装冻干。
用在震荡瓶中菌株的两阶段发酵培养物生产头孢菌素或生产作为DNA源的菌丝。把接种物加到250ml培养瓶中以开始种子菌培养阶段，每个培养瓶含15ml由下列组分组成的培养基：1升蒸馏水中含葡萄糖，5g;蔗糖，4.0g;玉米淀粉，30g;甜菜糖蜜，50g;大豆粉，65g;CaSO4/2H2O，15.8g;乙酸铵，8g;CaCO3（pptd），5g;（NH4）2SO4，7.5g;MgSO4/7H2O，3.5g;KH2PO4，1g;大豆油每个培养瓶0.15ml，PH6.2。在直径为70mm，振幅220rpm的旋转震荡器上，于25℃和65%的相对湿度下培养。培养96小时后，将2ml的营养种子菌培养物转移到250ml含15ml上述新鲜培养基的培养瓶中开始生产阶段。在同样的条件下，再继续保温96小时。
当需要用菌丝体作为供转化的DNA源时，使菌株在含100ml/500ml完全培养基的培养瓶中生长，完全培养基由在1升蒸馏水中的甘油，20g;蛋白胨，4g;酶母提取物，4g;KH2PO4，0.5g;K2HPO4，0.5g;KCl，0.5g;MgSO4/7H2O，1g;NaNO3，3g;FeSO4/7H2O，0.01g组成。在30℃，200rpm的旋转震荡器上保温。
实施例3
分离青霉和头孢霉的基因组DNA及总RNA
通过粗干布过滤收集按上述方法经48小时保温生长的营养菌丝体，然后在液氮中冷冻并过夜冻干。用臼和杵把干菌丝体与沙子一起研磨，并重新悬浮在25mL    100mM    LiCl，50mM    EDTA，10mM    Tris（PH8.0），4%SDS中。在60℃的水浴中把悬浮液加热到50-55℃后，首先用1M    Tris（PH8）饱和的苯酚提取，然后用Tris-饱和的苯酚∶氯仿（1∶1;V∶V），再用氯仿提取该混合物。加入等体积的冷6M    LiCl使RNA从液相中沉淀;然后将混和物在-20℃下保持2-3小时。于4℃，以12000×g离心20分钟后，在上清液中加入66%乙醇，并冷却到-20℃，经15分钟以沉淀DNA。按上述离心后，用70%乙醇洗DNA沉淀物，干燥并再悬浮于TE缓冲液（10mM    Tris-HCl，PH7.5，1mM    EDTA）中。在琼脂糖凝胶电泳中，用溴乙啶染色，通过与已知的DNA标准品比较以估测DNA的浓度。
为了提取RNA，将实施例1和2中所述的黄色青霉和顶头孢霉培养物加在35mL发酵培养基（发酵条件如上述）中，于25℃下，220rpm的旋转震荡器上培养96小时。在真空下通过Whatman1号滤纸过滤收集菌丝体并用约50mL水冲洗之。直接从滤纸上刮下菌丝体，悬浮在5mL的裂解缓冲液（50mM    Tris-HCl，pH7.4、150mM    NaCl、5mM    EDTA，pH8.0、5%SDS）中，在液氮中冷冻并冻干。过夜冻干后，加入5mL含0.1%DEPC和5mL    1M    Tris（pH8）饱和过的苯酚∶氯仿∶异戊醇（50∶50∶1）并将混和物置于37℃下震荡20分钟以融化之。在4℃下，将混和物以1200×g离心10分钟，移出含水层，并首先用1M    Tris（pH8）饱和的苯酚∶氯仿∶异戊醇（50∶50∶1），次之用1M    Tris（pH8）饱和的苯酚，第三步用氯仿再次提取之。使等体积的6M    LiCl与最后的含水层合并，溶液在-20℃下至少放置4小时。4℃下，以12000×g离心20分钟以沉淀总RNA，把沉淀饼溶解在0.3mL    TE缓冲液加0.03mL    3M乙酸钠中，然后加入2.5体积乙醇沉淀RNA。将最后的沉淀饼溶解在0.1mL    TE缓冲液中并根据260nm吸收率进行分光光度分析，以确定RNA浓度。
实施例4
构建顶头孢霉基因文库并分离顶头孢霉延伸酶/羟化酶和乙酰转移酶基因
分离顶头孢霉延伸酶/羟化酶基因
为了得到大小为10到20Kb的平均片段，用Sau 3 AI部分消化顶头孢霉基因组DNA，通过在5到20%NaCl密度梯度上离心已消化的片段以浓缩该大小范围的片段。用上述大小的DNA经连接到λ2001载体的BamHI位点以产生顶头孢霉基因组DNA文库，使用Gigapak（Stratagene）包装到噬菌体颗粒中，然后感染大肠杆菌。把所得的噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜上并通过与已公开的延伸酶/羟化酶基因（Samson et al，1987）的3′末端序列互补的寡核苷酸探针杂交以筛选之。使用T4多核苷酸激酶用[τ-32p]ATP对探针进行末端标记。分离阳性克隆，绘制限制性内切酶位点图，并通过与上述寡核苷酸以及另一个具有与该基因的5′末端互补的序列的Southern印迹杂交确认该基因的方向。
分离顶头孢霉乙酰转移酶基因
虽然它不是下文实施例11和12所述的为随后的载体构建而分离乙酰转移酶基因所用的方法，但下列方法是本领域技术人员能够根据目前可获得的DNA序列资料完成的。按上文所述构建顶头孢霉基因组文库，在与寡核苷酸探针杂交的基础上从中筛选编码乙酰转移酶基因的克隆，上述探针与乙酰转移酶序列互补（参见Matsuda    at    al.（1992）Biochem.Biolhys.Res.Commun.182∶995-1001）。
实施例5
链霉菌Streptomyces    clavuligerus的培养条件
在这些方法中所用的S.clavuligerous菌株是ATCC27064。在含下列组份的平皿上培养该菌株：1升蒸馏水中含酵母提取物，4g;麦芽提取物，10g;葡萄糖，4g;琼脂，20g;pH7.2。在30℃下生长5天后，向平皿中加2mL无菌水，并从琼脂表面刮下生长的培养物。把所得的悬浮液转移到含玻璃珠的无菌螺旋帽试管中。通过旋转浸渍生长的培养物，用悬浮液接种液体培养基。加入终体积为15%的甘油，可在-70℃下永久贮存该悬浮液。
当需要以菌丝体产生用于转化的原生质体或作为DNA源时，使菌株在每升含200mL    YEME的培养基中生长，YEME培养基由在1升蒸馏水中的酵母提取物，3g;胨，5g;麦芽提取物，3g;葡萄糖，10g;蔗糖，340g;MgCl2-6H2O，1.02g;甘氨酸，5g;琼脂，18g组成。在28℃，220rpm的旋转震荡器上保温。
实施例6
分离链霉菌基因组DNA
通过以22100×g离心10分钟收集如上所述制备的经48小时生长的营养培养物。把细胞再悬浮在10mL    TE缓冲液中并加入10mg溶菌酶，在30℃把混和物保温15分钟。然后加入1ml20%SDS，接着立刻加入10mL    TE（pH8）饱和的苯酚和1.5mL    5M    NaCl，并将混和物缓慢倒转20分钟。以12000×g离心10分钟分离各相，移出液相并把它转移到干净试管中。加入等体积的氯仿并把混和物缓慢翻转10分钟。以12000×g再次离心10分钟分离各相并把液相再移到一干净试管中。仔细加入2体积的异丙醇，使沉淀的DNA卷曲，并将其再次溶解在最小体积的TE缓冲液中。加入RNAse    A直到终浓度为20μg/mL，并在50℃将溶液保温1小时。然后加入蛋白酶K，直到终浓度为100μg/mL，同时还加入100mM    NaCl，和0.4%SDS，将混和物在37℃保温1小时。再用等体积TE（PH8）饱和过的苯酚提取该溶液，再用另一份氯仿提取。在加入2体积的异丙醇后，使最后提取的DNA卷曲，根据在260nm处的吸收率，用分光光度法确定DNA的浓度。
实施例7
构建基因文库并分离含S.clavuligerus延伸酶和羟化酶基因的DNA片段
分离S.clavuligerus延伸酶基因
用限制酶BamHI和SalI消化按上述方法得的S.clavaligerous基因组DNA。在0.8%琼脂糖凝胶上电泳分离消化的DNA并洗脱1.8到2.2Kb的片段，将其连接到预先用BamHI和SalI消化的pUC18 DNA上。通过电穿孔（Gene Pulser，Bio-Rad，Richmond，CA）用连接混和物的稀释物转化感受态JM 109细胞。感受态细胞的制备和电穿孔条件均根据制造商的说明书。把转化混和物铺敷在含100μg/mL氨苄青霉素，和75μL 2%X-Gal的LB平皿上。接着在37℃保温过夜，由于质粒载体的β-半乳糖苷酶基因活性失活而使菌落呈无色，从而根据这一现象鉴别重组菌落。检出无色菌落并放到新鲜的含100μg/mL氨苄青霉素的LB平皿上。在37℃过夜生长后，把菌落转移到硝酸纤维素滤膜上并与符合于公开的S.clavuligerus延伸酶基因序列[Kovacevic et al，（1989）J.Bacteriol.171∶754-760，和Ingolia et al，U.S，5，070，020]的、通过多聚酶链反应产生的探针杂交。根据制造商的说明书（Pharmacia，Piscataway，New Jersey），用（32p）dCTP和寡标记盒通过随机引物延伸反应完成多聚酶链反应产物的标记。在106CPM放射标记探针、30%甲酰胺、5×SSC（0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，PH7）、0.1%SDS、5×Denhardt′s（5g Ficoll，5g聚乙烯吡咯烷酮，和5g BSA制成的500mL 50×储备液）以及100μg/mL小牛胸腺DNA存在的情况下，在37℃过夜完成杂交反应。数个转化体明显地与探针杂交。通过限制酶分析，确定了一个菌落含有带延伸酶基因的载体，并把该质粒命名为pFTSO-1。
分离S.clavuligerus羟化酶基因
用BamHI部分消化S.clavuligerus基因组DNA，并将其连接到得自Stratagene的λDashⅡ载体上。通过与30bp寡核苷酸杂交筛选所得的基因文库，该30bp寡核苷酸序列有与公开的羟化酶基的前30个碱基（Kovacevic    and    Miller，1991，J.Bact.173∶398）相同的序列。与来自两个阳性噬菌体克隆的用BamHI消化的DNA进行Southern杂交，显示出所需要的6Kb片段，然后再次克隆该片段。用Kpn    I消化后，该亚克隆产生了一组与已公开的羟化酶基因周围区域的限制酶图谱（Kovacevic    and    Miller，1991）相一致的片段。
实施例8
分离质粒DNA
使含所需质粒的大肠杆菌培养物在500mL    LB肉汤（20g/l    LB    Broth    Base（Gibco，Paisley，Scotland）），和15μg/mL四环素中，在37℃，220rpm旋转震荡器上生长12-16小时。在4℃下以4000×g离心10分钟，沉淀细胞团块。把细胞团块再次悬浮在18mL葡萄糖缓冲液（50mM葡萄糖，25mM    Tris    PH8.0，10mM    EDTA）中，并在葡萄糖缓冲液中加入2mL    40mg/mL溶菌酶（Sigma，St.Louis，MO），混和后将混和物在室温下保温15分钟。加入40mL新制备的0.2N    NaOH，1%SDS，缓慢翻动混和物并在冰上放置10分钟。然后加入30mL乙酸钾（PH4.8），充分混和后把所得的混和物在冰上再放置10分钟。在4℃下以4000×g离心10分钟，沉淀细胞碎片，并通过粗平布滤器过滤所得的上清液。把异丙醇（6体积）加到澄清的上清液中以沉淀质粒DNA，并在室温下保温20分钟以使沉淀形成。在4℃，以4000×g离心20分钟使质粒DNA沉淀，然后用70%乙醇洗并简单干燥之。用9mL    TE缓冲液再次悬浮沉淀饼，然后加入10g    CsCl和0.387mL    10mg/mL的溴乙锭。将该溶液以313，100×g离心24小时。用紫外灯观察在氯化铯梯度中形成的质粒带，分离该带，然后用水饱和的丁醇提取以除去溴乙锭。通过对TE缓冲液透析除去在质粒制备中使用的CsCl，最后使用PEG（MW8000）浓缩DNA。根据在260nm处读出的吸光率，以分光光度法测定DNA的浓度。
实施例9
构建青霉转化载体pPenFTSO
插入腐草霉素抗性基因
用腐草霉素抗性基因作为选择性标记，构建青霉转化载体。首先通过分离经在琼脂糖凝胶上电泳并从琼脂糖凝胶上洗脱的来自质粒pUT713（CAYLA，Toulouse Cedex，France）之BamHI/BglⅡ消化产物的660bp片段以完成载体的构建，该片段含腐草霉素抗性基因（来自Streptoalloteichus hindustanus的腐草霉素结合蛋白基因）并与酵母细胞色素C1末端偶联。把分离的片段连接到载体pSELECT
Figure 921133316_IMG6
1（Promega Corporation）的BamHI位点上，并通过限制酶分析确定基因的方向。通过用HindⅢ限制除去所得质粒中唯一的HindⅢ位点，用Klenow多聚酶填平并再连接之。接着，插入含λcos位点的550bp    SauⅠ片段。当包括适宜大小的插入段时，该位点即能使载体用于形成柯氏质粒。该载体称为pSCP4。
用Sau3A消化黄色青霉的基因组DNA，并用于制备在噬菌体载体λEMBL3中的文库。从该文库中分离含异青霉素N合成酶（TPNS）基因的克隆，并用于制备一系列的亚克隆，其中之一含～3.6Kb片段，该片段从IPNS基因上游的第一个HindⅢ位点到该基因下游的第一个HindⅢ位点。经用SalⅠ限制除去亚克隆中唯一的SalⅠ位点，用Klenow多聚酶填平缺口并再连接之。接着，用XbaⅠ作限制切割，相似地除去唯一的XbaⅠ位点，然后填平并再连接之。所得的质粒叫作pSXF-1。从pSXF-1中凝胶分离基因工程改造的IPNS启动子（作为1.2Kb    NcoⅠ片段），并连接到上述pSCP4的NcoⅠ位点中。选择通过限制性消化确定的方向，以使该启动子在ATG起始密码子处与腐草霉素抗性基因融合。该质粒叫做pUTZ-2。
插入S.clavuligerus延伸酶基因
通过在0.8%琼脂糖凝胶上电泳并洗脱从来自pFTSO-1（上文所述的载体）的BamHI和SalI消化片段纯化含S.clavuligerus延伸酶基因的1.645Kb片段。把分离的片段连接到也用BamHI和SalI消化的载体pSELECT（Promega Corporation）中。该载体叫作pFTSO-8。使用Altered Sites
Figure 921133316_IMG7
体外诱变系统（Promega Corporation）通过对pFTSO-8的位点针对性诱变在延伸酶基因的ATG起始密码子处产生新的NcoⅠ位点。根据制造商的说明书完成诱变。构建一个互补于来自已公开之链霉菌延伸酶基因（Kovacevic    et    al，（1990）Journal    of    Bacteriology，171，P.3952-3958）序列，在ATG起始密码子区域的DNA编码序列的寡核苷酸。通过氰乙基氨基磷酸酯化学方法（Pharmacia    Gere    Assembler    instrumentation）合成寡核苷酸，寡核苷酸序列如下：
SEQ    ID    NO∶8
3'    CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG    5'.
通过限制酶分析进一步确定诱变。接着，用NcoⅠ限制含工程改造之黄色青霉IPNS启动子区域的，来自pUTZ-2的1.2Kb    NcoⅠ片段，再通过琼脂糖凝胶电泳分离该片段。把IPNS-启动子区域连接到pFTSO-8载体中并在延伸酶基因的ATG起始密码子处通过诱变产生的新的NcoⅠ位点插入之。通过限制酶分析确定启动子到延伸酶基因的方向。除去该IPNS-启动子∶延伸酶基因暗盒（作为一个BamHI/SalⅠ片段）并插入到BamHI/SalI切割的上述青霉转化载体pUTZ-2中。最后得到的构建体叫作pPenFTSO。
实施例10
构建青霉转化载体pPen/CEPH-1
掺入IPNS启动子区域
通过用xhoⅠ/smal消化，从上文实施例9进一步描述的pUTZ-2中分离IPNS启动子区域。用BamHI切割pUTZ-2载体，用dNTP′s和Klenow片段填平突起末端产生平整末端，然后用xhoⅠ消化，并把分离出的xhoⅠ/SmaⅠ    IPNS启动子片段连接到该被切割载体中，得到含两个IPNS启动子区域的构建体，该载体叫作pUTZ-7。
掺入顶头孢霉延伸酶/羟化酶基因
作为XhoⅠ/XbaⅠ片段从pUTZ-7分离其中的一个IPNS启动子区域（通过在琼脂糖凝胶上电泳并洗脱），并把它连接到XhoⅠ/XbaⅠ切割的载体pBlue    ScriptⅡSK（Stratagere，La，Jolla    CA）中。该载体叫作pIPNSp/blue。
从上述鉴定的基因组克隆中分离头孢菌延伸酶/羟化酶基因（通过在琼脂糖凝胶上电泳并从琼脂糖凝胶上洗脱），并作为一个1.6Kb HindⅢ/xbaⅠ片段将其连接到HindⅢ/xbaⅠ消化的载体pSELECT中。使用Altered EitesTM体外诱变系统（Promega Coropation）通过位点针对性诱变在延伸酶/羟化酶的ATG起始密码子处产生一个新的BspHI位点。按照制造商的说明完成诱变。构建一个酸互补于来自已公开的顶头孢霉延伸酶/羟化酶基因（Samson et al.，Bio/Technology，Vol.5，November，1987）ATG起始密码子区域DNA序列的寡核苷酸。通过氰乙基氨基磷酸酯化学方法（Pharmacia Gene Assembler instrumentotion）合成寡核苷酸序列，寡核苷酸序列如下：
SEQ    ID    NO∶9
3'    GTTTTGGTGTCGTAGTAGTACTGAAGGTTCCAG    5'.
通过限制酶分析进一步确定诱变。然后分离作为BspHT/xbaⅠ片段的顶头孢霉延伸酶/羟化酶基因（通过在琼脂糖凝胶上电泳并洗脱），并把它连接到在上面实施例中描述的NcoⅠ/xbaⅠ消化的载体pIPNSp/blue中。现在该载体在顶头孢霉延伸酶/羟化酶基因的ATG处含有青霉菌IPNS启动子。该载体叫作pIPNSp/EXP/blue。有XhoⅠ部分消化并用XbaⅠ完全消化该IPNS启动子∶延伸酶/羟化酶基因暗盒，分离该片段（通过在琼脂糖凝胶上电泳并洗脱），然后把该片段连接到xhoⅠ/xbaⅠ消化的上面实施例中描述的载体pUTZ-2中，以产生最后的转化载体pPEN/CEPH-1。
实施例11
构建表达S.clavuligerus之延伸酶和羟化酶基因的青霉转化载体
用黑曲霉β-微管蛋白基因作为杂交探针，从λ基因文库中克隆黄色青霉β-微管蛋白基因。把含青霉β-微管蛋白启动子的2.0Kb    xbaⅠ/HindⅢ片段连接到pSELECT（Promega）的xbaⅠ/HindⅢ位点中。通过对序列AAAATGCGT到ACCATGGGT的位点针对性诱变，在ATG起始密码子处导入一个NcoⅠ位点。从所得载体中凝胶分离一个1.4Kb    BamHI/NcoⅠ片段，并连接在pUTZ-2（上面所述的）的BamHI和NcoⅠ位点之间以产生载体pCI-6。从黄色青霉基因组克隆中凝胶分离一个含IPNS和乙酰转移酰基因的5.1Kb    SalⅠ片段，并把它连接到pUTZ-2的SalⅠ位点中，以产生pUTZ-5。经用BamHI和HindⅢ限制性消化，从pUTZ-5中分离IPNS基因的3′末端序列，然后通过凝胶分离连接在pCI-6（上述的）BamHI和HindⅢ位点之间的1.3Kb片段，以产生pCI-13。通过限制性消化除去在pCI-13的BamHI位点附近的唯一SalⅠ位点，用Klenow多聚酶充填并重新连接之。通过对序列GGAAGACG到GGTCGACG的位点针对性诱变，在BamHI位点的另一侧导入一个新的SalⅠ位点。然后通过用PvuⅠ限制性凝胶分离较大的片段，从质粒中除去氨苄青霉素抗性基因，再连接后得到pCI-15。最后，从pPENFTSO中凝胶分离作为2.4Kb    BamHI/SalⅠ片段的IPNS启动子∶延伸酶基因暗盒，并把它连接到pCI-15中，得到pEXP-1。
构建表达S.clavuligerus羟化酶和延伸酶基因的载体包括下列步骤。把含羟化酶基因的2.9Kb    KpnⅠ片段亚克隆到pSELECT中，以使多聚接头中的EcoRI位点与该基因的5′末端邻近。通过对序列TCCATGGGC到序列TCGATGGC的位点针对性诱变除去质粒中的唯一NcoⅠ位点，同时通过把序列AACATGGC改变成ACCATGGC，在起始密码子处导入一个新的NcoⅠ位点。两种变化均维持编码的氨基酸序列不变。从pUTZ-2中凝胶分离含基因工程改造之IPNS启动子的1.0Kb    EcoRI/NcoⅠ片段，并把它连接在含改变之羟化酶基因的上述载体的EcoRI位点和NcoⅠ位点之间。接着，通过位点针对性诱变使所得载体中的唯一EcoRI位点改变成HindⅢ位点。从所得的载体中分离作为HindⅢ片段的5′IPNS∶羟化酶融合构建体，并把它连接到上述载体pEXP-1的唯一HindⅢ位点中。最后的载体含各由IPNS启动子驱动的延伸酶基因和羟化酶基因，以及由β-微管蛋白启动子驱动的腐草霉素抗性标志基因。
实施例12
构建青霉转化载体pPenCACT
掺入潮霉素抗性基因
用潮霉素抗性基因作为优势选择性标志，构建青霉转化载体。从载体pHph-1（Boehringer    Mannheim，Indianapolis，IN）中分离作为1.15Kb之BanHI片段的大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因（在琼脂糖凝胶上电泳并洗脱），并把该基因连接到BamHI消化的载体mp19中。根据对RF DNA的限制酶分析确定潮霉素抗基因在载体mp19中的方向。5′BamHI位点靠近潮霉素抗性基因的ATG起始密码子。为了利于定位一个在该5′BamHI位点处的改变的启动子，用MutatorTM位点针对性诱变药盒（Stratagene，La Jolle，CA），通过位点针对性诱变除去3′BamHI位点。根据制造商的说明书完成诱变。构建一个寡核苷酸以互补于来自已公开的大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因序列（Gritz，L.and Davies，J.1983，Gene 25，179）3′BamHI位点的DNA区域。通过氰乙基氨基磷酸酯化学方法（Pharmacia Gene Assembler imstrumentation）合成寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列如下：
SEQ    ID    NO∶10
5'    TACCCGGGGTTCCCGCGAACT    3'.
通过限制酶分析进一步确认诱变。然后作为一个SmaⅠ/xbaⅠ片段分离诱变的潮霉素抗性基因（通过在琼脂糖凝胶上电泳并洗脱），并把该片段连接到SmaⅠ/xbaⅠ消化的载体pUC18中。
从NcoⅠ切割的载体pUTZ-2（上文描述的载体）中分离（通过在琼脂糖凝胶上电泳并洗脱）作为一个1.2kb    NcoⅠ片段的青霉启动子。合成寡核苷酸接头，在IPNS启动子片段的末端从NcoI位点产生一个BamHI位点，以使IPNS启动子定位在5′BamHI位点中靠近潮霉素抗性基因的ATG处。通过氰乙基氨基磷酸酯化学方法（Pharmacia    Gene    Assembler    instrumentation）合成寡核苷酸，且寡核苷酸的序列如下：
SEQ    ID    NO∶11
5'    CATGAAGAAG    3'
SEQ    ID    NO∶12
3'    TTCTTCCTAG    5'
该序列保持IPNS启动子的天然序列，但在潮霉素抗性基因中插入两个氨基酸。将寡核苷酸退火，磷酸化并连接到NcoⅠ切割的IPNS启动子片段上，结果在IPNS启动子片段的5′和3′末端均有BamHI位点。将连接好的启动子与在pUC18中的BamHI切割的潮霉素抗性基因相连，并通过限制酶分析确定其方向。然后分离（通过在琼脂糖凝胶上电泳并洗脱）作为一个2.1Kb    xhoⅠ/SalⅠ片段的上述IPNS启动子∶潮霉素抗性基因盒（xhoⅠ位点位于IPNS启动子的5′末端，并且SalⅠ位点来自pUC多聚接头），并将其连接到Sal消化的载体pSELECT中。通过限制酶分析确定基因暗盒的方向。该载体被称为pIPNS/HYG。
掺入顶头孢霉乙酰转移酶基因
通过在琼脂糖凝胶上电泳并从琼脂糖凝胶上洗脱，从基因组克隆（上文所述）分离作为1.8Kb BglⅡ/SalⅠ片段的头孢菌素乙酰转移酶基因。把该乙酰转移酶基因连接到BamHI/SalⅠ消化的载体pSELECT中。为了有利于在头孢菌素乙酰转移酶基因的ATG处定位青霉菌IPNS启动子，在乙酰转移酶基因的ATG处产生一个新的NcoⅠ位点，并且使用Altered SitesTM体外诱变系统（Promega Coroporation），通过位点针对性诱变除去结构基因中的内部NcoⅠ位点。按照制造商的说明书完成诱变。构建寡核苷酸使之互补于来自上文SEQ ID NO∶1和2中列出的头孢菌乙酰转移酶基因序列的有所需DNA区域的编码序列。用于除去结构基因中内部NcoⅠ位点的寡核苷酸序列如下：
SEQ    ID    NO∶13
3'    GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT    5'.
用于在ATG起始密码子处产生新的NcoⅠ位点的寡核苷酸序列如下：
SEQ    ID    NO∶14
3'    CGCCCACCATGGCGCCTCAGAT    5'.
通过氰乙基氨基磷酸酯化学方法（Pharmacia    Gene    Assemblerinstrumentation）合成上述寡核苷酸。通过限制酶分析确定诱变。该载体叫作pMUTACT。
从上文实施例中描述的载体pUTZ-2中分离（通过在琼脂糖凝胶上电泳并洗脱）作为一个1.2Kb    NcoⅠ片段的青霉菌IPNS启动子，把该启动子片段连接到NcoⅠ切割的载体pMUTACT中，现在IPNS启动子便直接定位在顶头孢霉乙酰转移酶基因的ATG处。通过限制酶分析确定启动子的方向。用XhoⅠ/SalⅠ消化上述IPNS启动子∶乙酰转移酶基因暗盒（XhoⅠ位点在IPNS启动子的5′端，SalⅠ位点在乙酰转移酶基因的3′端），并把上述暗盒连接到SalI消化的载体pSELEECT中。通过限制酶分析确定该片段的方向。该载体称为pMUTACT/IPNS。
用于在乙酰转移酶基因的ATG处产生新的NcoⅠ位点的诱变导致第二个氨基酸由丝氨酸变为丙氨酸。为了保持编码序列与天然基因相同，使用Altered SitesTM体外诱变系统进行位点针对性诱变。构建互补于来自上文SEQ ID NO∶1和2列出之乙酰转移酶基因序列的所需DNA区域之编码序列的寡核苷酸。用于把第二个氨基酸从丝氨酸改变为丙氨酸的寡核苷酸序列如下：
SEQ    ID    NO∶15
3'    TCTAGCTAGACACCATGTCGCCTCAGAT    5'
用氰乙基氨基磷酸酯化学方法（Pharmacia    Gere    Assembler    instramentation）合成上述寡核苷酸，使用USB    Sequenase    Veision2.0DNA序列分析药盒（USB，Cleveland，Ohio）经DNA序列分析进一步确定诱变。使用氰乙基氨基磷酸酯化学方法（Pharmacia    Gere    Assembler    instramentation）合成用于序列分析的引物。该载体被称为pMUTACT/IPNS-2。
从载体pIPNS/HYG中除去作为XbaⅠ片段的IPNS启动子∶潮霉素抗性基因暗盒，并把它连接到用XbaⅠ消化的载体pMUTACT/IPNS-2中，得到最后的转化载体pPenCACT。通过限制酶分析确定潮霉素基因盒的方向。
实施例13
构建表达顶头孢霉延伸酶/羟化酶和乙酰转移酶基团的青霉转化载体pTS-8
从基团组克隆中分离（在琼脂糖凝胶上电泳并从中洗脱）作为1.8Kb    BglⅡ/SalⅠ片段的头孢菌乙酰转移酶基因，并把它连接到BamHI/SalⅠ消化的载体pSELECT（Promega    Corporation）中。为了利于青霉IPNS启动子在头孢菌乙酰转移酶基因的ATG处定位，在位于-42碱基的ATG处（Mathison    et    al.，Current    Genetics）产生一个新的NcoⅠ位点，并使用Altered    Sites体外诱变系统（Promega    Corporation）通过位点针对性诱变除去结构基因中的内部NcoⅠ位点。按照制造商的说明书完成诱变。构建掺入数个改变以产生或除去NcoⅠ位点的寡核苷酸，所说的寡核苷酸，所说的寡核苷酸互补于有用DNA区域的编码序列。用于除去结构基因中的内部NcoⅠ位点的寡核苷酸序列如下：
SEQ    ID    NO∶16
3'    GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT    5'.
用于在-42位碱基ATG处产生新NcoⅠ位点的寡核苷酸序列如下：
SEQ    ID    NO∶17
5'    CTCCGATAGGGCGTGGTACCCGGCCCTACTCTTAT    3'.
用氰乙基氨基磷酸酯化方法（Pharmacia    Gere    Assembler    instramentation）合成寡核苷酸。均经限制酶分析确定上述两个诱变。该载体叫作pMUTACT。从上文进一步描述的载体pUTZ-2中分离（通过在琼脂糖凝胶上电泳并从中洗脱）作为1.2Kb    NcoⅠ片段的青霉IPNS启动子。把该启动子片段连接到NcoⅠ切割的载体pMUTACT中，现在，IPNS启动子即直接定位在头孢霉乙酰转移酶基因的-42位ATG处。通过限制酶分析确定该启动子的方向。该载体被定名为pMUTACT/IPNS。从含IPNS启动子∶乙酰转移酶基因盒的载体pMUTACT/IPNS中分离（通过在琼脂糖凝胶上电泳并从中洗脱）2.5Kb    XhoⅠ/SalⅠ片段，并将其连接到SalⅠ消化的载体pUTZ-2（上文所述的）中。然后用XbaⅠ消化中间载体，并与来自含IPNS启动子∶延伸酶/羟化酶基因暗盒的载体pPEN/CEPH-1（上文描述的）的2.1Kb    XbaⅠ片段连接，产生最后的转化载体pTS-8。
实施例14
转化黄色青霉
在25℃下，220rpm的旋转震荡器上将1×107个孢子与50mL CM肉汤一起保温67小时。在粗平布滤器上过滤收集菌丝体，把菌丝体转移到500mL培养瓶，重新悬浮在含100mg Novozyme 234（Novo Biolabs，Bagsvaerd，Denmark）的25mL KMP（0.7M KCl，0.8M甘露糖醇，0.02M KPO4，PH6.3）中，并以100rpm，在30℃下保温。通过粗平布/玻璃棉过滤分离原生质球并以350×g离心10分钟沉淀之。用10mL KMP缓冲液将原生质球洗3次，然后再悬浮在KMPC（含50mM CaCl2的KMP）中，浓度达到5×107个细胞/mL，并在室温下放置20分钟。为了转化青霉，将200μl原生质球悬浮液加到含50μl PPC（40%PEG MW 3500，20mM KPO4，PH6.3，使用前加入5%CaCl2）的DNA（5μg载体DNA在6.2μl含5mg/mL肝素的KMPC中）。将转化混合液置于冰上保温30分钟。加入1ml新鲜制备的PPC，并将混和物转移到50mL熔化（50℃）的再生琼脂（CM加1.3M甘露醇和3%琼脂）中。然后把转化混和物分散到5个培养皿中。在25℃再生24小时后，用含100μg/50mL腐草霉素的OL（在1%琼脂中含1%蛋白胨）铺敷培养皿。铺敷的量等于再生琼脂的量。将培养皿在25℃下保温7-14天，并观察转化菌落的产生。
实施例15
生物活性检测
用琼脂扩散生物检测法确定HPLC分离的己二酰-6-APA和己二酰-7-ADCA发酶产物的抗生素活性。将20μl分离的产物加到接种了枯草杆菌ATCC33677，或大肠杆菌超敏感型菌株（由Prof.Arnold    L.Demain，MIT提供）的LB琼脂培养皿[含3%琼脂（Gibco，Paisley，Scotland）的20g/L    LB    Broth    Base]（5mm）上。用枯草杆菌作为检测己二酰-6-APA产物的指示菌株，用大肠杆菌超敏感型菌株作为检测己二酰-7-ADCA产物的指示菌株。在37℃下保温15小时后，圆盘周围的指示细菌出现抑制生长的晕圈表明产物具有生物活性。本实验的对照组包括去乙酰基头孢菌素C，头孢菌素C，青霉素V以及含青霉素酶或不含青霉素酶的琼脂作为进一步确定β-内酰胺结构的对照组。
实施例16
同时分析己二酰-∶6-APA，7-ADCA，7-ADAC和7-ACA的HPLC方法
用高效液相层析法（HPLC）同时分析来自转化之青霉菌菌株的发酵产物（己二酰-6APA，己二酰-7-ADCA，己二酰-ADAC和己二酰-7-ACA）。由下列Waters组分组成HPLC系统∶625溶剂释放系统、409E可变波长检测器（定在220nm和260nm）、825Maxima数据系统。静止相是含Novo-Pak    C18    Guard-Pak插入物的Novo-Pak    C185×100mm径向压力圆筒。流动相（流速1ml/min）由一个从起始条件5%甲醇和95%10mM KPO4（pH5）到40%甲醇和60%KPO4（PH5）的10分钟线性梯度组成。通过与青霉素N在220nm处的标准曲线比较，定量检测己二酰-6-APA。通过与合成的己二酰-7-ADCA和己二酰-7-ACA在260nm处的标准曲线比较，定量检测展开的产物。
实施例17
RAEV酶检测
用化学合成的己二酰-7-ADCA和己二酰7-ACA作为检测RAEV酶（购自RAEV Corp.）之特异活性的底物。37℃下保温在0.16M KH2PO4中总体积为50μl的含10mM底物、1μg RAEV酶，5%甘油的反应混和物。（更好的最适反应条件包括使用在20-50mM磷酸钾缓冲液中的20mM或浓度更大的底物）。在时间点0、1、3、5、10、20和30分钟分别取5μl等分试样，并用35μl 0.010M KH2PO4（pH3.5）稀释，在上述条件下进行HPLC分析，分析前将等分试样置于-70℃下冷冻。
在37℃下，使用在0.065M KH2PO4PH7.0中的总体积50μl的5mM底物、8.25μg RAEV酶、10%甘油经反应5分钟以检测RAEV酶对比色己二酰-P-氨基苯甲酸底物的活性。在96孔微滴定板中完成上述反应。加入50μl在0.25M乙酸中的1/100稀释度的1M NaNO3以终止该反应，并将反应混合物在室温下放置3分钟，加入100μl1/100稀释的10mg/mL4-氨基-5-羟基-2，7-萘基-二磺酸（在0.5MNaNO3中的单钠盐水合物）并直接用EL 312 Bio-Kinetics平板读数器（BioTek Znstruments）监测所显现的颜色。
实施例18
估计可代用的己二酰酰基转移酶
除使用RAEV酶研究外，还用从各种微生物源生产的酶证明从己二酰-7-ADCA（和其它己二酰化合物）上除去了己二酰侧链。在开始的研究中，Asahi假单孢杆菌菌株SE-83和SE-495（寄存在Fermentation    Research    Institute，保藏号分别是FERM    BP-817和FERM    BP-818），以及Toyo    Jozo假单孢杆菌菌株SY-77-1（寄存在Northern    Regional    Research    Laboratory，保藏号为NRRL    B-8070）在含HyCase    SF，2.0%（w/v）;谷氨酸单钠，0.5%（w/v）;酵母提取物，0.5%（w/v）;玉米粉，0.2%（w/v）;棉籽油，0.5%（w/v）和戊二酸，0.1%（w/v）的培养基中生长72小时。离心收集细胞并用50mM（PH8.0）磷酸盐缓冲液冲洗;然后把细胞重新悬浮在缓冲液中，并通过加入小体积的氯仿使其外膜具有通透性。将等分的细胞悬浮液与己二酰-对位硝基酰苯胺（ad-pNA）混和并在30℃保温2至18小时。保温后，经加入10%（v/v）乙酸酸化混和物。在利用Sigma    Chemical    Company以试剂盒形式提供的用于检测γ-谷氨酰转移酶（Sigma产品批号：545-A）的试剂将对位硝基苯胺变成重氮基化合物后，用比色方法检测所释放的对位硝基苯胺。三个菌株SE-495、SE-83和SY-77-1的相对活性分别为100%、85.5%和48%。使用与上述RAEV酶相类似的方法，也能证明SE-83和SE-495酶对己二酰-7-ADCA的活性。SY-77-1产生的β-内酰胺酶导致不能证明该菌株对己二酰-7-ADCA的脱乙酰活性。
使用相似的方法，可证明两个真菌菌株（交链霉MA-133，ATCC    No.20492，和曲霉MA-13，ATCC    No.20491;参见Meiji    Seika    Kaisha    Ltd.的U.S.4，141，790）和三个细菌菌株（短杆菌，ATCC    No.14649，无色杆菌，ATCC    No.146648及黄杆菌，ATCC    No.14，650，在Merck    &    Co.，Inc.的US，3，239，394中描述了上述三个菌株为头孢菌素C酰基转移酶生产菌株）的己二酰酰基转移酶生产能力。
序列目录
（1）一般资料：
（ⅰ）申请人：Conder，Michael    J.
McAda，Phyllis
Rambosek，John
Reeves，Christopher    D.
（ⅱ）发明的题目：制备7-ACA和7-ADAC的新的生物方法
（ⅲ）序列编号：17
（ⅳ）有关地址：
（A）收信人：Merck    &    CO.1    Inc.
（B）街道：126E.Lincoln    Ave
（C）城市：Bahway
（D）州：新泽西（New    Jersey）
（E）国家：USA
（F）邮政编码：07065
（ⅴ）计算机可读形式：
（A）媒介型式：下垂盘
（B）计算机：IBM    PC兼容的
（C）操作系统：PC-DOS/MS-DOS
（D）软件：Patent In Release＃1.0，Version＃1.25
（ⅵ）目前的申请资料：
（A）申请号：
（B）申请日：
（C）分类：
（ⅷ）代理人/代理资料：
（A）姓名：Speer，Raymond    M.
（B）注册号：26，810
（C）参考/文件号：18572IA
（ⅸ）电讯资料：
（A）电话：（908）594-4481
（B）传真：（908）594-4720
（2）SEQ    ID    NO∶1的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：14碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶1
TCTAGACACC  ATGG    14
（2）SEQ    ID    NO∶2资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：16碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶2
GTGAGAGTTG  ATGGAC    16
（2）SEQ    ID    NO∶3的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：16碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶3
TCTAGACACT  ATGGAC    16
（2）SEQ    ID    NO∶4的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：16碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶4
TCTAGACACC  ATGGAC    16
（2）SEQ    ID    NO∶5的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：22个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：肽
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶5
Figure 921133316_IMG8
（2）SEQ    ID    NO∶6的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：22个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：肽
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶6
（2）SEQ    ID    NO∶7的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：22个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：肽
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶7
Figure 921133316_IMG10
（2）SEQ    ID    NO∶8的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：34个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶8
CGAGAGGATC  AGTGAGAGTC  CATGGACACG  ACGG
（2）SEQ    ID    NO∶9的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）：33个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶9
GTTTTGGTGT  CGTAGTAGTA  CTGAAGGTTC  CAG
（2）SEQ    ID    NO∶10的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：21个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
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（ⅱ）分子类型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶10
TACCCGGGGT  TCCCGCGAAC  T
（2）SEQ    ID    NO∶11的资料
（i）序列特征：
（A）长度：10个碱基对
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（C）链型：单链
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CATGAAGAAG
（2）SEQ    ID    NO∶12的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：10个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶12
TTCTTCCTAG
（2）SEQ    ID    NO∶13的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：23个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶13
GTCGGCGCAT  CGATGGGTGG  AAT
（2）SEQ    ID    NO∶14的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：22个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶14
CGCCCACCAT  GGCGCCTCAG  AT
（2）SEQ    ID    NO∶15的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：28个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组的）
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶15
TCTAGCTAGA  CACCATGTCG  CCTCAGAT
（2）SEQ    ID    NO∶16的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：23个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：CDNA到MRNA
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶16
GTCGGCGCAT  CGATGGGTGG  AAT
（2）SEQ    ID    NO∶17的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：35个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：CDNA到MRNA
（xi）序列描述：SEQ    ID    NO∶17
CTCCGATAGG  GCGTGGTACC  CGCCCTACT  CTTAT

Claims (16)

1、制备7-氨基脱乙酰基头孢菌烷酸(7-ADAC)的新生物方法，该方法包括：
1)将能产生异青霉素N的产黄青霉菌菌株培养于能供养其生长的培养基中，向所说的培养基中加入己二酸盐原料，该原料包括一种或多种能为所说产黄青霉菌菌株同化和利用并产生己二酰-6-氨基青霉菌烷酸(己二酰-6-APA)的己二酸，或其盐和酯，从而产生所说的己二酰-6-APA；
2)由原位表达相应的基因而完成下列酶促变化：
a)由延伸酶在原位将己二酰-6-APA进行环扩展而形成己二酰-7-氨基去乙酸头孢菌烷酸(己二酰-7-ADCA)，其中所说的产黄青霉菌菌株已用编码能接受所说己二酰-6-APA作为底物的活性延伸酶的DNA进行转化，在其表达之后，由所说菌株产生的己二酰-6-APA接着在原位进行环扩展而形成己二酰-7-ADCA；
b)由羟化酶在原位将己二酰-7-ADCA的3-甲基侧链进行羟基化而产生己二酰-7-氨基脱乙酰基头孢菌烷酸(己二酰-7-ADAA)，其中所说的产黄青霉菌菌株已用编码能接受己二酰-7-ADCA作为底物的活性羟基化酶的DNA进行转化，在其表达后，也在原位由所说菌株产生的己二酰-7-ADCA进行环扩展而形成己二酰-7-ADAC；并且
3)将所说己二酰-7-ADAC与己二酰酰胺酶接触，从而移走己二酰侧链，并形成7-ADAC产物；然后分离所说的产物。
2、根据权利要求1所说的生物方法，其中己二酸盐原料是己二酸二钠盐。
3、根据权利要求1所说的生物方法，其中编码活性延伸酶和羟化酶的DNA来源于顶头孢菌。
4、根据权利要求3所说的生物方法，其中使用单个双功能的延伸酶/羟化酶。
5、根据权利要求1所说的生物方法，其中的己二酰酰胺酶来源于假单孢菌菌种。
6、一种制备7-氨基头孢菌烷酸（7-ACA）的生物方法，该方法包括下列步骤：
1）将能产生异青霉素N的产黄青霉菌菌株培养于能供养其生长的培养基中，向所说培养基中加入己二酸盐原料，该原料包括一种或多种能为所说产黄青霉菌菌株同化和利用并产生己二酰-6-氨基青霉菌烷酸（己二酰-6-APA）的己二酸;或其盐和酯，从而产生所说的己二酰-6-APA;
2）由原位表达相应基因完成下列酶促变化：
a）由延伸酶在原位将己二酰-6-APA进行环扩展而形成己二酰-7-氨基去乙酸基头孢菌烷酸（己二酰-7-ADCA），其中所说的产黄青霉菌菌株已用编码能接受己二酰-6-APA作为底物的活性延伸酶的DNA进行转化，其表达之后，也在原位由所说菌株产生的己二酰-6-APA接着进行环扩展而形成己二酰-7-ADCA;
b）由羟化酶在原位将己二酰-7-ADCA的3-甲基侧链进行羟基化而产生己二酰-7-氨基去乙酰基头孢菌烷酸（己二酰-7-ADAC），其中所说产黄青霉菌菌株已用编码能接受所说己二酰-7-ADCA作为底物的活性羟基化酶的DNA进行转化，在其表达之后，也在原位将所说菌株产生的己二酰-7-ADCA羟基化形成己二酰-7-ADCA;和
c）由酰基转移酶在原位将己二酰-7-ADAC酰基化而形成己二酰-7-氨基头孢菌烷酸（己二酰-7-ACA），其中所说的产黄青霉菌菌株已用编码能接受所说己二酰-7-ADAC作为底物的活性酰基转移酶的DNA进行转化，在其表达之后，也在原位由所说菌株产生的己二酰-7-ADAC接着进行酰基化而形成己二酰-7-ADAC;和
3）将所说己二酰-7-ACA与己二酰酰胺酶接触，从而移走所说己二酰侧链并形成7-ACA产物;然后分离所说产物。
7、根据权利要求6所说的生物方法，其中己二酸盐原料是己二酸二钠盐。
8、根据权利要求6所说的生物方法，其中编码活性延伸酶，羟化酶和酰基转移酶的DNA来源于顶头孢菌。
9、根据权利要求6所说的生物方法，其中使用单个双功能的延伸酶/羟化酶。
10、根据权利要求6所说的生物方法，其中己二酰酰胺酶来源于假单胞菌菌种。
11、一种重组DNA表达载体，包括来源于顶头孢菌的编码活性延伸酶/羟化酶和酰基转移酶的DNA，以及启动编码所说延伸酶/羟化酶和酰基转移酶活性的DNA表达的启动子，包括产黄青霉菌IPNS基因的启动子。
12、根据权利要求11所说的表达载体，包括质粒pPEN/CEPH-1，pPenCACT和pTS-8。
13、一种用重组DNA表达载体转化的产黄青霉菌宿主细胞，其含有来源于顶头孢菌并编码活性延伸酶/羟化酶和酰基转移酶的DNA，以及启动编码活性延伸酶/羟化酶和酰基转移酶的DNA进行表达的启动子，包括产黄青霉菌IPNS基因的启动子。
14、根据权利要求13所说的转化宿主细胞，其中表达载体包括质粒pPEN/CEPH-1，pPenCACT和pTS-8。
15、在适合于基因表达的条件下培养重组产黄青霉菌宿主细胞的方法，其中所说的重组宿主细胞含有重组DNA表达载体，该载体包括来源于顶头孢菌并编码活性延伸酶/羟化酶和酰基转移酶的DNA，以及启动编码所说活性延伸酶/羟化酶和酰基转移酶的DNA表达的启动子，包括产黄青霉菌IPNS基因的启动子。
16、根据权利要求15的方法，其中的重组宿主细胞含有重组DNA表达载体，包括质粒pPEN/CEPH-1，pPenCACT和pTS-8。
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