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CN108064176A - 用于治疗肿瘤疾病的含有rna的组合物 - Google Patents

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CN108064176A
CN108064176A CN201680023484.9A CN201680023484A CN108064176A CN 108064176 A CN108064176 A CN 108064176A CN 201680023484 A CN201680023484 A CN 201680023484A CN 108064176 A CN108064176 A CN 108064176A
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CN
China
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rna
protein
containing rna
sequence
mage
Prior art date
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Pending
Application number
CN201680023484.9A
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English (en)
Inventor
马里奥拉·福廷-姆莱泽科
亚历山大·科瓦尔奇克
雷吉娜·海登赖希
帕特里克·鲍姆霍夫
约亨·普罗布斯特
卡尔-约瑟夫·卡伦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Curevac SE
Original Assignee
Curevac AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53005455&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN108064176(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Curevac AG filed Critical Curevac AG
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Abstract

本发明涉及用于治疗或预防肿瘤和/或癌症疾病的含有RNA的组合物，药物组合物，试剂盒，及含有RNA的组合物在治疗或预防肿瘤和/或癌症疾病中的用途。

Description

用于治疗肿瘤疾病的含有RNA的组合物
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防肿瘤和/或癌症疾病的含有RNA的组合物，药物组合物，试剂盒，及含有RNA的组合物在治疗或预防肿瘤和/或癌症疾病中的用途。
癌症，也称为恶性肿瘤，描述了一组涉及异常细胞生长且可能侵袭或扩散至机体其它部分的疾病。在2012年，全球出现约1410万新的癌症病例(不包括除黑素瘤之外的皮肤癌)。
癌症的标准治疗包括化学疗法、辐射及手术，其中这些治疗个别地或组合地施用。其它治疗应用癌症免疫疗法，其集中于经由疫苗接种或过继性细胞免疫疗法来刺激免疫系统以激发抗肿瘤反应。
一些方法使用基因疗法和基因疫苗接种来治疗癌症或其它肿瘤疾病。基因疗法和基因疫苗接种是基于将核酸引入至患者的细胞或组织中的分子医学方法。随后，由引入的核酸编码的信息在生物体中经处理，即导致了治疗肽或蛋白质的表达或所述核酸编码的抗原的表达。
常规的基因治疗方法，包括基因疗法和基因疫苗接种，是基于使用DNA分子以便将所需遗传信息转移至细胞中。已开发了各种方法用于将DNA引入至细胞中，诸如磷酸钙转染、凝聚胺转染、原生质体融合、电穿孔、显微注射及脂质体转染。DNA病毒可同样用作实现极高转染率的DNA赋形剂。使用DNA带来了这样的风险：DNA通过例如重组插入到宿主细胞基因组的完整基因中。在此情况下，受影响的基因可突变及失活或者可产生错误信息。使用DNA作为医药试剂的另一个风险是这样的风险：在患者中诱导病原性抗药物抗体(抗DNA抗体)，其可引起(可能致死性)免疫应答。
使用RNA作为基因治疗剂或基因疫苗是实质上更安全的，因为RNA不涉及这样的风险：其整合到基因组中，诱导了抗药物抗体的不理想的病原性诱导。
因此，在基因疗法及基因疫苗接种中，RNA表达系统具有优于DNA表达系统的可观优势，虽然先前技术中已知或长期假定了mRNA或RNA的不稳定性通常可能在基于RNA表达系统的医疗方法的应用中成为问题。
RNA的不稳定性尤其归因于RNA降解酶(核糖核酸酶—RNase)。也存在使RNA不稳定的许多其它过程，其中RNA与蛋白质之间的相互作用通常似乎起到关键作用。已提议用于增加RNA稳定性的一些措施，因此使得其能够用作基因治疗剂或RNA疫苗。
为了解决离体RNA稳定性的问题，欧洲专利申请EP 1 083 232 A1描述一种将RNA(特别是mRNA)引入到细胞和生物体中的方法，其中RNA与阳离子肽或蛋白质形成复合物。
已知用于治疗和/或预防癌症的mRNA的应用。例如，国际专利申请WO 03/051401A2描述了一种包括至少一种mRNA的药物组合物，该至少一种mRNA含有编码来自肿瘤的抗原的至少一个区域，其与水性溶剂组合且优选与细胞因子(例如，GM-CSF)组合。该药物组合物被提出用于针对癌症的疗法和/或预防。
国际专利申请WO 2006/008154 A1公开了一种用于针对肿瘤疾病进行疫苗接种的mRNA混合物，其中至少一种类型的mRNA含有至少一个肿瘤抗原编码区。至少一种其它mRNA含有至少一种类型的免疫原性蛋白编码区。
尽管如此，仍需要对肿瘤疾病且尤其用于治疗癌症的有效治疗。因此，本发明的目的是提供一种有效治疗肿瘤疾病的方法，其中肿瘤组织及癌细胞被特异性毁灭。
该目的通过本申请权利要求的主题得到解决。具体而言，本发明的目的根据以下第一方面得到解决：用于治疗或预防肿瘤和/或癌症疾病的含有RNA的组合物。根据本发明的其它方面，该目的通过药物组合物、试剂盒或具有多个部分的试剂盒(kit of parts)以及治疗肿瘤或癌症疾病的方法得到解决。
定义：
为了清楚和可读性起见，提供了以下科学背景信息和定义。所公开的任何技术特征因此可为本发明的每一个具体实施方案的一部分。在本发明的情形中可提供额外定义及解释。
免疫系统：免疫系统可以保护生物体免受感染。如果病原体突破生物体的物理屏障并且进入该生物体，则先天性免疫系统提供即时的但非特异性的应答。如果病原体避开该先天性应答，则脊椎动物具有第二层保护，即适应性免疫系统。此处，免疫系统在感染过程中改变其应答以改善其对病原体的识别。然后，该改善的应答在病原体被消除后以免疫记忆的形式保留，并且允许适应性免疫系统在每次遇到该病原体时建立更快且更强的攻击。据此，免疫系统包括先天性和适应性免疫系统。这两部分的每一个包含所谓的体液和细胞成分。
免疫应答：免疫应答典型地可以是适应性免疫系统针对特定抗原的特异性反应(所谓的特异性或适应性免疫应答)或是先天性免疫系统的非特异性反应(所谓的非特异性或先天性免疫应答)。
适应性免疫系统：适应性免疫系统由消除或防止病原生长的高度专门化的、系统性细胞和过程组成。所述适应性免疫应答提供具有识别并记忆特定病原体(以产生免疫性)并且在每次遇到所述病原体时建立更强的攻击的能力的脊椎动物免疫系统。由于体细胞高度突变(增加频率的体细胞突变过程)和V(D)J重组(抗原受体基因片段的不可逆的遗传重组)，该系统是高度适应性的。这种机制允许少量的基因产生巨大数量的不同的抗原受体，然后其在每种个体淋巴细胞上独特地表达。由于基因重排导致每种细胞的DNA中的不可逆的改变，所以该细胞的所有后代(子代)都将遗传编码相同受体特异性的基因，包括记忆B细胞和记忆T细胞，它们是长久的特异性免疫性的关键细胞。免疫网络理论是关于适应性免疫系统如何工作的理论，其是基于T细胞、B细胞受体的可变区与由T细胞和B细胞产生具有可变区域的分子的可变区之间的相互作用。
适应性免疫应答：适应性免疫应答典型地理解为是抗原特异性的。抗原特异性允许产生针对特定抗原、病原体或病原体感染的细胞定制的应答。在体内由“记忆细胞”保留建立这些定制的应答的能力。如果病原体感染机体超过一次，则这些特异性记忆细胞通常迅速将其消灭。在这一情形中，适应性免疫应答的第一步是抗原呈递细胞对幼稚抗原特异性T细胞或能够诱导抗原特异性免疫应答的不同的免疫细胞的激活。这发生在幼稚T细胞通常从中流过的淋巴组织和器官中。可以作为抗原呈递细胞的细胞类型特别是树突细胞、巨噬细胞和B细胞。这些细胞中的每一种在激发免疫应答中具有不同的功能。树突细胞通过吞噬作用和大胞饮吸收抗原并且通过与例如外源抗原接触而被刺激以迁移到局部淋巴组织，它们在该处分化成成熟的树突细胞。巨噬细胞摄取微粒抗原，诸如细菌，并且被传染物或其它适当的刺激诱导来表达MHC分子。B细胞经由其受体结合并内在化可溶性蛋白抗原的独特能力对于诱导T细胞也是重要的。在MHC分子上呈递抗原导致T细胞的激活，这诱导其增殖并且分化成武装效应T细胞。效应T细胞最重要的功能是通过CD8+细胞毒性T细胞杀死感染的细胞以及通过Th1细胞激活巨噬细胞，它们共同组成细胞介导的免疫性，以及通过Th2和Th1细胞二者激活B细胞以产生不同种类的抗体，由此驱动体液免疫应答。T细胞通过其T细胞受体识别抗原，所述T细胞受体不直接识别和结合抗原，相反而是识别与在其它细胞表面上的MHC分子结合的例如病原体来源的蛋白抗原的短肽片段。
细胞免疫性/细胞免疫应答：细胞免疫性典型地涉及巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的激活以及响应抗原的各种细胞因子的释放。在更一般的方式中，细胞免疫性不涉及抗体而是涉及免疫系统细胞的激活。例如，细胞免疫应答特征在于，激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，其能够在其表面上展示抗原表位的机体细胞(如病毒感染的细胞、具有细胞内细菌的细胞)和展示肿瘤抗原的癌细胞中诱导凋亡(apoptosis)；激活巨噬细胞和天然杀伤细胞，允许它们破坏病原体；并且刺激细胞分泌影响适应性免疫应答和先天性免疫应答所涉及的其它细胞的功能的多种细胞因子。
体液免疫性/体液免疫应答：体液免疫性典型地是指抗体产生和可能伴随其的辅助过程。例如，体液免疫应答可以典型地特征在于，Th2激活和细胞因子产生，生发中心形成和同种异型转换，亲和力成熟和记忆细胞产生。体液免疫性还典型地可以指抗体的效应子功能，其包括病原体和毒素中和作用，经典补体激活和吞噬作用及病原体消除的调理促进。
先天性免疫系统：先天性免疫系统(也称为非特异性免疫系统)包括以非特异性方式保护宿主防御其它生物体的感染的细胞和机制。这意指先天性系统的细胞以一般方式识别病原体并且针对其响应，但是与适应性免疫系统不同，其不赋予宿主长久的或保护性的免疫性。先天性免疫系统可例如由病原体相关分子模式(PAMP)受体(例如，Toll样受体(TLR))的配体或其它辅助物质(诸如，脂多糖、TNF-α、CD40配体或细胞激素、单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子、免疫刺激性核酸、免疫刺激性RNA(isRNA)、CpG-DNA、抗细菌剂或抗病毒剂)激活。典型地，先天性免疫系统的反应包括通过产生化学因子招募免疫细胞至感染部位，所述化学因子包括专门的化学介质，称为细胞因子；激活补体级联；通过专门的白血细胞识别并且去除器官、组织、血液和淋巴中存在的外源物质；通过已知为抗原呈递的过程激活适应性免疫系统；和/或作用为针对传染物的物理和化学屏障。
佐剂/佐剂组分：广义上的佐剂或佐剂组分典型是可以修饰(例如增强)其它试剂(诸如药物或疫苗)的效力的(例如药理学或免疫学)试剂或组合物。通常，该术语在本发明的情形中是指用作免疫原和/或其它药学活性化合物的载体或辅助物质的化合物或组合物。其将被广义地解释并且是指能够增加并入所述佐剂或与所述佐剂共施用的抗原的免疫原性的广谱物质。在本发明的情形中，佐剂将优选增强本发明的活性剂的特异性免疫原性作用。典型地，“佐剂”或“佐剂成分”具有相同含义并可相互使用。佐剂可以分为例如免疫增强剂、抗原递送系统或甚至其组合。
术语“佐剂”典型地理解为不包括本身赋予免疫性的试剂。佐剂非特异性地辅助免疫系统以增强抗原-特异性的免疫应答，例如，通过促使抗原向免疫系统的呈递或非特异性先天性免疫应答的诱导而增强。此外，例如，佐剂可以优选地调节抗原特异性免疫应答，例如，通过将主要的基于Th2的抗原特异性应答转换为更多基于Th1的抗原特异性应答或反之亦然进行调节。因此，佐剂可以有利地调节细胞因子表达/分泌、抗原呈递、免疫应答的类型等。
免疫刺激性/免疫刺激RNA：在本发明的情形中，免疫刺激性/免疫刺激RNA(isRNA)可以典型地是本身能够诱导先天性免疫应答的RNA。其通常不具有开放阅读框，并且由此不提供肽-抗原或免疫原而是激发先天性免疫应答，例如，通过与特定种类的Toll-样受体(TLR)或其它适当的受体结合而激发。因此，免疫刺激性/免疫刺激RNA优选是非编码RNA。然而，具有开放阅读框并且编码肽/蛋白(例如，抗原功能)的mRNAs当然也可以诱导先天性免疫应答。
抗原：术语“抗原”典型地是指可以由免疫系统识别并能够，例如通过形成抗体作为适应性免疫应答的一部分的抗原特异性T-细胞来触发抗原特异性免疫应答的物质。抗原可以是蛋白质或肽。在这一情形中，适应性免疫应答的第一步是抗原呈递细胞对幼稚抗原特异性T细胞的激活。这发生在幼稚T细胞通常从中流过的淋巴组织和器官中。可以作为抗原呈递细胞的三种细胞类型是树突细胞、巨噬细胞和B细胞。这些细胞中的每一种在激发免疫应答中具有不同的功能。组织树突细胞通过吞噬作用和大胞饮吸收抗原并受感染刺激以迁移到局部淋巴组织，它们在该处分化为成熟的树突细胞。巨噬细胞摄取微粒抗原(诸如细菌)并且被传染物诱导来表达MHC II类分子。B细胞经由其受体结合并内在化可溶性蛋白抗原的独特能力对于诱导T细胞可能是重要的。通过在MHC分子上呈递抗原导致T细胞的激活，这诱导其增殖并且分化成武装效应T细胞。效应T细胞最重要的功能是通过CD8+细胞毒性T细胞杀死感染的细胞以及通过Th1细胞激活巨噬细胞，它们共同组成细胞介导的免疫性，以及通过Th2和Th1细胞二者激活B细胞以产生不同种类的抗体，由此驱动体液免疫应答。T细胞通过其T细胞受体识别抗原，所述T细胞受体不直接识别和结合抗原，相反而是识别与在其它细胞表面上的MHC分子结合的例如病原体蛋白抗原的短肽片段。
T细胞属于两种具有不同效应子功能的主要类型。这两类通过细胞表面蛋白CD4和CD8的表达来区分。这两种T细胞类型的不同之处在于它们识别的MHC分子类型。存在两种MHC分子类型—MHC I类和MHC II类分子—其区别在于它们的结构和在机体组织上的表达模式。CD4+T细胞结合MHC II类分子且CD8+T细胞结合MHC I类分子。MHC I类和MHC II类分子在细胞之间具有不同的分布，这反映识别它们的T细胞的不同效应子功能。MHC I类分子将细胞溶质和核源的肽(例如来自病原体，常见地来自病毒)呈递到CD8+T细胞，其分化为细胞毒性T细胞，所述细胞毒性T细胞特化为杀死它们特异性识别的任何细胞。几乎所有细胞都表达MHC I类分子，尽管组成型表达的水平从一种细胞类型到下一种而变化。但是不仅来自病毒的致病性肽由MHC I类分子呈递，而且自身-抗原样肿瘤抗原也由它们呈递。MHC I类分子结合来自在细胞溶质中降解和在内质网中运输的蛋白质的肽。在感染的细胞表面识别MHC I类:肽复合物的CD8+T细胞被特化为杀死展示外源肽的任何细胞并因此除去受病毒和其它细胞溶质病原体感染的细胞体。识别MHC II类分子的CD4+T细胞(CD4+辅助性T细胞)的主要功能是激活免疫系统的其它效应细胞。因此MHC II类分子通常存在于参与免疫应答的B淋巴细胞、树突细胞和巨噬细胞上，而不在其它组织细胞上。例如，激活巨噬细胞，从而杀死它们包埋的小泡内病原体，并且激活B细胞，从而分泌针对外源分子的免疫球蛋白。抑制MHC II类分子与内质网中的肽结合，并且由此MHC II类分子结合来自在内体中降解的蛋白质的肽。它们可以捕获来自已经进入巨噬细胞小泡系统的病原体的肽，或来自通过未成熟树突细胞或B细胞免疫球蛋白受体内在化的抗原的肽。在巨噬细胞和树突细胞小泡内部大量积聚的病原体倾向于刺激Th1细胞的分化，而胞外抗原倾向于刺激Th2细胞生成。Th1细胞激活巨噬细胞的杀微生物性质并诱导B细胞产生IgG抗体，所述IgG抗体非常有效地调理胞外病原体，从而被吞噬细胞摄取，而Th2细胞通过激活幼稚B细胞分泌IgM而启动体液应答，并诱导弱调理抗体诸如IgG1和IgG3(小鼠)和IgG2和IgG4(人)以及IgA和IgE(小鼠和人)的生成。
表位(也称为“抗原决定簇”)：T细胞表位可以包括优选具有约6至约20个或甚至更多个氨基酸的长度的片段，例如，由MHC I类分子加工和呈递的片段，优选具有约8至约10个氨基酸的长度，例如，8、9或10个氨基酸(或甚至11个或12个氨基酸)，或由MHC II类分子加工和呈递的片段，优选具有约13个以上氨基酸的长度，例如，13、14、15、16、17、18、19、20个或甚至更多个氨基酸，其中这些片段可以选自氨基酸序列的任意部分。这些片段典型地以由所述肽片段与MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别。B细胞表位典型地是位于(天然)蛋白质或肽抗原的外表面上的片段。
疫苗：疫苗典型地理解为提供至少一种抗原或抗原功能的预防性或治疗性物质。所述抗原或抗原功能可以刺激机体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。
提供抗原的mRNA：提供抗原的mRNA可以典型地是具有至少一个开放阅读框的mRNA，被提供了该mRNA的细胞或生物体可以翻译所述开放阅读框。该翻译的产物是可以用作抗原(优选用作免疫原)的肽或蛋白质。产物还可以是由多于一种免疫原组成的融合蛋白，例如由两个或多个表位、肽或蛋白质组成的融合蛋白，其中所述表位、肽或蛋白质可通过连接序列连接。
双/多顺反子mRNA：双/多顺反子mRNA典型地可具有两种(双顺反子)或更多种(多顺反子)编码序列(cds)(通常也称为开放阅读框(ORF))。在这种情形中，编码序列/开放阅读框是可以翻译成肽或蛋白质的若干核苷酸三联体(密码子)的序列。这种mRNA的翻译产生了两个(双顺反子)或多个(多顺反子)不同的翻译产物(条件是编码序列/ORFs不相同)。为了在真核细胞中表达，所述mRNAs可以例如包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。
5’-帽结构：5’-帽典型地是添加在mRNA分子的5’端的修饰的核苷酸(帽类似物)，特别是鸟嘌呤核苷酸。优选地，5’-帽使用5’-5’-三磷酸酯键(也称为m7GpppN)添加。5’-帽结构的另外实例包括甘油基，反向脱氧脱碱基残基(部分)，4’,5’亚甲基核苷酸，1-(β-D-赤式呋喃糖基)核苷酸，4’-硫代核苷酸，碳环核苷酸，1,5-脱水己糖醇核苷酸，L-核苷酸，α-核苷酸，修饰的碱基核苷酸，苏式戊呋喃糖基核苷酸，无环3’,4’-闭联核苷酸，无环3,4-二羟基丁基核苷酸，无环3,5-二羟基戊基核苷酸，3’-3’-反向核苷酸部分，3’-3’-反向脱碱基部分，3’-2’-反向核苷酸部分，3’-2’-反向脱碱基部分，1,4-丁二醇磷酸酯，3’-氨基磷酸酯，己基磷酸酯，氨基己基磷酸酯，3’-磷酸酯，3’硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯或桥接或非桥接甲基膦酸酯部分。这些修饰的5’-帽结构可用于本发明的情形中以修饰本发明组合物的mRNA序列。可在本发明的情形中使用的进一步修饰的5’-帽结构是CAP1(m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的额外甲基化)，CAP2(m7GpppN下游的第二核苷酸的核糖的额外甲基化)，CAP3(m7GpppN下游的第三核苷酸的核糖的额外甲基化)，CAP4(m7GpppN下游的第四核苷酸的核糖的额外甲基化)，ARCA(抗反向帽类似物，修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA)，肌苷，N1-甲基-鸟苷，2’-氟-鸟苷，7-脱氮-鸟苷，8-氧代-鸟苷，2-氨基-鸟苷，LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
在本发明之情形下，5’帽结构也可使用帽类似物在化学RNA合成或RNA体外转录(共同转录加帽)中形成，或帽结构可使用加帽酶(例如，可商购的加帽试剂盒)在体外形成。
帽类似物：帽类似物是指具有帽功能的不可聚合二核苷酸，因为其促进翻译或定位，和/或当在RNA分子的5’端并入时阻止RNA分子的降解。不可聚合意为帽类似物将仅在5’端并入，因为其不具有5’三磷酸酯且因此无法通过模板依赖性RNA聚合酶在3’方向上延伸。
帽类似物包括但不限于选自由以下组成的组的化学结构：m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化帽类似物(例如，GpppG)；二甲基化帽类似物(例如，m2,7GpppG)、三甲基化帽类似物(例如m2,2,7GpppG)、二甲基化对称帽类似物(例如，m7Gpppm7G)或抗反向帽类似物(例如，ARCA；m7,2’OmeGpppG、m7,2’dGpppG、m7,3’OmeGpppG、m7,3’dGpppG及它们的四磷酸酯衍生物)(Stepinski等,2001.RNA 7(10):1486-95)。
先前已描述了其它帽类似物(US 7,074,596、WO 2008/016473、WO 2008/157688、WO 2009/149253、WO 2011/015347和WO 2013/059475)。最近已描述了经N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物的合成(Kore等(2013)Bioorg.Med.Chem.21(15):4570-4)。
蛋白质的片段：在本发明的情形中，蛋白质或肽的“片段”可以典型地包括本文定义的蛋白质或肽的序列，关于其氨基酸序列(或其编码核酸分子)，与原始(天然)蛋白质(或其编码核酸分子)相比，其在N端和/或C端被截短。因此，所述截短可以发生在氨基酸水平上或者相应地发生在核酸水平上。故而，关于本文定义的所述片段的序列同一性可以优选地指本文定义的完整的蛋白质或肽或指所述蛋白质或肽的完整的(编码)核酸分子。在抗原的情形中，所述片段可以具有约6至约20个或甚至更多个氨基酸的长度，例如，由MHC I类分子加工和呈递的片段，优选具有约8至约10个氨基酸的长度，例如，8、9或10个氨基酸(或甚至6、7、11个或12个氨基酸)，或由MHC II类分子加工和呈递的片段，优选具有约13个以上氨基酸的长度，例如，13、14、15、16、17、18、19、20个或甚至更多个氨基酸，其中这些片段可以选自氨基酸序列的任意部分。这些片段典型地以由所述肽片段与MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别，即，所述片段典型地不以其天然形式被识别。蛋白质或肽的片段(例如，在抗原的情形中)可以包括那些蛋白质或肽的至少一个表位。此外，蛋白质的结构域，如胞外结构域、胞内结构域或跨膜结构域以及蛋白质的缩短或截短版本，也可以理解为包括蛋白质的片段。优选地，蛋白质的片段包括蛋白质的功能片段，其意为所述片段发挥出与其来源于的整个蛋白质相同的效应或功能。
蛋白质的变体：可以产生本发明的情形中所定义的蛋白质或肽的“变体”，其具有与原始序列在一个或多个突变处不同的氨基酸序列，所述突变诸如一个或多个取代的、插入的和/或缺失的氨基酸。优选地，与全长天然蛋白质相比，这些片段和/或变体具有相同的生物功能或特定的活性，例如，其抗原特性。本发明的情形中所定义的蛋白质或肽的“变体”与其天然序列(即，未突变的生理序列)相比可以包括保守氨基酸取代。这些氨基酸序列及其编码核苷酸序列特别都在本文定义的术语变体的涵盖下。其中来源于同一类的氨基酸彼此交换的取代称为保守取代。具体地，这些是具有脂族侧链、带正电荷或负电荷的侧链、在侧链中有芳香基团的氨基酸或是这样的氨基酸，即所述氨基酸的侧链可以参与氢桥，例如，具有羟基官能的侧链。这意味着，例如，具有极性侧链的氨基酸被具有相似极性侧链的另一种氨基酸替代，或者例如，以疏水侧链为特征的氨基酸被另一种具有类似的疏水侧链的氨基酸取代(例如，丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)取代，或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)取代)。特别地，插入和取代可能在不引起三维结构改变或不影响结合区的那些序列位置。例如，使用CD光谱(圆二色谱)可以容易地确定插入或缺失对三维结构的改变(Urry,1985,Absorption,Circular Dichroism and ORD of Polypeptides(多肽的吸光度、圆二色性和ORD),在:Modern Physical Methods in Biochemistry(生物化学中的现代物理方法),Neuberger等人，(编),Elsevier,Amsterdam)。
蛋白质或肽的“变体”可以与所述蛋白质或肽的10、20、30、50、75或100个氨基酸的片段具有至少70％、75、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性。
此外，本文定义的可以由核酸分子编码的蛋白或肽的变体还可以包括那些序列，其中编码核酸序列的核苷酸按照遗传密码的简并性交换而不导致蛋白或肽相应的氨基酸序列改变，即，所述氨基酸序列或其至少部分在上述意义内与原始序列没有区别。
优选地，蛋白质的变体包括蛋白质的功能变体，其意为所述变体发挥出与其来源于的蛋白质相同的效应或功能。
序列的同一性：为了确定两个序列相同的百分数，所述序列例如，本文定义的核酸序列或氨基酸序列，优选由本文定义的聚合载体的核酸序列所编码的氨基酸序列或者氨基酸序列本身，可以比对所述序列，以随后彼此比较。因此，例如，第一序列的位置可以与第二序列的相应位置进行比较。如果第一序列中的位置被与第二序列中某位置相同的成分(残基)占据，则这两个序列在该位置是相同的。如果这不是这样的情形，则所述序列在该位置是不同的。如果与第一序列相比，在第二序列中存在插入，则可以在第一序列中插入缺口以允许进一步的比对。如果与第一序列相比，在第二序列中存在缺失，则可以在第二序列中插入缺口以允许进一步的比对。然后，两个序列相同的百分数是相同位置的数目除以位置总数(包括仅在一个序列中占据的那些位置)的函数。两个序列相同的百分数可以使用数学算法确定。可以使用的一种优选的但非限制性的数学算法的实例是Karlin等(1993),PNASUSA,90:5873-5877或Altschul等(1997),Nucleic Acids Res.,25:3389-3402的算法。这样的算法整合在BLAST程序中。通过该程序能够鉴定与本发明的序列在某种程度上相同的序列。
单顺反子mRNA：单顺反子mRNA可以典型地是mRNA，其包括仅一个开放阅读框。在这种情形中，编码序列/开放阅读框是可以翻译成肽或蛋白质的若干核苷酸三联体(密码子)的序列。
核酸：术语“核酸”是指任何DNA或RNA分子，并且被用于与“多核苷酸”同义。无论何处在本文中提及编码特定蛋白质和/或肽的核酸或核酸序列，所述核酸或核酸序列分别优选还包括调节和/或其它序列，所述序列允许其在合适的宿主(例如，人)中的表达和/或稳定性，即编码特定蛋白质或肽的核酸序列的转录和/或翻译。
肽：肽是氨基酸单体的聚合物。通常，单体由肽键连接。术语“肽(peptide)”不限制氨基酸的聚合物链的长度。在本发明的一些实施方案中，肽可以例如含有少于50个单体单元。更长的肽也可称为多肽，通常具有50至600个单体单元，更具体地50至300个单体单元。
药学上有效量：在本发明的情形中，药学上有效量典型地理解为足以诱导免疫应答或触发所需治疗效果的量。
蛋白质：蛋白质典型地由折叠成三维形式、促进了生物功能的一种或多种肽和/或多肽组成。
多聚(C)序列：多聚(C)序列典型地是一段长的胞嘧啶核苷酸的序列，典型地约10至约200个胞嘧啶核苷酸，优选约10至约100个胞嘧啶核苷酸，更优选地约10至约70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优选地约20至约50个或甚至约20至约30个胞嘧啶核苷酸。多聚(C)序列可以优选地位于核酸所包含的编码区的3’。
多聚(A)尾：多聚(A)尾也称为“3’-多聚(A)尾”或“多聚(A)序列”，典型地是添加在mRNA的3’端的腺苷核苷酸的一段长的同聚合序列，其为多至约400个腺苷核苷酸，例如，约25至约400个，优选约50至约400个，更优选约50至约300个，甚至更优选约50至约250个，最优选约60至约250个腺苷核苷酸。在本发明的情形下，mRNA的多聚(A)尾优选来源于通过RNA体外转录的DNA模板。或者，多聚(A)序列也可通用化学合成方法在体外获得，而不必自DNA起源转录。此外，多聚(A)序列或多聚(A)尾可通过RNA的酶促聚腺苷酸化而产生。
稳定的核酸：稳定的核酸典型地展现这样的修饰：所述修饰增加对体内降解(例如，被外切或内切核酸酶降解)和/或离体降解(例如，通过疫苗施用之前的制备过程，例如，在制备要施用的疫苗溶液的过程中)的抵抗。例如，RNA的稳定可以通过提供5’-帽结构、多聚(A)尾或任何其它UTR修饰而实现。其还可以通过核酸的主链修饰或者核酸的G/C含量或C含量的修饰而实现。本领域中已知且在本发明的情形中可以考虑多种其它方法。
载体/聚合载体：在本发明的情形中的载体可以典型地是促进另一种化合物的转运和/或复合的化合物。所述载体可以与所述其它化合物形成复合物。聚合载体是由聚合物形成的载体。
阳离子组分：术语“阳离子组分”典型地是指带电荷的分子，在典型地约1-9的pH值、优选等于或低于9(例如5-9)的pH值、等于或低于8(例如5-8)的pH值、等于或低于7(例如5-7)的pH值、最优选在生理pH值(例如，约7.3-7.4)，所述分子带正电荷(阳离子)。因此，根据本发明的阳离子肽、蛋白质或聚合物在生理条件下、特别是在体内细胞的生理盐条件下带正电荷。阳离子肽或蛋白质优选含有比其它氨基酸残基更多数量的阳离子氨基酸，例如，更多数量的Arg、His、Lys或Orn(特别是比阴离子氨基酸残基(如Asp或Glu)更多的阳离子氨基酸)，或者含有主要由阳离子氨基酸残基形成的单元。定义“阳离子”还可以是指“聚阳离子”组分。
赋形剂：赋形剂是可以典型地在药物组合物或疫苗内使用的试剂(例如，载体)，用于促进将药物组合物或疫苗的组分施用到个体。
3’-非翻译区(3’-UTR)：3’-UTR典型是mRNA的部分，其位于蛋白编码区(即开放阅读框)和mRNA的多聚(A)序列之间。mRNA的3’-UTR未翻译成氨基酸序列。3’-UTR序列通常由这样的基因编码：所述基因在基因表达过程中转录成相应的mRNA。基因组序列首先转录为成熟前mRNA，其包括任选的内含子。然后在成熟过程中将成熟前mRNA进一步加工成成熟mRNA。该成熟过程包括以下步骤：5’-加帽，剪接成熟前mRNA以切除任选的内含子，以及3’端的修饰，诸如成熟前mRNA的3’端的聚腺苷酸化和任选的内切或外切核酸酶切割等。在本发明的情形中，3’-UTR对应于这样的成熟mRNA的序列：其位于蛋白编码区的终止密码子的3’，优选直接位于蛋白编码区的终止密码子的3’，并且延伸到多聚(A)序列的5’-侧，优选到直接位于多聚(A)序列的5’的核苷酸。术语“对应于”是指3’-UTR序列可以是RNA序列，诸如在用于限定3’-UTR序列的mRNA序列，或对应于该RNA序列的DNA序列。在本发明的情形中，术语“基因的3’-UTR”，诸如“白蛋白基因的3’-UTR”，是这样的序列：其对应于来源于该基因的成熟mRNA的3’-UTR，即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟而获得的mRNA。术语“基因的3’-UTR”包括3’-UTR的DNA序列和RNA序列。
5’-非翻译区(5’-UTR)：5’-UTR典型被理解为信使RNA(mRNA)的特定部分。它位于mRNA的开放阅读框的5’处。典型地，5’-UTR从转录起始位点开始，并结束于开放阅读框的起始密码子之前的一个核苷酸。5’-UTR可以包括用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。所述调节元件可以是例如核糖体结合位点或5’-末端寡嘧啶序列。5’-UTR可以经转录后修饰，例如通过加入5’-CAP。在本发明的情形中，5’-UTR对应于位于5’-CAP和起始密码子之间的成熟mRNA的序列。优选地，5’-UTR对应于这样的序列：其从位于5’-CAP的3’的核苷酸延伸(优选从直接位于5’-CAP的3’的核苷酸延伸)到位于蛋白编码区的起始密码子的5’的核苷酸(优选到直接位于蛋白编码区的起始密码子的5’的核苷酸)。直接位于成熟mRNA的5’-CAP的3’的核苷酸典型地对应于转录起始位点。术语“对应于”是指5’-UTR序列可以是RNA序列，诸如在用于限定5’-UTR序列的mRNA序列，或对应于该RNA序列的DNA序列。在本发明的情形中，术语“基因的5’-UTR”，诸如“TOP基因的5’-UTR”，是这样的序列：其对应于来源于该基因的成熟mRNA的5’-UTR，即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟而获得的mRNA。术语“基因的5’-UTR”包括5’-UTR的DNA序列和RNA序列。
5’末端寡嘧啶序列(TOP)：5’末端寡嘧啶序列(TOP)典型地是位于核酸分子5’末端区的一段嘧啶核苷酸，诸如某些mRNA分子的5’末端区或功能实体的5’末端区，例如某些基因的转录区。序列开始于胞苷，其通常对应于转录起始位点，随后是一段通常约3至30个嘧啶核苷酸。例如，TOP可以包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或甚至更多的核苷酸。嘧啶延伸并因此5’TOP结束于位于TOP下游的第一个嘌呤核苷酸的5’端的一个核苷酸。含有5’末端寡嘧啶序列的mRNA通常被称为TOP mRNA。因此，提供这种信使RNAs的基因被称为TOP基因。例如，TOP序列已被发现于编码肽延伸因子和核糖体蛋白的基因和mRNAs。
TOP基序：在本发明的情形中，TOP基序是对应于如上定义的5’TOP的核酸序列。因此，在本发明情形中的TOP基序优选是长度为3-30个核苷酸的一段嘧啶核苷酸。优选地，TOP基序由至少3个嘧啶核苷酸、优选至少4个嘧啶核苷酸、优选至少5个嘧啶核苷酸、更优选至少6个核苷酸、更优选至少7个核苷酸、最优选至少8个嘧啶核苷酸组成，其中所述一段嘧啶核苷酸优选在胞嘧啶核苷酸的5’端开始。在TOP基因和TOP mRNAs中，TOP基序优选在转录起始位点的5’端开始，并结束于所述基因或mRNA中第一个嘌呤残基5’的一个核苷酸。本发明意义上的TOP基序优选位于代表5’-UTR的序列的5’端或者编码5’-UTR的序列的5’端。因此，优选地，如果一段3个或更多个嘧啶核苷酸位于相应序列的5’端(诸如，本发明的mRNA、本发明的mRNA的5’-UTR元件或者来源于本文所述TOP基因的5’-UTR的核酸序列)，则该段3个或更多个嘧啶核苷酸被称为本发明意义上的“TOP基序”。换句话说，这样的一段3个或更多个嘧啶核苷酸优选地不被称为“TOP基序”：其不位于5’-UTR或5’-UTR元件的5’端而是在5’-UTR或5’-UTR元件内的任何位置。
TOP基因：典型地，TOP基因的特征在于存在5’末端寡嘧啶序列。此外，大多数TOP基因的特征在于生长相关的翻译调节。然而，也已知具有组织特异性翻译调节的TOP基因。如上所定义，TOP基因的5’-UTR对应于来自TOP基因的成熟mRNA的5’-UTR的序列，优选地从位于5’-CAP的3’的核苷酸延伸到位于起始密码子的5’的核苷酸。TOP基因的5’-UTR典型地不包括任何起始密码子，优选不包括上游AUGs(uAUGs)或上游开放阅读框(uORFs)。其中，上游AUGs和上游开放阅读框典型地被理解为是这样的AUGs和开放阅读框：其在应被翻译的开放阅读框的起始密码子(AUG)的5’出现。TOP基因的5’-UTR通常相当短。TOP基因的5’-UTRs的长度可以在20个核苷酸至多达500个核苷酸之间变化，并且典型地小于约200个核苷酸，优选小于约150个核苷酸，更优选小于约100个核苷酸。在本发明的意义上，示例性的TOP基因的5’-UTRs是这样的核酸序列：在国际专利申请WO2013/143700的根据SEQ ID Nos.1-1363、SEQ ID NO.1395、SEQ ID NO.1421和SEQ ID NO.1422的序列中(或其同系物或变体)，其从5位的核苷酸延伸到直接位于起始密码子(例如，ATG)的5’的核苷酸，上述公开内容通过引用并入本文。在该情形中，TOP基因的5’-UTR的特别优选的片段是缺少5’TOP基序的TOP基因的5’-UTR。术语“TOP基因的5’-UTR”优选是指天然存在的TOP基因的5’-UTR。
RNA的化学合成：具有所定义化学结构的寡核苷酸的相对短片段的化学合成提供了获得任何所需序列的定制寡核苷酸的快速且便宜的方法。尽管酶仅在5’至3’方向上合成DNA及RNA，但是化学寡核苷酸合成不具有此限制，虽然其最常在相反(即3’至5’)方向上进行。当前，该过程使用亚磷酰胺方法及来源于受保护的核苷酸(A、C、G及U)或化学修饰的核苷酸的亚磷酰胺结构单元以固相合成形式实施。
为获得所需寡核苷酸，在完全自动化过程中以产物序列所需的次序在固相上将结构单元依序偶合到生长寡核苷酸链。在完成链组装后，使产物从固相释放至溶液中，脱保护，并收集。副反应的存在对合成寡核苷酸的长度设定了实际限制(至多约200个核苷酸残基)，因为错误的数目随合成的寡核苷酸的长度而增加。通常通过HPLC分离产物以获得高纯度的所需寡核苷酸。
化学合成的寡核苷酸在分子生物学及医学中具有多种应用。它们最常用作反义寡核苷酸、小干扰RNA、用于DNA测序及扩增的引物、用于经由分子杂交来检测互补DNA或RNA的探针、用于靶向引入突变和限制位点的工具及用于合成人工基因的工具。
RNA体外转录：术语“RNA体外转录(RNA in vitro transcription)”或“体外转录(in vitro transcription)”涉及其中RNA在无细胞系统中(体外)合成的过程。DNA，特别是质粒DNA，用作用于产生RNA转录物的模板。RNA可通过适当DNA模板的DNA依赖性体外转录而获得，该DNA模板根据本发明优选为线性化质粒DNA模板。用于控制体内转录的启动子可以是用于任何DNA依赖性RNA聚合酶的任何启动子。DNA依赖性RNA聚合酶的特定实例是T7、T3及SP6RNA聚合酶。用于体外RNA转录的DNA模板可通过以下方式获得：克隆对应于待体外转录的相应RNA的核酸(特别是cDNA)，及将其引入到用于体外转录的适当载体中(例如，引入到质粒DNA中)。在本发明的一个优选具体实施方案中，将DNA模板用合适的限制性内切酶线性化，随后将其体外转录。cDNA可通过mRNA的反转录或化学合成而获得。此外，用于体外RNA合成的DNA模板也可通过基因合成而获得。
用于体外转录的方法在本领域中是已知的(参见例如Geall等(2013)Semin.Immunol.25(2):152–159；Brunelle等(2013)Methods Enzymol.530:101-14)。用于该方法中的试剂典型地包括：
1)具有启动子序列的线性化DNA模板，所述启动子序列对其相应RNA聚合酶(诸如细菌噬菌体编码的RNA聚合酶)具有高结合亲和力；
2)用于四种碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤及尿嘧啶)的三磷酸核糖核苷(NTP)；
3)任选的如上所定义的帽类似物(例如，m7G(5’)ppp(5’)G(m7G))；
4)DNA依赖性RNA聚合酶(例如T7、T3或SP6RNA聚合酶)，其能够结合至线性化DNA模板内的启动子序列；
5)任选的核糖核酸酶(RNase)抑制剂，其用以使任何污染性RNase失活；
6)任选的用以降解焦磷酸酯的焦磷酸酶，其可抑制转录；
7)MgCl2，其供应Mg2+离子作为用于聚合酶的辅因子；
8)用以维持适合pH值的缓冲液，其也可含有最优浓度的抗氧化剂(例如，DTT)和/或多元胺(诸如，亚精胺)。
RNA、mRNA：RNA为核糖核酸的常见缩写。其为核酸分子，即由核苷酸单体组成的聚合物。这些核苷酸通常是单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸尿苷(UMP)、单磷酸鸟苷(GMP)及单磷酸胞苷(CMP)单体或其类似物，其沿所谓的骨架彼此连接。骨架通过第一单体的糖(即核糖)与第二相邻单体的磷酸酯部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定次序，即连接至糖/磷酸酯骨架的碱基次序，称为RNA序列。通常，RNA可通过(例如在细胞内)DNA序列的转录而获得。在真核细胞中，转录典型地在细胞核或线粒体内进行。在体内，DNA的转录通常产生了所谓的成熟前RNA(也称为前-mRNA、前体mRNA或异源核RNA)，其必须被处理成所谓的信使RNA(通常缩写为mRNA)。例如在真核生物体中成熟前RNA的处理包括多种不同的转录后修饰，诸如剪接、5’-加帽、聚腺苷酸化、自细胞核或线粒体导出及类似修饰。这些过程的总和也称为RNA的成熟化。成熟信使RNA通常提供可翻译为特定肽或蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列。典型地，成熟mRNA包含5’-帽、任选的5’UTR、开放阅读框、任选地3’UTR及多聚(A)尾。
除了信使RNA之外，存在若干非编码类型的RNA，其可参与转录和/或翻译的调节以及免疫刺激。在本发明内，术语“RNA”进一步包括本领域中已知的任何类型的单链(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)分子，诸如病毒RNA、逆转录病毒RNA及复制子RNA、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA(asRNA)、环状RNA(circRNA)、核酶、适配体、核糖开关、免疫刺激/免疫刺激性RNA、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)及Piwi相互作用RNA(piRNA)。
核酸序列(特别是RNA)的片段：核酸序列的片段由核苷酸的连续片段组成，其对应于全长核酸序列(所述全长核酸序列是所述片段的核酸序列的基础)中核苷酸的连续片段，其代表全长核酸序列的至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少80％以及最优选至少90％。在本发明的意义上，所述片段优选是全长核酸序列的功能性片段。
核酸序列(特别是RNA)的变体：核酸序列的变体是指形成核酸序列基础的核酸序列的变体。例如，与变体所源自的核酸序列相比，变体核酸序列可以表现出一个或多个核苷酸缺失、插入、添加和/或取代。优选地，核酸序列的变体是与该变体所源自的核酸序列至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％相同。优选地，所述变体是功能性变体。核酸序列的“变体”可以与所述核酸序列的10、20、30、50、75或100个核苷酸的片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的核苷酸同一性。
瘤内给药/施用：术语“瘤内给药/施用”是指将药物组合物直接递送至肿瘤或癌症中或邻近于肿瘤或癌症和/或肿瘤或癌症的直接邻域。还包括向肿瘤或癌症的单独区域中的多次注射。此外，瘤内给药/施用包括将药物组合物递送至一个或多个转移灶中。
用于瘤内递送药物的方法在本领域中的已知的(Brincker,1993.Crit.Rev.Oncol.Hematol.15(2):91-8；Celikoglu等,2008.Cancer Therapy 6,545-552)。例如，药物组合物可通过常规的针注射、无针快速注射或电穿孔或其组合施用至肿瘤或癌症组织中。可使用计算机断层摄影、超声波、γ摄影机成像、正电子发射断层摄影或磁共振肿瘤成像以极大精确度将药物组合物直接注射至肿瘤或癌症(组织)中。其它程序选自包括但不限于以下的群组：通过内窥镜检查、支气管窥镜检查、膀胱镜检查、结肠镜检查、腹腔镜和导管插入术的直接瘤内注射。
诱饵受体：诱饵受体以高亲和力和特异性识别某些生长因子或细胞因子，但是在结构上不能传导信号或呈递激动剂到信号传导受体复合物。它们作为用于激动剂和用于信号传导受体组分的分子阱。诱饵受体或吸收受体(sink receptor)是与配体结合的受体，其抑制配体与正常受体结合。例如，受体VEGFR-1可阻止血管内皮生长因子(VEGF)与VEGFR-2结合。
显性负性受体：显性负性受体是包括显性负性(DN)突变的特定受体的变体，所述显性负性突变导致了在过表达时干扰野生型受体活性的突变体多肽。
发明详述
根据本发明的含有RNA的组合物包括至少一种RNA且特别地经提供以用于治疗或预防肿瘤和/或癌症疾病，其中含有RNA的组合物优选为瘤内施用/给药。尤其优选的是含有RNA的组合物直接注射至肿瘤组织中。或者，尤其优选的是含有RNA的组合物相邻于或非常接近于肿瘤组织和/或转移灶(metastasis)注射。
本发明人已发现，分别施用根据本发明的含有RNA的组合物的瘤内施用能够有效地治疗肿瘤和/或癌症疾病及相关病症。已显示，瘤内施用令人惊讶地对减小肿瘤大小有效。此外，施用根据本发明的含有RNA的组合物能够增加动物模型中的存活。
含有RNA的组合物的至少一种RNA可选自由以下组成的组：化学修饰或未经修饰的RNA、单链或双链RNA、编码或非编码RNA、mRNA、寡核糖核苷酸、病毒RNA、逆转录病毒RNA、复制子RNA、tRNA、rRNA、免疫刺激性RNA、微小RNA、siRNA、小核RNA(snRNA)、小发夹(sh)RNA核糖开关、RNA适配体、RNA诱饵、反义RNA、核酶或其任意组合。
在特定具体实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA选自编码RNA或非编码RNA。
编码RNA：
根据本发明的一个优选实施方案，含有RNA的组合物的至少一种RNA包含编码至少一种肽或蛋白质的至少一个编码区。
优选地，编码RNA选自由以下组成的组：mRNA、病毒RNA、逆转录病毒RNA和复制子RNA。
在本发明的优选实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA编码至少一种细胞因子，和/或至少一种趋化因子，和/或至少一种自杀基因产物，和/或至少一种免疫原性蛋白质或肽，和/或至少一种细胞死亡/细胞凋亡诱导剂，和/或至少一种血管生成抑制剂，和/或至少一种热休克蛋白，和/或至少一种肿瘤抗原，和/或至少一种β-联蛋白(catenin)抑制剂，和/或至少一种STING(干扰素基因刺激剂)途径活化剂，和/或至少一种检查点调节剂，和/或至少一种抗体，和/或至少一种显性负性受体，和/或至少一种诱饵受体，和/或至少一种骨髓源性抑制细胞(MDSC)抑制剂，和/或至少一种IDO途径抑制剂，和/或至少一种与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽，或其片段或变体，如下文将更详细地概述的。
1.细胞因子
在本发明含有RNA的组合物的一个优选实施方案中，RNA包含编码至少一种细胞因子(或其片段或变体)的至少一个编码区。
优选地，细胞因子是白细胞介素(IL)。一种或多种白细胞介素可选自例如以下列表：IL-1α、IL-1β、IL-1ra(拮抗剂)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10；IL-11、IL-12、IL-13、IL14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、EL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A/B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35。此外，细胞因子可为一种或多种选自TNF家族的细胞因子，例如选自以下列表：TNF(尤其TNFα)、LTα、LTβ、LIGHT、TWEAK、APRIL、BAFF、TL1A、GITRL、OX40L、CD40L(CD154)、FASL、CD27L、CD30L、4-1BBL、TRAIL、RANK配体。优选细胞因子的其它实例可选自以下列表：FLT3配体、G-CSF、GM-CSF、IFNα/β/ω、IFNγ、LIF、M-CSF、MIF、OSM、干细胞因子、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TSLP配体。
特别优选的是选自以下列表的细胞因子：IL-12、IL-15、IL-2、IFNγ、TNFα、IL-18、IFNα、IL-1β、IL-32、IL-7、IL-21、IL-8、GM-CSF。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明组合物的RNA编码白细胞介素-12或CD40L。本发明人已展示，编码该细胞因子的mRNA在应用于本发明的方法中时尤其有效。特别优选的是编码IL-12的根据SEQ ID Nos.1、3、4194、4195、4196、4197、4198、4199、4200的RNA序列。此外，编码CD40L的根据SEQ ID Nos.3898、3899、3900、3901、3902、3903、3904、10073的RNA序列是特别优选的。
在本发明的情形下，根据优选实施方案，细胞因子可选自选自由以下组成的组的任何细胞因子：4-1BBL；Apo2L/TRAIL；APRIL；BAFF；CD27L；CD30L；CD40L(CD154)；CXCL8；EL-17C；FasL；FLT3配体；G-CSF；GITRL；GM-CSF；IFNα；IFNB；IFNG；IFNω；IL-1α；IL-1β；IL-10；IL-11；IL-12；IL-12A；IL-13；IL-14；IL-15；IL-16；IL-17A；IL-17B；IL-17D；IL-17F；IL-18；IL-19；IL-lra(拮抗剂)；IL-2；IL-20；IL-21；IL-22；IL-23；IL-24；IL-25；IL-26；IL-27A；IL-27B；IL-28A；IL-28B；IL-29；IL-3；IL-31；IL-32；IL-33；IL-37；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；IL-9；LIF；LIGHT；LTα；LTβ；M-CSF；MIF；OSM；OX40L；RANK配体；干细胞因子；TGFβ1；TGFβ2；TGFβ3；TL1A；TNF；TWEAK，优选如表1中所公开的。在本文中，特别优选的是根据表1的编码细胞因子的RNA序列。
表1：细胞因子：
根据本发明，在一个更优选的实施方案中，本发明组合物包括至少一种RNA(优选mRNA)，其包括编码至少一种细胞因子(或其片段或变体)的至少一个编码区，其中所述至少一个编码区包括这样的RNA序列：其与根据如表1公开的SEQ ID Nos的RNA序列相同或至少50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
2.趋化因子：
在本发明含有RNA的组合物的另一个优选实施方案中，RNA包含编码至少一种趋化因子(或其片段或变体)的至少一个编码区。
趋化因子为控制免疫细胞的迁移模式和定位的趋化性细胞因子，如Griffith等,2014.Annu.Rev.Immunol.32:659-702(PMID 24655300)所综述。趋化因子功能对于所有免疫细胞移动均为重要的，该免疫细胞移动范围从免疫细胞发育及稳态所需的迁移、至产生初始及健忘性细胞及体液免疫应答所需的迁移、至在疾病中免疫细胞的病理性募集。趋化因子构成细胞因子的最大家族，在人类及小鼠中由约50个内源性趋化因子配体组成。
在本发明的情形下，根据优选实施方案，趋化因子可选自选自由以下组成的组的任何趋化因子：CCL1；CCL11；CCL12；CCL13；CCL14；CCL15；CCL16；CCL17；CCL18；CCL19；CCL2；CCL20；CCL21；CCL22；CCL24；CCL25；CCL26；CCL27；CCL28；CCL3；CCL4；CCL5；CCL6；CCL7；CCL8；CCL9；CX3CL1；CXCL1；CXCL10；CXCL11；CXCL12；CXCL13；CXCL14；CXCL15；CXCL2；CXCL3；CXCL4；CXCL5；CXCL6；CXCL7；CXCL8；CXCL9；XCL1；XCL2，优选如表2所公开的。在本文中，特别优选的是根据表2的编码趋化因子的RNA序列。
表2：趋化因子
在本文中，特别优选的是选自以下列表的趋化因子：CXCL9,CXCL10,CCL5,XCL1,CCL20,CCL19,CCL21,CCL2,CCL3,CCL16和CXCL12。
根据本发明，在一个更优选的实施方案中，本发明组合物包括至少一种RNA(优选mRNA)，其包括编码至少一种趋化因子(或其片段或变体)的至少一个编码区，其中所述至少一个编码区包括这样的RNA序列：其与根据如表2公开的SEQ ID Nos的RNA序列相同或至少50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
3.自杀基因产物
在本发明含有RNA的组合物的进一步优选实施方案中，RNA编码至少一种所谓的自杀基因产物、尤其自杀酶、优选核苷酸代谢酶。优选地，RNA与前药组合使用，该前药是自杀基因产物(尤其自杀酶)的底物，并通过自杀基因产物转化为细胞毒性化合物。适当的前药可添加至本发明RNA组合物中或其可单独地施用于患者。
一种或多种优选的自杀酶可选自以下列表：胸苷激酶，优选病毒胸苷激酶，更优选单纯疱疹(Herpes simplex)病毒胸苷激酶、水痘带状疱疹(Varicella zoster)胸苷激酶；植物胸苷激酶，优选西红柿胸苷激酶；胞嘧啶脱氨酶，优选细菌胞嘧啶脱氨酶或酵母胞嘧啶脱氨酶；脱氧核苷激酶，优选黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)脱氧核苷激酶；脱氧胞苷激酶，优选哺乳动物脱氧胞苷激酶；嘌呤核苷磷酸化酶，优选细菌嘌呤核苷磷酸化酶。
已经知晓自杀基因疗法是用于癌症的有前景的治疗(Ardiani等,2012.Curr.GeneTher.12(2):77-91.PMID:22384805)。此方法是基于在肿瘤细胞中自杀基因的成功递送及表达。自杀基因编码具有活化原本无效的前药的独特能力的酶。在转染的细胞中自杀基因表达之后，适当的前药经施用且通过自杀基因产物的作用转化为细胞毒性化合物。由于大多数自杀基因编码属于核苷酸代谢酶类别的酶，因此活化的前药的通用作用模式干扰DNA合成，其因此导致诱导细胞凋亡。与正常细胞相比，这些药物的效力归因于它们的更大增殖速率而在癌细胞中最大化。由于优先递送基因至肿瘤细胞的可能性，因此该策略有可能提供选择性肿瘤杀死同时避开正常细胞，这是标准化学疗法及放射疗法方法通常无法提供的特征。
下表3(Ardiani等,2012.Curr.Gene Ther.12(2):77-91.PMID:22384805)概述了可用于本发明方法中的优选核苷酸代谢酶。该表包括所述酶的变体和突变体，其通过蛋白质工程改造策略产生。
表3：自杀酶
*药物抑制性作用。1：DNA合成；2：胸苷酸合成酶；3：核糖核苷酸还原酶；4：RNA/蛋白质合成；5：反转录酶。
单纯疱疹1型病毒胸苷激酶(HSVTK，EC 2.7.1.21)，即亚单位分子量为45kDa的均二聚体，引起胸苷、脱氧胞苷、脱氧胸苷酸(dTMP)以及各种药学上重要的嘧啶及鸟苷类似物的磷酸化。特别注意，HSVTK引起抗病毒鸟苷类似物阿昔洛韦(ACV)及更昔洛韦(GCV)的初始且速率限制性的磷酸化。一旦单磷酸化，这些类似物可通过内源性酶(鸟苷酸激酶及核苷二磷酸激酶)进一步磷酸化，随后并入至初生DNA中以导致双链去稳定及随后细胞死亡。
此外，水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-tk)可例如与前药6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷(ara-M)或1-(2’-脱氧-2-氟-b-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)结合使用。其他实例为阿留申病病毒(ADV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)及巨细胞病毒(CMV)的胸苷激酶。
胞嘧啶脱氨酶(CD；EC 3.5.4.1)是嘧啶补救途径中的酶，其催化胞嘧啶的脱氨以形成尿嘧啶和氨。来自大肠杆菌的CD(bCD)是与催化金属铁的48kDA亚单位的六聚体。该酶不存在于哺乳动物中且独特地存在于真菌及细菌中。其用于自杀基因疗法中，因为其能够使抗真菌药物5-氟胞嘧啶(5FC)脱氨为5-氟尿嘧啶(5FU)，即一种有效的抗肿瘤药物。尿嘧啶磷酸核糖转移酶(Uracil phosphoribosyltransferase，UPRT)可用作潜在的增强剂。
酿酒酵母或酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD，EC 3.5.4.1)是17.5kDa亚单位的均二聚体，且已经显示与bCD相比对5FC的活性更大(22倍低的Km)，其相对于其天然底物胞嘧啶对5FC具有更好的催化效率(kcat/Km)。
黑腹果蝇脱氧核糖核苷激酶(Dm-dNK；2.7.1.145)是29kDa均二聚多底物激酶，其能够磷酸化DNA合成所需的所有四种天然脱氧核糖核苷。除了其广泛的底物特异性之外，Dm-dNK对这些天然脱氧核苷及若干核苷类似物展现出与哺乳动物脱氧核苷激酶相比更高的催化速率。归因于这些独特特性，Dm-dNK是用于本发明自杀基因疗法应用的特别优选的酶。
人类脱氧胞苷激酶(dCK；EC 2.7.1.74)是在脱氧核糖核苷的补救途径中30.5kDa的均二聚酶，且引起活化所有天然脱氧核糖核苷(不包括胸苷)以作为用于DNA合成的前体。归因于其广泛的底物特异性，dCK能够活化对于不同类型的癌症有效的多种核苷类似物。然而，野生型dCK本质上是具有低周转率的相对不良催化剂，且前药活化依赖于其表达水平。实际上，作为dCK的高效底物的核苷类似物，诸如阿糖胞苷(AraC)、氟达拉滨(fludarabine，F-AraA)、克拉屈滨(cladribine，CdA)及吉西他滨(gemcitabine，dFdC)，是有效的抗白血病试剂，因为淋巴母细胞已经显示具有高dCK表达水平，而不具有dCK活性的癌细胞对这些相同类似物具有抗性。因此，dCK是用于本发明方法的特别优选的酶。
优选地，本发明含有RNA的组合物的RNA与增强治疗的细胞毒性作用的其它组分组合使用。尤其优选的是该RNA与编码连接蛋白的RNA组合使用和/或与连接蛋白家族的蛋白质或其部分或片段组合使用。连接蛋白是在细胞之间形成间隙连接的跨膜蛋白。它们允许例如相邻细胞之间的分子转移，因此使得细胞毒性物质能够转移。
虽然自杀基因疗法是相当新的抗癌方法，但是该概念最初由Moolten(Moolten,1986.Cancer Res.46(10):5276-81)在超过二十年前的1986年描述。其还提出当前称为旁观者效应的存在，所述旁观者效应目前公认为是自杀基因疗法成功的基本特征。按照定义，旁观者效应是细胞毒性效应自转染的细胞至未转染的相邻细胞的延伸，以便当仅小亚群的肿瘤细胞被成功转染时可观察到完全肿瘤消退。现归因于可通过可用递送系统实现的低转染效率，该现象对自杀基因疗法的总体有效性至关重要。
认为旁观者效应经由两种主要机制出现：局部机制及免疫介导的机制。局部机制涉及杀死未转染的邻近细胞，其归因于毒性物质或自杀酶的转移，所述转移经由间隙连接、细胞凋亡囊泡或经由可溶毒性代谢物的扩散。间隙连接在细胞-细胞相互作用中是重要的，且引起离子、核苷酸及小分子至相邻细胞的转移。然而，毒性药物经由间隙连接的转移可能不可用于某些类型的肿瘤中，所述肿瘤下调胞内间隙连接通讯且显示杂乱且非功能化的间隙连接。为了解决此问题，若干研究已增加了连接蛋白(间隙连接的结构单元)的表达，且证明了实现增强的旁观者及细胞杀死效应。
体内实验的累积证据表明，免疫介导性旁观者效应也在肿瘤消退中起到重要作用。已发现炎性浸润、趋化因子和细胞因子的存在在使接受自杀基因疗法治疗的免疫活性动物的肿瘤消退时增加。这些细胞因子和趋化因子进一步诱导了产生能够刺激更稳定抗癌效应的免疫调节分子，另外，因为转染的细胞的死亡是经由细胞凋亡，所以可释放许多炎性信号以引发有效免疫应答。因此，本发明组合物与连接蛋白的组合或与编码链接蛋白的RNA的组合是尤其优选的，因为其加强了旁观者效应，由此增加了本发明含有RNA的组合物的效率。
在本发明的情形中，根据优选的实施方案，自杀基因产物可选自选自由以下组成的组的任何自杀基因产物：胞嘧啶脱氨酶codA；胞嘧啶脱氨酶fcy1；脱氧胞苷激酶dCK；脱氧核苷激酶dNK；嘌呤核苷磷酸化酶deoD；胸苷激酶TK，优选如表4中所公开的。在本文中，特别优选的是根据表4的编码自杀基因产物的RNA序列。
表4：自杀基因产物
根据本发明，在一个更优选的实施方案中，本发明组合物包括至少一种RNA(优选mRNA)，其包括编码至少一种自杀基因产物(或其片段或变体)的至少一个编码区，其中所述至少一个编码区包括这样的RNA序列：其与根据如表4公开的SEQ ID Nos的RNA序列相同或至少50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
4.免疫原性蛋白质或肽
优选地，本发明RNA组合物的RNA(优选mRNA)编码至少一种免疫原性蛋白质或肽，尤其病原体(优选病毒病原体)的蛋白质或肽，或其片段或变异体。通过使用编码免疫原性蛋白质或肽(优选为病原性抗原)的RNA，有可能利用针对所述抗原的预先存在的免疫性来治疗肿瘤和/或癌症疾病。记忆免疫应答被触发且免疫系统被加强以便攻击肿瘤细胞。
本发明的该实施方案是基于以下认识：原则上每种具有免疫系统的生物体针对某些外源分子(抗原)(例如蛋白质、特别是病毒或细菌蛋白质)均展现“记忆免疫应答”。如果生物体已经在较早时间点被所述抗原感染，则针对例如病毒蛋白质的免疫应答已经由该感染触发。免疫系统具有该应答的“记忆”且将其储存。作为经抗原再感染的结果，免疫应答被再活化。所述再活化可通过施用编码所述抗原的RNA(优选mRNA)进行，其中根据本发明的优选瘤内施用尤其有效。通过再活化针对例如病毒病原体的记忆免疫应答，有可能有效地毁灭肿瘤细胞。
用于本发明的该实施方案的免疫原性蛋白质或肽的优选实例为广泛的病原体的蛋白质或肽，即每种生物体(特别是哺乳动物、优选人类)具有在其生命周期中感染至少一次的高概率的病原体。其包括例如以下的任何结构或非结构蛋白质或肽：
-A或B型流感病毒或任何其他正粘病毒(C型流感病毒)；
-小核糖核酸病毒，诸如鼻病毒或A型肝炎病毒；
-披膜病毒，诸如α病毒或风疹病毒，例如辛德毕斯(Sindbis)病毒、塞姆利基森林(Semliki-Forest)病毒或麻疹病毒(rubeolavirus/measles virus)；
-风疹病毒(rubella virus)(德国麻疹病毒(German measles virus))；
-冠状病毒，特别是HCV-229E或HCV-OC43亚型；
-棒状病毒，诸如狂犬病病毒；
-副粘病毒，诸如腮腺炎病毒；
-呼肠孤病毒，诸如A、B或C组轮状病毒；
-嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)，诸如B型肝炎病毒；
-乳多泡病毒(papovirus)，诸如任何血清型(尤其1至75型)的人类乳头瘤病毒(HPV)；
-腺病毒，特别是1至47型；
-疱疹病毒，诸如单纯疱疹病毒1、2或3；
-巨细胞病毒(CMV)，优选CMVpp65；
-EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)；
-牛痘病毒；及
-细菌肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)(肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae))。
优选的免疫原性蛋白质或肽的其他实例为仅很少感染生物体的病原体的蛋白质或肽。尽管如此，编码这些蛋白质或肽中的一种或多种的RNA可在本发明的方法中有效。这些蛋白质或肽包括例如以下的任何结构或非结构蛋白质或肽：
-黄病毒，诸如1至4型登革热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒(West Nile virus)、日本脑炎病毒；
-C型肝炎病毒；
-杯状病毒；
-丝状病毒，诸如埃博拉病毒(Ebola virus)；
-博尔纳病毒(bornavirus)；
-布尼亚病毒(bunyavirus)，诸如裂谷热病毒(Rift Valley fever virus)；
-沙粒病毒，诸如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitisvirus，LCMV)或出血热病毒；
-逆转录病毒，诸如HIV；及
-细小病毒。
优选地，本发明mRNA组合物的RNA编码流感核蛋白(NP)。本发明人已展示，使用含有编码流感核蛋白的mRNA的组合物在根据本发明方法施用时对减小肿瘤大小尤其有效。在本文中，特别优选的是编码根据SEQ ID NO.6的流感核蛋白的mRNA。
5.细胞死亡诱导剂和细胞凋亡诱导剂：
在最广泛的意义上，细胞凋亡诱导剂或细胞死亡诱导剂需理解为诱导自体吞噬、角化、兴奋性毒性、坏死、瓦勒氏变性(Wallerian degeneration)、内吞死亡(entosis)、有丝分裂灾变、坏死性凋亡及细胞焦亡的分子(综述于Kroemer,G.,等“Classification ofcell death:recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009.”Cell Death&Differentiation16.1(2009):3-11)。
在本发明含有RNA的组合物的进一步优选实施方案中，RNA编码至少一种细胞凋亡诱导剂，优选选自由以下组成的组的细胞凋亡诱导剂：Bcl-2家族及肿瘤抑制蛋白p53及跨膜死亡受体的配体，尤其肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体基因超家族、促凋亡受体激动剂和Beclin-1。
在本发明的情形中，特别优选的细胞凋亡诱导剂为Beclin-1(来源于BECN1基因)。本领域中已知，Beclin-1与Bcl-2、BCL2L2、GOPC和MAP1LC3A相互作用以调节自体吞噬及细胞死亡。
细胞凋亡提供了针对癌症的重要障壁。然而，特异性突变(例如，肿瘤抑制基因p53的突变)使一些肿瘤细胞能够逃脱细胞凋亡死亡且变得更加恶性。通过使用编码至少一种细胞凋亡诱导剂的mRNA，有可能再活化细胞凋亡，其是生物体消除癌细胞的重要且有效的系统。
细胞凋亡诱导剂的优选实例可选自以下列表：Bcl-10、Bax、Bak、Bid、Bad、Bim、Bik、Blk、细胞色素c、胱天蛋白酶、尤其胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、死亡结构域，尤其Fas、优选FasL、TNFα、Apo2L/TRAIL、DR4和/或DR5的激动剂、Apo3L、DR4激动抗体、DR5激动抗体、蛋白激酶R(PKR)(优选组成型活性PKR)、颗粒酶B。
两种信号传导途径启动细胞凋亡：内源性途径经由胞内Bcl-2蛋白质起作用，外源性途径经由细胞表面促细胞凋亡受体起作用。
程序性细胞死亡的内源性信号传导途径涉及非受体介导的胞内信号，在线粒体中诱导启动细胞凋亡的活性。内源性途径的刺激包括病毒感染或毒素、自由基或辐射对细胞的损害。对细胞DNA的损害也可诱导程序性细胞死亡的内源性途径的活化。这些刺激诱导内部粒线体膜的变化，所述变化引起了跨膜电势损失，导致促细胞凋亡蛋白质释放至细胞溶质中。促细胞凋亡蛋白质活化了胱天蛋白酶，所述胱天蛋白酶经由许多途径介导细胞的破坏。这些蛋白质也易位至细胞核中，诱导DNA片段化，其为细胞凋亡的标志。线粒体中的促细胞凋亡事件的调节经由Bcl-2家族的蛋白质的成员及肿瘤抑制蛋白p53的活性进行。Bcl-2家族的蛋白质的成员可为促细胞凋亡或抗细胞凋亡的。抗细胞凋亡蛋白质为Bcl-2、Bcl-x、Bcl-xL、Bcl-XS、Bcl-w及BAG。促细胞凋亡蛋白质包括Bcl-10、Bax、Bak、Bid、Bad、Bim、Bik及Blk(Elmore,2007.Toxicol Pathol.35(4):495-516(PMID:17562483))，其对于本发明方法是尤其优选的。
导致细胞凋亡的外源性信号传导途径涉及跨膜死亡受体，其为肿瘤坏死因子(TNF)受体基因超家族的成员。该受体家族的成员与外源性配体结合并转导胞内信号，该胞内信号最终引起细胞破坏。迄今为止这些受体的最具特征的配体为FasL、TNFα、Apo2L和Apo3L。对应受体为FasR、TNFR1、DR3和DR4/DR5。当前针对其在治疗癌症(包括恶性血液病)中的治疗潜力，对刺激这些促细胞凋亡蛋白质的活性或活化这些受体的分子进行评价(Elmore,2007.Toxicol Pathol.35(4):495-516(PMID:17562483))。这些外源性配体是适用于本发明方法的其它特别优选的实例。
新分子洞察已激发了对促细胞凋亡受体激动剂(PARA)(包括重组人类蛋白质细胞凋亡配体2/TNF相关细胞凋亡诱导配体(Apo2L/TRAIL))的开发。另外，针对其信号传导受体DR4(TRAILR1)和DR5(TRAILR2)的激动单克隆抗体在开发中。马帕木单抗(Mapatumumab)是DR4激动抗体的一个实例。DR5激动抗体的实例包括来沙木单抗(Lexatumumab)、阿扑单抗(Apomab)、AMG655、CS-1008和LBY-135(Ashkenazi,2008.Nat.Rev.Drug Discov.7(12):1001-12(PMID:18989337))。
下表5概述了一些优选的细胞凋亡诱导剂。
表5：细胞凋亡诱导剂
在本发明的情形中，根据优选实施方案，细胞凋亡诱导剂可选自选自由以下组成的组的任何细胞凋亡诱导剂：Apo2L/TRAIL；Apo3L；Bad；Bak；Bax；Bcl-10；Bid；Bik；Bim；Blk；胱天蛋白酶3；胱天蛋白酶6；胱天蛋白酶7；胱天蛋白酶8；胱天蛋白酶9；细胞色素c；FasL；颗粒酶B；TNF，优选如表6中所公开的。在本文中，特别优选的是根据表6的编码细胞凋亡诱导剂的RNA序列。
表6：细胞凋亡诱导剂：
根据本发明，在一个更优选的实施方案中，本发明组合物包括至少一种RNA(优选mRNA)，其包括编码至少一种细胞凋亡诱导剂(或其片段或变体)的至少一个编码区，其中所述至少一个编码区包括这样的RNA序列：其与根据如表6公开的SEQ ID Nos的RNA序列相同或至少50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
6.血管生成抑制剂
在本发明含有RNA的组合物的进一步优选实施方案中，至少一种RNA(优选mRNA)编码至少一种血管生成调节剂或抑制剂(或其片段或变体)，优选内源性血管生成抑制剂。肿瘤生长和存活依赖于血管生成以提供向肿瘤细胞递送氧和营养素的路径。通过使用根据本发明方法编码至少一种血管生成抑制剂的RNA，有可能以局部方式(即在肿瘤组织内)阻断血管生成，从而提供停止肿瘤生长及减小肿瘤体积的有效方法。根据本发明的血管生成抑制剂的优选实例可选自以下列表：干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素γ(IFN-γ)、CXCL9、CXCL10、白细胞介素12(IL-12)、血小板因子4(PF-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、可溶fms样酪氨酸激酶1(sFLT-1)、胎肝激酶1(FLK-1)、血管抑制素、内皮抑制素、血管形成抑制素、血管能抑制素、肿瘤抑制素、16kD促乳素片段、金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP-1)金属蛋白酶的组织抑制剂2(TIMP-2)、金属蛋白酶的组织抑制剂3(TIMP-3)、血小板反应蛋白1(TSP-1)、血小板反应蛋白2(TSP-2)、乳腺丝抑蛋白、PEX、可溶酪氨酸蛋白激酶受体1(sTie1)、可溶血管生成素-1受体2(sTie2)、血管生成素-1、血管生成素-2、抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体(例如，阿珠单抗(Alacizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab))、抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体(例如，布罗卢西珠单抗(Brolucizumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、贝伐单抗(Bevacizumab))和抗血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)抗体(例如，伊克鲁库单抗(Icrucumab))。
在无该血管募集过程的情况下，肿瘤生长限于1至2mm2，氧的扩散限制。在1971年，Folkman已经提出肿瘤生长可通过阻断血管生成而停滞(Folkman,1972.N.Engl.J.Med.285(21):1182-6)。
血管生成是自预先存在的血管结构形成新血管的多步骤过程，其包括内皮细胞(EC)的活化、增殖和迁移，破坏血管基底膜，重塑组织的胞外基质，形成血管管路和网络，募集支持细胞(包括平滑肌细胞及外膜细胞)，和连接至预先存在的血管网络。
在给定微环境内，血管生成反应起因于促血管生成与抗血管生成因子之间的平衡，所述因子二者均由肿瘤细胞及基质的组分分泌；前者的盛行率确定了“血管生成开关”，导致血管生成的活化，随后肿瘤外生长(Hanahan和Folkman,1996.Cell 86(3):353-64)。
与施用抗血管生成药物的常规模式相比，血管生成抑制的基于基因疗法的策略以及尤其根据本发明的方法具有若干优势。首先，因为病理性血管生成的有效抑制可最终需要慢性治疗，所以根据本发明的基因疗法策略可用于实现向受影响组织的选择性递送及治疗剂的长期表达。基因疗法通常也代表一种规避许多重组蛋白的生产问题(包括它们的稳定性及溶解性)的方法；通过重组工程改造方法充足产生抗血管生成因子有时也具有问题(例如，对于血管抑制素)且可能限制其临床应用。此外，基因转移使用允许蛋白药剂的正确折叠以及它们的体内稳定性，因为它们在其生理环境中组装。本发明方法的特别诱人的特征在于这样的可能性：靶向基因递送至选择性组织(即肿瘤组织)，因此实现局部基因表达及高区域性药物浓度而不增加治疗剂的全身性水平且从而导致治疗指数提高。
血管生成抑制剂在来源及效力方面是异质的，且其生长列表包括具有不同功能的较大分子的蛋白水解产物，诸如血管抑制素、内皮抑制素及血管形成抑制素，血管内皮生长因子活性的调节剂(诸如可溶FLT-1(sFLT-1))，和一些具有显著抗内皮活性的细胞因子/趋化因子(诸如IL-12、IFN-α及CXCL10)。下表8(改编自Persano等,2007.Mol.Aspects Med.28(1):87-114.PMID:17306361)概述了可用于本发明方法中的优选血管生成抑制剂。
在本发明的情形中，根据优选实施方案，血管生成抑制剂可选自选自由以下组成的组的任何内源性血管生成抑制剂：血管生成素-2；血管抑制素；血管能抑制素；CXCL10；CXCL4；CXCL9；内皮抑制素；FLK-1；IFNα；IFNB；IFNG；IL-12；PEX；PRL；SERPINB5；sFLT-1；sTie2；TIMP-1；TIMP-2；TIMP-3；TNF；TSP-1；TSP-2；肿瘤抑制素、血管形成抑制素，优选如表7中所公开的。在本文中，特别优选的是根据表7的编码血管生成抑制剂的RNA序列。
表7：内源性血管生成抑制剂
根据本发明，在一个更优选的实施方案中，本发明组合物包括至少一种RNA(优选mRNA)，其包括编码至少一种血管生成抑制剂(或其片段或变体)的至少一个编码区，其中所述至少一个编码区包括这样的RNA序列：其与根据如表7公开的SEQ ID Nos的RNA序列相同或至少50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
7.热休克蛋白
在本发明含有RNA的组合物的进一步优选实施方案中，RNA编码至少一种热休克蛋白(HSP)或其片段或变体。优选地，热休克蛋白可选自以下列表：HSP27、HSP47(丝氨酸蛋白酶抑制剂H1)、HSP60、HSP70、HSC70、GRP78(BiP)、HSP90、HSP110、GRP94(gp96)、GRP170(ORP150)、PDI/PDIA、CRT/CALR。
如Graner等人(Graner MW,Lillehei KO,Katsanis E.Endoplasmic reticulumchaperones and their roles in the immunogenicity of cancer vaccines.FrontOncol.2015Jan 6；4:379.doi:10.3389/fonc.2014.00379)所综述，热休克蛋白发挥必需细胞管家功能且在蛋白质合成、折叠及跨越胞内膜输送以及蛋白质降解期间不可或缺。HSP属于分子伴侣的多蛋白家族，其由(但不限于)以下组成：HSP27、HSP47(丝氨酸蛋白酶抑制剂H1)、HSP60、HSP70、HSC70、GRP78(BiP)、HSP90、HSP110、GRP94(gp96)、GRP170(ORP150)、PDI/PDIA、CRT/CALR。除了作为分子伴侣的胞内功能之外，HSP已经显示作为(特别是肿瘤环境中)免疫应答的模拟剂起到重要的胞外作用。各种文献报导表明，来源于肿瘤的HSP-肽复合物极高效地诱导抗肿瘤免疫应答。已阐明这些观察结果的分子机制。HSP作为分子伴侣能够结合变性肽(包括抗原肽)，且那些复合物通过抗原呈递细胞(APC)而内化，这最终导致抗原呈递及免疫诱导。除了它们的分子伴侣功能之外，HSP已经显示可触发肿瘤微环境中的危险信号，且因此刺激巨噬细胞和树突状细胞(DC)以产生促炎性细胞因子并增强诱导的免疫应答。
在本发明的情形中，根据优选实施方案，热休克蛋白可选自选自由以下组成的组的任何热休克蛋白：钙网蛋白；GRP170(ORP150)；GRP78(BiP)；GRP94(gp96)；HSC70；HSP110；HSP27；HSP47(丝氨酸蛋白酶抑制剂H1)；HSP60；HSP70；HSP90；PDI/PDIA，优选如表8中所公开的。在本文中，特别优选的是根据表8的编码热休克蛋白的RNA序列。
表8：热休克蛋白
根据本发明，在一个更优选的实施方案中，本发明组合物包括至少一种RNA(优选mRNA)，其包括编码至少一种热休克蛋白(或其片段或变体)的至少一个编码区，其中所述至少一个编码区包括这样的RNA序列：其与根据如表8公开的SEQ ID Nos的RNA序列相同或至少50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
8.肿瘤抗原
在本发明含有RNA的组合物的进一步优选实施方案中，组合物可含有编码至少一种肿瘤抗原或其片段或变异体的RNA(优选mRNA)，其根据本发明用于疫苗接种以诱导适应性免疫应答。
在本文中，肿瘤抗原特别优选由包含于本发明RNA组合物中的RNA(优选mRNA)编码。特别优选地，本发明RNA组合物包含至少一种RNA，其编码至少一种肿瘤抗原或其片段或变异体。
肿瘤抗原优选位于(肿瘤)细胞的表面上。肿瘤抗原也可选自与正常细胞相比过表达于肿瘤细胞中的蛋白质。此外，肿瘤抗原也包括在以下细胞中表达的抗原：所述细胞自身不(或最初自身不)退化但与假定肿瘤相关。本文中还包括与肿瘤供应血管或其(再)形成相关的抗原，特别是与新血管生成相关的那些抗原，例如生长因子，诸如VEGF、bFGF等。此外，与肿瘤相关的抗原包括来自细胞或组织(典型地包埋肿瘤的)的抗原。此外，一些物质(通常蛋白质或肽)表达于(知情或不知情地)罹患癌症疾病的患者中且其以增加的浓度存在于所述患者的体液中。这些物质也称为“肿瘤抗原”，然而在免疫应答诱导物质的严格意义上它们不是抗原。肿瘤抗原的类别可进一步分为肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)。TSA仅能由肿瘤细胞呈递且从未由正常“健康”细胞呈递。它们典型地由肿瘤特异性突变产生。更常见的TAA通常由肿瘤及健康细胞两者呈递。这些抗原被识别，且抗原呈递细胞可由细胞毒性T细胞破坏。另外，肿瘤抗原也能够以例如突变受体形式存在于肿瘤的表面上。在此情况下，它们能够通过抗体识别。
此外，肿瘤相关抗原可归类为组织特异性抗原，也称为黑素细胞特异性抗原、睾丸癌抗原及肿瘤特异性抗原。睾丸癌抗原典型地理解为生殖系相关基因的肽或蛋白质，其可在多种多样的肿瘤中活化。人类睾丸癌抗原可进一步再分为在X染色体上编码的抗原(所谓的CT-X抗原)以及不在X染色体上编码的那些抗原(所谓的非X CT抗原)。在X染色体上编码的睾丸癌抗原包括例如黑素瘤抗原基因的家族，即所谓的MAGE家族。MAGE家族的基因的特性可在于共享MAGE同源结构域(MHD)。这些抗原(即，黑素细胞特异性抗原、睾丸癌抗原及肿瘤特异性抗原)中的每一者可激发自体细胞及体液性免疫应答。因此，由本发明核酸序列编码的肿瘤抗原优选是黑素细胞特异性抗原、睾丸癌抗原或肿瘤特异性抗原，其优选地可为CT-X抗原、非X CT抗原、CT-X抗原的结合配偶体或非X CT抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原，更优选为CT-X抗原、非X CT抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原。
特别优选的肿瘤抗原选自由以下组成的列表：5T4、707-AP、9D7、AFP、AlbZIPHPG1、α-5-β-1-整合素、α-5-β-6-整合素、α-辅肌动蛋白-4/m、α-甲基酰基-辅酶A消旋酶、ART-4、ARTC1/m、B7H4、BAGE-1、BCL-2、bcr/abl、β-联蛋白/m、BING-4、BRCA1/m、BRCA2/m、CA15-3/CA 27-29、CA 19-9、CA72-4、CA125、钙网蛋白、CAMEL、CASP-8/m、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD19、CD20、CD22、CD25、CDE30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CEA、CLCA2、CML28、CML66、COA-1/m、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2、CT-9/BRD6、Cten、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyp-B、CYPB1、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EFTUD2/m、EGFR、ELF2/m、EMMPRIN、EpCam、EphA2、EphA3、ErbB3、ETV6-AML1、EZH2、FGF-5、FN、Frau-1、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE7b、GAGE-8、GDEP、GnT-V、gp100、GPC3、GPNMB/m、HAGE、HAST-2、肝丝酶(hepsin)、Her2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A*0201-R17I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HNE、同源盒NKX3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、iCE、IGF-1R、IL-13Ra2、IL-2R、IL-5、未成熟层黏连蛋白受体、激肽释放酶-2、激肽释放酶-4、Ki67、KIAA0205、KIAA0205/m、KK-LC-1、K-Ras/m、LAGE-A1、LDLR-FUT、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGE-B17、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2、乳腺球蛋白A、MART-1/melan-A、MART-2、MART-2/m、基质蛋白22、MC1_R、M-CSF、ME1/m、间皮素、MG50/PXDN、MMP11、MN/CA IX抗原、MRP-3、MUC-1、MUC-2、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、肌凝蛋白I类/m、NA88-A、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V、Neo-PAP、Neo-PAP/m、NFYC/m、NGEP、NMP22、NPM/ALK、N-Ras/m、NSE、NY-ESO-B、NY-ESO-1、OA1、OFA-iLRP、OGT、OGT/m、OS-9、OS-9/m、骨钙素、骨桥蛋白、p15、p190微bcr-abl、p53、p53/m、PAGE-4、PAI-1、PAI-2、PAP、PART-1、PATE、PDEF、Pim-1激酶、Pin-1、Pml/PARα、POTE、PRAME、PRDX5/m、前列腺蛋白(prostein)、蛋白酶-3、PSA、PSCA、PSGR、PSM、PSMA、PTPRK/m、RAGE-1、RBAF600/m、RHAMM/CD168、RU1、RU2、S-100、SAGE、SART-1、SART-2、SART-3、SCC、SIRT2/m、Sp17、SSX-1、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1、STEAP-1、存活素、存活素-2B、SYT-SSX-1、SYT-SSX-2、TA-90、TAG-72、TARP、TEL-AML1、TGFβ、TGFβRII、TGM-4、TPI/m、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2/6b、TRP/INT2、TRP-p8、酪氨酸酶、UPA、VEGFR1、VEGFR-2/FLK-1和WT1。所述肿瘤抗原优选可选自由以下组成的组：p53、CA125、EGFR、Her2/neu、hTERT、PAP、MAGE-A1、MAGE-A3、间皮素、MUC-1、GP100、MART-1、酪氨酸酶、PSA、PSCA、PSMA、STEAP-1、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、Ras、CEA或WT1，且更优选地选自PAP、MAGE-A3、WT1和MUC-1。所述肿瘤抗原优选可选自由以下组成的组：MAGE-A1(例如，根据登录编号M77481的MAGE-A1)、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6(例如，根据登录编号NM_005363的MAGE-A6)、MAGE-C1、MAGE-C2、melan-A(例如，根据登录编号NM_005511的melan-A)、GP100(例如，根据登录编号M77348的GP100)、酪氨酸酶(例如，根据登录编号NM_000372的酪氨酸酶)、存活素(例如，根据登录编号AF077350的存活素)、CEA(例如，根据登录编号NM_004363的CEA)、Her-2/neu(例如，根据登录编号M11730的Her-2/neu)、WT1(例如，根据登录编号NM_000378的WT1)、PRAME(例如，根据登录编号NM_006115的PRAME)、表皮生长因子受体1(epidermal growth factor receptor 1，EGFRI)(例如，根据登录编号AF288738的表皮生长因子受体1(EGFRI))、MUC1、粘蛋白-1(例如，根据登录编号NM_002456的黏蛋白-1)、SEC61G(例如，根据登录编号NM_014302的SEC61G)、hTERT(例如，登录编号NM_198253的hTERT)、5T4(例如，根据登录编号NM_006670的5T4)、TRP-2(例如，根据登录编号NM_001922的TRP-2)、STEAP1、PCA、PSA、PSMA等。
在本发明的情形中，根据优选的实施方案，肿瘤抗原可选自选自由以下组成的组的任何肿瘤抗原：1A01_HLA-A/m、1A02、5T4、ACRBP、AFP、AKAP4、α-辅肌动蛋白-4/m、α-甲基酰基-辅酶A消旋酶、ANDR、ART-4、ARTC1/m、AURKB、B2MG、B3GN5、B4GN1、B7H4、BAGE-1、BASI、BCL-2、bcr/abl、β-联蛋白/m、BING-4、BIRC7、BRCA1/m、BY55、钙网蛋白、CAMEL、CASPA、胱天蛋白酶8、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、CD1E、CD20、CD22、CD276、CD33、CD3E、CD3Z、CD4、CD44同种型1、CD44同种型6、CD52、CD55、CD56、CD80、CD86、CD8A、CDC27/m、CDE30、CDK4/m、CDKN2A/m、CEA、CEAM6、CH3L2、CLCA2、CML28、CML66、COA-1/m、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2、CP1B1、CSAG2、CT-9/BRD6、CT45A1、CT55、CTAG2同种型LAGE-1A、CTAG2同种型LAGE-1B、CTCFL、Cten、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyp-B、DAM-10、DEP1A、E7、EF1A2、EFTUD2/m、EGFR、EGLN3、ELF2/m、EMMPRIN、EpCam、EphA2、EphA3、ErbB3、ERBB4、ERG、ETV6、EWS、EZH2、FABP7、FCGR3A变型1、FCGR3A变型2、FGF5、FGFR2、纤连蛋白(fibronectin)、FOS、FOXP3、FUT1、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE7b、GAGE-8(GAGE-2D)、GASR、GnT-V、GPC3、GPNMB/m、GRM3、HAGE、肝丝酶、Her2/neu、HLA-A2/m、同源盒NKX3.1、HOM-TES-85、HPG1、HS71A、HS71B、HST-2、hTERT、iCE、IF2B3、IL-10、IL-13Ra2、IL2-RA、IL2-RB、IL2-RG、IL-5、IMP3、ITA5、ITB1、ITB6、激肽释放酶-2、激肽释放酶-4、KI20A、KIAA0205、KIF2C、KK-LC-1、LDLR、LGMN、LIRB2、LY6K、MAGA5、MAGA8、MAGAB、MAGE-B1、MAGE-E1、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGE-B17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1(MAGE1)、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2、乳腺球蛋白A、MART-1/melan-A、MART-2、MC1_R、M-CSF、间皮素、MITF、MMP11、MMP7、MUC-1、MUM-1/m、MUM-2/m、MYO1A、MYO1B、MYO1C、MYO1D、MYO1E、MYO1F、MYO1G、MYO1H、NA17、NA88-A、Neo-PAP、NFYC/m、NGEP、N-myc、NPM、NRCAM、NSE、NUF2、NY-ESO-1、OA1、OGT、OS-9、骨钙素、骨桥蛋白、p53、PAGE-4、PAI-1、PAI-2、PAP、PATE、PAX3、PAX5、PD1L1、PDCD1、PDEF、PECA1、PGCB、PGFRB、Pim-1激酶、Pin-1、PLAC1、PMEL、PML、POTE、POTEF、PRAME、PRDX5/m、PRM2、前列腺蛋白、蛋白酶-3、PSA、PSB9、PSCA、PSGR、PSM、PTPRC、RAB8A、RAGE-1、RARA、RASH、RASK、RASN、RGS5、RHAMM/CD168、RHOC、RSSA、RU1、RU2、RUNX1、S-100、SAGE、SART-1、SART-2、SART-3、SEPR、SERPINB5、SIA7F、SIA8A、SIAT9、SIRT2/m、SOX10、SP17、SPNXA、SPXN3、SSX-1、SSX-2、SSX3、SSX-4、ST1A1、STAG2、STAMP-1、STEAP-1、存活素、存活素-2B、SYCP1、SYT-SSX-1、SYT-SSX-2、TARP、TCRg、TF2AA、TGFβ1、TGFR2、TGM-4、TIE2、TKTL1、TPI/m、TRGV11、TRGV9、TRPC1、TRP-p8、TSG10、TSPY1、TVC(TRGV3)、TX101、酪氨酸酶、TYRP1、TYRP2、UPA、VEGFR1、WT1、XAGE1，优选如表9中所公开的。在本文中，特别优选的是根据表9的编码肿瘤抗原的RNA序列。
表9：肿瘤抗原
根据本发明，在一个更优选的实施方案中，本发明组合物包括至少一种RNA(优选mRNA)，其包括编码至少一种肿瘤抗原(或其片段或变体)的至少一个编码区，其中所述至少一个编码区包括这样的RNA序列：其与根据如表9公开的SEQ ID Nos的RNA序列相同或至少50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
此外，肿瘤抗原也可包括与癌症或肿瘤疾病(特别是淋巴瘤或淋巴瘤相关疾病)相关的个体基因型抗原，其中所述个体基因型抗原是淋巴血细胞的免疫球蛋白个体基因型或淋巴血细胞的T细胞受体个体基因型。
在一个特别优选的实施方案中，本发明RNA组合物包括至少一种RNA，其中所述至少一种RNA编码以下抗原：
·前列腺六跨膜上皮抗原(Six Transmembrane Epithelial Antigen of theProstate，STEAP)；
·前列腺特异性抗原(Prostate-Specific Antigen，PSA)；
·前列腺特异性膜抗原(Prostate-Specific Membrane Antigen，PSMA)；
·前列腺干细胞抗原(Prostate Stem Cell Antigen，PSCA)；
·前列腺酸磷酸酶(Prostatic Acid Phosphatase，PAP)；及
·粘蛋白1(mucin 1，MUC1)。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明RNA组合物包括至少一种RNA，其中所述至少一种RNA编码以下抗原：
·5T4(滋养层糖蛋白，TPBG)；
·存活素(杆状病毒的含有IAP重复序列的蛋白质5；BIRC5)；
·纽约食管鳞状细胞癌1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1；CTAG1B)；
·黑素瘤抗原家族C1(Melanoma antigen family C1，MAGE-C1)；
·黑素瘤抗原家族C2(Melanoma antigen family C2，MAGE-C2)；及
·粘蛋白1(mucin 1，MUC1)。
9.β-联蛋白抑制剂
在本发明含有RNA的组合物的进一步优选实施方案中，RNA(优选mRNA)编码至少一种β-联蛋白抑制剂或其片段或变体。优选地，编码至少一种β-联蛋白抑制剂的RNA编码了β-联蛋白途径的抑制性蛋白或显性负突变蛋白。根据本发明的特别优选β-联蛋白抑制剂包含TAT-NLS-BLBD-6、轴蛋白-1、TCF-4、GSK-3b、DKK-1、Dvl-1衍生物或其片段。
如Thakur和Mishra(Thakur R,Mishra DP.Pharmacological modulation ofbeta-catenin and its applications in cancer therapy.J Cell Mol Med.2013 Apr；17(4):449-56.doi:10.1111/jcmm.12033)所综述，β-联蛋白是在生理稳态中起到重要作用的多功能蛋白质。其充当转录调节子和用于胞内粘附的衔接蛋白二者。β-联蛋白是建立和维持上皮层所必需的，且提供了胞内连接与细胞骨架蛋白质之间的键联。β-联蛋白通过Wnt信号传导而调节。在不存在Wnt下游信号的情况下，β-联蛋白被磷酸化，这导致其泛素化及最终的蛋白质降解。各种文献报导已将β-联蛋白与正常细胞的恶性转化联系起来。例如，Wnt信号传导和β-联蛋白核定位与肝细胞向肿瘤表型的分化相关。类似地，在肺上皮及胰脏细胞中，β-联蛋白的活化足以诱导致癌转化。除了是恶性转化的驱动力之外，异常β-联蛋白表达和定位已与增加的转移能力相关。最近已显示了β-联蛋白信号传导阻止T细胞浸润及抗肿瘤免疫性，大大地限制了免疫疗法的潜在效应。因为β-联蛋白在肿瘤形成中起到重要且有害的作用，所以其已经提议作为推定的药物标靶。
10.STING途径活化剂
在本发明含有RNA的组合物的进一步优选实施方案中，RNA(优选mRNA)编码至少一种STING途径(干扰素基因刺激剂)活化剂或其片段或变体。优选地，编码至少一种STING途径活化剂(刺激剂)的RNA编码STING途径的活化蛋白或组成型活性蛋白(优选DDX41、STING、cGAS、IRF3、TBK1或STAT6)或其片段或变体。
如Woo等人(Woo SR,Corrales L,Gajewski TF.The STING pathway and the Tcell-inflamed tumor microenvironment.Trends Immunol.2015Mar 7.pii:S1471-4906(15)00019-8.doi:10.1016/j.it.2015.02.003)和Dubensky等(Dubensky TW Jr,KanneDB,Leong ML.Rationale,progress and development of vaccines utilizing STING-activating cyclic dinucleotide adjuvants.Ther Adv Vaccines.2013Nov；1(4):131-43.doi:10.1177/2051013613501988)所综述，所谓的STING途径(STING-干扰素基因刺激剂)引起感测细胞质DNA及诱导促炎性介质。在结合细胞质中的DNA之后，STING经由TANK结合激酶1(TBK-1)/IRF-3轴活化信号传导，这导致了产生IFN-β。该途径显示出在感测DNA病毒以及一些自身免疫病中起到重要作用。最近数据已将STING途径鉴别是在体内诱导针对肿瘤抗原的自发T细胞引发所绝对必需的。肿瘤DNA在肿瘤浸润DC内被检测到，这导致IFN-β产生及T细胞活化。因此，瘤内施用小分子STING路途径激动剂已证明其在荷瘤动物中的功效。STING途径的激动剂也已被评价为展现了诱导已进行疫苗接种的宿主中的细胞和体液性免疫性的效力的疫苗佐剂。
11.检查点调节剂
在本发明含有RNA的组合物的一个优选实施方案中，RNA(优选mRNA)包含编码至少一种检查点调节剂(或其片段或变体)的至少一个编码区。
发现负调节T细胞表面分子，其于活化的T细胞中上调以使其活性衰减，这使得肿瘤细胞的杀死不大有效。归因于与T细胞共刺激分子CD28的同源性，这些抑制性分子被称为负共刺激分子。这些蛋白(也称为免疫检查点蛋白)在多种途径中起作用，所述途径包括早期活化信号的衰减、正共刺激的竞争和抗原呈递细胞的直接抑制(Bour-Jordan等,2011.Immunol Rev.241(1):180-205)。
在本发明的优选实施方案中，检查点调节剂为B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7/HHLA2、BTLA、CD28、CD28H/IGPR-1、CTLA-4、ICOS、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、VISTA/B7-H5/PD-1H、BTN1A1/嗜乳脂蛋白、BTN2A1、BTN2A2/嗜乳脂蛋白2A2、BTN3A1/2、BTN3A2、BTN3A3、BTNL2/嗜乳脂蛋白样2、BTNL3、BTNL4、BTNL6、BTNL8、BTNL9、BTNL10、CD277/BTN3A1、LAIR1、LAIR2、CD96、CD155/PVR、CRTAM、DNAM-1/CD226、柄蛋白-2/CD112、柄蛋白-3、TIGIT、LILRA3/CD85e、LILRA4/CD85g/ILT7、LILRB1/CD85j/ILT2、LILRB2/CD85d/ILT4、LILRB3/CD85a/ILT5、LILRB4/CD85k/ILT3、4-1BB/TNFRSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α、TNF RII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-3、TIM-4、CD7、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP R的调节剂或其任意组合。
在本发明的情形中，检查点调节剂在本文中定义为调节免疫检查点蛋白的功能的分子(优选蛋白质，例如抗体、显性负性受体、诱饵受体或配体或其片段或变体)，例如其抑制或降低检查点抑制剂(或抑制性检查点分子)的活性或其刺激检查点刺激剂(或刺激性检查点分子)的活性。因此，如本文所定义的检查点调节剂影响检查点分子的活性。
在本文中，抑制性检查点分子定义为检查点抑制剂且可同义使用。另外，刺激性检查点分子定义为检查点刺激剂且可同义使用。
在本发明的情形中，可被检查点调节剂抑制的优选抑制性检查点分子为PD-1、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、LAG3、TIM3/HAVCR2、2B4、A2aR、B7H3、B7H4、BTLA、CD30、CD160、GAL9、HVEM、IDO1、IDO2、KIR、LAIR1和VISTA。
在本发明的情形中，可被检查点调节剂刺激的优选刺激性检查点分子为CD2、CD27、CD28、CD40、CD137、CD226、CD276、GITR、ICOS、OX-40及CD70。
优选地，检查点调节剂选自激动抗体、拮抗抗体、配体、显性负性调节物及诱饵受体或其组合。
产生及使用mRNA编码的抗体的方法在本领域中是已知的(例如，WO2008/083949)。
优选地，激动抗体选自以下列表：抗4-1BB、抗OX40、抗GITR、抗CD28、抗CD27、抗CD-40抗ICOS、抗TNFRSF25和抗LIGHT。
OX40是受体的TNFR超家族的成员，且在抗原活化的哺乳动物CD4+及CD8+T淋巴细胞的表面上表达。OX40配体(OX40L，也称为gp34、ACT-4-L和CD252)是与OX40受体特异性相互作用的蛋白质。术语OX40L包括整个OX40配体，可溶OX40配体，和这样的融合蛋白：其包括OX40配体的功能活性部分，所述功能活性部分共价连接于第二部分(例如，蛋白质结构域)。OX40L的定义内也包括这样的变体：其氨基酸序列与天然存在的OX4L不同但保持与OX40受体特异性结合的能力。OX40L的定义内进一步包括增强OX40的生物活性的变体。OX40激动剂是诱导或增强OX40的生物活性(例如，由OX40介导的信号转导)的分子。OX40激动剂优选在本文中定义为能够特异性结合至OX40的结合分子。因此，OX40激动剂可以是与OX40结合且能够刺激OX40信号传导的任何激动剂。在本文中，OX40激动剂可为与OX40结合的激动抗体。
OX40激动剂及抗OX40单克隆抗体描述于WO1995/021251、WO1995/012673和WO1995/21915中。特别优选的是抗OX40抗体9B12，即针对人类OX40的胞外域的鼠类抗OX40单克隆抗体(Weinberg等,2006.J.Immunother.29(6):575-585)。
优选地，拮抗抗体选自以下列表：抗CTLA4、抗PD1、抗PD-L1、抗Vista、抗Tim-3、抗LAG-3和抗BTLA。
细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)主要表达于T细胞的胞内区室内。在经由T细胞受体(TCR)对幼稚T细胞进行有效或持久刺激之后，CTLA-4输送至细胞表面且在免疫突触处密集。CTLA-4随后与CD28竞争CD80/CD86且经由对Akt信号传导的效应下调TCR信号传导。因此，CTLA-4在生理学上起到信号衰减剂的作用(Weber,J.2010.Semin.Oncol.37(5):430-9)。
特别优选的是抗CTLA-4抗体伊匹单抗(ipilimumab)曲美木单抗(tremelimumab)及AGEN-1884。
PD-1途径的成员是与PD-1信号传导相关的所有蛋白。一方面，这些可为诱导PD-1的上游的PD-1信号传导的蛋白质，例如PD-1的配体PD-L1和PD-L2以及信号转导受体PD-1。另一方面，这些可为PD-1受体的下游的信号转导蛋白质。在本发明的情形中，PD-1途径的成员特别优选为PD-1、PD-L1和PD-L2。
在本发明的情形中，PD-1途径拮抗剂优选在本文中定义为能够削弱PD-1途径信号传导(优选由PD-1受体介导的信号传导)的化合物。因此，PD-1途径拮抗剂可为能够拮抗PD-1途径信号传导的针对PD-1途径任何成员的任何拮抗剂。在本文中，拮抗剂可为如本文所定义的拮抗抗体，其靶向PD-1途径的任何成员，优选针对PD-1受体、PD-L1或PD-L2。该拮抗抗体也可由核酸编码。此外，PD-1途径拮抗剂可为阻断PD1配体活性的PD-1受体的片段。B7-1或其片段也可充当PD1拮抗配体。另外，PD-1途径拮抗剂可为包括以下氨基酸序列的蛋白质(或编码以下氨基酸序列的核酸)：所述氨基酸序列能够结合至PD-1但例如通过抑制PD-1与B7-H1或B7-DL相互作用来阻止PD-1信号传导(WO2014127917)。
特别优选的是抗PD1抗体纳武单抗(Nivolumab)(MDX-1106/BMS-936558/ONO-4538)(Brahmer等,2010.J Clin Oncol.28(19):3167-75；PMID:20516446)；皮立珠单抗(Pidilizumab)(CT-011)(Berger等,2008.Clin Cancer Res.14(10):3044-51；PMID:18483370)；派姆单抗(Pembrolizumab)(MK-3475，SCH 900475)；AMP-224；和MEDI0680(AMP-514)。
特别优选的是抗PD-L1抗体MDX-1105/BMS-936559(Brahmer等2012.N Engl JMed.366(26):2455-65；PMID:22658128)；阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A/RG7446)；德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)；和阿维单抗(avelumab)(MSB0010718)。
根据本发明，本发明含有RNA的组合物的至少一种RNA编码表10的至少一种抗体或其片段或变体。特别优选地，含有RNA的组合物包括至少一种编码特定抗体或其片段或变体的重链的RNA及至少一种编码相同特定抗体或其片段或变体的轻链的其它RNA。
表10：针对检查点分子的抗体
在另一个优选实施方案中，检查点调节剂是诱饵受体(例如，可溶受体)。优选地，诱饵受体是可溶PD1受体。在特别优选的实施方案中，本发明的包含RNA的组合物中至少一种RNA包括这样的RNA序列：其与编码可溶PD-1受体的根据SEQ ID NO:389的RNA序列相同或至少50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
在本发明含有RNA的组合物的进一步优选实施方案中，RNA(优选mRNA)编码至少一种配体，所述配体起到检查点调节剂作用。优选地，配体是CD40配体(CD40L)。在本发明含有RNA的组合物的进一步优选实施方案中，RNA(优选mRNA)编码至少一种配体，所述配体起到检查点调节剂作用。优选地，配体是CD40配体(CD40L)。更优选地，本发明的包含RNA的组合物中至少一种RNA包括这样的RNA序列：其与编码CD40L的根据SEQ ID NO:10073的RNA序列相同或至少50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
12.先天性免疫活化剂：
在本文中，先天性免疫活化剂可选自典型地包括能够激发先天性免疫应答(在哺乳动物中)(例如作为外源性TLR配体结合至TLR的应答)的任何人类蛋白质或肽的哺乳动物、特别是人类佐剂蛋白。更优选地，人类佐剂蛋白选自由这样的蛋白质组成的组：所述蛋白质是模式识别受体的信号传导网络的组分和配体，包括TLR、NLR及RLH，包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11；NOD1、NOD2、NOD3、NOD4、NOD5、NALP1、NALP2、NALP3、NALP4、NALP5、NALP6、NALP6、NALP7、NALP7、NALP8、NALP9、NALP10、NALP11、NALP12、NALP13、NALP14,l IPAF、NAIP、CIITA、RIG-I、MDA5和LGP2，TLR信号传导的信号转导子，包括衔接蛋白，包括例如Trif和Cardif；小GTP酶信号传导的组分(RhoA、Ras、Rac1、Cdc42、Rab等)；PIP信号传导的组分(PI3K、Src激酶等)；MyD88依赖性信号传导的组分(MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TIRAP、TRAF6等)；MyD88非依赖性信号传导的组分(TICAM1、TICAM2、TRAF6、TBK1、IRF3、TAK1、IRAK1等)；活化的激酶，包括例如Akt、MEKK1、MKK1、MKK3、MKK4、MKK6、MKK7、ERK1、ERK2、GSK3、PKC激酶、PKD激酶、GSK3激酶、JNK、p38MAPK、TAK1、IKK和TAK1；活化的转录因子，包括例如NF-κB、c-Fos、c-Jun、c-Myc、CREB、AP-1、Elk-1、ATF2、IRF-3、IRF-7。
此外，哺乳动物、特别是人类佐剂蛋白可选自由以下组成的组：热休克蛋白，诸如HSP10、HSP60、HSP65、HSP70、HSP75及HSP90；gp96；纤维蛋白原；纤连蛋白的TypIII重复序列额外结构域A；或补体系统的组分，包括C1q、MBL、C1r、C1s、C2b、Bb、D、MASP-1、MASP-2、C4b、C3b、C5a、C3a、C4a、C5b、C6、C7、C8、C9、CR1、CR2、CR3、CR4、C1qR、C1INH、C4bp、MCP、DAF、H、I、P及CD59；或诱导的靶标基因，包括例如β-防御素；细胞表面蛋白；或人类佐剂蛋白，包括trif、flt-3配体、Gp96或纤连蛋白等；或以上人类佐剂蛋白中任一者的任何物种同源物。此外，HGMB1可用作佐剂蛋白。
此外，哺乳动物、特别是人类佐剂蛋白可包括诱导或增强先天性免疫应答的细胞因子，包括IL-1α、IL1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、TNFα、IFNα、IFNβ、IFNγ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF；趋化因子，包括IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、CCL21；由巨噬细胞释放的细胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-8、IL-12及TNF-α；以及IL-1R1及IL-1α。
因此，在本文中，特别优选地，至少一种RNA编码至少一种先天性免疫活化剂、优选佐剂蛋白、更优选人类佐剂蛋白，或其片段或变体。
在本文中，特别优选地，佐剂蛋白的I组成型活性变体(优选RIG-1的组成型活性变体(ΔRIGI))由至少一种RNA编码。
在另一个优选实施方案中，至少一种RNA编码作为先天性免疫活化剂的HGMB1，或其片段或变体。
在本发明的情形中，根据优选实施方案，先天性免疫活化剂可选自选自由以下组成的组的任何先天性免疫活化剂：CD55、Akt、ATF2、C1QBP、C1QC、Cardif、CCL11、CCL2、CCL21、CCL3、CCL5、CD59,β-防御素、Cdc42、CFAD、CFAH、CFAI、CH60、CIITA、c-Jun、c-myc、CO8A、CO8B、CO8G、补体系统组分C1INH、补体系统组分C1qR、补体系统组分C1s、补体系统组分C4bp、补体系统组分C6、补体系统组分C7、补体系统组分C8、补体系统组分C9、补体系统组分CR2、补体系统组分CR3、补体系统组分MASP-1、补体系统组分MASP-2、补体系统组分MBL、补体系统组分MCP、CREB3、CREB3L1、CREB3L3、CREB3L4、CREB5、CRTC2、CXCL10、CXCL8、DJB11、DJB13、DJB14、DJC10、DJC12、DJC14、DJC15、DJC16、DJC17、DJC18、DJC22、DJC24、DJC25、DJC27、DJC28、DJC30、DNAJB12、DNAJC11、DNAJC21、DNJA1、DNJA2、DNJA3、DNJA4、DNJB1、DNJB2、DNJB3、DNJB4、DNJB5、DNJB6、DNJB7、DNJB8、DNJB9、DNJC1、DNJC2、DNJC3、DNJC4、DNJC5、DNJC7、DNJC8、DNJC9、Elk-1、ERK1、ERK2、纤维蛋白原、纤连蛋白、FLT3配体、FOS、G-CSF、GM-CSF、GRP94(gp96)、GSK3A、GSK3B、HS71A、HS71B、HSC70、HSP10、HSP60、HSP70、HSP75、HSP90、HSP90B1、IFNα、IFNB、IFNG、IKK、IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-18、IL-1R1、IL-2、IL-21、IL-23、IL-6、IL-7、IL-9、IRAK1、IRAK2、IRAK4、IRF3、IRF-7、JNK、KPCB、KPCD、KPCD1、KPCD3、KPCE、KPCG、KPCI、KPCL、KPCT、KPCZ、l_IPAF、LGP2、M-CSF、MDA5、MK11、MK12、MK13、MK14、MKK1、MKK3、MKK4、MKK6、MKK7、MSTP104、MyD88、NALP10、NALP11、NALP12、NALP13、NALP2、NALP3、NALP4、NALP5、NALP6、NALP7、NALP8、NALP9、NF-κB、NLRP14、NOD1、NOD2、NOD3、PI3K、PKD2、PKN1、PKN2、PKN3、PRKCA、PRKD2、Rab、Rac1、RASH、RASK、RASN、RhoA、RIG-I、Src激酶；表面蛋白A；表面蛋白D、TAK1、TBK1、TICAM1、TICAM2、TIRAP、TLR1、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TRAF6，优选如表11中所公开的。在本文中，特别优选的是根据表11的编码先天性免疫活化剂的RNA序列。
表11：先天性免疫活化剂(人类佐剂蛋白)
根据本发明，在一个更优选的实施方案中，本发明组合物包括至少一种RNA(优选mRNA)，其包括编码至少一种先天性免疫活化剂(或其片段或变体)的至少一个编码区，其中所述至少一个编码区包括这样的RNA序列：其与根据如表11公开的SEQ ID Nos的RNA序列相同或至少50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
13.抗体、诱饵受体和显性负性受体：
根据一个优选实施方案，本发明含有RNA的组合物的至少一种RNA编码至少一种抗体和/或至少一种显性负性受体/或至少一种诱饵受体或其片段或变体，其调节(例如，抑制)与肿瘤或癌症进展相关的蛋白质或信号传导途径的功能。特别优选地，含有RNA的组合物包括至少一种编码特定抗体或其片段或变体的重链的RNA及至少一种编码相同特定抗体或其片段或变体的轻链的其它RNA。
在本文中，特别优选的是根据表12的抗体。
表12：针对与肿瘤或癌症进展相关的蛋白质的抗体
优选地，中和抗体选自抗IL-10及抗TGFβ的列表。
此外，至少一种抗体优选可选自抗CD73抗体或其片段或变体。
在另外的特别优选实施方案中，至少一种抗体选自针对CCR5/CD195的抗体或选自针对其配体CCL5/RANTES的抗体。
在一个特别优选的实施方案中，诱饵受体是可溶CCR5(趋化因子受体5型，也称为CD195)。
在一个特别优选的实施方案中，显性负性受体是显性负性CCR5(趋化因子受体5型，也称为CD195)。
此外，至少一种抗体优选可选自抗CD73抗体或其片段或变体。
14.骨髓源性抑制细胞(MDSC)抑制剂
骨髓源性抑制细胞(MDSC)是在癌症及相关病症中增加的未成熟骨髓细胞的异质群体。MDSC由肿瘤分泌的生长因子诱导。MDSC经由若干机制在抑制宿主免疫应答中起到重要作用。另外，MDSC也可促进血管生成及肿瘤侵袭。因此，MDSC抑制是治疗癌症及相关病症的策略。
在本发明的情形中，MDSC抑制可通过直接去活化MDSC(例如抗IL-17抗体)、通过阻断MDSC向成熟细胞的分化(例如IL-12)、通过阻断MDSC的细胞发育或通过耗尽MDSC(例如细胞毒性剂)而实现。
因此，特别优选地，使用抗IL-17抗体和IL-12作为MDSC抑制剂。
15.IDO途径抑制剂
在本发明含有RNA的组合物的进一步优选实施方案中，RNA(优选mRNA)编码至少一种IDO途径抑制剂。优选地，编码至少一种IDO途径抑制剂的RNA编码了IDO途径的抑制性蛋白或显性负突变蛋白。
如Prendergast等人(Prendergast GC,Smith C,Thomas S,Mandik-Nayak L,Laury-Kleintop L,Metz R,Muller AJ.Indoleamine 2,3-dioxygenase pathways ofpathogenic inflammation and immune escape in cancer.CancerImmunol.Immunother.2014 Jul；63(7):721-35)所综述，吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶(IDO或INDO EC 1.13.11.52)是人类中由IDO1基因编码的酶。该酶催化必需氨基酸L-色氨酸向N-甲酰基犬尿氨酸的降解。IDO是经由犬尿氨酸途径使色氨酸分解代谢的第一且限速酶，因此导致色氨酸的耗尽，这能够导致微生物以及T细胞停止生长。IDO是由一些可替代性活化的巨噬细胞和其它免疫调节细胞产生的免疫调节酶(也由许多肿瘤用作免疫颠覆策略)。IDO抑制剂的临床开发可产生在治疗晚期人类癌症中具有广泛应用的一类新颖免疫调节剂。
16.与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽
细胞凋亡是紧密调节的细胞过程且细胞凋亡的错误调节是人类癌症的标志。已寻求目标为恢复肿瘤细胞中的细胞凋亡的靶向关键细胞凋亡调节因子以作为新颖癌症治疗策略。XIAP、cIAP1和cIAP2，即细胞凋亡蛋白质抑制剂(IAP)的成员，是细胞死亡和存活的重要调节因子且是新颖癌症疗法的诱人靶标。SMAC/DIABLO蛋白质是XIAP、cIAP1和cIAP2的内源性拮抗剂。在过去十年中，密集研究工作已产生了若干小分子SMAC模拟物的设计和开发，所述模拟物现处于用于癌症治疗的临床试验中。
在另一个优选实施方案中，本发明组合物包括至少一种RNA，所述至少一种RNA包括至少一个编码区，所述至少一个编码区编码至少一种肽或蛋白质，所述至少一种肽或蛋白质与细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP)结合并因此使癌细胞对细胞凋亡死亡敏感。
因此，特别优选地，本发明含有RNA的组合物的至少一种RNA编码与细胞凋亡抑制剂结合的至少一种蛋白质或肽(诸如SMAC模拟物)。
根据本发明，与IAP结合的特别优选的蛋白质或肽包括Omi/HtrA2、Smac、Smac衍生肽、Smac/DIABLO和XAF1(XIAP相关因子1)及其片段或变体。
RNA修饰
根据一个实施方案，组合物的至少一种RNA(其编码本文定义的至少一种蛋白质和/或肽)可以呈修饰的RNA的形式，其中本文定义的任何修饰可被引入到组合物的至少一种RNA中。本文定义的修饰优选地导致本发明的组合物的至少一种RNA的稳定化。
根据一个实施方案，本发明的组合物的至少一种RNA可以因此作为“稳定化的RNA”被提供，也就是说作为基本上耐受体内降解(例如通过核酸外切酶或核酸内切酶)的RNA被提供。这种稳定化可以例如通过本发明的组合物的至少一种RNA的修饰的磷酸主链来实现。与本发明相联系的主链修饰是这样的修饰：其中RNA中所含的核苷酸的主链的磷酸酯被化学修饰。可以优选用于这方面的核苷酸包括例如硫代磷酸酯修饰的磷酸主链，优选磷酸主链中所含的至少一个磷酸氧被硫原子置换。稳定化的RNA可进一步包括，例如：非离子型磷酸酯类似物，诸如，例如烷基和芳基膦酸酯，其中带电荷的磷酸氧被烷基基团或芳基基团置换，或者磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧残基以烷基化形式存在。这种主链修饰典型地包括，但不限于，来自由以下组成的组的修饰：甲基膦酸酯，氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(例如胞苷-5’-O-(1-硫代磷酸酯))。
在下文中，描述优选能够“稳定化”如本文所定义的至少一种RNA的具体修饰。
化学修饰：
本文使用的术语“RNA修饰”可以是指包括主链修饰以及糖修饰或碱基修饰的化学修饰。
在本文中，本文定义的修饰的RNA可含有核苷酸类似物/修饰，例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。与本发明相联系的主链修饰是这样的修饰：其中本文定义的RNA中所含的核苷酸的主链的磷酸酯被化学修饰。与本发明相联系的糖修饰是本文定义的RNA的核苷酸的糖的化学修饰。此外，与本发明相联系的碱基修饰是RNA的核苷酸的碱基部分的化学修饰。在本文中，核苷酸类似物或修饰优选选自适用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。
糖修饰：
可并入至本文所述的修饰的RNA中的修饰的核苷及核苷酸可在糖部分中进行修饰。例如，2’羟基(OH)可经多个不同“氧基”或“脱氧”取代进行修饰或置换。“氧基”-2’羟基修饰的实例包括但不限于：烷氧基或芳氧基(-OR，例如，R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁”核酸(LNA)，其中2’羟基例如通过亚甲基桥连接至同一核糖的4’碳；和氨基基团(-O-氨基，其中氨基基团(例如，NRR)可为烷氨基、二烷氨基、杂环基、芳氨基、二芳氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)或氨基烷氧基。
“脱氧”修饰包括氢、氨基(例如，NH2；烷氨基、二烷氨基、杂环基、芳氨基、二芳氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；或氨基基团可通过接头连接至糖，其中接头包括原子C、N及O中的一者或多者。
糖基团也可含有一个或多个碳，其具有与核糖中的对应碳的立体化学构型相比相反的立体化学构型。因此，修饰的RNA可包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
主链修饰：
磷酸酯主链可进一步在可并入至本文所述的经修饰的RNA中的经修饰的核苷及核苷酸中进行修饰。主链的磷酸酯基团可通过用不同取代基置换一个或多个氧原子来进行修饰。此外，修饰的核苷及核苷酸可包括用本文所述的修饰的磷酸酯完全置换未修饰的磷酸酯部分。修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐(borano phosphate)、硼烷磷酸酯(borano phosphate ester)、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非键联氧均经硫置换。磷酸酯接头也可通过用氮(桥接氨基磷酸酯)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基-膦酸酯)置换键联氧来进行修饰。
碱基修饰：
可并入至本文所述的修饰的RNA中的修饰的核苷及核苷酸可在核碱基部分中进行修饰。发现于RNA中的核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶。例如，本文所述的核苷及核苷酸可在大沟(major groove)面上经化学修饰。在一些实施方案中，大沟化学修饰可包括氨基、硫醇基、烷基或卤基。
在本发明的特别优选实施方案中，核苷酸类似物/修饰选自碱基修饰，其优选选自：2-氨基-6-氯嘌呤核糖核苷-5’-三磷酸酯，2-氨基嘌呤-核糖核苷-5’-三磷酸酯；2-氨基腺苷-5’-三磷酸酯，2’-氨基-2’-脱氧胞苷-三磷酸酯，2-硫代胞苷-5’-三磷酸酯，2-硫代尿苷-5’-三磷酸酯，2’-氟胸苷-5’-三磷酸酯，2’-O-甲基肌苷-5’-三磷酸酯，4-硫代尿苷-5’-三磷酸酯，5-氨基烯丙基胞苷-5’-三磷酸酯，5-氨基烯丙基尿苷-5’-三磷酸酯，5-溴胞苷-5’-三磷酸酯，5-溴尿苷-5’-三磷酸酯，5-溴-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯，5-溴-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸酯，5-碘胞苷-5’-三磷酸酯，5-碘-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯，5-碘尿苷-5’-三磷酸酯，5-碘-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸酯，5-甲基胞苷-5’-三磷酸酯，5-甲基尿苷-5’-三磷酸酯，5-丙炔基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯，5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸酯，6-氮胞苷-5’-三磷酸酯，6-氮尿苷-5’-三磷酸酯，6-氯嘌呤核糖核苷-5’-三磷酸酯，7-脱氮腺苷-5’-三磷酸酯，7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸酯，8-氮腺苷-5’-三磷酸酯，8-叠氮腺苷-5’-三磷酸酯，苯并咪唑-核糖核苷-5’-三磷酸酯，N1-甲基腺苷-5’-三磷酸酯，N1-甲基鸟苷-5’-三磷酸酯，N6-甲基腺苷-5’-三磷酸酯，O6-甲基鸟苷-5’-三磷酸酯，假尿苷-5’-三磷酸酯，或嘌呤霉素-5’-三磷酸酯，黄苷-5’-三磷酸酯。特别优选的是选自由以下组成的碱基修饰的核苷酸的群组的碱基修饰用核苷酸：5-甲基胞苷-5’-三磷酸酯，7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸酯，5-溴胞苷-5’-三磷酸酯，和假尿苷-5’-三磷酸酯。
在一些实施方案中，修饰的核苷包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、l-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。
在一些实施方案中，修饰的核苷包括5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮杂-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-l-甲基-假异胞苷。
在其它实施方案中，修饰的核苷包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。
在其它实施方案中，修饰的核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷(wyosine)、怀丁苷(wybutosine)、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、l-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
在一些实施方案中，核苷酸可在大沟面上进行修饰且可包括用甲基或卤基置换尿嘧啶的C-5上的氢。
在特定实施方案中，修饰的核苷是5’-O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-鸟苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷或5’-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷。
在其它特定实施方案中，修饰的RNA可包括选自以下的核苷修饰：6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷。
脂质修饰：
根据进一步实施方案，本文定义的修饰的RNA可以含有脂质修饰。该脂质修饰的RNA典型地包括本文定义的RNA。该脂质修饰的RNA典型地还包括与所述RNA共价连接的至少一种接头和与相应的接头共价连接的至少一种脂质。备选地，脂质修饰的RNA包括本文定义的至少一种RNA和与所述RNA共价连接(在没有接头的情况下)的至少一种(双功能)脂质。根据第三备选方案，脂质修饰的RNA包括本文定义的RNA分子，与所述RNA共价连接的至少一种接头，和与相应的接头共价连接的至少一种脂质，以及同样与所述RNA共价连接(在没有接头的情况下)的至少一种(双功能)脂质。在本文中，特别优选的是脂质修饰存在于线性RNA序列的末端。
G/C含量优化：
根据本发明的一个特别优选的实施方案，本发明组合物的RNA是修饰的。优选地，RNA通过修饰及优选增加其编码区的RNA的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量来稳定化。其中，与其特定野生型编码序列(即，未修饰的RNA)的编码区的G/C含量相比，编码区的RNA的G/C含量增加。然而，与特定野生型/未修饰的RNA的所编码氨基酸序列相比，所述RNA的所编码氨基酸优选不改变。
本发明组合物的RNA的G/C含量的修饰是基于这样的事实：与具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的RNA序列相比，具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的RNA序列更稳定。编码序列或整个RNA的密码子因此有别于野生型编码序列或RNA，以致其包含增加量的G/C核苷酸同时保持翻译的氨基酸序列。关于若干密码子编码同一种氨基酸(所谓的遗传密码的简并性)的事实，可以确定对稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用(alternativecodon usage))。取决于由所述至少一种RNA编码的氨基酸，RNA序列的修饰与其野生型序列相比存在多种可能性。在由仅包含G或C核苷酸的密码子编码的氨基酸的情况中，不需要改变密码子。因此，Pro的密码子(CCC或CCG)，Arg的密码子(CGC或CGG)，Ala的密码子(GCC或GCG)和Gly的密码子(GGC或GGG)不需要改变，因为不存在A或U。与此对比，含有A和/或U核苷酸的密码子可以通过置换成编码相同氨基酸但不含有A和/或U的其它密码子而被改变。这些的实例是：Pro的密码子可以由CCU或CCA改变成CCC或CCG；Arg的密码子可以由CGU或CGA或AGA或AGG改变成CGC或CGG；Ala的密码子可以由GCU或GCA改变成GCC或GCG；Gly的密码子可以由GGU或GGA改变成GGC或GGG。在其它情况中，虽然不能将A或U核苷酸从密码子中排除，然而可能的是通过使用含有较低含量的A和/或U核苷酸的密码子而降低A和U含量。这些的实例是：Phe的密码子可以由UUU改变成UUC；Leu的密码子可以由UUA、UUG、CUU或CUA改变成CUC或CUG；Ser的密码子可以由UCU或UCA或AGU改变成UCC、UCG或AGC；Tyr的密码子可以由UAU改变成UAC；Cys的密码子可以由UGU改变成UGC；His的密码子可以由CAU改变成CAC；Gln的密码子可以由CAA改变成CAG；Ile的密码子可以由AUU或AUA改变成AUC；Thr的密码子可以由ACU或ACA改变成ACC或ACG；Asn的密码子可以由AAU改变成AAC；Lys的密码子可以由AAA改变成AAG；Val的密码子可以由GUU或GUA改变成GUC或GUG；Asp的密码子可以由GAU改变成GAC；Glu的密码子可以由GAA改变成GAG；终止密码子UAA可以改变成UAG或UGA。另一方面，在Met的密码子(AUG)和Trp的密码子(UGG)的情况中，不可能改变序列。以上列出的置换可以被单独地或以所有可能的组合用于使本发明的组合物的至少一种mRNA的G/C含量相比于其具体的野生型mRNA(即原序列)增加。因此，例如，存在于野生型序列中的Thr的所有密码子可以被改变成ACC(或ACG)。优选地，然而，例如，使用以上置换可能性的组合：
原序列(野生型mRNA)中编码Thr的所有密码子置换成ACC(或ACG)和
原来编码Ser的所有密码子置换成UCC(或UCG或AGC)；原序列中编码Ile的所有密码子置换成AUC和
原来编码Lys的所有密码子置换成AAG和
原来编码Tyr的所有密码子置换成UAC；原序列中编码Val的所有密码子置换成GUC(或GUG)和
原来编码Glu的所有密码子置换成GAG和
原来编码Ala的所有密码子置换成GCC(或GCG)和
原来编码Arg的所有密码子置换成CGC(或CGG)；原序列中编码Val的所有密码子置换成GUC(或GUG)和
原来编码Glu的所有密码子置换成GAG和
原来编码Ala的所有密码子置换成GCC(或GCG)和
原来编码Gly的所有密码子置换成GGC(或GGG)和
原来编码Asn的所有密码子置换成AAC；原序列中编码Val的所有密码子置换成GUC(或GUG)和
原来编码Phe的所有密码子置换成UUC和
原来编码Cys的所有密码子置换成UGC和
原来编码Leu的所有密码子置换成CUG(或CUC)和
原来编码Gln的所有密码子置换成CAG和
原来编码Pro的所有密码子置换成CCC(或CCG)；等。
优选地，与野生型RNA的编码区的G/C含量相比，根据本发明的至少一种RNA的编码区的G/C含量增加至少7％，更优选至少15％，特别优选至少20％。根据具体实施方案，在编码本文定义的蛋白质或肽或其片段或变体的区域或者野生型RNA序列或编码序列的整个序列中的可置换密码子中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％和最优选至少90％、95％或甚至100％被置换，由此增加所述序列的G/C含量。在本文中，特别优选的是，与野生型序列相比，增加本发明的组合物的至少一种RNA的G/C含量至最大(即，100％的可置换密码子)，特别是在编码区中。
根据本发明，组合物的至少一种RNA的编码序列的进一步优选的改变是基于这样的发现：翻译效率也取决于在细胞中tRNA的不同出现频率。因此，如果所谓的“稀有密码子”以增加的程度存在于本发明的组合物的至少一种RNA的至少一个编码区域中，那么与存在编码相对“常见的”tRNA的密码子的情况相比，对应的改变的至少一种RNA序列以显著较差的程度被翻译。根据本发明，在本发明的组合物的改变的至少一种RNA中，编码所述肽或蛋白质的区域相比于野生型RNA的对应区域被改变，以致编码在细胞中相对稀有的tRNA的至少一个野生型序列密码子被换成编码在所述细胞中相对常见且带有与所述相对稀有的tRNA相同的氨基酸的tRNA的密码子。通过此改变，本发明的组合物的至少一种RNA的至少一个编码区的序列被改变，以致对于常出现的tRNA可用的密码子被插入。换言之，根据本发明，通过此改变，编码在细胞中相对稀有的tRNA的所有野生型序列密码子可在所有情况下被换成这样的密码子：其编码在细胞中相对常见且在所有情况下带有与所述相对稀有的tRNA相同的氨基酸的tRNA。哪种tRNA在细胞中相对常见地出现以及与此对比，哪种tRNA在细胞中相对稀有地出现，是本领域技术人员已知的；参见例如Akashi,Curr.Opin.Genet.Dev.2001,11(6):660-666。使用最频繁出现的tRNA的特别的氨基酸的密码子，例如使用最频繁出现在(人)细胞中的tRNA的Gly密码子，是特别优选的。根据本发明，特别优选的是将本发明的组合物的改变的至少一种RNA中的增加的(特别是被最大化的)连续G/C含量与“常见的”密码子相结合，而不改变由所述RNA的编码区编码的蛋白质的氨基酸序列。该优选实施方案允许提供被特别有效地翻译和稳定化(修饰)的本发明的组合物的至少一种RNA。如上所述的本发明的组合物的改变的至少一种RNA的确定(增加的G/C含量；tRNA的交换)可以使用在WO02/098443中说明的计算机程序进行-所述专利文献的公开内容完整地结合在本发明中。使用此计算机程序，借助于遗传密码或其简并性可以改变任何所需编码RNA的核苷酸序列，以致产生最大G/C含量，结合使用编码在细胞中尽可能频繁出现的tRNA的密码子，相比于未改变的序列，由所述改变的至少一种RNA编码的氨基酸序列优选地没有改变。或者，还可能的是与原序列相比，仅改变G/C含量或仅密码子使用。VisualBasic 6.0(使用的开发环境：Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0，带Servicepack3)中的源代码也被描述于WO 02/098443中。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的组合物的至少一种RNA的核糖体结合位点的周围的A/U含量与其具体野生型RNA的核糖体结合位点的周围的A/U含量相比是增加的。此改变(核糖体结合位点附近增加的A/U含量)提高了核糖体与所述至少一种RNA结合的效率。核糖体与核糖体结合位点(Kozak序列：GCCGCCACCAUGG(SEQ ID NO:10.071)，AUG形成起始密码子)的有效结合又具有有效翻译所述至少一种RNA的作用。根据本发明的进一步实施方案，本发明的组合物的至少一种RNA可以关于潜在的不稳定序列元件而被改变。特别地，与具体的野生型RNA相比，该RNA的编码区和/或5’和/或3’未翻译区可以被改变，以使其不含有不稳定序列元件，改变的至少一种RNA的编码的氨基酸序列与其具体的野生型RNA相比优选不被改变。已知的是，例如，在真核RNA序列中存在不稳定序列元件(DSE)，信号蛋白与其结合并调节体内的RNA酶促降解。为了进一步稳定所述改变的至少一种RNA，任选地在编码本文定义的蛋白质或肽的区域中，可以因此进行相比于野生型RNA的对应区域的一种或多种此种改变，以致其中不含有或基本不含有不稳定序列元件。根据本发明，也可以通过此种改变将存在于未翻译区(3’-和/或5’-UTR)中的DSE从本发明的组合物的至少一种RNA中排除。此种不稳定序列是例如富AU序列(AURES)，其出现在许多不稳定的RNA的3’-UTR区段中(Caput等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1986,83:1670至1674)。因此，与野生型RNA相比，本发明的组合物的至少一种RNA优选地被改变，以致所述至少一种RNA不含有此种不稳定序列。这也适用于被可能的核酸内切酶识别的那些序列基序，例如序列GAACAAG，其包含在编码运铁蛋白受体的基因的3’-UTR区段中(Binder等,EMBO J.1994,13:1969至1980)。也优选将这些序列基序从本发明的组合物的至少一种RNA中移除。
对人类密码子使用的适应：
根据本发明，本发明的组合物的至少一种RNA的进一步优选修饰是基于这样的发现：编码相同氨基酸的密码子以不同频率出现。根据本发明，在本发明的组合物的所述改变的至少一种RNA中，编码上述定义的肽或蛋白质的一者的区域(编码序列)与野生型RNA的对应区域相比优选地被改变，以便编码相同氨基酸的密码子的频率对应于该密码子存在于人类编码使用中的天然存在频率，如例如表13中所显示的。
这意味着，例如，对于存在于根据本发明的编码的蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸丙氨酸(Ala)，野生型编码序列以这样的方式适应：密码子“GCC”以0.40的频率使用，密码子“GCT”以0.28的频率使用，密码子“GCA”以0.22的频率使用，且密码子“GCG”以0.10的频率使用，等(参见表13)。
表13：人类密码子使用表(最常见密码子标记有星号)
密码子优化：
根据一个特别优选的实施方案，优选的是编码在细胞中相对稀有的tRNA的本发明组合物的至少一种RNA的编码区的所有野生型序列密码子可在所有情况下被换成这样的密码子：其编码在细胞中相对常见且在所有情况下带有与所述相对稀有的tRNA相同的氨基酸的tRNA。因此，特别优选的是，最常见密码子用于每个编码的氨基酸(参见表13，最常见密码子标记有星号)。
这意味着，例如，对于存在于根据本发明的编码的肽或蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸丙氨酸(Ala)，野生型编码序列以这样的方式适应：最常见人类密码子“GCC”始终用于该氨基酸；或对于氨基酸半胱氨酸(Cys)，野生型序列以这样的方式适应：最常见人类密码子“TGC”始终用于该氨基酸，等。
C富集：
根据另一个实施方案，本发明的组合物的至少一种RNA可通过增加RNA的C含量、优选至少一种RNA的编码区的C含量而被修饰。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，本发明的组合物的至少一种RNA的编码区的C含量与其特定野生型RNA(即，未修饰的mRNA)的编码区的C含量相比是被修饰的(特别是增加的)。由至少一种RNA编码的氨基酸序列与由特定野生型RNA编码的氨基酸序列相比优选不被修饰。
在本发明的一个优选实施方案中，修饰的RNA被修饰以便实现理论上最大胞嘧啶含量的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％或至少90％或者甚至最大胞嘧啶含量。
在其它优选实施方案中，靶标RNA野生型序列的密码子的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％(其为“胞嘧啶含量可优化的”)被如存在于野生型序列中具有更高胞嘧啶含量的密码子置换。
在另一个优选实施方案中，野生型编码序列的一些密码子可另外地被修饰，以便在细胞中相对稀有tRNA的密码子被换成在细胞中相对常见tRNA的密码子，条件是相对常见tRNA的取代密码子携带与原始野生型密码子的相对稀有tRNA相同的氨基酸。优选地，相对稀有tRNA的所有密码子均被在细胞中相对常见tRNA的密码子置换，编码仅仅由不含有任何胞嘧啶的密码子编码的氨基酸的密码子除外，或者除了由两种各自含有相同数目胞嘧啶的密码子编码的谷氨酰胺(Gln)以外。
在本发明的另一优选实施方案中，修饰的靶标RNA被修饰，以便通过编码在细胞中相对常见tRNA的密码子实现理论上最大胞嘧啶含量的至少80％或至少90％或者甚至最大胞嘧啶含量，其中氨基酸序列保持无变化。
归因于遗传密码的天然存在的简并性，多于一种密码子可编码特定氨基酸。因此，20种天然存在的氨基酸中的18种由多于1种密码子编码(Tryp及Met除外)，例如由2种密码子(例如Cys、Asp、Glu)、三种密码子(例如Ile)、4种密码子(例如Al、Gly、Pro)或6种密码子(例如Leu、Arg、Ser)编码。然而，并非所有编码相同氨基酸的密码子均在体内条件下同样频繁地使用。取决于各单一生物体，确立典型密码子使用概况。
如本发明的情形内所用，术语“胞嘧啶含量可优化密码子(cytosine content-optimizable codon)”是指这样的密码子：其与编码相同氨基酸的其它密码子相比展现出较低量的胞嘧啶。因此，可由编码相同氨基酸且在该密码子内展现更高数目胞嘧啶的另一个密码子置换的任何野生型密码子均视为胞嘧啶可优化的(C可优化)。C可优化野生型密码子经野生型编码区内的特定C优化密码子的任何该取代增加了其总体C含量且反映了C富集的修饰的RNA序列。C最大化RNA序列含有C优化密码子，针对所有潜在C可优化密码子。因此，在该条件下，理论上可置换的C可优化密码子的100％或全部实际上在编码区的整个长度上被C优化密码子置换。
在本文中，胞嘧啶含量可优化密码子是这样的密码子：其与编码相同氨基酸的其它密码子相比含有较低数目的胞嘧啶。
密码子GCG、GCA、GCU中的任一者编码氨基酸Ala，该密码子可被换成编码相同氨基酸的密码子GCC，和/或
编码Cys的密码子UGU可被换成编码相同氨基酸的密码子UGC，和/或
编码Asp的密码子GAU可被换成编码相同氨基酸的密码子GAC，和/或
编码Phe的密码子UUU可被换成编码相同氨基酸的密码子UUC，和/或
编码Gly的密码子GGG、GGA、GGU可被换成编码相同氨基酸的密码子GGC，和/或
编码His的密码子CAU可被换成编码相同氨基酸的密码子CAC，和/或
编码Ile的密码子AUA、AUU中的任一者可被换成密码子AUC，和/或
编码Leu的密码子UUG、UUA、CUG、CUA、CUU中的任一者可被换成编码相同氨基酸的密码子CUC，和/或
编码Asn的密码子AAU可被换成编码相同氨基酸的密码子AAC，和/或
编码Pro的密码子CCG、CCA、CCU中的任一者可被换成编码相同氨基酸的密码子CCC，和/或
编码Arg的密码子AGG、AGA、CGG、CGA、CGU中的任一者可被换成编码相同氨基酸的密码子CGC，和/或
编码Ser的密码子AGU、AGC、UCG、UCA、UCU中的任一者可被换成编码相同氨基酸的密码子UCC，和/或
编码Thr的密码子ACG、ACA、ACU中的任一者可被换成编码相同氨基酸的密码子ACC，和/或
编码Val的密码子GUG、GUA、GUU中的任一者可被换成编码相同氨基酸的密码子GUC，和/或
编码Tyr的密码子UAU可被换成编码相同氨基酸的密码子UAC。
在以上情况中的任一者中，胞嘧啶的数目在每个交换的密码子中增加1。编码区的所有非C优化密码子(对应于C可优化密码子)的交换产生了C最大化编码序列。在本发明的情形中，非C优化密码子的至少70％被野生型序列的C优化密码子置换，被编码区内的C优化密码子的优选至少80％、更优选至少90％置换。
可优选的是，对于一些氨基酸，被C优化密码子置换的C可优化密码子的百分比小于70％，而对于其它氨基酸，置换的密码子的百分比高于70％以满足C优化的总体百分比为编码区的所有C可优化野生型密码子的至少70％。
优选地，在本发明的C优化RNA中，对于任何给定氨基酸，C可优化野生型密码子的至少50％被C优化密码子置换，例如任何修饰的C富集RNA优选在C可优化野生型密码子位置处含有至少50％、优选至少60％的C优化密码子，其编码上文提及的氨基酸Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val及Tyr中的任何单一者。
在本文中，编码胞嘧啶含量不可优化且然而由至少两种密码子编码的氨基酸的密码子可在无任何其它选择过程的情况下使用。然而，编码在细胞(例如人类细胞)中相对稀有tRNA的野生型序列的密码子可被换成编码在细胞中相对常见tRNA的密码子，由此两者编码相同氨基酸。因此，编码Glu的相对稀有密码子GAA可被换成编码相同氨基酸的相对常见密码子GAG，和/或
编码Lys的相对稀有密码子AAA可被换成编码相同氨基酸的相对常见密码子AAG，和/或
编码Gln的相对稀有密码子CAA可被换成编码相同氨基酸的相对常见密码子CAG，和/或
在本文中，仅由一种密码子编码的氨基酸Met(AUG)和Trp(UGG)各自保持无变化。终止密码子不经胞嘧啶含量优化，然而，相对稀有终止密码子琥珀、赭石(UAA、UAG)可被换成相对常见终止密码子乳白(UGA)。
以上列出的取代显然可个别地以及以所有可能组合形式使用，以便与野生型RNA序列相比优化修饰的RNA的胞嘧啶含量。
因此，与野生型RNA的编码区相比，修饰的RNA的编码肽或蛋白质的区域可以以这样的方式改变：由至少两种或多种密码子编码的氨基酸，其中的一个包括一个额外胞嘧啶，该种密码子可被换成包括一个额外胞嘧啶的C优化密码子，由此氨基酸与野生型序列相比是不变的。
碱基的置换、添加或消除优选地使用用于制备核酸分子的DNA基质通过已知的定向诱变技术或利用寡核苷酸连接进行。在此种方法中，为了制备本文定义的至少一种RNA，可以在体外对对应的DNA分子进行转录。该DNA基质优选地包括适用于体外转录的启动子，例如T7或SP6启动子，其之后是用于要制备的至少一种RNA的所需核苷酸序列和用于体外转录的终止信号。形成目标的至少一种RNA的基质的DNA分子可以通过发酵增殖及随后作为可在细菌中复制的质粒的部分的分离来制备。可被提及为适用于本发明的质粒有例如质粒pT7Ts(GenBank登录编号U26404；Lai等,Development 1995,121:2349至2360)，系列，例如-1(GenBank登录编号X65300；来自Promega)和pSP64(GenBank登录编号X65327)；也参见Mezei和Storts,Purification of PCR Products,于:Griffin和Griffin(ed.),PCRTechnology:Current Innovation,CRC Press,Boca Raton,FL,2001。
片段和变体
在本发明的除此处所公开以外的情形下，并入展示一定程度的序列同一性的肽和蛋白质。因此，本文定义的蛋白质和肽的片段和变体在本发明的情形下公开于此。
此外，本文定义的核酸的片段和变体因此在本发明的情形下公开于此。
单-双-多顺反子自身裂解肽等：
本发明组合物的至少一种RNA的编码区可作为单顺反子、双顺反子或甚至多顺反子RNA(即，携带一种、两种或多种蛋白质或肽的编码序列的RNA序列)存在。双顺反子或甚至多顺反子RNA的这种编码序列可由至少一个内部核糖体进入位点(IRES)序列隔开。因此，根据本发明的至少一种RNA可进一步包括一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)序列或IRES基序，其可隔开若干开放阅读框，尤其在RNA编码两种或多种肽或蛋白质(双顺反子或多顺反子RNA)时。例如，内部核糖体进入位点序列可来源于脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)或口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)。此外，可使用自身裂解信号肽，其诱导包含若干蛋白质或肽的所得多肽的裂解，例如来源于来自FMDV的F2A肽的自身裂解信号肽序列。
不同编码序列的组合
在一个优选实施方案中，本发明组合物包括至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种RNA，每一个包括至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、或更多个编码区，所述编码区编码至少一种或多种如上文所定义的细胞因子、和/或至少一种或多种如上文所定义的趋化因子、和/或至少一种或多种如上文所定义的自杀基因产物、和/或至少一种或多种如上文所定义的免疫原性肽或蛋白质、和/或至少一种或多种如上文所定义的细胞凋亡诱导剂、和/或至少一种或多种如上文所定义的血管生成抑制剂、和/或至少一种或多种如上文所定义的热休克蛋白、和/或至少一种或多种如上文所定义的肿瘤抗原、和/或至少一种或多种如上文所定义的β-联蛋白抑制剂、和/或至少一种或多种如上文所定义的STING途径活化剂、和/或至少一种或多种如上文所定义的检查点调节剂、和/或至少一种或多种先天性免疫活化剂、和/或至少一种或多种如上文所定义的抗体、和/或至少一种显性负性受体和/或至少一种或多种诱饵受体、和/或至少一种或多种骨髓源性抑制细胞(MDSC)抑制剂、和/或至少一种或多种IDO途径抑制剂、和/或至少一种或多种如上文所定义的与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽，或其变体或片段。
非翻译区(UTR)
通过进一步的实施方案，本发明组合物的至少一种RNA优选包括以下结构元件中的至少一者：5’-和/或3’-非翻译区元件(UTR元件)，优选包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成的5’-UTR元件：所述核酸序列来源于TOP基因的5’-UTR或其片段、同源物或变体，或者可来源于提供稳定mRNA的基因或其同源物、片段或变体的5’-和/或3’-UTR元件；组蛋白茎环结构，优选其3’非翻译区中的组蛋白茎环；5’-帽结构；多聚A尾(多聚(A)序列)；或多聚(C)序列。
在一个优选实施方案中，至少一种RNA包括至少一个5’-或3’-UTR元件。在本文中，UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于任何天然存在的基因的5’-或3’-UTR或来源于基因的5’-或3’-UTR的片段、同源物或变体。优选地，根据本发明使用的5’-或3’-UTR元件与本发明组合物的RNA的编码区是异源的。即使来源于天然存在的基因的5’-或3’-UTR元件是优选的，合成工程改造的UTR元件也可用于本发明的情形中。
在一个特别优选的实施方案中，至少一种RNA包括至少一个5’非翻译区元件(5’-UTR元件)，其包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于TOP基因的5’-UTR或来源于TOP基因的5’-UTR的片段、同源物或变体。
特别优选的是，5’-UTR元件不包括如上文所定义的TOP基序或5’-TOP。
在一些实施方案中，来源于TOP基因的5’-UTR的5’-UTR元件的核酸序列在其3’端处结束于位于基因(其来源于该基因的mRNA)的起始密码子(例如，A(U/T)G)上游的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处的核苷酸。因此，5’-UTR元件不包括蛋白质编码区的任何部分。因此，优选地，本发明组合物的mRNA的唯一蛋白质编码部分由编码区提供。
来源于TOP基因的5’-UTR的核酸序列优选来源于真核生物TOP基因、优选植物或动物TOP基因、更优选脊索动物TOP基因、甚至更优选脊椎动物TOP基因、最优选哺乳动物TOP基因(诸如，人类TOP基因)。
例如，5’-UTR元件优选选自包含这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成的5’-UTR元件：所述核酸序列来源于：选自由专利申请WO2013/143700(其公开内容以引用的方式并入本文中)的SEQ ID Nos.1-1363、SEQ ID NO.1395、SEQ ID NO.1421和SEQ ID NO.1422组成的组的核酸序列，专利申请WO2013/143700的SEQ ID Nos.1-1363、SEQ ID NO.1395、SEQ ID NO.1421和SEQ ID NO.1422的同源物，其变体，或优选对应的RNA序列。术语“专利申请WO2013/143700的SEQ ID Nos.1-1363、SEQ ID NO.1395、SEQ ID NO.1421和SEQ IDNO.1422的同源物”是指不为智人的物种的序列，其与根据专利申请WO2013/143700的SEQID Nos.1-1363、SEQ ID NO.1395、SEQ ID NO.1421和SEQ ID NO.1422的序列是同源的。
在一个优选实施方案中，5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于从以下各者的核苷酸位置5(即，位于序列中的位置5处的核苷酸)延伸至直接位于起始密码子的5’(位于序列的3’端)的核苷酸位置的核酸序列(例如，直接位于ATG序列的5’的核苷酸位置)：选自专利申请WO2013/143700的SEQ ID Nos.1-1363、SEQID NO.1395、SEQ ID NO.1421和SEQ ID NO.1422的核酸序列，专利申请WO2013/143700的SEQ ID Nos.1-1363、SEQ ID NO.1395、SEQ ID NO.1421和SEQ ID NO.1422的同源物，其变体，或对应的RNA序列。在一个特别优选的实施方案中，5’-UTR元件来源于这样的核酸序列：所述核酸序列从以下各者的直接位于5’-TOP的3’的核苷酸位置延伸至直接位于起始密码子的5’(位于序列的3’端)的核苷酸位置(例如，直接位于ATG序列的5’的核苷酸位置)：选自专利申请WO2013/143700的SEQ ID Nos.1-1363、SEQ ID NO.1395、SEQ ID NO.1421和SEQID NO.1422的核酸序列，专利申请WO2013/143700的SEQ ID Nos.1-1363、SEQ ID NO.1395、SEQ ID NO.1421和SEQ ID NO.1422的同源物，其变体，或对应的RNA序列。
在一个特别优选的实施方案中，5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于编码核糖体蛋白的TOP基因的5’-UTR或编码核糖体蛋白的TOP基因的5’-UTR的变体。例如，5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于以下各者的5’-UTR：如本文所述的根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NOs:67、170、193、244、259、554、650、675、700、721、913、1016、1063、1120、1138和1284-1360中的任一者的核酸序列，对应的RNA序列，其同源物，或其变体，优选不具有5’-TOP基序。如上文所述，从位置5延伸至直接位于ATG的5’的核苷酸(其位于序列的3’端处)的序列对应于该序列的5’-UTR。
优选地，5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于编码核糖体大蛋白(ribosomal large protein，RPL)的TOP基因的5’-UTR或编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5’-UTR的变体。例如，5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于以下各者的5’-UTR：如本文所述的根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NOs:67、259、1284-1318、1344、1346、1348-1354、1357、1358、1421和1422中的任一者的核酸序列，对应的RNA序列，其同源物，或其变体，优选不具有5’-TOP基序。
在一个特别优选的实施方案中，5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于以下各者的5’-UTR：核糖体蛋白大32基因、优选脊椎动物核糖体蛋白大32(L32)基因、更优选哺乳动物核糖体蛋白大32(L32)基因、最优选人类核糖体蛋白大32(L32)基因的5’-UTR，或者核糖体蛋白大32基因、优选脊椎动物核糖体蛋白大32(L32)基因、更优选哺乳动物核糖体蛋白大32(L32)基因、最优选人类核糖体蛋白大32(L32)基因的5’-UTR的变体，其中5’-UTR元件优选不包括该基因的5’-TOP。
5’-UTR元件的优选序列对应于专利申请WO2013/143700的SEQ ID No.1368。
因此，在一个特别优选的实施方案中，5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列与如上文所提及的核酸序列(根据SEQ ID NO.10.051(不具有5’端寡嘧啶序列的人类核糖体蛋白大32的5’-UTR：GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC；对应于专利申请案WO2013/143700的SEQ ID NO.1368))，或优选与对应的RNA序列，具有至少约20％、优选至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，或者其中至少一个5’-UTR元件包括这样的核酸序列的片段或由这样的核酸序列的片段组成：其与根据SEQ ID NO.10.052的核酸序列(或更优选与对应的RNA序列)具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，其中优选地，所述片段如上文所述，即为代表全长5’-UTR的至少20％等的一段连续核苷酸。
优选地，片段展现出至少约20个或更多个核苷酸、优选至少约30个或更多个核苷酸、更优选至少约40个或更多个核苷酸的长度。优选地，片段是如本文所述的功能片段。
在一些实施方案中，本发明组合物的mRNA包括5’-UTR元件，所述5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于以下各者的5’-UTR：脊椎动物TOP基因(诸如，哺乳动物(例如人类)TOP基因)，选自RPSA、RPS2、RPS3、RPS3A、RPS4、RPS5、RPS6、RPS7、RPS8、RPS9、RPS10、RPS11、RPS12、RPS13、RPS14、RPS15、RPS15A、RPS16、RPS17、RPS18、RPS19、RPS20、RPS21、RPS23、RPS24、RPS25、RPS26、RPS27、RPS27A、RPS28、RPS29、RPS30、RPL3、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPL9、RPL10、RPL10A、RPL11、RPL12、RPL13、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL27A、RPL28、RPL29、RPL30、RPL31、RPL32、RPL34、RPL35、RPL35A、RPL36、RPL36A、RPL37、RPL37A、RPL38、RPL39、RPL40、RPL41、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPLP3、RPLP0、RPLP1、RPLP2、EEF1A1、EEF1B2、EEF1D、EEF1G、EEF2、EIF3E、EIF3F、EIF3H、EIF2S3、EIF3C、EIF3K、EIF3EIP、EIF4A2、PABPC1、HNRNPA1、TPT1、TUBB1、UBA52、NPM1、ATP5G2、GNB2L1、NME2、UQCRB；或其同源物或变体；其中5’-UTR元件优选地不包括所述基因的TOP基序或5’-TOP，且其中5’-UTR元件任选地在其5’端处开始于位于5’寡嘧啶序列(TOP)下游的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处的核苷酸，且其中来源于TOP基因的5’-UTR的5’-UTR元件进一步任选地在其3’端处结束于位于基因(其来源于该基因)的起始密码子(A(U/T)G)上游的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处的核苷酸。
在进一步的特别优选实施方案中，5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于以下各者的5’-UTR：核糖体蛋白大32基因(RPL32)、核糖体蛋白大35基因(RPL35)、核糖体蛋白大21基因(RPL21)、ATP合成酶H+输送线粒体F1复合物α亚单位1心肌(ATP5A1)基因、羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、雄激素诱导1基因(AIG1)、细胞色素c氧化酶亚单位VIc基因(COX6C)或N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸神经酰胺酶)1基因(ASAH1)的5’-UTR或其变体；优选脊椎动物核糖体蛋白大32基因(RPL32)、脊椎动物核糖体蛋白大35基因(RPL35)、脊椎动物核糖体蛋白大21基因(RPL21)、脊椎动物ATP合成酶H+输送线粒体F1复合物α亚单位1心肌(ATP5A1)基因、脊椎动物羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、脊椎动物雄激素诱导1基因(AIG1)、脊椎动物细胞色素c氧化酶亚单位VIc基因(COX6C)或脊椎动物N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体；更优选哺乳动物核糖体蛋白大32基因(RPL32)、核糖体蛋白大35基因(RPL35)、核糖体蛋白大21基因(RPL21)、哺乳动物ATP合成酶H+输送线粒体F1复合物α亚单位1心肌(ATP5A1)基因、哺乳动物羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、哺乳动物雄激素诱导1基因(AIG1)、哺乳动物细胞色素c氧化酶亚单位VIc基因(COX6C)或哺乳动物N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体；最优选人类核糖体蛋白大32基因(RPL32)、人类核糖体蛋白大35基因(RPL35)、人类核糖体蛋白大21基因(RPL21)、人类ATP合成酶H+输送线粒体F1复合物α亚单位1心肌(ATP5A1)基因、人类羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、人类雄激素诱导1基因(AIG1)、人类细胞色素c氧化酶亚单位VIc基因(COX6C)或人类N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体；其中5’-UTR元件优选地不包括所述基因的5’-TOP。在本文中，特别优选的是包括根据SEQ ID Nos.10.051-10.054的核酸序列的5’-UTR元件。
因此，在一个特别优选的实施方案中，5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列与根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID No.1368或SEQID NOs 1412-1420的核酸序列(或对应的RNA序列)具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，或者其中至少一个5’-UTR元件包括这样的核酸序列的片段或由这样的核酸序列的片段组成：其与根据专利申请WO2013/143700的SEQ IDNo.1368或SEQ ID NOs1412-1420的核酸序列具有至少20％、优选至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，其中优选地，所述片段如上文所述，即为代表全长5’-UTR的至少20％等的一段连续核苷酸。优选地，片段展现出至少约20个或更多个核苷酸、优选至少约30个或更多个核苷酸、更优选至少约40个或更多个核苷酸的长度。优选地，片段是如本文所述的功能片段。
因此，在一个特别优选的实施方案中，5’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列与根据专利SEQ ID No.10.053(不具有5’端寡嘧啶序列的ATP5A1的5’-UTR：GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCG-GAGTAACTGCAAAG；对应于专利申请案WO2013/143700的SEQ ID No.1414(不具有5’端寡嘧啶序列的ATP5A1的5’-UTR)，或优选与对应的RNA序列，具有至少约20％、优选至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，或者其中至少一个5’-UTR元件包括这样的核酸序列的片段或由这样的核酸序列的片段组成：其与根据(专利申请WO2013/143700的)SEQ ID NO.26的核酸序列(或更优选与对应的RNA序列)具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，其中优选地，所述片段如上文所述，即为代表全长5’-UTR的至少20％等的一段连续核苷酸。优选地，片段展现出至少约20个或更多个核苷酸、优选至少约30个或更多个核苷酸、更优选至少约40个或更多个核苷酸的长度。优选地，片段是如本文所述的功能片段。
在进一步的优选实施方案中，本发明组合物的至少一种RNA进一步包括至少一个3’-UTR元件，所述3’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于：脊索动物基因、优选脊椎动物基因、更优选哺乳动物基因、最优选人类基因的3’-UTR；或来源于脊索动物基因、优选脊椎动物基因、更优选哺乳动物基因、最优选人类基因的3’-UTR的变体。
术语“3’-UTR元件”是指包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成的核酸序列：来源于3’-UTR或3’-UTR的变体。在本发明的意义上，3’-UTR元件可代表mRNA的3’-UTR。因此，在本发明的意义上，优选地，3’-UTR元件可为mRNA、优选人工mRNA的3’-UTR，或者其可为用于mRNA的3’-UTR的转录模板。因此，3’-UTR元件优选为对应于mRNA的3’-UTR、优选对应于人工mRNA(诸如通过遗传工程改造载体构建体的转录而获得的mRNA)的3’-UTR的核酸序列。优选地，3’-UTR元件满足3’-UTR的功能或编码满足3’-UTR的功能的序列。
优选地，本发明的mRNA包括可来源于涉及具有增加的半衰期(提供稳定mRNA)的mRNA的基因的3’-UTR元件，例如如下文所定义和描述的3’-UTR元件。优选地，3’-UTR元件是这样的核酸序列：其来源于基因(优选编码稳定mRNA的基因)的3’-UTR或该基因的同源物、片段或变体。
在一个特别优选的实施方案中，3’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于基因的3’-UTR，所述基因选自由以下组成的组：白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂肪氧合酶基因和胶原蛋白α基因(诸如胶原蛋白α1(I)基因)，或选自由以下组成的组的基因的3’-UTR的变体：白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂肪氧合酶基因及胶原蛋白α基因(诸如根据专利申请WO2013/143700(其公开内容以引用的方式并入本文中)的SEQ ID No.1369-1390的胶原蛋白α1(I)基因)。在一个特别优选的实施方案中，3’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于以下基因的3’-UTR：白蛋白基因、优选脊椎动物白蛋白基因、更优选哺乳动物白蛋白基因、最优选人类白蛋白基因、最优选根据SEQ ID NO.10063(根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID No:1369)的人类白蛋白基因。mRNA序列可包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于根据GenBank登录编号NM_000477.5的人类白蛋白基因的3’-UTR或其片段或变体。
在本文中，特别优选的是本发明组合物的mRNA包括3’-UTR元件，所述3’-UTR元件包括来源于根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID No.1369-1390的核酸的对应RNA序列或其片段、同源物或变体。
最优选地，3’-UTR元件包括这样的核酸序列：所述核酸序列来源于根据SEQ IDNO.10065(根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID No:1376)的人类白蛋白基因(白蛋白73’UTR)的片段。
在本文中，特别优选的是本发明组合物的至少一种RNA的3’-UTR元件包括以下或由以下组成：根据SEQ ID NO.10066的核酸序列的对应RNA序列。
在另一个特别优选的实施方案中，3’-UTR元件包括这样的核酸序列或由这样的核酸序列组成：所述核酸序列来源于以下各者的3’-UTR：α-球蛋白基因，优选脊椎动物α-或β-球蛋白基因，更优选哺乳动物α-或β-球蛋白基因，最优选根据SEQ ID NO.10055(对应于专利申请WO2013/143700的SEQ ID No.1370(智人血红蛋白α1(HBA1)的3’-UTR))或根据SEQID NO.10057(对应于专利申请WO2013/143700的SEQ ID No.1371(智人血红蛋白α2(HBA2)的3’-UTR))和/或根据SEQ ID NO.10059(对应于专利申请WO2013/143700的SEQ IDNo.1372(智人血红蛋白β(HBB)的3’-UTR))的人类α-或β-球蛋白基因。
例如，3’-UTR元件可包括以下或由以下组成：根据SEQ ID NO.10061(对应于专利申请WO2013/143700的SEQ ID No.1393)的α-球蛋白基因的3’-UTR的中心α-复合物结合部分。
在本文中，特别优选的是本发明组合物的RNA的3’-UTR元件包括以下或由以下组成：根据SEQ ID NO.10062、根据以上或其同源物、片段或变体的核酸序列的对应RNA序列。
术语“衍生自……基因的3’-UTR的核酸序列”优选是指这样的核酸序列：其基于……基因的3’-UTR序列或其一部分，诸如白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂肪氧合酶基因或胶原蛋白α基因(诸如胶原蛋白α1(I)基因)、优选白蛋白基因的3’-UTR或其一部分。此术语包括对应于基因的整个3’-UTR序列(即全长3’-UTR序列)的序列，和对应于基因的3’-UTR序列的片段的序列，诸如白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂肪氧合酶基因或胶原蛋白α基因(诸如胶原蛋白α1(I)基因))、优选白蛋白基因。
术语“衍生自……基因的3’-UTR的变体的核酸序列”优选是指这样的核酸序列：其基于……基因的3’-UTR序列的变体，诸如基于以下基因的3’-UTR的变体：白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂肪氧合酶基因或胶原蛋白α基因(诸如胶原蛋白α1(I)基因)、优选白蛋白基因，或以上描述的一部分。此术语包括对应于基因的3’-UTR的变体的整个序列的序列，即基因的全长变体3’-UTR序列；和对应于基因的变体3’-UTR序列的片段的序列。在本发明的情形中，片段优选地由一段连续核苷酸组成，所述核苷酸对应于全长变体3’-UTR中的一段连续核苷酸，其代表全长变体3’-UTR的至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少80％以及最优选至少90％。在本发明的意义上，所述变体的片段优选是本文所述变体的功能性片段。
优选地，至少一个5’-UTR元件和至少一个3’-UTR元件协同起作用以增加来自由如上文所述的本发明组合物的RNA的蛋白质产生。
组蛋白茎环：
在一个特别优选的实施方案中，本发明组合物的至少一种RNA包括组蛋白茎环序列/结构。所述组蛋白茎环序列优选选自如WO 2012/019780(其公开内容在此以引用的方式并入)中公开的组蛋白茎环序列。
适合用于本发明内的组蛋白茎环序列优选选自以下式(I)或(II)中的至少一个：
式(I)(不具有茎分界元件的茎环序列)：
式(II)(具有茎分界元件的茎环序列)：
其中：
茎1或茎2分界元件N1-6是1至6、优选地2至6、更优选地2至5、甚至更优选地3至5、最优选地4至5或5个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自：选自A、U、T、G和C的核苷酸，或其核苷酸类似物；
茎1[N0-2GN3-5]与元件茎2反向互补或部分反向互补，并且是5至7个核苷酸的连续序列；
其中N0-2是0至2、优选地0至1、更优选地1个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自：选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物；
其中N3-5是3至5、优选地4至5、更优选地4个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自：选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物，并且
其中G是鸟苷或其类似物，并且可以任选地被胞苷或其类似物代替，条件是其在茎2中的互补核苷酸胞苷被鸟苷代替；
环序列[N0-4(U/T)N0-4]位于元件茎1和茎2之间，并且是3至5个核苷酸、更优选地4个核苷酸的连续序列；
其中每个N0-4彼此独立地是0至4、优选地1至3、更优选地1至2个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自：选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物；并且
其中U/T表示尿苷，或任选地胸苷；
茎2[N3-5CN0-2]与元件茎1反向互补或部分反向互补，并且是5至7个核苷酸的连续序列；
其中N3-5是3至5、优选地4至5、更优选地4个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自：选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物；
其中N0-2是0至2、优选地0至1、更优选地1个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自：选自A、U、T、G或C的核苷酸或其核苷酸类似物；并且
其中C是胞苷或其类似物，并且可以任选地被鸟苷或其类似物代替，条件是其在茎1中的互补核苷酸鸟苷被胞苷替代；
其中茎1和茎2能够彼此碱基配对从而形成反向互补序列，其中碱基配对可以发生在茎1和茎2之间，例如通过核苷酸A和U/T或G和C的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或通过非沃森-克里克碱基配对(例如摆动(wobble)碱基配对、反向沃森-克里克碱基配对、Hoogsteen碱基配对、反向Hoogsteen碱基配对)，或者能够彼此碱基配对从而形成部分反向互补序列，其中不完全碱基配对可以发生在茎1和茎2之间，这基于以下，即一个茎中的一个或多个碱基在另一个茎的反向互补序列中不具有互补碱基。
根据本发明第一方面的另一个优选实施方案，本发明的mRNA序列可以包括根据以下具体式(Ia)或(IIa)中至少一个的至少一个组蛋白茎环序列：
式(Ia)(不具有茎分界元件的茎环序列)：
式(IIa)(具有茎分界元件的茎环序列)：
其中N、C、G、T和U是如以上所定义的。
根据所述第一方面的另一个更加优选的实施方案，至少一个RNA序列可以包括根据以下具体式(Ib)或(IIb)中至少一个的至少一个组蛋白茎环序列：
式(Ib)(不具有茎分界元件的茎环序列)：
式(IIb)(具有茎分界元件的茎环序列)：
其中N、C、G、T和U是如以上所定义的。
特别优选的组蛋白茎环序列是根据SEQ ID No:8的序列。
更优选地，茎环序列是根据SEQ ID NO:9的核酸序列的对应RNA序列。
多聚(A)
在一个特别优选的实施方案中，除了编码至少一种如上文所述的肽或蛋白质或其片段或变异体的编码区之外，本发明组合物的至少一种RNA优选在RNA的3’端处包含多聚(A)序列，也称为多聚A尾。当存在时，所述多聚(A)序列包括约25至约400个腺苷核苷酸的序列、优选约50至约400个腺苷核苷酸的序列、更优选约50至约300个腺苷核苷酸的序列、甚至更优选约50至约250个腺苷核苷酸的序列、最优选约60至约250个腺苷核苷酸的序列。在本文中，术语“约”是指其连接的值的±10％的偏差。此多聚(A)序列优选位于包含于根据本发明的RNA中的编码区的3’。
优选地，组合物的至少一种RNA中的多聚(A)序列是通过RNA体外转录而来源于DNA模板。或者，多聚(A)序列也可通用化学合成方法在体外获得，而不必自DNA起源转录。此外，多聚(A)序列或多聚(A)尾可通过使用可商购聚腺苷酸化试剂盒及本领域中已知的对应方案使至少一种RNA酶促聚腺苷酸化而产生。
或者，本发明组合物的至少一种RNA任选地包括聚腺苷酸化信号，其在本文中定义为这样的信号：其通过特异性蛋白因子(例如，裂解和聚腺苷酸化特异性因子(CPSF)、裂解刺激因子(CstF)、裂解因子I及II(CF I及CF II)、多聚(A)聚合酶(PAP))赋予(经转录)RNA以聚腺苷酸化。在本文中，共有聚腺苷酸化信号优选包括NN(U/T)ANA共有序列。在一个特别优选的方面，聚腺苷酸化信号包括以下序列之一：AA(U/T)AAA或A(U/T)(U/T)AAA(其中尿苷通常存在于RNA中且胸苷通常存在于DNA中)。
多聚(C)
根据进一步的优选实施方案，本发明组合物的RNA可由至少10个胞嘧啶、优选至少20个胞嘧啶、更优选至少30个胞嘧啶的序列(所谓的“多聚(C)序列”)修饰。特别地，RNA可以含有这样的多聚(C)序列：其典型地具有约10至200个胞嘧啶核苷酸，优选约10至100个胞嘧啶核苷酸，更优选地约10至70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优选地约20至50个或甚至20至30个胞嘧啶核苷酸。此多聚(C)序列优选位于编码区的3’，更优选位于包含于根据本发明的RNA中的任选多聚(A)序列的3’。
5’-帽
根据本发明的另一个优选实施方案，本文定义的修饰的RNA分子可通过添加所谓的“5’帽”结构进行修饰，该结构优选使如本文所述的RNA稳定。5’-帽是通常对成熟mRNA的5’端“加帽”的实体、典型地是修饰的核苷酸实体。5’-帽可典型地由修饰的核苷酸形成，特别由鸟嘌呤核苷酸的衍生物形成。优选地，5’-帽经由5’-5’三磷酸酯键联连接至5’端。5’-帽可经甲基化，例如m7GpppN，其中N为携带5’-帽的核酸的末端5’核苷酸，典型地mRNA的5’端。m7GpppN是这样的5’-帽结构：其天然存在于由聚合酶II转录的mRNA中且因此在本文中优选不视为包含于修饰的RNA中的修饰。因此，本发明中修饰的RNA可包括m7GpppN作为5’-帽，但另外地，修饰的RNA典型地包括至少一种如本文所定义的其它修饰。
5’-帽结构的另外实例包括甘油基，反向脱氧脱碱基残基(部分)，4’,5’亚甲基核苷酸，1-(β-D-赤式呋喃糖基)核苷酸，4’-硫代核苷酸，碳环核苷酸，1,5-脱水己糖醇核苷酸，L-核苷酸，α-核苷酸，修饰的碱基核苷酸，苏式戊呋喃糖基核苷酸，无环3’,4’-闭联核苷酸，无环3,4-二羟基丁基核苷酸，无环3,5-二羟基戊基核苷酸，3’-3’-反向核苷酸部分，3’-3’-反向脱碱基部分，3’-2’-反向核苷酸部分，3’-2’-反向脱碱基部分，1,4-丁二醇磷酸酯，3’-氨基磷酸酯，己基磷酸酯，氨基己基磷酸酯，3’-磷酸酯，3’硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯或桥接或非桥接甲基膦酸酯部分。这些修饰的5’-帽结构在本文中视为至少一种修饰。
特别优选的修饰的5’-帽结构是cap1(m7G的相邻核苷酸的核糖的甲基化)，cap2(m7G下游的第二核苷酸的核糖的额外甲基化)，cap3(m7G下游的第三核苷酸的核糖的额外甲基化)，cap4(m7G下游的第四核苷酸的核糖的甲基化)，ARCA(抗反向帽类似物，修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA)，肌苷，N1-甲基-鸟苷，2’-氟-鸟苷，7-脱氮-鸟苷，8-氧代-鸟苷，2-氨基-鸟苷，LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
分泌信号序列：
根据另一个特别优选的实施方案，组合物的至少一种RNA可以另外地或备选地编码分泌信号肽。此种信号肽是典型地显示约15至30个氨基酸的长度并且优选地位于编码的肽的N端的肽序列，但不限于此。如本文所定义的信号肽优选地允许将由组合物的至少一种RNA的至少一个编码序列编码的编码肽或蛋白质运输至限定的细胞区室中，优选地运输至细胞表面、内质网(ER)或核内体-溶酶体区室。如本文所定义的分泌信号肽序列的实例包括，但不限于，经典的或非经典的MHC分子的分泌信号序列(例如MHC I和II分子的信号序列，例如MHC I类分子HLA-A*0201的信号序列)，如本文所定义的细胞因子或免疫球蛋白的分泌信号序列，如本文所定义的免疫球蛋白或抗体的恒定链的分泌信号序列，Lamp1、Tapasin、Erp57、Calretikulin、钙联接蛋白及其它膜相关蛋白或与内质网(ER)或核内体-溶酶体区室相关的蛋白质的信号序列。
以上关于编码序列的修饰和/或关于如上文所定义的RNA的修饰中的任一者可应用于本发明的组合物的编码序列和/或RNA，且进一步应用于如在本发明的情形中使用的任何RNA，且可在适合或必需时以任何组合形式与彼此组合，其限制条件是这些修饰组合在各别至少一种RNA中不干扰彼此。本领域技术人员将能够因此进行其选择。
制备mRNA及RNA
RNA可使用本领域中已知的任何方法制备，该方法包括合成方法(RNA的化学合成)，诸如固相合成；以及体外方法，诸如RNA体外转录反应。
组合：
根据本发明，特别优选的是组合RNA编码的肽或蛋白质。在本文中，特别优选的是以下组合：
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种趋化因子的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种自杀基因产物的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种免疫原性蛋白质或肽的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种细胞凋亡诱导剂的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种血管生成抑制剂的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种热休克蛋白的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种肿瘤抗原的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种β-联蛋白抑制剂的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种STING途径活化剂的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种检查点调节剂的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种先天性免疫活化剂的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种抗体的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种诱饵受体的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种骨髓源性抑制细胞(MDSC)抑制剂的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种IDO途径抑制剂的RNA(优选mRNA)
·编码至少一种细胞因子的RNA(优选mRNA)+编码至少一种与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽的RNA(优选mRNA)
此外，特别优选的是以下实施方案：
-编码IL-2的RNA(优选mRNA)和/或编码IL-12的RNA(优选mRNA)+编码胸苷激酶的mRNA(方法：细胞因子+自杀基因产物)
-编码IL-2的RNA(优选mRNA)和/或编码IL-12的RNA(优选mRNA)
-编码IL-12的RNA(优选mRNA)和/或编码CD40L的RNA(优选mRNA)
-编码IL-15的RNA(优选mRNA)和/或编码IL-12的RNA(优选mRNA)
-编码IL-2的RNA(优选mRNA)+编码流感NP蛋白的mRNA
-编码IL-2的RNA(优选mRNA)+编码IL-12的RNA(优选mRNA)+编码细胞色素C/胱天蛋白酶3的RNA(优选mRNA)(细胞因子+细胞凋亡诱导)
-编码CD40L的RNA(优选mRNA)+编码IL-12的RNA(优选mRNA)+编码ΔRIGI的RNA(优选mRNA)
必须理解，本发明组合物的RNA分子可以编码一种或多种不同的肽或蛋白质(例如，如上所描述的细胞因子、趋化因子、自杀基因产物、免疫原性肽或蛋白质、细胞凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、热休克蛋白、肿瘤抗原、β-联蛋白抑制剂、STING途径活化剂、检查点调节剂、先天性免疫活化剂、抗体、显性负性受体和诱饵受体、骨髓源性抑制细胞(MDSC)抑制剂、IDO途径抑制剂、和与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽。若干RNA序列可组合于一种本发明含有RNA的组合物中。此外，有可能本发明组合物的RNA序列或若干序列编码野生型蛋白质序列的变体或片段或者野生型蛋白质序列或其变体的一个或多个部分或片段。
非编码RNA
根据本发明，本发明含有RNA的组合物的至少一种RNA可包括至少一种非编码RNA，其优选选自由以下组成的组：小干扰RNA(siRNA)、反义RNA(asRNA)、环状RNA(circRNA)、核酶、适配体、核糖开关、免疫刺激/免疫刺激性RNA RNA、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)及Piwi相互作用RNA(piRNA)。
免疫刺激性/免疫刺激RNA(isRNA)：
类似地，根据进一步的备选方案，本发明含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激性/免疫刺激RNA，其优选激发先天性免疫应答。这种免疫刺激性RNA可以是任何(双链或单链)RNA，例如编码RNA，如上定义。在一个优选的实施方案中，免疫刺激性RNA是非编码RNA。优选地，免疫刺激性RNA可以是单链、双链或部分双链RNA，更优选单链RNA，和/或环状或线性RNA，更优选线性RNA。更优选地，免疫刺激性RNA可以是(线性)单链RNA。甚至更优选地，免疫刺激性RNA可以是(长)(线性)单链)非编码RNA。在本文中，特别优选的是isRNA在其5’端处携带三磷酸酯，对于体外转录的RNA为此情况。免疫刺激性RNA也可以作为如本文所定义的短RNA寡核苷酸存在。
此外，本文使用的免疫刺激性RNA可以选自天然发现的或合成制备的任何RNA分子类型，并且其可以诱导先天性免疫应答且可以支持由抗原诱导的适应性免疫应答。在本文中，免疫应答可以以多种方式发生。对于合适的(适应性)免疫应答的基本因素是不同T细胞亚群的刺激。T淋巴细胞典型地分为2个亚群，T辅助1(Th1)细胞和T辅助2(Th2)细胞，免疫系统利用它们能够破坏胞内(Th1)和胞外(Th2)病原体(例如，抗原)。这两种Th细胞群在由它们产生的效应蛋白(细胞因子)的模式中所不同。因此，Th1细胞通过活化巨噬细胞和细胞毒性T细胞协助细胞免疫应答。在另一方面，Th2细胞通过刺激B细胞转变为浆细胞和通过形成(例如针对抗原的)抗体来促进体液免疫应答。因此，Th1/Th2比在适应性免疫应答的诱导和维持中是非常重要的。与本发明有关地，(适应性)免疫应答的Th1/Th2比优选向着细胞应答(Th1应答)的方向移动并且由此诱导细胞免疫应答。根据一个实例，可以支持适应性免疫应答的先天性免疫系统可以由Toll样受体(TLRs)的配体活化。TLRs是高度保守模式识别受体(PRR)多肽的家族，其识别病原体相关分子模式(PAMPs)并在哺乳动物的先天免疫性中起到关键作用。目前，已经确定了至少13个家族成员，命名为TLR1–TLR13(Toll-样受体：TLR1,TLR2,TLR3,TLR4,TLR5,TLR6,TLR7,TLR8,TLR9,TLR10,TLR11,TLR12或TLR13)。此外，已经确定了许多特异性TLR配体。此外，已报导，某些TLR的配体包括某些核酸分子，且某些类型的RNA以序列非依赖性或序列依赖性方式为免疫刺激性的，其中这些各种免疫刺激性RNA可例如刺激TLR3、TLR7或TLR8或胞内受体诸如RIG-I、MDA-5等。
优选地，本文使用的免疫刺激性核酸(优选免疫刺激性RNA(isRNA))可以包括已知具有免疫刺激性的任何RNA序列，包括但不仅限于，代表和/或编码TLRs的配体的RNA序列，优选选自人类家族成员TLR1–TLR10或鼠类家族成员TLR1–TLR13、更优选选自(人类)家族成员TLR1–TLR10、甚至更优选选自TLR7和TLR8，RNA的胞内受体的配体(诸如，RIG-I或MAD-5等)(参见例如Meylan,E.,Tschopp,J.(2006).Toll-like receptors and RNA helicases:two parallel ways to trigger antiviral responses.Mol.Cell22,561-569)，或任何其它免疫刺激性RNA序列。此外，可以用作本发明疫苗中其它化合物的免疫刺激性RNA分子(的类型)可以包括能够激发免疫应答的任何其它RNA。不受限于此，所述免疫刺激性RNA可以包括核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)、和病毒RNA(vRNA)。所述免疫刺激性RNA可以包括1000至5000个、500至5000个、5至5000个、或5至1000个、5至500个、5至250个、5至100个、5至50个或5至30个核苷酸的长度。
此外，本文使用的免疫刺激性RNA可以选自天然发现的或合成制备的任何RNA分子类型，并且其可以诱导先天性免疫应答且可以支持由抗原诱导的适应性免疫应答。在本文中，免疫应答可以以多种方式发生。对于合适的(适应性)免疫应答的基本因素是不同T细胞亚群的刺激。T淋巴细胞典型地分为2个亚群，T辅助1(Th1)细胞和T辅助2(Th2)细胞，免疫系统利用它们能够破坏胞内(Th1)和胞外(Th2)病原体(例如，抗原)。这两种Th细胞群在由它们产生的效应蛋白(细胞因子)的模式中所不同。因此，Th1细胞通过活化巨噬细胞和细胞毒性T细胞协助细胞免疫应答。在另一方面，Th2细胞通过刺激B细胞转变为浆细胞和通过形成(例如针对抗原的)抗体来促进体液免疫应答。因此，Th1/Th2比在适应性免疫应答的诱导和维持中是非常重要的。与本发明有关地，(适应性)免疫应答的Th1/Th2比优选向着细胞应答(Th1应答)的方向移动并且由此诱导细胞免疫应答。根据一个实例，可以支持适应性免疫应答的先天性免疫系统可以由Toll样受体(TLRs)的配体活化。TLRs是高度保守模式识别受体(PRR)多肽的家族，其识别病原体相关分子模式(PAMPs)并在哺乳动物的先天免疫性中起到关键作用。目前，已经确定了至少13个家族成员，命名为TLR1–TLR13(Toll-样受体:TLR1,TLR2,TLR3,TLR4,TLR5,TLR6,TLR7,TLR8,TLR9,TLR10,TLR11,TLR12或TLR13)。此外，已经确定了许多特异性TLR配体。例如发现，未甲基化的细菌DNA及其合成类似物(CpG DNA)是TLR9的配体(Hemmi H等(2000)Nature 408:740-5；Bauer S等(2001)Proc NatlAcadSci USA98,9237-42)。此外，已报导，某些TLR的配体包括某些核酸分子，且某些类型的RNA以序列非依赖性或序列依赖性方式为免疫刺激性的，其中这些各种免疫刺激性RNA可例如刺激TLR3、TLR7或TLR8或胞内受体诸如RIG-I、MDA-5等。例如，Lipford等确定了某些包含G,U的寡核糖核苷酸通过经由TLR7和TLR8作用而具有免疫刺激性(参见WO 03/086280)。由Lipford等所描述的免疫刺激性的含有G,U的寡核糖核苷酸被认为可来源于包括核糖体RNA、转运RNA、信使RNA和病毒RNA的RNA来源。
根据一个特别优选的实施方案，所述免疫刺激性核酸序列优选是这样的RNA：所述RNA优选由以下式(III)或(IV)的核酸序列组成或包括以下式(III)或(IV)的核酸序列：
GlXmGn,(式(III))
其中：
G是鸟苷、尿嘧啶或者鸟苷或尿嘧啶的类似物；
X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物；
l是1至40的整数，
其中
当l＝1时，G是鸟苷或其类似物，
当l>1时，至少50％的核苷酸是鸟苷或其类似物；
m是整数且至少为3；
其中
当m＝3时，X是尿嘧啶或其类似物，
当m>3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；
n是1-40的整数，
其中
当n＝1时，G是鸟苷或其类似物,
当n>1时，至少50％的核苷酸是鸟苷或其类似物。
ClXmCn,(式(IV))
其中：
C是胞嘧啶、尿嘧啶或者胞嘧啶或尿嘧啶的类似物；
X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物；
l是1至40的整数，
其中
当l＝1时，C是胞嘧啶或其类似物，
当l>1时，至少50％的核苷酸是胞嘧啶或其类似物；
m是整数且至少为3；
其中
当m＝3时，X是尿嘧啶或其类似物，
当m>3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；
n是1-40的整数，
其中
当n＝1时，C是胞嘧啶或其类似物，
当n>1时，至少50％的核苷酸是胞嘧啶或其类似物；
可以用作免疫刺激性RNA的式(II)或(III)的核酸可以是相对短的核酸分子，典型的长度约为5至100(但是，对于特定的实施方案，也可以长于100个核苷酸，例如，至多200个核苷酸)，5至90个或5至80个核苷酸，优选长度约为5至70个、更优选长度约为8至60个，且更优选长度约为15至60个核苷酸，更优选20至60个，最优选30至60个核苷酸。如果本发明核酸货物复合物的核酸具有例如100个核苷酸的最大长度，则m将典型地<＝98。式(III)的核酸中核苷酸G的数目由l或n确定。l和n，彼此独立，分别是1至40的整数，其中当l或n＝1时，G是鸟苷或其类似物，当l或n>1时，至少50％的核苷酸是鸟苷或其类似物。例如，不暗示任何限制，当l或n＝4时，Gl或Gn可以是，例如，GUGU、GGUU、UGUG、UUGG、GUUG、GGGU、GGUG、GUGG、UGGG或GGGG等；当l或n＝5时，Gl或Gn可以是，例如，GGGUU、GGUGU、GUGGU、UGGGU、UGGUG、UGUGG、UUGGG、GUGUG、GGGGU、GGGUG、GGUGG、GUGGG、UGGGG或GGGGG等；等等。在根据本发明的式(III)的核酸中与Xm相邻的核苷酸优选不是尿嘧啶。类似地，根据本发明的式(IV)的核酸中核苷酸C的数目由l或n确定。l和n，彼此独立，分别是1至40的整数，其中当l或n＝1时，C是胞嘧啶或其类似物，当l或n>1时，至少50％的核苷酸是胞嘧啶或其类似物。例如，不暗示任何限制，当l或n＝4时，Cl或Cn可以是，例如，CUCU、CCUU、UCUC、UUCC、CUUC、CCCU、CCUC、CUCC、UCCC或CCCC等；当l或n＝5时，Cl或Cn可以是，例如，CCCUU、CCUCU、CUCCU、UCCCU、UCCUC、UCUCC、UUCCC、CUCUC、CCCCU、CCCUC、CCUCC、CUCCC、UCCCC或CCCCC等；等等。在根据本发明的式(III)的核酸中与Xm相邻的核苷酸优选不是尿嘧啶。优选地，对于式(II)，当l或n>1时，至少60％、70％、80％、90％或甚至100％的核苷酸是鸟苷或其类似物，如上文定义。在侧翼序列G1和/或Gn中至100％的其余的核苷酸(当鸟苷组成少于100％的核苷酸时)是尿嘧啶或其类似物，如前文定义。还优选地，l和n，彼此独立，分别是2至30的整数，更优选是2至20的整数，且更优选是2至15的整数。如果有必要，l或n的下限可以变化，并且至少为1，优选至少为2，更优选至少为3、4、5、6、7、8、9或10。这一定义相应地适用于式(III)。
根据一个特别优选的实施方案，可用作免疫刺激性RNA的根据以上式(III)或(IV)中的任一者的核酸可选自由以下序列组成或包括以下序列的序列：以下序列SEQ ID NOs298–381中的任一者。
或选自与这些序列中的任一者具有至少60％、70％、80％、90％或甚至95％的序列同一性的序列。
根据进一步的特别优选实施方案，所述免疫刺激性核酸序列，特别是isRNA，由式(V)或(VI)的核酸组成或包括式(V)或(VI)的核酸：
(NuGlXmGnNv)a,(式(V))
其中：
G是鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)或者鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)的类似物，优选鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；
X是鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)、或这些核苷酸(核苷)的类似物，优选尿苷(尿嘧啶)或其类似物；
N是具有约4至50个、优选约4至40个、更优选约4至30个或4至20个核酸的长度的核酸序列，每个N独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸(核苷)的类似物；
a是1至20、优选1至15、最优选1至10的整数；
l是1至40的整数，
其中，当l＝1时，G是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，
当l>1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)是鸟苷(鸟嘌呤)
或其类似物；
m是整数且至少为3；
其中，当m＝3时，X是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，和
当m>3时，存在至少3个连续的尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)类似物；
n是1-40的整数，
其中，当n＝1时，G是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，
当n>1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)是鸟苷(鸟嘌呤)
或其类似物；
u,v可以彼此独立为0至50的整数，
优选地其中，当u＝0时，v≥1，或
当v＝0时，u≥1；
其中式(IV)的核酸分子的长度为至少50个核苷酸，优选至少100个核苷酸，更优选至少150个核苷酸，甚至更优选至少200个核苷酸，且最优选至少250个核苷酸。
(NuClXmCnNv)a,(式(VI))
其中：
C是胞苷(胞嘧啶)、尿苷(尿嘧啶)或者胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的类似物，优选胞苷(胞嘧啶)或其类似物；
X是鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)、或前述核苷酸(核苷)的类似物，优选尿苷(尿嘧啶)或其类似物；
N各自是彼此独立具有约4至50个、优选约4至40个、更优选约4至30个或4至20个核酸的长度的核酸序列，每个N独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸(核苷)的类似物；
a是1至20、优选1至15、最优选1至10的整数；
l是1至40的整数，
其中，当l＝1时，C是胞苷(胞嘧啶)或其类似物，
当l>1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)是胞苷(胞嘧啶)
或其类似物；
m是整数且至少为3；
其中，当m＝3时，X是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，
当m>3时，存在至少3个连续的尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)类似物；
n是1-40的整数，
其中，当n＝1时，C是胞苷(胞嘧啶)或其类似物，
当n>1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)是胞苷(胞嘧啶)
或其类似物；
u,v可以彼此独立为0至50的整数，
优选地其中，当u＝0时，v≥1，或
当v＝0时，u≥1；
其中根据本发明的式(V)的核酸分子的长度为至少50个核苷酸，优选至少100个核苷酸，更优选至少150个核苷酸，甚至更优选至少200个核苷酸，且最优选至少250个核苷酸。
对于式(VI)，上述关于元件N(即Nu和Nv)和X(Xm)，特别是上文定义的核心结构，以及关于整数a、l、m、n、u和v给出的任一定义，类似地相应地适用于式(VI)的元件，其中式(VI)中，核心结构由ClXmCn限定。分界元件Nu和Nv的定义与上文关于Nu和Nv给出的定义相同。
根据一个更特别优选的实施方案，根据式(V)的核酸分子(优选免疫刺激RNA)可以选自例如根据SEQ ID NOs 382-395的序列的任一者，或选自与这些序列中的任一者具有至少60％、70％、80％、90％或甚至95％的序列同一性的序列。
在本文中，特别优选的是根据SEQ ID NOs 5、394和10072的免疫刺激RNA。
R2025：
GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCAUCGAGGGUCGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACAGUUACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGAGUGUCACUGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAGGUCUGCUCUAG(SEQ ID NO:5和394)。
R3630：
GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCAUCGAGGGUCGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACAGUUACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGAGUGUCACUGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUGCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAGGUCUGCUCUAG(SEQ ID NO.10072)。
根据另一个更特别优选的实施方案，根据式(VI)的核酸分子可以选自例如根据SEQ ID NO 396或397的序列的任一者，或选自与这些序列中的任一者具有至少60％、70％、80％、90％或甚至95％的序列同一性的序列。
在编码RNA的情形下公开的所有修饰在非编码RNA的情形下(如果适用)也可适用。
编码与非编码RNA的组合
在特别优选的实施方案中，本发明含有RNA的组合物包括编码至少一种肽或蛋白质的至少一种RNA，和至少一种如上文所定义的非编码RNA、优选至少一种免疫刺激RNA。
特别优选的是以下实施方案：
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种细胞因子(优选IL-2、IL-12、IL-15或CD40L)的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种趋化因子的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种自杀基因产物(优选单纯疱疹病毒胸苷激酶)的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种免疫原性蛋白质或肽(优选流感NP蛋白)的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种细胞凋亡诱导剂(优选细胞色素c或胱天蛋白酶3)的RNA
(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种血管生成诱导剂的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种热休克蛋白的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种肿瘤抗原的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种β-联蛋白抑制剂的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种STING途径活化剂的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种检查点调节剂(优选针对PD-1、PD-L1或CTLA4的抗体)的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种先天性免疫活化剂(优选RIG-1的组成型活性变体)的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种抗体的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种诱饵受体(优选可溶PD-1受体)的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种骨髓源性抑制细胞(MDSC)抑制剂的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种IDO途径抑制剂的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos XY或YY的免疫刺激RNA+编码至少一种与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽的RNA(优选mRNA)
更特别优选的是以下实施方案：
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种细胞因子(优选IL-2、IL-12、IL-15或CD40L)的RNA(优选mRNA)+编码至少一种免疫原性蛋白质或肽(优选流感NP蛋白)的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种细胞因子(优选IL-2、IL-12、IL-15或CD40L)的RNA(优选mRNA)+编码至少一种先天性免疫活化剂(优选RIG-1的组成型活性变体)的RNA(优选mRNA)
·优选根据SEQ ID Nos 5、394或10072的免疫刺激RNA+编码至少一种细胞因子(优选IL-2、IL-12或IL-15)的RNA(优选mRNA)+编码至少一种其它细胞因子(优选CD40L)的RNA(优选mRNA)
配制及复合
本发明组合物的至少一种RNA可在不与任何其它赋形剂、载体、转染或复合剂缔合的情况下裸施用。
在一个优选实施方案中，本发明组合物的RNA与用于增加RNA的转染效率和/或免疫刺激性质的其它化合物一起配制。这种化合物在本文中称为载体、赋形剂、转染或复合剂。优选地，RNA与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物、优选与阳离子或聚阳离子聚合物；阳离子或聚阳离子肽或蛋白质；阳离子或聚阳离子多糖；阳离子或聚阳离子脂质；和/或与聚合载体一起配制。在本发明的情形下，所述阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子肽或蛋白质、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质或聚合载体可用作核酸的载体、赋形剂、转染或复合剂。因此，在本发明的进一步实施方案中，优选的是包含于本发明组合物中的至少一种RNA或任何其它核酸与阳离子或聚阳离子化合物或聚合物载剂缔合或复合，该缔合或复合任选地以选自以下范围的RNA或核酸与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体的重量比：约6:1(w/w)至约0.25:1(w/w)、更优选约5:1(w/w)至约0.5:1(w/w)、甚至更优选约4:1(w/w)至约1:1(w/w)或约3:1(w/w)至约1:1(w/w)且最优选约3:1(w/w)至约2:1(w/w)的比率；或任选地以如下的RNA或核酸与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体的氮/磷酸酯比：约0.1-10范围内、优选约0.3-4或0.3-1范围内、且最优选约0.5-1或0.7-1范围内、且甚至最优选约0.3-0.9或0.5-0.9范围内。
如上文所述的至少一种RNA与阳离子或聚阳离子化合物的比可基于所有这些组分的氮/磷酸酯比(N/P比)来计算。在本发明的情形下，关于含于本发明疫苗中的核酸:阳离子或聚阳离子肽的比，N/P比优选在约0.01-4、0.01-2、0.1-2或0.1-1.5范围内，且最优选在约0.1-1范围内。所述N/P比优选经设计以提供良好的体内转染性质以及输送至细胞膜中并通过细胞膜。优选地，出于此目的，本文使用的阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体是基于肽序列的。
作为本发明的情形中特别优选的试剂，阳离子或聚阳离子化合物包括鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，或其它阳离子肽或蛋白质，诸如聚-L-赖氨酸(PLL)，聚-精氨酸，碱性多肽，细胞渗透肽(CPP)，包括HIV结合肽，HIV-1Tat(HIV)，Tat衍生的肽，穿透肽，VP22衍生的肽或类似物肽，HSV VP22(单纯疱疹)，MAP，KALA或蛋白质转导结构域(PTD)，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，MPG-肽(s)，Pep-1，L-低聚物，降钙素肽，触角足(Antennapedia)衍生的肽(特别是来自果蝇(Drosophila)触角足)，pAntp，pIsl，FGF，乳铁蛋白，转运素(Transportan)，Buforin-2，Bac715-24，SynB，SynB(1)，pVEC，hCT衍生的肽，SAP，或组蛋白。
在本文中，鱼精蛋白是特别优选的。
另外地，优选的阳离子或聚阳离子蛋白质或肽可以选自具有以下总式(VII)的以下蛋白质或肽：
(Arg)1；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x, (式(VII)
其中l+m+n+o+x＝8-15，并且l、m、n或o可以彼此独立地是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的任何数，条件是Arg、Lys、His和Orn的总含量占寡肽的所有氨基酸的至少50％；并且Xaa可以是选自天然(＝自然存在的)或非天然氨基酸的任何氨基酸，除了Arg、Lys、His或Orn以外；并且x可以是选自0、1、2、3或4的任何数，条件是Xaa的总含量不超过寡肽的所有氨基酸的50％。在本文中，特别优选的阳离子肽是例如Arg7、Arg8、Arg9、H3R9、R9H3、H3R9H3、YSSR9SSY、(RKH)4、Y(RKH)2R等。在本文中，WO 2009/030481的公开内容通过引用并入本文中。
根据本发明所用的聚合载体可为由二硫键交联的阳离子组分形成的聚合载体。
根据进一步的特别优选实施方案，聚合载体的具有上文所示的经验总式(VII)并包含或另外被修饰从而包含至少一个–SH部分的所述阳离子或聚阳离子肽或蛋白质可以选自，但不限于此，由通式Arg7(也叫作R7)、Arg9(也叫作R9)、Arg12(也叫作R12)组成的亚组。
根据另一个特别优选的实施方案，聚合载体的阳离子或聚阳离子肽或蛋白质，在根据上文所示的式{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x}(式(VII))定义并且包含或另外被修饰从而包含至少一个–SH部分时，可以选自分式(VIIa)，但不限于此：
{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa’)x(Cys)y} 式(VIIa)
其中(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；和x如本文中所定义；Xaa’是选自天然(＝天然存在的)或非天然氨基酸中的任意氨基酸，除了Arg、Lys、His、Orn或Cys以外；并且y是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-70、71-80和81-90的任何数，条件是Arg(精氨酸)、Lys(赖氨酸)、His(组氨酸)和Orn(鸟氨酸)的总含量占寡肽的所有氨基酸的至少10％。
这个实施方案可以适用于这样的情形，其中聚合载体的阳离子或聚阳离子肽或蛋白质，例如当根据上文所示的经验式(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x(式(VII))定义时，包括至少一个半胱氨酸或已经被至少一个半胱氨酸修饰以作为上述意思中的–SH部分，以便作为阳离子组分载体的阳离子或聚阳离子肽携带至少一个半胱氨酸，其能够与聚合载体的其它组分形成二硫键。
示例性的实例可包括以下序列的任一者：
Cys(Arg7)、Cys(Arg8)、Cys(Arg9)、Cys(Arg10)、Cys(Arg11)、Cys(Arg12)、Cys(Arg13)、Cys(Arg14)、Cys(Arg15)、Cys(Arg16)、Cys(Arg17)、Cys(Arg18)、Cys(Arg19)、Cys(Arg20)。
根据另一个特别优选的实施方案，聚合载体的阳离子或聚阳离子肽或蛋白质，在根据上文所示的式{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x}(式(VII))定义时，可以选自分式(VIIb)，但不限于此：
Cys1{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x}Cys2 (式(VIIb))
其中经验式{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x}(式(VII))如本文中所定义，并且形成根据(半经验)式(I)的氨基酸序列的核心，并且其中Cys1和Cys2是接近(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x或在(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x末端的半胱氨酸。示例性的实例可包括两侧为两个Cys的任一上述序列和下述序列：
Cys(Arg7)Cys、Cys(Arg8)Cys、Cys(Arg9)Cys、Cys(Arg10)Cys、Cys(Arg11)Cys、Cys(Arg12)Cys、Cys(Arg13)Cys、Cys(Arg14)Cys、Cys(Arg15)Cys、Cys(Arg16)Cys、Cys(Arg17)Cys、Cys(Arg18)Cys、Cys(Arg19)Cys、Cys(Arg20)Cys(SEQ ID NOs:10-23):
这个实施方案可以适用于这样的情形，其中聚合载体的阳离子或聚阳离子肽或蛋白质，例如当根据上文所示的经验式(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x(式(VII))定义时，包括至少两个半胱氨酸或已经被至少两个半胱氨酸修饰以作为上述意思中的–SH部分，以便作为阳离子组分载体的本发明聚合载体货物复合物的阳离子或聚阳离子肽携带至少两个(末端)半胱氨酸，其能够与聚合载体的其它组分形成二硫键。
在一个优选实施方案中，聚合载体通过以下肽形成、包括以下肽或由以下肽组成：CysArg12Cys(SEQ ID NO:15)或CysArg12(CRRRRRRRRRRRR)。
根据第二备选方案，聚合载体的至少一个阳离子(或聚阳离子)组分可以选自，例如，适于此情形的任何(非肽)阳离子或聚阳离子聚合物，条件是该(非肽)阳离子或聚阳离子聚合物展现出或被修饰从而展现出至少一个–SH-部分，其提供连接阳离子或聚阳离子聚合物与本文定义的聚合载体的另一种组分的二硫键。因此，同样如本文所定义的，聚合载体可以包括相同的或不同的阳离子或聚阳离子聚合物。
在聚合载体的阳离子组分包括(非肽)阳离子或聚阳离子聚合物的具体情形中，所述(非肽)阳离子或聚阳离子聚合物的阳离子性质可以基于其与阳离子聚合物的组分的总电荷相比时的阳离子电荷的含量而确定。优选地，在本文定义的(生理)pH下，阳离子聚合物中的阳离子电荷的含量是至少10％、20％或30％，优选至少40％，更优选至少50％、60％或70％,，还优选至少80％、90％或甚至95％、96％、97％、98％、99％或100％，最优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或者可以在约10％至90％的范围内，更优选在约30％至100％的范围内，甚至优选在约50％至100％的范围内，例如，50、60、70、80％、90％或100％，或者在由前述数值中任意两个数值形成的范围内，条件是在整个阳离子聚合物中的总电荷含量，例如在本文定义的(生理)pH下的正电荷和负电荷含量为100％。
优选地，聚合载体的(非肽)阳离子组分表现为阳离子或聚阳离子聚合物，典型地展现出约0.1或0.5kDa至约100kDa、优选约1kDa至约75kD、更优选约5kDa至约50kDa、甚至更优选约5kDa至约30kDa的分子量、或者约10kDa至约50kDa、甚至更优选约10kDa至约30kDa的分子量。另外地，(非肽)阳离子或聚阳离子聚合物典型地展现出至少一个-SH-部分，其能够在与本文定义的聚合载体的其它阳离子组分或其它组分缩合时形成二硫键。
在上述情形中，聚合载体的(非肽)阳离子组分可以选自丙烯酸酯，改性的丙烯酸酯，诸如pDMAEMA(聚(丙烯酸二甲基氨基乙基甲酯))，壳聚糖，氮丙啶或2-乙基-2-唑啉(形成低聚乙烯亚胺或改性的低聚乙烯亚胺)，通过二丙烯酸酯与胺类反应形成低聚β氨基酯或聚酰氨基胺(poly amido amines)而得到的聚合物，或其它聚合物，诸如聚酯、聚碳酸酯等。这些(非肽)阳离子或聚阳离子聚合物中的每种分子典型地展现出至少一个–SH-部分，其中这些至少一个–SH-部分可以通过化学修饰，例如使用imonothiolan、3-硫代丙酸或引入含有–SH-部分的氨基酸(诸如半胱氨酸或任意其它(修饰的)氨基酸)而引入到(非肽)阳离子或聚阳离子聚合物中。所述–SH-部分优选地如上文已定义的。
二硫键交联的阳离子组分可以彼此相同或不同。聚合载体也可以含有其它的组分。还特别优选的是根据本发明使用的聚合载体包括阳离子肽、蛋白质或聚合物以及任选地本文定义的其它组分的混合物，它们通过本文所述的二硫键交联。在本文中，WO 2012/013326的公开内容通过引用并入本文中。
在本文中，通过二硫键交联形成聚合载体的基础的阳离子组分典型地选自任何适于该目的的适当的阳离子或聚阳离子肽、蛋白质或聚合物，特别是能够与根据本发明定义的RNA或核酸复合并且由此优选地缩合所述RNA或核酸的任何阳离子或聚阳离子肽、蛋白质或聚合物。阳离子或聚阳离子肽、蛋白质或聚合物优选是线性分子，然而，也可以使用支链阳离子或聚阳离子肽、蛋白或聚合物。
聚合载体的每个二硫键交联的阳离子或聚阳离子蛋白质、肽或聚合物(其可以用于与本发明组合物的RNA复合或与包含于本发明组合物的任何其它核酸复合)含有至少一个–SH部分，最优选至少一个半胱氨酸残基或任意其它展现–SH部分的化学基团，其在与作为本文提及的聚合载体的阳离子组分的至少一个其它阳离子或聚阳离子蛋白质、肽或聚合物缩合时能够形成二硫键。
如上文所定义，可用于与本发明组合物的RNA复合或与包含于本发明组合物中的任何其它核酸复合的聚合载体可由二硫键交联的阳离子(或聚阳离子)组分形成。
与这种聚合载体复合的核酸在本文中也称为“聚合物载体货物复合物”。
在本文中，特别优选的是，如果免疫刺激RNA用于本发明的情形下，那么该免疫刺激RNA与上文定义的聚合载体复合。优选地，免疫刺激RNA(例如，包括根据式III-VI中的任一者的RNA序列)、最优选包括根据SEQ ID NO.5、394或10072的RNA序列与聚合载体复合，所述聚合载体包括以下或由以下形成：根据式VII、VIIa或VIIb的二硫键交联的肽，优选由Cys(Arg12)Cys或Cys(Arg12)形成的聚合载体。这种特别优选的实施方案在本文中也称为“RNAdjuvant”。
在进一步的特定实施方案中，可用于与包含于本发明组合物中的RNA或任何其它核酸复合的聚合载体可选自根据通式(VIII)的聚合载体分子：
L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L 式(VIII)
其中
P1和P3彼此不同或相同且表示线性或支链亲水性聚合物链，各P1和P3展现至少一个-SH部分，其能够在与组分P2或者与(AA)、(AA)x或[(AA)x]z(如果这种组分用作P1与P2或P3与P2之间的接头时)和/或与其它组分(例如(AA)、(AA)x或[(AA)x]z或L)缩合时形成二硫键，所述线性或支链亲水性聚合物链彼此独立地选自聚乙二醇(PEG)、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚-2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱、聚(羟烷基L-天冬酰胺)、聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱)、羟乙基淀粉或聚(羟烷基L-谷氨酰胺)，其中所述亲水性聚合物链展现出约1kDa至约100kDa、优选约2kDa至约25kDa、或更优选约2kDa至约10kDa、例如约5kDa至约25kDa或5kDa至约10kDa的分子量；
P2是阳离子或聚阳离子肽或蛋白质，例如如上文关于由二硫键交联的阳离子组分形成的聚合载体所定义的，且优选具有约3至约100个氨基酸的长度，更优选具有约3至约50个氨基酸长度，甚至更优选具有约3至约25个氨基酸长度，例如约3至10个、5至15个、10至20个或15至25个氨基酸的长度，更优选约5至约20个的长度，且甚至更优选约10至约20个的长度；
是阳离子或聚阳离子聚合物，例如如上文关于由二硫键交联的阳离子组分形成的聚合载体所定义的，典型地具有约0.5kDa至约30kDa的分子量，包括约1kDa至约20kDa、甚至更优选约1.5kDa至约10kDa的分子量，或具有约0.5kDa至约100kDa的分子量，包括约10kDa至约50kDa、甚至更优选约10kDa至约30kDa的分子量。各P2展现至少两个-SH部分，其能够在与另外的组分P2或组分P1和/或P3或者与其它组分(例如(AA)、(AA)x或[(AA)x]z)缩合时形成二硫键；
-S-S-是(可逆的)二硫键(为了更好可读性，省略括号)，其中S优选表示硫或携带-SH的部分，其已形成(可逆)二硫键。(可逆的)二硫键优选通过使组分P1和P2、P2和P2、或P2和P3或任选地如本文所定义的其它组分(例如L、(AA)、(AA)x、[(AA)x]z等)的-SH部分缩合而形成；-SH部分可为这些组分的结构的一部分或通过如下定义的修饰添加；
L是任选的配体，其可能存在或可能不存在，并且可彼此独立地选自RGD、运铁蛋白、叶酸酯、信号肽或信号序列、定位信号或序列、核定位信号或序列(NLS)、抗体、细胞渗透肽(例如，TAT或KALA)、受体的配体(例如，细胞因子、激素、生长因子等)、小分子(例如，碳水化合物，如甘露糖或半乳糖或合成配体)、受体的小分子激动剂、抑制剂或拮抗剂(例如，RGD肽模拟类似物)、或如本文所定义的任何其它蛋白质等；
n是整数，典型地选自约1至50的范围，优选约1、2或3至30的范围，更优选约1、2、3、4或5至25的范围，或约1、2、3、4或5至20的范围，或约1、2、3、4或5至15的范围，或约1、2、3、4或5至10的范围，包括例如约4至9、4至10、3至20、4至20、5至20或10至20的范围，或约3至15、4至15、5至15或10至15的范围，或约6至11或7至10的范围。最优选地，n在约1、2、3、4或5至10范围内，更优选在约1、2、3或4至9范围内，在约1、2、3或4至8范围内，或在约1、2或3至7范围内。
在本文中，WO 2011/026641和WO 2012/116811的公开内容通过引用并入本文中。亲水性聚合物P1和P3中的每一者典型地展现至少一个-SH部分，其中至少一个-SH部分能够在与组分P2或与组分(AA)或(AA)x(如果在用作如下文所定义的P1与P2或P3与P2之间的接头时)及任选地与其它组分(例如，L和/或(AA)或(AA)x，例如如果在含有两个或多个-SH部分时)反应时形成二硫键。以上通式内的以下子式“P1-S-S-P2”及“P2-S-S-P3”，其中S、P1和P3中的任一者如本文所定义的，典型地表示如下情况，其中亲水性聚合物P1和P3的一个-SH部分与以上通式的组分P2的一个-SH部分缩合，其中这些-SH部分的两个硫形成二硫键-S-S-。这些-SH部分典型地由亲水性聚合物P1和P3中的每一者提供，例如经由内部半胱氨酸或携带-SH部分的任何其它(修饰的)氨基酸或化合物提供。因此，如果-SH部分由半胱氨酸提供，则子式“P1-S-S-P2”和“P2-S-S-P3”也可写为“P1-Cys-Cys-P2”和“P2-Cys-Cys-P3”，其中术语Cys-Cys表示两个经由二硫键(而不经由肽键)偶合的半胱氨酸。在此情况下，这些式中的术语“-S-S-”也可写为“-S-Cys”、“-Cys-S”或“-Cys-Cys-”。在本文中，术语“-Cys-Cys-”不表示肽键而表示两个半胱氨酸经由其-SH部分以形成二硫键的键联。因此，术语“-Cys-Cys-”通常也可理解为“-(Cys-S)-(S-Cys)-”，其中在此特定情况下，S表示半胱氨酸的-SH部分的硫。同样，术语“-S-Cys”和“-Cys-S”表示含-SH的部分与半胱氨酸之间的二硫键，其也可写为“-S-(S-Cys)”和“-(Cys-S)-S”。或者，亲水性聚合物P1和P3可以经由-SH部分修饰，优选地通过与携带-SH部分的化合物进行化学反应而修饰，以便亲水性聚合物P1和P3中的每一者携带至少一个该-SH部分。该种携带-SH部分的化合物可为例如(额外的)半胱氨酸或任何其它(修饰的)氨基酸，这些携带–SH部分。该种化合物也可以是任何非氨基化合物或部分，其含有或允许向本文定义的亲水性聚合物P1和P3中引入-SH部分。所述非氨基化合物可以通过化学反应或化合物的结合与聚合载体的亲水性聚合物P1和P3连接，例如，通过3-硫代丙酸或thioimolane的结合，通过酰胺形成(例如，羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克尔加成(例如，顺丁烯二酰亚胺部分，不饱和羰基等)，通过点击化学(click chemistry)(例如，叠氮化物或炔)，通过烯/炔复分解(methatesis)(例如，烯或炔)，亚胺或腙形成(醛或酮，肼，羟胺，胺)，络合反应(抗生物素蛋白，生物素，蛋白G)或允许Sn-型取代反应的组分(例如，卤代烷，硫醇，醇，胺，肼，酰肼，磺酸酯，氧盐(oxyphosphonium salts)或其它可以用于连接其它组分的化学部分。在本文中，特别优选的PEG衍生物是α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇)。在每种情形中，–SH部分，例如半胱氨酸或任何其它(修饰的)氨基酸或化合物的–SH部分，可以存在于亲水性聚合物P1和P3的末端或内部的任何位置。如本文定义，亲水性聚合物P1和P3的每一者，典型地展现出至少一个–SH-结构部分(优选地在一个末端处)，但是也可以含有两个或甚至更多个–SH-部分，其可用于额外地连接如本文所定义的其它组分，优选其它功能肽或蛋白质，例如配体、氨基酸组分(AA)或(AA)x,、抗体、细胞渗透肽或增强子肽(例如，TAT、KALA)等。
如上文所定义，配体(L)可任选地用于根据通式(VIII)的聚合载体分子中，例如用于将本发明载体聚合物及其整个“货物”(本发明组合物或疫苗组合物的佐剂组分和/或抗原)定向至特异性细胞中。它们可彼此独立地选自RGD、运铁蛋白、叶酸酯、信号肽或信号序列、定位信号或序列、核定位信号或序列(NLS)、抗体、细胞渗透肽(CPP)(例如TAT、KALA)、受体的配体(例如，细胞因子、激素、生长因子等)、小分子(例如，碳水化合物，如甘露糖或半乳糖或合成配体)、受体的小分子激动剂、抑制剂或拮抗剂(例如，RGD肽模拟类似物)、或如下进一步定义的任何此类分子等。特别优选的是细胞渗透肽(CPPs)，其在内体中诱导pH-介导的构象变化，并且通过插入到脂质体的脂质层而导致本发明的聚合载体(其与核酸复合)从内体的释放提高。这些用于转运的所谓的CPPs或阳离子肽可以包括，但不限于此，鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，聚-L-赖氨酸(PLL)，碱性多肽，聚-精氨酸，嵌合CPPs，诸如转运素，或MPG肽，HIV-结合肽，Tat，HIV-1Tat(HIV)，Tat衍生的肽，寡聚精氨酸，穿膜肽家族成员，例如穿膜肽，触角足衍生的肽(特别是来自果蝇触角足)，pAntp，pIsl等，抗微生物衍生的CPPs，例如Buforin-2，Bac715-24，SynB，SynB(1)，pVEC，hCT衍生的肽，SAP，MAP，PpTG20，富含脯氨酸的肽，Loligomers，富含精氨酸的肽，降钙素肽，FGF，乳铁蛋白，聚-L-赖氨酸，聚-精氨酸，组蛋白，VP22衍生的肽或类似物肽，瘟病毒Erns(Pestivirus Erns)，HSV,VP22(单纯疱疹)，MAP，KALA或蛋白转导结构域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，Pep-1，L-寡聚体，降钙素肽等。在本文中，特别优选的是甘露糖作为配体以靶向在其细胞膜甘露糖受体携带的抗原呈递细胞。在本发明的第一实施方案的进一步优选方面中，半乳糖作为任选的配体可用于靶向肝细胞。所述配体可以通过如下定义的可逆的二硫键或任何其它可能的化学连接与组分P1和/或P3连接，例如，通过酰胺形成(例如，羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克尔加成(例如，顺丁烯二酰亚胺部分，α,β不饱和羰基等)，通过点击化学(例如，叠氮化物或炔)，通过烯/炔复分解(alkene/alkine methatesis)(例如，烯或炔)，亚胺或腙形成(醛或酮，肼，羟胺，胺)，络合反应(抗生物素蛋白，生物素，蛋白G)或允许Sn-型取代反应的组分(例如，卤代烷，硫醇，醇，胺，肼，酰肼，磺酸酯，氧 盐或其它可以用于连接其它组分的化学部分。
在本发明的式(VIII)的情形中，组分P1和P3表示线性或支链亲水性聚合物链，含有至少一个-SH部分，各P1和P3彼此独立地选自例如聚乙二醇(PEG)、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚-2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱、聚(羟烷基L-天冬酰胺)或聚(羟烷基L-谷氨酰胺)。P1和P3可以彼此相同或不同。优选地，亲水性聚合物P1和P3中的每一个展现出约1kDa至约100kDa、优选约1kDa至约75kDa、更优选约5kDa至约50kDa、甚至更优选约5kDa至约25kDa的分子量。另外，亲水性聚合物P1和P3中的每一者典型地展现至少一个-SH部分，其中至少一个-SH部分能够在与组分P2或与组分(AA)或(AA)x(如果在用作如下文所定义的P1与P2或P3与P2之间的接头时)及任选地与其它组分(例如，L和/或(AA)或(AA)x，例如如果在含有两个或多个-SH部分时)反应时形成二硫键。以上通式(VII)内的以下子式“P1-S-S-P2”和“P2-S-S-P3”(为了更好可读性，省略括号)，其中S、P1和P3中的任一者如本文所定义的，典型地表示如下情况，其中亲水性聚合物P1和P3的一个-SH部分与以上通式(VII)的组分P2的一个-SH部分缩合，其中这些-SH部分的两个硫形成如式(VII)中所定义的二硫键-S-S-。这些-SH部分典型地由亲水性聚合物P1和P3中的每一者提供，例如经由内部半胱氨酸或携有-SH部分的任何其它(修饰的)氨基酸或化合物提供。因此，如果-SH部分由半胱氨酸提供，则子式“P1-S-S-P2”和“P2-S-S-P3”也可写为“P1-Cys-Cys-P2”和“P2-Cys-Cys-P3”，其中术语Cys-Cys表示两个经由二硫键(而不经由肽键)偶合的半胱氨酸。在此情况下，这些式中的术语“-S-S-”也可写为“-S-Cys”、“-Cys-S”或“-Cys-Cys-”。在本文中，术语“-Cys-Cys-”不表示肽键而表示两个半胱氨酸经由其-SH部分以形成二硫键的键联。因此，术语“-Cys-Cys-”通常也可理解为“-(Cys-S)-(S-Cys)-”，其中在此特定情况下，S表示半胱氨酸的-SH部分的硫。同样，术语“-S-Cys”和“-Cys-S”表示含-SH的部分与半胱氨酸之间的二硫键，其也可写为“-S-(S-Cys)”和“-(Cys-S)-S”。或者，亲水性聚合物P1和P3可以经由-SH部分修饰，优选地通过与携带-SH部分的化合物进行化学反应而修饰，以便亲水性聚合物P1和P3中的每一者携带至少一个该-SH部分。该种携带-SH部分的化合物可为例如(额外的)半胱氨酸或任何其它(修饰的)氨基酸，这些携带–SH部分。该种化合物也可以是任何非氨基化合物或部分，其含有或允许向本文定义的亲水性聚合物P1和P3中引入-SH部分。所述非氨基化合物可以通过化学反应或化合物的结合与根据本发明的聚合载体的式(VII)的亲水性聚合物P1和P3连接，例如，通过3-硫代丙酸或thioimolane的结合，通过酰胺形成(例如，羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克尔加成(例如，顺丁烯二酰亚胺部分，α,β不饱和羰基等)，通过点击化学(例如，叠氮化物或炔)，通过烯/炔复分解(alkene/alkine methatesis)(例如，烯或炔)，亚胺或腙形成(醛或酮，肼，羟胺，胺)，络合反应(抗生物素蛋白，生物素，蛋白G)或允许Sn-型取代反应的组分(例如，卤代烷，硫醇，醇，胺，肼，酰肼，磺酸酯，氧盐或其它可以用于连接其它组分的化学部分。在本文中，特别优选的PEG衍生物是α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇)。在每种情形中，–SH部分，例如半胱氨酸或任何其它(修饰的)氨基酸或化合物的–SH部分，可以存在于亲水性聚合物P1和P3的末端或内部的任何位置。如本文定义，亲水性聚合物P1和P3的每一者，典型地展现出至少一个–SH-结构部分(优选地在一个末端处)，但是也可以含有两个或甚至更多个–SH-部分，其可用于额外地连接如本文所定义的其它组分，优选其它功能肽或蛋白质，例如配体、氨基酸组分(AA)或(AA)x,、抗体、细胞渗透肽或增强子肽(例如，TAT、KALA)等。
根据一个优选的备选方案，所述其它功能肽或蛋白质可以包括用于转运的所谓的细胞渗透肽(CPPs)或阳离子肽。特别优选的是CPPs，其在内体中诱导pH-介导的构象变化，并且通过插入到脂质体的脂质层而导致本发明的聚合载体(其与核酸复合)从内体的释放提高。这些用于转运的所谓的细胞渗透肽(CPPs)或阳离子肽可以包括，但不限于此，鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，聚-L-赖氨酸(PLL)，碱性多肽，聚-精氨酸，嵌合CPPs，诸如转运素，或MPG肽，HIV-结合肽，Tat，HIV-1Tat(HIV)，Tat衍生的肽，寡聚精氨酸，穿膜肽家族成员，例如穿膜肽，触角足衍生的肽(特别是来自果蝇触角足)，pAntp，pIsl等，抗微生物衍生的CPPs，例如Buforin-2，Bac715-24，SynB，SynB(1)，pVEC，hCT衍生的肽，SAP，MAP，PpTG20，富含脯氨酸的肽，Loligomers，富含精氨酸的肽，降钙素肽，FGF，乳铁蛋白，聚-L-赖氨酸，聚-精氨酸，组蛋白，VP22衍生的肽或类似物肽，瘟病毒Erns(Pestivirus Erns)，HSV,VP22(单纯疱疹)，MAP，KALA或蛋白转导结构域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，Pep-1，L-寡聚体，降钙素肽等。
根据本发明的进一步优选实施方案，根据本发明使用的聚合载体的式(VIII)的亲水性聚合物P1和P3中的每一个也可以含有至少一个其它的功能部分，其允许连接本文定义的其它组分(例如，上文定义的配体)，或者允许连接其它组分的官能性，例如通过酰胺形成(例如，羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克尔加成(例如，顺丁烯二酰亚胺部分，不饱和羰基等)，通过点击化学(例如，叠氮化物或炔)，通过烯/炔复分解(alkene/alkine methatesis)(例如，烯或炔)，亚胺或腙形成(醛或酮，肼，羟胺，胺)，络合反应(抗生物素蛋白，生物素，蛋白G)或允许Sn-型取代反应的组分(例如，卤代烷，硫醇，醇，胺，肼，酰肼，磺酸酯，氧盐或其它可以用于连接其它组分的化学部分。其它功能部分可包括如本文所定义的氨基酸组分(AA)或(AA)x，其中(AA)优选为如上文所定义的氨基组分。在以上情形中，x优选为整数，且可选自约1至100的范围，优选约1至50、更优选1至30的范围，且甚至更优选选自包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15-30的数目，例如选自约1至30的范围、约1至15的范围，或选自包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的数目，或可选自由前面提及的任两个值形成的范围。最优选地，x是1。这种氨基酸组分(AA)或(AA)x可含于根据以上式(VIII)的本发明聚合载体的每一部分中，且因此可连接至根据式(VII)的本发明聚合载体的所有组分。特别优选的是氨基酸组分(AA)或(AA)x以配体或重复组分[S-P2-S]n的一部分存在于本发明聚合载体的式(VIII)内。
在聚合载体的整个式(VIII)的情形中可优选定义如下：
L-P1-S-[Cys-P2-Cys]n-S-P3-L
其中L、P1、P2、P3和n如本文所定义，S是硫，且各Cys向二硫键提供一个-SH-部分。
根据一个特定实施方案，如上文所定义的根据式(VII)的聚合载体可包括至少一种如上文所定义的氨基酸组分(AA)或(AA)x。这种氨基酸组分(AA)或(AA)x可含于根据以上式(VIII)的本发明聚合载体的每一部分中，且因此可连接至根据式(VIII)的聚合载体的所有组分。特别优选的是氨基酸组分(AA)或(AA)x以配体或重复组分[S-P2-S]n的一部分存在于聚合载体的式(VIII)内。氨基酸组分(AA)或(AA)x优选含有或者两侧是(例如，末端地)至少一个含有–SH的部分，其允许通过二硫键将该组分(AA)或(AA)x引入到本文定义的聚合载体中。所述含有–SH的部分可以是任何含有–SH的部分(或者，当然，二硫键的一个硫)，例如半胱氨酸残基。在含有–SH的部分表现为半胱氨酸的具体情形中，氨基酸组分(AA)x还可以读作-Cys-(AA)x-或-Cys-(AA)x-Cys-，其中Cys表示半胱氨酸，并且提供二硫键必需的–SH-部分。也可以使用上文所示的用于组分P1、P2或P3的任一种修饰或反应而将含有–SH的部分引入到氨基酸组分(AA)x中。在氨基酸组分(AA)x连接至根据式(VIII)的聚合载体的两个组分的特定情况下，优选的是(AA)或(AA)x优选在其末端处含有至少两个-SH部分，例如至少两个半胱氨酸。这在(AA)或(AA)x是重复组分[S-P2-S]n的一部分时是特别优选的。或者，氨基酸组分(AA)或(AA)x经由任何化学可能的加成反应引入到如本文所定义的根据式(VIII)的聚合载体中。因此，氨基酸组分(AA)或(AA)x含有至少一个其它的功能部分，其允许将其连接至如本文所定义的其它组分，例如组分P1或P3、P2、L或其它的氨基酸组分(AA)或(AA)x等。所述功能部分可以选自允许连接其它组分的官能性(例如，本文定义的官能性)，例如通过酰胺形成(例如，羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克尔加成(例如，顺丁烯二酰亚胺部分，α,β不饱和羰基等)，通过点击化学(例如，叠氮化物或炔)，通过烯/炔复分解(alkene/alkinemethatesis)(例如，烯或炔)，亚胺或腙形成(醛或酮，肼，羟胺，胺)，络合反应(抗生物素蛋白，生物素，蛋白G)或允许Sn-型取代反应的组分(例如，卤代烷，硫醇，醇，胺，肼，酰肼，磺酸酯，氧盐或其它可以用于连接其它组分的化学部分。
式(VIII)的聚合载体中的氨基酸组分(AA)或(AA)x也可以作为混合重复氨基酸组分[(AA)x]z出现，其中氨基酸组分(AA)或(AA)x的数目进一步由整数z定义。在本文中，z可选自约1至30的范围，优选约1至15、更优选1至10或1至5的范围，且甚至更优选选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，或可选自由前面提及的任两个值形成的范围。
根据一个特定且特别优选的替代方案，氨基酸组分(AA)或(AA)x、优选写为S-(AA)x-S或[S-(AA)x-S]，可用于修饰以上式(VIII)的聚合载体的重复组分[S-P2-S]n中的组分P2、特别是组分S-P2-S的含量。在根据式(VIII)的整个聚合载体的情形下这可例如由下式(VIIIa)表示：
L-P1-S-{[S-P2-S]a[S-(AA)x-S]b}-S-P3-L,
其中x、S、L、AA、P1、P2和P3优选如本文所定义的。在以上式(VIIIa)中，单一组分[S-P2-S]和[S-(AA)x-S]中的任一者可以在子式{[S-P2-S]a[S-(AA)x-S]b}中以任何次序出现。子式{[S-P2-S]a[S-(AA)x-S]b}中的单一组分[S-P2-S]和[S-(AA)x-S]的数目由整数a和b确定，其中a+b＝n。n是整数，且如上文关于式(VIII)中所定义的。
a是整数，典型地与整数b彼此独立地选自约1至50的范围，优选约1、2或3至30的范围，更优选约1、2、3、4或5至25的范围，或约1、2、3、4或5至20的范围，或约1、2、3、4或5至15的范围，或约1、2、3、4或5至10的范围，包括例如约3至20、4至20、5至20或10至20的范围，或约3至15、4至15、5至15或10至15的范围，或约6至11或7至10的范围。最优选地，a在约1、2、3、4或5至10范围内，更优选在约1、2、3或4至9范围内，在约1、2、3或4至8范围内，或在约1、2或3至7范围内。
b是整数，典型地与整数a彼此独立地选自约0至50或1至50的范围，优选约0、1、2或3至30的范围，更优选约0、1、2、3、4或5至25的范围，或约0、1、2、3、4或5至20的范围，或约0、1、2、3、4或5至15的范围，或约0、1、2、3、4或5至10的范围，包括例如约3至20、4至20、5至20或10至20的范围，或约3至15、4至15、5至15或10至15的范围，或约6至11或7至10的范围。最优选地，b在约1、2、3、4或5至10范围内，更优选在约1、2、3或4至9范围内，在约1、2、3或4至8范围内，或在约1、2或3至7范围内。
在本文中，特别优选的是本发明组合物的RNA、优选mRNA至少部分与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体、优选阳离子蛋白质或肽复合。在本文中，WO 2010/037539和WO2012/113513的公开内容通过引用并入本文中。“部分”意为，仅一部分RNA与阳离子化合物复合，且其余RNA(包含于本发明组合物中)呈未复合形式(“游离”)。优选地，(本发明组合物中的)复合RNA与(:)游离RNA的比率选自约5:1(w/w)至约1:10(w/w)的范围，更优选约4:1(w/w)至约1:8(w/w)的范围，甚至更优选地约3:1(w/w)至约1:5(w/w)或1:3(w/w)的范围，并且最优选地本发明组合物中的复合RNA与游离RNA的比率选自约1:1(w/w)的比率。
所谓的“(佐剂)组分”，其可与本发明组合物中的RNA、优选mRNA一起使用，优选根据这样的第一步制备：通过将(佐剂)组分的至少一种(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物和/或与聚合载体，优选如本文所定义，以特定比率复合以形成稳定的复合物。在本文中，十分优选的是在与(m)RNA复合后，(佐剂)组分中不剩余游离的阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体或者仅剩余可忽略的小量的游离阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体。因此，(佐剂)组分中的(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体的比率典型地在这样的范围中进行选择：(m)RNA被完全复合并且在组合物中不剩余游离阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体后者仅剩余可忽略的小量的游离阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体。优选地，(佐剂)组分的比率，即(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体的比率，优选如本文所定义，选自以下范围：约6:1(w/w)至约0,25:1(w/w)，更优选约5:1(w/w)至约0,5:1(w/w)，甚至更优选约4:1(w/w)至约1:1(w/w)或约3:1(w/w)至约1:1(w/w)且最优选约3:1(w/w)至约2:1(w/w)的比率；或者，在(佐剂)组合物中的(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体的比率，优选如本文所定义，也可以基于整个复合物的氮/磷酸酯比(N/P-比)计算。在本发明的情形中，关于复合物中的RNA:阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体(优选如本文所定义)的比，N/P-比优选在约0.1-10的范围中，优选在约0.3-4的范围中且最优选为约0.5-2或0.7-2的范围中，并且最优选在约0.7-1.5范围内，优选地条件是复合物中的阳离子或聚阳离子化合物是本文所定义的阳离子或聚阳离子蛋白质或肽和/或聚合载体。所述比率，特别是重量比和/或N/P比也可适用于本文定义的至少一种RNA与用于与所述至少一种RNA复合的本文定义的阳离子或聚阳离子聚合物或聚合载体。
在本文中，N/P比是阳离子或聚阳离子化合物或的阳离子(侧链)组分的离子电荷的量度。具体地，如果阳离子化合物的阳离子性质是由氮(例如，氨基酸侧链的氮)产生，那么考虑到阳离子化合物中的(侧链)氮原子贡献正电荷并且核酸的磷酸酯主链的磷酸酯贡献负电荷，N/P比表示碱性氮原子与核苷酸主链中的磷酸酯残基的比率。N/P-比被定义为核酸与阳离子或聚阳离子化合物的整个复合物的氮/磷酸酯比率(N/P-比)。这典型地示例阳离子化合物的含量/量，并且表征结合或复合的核酸的含量/量。其可以基于以下进行计算，例如，1μg RNA典型地含有约3nmol磷酸酯残基，条件是RNA展现出碱基的统计学分布。另外，取决于分子量和其(阳离子)氨基酸的数目，1nmol肽典型地含有约x nmol氮残基。
在一个特别优选的实施方案中，本发明组合物包括聚合载体货物复合物，其包括或由以下组成：
a)(作为载体的)由二硫键交联的阳离子组分形成的聚合载体，优选如上文所定义，更优选根据式VII、VIIa、VIIb或VIII；和
b)(作为货物的)至少一种核酸分子，优选免疫刺激RNA，最优选包括根据SEQ IDNOs.5、394或10072的RNA序列的RNA,
优选用作药物，更优选用作免疫刺激剂或佐剂，优选用于治疗癌症或肿瘤疾病，其中聚合载体货物复合物优选瘤内施用。
在一个较佳的实施方案中，本发明的含有RNA的组合物包括聚合载体货物复合物，其包括：
a)(作为载体的)由二硫键交联的阳离子组分形成的聚合载体，优选如上文所定义，更优选根据式VII、VIIa、VIIb或VIII；和
b)(作为货物的)至少一种第一核酸分子，优选免疫刺激RNA，最优选包括根据SEQID NOs.5、394或10072的RNA序列的RNA,
用作免疫刺激剂或用作佐剂，
以及至少一种第二核酸分子，优选编码至少一种蛋白质或肽的RNA(更优选mRNA)，最优选如上文关于编码RNA所公开的，并且
其中本发明组合物优选瘤内施用。
在一个较佳的实施方案中，本发明涉及聚合载体货物复合物，其包括：
a)(作为载体的)由二硫键交联的阳离子组分形成的聚合载体，优选如上文所定义，更优选根据式VII、VIIa、VIIb或VIII；和
a)b)(作为货物的)至少一种第一核酸分子，优选免疫刺激RNA，最优选包括根据SEQ ID NOs.5、394或10072的RNA序列的RNA,
用作免疫刺激剂或用作佐剂，
其中聚合载体货物复合物与以下组合施用，至少一种第二核酸分子，优选编码至少一种蛋白质或肽的RNA(更优选mRNA)，最优选如上文关于编码RNA所公开的，并且
其中聚合载体货物复合物和第二核酸分子优选瘤内施用
至少一种第一核酸、优选免疫刺激RNA和至少一种第二核酸、优选编码至少一种蛋白质或肽的RNA(更优选mRNA)的这种优选组合在上文中在“编码与非编码RNA的组合”的情形下公开。
如本文所用，术语“第一核酸分子”是指在聚合载体货物复合物中用作货物且因此与聚合载体缔合的核分子。如本文所用，术语“第二核酸分子”典型地是指这样的核酸：其不为聚合载体货物复合物的一部分且编码至少一种肽或蛋白质。
在本发明的情形中，免疫刺激剂或佐剂被理解为这样的化合物：其优选高效地诱导先天性免疫应答、特别是诱导抗病毒细胞因子IFN-α。
佐剂或免疫刺激剂通常通过其诱导先天性免疫应答的能力起作用。先天性免疫系统在大部分生物体中形成宿主防御的主要系统，并且包括屏障，诸如体液和化学屏障(包括例如炎症)，补体系统和细胞屏障。先天性免疫系统典型地基于称为模式识别受体(patternrecognition receptors)的少量的受体。它们识别保守的分子模式，所述保守的分子模式区分外源生物体(如病毒、细菌、真菌和寄生虫)与宿主细胞。这种病原体相关的分子模式(PAMP)包括病毒核酸、细菌和真菌壁的组分、鞭毛蛋白和其它。详细研究的第一模式识别受体(PAMP受体)家族是Toll样受体(TLR)家族。TLRs是识别胞外环境的配体或内体腔的配体的跨膜蛋白。在配体结合后，它们通过胞质衔接蛋白转导信号，这导致宿主防御应答的触发并且使抗微生物肽、促炎症趋化因子和细胞因子、抗病毒细胞因子等产生(例如，参见Meylan,E.,J.Tschopp,等(2006),Nature 442(7098):39-44)。其它相关的免疫系统组分包括，例如，内体TLRs，胞质受体，I型干扰素和胞质受体。因此，免疫刺激剂或佐剂在本文中优选定义为先天性免疫应答的诱导剂，其活化模式识别受体(PAMP受体)。由此，信号级联被激发，例如，其可以导致支持先天性免疫应答的细胞因子(例如，IFN-α)的释放。因此，优选的是免疫刺激剂或佐剂的特征是结合这种受体并且激活这种PAMP受体。理想地，所述试剂或佐剂另外通过例如转换免疫应答而支持适应性免疫应答，以便优选种类的Th细胞被活化。取决于要治疗的疾病或病症，向基于Th1的免疫应答的转换可能是优选的，或者在其它情形中，向Th2免疫应答的转换可能是优选的。此外，佐剂通常定义为能够增加和/或调节抗原的固有免疫原性的化合物。
术语“免疫刺激剂”典型地理解为不包括激发适应性/细胞毒性免疫应答(例如，“体液”或“细胞”免疫应答，换言之，激发这样的免疫应答(以及通过它们赋予免疫性)：所述免疫应答的特征在于针对被免疫活性细胞识别为外源的抗原的结构特性的特异性应答)的试剂，例如抗原(无论何种化学结构的抗原)。相反，“免疫刺激剂”典型地理解为意指这样的试剂/化合物/复合物：其本身不触发任何适应性免疫应答，但是其可以特殊地以非特异性方式增强所述适应性免疫应答，例如，通过激活“PAMP”受体并且由此触发支持实际的适应性免疫应答的细胞因子的释放而增强。由此，短语“免疫刺激剂”典型地排除由本身激发适应性免疫应答(本身直接或间接地赋予免疫性)的试剂(例如抗原)的任何免疫刺激。
术语“佐剂”也理解为不包括本身赋予免疫性的试剂。因此，佐剂本身不赋予免疫性，但是以多种方式辅助免疫系统以增强抗原-特异性的免疫应答，例如，通过促使抗原向免疫系统的呈递而增强。由此，例如，佐剂可以优选地调节抗原特异性免疫应答，例如，通过将主要的基于Th1的抗原特异性应答转换为更多基于Th2的抗原特异性应答或反之亦然进行调节。因此，在本发明的情形中术语“免疫刺激剂”和“佐剂”典型地理解为意指这样的试剂、化合物或复合物，其本身不赋予免疫性，但是特殊地以非特异性方式(与抗原特异性免疫应答相反)通过各种作用支持免疫应答，其通过非特异性方式，例如细胞因子表达/分泌、改善的抗原呈递、转换免疫应答的分支(arm)的性质等而调节抗原特异性(适应性细胞和/或体液免疫应答)。因此，术语“佐剂”或“免疫刺激剂”典型地排除本身激发免疫性的任何试剂。
任选与第二核酸分子组合的聚合载体货物复合物的用途允许提供更有效的和/或更安全的药物。有利地，聚合载体货物复合物适于体内递送核酸，特别是用于压缩和稳定用于核酸转染目的的核酸，诸如展现出上文所讨论的高分子量聚合物的一种或多种减少的不利的副作用，诸如低生物降解性或高毒性、团聚性、低体内转染活性等。聚合载体货物复合物还提供改善的体内核酸转运，特别是通过瘤内途径的转运，包括血清稳定性、盐稳定性、摄入效率、减少的补体活化、核酸释放等。所述聚合载体货物复合物还可以通过开始或加强平行的先天性免疫应答而支持适应性免疫应答的诱导和维持。已发现，特别是当聚合载体货物复合物与第二核酸分子、优选编码蛋白质或肽的RNA组合施用时，或当聚合载体货物复合物与第二核酸分子、优选编码蛋白质或肽(优选抗原肽或蛋白质)的RNA共配制于药物组合物中时，可进一步获得改善的适应性免疫应答。在这方面，经由瘤内途径任选地与本文定义的第二核酸分子组合施用包含聚合载体货物复合物的本发明组合物已证实为特别有益的。另外地，聚合载体货物复合物可以展现出改善的储存稳定性，特别是在冻干过程中。
在特定实施方案中，如上文所定义的聚合载体货物复合物增强针对蛋白质或肽的免疫应答，所述蛋白质或肽由第二核酸分子、优选RNA、更优选mRNA编码，该第二核酸分子优选经由瘤内施用途径与聚合载体货物复合物组合施用。
聚合载体货物复合物和/或编码肽或蛋白质的第二核酸分子优选地与药学上可接受的载体和/或赋形剂一起提供。在本发明的情形中，药学上可接受的载体典型地包括液体或非液体物质，其与聚合载体货物复合物和/或第二核酸分子混合。如果聚合载体货物复合物和/或第二核酸分子以液体形式提供，则载体将典型地是不含致热原的水；等渗的盐水或缓冲的水溶液，例如，磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。林格氏溶液或林格氏-乳酸盐溶液作为液体基质(basis)是特别优选的。
本文使用的短语“组合施用”是指这样的情况：其中在编码蛋白质或肽的第二核酸分子向个体的施用之前、与其伴随或在其之后，聚合载体货物复合物施用至相同个体。优选地，施用聚合载体货物复合物与编码蛋白质或肽的至少一种第二核酸分子(优选RNA)之间的时间间隔小于约48小时，更优选小于约24小时、12小时、6小时、4小时、2小时、1小时，最优选小于约30分钟、15分钟或5分钟。在一个特别优选的实施方案中，短语“组合施用”是指伴随地施用聚合载体货物复合物与至少一种第二核酸分子，即同时施用两种组分或在典型地包含少于5分钟的时间段内施用两种组分。短语“组合施用”不仅指这样的情况，其中药学载体货物复合物与至少一种第二核酸分子实体接触或与所述第二核酸分子一起配制。本文使用的短语“组合施用”也包括分开施用聚合载体货物复合物和第二核酸分子(例如通过两次分开的注射)，只要两次施用之间的时间间隔不超过如上文所定义的间隔。或者，聚合载体货物复合物和第二核酸分子可通过在混合聚合载体货物复合物与第二核酸分子之后将混合物给药和施用到个体而组合施用。当聚合载体货物复合物与第二核酸分子一起配制时或当使用如本文所定义的组合物时，聚合载体货物复合物与第二核酸分子可彼此独立地通过如本文所述的施用途径中的任一者而进一步组合施用。
聚合载体货物复合物包括作为货物的至少一种核酸分子。在本发明的情形中，所述核酸分子可以是任意适合的核酸，例如，选自任意(单链或双链)DNA，优选但不限于此，例如，基因组DNA，单链DNA分子，双链DNA分子，编码DNA，DNA引物，DNA探针，免疫刺激性/免疫刺激DNA，(短)DNA寡核苷酸((短)寡脱氧核糖核苷酸)，病毒DNA，或者可以选自例如任意PNA(肽核酸)，或者可以选自例如任意(单链或双链的)RNA，优选但不限于此，(短)RNA寡核苷酸((短)寡核糖核苷酸)，编码RNA，信使RNA(mRNA)，病毒RNA，复制子，免疫刺激性/免疫刺激RNA，小干扰RNA(siRNA)，反义RNA，微小RNA，小核RNA(snRNA)，小发夹(sh)RNA或核糖开关，核酶或适配体；等等。聚合载体货物复合物的核酸分子也可以是核糖体RNA(rRNA)，转运RNA(tRNA)，信使RNA(mRNA)或病毒RNA(vRNA)。优选地，聚合载体货物复合物的核酸分子是RNA。更优选地，聚合载体货物复合物的核酸分子是(线性)单链RNA，甚至更优选地是mRNA或免疫刺激性/免疫刺激RNA。
此外，聚合载体货物复合物的核酸可以是单链的或双链的核酸分子或者部分双链的或部分单链的核酸，其至少部分自我互补(这些部分双链的或部分单链的核酸分子二者典型地由较长的和较短的单链核酸分子形成或由两条长度大约相同的单链核酸分子形成，其中一条单链核酸分子与另一条单链核酸分子部分互补，并且二者由此在该区域中形成双链核酸分子，即，部分双链的或部分单链的核酸分子)。优选地，核酸分子可以是单链核酸分子。此外，核酸分子可以是环形或线性核酸分子，优选是线性核酸分子。
根据一个备选方案，本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子可以是编码核酸，例如DNA或RNA。此外，聚合载体货物复合物可以与编码蛋白质或肽的至少一种第二核酸分子组合施用。
根据一个实施方案，至少一种第一核酸分子和至少一种第二核酸分子二者均是编码核酸分子。优选地，至少一种第一核酸分子和至少一种第二核酸分子每一个编码不同的肽或蛋白质。在一个实施方案中，第一核酸分子具有与第二核酸分子的序列不同的序列，其与聚合载体货物复合物组合施用。或者，第一核酸分子和第二核酸分子可以包括相同的序列或者是相同的。
在至少一种第一核酸分子和/或第二核酸分子的情形中，所述编码DNA或RNA可以是如本文所定义的任何DNA或RNA。优选地，所述编码DNA或RNA可以是单链的或双链的DNA或RNA，更优选地是单链DNA或RNA，和/或环形或线性DNA或RNA，更优选地是线性DNA或RNA。此外，所述编码DNA或RNA可以是基因组DNA，病毒RNA或DNA，复制子，质粒DNA或mRNA。甚至更优选地，所述编码DNA或RNA可以是(线性)单链DNA或RNA。最优选地，根据本发明的核酸分子可以是线性单链信使RNA(mRNA)。所述mRNA可以作为单顺反子、双顺反子或甚至多顺反子RNA存在，即为携带一种、两种或更多种蛋白质或肽的编码序列的RNA。在双顺反子或甚至多顺反子mRNA中的所述编码序列可以被至少一个IRES(例如，如本文定义)序列隔开。
在一个优选实施方案中，至少一种第二核酸分子编码如本文所定义的、优选如在“编码RNA”的情形中所公开的治疗活性蛋白质或抗原。在一个特别优选的实施方案中，与聚合载体货物复合物组合施用的至少一种第二核酸分子编码肽或蛋白质，其在向宿主施用、尤其瘤内施用之后能够激发免疫应答、优选适应性免疫应答。或者，至少一种第二核酸分子编码至少一种治疗活性肽或蛋白质，其优选选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、自杀基因产物、免疫原性蛋白质或肽、细胞凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、热休克蛋白、肿瘤抗原、β-联蛋白抑制剂、STING途径活化剂、检查点调节剂、先天性免疫活化剂、抗体、显性负性受体和诱饵受体、骨髓源性抑制细胞(MDSC)抑制剂、IDO途径抑制剂、和与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽。
在一个特定实施方案中，本文定义的聚合载体货物复合物的第一核酸分子和/或与聚合载体货物复合物组合施用的第二核酸分子可以含有主链修饰、糖修饰或碱基修饰。与本发明相联系的主链修饰是这样的修饰：其中包含于本发明聚合载体货物复合物的核酸分子中的核苷酸的主链的磷酸酯被化学修饰。与本发明相联系的糖修饰是对本发明聚合载体货物复合物的第一核酸分子和/或与聚合载体货物复合物组合施用的第二核酸分子的核苷酸的糖的化学修饰。此外，与本发明相联系的碱基修饰是对本发明聚合载体货物复合物的核酸分子和/或与聚合载体货物复合物组合施用的第二核酸分子的核苷酸的碱基部分的化学修饰。这些修饰在上文中“RNA修饰”的情形中公开。
根据一个其它的实施方案，本文定义的聚合载体货物复合物的第一核酸分子和/或与聚合载体货物复合物组合施用的第二核酸分子可以含有脂质修饰。该脂质修饰的核酸典型地包括本文定义的核酸。该脂质修饰的聚合载体货物复合物的第一核酸分子或脂质修饰的与聚合载体货物复合物组合施用的第二核酸分子典型地还包括与所述核酸分子共价连接的至少一种接头，和与相应的接头共价连接的至少一种脂质。备选地，脂质修饰的核酸分子包括本文定义的至少一种核酸分子和与所述核酸分子共价连接(在没有接头的情况下)的至少一种(双功能)脂质。根据第三备选方案，脂质修饰的核酸分子包括本文定义的核酸分子，与所述核酸分子共价连接的至少一种接头，和与相应的接头共价连接的至少一种脂质，以及同样与所述核酸分子共价连接(在没有接头的情况下)的至少一种(双功能)脂质。
根据进一步的优选实施方案，本发明组合物的至少一种RNA与脂质复合以形成一个或多个脂质体、脂复合物(lipoplexes)或脂质纳米粒。因此，在一个实施方案中，本发明组合物包括包含至少一种RNA的脂质体、脂复合物和/或脂质纳米粒。
基于脂质的配制物归因于其生物相容性及其大规模生产的简易性而已被日益识别为用于RNA的最有前景的递送系统的。已广泛研究阳离子脂质作为用于递送RNA的合成物质。在混合在一起之后，核酸由阳离子脂质缩合以形成称为脂复合物的脂质/核酸复合物。这些脂质复合物能够保护遗传物质免于核酸酶的作用并通过与带负电的细胞膜相互作用将其递送至细胞中。脂复合物可通过在生理pH下直接混合带正电脂质与带负电核酸而制备。
常规脂质体由脂质双层组成，该脂质双层可由阳离子、阴离子或中性(磷酸化)脂质和胆固醇构成，其包围水性核心。脂质双层和水性空间两者可分别并有疏水性或亲水性化合物。脂质体体内特性和行为可通过添加亲水性聚合物涂层(例如聚乙二醇(PEG))至脂质体表面以赋予立体稳定化来进行修饰。此外，脂质体可用于通过将配体(例如，抗体、肽和碳水化合物)连接至其表面或所连接的PEG链的末端来特异性靶向(FrontPharmacol.2015Dec 1；6:286)。
脂质体是胶质的基于脂质且基于表面活性剂的递送系统，其由围绕水性区室的磷脂双层构成。它们可以以球形囊泡存在且大小可在20nm至几微米的范围内。阳离子的基于脂质的脂质体能够经由静电相互作用与带负电核酸复合，这产生了这样的复合物：其提供了体内临床应用所需的生物相容性、低毒性和大规模生产的可能性。脂质体可与质膜融合以便吸收；一旦进入细胞内部，脂质体经由内吞途径处理且遗传物质随后自内体/载体释放至细胞质中。长期以来，脂质体由于其优越的生物相容性而被视为药物递送赋形剂，鉴于脂质体基本上是生物膜的类似物，且可由天然及合成磷脂二者制备(Int JNanomedicine.2014；9:1833–1843)。
阳离子脂质体传统上是用于寡核苷酸(包括质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA/小发夹RNA(shRNA))的最常用的非病毒递送系统。阳离子脂质，诸如1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷
(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)和甲基硫酸N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵
(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl-ammonium methylsulfate，DOTMA)，可以通过静电相互作用与带负电核酸形成复合物或脂复合物以形成纳米粒子，这提供了高的体外转染效率。此外，开发了用于RNA递送的基于脂质的中性纳米脂质体，例如基于1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)的中性纳米脂质体(Adv DrugDeliv Rev.2014Feb；66:110–116.)。
因此，在一个实施方案中，本发明组合物的至少一种RNA与阳离子脂质和/或中性脂质复合且从而形成脂质体、脂质纳米粒、脂复合物或中性的基于脂质的纳米脂质体。
可用作转染或复合剂的优选阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖，例如壳聚糖，聚凝胺，阳离子聚合物，例如聚乙烯亚胺(PEI)，阳离子脂质，例如DOTMA：1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵，DMRIE，二-C14-脒，DOTIM，SAINT，DC-Chol，BGTC，CTAP，DOPC，DODAP，DOPE：二油酰磷脂酰乙醇-胺，DOSPA，DODAB，DOIC，DMEPC，DOGS：双十八烷基酰胺甘氨酰精胺，DIMRI：双肉豆蔻-氧基丙基二甲基羟乙基溴化铵，DOTAP：二油酰氧基-3-(三甲氨基)丙烷，DC-6-14：O,O-双十四烷酰基-N-(α-三甲氨基乙酰基)二乙醇氯化胺，CLIP1：外消旋-[(2,3-双十八烷氧基丙基)(2-羟乙基)]-二甲基氯化铵，CLIP6：外消旋-[2(2,3-双十六烷氧基丙基-氧基甲氧基)乙基]三甲基铵，CLIP9：外消旋-[2(2,3-双十六烷氧基丙基-氧基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基铵，oligofectamine，或阳离子或聚阳离子聚合物，例如改性聚氨基酸，诸如β-氨基酸-聚合物或反向的聚酰胺等，改性聚乙烯，诸如PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶))等，改性丙烯酸酯，诸如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯))等，改性酰氨胺，诸如pAMAM(聚(酰氨胺))等，改性聚β氨基酯(PBAE)，诸如二胺末端改性的1,4丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物等，树状大分子(dendrimer)，诸如聚丙胺树状大分子或基于pAMAM的树状大分子等，聚亚胺，诸如PEI：聚(亚乙基亚胺)，聚(亚丙基亚胺)等，聚烯丙胺，基于糖主链的聚合物，诸如基于环糊精的聚合物，基于葡聚糖的聚合物，壳聚糖等，基于硅烷主链的聚合物，诸如PMOXA-PDMS共聚物等，由一种或多种阳离子嵌段(例如选自如上所述的阳离子聚合物的)与一种或多种亲水性或疏水性嵌段(例如聚乙二醇)的组合组成的嵌段聚合物；等。
额外的药学上活性的化合物：
此外，本发明组合物可包括至少一种额外的药学上活性的组分/化合物。或者或除此之外，至少一种额外的药学上活性的组分/化合物与根据本发明的组合物伴随而共施用。因此，至少一种额外的药学上活性的组分/化合物可与本发明组合物的至少一种RNA或与根据本发明的含有RNA的组合物组合施用。
如本文所用，短语“组合施用”、“共施用”或“伴随施用(concomitantadministration)”是指如下情况，其中本发明组合物或其成分在向个体施用其它药学上活性的组分之前、与之伴随或在其之后向相同个体施用。施用本发明组合物或其成分与至少一种第二药学上活性的组分之间的时间间隔取决于特定的药学上活性的组分的性质和生物效应，且可由医师确定。优选地，时间间隔少于约48小时，更优选少于约24小时、12小时、6小时、4小时、2小时、1小时，最优选少于约30分钟、15分钟或5分钟。在一个特别优选的实施方案中，短语“组合施用”是指伴随地施用本发明组合物或其成分与至少一种第二药学上活性的组分，即同时施用两种化合物或在典型地包含少于5分钟的时间段内施用两种化合物。短语“组合施用”不仅指这样的情况，其中本发明组合物或其成分与至少一种第二药学上活性的组分实体接触或与所述第二药学上活性的组分一起配制。本文使用的短语“组合施用”也包括分开施用本发明组合物或其成分与第二医药学上活性的组分(例如通过两次分开的注射)。或者，本发明组合物或其成分与第二药学上活性的组分可以通过在混合本发明组合物或其成分与第二药学上活性的组分之后将混合物给药和施用到个体而组合施用。当本发明组合物或其成分与第二药学上活性的组分一起配制时或当使用如本文所定义的组合物时，本发明组合物或其成分与第二药学上活性的组分可彼此独立地通过如本文所述的施用途径中的任一者而进一步组合施用。
就此而论，药学上活性的组分/化合物是这样的化合物：其具有用以治愈、改善或预防特定适应症或疾病(即肿瘤或癌症疾病)的治疗效应。所述化合物包括(但不欲限于)优选如本文所定义的肽或蛋白质、优选如本文所定义的核酸、(治疗活性的)低分子量有机或无机化合物(分子量小于5000、优选小于1000)、糖、优选如本文所定义的抗原或抗体、现有技术中已经已知的治疗剂、抗原细胞、抗原细胞片段、细胞部分、细胞壁组分(例如，多糖)、修饰的、减毒的或去活化的(例如以化学方式或通过辐照)病原体(病毒、细菌等)、佐剂等。
在优选实施方案中，本发明组合物还包括至少一种其它药学上活性的组分/化合物，其中所述至少一种其它药学上活性的组分/化合物选自：细胞因子、趋化因子、自杀基因产物、免疫原性蛋白质或肽、细胞凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、热休克蛋白、肿瘤抗原、β-联蛋白抑制剂、STING途径活化剂、检查点调节剂、先天性免疫活化剂、抗体、显性负性受体和诱饵受体、骨髓源性抑制细胞(MDSC)抑制剂、IDO途径抑制剂、和与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽、抗病毒剂、佐剂、化疗剂和激酶抑制剂。
或者或除此之外，至少一种额外的药学上活性的组分可与含有RNA的组合物或本发明组合物的至少一种RNA伴随而共施用，或可与含有RNA的组合物或本发明组合物的至少一种RNA组合使用。
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中公开的基于蛋白质的细胞因子、趋化因子、自杀基因产物、免疫原性蛋白质或肽、细胞凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、热休克蛋白、肿瘤抗原、β-联蛋白抑制剂、STING途径活化剂、检查点调节剂、先天性免疫活化剂、抗体、显性负性受体和诱饵受体、骨髓源性抑制细胞(MDSC)抑制剂、IDO途径抑制剂、和与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽，或其片段或变体，可以用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
1.细胞因子：
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的细胞因子或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
优选地，细胞因子是白细胞介素(IL)。一种或多种白细胞介素可选自例如以下列表：IL-1α、IL-1β、IL-1ra(拮抗剂)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10；IL-11、IL-12、IL-13、IL14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、EL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A/B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35。此外，细胞因子可为一种或多种选自TNF家族的细胞因子，例如选自以下列表：TNF(尤其TNFα)、LTα、LTβ、LIGHT、TWEAK、APRIL、BAFF、TL1A、GITRL、OX40L、CD40L(CD154)、FASL、CD27L、CD30L、4-1BBL、TRAIL、RANK配体。优选细胞因子的其它实例可选自以下列表：FLT3配体、G-CSF、GM-CSF、IFNα/β/ω、IFNγ、LIF、M-CSF、MIF、OSM、干细胞因子、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TSLP配体。
特别优选的是选自以下列表的细胞因子：IL-12、IL-15、IL-2、IFNγ、TNFα、IL-18、IFNα、IL-1β、IL-32、IL-7、IL-21、IL-8、GM-CSF。
在本文中，特别优选的是根据上述表1所公开的细胞因子。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种细胞因子(优选IL-2、IL-12、CD40L或IL-15)或其片段或变体组合。
2.趋化因子
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的趋化因子或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
优选的趋化因子可选自以下列表：CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、XCL1、XCL2、CX3CL1。
在本文中，特别优选的是根据上述表2所公开的趋化因子。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种趋化因子或其片段或变体组合。
3.自杀酶
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的自杀酶或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
自杀酶优选是核苷酸代谢酶。优选地，自杀酶与前药组合使用，该前药是自杀酶的底物，并通过自杀酶转化为细胞毒性化合物。一种或多种优选的自杀酶可选自以下列表：胸苷激酶，优选病毒胸苷激酶，更优选单纯疱疹病毒胸苷激酶、水痘带状疱疹胸苷激酶；植物胸苷激酶，优选西红柿胸苷激酶；胞嘧啶脱氨酶，优选细菌胞嘧啶脱氨酶或酵母胞嘧啶脱氨酶；脱氧核苷激酶，优选黑腹果蝇脱氧核苷激酶；脱氧胞苷激酶，优选哺乳动物脱氧胞苷激酶；嘌呤核苷磷酸化酶，优选细菌嘌呤核苷磷酸化酶。
在本文中，特别优选的是根据上述表3和4所公开的自杀酶(自杀基因产物)。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种自杀酶或其片段或变体组合。
3.免疫原性蛋白质或肽
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的免疫原性蛋白质或肽或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
免疫原性蛋白质或肽优选是病原性抗原，以利用针对所述抗原的预先存在的免疫性来治疗肿瘤和/或癌症疾病。记忆免疫应答被触发且免疫系统被加强以便侵袭肿瘤细胞。
用于本发明的该实施方案的免疫原性蛋白质或肽的优选实例为广泛的病原体的蛋白质或肽，即每种生物体(特别是哺乳动物、优选人类)具有在其生命周期中感染至少一次的高概率的病原体。其包括例如以下的任何结构或非结构蛋白质或肽：
-A或B型流感病毒或任何其他正粘病毒(C型流感病毒)；
-小核糖核酸病毒，诸如鼻病毒或A型肝炎病毒；
-披膜病毒，诸如α病毒或风疹病毒，例如辛德毕斯(Sindbis)病毒、塞姆利基森林(Semliki-Forest)病毒或麻疹病毒(rubeolavirus/measles virus)；
-风疹病毒(rubella virus)(德国麻疹病毒(German measles virus))；
-冠状病毒，特别是HCV-229E或HCV-OC43亚型；
-棒状病毒，诸如狂犬病病毒；
-副粘病毒，诸如腮腺炎病毒；
-呼肠孤病毒，诸如A、B或C组轮状病毒；
-嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)，诸如B型肝炎病毒；
-乳多泡病毒(papovirus)，诸如任何血清型(尤其1至75型)的人类乳头瘤病毒(HPV)；
-腺病毒，特别是1至47型；
-疱疹病毒，诸如单纯疱疹病毒1、2或3；
-巨细胞病毒(CMV)，优选CMVpp65；
-EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)；
-牛痘病毒；及
-细菌肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)(肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae))。
优选的免疫原性蛋白质或肽的其他实例为仅很少感染生物体的病原体的蛋白质或肽。这些蛋白质或肽包括例如以下的任何结构或非结构蛋白质或肽：
-黄病毒，诸如1至4型登革热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒(West Nile virus)、日本脑炎病毒；
-C型肝炎病毒；
-杯状病毒；
-丝状病毒，诸如埃博拉病毒(Ebola virus)；
-博尔纳病毒(bornavirus)；
-布尼亚病毒(bunyavirus)，诸如裂谷热病毒(Rift Valley fever virus)；
-沙粒病毒，诸如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitisvirus，LCMV)或出血热病毒；
-逆转录病毒，诸如HIV；及
-细小病毒。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种免疫原性蛋白质或肽(优选流感核蛋白(NP))或其片段或变体组合。
4.细胞凋亡诱导剂：
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的细胞凋亡诱导剂或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
优选地，细胞凋亡诱导剂选自由以下组成的组：Bcl-2家族及肿瘤抑制蛋白p53及跨膜死亡受体的配位体，尤其TNF(肿瘤坏死因子)受体基因超家族、促凋亡受体激动剂和Beclin-1。
在本发明的情形中，特别优选的细胞凋亡诱导剂为Beclin-1(来源于BECN1基因)。
细胞凋亡诱导剂的其它优选实例可选自以下列表：Bcl-10、Bax、Bak、Bid、Bad、Bim、Bik、Blk、细胞色素c、胱天蛋白酶、尤其胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、死亡结构域，尤其Fas、优选FasL、TNFα、Apo2L/TRAIL、DR4和/或DR5的激动剂、Apo3L、DR4激动抗体、DR5激动抗体、蛋白激酶R(PKR)(优选组成型活性PKR)、颗粒酶B。
在本文中，特别优选的是根据上述表5和6所公开的细胞凋亡诱导剂。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种细胞凋亡诱导剂或其片段或变体组合。
5.血管生成抑制剂
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的血管生成诱导剂或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
根据本发明的血管生成抑制剂的优选实例可选自以下列表：干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素γ(IFN-γ)、CXCL9、CXCL10、白细胞介素12(IL-12)、血小板因子4(PF-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、可溶fms样酪氨酸激酶1(sFLT-1)、胎肝激酶1(FLK-1)、血管抑制素、内皮抑制素、血管形成抑制素、血管能抑制素、肿瘤抑制素、16kD促乳素片段、金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP-1)、金属蛋白酶的组织抑制剂2(TIMP-2)、金属蛋白酶的组织抑制剂3(TIMP-3)、血小板反应蛋白1(TSP-1)、血小板反应蛋白2(TSP-2)、乳腺丝抑蛋白、PEX、可溶酪氨酸蛋白激酶受体1(sTie1)、可溶血管生成素-1受体2(sTie2)、血管生成素-1、血管生成素-2、抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体(例如，阿珠单抗、雷莫芦单抗)、抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体(例如，布罗卢西珠单抗、雷珠单抗、贝伐单抗)和抗血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)抗体(例如，伊克鲁库单抗)。
在本文中，特别优选的是根据上述表7所公开的血管生成抑制剂。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种血管生成抑制剂或其片段或变体组合。
6.热休克蛋白：
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的热休克蛋白或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
优选地，热休克蛋白可选自以下列表：HSP27、HSP47(丝氨酸蛋白酶抑制剂H1)、HSP60、HSP70、HSC70、GRP78(BiP)、HSP90、HSP110、GRP94(gp96)、GRP170(ORP150)、PDI/PDIA、CRT/CALR。
在本文中，特别优选的是根据上述表8所公开的热休克蛋白。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种热休克蛋白或其片段或变体组合。
7.肿瘤抗原：
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的肿瘤抗原或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
在本文中，特别优选的是根据上述表9所公开的肿瘤抗原。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种肿瘤抗原或其片段或变体组合。
8.β-联蛋白抑制剂：
在本文中，如上文在“编码RNA“的情形中所公开的基于蛋白质的β-联蛋白或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
根据本发明的特别优选β-联蛋白抑制剂包含TAT-NLS-BLBD-6、轴蛋白-1、TCF-4、GSK-3b、DKK-1、Dvl-1衍生物或其片段。
化学β-联蛋白抑制剂：
根据本发明，可包含于本发明组合物中的、和/或可与本发明组合物共施用的、或可与本发明组合物组合施用的至少一种额外的活性药学成分可以是化学β-联蛋白抑制剂。可根据本发明施用的化学β-联蛋白抑制剂是本领域中已知的。优选地，化学β-联蛋白抑制剂可选自以下列表：PKF118-310，CGP049090，PKF115-584，PKF222-815，PKF118-744，ICG001，CCT036477，XAV939，酰腙(HQBA)，具有2,3,6-三取代吡啶并[2,3,-b]吡嗪核心骨架的分子，鼠尾草酸，CCT031374，iCRT-3,5,14，NC043，布洛芬(Ibuprofin)，阿司匹林。
如下表13总结了β-联蛋白信号传导的小分子抑制剂的实例，其在本文中是特别优选的。
表13：β-联蛋白抑制剂
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种β-联蛋白或其片段或变体组合。
9.STING途径活化剂
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的STING途径活化剂或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。优选地，至少一种STING途径活化剂(刺激剂)选自STING途径的活化蛋白或组成型活性蛋白(优选DDX41、STING、cGAS、IRF3、TBK1或STAT6)或其片段或变体。
化学STING途径活化剂：
在一个进一步优选的实施方案中，任选的额外药学上活性组分可以选自化学STING途径活化剂，其优选选自环形二核苷酸和呫吨酮类似物。
表14显示了化学STING激动剂的实例。STING激动剂的其它实例公开于WO2014189805。
表14：STING途径活化剂
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种STING途径活化剂或其片段或变体组合。
10.检查点调节剂
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的检查点调节剂或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
在本发明的优选实施方案中，检查点调节剂为B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7/HHLA2、BTLA、CD28、CD28H/IGPR-1、CTLA-4、ICOS、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、VISTA/B7-H5/PD-1H、BTN1A1/嗜乳脂蛋白、BTN2A1、BTN2A2/嗜乳脂蛋白2A2、BTN3A1/2、BTN3A2、BTN3A3、BTNL2/嗜乳脂蛋白样2、BTNL3、BTNL4、BTNL6、BTNL8、BTNL9、BTNL10、CD277/BTN3A1、LAIR1、LAIR2、CD96、CD155/PVR、CRTAM、DNAM-1/CD226、柄蛋白-2/CD112、柄蛋白-3、TIGIT、LILRA3/CD85e、LILRA4/CD85g/ILT7、LILRB1/CD85j/ILT2、LILRB2/CD85d/ILT4、LILRB3/CD85a/ILT5、LILRB4/CD85k/ILT3、4-1BB/TNFRSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α、TNF RII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-3、TIM-4、CD7、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP R的调节剂或其任意组合。
优选地，检查点调节剂选自激动抗体、拮抗抗体、配体、显性负性调节物和诱饵受体或其组合。
优选地，激动抗体选自以下列表：抗4-1BB、抗OX40、抗GITR、抗CD28、抗CD27、抗CD-40抗ICOS、抗TNFRSF25和抗LIGHT。
优选地，拮抗抗体选自以下列表：抗CTLA4、抗PD1、抗PD-L1、抗Vista、抗Tim-3、抗LAG-3和抗BTLA。
特别优选的是抗CTLA-4抗体伊匹单抗曲美木单抗及AGEN-1884。
特别优选的是抗PD1抗体纳武单抗
(MDX-1106/BMS-936558/ONO-4538)(Brahmer等,2010.J Clin Oncol.28(19):3167-75；PMID:20516446)；皮立珠单抗(CT-011)(Berger等,2008.Clin Cancer Res.14(10):3044-51；PMID:18483370)；派姆单抗(MK-3475，SCH 900475)；AMP-224；和MEDI0680(AMP-514)。
特别优选的是抗PD-L1抗体MDX-1105/BMS-936559(Brahmer等2012.N Engl JMed.366(26):2455-65；PMID:22658128)；阿特珠单抗(MPDL3280A/RG7446)；德瓦鲁单抗(MEDI4736)；和阿维单抗(MSB0010718)。
根据本发明，根据表15的检查点调节剂是特别优选的：
表15：针对免疫检查点蛋白的抗体
在另一个优选实施方案中，检查点调节剂是诱饵受体(例如，可溶受体)。优选地，诱饵受体是可溶PD1受体。在一个特别优选的实施方案中，编码可溶PD1受体的RNA序列包括根据SEQ ID NO:389的RNA序列。
在另一个优选实施方案中，检查点调节剂是免疫检查点蛋白的配体。优选地，配体是CD40配体(CD40L)。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种检查点调节剂(优选选自抗-CTLA4抗体，抗-PD1抗体，抗PD-L1抗体，CD40配体，或可溶PD1受体)或其片段或变体组合。
11.先天性免疫活化剂
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的先天性免疫活化剂或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
在本文中，先天性免疫活化剂可选自典型地包括能够激发先天性免疫应答(在哺乳动物中)(例如作为外源性TLR配体结合至TLR的应答)的任何人类蛋白质或肽的哺乳动物，特别是人类佐剂蛋白。更优选地，人类佐剂蛋白选自由这样的蛋白质组成的组：所述蛋白质是模式识别受体的信号传导网络的组分和配体，包括TLR、NLR及RLH，包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11；NOD1、NOD2、NOD3、NOD4、NOD5、NALP1、NALP2、NALP3、NALP4、NALP5、NALP6、NALP6、NALP7、NALP7、NALP8、NALP9、NALP10、NALP11、NALP12、NALP13、NALP14,l IPAF、NAIP、CIITA、RIG-I、MDA5和LGP2，TLR信号传导的信号转导子，包括衔接蛋白，包括例如Trif和Cardif；小GTP酶信号传导的组分(RhoA、Ras、Rac1、Cdc42、Rab等)；PIP信号传导的组分(PI3K、Src激酶等)；MyD88依赖性信号传导的组分(MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TIRAP、TRAF6等)；MyD88非依赖性信号传导的组分(TICAM1、TICAM2、TRAF6、TBK1、IRF3、TAK1、IRAK1等)；活化的激酶，包括例如Akt、MEKK1、MKK1、MKK3、MKK4、MKK6、MKK7、ERK1、ERK2、GSK3、PKC激酶、PKD激酶、GSK3激酶、JNK、p38MAPK、TAK1、IKK和TAK1；活化的转录因子，包括例如NF-κB、c-Fos、c-Jun、c-Myc、CREB、AP-1、Elk-1、ATF2、IRF-3、IRF-7。
此外，哺乳动物、特别是人类佐剂蛋白可选自由以下组成的组：热休克蛋白，诸如HSP10、HSP60、HSP65、HSP70、HSP75及HSP90；gp96；纤维蛋白原；纤连蛋白的TypIII重复序列额外结构域A；或补体系统的组分，包括C1q、MBL、C1r、C1s、C2b、Bb、D、MASP-1、MASP-2、C4b、C3b、C5a、C3a、C4a、C5b、C6、C7、C8、C9、CR1、CR2、CR3、CR4、C1qR、C1INH、C4bp、MCP、DAF、H、I、P及CD59；或诱导的靶标基因，包括例如β-防御素；细胞表面蛋白；或人类佐剂蛋白，包括trif、flt-3配体、Gp96或纤连蛋白等；或以上人类佐剂蛋白中任一者的任何物种同源物。此外，HGMB1可用作佐剂蛋白。
此外，哺乳动物、特别是人类佐剂蛋白可包括诱导或增强先天性免疫应答的细胞因子，包括IL-1α、IL1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、TNFα、IFNα、IFNβ、IFNγ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF；趋化因子，包括IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子、CCL21；由巨噬细胞释放的细胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-8、IL-12及TNF-α；以及IL-1R1及IL-1α。
因此，在本文中，特别优选的是至少一种先天性免疫活化剂优选是佐剂蛋白，更优选人类佐剂蛋白，或其片段或变体。
在本文中，特别优选的是佐剂蛋白的I组成型活性变体是免疫活化剂，优选RIG-1的组成型活性变体(ΔRIGI)。
在另一个优选实施方案中，至少一种先天性免疫活化剂是HGMB1，或其片段或变体。
在本文中，特别优选的是根据上述表11所公开的先天性免疫活化剂。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种先天性免疫活化剂或其片段或变体组合。
12.抗体、诱饵受体和显性负性受体
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的抗体、诱饵受体或显性负性受体或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
根据本发明，根据表16的抗体是特别优选的：
表16：针对与肿瘤或癌症进展相关的蛋白质的抗体
优选地，中和抗体选自抗IL-10及抗TGFβ的列表。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种抗体(优选抗-CD73抗体)或至少一种诱饵受体或其片段或变体组合。
此外，至少一种抗体优选可选自抗CD73抗体或其片段或变体。
在另外的特别优选实施方案中，至少一种抗体选自针对CCR5/CD195的抗体或选自针对其配体CCL5/RANTES的抗体，或其片段或变体。
在一个特别优选的实施方案中，诱饵受体是可溶CCR5(趋化因子受体5型，也称为CD195)。
在一个特别优选的实施方案中，显性负性受体是显性负性CCR5(趋化因子受体5型，也称为CD195)。
13.骨髓源性抑制细胞(MDSCs)抑制剂
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的骨髓源性抑制细胞(MDSCs)抑制剂或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
因此，特别优选的是使用抗IL-17抗体和IL-12作为MDSCs抑制剂。
在本发明的情形中，MDSC抑制可通过直接去活化MDSCs抑制剂(例如，化学NO抑制剂(PDE-5抑制剂、NO-阿司匹林、L-NAME)、精氨酸酶抑制剂(PDE-5抑制剂、COX2抑制剂、NOHA、L-NAME)、ROS抑制剂(合成三萜系化合物))；通过阻断MDSCs向成熟细胞的分化(例如，ATRA、维生素A、维生素D3、CpG)；通过阻断MDSCs的细胞发育(例如，双磷酸化物(zolodronic酸)、细胞信号传导调节剂(JAK2/STAT3抑制剂、多激酶抑制剂、VEGF抑制剂))；或通过耗尽MDSCs(例如，细胞毒性剂(吉西他滨、顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶)或HSP90抑制剂(17-DMAG))而实现。因此，这些化合物也可以用作额外的药学上活性的化合物。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种MDSCs抑制剂或其片段或变体组合。
14.IDO途径抑制剂
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的基于蛋白质的IDO途径抑制剂或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
化学IDO途径抑制剂：
在一个进一步优选的实施方案中，额外的药学上活性的组分可以选自IDO途径抑制剂，其优选选自小分子抑制剂。优选地，IDO途径抑制剂可选自以下列表：Indoximod(1-甲基-色氨酸的D异构体)和NLG919)。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的至少一种IDO途径抑制剂或其片段或变体组合。
15.与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽
细胞凋亡是紧密调节的细胞过程且细胞凋亡的错误调节是人类癌症的标志。已寻求目标为恢复肿瘤细胞中的细胞凋亡的靶向关键细胞凋亡调节因子以作为新颖癌症治疗策略。XIAP、cIAP1和cIAP2，即细胞凋亡蛋白质抑制剂(IAP)的成员，是细胞死亡和存活的重要调节因子且是新颖癌症疗法的诱人靶标。SMAC/DIABLO蛋白质是XIAP、cIAP1和cIAP2的内源性拮抗剂。在过去十年中，密集研究工作已产生了若干小分子SMAC模拟物的设计和开发，所述模拟物现处于用于癌症治疗的临床试验中。
在另一个优选实施方案中，本发明组合物包括至少一种分子，所述至少一种分子与细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP)结合并因此使癌细胞对细胞凋亡死亡敏感。
因此，特别优选的是本发明含有RNA的组合物包括与细胞凋亡抑制剂结合的至少一种分子，诸如SMAC模拟物。
根据本发明，与IAP结合的特别优选的蛋白质或肽包括Omi/HtrA2、Smac、Smac衍生肽、Smac/DIABLO和XAF1(XIAP相关因子1)及其片段或变体。
在本文中，如上文在“编码RNA”的情形中所公开的与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽或其片段和变体可用作额外的药学上活性的组分。或者，编码这些蛋白质或肽或其片段或变体的核酸可用作额外的药学上活性的组分。
因此，特别优选的是额外的药学上活性组分选自与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽，诸如SMAC模拟物。此外，特别优选的是用作额外的药学上活性组分的所述SMAC模拟物是抑制细胞凋亡抑制剂的小分子。
在一个特别优选的实施方案中，含有RNA的组合物的至少一种RNA是免疫刺激RNA(优选根据SEQ ID NOs.5、394或10072)，并且与如上文所定义的与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽或其片段或变体组合。
16.抗细菌剂：
根据本发明，可包含于本发明组合物中和/或可共施用的至少一种额外的活性药学组分可以是抗细菌剂。在本文中，本领域技术人员已知的任何抗细菌剂可与本文定义的本发明组合物的组分组合使用。抗细菌剂的非限制性实例包括：阿米卡星(Amikacin)，阿莫西林(Amoxicillin)，阿莫西林-克拉维酸(Amoxicillin-clavulanic acid)，两性霉素B(Amphothericin-B)，氨苄青霉素(Ampicillin)，氨苄西林舒巴坦(Ampicllin-sulbactam)，安普霉素(Apramycin)，阿奇毒素(Azithromycin)，安曲南(Aztreonam)，杆菌肽(Bacitracin)，苄青霉素(Benzylpenicillin)，卡泊芬净(Caspofungin)，头孢克洛(Cefaclor)，头孢羟氨苄(Cefadroxil)，头孢氨苄(Cefalexin)，头孢噻吩(Cefalothin)，头孢唑啉(Cefazolin)，头孢地尼(Cefdinir)，头孢吡肟(Cefepime)，头孢克肟(Cefixime)，头孢甲肟(Cefmenoxime)，头孢哌酮(Cefoperazone)，头孢哌酮-舒巴坦(Cefoperazone-sulbactam)，头孢噻肟(Cefotaxime)，头孢西丁(Cefoxitin)，Cefbirome，头孢泊肟(Cefpodoxime)，头孢泊肟-克拉维酸(Cefpodoxime-clavulanic acid)，头孢泊肟-舒巴坦(Cefpodoxime-sulbactam)，头孢丙烯(Cefbrozil)，头孢喹诺(Cefquinome)，头孢他啶(Ceftazidime)，头孢布烯(Ceftibutin)，头孢噻呋(Ceftiofur)，头孢吡普(Ceftobiprole)，头孢曲松(Ceftriaxon)，头孢呋辛(Cefuroxime)，氯霉素(Chloramphenicole)，氟苯尼考(Florfenicole)，环丙沙星(Ciprofloxacin)，克拉霉素(Clarithromycin)，克林沙星(Clinafloxacin)，克林霉素(Clindamycin)，氯唑西林(Cloxacillin)，多粘菌素E(Colistin)，复方新诺明(Cotrimoxazol)(甲氧苄啶/磺胺甲唑(Trimthoprim/sulphamethoxazole))，达巴万星(Dalbavancin)，达福普汀(Dalfopristin)/Quinopristin，达托霉素(Daptomycin)，地贝卡星(Dibekacin)，双氯西林(Dicloxacillin)，多利培南(Doripenem)，多西环素(Doxycycline)，恩氟沙星(Enrofloxacin)，厄他培南(Ertapenem)，红霉素(Erythromycin)，氟氯西林(Flucloxacillin)，氟康唑(Fluconazol)，氟胞嘧啶(Flucytosin)，磷霉素(Fosfomycin)，梭链孢酸(Fusidicacid)，加雷沙星(Garenoxacin)，加替沙星(Gatifloxacin)，吉米沙星(Gemifloxacin)，庆大霉素(Gentamicin)，亚胺培南(Imipenem)，伊曲康唑(Itraconazole)，卡那霉素(Kanamycin)，酮康唑(Ketoconazole)，左氧氟沙星(Levofloxacin)，林可霉素(Lincomycin)，利奈唑胺(Linezolid)，氯拉卡比(Loracarbef)，美西林(Mecillnam)(阿姆地诺西林(amdinocillin))，美罗培南(Meropenem)，甲硝唑(Metronidazole)，美洛西林(Meziocillin)，美洛西林-舒巴坦(Mezlocillin-sulbactam)，米诺环素(Minocycline)，莫西沙星(Moxifloxacin)，莫匹罗星(Mupirocin)，萘啶酸(Nalidixic acid)，新霉素(Neomycin)，奈替米星(Netilmicin)，硝基呋喃妥因(Nitrofurantoin)，诺氟沙星(Norfloxacin)，氧氟沙星(Ofloxacin)，苯唑西林(Oxacillin)，培氟沙星(Pefloxacin)，青霉素V，哌拉西林(Piperacillin)，哌拉西林-舒巴坦(Piperacillin-sulbactam)，哌拉西林-他佐巴坦(Piperacillin-tazobactam)，利福平(Rifampicin)，罗红霉素(Roxythromycin)，司帕沙星(Sparfloxacin)，状观霉素(Spectinomycin)，螺旋霉素(Spiramycin)，链霉素(Streptomycin)，舒巴坦(Sulbactam)，磺胺甲唑(Sulfamethoxazole)，替考拉宁(Teicoplanin)，特拉万星(Telavancin)，泰利霉素(Telithromycin)，替莫西林(Temocillin)，四环素(Tetracyklin)，替卡西林(Ticarcillin)，替卡西林-克拉维酸(Ticarcillin-clavulanic acid)，替加环素(Tigecycline)，妥布霉素(Tobramycin)，甲氧苄啶(Trimethoprim)，曲伐沙星(Trovafloxacin)，泰乐菌素(Tylosin)，万古霉素(Vancomycin)，维吉霉素(Virginiamycin)，和伏立康唑(Voriconazole)。
17.抗病毒剂：
根据本发明，可包含于本发明组合物中和/或可共施用的至少一种额外的药学上活性组分/化合物可以是抗病毒剂，优选但不限制地，核苷类似物(例如，齐多夫定(zidovudine)、阿昔洛韦、gangcyclovir、阿糖腺苷(vidarabine)、疱疹净(idoxuridine)、三氟胸苷(trifluridine)和利巴韦林(ribavirin))，膦甲酸(foscarnet)，金刚烷胺(amantadine)，帕拉米韦(peramivir)，金刚乙胺(rimantadine)，沙奎那韦(saquinavir)，茚地那韦(indinavir)，利托那韦(ritonavir)，α-干扰素和其它干扰素，AZT，t-705，扎那米韦(zanamivir)和奥塞米韦(oseltamivir)其它抗病毒剂包括：流感病毒疫苗，例如，(Glaxo SmithKline)、(Medlmmune Vaccines)、(Chiron Corporation)、(GlaxoSmithKline)、(CSLBiotherapies Inc.)、(Novartis)或(Aventis Pasteur)。
18.药物：
在一些实施方案中，额外的药学上活性组分/化合物可包括至少一种药物。术语“药物”旨在包括当引入或吸收至活生物体机体中时改变正常机体或细胞功能的任何物质。适合的药物的一些非限制性实例，包括药物的组合和替代形式(诸如替代盐形式、游离酸形式、游离碱形式、前药和水合物)，包括：镇痛药/解热药(例如，阿司匹林、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生钠(naproxen sodium)、丁丙诺啡(buprenorphine)、盐酸丙氧芬(propoxyphene hydrochloride)、萘磺酸丙氧芬(propoxyphene napsylate)、盐酸哌替啶(meperidine hydrochloride)、盐酸氢吗啡酮(hydromorphone hydrochloride),吗啡(morphine)、羟考酮(oxycodone)、可待因(codeine)、酒石酸二氢可待因(dihydrocodeine bitartrate)、喷他佐辛(pentazocine)、酒石酸氢可酮(hydrocodone bitartrate)、左啡诺(levorphanol)、二氟尼柳(diflunisal)、水杨酸三乙醇胺(trolamine salicylate)、盐酸纳布啡(nalbuphinehydrochloride)、甲芬那酸(mefenamic acid)、布托啡诺(butorphanol)、水杨酸胆碱(choline salicylate)、布他比妥(butalbital)、枸橼酸苯托沙敏(phenyltoloxaminecitrate)、枸橼酸苯海拉明(diphenhydramine citrate)、左美丙嗪(methotrimeprazine)、盐酸桂美君(cinnamedrine hydrochloride)和甲丙氨酯(meprobamate))；平喘药(例如，酮替芬(ketotifen)和曲呫诺(traxanox)；抗生素类(例如，新霉素、链霉素、氯霉素、头孢菌素(cephalosporin)、氨苄青霉素、青霉素、四环素(tetracycline)和环丙沙星)；抗抑郁药(例如，奈福泮(nefopam)、奥昔哌汀(oxypertine)、多塞平(doxepin)、阿莫沙平(amoxapine)、曲唑酮(trazodone)、阿米替林(amitriptyline)、马普替林(maprotiline)、苯乙肼(phenelzine)、地昔帕明(desipramine)、去甲替林(nortriptyline)、反苯环丙胺(tranylcypromine)、氟西汀(fluoxetine)、丙咪嗪(imipramine)、双羟萘酸丙咪嗪(imipramine pamoate)、异卡波肼(isocarboxazid)、曲米帕明(trimipramine)和普罗替林(protriptyline))；抗糖尿病药(例如，双胍类和磺酰脲衍生物)；抗真菌剂(例如，灰黄霉素(griseofulvin)、酮康唑(ketoconazole)、伊曲康唑、两性霉素(amphotericin B)、制霉菌素(nystatin)和克念菌素(candicidin))；抗高血压药(例如，心得安(propanolol)、普罗帕酮(propafenone)、氧烯洛尔(oxyprenolol)、硝苯地平(nifedipine)、利血平(reserpine)、咪噻吩(trimethaphan)、酚苄明(phenoxybenzamine)、盐酸帕吉林(pargylinehydrochloride)、地舍平(deserpidine)、二氮嗪(diazoxide)、单硫酸胍乙啶(guanethidine monosulfate)、米诺地尔(minoxidil)、瑞西那明(rescinnamine)、硝普钠(sodium nitroprusside)、萝芙木蛇根碱(rauwolfia serpentine)、萝芙西隆(alseroxylon)和酚妥拉明(phentolamine))；抗炎药(例如，(非甾体)吲哚美辛((non-steroidal)indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、萘普生(naproxen)、布洛芬、雷米那酮(ramifenazone)、吡罗昔康(piroxicam)、(甾体)可的松((steroidal)cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氟扎可特(fluazacort)、地夫可特(deflazacort)、塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松龙(prednisolone)和强的松(prednisone))；抗肿瘤药(例如，环磷酰胺(cyclophosphamide)、放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、丝裂霉素(mitomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate),氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine,BCNU)、甲基-CCNU,顺铂(cisplatin)、依托泊苷(etoposide)、喜树碱(camptothecin)及其衍生物、苯芥胆甾醇(phenesterine)、紫杉醇(paclitaxel)及其衍生物、多西他赛(docetaxel)及其衍生物、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、戈舍瑞林(goserelin)、亮脯利特(leuprolide)、他莫昔芬(tamoxifen)、干扰素α、视黄酸(retinoic acid,ATRA)、氮芥烷化剂(nitrogen mustard alkylating agents)和哌泊舒凡(piposulfan))；抗焦虑药(例如，劳拉西泮(lorazepam)、丁螺环酮(buspirone)、普拉西泮(prazepam)、利眠宁(chlordiazepoxide)、奥沙西泮(oxazepam)、氯拉酸二钾酯(clorazepatedipotassium)、地西泮(diazepam)、双羟萘酸羟嗪(hydroxyzine pamoate)、盐酸羟嗪(hydroxyzine hydrochloride)、阿普唑仑(alprazolam)、氟哌利多(droperidol)、哈拉西泮(halazepam)、氯美扎酮(chlormezanone)和丹曲林(dantrolene))；免疫抑制剂(例如，环孢菌素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、咪唑立宾(mizoribine)和FK506(他克莫司(tacrolimus))；抗偏头痛药(例如，麦角胺(ergotamine)、心得安、粘酸异美汀(isometheptene mucate)和氯醛比林(dichloralphenazone))；镇静剂/安眠药(例如，巴比妥类(barbiturates)诸如戊巴比妥(pentobarbital)、戊巴比妥和司可巴比妥(secobarbital)；以及苯二氮类(benzodiazapines)诸如盐酸氟西泮(flurazepamhydrochloride),三唑仑(triazolam)和咪达唑仑(midazolam))；抗心绞痛药(例如，β-肾上腺素能阻断药(beta-adrenergic blockers)；钙通道阻滞剂(calcium channel blockers)诸如硝苯地平(nifedipine)和地尔硫卓(diltiazem)；以及硝酸盐类诸如硝酸甘油(nitroglycerin),硝酸异山梨酯(isosorbide dinitrate)、(pentearythritoltetranitrate)和丁四硝酯(erythrityl tetranitrate))；抗精神病药(例如，氟哌啶醇(haloperidol)、琥珀酸洛沙平(loxapine succinate)、盐酸洛沙平(loxapinehydrochloride)、硫利达嗪(thioridazine)、盐酸硫利达嗪(thioridazinehydrochloride)、替沃噻吨(thiothixene)、氟非乃静(fluphenazine)、氟奋乃静癸酸酯(fluphenazine decanoate)、氟奋乃静庚酸酯(fluphenazine enanthate)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、奋乃静(perphenazine)、枸椽酸锂(lithium citrate)和丙氯拉嗪(prochlorperazine))；抗躁狂药(例如，碳酸锂(lithiumcarbonate))；抗心律失常药(例如，甲苯磺酸溴苄铵(bretylium tosylate)、艾司洛尔(esmolol)、维拉帕米(verapamil)、胺碘酮(amiodarone)、encamide、地高辛(digoxin)、洋地黄毒苷(digitoxin)、美西律(mexiletine)、磷酸双异丙吡胺(disopyramidephosphate)、普鲁卡因胺(procainamide)、硫酸奎尼丁(quinidine sulfate)、葡萄糖酸奎尼丁(quinidine gluconate)、聚半乳糖醛酸奎尼丁(quinidine polygalacturonate)、醋酸氟卡胺(flecamide acetate)、tocamide和利多卡因(lidocaine))；抗关节炎药(例如，保泰松(phenylbutazone)、舒林酸(sulindac)、青霉胺(penicillanine)、双水杨酯(salsalate)、吡罗昔康(piroxicam)、硫唑嘌呤、吲哚美辛、甲氯灭酸盐(meclofenamate)、硫代苹果酸金钠(gold sodium thiomalate)、酮洛芬、金诺芬(auranofin)、金硫葡糖(aurothioglucose)和托美丁钠(tolmetin sodium))；抗痛风药(例如，秋水仙碱(colchicine)和别嘌呤醇(allopurinol))；抗凝剂(例如，肝素(heparin)、肝素钠(heparinsodium)和华法林钠(warfarin sodium))；血栓溶解剂(例如，尿激酶(urokinase)、链激酶(streptokinase)和阿替普酶(alteplase))；纤溶对抗物(例如，氨基己酸(aminocaproicacid))；活血药(例如，己酮可可碱(pentoxifylline))；抗血小板剂(例如，阿司匹林)；抗惊厥药(例如，丙戊酸(valproic acid)、双丙戊酸钠(divalproex sodium)、苯妥英(phenyloin)、苯妥英钠(phenyloin sodium)、氯硝西泮(clonazepam)、扑米酮(primidone)、苯巴比妥(phenobarbital)、卡马西平(carbamazepine)、异戊巴比妥钠(amobarbital sodium)、甲琥胺(methsuximide)、美沙比妥(metharbital)、甲苯比妥(mephobarbital)、美芬妥英(mephenyloin)、苯琥胺(phensuximide)、甲乙双酮(paramethadione)、乙苯妥英(ethotoin)、苯乙酰脲(phenacemide)、司可巴比妥钠(secobarbital sodium)、氯拉酸二钾酯和三甲双酮(trimethadione))；抗帕金森药(例如，乙琥胺(ethosuximide))；抗组织胺药/止痒药(例如，羟嗪、苯海拉明(diphenhydramine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、马来酸溴苯那敏、盐酸赛庚啶(cyproheptadine hydrochloride)、特非那定(terfenadine)、富马酸氯马斯汀(clemastine fumarate)、曲普利啶(triprolidine)、卡比沙明(carbinoxamine)、二苯拉林(diphenylpyraline)、苯茚胺(phenindamine)、阿扎他定(azatadine)、曲吡那敏(tripelennamine)、马来酸右氯苯那敏(dexchlorpheniramine maleate)、甲地嗪(methdilazine)和)；可用于钙调节的试剂(例如，降钙素(calcitonin)和甲状旁腺素(parathyroid hormone))；抗细菌剂(例如，硫酸阿米卡星(amikacin sulfate)、安曲南、氯霉素、棕榈酸氯霉素、环丙沙星、克林霉素、棕榈酸克林霉素、磷酸克林霉素、甲硝唑、盐酸甲硝唑、硫酸庆大霉素、盐酸林可霉素、硫酸妥布霉素、盐酸万古霉素、硫酸多粘菌素B(polymyxin B sulfate)、多粘菌素E甲磺酸钠(colistimethate sodium)和硫酸多粘菌素E(colistin sulfate))；抗病毒剂(例如，干扰素α、β或γ、齐多夫定、盐酸金刚烷胺、利巴韦林和阿昔洛韦)；抗微生物剂(例如，头孢菌素类(cephalosporins)诸如头孢唑啉钠、头孢拉定(cephradine)、头孢克洛、头孢匹林钠(cephapirin sodium)、头孢唑肟钠(ceftizoximesodium)、头孢哌酮钠、头孢替坦二钠(cefotetan disodium)、头孢呋辛乙酰氧乙酯(cefuroxime axetil)、头孢噻肟钠、头孢羟氨苄一水合物、头孢氨苄(cephalexin)、头孢噻吩钠(cephalothin sodium)、盐酸头孢氨苄一水合物、头孢孟多甲酸酯钠(cefamandolenafate)、头孢西丁钠、头孢尼西钠(cefonicid sodium)、头孢雷特(ceforanide)、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢羟氨苄、头孢拉定和头孢呋辛钠；青霉素类诸如氨苄青霉素、阿莫西林、苄星青霉素G(penicillin G benzathine)、环青霉素(cyclacillin)、氨苄青霉素钠、青霉素G钾、青霉素V钾、哌拉西林钠、苯唑西林钠、盐酸巴氨西林(bacampicillinhydrochloride)、氯唑西林钠(cloxacillin sodium)、替卡西林二钠(ticarcillindisodium)、阿洛西林钠(azlocillin sodium)、卡茚西林钠(carbenicillin indanylsodium)、普鲁卡因青霉素(penicillin G procaine)、甲氧西林钠(methicillin sodium)和萘夫西林钠(nafcillin sodium)；大环内酯类(macrolides)诸如阿奇毒素、克拉霉素和红霉素类(erythromycins)诸如琥乙红霉素(erythromycin ethylsuccinate)、红霉素、依托红霉素(erythromycin estolate)、乳糖酸红霉素(erythromycin lactobionate)、硬脂酸红霉素(erythromycin stearate)和琥乙红霉素；以及四环素类(tetracyclines)诸如盐酸四环素、盐酸多西环素(doxycycline hyclate)和盐酸米诺环素)；抗感染药(例如，GM-CSF)；支气管扩张药(例如，拟交感神经药(sympathomimetics)诸如盐酸肾上腺素、硫酸奥西那林(metaproterenol sulfate)、硫酸特布他林(terbutaline sulfate)、异他林(isoetharine)、甲磺酸异他林、盐酸异他林、硫酸舒喘宁(albuterol sulfate)、舒喘宁(albuterol)、甲磺酸比托特罗(bitolterolmesylate)、盐酸异丙肾上腺素(isoproterenolhydrochloride)、硫酸特布他林、酸式酒石酸肾上腺素(epinephrine bitartrate)、硫酸奥西那林、肾上腺素和酸式酒石酸肾上腺素；抗胆碱药诸如异丙托溴铵(ipratropiumbromide)；黄嘌呤类诸如氨茶碱(aminophylline)、二羟丙茶碱(dyphylline)、硫酸奥西那林和茶碱(theophylline)；肥大细胞稳定剂诸如色甘酸钠(cromolyn sodium)；皮质类固醇类吸入剂(inhalant corticosteroids)诸如二丙酸倍氯米松(beclomethasonedipropionate,BDP)和二丙酸倍氯米松一水合物；沙丁胺醇(salbutamol)；异丙托溴铵；布地奈德(budesonide)；沙美特罗(salmeterol)；昔萘酸盐(xinafoate)；曲安西龙(triamcinolone)；奈多罗米钠(nedocromil sodium)；氟尼缩松(flunisolide)；丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)；甾体化合物和激素(例如，雄激素类诸如达那唑(danazol)、环戊丙酸睾酮(testosterone cypionate)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、乙睾酮(ethyltestosterone)、庚酸睾酮(testosterone enathate)、甲睾酮(methyltestosterone)；雌激素类诸如雌二醇(estradiol)、雌酮硫酸酯哌嗪(estropipate)和结合雌激素(conjugated estrogens)；孕激素类诸如乙酸甲氧基孕酮(methoxyprogesterone acetate)和醋酸炔诺酮(norethindrone acetate)；皮质类固醇类诸如曲安西龙、倍他米松(betamethasone)、倍他美松磷酸钠(betamethasone sodiumphosphate)、地塞米松、地塞米松磷酸钠、醋酸地塞米松、强的松、醋酸甲基泼尼松龙悬浮剂(methylprednisolone acetate suspension)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙磷酸钠、甲基泼尼松龙琥珀酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、己曲安奈德(triamcinolone hexacetonide)、氢化可的松、氢化可的松环戊丙酸酯(hydrocortisone cypionate)、泼尼松龙、醋酸氟氢可的松(fludrocortisoneacetate)、醋酸泼拉米松(paramethasone acetate)、泼尼松龙叔丁乙酯(prednisolonetebutate)、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠以及甲状腺激素类诸如左甲状腺素钠(levothyroxine sodium))；降血糖药(例如，人胰岛素、纯化的牛胰岛素、纯化的猪胰岛素、格列本脲(glyburide)、二甲双胍(metformin)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列吡嗪(glipizide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)和妥拉磺脲(tolazamide))；降血脂药(例如，氯贝丁酯(clofibrate)、右甲状腺素钠(dextrothyroxine sodium)、普罗布考(probucol)、普伐他汀(pravastitin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)和烟酸(niacin))；蛋白质(例如，脱氧核糖核酸酶(Dnase)、藻酸酶(alginase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)和脂肪酶(lipase))；核酸(例如，反义核酸)；可用于刺激红细胞生成的试剂(例如，红细胞生成素)；抗溃疡/抗反流药(例如，法莫替丁(famotidine)、西眯替丁(cimetidine)和盐酸雷尼替丁(ranitidine hydrochloride))；止恶心药/止吐药(例如，盐酸美克洛嗪(meclizine hydrochloride)、大麻隆(nabilone)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、盐酸异丙嗪(promethazinehydrochloride)、硫乙拉嗪(thiethylperazine)和东莨菪碱(scopolamine))；以及可用于本文描述的组合物和方法中的其它药物包括米托坦(mitotane)、卤亚硝基脲(halonitrosoureas)、蒽环类(anthrocyclines)、玫瑰树碱(ellipticine)、头孢曲松(ceftriaxone)、酮康唑、头孢他啶、奥沙普秦(oxaprozin)、伐昔洛韦(valacyclovir)、尿促卵泡素(urofollitropin)、泛昔洛韦(famciclovir)、氟他胺(flutamide)、依那普利(enalapril)、伊曲康唑、丁螺环酮、加巴喷丁(gabapentin)、福辛普利(fosinopril)、曲马多(tramadol)、阿卡波糖(acarbose)、劳拉西泮、促卵泡素(follitropin)、奥美拉唑(omeprazole)、氟西汀、赖诺普利(lisinopril)、曲马多、左氧氟沙星、扎鲁司特(zafirlukast)、干扰素、生长激素、白细胞介素、促红细胞生成素、粒细胞刺激因子、尼扎替丁(nizatidine)、安非他酮(bupropion)、培哚普利(perindopril)、特丁胺(erbumine)、腺苷、阿伦膦酸钠(alendronate)、前列地尔(alprostadil)、贝那普利(benazepril)、倍他洛尔(betaxolol)、硫酸博来霉素、右芬氟拉明(dexfenfluramine)、地尔硫卓、芬太尼(fentanyl)、氟卡胺(flecamide)、吉西他滨、醋酸格拉默(glatiramer acetate)、格拉司琼(granisetron)、拉米夫定(lamivudine)、锰福地吡三钠(mangafodipir trisodium)、美沙拉秦(mesalamine)、富马酸美托洛尔(metoprolol fumarate)、甲硝唑、米格列醇(miglitol)、莫昔普利(moexipril)、孟鲁司特(monteleukast)、醋酸奥曲肽(octreotideacetate)、奥洛他定(olopatadine)、帕立骨化醇(paricalcitol)、生长激素(somatropin)、琥珀酸舒马曲坦(sumatriptan succinate)、他克林(tacrine)、维拉帕米、萘丁美酮(nabumetone)、曲伐沙星、多拉司琼(dolasetron)、齐多夫定、非那雄胺(finasteride)、妥布霉素、伊拉地平(isradipine)、托卡朋(tolcapone)、依诺肝素(enoxaparin)、氟康唑(fluconazole)、兰索拉唑(lansoprazole)、特比萘芬(terbinafine)、氨羟二磷酸二钠(pamidronate)、地达诺新(didanosine)、双氯芬酸(diclofenac)、西沙必利(cisapride)、文拉法辛(venlafaxine)、曲格列酮(troglitazone)、氟伐他汀(fluvastatin)、氯沙坦(losartan)、伊米苷酶(imiglucerase)、多奈哌齐(donepezil)、奥氮平(olanzapine)、缬沙坦(valsartan)、非索非那定(fexofenadine)、降钙素和异丙托溴铵。在一些实施方案中，药物可以是水溶性的。在一些实施方案中，药物可以是非水溶性的。
19.与标准疗法的组合：
根据本发明，可包含于本发明组合物中的和/或可共施用的至少一种额外的药学上活性组分/化合物可选自用于治疗特定肿瘤或癌症疾病的任何标准疗法，例如任何化学疗法、检查点调节剂、激酶抑制剂等。
佐剂和其它组分：
根据本发明，可包含于本发明组合物中的和/或可共施用的至少一种额外的活性药学组分可以是佐剂。根据一个特定实施方案，本发明组合物可以包括佐剂。在本文中，佐剂可以被理解为适于启动或增加先天性免疫系统的免疫应答，即非特异性免疫应答。换言之，当施用时，本发明组合物优选由包含在其中的佐剂所致而激发先天性免疫应答。优选地，这种佐剂可以选自技术人员已知且适于本发明情况(即，支持在哺乳动物中诱导先天性免疫应答)的佐剂。
作为适于储存和递送的佐剂特别优选的是如上文关于本发明组合物的RNA作为赋形剂、转染或复合剂所定义的阳离子或聚阳离子化合物。
此外，本发明组合物可包含一种或多种额外的佐剂，其适于启动或增加先天性免疫系统的免疫应答(即，非特异性免疫应答)，特别是通过结合至病原体相关分子模式(PAMPs)。换言之，当施用时，药物组合物优选由包含在其中的佐剂所致而激发先天性免疫应答。优选地，这种佐剂可以选自技术人员已知且适用于本发明情况(即，支持哺乳动物中先天性免疫应答的诱导)的佐剂。
这种佐剂还可以选自技术人员已知且适用于本发明情况(即，支持哺乳动物中先天性免疫应答的诱导和/或适于储存和递送本发明组合物的组分)的佐剂。作为适于储存和递送的佐剂优选的是如上文所定义的阳离子或聚阳离子化合物。同样地，佐剂可以选自由例如如上文所定义的阳离子或聚阳离子化合物组成的组，来自壳聚糖，TDM，MDP，胞壁酰基二肽，普流尼克类(pluronics)，明矾溶液，氢氧化铝，ADJUMERTM(聚磷腈)；磷酸铝凝胶；来自藻类的葡聚糖；algammulin；氢氧化铝凝胶(明矾)；高蛋白质吸附氢氧化铝凝胶；低粘度氢氧化铝凝胶；AF或SPT(角鲨烷(5％)，Tween 80(0.2％)，普流尼克L121(1.25％)，磷酸缓冲盐水，pH 7.4的乳液)；AVRIDINETM(丙烷二胺)；BAY R1005TM((N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-b-D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基-十二烷酰基-酰胺氢乙酸酯(hydroacetate))；CALCITRIOLTM(1-α,25-二羟基-维生素D3)；磷酸钙凝胶；CAPTM(磷酸钙纳米粒)；霍乱全毒素，霍乱-毒素-A1-蛋白质-A-D-片段融合蛋白，霍乱毒素的B亚基；CRL 1005(嵌段共聚物P1205)；含细胞因子的脂质体；DDA(二甲基双十八烷基溴化铵)；DHEA(脱氢表雄酮)；DMPC(双十四烷酰基磷脂酰胆碱)；DMPG(双十四烷酰基磷脂酰甘油)；DOC/明矾络合物(脱氧胆酸钠盐)；弗氏完全佐剂；弗氏不完全佐剂；γ菊糖；Gerbu佐剂(以下各项的混合物：i)N-乙酰基葡糖氨基-(P1-4)-N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D35-谷氨酰胺(GMDP)，ii)二甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，iii)锌-L-脯氨酸盐络合物(ZnPro-8)；GM-CSF)；GMDP(N-乙酰基葡糖氨基-(b1-4)-N-乙酰基胞壁酰基-L47-丙氨酰基-D-异谷酰胺)；咪喹莫特(imiquimod)(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)；ImmTherTM(N-乙酰基葡糖氨基-N-乙酰基胞壁酰基-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-甘油二棕榈酸酯)；DRV(制备自脱水-再水合囊泡的免疫脂质体)；干扰素-γ；白介素-1β；白介素-2；白介素-7；白介素-12；ISCOMSTM；ISCOPREP7.0.3.TM；脂质体；LOXORIBINETM(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)；LT5口服佐剂(大肠杆菌不稳定肠毒素-原毒素)；任何组成的微球和微粒；MF59TM；(角鲨烯-水乳液)；MONTANIDE ISA 51TM(纯化的不完全弗氏佐剂)；MONTANIDE ISA720TM(可代谢的油性佐剂)；MPLTM(3-Q-去酰基(desacyl)-4'-单磷酰基脂质A)；MTP-PE和MTP-PE脂质体((N-乙酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰氨基-L-丙氨酸-2-(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-(羟基磷酰氧基))-乙基酰胺，一钠盐)；MURAMETIDETM(Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3)；MURAPALMITINETM和DMURAPALMITINETM(Nac-Mur-L-Thr-D-异GIn-sn-甘油二棕榈酰基)；NAGO(神经氨酸酶-半乳糖氧化酶)；任何组成的纳米球或纳米粒；NISV(非离子表面活性剂小泡)；PLEURANTM(β-葡聚糖)；PLGA，PGA和PLA(乳酸和乙醇酸的均聚物和共聚合物；微球/纳米球)；普流尼克L121TM；PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)；PODDSTM(类蛋白微球)；聚亚乙基氨基甲酸酯衍生物；聚-rA：聚-rU(聚腺苷酸-聚尿苷酸复合物)；聚山梨酸酯80(Tween 80)；蛋白脂质卷(protein cochleate)(Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,AL)；STIMULONTM(QS-21)；Quil-A(Quil-A皂苷)；S-28463(4-氨基-otec-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑并[4,5c]喹啉-1-乙醇)；SAF-1TM("Syntex佐剂制剂")；Sendai脂蛋白体和含Sendai的脂质基质；Span-85(脱水山梨醇三油酸酯)；Specol(Marcol 52、Span 85和Tween 85的乳液)；角鲨烯或(2,6,10,15,19,23-六甲基二十四烷和2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯(tetracosahexane))；硬脂酰酪氨酸(十八烷基酪氨酸盐酸盐)；(N-乙酰基葡糖氨基-N-乙酰基胞壁酰基-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酰基丙基酰胺)；苏氨酰基-MDP(TermurtideTM或[thr 1]-MDP；N-乙酰基胞壁酰基-L苏氨酰基-D-异谷氨酸)；Ty颗粒(Ty-VLP或病毒样颗粒)；Walter-Reed脂质体(含有吸附在氢氧化铝上的脂质A的脂质体)，和脂肽，包括Pam3Cys，尤其是铝盐，如Adju-phos，Alhydrogel，Rehydragel；乳液，包括CFA，SAF，IFA，MF59，Provax，TiterMax，Montanide，Vaxfectin；共聚物，包括Optivax(CRL1005)，L121，Poloaxmer4010)等；脂质体，包括Stealth，脂质卷，包括BIORAL；来源于植物的佐剂，包括QS21，Quil A，Iscomatrix，ISCOM；适用于共刺激的佐剂，包括番茄素，生物聚合物，包括PLG，PMM，菊糖；来源于微生物的佐剂，包括罗莫肽(Romurtide)，DETOX，MPL，CWS，甘露糖，CpG核酸序列，CpG7909，人TLR 1-10的配体，鼠TLR 1-13的配体，ISS-1018，35IC31，咪唑并喹啉，聚肌胞(Ampligen)，Ribi529，IMOxine，IRIVs，VLPs，霍乱毒素，热不稳定毒素，Pam3Cys，Flagellin，GPI锚定物，LNFPIII/Lewis X，抗微生物肽，UC-1V150，RSV融合蛋白质，cdiGMP；以及适用作拮抗剂的佐剂，包括CGRP神经肽。
特别优选地，佐剂可选自支持Th1免疫应答的诱导或幼稚T细胞的成熟的佐剂，诸如GM-CSF、IL-12、IFNg、如本文所定义的任何RNA(优选免疫刺激性RNA)、CpG DNA等。
有可能的是，本发明组合物除如上文所述的至少一种RNA之外含有选自包含以下的群组的其它组分：其它抗原或其它抗原提供核酸；其它免疫治疗剂；一种或多种辅助物质；或已知归因于其与人类Toll样受体的结合亲和力(作为配体)而具有免疫刺激性的任何其它化合物；和/或佐剂核酸、优选免疫刺激性RNA(isRNA)。
如有需要，本发明组合物可额外地含有一种或多种辅助物质以便增加其免疫原性或免疫刺激性能力。由此优选地实现如本文所定义的至少一种RNA和可任选地包含于本发明组合物中的辅助物质的协同作用。取决于辅助物质的不同类型，在该方面中可考虑多种机制。例如，允许树突状细胞(DC)成熟的化合物，例如脂多糖、TNF-α或CD40配体，形成了第一类合适的辅助物质。通常，可能的是使用任何以“危险信号”方式影响免疫系统的试剂(LPS、GP96等)或允许免疫应答以靶向方式被增强和/或影响的细胞因子(诸如，GM-CFS)作为辅助物质。特别优选的辅助物质是进一步促进先天性免疫应答的细胞因子，诸如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子，诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α，生长因子诸如hGH。
本发明组合物可含有已知归因于其与人类Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的结合亲和力(作为配体)或归因于其与鼠类Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的结合亲和力(作为配体)而具有免疫刺激性的任何其它化合物。
可以包括在本发明组合物中的其它添加剂为乳化剂，诸如Tween；湿润剂，诸如月桂基磺酸钠；着色剂；调味剂；药物载体；成片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。
药物组合物：
在其它方面中，本发明也提供了一种药物组合物，其包含如本文所定义的含有RNA的组合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。优选地，药物组合物经制备以用于瘤内施用、优选通过注射至肿瘤组织中。本发明药物组合物的无菌可注射形式可以是水性或油状悬浮液。这些悬浮液可根据本领域中已知的技术使用适合的分散剂或湿润剂以及悬浮剂来配制。
药学上可接受的载体典型地包括包含本发明组合物的组分的组合物的液体或非液体基质。如果组合物以液体形式提供，则载体将典型地是不含致热原的水；等渗的盐水或缓冲的(水)溶液，例如，磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。相对于具体的参比介质，注射缓冲液可以是高渗的、等渗的或低渗的，即相对于具体的参比介质，所述缓冲液可以具有更高的、相同的或更低的盐含量，其中优选地可使用前面提及的盐的这样的浓度：所述浓度由于渗透或其它浓度效应而不导致细胞损伤。参比介质是例如在“体内”方法中出现的液体，诸如血液、淋巴液、细胞溶质液或其它体液，或例如在“体外”方法中可以用作参比介质的液体，诸如常见的缓冲液或液体。这种常见缓冲剂或液体是技术人员已知的。林格氏-乳酸盐溶液作为液体基质是特别优选的。
然而，适于施用于待治疗的患者的一种或多种相容的固体或液体填充剂或稀释剂或包封化合物也可用于根据本发明的药物组合物。如本文中所用，术语“相容的”表示本发明药物组合物的这些成分能够与本发明药物组合物的组分以这样的方式混合：以致不发生在典型的使用条件下将实质上降低药物组合物的药物有效性的相互作用。
施用：
本发明组合物或本发明药物组合物可通过常规的针注射或无针快速注射至肿瘤组织中而施用。在优选的实施方案中，本发明组合物或本发明药物组合物通过快速注射施用。快速注射是指这样的无针注射方法，其中迫使包含本发明组合物以及任选地其它合适的赋形剂的流体通过孔口，由此产生超细的高压液流，其能够穿透哺乳动物的皮肤。原则上，液流在皮肤中形成孔，所述液流被推动通过所述孔而进入靶组织。根据本发明，快速注射可用于本发明组合物的瘤内施用。
本发明组合物可通过常规针注射或无针快速注射邻近于和/或非常接近于肿瘤组织而施用。在优选的实施方案中，本发明药物组合物通过快速注射邻近于和/或非常接近于肿瘤组织而施用。快速注射是指这样的无针注射方法，其中迫使包含本发明组合物以及任选地其它合适的赋形剂的流体通过孔口，由此产生超细的高压液流，其能够穿透哺乳动物的皮肤。原则上，液流在皮肤中形成孔，所述液流被推动通过所述孔而进入靶组织。根据本发明，快速注射可用于本发明组合物的瘤内施用(邻近于和/或非常接近于肿瘤组织)、尤其注射。
在其它实施方案中，本发明组合物或本发明药物组合物可经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式贮存器施用。如本文所用，术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌内、关节内、结节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、经皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内及舌下注射或输注技术。
其它特别优选的施用途径为皮内和肌内注射。
尽管如此，本发明药物组合物可以包含用于促进药物组合物的组分的施用和吸收的其它组分。这种其它组分可以使适当的载体或赋形剂、支持任何免疫应答的额外佐剂、抗细菌剂和/或抗病毒剂。
本发明药物组合物的其它组分可以是免疫治疗剂，其可以选自免疫球蛋白(优选IgG)、单克隆或多克隆抗体、多克隆血清等。优选地，这种其它免疫治疗剂可以作为肽/蛋白质提供或可以由核酸、优选DNA或RNA、更优选mRNA编码。
本发明药物组合物典型地包含“安全且有效的量”的本发明药物组合物的组分、尤其如本文所定义的RNA分子。如本文所用，“安全且有效的量”表示足以显著引起肿瘤或癌症疾病的积极改变的如本文所定义的RNA分子的量。然而，同时，“安全且有效的量”足够小从而避免严重的副作用且允许益处和风险之间的切合实际的关系。对这些界限的确定典型地在切合实际的医学判断的范围内。
本发明的药物组合物可以用于人并且还可以用于兽医用途，优选用于人医疗用途，通常作为药物组合物。
疫苗：
根据另一个特别优选的方面，本发明组合物或本发明药物组合物可作为疫苗提供或使用。典型地，这种疫苗是如上文关于药物组合物所定义的。另外，这种疫苗典型地含有如本文所定义的至少一种RNA，或包含多种RNA的本发明组合物。优选地，所述至少一种RNA编码如上文所定义的至少一种肿瘤抗原或至少一种免疫活化剂。本发明疫苗也可以包含用于本发明药物组合物的如本文所定义的药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂。在本发明疫苗的特定情形中，药学上可接受的载体的选择在原则上通过施用本发明疫苗的方式确定。本发明疫苗可以局部施用至肿瘤组织中。
如有需要，本发明疫苗可额外地含有一种或多种辅助物质以便增加其免疫原性或免疫刺激性能力。特别优选的是如关于药物组合物所定义的作为辅助物质或添加剂的佐剂。
试剂盒或具有多个部分的试剂盒：
在另一方面中，本发明涉及试剂盒或具有多个部分的试剂盒，其包含如上文所述的含有RNA的组合物、或如上文所述的药物组合物或其组分、以及任选地具有关于组分的施用和剂量的信息的技术说明。
除本发明的含有RNA的组合物的组分之外，试剂盒可以额外含有药学上可接受的赋形剂、佐剂和至少一种其它组分(例如，如本文所定义的额外的药学上活性的组分/化合物)，以及用于施用的方法和技术说明。组合物的组分及可能的其它组分可以以冻干形式提供。在优选的实施方案中，在使用试剂盒之前，所提供的赋形剂以如例如所提供的技术说明中所写的预定量添加至冻干组分中。
医学适应症：
此外，本发明提供了如本文所定义的本发明含有RNA的组合物、或药物组合物、或疫苗、或试剂盒或具有多个部分的试剂盒的若干应用和用途。作为本发明的主要方面，组合物或药物组合物或试剂盒或具有多个部分的试剂盒可用作药物，即用于治疗肿瘤或癌症疾病。在本文中，治疗优选通过瘤内施用、尤其通过注射至肿瘤组织中进行。根据另一个方面，本发明涉及如上文所述的含有RNA的组合物或药物组合物、或疫苗、或试剂盒或具有多个部分的试剂盒的第二医学用途，其中这些主题用于制备药物，尤其用于瘤内施用(施用)以治疗肿瘤或癌症疾病的药物。
优选地，本文中提及的疾病选自肿瘤或癌症疾病，其优选包括例如急性淋巴母细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia)，急性髓细胞白血病(Acute myeloidleukemia)，肾上腺皮质癌(Adrenocortical carcinoma)，艾滋相关的癌症(AIDS-relatedcancers)，艾滋相关的淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)，肛门癌(Anal cancer)，阑尾癌(Appendix cancer)，星形细胞瘤(Astrocytoma)，基底细胞癌(Basal cell carcinoma)，胆管癌(Bile duct cancer)，膀胱癌(Bladder cancer)，骨癌(Bone cancer)，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤(Osteosarcoma/Malignant fibrous histiocytoma)，脑干胶质瘤(Brainstem glioma)，脑瘤(Brain tumor)，小脑星形细胞瘤(cerebellar astrocytoma)，大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤(cerebral astrocytoma/malignant glioma)，室管膜瘤(ependymoma)，髓母细胞瘤(medulloblastoma)，幕上原始神经外胚瘤(supratentorialprimitive neuroectodermal tumors)，视通路和下丘脑胶质瘤(visual pathway andhypothalamic glioma)，乳腺癌(Breast cancer)，支气管腺癌/类癌(Bronchialadenomas/carcinoids)，伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)，儿童期类癌瘤(childhoodCarcinoid tumor)，胃肠道类癌瘤(gastrointestinal Carcinoid tumor)，未知的原发性癌(Carcinoma of unknown primary)，原发性中枢神经系统淋巴瘤(primary Centralnervous system lymphoma)，儿童期小脑星形细胞瘤(childhood Cerebellarastrocytoma)，儿童期大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤(childhood Cerebral astrocytoma/Malignant glioma)，宫颈癌(Cervicalcancer)，儿童期癌(Childhood cancers)，慢性淋巴细胞性白血病(Chronic lymphocytic leukemia)，慢性骨髓性白血病(Chronicmyelogenous leukemia)，慢性骨髓增殖性病症(Chronic myeloproliferativedisorders)，结肠癌(ColonCancer)，皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma)，结缔组织增生性小圆细胞瘤(Desmoplastic small round cell tumor)，子宫内膜癌(Endometrial cancer)，室管膜瘤(Ependymoma)，食管癌(Esophageal cancer)，尤因肿瘤家族的尤因肉瘤(Ewing′s sarcoma in the Ewing family oftumors)，儿童期颅外生殖细胞瘤(Childhood Extracranial germ cell tumor)，性腺外生殖细胞瘤(ExtragonadalGerm cell tumor)，肝外胆管癌(Extrahepatic bile duct cancer)，眼内黑素瘤(Intraocular melanoma)，视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma)，胆囊癌(Gallbladdercancer)，胃癌(Gastric(Stomach)cancer)，胃肠类癌瘤(Gastrointestinal CarcinoidTumor)，胃肠间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor，GIST)，颅外、性腺外或卵巢生殖细胞瘤(extracranial，extragonadal，orovarian Germ cell tumor)，妊娠滋养细胞肿瘤(Gestational trophoblastic tumor)，脑干胶质瘤(Glioma of the brain stem)，儿童期大脑星形细胞瘤(Childhood Cerebral Astrocytoma)，儿童期视通路和下丘脑胶质瘤(Childhood Visual Pathway and Hypothalamic Glioma)，胃类癌(Gastric carcinoid)，毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)，头颈癌(Head and neck cancer)，心脏癌(Heartcancer)，肝细胞(肝)癌(Hepatocellular(liver)cancer)，霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma)，咽下癌(Hypopharyngeal cancer)，儿童期下斤脑和视通路胶质瘤(childhoodHypothalamic and visual pathway glioma)，眼内黑素瘤(Intraocular Melanoma)，胰岛细胞癌(Islet Cell Carcinoma，内分泌胰腺(Endocrine Pancreas))，卡波西肉瘤(Kaposisarcoma)，肾癌(Kidney cancer，肾细胞癌(renalcellcancer))，喉癌(LaryngealCancer)，白血病(Leukemias)，急性淋巴母细胞白血病(acute lymphoblastic Leukemia)，急性髓细胞白血病(acute myeloid Leukemia)，慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocytic Leukemia)，慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous Leukemia)，毛细胞白血病(hairy cell Leukemia)，唇和口腔癌(Lip and Oral Cavity Cancer)，脂肪肉瘤(Liposarcoma)，肝癌(Liver Cancer)，非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer)，小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)，淋巴瘤(Lymphomas)，艾滋相关的淋巴瘤(AIDS-related Lymphoma)，伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)，皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-Cell Lymphoma)，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)，非霍奇金淋巴瘤(Non-HodgkinLymphomas)，原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primary Central Nervous System Lymphoma)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Macroglobulinemia)，骨骼恶性纤维腺组织细胞瘤/骨肉瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone/Osteosarcoma)，儿童期髓母细胞瘤(Childhood Medulloblastoma)，黑素瘤(Melanoma)，眼内(眼)黑素瘤(Intraocular(Eve)Melanoma)，梅克尔细胞癌(Merkel Cell Carcinoma)，成人恶性间皮瘤(AdultMalignant Mesothelioma)，儿童期间皮瘤(Childhood Mesothelioma)，隐匿性原发性转移性鳞状颈癌(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary)，口腔癌(MouthCancer)，儿童期多发性内分泌癌变综合征(Childhood Multiple Endocrine NeoplasiaSyndrome)，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤(Multiple Myeloma/Plasma Cell Neoplasm)，蕈样真菌病(Mycosis Fungoides)，骨髓增生异常综合症(Myelodysplastic Syndromes)，骨髓增生异常/骨髓增生性疾病(Myelodysplastic/Myeloproliferative Diseases)，慢性骨髓性白血病(Chronic Myelogenous Leukemia)，成人急性髓细胞白血病(Adult AcuteMyeloid Leukemia)，儿童期急性髓细胞白血病(Childhood Acute Myeloid Leukemia)，多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，骨髓癌(Cancer of the Bone-Marrow))，慢性骨髓增殖性病症(Chronic Myeloproliferative Disorders)，鼻腔和鼻旁窦癌(Nasal cavity andparanasal sinus cancer)，鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)，神经母细胞瘤(Neuroblastoma)，口癌(Oral Cancer)，口咽癌(Oropharyngeal cancer)，骨肉瘤/骨骼恶性纤维性组织细胞瘤(Osteosarcoma/malignant fibrous histiocytoma of bone)，卵巢癌(Ovarian cancer)，卵巢上皮癌(Ovarian epithelial cancer，表面上皮-间质瘤(Surface epithelial-stromal tumor))，卵巢生殖细胞瘤(Ovarian germ cell tumor)，卵巢低度恶性潜能的肿瘤(Ovarian low malignant potential tumor)，胰腺癌(Pancreatic cancer)，胰岛细胞胰腺癌(islet cell Pancreatic cancer)，鼻旁窦和鼻腔癌(Paranasal sinus and nasal cavity cancer)，甲状旁腺癌(Parathyroid cancer)，阴茎癌(Penile cancer)，咽癌(Pharyngeal cancer)，嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma)，松果体星形细胞瘤(Pineal astrocytoma)，松果体生殖细胞瘤(Pineal germinoma)，儿童期松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚瘤(childhood Pineoblastoma and supratentorialprimitive neuroectodermal tumors)，垂体腺瘤(Pituitary adenoma)，浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤(Plasma cell neoplasia/Multiple myeloma)，胸膜肺母细胞瘤(Pleuropulmonary blastoma)，原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primary central nervoussystem lymphoma)，前列腺癌(Prostate cancer)，直肠癌(Rectal cancer)，肾细胞癌(Renal cell carcinoma，肾癌(kidney cancer))，肾盂输尿管肿瘤(Cancer of the Renalpelvis and ureter)，视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma)，儿童期横纹肌肉瘤(childhoodRhabdomyosarcoma)，唾液腺癌(Salivary gland cancer)，尤因肿瘤家族肉瘤(Sarcoma ofthe Ewing family of tumors)，卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)，软组织肉瘤(soft tissueSarcoma)，子宫肉瘤(uterine Sarcoma)，赛塞利综合征(Sézary syndrome)，皮肤癌(非黑素瘤)(Skin cancer(nonmelanoma))，皮肤癌(黑素瘤)(Skincancer(melanoma))，梅克尔细胞皮肤癌(Merkel cell Skin carcinoma)，小肠癌(Small intestine cancer)，鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma)，隐匿性原发性转移性鳞状颈癌(metastatic Squamousneck cancer with occult primary)，儿童期幕上原始神经外胚瘤(childhoodSupratentorial primitive neuroectodermal tumor)，睾丸癌(Testicular cancer)，喉癌(Throat cancer)，儿童期胸腺瘤(childhood Thymoma)，胸腺瘤和胸腺癌(Thymoma andThymic carcinoma)，甲状腺癌(Thyroid cancer)，儿童期甲状腺癌(childhood Thyroidcancer)，肾盂和输尿管移行细胞癌(Transitional cell cancer of the renal pelvisand ureter)，妊娠滋养细胞肿瘤(gestational Trophoblastic tumor)，尿道癌(Urethralcancer)，子宫内膜子宫癌(endometrial Uterine cancer)，子宫肉瘤(Uterine sarcoma)，阴道癌(Vaginal cancer)，儿童期视通路和下丘脑胶质瘤(childhood Visual pathwayand hypothalamic glioma)，外阴癌(Vulvar cancer)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)，和儿童期肾母细胞瘤(childhood Wilms tumor，肾癌(kidney cancer))。
适于瘤内施用的肿瘤或癌症的特别优选实例为前列腺癌、肺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、甲状腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、皮肤癌、膀胱癌、子宫癌及子宫颈癌。
根据特定的实施方案，药物可以作为单一剂量或作为若干剂量向患者施用。在某些实施方案中，药物可以作为单一剂量接着之后的第二剂量以及其之后任选地甚至第三、第四(或更多)剂量等向患者施用。
优选地，本发明组合物以至少40μg RNA/剂量的量提供。更具体地，包含于单一剂量中的mRNA的量典型地为至少200μg、优选200μg至1.000μg、更优选300μg至850μg、甚至更优选300μg至700μg。
使用额外的(药物)化合物的治疗：
在特别优选的实施方案中，接受本发明组合物或药物组合物或疫苗的个体可以是具有癌症或肿瘤的患者，所述患者接受或接受过癌症的标准治疗。优选地，患者在已接受标准治疗之后已实现部分反应或稳定疾病。
取决于待治疗的特定癌症或肿瘤类型，癌症的标准治疗包括化学疗法、辐射、放化疗和手术，其中这些治疗个别地或组合地应用。
在一些实施方案中，接受本发明组合物、药物组合物或疫苗的个体可以是具有癌症或肿瘤的患者，其接受过或接受化学疗法(例如，一线或二线化学疗法)、放射疗法、放化疗(化学疗法与放射疗法的组合)、激酶抑制剂、抗体疗法和/或检查点调节剂(例如，CTLA4抑制剂、PD1途径抑制剂)，或者在已接受以上指定的治疗中的一种或多种之后已实现部分反应或稳定疾病的患者。
在其它实施方案中，接受本发明组合物、药物组合物或疫苗的个体可以是具有癌症或肿瘤的患者，其接受过或接受如上文所定义的额外的药学上活性的组分/化合物。优选地，个体是在已接受以上指定的治疗中的一种或多种之后已实现部分反应或稳定疾病的患者。
根据其它方面，本发明涉及一种治疗肿瘤或癌症疾病的方法，其中如上文所述的含有RNA的组合物、或如上文所述的药物组合物、或如上文所述的疫苗、或如上文所述的试剂盒或具有多个部分的试剂盒优选瘤内施用，特别是通过注射至肿瘤组织中施用。关于治疗方法的其它特征，参考上文的描述。
优选的瘤内施用：
在本文中，特别优选的是如上文所定义的含有RNA的组合物或药物组合物或疫苗的瘤内施用与不同试剂/药学上活性的组分/化合物的施用相组合。特别优选的是抗体(例如，检查点调节剂如抗CTLA4、抗OX40、抗PD1或抗PD-L1)或配体(例如，CD40L)。
在优选的实施方案中，以下组合是特别优选的：
-RNAdjuvant(i.t.)+作为蛋白质的抗-CTLA4(i.p./i.v.)
-RNAdjuvant(i.t.)+作为蛋白质的抗-CTLA4(i.t.)
-RNAdjuvant(i.t.)+作为蛋白质的抗-PD1(i.p./i.v.)
-RNAdjuvant(i.t.)+作为蛋白质的抗-PD1(i.t.)
-RNAdjuvant(i.t.)+作为蛋白质的抗-PD-L1(i.p./i.v.)
-RNAdjuvant(i.t.)+作为蛋白质的抗-PD-L1(i.t.)
-RNAdjuvant(i.t.)+CD40L(i.t.)，其作为蛋白质或由核酸、优选RNA、更优选mRNA编码
-RNAdjuvant(i.t.)+编码IL-12的mRNA+编码可溶PD-1受体的mRNA+抗-CD73(i.p./i.v.)
-RNAdjuvant(i.t.)+编码IL-12的mRNA+编码可溶PD-1受体的mRNA+抗-CD137(i.p./i.v.)
-RNAdjuvant(i.t.)
(i.t.＝瘤内，i.p.＝腹膜内，i.v.＝静脉内)
在本发明中，若不另外指明，则替代方案和实施方案的不同特征可以在适合的情况下彼此组合。此外，若不具体提及，则术语“包含”不应狭义地理解为仅限于“由……组成”。实际上，在本发明的情形下，“由……组成”是这样的实施方案：无论何处在本文中使用了“包含”，其被本发明人特定里理解为落入“包含”的范围内。
本说明书中引用的所有公开案、专利和专利申请均通过引用并入本文中，就如同每个个别公开案或专利申请被特定地且个别地指明以通过引用并入一般。尽管出于清楚理解的目的已通过说明和实施例的方式相当详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教示，本领域技术人员将容易知悉，在不背离随附权利要求的精神和范围的情况下对其进行某些变化和修饰。
下文展示的实施例和图式仅仅是示例性的且应以其它方式描述本发明。这些图式和实施例不应被视为将本发明限于此。
附图简述：
图1：显示了在使用编码IL-12的mRNA(IL-12mRNA)或重组IL-12蛋白(rIL-12蛋白)的瘤内治疗之后，携带E.G7-OVA肿瘤的小鼠存活比例。如实施例1中所描述的进行实验。呈现卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。
图2：显示了使用IL-12mRNA(R2763，SEQ ID NO:1)与聚合载体货物复合物(R2391，如方法中所描述的制备)的组合对小鼠进行瘤内治疗导致肿瘤体积与对照组相比显著减小。如实施例2中所描述的进行实验。图2显示了在肿瘤攻击后第21天(所有动物均存活的最后一天)的平均肿瘤体积。使用曼惠特尼(Mann Whitney)测试在GraphPadPrism 5.04版中进行统计分析。
图3：显示了在如实施例2中和图2的图例中所描述的使用IL-12mRNA与聚合载体货物复合物(“RNAdjuvant”)的组合进行瘤内治疗之后，携带CT26肿瘤的小鼠的存活比例。呈现卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。使用对数秩(Log-rank)检验在GraphPad Prism5.04版中进行统计分析。
图4：显示了在使用编码流感核蛋白的mRNA的瘤内治疗之后，携带CT26肿瘤的小鼠的存活比例。如实施例3中所描述的进行实验。呈现卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。
图5：图(A)显示了在使用编码IL-12的mRNA、RNAdjuvant和编码可溶PD-1的mRNA的瘤内治疗之后，携带CT26肿瘤的小鼠的中值肿瘤生长分析。如图中所指示的测试这些化合物的各别组合(包括对照组)。如实施例4中所描述的进行实验。
图(B)显示了在使用编码IL-12的mRNA、RNAdjuvant和编码可溶PD-1的mRNA的瘤内治疗之后，携带CT26肿瘤的小鼠的存活比例。如图中所指示的测试这些化合物的各别组合(包括对照组)。如实施例4中所描述的进行实验。呈现卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。
图6：显示了在使用编码IL-12的mRNA、RNAdjuvant、编码可溶PD-1的mRNA的瘤内治疗和抗CD73抗体的腹膜内治疗之后，携带CT26肿瘤的小鼠的存活比例。如图中所指示的测试这些化合物的各别组合(包括对照组)。如实施例5中所描述的进行实验。呈现卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。
图7：显示了在使用编码IL-12的mRNA、RNAdjuvant、编码可溶PD-1的mRNA的瘤内治疗和抗CD173抗体的腹膜内治疗之后，携带CT26肿瘤的小鼠的存活比例。如图中所指示的测试这些化合物的各别组合(包括对照组)。如实施例6中所描述的进行实验。呈现卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。
图8：显示了在使用RNAdjuvant的瘤内治疗和抗PD-1抗体的腹膜内治疗之后，携带CT26肿瘤的小鼠的存活比例。如图中所指示的测试这些化合物的各别组合(包括对照组)。如实施例7中所描述的进行实验。呈现卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。
图9：显示了与单独使用编码IL-12的mRNA的瘤内治疗相比，在使用编码IL-12的mRNA、RNAdjuvant、编码CD40L的mRNA的瘤内治疗之后携带CT26肿瘤的小鼠的存活比例。如图中所指示的测试这些化合物的各别组合(包括对照组)。如实施例8中所描述的进行实验。呈现卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。
图10：显示了根据SEQ ID NO.10.073的编码鼠类CD40L(MmCD40L)的mRNA序列R3571。
实施例：
方法：RNA的制备
1.DNA和RNA构建体的制备
在本发明实施例中，制备编码指定RNAs的DNA序列(参见表17)，且将其用于后续的RNA体外转录反应。
表17：RNA构建体
通过以下方式制备MmIL-12(GC)、流感NP(GC)、solPD-1和PpLuc(GC))的构建体：引入来源于核糖体蛋白32L的5’-TOP-UTR，通过引入GC优化序列来修饰野生型编码序列以便稳定化，随后引入来源于白蛋白-3’-UTR的稳定化序列、一段64个腺苷(多聚(A)序列)、一段30个胞嘧啶(多聚(C)序列)和组蛋白茎环。通过以下方式制备大多数DNA序列：通过引入GC优化序列来修饰野生型编码DNA序列以便稳定化，使用与野生型编码序列相比增加各自编码序列的GC含量的计算机模拟算法(在表12中指示为“GC”)。
在本实施例中，制备编码非编码免疫刺激性RNA(isRNA)R2025的DNA序列，且将其用于后续的RNA体外转录反应。
2.RNA体外转录：
使用T7聚合酶将根据以上章节1制备的各个DNA质粒进行体外转录。在帽类似物(m7GpppG)的存在下进行IL-12、NP、PpLuc、CD40L和可溶PD-1的编码构建体的RNA体外转录反应。在无帽类似物的情况下制备isRNA R2025。随后，使用(CureVac,Tübingen,德国；WO2008/077592A1)纯化RNA。
3.制备聚合货物复合物(“RNAdjuvant”)
根据SEQ ID NO:7，以下阳离子肽作为聚合载体的阳离子组分使用(Cys-Arg12-Cys或CR12C)。
为了合成聚合载体货物复合物，将具有如以上章节1中所定义的RNA序列R2025的RNA分子与如上文所定义的阳离子CR12C肽组分混合。将规定量的RNA与各个阳离子组分以如下文所指示的质量比混合，因此形成复合物。如果根据本发明使用聚合阳离子组分，那么阳离子组分的聚合与核酸货物的复合同时发生。随后，将所得溶液用水调节至50μl的最终体积且在室温下孵育30分钟。其它细节描述于WO2012013326中。
肽:RNA的质量比是1:3.7。聚合载体货物复合物由作为载体的二硫键交联的阳离子肽CR12C和作为核酸货物的免疫刺激性R2025形成。该聚合载体货物复合物R2025/CR12C(指定为R2391)在以下实施例中用作佐剂(称为“RNAdjuvant”)。
4.制备编码流感核蛋白(H1N1(PR8)-NP(GC))的疫苗配制物(R2651)通过以比率(1:2)(w/w)(佐剂组分)将鱼精蛋白添加至mRNA将mRNA(R2650)与鱼精蛋白复合。在孵育10分钟后，添加相同量的用作提供抗原的mRNA的mRNA。该疫苗配制物在本文称为R2651(根据WO2010037539)。在林格氏乳酸盐溶液中施用疫苗。
5.制备用于施用的RNA
在林格氏乳酸盐(RiLa)溶液中施用裸的(即，非配制)PpLuc mRNA(R2244、R491)、IL-12mRNA(R2763、R1328)、可溶PD-1mRNA(R3971)、CD40L mRNA(R3571)。在注射前立即混合两种组分之后，也在林格氏乳酸盐(RiLa)中施用裸mRNAs与聚合载体货物复合物“RNAdjuvant”(R2391)的共配制物。
实施例1：编码IL-12的mRNA的瘤内施用
在第一次治疗前5天，将每治疗组5只雌性C57BL/6小鼠用106个细胞的E.G7-OVA细胞进行接种。对于每个治疗组，对5个确立的(约100mm3)皮下植入的EG.7-OVA肿瘤进行治疗。在第0、2、4、21、23和25天以50μg(1μg/μl)使用16μg编码MmIL-12的mRNA(MmIL-12(GC))-sc-Flag)(R1328)或0.5μg MmIL-12蛋白对肿瘤进行治疗。作为对照，用不相关的mRNA(pPLuc)(R491)治疗小鼠。
研究第0天定义为治疗第一天。频繁(每2-3天)监测肿瘤生长。杀死体积>3cm3的小鼠。
实施例1的结果
图1显示了使用编码IL-12的mRNA(IL-12mRNA)的瘤内治疗导致了与对照组相比，存活显著增加。此外，与瘤内施用重组IL-12蛋白(rIL-12蛋白)相比，可观察到增加的存活。
实施例2：使用与免疫刺激RNA 组合的编码IL-12的mRNA的瘤内 治疗
下表18概述了用于实施例2的RNA构建体。
表18：用于实施例2的RNA构建体
在实验的第0天在右腹上向Balb/c小鼠(n＝6或7，参见表14)皮下(s.c.)注射1x106个CT26细胞(结肠癌细胞系)/小鼠(在100μl PBS的体积中)。在肿瘤攻击后第9天，根据肿瘤大小分选小鼠以获得平均肿瘤体积为约60mm3的组。瘤内(i.t.)疗法在第9天开始且持续每3-4天的额外4次注射。向小鼠注射编码IL-12的mRNA(25μg的R2763)+(25μg的R2391)的组合(A组)。为了针对归因于RNA施用或注射程序的局部发炎进行控制，分别向小鼠注射编码荧光素酶的对照mRNA(PpLuc，R2244，B组)或缓冲液(RiLa，C组)。未经治疗的小鼠充当额外的对照(D组)。
通过使用卡尺在三维上测量肿瘤大小来监测肿瘤生长。根据下式计算肿瘤体积：
在实验第9、11、14、17和21天，根据下表19向小鼠瘤内(i.t.)注射RNA。瘤内注射的体积为50μl。
表19：动物组
实施例2的结果
图2显示了使用编码IL-12的mRNA(R2763)与(R2391)的组合的瘤内治疗导致了与所有对照组相比，在肿瘤攻击之后第21天肿瘤体积在统计学上显著减小。
图3显示了用编码IL-12的mRNA(R2763)与(R2391)的组合的瘤内治疗导致了与全部三个对照组相比，存活在统计学上显著增加(A组vs.B组*p＝0.0104，A组vs.C组**p＝0.0035，A组vs.组D*p＝＝0.0263)。
实施例3：使用编码流感核蛋白(NP)的mRNA对小鼠进行疫苗接种以及使用编码NP 的mRNA的后续瘤内治疗
该实验的目的是测试针对确立的肿瘤是否可利用预先存在的免疫应答。为此目的，首先使用编码流感核蛋白(NP)的RNActive(与鱼精蛋白复合的疫苗配制物)(R2651)对小鼠进行疫苗接种，其诱导高水平的抗NP CD8+T细胞应答，随后用CT26肿瘤细胞攻击，随后用编码NP的裸RNA(R2650)进行瘤内治疗。
在实验第0天、第7天和第16天，用40μg的H1N1(PR8)-NP(GC)RNActive(R2651)(2×50μl)或作为对照的林格氏-乳酸盐缓冲液(RiLa)对27只Balb/c小鼠进行皮内(i.d.)疫苗接种。在第14天，在右腹上用1×106个CT26细胞/小鼠(在100μl PBS的体积中)对所有小鼠进行皮下(s.c.)攻击。在第22天，如表20中所示将小鼠分配给不同的组。
在第23天，即在第二次加强后七天，开始瘤内(i.t.)施用50μg裸H1N1(PR8)-NP(GC)mRNA(R2650)(仅C组)并继续额外的四次注射(在第25天、第28天、第31天和第35天)。瘤内注射的体积为50μl。详细的治疗时间表显示于表21中。
通过使用卡尺在三维上测量肿瘤大小来监测肿瘤生长。根据下式计算肿瘤体积：
表20：动物组
表21：疫苗接种时间表
实施例3的结果
图4显示了预先存在的免疫性(在此模型中由NP疫苗接种诱导)增加了接受NP编码mRNA的瘤内施用的小鼠与仅用缓冲液治疗的小鼠相比的中值存活时间(MST)(分别为MST＝28vs.MST＝21)。
实施例4：使用免疫刺激RNA(“RNAdjuvant”)和编码可溶PD-1的mRNA和编码IL-12 的mRNA的瘤内治疗
表22概述了如在本实施例中所用的治疗。瘤内(i.t.)施用RNAdjuvant及编码IL-12和可溶PD-1的mRNA构建体。在CT26肿瘤攻击的小鼠中，分析存活率和中值肿瘤生长。
表22：组、治疗及RNA稀释液
肿瘤攻击和本发明组合物的施用：
在实验的第0天，在右腹上用1×106个CT26细胞/小鼠(在100μl PBS的体积中)对60只Balb/c小鼠进行皮下攻击。在第8天，根据肿瘤大小分选小鼠。根据肿瘤大小，在第8或9天进行第一次疫苗接种(肿瘤的大小应为约40-50mm3)。根据上表使用mRNAs与RNAdjuvant的不同组合对小鼠进行疫苗接种。进行六次疫苗接种。瘤内注射的体积为50μl。
根据表22所示的指定流程对小鼠进行注射。根据实施例3确定中值肿瘤生长。实验的结果显示于图5中，其中图5A显示了本发明组合物对肿瘤生长的效果，且图5B显示了本发明组合物对存活的效果。
结果：
图5A中的结果显示了：与其它治疗(根据表22的B-D组)相比，包含与RNAdjuvant组合的编码IL-12的mRNA和编码可溶PD-1的mRNA的本发明组合物(根据表22的“A”组)大大降低了中值肿瘤体积。另外，图5B中的结果显示了：与其它治疗(根据表22的B-D组)相比，包含与RNAdjuvant组合的编码IL-12的mRNA和编码可溶PD-1的mRNA的本发明组合物(根据表22的“A”组)大大提高了肿瘤攻击小鼠的存活。
实施例5：使用与免疫刺激RNA(“RNAdjuvant”)和编码solPD-1的mRNA和抗CD73抗 体组合的编码IL-12的mRNA的瘤内治疗
表23概述了如在本实施例中所用的治疗。除了RNAdjuvant及编码IL-12和可溶PD-1的mRNA构建体(瘤内(i.t)施用)之外，腹膜内(i.p.)共施用抗CD73抗体(BioXCell)。在CT26肿瘤攻击的小鼠中，分析存活率。
表23：组、治疗及RNA稀释液
肿瘤攻击和本发明组合物的施用：
根据前述实验(参见实施例4)进行肿瘤攻击。
根据表23所示的指定流程对小鼠进行注射。
实验的结果显示于图6中。
结果：
图6显示了：与仅接受抗CD73抗体的相关对照组(根据表23的“C”组)相比，使用与抗CD73抗体的腹膜内施用组合的编码IL-12的mRNA(R2763)、编码sol-PD-1的mRNA(R3971)和(R2391)的瘤内治疗(根据表23的“A”组)导致了存活在统计学上显著增加，并且与使用IL-12+RNAdjuvant+可溶PD-1和对照抗体(大鼠IgG2a，BioXCell)治疗(根据表23的“B”组)相比，存活率增加。
实施例6：使用与免疫刺激RNA(“RNAdjuvant”)和抗CD137抗体组合的编码IL-12的 mRNA的瘤内治疗
表24概述了如在本实施例中所用的治疗。除了RNAdjuvant及编码IL-12和可溶PD-1的mRNA构建体(瘤内(i.t)施用)之外，腹膜内(i.p.)共施用抗CD137抗体(BioXCell)。在CT26肿瘤攻击的小鼠中，分析存活率。
表24：组、治疗及RNA稀释液
肿瘤攻击和本发明组合物的施用：
根据前述实验(参见实施例4)进行肿瘤攻击。
根据表24所示的指定流程对小鼠进行注射。
实验的结果显示于图7中。
结果：
图7显示了与仅接受抗CD137抗体的相关对照组(根据表24的“C”组)相比，使用与抗CD137抗体的腹膜内施用组合的编码IL-12的mRNA(R2763)、sol-PD-1(R3971)和(R2391)的瘤内治疗(根据表24的“A”组)导致了存活显著增加，并且与使用IL-12+RNAdjuvant+可溶PD-1和对照抗体(大鼠IgG2a，BioXCell)治疗(根据表24的“B”组)相比，存活率增加。
实施例7：使用与检查点抑制剂抗PD-1抗体组合的免疫刺激RNA(“RNAdjuvant”)的 治疗
表25概述了如在本实施例中所用的治疗。除了RNAdjuvant(瘤内施用)之外，腹膜内施用检查点抑制剂抗PD-1(BioXCell)。在CT26肿瘤攻击的小鼠中，分析存活率。
表25：组、治疗及RNA稀释液/抗体稀释液
肿瘤攻击和本发明组合物的施用：
根据前述实验(参见实施例4)进行肿瘤攻击。
根据表25所示的指定流程对小鼠进行注射。
实验的结果显示于图8中。
结果：
图8显示了与仅接受检查点抑制剂抗PD-1抗体的相关对照组(根据表25的“D”组)相比，使用与抗PD-1抗体的腹膜内施用组合的(R2391)的瘤内(i.t.)治疗(根据表25的“C”组)导致了存活增加，并且与使用RNAdjuvant和对照抗体(抗仓鼠IgG，BioXCell)的治疗(根据表25的“B”组)相比，存活率增加。
实施例8：使用免疫刺激RNA(“RNAdjuvant”)和编码CD40配体(CD40L)的mRNA和编 码IL-12的mRNA的瘤内治疗
表26概述了如在本实施例中所用的治疗。瘤内(i.t.)施用RNAdjuvant及编码IL-12和鼠类CD40L的mRNA构建体。在CT26肿瘤攻击的小鼠中，分析存活率。
表26：组、治疗及RNA稀释液
肿瘤攻击和本发明组合物的施用：
根据前述实验(参见实施例4)进行肿瘤攻击。
根据表26所示的指定流程对小鼠进行注射。
实验的结果显示于图9中。
结果：
图9中的结果显示了与其它治疗(根据表26的B-C组)相比，包含与RNAdjuvant组合的编码IL-12的mRNA和编码CD40L的mRNA的本发明组合物(根据表26的“A”组)大大提高了肿瘤攻击小鼠的中值存活。

Claims (62)

1.包括至少一种RNA的含有RNA的组合物，其用于治疗或预防肿瘤和/或癌症疾病。
2.根据权利要求1所述的含有RNA的组合物，其中所述含有RNA的组合物特别是通过注射到肿瘤组织中被瘤内施用。
3.根据权利要求1或2所述的含有RNA的组合物，其中所述至少一种RNA选自由编码RNA和非编码RNA组成的组。
4.根据权利要求3所述的含有RNA的组合物，其中所述编码RNA包括编码至少一种肽或蛋白质的至少一个编码区，并且优选选自由以下组成的组：mRNA、病毒RNA、逆转录病毒RNA和复制子RNA。
5.根据权利要求4所述的含有RNA的组合物，其中所述编码RNA是mRNA。
6.根据权利要求4或5所述的含有RNA的组合物，其中所述至少一种肽或蛋白质选自或来源于由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、自杀基因产物、免疫原性蛋白质或肽、细胞凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、热休克蛋白、肿瘤抗原、β-联蛋白抑制剂、STING途径活化剂、检查点调节剂、先天性免疫活化剂、抗体、显性负性受体和诱饵受体、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)抑制剂、IDO途径抑制剂和与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽。
7.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述细胞因子是白细胞介素，优选选自以下列表：IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A/B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35。
8.根据权利要求6或7所述的含有RNA的组合物，其中所述白细胞介素是白细胞介素-12(IL-12)。
9.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述细胞因子是TNF家族成员，优选选自以下列表：TNF、尤其是TNFα，LTα、LTβ、LIGHT、TWEAK、APRIL、BAFF、TL1A、GITRL、OX40L、CD40L、FASL、CD27L、CD30L、4-1BBL、TRAIL、RANK配体。
10.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述细胞因子选自以下列表：FLT3配体、G-CSF、GM-CSF、IFNα/β/ω、IFNγ、LIF、M-CSF、MIF、OSM、干细胞因子、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TSLP配体。
11.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述趋化因子选自以下列表：CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、XCL1、XCL2、CX3CL1。
12.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述自杀基因产物是自杀酶，优选核苷酸代谢酶。
13.根据权利要求12所述的含有RNA的组合物，其中所述核苷酸代谢酶选自以下列表：胸苷激酶、优选单纯疱疹病毒胸苷激酶，胞嘧啶脱氨酶、优选细菌胞嘧啶脱氨酶或酵母胞嘧啶脱氨酶，脱氧核苷激酶、优选黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)脱氧核苷激酶，脱氧胞苷激酶、优选哺乳动物脱氧胞苷激酶，嘌呤核苷磷酸化酶、优选细菌嘌呤核苷磷酸化酶。
14.根据权利要求6、12或13中任一项所述的含有RNA的组合物，其中编码至少一种自杀基因产物的所述至少一种RNA与前药组合使用，所述前药是自杀基因产物的底物。
15.根据权利要求6、12-14中任一项所述的含有RNA的组合物，其中所述至少一种RNA编码至少一种连接蛋白和至少一种自杀基因产物。
16.根据权利要求6、12-14中任一项所述的含有RNA的组合物，其中RNA组合物包括编码至少一种自杀基因产物的至少一种RNA，且其中所述RNA组合物与编码至少一种连接蛋白的其它RNA和/或与连接蛋白家族的蛋白质或其部分或片段组合使用。
17.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述免疫原性蛋白质或肽是病原体的蛋白质或肽，更优选病毒或细菌病原体的蛋白质或肽。
18.根据权利要求17所述的含有RNA的组合物，其中所述免疫原性蛋白质或肽是以下列表的一种病毒或细菌的至少一种蛋白质或肽：A或B型流感病毒或任何其它正粘病毒(C型流感病毒)；小核糖核酸病毒，诸如鼻病毒或A型肝炎病毒；披膜病毒，诸如α病毒或风疹病毒，例如辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒或麻疹病毒；风疹病毒；冠状病毒，尤其是HCV-229E或HCV-OC43亚型；棒状病毒，诸如狂犬病病毒；副粘病毒，诸如腮腺炎病毒；呼肠孤病毒，诸如A、B或C组轮状病毒；嗜肝DNA病毒，诸如B型肝炎病毒；乳多泡病毒，诸如任何血清型的人类乳头瘤病毒；腺病毒，尤其1至47型；疱疹病毒，诸如单纯疱疹病毒1、2或3；巨细胞病毒，优选CMVpp65；EB病毒；牛痘病毒；细菌肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)；黄病毒，诸如1至4型登革热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒；C型肝炎病毒；杯状病毒；丝状病毒，诸如埃博拉病毒；博尔纳病毒；布尼亚病毒，诸如裂谷热病毒；沙粒病毒，诸如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒或出血热病毒；逆转录病毒，诸如HIV；细小病毒。
19.根据权利要求17或18所述的含有RNA的组合物，其中所述免疫原性肽或蛋白质来源于流感核蛋白。
20.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述细胞凋亡诱导剂选自由以下组成的组：Bcl-2家族、肿瘤抑制蛋白p53、跨膜死亡受体的配体、尤其TNF受体基因超家族、促凋亡受体激动剂和Beclin-1。
21.根据权利要求6或20所述的含有RNA的组合物，其中所述细胞凋亡诱导剂选自以下列表：Bcl-10、Bax、Bak、Bid、Bad、Bim、Bik、Blk、细胞色素c、胱天蛋白酶、尤其胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、死亡结构域、尤其Fas、优选FasL、TNFα、Apo2L/TRAIL、DR4和/或DR5的激动剂、Apo3L、DR4激动抗体、DR5激动抗体、蛋白激酶R(PKR)、颗粒酶B。
22.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述血管生成抑制剂选自以下列表：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、CXCL9、CXCL10、IL-12、PF-4、TNF-α、sFLT-1、FLK-1、血管抑制素、内皮抑制素、血管形成抑制素、血管能抑制素、肿瘤抑制素、16kD促乳素片段、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TSP-1、TSP-2、乳腺丝抑蛋白、PEX、sTie1、sTie2、血管生成素-1、血管生成素-2、抗VEGFR2抗体、抗VEGF抗体和抗VEGFR1抗体。
23.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述热休克蛋白选自以下列表：HSP27、HSP47、HSP60、HSP70、HSC70、GRP78、HSP90、HSP110、GRP94、GRP170、PDI/PDIA、CRT/CALR。
24.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述肿瘤抗原选自以下列表：1A01_HLA-A/m、1A02、5T4、ACRBP、AFP、AKAP4、α-辅肌动蛋白-4/m、α-甲基酰基-辅酶A消旋酶、ANDR、ART-4、ARTC1/m、AURKB、B2MG、B3GN5、B4GN1、B7H4、BAGE-1、BASI、BCL-2、bcr/abl、β-联蛋白/m、BING-4、BIRC7、BRCA1/m、BY55、钙网蛋白、CAMEL、CASPA、胱天蛋白酶8、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、CD1E、CD20、CD22、CD276、CD33、CD3E、CD3Z、CD4、CD44同种型1、CD44同种型6、CD52、CD55、CD56、CD80、CD86、CD8A、CDC27/m、CDE30、CDK4/m、CDKN2A/m、CEA、CEAM6、CH3L2、CLCA2、CML28、CML66、COA-1/m、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2、CP1B1、CSAG2、CT-9/BRD6、CT45A1、CT55、CTAG2同种型LAGE-1A、CTAG2同种型LAGE-1B、CTCFL、Cten、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyp-B、DAM-10、DEP1A、E7、EF1A2、EFTUD2/m、EGFR、EGLN3、ELF2/m、EMMPRIN、EpCam、EphA2、EphA3、ErbB3、ERBB4、ERG、ETV6、EWS、EZH2、FABP7、FCGR3A变型1、FCGR3A变型2、FGF5、FGFR2、纤连蛋白(fibronectin)、FOS、FOXP3、FUT1、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE7b、GAGE-8(GAGE-2D)、GASR、GnT-V、GPC3、GPNMB/m、GRM3、HAGE、肝丝酶、Her2/neu、HLA-A2/m、同源盒NKX3.1、HOM-TES-85、HPG1、HS71A、HS71B、HST-2、hTERT、iCE、IF2B3、IL-10、IL-13Ra2、IL2-RA、IL2-RB、IL2-RG、IL-5、IMP3、ITA5、ITB1、ITB6、激肽释放酶-2、激肽释放酶-4、KI20A、KIAA0205、KIF2C、KK-LC-1、LDLR、LGMN、LIRB2、LY6K、MAGA5、MAGA8、MAGAB、MAGE-B1、MAGE-E1、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGE-B17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1(MAGE1)、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2、乳腺球蛋白A、MART-1/melan-A、MART-2、MC1_R、M-CSF、间皮素、MITF、MMP1_1、MMP7、MUC-1、MUM-1/m、MUM-2/m、MYO1A、MYO1B、MYO1C、MYO1D、MYO1E、MYO1F、MYO1G、MYO1H、NA17、NA88-A、Neo-PAP、NFYC/m、NGEP、N-myc、NPM、NRCAM、NSE、NUF2、NY-ESO-1、OA1、OGT、OS-9、骨钙素、骨桥蛋白、p53、PAGE-4、PAI-1、PAI-2、PAP、PATE、PAX3、PAX5、PD1L1、PDCD1、PDEF、PECA1、PGCB、PGFRB、Pim-1激酶、Pin-1、PLAC1、PMEL、PML、POTE、POTEF、PRAME、PRDX5/m、PRM2、前列腺蛋白、蛋白酶-3、PSA、PSB9、PSCA、PSGR、PSM、PTPRC、RAB8A、RAGE-1、RARA、RASH、RASK、RASN、RGS5、RHAMM/CD168、RHOC、RSSA、RU1、RU2、RUNX1、S-100、SAGE、SART-1、SART-2、SART-3、SEPR、SERPINB5、SIA7F、SIA8A、SIAT9、SIRT2/m、SOX10、SP17、SPNXA、SPXN3、SSX-1、SSX-2、SSX3、SSX-4、ST1A1、STAG2、STAMP-1、STEAP-1、存活素、存活素-2B、SYCP1、SYT-SSX-1、SYT-SSX-2、TARP、TCRg、TF2AA、TGFβ1、TGFR2、TGM-4、TIE2、TKTL1、TPI/m、TRGV11、TRGV9、TRPC1、TRP-p8、TSG10、TSPY1、TVC(TRGV3)、TX101、酪氨酸酶、TYRP1、TYRP2、UPA、VEGFR1、WT1、XAGE1。
25.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述β-联蛋白抑制剂选自以下列表：TAT-NLS-BLBD-6、轴蛋白-1、TCF-4、GSK-3b、DKK-1、Dvl-1。
26.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述STING(干扰素基因刺激剂)途径活化剂是STING途径的活化蛋白或组成型活性蛋白，优选DDX41、STING、cGAS、IRF3、TBK1或STAT6的活化蛋白或组成型活性蛋白。
27.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述检查点调节剂是B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7/HHLA2、BTLA、CD28、CD28H/IGPR-1、CTLA-4、ICOS、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、VISTA/B7-H5/PD-1H、BTN1A1/嗜乳脂蛋白、BTN2A1、BTN2A2/嗜乳脂蛋白2A2、BTN3A1/2、BTN3A2、BTN3A3、BTNL2/嗜乳脂蛋白样2、BTNL3、BTNL4、BTNL6、BTNL8、BTNL9、BTNL10、CD277/BTN3A1、LAIR1、LAIR2、CD96、CD155/PVR、CRTAM、DNAM-1/CD226、柄蛋白-2/CD112、柄蛋白-3、TIGIT、LILRA3/CD85e、LILRA4/CD85g/ILT7、LILRB1/CD85j/ILT2、LILRB2/CD85d/ILT4、LILRB3/CD85a/ILT5、LILRB4/CD85k/ILT3、4-1BB/TNFRSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α、TNF RII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-3、TIM-4、CD7、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP R的调节剂或其任意组合。
28.根据权利要求6或27所述的含有RNA的组合物，其中所述检查点调节剂选自由以下组成的组：激动抗体、拮抗抗体、显性负性受体、诱饵受体和配体。
29.根据权利要求28所述的含有RNA的组合物，其中所述拮抗抗体针对PD-1、PD-L1或CTLA-4。
30.根据权利要求28所述的含有RNA的组合物，其中所述激动抗体针对OX-40。
31.根据权利要求28所述的含有RNA的组合物，其中所述诱饵受体是可溶PD-1受体。
32.根据权利要求6所述的含有RNA的组合物，其中所述抗体是激动抗体、拮抗抗体或中和抗体。
33.根据权利要求6或32所述的含有RNA的组合物，其中所述抗体针对肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。
34.根据权利要求3-33中任一项所述的含有RNA的组合物，其中所述编码RNA、优选mRNA的编码区的G/C含量与野生型RNA的编码区的G/C含量相比是增加的，且其中所述G/C富集的RNA的所编码氨基酸序列与野生型RNA的所编码氨基酸序列相比优选不改变。
35.根据权利要求3-34中任一项所述的含有RNA的组合物，其中所述编码RNA，优选mRNA，额外包括5’-UTR元件和/或3’-UTR元件。
36.根据权利要求3-35中任一项所述的含有RNA的组合物，其中所述编码RNA，优选mRNA，额外包括至少一个组蛋白茎环。
37.根据权利要求3-36中任一项所述的含有RNA的组合物，其中所述编码RNA，优选mRNA，额外包括5’-帽结构和/或多聚(A)序列和/或多聚(C)序列。
38.根据权利要求3所述的含有RNA的组合物，其中所述非编码RNA选自由以下组成的组：小干扰RNA(siRNA)、反义RNA(asRNA)、环状RNA(circRNA)、核酶、适配体、核糖开关、免疫刺激RNA、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)及Piwi相互作用RNA(piRNA)。
39.根据权利要求38所述的含有RNA的组合物，其中所述免疫刺激RNA包括根据式(III)(GlXmGn)、式(IV)(ClXmCn)、式(V)(NuGlXmGnNv)a和/或式(VI)(NuClXmCnNv)a)的至少一种RNA序列。
40.根据权利要求38或39所述的含有RNA的组合物，其中所述免疫刺激RNA包括根据SEQID NO.5、394和10072的至少一种RNA序列。
41.根据前述权利要求中任一项所述的含有RNA的组合物，其中所述至少一种RNA与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物复合，优选与阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子肽或蛋白质(例如鱼精蛋白)、阳离子或聚阳离子多糖和/或阳离子或聚阳离子脂质复合。
42.根据权利要求41所述的含有RNA的组合物，其中所述阳离子或聚阳离子化合物是聚合载体。
43.根据权利要求42所述的含有RNA的组合物，其中所述聚合载体由二硫键交联的阳离子组分、优选二硫键交联的阳离子肽形成，优选包括根据式VII、VIIa和/或VIIb的肽和/或根据式(VIII)(L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L)的化合物。
44.根据权利要求41-43所述的含有RNA的组合物，其中所述至少一种RNA与所述一种或多种阳离子或聚阳离子化合物、优选阳离子或聚阳离子肽或蛋白质的N/P比在约0.1至10的范围内，所述范围包括约0.3至4、约0.5至2、约0.7至2和约0.7至1.5的范围。
45.根据前述权利要求中任一项所述的含有RNA的组合物，其中所述含有RNA的组合物包括与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物复合的至少一种RNA，和至少一种游离RNA、优选编码RNA、更优选mRNA。
46.根据前述权利要求中任一项所述的含有RNA的组合物，其中所述至少一种mRNA与一种或多种脂质复合并从而形成脂质体、脂质纳米粒和/或脂复合物。
47.根据前述权利要求中任一项所述的含有RNA的组合物，其中所述含有RNA的组合物包括聚合载体货物复合物，其由聚合载体、优选包括二硫键交联的阳离子肽、优选Cys-Arg12和/或Cys-Arg12-Cys与免疫刺激RNA、优选根据SEQ ID NO:5、394或10072的RNA序列形成。
48.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至47所定义的含有RNA的组合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
49.根据权利要求48的药物组合物，其经制备以用于注射至肿瘤组织中。
50.一种试剂盒或具有多个部分的试剂盒，其包括根据权利要求1至47所定义的含有RNA的组合物或根据权利要求48或49所定义的药物组合物，以及任选地具有关于施用和施用剂量的信息的技术说明。
51.根据权利要求1至47中任一项所定义的含有RNA的组合物或根据权利要求48或49所定义的药物组合物或根据权利要求50所定义的试剂盒或具有多个部分的试剂盒，其用作药物。
52.根据权利要求1至47所定义的含有RNA的组合物或根据权利要求48或49所定义的药物组合物或根据权利要求50所定义的试剂盒或具有多个部分的试剂盒，其优选通过瘤内施用、尤其通过注射至肿瘤组织中用于治疗或预防肿瘤和/或癌症疾病。
53.一种根据权利要求1至47所定义的含有RNA的组合物或根据权利要求48或49所定义的药物组合物或根据权利要求50所定义的试剂盒或具有多个部分的试剂盒优选通过瘤内施用、尤其通过注射至肿瘤组织中用于治疗或预防肿瘤和/或癌症疾病中的用途。
54.根据权利要求53所述的用途，其中所述治疗或预防包括施用至少一种额外的药学上活性的化合物。
55.根据权利要求54所述的用途，其中所述至少一种额外的药学上活性的化合物选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、自杀基因产物、免疫原性蛋白质或肽、细胞凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、热休克蛋白、肿瘤抗原、β-联蛋白抑制剂、STING途径活化剂、检查点调节剂、先天性免疫活化剂、抗体、显性负性受体和诱饵受体、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)抑制剂、IDO途径抑制剂、与细胞凋亡抑制剂结合的蛋白质或肽、抗菌剂、抗病毒剂、药物、佐剂、化疗剂和激酶抑制剂。
56.根据权利要求54或55所述的用途，其中所述治疗进一步包括放射疗法和/或手术。
57.根据权利要求55所述的用途，其中所述检查点调节剂选自权利要求27中所定义的调节剂。
58.根据权利要求57所述的用途，其中所述检查点调节剂选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、LAG3抑制剂、TIM3抑制剂、OX-40刺激剂、4-1BB刺激剂、CD40L刺激剂、CD28刺激剂、GITR刺激剂。
59.根据权利要求58所述的用途，其中所述PD-1抑制剂是针对PD-1的拮抗抗体，且所述PD-L1抑制剂是针对PD-L1的拮抗抗体。
60.根据权利要求54所述的用途，其中所述抗体选自针对CD73和/或CD137的抗体。
61.根据权利要求1至47中任一项所定义的含有RNA的组合物或根据权利要求48或49所定义的药物组合物或根据权利要求50所定义的试剂盒或具有多个部分的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物优选通过瘤内施用、尤其通过注射至肿瘤组织中用于治疗肿瘤和/或癌症疾病。
62.优选通过瘤内施用、尤其通过注射至肿瘤组织中使用根据权利要求1至47中任一项所定义的含有RNA的组合物或根据权利要求48或49所定义的药物组合物或根据权利要求50所定义的试剂盒或具有多个部分的试剂盒来治疗肿瘤和/或癌症疾病的方法。
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