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CN108587867B - 微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法 - Google Patents

微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法 Download PDF

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CN108587867B CN201810486334.2A CN201810486334A CN108587867B CN 108587867 B CN108587867 B CN 108587867B CN 201810486334 A CN201810486334 A CN 201810486334A CN 108587867 B CN108587867 B CN 108587867B
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University of North Carolina at Chapel Hill
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Abstract

本发明涉及微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法。微流体装置包括多个反应孔和多个固体支持体，并且每一个固体支持体具有附接至其上的试剂。所述试剂通过不稳定的试剂/支持体键而附接至固体支持体以便将所述试剂配置以通过裂解操作而从支持体上裂解。

Description

微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法
本申请为分案申请，原申请的申请日为2013年3月15日，申请号为201380039315.0(PCT/US2013/032300)，发明名称为“微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法”。
相关申请
本申请要求提交于2012年5月25日的美国临时申请系列号61/651,648的优先权，该申请的公开内容通过整体引用而并入此处。
发明领域
本发明涉及微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法。
背景
聚合酶链反应(PCR)是用于扩增基因组DNA(gDNA)或互补DNA(cDNA)的区段的高灵敏性方法。PCR具有许多应用，例如：检测痕量核酸以确定存在致病生物体、基因表达、基因分型、遗传工程或修饰和法医的科学应用。PCR扩增提供在大范围的分析物浓度中卓越的靶标鉴定和定量。然而，经PCR同时且定量地分析许多分析物已经被证明是极富挑战性的。基于嵌入染料荧光的检测仅能确定总dsDNA的浓度，因此在单一反应器中并行分析多个模板不可能使用此检测方法。荧光探针技术(即，Taqman、分子信标或其他化学法)可用于低水平的反应多重化，因为每种靶标可使用不同颜色的荧光探针作为信号报告分子来扩增。探针也是序列特异性的，降低源自引物二聚体形成或非特异性扩增的假阳性。用常规微量滴定板或微流体实时-PCR(rt-PCR)进行多重化的典型方法是使用少量的反应孔，每孔含有三种不同颜色的探针。然而，通常认为设计多重化的引物和探针集合是有挑战性的，因为它们需要附加水平的小心设计和优化以确保彼此的兼容性。依据此方法的多重化因染料之间的光谱重叠和仪器而最终限于四色检测，而一种颜色通常预留为内标染料。
多重化PCR的优化挑战也对新出现的疾病的测定或需要分析新序列的其他时间敏感性应用的快速重构产生障碍。在多重化PCR中遇到的其他难题包括：产生二聚体的引物互补性、外来的DNA与扩增子或引物/探针之间的非特异性相互作用，以及其中短序列与较长序列相比扩增更快的固有偏倚。此外，虽然使用在少量的反应孔中分隔开的多重化反应可对在诸如GeneXpert (Cepheid)或JBAIDS(Idaho Technology Inc.)等系统中的少量靶标(约3-12个)运行良好，但此方法对于显著较大量的靶标变得不方便。在护理点或制造点，与这些技术一起使用的盒(cartridge)必须单个地装载相对大量的液体试剂。诸如来自LifeTechnologies的OpenArray Real-Time PCR System等技术使用在大约3000个微孔的阵列中干燥的预装引物/探针序列。此技术不进行样品清除或制备，并且它需要多件单独的仪器以加工、装载和分析样品。此外，预装引物/探针集合必须使用基于印制的技术来完成，所述技术极大地增加装置制作所需的时间和花费。
发明实施方案概要
在一些实施方案中，微流体装置包括多个反应孔和多个固体支持体。每一个固体支持体具有附接至其上的试剂，其中所述试剂通过不稳定的试剂/支持体键而附接至固体支持体以便将所述试剂配置以通过裂解操作而从支持体上裂解。
在一些实施方案中，裂解操作包括热力操作、添加化学品和/或应用光至试剂/支持体键。试剂可包括用于PCR反应的引物。不稳定的试剂/支持体键可包括链霉亲和素-生物素键和/或抗生物素蛋白-生物素键。裂解操作可包括热力操作。在一些实施方案中，将链霉亲和素-生物素键配置用以当固体支持体在约50-99℃下孵育时从支持体释放试剂。固体支持体可为微珠例如磁性微球。在一些实施方案中，固体支持体包含标记。标记可包含预定支持体形状、预定支持体大小、支持体的磁性特性和/或光学特性。标记可包括荧光标记。
在一些实施方案中，将所述多个孔和所述多个固体支持体调整大小并配置使得仅单个所述多个固体支持体容纳于对应的单个所述多个孔中。所述多个孔可包含固体支持体容纳区域或固体支持体容纳区域和反应区，并且可将该固体支持体容纳区域配置用以容纳单个所述多个固体支持体。固体支持体容纳区域可具有与单个所述多个固体支持体的大小和/或形状基本对应的横截面积。在一些实施方案中，反应可发生或启始于固体支持体容纳区域中，其可在此情况下充当反应区。反应区可具有比固体支持体容纳区域的横截面积更大的横截面积。微流体装置可包含密封件(弹性膜，例如聚二甲基硅氧烷)或以流体性隔离各个所述多个孔的不可混溶的流体。微流体装置可包含在孔中的膜。膜可为提取膜。在一些实施方案中，膜包含单片氧化铝膜。在一些实施方案中，通道连接至膜，所述膜配置用以提供通过膜与所述多个孔的流体连接。在一些实施方案中，将孔配置以容纳多个支持体。在一些实施方案中，图案化的微柱在膜和通道之间以支撑膜，但允许来自所述多个孔的经由膜的均匀流体流动。在一些实施方案中，将试剂配置用以从所述多个孔之一中的多个珠上释放而实现试剂之间的反应。
在一些实施方案中，用于向包含多个反应孔的微流体装置提供试剂的方法包括提供在所述多个反应孔中的多个固体支持体，每个固体支持体具有附接至其上的试剂使得该试剂通过不稳定的试剂/支持体键而附接至固体支持体并且将该试剂配置以通过裂解操作而从支持体裂解。进行裂解操作以释放试剂到所述多个反应孔内的溶液中。
附图简述
结合入并组成说明书的一部分的附图阐释本发明实施方案，并且和说明一起用以解释本发明的原理。
图1A为依据一些实施方案的具有引物附接至其上的珠的示图。
图1B为依据一些实施方案的具有不同编码特性的四个珠的示图。
图2为具有用于保持图1A-1B的珠/引物的多个孔的微流体装置的数字图像。
图3为图2的微流体装置的侧视截面图。
图4为展示测得的DNA量(ng/μL)并指示在室温和95℃下从珠上释放的引物的量和不含引物珠的样品的条线图。
图5A-5D为阐释依据一些实施方案的配置用以在各自孔中容纳各个珠的微流体的示图。
图6为展示依据一些实施方案的使用三种不同珠集合对三种不同模板序列的PCR扩增的数据的线图。
图7为依据一些实施方案的数字荧光显微术图像，其展示：来自含有扩增模板分子的图2-3装置的孔的嵌入染料的相对强的信号，和来自图像中央的空白反应孔的几乎没有的信号。
图8为依据一些实施方案的针对rt-PCR实验的PCR循环数绘制的图2-3装置中各孔的荧光信号的图。
图9为依据一些实施方案的微流体装置示意图。
图10为图9的装置的透视图，其展示基底的对齐.
图11为图9装置的侧视截面图。
图12为示意图的顶视图，其展示了依据一些实施方案的具有光刻胶道以控制流体流动的微流体装置。
图13为图12的装置的光学显微术图像，其展示其中金层被除去的100 μm×100 μm的垫。珠孔位于孔中央。
图14为在图12的装置中的444个垫上隔离的染料溶液的荧光图像。未看到桥接和看到很少的偏离的小液滴。
图15A-15B为带有440个亲水反应区(100 μm×100 μm孔)的依据一些实施方案的微流体装置的荧光图像，所述反应区使用25 μm高的光刻胶隔离物隔离250 pL(图15A)和使用7.5 μm隔离物隔离75 pL(图15B)。
图15C为依据一些实施方案的微流体装置的荧光图像 其包括1500个用9 μm隔离物隔离出22.5 pL体积的反应区(50 μm×50 μm孔)
图16A-16C为依据一些实施方案的微流体装置中的数字PCR反应的荧光图像，其展示用每个装置上的1500个反应孔在22.5 pL反应中进行的拷贝扩增，标称拷贝数/孔为：0.7(图16A)、0.2(图16B)和0.04(图16C)。为鉴定阳性孔，将20-25个循环的信号合计以改善信噪比。
图17A为依据一些实施方案的装载于直径4.15 μm、深度5.7 μm的孔中的直径3.3μm的经装载引物珠的SEM图像。
图17B为依据一些实施方案的装置的荧光显微术图像，其阐释在孔中超过90%的珠占用率。
图18A-18D为展示依据一些实施方案的珠的磁性装载的一系列荧光图像。一团超过15,000个珠可被看作各个画面中的一大块，而箭头指示正通过在装置下面的磁体吸引该团珠的方向。
图19A-19C为依据一些实施方案的相同12个反应孔的解码图像，所述反应孔用不同荧光滤器组成像以便将所关心的珠用白色正方形突显。图19A鉴别出Qdot 605和mecA基因的引物(365/10nm激发)；图19B鉴别出Qdot 655和变异链球菌(S. mutans)的引物；而图19C鉴别出携带发现于金黄色葡萄球菌(S. aureus) gDNA中的nuc基因的引物的无Qdot标记的珠。Qdot 605和Qdot 655标记的珠发出明亮的荧光。在图19C中展示用白色六边形突显的空珠孔。图19D为展示mecA和nuc基因的阳性结果的测定图像。
图20为在依据一些实施方案的基于大量珠的靶标DNA俘获后在5 μL反应中扩增的图。
图21A-21C为在30个循环的PCR扩增后的依据一些实施方案的微流体装置的阵列的区域的图像，其展示在针对依据一些实施方案用彩色荧光编码的三种不同引物集合的阳性孔中SYBRgreen荧光增强。
图22A为依据一些实施方案的微流体装置的示意图像，其中依据一些实施方案，不同孔大小优先保留对应大小的珠。
图22B-22C为荧光显微术图像，其阐释图22A的装置接纳珠的图案。
发明实施方案的详述
本发明现可将在下文中参考其中展示本发明的实施方案的附图和实施例来描述。然而，本发明可以以许多不同形式来体现并且不应该解释为限定于本文阐述的实施方案。相反地，提供这些实施方案使得此公开会是全面的和完整的，并会向本领域技术人员充分地传达本发明的范围。
同样的数字始终是指同样的元件。在图中，为清楚可放大某些线、层、组分、元件或特征的厚度。
本文使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的而并非想要限定本发明。本文所使用的单数形式“一个”“一种”和“该”也意图包含复数形式，除非上下文另外明确指出。可进一步理解的是，术语"包含"和/或“包括”当在说明书中使用时，规定所述特征、步骤、操作、元件和/或组分的存在，但并不排除存在或添加一个或更多个其它特征、步骤、操作、元件、组分和/或其群组。本文所使用的术语"和/或"包括一个或更多个相关列举条目的任何的和全部的组合。本文所使用的短语例如"在X和Y之间"和"约X和Y之间"应该理解为包含X和Y。本文所使用的短语例如"在约X和Y之间"意指"在约X和约Y之间"。本文所使用的短语例如"从约X至Y"意指"从约X至约Y"。
除非另外定义，本文所使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属的领域的普通技术人员通常所理解的同样的含义。可进一步理解的是，术语例如在常用词典中定义的那些术语，应该理解为具有与相关领域和说明书的上下文中它们的含义一致的含义，并且不应以理想化的或过度正式的意义来理解，除非本文明白地那样定义。为了简短和/或清楚，可不对众所周知的功能或结构详细描述。
可理解的是，当元件被提及为"在另一元件之上"、"附接至另一元件"、"连接至另一元件"、"与另一元件偶联"、"接触另一元件"等时，它可以是直接在另一元件上、附接至另一元件、连接至另一元件、与另一元件偶联或接触另一元件，或也可存在间插元件。相反，当元件被提及为例如"直接在另一元件之上"、"直接附接至另一元件"、"直接连接至另一元件"、"直接与另一元件偶联"或"直接接触另一元件"时，不存在间插元件。本领域技术人员也可理解的是，提及的有"邻近"另一特征布置的结构或特征可具有重叠邻近特征或位于邻近特征之下的部分。
空间相关术语例如"在……之下"、"在……下面"、"下部"、"在…之上"、"上部"等等，为方便描述可用于本文中，以描述一个元件或特征与另一元件或特征的如图中所阐释的关系。可理解的是，除了图中所描述的方向之外，空间相关术语还意图包含使用或操作中装置的不同方向。例如，如果将图中的装置倒转，那么被描述为"在其他元件或特征下面"或"在其它元件或特征之下"的元件将定向"在其它元件或特征之上"。因此，代表性的术语"在……之下"可包括"在……之上"和"在……之下"两个方向。装置可另外定向(旋转90度或向其他方向)且本文所使用的空间相关描述符相应地解释。同样地，术语"朝上地"、"朝下地"、"垂直的"、"水平的"等等在本文中仅用于解释目的，除非另外明确指出。
可理解的是，尽管术语"第一"、"第二"等可在本文中用于描述多个元件，但这些元件不应该被这些术语所限定。这些术语仅用于将一个元件区别于另一元件。因此，下面论述的"第一"元件也可称为"第二"元件而不违背本发明的教义。操作(或步骤)的顺序不限定于权利要求或图中所提出的次序，除非另外明确指出。
术语“寡核苷酸”是指至少约5-约500个核苷酸(例如 5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、21、22、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸)的核苷酸序列。在一些实施方案中，例如，寡核苷酸可源自约15-约30个核苷酸或约20-约25个核苷酸，该寡核苷酸可用作例如聚合酶链反应(PCR)扩增测定中的引物和/或在杂交测定或微阵列中的探针。本发明的寡核苷酸可为天然的或合成的，例如，DNA、RNA、PNA、LNA、修饰过的主链等或它们的任意组合，如在本领域中周知的。
包括用于扩增和/或检测的那些在内的探针和引物为任意合适长度的寡核苷酸(其包括天然存在的寡核苷酸例如DNA和合成的和/或修饰过的寡核苷酸)，但通常长度为5、6或8个核苷酸，多至40、50或60个核苷酸或更多个核苷酸。可将这样的探针和/或引物固定于或偶联至固体支持体（例如：珠、芯片、针或微量滴定板孔）和/或偶联至或标记上可检测的基团（例如：荧光化合物、化学发光化合物、放射性元素或酶）。
聚合酶链反应(PCR)可依据已知技术来进行。参见例如：美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188。通常，PCR涉及：首先，将核酸样品(例如，在热稳定DNA聚合酶存在的情况下)与针对待检测的特定序列的每条链的一种寡核苷酸引物在杂交条件下处理，以便合成与各核酸链互补的各引物的延伸产物，所述引物与特定序列的各条链充分互补以与之杂交，使得从各引物合成的延伸产物当与其互补序列分开时可用作用于合成其他引物延伸产物的模板，并随后将样品在变性条件下处理以在待检测的一个或多个序列存在时将引物延伸产物同它们的模板分离。循环重复这些步骤直到获得所需程度的扩增。扩增序列的检测可通过向反应产物添加携带可检测的标记的能够杂交至反应产物上的寡核苷酸探针(例如，本发明的寡核苷酸探针)，并随后依据已知技术检测该标记，或通过在凝胶上直接显影来进行。扩增序列也可通过将嵌入染料添加至反应混合物中并监测会与双链DNA的总质量成比例的荧光信号强度来检测。尽管本发明的实施方案关于PCR反应来描述，应该理解的是，可使用其它核酸扩增方法，例如逆转录PCR (RT-PCR)，所述扩增方法包括等温扩增技术例如滚环扩增或环介导的等温扩增(LAMP)。
DNA扩增技术例如前述的DNA扩增技术可包括探针、一对探针或两对探针的使用，所述探针特异性地结合含有所关心的多态性或突变的DNA，但在相同的杂交条件之下不结合不含所关心的多态性的DNA，并且所述探针充当用于在扩增反应中扩增DNA或其一部分的一个或多个引物。这样的探针在本文中有时称为扩增探针或引物。
术语“试剂”是指为引起化学反应而添加入系统中或加入以查看是否发生反应的任何物质或化合物，其包括引物、核酸模板和扩增酶。扩增试剂是指除引物、核酸模板和扩增酶之外通常用于扩增的那些试剂(脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液等)。通常，将扩增试剂与其它反应组分一起放置和容纳于反应容器(测试管、微孔等)中。
本文所使用的术语“磁性”包括铁磁性、顺磁性和超级顺磁性性质。
通常，用于检测包含所关心的多态性或突变的DNA的寡核苷酸探针是这样的寡核苷酸探针，其结合编码所述突变或多态性的DNA，但在相同杂交条件下不结合不含所述突变或多态性的DNA。将寡核苷酸探针标记上合适的可检测的基团，例如下面阐述的那些。本文中这样的探针有时称为检测探针或引物。
可用于实施本发明方法的试剂盒通常会包括：任选与用于实施上述方法的合适说明书一起包装的一个或更多个具有附接至其上的试剂的固体支持体和用于实施上述方法的其他试剂，例如限制酶。试剂盒也可包括容器，其用于容纳包括于其中的元件。这样的容器包括但不限于：小瓶、安瓿、管、胶囊、瓶、注射器、袋、微流体芯片和盒，包括预装珠装置。
如图1A中所阐释，固体支持体或珠10可具有附接至其上的引物20A、20B。引物20A、20B可为一对生物素化的引物，而珠10可为链霉亲和素标记的以便发生生物素化引物与珠的结合。在一些实施方案中，珠10可包括标记，例如光学标记，所述标记可在分析期间使用以鉴定锚定到各自的珠10A上的引物20A、20B。例如，如图1B中所显示，不同编码的珠10A、10B、10C、10D可标记用于在分析期间鉴别不同附接的引物集合。多种预编码方法可用于在珠10或其他固体支持体上提供标记，包括单独使用或与其他编码方法组合使用的预定的大小、形状、磁性性质和/或荧光掺杂。定制序列的生物素化的引物和链霉亲和素标记的顺磁性的磁珠两者都可容易地从市售供应商购买或在适当装备的实验室以合适的质量制得。
尽管本发明实施方案在本文中关于珠10 (例如磁性微球)来描述，但应该理解的是，可使用任何合适的固体支持体，无论多孔的、表面多孔的，还是无孔的。支持体可包括但不限于：诸如多聚体或塑料、玻璃、二氧化硅或金属或半金属氧化物(包括但不限于氧化铝、氧化钛、氧化锆或其他氧化物)等材料制成的磁性或非磁性颗粒或微粒；量子点；光刻制得的颗粒或结构(离散的或非离散的)；过滤膜或元件；小瓶、微量滴定板、微流体或宏观流体反应孔的固体表面；硅酮或其他橡胶；金属和金属颗粒；适合于这些目的的天然存在的支持体或吸收剂。
尽管本发明实施方案在本文中也关于PCR反应来描述，但应该理解的是，本文所述的微流体装置、珠和反应方法可用于多种其他反应，例如，其中试剂从珠上裂解入孔中参与反应的其他反应。例如，任何核酸转录和/或扩增相关的反应是在本发明的范围之内，包括但不限于：PCR反应、实时PCR(rt-PCR)、数字PCR (dPCR)、从RNA到cDNA的逆转录(RT)、对来自先前RT步骤的cDNA进行的PCR (RT-PCR)、使用实时或数字定量的RT-PCR、免疫-PCR(iPCR)及其变体、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环复制和/或非酶核酸扩增方法(例如,“DNA回路（DNA circuits）”)。包含于在本发明的范围内的其他反应包括但不限于：酶联免疫吸附测定(ELISA)（其中将荧光底物结合至支持体表面以待在随后的反应的某个点裂解）、单分子测定(SiMoA)或数字ELISA（其中将荧光底物结合至支持体表面以待在随后的反应某个点裂解）、其中将多个珠用于递送不同试剂用于组合化学的反应、其中珠递送催化剂试剂的反应和/或其中将“点击”化学试剂以通过随机珠装载而确定的化学计量递送的反应。
所有合适的偶联化学可用于将引物20A、20B结合至珠10。在一些实施方案中，可使用不稳定的化学键例如可使用多种技术裂解的键将引物20A、20B附接至珠10。例如，可将热能应用于破坏或裂解化学键或可将光应用于破坏光可裂解键。热力加热可通过与热表面导热接触、焦耳加热溶液、电阻加热邻近珠10的基底、暴露于电磁辐射和/或电磁感应来完成。在一些实施方案中，化学键可使用电离辐射、化学试剂、酶、电化学处理、pH值变化或其它合适的裂解操作来裂解。例如，pH值变化可由发生于保持珠10的区域表面的电化学反应引起或条件变化可由引发剂的活化作用直接或间接地引起，所述引发剂自身可通过诸如热、光等物理变化、电化学处理、pH值变化等激活。可将引物20A、20B锚定至珠10以便引物可在PCR之前的储藏、样品制备和/或洗涤步骤期间保持锚定。当PCR反应发生时可进行裂解操作以使引物20A、20B从珠10脱离。根据具体使用的不稳定化学键，裂解操作可包括应用热、光和/或添加化学品以使引物20A、20B从珠10脱离。当引物20A、20B从珠10脱离时，引物可容易地参与PCR反应，而当引物20A、20B锚定于珠10时，引物20A、20B通常不在PCR反应中反应，除非模板DNA在附近。尽管本发明实施方案关于引物20A、20B来描述，但应该理解的是，任何合适的试剂可用作元件20A、20B并用任何合适的化学键结合。例如，可使用任何试剂、探针或寡核苷酸。除了链霉亲和素-生物素之外合适的可裂解的键包括但不限于：光可裂解的生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素以及captavidin，并且可为市售可得的，例如，从Ambergen(PC Biotin Phosphoramidite、PC Amino-Modifier Phosphoramidite和PC SpacerPhosphoramidite)获得。
如图2-3所阐释，微流体装置50可包含多个孔60。可将珠10和附接至其上的引物20A、20B预装入孔60中。装置50可另外包括基底62(例如，玻璃)和具有用于流体性连接至孔60的通道66的微流体部分64。如图3中所阐释，孔60可在膜68例如单片氧化铝膜(AOM)上成型。膜68可用于从样品中纯化DNA。可应用用于样品清除的其它合适的材料，所述材料包括能进行固相提取或另一分离方法的无机或多聚体表面或者多聚体膜。可将膜支撑于连接至通道的图案化的微柱70的格子或阵列之上，以便将膜充分支持起来但流体仍可自由且均匀地流经它。因此，珠10上的引物20A、20B可预装入孔60并且在使用之前储存一段时间。孔60可各自包含具有单一引物对的许多拷贝且为方便分析而标记的珠10。
在一些实施方案中，引物20A、20B经链霉亲和素-生物素键而附接至珠10。链霉亲和素-生物素键是在生物系统中所发现的已知最强的非共价键，但它是热不稳定的。当生物素化的引物在PCR之前与链霉亲和素涂覆的微球反应时,引物明显被俘获到珠的表面上。可在合适的缓冲液中进行洗涤或其他的样品处理步骤而基本上不释放引物。然而，在加热珠10或以其他方式变性链霉亲和素时，大量的引物从表面释放并可参加PCR反应。图4为使用NanoDrop 2000 UV-Vis吸光度检测仪器测量来自以此方式用特异于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）靶标DNA的区域的引物标记的珠的混悬液的上清液的图。如阐释的，在从室温(RT)至<50℃的温度范围下，甚至于4℃下存储若干天后或当于室温下在微流体装置的孔中干燥储存达超过2个月时，没有可检测到的引物释放。当在95℃下孵育时，引物被释放并可轻易地在上清液中检测到。
已观察到用至今测试的所有生物素化引物集合进行的高水平的珠官能化。当在室温下干燥储存时附接稳定超过60天，而已经测试储存于溶液中在4℃下>11个月的珠，仍观察到PCR反应中的活性。
在一些实施方案中，可将珠集合标记上用于如图1B中所阐释的PCR反应的多种引物(例如，正向和反向引物和/或杂交探针)。珠10可通过染料、大小、形状、磁性特性或其他可检测的和/或光学物理特性或特性组合来解码以便可将带有预定引物对的各个珠集合相互区分。如图5A中阐释，可提供包含有多个孔110的微反应孔阵列100。每个孔110包含支持体或珠容纳区域112和反应区114。珠和孔的尺寸应该成比例以便递送合适量的试剂(引物、探针等)。如果使用，可将珠容纳区域112类似调整大小为珠直径。反应区114尺寸可从亚微米变化至毫米，体积从亚毫微微升（subfemtoliter）变化至数百微升。珠容纳区域112和珠10大小可如适合于所需反应从亚微米至毫米变化。将珠容纳区域112调整大小并配置以容纳单一珠10。因此，可将珠10分别装载入单个反应孔110。如图5B中所展示，将反应溶液120添加入孔110，而可将孔用盖子130或其它密封件例如不可混溶的流体或油密封以便将反应孔110相互流体性隔离。如图5C中所示，可进行裂解操作以将引物20A、20B从珠10分离。例如，可加热装置100以从链霉亲和素-生物素键释放引物20A、20B。然而，可根据引物20A、20B和珠10之间的键的类型使用包括应用光或化学品在内的其他裂解操作。如图5D中所阐释，可读取珠编码和PCR反应结果以确定：1)孔110中的珠10(和孔110中的反应中的相应引物)的类型和2)正检测的各自模板分子的存在和/或浓度。例如，如果将具体波长的荧光编码用在珠10上以鉴别相关引物20A、20B，随后在PCR之前、期间或结束时在那个波长下读取荧光编码信号。可在另一波长下读取来自用于确定扩增子的浓度或存在的嵌入染料或探针的信号。可随后将此信号与编码信息一起用于确定各模板分子的存在和/或浓度。
因此，在此配置中，无需复杂的确定性装载或印制技术就可将珠10随机地分布于微孔110。在装载珠10之后和/或进行反应之后可确定在微孔110中的每个珠10的引物集合和/或探针。因此，可使用相对大量的非常小的反应孔110，其由全部所需珠集合的混合物随机装载。装置100可使用图案化至基底中的微孔110集合，该基底配合至密封件或盖130或不可混溶的流体例如油、液体多聚体或氟碳化合物液体的覆盖层，其以其中将各孔110与其临孔流体性隔离的方式密封以便各PCR反应充分隔离。在一些实施方案中，装置100(具有基底和孔)和盖130可由一种刚性的和一种可变形的弹性材料的组合制得以便可通过施加压力至装置100的外表面来产生充分的密封。预编码方法(单独或组合使用的大小、荧光掺杂、形状、磁性特性等)的应用可实施于非常小的反应体积(例如，在约1 cL至1 µL之间或小于约1µL)，其中仅需要单一珠10以提供需要的引物或其他具体试剂。在此情况下，可将珠10装载入微反应孔110以便各个孔110含有仅仅一个珠10和足以进行PCR反应的体积。在某些情况下，没有被珠占据的珠孔体积可为足以发生反应的体积。在此情况下，珠孔可用来不仅保持珠而且界定反应体积。可将不同集合的引物标记的和/或探针标记的珠10一起混入单一的溶液中。引物集合(或其他试剂)的身份可随后依据珠10的编码而确定。取样可要么通过简单包含入孔110中(通常处于高模板浓度)要么通过直接杂交至键合至珠10的引物集合或其它亲和试剂(包括但不限于：抗体或适体)(通常处于较低模板浓度)来实施。在一些实施方案中，数百至数十亿的平行的一元定量PCR反应可在单一小足迹装置100中进行。
如图9-11中所示，微流体装置200包含由形成通道的光刻胶或其他隔离物230分隔开的两个基底210、220。隔离物230的高度界定了基底210、220和通道232之间的间隙。基底210、220包括各自的疏水的区域212、222和亲水的区域214、224，其在空间上相互对应以便当基底210、220处于组合配置(图10)中时，疏水的区域212、222和亲水的区域214、224相互对齐。基底之一210包括流体性连接至通道232的孔口240。基底之一220另外包括蚀刻的珠孔260。
在此配置中，可将如本文所描述的珠10放置在珠孔260中。可将非水性流体242和水性溶液244放置在通道232中以形成与各自的珠10之一流体接触的基本上分隔开的水性溶液244的反应区246。
在一些实施方案中，可将珠10、非水性溶液242和水性溶液244如下装载入装置200。可将多个珠10嵌入孔口240并装载入孔260中。例如，珠10可为磁珠，而应用于基底210、220之一的外部的磁体可用于牵引珠10通过通道232以便珠10落入孔260并原地停留。可将孔260调整大小并配置用以容纳单一珠10。可让缓冲液涌流过通道232以除去任何过量的没有装载入孔260中的珠10。可随后将水性流体添加至孔口240，接着将非水性流体添加至孔口240。水性流体可形成邻近亲水的区域214、224的反应区246，所述亲水的区域214、224由非水性流体242分隔开。
尽管微流体装置200前面关于在亲水区域214、224中的孔260和反应区246来描述，但应该理解的是，依据所需反应环境，可将反应区246和孔260替代性地放置在疏水区域中以便反应发生在非水性流体中。在一些实施方案中，水性流体为包含所需反应的组分的流体，例如PCR主混合物(master mix)。基底210、220可由任何合适的材料，例如塑料、玻璃、或硅或其组合形成。也可使用疏脂图案化，例如带有基于氟碳化合物的油相的基于氟碳化合物的涂层。
亲水的区域214、224和疏水区域212、214可通过沉积亲水的或疏水的层到基底210、220上来形成，并依据基底210、220的亲水的或疏水的特性，可以要求或可以不要求随后去除层的一部分。例如，可将金沉积到亲水基底，例如硅或玻璃上，并随后蚀刻以形成基底的亲水区域和金的疏水区域。备选地，可通过对现有表面选择性修饰，例如等离子体处理塑料基底的天然表面区域来完成图案化。
如上面所述，可将珠10随机装载入孔260，而后续操作可用于确定哪一种珠的类型与在装置200上的具体位置相对应。例如，如果珠10包含与附接至珠10的特定引物或其他试剂相关联的光学标记，那么可使用光学成像仪例如显微镜以光学鉴定哪一个引物与特定的孔位置相关联用于后续分析。
在一些实施方案中，可将孔260调整大小并配置以基于大小和/或形状优先保留特定的珠类型以便，例如，较大的珠可由较大的孔保留，而较小的珠可由较小的孔保留。例如，如图22A中所阐释，展示了具有分别保持3和6µm直径的珠的2.1µm珠孔360A和5.6µm珠孔360B的硅酮芯片设计简图。在此芯片设计中，较小的硅酮孔扩张以接受稍微较大直径的珠，但较小的珠不可保留在较大直径的珠孔中。外面的轮廓线指示在各珠孔周围的反应孔几何构型。图22B为展示仅装载了3µm珠的芯片的荧光显微术图像。图22C为展示装载了3和6µm珠混合物的芯片的图像，并阐释基于大小编码优先装载珠入具体孔中的能力。
此外，在一些实施方案中，可通过在固体反应孔中使用固体支持体将反应隔离成多个较小的体积例如以减少引物二聚体而充分减少非特异性的“寄生”反应。使用这些原理将反应分割成多个较小的反应可适用于许多不同反应。通过使用依据一些实施方案的珠10来多重化，通常并不需要形成乳液(例如与乳液PCR一起使用的)以实现反应分割。乳液可增加制备的复杂性和/或花费，限制反应体积的范围和需要具有形成乳液倾向的化学物类。
此外，应该理解的是，可将本文所描述的一些或所有过程例如使用泵、阀、光学成像装置等自动化。
本发明实施方案现将关于以下非限定实施例来描述。
实施例1
在标准200 µL PCR-级聚丙烯管中，以10µL总反应体积，用珠集合来进行PCR，所述珠集合包含针对金黄色葡萄球菌在甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)中发现的mecA基因和从IDT(Coralville, IA)购买的变异链球菌(Streptococcus mutans)且键合至链霉亲和素涂覆的珠(Bangs Laboratories, Inc., 产品号PMS3N/10098)的生物素化引物序列。使用两种不同浓度的珠：一种含有2.5 µg珠(约60 nM当量的引物浓度)和一种含有5 µg珠(约120 nM引物浓度)。将来自各种类的大约300-400拷贝的纯化gDNA添加至对应的反应管。将含有除引物外的PCR所需的所有试剂的PCR主混合物加入并且让管热循环50个循环。图6展示了使用Agilent Bioanalyzer 2100，应用DNA1000试剂盒对上清液进行的后续分析。各分析物的第一道展示含有2.5 µg珠的PCR反应的结果，而第二道展示来自含有5 µg珠的反应的结果。空白也针对各珠浓度跑胶。对于甲氧西林易感性金黄色葡萄球菌(MSSA)和MRSA空白反应，引物二聚体(通常指示高引物浓度)是明显的。降低珠的量至2.5 µg为这些反应消除二聚体形成。对在2.5 µg珠浓度下含有针对MSSA和MRSA的模板DNA以及在5-µg珠浓度下含有针对变异链球菌的模板DNA的管看到了强扩增子带。二聚体在含有模板DNA的样品中在任一珠浓度下都不明显。这些结果表明了可如何将引物附接至珠，递送至反应孔并随后在裂解操作后参与特异性PCR扩增反应。
图2-3的装置50用于按已知图案将珠放置入特定的孔60(即，确定性装载)。相对于在单一孔中的多重化反应，各反应是一元的，因此嵌入染料可用于检测，与需要带有不同荧光团的多个引物/探针集合的传统多重化PCR相比极大地降低优化的时间。针对不同测定而重新配置或并入新的珠集合可简单地通过替换珠集合或添加更多反应孔至芯片或装置50来实现。
手工进行转移液体到装置50上，然而应该理解的是，液体处理可容易地自动化。可使用简单的试剂分配技术将带有独特引物的预先标记的珠装载入单一孔60中。允许溶液变干，将珠留置在AOM 68(或其他固相提取表面或材料)的表面上。
样品可通过加热、添加试剂、离心、酶消化或其他方法预处理。将样品分配入已经含有预装引物珠的各个孔60中并将真空施加在废液池或通道66处以牵引样品流体通过AOM68来将分析物俘获到AOM上。随后可将洗涤缓冲液分配入反应孔60并且如需要通过施加到通道66处的真空除去。因为引物锚定于珠，它们不会在这些样品清除步骤期间被洗掉。在样品清除之后，将含有除引物之外PCR所需的所有试剂的PCR主混合物添加到所有反应孔60中并热循环装置50。由于主混合物不含模板特异性引物，相同的主混合物可在所有反应中使用。在PCR期间用于变性DNA的升高的温度也变性链霉亲和素，引起在第一个rt-PCR循环期间后续释放生物素化的引物，从而启动靶标DNA的扩增。释放的引物自由地与在反应孔中的靶标DNA相互作用，无论在启始PCR之前靶标DNA是否直接与在珠上的引物杂交。除链霉亲和素-生物素之外的偶联化学可用于一些实施方案，包括使用可用热、键的化学诱导变化或光诱导变化而裂解的化学键来附接引物至珠。因为引物自由地被释放入在反应孔60中所容纳的溶液中，所以由固相提取膜68(例如AOM)所捕获的非杂交DNA和双链DNA(dsDNA)容易被检测到。因此，可对单链(ssDNA)和dsDNA二者实施快速的样品清除而无需在将样品DNA直接杂交到结合在珠上的低聚体之前，将dsDNA转变为ssDNA通常所需的变性步骤。由于引物被附接至珠上，在一些实施方案中，DNA可用AOM提取而不会将其洗掉，随后释放引物到溶液中允许进行扩增/检测提取的DNA的PCR。AOM可允许快速的样品清除。DNA提取也可通过将靶标ssDNA与偶联到珠上的引物杂交或将靶标DNA吸附于珠的表面来实施。
尽管上述实施例关于PCR反应来论述，但应该理解的是，相似的程序可用于任何合适的反应，例如：任何核酸转录和/或扩增相关的反应、其中也将荧光底物结合于支持体表面的酶联免疫吸附测定(ELISA)、其中也将荧光底物结合于支持体表面的单分子阵列(SiMoA)、其中使用多个珠以递送用于组合化学的不同试剂的反应、其中珠递送催化剂试剂的反应和/或其中“点击”化学试剂以通过随机珠装载所确定的化学计量递送的反应。
使用rt-PCR芯片例如图2-3的装置50来测试系统，图中微流体部分66由PDMS构成，而基底62由玻璃构成。将用正向PCR引物标记的珠集合与用反向PCR引物标记的珠集合按1:1的比率在反应孔1-3(图7)中混合。将附接有正向和反向引物的珠集合的1-µL等分试样(含有约10 µg珠)加入至孔4-6(图7)的每孔中。将基因组DNA以10 µL体积添加至孔1-6，该体积递送了合计300-400拷贝模板DNA至各孔中。施加真空于废液池上直至孔干燥。随后将含有0.28个单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、1×PlatinumqPCRSupermix-UDG (Invitrogen, Carlsbad, CA)、1% Blocker BSA (ThermoScientific, Rockford, IL)和1×SYBR Green的5 µL 主混合物添加至各孔中。不添加另外的引物。将PDMS预聚物加入废液池中以密封它。将装置50从66℃至95℃热循环60个循环，并且在每个循环结束时采集荧光图像。
图7展示了在第50个扩增循环后rt-PCR芯片的扣除本底的荧光显微术图像。将扣除本底的图像集合用于推算来自SYBR Green嵌入染料的平均信号强度。图8为源自各孔的扩增曲线的图。循环阈（CT）值（其中扩增首次明显）对于所有反应孔是一致的。此实验证明可使用此技术来实施成功的可再现的芯片内rt-PCR。其中在单一反应中将两种引物的混合物附接至珠的单一珠集合与其中仅将正向引物附接至一个珠集合且仅将反向引物附接至另一珠集合的两个珠集合的混合物之间没有可辨识的差异。预装的生物素化的引物在样品清除步骤期间保持稳固地附接至珠上，但在PCR期间释放入溶液中，并证明成功扩增模板序列。
实施例2
图9-11的装置200使用光刻法由硅基底(基底220)和玻璃基底(基底210)制得。硅薄片使用磁控溅射用5 nm的钛(Ti)和100 nm的金(Au)来涂覆。将金属化的薄片用正性光刻胶涂覆并用光刻法图案化以便露出50µm×50µm或100µm×100µm正方形区域的阵列。Au层通过用王水处理而从露出区域除去，留下一层十分亲水的氧化钛。将基底用1-十八烷硫醇（octadecanethiol）处理以仅在Au表面形成十分疏水的自组装单层。(硫醇例如1-十八烷硫醇与Au，但不与氧化钛形成强键)。
通过用含有染料的水性缓冲液覆盖它来用仅薄片侧(即敞开的且无玻璃的)进行初始测试。让矿物油轻轻地流过表面，并将大多数水相推下金-烷基硫醇表面。水性缓冲液的小液滴留在其中Au已经被去除的区域。在薄片上被各个小液滴所覆盖的区域由图案充分界定，但小液滴的高度(并因此，体积)变化极大。
制造带有图案化的玻璃盖或基底210的微流体装置200以更好地控制小液滴的大小(图9-11)。硅薄片按如上面所述制作，但1 mm宽和9-25µm高的光刻图案化边界用基于环氧树脂的负性光刻胶(KMPR1010，Microchem Corp.，Newton，MA)制得。将玻璃基底用5 nm的Ti和20 nm的Au涂层。将Au通过光刻法除去以留出与在硅基底220上的对应的正方形(区域224)互补的亲水的正方形阵列(区域214)(图9)。通孔或孔口240是使用研磨粉喷射打穿玻璃基底210而得。使用Finetech芯片焊接机(FINEPLACER, Berlin, Germany)将玻璃基底210对齐到硅基底上和使用环氧树脂(LOCTITE Hysol E-120HP)永久粘合。图10展示了所述对齐的示意图，而图11展示了芯片的横切面的示图。在玻璃上的金属薄膜在这些厚度下几乎透明，使得有可能对齐和光学探寻疏水区域。在十八烷硫醇饱和的乙醇中处理达≥12小时后，将芯片用纯乙醇漂洗并随后干燥储存。
备选的用于图案化基底210、220上的金属薄膜的方法可用于形成亲水的和疏水的区域，包括用光刻胶对基底图案化并随后用发射和/或多种溅射技术例如氩离子溅射来金属沉积。出于形成亲水和疏水动机的另外的技术对本领域技术人员会是容易地显而易见的。
将芯片设计为包含负性光刻胶的网格或“道”250以将阵列隔开成分隔区域以便可更好地调节不可混溶相的流动(图12-13)。制作与前述相似，而芯片的道和外边界在光刻法的相同步骤期间图案化。将Au从以下区域除去，所述区域中由于烷基硫醇处理在延长处理后引起从Au上抗蚀涂层剥离，光刻胶被图案化。如先前所述加入染料溶液以填充芯片。随后加入矿物油并使用真空以牵引它通过芯片。如在图14中可见，小液滴由填充空隙空间(在基底上由疏水区域所界定)的矿物油隔离。观察到少许小的偏离的小液滴，但很少至没有观察到在孔之间的桥接。小液滴的大多数显示相似且规则的形态。
具有440个计量100µm×100µm的反应区的装置使用25µm或7.5µm高的KMPR边界来制作以形成250 pL或75 pL的反应体积。也制作并测试了掺有1,500个各自在相同的总面积内的具有22.5 pL体积的反应孔(9µm高的KMPR的50µm×50µm垫)的更高密度的阵列。图15A-15C展示了三个填充包含荧光素染料的水性缓冲液的芯片。将水溶液按2.5-5 µL小液滴加入一个通孔，而将真空施加在另一通孔以填充芯片。在用缓冲液填充之后，将矿物油加入通孔并牵引通过芯片。矿物油浸湿Au/烷基硫醇表面，迫使水溶液从芯片大部分区域上离开，留下处于界定的亲水反应区的隔离开的小液滴。填充/小液滴隔离过程可为非常快速的，其通常仅需要约2分钟或更少以界定隔离的反应孔。
芯片在rt-PCR和数字PCR实验中的应用
将使用250nM的自由溶液引物的数字PCR用于验证在单一靶标分子水平下在22.5pL反应(每个芯片1,500个)中的芯片性能。图16A-16C展示了0.7、0.2和0.04拷贝的模板DNA/孔(标称浓度)的结果。在总共1,500个孔中，指示存在至少一个靶标拷贝的阳性命中分别总计约1100个(73%)、360个(24%)和140个(9%)。在样品制备期间允许亚微升体积的移液误差的情况下，假定孔之间泊松分布，1.3、0.27和0.094拷贝/孔的计算浓度相当地接近标称浓度。应该注意到的是，尽管该系统并没有针对快速热循环而优化，但对单一拷贝DNA的检测在小于20分钟之内完成。通过增强对多种参数的优化可获得更短的循环时间。
为了高取样效率和高珠孔占用率使用磁体来装载珠的实证
一些芯片设计可使用玻璃和硅组分来将样品和试剂分配入隔离的反应孔，但这些元件可用塑料的类似结构和表面化学中复制,例如高容量可制造的单片多聚体装置。
尽管已经观察到基于重力的装载导致3.28-µm直径的磁性引物涂覆的珠对硅和玻璃芯片设计>55%占用率，但全部珠群体的取样效率是低的(<1%)。为实现通过与珠上的引物杂交来对稀有靶标序列取样，在此处定义为意指装载入珠孔中的珠总数除以与样品孵育的浆液中的珠总数的取样效率应该尽可能高。修改珠孔几何构型并使用合适的封闭缓冲液显示出明显改善使用磁性装载的珠取样效率和占用率。对珠进行磁性操作可极大地加速将珠递送至珠孔，但可以是成问题的，原因是珠沿着磁场线呈链状对齐，所述链在非优化的几何构型中导致多重装载，如其中磁性装载不成功的新近的文章中所注意到的。[Kan, C. W.等人 Lab on a Chip, 2012, 12, 5, 第977-985页]。
将DRIE用于将具有4.4、5.7和7.0µm深度、直径大小范围从2.5至5.4µm的的珠孔阵列制作于Si薄片中。将薄片切割为各自具有3-4个阵列的区域。将Starting Block PBS缓冲液(Thermo Scientific)用于封闭阵列并防止珠吸附(目前，因芯片内观察到的PCR抑制问题所致而使用0.5% BSA而非Starting Block)。将等分试样的珠(约15,000)放置在阵列的一侧，并在用显微镜观察珠同时沿着硅的背面平移磁体以拖拽珠到珠孔的阵列之上。在牵引珠经过相当多孔后，通常将阵列用去离子水洗涤，用约5 nm的Au/Pd溅射涂覆并用SEM成像。大多数蚀刻至4.4 µm深的阵列在剧烈洗涤后展示弱至中等的对珠的保留，但是在更柔和地洗涤下保留应该是可接受的。蚀刻至7.0 µm深的阵列当通过SEM检查时显示许多双重珠装载的情况。虽然对于3.5 µm直径的珠孔观察到了好的保留，但在取得可观的装载之前需要多次在阵列上通过。蚀刻至5.7 µm深度和具有4.1 µm直径的阵列(图17A-17B)装载迅速并显示好的珠保留。由此几何构型的珠孔制成的芯片可装载<15k珠并通常展示在洗涤后80%至>90%的珠占用率，产生>8-10%的取样效率。图18A-18D展示了在装载过程中采集的一系列图像。当在阵列上移动荧光珠的亮团时，珠从亮团上沉积入孔中。在装载之后用缓冲液洗涤除去大多数松动的珠，使多数孔装载单一珠。可通过将孔深度降低至在4.5和5.7 µm之间的值来进一步减少稀有的双重装载情况。据观察>10k的珠的群体与较小的珠的群体相比可更快地转移；因此，可随着珠孔的数量增加而改善取样效率。加强优化磁体几何构型和磁体移动自动化可进一步改善占用率和最小化装载时间。在一些实施方案中，珠与孔或容纳区域的多种比率可用于改善珠的容纳。例如，目前相信，当珠具有d的直径时，固体支持体容纳区域具有这样的圆柱形，该圆柱形具有1.05d至1.55d的直径和1.2d至1.8d的深度。当如本文所描述使用磁珠装载时，此比率可尤其有益。此外，此比率可用于任何合适的珠的阵列装载应用或装置，例如SiMoA。
通过降低反应体积来降低二聚体形成
完成针对三种靶标的生物素化的引物集合的测试并研究当将主混合物的总体积分成较小的隔离开的反应物时对引物二聚体形成的作用。大规模平行空间多重化可需要对所有引物集合兼容的热循环程序。虽然在聚丙烯PCR管中以常规体积(5-10 µL)在低退火温度下进行PCR时通常注意到形成针对nuc、变异链球菌和mecA引物集合的明显的引物二聚体，但也已观察到芯片内以较小的体积时降低的引物二聚体的形成。虽然可能这些观察可以是因表面相互作用的差异所致，但备选的解释可为：尽管引物的浓度保持相同，然而在特定反应中引物分子的总数(以及因此放大非特异性相互作用的可能性)随着总引物群体的减少而减少。此外，在合成期间形成的在纯化中没有除去的痕量的畸形引物也可引起非特异性扩增。分割反应使得这些杂质的在任何特定反应中的出现率非常低，会减少这些非特异性反应的情况。据预期，用于单一珠反应的极大减少的体积(标准的10 µL反应的数百万分之一至数千分之一)将允许使用因在低退火温度下在一些集合中形成引物二聚体所致而目前在常规体积的反应中不可兼容的引物集合。减少引物设计制约的能力可极大地改善此技术的可用性并极大地加速重新配置以包含用于检测新出现的疾病的新的靶标序列。通常，二聚体形成为稀有事件，但当它发生时它被扩增并遍及整个反应体积分布。当将特定体积的PCR 主混合物分隔到许多隔离开的孔中时，二聚体形成的稀有情况(或痕量的杂质)被有效地隔离在许多小反应体积之一中，而大多数反应保持不受影响。
表1. 反应体积和二聚体发生
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进行初步测试以将在PCR管中的5 µL反应中二聚体形成的程度与在300 nL芯片内反应中观察到的程度相比较。制备3个储备的主混合物，其每一个包含：500 nM不同引物集合(表2)、1% Blocker BSA、1×Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG、1×SYBRGreen I和0.0625单位/µL附加的Platinum Taq DNA聚合酶。随后将九个等分试样(5 µL)分配入丙烯PCR管并用60℃退火温度热循环60个循环。在热循环后，在带有DNA 1000芯片的Agilent Bioanalyzer 2100上使用毛细管凝胶电泳来分析PCR混合物。在11-22%的这些反应中观察到二聚体形成。由如上配制的主混合物制备50个芯片内反应(每个300 nL)并使用rt-PCR芯片内热循环。仅一个芯片内反应以SYBR Green I荧光信号展现出引物二聚体。针对变异链球菌16S rRNA和mecA序列的阳性对照指示对于11个反应分别11次成功扩增。
用引物功能化的珠来杂交
已经使用大量珠和标准PCR进行对引物标记的珠从稀释溶液中取样DNA的能力的初步研究。将靶标gDNA(约350拷贝/µL)用限制酶(例如EcoRV, Bpu10I和SfaNI)在37℃下消化15分钟以切断在靶标区域附近的DNA。随后将消化物加热至95℃达5分钟以变性DNA。随后将10µL此消化物(约3,500拷贝)与5 µL珠浆液(约25 µg珠)一起孵育10-15分钟。用PCR缓冲液(w/o聚合酶)进行三次15 µL清洗步骤。随后将1.5 µL等分试样加入PCR主混合物以形成5µL反应物，该反应物被热循环60次。按凝胶标绘的实施例的电泳图展示于图20中。如果假定洗涤步骤间存在0.5 µL的遗留，那么在液相中就仅转移约0.013拷贝靶标DNA。因此，这些初步结果表明珠以某种方式俘获DNA。DNA附接至珠的机制可为特异性杂交或非特异性吸附。虽然杂交优选用于有效取样和最低的可能检测限，但是某种程度的非特异性吸附不大可能对测定有害，原因是靶标的鉴定是通过PCR扩增来确定。
实施例3
图21A-21C展示了来自用多种遗传标记(nuc和mecA，变异链球菌作为阴性对照)检测MRSA的基于编码珠测定实施例的代表性区域。
将三个等分试样的链霉亲和素涂覆的珠(Bangs Laboratories, Inc., 产品号PMS3N/10098)放入分开的200 µL PCR级聚丙烯管。将不同集合的正向和反向5’-生物素化引物与各个等分试样孵育以便一个等分试样含有针对发现于金黄色葡萄球菌gDNA中的nuc基因的引物，另一个含有针对发现于甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)中的mecA基因的引物和第三个含有针对变异链球菌gDNA的引物。在孵育之后，用缓冲液洗涤珠以除去任何没有键合至珠表面的引物。出于编码目的，随后将带有针对mecA基因的引物的珠与生物素标记的Qdot®605纳米晶体(Invitrogen, Carlsbad, CA)一起孵育，并将带有针对变异链球菌gDNA的引物的珠与生物素标记的Qdot®655纳米晶体(Invitrogen)一起孵育。带有针对发现于金黄色葡萄球菌中的nuc基因的引物的珠仅在缓冲液中孵育。在孵育之后，用缓冲液洗涤珠集合以除去所有未结合的生物素标记的Qdot纳米晶体。以此方式，实现了初步的编码方案；然而，编码并不限定于此方法并可使用本文所描述的多种其它方法来完成。然后将来自各集合的珠的等分试样混合在一起以形成包含所有三种珠类型的浆液。珠类型使用荧光显微术通过监测来自Qdot605、Qdot655或未标记的珠的自发荧光的发射可容易地辨识(图19A-19C)。
将微流体芯片例如图9-11中的装置200用于将单个珠隔离在分隔开的反应孔(每一个约22.5pL)中。简而言之，将硅薄片使用磁控溅射用5 nm的钛和100 nm的金涂覆。玻璃基底也用5 nm的钛和20 nm的金涂覆。将光刻图案化使用在硅薄片和玻璃基底上以形成1,500个反应区的阵列，各各区界定为边长计量50 µm的正方形，其中金被去除，留下亲水性氧化物表面。使用光刻法和深度反应离子刻蚀将直径计量约4.1 µm且深5.7 µm的单一珠孔蚀刻入各反应区的中心。将一层负性光刻胶(KMPR1010, MicroChem Corp., Newton, MA)图案化在硅薄片的表面以形成约9 µm高的壁和通道的图案。在制作好玻璃基底中用于添加试剂的洞之后，将玻璃基底在硅薄片上对齐以便亲水性氧化物图案与硅薄片上的图案互补。随后使用环氧树脂将两者粘合使得约9µm的间隙将玻璃基底同硅薄片分隔开。用1-十八烷硫醇在纯乙醇中的饱和溶液填充装置并静置>12小时，从而在玻璃和硅基底的金表面上形成自组装单层的烷基硫醇。
用缓冲液填充微流体装置，并随后将少量含有三种不同珠类型的混合物装载入装置。将磁体施加于装置的外侧以便将磁珠牵引到蚀刻入硅基底的珠孔的阵列上。观察到单一珠装载入约80%至超过90%的珠孔中。用缓冲液洗涤阵列以除去松动的珠。随后将阵列通过荧光显微术成像以确定各装载的珠的类型和位置。
PCR主混合物用1×Platinum qPCRSupermix-UDG和0.11单位/µL附加的PlatinumTaq DNA聚合酶(Invitrogen, Carls bad, CA)、0.55% Blocker BSA (ThermoScientific, Rockford, IL)和1x SYBR Green I (Invitrogen, Carlsbad, CA)，以及每25 pL反应大约15拷贝MRSA gDNA(ATCC# 700699D-5)来制备。随后将主混合物装载入微流体装置以便它完全填满玻璃与硅之间的间隙。随后将矿物油加入装置并通过真空输送经过孔阵列。矿物油优先浸湿烷基硫醇处理过的金表面，留下夹心在裸露的亲水性氧化物表面之间的隔离的约25 pL水性小液滴。
将芯片放置于热循环台上，在那里将它加热至50℃ 12秒，90℃ 120秒，并随后30个循环：90℃ 5秒和60℃ 30秒。在每个循环后对阵列成像以监测来自SYBR Green I嵌入染料的荧光发射。大约94%的含有鉴定为携带针对发现于金黄色葡萄球菌gDNA中的nuc基因的引物的那些珠的珠的反应孔展示了PCR扩增的证据，约94%的含有携带针对发现于甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)中的mecA基因的引物的珠的反应孔亦是如此。仅约6%的鉴定为含有变异链球菌gDNA的引物的孔显示阳性结果。大约2%的珠孔被鉴定为含有一个MRSA引物珠和一个变异链球菌引物珠。很可能存在一些携带nuc基因的引物的珠的双重装载，引起对变异链球菌引物集合所看到的假阳性，但这并不可与来自珠的聚苯乙烯壳的弱自发荧光信号(由于此集合没有使用编码染料)容易地区分开。可预期的是，可容易地实现珠孔几何构形的进一步优化和更加高度精炼的编码方法以减少假阳性信号。
芯片的小区域展示于约25 pL体积的12个反应孔的荧光显微术图像中，所述荧光显微术图像各自展示于图19A-19D中。图19A是具有365/10 nm激发和605/55 nm发射的编码图像。用Qdot 605和发现于MRSA gDNA中的mecA基因的引物标记的三个珠用白色正方形来突显。图19B展示了在445/50 nm激发和665/30 nm发射的编码图像。用Qdot 655和变异链球菌gDNA的引物标记的四个珠用白色正方形来突显。图19C显示在556/20 nm激发和620/60nm发射的第三个编码图像。所有珠集合在这些波长发出弱的自发荧光，而Qdot 605和Qdot655标记的珠发出明亮的荧光。不带Qdot标记的珠(用白色正方形突显)携带发现于金黄色葡萄球菌gDNA中的nuc基因的引物。空珠孔用白色六边形突显。图19D展示了热循环30次后在470/40 nm激发和525/50 nm发射的测定图像。SYBR Green I荧光在存在大量的双链DNA的情况下可轻松检测到，指示检测到分析物。用正方形画出轮廓的反应孔显示在信号上大大地增加，而其它反应孔仅展示珠的自发荧光或来自非嵌入的SYBR Green I的弱信号，与由不含引物的孔(白色六边形)显示的类似。
表2.来自全芯片的结果
nuc-MSSA mecA-MRSA 变异链球菌
全部的珠 约6,000 约6,000 约6,000
装载的珠 174 440 561
活性孔 164 413 34
阴性孔 10 27 527
双重装载的 ND 13 13
因此，PCR探针(例如Taqman和分子信标探针等)可改善PCR的特异性，而且如果将探针生物素化或以其它方式功能化用于附接至固体表面，就可将这些探针与引物一起容易地附接至珠。由于将珠确定性地装载入反应孔中，单一的检测荧光团可用于所有探针集合。如果并入探针，可进行另外的优化。可将不需要探针的PCR反应与使用探针的反应一起在相同芯片上使用，如果两种类型的反应都使用类似的热循环和主混合物条件。在某些情况下，可将通用引物加入自由溶液形式的主混合物中且可将特异性探针取代特异性引物集合附接至珠。
虽然本发明的一些实施方案使用固相提取膜68(图2-3)以在PCR前纯化DNA，但是该装置的其它实施可利用靶标DNA直接杂交至它的键合至微珠的序列特异性引物。当将珠混合物与分析物DNA或cDNA孵育时，附接至珠的引物充当杂交探针，俘获和纯化对该珠特异性的序列。可通过控制它们的长度和序列或加入新的核碱基来设计引物以优化这些杂交事件。可将样品基质的干扰组分(外来的gDNA、RNA、细胞膜组分等)洗掉,留下纯化的与键合至珠的引物杂交的靶标DNA。
一些实施方案也可按数字PCR形式实施，所述数字PCR形式中许多反应孔可含有用引物标记的相同集合的一个或更多个珠或表面。随后可基于终点检测来定量。使用等温扩增的对靶标定量也可按与数字PCR方法类似的方式来完成。
前述为本发明的例示说明而不应解释为对其的限制。尽管已经描述少许本发明的示例性实施方案，但是本领域技术人员会容易理解的是，在本质上不违背本发明的新的教导和优点的情况下在示例性实施方案中进行许多修改是有可能的。因此，所有这样的修改意图包含于权利要求中所限定的本发明的范围内。因此，应该理解的是，前述为本发明的例示说明而不应解释为对公开的具体实施方案的限定，并且对公开的实施方案的修改以及其它实施方案，意图包含于随附的权利要求的范围内。本发明由随附权利要求和待包含于其中的权利要求的相等物限定。

Claims (35)

1.一种微流体装置，其包含：
多个反应孔；
多个固体支持体，每一个固体支持体具有附接至其上的试剂，其中所述试剂通过不稳定的试剂/支持体键而附接至固体支持体以便将所述试剂配置以通过裂解操作而从支持体上裂解，其中将所述孔配置以容纳两个或更多个所述多个支持体。
2.权利要求1的微流体装置，其中将所述试剂配置以从所述多个孔之一中的所述两个或更多个所述多个支持体释放而实现试剂之间的反应。
3.权利要求2的微流体装置，其中将所述试剂配置以从所述多个孔之一中的多个珠释放且为设计以实现从较小的化学单位形成较大的分子的“点击化学”试剂。
4.权利要求1的微流体装置，其中所述裂解操作包括：热力操作、添加化学品、添加酶、应用电势和/或应用光和/或电离辐射至试剂/支持体键。
5.权利要求4的微流体装置，其中所述试剂包含用于核酸转录和/或扩增反应的核酸序列。
6.权利要求5的微流体装置，其中所述试剂包含用于PCR反应的DNA引物或探针。
7.权利要求6的微流体装置，其中所述不稳定的试剂/支持体键包含链霉亲和素-生物素键和/或抗生物素蛋白-生物素键。
8.权利要求7的微流体装置，其中所述裂解操作包含热力操作。
9.权利要求8的微流体装置，其中将所述链霉亲和素-生物素键配置用以当在50-99℃下孵育固体支持体时从支持体上释放试剂。
10.权利要求1-9中任一项的微流体装置，其中所述固体支持体为微珠。
11.权利要求10的微流体装置，其中所述微珠为磁性的。
12.权利要求10的微流体装置，其中所述固体支持体包含配置以鉴别固体支持体和/或试剂的特性的标记。
13.权利要求12的微流体装置，其中所述标记包括预定的支持体形状、预定的支持体大小、支持体的磁性性质和/或光学性质。
14.权利要求12的微流体装置，其中所述标记包括荧光标记。
15.权利要求10的微流体装置，其中所述微流体装置包含密封件或不可混溶的流体以流体性隔离各个所述多个孔。
16.权利要求15的微流体装置，其中所述密封件为弹性膜。
17.权利要求16的微流体装置，其中所述弹性膜为聚二甲基硅氧烷。
18.权利要求1-9和11-17中任一项的微流体装置，其中所述微流体装置在孔中包括膜。
19.权利要求18的微流体装置，其中所述膜包括提取膜。
20.权利要求19的微流体装置，其中所述膜包括单片氧化铝膜。
21.权利要求18的微流体装置，其另外包括连接至膜的通道，其配置用以提供通过膜与所述多个孔的流体连接。
22.权利要求18的微流体装置，其另外包括在膜和通道之间图案化的微柱以支撑膜但允许来自所述多个孔的经由膜的均匀流体流动。
23.权利要求1-9、11-17和19-22中任一项的微流体装置，其另外包括含有所述多个反应孔的基底，其中所述基底包括图案化的亲水和疏水区域，并且所述多个反应孔在亲水区域或疏水区域之一上。
24.权利要求23的微流体装置，其中所述基底包括第一基底，所述装置另外包括第二基底，所述第二基底经间隙与第一基底间隔开并具有面向第一基底上图案化的交替的亲水和疏水区域且与之对齐的对应的图案化的交替的亲水和疏水区域。
25.权利要求24的微流体装置，其中将所述装置配置以便当将水性流体放置在第一和第二基底之间的间隙中并随后将非水性流体放置在第一和第二基底之间的间隙中时，水性流体形成由在第一和第二基底之间的非水性流体所隔离的小液滴。
26.权利要求23的微流体装置，其中所述疏水和亲水区域包括在第一和第二基底上的图案化的金属层之上的图案化的自组装单层。
27.权利要求26的微流体装置，其中所述图案化的金属层为金或其它合适的金属。
28.权利要求23的微流体装置，其中应用至第一和/或第二基底的电势差实现电化学反应和/或通过在所述多个反应孔中的电化学反应产生化学物类，所述电化学反应包括但不限于从固体支持体裂解试剂。
29.权利要求23的微流体装置，其中施加至第一和/或第二基底上的直流或交流电流产生诱导化学反应的焦耳加热，所述化学反应包括但不限于从固体支持体裂解试剂。
30.一种用于向微流体装置提供试剂的方法，所述装置包括多个反应孔，所述方法包括：
提供在所述多个反应孔中的多个固体支持体，每一个固体支持体具有附接至其上的试剂以便所述试剂通过不稳定的试剂/支持体键而附接至固体支持体并且将所述试剂配置以通过裂解操作而从支持体上裂解；
在所述多个反应孔之一中容纳两个或更多个所述多个支持体；和
进行裂解操作以释放试剂至所述多个反应孔中的溶液中。
31.权利要求30的方法，其中将所述试剂配置以从所述多个孔之一中的所述两个或更多个所述多个支持体释放而实现试剂之间的反应。
32.权利要求31的方法，其中将所述试剂配置以从所述多个孔之一中的多个珠释放且为设计以实现从较小的化学单位形成较大的分子的“点击化学”试剂。
33.权利要求32的方法，其中所述多个固体支持体至少包括具有附接至其上的第一试剂的第一多个固体支持体和具有附接至其上的第二试剂的第二多个固体支持体，其中所述第一和第二多个固体支持体另外包括配置以鉴别固体支持体和/或试剂的性质的各自的第一和第二标记。
34.权利要求33的方法，其另外包括通过鉴定各个所述多个反应孔是否被第一多个固体支持体或第二多个固体支持体占据来解码所述装置。
35.权利要求34的方法，其中解码所述装置包括鉴定所述多个固体支持体的第一和第二标记。
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