CN101490251A

CN101490251A - 使用肠杆菌科细菌产生l-氨基酸的方法

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Publication number: CN101490251A
Application number: CNA2007800271571A
Authority: CN
Inventors: 利奥尼德·R·普蒂特辛; 伊里纳·B·奥尔特曼; 韦罗妮卡·A·科特利亚罗瓦; 奥尔佳·N·莫科瓦; 塔蒂亚纳·A·亚姆波尔斯卡亚; 尤里·I·科兹洛夫; 寺下优; 臼田佳弘; 松井和彦
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2006-07-19
Filing date: 2007-07-12
Publication date: 2009-07-22
Anticipated expiration: 2027-07-12
Also published as: WO2008010565A2; US20090203090A1; CN101490251B; US20150203881A1; BRPI0715584A2; WO2008010565A3; BRPI0715584B1; JP2009543543A; JP5407858B2; BRPI0715584B8; EP2046949B1; EP2046949A2; CN103215319A

Abstract

描述了一种使用肠杆菌科的细菌产生L－氨基酸的方法，例如L－苏氨酸、L－赖氨酸、L－组氨酸、L－苯丙氨酸、L－精氨酸、L－色氨酸或L－谷氨酸，其中已经对所述细菌进行了修饰以增强由adhE基因编码的野生型醇脱氢酶或对有氧失活有抗性的突变醇脱氢酶的活性。

Description

使用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物工业，具体涉及通过使用具有增强的醇脱氢酶活性的细菌进行发酵来产生L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。

背景技术

常规而言，在工业上通过利用从天然来源获得的微生物菌株或其变体的发酵方法产生L-氨基酸。通常对微生物进行修饰以提高L-氨基酸的产率(production yield)。

已经报道过许多提高L-氨基酸产率的技术，包括用重组DNA转化微生物(美国专利No.4,278,765)。用于提高产率的其它技术包括增加氨基酸生物合成中涉及的酶的活性和/或使目标酶对产生的L-氨基酸的反馈抑制脱敏(美国专利Nos.4,346,170、5,661,012和6,040,160)。

通过优化期望的化合物的主要生物合成途径，能够实现对产生L-氨基酸的菌株的进一步改进。通常这通过为细菌补充越来越大量的碳源(如糖，例如葡萄糖)来实现。无论通过PTS的葡萄糖转运的效率为何，但是在高产菌株中对碳源的获取(access)却仍可能不足。另一种增加产生L-氨基酸的菌株的生产力和降低目标L-氨基酸成本的方法是使用替代性(alternative)的碳源，如醇，例如乙醇。

大肠杆菌的醇脱氢酶(乙醇氧化还原酶，AdhE)是一种多功能酶，其通过两个连续的NADH-依赖性乙酰辅酶A还原反应，以及使将丙酮酸切割成乙酰辅酶A和甲酸的丙酮酸甲酸裂合酶来催化乙醇的发酵生产。

AdhE在葡萄糖存在下在厌氧生长的过程中大量合成(约3 x 10⁴拷贝每细胞)，并形成称为螺旋体(spirosome)的螺旋结构，这些螺旋结构大约0.22μm长，含有40-60个AdhE分子(Kessler，D.，Herth，W.和Knappe，J.，J.Biol.Chem.，267，18073-18079(1992))。当将大肠杆菌细胞培养从厌氧条件转换至有氧条件时，adhE基因的转录降低，并维持在于厌氧条件下所得范围的10％以内(Chen，Y.M.和Lin，E.C.C.，J.Bacteriol.173，8009-8013(1991)；Leonardo，M.R.，Cunningham，P.R.和Clark，D.P.，J.Bacteriol.175,870-878(1993)；Mikulskis，A.，Aristarkhov，A.和Lin，E.C.C.，J.Bacteriol.179，7129-7134(1997)；Membrillo-Hemandez，J.和Lin，E.C.C.，J.Bacteriol.181，7571-7579(1999))。翻译也受到调节，并且需要RNA酶III(Membrillo-Hemandez，J.和Lin，E.C.C.，J.Bacteriol.181，7571-7579(1999)；Aristarkhov，A.等，J.Bacteriol.178，4327-4332(1996))。已将AdhE鉴定为大肠杆菌细胞经受过氧化氢应激(hydrogen peroxide stress)时的主要靶物之一(Tamarit，J.，Cabiscol，E.和Ros，J.，J.Biol.Chem.273，3027-3032(1998))。

尽管由AdhE催化的两个NADH-偶联反应具有可逆性，野生型大肠杆菌也无法在乙醇作为唯一碳源和能源存在时生长，因为adhE基因在有氧条件下以低水平转录(Chen，Y.M.和Lin，E.C.C.，J.Bacteriol.73，8009-8013(1991)；Leonardo，M.R.，Cunningham，P.R.& Clark，D.P.，J.Bacteriol.175870-878(1993))，并且在有氧代谢过程中AdhE蛋白的半衰期因金属催化的氧化(MCO)而缩短。

已经分离并表征了能够在乙醇作为唯一碳源和能源时进行有氧生长的大肠杆菌突变体(在37℃，具有取代Ala267Thr的突变体，在乙醇存在下生长，倍增时间为240分钟；具有取代Ala267Thr和Glu568Lys的变体，倍增时间为90分钟)(Membrillo-Hemandez，J.等，J.Biol.Chem.275，33869-33875(2000)；Holland-Staley，C.A.等，J.Bacteriol.182，6049-6054(2000))。显然，当按照与生理上的方向相反的方向催化两个连续反应时，对于野生型AdhE而言乙酰辅酶A的形成是速率受限的。作为通过AdhE中的A267T取代来改进V_max的交换(tradeoff)是酶的热稳定性降低和对MCO损坏的敏感性增加。AdhE中的第二氨基酸取代E568K(A267T/E568K)部分恢复了蛋白质稳定性和对MCO损坏的抗性，而未进一步改进在底物氧化中的催化效率。

然而，迄今尚未有报道使用肠杆菌科(Enterobacteriaceae family)细菌通过在含有乙醇的培养基中发酵来增加L-氨基酸的产生，所述肠杆菌科细菌具有活性增强的对有氧失活(aerobic inactivation)有抗性的天然醇脱氢酶或突变醇脱氢酶。

发明概述

本发明的目的包括提高产生L-氨基酸的菌株的生产力，和提供使用这些菌株产生非芳族或芳族L-氨基酸的方法。

通过发现在处于有氧培养条件下有功能的启动子的调控下表达编码醇脱氢酶的天然或突变adhE基因使L-氨基酸(例如，L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和/或L-亮氨酸)的产生增强而达到了该目的。

本发明的目的是提供用于产生L-氨基酸的方法，其包括：

A)在含有乙醇的培养基中培养具有醇脱氢酶的肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，和

B)从培养基中分离L-氨基酸，

其中编码所述醇脱氢酶的基因在非天然启动子的调控下表达，所述非天然启动子在有氧培养条件下有功能。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述非天然启动子选自下组：P_tac、P_lac、P_trp、P_trc、P_R和P_L。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶对有氧失活有抗性。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶源于选自下组的细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、Pantoea ananatis(菠萝泛菌)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQ ID NO：2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为另一种除天冬氨酸残基之外的氨基酸残基。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQ ID NO：2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为赖氨酸残基。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶具有至少一个额外的突变，该突变能够改进所述细菌在含有乙醇作为唯一碳源的液体培养基中的生长。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述额外的突变选自下组：

A)用另一种氨基酸残基替代SEQ ID NO：2中在位置560的谷氨酸残基；

B)用另一种氨基酸残基替代SEQ ID NO：2中在位置566的苯丙氨酸残基；

C)用其它氨基酸残基替代SEQ ID NO：2中分别在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和

D)以上各项的组合。

A)用赖氨酸残基替代SEQ ID NO：2中在位置560的谷氨酸残基；

B)用缬氨酸残基替代SEQ ID NO：2中在位置566的苯丙氨酸残基；

C)用甘氨酸残基、缬氨酸残基、半胱氨酸残基、丝氨酸残基和缬氨酸残基分别替代SEQ ID NO：2中在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和

D)以上各项的组合。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于选自下组的属：埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)和摩根氏菌属(Morganella)。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸选自下组：L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。

优选实施方案详述

醇脱氢酶是Fe²⁺-依赖性多功能蛋白质，其在N-末端具有乙醛-辅酶A脱氢酶活性，在C-末端具有铁依赖性醇脱氢酶活性，和丙酮酸甲酸裂合酶失活酶(deactivase)活性。同物异名包括B1241、AdhC和Ana。在有氧条件下，在有氧代谢过程中的活性AdhE蛋白的半衰期因金属催化的氧化而缩短。

在本发明中，短语“醇脱氢酶的活性”的意思是催化醇变成醛或酮的NAD-依赖性氧化反应的活性。醇脱氢酶(EC1.1.1.1)良好地作用于乙醇、正丙醇和正丁醇。醇脱氢酶的活性能够通过例如由Membrillo-Hernandez，J.等描述的方法(J.Biol.Chem.275，33869-33875(2000))来检测和度量。

醇脱氢酶由adhE基因编码，并且可以使用源自或天然存在于(native to)属于以下菌属的细菌的任何adhE基因作为本发明中的醇脱氢酶基因：埃希氏菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属(Yershinia)、泛菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属。adhE基因的来源的具体实例包括细菌菌株，如大肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、Pantoea ananatis、植物乳杆菌和乳酸乳球菌。已经阐明了编码大肠杆菌醇脱氢酶的野生型adhE基因(与GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990的序列中编号1294669-1297344互补的核苷酸号)。adhE基因位于大肠杆菌K-12染色体上的ychG和ychE ORF之间。也已经阐明编码醇脱氢酶的其它adhE基因：来自胡萝卜软腐欧文氏菌的adhE基因(GenBank登录号NC_004547.2；gi：50121254的序列中的核苷酸号2634501-2637176)；来自肠沙门氏菌的adhE基因(GenBank登录号NC_004631.1；gi：29142095的序列中的核苷酸号1718612-1721290)；来自鼠伤寒沙门氏菌的adhE基因(GenBank登录号U68173.1；gi：1519723的序列中的核苷酸号1-2637)；来自弗氏志贺氏菌的adhE基因(与GenBank登录号NC_004741.1；gi：30062760的序列中的核苷酸号1290816-1293491互补的核苷酸号)；来自假结核耶尔森氏菌的adhE基因(与GenBank登录号NC_006155.1；gi：51596429的序列中的核苷酸号2478099-2480774互补的核苷酸号)；来自Pantoea ananatis的adhE基因(SEQ ID NO：29)；来自植物乳杆菌的adhE基因(UniProtKB Entry：Q88RY9_LACPL)；来自乳酸乳球菌MG1363的adhE基因(EMBL登录号AJ001007)；等等(见图2)。来自大肠杆菌的adhE基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：1表示。由这种adhE基因编码的氨基酸序列由SEQ ID NO：2表示。

因此，能够使用基于来自大肠杆菌染色体的基因的已知核苷酸序列制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参见White，T.J.等.，Trends Genet.，5,185(1989))获得adhE基因。编码来自其它微生物的醇脱氢酶的基因能够以类似的方式获得。

用编码以下的蛋白质(A)或(B)的DNA作为源自大肠杆菌的adhE基因的示例：

(A)具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质；或

(B)SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。

用编码以下的蛋白质(A)或(B)的DNA作为源自Pantoea ananatis的adhE基因的示例：

(A)具有SEQ ID NO：30中所示氨基酸序列的蛋白质；或

(B)SEQ ID NO：30中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。

用编码以下的蛋白质(A)或(B)的DNA作为源自弗氏志贺氏菌的adhE基因的示例：

(A)具有SEQ ID NO：53中所示氨基酸序列的蛋白质；或

(B)SEQ ID NO：53中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。

用编码以下的蛋白质(A)或(B)的DNA作为源自鼠疫耶尔森氏菌的adhE基因的示例：

(A)具有SEQ ID NO：54中所示氨基酸序列的蛋白质；或

(B)SEQ ID NO：54中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。

用编码以下的蛋白质(A)或(B)的DNA作为源自胡萝卜软腐欧文氏菌的adhE基因的示例：

(A)具有SEQ ID NO：55中所示氨基酸序列的蛋白质；或

(B)SEQ ID NO：55中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。

用编码以下的蛋白质(A)或(B)的DNA作为源自鼠伤寒沙门氏菌的adhE基因的示例：

(A)具有SEQ ID NO：56中所示氨基酸序列的蛋白质；或

(B)SEQ ID NO：56中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。

用编码以下的蛋白质(A)或(B)的DNA作为源自植物乳杆菌的adhE基因的示例：

(A)具有SEQ ID NO：57中所示氨基酸序列的蛋白质；或

(B)SEQ ID NO：57中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。

用编码以下的蛋白质(A)或(B)的DNA作为源自乳酸乳球菌的adhE基因的示例：

(A)具有SEQ ID NO：58中所示氨基酸序列的蛋白质；或

(B)SEQ ID NO：58中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。

短语“变体蛋白”如用于本发明中意思是序列中具有变化的蛋白质，无论这些变化是氨基酸的缺失、插入、添加或取代，但是所述蛋白质仍保留可用水平的醇脱氢酶活性。变体蛋白中变化的数量依赖于蛋白质三维结构中的位置或氨基酸残基的类型。相对于蛋白质(A)而言，变化的数量可为1-30，优选1-15，和更优选1-5。变体中的这些变化是保留蛋白质功能的保守突变。换句话说，这些变化可以发生在对于蛋白质功能而言非关键性的蛋白质区域中。这是因为一些氨基酸彼此具有高同源性，所以这样的变化不影响三维结构或活性。因此，只要保持醇脱氢酶活性，蛋白质变体(B)可以是一种与SEQID NO.2中所示醇脱氢酶的完整氨基酸序列具有不少于70％，优选不少于80％，更优选不少于90％，并最优选不少于95％同一性的蛋白质变体。

两个氨基酸序列之间的同源性能够使用公知的方法来测定，例如，计算以下三种参数的计算机程序BLAST2.0：得分、同一性和相似性。

一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加应为保守突变，从而保持活性。代表性保守突变是保守取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Tm、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，和用Met、Ile或Leu取代Val。

对来自大肠杆菌、弗氏志贺氏菌、Pantoea ananatis、鼠疫耶尔森氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、鼠伤寒沙门氏菌(革兰氏阴性细菌)和植物乳杆菌、乳酸乳球菌(革兰氏阳性细菌)的醇脱氢酶的基本序列(primary sequence)进行比较的数据显示这些蛋白之间高水平的同源性(参见图2)。从这个观点，取代或缺失在全部上述蛋白中都相同的氨基酸残基(用星号标记)对于这些蛋白质的功能可能是重要的。用相似的氨基酸残基替代相似的(用冒号标记的)氨基酸残基而无损于蛋白质活性是可能的。但是对其它非保守氨基酸残基的修饰可能不导致醇脱氢酶活性的改变。

可以获得编码与上述醇脱氢酶基本上相同的蛋白质的DNA，例如，通过修饰编码醇脱氢酶的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，例如通过定点诱变的方式，从而缺失、取代、插入或添加负责特定位点的一个或多个氨基酸残基的核苷酸序列。如上所述修饰的DNA可以通过常规已知的突变处理获得。这些处理包括以羟胺处理编码本发明的蛋白质的DNA，或用UV照射或试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸处理含有所述DNA的细菌。

编码与醇脱氢酶基本上相同的蛋白质的DNA可通过在适当的细胞中表达具有如上所述突变的DNA并研究任何表达产物的活性来获得。编码与醇脱氢酶基本上相同的蛋白质的DNA也可以通过如下获得：分离能够在严紧条件下与探针杂交并且编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA，所述探针具有核苷酸序列，该序列包含例如如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本文所提及的“严紧条件”是这样的条件，在该条件下形成所谓的特异性杂合体，并且不形成非特异性杂合体。例如，可以以一些条件作为严紧条件的示例，在所述这些条件下，具有高同源性的DNA，例如具有不低于50％，优选不低于60％，更优选不低于70％，还更优选不低于80％，进一步优选不低于90％，最优选不低于95％的同源性的DNA能够相互杂交；但是具有低于上述同源性的DNA不能相互杂交。可选地，可以以一些条件作为严紧条件的示例，在所述这些条件下，DNA能够在下述盐浓度下杂交，该盐浓度等同于Southern杂交中通常的洗涤条件，即1xSSC，0.1％SDS，优选0.1xSSC，0.1％SDS，在60℃。洗涤的持续时间依赖于用于印迹的膜的类型，并且通常由制造商推荐。例如，在严紧条件下对于Hybond^TM N+尼龙膜(Amersham)推荐的洗涤持续时间是15分钟。优选地，可以进行2至3次洗涤。

也可以将SEQ ID NO：1的核苷酸序列的部分序列用作探针。可以使用基于SEQ ID NO：1的核苷酸序列的引物，并使用含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA片段作为模板通过PCR制备探针。当使用长度约300bp的DNA片段作为探针时，用于洗涤的杂交条件包括，例如，50℃，2x SSC和0.1％SDS。

如上所述的核苷酸的取代、缺失、插入或添加也包括天然存在的突变(突变体或变体)，例如，由于细菌的种或者属的多样性而天然存在的突变，并且所述细菌含有醇脱氢酶(，and which contains alcohol dehydrogenase)。

野生型醇脱氢酶可能受到金属催化的氧化。尽管可以使用这样的野生型醇脱氢酶，但是对有氧失活有抗性的突变醇脱氢酶在本发明中是优选的。短语“对有氧失活有抗性的突变醇脱氢酶”的意思是在有氧条件下保持其活性的突变醇脱氢酶，或与野生型醇脱氢酶相比活性降低的量可忽略的突变醇脱氢酶。

在大肠杆菌adhE基因的情况下，野生型醇脱氢酶包含SEQ ID NO：2中所列的氨基酸序列。SEQ ID NO：2的醇脱氢酶中导致该蛋白质对有氧失活有抗性的突变的实例是用赖氨酸残基替代位置568处的谷氨酸残基。然而，向adhE基因中引入突变(例如在SEQ ID NO：2中的位置568处)可能导致在含有乙醇作为碳源的液体培养基中的生长延缓，在这样的情况下，优选的是突变醇脱氢酶具有能够改进细菌在含有乙醇作为唯一碳源的液体培养基中的生长的至少一个额外突变。例如，当用另一种氨基酸残基替代SEQ ID NO：2的醇脱氢酶中位置568处的谷氨酸残基时，通过引入选自下组的额外突变，改进了大肠杆菌的生长：

A)用另一种氨基酸残基，例如赖氨酸残基，替代SEQ ID NO：2中在位置560的谷氨酸残基；

B)用另一种氨基酸残基，例如缬氨酸残基，替代SEQ ID NO：2中在位置560的谷氨酸残基；

C)用其它氨基酸残基，例如分别用甘氨酸残基、缬氨酸残基、半胱氨酸残基、丝氨酸残基和缬氨酸残基，替代SEQ ID NO：2中分别在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和

D)以上各项的组合。

涉及的序列中的位置号，例如，短语“在位置22、236、554、560、566和786的氨基酸残基”是指在来自大肠杆菌的野生型AdhE的氨基酸序列中这些残基的位置。然而，氨基酸残基的位置可能变化。例如，如果在N-末端部分插入一个氨基酸残基，那么原本位于位置22的氨基酸残基则变成在位置23。在这样的情况下，在原位置22的氨基酸残基是本发明的在位置22的氨基酸残基。

突变AdhE可以在除上面A)-C)中确定的位置之外的一个或多个位置包括一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，条件是不丧失或降低AdhE活性。

根据本发明的突变AdhE和突变adhE基因能够从野生型adhE基因获得，例如，通过使用常规方法的位点特异性诱变，所述常规方法如PCR(聚合酶链式反应，参见White，T.J.等.，Trends Genet.，5,185(1989))，其利用基于所述基因的核苷酸序列制备的引物。

野生型大肠杆菌中adhE基因的转录仅在厌氧条件下被诱导，主要是响应于还原的NADH水平提高(Leonardo，M.R.，Cunningham，P.R.& Clark，D.P.，J.Bacteriol.175870-878(1993))。

在本发明中，修饰用于产生L-氨基酸的细菌菌株，从而使adhE基因的表达由非天然启动子调控，即，在野生型菌株中不调控adhE基因表达的启动子。这样的修饰可以通过用在有氧培养条件下有功能的非天然启动子替代染色体上adhE基因的天然启动子从而使adhE基因与该非天然启动子可操作地连接来实现。作为在有氧培养条件下有功能的非天然启动子，可以使用在有氧培养条件下能够使adhE基因的表达在特定水平之上的任何启动子。关于本发明中AdhE蛋白的水平，根据Clark和Cronan(J.Bacteriol.141177-183(1980))的方法测量的无细胞提取物中醇脱氢酶的活性应为每mg蛋白质1.5个单位或更多，优选5个单位或更多，并且更优选10个单位或更多。有氧培养条件可以是那些通常用于培养细菌的条件，其中通过如振摇、通气和搅拌等方法来提供氧气。具体而言，可以使用已知在有氧培养条件下表达基因的任何启动子。例如，可以使用糖酵解(glycosis)、磷酸戊糖途径、TCA循环、氨基酸生物合成途径等中涉及的基因的启动子。此外，λ噬菌体的P_tac启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、P_R或P_L启动子全部已知为在有氧培养条件下有功能的强启动子，并且是优选使用的。

可以将非天然启动子的使用与基因拷贝的倍增(multiplication)组合。例如，将与非天然启动子可操作地连接的adhE基因插入能够在肠杆菌科细菌中发挥功能的载体，并将该载体引入细菌，这使得细胞中所述基因的拷贝数增加。优选地，使用低拷贝载体。低拷贝载体的实例包括，但不限于，pSC101、pMW118、pMW119等。术语“低拷贝载体”用于拷贝数为多至5个拷贝每细胞的载体。增加adhE基因的拷贝数也可以通过如下来实现：通过例如同源重组、Mu整合等将该基因的多个拷贝引入细菌的染色体DNA。同源重组使用以多个拷贝存在的序列作为染色体DNA上的靶来进行。在染色体DNA上具有多个拷贝的序列包括，但不限于，重复DNA，或存在于转座元件末端的反向重复序列。同样，如美国专利No.5,595,889中公开的，可以将adhE基因并入转座子，再使其转移以将该基因的多个拷贝引入染色体DNA。在这些情况下，可以将adhE基因置于在有氧培养条件下有功能的启动子的调控之下。可选地，可以通过例如向该启动子中引入突变以增加位于该启动子下游的基因的转录水平来增强启动子的作用。另外，已知对于在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中的几个核苷酸的取代，特别是在起始密码子紧邻上游的序列中的几个核苷酸的取代，显著影响mRNA的可翻译性(translatability)。例如，依赖于起始密码子之前的三个核苷酸的性质，发现了20倍范围的表达水平(Gold等，Annu.Rev.Microbiol.，35,365-403，1981；Hui等，EMBO J.，3,623-629，1984)。之前，显示了rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的-1位置的A对G的取代(A-for-G substitution)(AB STRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and MolecularBiology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society forBiochemistry and Molecular Biology(第17届国际生物化学与分子生物学大会暨美国生物化学与分子生物学学会1997年年会摘要)，San Francisco，California August24-29，1997，abstract No.457)。因此，可以想到rhtA23突变增强rhtA基因表达，并因此增加对苏氨酸、高丝氨酸和转运到细胞外的一些其它物质的抗性。

另外，还可以将核苷酸取代引入细菌染色体上adhE基因的启动子区，其产生更强的启动子功能。可以进行表达调控序列的改变，例如，使用温度敏感质粒按照与基因取代相同的方式进行，如国际专利公开WO 00/18935和日本专利申请公开号1-215280。

在本发明中，“产生L-氨基酸的细菌”的意思是当在培养基中培养所述细菌时，具有产生L-氨基酸并将L-氨基酸分泌到培养基中的能力的细菌。可以通过培育来赋予或增强产生L-氨基酸的能力。本文使用的术语“产生L-氨基酸的细菌”也表示能够产生L-氨基酸并且引起L-氨基酸以大于该细菌(例如，大肠杆菌，如大肠杆菌K-12)的野生型或亲本菌株的量在培养基中积累的细菌，并且优选地表示能够在培养基中引起不少于0.5g/L，更优选不少于1.0g/L的量的目标L-氨基酸积累的细菌。术语“L-氨基酸”包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸是特别优选的。

肠杆菌科包括属于以下属的细菌：埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、发光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、摩根氏菌属、耶尔森氏菌属等。具体而言，可以使用根据NCBI(National Center for Biotechnology Information；国家生物技术信息中心)数据库使用的分类学(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)归类于肠杆菌科的那些。属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌是优选的。短语“属于埃希氏菌属的细菌”的意思是根据微生物领域的技术人员已知的分类法归类于埃希氏菌属的细菌。如在本发明中使用的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括，但不限于大肠杆菌(E.coli)。

对于能够用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌无具体限制，然而，例如，Neidhardt，F.C.等.(Escherichia coli and Salmonella typhimurium，AmericanSociety for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)描述的细菌包括在本发明内。

属于泛菌属的细菌的意思是根据微生物领域的技术人员已知的分类法归类于泛菌属的细菌。最近已经将成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)的一些种基于16S rRNA的核苷酸序列分析等重新归类于成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、Pantoea ananatis(菠萝泛菌)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等(Int.J.Syst.Bacteriol.，43,162-173(1993))。

本发明的细菌包括这样的肠杆菌科的菌株，该菌株具有产生L-氨基酸的能力，并且已经经过修饰从而使编码醇脱氢酶的基因在启动子的调控下表达，所述启动子在有氧培养条件下有功能。此外，本发明的细菌包括这样的肠杆菌科的菌株，该菌株具有产生L-氨基酸的能力，并且没有天然的醇脱氢酶活性，但是已经用编码醇脱氢酶的DNA片段转化。

在本发明中，由于编码醇脱氢酶的基因在处于有氧培养条件下时有功能的启动子的控制下表达，所以在含有乙醇作为碳源的培养基中积累的L-氨基酸的量能够显著增加，所述L-氨基酸例如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸。

产生L-氨基酸的细菌

作为被修饰而具有本发明的突变醇脱氢酶的本发明的细菌，可以使用能够产生芳族或非芳族L-氨基酸的细菌。

可以通过将编码本发明的突变醇脱氢酶的基因引入天然具有产生L-氨基酸的能力的细菌来获得本发明的细菌。或者，可以通过将产生L-氨基酸的能力赋予已经具有突变醇脱氢酶的细菌来获得本发明的细菌。

产生L-苏氨酸的细菌

能够用于得到本发明产生L-苏氨酸的细菌的亲本菌株实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利No.5,175,107，美国专利No.5,705,371)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC98081)(美国专利No.5,631,157)、大肠杆菌NRRL-21593(美国专利No.5,939,307)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利No.5,474,918)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利No.5,376,538)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner等，Genetika(俄语)，14,947-956(1978))、大肠杆菌VL643和VL2055(EP114991lA)等。

菌株TDH-6是thrC基因缺陷的，也是蔗糖同化性的(sucrose-assimilative)，并且此菌株中的ilvA基因具有渗漏突变(leaky mutation)。这种菌株还在rhtA基因中具有突变，该突变赋予对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗性。菌株B-3996含有质粒pVIC40，其通过将包括突变thrA基因的thrA^*BC操纵子插入由RSF1010衍生的载体而获得。这种突变thrA基因编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I，其具有基本上脱敏的苏氨酸反馈抑制。菌株B-3996于1987年11月19日以登录号RIA1867保藏在All-Union Scientific Center ofAntibiotics(全联盟抗生素科学中心)(Russia，117105Moscow，NagatinskayaStreet3-A)。该菌株还于1987年4月7日以登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms)(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1Dorozhny proezd，.1)。

大肠杆菌VKPM B-5318(EP 0593792B)也可以用作亲本菌株来得到本发明的产生L-苏氨酸的细菌。菌株B-5318相对于异亮氨酸是原养型的，温度敏感λ噬菌体C1阻抑物和PR启动子替代了该菌株含有的质粒pVIC40中的苏氨酸操纵子的调节区。菌株VKPM B-5318在1990年5月3日以登录号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)。

优选地，额外地修饰本发明的细菌以增强以下基因中一个或多个的表达：

-突变thrA基因，其编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I；

-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；

-thrC基因，其编码苏氨酸合酶；

-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白；

-asd基因，其编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；和

-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)；

编码大肠杆菌的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因已经阐明(GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990的核苷酸位置337-2799)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrL和thrB基因之间。编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因已经阐明(GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990的核苷酸位置2801-3733)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA和thrC基因之间。编码大肠杆菌苏氨酸合酶的thrC基因已经阐明(GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990的核苷酸位置3734-5020)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrB基因和yaaX开读框之间。所有三个基因起单一的苏氨酸操纵子的作用。为了增强苏氨酸操纵子的表达，理想的是将影响转录的弱化子区域从该操纵子中去除(WO2005/049808、WO2003/097839)。

编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，连同thrB和thrC基因，能够作为一个操纵子从已知质粒pVIC40获得，该质粒存在于产生苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPM B-3996中。质粒pVIC40在美国专利No.5,705,371中详细描述。

rhtA基因位于大肠杆菌染色体上的18分钟处，接近glnHPQ操纵子，glnHPQ操纵子编码谷氨酰胺转运系统的组分。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，核苷酸位置764-1651，GenBank登录号AAA218541，gi：440181)相同，并且位于pexB和ompX基因之间。已经将表达由ORF1编码的蛋白的DNA序列定名为rhtA基因(rht：对高丝氨酸和苏氨酸的抗性)。同样，已知rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子而言的位置-1处A对G的取代(ABSTRACTS ofthe 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology inconjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry andMolecular Biology(第17届国际生物化学与分子生物学大会暨美国生物化学与分子生物学学会1997年年会摘要)，San Francisco，California August 24-29，1997，abstract No.457，EP1013765A)。在下文中，将rhtA23突变标记为rhtA^*。

大肠杆菌的asd基因已经阐明(核苷酸位置3572511-3571408，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16131307)，并且能够利用基于该基因的核苷酸序列制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参见White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))获得。其它微生物的asd基因能够以相似的方式获得。

同样，大肠杆菌的aspC基因已经阐明(核苷酸位置983742-984932，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16128895)，并且能够通过PCR获得。其它微生物的aspC基因能够以相似的方式获得。

产生L-赖氨酸的细菌

属于埃希氏菌属的产生L-赖氨酸的细菌的实例包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是当培养基中存在L-赖氨酸时，这种抑制全部或部分地脱敏。L-赖氨酸类似物的实例包括，但不限于，氧代赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯代己内酰胺(α-chlorocaprolactam)等。对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体能够通过对属于埃希氏菌属的细菌进行常规人工诱变处理来获得。可用于产生L-赖氨酸的细菌菌株的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；参见美国专利No.4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，天冬氨酸激酶的L-赖氨酸反馈抑制是脱敏的。

可以使用菌株WC196作为产生L-赖氨酸的大肠杆菌细菌。这种细菌菌株是通过将AEC抗性赋予源自大肠杆菌K-12的菌株W3110来培育的。将所得菌株命名为大肠杆菌AJ13069，并且在1994年12月6日保藏在工业技术研究院国立生命科学与人体技术研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)(现在称作独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International Patent OrganismDepositary)，Tsukuba Central6，1-1，Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，并且获得了登录号FERM P-14690。之后根据布达佩斯条约规定在1995年9月29日将其转为国际保藏，并且获得了登录号FERMBP-5252(美国专利No.5,827,698)。

能够用于得到本发明产生L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括这样的菌株，在这些菌株中将编码L-赖氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强。这些基因的实例包括，但不限于，编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因(dapA)、编码天冬氨酸激酶的基因(lysC)、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因(dapB)、编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因(lysA)、编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因(ddh)(美国专利No.6,040,160)、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(ppc)、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因(asd)和编码天冬氨酸酶的基因(aspA)(EP1253195A)。另外，亲本菌株可以具有表达水平增加的涉及能效(energyefficiency)的基因(cyo)(EP 1170376 A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利No.5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390)或它们的组合。

用于得到本发明的产生L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括这样的菌株，其具有活性降低或消除的酶，该酶催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支(branch off)而产生L-赖氨酸之外化合物的反应。催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸之外化合物的反应的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利No.5,827,698)和苹果酸酶(malicenzyme)(WO2005/010175)。

产生L-赖氨酸的菌株的实例包括大肠杆菌WC196ΔcadAΔldc/pCABD2(WO2006/078039)，这种菌株通过向菌株WC196中引入质粒pCABD2(其在美国专利No.6,040,160中公开)获得，菌株WC196具有破坏的编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因。质粒pCABD2含有：具有突变的编码二氢吡啶二羧酸合酶的大肠杆菌dapA基因，所述突变使L-赖氨酸反馈抑制脱敏；具有突变的编码天冬氨酸激酶III的大肠杆菌lysC基因，所述突变使L-赖氨酸的反馈抑制脱敏；编码二氢吡啶二羧酸还原酶的大肠杆菌dapB基因；和编码二氨基庚二酸脱氢酶的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ddh基因。

产生L-半胱氨酸的细菌

能够用于得到本发明产生L-半胱氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利No.6,218,168，俄罗斯专利申请2003121601)；使编码蛋白质的基因过表达的大肠杆菌W3110，所述蛋白质适于分泌对细胞有毒的物质(美国专利No.5,972,663)；半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)；由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物(positive transcriptionregulator)活性增加的大肠杆菌W3110菌株(WO0127307A1)，等等。

产生L-亮氨酸的细菌

能够用于得到本发明产生L-亮氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPM B-7386，美国专利No.6,124,121))或对亮氨酸类似物(包括β-2-噻吩丙氨酸(β-2-thienylalanine)、3-羟基亮氨酸、4-氮杂亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸)有抗性的大肠杆菌菌株(JP 62-34397B和JP 8-70879A)；通过遗传工程方法获得的大肠杆菌菌株如WO96/06926中描述的那些；大肠杆菌H-9068(JP 8-70879A)，等等。

可以通过增强L-亮氨酸生物合成中涉及的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。实例包括leuABCD操纵子中的基因，这些基因优选的代表是突变leuA基因，该基因编码不受L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶(美国专利6,403,342)。此外，可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP 1239041 A2)。

产生L-组氨酸的细菌

能够用于得到本发明产生L-组氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌24菌株(VKPM B-5945，RU2003677)；大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，RU2119536)；大肠杆菌NRRLB-12116-B12121(美国专利No.4,388,405)；大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利No.6,344,347)；大肠杆菌H-9341(FERM BP-6674)(EP1085087)；大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利No.6,258,554)等等。

能够用于得到本发明产生L-组氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括如下菌株，所述菌株中编码L-组氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强。这些基因的实例包括编码下述酶的基因：ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶(hisI)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖基亚氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶(phosphoribosyl formimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase)(hisA)、酰胺转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)、组氨醇脱氢酶(hisD)等。

已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶被L-组氨酸所抑制，因此还可以通过将突变引入任何这些基因中以将对反馈抑制的抗性赋予由这些基因编码的酶，从而有效地增强产生L-组氨酸的能力(俄罗斯专利Nos.2003677和2119536)。

具有产生L-组氨酸能力的菌株具体实例包括：大肠杆菌FERM P-5038和5048，其已经用携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体转化(JP56-005099A)；用rht(即氨基酸输出蛋白的基因)转化的大肠杆菌菌株(EP1016710A)；赋予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素-抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利No.2119536)，等等。

产生L-谷氨酸的细菌

能够用于得到本发明产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌VL334thrC⁺(EP 1172433)。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中具有突变(美国专利No.4,278,765)。利用生长于野生型大肠杆菌菌株K12(VKPM B-7)细胞上的噬菌体P1，用常规转导来转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了能够产生L-谷氨酸的L-异亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC⁺(VKPM B-8961)。

能够用于得到本发明产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的菌株，或其中编码L-谷氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强的菌株。这些基因的实例包括编码谷氨酸脱氢酶的基因(gdh)、编码谷氨酰胺合成酶的基因(glnA)、编码谷氨酸合成酶的基因(gltAB)、编码异柠檬酸脱氢酶的基因(icdA)、编码乌头酸水合酶的基因(acnA、acnB)、编码柠檬酸合酶(citrate synthase)的基因(gltA)、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(ppc)、编码丙酮酸脱氢酶的基因(aceEF、lpdA)、编码丙酮酸激酶的基因(pykA、pykF)、编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的基因(ppsA)、编码烯醇化酶的基因(eno)、编码磷酸甘油酸变位酶的基因(pgmA、pgmI)、编码磷酸甘油酸激酶的基因(pgk)、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因(gapA)、编码丙糖磷酸异构酶的基因(tpiA)、编码果糖二磷酸醛缩酶的基因(fbp)、编码磷酸果糖激酶的基因(pfkA，pfkB)、编码葡糖磷酸异构酶的基因(pgi)等。

经修饰以使柠檬酸合成酶(citrate synthetase)基因和/或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的表达降低的，和/或α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的菌株的实例包括在EP1078989A、EP955368A和EP952221A中公开的那些菌株。

用于得到本发明产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括将下述酶的活性减少或去除的菌株，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径分支的除L-谷氨酸外的化合物的合成。这些酶的实例包括异柠檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、磷酸转乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羟酸合酶(acetohydorxy acid synthase)(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvI)、甲酸乙酰转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh)、和谷氨酸脱羧酶(gadAB)。在美国专利Nos.5,378,616和5,573,945中描述了α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失或降低的属于埃希氏菌属的细菌及获得它们的方法。具体地，这些菌株包括下面的：

大肠杆菌W3110sucA::Km^R

大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)

大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)

大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)

通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(在下文称为“sucA基因”)来获得大肠杆菌W3110sucA::Km^R。该菌株完全缺失α-酮戊二酸脱氢酶活性。

产生L-谷氨酸的细菌的其它实例包括属于埃希氏菌属并且对天冬氨酸抗代谢物具有抗性的细菌。这些菌株也可能是α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的，包括例如大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利No.5.908,768)，额外具有低L-谷氨酸分解能力的FERM P-12379菌株(美国专利No.5,393,671)；AJ13138(FERM BP-5565)(美国专利No.6,110,714)，等等。

产生L-谷氨酸的细菌的实例包括α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失或α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的属于泛菌属(genus Pantoea)的突变菌株，并且可以如上所述获得。这些菌株包括Pantoea ananatis AJ13356(美国专利No.6,331,419)。Pantoea ananatis AJ13356于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在称作独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，Central6，1-1，Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，登录号为FERM P-16645。其后按照布达佩斯条约的规定，在1999年1月11日将其转为国际保藏，并得到登录号FERM BP-6615。作为破坏αKGDH-E1亚基基因(sucA)的结果，Pantoea ananatis AJ13356的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失。当将上述菌株分离时将其鉴定为成团肠杆菌，并且作为成团肠杆菌AJ13356保藏。但是，近来基于对16S rRNA的核苷酸测序等，将其重新归类为Pantoea ananatis。尽管AJ13356作为成团肠杆菌保藏在前述保藏单位，就本说明书而言，将它们描述为Pantoea ananatis。

产生L-苯丙氨酸的细菌

能够用于得到本发明产生L-苯丙氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)；具有突变pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC55371)(美国专利No.5,354,672)；大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)；大肠杆菌NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利No.4,407,952)。同样地，可使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和命名为AJ12604(FERM BP-3579)的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]作为亲本菌株(EP488424B1)。此外，还可使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白活性增强的产生L-苯丙氨酸的属于埃希氏菌属的细菌(美国专利申请2003/0148473 A1和2003/0157667 A1)。

产生L-色氨酸的细菌

能够用于得到本发明产生L-色氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其由突变trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶缺陷(美国专利No.5,756,345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制性的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美国专利6,180,373)；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利No.4,371,614)；产生磷酸烯醇丙酮酸的能力增强的大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美国专利No.6,319,696)等等。还可以使用由yedA或yddG基因编码的蛋白活性增强的产生L-色氨酸的属于埃希氏菌属的细菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。

能够用于得到本发明产生L-色氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括其中以下酶中一种或多种的活性增强的菌株：邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)和色氨酸合酶(trpAB)。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者均受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入使反馈抑制脱敏的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164和通过将质粒pGH5引入大肠杆菌SV164获得的转化菌株(WO94/08031)，所述质粒pGH5包含编码反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因。

能够用于得到本发明产生L-色氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括已经用色氨酸操纵子转化的菌株，所述色氨酸操纵子包含编码脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因(JP57-71397A、JP62-244382A、美国专利No.4,371,614)。此外，可以通过增强色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予产生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由α和β亚基组成，其分别由trpA和trpB基因编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达来改进产生L-色氨酸的能力(WO2005/103275)。

产生L-脯氨酸的细菌

能够用于得到本发明产生L-脯氨酸的细菌的亲本菌株实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如ilvA基因缺陷并且能够产生L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)(EP 1172433)。可以通过增强L-脯氨酸生物合成中涉及的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的实例包括编码对L-脯氨酸反馈抑制脱敏的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利3127361)。此外，可以通过增强一个或多个编码负责从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的例子是b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP 1239041 A2)。

具有产生L-脯氨酸活性的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括下列大肠杆菌菌株：NRRL B-12403和NRRL B-12404(英国专利2075056)，VKPMB-8012(俄罗斯专利申请2000124295)，德国专利3127361中描述的质粒突变体，Bloom F.R.等描述的质粒突变体(The 15^th Miami winter symposium(第15界迈阿密冬季研讨会)，1983，第34页)等等。

产生L-精氨酸的细菌

能够用于得到本发明产生L-精氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请2002/058315 A1)及其带有突变的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase)的衍生菌株(俄罗斯专利申请No.2001112869)，大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)(EP1170358A1)，用编码N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因转化的产生精氨酸的菌株(EP1170361A1)，等等。

能够用于得到本发明产生L-精氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括编码L-精氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强的菌株。这些基因的实例包括编码N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶的基因(argC)、编码鸟氨酸乙酰转移酶的基因(argJ)、编码N-乙酰谷氨酸激酶的基因(argB)、编码乙酰鸟氨酸转氨酶的基因(argD)、编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的基因(argF)、编码精氨琥珀酸合成酶的基因(argG)、编码精氨琥珀酸裂合酶的基因(argH)、编码氨甲酰基磷酸合成酶的基因(carAB)等。

产生L-缬氨酸的细菌

能够用于得到本发明的产生L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，经修饰以过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利No.5,998,178)。理想的是将负责衰减的ilvGMEDA操纵子的区域移除以使产生的L-缬氨酸不会削弱该操纵子的表达。此外，理想的是将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。

能够用于得到本发明的产生L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括氨酰t-RNA合成酶的突变体(美国专利No.5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已将大肠杆菌VL1970在1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1 Dorozhny Proezd，1)，登录号为VKPM B-4411。

此外，还可以使用生长需要硫辛酸(lipoic acid)的突变体和/或缺乏H⁺-ATP酶的突变体作为亲本菌株(WO96/06926)。

产生L-异亮氨酸的细菌

能够用于得到本发明产生L-异亮氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变体(JP5-304969A)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸具有抗性的突变体，以及额外对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变体(JP5-130882A)。此外，还可以使用以编码L-异亮氨酸生物合成中涉及的蛋白(如苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase))的基因转化的重组菌株(JP2-458A，FR0356739和美国专利No.5,998,178)作为亲本菌株。

用于产生本发明的L-氨基酸的方法包括以下步骤：在培养基中培养本发明的细菌，使L-氨基酸能够在培养基中积累，和从培养基中收集L-氨基酸。此外，本发明的方法包括用于产生L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸的方法，包括以下步骤：在培养基中培养本发明的细菌，使L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸能够在培养基中积累，和从培养基中收集L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸。

在本发明中，从培养基培养、收集和纯化L-氨基酸等可通过常规发酵方法进行，其中使用细菌来产生L-氨基酸。

培养基可以是合成的或天然的，只要该培养基包括碳源、氮源、矿质，如有必要，还包括细菌生长所需的适量营养物。碳源可以包括多种糖，例如葡萄糖和蔗糖，多种有机酸和醇，如乙醇。根据本发明，可以使用乙醇作为唯一碳源或者与糖(如葡萄糖和蔗糖)混合。作为氮源，可以使用多种铵盐如氨水和硫酸铵，其它含氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨、大豆-水解物和消化的发酵微生物。作为矿质，可以使用磷酸氢二钾(potassiummonophosphate)、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等等。作为维生素，可以使用硫胺素、酵母提取物等等。如有必要，可以向培养基添加额外的营养物。例如，如果细菌生长需要L-氨基酸(L-氨基酸营养缺陷型(L-amino acid auxotrophy))，可以向培养基添加足够量的L-氨基酸。

培养优选在有氧条件下进行，如摇动培养和带有通气的搅拌培养，温度为20-40℃，优选30-38℃。培养物的pH通常为5-9，优选6.5-7.2。可以用氨水、碳酸钙、多种酸、多种碱和缓冲剂调节培养物的pH。通常1-5天的培养导致目标氨基酸在液体培养基中的积累。

培养之后，可以通过离心或膜过滤将固体如细胞从液体培养基去除，然后可以收集目标L-氨基酸并通过离子交换、浓缩和/或结晶方法纯化。

附图简述

图1显示大肠杆菌染色体中adhE基因上游区的结构，以及含有cat基因和P_L-tac启动子的整合DNA片段的结构。

图2显示来自以下菌种的醇脱氢酶的原始序列的比对：大肠杆菌(ADHE_ECOLI，SEQ ID NO：2)、弗氏志贺氏菌(Q83RN2_SHIFL，SEQ ID NO：53)、Pantoea ananatis(ADHE PANAN，SEQ ID NO：30)、鼠疫耶尔森氏菌(Q66AM7_YERPS，SEQ ID NO：54)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Q6D4R4_ERWCT，SEQ ID NO：55)、鼠伤寒沙门氏菌(P74880_SALTY，SEQ ID NO：56)、植物乳杆菌(Q88RY9_LACPL，SEQ ID NO：57)和乳酸乳球菌(O86282_9LACT，SEQID NO：58)。所述比对使用PIR多重比对程序来进行(http://pir.georgetown.edu)。用星号(*)标记相同的氨基酸，用冒号(：)标记相似的氨基酸。

图3显示在含有乙醇(2％或3％)作为唯一碳源的M9基本培养基上生长的修饰菌株的生长曲线。

图4显示在含有葡萄糖(0.1重量％)和乙醇(0.1体积％)的混合物的M9基本培养基上生长的修饰菌株的生长曲线。

图5显示具有在天然启动子或P_L-tac启动子调控下的突变adhE^*基因的菌株在含有乙醇(2％或3％)作为唯一碳源的M9基本培养基上生长的生长曲线的比较。

实施例

将参考以下非限定性实施例对本发明进行更具体的阐释。

实施例1.制备大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*

通过如下构建产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株MG1655 Δtdh，rhtA^*(pVIC40)：使用cat基因将大肠杆菌MG1655(ATCC 700926)中编码苏氨酸脱氢酶的天然tdh基因失活，其后引入rhtA23突变(rhtA^*)，该突变赋予对高浓度的苏氨酸(>40mg/ml)和高丝氨酸(>5mg/ml)的抗性。然后用来自大肠杆菌VKPM B-3996的质粒pVIC40转化所得菌株。质粒pVIC40在美国专利No.5,705,371中详细描述。

为了替代天然的tdh基因，用Datsenko K.A.和Wanner B.L(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)所述的也称为“Red介导的整合(Red-mediated integration)”和/或“Red-驱动的整合(Red-driven integration)”的方法，将携带由cat基因编码的氯霉素抗性标记(Cm^R)的DNA片段整合到大肠杆菌MG1655的染色体中以替代天然基因。使用具有热敏感的复制子的重组质粒pKD46(Datsenko，K.A.，Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)作为负责Red-介导的重组体系的由噬菌体λ得到的基因的供体。含有重组质粒pKD46的大肠杆菌BW25113可以从E.coli Genetic StockCenter，Yale University，New Haven，USA获得，其登录号为CGSC7630。

使用商业上可获得的质粒pACYC184(GenBank/EMBL登录号X06403，“Fermentas”，Lithuania)作为模板，以及引物P1(SEQ ID NO：3)和P2(SEQ IDNO：4)通过PCR获得了含有由cat基因编码的Cm^R标记的DNA片段。引物P1含有引入到该引物中的与tdh基因5’-区同源的35个核苷酸用于进一步整合到细菌染色体中。引物P2含有引入到该引物中的与tdh基因3’-区同源的32个核苷酸用于进一步整合到细菌染色体中。

使用“Gene Amp PCR System 2700”扩增设备(Applied Biosystems)来提供PCR。反应混合物(总体积50μl)组成为5μl含25mM MgCl₂的10x PCR缓冲液(“Fermentas”，Lithuania)、每种dNTP200μM、每种所用的引物25pmol和1U Taq聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)。向所述反应混合物加入约5ng质粒DNA作为PCR扩增用的模板DNA。温度曲线设定如下：在95℃初始DNA变性5分钟，其后是25个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸40秒，和在72℃最终延伸5分钟。然后将扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化，使用“GenElute Spin Columns(GenElute自旋柱)”(Sigma，USA)提取，并用乙醇沉淀。

将获得的DNA片段用于电穿孔和Red介导整合入大肠杆菌MG1655/pKD46的细菌染色体中。

将MG1655/pKD46细胞在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的液体LB培养基中在30℃培养过夜，然后用含有氨苄青霉素(100μg/ml)和L-阿拉伯糖(10mM)(使用阿拉伯糖来诱导含有Red系统的基因的质粒)的SOB培养基(酵母提取物5g/l；NaCl 0.5g/l；胰蛋白胨20g/l；KCl 2.5mM；MgCl₂10mM)以1:100稀释，并且在30℃培养至细菌培养物的光密度达到OD₆₀₀＝0.4-0.7。将来自10ml该细菌培养物的经培养细胞用冰冷的去离子水洗涤3次，其后在100μl水中悬浮。向该细胞悬液添加10μl溶解在去离子水中的DNA片段(100ng)。用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA)(No.165-2098，2-89型)根据制造商的说明书进行电穿孔。将经过电击的细胞(shocked cell)添加至1ml SOC培养基(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”(《分子克隆实验手册第二版》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，在37℃温育2小时，然后涂布到含有25μg/ml氯霉素的L-琼脂上。使用引物P3(SEQ ID NO：5)和P4(SEQ ID NO：6)通过PCR检测生长了24小时的菌落中取代天然tdh基因Cm^R标记的存在。为此，将新鲜分离的菌落悬浮在20μl水中，其后使用1μl所得悬液进行PCR。温度曲线设定如下：在95℃初始DNA变性5分钟；其后是30个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸40秒；以及在72℃最终延伸5分钟。少数经检测的Cm^R菌落含有期望的1104bp DNA片段，其确认了取代tdh基因的1242bp片段的Cm^R标记DNA的存在。获得的菌株之一通过在37℃培养消除了热敏质粒pKD46，并且将所得的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δtdh。

然后，将来自菌株VL614rhtA23(Livshits V.A.等，2003，Res.Microbiol.，154：123-135)的rhtA23突变引入获得的菌株MG1655 Δtdh，产生菌株MG1655Δtdh，rhtA^*。rhtA23是一种赋予对高浓度的苏氨酸(>40mg/ml)和高丝氨酸(>5mg/ml)的抗性的突变。为此用生长在供体菌株VL614rhtA23上的噬菌体P1_vir感染菌株MG1655 Δtdh。在含有8mg/ml高丝氨酸和0.4％作为唯一碳源的葡萄糖的M9基本培养基上选择转导体。

实施例2.构建大肠杆菌MG1655::P_L-tacadhE

通过用P_L-tac启动子替代菌株MG1655中adhE基因的天然启动子区获得了大肠杆菌MG1655::P_L-tacadh。

为了替代adhE基因的天然启动子区，通过Datsenko K.A.和Wanner B.L(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)描述的也称为“Red-介导的整合”和/或“Red-驱动的整合”的方法，将携带P_L-tac启动子和由cat基因编码的氯霉素抗性标记(Cm^R)的DNA片段整合到了大肠杆菌MG1655的染色体中来取代天然启动子区。

使用大肠杆菌MG1655P_L-tacxylE(WO2006/043730)的染色体DNA作为模板通过PCR获得了含有P_L-tac启动子和cat基因的片段。P_L-tac启动子的核苷酸序列在序列表中提供(SEQ ID NO：7)。使用引物P5(SEQ ID NO：8)和P6(SEQID NO：9)用于PCR扩增。引物P5含有引入到该引物中的与位于adhE基因起始密码子上游318bp的区域互补的40个核苷酸，用于进一步整合到细菌染色体中；引物P6含有与adhE基因的5’-序列相同的39个核苷酸。

使用“Gene Amp PCR System2700”扩增设备(Applied Biosystems)来提供PCR。反应混合物(总体积50μl)组成为5μl含15mM MgCl₂的10x PCR缓冲液(“Fermentas”，Lithuania)、每种dNTP200μM、每种所用的引物25pmol和1U Taq聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)。向所述反应混合物加入约20ng大肠杆菌MG1655P_L-tacxylE基因组DNA作为PCR的模板。

温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟，其后是35个循环的95℃变性30秒、54℃退火30秒、72℃延伸1.5分钟，和在72℃最终延伸5分钟。然后将扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化，使用“GenElute SpinColumns”(Sigma，USA)提取，并用乙醇沉淀。将获得的DNA片段用于电穿孔和Red介导的整合入大肠杆菌MG1655/pKD46的细菌染色体中。

将MG1655/pKD46细胞在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的液体LB培养基中在30℃培养过夜，然后用含有氨苄青霉素(100μg/ml)和L-阿拉伯糖(10mM)(使用阿拉伯糖来诱导编码Red系统的基因的质粒)的SOB培养基(酵母提取物5g/l；NaCl 0.5g/l；胰蛋白胨20g/l；KCl 2.5mM；MgCl₂10mM)以1:100稀释，并且在30℃培养以达到细菌培养物的光密度OD₆₀₀＝0.4-0.7。将来自10ml该细菌培养物的经培养细胞用冰冷的去离子水洗涤3次，其后在100μl水中悬浮。向该细胞悬液添加10μl溶解在去离子水中的DNA片段(100ng)。用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA)(No.165-2098，2-89型)根据制造商的说明书进行了电穿孔。

将经过电击的细胞添加至1ml SOC培养基(Sambrook等，“MolecularCloning A Laboratory Manual，Second Edition”(《分子克隆实验手册第二版》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，在37℃温育2小时，然后涂布到含有25μg/ml氯霉素的L-琼脂上。

将约100个所得克隆在含有2％乙醇作为唯一碳源的M9平板上进行选择。选取了在36小时中在含有2％乙醇的M9平板上生长的一些克隆，并使用引物P7(SEQ ID NO：10)和P8(SEQ ID NO：11)通过PCR检测这些克隆中取代adhE基因天然启动子区的Cm^R标记的存在。为此，将新鲜分离的菌落悬浮在20μl水中，然后将1μl所得悬液用于PCR。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性10分钟；其后是30个循环的95℃变性30秒、54℃退火30秒和72℃延伸1.5分钟；在72℃最终延伸1分钟。少数经检测的Cm^R菌落含有期望的～1800bp DNA片段，这证实了取代adhE基因的520bp天然启动子区的Cm^R标记DNA的存在。获得的菌株之一通过在37℃的培养消除了热敏质粒pKD46，并将所得的菌株命名为大肠杆菌MG1655::P_L-tacadhE(参见图1)。

实施例3.构建大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE

通过将来自菌株MG1655::P_L-tacadhE的P_L-tac启动子转导至菌株MG1655Δtdh，rhtA^*中获得了大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE。

用生长在供体菌株MG1655::P_L-tacadhE上的噬菌体P1_vir感染菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，获得了菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE。检查这种菌株在含有2％乙醇作为唯一碳源的M9平板上的生长。生长速率与菌株MG1655::P_L-tacadhE的生长速率相同。

实施例4.增加adhE基因表达对L-苏氨酸产生的影响

为了评估增强adhE基因的表达对L-苏氨酸产生的影响，用质粒pVIC40转化了两种大肠杆菌菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE和MG1655Δtdh，rhtA^*。

将菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE(pVIC40)和亲本菌株MG1655Δtdh，rhtA^*(pVIC40)各自在营养培养液(nutrient broth)中在37℃培养18小时，将获得的每种培养物的0.3ml接种到20 x 200mm试管中具有以下组成的3ml发酵培养基中，并且用旋转摇床在34℃培养48小时。表1和2显示来自至少10次独立实验的数据。

发酵培养基组成(g/l)：

乙醇 24或16

葡萄糖 0(表1)或3(表2)

(NH₄)₂SO₄ 16

K₂HPO₄ 0.7

MgSO₄·7H₂O 1.0

MnSO₄·5H₂O 0.01

FeSO₄·7H₂O 0.01

盐酸硫胺素 0.002

酵母提取物 1.0

L-异亮氨酸 0.01

CaCO₃ 33

MgSO₄·7H₂O和CaCO₃各自分开灭菌。

从表1和2中能够看出，MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE与MG1655Δtdh，rhtA^*相比能够积累更高量的L-苏氨酸。而且，MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE能够在含有乙醇作为唯一碳源的培养基上生长，并且引起L-苏氨酸的积累，而MG1655Δtdh，rhtA^*在含有乙醇作为唯一碳源的培养基中显示非常差的生长和生产力。

实施例5.构建大肠杆菌MG1655ΔadhE

通过用kan基因使大肠杆菌MG1655中的天然adhE基因失活构建了此菌株。

为了失活(或破坏)天然adhE基因，通过Datsenko K.A.和Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)描述的也称为“Red-介导的整合”和/或“Red-驱动的整合”的方法，将携带由kan基因编码的卡那霉素抗性标记(Km^R)的DNA片段整合至大肠杆菌MG1655(ATCC 700926)的染色体中来取代天然基因。

使用商业上可获得的质粒pACYC177(GenBank/EMBL登录号X06402，“Fermentas”，Lithuania)作为模板，和引物P9(SEQ ID NO：12)和P10(SEQ IDNO：13)通过PCR获得了含有Km^R标记(kan基因)的DNA片段。引物P9含有引入到该引物中的与位于adhE基因起始密码子上游318bp的区域同源的40个核苷酸，用于进一步整合到细菌染色体中。引物P10含有引入到该引物中的与adhE基因3’-区同源的41个核苷酸，用于进一步整合到细菌染色体中。

使用“Gene Amp PCR System 2700”扩增设备(Applied Biosystems)来提供PCR。反应混合物(总体积50μl)组成为5μl含25mM MgCl₂的10 x PCR缓冲液(“Fermentas”，Lithuania)、每种dNTP200μM、每种所用的引物25pmol和1U Taq聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)。向所述反应混合物加入约5ng质粒DNA作为PCR扩增的模板DNA。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟，其后是25个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸40秒，和在72℃最终延伸5分钟。然后将扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化，使用“GenElute Spin Columns(GenElute自旋柱)”(Sigma，USA)提取，并用乙醇沉淀。

将获得的DNA片段用于电穿孔和Red介导的整合入大肠杆菌MG1655/pKD46的细菌染色体中。

将MG1655/pKD46细胞在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的液体LB培养基中在30℃培养过夜，然后用含有氨苄青霉素(100μg/ml)和L-阿拉伯糖(10mM)(使用阿拉伯糖来诱导编码Red系统的基因的质粒)的SOB培养基(酵母提取物5g/l；NaCl 0.5g/l；胰蛋白胨20g/l；KCl 2.5mM；MgCl₂ 10mM)以1:100稀释，并且在30℃培养以达到细菌培养物的光密度OD₆₀₀＝0.4-0.7。将来自10ml该细菌培养物的经培养细胞用冰冷的去离子水洗涤3次，其后在100μl水中悬浮。向该细胞悬液添加10μl溶解在去离子水中的DNA片段(100ng)。用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA)(No.165-2098，2-89型)根据制造商的说明书进行了电穿孔。将经过电击的细胞添加至1ml SOC培养基(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”(《分子克隆实验手册第二版》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，在37℃温育2小时，然后涂布到含有20μg/ml卡那霉素的L-琼脂上。使用引物P11(SEQ IDNO：14)和P12(SEQ ID NO：15)通过PCR检测了24小时内生长的菌落中取代天然adhE基因的Km^R标记的存在。为此，将新鲜分离的菌落悬浮在20μl水中，然后将1μl所得悬液用于PCR。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟；其后是30个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸30秒；在72℃最终延伸5分钟。少数经检测的Km^R菌落含有期望的约1030bp DNA片段，这证实了取代3135bp的adhE基因片段的Km^R标记DNA的存在。获得的菌株之一通过在37℃的培养消除了热敏质粒pKD46，并将所得的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔadhE。

实施例6.构建大肠杆菌MG1655::P_L-tacadhE^*

通过向adhE基因中引入Glu568Lys(E568K)突变获得了大肠杆菌MG1655::P_L-tacadhE^*。首先，使用大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板，以及引物P13(SEQ ID NO：16)和P12(SEQ ID NO：15)通过PCR获得了携带E568K突变的adhE基因的1.05kbp片段。引物P15与adhE基因的1662-1701bp和1703-1730bp区同源，并且包括以粗体显示的取代g/a(位置1702bp)，引物P12与adhE基因的3’-末端同源。使用“Gene Amp PCR System 2700”扩增设备(Applied Biosystems)来提供PCR。反应混合物(总体积50μl)组成为5μl含MgCl₂的10x PCR缓冲液(“TaKaRa”，Japan)、每种dNTP250μM、每种所用的引物25pmol和2.5U Pyrobest DNA聚合酶(“TaKaRa”，Japan)。向所述反应混合物加入约20ng大肠杆菌MG1655基因组DNA作为PCR的模板。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟，其后是35个循环的95℃变性30秒、54℃退火30秒、72℃延伸1分钟，和在72℃最终延伸5分钟。通过琼脂糖凝胶电泳纯化获得的片段，使用“GenElute Spin Columns(GenElute自旋柱)”(“Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。

在第二步中，使用大肠杆菌MG1655::P_L-tacadhE的基因组DNA作为模板(参见实施例2)，使用引物P11(SEQ ID NO：14)，并使用携带突变序列的1.05kbp片段(见上文)作为第二引物通过PCR获得了包含P_L-tac启动子具有突变adhE基因并由提供氯霉素抗性的cat基因标记的片段。引物P11与位于adhE基因起始密码子上游402-425bp的区域同源。使用“Gene Amp PCR System2700”扩增设备(Applied Biosystems)来提供PCR。反应混合物(总体积50μl)组成为5μl10x PCR缓冲液(“TaKaRa”，Japan)、25mM MgCl₂、每种dNTP250μM、10ng引物P11、1μg作为第二引物的1.05kbp片段和2.5U TaKaRa LADNA聚合酶(“TaKaRa”，Japan)。向所述反应混合物加入约20ng的大肠杆菌MG1655::P_L-tacadhE基因组DNA作为PCR的模板。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟，其后是35个循环的95℃变性30秒、54℃退火30秒、72℃延伸3.5分钟，和在72℃最终延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得片段，使用“GenElute Spin Columns(GenElute自旋柱)”(“Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。

为了替代adhE基因的天然区，通过Datsenko K.A.和Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)描述的也称为“Red-介导的整合”和/或“Red-驱动的整合”的方法，将携带P_L-tac启动子及突变adhE和由cat基因编码的氯霉素抗性标记(Cm^R)的DNA片段(cat-P_L-tacadhE^*，4.7kbp)整合到了大肠杆菌MG1655ΔadhE的染色体中。将MG1655ΔadhE/pKD46细胞在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的液体LB培养基中在30℃培养过夜，然后用含有氨苄青霉素(100μg/ml)和L-阿拉伯糖(10mM)(使用阿拉伯糖来诱导编码Red系统的基因的质粒)的SOB培养基(酵母提取物5g/l；NaCl 0.5g/l；胰蛋白胨20g/l；KCl 2.5mM；MgCl₂10mM)以1:100稀释，并且在30℃培养以达到细菌培养物的光密度OD₆₀₀＝0.4-0.7。将来自10ml该细菌培养物的经培养细胞用冰冷的去离子水洗涤3次，其后在100μl水中悬浮。向该细胞悬液添加10μl溶解在去离子水中的DNA片段(300ng)。用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA)(No.165-2098，2-89型)根据制造商的说明书进行了电穿孔。

将获得的克隆在含有2％乙醇作为唯一碳源的M9平板上进行了选择。

选择失控克隆(runaway clone)并验证了完整基因序列。揭示了如下的突变列(row)：Glu568Lys(gag-aag)，Ile554Ser(atc-agc)，Glu22Gly(gaa-gga)，Met236Val(atg-gtg)，Tyr461Cys(tac-tgc)，Ala786Val(gca-gta)。将此克隆命名为MG1655::P_L-tacadhE^*。

实施例7.构建大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*

通过转导来自菌株MG1655::P_L-tacadhE^*的P_L-tacadhE^*突变获得了大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*。

用生长在供体菌株MG1655::P_L-tacadhE^*上的噬菌体P1_vir转染菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，获得了菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*。检查了此菌株在含有2％乙醇作为唯一碳源的M9平板上的生长。生长速率与菌株MG1655::P_L-tacadhE^*的生长速率相同。

实施例8.构建大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568

进行了为获得具有Glu568Lys突变的单突变adhE的第二个尝试。为此，构建了大肠杆菌菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-wtΔ34。

通过用kan基因取代大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-wt(wt表示野生型)中adhE基因的34bp片段(1668-1702bp的区域，包括编码Glu568的三联体)获得了大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-wtΔ34。通过DatsenkoK.A.和Wanner B.L(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)描述的也称为“Red-介导的整合”和/或“Red-驱动的整合”的方法将kan基因整合至大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-wt的染色体中。

使用商业上可获得的质粒pACYC177(GenBank/EMBL登录号X06402，“Fermentas”，Lithuania)作为模板，以及引物P14(SEQ ID NO：17)和P15(SEQID NO：18)通过PCR获得了含有由kan基因编码的Km^R标记的DNA片段。引物P14含有与adhE基因的1627-1668bp区域相同的41个核苷酸，而引物P15含有引入到该引物中的与adhE基因的1702-1740bp区域互补的39个核苷酸，用于进一步整合到细菌染色体中。

使用“Gene Amp PCR System 2700”扩增设备(Applied Biosystems)来提供PCR。反应混合物(总体积50μl)组成为5μl含25mM MgCl₂的10x PCR缓冲液(“Fermentas”，Lithuania)、每种dNTP200μM、每种所用的引物25pmol和1UTaq聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)。向所述反应混合物加入约5ng质粒DNA作为PCR扩增的模板DNA。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟，其后是25个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸50秒，和在72℃最终延伸5分钟。然后通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA片段，使用“GenElute Spin Columns(GenElute自旋柱)”(Sigma，USA)提取，并用乙醇沉淀。

使用引物P16(SEQ ID NO：19)和P17(SEQ ID NO：20)通过PCR检测了所得菌落中Km^R标记的存在。为此，将新鲜分离的菌落悬浮在20μl水中，然后将1μl所得悬液用于PCR。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟；其后是30个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸45秒；在72℃最终延伸5分钟。少数经检测的Km^R菌落含有期望的1200bpDNA片段，这证实了取代天然adhE基因的230bp片段的Km^R标记DNA的存在。获得的菌株之一通过在37℃的培养消除了热敏质粒pKD46，并且将所得的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-wtΔ34。

然后，为了用编码Glu568Lys突变的adhE基因的片段替代由kan基因编码的卡那霉素抗性标记(Km^R)，通过“Red-介导的整合”和/或“Red-驱动的整合”的方法(Yu D.，Sawitzke J.等.，Recombineering with overlappingsingle-stranded DNA oligonulceotides：Testing of recombination intermediate，PNAS，2003，100(12)，7207-7212)，将携带适当突变的寡核苷酸P18(SEQ IDNO：21)和P19(SEQ ID NO：22)整合到了大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA，P_L-tacadhE-wtΔ34的染色体中。引物P18含有与adhE基因的1627-1702bp区域相同的75个核苷酸，而引物P19含有与adhE基因的1668-1740bp区域互补的75个核苷酸，这两种引物均包括编码Lys568代替Glu568的三联体。

将克隆在含有2％乙醇和25mg/ml琥珀酸盐作为碳源的M9基本培养基上进行选择。

使用引物P16(SEQ ID NO：19)和P17(SEQ ID NO：20)通过PCR检测克隆中Km^R标记的缺失。为此，将新鲜分离的菌落悬浮在20μl水中，然后将1μl所得悬液用于PCR。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟；其后是30个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸25秒；在72℃最终延伸5分钟。少数经检测的Km^S菌落含有期望的adhE基因的230bp DNA片段，这证实了取代1200bp片段的Km^R标记DNA的缺失。几个获得的菌株通过在37℃的培养消除了热敏质粒pKD46，并且将所得的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA，P_L-tacadhE-Lys568。

通过测序证实了Glu568Lys突变的存在，例如，克隆18具有单突变Glu568Lys。另外还发现某些克隆(#1，13)含有额外的突变：克隆1-Glu568Lys，Phe566Val；克隆13-Glu568Lys，Glu560Lys。

研究了菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568(克隆18)、MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568，Val566(克隆1)、MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568，Lys560(克隆13)和MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*的生长曲线(图3和4)。

将菌株培养在具有乙醇作为唯一碳源的M9培养基中，以及含葡萄糖和乙醇(摩尔比1:3)的M9培养基中。

实施例9.构建大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*

通过重建菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*中的天然adhE启动子获得了大肠杆菌菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*。将菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*的染色体中携带P_L-tac启动子和由cat基因编码的氯霉素抗性标记(Cm^R)的DNA片段替代为携带天然adhE启动子和由kan基因编码的卡那霉素抗性标记(Km^R)的片段。使用菌株MG1655的DNA作为模板，以及引物P20(SEQ ID NO：23)和P21(SEQ ID NO：24)通过PCR获得天然P_adhE。引物P20在其5’-端含有EcoRI识别位点，该位点是进一步连接于kan基因所必需的；引物P21含有与adhE基因的5’-区(50bp-20bp)同源的30个核苷酸。

使用商业上可获得的质粒pACYC177(GenBank/EMBL登录号X06402，“Fermentas”，Lithuania)作为模板，以及引物P22(SEQ ID NO：25)和P23(SEQID NO：26)通过PCR获得了含有由kan基因编码的Km^R标记的DNA片段。引物P22含有引入到该引物中的与位于adhE基因起始密码子上游425bp的区域同源的41个核苷酸，用于进一步整合到细菌染色体中；而引物P23在其3’-端含有EcoRI识别位点，该位点是进一步连接于P_adhE启动子所必需的。

使用“Gene Amp PCR System 2700”扩增设备(Applied Biosystems)来提供PCR。反应混合物(总体积50μl)组成为5μl含25mM MgCl₂的10x PCR缓冲液(“Fermentas”，Lithuania)、各200μtM的dNTP、各25pmol所用的引物和1U Taq聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)。向所述反应混合物加入约20ng基因组DNA或5ng质粒DNA作为PCR扩增的模板。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟；其后是35个循环(对于P_adhE)或25个循环(对于kan基因)的95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸20秒(对于Ptac启动子)或50秒(对于kan基因)；和在72℃最终延伸5分钟。然后通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA片段，使用“GenElute Spin Columns(GenElute自旋柱)”(“Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。

用EcoRI限制酶分别处理上述两种DNA片段并连接。使用引物P21和P22通过PCR扩增了连接产物。通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的kan-P_adhEDNA片段，使用“GenElute Spin Columns(GenElute自旋柱)”(“Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。将所得DNA片段用于电穿孔和Red-介导的整合入大肠杆菌MG1655Δtdh::rhtA^*，P_L-tacadhE^*/pKD46的细菌染色体中。

将MG1655Δtdh::rhtA^*，P_L-tacadhE^*/pKD46细胞在添加了氨苄青霉素(100μg/ml)的液体LB培养基中在30℃培养过夜，然后用添加了氨苄青霉素(100μg/ml)和L-阿拉伯糖(10mM)(使用阿拉伯糖来诱导编码Red系统的基因的质粒)的SOB培养基(酵母提取物5g/l；NaCl 0.5g/l；胰蛋白胨20g/l；KCl 2.5mM；MgCl₂ 10mM)以1:100稀释，并且在30℃培养以达到细菌培养物的光密度OD₆₀₀＝0.4-0.7。将来自10ml该细菌培养物的经培养细胞用冰冷的去离子水洗涤3次，其后在100μl水中悬浮。向该细胞悬液添加10μl溶解在去离子水中的DNA片段(100ng)。用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA)(No.165-2098，2-89型)根据制造商的说明书进行了电穿孔。

将经过电击的细胞添加至1ml SOC培养基(Sambrook等，“MolecularCloning A Laboratory Manual，Second Edition”(《分子克隆实验手册第二版》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，在37℃温育2小时，然后涂布到含有20μg/ml卡那霉素的L-琼脂上。

使用引物P24(SEQ ID NO：27)和P25(SEQ ID NO：28)通过PCR检测在24小时内生长的菌落中取代P_L-tac-Cm^R-标记的P_adhE-Km^R标记的存在。为此，将新鲜分离的菌落悬浮在20μl水中，然后将1μl所得悬液用于PCR。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟；其后是30个循环的95℃变性30秒、54℃退火30秒和72℃延伸1.0分钟；以及在72℃最终延伸5分钟。少数经检测的Km^R菌落含有期望的1200bp DNA片段，这证实了天然P_adhE启动子和Km^R-标记DNA的存在。对这些片段中的一些进行了测序。证实了天然P_adhE启动子的结构。含有在天然启动子调控下的突变adhE基因的菌株之一通过在37℃培养消除了热敏质粒pKD46，并将所得菌株命名为大肠杆菌MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*。

对所有获得的菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568(克隆18)；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568，Val566(克隆1)；MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*和亲本菌株MG1655Δtdh，rhtA^*在含有乙醇作为唯一碳源的基本培养基M9上的生长的能力进行了研究。显示亲本菌株MG1655Δtdh，rhtA^*和野生型醇脱氢酶表达增强的菌株不能在含有乙醇(2％或3％)作为唯一碳源的培养基上生长(图3，A和B)。先前描述的在醇脱氢酶中含有单突变的菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568(克隆18)(Membrillo-Hernandez，J.等，J.Biol.Chem.275，33869-33875(2000))在相同的培养基中显示非常差的生长。但是在醇脱氢酶中含有除突变Glu568Lys之外的突变的菌株显示出良好的生长(图3，A和B)。全部上述菌株均能在含有葡萄糖和乙醇的混合物的基本培养基M9上生长，但是含有除突变Glu568Lys之外的突变的突变醇脱氢酶表达增强的菌株显示出更好的生长(图4)。

还显示了包含在天然启动子调控下的具有5个突变的醇脱氢酶的菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*不能在含有乙醇(2％或3％)作为唯一碳源的基本培养基M9上生长。编码所述醇脱氢酶的基因表达的增强对于良好的生长是必需的(图5)。

实施例10.增加突变adhE基因表达对L-苏氨酸产生的影响

为了评估增强突变adhE基因的表达对苏氨酸产生的影响，将大肠杆菌菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568(克隆18)；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568，Val566(克隆1)；MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*和亲本菌株MG1655Δtdh，rhtA^*用质粒pVIC40转化。

将这些菌株和亲本菌株MG1655Δtdh，rhtA^*(pVIC40)在营养培养液中在37℃培养18个小时，将获得的每种培养物的0.3ml接种到20x200mm试管中的3ml发酵培养基(参见实施例4)中，并且用旋转摇床在34℃培养48小时。来自至少10次独立实验的数据在表1和2中显示。

从表1和2中能够看出，与MG1655Δtdh，rhtA^*(其中野生型醇脱氢酶和突变醇脱氢酶的表达均未增加)相比，或者甚至与MG1655Δtdh，rhtA^*或P_L-tacadhE(其中野生型醇脱氢酶的表达增加)相比，突变醇脱氢酶能够引起更高量的L-苏氨酸的积累。在含有葡萄糖和乙醇的混合物或者仅含乙醇作为唯一碳源的培养基中均观察到了这种在发酵过程中更高的L-苏氨酸积累。

表1

表2

试管发酵在不恢复(reversion)蒸发的乙醇的条件下进行。

实施例11.增加adhE基因表达对L-赖氨酸产生的影响

为了测试在P_L-tac启动子调控下adhE基因增强的表达对赖氨酸产生的影响，将来自上述菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568(克隆18)；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568，Val566(克隆1)；MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*的染色体的DNA片段通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbor Lab.Press，Plainview，NY)转移至产生赖氨酸的大肠杆菌菌株WC196ΔcadAΔldc(pCABD2)。pCABD2是包含以下基因的质粒：编码具有突变的二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因，所述突变使L-赖氨酸的反馈抑制脱敏；编码具有突变的天冬氨酸激酶III的lysC基因，所述突变使L-赖氨酸的反馈抑制脱敏；编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；和编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因(美国专利No.6,040,160)。

将所得菌株和亲本菌株WC196ΔcadAΔldc(pCABD2)在37℃涂布到含20mg/l链霉素的L-培养基平板上，再将对应于1/8平板的细胞接种至500ml摇瓶中含有所需药品的20ml发酵培养基中。培养可使用往复式摇床，以115rpm的搅动速度在37℃进行48小时。培养之后，培养基中L-赖氨酸和残余乙醇的量可以通过已知方法测量(Bio-Sensor BF-5，由Oji Scientific Instruments制造)。然后，可以对每种菌株计算L-赖氨酸相对于消耗的乙醇的得率(yield)。

发酵培养基的组成(g/l)如下：

乙醇 20.0

(NH₄)₂SO₄ 24.0

K₂HPO₄ 1.0

MgSO₄·7H₂O 1.0

FeSO₄·7H₂O 0.01

MnSO₄·5H₂O 0.01

酵母提取物 2.0

用KOH将pH调节至7.0，将培养基在115℃高压灭菌10分钟。将乙醇和MgSO₄·7H₂O分开灭菌。将CaCO₃在180℃干热灭菌2小时，再以终浓度30g/l添加至培养基。来自两次平行实验的数据示于表3。

表3

从表3能够看出，与野生型醇脱氢酶和突变醇脱氢酶的表达均未增加的WC196ΔcadAΔldc(pCABD2)相比，突变醇脱氢酶和野生型醇脱氢酶能够引起生长增强和更高量的L-赖氨酸积累。

实施例12.构建大肠杆菌MG1655ΔargR，P_L-tacadhE^*

1.构建菌株MG1655ΔargR

通过用kan基因失活天然argR基因构建了此菌株，所述argR基因编码大肠杆菌MG1655中L-精氨酸生物合成途径的阻抑物。为了替代天然argR基因，通过Red-驱动的整合将携带由kan基因编码的卡那霉素抗性标记(Km^R)的DNA片段整合至大肠杆菌MG1655(ATCC 700926)的染色体中来取代天然argR基因。

使用商业上可获得的质粒pACYC177(GenBank/EMBL登录号X06402，“Fermentas”，Lithuania)作为模板，以及引物P26(SEQ ID NO：31)和P27(SEQID NO：32)通过PCR获得了含有由kan基因编码的Km^R标记的DNA片段。引物P26含有引入到该引物中的与argR基因的5’-区同源的40个核苷酸，用于进一步整合到细菌染色体中。引物P27含有引入到该引物中的与argR基因的3’-区同源的41个核苷酸，用于进一步整合到细菌染色体中。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟，其后是25个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸40秒，和在72℃最终延伸5分钟。然后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA片段，使用“GenElute Spin Columns(GenElute自旋柱)”(“Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。

将MG1655/pKD46细胞在添加了氨苄青霉素(100μg/ml)的液体LB培养基中在30℃培养过夜，然后用添加了氨苄青霉素(100μg/ml)和L-阿拉伯糖(10mM)(使用阿拉伯糖来诱导编码Red系统的基因的质粒)的SOB培养基(酵母提取物5g/l；NaCl 0.5g/l；胰蛋白胨20g/l；KCl 2.5mM；MgCl₂ 10mM)以1:100稀释，并且在30℃培养以达到细菌培养物的光密度OD₆₀₀＝0.4-0.7。将来自10ml该细菌培养物的经培养细胞用冰冷的去离子水洗涤3次，其后在100μl水中悬浮。向该细胞悬液添加10μl溶解在去离子水中的DNA片段(100ng)。用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA)(No.165-2098，2-89型)根据制造商的说明书进行了电穿孔。将经过电击的细胞添加至1ml SOC培养基，在37℃温育2小时，然后涂布到含有25μg/ml氯霉素的L-琼脂上。使用引物P28(SEQ ID NO：33)和P29(SEQ ID NO：34)通过PCR检测24小时内生长的菌落中取代天然argR基因的Km^R标记的存在。为此，将新鲜分离的菌落悬浮在20μl水中，然后将1μl所得悬液用于PCR。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟；其后是30个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸30秒；以及在72℃最终延伸5分钟。少数经检测的Km^R菌落含有期望的1110bp DNA片段，这证实了取代660bp的argR基因片段的Km^R标记DNA的存在。获得的菌株之一通过在37℃培养消除了热敏质粒pKD46，并且将所得的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔargR。

2.构建大肠杆菌MG1655ΔargR，P_L-tacadhE^*

通过转导来自菌株MG1655::P_L-tacadhE^*的P_L-tacadhE^*突变获得了大肠杆菌MG1655ΔargR，P_L-tacadhE^*。

用生长在供体菌株MG1655::P_L-tacadhE^*上的噬菌体P1_vir感染菌株MG1655ΔargR，获得了菌株MG1655ΔargR，P_L-tacadhE^*。在含有2％乙醇作为唯一碳源的M9平板上检查此菌株的生长。生长速率与菌株MG1655::P_L-tacadhE^*的生长速率相同(36h)。

实施例13.构建pMW119-ArgA4质粒

将具有提供fbr(反馈抗性)表型的单突变并且在其自身启动子调控下的ArgA基因(JP2002253268，EP1170361)克隆至pMW119载体中。

使用质粒pKKArgA-r4(JP2002253268，EP1170361)作为模板，以及引物P30(SEQ ID NO：35)和P31(SEQ ID NO：36)通过PCR获得了argA基因。引物P30的序列与位于argA基因起始密码子上游20bp和下游19bp的argA基因5’-区同源。引物P31含有与argA基因的3’-区同源的24个核苷酸和引入的HindIII限制位点，用于进一步克隆至pMW119/BamHI-HindIII载体中。

使用大肠杆菌MG1655作为模板，以及引物P32(SEQ ID NO：37)和P33(SEQ ID NO：38)通过PCR获得了P_argA启动子的序列。引物P32含有与位于启动子上游245bp的argA基因5’-非翻译区同源的30个核苷酸，并且此序列包括BamHI识别位点。引物P33含有与位于起始密码子上游20bp的argA基因5’-区和起始密码子本身同源的24个核苷酸。温度曲线如下：在95℃初始DNA变性5分钟，其后是25个循环的95℃变性30秒、54℃退火30秒、72℃延伸1分20秒(对于ArgA基因)或20秒(对于P_argA启动子)，和在72℃最终延伸5分钟。然后通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA片段，使用“GenElute SpinColumns(GenElute自旋柱)”(“Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。

使用上述两种DNA片段：P_argA启动子和ArgA基因通过PCR获得了P_argA ArgA片段。首先，反应混合物(总体积100μl)组成为10μl含25mM MgCl₂的10x PCR缓冲液(Sigma，USA)、各200μM的dNTP和1U Accu-Taq DNA聚合酶(Sigma，USA)。同时使用argA片段(25ng)和P_argA(5ng)作为模板DNA和引物。接下来，向反应混合物添加引物P31和P32。温度曲线如下：第一步-在95℃初始DNA变性5分钟，其后是10个循环的95℃变性30秒、53℃退火30秒、72℃延伸1分钟；第二步-15个循环的95℃变性、54℃退火30秒、72℃延伸1分30秒。通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA片段，使用“GenElute Spin Columns(GenElute自旋柱)”(“Sigma”，USA)提取，用乙醇沉淀，用BamHI和HindIII处理并与pMW119/BamHI-HindIII载体连接。结果获得了质粒pMW119-ArgA4。

实施例14.增加adhE基因表达对L-精氨酸产生的影响

为了评估突变adhE基因增强的表达对L-精氨酸产生的影响，将大肠杆菌菌株MG1655ΔargR P_L-tacadhE^*和MG1655ΔargR各自用质粒pMW119-ArgA4转化。将每种转化体的10个所得菌落在补充了150mg/l Ap的营养培养液中在37℃培养18小时，并且将每种所得培养物的0.1ml接种至20 x 200mm试管中的2ml发酵培养基中，并用旋转摇床在32℃培养96小时。培养之后，使用以下流动相通过纸层析确定培养基中积累的L-精氨酸的量：丁醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)。使用茚三酮的丙酮溶液(2％)作为显示试剂(visualizingreagent)。切下含有L-精氨酸的点，在CdCl₂的0.5％水溶液中洗脱L-精氨酸，并且以分光光度法在540nm估计L-精氨酸的量。独立试管发酵的结果示于表4。如下表4所示，在补充了葡萄糖或不含葡萄糖的培养基中，与MG1655ΔargRP_L-tacadhE^*相比，MG1655ΔargR P_L-tacadhE^*均产生了更高量的L-精氨酸。

发酵培养基的组成如下(g/l)：

乙醇 20

葡萄糖 0/5

(NH₄)₂SO₄ 25

K₂HPO₄ 2

MgSO₄·7H₂O 1.0

盐酸硫胺素 0.002

酵母提取物 5.0

CaCO₃ 33

将MgSO₄·7H₂O、乙醇和CaCO₃各自分开灭菌。

表4

实施例15.构建产生L-亮氨酸的大肠杆菌菌株NS1391

如下获得了菌株NS1391。

首先，构建了乙酰乳酸合酶基因失活的菌株(ΔilvIH和ΔilvGM缺失的组合)。通过P1转导(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))使ilvIH基因(ΔilvIH::cat)从野生型菌株大肠杆菌K12(VKPM B-7)中缺失。使用大肠杆菌MG1655ΔilvIH::cat作为供体菌株。用Red-驱动整合方法进行了菌株MG1655中ilvIH操纵子的缺失。根据这种方法，构建了与ilvIH操纵子相邻的两个区域同源的PCR引物P34(SEQ ID NO：39)和P35(SEQ ID NO：40)和在模板质粒中赋予氯霉素抗性的基因。使用质粒pMW-attL-Cm-attR(PCT申请WO05/010175)作为PCR反应中的模板。PCR所用条件如下：变性步骤在95℃进行3分钟；前两个循环的曲线：95℃ 1分钟、34℃ 30秒、72℃ 40秒；后30个循环的曲线：95℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒；最终步骤在72℃进行5分钟。在琼脂糖凝胶中纯化获得的1713bp PCR产物，并用于大肠杆菌MG1655/pKD46的电穿孔。在电穿孔之后选择氯霉素抗性的重组体，并使用位点特异性引物P36(SEQ ID NO：41)和P37(SEQ ID NO：42)通过PCR来验证。PCR验证的条件如下：变性步骤在94℃进行3分钟；30个循环的曲线：94℃ 30秒、53℃ 30秒、72℃ 1分20秒；最终步骤：72℃ 7分钟。在使用来自亲本IlvIH⁺菌株MG1655的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物的长度为2491nt。在使用来自突变MG1655ΔilvIH::cat菌株的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物的长度为1823nt。结果获得了菌株MG1655ΔilvIH::cat。在通过P1转导从大肠杆菌K12(VKPM B-7)缺失了ilvIH基因(ΔilvIH::cat)之后，选择Cm^R的转导体。结果获得了菌株B-7ΔilvIH::cat。为了从B-7ΔilvIH::cat消除氯霉素抗性标记，用质粒pMW118-int-xis(Ap^R)(WO2005/010175)转化细胞。将Ap^R克隆在含有150mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上在30℃培养。挑取了几十个ApR克隆并且测试其氯霉素敏感性。通过在LB琼脂平板上在42℃的温育将质粒pMW118-int-xis从Cms细胞中去除。结果获得了菌株B-7ΔilvIH。

通过P1转导使ilvGM基因(ΔilvGM::cat)从大肠杆菌B-7ΔilvIH中缺失。使用大肠杆菌MG1655ΔilvGM::cat作为供体菌株。通过Red-驱动整合使ilvGM操纵子从菌株MG1655中缺失。根据这种方法，构建了与ilvGM操纵子两个相邻区域同源的PCR引物P38(SEQ ID NO：43)和P39(SEQ ID NO：44)和在模板质粒中赋予氯霉素抗性的基因。在PCR反应中使用质粒pMW-attL-Cm-attR(PCT申请WO05/010175)作为模板。PCR的条件如下：变性步骤在95℃进行3分钟；前两个循环的曲线：95℃ 1分钟、34℃ 30秒、72℃ 40秒；后30个循环的曲线：95℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒；最终步骤在72℃进行5分钟。

在琼脂糖凝胶中纯化获得的1713bp PCR产物，并用于大肠杆菌MG1655/pKD46的电穿孔。在电穿孔之后选择氯霉素抗性重组体，并使用位点特异性引物P40(SEQ ID NO：45)和P41(SEQ ID NO：46)通过PCR验证。PCR验证的条件如下：变性步骤在94℃进行3分钟；30个循环的曲线：94℃30秒、54℃30秒、72℃1分30秒；最终步骤：72℃7分钟。在使用来自亲本菌株MG1655的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物的长度为2209nt。在使用来自突变MG1655 ΔilvGM::cat菌株的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物的长度为1941nt。结果获得了菌株MG1655ΔilvGM::cat。在通过P1转导从大肠杆菌B-7 ΔilvIH缺失了ilvGM基因(ΔilvGM::cat)之后，选择Cm^R的转导体。结果获得了菌株B-7 ΔilvIH ΔilvBNΔilvGM::cat。如上所述将氯霉素抗性标记从B-7 ΔilvIH ΔilvBN ΔilvGM::cat中消除。结果获得了菌株B-7 ΔilvIH ΔilvGM。

通过Red-驱动整合用噬菌体λP_L启动子替代ilvBN操纵子的天然调节子区。为此，使用具有单一AHAS I的菌株B7 ΔilvIH ΔilvGM作为原始菌株用于这样的修饰。根据Red-驱动整合的方法，构建了PCR引物P42(SEQ ID NO：47)和P43(SEQ ID NO：48)。寡核苷酸P42(SEQ ID NO：47)与ilvB基因上游的区域以及存在于BW25113 cat-P_L-yddG染色体DNA中赋予抗生素抗性的基因的相邻区域同源。寡核苷酸P43(SEQ ID NO：48)与ilvB区和BW25113cat-P_L-yddG染色体中存在的P_L启动子下游的区域二者同源。先前已经详细描述了BW25113 cat-P_L-yddG的获得(EP1449918A1，俄罗斯专利RU2222596)。使用菌株BW25113 cat-P_L-yddG的染色体DNA作为PCR的模板。PCR的条件如下：变性在95℃进行3分钟；前两个循环的曲线：95℃ 1分钟、34℃ 30秒、72℃ 40秒；后30个循环的曲线：95℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒；最终步骤在72℃进行5分钟。结果获得了PCR产物(SEQ IDNO：49)，将其在琼脂糖凝胶中纯化，并用于含有温度敏感复制质粒pKD46的大肠杆菌B-7ΔilvIH ΔilvGM的电穿孔。如下制备电感受态细胞：将大肠杆菌菌株B-7ΔilvIH ΔilvGM在含有氨苄青霉素(100mg/l)的LB培养基中在30℃培养过夜，再用5ml含有氨苄青霉素和L-阿拉伯糖(1mM)的SOB培养基(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))将培养物稀释100倍。将细胞在通气条件下在30℃培养至OD₆₀₀≈0.6，然后通过浓缩100倍并用冰冷的去离子水洗涤3次来将其制成电感受态。使用70μl细胞和≈100ng PCR产物进行电穿孔。电穿孔之后，将细胞与1ml SOC培养基(Sambrook等，“MolecularCloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))一起在37℃温育2.5小时，温育之后铺板至L-琼脂上，在37℃培养以选择Cm^R重组体。然后，为了去除pKD46质粒，在含有Cm的L-琼脂上在42℃进行两次传代，并且测试获得的菌落对氨苄青霉素的敏感性。

获得的菌株B7ΔilvIHΔilvGM cat-P_L-ilvBN是缬氨酸敏感性的。从这种菌株获得了AHAS I的新的缬氨酸抗性自发突变体。表征了在1g/l缬氨酸条件下生长更好的菌株。

还获得了对异亮氨酸有抗性的缬氨酸抗性突变。获得了与野生型相比具有更大比活性的变体。测定了突变ilvBN4的突变操纵子的核苷酸序列。揭示了IlvBN4在IlvN：N17K Asn-Lys中含有一个点突变(用aag代替密码子aac)。将获得的菌株B7ΔilvIHΔilvGM cat-P_L-ilvBN4用于以下的构建。

然后，通过P1转导将cat-P_L-ilvBN4DNA片段从大肠杆菌B7ΔilvIHΔilvGM cat-P_L-ilvBN4转移至大肠杆菌MG1655mini-Mu::scrKYABR(EP申请1149911)。结果获得了菌株ESP214。如上所述从菌株ESP214中消除氯霉素抗性标记。结果获得了菌株ESP215。

然后为了随后整合入染色体中，将(SEQ ID NO：50)中所示DNA片段用于菌株ESP215/pKD46的电穿孔。这种DNA片段含有与基因b1701的3’区和基因b1703的5’区互补的区域(这些基因与基因pps相邻)，其为整合到所述染色体中所必需的。该片段还含有可切除的(excisable)氯霉素抗性标记cat，和在组成型启动子P_L调控下的突变ilvBN4操纵子。如上所述进行电穿孔。由于将cat-P_L-ilvBN4片段整合至染色体中，所以选择的Cm^R重组体含有基因pps的缺失。由此获得了菌株ESP216。如上所述将氯霉素抗性标记从菌株ESP216中消除。结果获得了菌株ESP217。

在下一步中，将在组成型启动子P_L调控下的突变leuA基因(Gly479->Cys)引入菌株ESP217。为了随后整合入染色体中，将(SEQ ID NO：51)中所示DNA片段用于菌株ESP217/pKD46的电穿孔。该DNA片段含有35nt区，其是整合入染色体中所必需的，并且与基因leuA的上游区同源。该DNA片段还含有与氯霉素抗性标记cat的序列互补的可切除的区，以及在组成型启动子P_L调控下的突变leuA(Gly479->Cys)基因。如上所述进行电穿孔。选择的Cm^R重组体含有整合入染色体中的组成型启动子P_L调控下的突变基因leuA(Gly479->Cys)。由此获得了菌株ESP220。如上所述从菌株ESP220消除了氯霉素抗性标记。结果获得了菌株ESP221。

然后，为了随后整合入染色体中，将SEQ ID NO：52中所示DNA片段用于菌株ESP221/pKD46的电穿孔。这种DNA片段含有与基因tyrB的上游区同源的35nt区，其是整合入染色体中所必需的。该DNA片段还含有与氯霉素抗性标记cat的序列互补的可切除的区域，以及具有修饰的调节(-35)区的基因tyrB。如上所述进行电穿孔。选择的Cm^R重组体包含具有修饰调节(-35)区的基因tyrB。由此获得了菌株NS1390。如上所述将氯霉素抗性标记从菌株NS1390中消除。结果获得了菌株NS1391。将产生亮氨酸的菌株NS1391用于进一步的工作。

实施例16.增加突变adhE基因表达对L-亮氨酸产生的影响

为了测试在P_L-tac启动子调控下adhE基因的增强表达对L-亮氨酸产生的影响，通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Harbor Lab.Press，Plainview，NY)将来自上述菌株MG1655 P_L-tacadhE^*染色体的DNA片段转移至产生L-亮氨酸的大肠杆菌菌株NS1391，以获得菌株NS1391P_L-tacadhE^*。

将两种大肠杆菌菌株NS1391和NS1391P_L-tacadhE^*在L-琼脂平板上在37℃培养18-24小时。为了获得种子培养物，在旋转摇床(250rpm)上将菌株在20x200-mm试管中在32℃培养18个小时，所述试管含有补充了4％蔗糖的2ml L-培养液。然后，用0.21ml种子材料(10％)接种发酵培养基。在20 x 200-mm试管中的2ml基本发酵培养基中进行发酵。将细胞在32℃以250rpm摇动的条件下培养48-72小时。通过纸层析(液相组成：丁醇-乙酸-水＝4:1:1)测定L-亮氨酸的量。十个独立试管发酵的结果示于表5。如下表5所示，在含有不同浓度乙醇的培养基中，与NS1391相比，NS1391 P_L-tacadhE^*产生了更高量的L-亮氨酸。

发酵培养基(pH7.2)的组成(g/l)如下：

葡萄糖 60.0

乙醇 0/10.0/20.0/30.0

(NH₄)₂SO₄ 25.0

K₂HPO₄ 2.0

MgSO₄·7H₂O 1.0

硫胺素 0.01

CaCO₃ 25.0

将葡萄糖、乙醇和CaCO₃分开灭菌。

表5

实施例17.增加adhE基因表达对L-苯丙氨酸产生的影响

为了测试在P_L-tac启动子调控下的adhE基因的增强表达对苯丙氨酸产生的影响，可以通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbor Lab.Press，Plainview，NY)将来自如上所述MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568(克隆18)；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568，Val566(克隆1)；MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*的染色体的DNA片段转移至产生苯丙氨酸的大肠杆菌菌株AJ12739。菌株AJ12739已经在2001年11月6日以登录号VKPM B-8197保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545Moscow，1Dorozhny proezd，.1)，其后在2002年8月23日转换为根据布达佩斯条约规定的保藏。

可以将每种所得菌株和亲本菌株AJ12739各自都在营养培养液中在37℃培养18个小时，并且可以将所得培养物的0.3ml各自接种至20x200mm试管中的3ml发酵培养基中，并且用旋转摇床在37℃培养48小时。培养之后，能够通过TLC测定培养基中积累的苯丙氨酸的量。可使用以0.11mm的不含荧光指示剂的Sorbfil硅胶层涂覆的10 x 15cm TLC平板(StockCompany Sorbpolymer，Krasnodar，Russia)。可以用流动相(2-丙醇(propan-2-ol)：乙酸乙酯:25％氨水:水＝40:40:7:16(v/v)将Sorbfil平板展开。可以使用茚三酮的丙酮溶液(2％)作为显示试剂。

发酵培养基的组成(g/l)：

乙醇 20.0

(NH₄)₂SO₄ 16.0

K₂HPO₄ 0.1

MgSO₄·7H₂O 1.0

FeSO₄·7H₂O 0.01

MnSO₄·5H₂O 0.01

盐酸硫胺素 0.0002

酵母提取物 2.0

酪氨酸 0.125

CaCO₃ 20.0

将乙醇和硫酸镁分开灭菌。CaCO₃在180℃干热灭菌2小时。将pH调节至7.0。

实施例18.增加adhE基因表达对L-色氨酸产生的影响

为了测试在P_L-tac启动子调控下的adhE基因的增强表达对色氨酸产生的影响，通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Harbor Lab.Press，Plainview，NY)将来自上述菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568(克隆18)；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568，Val566(克隆1)；MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*的染色体的DNA片段转移至产生色氨酸的大肠杆菌菌株SV164(pGH5)。菌株SV164具有编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶的trpE等位基因。质粒pGH5含有突变serA基因，该基因编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶。菌株SV164(pGH5)在美国专利No.6,180,373或欧洲专利0662143中详细描述。

可将所得菌株和亲本菌株SV164(pGH5)各自在3ml补充了20mg/l四环素(pGH5质粒的标记物)的营养培养液中在37℃摇动培养18小时。将每种获得的培养物的0.3ml接种至20 x 200mm试管中含有四环素(20mg/l)的3ml发酵培养基中，并且用旋转摇床以250rpm在37℃培养48小时。培养之后，可以通过如实施例17中所述的TLC来测定培养基中积累的色氨酸的量。发酵培养基组分列于表6，但是应当以如所示的各个单独的组A、B、C、D、E、F和H进行灭菌，以避免灭菌过程中不良的相互作用。

表6

溶液	组分	终浓度，g/l
溶液	组分	终浓度，g/l	ABCDEFGH	KH₂PO₄NaCl(NH₄)₂SO₄L-甲硫氨酸L-苯丙氨酸L-酪氨酸Mameno(豆浓)(总N)乙醇MgSO₄·7H₂OCaCl₂FeSO₄·7H₂O柠檬酸钠Na₂MoO₄·2H₂OH₃BO₃CoCl₂·6H₂OCuSO₄·5H₂OMnCl₂·4H₂OZnSO₄·7H₂O盐酸硫胺素CaCO₃吡哆醇	1.50.51.50.050.10.10.0720.00.30.0110.0751.00.000150.00250.000070.000250.00160.00030.00530.00.03

溶液A具有7.1的pH，通过NH₄OH调节。

实施例19.增加adhE基因表达对L-苏氨酸产生的影响

为了测试在P_L-tac启动子调控下的adhE基因的增强表达对产生组氨酸的影响，通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.Press，Plainview，NY)将来自如上所述菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568(克隆18)；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568，Val566(克隆1)；MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*的染色体的DNA片段转移至产生组氨酸的大肠杆菌菌株80。菌株80已经在俄罗斯专利2119536中描述，并且在1999年10月15日以登录号VKPM B-7270保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russia，117545Moscow，1Dorozhny proezd，1)，其后在2004年7月12日转为根据布达佩斯条约的保藏。

可以将所得菌株和亲本菌株80各自在L培养液中在29℃培养6小时。然后将每种获得的培养物的0.1ml接种至20 x 200mm试管中的2ml发酵培养基中，并且用旋转摇床(350rpm)在29℃培养65小时。培养之后，可以通过纸层析来测定培养基中积累的组氨酸的量。纸可以用以下流动相来展开：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1(v/v)。可以使用茚三酮的丙酮溶液(0.5％)作为显示试剂。

发酵培养基(pH6.0)的组成(g/l)：

乙醇 20.0

Mameno(豆浓)(大豆水解物) 0.2作为总氮(as total nitrogen)

L-脯氨酸 1.0

(NH4)₂SO₄ 25.0

KH₂PO₄ 2.0

MgSO₄·7H₂O 1.0

FeSO₄·7H₂O 0.01

MnSO₄ 0.01

硫胺素 0.001

甜菜碱 2.0

CaCO₃ 60.0

将乙醇、脯氨酸、甜菜碱和CaCO₃分开灭菌。在灭菌之前将pH调节至6.0。

实施例20.增加adhE基因表达对L-谷氨酸产生的影响

为了测试在P_L-tac启动子调控下的adhE基因的增强表达对谷氨酸产生的影响，通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Harbor Lab.Press，Plainview，NY)将来自上述菌株MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE^*；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568(克隆18)；MG1655Δtdh，rhtA^*，P_L-tacadhE-Lys568，Val566(克隆1)；MG1655Δtdh，rhtA^*，adhE^*的染色体的DNA片段转移至产生谷氨酸的大肠杆菌菌株VL334thrC⁺(EP1172433)。菌株VL334thrC⁺已经在2004年12月6日以登录号VKPM B-8961保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心，并且在2004年12月8日转为根据布达佩斯条约的保藏。

可将所得菌株和亲本菌株VL334thrC⁺各自在3ml营养培养液中在37℃摇动培养18小时。将每种获得的培养物的0.3ml接种至20 x 200mm试管中的3ml发酵培养基中，并且用旋转摇床以250rpm在37℃培养48小时。

发酵培养基(pH7.2)的组成(g/l)：

乙醇 20.0

硫酸铵 25.0

KH₂PO₄ 2.0

MgSO₄·7H₂O 1.0

硫胺素 0.0001

L-异亮氨酸 0.05

CaCO₃ 25.0

将乙醇和CaCO₃分开灭菌。

尽管已经参考本发明的优选实施方案详细地描述了本发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是可以在不背离本发明范围的前提下进行多种改变以及采用等同物。将每个上文提到的文件通过引用整体并入本文。

工业实用性

根据本发明，通过肠杆菌科的细菌产生L-氨基酸能够得到增强。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>使用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸的方法

<130>C666-C7177

<150>RU2006125964

<151>2006-07-09

<150>US60/885671

<151>2007-01-19

<160>58

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>2676

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2676)

<400>1

<210>2

<211>891

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>2

<210>3

<211>70

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P1

<400>3

<210>4

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P2

<400>4

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P3

<400>5

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P4

<400>6

<210>7

<211>183

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>杂合启动子

<400>7

<210>8

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P5

<400>8

<210>9

<211>58

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P6

<400>9

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P7

<400>10

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P8

<400>11

<210>12

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P9

<400>12

<210>13

<211>65

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P10

<400>13

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P11

<400>14

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P12

<400>15

<210>16

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P13

<400>16

<210>17

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P14

<400>17

<210>18

<211>67

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P15

<400>18

<210>19

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P16

<400>19

<210>20

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P17

<400>20

<210>21

<211>75

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P18

<400>21

<210>22

<211>73

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P19

<400>22

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P20

<400>23

<210>24

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P21

<400>24

<210>25

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P22

<400>25

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P23

<400>26

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P24

<400>27

<210>28

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P25

<400>28

<210>29

<211>2688

<212>DNA

<213>Pantoea ananatis(菠萝泛菌)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2688)

<400>29

<210>30

<211>895

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis(菠萝泛菌)

<400>30

<210>31

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P26

<400>31

<210>32

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P27

<400>32

<210>33

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P28

<400>33

<210>34

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P29

<400>34

<210>35

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P30

<400>35

<210>36

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P31

<400>36

<210>37

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P32

<400>37

<210>38

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P33

<400>38

<210>39

<211>61

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P34

<400>39

<210>40

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P35

<400>40

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P36

<400>41

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P37

<400>42

<210>43

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P38

<400>43

<210>44

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P39

<400>44

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P40

<400>45

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P41

<400>46

<210>47

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P42

<400>47

<210>48

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物P43

<400>48

<210>49

<211>1968

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>含有cat基因和PL启动子的DNA片段

<400>49

<210>50

<211>4971

<212>DNA

<213>DNA片段

<400>50

<210>51

<211>3786

<212>DNA

<213>DNA片段

<400>51

<210>52

<211>2942

<212>DNA

<213>DNA片段

<400>52

<210>53

<211>891

<212>PRT

<213>弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)

<400>53

<210>54

<211>891

<212>PRT

<213>鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)

<400>54

<210>55

<211>891

<212>PRT

<213>胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)

<400>55

<210>56

<211>878

<212>PRT

<213>鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)

<400>56

<210>57

<211>867

<212>PRT

<213>植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400>57

<210>58

<211>903

<212>PRT

<213>乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)

<400>58

Claims

1.一种用于产生L-氨基酸的方法，其包括：

B)从培养基中分离L-氨基酸，

其中编码所述醇脱氢酶的基因在非天然启动子的调控下表达，所述启动子在有氧培养条件下有功能。

2.根据权利要求1的方法，其中所述非天然启动子选自下组：P_tac、P_lac、P_trp、P_trc、P_R和P_L。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述醇脱氢酶对有氧失活有抗性。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶源于选自下组的细菌：大肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、Pantoea ananatis、植物乳杆菌和乳酸乳球菌。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQ IDNO：2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为不是天冬氨酸残基的另一种氨基酸残基。

6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQ IDNO：2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为赖氨酸残基。

7.根据权利要求5或6的方法，其中所述醇脱氢酶具有至少一个额外的突变，该突变能够改进所述细菌在含有乙醇作为唯一碳源的液体培养基中的生长。

8.根据权利要求7的方法，其中所述额外的突变选自下组：

A)用另一种氨基酸残基替代SEQ ID NO：2中位置560的谷氨酸残基；

B)用另一种氨基酸残基替代SEQ ID NO：2中位置566的苯丙氨酸残基；

D)以上各项的组合。

9.根据权利要求7的方法，其中所述额外的突变选自下组：

A)用赖氨酸残基替代SEQ ID NO：2中位置560的谷氨酸残基；

B)用缬氨酸残基替代SEQ ID NO：2中位置566的苯丙氨酸残基；

C)用甘氨酸残基、缬氨酸残基、半胱氨酸残基、丝氨酸残基和缬氨酸残基分别替代SEQ ID NO：2中分别在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和

D)以上各项的组合。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述产生L-氨基酸的细菌属于选自下组的属：埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和摩根氏菌属。

11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述L-氨基酸选自下组：L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。