CN1159211A - 用于hladr分型的探针系统和用该探针分型的方法 - Google Patents
用于hladr分型的探针系统和用该探针分型的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1159211A CN1159211A CN96190783A CN96190783A CN1159211A CN 1159211 A CN1159211 A CN 1159211A CN 96190783 A CN96190783 A CN 96190783A CN 96190783 A CN96190783 A CN 96190783A CN 1159211 A CN1159211 A CN 1159211A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- drb1
- complementary sequence
- sequence
- hla
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 176
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 67
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 46
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 16
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 4
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 165
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 165
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 43
- 101150082328 DRB5 gene Proteins 0.000 description 26
- 101100117569 Oryza sativa subsp. japonica DRB6 gene Proteins 0.000 description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 25
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 16
- 239000002585 base Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 101150034979 DRB3 gene Proteins 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 101100278514 Oryza sativa subsp. japonica DRB2 gene Proteins 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- -1 dimethoxytrityl protecting group Chemical group 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100284398 Bos taurus BoLA-DQB gene Proteins 0.000 description 3
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 3
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000854908 Homo sapiens WD repeat-containing protein 11 Proteins 0.000 description 3
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 101100117565 Oryza sativa subsp. japonica DRB4 gene Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100020705 WD repeat-containing protein 11 Human genes 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000610640 Homo sapiens U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 2
- 101001110823 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-A Proteins 0.000 description 2
- 101000712176 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-B Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100040374 U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- YVOYWIWAVSLUKN-DJLDLDEBSA-N 5-(dimethylamino)-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(N(C)C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 YVOYWIWAVSLUKN-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 1
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 5-methyl-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 1
- 241000937413 Axia Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101100313164 Caenorhabditis elegans sea-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100036243 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 1 chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010086786 HLA-DQA1 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010053491 HLA-DR beta-Chains Proteins 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 238000005766 Middleton reaction Methods 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NEIXQLKURTVWCD-UHFFFAOYSA-N P(O)(O)N.P(N)(O)(O)=O Chemical group P(O)(O)N.P(N)(O)(O)=O NEIXQLKURTVWCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229910001413 alkali metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 101150118925 bioM gene Proteins 0.000 description 1
- OMWQUXGVXQELIX-UHFFFAOYSA-N bitoscanate Chemical compound S=C=NC1=CC=C(N=C=S)C=C1 OMWQUXGVXQELIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 150000001642 boronic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical class 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N phosphoramidic acid Chemical group NP(O)(O)=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000000247 postprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003011 styrenyl group Chemical group [H]\C(*)=C(/[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
选自下组的核酸探针：TGGCAGCTTAAGTTT，CCTAAGAGGGAGTG，GCGAGTGTGGAACCT，AAGACAGGCGGGC或其互补序列。这些探针可用于尤其在器官转植前进行个体的HLADR分型。
Description
本发明涉及测定个体的II类HLA基因型的方法，尤其是对多态性HLA-DR基因的检测。该方法特别可用于移植中的HLA分型、医学诊断、法医等。
HLA(人淋巴细胞抗原)系统是由人体主要组织相容性复合物编码的，它通过区分自我和非自我在个体间器官移植中产生很大的限制。另外，大量疾病的素因中涉及HLA因子。因此HLA系统的抗原用于确定器官移植中供体和受体间的特征(F.H.BACH和J.J.VAN ROOD，《新英格兰医学杂志》，295，806-13页(1976))以及确定对某些疾病的个体素质的分型方法中。
从遗传角度看HLA系统已被充分表征，它由位于6号染色体短臂上约2厘摩(CM)空间中的一系列有或多或少多态性的基因座组成。该系统中的三个基因座(HLA-A、HLA-B和HLA-C)编码一类共显性表达的同种抗原(I类)。另一区域(HLA-D)(它实际上含有几个基因)编码具有相当程度多态性的共显性表达的第二类同种抗原(II类)。特别控制补体系统C2、C4成分和Bf因子的几个其他基因座也属于HLA系统(III)类。器官移植的成功大多取决于受体和供体间的HLA一致性(I类和II类)，因此HLA的分型一定要尽量准确。这一要求主要涉及肾移植(P.J.Morris和A.Ting(1982)，《免疫学综述》66，103-G.Opelz(1989)《移植进展》，21，609-E.L.LAGAAIJ，P.H.Hennemann，M.Ruigrok等(1985)，《新英格兰医学杂志》，321，701)和骨髓移植(P.G.Beatty，R.A.Clift，E.M.Mickelson等(1985)《新英格兰医学杂志》313，765-J.M.Hows和B.A.Bradley(1990)《英国血液学杂志》76.1)。对于骨髓移植来说，II类HLA抗原的完全一致性是移植成功的关键因素，即避免移植物排斥或患移植物-宿主疾病(P.G.Beatty，J.Hanson，G.M.Long-ton等(1991)《移植》51，443-R.C.Ash，J.T.Casper，C.R.Chitamber等(1990)《新英格兰医学杂志》322，485-C.Anasetti，D.Amos，P.G.Beatty等(1989)《新英格兰医学杂志》320，197)。
HLA-D区基因表达产物的多态性通常用血清学技术在分析HLA基因细胞表面表达产物的同种抗血清基础上来确定(J.J.VanRood和A.Van Leeuwen(1963)《临床调查杂志》42，1382-J.J.VanRood，A.Van Leeuwen，J.J.Koning，A.B.Van Oud Ablas(1975)《组织抗原》5，73)，其准确性和可重复性取决于所供血清的批次。但既使在最好的条件下，也有大量的等位基因不能由这些血清学技术检测到。血清学分析的这种局限性主要由以下原因造成：缺乏单特异性同种抗血清，不能完全分辨紧密相关的特异性间的交叉反应性(例如DR3和DRw13)，或者II类HLA分子在细胞(例如白血病细胞)表面的表达改变。
利用分子生物学现在了解到存在比以前设想的多得多的HLA基因，尤其是许多不同的等位基因。这种多样性现由不同基因和等位基因的DNA序列来表征。根据HLA命名委员会的最近报道(见，HLA系统因子的WHO命名委员会(1990)《免疫遗传学》31，131-和J.G.Bodmer，S.G.E.Marsh，E.D.Albert，W.F.Bodmer，B.Dupont，H.A.Erlich，B.Mach，W.R.Mayr，P.Parham，T.Sasazuki，G.M.T.Schrender，J.L.Strominger，A.Svejgaard和P.I.Terasaki(1991)《组织抗原》37，97)，II类HLA的多态性分布如下：DRB1座：47个等位基因，DRB3座：4个等位基因，DRB4座：1个等位基因，DRB5座：4个等位基因，DQB1座：17个等位基因，DQA1座：13个等位基因，DPB1座：21个等位基因，DPA1座：4个等位基因。
许多这些血清学分析遗漏的等位基因只有在DNA水平才能被识别。血清学分型的局限性可由DR4的血清特异性得到说明，它现在被分成11个亚型(DRB1*0401-0411)(见，J.G.Bodmer，S.G.E.Marsh，E.D.Albert，W.F.Bodmer，B.Dupont，H.A.Erlich，B.Mach，W.R.Mayr，P.Parham，T.Sasazuki，G.M.T.Schreuder，J.L.Stro-minger，A.Svejgaard和P.I.Terasaki(1991)《组织抗原》37，97)，这些只有在DNA序列水平才能识别。
与之相似，DRw6的特异性可用几种同种抗血清进一步分为DRw13和DRw14，实际上它含有10个等位基因序列(DRB1*1301-1305和DRB1*1401-1405)(见上文引用的Bodmer J.G.的文章)，这些也只有用DNA序列进行基因型分析才能识别。
基因型分析是一种在基因水平直接分析II类HLA系统多样性的新方法。基因型分析基于分子杂交的理论，提出的第一种方法是所谓的“RFLP”技术，即利用限制性酶将DNA切成片段，并分析由这些酶产生的特异DNA片段的大小(见，C.T.Wake，E.O.Long和B.Mach(1982)《自然》300，372-J.Bhme，M.Andersson，G.Andersson，E.Miller，P.A.Peterson和L.Rask(1985)《免疫学杂志》135，2149-J.L.Bidwell，E.A.Bidwen，D.A.Savage，D.Middle-ton，P.T.Klouda和B.A.Bradley(1988)《移植》45，640)。
RFLP只能使部分血清学方法检不到的等位基因差异得以识别，这种技术仍有局限性。实际上，只有差别核苷酸位于分析中所用限制酶的识别位点时该方法才能识别带有不同序列的等位基因，因此将有大量II类HLA等位基因不能被这种分析方法所识别。而且，RFLP分析仅仅指出编码序列中的修饰，而不能提供关于这种修饰的确切性质的信息。最后，这一技术费时费力，因为它涉及相当大量的核酸用数种限制酶消化、电泳以及转移至滤膜。
DR1、DR4、DRw8、DRw11或DRw13特异性的亚型不能由RFLP检测到，也可以说明RFLP技术的局限性。
已提出了一种II类HLA基因型分析的新技术，该方法称为“用寡核苷酸分型”。由于对II类HLA基因的DNA序列的了解，尤其是迄今最具多态性的DRβ基因的DNA序列，人们可以利用对该基因序列中给定位置特异的寡核苷酸作为杂交方法分析多态性的示踪物。选择这些寡核苷酸使其具有最大可能的报道性，能根据序列不同鉴别不同的等位基因。实际上可以检测到任何序列差异，甚至单一核苷酸的差异。
利用寡核苷酸的分型技术可以应用于DNA，如Angelini等的文章中所述，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83卷，4489-4493页(1986)，也可以应用于RNA(见，C.Ucla，J.J.Van Rood，J.Gorski和B.Mach(1987)《临床调查杂志》80，1155)。
这种新方法是基于利用核酸典型特征进行分子杂交的原理，这些特征是通过氢键与互补序列相互作用从而形成稳定的杂交体，其配对法则是已知的，即DNA中A-T，G-C和RNA中的A-U、G-C。这样，相应于已知等位基因DNA或RNA的合成寡核苷酸可用作探针，来检别样品中的含有与探针互补序列的称为靶标的核酸序列。标记靶标和探针间所形成的杂交体可以对样品中的靶标进行检测和定量。利用任何已知标记物，如酶的、化学的或放射活性的标记物进行这种标记。在这些原理的基础上，Angelini等在以上引用的文章中第一次提出了用寡核苷酸在II类HLA分型中的应用，其中利用所谓的“SOUTHERN”技术：将靶DNA沉积在尼龙膜上，用标记的寡核苷酸探针进行检测。随后这一技术被用于检测常规血清法测不出的II类HLA等位基因(见，J.M.Tiercy，J.Gorski，M.Jean-net和B.Mach(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，198-J.M.Tier-cy，J.Gorski，H.Bétuel，A.C.Freidel，L.Geb hrer，M.Jeannet和B.Mach(1989)《人体免疫学》24，1)。对II类HLA分型的另一直接应用描述在专利申请PCT WO89/11547中，其中使用所谓的“斑点印迹”技术。所谓的“反向斑点印迹”法是这些技术的一种改良，它是将核苷酸探针结合在纸膜、硝基纤维素或两者的混合物上，用标记的靶标进行杂交检测。这一技术已用于HLA-DQA的分型和地中海1β-贫血突变的检测(R.K.Saiki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86卷，6230-6234页(1989))。
如上文所述和以上引述的出版物和专利申请中解释的那样，细胞分型需要检测基因组中的点突变、涉及建立对检测和区分同源序列(单一核苷酸不同)足够敏感的探针，发现使用短探针是必需的，一般少于30个核苷酸，这些探针使试验具有很大的特异性同时保持良好的敏感性。短探针的使用使得具有广泛的选择性。
对于涉及探针与固体载体结合的试验，存在小于30个核苷酸的短探针在这种固体载体上固定的问题。R.K.SAIKI等在上文所引述的文章中提出一种方法：将400个碱基的多(dT)尾与含15-20个碱基探针的3′末端偶联，然后通过紫外线照射将探针借该尾固定在尼龙滤膜上，使胸腺嘧啶碱基与尼龙中存在的伯胺共价偶联。
但这一方法还不能令人完全满意，因为存在特异性问题。事实上，探针的胸腺嘧啶碱基也能在紫外照射下与载体反应，从而使杂交的效力降低。
另外，出于工业化原因，希望发展一种具有高特异性和良好灵敏性但操作简便、迅速、廉价、能够自动化并可用于个体分型的分型方法。
现发现了一种测定个体HLA-DR基因型的新方法，该方法克服了上述缺点，但能检测并区分仅单一核苷酸区别的同源序列。
利用一套选择的核苷酸探针实施本发明方法，使得用最小数目的探针实现分型。这一套探针尤其具有可以在单一温度下工作的优点，特别是在37℃下(如在下文实验部分将看到的，也可能在其他温度下工作)。这一套探针也形成本发明的一部分。
本发明的该套探针(将在下文定义)可以以检测探针形式(用标准示踪剂标记)用于Southern类技术，或优选以捕捉探针形式(三明治或反向斑点印迹技术)使用并固定在固体载体上，固定方法为直接被动结合(吸附)或借助于配体如疏水性配体吸附(见，例如欧洲专利申请0,405,913)，或通过建立至少一个共价键，同样可为直接共价键或借助于能与载体共价结合的配体(见，例如专利申请PCT WO88/01,302)
探针的固定化可用已知方法进行，或用以下文将描述的其他方法进行。
本发明的探针(核苷酸探针)将主要以核苷酸序列的形式描述。本领域技术人员清楚，甚至对于在一定温度下检测点突变的探针，也可以设想一定范围内的各种长度(核苷酸数目)的探针，特别是借助于使用或多或少对杂交复合体稳定性有利的溶液和缓冲液。因而，本发明探针用一般认为是最长的序列来定义(特别是希望它在较低温度如37℃下工作时)，同时指明对在所述温度下仍可使用、甚至对点突变仍将敏感的最短序列。
专业人员显然知道每个具体核苷酸探针有其相应的互补探针，后者自然能够起捕捉探针或检测探针的作用。因此本发明包括具有下文所述探针互补序列的探针。
专业人员还清楚，一套探针中识别某一具体特异性X的某一探针一般可以由一个两探针系统来替代，其中之一识别特异性X和Y，另一个识别特异性X和Z，此时用XY探针和用XZ探针均为阳性反应则可推断存在特异性X。因此，本发明包括其中一个或多个探针被这种两探针或多探针的等价系统替代的探针系统，正如下文将要定义的。自然，这种系统组合可应用于两个以上的特异性。
本发明涉及可用于HLA DR类型测定的寡核苷酸分型技术的核苷酸探针，所述探针选自下列各种：-TGGCAGCTTAAGTTT-CCTAAGAGGGAGTG-GCGAGTGTGGAACCT-AAGACAGGCGGGGC.
上述四个序列分别编号为101、102、103和104。
探针101识别DRB1*01型。
探针102识别DRB1*02型。
探针103识别DRB4*01型，及
探针104识别DRB1*1305型。
本发明进一步涉及包括选自探针101至104的至少一个探针的一套核苷酸探针或HLA分型试剂盒。
本发明还涉及包括选自下列各种的至少一个探针的一套核苷酸探针：-GTGGACAACTACTG-GATACTTCTATCACCAA-GCCTGATGAGGAGTAC-TGGCAGGGTAAGTATAAG-GGGCCCTGGTGGACA-TGCGGTATCTGCACA-GGAGGAGGTTAAGTT-CTGGAAGACGAGCG-TGGAAGACAAGCGG-TGCGGAGCACTGGA-AACCAGGAGGAGAACGTG-ACTCTACGGGTGAGTG-GACACCTATTGCAGAC-
下划线的部分相当于最小序列。
上述13个序列分别编号为105-117。
在一优选实施方案中，探针111以其完全的形式使用，包括3′-末端的两个未划线的T。其特异性与探针45的相同。
探针115优选以划线序列加上5′-末端未划线的两个A的形式使用。其特异性与探针28的相同。
探针105-110、112-114、116和117优选以下文试验部分以编号43、9、10、14、17、44、46、48、47、24和27相称的探针形式使用。
本发明特别涉及如上所定义的一套探针，其特征在于其还包括至少一种下列探针(划线部分相当于最佳序列)：-GAGGAGGACTTGCGCT-TACGGGGCTGTGGAG-GGAGCTGCGTAAGT-TTCCTGGAGAGACAC-GGGAGAGATACTTCC.
以上五个序列分别编号为118-122。所述序列特别以编号42、42bis、52、37和55的探针形式使用。
上述特异探针尤其可用作捕捉探针或检测探针。它们优选以固定化或可固定在固体载体上的捕捉探针形式使用。
本发明的主题还在于按标准寡核苷酸分型技术测定个体HLA-DRβ类型的方法，其中如上所定义的一套探针中至少部分探针相继地或同时用作捕捉探针或检测探针。
在自动化方法中，同时使用这些成套探针。在其他情形下，显然可以一个接一个地使用这些探针，并在收集的信息足以分型时停止该方法。
因而本发明的方法主要包括以下步骤：--按照所选择的具体技术，使含有个体HLA-DR基因多态区的靶核酸样品与以上定义的一套探针中的至少一部分接触，--按已知方法在预定条件下保温，使每个探针的杂交只在靶标含有与所述探针完全互补的序列时才发生，及--按标准检测技术确定所用的每个探针杂交与否。
然后用所收集的信息按预先建立的分型表确定类型，考虑所用探针和已知HLA-DR类型和/或相关亚型的列表来确定。使用分型表简化了这一工作，即按所观察到的阳性反应(杂交)，该表直接给出类型和/或亚型。对于本发明的此套探针，这种表在下文试验部分给出(见表6)。
本发明尤其涉及其中所述探针用作捕捉探针的上述方法，该方法的特征在于其包括以下步骤：
a)将每个捕捉探针固定在固体载体上，
b)在若靶标中存在与探针互补的序列则可杂交的条件下，使每个固定化捕捉探针与含有至少一种靶核酸片段的液体介质接触，及
c)检测可能形成的任何杂交体的存在。
当然，本发明探针可用于检测RNA和DNA的靶片段。而且显然可以使用上述探针以外的所有适当探针作为检测探针，尤其是下文实施例5中描述的探针之一。
当捕捉探针非常短时，即小于20个核苷酸，特别是小于17个核苷酸，需要实施改善探针与固体结合的手段。这样探针与载体的结合是以探针与配体共价连接形成的衍生物形式进行的，所述配体能帮助与固体载体的结合。配体可以包含疏水部分，但尤其包含至少一种极性功能团，例如氨基。该功能团可通过建立共价键用于结合探针和固体载体。当极性功能团不与载体反应时，配体通过吸附于载体(甚至载体是疏水性的)来改进结合。
配体例如选自蛋白质和分别由下式I和II代表的化合物：
其中：
Z代表含2-12个碳原子由一个或多个选自羟基和/或氨基的基团取代或未取代的直链或支链烷基或链烯基，M+尤其代表碱金属离子或铵离子。该配体优选与捕捉探针核苷酸序列的5′-末端连接；其中n为1-4的整数，优选n＝1或4。
该配体优选与捕捉探针核苷酸序列的3′-末端连接。
当配体为蛋白质时，例如选择白蛋白，优选牛血清白蛋白，它可以与捕捉探针核苷酸序列的5′或3′末端连接。
本发明的载体可以是能使本发明的核苷酸序列或衍生物通过被动吸附或共价结合而固定化的任何载体。该载体可由常用材料制得，例如硝基纤维素、尼龙、纸、或优选使用疏水性材料，如苯乙烯聚合物或含10％(重量)苯乙烯单位的苯乙烯共聚物。
本发明固体载体例如可以是如下形式：微滴定板、片状、管状、锥形、孔状等。
按照本发明方法，含核酸的样品得自其HLA-DR基因型待测的个体。含HLA-DR核酸的任何类型的组织均可用于本发明。例如可以使用个体样品中的核酸经化学方法、酶法或其他方法裂解后所得核酸(DNA或RNA)片段。
但是增加先期进行的靶DNA或RNA扩增步骤对本发明的寡核苷酸分型法有利。虽然通过序列特异性寡核苷酸杂交分析HLA多态性的原理仍相同，但选择性的扩增步骤使靶序列富集，从而简化了该技术(R.K.Saiki，T.L.Bugawan，G.T.Horn，K.B.Mullis和H.A.Erlich(1986)《自然》324，163-J.M.Tiercy，M.Jeannet和B.Mach(1990)《欧洲免疫学杂志》20，237)。
可以从DNA或从RNA进行扩增。本领域技术人员清楚，样品中HLA-DR靶序列的扩增可按任何已知方法进行，该方法使序列足量扩增以使得通过核酸与探针的杂交能够检测出靶序列。
样品中核酸一般为DNA，通常为基因组DNA。但用其他核酸如信使RNA或克隆的DNA也可以实施本及明，而且个体样品中的核酸可以是单链或双链形式。当然，如果核酸是双链形式则需要进行变性步骤以获得单链核酸。
本发明中所使用的探针是序列特异性寡核苷酸(SSO)，在适当条件下能与其互补序列特异性结合。如果一种具体探针可用于识别一种独特的等位基因，则称该探针为ASO，即等位基因特异性寡核苷酸。由于各种DRβ等位基因间的不同性质，单一探针自身可能无法识别一种DRβ特异性等位基因。
根据本发明方法，从一套探针的结合模式来推断等位基因的身份，其中每个单一探针对HLA-DR基因的不同部分特异。选择对应于已知等位基因DNA序列的多个探针的结果是，本发明寡核苷酸分型方法的特异性使得可以识别DRB1、DRB3和DRB5基因座的所有等位基因。当然，本发明方法可能用于识别其他极端多态性基因座如DQB1和DPB1的等位基因。因为等位基因差异主要位于编码HLA分子第一功能区(aa 5-94)的外显子中，选择与该区域中特异序列互补的探针。如果有新的等位基因被发现，就立即将其列在II类HLA序列的登记表中，这使得报道性示踪物的集合不断更新，因而本方法适于检测任何新的等位基因。
为了使II类HLA完全分型法合理化，已提出首先用有限数目的探针进行第一步DR属分型，这可以识别主要HLA-DR特异性，即HLA-DR1-DRw18。这一步骤对许多临床应用已经足够了(见B.Mach和J.M.Tiercy(1991)《人体免疫学》30，278)。
在这第一步结果的基础上，第二步可能选择出产生DRβ微多态性、检测DQB1多态性和需要时鉴定DPB1等位基因所需的特异性探针。
用寡核苷酸分型技术对HLA-DR1-DRw18特异性的分析，可以代替DR血清学方法用于组织相容性实验室进行常规的DR分型，特别是进行肾移植等待者名单中病人的DR分型或潜在肾提供者的分型，计划进行骨髓移植的白血病病人、其家庭成员或无关的潜在提供者的DR分型，对登记志愿捐献骨髓者的大量DR分型，用于在例如胰岛素依赖性糖尿病中确定疾病与HLA系统的联系，应用于预见医学或者用于亲子鉴定试验中和其他法医鉴定中。
以下是本申请中所用几个术语的定义：
“基因型”指个体的一系列基因方面的特征，与“表现型”相反，后者包括分析基因表达产物(尤其是蛋白质)而呈现的个体特征。
“等位基因”指相同基因的不同形式，它们在核酸序列中存在差异。这些差异表现在DNA、RNA和蛋白质中。
“多态性”表示由于相同基因存在不同等位基因而引起的人群中的多样性。
本文所用“寡核苷酸”指引物、探针、待检测的核酸片段等。可用任何适当的已知方法制备这些寡核苷酸。
“核苷酸探针”指天然DNA或RNA片段，或天然或合成的寡核苷酸，或合成的DNA或RNA片段，可以是未修饰的也可以含有一人或多个修饰碱基如肌苷(用字母I代表)、5-甲基脱氧胞苷、5-(二甲氨基)-脱氧尿苷、脱氧尿苷、2，6-二氨基嘌呤、5-溴脱氧尿苷或其他能杂交的修饰碱基。
另外，在本申请中，当捕捉探针的序列有下划线时，这代表用于本发明分型方法的最佳序列。当然，这些最佳序列可以在3′和/或5′末端延长至少一个碱基。这种情况下，这些可以任意增加的碱基示于括号中，这例如可以在阅读以下的描述时看到。最后，本领域技术人员可以根据工作条件(诸如杂交和洗涤温度、杂交缓中液和/或洗涤缓冲液的性质)和分型表来改变所用序列的长度。
以下非限定性实施例说明本发明方法的优选实施方案，在阅读了以下参照实施例的详细说明后将会更好地理解本发明。实施例1
这里举例给出的本发明所用配体可以是市售的化合物，如下表1中所示：
表1
NMTr＝单甲氧基三苯甲基DMTr＝二甲氧基三苯甲基Fmoc＝9-芴基甲氧基羰基CPG＝控孔玻璃珠LCAA＝长链烷基胺(间隔臂)
按照下述一般操作方法进行氨基磷酸酯(phosphoramidite)配体与寡核苷酸的连接：
按照制造商的说明，在应用生物系统公司(APPLIED BIOSY-SEMS)自动合成仪381A上用氨基磷酸酯化学方法合成寡核苷酸。将氨基磷酸酯配体溶解在无水乙腈中达0.2M的浓度，并置于合成仪的X位，当寡核苷酸的合成结束时，按照标准的自动合成方法在寡核苷酸的5′-端加上配体。
当配体带有二甲氧基三苯甲基保护基时(如对于化合物d)，合成结束后还需要用三氯乙酸脱去三苯甲基的脱保护步骤。
在33％NH4OH中55℃脱保护过夜，然后在-20℃乙醇中沉淀后，真空干燥寡核苷酸并溶于1ml水中。
对于代号为b和c的化合物，脱保护后按制造商(分别为CLONTECH和GLEN)的说明另外进行一步单甲氧基三苯甲基的裂解步骤。
对于代号为e和f的化合物，按标准方法从与二氧化硅连接的配体开始自动合成。配体与寡核苷酸的连接通过寡核苷酸的3′-末端进行。
在5′或3′末端修饰的寡核苷酸均在Brownlee RP18柱(10mm×25cm)上经反相高压液相色谱(HPLC)纯化。条件：流速：4.6ml/分
梯度：30分钟内10％-30％的缓中液B。
3分钟内35％-100％的缓冲液B。
缓中液A和B的性质如下：
缓冲液A：0.1M醋酸三乙基铵(TEAA)，pH7.00
缓冲液B：50％缓中液A+50％CH3CN。实施例2：
寡核苷酸与牛血清白蛋白(BSA)的连接
如实施例1中所述合成了带有氨基连结臂2(在表1中代号为a)的寡核苷酸：将3×10-8mol寡核苷酸真空干燥并溶解在0.1M硼酸钠缓中液(pH9.3)25μl中，加入含30mg/ml DITC(1，4-亚苯基二异硫氰酸酯，Fluka 78480)的DMF溶液500μl。加入3ml水后室温下搅拌该混合物1.5小时。用丁醇(3×3ml)提取该溶液后，将剩余水相(500μl)真空干燥，然后与400μl硼酸盐缓中液(0.1M，pH9.3)中的1×10-7mol(6.6mg)BSA(Pierce 30444)混合。室温下搅拌过夜后，偶联物在AX300柱(BROWNLEE 4.6×100mm)上用NaCl梯度进行离子交换HPLC而纯化(表1)。将偶联物峰洗脱液对水(2×1升)透析，真空浓缩，溶于1ml水中于-20℃保存。
色谱条件：
梯度：25分钟内10％-56％缓冲液B′
2分钟内56-100％缓冲液B′。
缓冲液A′和B′的性质：
A′＝20mM磷酸钠，pH7.00/20％CH3CN
B′＝缓冲液A′+1M NaCl或2M NaCl。实施例3
表2显示DRβ基因不同等位基因的氨基酸排列对比，以表明突变氨基酸相对于选定保守序列(称为“DR CONS”)的位置。这些突变相应于DNA中的非沉默突变，即引起氨基酸变化的突变。实际上已知DNA中三联碱基将要编码的氨基酸。在第三位的突变一般不引起氨基酸的变化，而第二碱基的改变很可能引起氨基酸的改变，第一碱基的突变总是引起氨基酸的变化。
因而在不同等位基因的分型中，相应于非沉默突变的DNA突变最常用。但检测沉默型突变也是可能的，例如为了区分两个密切相关的等位基因。
表3显示了所有迄今已知和文献中出版的等位基因的DRβ基因核苷酸排列对比(相对表2中的相同保守序列)。
用于指称不同等位基因的命名规则是由第五次组织相容性会议上提出的(Leiden，荷兰，1991)。表2中括号中的代号是以前的命名。
表2
10 20 30 40 50 60 70 80 90
* * * * * * * * * * * * * * * * *DR CONS PRFLEQxKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRDRB1*0101 (Dw1) ----W-L-F------------L-E-CI-----S----------------------------------------------------------DRB1*0102 (Dw20) ----W-L-F------------L-E-CI-----S------------------------------------------------AV--------DRB1*0103 (DwBON) ----W-L-F------------L-E-CI-----S------------------------------I--DE-----------------------DRB1*1501 (Dw2) ----W-P-R-----------------------S----------F-------------------I---A--------------V--------DRB1*1502 (Dw12) ----W-P-R-----------------------S----------F-------------------I---A-----------------------DRB1*1601 (DW21) ----W-P-R-----------------------S------------------------------F--D------------------------DRB1*1602 (Dw22) ----W-P-R-----------------------S------------------------------L--D------------------------DRB1*0301 (DRw17) -----YST-------------Y-----H----N----------F-----------------------K-GR--N--------V--------DRB1*0302 (DRw18) -----YST---------------E---H----N----------------------------------K-GR--N-----------------DRB1*0401 (Dw4) ------V-H-------------------H--------------------------------------K-----------------------DRB1*0402 (Dw10) ------V-H-------------------H----------------------------------I--DE--------------V--------DRB1*0403 (Dw13TAS ------V-H-------------------H-----------------------------------------E-----------V--------DRB1*0404 (Dw14) ------V-H-------------------H-----------------------------------------------------V--------DRB1*0405 (Dw15) ------V-H-------------------H-----------------------S--------------------------------------DRB1*0406 (KT2) ------V-H-------------------H---S-------------------------------------E-----------V--------DRB1*0407 (Dw13JHA ------V-H-------------------H-----------------------------------------E--------------------DRB1*0408 ------V-H-------------------H--------------------------------------------------------------DRB1*0409 ------V-H-------------------H-----------------------S--------------K-----------------------DRB1*0410 -----------------H-----------------------S-----------------------------V-DRB1*0411 -----------------H-----------------------S-----------------E-----------V-DRB1*0701 (Dw17) ----W-G-YK----------Q--E-L------F-------------------V--S------I--D--GQ---V-----------------DRB1*0702 (DB1) ----W-G-YK----------Q--E-L------F-------------------V--S------I--D--GQ---V-----------------DRB1*0801 (MADURA) -----YSTG--Y----------------------------------------S---------F--D---L-------------DRB1*0802 (SPL) -----YSTG--Y--------------------------------------------------F--D---L---------------------DRB1*0803 (TAB) -----YSTG--Y----------------------------------------S---------I--D---L---------------------DRB1*0804 -----YSTG--Y--------------------------------------------------F--D---L-------------V-------DRB1*0901 (Dw23) --------Y-H-GI-----N-------------------V--S------F--R---E---V-----------------DRB1*1001 -----EV-F------------L-E-RVH-----A-Y-----------------------------R-------------------------DRB1*1101 (SVEIG) -----YST----------------------------------F----------E--------F--D-------------------------DRB1*1102 (JVM) -----YST----------------------------------F----------E--------I--DE---------------V--------表2(续)
10 20 30 40 50 60 70 80 90
* * * * * * * * * * * * * * * * *DR CONS PRFLEQxKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRDRB1*1103 (UA-S2) -----YST-----------------------------------F----------E--------F--DE--------------V--------DRB1*1104 (TUBO) -----YST-----------------------------------F----------E--------F--D---------------V--------DRB1*1201 (HERLUF)-----YSTG--Y--------------H-H----LL--------F---------V--S------I--D--------------AV--------DRB1*1202 -----YSTG--Y--------------H-H----LL--------F---------V--S------F--D--------------AV--------DRB1*1301 (HHK) -YST--------------------H----N---------F-------------------I--DE--------------V--------DRB1*1302 (WT46) -----YST--------------------H----N---------F-------------------I--DE-----------------------DRB1*1303 (HAG) -----YST---------------------------------------------S---------I--DK-----------------------DRB1*1304 YST -----YST-----------------------------------F---------S---------I--DE--------------V--------DRB1*1305 (DES.DI)-----YST--------------------H----N---------F-------------------F--D------------------DRB1*1401 (TEM) -----YST--------------------H----F-------------------A--H---------R---E-----------V--------DRB1*1402 (AMALA) -----YST----------------E---H----N---------------------------------------------------------DRB1*1403 (J×6) -----YST----------------E---H----N--------------------------------D---L--------------------DRB1*1404 -----YSTG-------------------H----F-------------------A--H---------R---E-----------V--------DRB1*1405 ---YST---Q----------------H----F--------------------------------R---E-----------V-DRB3*0101 (52a) -----LR---------------Y-----H----FL------------------V--S----------K-GR--N-----------------DRB3*0201 (52b1) -----LL-----------------E-H-H-----A------------R-------------------K-GQ--N--------V--------DRB3*0202 (52b2) -----LL-----------------E-H-H-----A------------R-------------------K-GQ--N-----------------DRB3*0301 (52c) -----LL-----------------E---H----F-------------------V--S----------K-GQ--N--------V--------DRB4*0101 ------A-C----L-------WN-I--I------A-YN--L---Q---------------------R---E------Y----V--------DRB5*0101 (Dw2) ----Q-D-Y---------------H-DI-----DL----------------------------F--D------------------------DRB5*0102 (Dw12) ----Q-D-Y---------------H-GI-----N-----------------------------F--D------------------------DRB5*0201 (Dw21) ----Q-D-Y---------------H-GI-----N-----------------------------I---A-------------AV--------DRB5*0202 (Dw22) ----Q-D-Y---------------H-GI-----N-----------------------------I---A-------------AV--------表3
10 15 20 25 30 35 40 45
R F L E Q X K S E C H F F N G T E R V R F L D R Y F Y N Q E E Y V R F D S D V G E Y R ADR cons CACGTTTCTTGGAGCAGxxTAAGTCTGAGTGTCATTTCTTCAATGGGACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTCTATAACCAGGAGGAGTACGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTACCGGGCGDRB3*0101 ---------------T-CG----------------------------------------------A----------------C---------------T-C---------------------------------DRB3*0201 ---------------T-CT-----------------------------------------------------G---C-----C------------------CDRB3*0202 ---------------T-CT-----------------------------------------------------G---C-----C------------------CDRB3*0301 ---------------T-CT-----------------------------------------------------G---------C---------------TDRB1*0301 --------------T-CTC--C-------------------------------------------A----------------C--------------A------------------------------T-----DRB1*0302 --------------T-CTC--C--------------------------------------------------G---------C--------A------------------------------------DRB1*1101 --------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1102 --------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1103 --------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1104 --------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1201 --------------T-CTC--C-GG-------T--------------------------------A------G---C------------------CT-C-----------------------------T-----DRB1*1202 --------------T-CTC--C-GG-------T--------------------------------A------G---C------------------CT-C-----------------------------T-----DRB1*1301 --------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C-----------A--------------------------------T-----DRB1*1302 --------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C-----------A--------------------------------T-----DRB1*1303 --------------T-CTC--C--------------------------------------------------------------------A-------------------------------------------DRB1*1304 --------------T-CTC--C--------------------------------------------------------------------A-------------------------------------------DRB1*1305 --------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C-----------A--------------------------------T-----DRB1*1401 --------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C------------T-------------------------------------DRB1*1402 --------------T-CTC--C--------------------------------------------------G----------C-----------A--------------------------------------DRB1*1403 --------------T-CTC--C--------------------------------------------------G----------C-----------A--------------------------------------DRB1*1404 --------------T-CTC--C-GG-------T--------------------------------------------------C------------T-------------------------------------DRB1*1405 --------------T-CTC--C------------A------------------------------------------------C------------T-------------------------------------DRB1*0801 --------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----------------------------------------DRB1*0802 --------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----------------------------------------DRB1*0803 --------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----A-----------------------------------DRB1*0804 --------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----------------------------------------DRB1*04 -----------------GT---ACA------------------C-------------------------------------------C----A-----------------------------------------DRB1*0406 -----------------GT---ACA------------------C-------------------------------------------C----A-------C---------------------------------DRB4*0101 -----------------GC-----G-------------C-----------------A---T--AA----AT-------A-------------A---------C-----A-A----T---C-----------A--DRB1*07 --------C--TG----GG-----A-A----------------C-----------------A---------A---CT----------------------T----------------------------------DRB1*0901 -----C--------------------AT---C-----GG-A-------------A-----A-----------------------------------DRB1*1001 --------------G--GT-----T------------------C---------------------G-----A---CG-G--C----------A---------C-----A---------------DRB1*0101 -----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A-------------A------C------------------------DRB1*0102 -----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A-------------A------C------------------------DRB1*0103 -----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A-------------A------C------------------------DRB5*0101 -----------C-----GA-----A------------------C-------------------------C-----G--A-------------A-----G--T----------------------DRB5*0102 -----------C-----GA-----A------------------C-------------------------------GG-A-------------A-----A-------------------------DRB5*0201/02 -----------C-----GA-----A------------------C-------------------------C-----GG-A-------------A-----A-------------------------DRB1*1501 -------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------T-----DRB1*1502 -------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------T-----DRB1*1601 -------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------------DRB1*1602 -------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------------表3(续)
50 55 60 65 70 75 80 85 90
V T E L G R P D A E Y W N S Q K D L L E Q × R A × V D T Y C R H N Y G V G E S F T V Q R RDR cons GTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGATGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACCTCCTGGAGCAGA×GCGGGCCG×GGTCGACACCTACTGCAGACACAACTACGGGGTTGGTGAGAGCTTCACAGTGCAGCGGCGADRB3*0101 ----------------------TC-------C--------------------------------A------G-CG---------AT------------------------------------------------DRB3*0201 ----G-----------------------------------------------------------A------G-CA---------AT-------------------------TG---------------------DRB3*0202 ----G-----------------------------------------------------------A------G-CA---------AT------------------------------------------------DRB3*0301 ----------------------TC-------C--------------------------------A------G-CA---------AT-------------------------TG---------------------DRB1*0301 ----------------------------------------------------------------A------G-CG---------A--------------------------TG---------------------DRB1*0302 ----------------------------------------------------------------A------G-CG---------A-------------------------------------------------DRB1*1101 -------------------------AG------------------------T-------AG-C-G---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1102 -------------------------AG------------------------A-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1103 -------------------------AG------------------------T-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1104 -------------------------AG------------------------T-------AG-C-G---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1201 ----------------------TC-------C-------------------A-------AG-C-G---C-----C------------T--------------------C--TG---------------------DRB1*1202 ----------------------TC-------C-------------------T-------AG-C-G---C-----C------------T--------------------C--TG---------------------DRB1*1301 ---------------------------------------------------A-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1302 ---------------------------------------------------A-------AG-CGA---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1303 ---------------------AGC---------------------------A-------AG-C-A---------C-------------------------------------------------G---------DRB1*1304 ---------------------AGC---------------------------A-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1305 ---------------------------------------------------T-------AG-C-G---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1401 ----------------------C---G---C------------------------------G--G---------A------------T-----------------------TG---------------------DRB1*1402 ----------------------------------------------------------------G---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1403 ---------------------AGC-----------------------------------AG-C-G---------CT----------------------------------------------------------DRB1*1404 ----------------------C---G---C------------------------------G--G----------A-----------T-----------------------TG---------------------DRB1*1405 --------------------------T----------------------------------G--G----------A-----------T-----------------------TG---------------------DRB1*0801 ---------------------AGC---------------------------T-------AG-C-G---------CT----------------------------------------------------------DRB1*0802 ---------------------------------------------------T-------AG-C-G---------CT------------------------------------------------G---------DRB1*0803 ---------------------AGC---------------------------A-------AG-C-G---------CT----------------------------------------------------------DRB1*0804 ---------------------------------------------------T-------AG-C-G---------CT-----------------------------------TG---------------------DRB1*0401 ----------------------------------------------------------------A----------C----------------------------------------------------------
0402 ---------------------------------------------------A-------AG-CGA----------C-----------------------------------TG---------------------
0403 ----------------------------------------------------------------G----------A-----------------------------------TG---------------------
0404 ----------------------------------------------------------------G----------C-----------------------------------TG---------------------
0405 ---------------------AGC----------------------------------------G----------C----------------------------------------------------------
0406 ----------------------------------------------G----------A-----------------------------------------------------TG---------------------
0407 ----------------------------------------------------------------G----------A----------------------------------------------------------
0408 ----------------------------------------------------------------G----------C----------------------------------------------------------DRB4*0101 -----------------------C--T----------------------------------G--G----------A-------------------T---------------TG---------------------DRB1*07 -----------A----------TC-------C--------------A-------------G-C-G-------G-CA----------GTG---------------------------------------------DRB1*0901 ----------------------T--------C--------------T--------------G--G----------A----------GTG------------------------------------------A--DRB1*1001 -------------------------------------------------------------G--G---T------C----------------------------------------------------------DRB1*0101 ----------------------------------------------------------------G----------C----------------------------------------------------------DRB1*0102 ----------------------------------------------------------------G----------C--------------------------------C--TG---------------------DRB1*0103 ----------------------------------------------A------------AG-C-G----------C----------------------------------------------------------DRB5*0101 -----------------------C--T-------------------T------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------DRB5*0102 -----------------------C--T-------------------T------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------DRB5*0201/02-----------------------C--T-------------------A----------------GC----------C-----------------------------------C--TG---------------------DRB1*1501 -----------------------C--T-------------------A----------------GC----------C--------------------------------------TG---------------------qDRB1*1502 -----------------------C--T-------------------A----------------GC----------C-------------------------------------------------------------DRB1*1601 -----------------------C--T-------------------T------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------DRB1*1602 -----------------------C--T--------------------------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------实施例4
利用上述两种途径，合成的寡核苷酸要么如实施例1中所述带有配体并列在表4中，要么如实施例2中所述与BSA连接并列在表5中。
表4
**X代表按前文表1中所用命名系统的配体，**tr表示在实施例1中所述条件(BROWNLEE RP18柱(4.6mm×25cm)，流速1m1/分)下，寡核苷酸的HPLC保留时间(分)。***序列33，34和34bis中的字母I代表肌苷。
| Ref. | N° | 序列 5′-3′*** | 配体x* | tr** |
| 1 | 563 | CTGGAAAGATGCA | a | 17，11 |
| 2 | 562 | TGGAAAGATGCAT | a | 17，63 |
| 3 | 561 | CAGGATAAGTATGA | a | 17，52 |
| 4 | 579 | GCAGGATAAGTATGA | a | 16，7 |
| 5 | 603 | CAGCAGGATAAGTATG | b | 17，44 |
| 6 | 1094 | CAGCAGGATAAGTATG | a | 16，25 |
| 7 | 546 | TGGACAACTACTG | a | 18，61 |
| 7bis | 570 | GGACAACTACTG | a | 16，09 |
| 8 | 596 | GGACAACTACTG | b | 17，29 |
| 9 | 545 | GATACTTCTATCACC | a | 19，2 |
| 10 | 398 | CCTGATGAGGAGTA | a | 14，6 |
| 11 | 573 | CAGGGTAAGTATAAG | a | 16，18 |
| 12 | 580 | GCAGGGTAAGTATAAG | a | 16，99 |
| 13 | 1064 | TGGCAGGGTAAGTAT | a | 17，55 |
| 14 | 591 | GGCAGGGTAAGTATAAG | b | 18，18 |
| 15 | 1095 | GGCAGGGTAAGTATAAG | a | 17，13 |
| 16 | 400 | GGCCCTGGTGGA | a | 13，79 |
| 17 | 595 | GGCCCTGGTGGA | b | 17，43 |
| 18 | 574 | GCGGTATCTGCACA | a | 16，62 |
| 19 | 556 | GGAGGAGGTTAAG | a | 17，94 |
| 20 | 555 | TGGAAGACGAGC | a | 16，1 |
| 21 | 755 | TGCGGAGCACTGGA | a | 16，85 |
| 22 | 867 | GGAAGACAAGCG | a | 13，36 |
| 23 | 915 | CTCTACGGGTGAG | a | 19，04 |
| 24 | 1066 | CTCTACGGGTGAGT | a | 17，14 |
| 25 | 990 | CACCTATTGCAGA | a | 17，47 |
| 26 | 1067 | CACCTATTGCAGAC | a | 17，08 |
| 27 | 1068 | ACACCTAT1GCAGA | a | 1，81 |
| 28 | 602 | CCAGGAGGAGAACGT | a | 15，86 |
| 29 | 1096 | CCAGGAGGAGAACGT | c | 15，77 |
| 30 | 1097 | CCAGGAGGAGAACGT | d | 13，74 |
| 31 | 1098 | CCAGGAGGAGAACGT | e | 14，03 |
| 32 | 1099 | CCAGGAGGAGAACGT | f | 14，81 |
| 33 | 1100 | CCAGIAGGAGAACGT | a | 14，97 |
| 34 | 1107 | ACCAGIAGGAGAACGT | a | 16，05 |
| 34bis | 1127 | AACCAGIAGGAGAACGT | a | 16，62 |
| 35 | 935 | ACCAGGAGGAGAACGTG | 19，29 | |
| 36 | 997 | GAGCTGCGTAAG | a | 16，55 |
| 37 | 1033 | TTCCTGGAGAGACAC | a | 18，4 |
| 38 | 1030 | TTCCTGGAGAGATAC | a | 18，39 |
| 39 | 1065 | TCCTGGAGAGATACT | a | 18，01 |
| 40 | 1058 | GGAGGACTTGCGC | a | 17，9 |
| 41 | 1059 | GGAGGACTTGCGCT | a | 18，35 |
| 42 | 1060 | AGGAGGACTTGCGC | a | 17，05 |
| 42bis | 1061 | ACGGGGCTGTGGA | a | 16，79 |
表5
*TR表示在实施例2中所述条件下与BSA相连寡核苷酸的HPLC保留时间(分)。
| 编号 | 序列5′-3′ | TR* | **oligo/BSA比 | |
| 43 | 571B | TGGACAACTACT | 7，85 (2M) | 1 |
| 44 | 574B | GCGGTATCTGCACA | 8，69 (2M) | 0，8 |
| 45 | 556B | GGAGGAGGTTAAG | 7，76 (2M) | 1 |
| 46 | 555B | TGGAAGACGAGC | 16，85 (1M) | 0，8 |
| 47 | 756B | GCGGAGCACTGG | 17，78 (1M) | 1，5 |
| 48 | 867B | GGAAGACAAGCG | 16，65 (1M) | 1，1 |
| 49 | 868B | TGGAAGACAAGC | 8，56 (2M) | 1，3 |
| 50 | 856B | GAGGAGCTCCTGCGCT | 19，96 (1M) | 1，2 |
| 51 | 966B | AGGAGAACGTGC | 19，66 (1M) | 1，5 |
| 52 | 997B | GAGCTGCGTAAG | 18，88 (1M) | 0，9 |
| 53 | 998B | AGCTGCGTAAGT | 16，32 (1M) | 1 |
| 54 | 1026B | GAGAGACACTTCC | 13，98 (1M) | 0，5 |
| 55 | 986B | GGAGAGATACTTC | 15，81 (1M) | 0，6 |
| 56 | 1049B | GAGAGATACTTCC | 15，86 (1M) | 1，2 |
| 57 | 1089B | ACGGGGCTGTG | 17，72 (1M) | 1，1 |
| 58 | 1090B | TACGGGGCTGT | 17，24 (1M) | 1 |
| 59 | 1091B | CGGGGCTGTGG | 17，42 (1M) | 1，1 |
(1M)指缓中液B含1M NaCl
(2M)指缓冲液B含2M NaCl。**按应用生物系统(APPLIED BIOSYSEMS)公司的说明，通过测定260nm处的吸光度用紫外光度法以皮可摩尔对寡核苷酸定量。用BRADFORD法(BRADFORD M.M.，分析生物化学，72，248(1976))以皮可摩尔测定BSA。oligo/BSA比是这两个值之比。
在本实施例中建立了捕捉探针寡核苷酸，它们可以以不带配体或带有配体或与例如BSA连接的形式来合成。这种合成寡核苷酸序列的选择要考虑实施例3表3中所述不同等位基因DNA序列的排列对比。利用选择用作例如捕捉探针的这些寡核苷酸能够建立一种分型表，如表6中所示。对本领域技术人员来说，很显然用其他寡核苷酸可以建立其他分型表。
表6
| 探针 | 1 | 5 | 43 | 9 | 10 | 14 | 17 | 44 | 45 | 46 | 48 | 47 | 28 | 24 | 27 | 52 | 37 | 55 | 42 | 42bis |
| 类别 | ||||||||||||||||||||
| DRB1*0101DRB1*0102DRB1*0103 | + | |||||||||||||||||||
| + | + | |||||||||||||||||||
| + | + | |||||||||||||||||||
| DRB5*0101DRB5*0102DRB5*0201/0202 | + | + | ||||||||||||||||||
| + | ||||||||||||||||||||
| + | + | |||||||||||||||||||
| DRB1*0301DRB1*0302 | + | + | +ou+ | |||||||||||||||||
| + | + | + | + | |||||||||||||||||
| DRB1*0401-0412DRB1*0402 | + | |||||||||||||||||||
| + | + | |||||||||||||||||||
| DRB1*1101/1104DRB1*1102/1103 | + | + | ||||||||||||||||||
| + | + | + | ||||||||||||||||||
| DRB1*12001/1202 | + | + | + | + | ||||||||||||||||
| DRB1*1301DRB1*1302DRB1*1303DRB1*1304DRB1*1305 | + | + | +ou+ | |||||||||||||||||
| + | + | + | ||||||||||||||||||
| + | + | |||||||||||||||||||
| + | + | |||||||||||||||||||
| + | + | |||||||||||||||||||
| DRB1*1401DRB1*1402DRB1*1403DRB1*1404DRB1*1405 | + | + | + | |||||||||||||||||
| + | + | + | ||||||||||||||||||
| + | + | + | + | |||||||||||||||||
| + | + | + | + | |||||||||||||||||
| + | + | |||||||||||||||||||
| DRB1*0701/0702 | + | |||||||||||||||||||
| DRB1*0801-0804 | + | + | ||||||||||||||||||
| DRB1*0901 | + | |||||||||||||||||||
| DRB1*1001 | + | |||||||||||||||||||
表6中括号中的代号是1991年组织相容性会议前对DRB5等位基因亚型的命名。
十号意指表6中该行的亚型与相应列中的探针杂交。
利用表6可以很容易地解析各种探针所得结果(杂交或不杂交)，例如用探针43、14、28和37得阳性反应的靶标相应于DRB1*0301/DRB1*07型。实施例5：检测探针的制备
按照实施例2，活化并真空干燥的寡核苷酸与0.1M硼酸钠缓冲液(pH9.3)200μl中的1.25×10-7 mol(5mg)辣根过氧化物酶(BOEHRINGER MANHEIM 413470)混合。
纯化方法相同：偶联物保存在-20℃50mM Tris-HCl缓中液，pH7.0，40％甘油中。
表7中列出了用于HLA-DR检测的不同偶联物。
表7
*Tr表示在实施例2中所述条件下与辣根过氧化物酶(HRP)相连寡核苷酸的HPLC保留时间(分)。(2M)指缓冲液B含有2M NaCl。**按应用生物系统公司的说明，通过测定260nM处的吸光度用紫外光度法以皮可摩尔定量寡核苷酸。按ATOR M.A.，《生物学化学杂志》，31，14954(1987)的方法在402nM处检测辣根过氧化物酶。oligo/HRP比是这两个值之比。***序列D2中的字母I指肌苷。序列D1中的(GT)指在该位置存在G和T两种碱基的等摩尔混合物。实施例6：遗传材料的制备
| 代号 | 序列5′-3′ *** | TR * | **oligo/HRP比 |
| D1 | CCGGGCGGTGAC(GT)GAGCTGGGGC | 11，88 (2M) | 1，4 |
| D2 | CCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC | 18，09 (2M) | 1，8 |
| D3 | GAACAGCCAGAAGGAC | 9，32 (2M) | 1 |
按以下实验方法在应用生物系统仪器上从全血提取核酸：将2-6ml全血加在TE缓中液(10mM Tris-HCl，pH8.00，1mM ED-TA)(加足至6m1)中并置于30ml萃液漏斗中。加入蛋白酶K的溶液(840单位，20mM Tris-HCl，pH8.5中)。整个混合物在55℃搅拌保温1小时。用苯酚/氯仿混合物同时萃取(8.5ml)2次除去存在的过量蛋白。于60℃搅拌混合物20分钟，除去有机相后再进行苯酚萃取。37℃下用氯仿(9.5ml)提取10分钟除去过量的苯酚。加入0.5ml3M醋酸钠(pH5.5)和13.5ml异丙醇沉淀水相中的DNA，然后回收在滤膜上。然后将DNA溶在1ml蒸馏水中，在260nM处分光光度法检测。实施例7：DNA扩增
按照下述步骤用聚合酶链反应(PCR)技术(MULLIS和FALOONA《酶学方法》155卷，335-350页)进行酶法扩增：
将总体积100μl下述缓冲液中的0.1-0.2μg纯化或未纯化的DNA加入Eppendorf管中：-10倍浓缩的PCR缓冲液10μl(500mM KCl、100mM Tris-HCl、pH8.3(20℃)、15mM MgCl2、0.1％明胶)-0.5μM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)2μl-相当于25pmol的每种引物2μl-Taq聚合酶(Perkin Elmer Cétus)1.5单位-蒸馏水(加足至100μl)-石蜡油50μl
将此管置于热循环仪(Thermocycler，Perkin Elner Cétus)中，在其中进行如下温度循环35个：-95℃变性0.5分钟-55℃杂交0.5分钟-72℃延伸0.5分钟
所用引物具有下列序列：
引物1＝5′-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3′
引物2＝5-TCGCCGCTGCACTGTGAAG-3′实施例8
将给定DR特异性的捕捉探针寡核苷酸在3×PBS(0.45M NaCl、0.15M磷酸钠，pH7.0)中的0.15μM浓度的溶液100μl置于聚苯乙烯微滴定板(Nunc 439454)的一个孔中。填充的孔数等于分型所需数目。
每次都应加入阳性对照以检验扩增步骤以及检测步骤的效力。用作阳性对照的捕捉探针存在于迄今已知的所有等位基因上，并具有下述序列：
5′-GGGGAGTACCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCT- 3′
用PBS/吐温300μl(0.15M NaCl、0.05M磷酸钠、pH7.0；0.5％吐温20(Merek 822184))洗板3次。如实施例7中所述的扩增产物(100μl)与2N NaOH 10μl室温下搅拌5分钟进行变性。向此溶液中相继加入2N醋酸10μl和体积等于n×50μl(n是分型所需捕捉探针的数目)的PEG缓中液(0.1M磷酸钠，pH7.0，0.5M NaCl，0.65％吐温20，0.14mg/ml鲑鱼精子DNA(Sigma D 9156)，2％PEG 4000(Merck 807490))。每孔中分配该溶液50μl，然后加入PEG缓中液中15nM浓度的检测探针(寡核苷酸-过氧化物酶偶联物)50μl。该板在37℃下保温1小时，用3×300μl PBS/吐温洗涤。向每孔中加入OPD缓冲液(0.05M柠檬酸，0.1M Na2HPO4，pH4.93)中4mg/ml OPD底物(邻苯二胺，剑桥医学生物技术货号/456)100μl(临用前向其中加入30体积稀释度为1/1000的H2O2)。反应20分钟后，用1 NH2SO4 100μl封阻酶活性，在Axia微读数器(bioMérieux)上读取492nm处的读数。实施例9
按实施例6中描述的方法制备的6种DNA用实施例7中所述方法扩增。
分型操作中包括下列捕捉探针：5′a-GATACTTCTATCACC 3′＝在5′末端带有配体的DR3特异性的寡核苷酸(编号545)，5′GATACTTCTATCACC 3′＝不带配体的相同序列的寡核苷酸(编号545nu)， 5′a-TGGACAACTACTG 3′＝5′-末端带有配体的DR4特异性的寡核苷酸(编号546)，5′TGGACAACTACTG 3′＝不带配体的相同序列的寡核苷酸(编号546nu)。
按照实施例8中所述一般方法进行分型操作。
探针D1和D2(表7)的50％/50％混合物用作检测探针。
结果示于下表8中：
表8
| DNA | 类别 | DR3545 NU | DR3545 | DR4546 NU | DR4546 |
| 1 | DR11/DR11 | 0,019 | 0,025 | 0,021 | 0,025 |
| 2 | DR4/DR4 | 0,018 | 0,021 | 0,021 | 0,138 |
| 3 | DR8/DR7 | 0,017 | 0,022 | 0,019 | 0,019 |
| 4 | DR3/DR11 | 0,026 | 0,423 | 0,021 | 0,027 |
| 5 | DR3/DR4 | 0,023 | 0,176 | 0,026 | 0,296 |
| 6 | DR3/DR3 | 0,023 | 0,387 | 0,023 | 0,018 |
不带配体的两个探针没能区分这些DNA的特异性，而带有配体a的相同序列能够鉴别这些DNA的DR2和DR4特异性。实施例10
按实施例6所述方法制备的24种DNA用实施例7中所述方法扩增。
按照实施例8中所述一般方法进行分型操作。
探针D1和D2(表7)的50％/50％混合物用作检测探针。
在分型操作中包含下表9中所列的捕捉探针。
表9
分型结果示于表10中：
| 编号 | 代号 | 序列 5′-3′ |
| 1 | 563 | CTGGAAAGATGCA |
| 5 | 603 | CAGCAGGATAAGTATG |
| 43 | 571B | TGGACAACTACT |
| 9 | 545 | GATACTTCTATCACC |
| 10 | 398 | CCTGATGAGGAGTA |
| 14 | 591 | GGCAGGGTAAGTATAAG |
| 17 | 595 | GGCCCTGGTGGA |
| 44 | 574B | GCGGTATCTGCACA |
| 45 | 556B | GGAGGAGGTTAAG |
| 46 | 555B | TGAGACGAGC |
| 48 | 867B | GGAAGACAAGCG |
| 47 | 756B | GCGGAGGACTGG |
| 28 | 802 | CCAGGAGGGAACGT |
| 24 | 1066 | CTCTACGGGTGAGT |
| 27 | 1068 | ACACCTATTGCAGA |
| 52 | 997B | GAGCTGCGTAG |
| 37 | 1033 | TTCCTGGAGAGACAC |
| 55 | 986B | GGAGAGATACTTC |
| 42 | 1060 | AGGGGATTGCGC |
表10
| 探针 | 1 | 5 | 43 | 9 | 10 | 14 | 17 | 44 | 45 | 46 | 48 | 47 |
| OLIGON° | 563 | 603 | 571-BSA | 545 | 398 | 591 | 595 | 574-BSA | 556-BSA | 555-BSA | 867-BSA | 756-BSA |
| DNA编号 | ||||||||||||
| 58 | 0,017 | 0,025 | 0,718 | 0,013 | 0,029 | 1,006 | 0,072 | 0,033 | 0,022 | 0,018 | 0,015 | 0,016 |
| 59 | 0,509 | 0,024 | 0,036 | 0,016 | 0,029 | 0,929 | 0,072 | 0,031 | 0,025 | 0,018 | 0,037 | 0,018 |
| 63 | 0,014 | 0,021 | 0,030 | 0,011 | 0,024 | 0,050 | 0,030 | 0,033 | 0,023 | ＞2,500 | 0,016 | 0,024 |
| 66 | 0,012 | 0,027 | 0,066 | 0,015 | 0,023 | 0,992 | 0,098 | 0,031 | 0,024 | 0,022 | 0,060 | 0,016 |
| 67 | 0,468 | 0,089 | 0,035 | 0,042 | ＞2,500 | 0,054 | 0,030 | 0,032 | 0,028 | ＞2,500 | 0,042 | 0,015 |
| 68 | 0,017 | 0,049 | 0,037 | 0,025 | 0,017 | 0,826 | 0,068 | 0,031 | 0,024 | ＞2,500 | 0,120 | 0,016 |
| 70 | 0,504 | 0,018 | 0,027 | 0,020 | 0,076 | 0,016 | 0,017 | 0,033 | 0,031 | 0,017 | 0,070 | 1,674 |
| 71 | 0,011 | 0,017 | 0,031 | 0,025 | ＞2,500 | 0,019 | 0,030 | 0,032 | 0,030 | ＞2,500 | 0,020 | 0,021 |
| 72 | 0,459 | 1,373 | 0,046 | 0,025 | 0,031 | 0,085 | 0,015 | 0,044 | 0,037 | 0,017 | 0,017 | 0,019 |
| 73 | 0,353 | 0,890 | 0,034 | 0,018 | 0,016 | 0,048 | 0,021 | 0,044 | 0,034 | 0,019 | 0,015 | 0,017 |
| 75 | 0,019 | 0,052 | 0,625 | 1,113 | 0,044 | 0,043 | 0,023 | 0,033 | 0,038 | 0,019 | 0,018 | 0,017 |
| 78 | 0,015 | 0,037 | 0,625 | 0,015 | 0,032 | 0,589 | 0,046 | 0,034 | 0,031 | 0,015 | 0,048 | 0,019 |
| 79 | 0,014 | 0,012 | 0,425 | 0,013 | 0,030 | 0,010 | 0,015 | 0,033 | 0,028 | ＞2,500 | 0,039 | 0,017 |
| 80 | 0,018 | 0,752 | 0,041 | 0,025 | 0,016 | 0,448 | 0,040 | 0,045 | 0,030 | 0,021 | 0,036 | 0,016 |
| 83 | 0,014 | 0,959 | 0,030 | 0,022 | 0,017 | 0,042 | 0,536 | 0,050 | 0,028 | 0,073 | 0,023 | 0,021 |
| 84 | 0,007 | 0,013 | 0,023 | 0,399 | 0,015 | 0,013 | 0,014 | 0,031 | 0,028 | 1,210 | 0,042 | 0,016 |
| 85 | 0,015 | 0,013 | 0,468 | 0,014 | 0,010 | 0,018 | 0,016 | 0,076 | 0,034 | ＞2,500 | 0,012 | 0,019 |
| 86 | 0,019 | 0,747 | 0,035 | 0,939 | 0,023 | 0,056 | 0,018 | 0,041 | 0,029 | 0,021 | 0,070 | 0,021 |
| 87 | 0,016 | 1,190 | 0,035 | 0,016 | 0,013 | 0,046 | 0,014 | 0,043 | 0,029 | ＞2,500 | 0,025 | 0,019 |
| 89 | 0,012 | 0,032 | 0,026 | 0,956 | 0,015 | 0,021 | 0,018 | 0,032 | 0,028 | 0,017 | 0,014 | 0,019 |
| 90 | 0,355 | 0,035 | 0,031 | 1,028 | 0,042 | 0,038 | 0,023 | 0,035 | 0,036 | 0,017 | 0,016 | 0,022 |
| 91 | 0,866 | 0,008 | 0,016 | 0,014 | 0,040 | 0,036 | 0,015 | 0,014 | 0,032 | 0,020 | 0,018 | 0,019 |
| 92 | 0,401 | 0,015 | 0,019 | 0,013 | 0,010 | 0,012 | 0,026 | 0,021 | 0,019 | 0,018 | 0,014 | 0,025 |
| 95 | 0,010 | 0,011 | 0,048 | 0,037 | 0,010 | 0,017 | 0,023 | 0,042 | 0,016 | 1,931 | 1,973 | 0,024 |
表10(续)
| 探针 | 28 | 24 | 27 | 52 | 37 | 55 | 42 | |||
| OLIGON° | 802 | 1066 | 1068 | 997,BSA | 1033 | 986-BSA | 1060 | 对照+ | ||
| DNA编号 | DNA号 | 分类 | ||||||||
| 58 | 0,083 | 0,026 | 0,026 | 0,050 | 0,759 | 0,028 | 0,024 | ＞2,500 | 58 | DRB1*0301/DRB1*07DRB1*0101-0102/DRB1*07DRB1*12/DRB1*1301DRB1*07/-DRB1*01/DRB1*11DRB1*07/DRB1*1302DRB1*1401/DRB1*0101-0102DRB1*11/DRB1*1301DRB1*0101/DRB5*0101DRB1*0101/DRB5*0101DRB1*0301/DRB1*04DRB1*0301/DRB1*07DRB1*0301/DRB1*1301DRB1*07/DRB5*0101DRB1*08/DRB5*0101DRB1*04/DRB1*1302DRB1*03/DRB1*13DRB1*04/DRB5*0201-0202DRB1*1301/DRB5*0201-0202DRB1*04/DRB1*12DRB1*0101/DRB1*04DRB1*0101/-DRB1*0101/DRB1*1402DRB1*1302/DRB1*1303 |
| 59 | 0,020 | 0,022 | 0,039 | 0,048 | 0,035 | 0,023 | 0,019 | ＞2,500 | 59 | |
| 63 | 0,083 | 0,881 | 0,584 | 0,777 | 1,194 | 0,026 | 0,030 | ＞2,500 | 63 | |
| 66 | 0,024 | 0,023 | 0,015 | 0,036 | 0,030 | 0,025 | 0,022 | ＞2,500 | 66 | |
| 67 | 0,028 | 0,028 | 0,032 | 0,041 | 0,893 | 0,026 | 0,026 | ＞2,500 | 67 | |
| 68 | 0,107 | 0,015 | 0,039 | 0,050 | 0,105 | 0,214 | 0,025 | ＞2,500 | 68 | |
| 70 | 0,024 | 0,028 | 0,846 | 0,058 | 0,952 | 0,028 | 0,024 | ＞2,500 | 70 | |
| 71 | 0,088 | 0,022 | 0,046 | 0,058 | 2,363 | 0,048 | 0,023 | ＞2,500 | 71 | |
| 72 | 0,028 | 0,024 | 0,042 | 0,074 | 0,070 | 0,017 | 0,446 | ＞2,500 | 72 | |
| 73 | 0,024 | 0,023 | 0,030 | 0,135 | 0,045 | 0,018 | 0,424 | ＞2,500 | 73 | |
| 75 | 0,099 | 0,029 | 0,025 | 0,729 | 0,031 | 0,017 | 0,021 | ＞2,500 | 75 | |
| 78 | 0,095 | 0,013 | 0,026 | 0,060 | 0,813 | 0,015 | 0,020 | ＞2,500 | 78 | |
| 79 | 0,117 | 0,028 | 0,034 | 0,744 | 0,912 | 0,019 | 0,019 | ＞2,500 | 79 | |
| 80 | 0,030 | 0,021 | 0,066 | 0,040 | 0,045 | 0,014 | 0,412 | ＞2,500 | 80 | |
| 83 | 0,040 | 2,096 | 0,060 | 0,038 | 0,058 | 0,023 | 0,501 | ＞2,500 | 83 | |
| 84 | 0,152 | 0,021 | 0,049 | 0,041 | 0,011 | 0,210 | 0,019 | ＞2,500 | 84 | |
| 85 | 0,219 | 0,070 | 0,040 | 0,612 | 0,038 | 0,168 | 0,024 | ＞2,500 | 85 | |
| 86 | 0,030 | 0,024 | 0,055 | 0,100 | 0,036 | 0,034 | 0,022 | ＞2,500 | 86 | |
| 87 | 0,183 | 0,048 | 0,096 | 0,595 | 0,047 | 0,015 | 0,024 | ＞2,500 | 87 | |
| 89 | 0,026 | 0,617 | 0,301 | 0,042 | 0,567 | 0,019 | 0,024 | ＞2,500 | 89 | |
| 90 | 0,026 | 0,024 | 0,032 | 0,042 | 0,016 | 0,018 | 0,026 | ＞2,500 | 90 | |
| 91 | 0,028 | 0,026 | 0,042 | 0,048 | 0,032 | 0,014 | 0,025 | ＞2,500 | 91 | |
| 92 | 0,156 | 0,039 | 0,028 | 1,157 | 0,021 | 0,312 | 0,023 | ＞2,500 | 92 | |
| 95 | 0,154 | 0,079 | 0,028 | 1,224 | 0,023 | 0,302 | 0,022 | ＞2,500 | 95 | |
所述方法使我们对24种试验DNA进行了清楚无疑的分类。实施例11：
本发明中所述HLA-DR分型方法中的优选杂交温度为37℃。但这一杂交温度可以改变。
下述实施例与实施例10相同，只是杂交温度从37℃改为45℃。对11种DNA进行分型。
所用的捕捉探针示于下表11中：
表11
| 编号 | 代号 | 序列 5′-3′ |
| 1 | 563 | CTGGAAAGATGCA |
| 5 | 603 | CAGCAGGATTAAGTATG |
| 43 | 571B | TGGACAACTACT |
| 9 | 545 | GATACTTCTATCACC |
| 10 | 398 | CCTGATGAGGAGTA |
| 14 | 591 | GGCAGGGTAAGTATAAG |
| 17 | 595 | GGCCCTGGTGGA |
| 44 | 574B | GCGGTATCTGCACA |
| 45 | 556B | GGAGGAGGTTAAG |
| 46 | 555B | TGGAAGACGAGC |
| 48 | 867B | GGAAGACAAGCG |
| 47 | 756B | GCGGAGCACTGG |
| 28 | 802 | CCAGGAGGAGAACGT |
分型结果示于表12中：
表12
实施例12
| 探针 | 1 | 5 | 43 | 9 | 10 | 14 | 17 | 44 | 45 |
| OLIGON° | 563 | 603 | 571-BSA | 545 | 398 | 591 | 595 | 574-BSA | 556-BSA |
| DNA编号 | |||||||||
| 71 | 0,003 | 0,003 | 0,025 | 0,006 | 0,805 | 0,004 | 0,008 | 0,003 | 0,033 |
| 72 | 0,099 | 1,200 | 0,035 | 0,002 | 0,005 | 0,012 | 0,007 | 0,008 | 0,039 |
| 73 | 0,099 | 1,035 | 0,023 | 0,001 | 0,007 | 0,012 | 0,007 | 0,009 | 0,036 |
| 75 | 0,005 | 0,022 | 0,114 | 0,171 | 0,009 | 0,013 | 0,009 | 0,004 | 0,040 |
| 78 | 0,005 | 0,014 | 0,126 | 0,001 | 0,006 | 0,704 | 0,008 | 0,003 | 0,037 |
| 79 | 0,007 | 0,005 | 0,148 | 0,006 | 0,007 | 0,007 | 0,009 | 0,005 | 0,036 |
| 80 | 0,007 | 1,135 | 0,025 | 0,003 | 0,008 | 0,525 | 0,008 | 0,009 | 0,044 |
| 83 | 0,008 | 1,012 | 0,020 | 0,008 | 0,011 | 0,029 | 0,060 | 0,022 | 0,058 |
| 84 | 0,009 | 0,011 | 0,022 | 0,194 | 0,010 | 0,020 | 0,019 | 0,015 | 0,053 |
| 85 | 0,009 | 0,006 | 0,102 | 0,003 | 0,012 | 0,022 | 0,020 | 0,016 | 0,058 |
| 86 | 0,004 | 0,924 | 0,022 | 0,182 | 0,011 | 0,033 | 0,021 | 0,018 | 0,067 |
| 探针 | 46 | 48 | 47 | 28 | ||
| OLIGON° | 555-BSA | 867-BSA | 756-BSA | 802 | 对照+ | 分类 |
| DNA编号 | DRB1*11/DRB1*1301DRB1*0101/DRB5*0101DRB1*0101/DRB5*0101DRB1*0301/DRB1*04DRB1*0301/DRB1*07DRB1*0301/DRB1*1301DRB1*07/DRB5*0101DRB1*08/DRB5*0101DRB1*04/DRB1*1302DRB1*03/DRB1*13DRB1*04/DRB5*0201-0202 | |||||
| 71 | 0,583 | 0,016 | 0,009 | 0,039 | ＞2,500 | |
| 72 | 0,012 | 0,010 | 0,009 | 0,013 | ＞2,500 | |
| 73 | 0,005 | 0,011 | 0,013 | 0,017 | ＞2,500 | |
| 75 | 0,011 | 0,007 | 0,010 | 0,045 | ＞2,500 | |
| 78 | 0,005 | 0,005 | 0,006 | 0,062 | ＞2,500 | |
| 79 | 0,790 | 0,013 | 0,009 | 0,122 | ＞2,500 | |
| 80 | 0,010 | 0,012 | 0,008 | 0,016 | ＞2,500 | |
| 83 | 0,029 | 0,021 | 0,021 | 0,040 | ＞2,500 | |
| 84 | 0,452 | 0,020 | 0,019 | 0,166 | ＞2,500 | |
| 85 | 0,564 | 0,023 | 0,021 | 0,244 | ＞2,500 | |
| 86 | 0,017 | 0,017 | 0,020 | 0,038 | ＞2,500 | |
如实施例8中所述，HLA-DR分型中所用的优选杂交缓冲液(称为PEG缓冲液)具有如下组成：0.1M磷酸钠，pH7，0.5M NaCl，0.65％吐温20，0.14mg/ml鲑鱼精子DNA(Sigma D9156)，2％PEG4000(Merck 807490)。
使用了含有甲酰胺(终浓度10％)的相同缓中液。已知甲酰胺能使杂交温度降低。
如果在甲酰胺存在下仍在37℃下进行杂交，则检测特异性应提高。
对实施例10中所述的24种DNA进行分型。
所用的捕捉探针和所得值示于下表13中。
表13
| 探针 | 1 | 5 | 43 | 9 | 10 | 14 | 17 | 44 | 45 | 46 | 48 | 47 |
| OLIGON° | 563 | 603 | 571-BSA | 545 | 398 | 591 | 595 | 574-BSA | 556-BSA | 555-BSA | 867-BSA | 756-BSA |
| DNA编号 | ||||||||||||
| 58 | 0,004 | 0,015 | 0,075 | 0,005 | 0,005 | 0,467 | 0,005 | 0,005 | 0,008 | 0,008 | 0,020 | 0,008 |
| 59 | 0,084 | 0,015 | 0,016 | 0,004 | 0,005 | 0,426 | 0,007 | 0,006 | 0,007 | 0,008 | 0,018 | 0,007 |
| 63 | 0,009 | 0,008 | 0,019 | 0,008 | 0,010 | 0,007 | 0,006 | 0,008 | 0,009 | 0,351 | 0,020 | 0,009 |
| 66 | 0,007 | 0,022 | 0,017 | 0,009 | 0,008 | 0,684 | 0,005 | 0,006 | 0,005 | 0,009 | 0,018 | 0,008 |
| 67 | 0,118 | 0,039 | 0,017 | 0,015 | 0,356 | 0,027 | 0,008 | 0,004 | 0,004 | 0,343 | 0,016 | 0,004 |
| 68 | 0,010 | 0,015 | 0,020 | 0,010 | 0,009 | 0,445 | 0,004 | 0,002 | 0,008 | 0,332 | 0,012 | 0,007 |
| 70 | 0,105 | 0,009 | 0,016 | 0,010 | 0,010 | 0,011 | 0,009 | 0,008 | 0,009 | 0,008 | 0,014 | 0,340 |
| 71 | 0,007 | 0,007 | 0,018 | 0,011 | 0,393 | 0,010 | 0,006 | 0,007 | 0,012 | 0,344 | 0,015 | 0,005 |
| 72 | 0,085 | 0,395 | 0,018 | 0,008 | 0,008 | 0,007 | 0,007 | 0,009 | 0,015 | 0,007 | 0,018 | 0,004 |
| 73 | 0,094 | 0,353 | 0,017 | 0,010 | 0,009 | 0,012 | 0,006 | 0,008 | 0,005 | 0,007 | 0,019 | 0,008 |
| 75 | 0,009 | 0,014 | 0,062 | 0,132 | 0,010 | 0,011 | 0,005 | 0,004 | 0,008 | 0,008 | 0,020 | 0,009 |
| 78 | 0,006 | 0,009 | 0,074 | 0,011 | 0,008 | 0,415 | 0,006 | 0,012 | 0,006 | 0,004 | 0,012 | 0,006 |
| 79 | 0,005 | 0,006 | 0,043 | 0,005 | 0,004 | 0,005 | 0,007 | 0,005 | 0,009 | 0,388 | 0,014 | 0,005 |
| 80 | 0,003 | 0,213 | 0,013 | 0,003 | 0,002 | 0,211 | 0,008 | 0,006 | 0,010 | 0,011 | 0,012 | 0,008 |
| 83 | 0,007 | 0,391 | 0,015 | 0,005 | 0,005 | 0,005 | 0,023 | 0,008 | 0,012 | 0,015 | 0,010 | 0,004 |
| 84 | 0,004 | 0,008 | 0,013 | 0,110 | 0,005 | 0,007 | 0,003 | 0,006 | 0,005 | 0,410 | 0,018 | 0,002 |
| 85 | 0,007 | 0,007 | 0,033 | 0,007 | 0,006 | 0,006 | 0,006 | 0,003 | 0,008 | 0,371 | 0,018 | 0,005 |
| 86 | 0,009 | 0,203 | 0,020 | 0,081 | 0,007 | 0,005 | 0,005 | 0,005 | 0,009 | 0,048 | 0,016 | 0,005 |
| 87 | 0,008 | 0,289 | 0,015 | 0,009 | 0,008 | 0,008 | 0,006 | 0,004 | 0,004 | 0,323 | 0,014 | 0,006 |
| 89 | 0,008 | 0,010 | 0,015 | 0,091 | 0,002 | 0,004 | 0,007 | 0,005 | 0,012 | 0,009 | 0,013 | 0,007 |
| 90 | 0,033 | 0,007 | 0,015 | 0,075 | 0,003 | 0,009 | 0,007 | 0,004 | 0,001 | 0,008 | 0,014 | 0,008 |
| 91 | 0,077 | 0,006 | 0,013 | 0,006 | 0,005 | 0,006 | 0,009 | 0,006 | 0,013 | 0,009 | 0,015 | 0,002 |
| 92 | 0,042 | 0,009 | 0,013 | 0,009 | 0,006 | 0,007 | 0,008 | 0,009 | 0,005 | 0,012 | 0,017 | 0,003 |
| 95 | 0,005 | 0,004 | 0,015 | 0,006 | 0,006 | 0,006 | 0,008 | 0,002 | 0,008 | 0,319 | 0,308 | 0,005 |
表13(续)
| 探针 | 28 | 24 | 27 | 52 | 37 | 42 | ||||
| OLIGON° | 802 | 1066 | 1068 | 997-BSA | 1033 | 1060 | 对照+ | |||
| DNA编号 | DNA编号 | 分类 | ||||||||
| 58 | 0,036 | 0,005 | 0,001 | 0,004 | 0,207 | 0,009 | ＞2,500 | 58 | DRB1*0301/DRB1*07DRB1*0101-0102/DRB1*07DRB1*12/DRB1*1301DRB1*07/-DRB1*01/DRB1*11DRB1*07/DRB1*1302DRB1*1401/DRB1*0101-0102DRB1*11/DRB1*1301DRB1*0101/DRB5*0101DRB1*0101/DRB5*0101DRB1*0301/DRB1*04DRB1*0301/DRB1*07DRB1*0301/DRB1*1301DRB1*07/DRB5*0101DRB1*08/DRB5*0101DRB1*04/DRB1*1302DRB1*03/DRB1*13DRB1*04/DRB5*0201-0202DRB1*1301/DRB5*0201-0202DRB1*04/DRB1*12DRB1*0101/DRB1*04DRB1*0101/-DRB1*0101/DRB1*1402DRB1*1302/DRB1*1303 | |
| 59 | 0,002 | 0,006 | 0,008 | 0,004 | 0,009 | 0,010 | ＞2,500 | 59 | ||
| 63 | 0,026 | 0,115 | 0,058 | 0,029 | 0,261 | 0,011 | ＞2,500 | 63 | ||
| 66 | 0,007 | 0,005 | 0,007 | 0,008 | 0,012 | 0,010 | ＞2,500 | 66 | ||
| 67 | 0,009 | 0,005 | 0,008 | 0,009 | 0,251 | 0,024 | ＞2,500 | 67 | ||
| 68 | 0,036 | 0,006 | 0,009 | 0,010 | 0,016 | 0,011 | ＞2,500 | 68 | ||
| 70 | 0,008 | 0,004 | 0,055 | 0,008 | 0,199 | 0,009 | ＞2,500 | 70 | ||
| 71 | 0,034 | 0,003 | 0,005 | 0,009 | 0,539 | 0,008 | ＞2,500 | 71 | ||
| 72 | 0,010 | 0,009 | 0,006 | 0,004 | 0,009 | 0,130 | ＞2,500 | 72 | ||
| 73 | 0,010 | 0,009 | 0,005 | 0,005 | 0,010 | 0,150 | ＞2,500 | 73 | ||
| 75 | 0,038 | 0,008 | 0,008 | 0,021 | 0,014 | 0,010 | ＞2,500 | 75 | ||
| 78 | 0,041 | 0,007 | 0,004 | 0,007 | 0,254 | 0,015 | ＞2,500 | 78 | ||
| 79 | 0,064 | 0,007 | 0,006 | 0,028 | 0,315 | 0,012 | ＞2,500 | 79 | ||
| 80 | 0,007 | 0,008 | 0,009 | 0,008 | 0,011 | 0,142 | ＞2,500 | 80 | ||
| 83 | 0,010 | 0,166 | 0,007 | 0,009 | 0,017 | 0,159 | ＞2,500 | 83 | ||
| 84 | 0,050 | 0,006 | 0,008 | 0,010 | 0,014 | 0,009 | ＞2,500 | 84 | ||
| 85 | 0,063 | 0,009 | 0,007 | 0,036 | 0,009 | 0,011 | ＞2,500 | 85 | ||
| 86 | 0,014 | 0,008 | 0,004 | 0,011 | 0,010 | 0,010 | ＞2,500 | 86 | ||
| 87 | 0,042 | 0,007 | 0,005 | 0,028 | 0,007 | 0,004 | ＞2,500 | 87 | ||
| 89 | 0,008 | 0,068 | 0,039 | 0,005 | 0,201 | 0,006 | ＞2,500 | 89 | ||
| 90 | 0,008 | 0,011 | 0,009 | 0,006 | 0,010 | 0,009 | ＞2,500 | 90 | ||
| 91 | 0,010 | 0,010 | 0,006 | 0,008 | 0,009 | 0,011 | ＞2,500 | 91 | ||
| 92 | 0,040 | 0,007 | 0,012 | 0,028 | 0,018 | 0,012 | ＞2,500 | 92 | ||
| 95 | 0,035 | 0,008 | 0,009 | 0,030 | 0,017 | 0,009 | ＞2,500 | 95 | ||
优选的杂交温度为37℃、优选的杂交缓冲液是PEG缓中液，但如实施例11和12中的结果所示，杂交温度和杂交缓冲液都可以改变。
从以上描述可以清楚看出，本发明综合了下列优点：
可以分辨所有等位基因的最佳特异性，
实施简便，比血清分析的费用低，
操作迅速，扩增后约90分钟得到结果，相当于总时间少于12小时，这对肾提供者是至关重要的，
与个体分型的相容性，这对急诊分型和在小实验室中的应用很重要，
信号可用光密度定量，适当时可用简单的计算机化系统处理结果，适应于自动化系统。实施例13
类似于上述方法，制备了相应于编号为101、102、103、104、115和111的寡核苷酸的捕捉探针。
当这些探针用作捕捉探针时，它们识别说明书中指出的那些特异性。
另外，本发明的捕捉探针可与下列检测探针一起使用：
-GCGGTGACGGAGCTGG
-GAACAGCCAGAAGGAC.
Claims (13)
1.选自下组的核酸探针：-TGGCAGCTTAAGTTT-CCTAAGAGGGAGTG-GCGAGTGTGGAACCT-AAGACAGGCGGGC，或其互补序列。
2.能进行HLR DR分型的一套寡核苷酸探针，其包括至少一种选自下组的探针：-TGGCAGCTTAAGTTT-CCTAAGAGGGAGTG-GCGAGTGTGGAACCT-AAGACAGGCGGGC，或其互补序列。
3.根据权利要求2的一套探针，其还含有至少一种选自下组的探针：-GTGGACAACTACTG-GATACTTCTATCACCAA-GCCTGATGAGGAGTAC-TGGCAGGGTAAGTATAAG-GGGCCCTGGTGGACA-TGCGGTATCTGCACA-GGAGGAGGTTAAGTT-CTGGAAGACGAGCG-TGGAAGACAAGCGG-TGCGGAGCACTGGA-AACCAGGAGGAGAACGTG-ACTCTACGGGTGAGTG-GACACCTATTGCAGAC，下划线部分相当于最小序列，或其互补序列。
4.根据权利要求3的一套探针，其含有选自下组的至少一种探针：-TGGACAACTACT-GATACTTCTATCACC-CCTGATGAGGAGTA-GGCAGGGTAAGTATAAG-GGCCCTGGTGGA-GCGGTATCTGCACA-GGAGGAGGTTAAGTT-TGGAAGACGAGC-GGAAGACAAGCG-GCGGAGCACTGG-AACCAGGAGGAGAACGT-CTCTACGGGTGAGT-ACACCTATTGCAGA，或其互补序列。
5.根据权利要求2或3的一套探针，其还含有选自下组的至少一种探针：-GAGGAGGACTTGCGCT-TACGGGGCTGTGGAG-GGAGCTGCGTAAGT-TTCCTGGAGAGACAC-GGGGAGAGATACTTCC，或其互补序列。
6.根据权利要求5的一套探针，其含有选自下组的至少一种探针：AGGAGGACTTGCGC-ACGGGGCTGTGGA-GAGCTGCGTAAGTTCCTGGAGAGACAC-GGAGAGATACTTC，或其互补序列。
7.根据权利要求2-6任一项的一套探针，其含有探针：
-AACCAGIAGGAGAACGT.或其互补序列。
8.根据权利要求2-7任一项的一套探针，其还含有下列探针的至少一种：GCGGTGACGGAGCTGGGAACAGCCAGAAGGACCCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC，或其互补序列。
9.按标准寡核苷酸分型技术从个体样品测定个体HLA-DR类型的方法，其特征在于使用权利要求2-8任一项定义的一套探针的至少一部分作为捕捉探针或检测探针。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述探针选自权利要求2-7任一项中提到的那些。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于所述探针用作捕捉探针。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于它包括下列步骤：--将每种捕捉探针固定在固体载体上，--在若靶标中存在与探针互补的序列则可发生杂交的预定条件下，使每种固定化捕捉探针与含有至少一种核酸靶片段的液体介质接触，和--检测可能形成的杂交体的存在。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于在37℃温度下进行每种固定化捕捉探针与含至少一种核酸靶片段的液体介质接触的步骤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/485,133 US5976789A (en) | 1991-07-17 | 1995-06-07 | System of probes enabling HLA-DR typing to be performed, and typing method using said probes |
| US08/485,133 | 1995-06-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1159211A true CN1159211A (zh) | 1997-09-10 |
Family
ID=23927027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN96190783A Pending CN1159211A (zh) | 1995-06-07 | 1996-06-03 | 用于hladr分型的探针系统和用该探针分型的方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5976789A (zh) |
| EP (1) | EP0772694A1 (zh) |
| JP (1) | JP3384806B2 (zh) |
| KR (1) | KR970704891A (zh) |
| CN (1) | CN1159211A (zh) |
| AU (1) | AU717296B2 (zh) |
| CA (1) | CA2196921A1 (zh) |
| IL (1) | IL120158A (zh) |
| NO (1) | NO970518L (zh) |
| NZ (1) | NZ311058A (zh) |
| PL (1) | PL184298B1 (zh) |
| WO (1) | WO1996040989A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113862342A (zh) * | 2021-11-23 | 2021-12-31 | 厦门倍博特医学科技有限公司 | 用于hla-dr*13基因检测的引物组、探针、试剂盒及其方法 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7094766B1 (en) | 1995-06-06 | 2006-08-22 | Trustees Of Boston University | Use of locally applied DNA fragments |
| US6147056A (en) * | 1995-06-06 | 2000-11-14 | Trustees Of Boston University | Use of locally applied DNA fragments |
| US20030032610A1 (en) | 1996-06-03 | 2003-02-13 | Gilchrest Barbara A. | Method to inhibit cell growth using oligonucleotides |
| US20020022261A1 (en) * | 1995-06-29 | 2002-02-21 | Anderson Rolfe C. | Miniaturized genetic analysis systems and methods |
| EP0953650A1 (en) | 1998-04-20 | 1999-11-03 | Innogenetics N.V. | Method for typing of HLA alleles |
| US6322976B1 (en) * | 1998-05-28 | 2001-11-27 | Medical Research Council | Compositions and methods of disease diagnosis and therapy |
| FR2793809B1 (fr) * | 1999-05-20 | 2006-07-28 | Biomerieux Sa | Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient a au moins une maladie et amplification adaptee a un tel procede |
| US6258593B1 (en) * | 1999-06-30 | 2001-07-10 | Agilent Technologies Inc. | Apparatus for conducting chemical or biochemical reactions on a solid surface within an enclosed chamber |
| HK1054184A1 (zh) | 2000-03-31 | 2003-11-21 | Trustees Of Boston University | 局部應用dna片斷的用途 |
| GB0016836D0 (en) * | 2000-07-07 | 2000-08-30 | Lee Helen | Improved dipstick assays (1) |
| WO2005063985A1 (en) | 2003-12-25 | 2005-07-14 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe set and method for identifying hla allele |
| JP4416492B2 (ja) * | 2003-12-25 | 2010-02-17 | キヤノン株式会社 | Ｈｌａ−ｄｒアレルを同定するためのプローブセット及び特定方法 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6194561B1 (en) * | 1986-03-13 | 2001-02-27 | Roche Molecular Systems, Inc. | Characterization and detection of sequences associated with autoimmune diseases |
| US5310893A (en) * | 1986-03-31 | 1994-05-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for HLA DP typing |
| US5567809A (en) * | 1986-03-13 | 1996-10-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods and reagents for HLA DRbeta DNA typing |
| WO1992010589A1 (en) * | 1990-12-06 | 1992-06-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods and reagents for hla drbeta dna typing |
| CA1284931C (en) * | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| US4965189A (en) * | 1986-07-01 | 1990-10-23 | University Of Massachusetts Medical School | Probes for the determination of the proclivity for development of autoimmune diseases |
| ATE88762T1 (de) * | 1986-08-11 | 1993-05-15 | Siska Diagnostics Inc | Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden. |
| DE69032847T2 (de) * | 1989-06-30 | 1999-05-12 | Chiron Corp., Emeryville, Calif. | Hydrophobe Nukleinsäure-Sonde |
| JPH03164180A (ja) * | 1989-08-10 | 1991-07-16 | Noboru Kashiwagi | 新規なｄｎａ塩基配列およびその用途 |
| GB9002625D0 (en) * | 1990-02-06 | 1990-04-04 | Univ Singapore | Human leukocyte antigen typing |
| US5387505A (en) * | 1990-05-04 | 1995-02-07 | Eastman Kodak Company | Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage |
| CA2049449C (en) * | 1990-08-20 | 1999-08-10 | Fumiya Obata | Hla-dr antigen gene and its nucleotide sequence and its use |
| NL9002259A (nl) * | 1990-10-17 | 1992-05-18 | Eurodiagnostics B V | Werkwijze voor het bepalen van een genotype door het vergelijken van de nucleotidensequentie van leden van een genfamilie, alsmede kit voor het opsporen van genetische variaties. |
| CA2101065A1 (en) * | 1991-01-22 | 1992-07-23 | Mark D. Howell | Vaccination and methods against diseases resulting from pathogenic responses by specific t cell populations |
| FR2679252B1 (fr) * | 1991-07-17 | 1993-12-10 | Bio Merieux | Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes. |
| JPH07500734A (ja) * | 1991-10-31 | 1995-01-26 | ユニヴァーシティ オブ ピッツバーグ | オリゴヌクレオチドプローブのポリマーを用いる核酸配列の検出方法 |
-
1995
- 1995-06-07 US US08/485,133 patent/US5976789A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-06-03 WO PCT/FR1996/000836 patent/WO1996040989A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1996-06-03 AU AU62289/96A patent/AU717296B2/en not_active Ceased
- 1996-06-03 PL PL96318536A patent/PL184298B1/pl unknown
- 1996-06-03 IL IL12015896A patent/IL120158A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-06-03 NZ NZ311058A patent/NZ311058A/xx unknown
- 1996-06-03 EP EP96920893A patent/EP0772694A1/fr not_active Withdrawn
- 1996-06-03 CA CA002196921A patent/CA2196921A1/fr not_active Abandoned
- 1996-06-03 KR KR1019970700904A patent/KR970704891A/ko not_active Withdrawn
- 1996-06-03 JP JP50018397A patent/JP3384806B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-03 CN CN96190783A patent/CN1159211A/zh active Pending
-
1997
- 1997-02-05 NO NO970518A patent/NO970518L/no not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113862342A (zh) * | 2021-11-23 | 2021-12-31 | 厦门倍博特医学科技有限公司 | 用于hla-dr*13基因检测的引物组、探针、试剂盒及其方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU717296B2 (en) | 2000-03-23 |
| JP3384806B2 (ja) | 2003-03-10 |
| EP0772694A1 (fr) | 1997-05-14 |
| US5976789A (en) | 1999-11-02 |
| PL318536A1 (en) | 1997-06-23 |
| NO970518L (no) | 1997-04-07 |
| NO970518D0 (no) | 1997-02-05 |
| IL120158A (en) | 2000-06-29 |
| WO1996040989A1 (fr) | 1996-12-19 |
| IL120158A0 (en) | 1997-06-10 |
| JPH10506541A (ja) | 1998-06-30 |
| CA2196921A1 (fr) | 1996-12-19 |
| NZ311058A (en) | 1998-12-23 |
| PL184298B1 (pl) | 2002-09-30 |
| KR970704891A (ko) | 1997-09-06 |
| AU6228996A (en) | 1996-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0553247B1 (en) | Method of determining a genotype by comparing the nucleotide sequence of members of a gene family and kit therefor | |
| EP1291440A1 (en) | Kit and method for determining hla type | |
| US8969254B2 (en) | Oligonucleotide array for tissue typing | |
| AU2007313472B2 (en) | Population scale HLA-typing and uses thereof | |
| CN1159211A (zh) | 用于hladr分型的探针系统和用该探针分型的方法 | |
| CN87108073A (zh) | 采用杂交测定人体t细胞白血病病毒i和ii | |
| EP0870056B1 (en) | Method for identifying an unknown allele | |
| US20090143245A1 (en) | Microarrays for genotyping and methods of use | |
| MXPA01009773A (es) | Metodo para la amplificacion de alelos hla de clase i. | |
| EP1071825B1 (en) | Method for typing of hla alleles | |
| CN1351672A (zh) | 分析患者对至少一种疾病的遗传倾向性的方法和适应该方法的扩增 | |
| EP0515660A1 (en) | TYPES OF HLA DQBETA DNA. | |
| EP0549776B1 (fr) | Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes | |
| WO2017135396A1 (ja) | Ｐｃｒを用いないキャプチャー法によるｈｌａ遺伝子タイピング用プローブセット及びそれを用いたタイピング方法 | |
| CN1847852A (zh) | 单核苷酸多态性试纸条快速检测方法及其试纸条 | |
| Middleton | HLA typing from serology to sequencing era | |
| JP2004208586A (ja) | Ｈｌａの検出 | |
| JP4363561B2 (ja) | 豚の種別の判別法 | |
| CN1300337C (zh) | 一种细胞因子基因型检测芯片及其用途 | |
| CN101065483A (zh) | 碱基多态性的鉴定方法 | |
| El-Borai et al. | A practical approach to HLA-DR genomic typing by heteroduplex analysis and a selective cleavage at position 86 | |
| KR101374247B1 (ko) | 고해상도 ｍｉｃａ 대립유전자 검출용 ｓｐｒｅｘ―ｄｎａ 칩 키트 | |
| Trucco | Advancements in DNA Technology as Applied to the Study of the Human Histocompatibility Complex | |
| AU2013273684A1 (en) | Population scale hla-typing and uses thereof | |
| Lee | A Study of Genetic Polymorphisms of HLA-class I and II Genes Using Polymerase Chain Reaction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |