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WO1996040989A1 - Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes - Google Patents

Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes Download PDF

Info

Publication number
WO1996040989A1
WO1996040989A1 PCT/FR1996/000836 FR9600836W WO9640989A1 WO 1996040989 A1 WO1996040989 A1 WO 1996040989A1 FR 9600836 W FR9600836 W FR 9600836W WO 9640989 A1 WO9640989 A1 WO 9640989A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
probes
probe
typing
hla
complementary
Prior art date
Application number
PCT/FR1996/000836
Other languages
English (en)
Inventor
Patrice André ALLIBERT
Philippe Cros
Bernard François MACH
Bernard Fabien Mandrand
Jean-Marie Tiercy
Original Assignee
Bio Merieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Merieux filed Critical Bio Merieux
Priority to NZ311058A priority Critical patent/NZ311058A/xx
Priority to PL96318536A priority patent/PL184298B1/pl
Priority to AU62289/96A priority patent/AU717296B2/en
Priority to IL12015896A priority patent/IL120158A/xx
Priority to JP50018397A priority patent/JP3384806B2/ja
Priority to EP96920893A priority patent/EP0772694A1/fr
Priority to KR1019970700904A priority patent/KR970704891A/ko
Publication of WO1996040989A1 publication Critical patent/WO1996040989A1/fr
Priority to NO970518A priority patent/NO970518L/no

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • Probe system for performing HLA DR typing, and typing method using said probes.
  • the present invention relates to a method for determining the HLA class II genotype of an individual and relates more particularly to the detection of polymorphic HLA DR genes. This process is applicable in particular to HLA typing in transplantation, to medical diagnosis, to legal medicine, etc.
  • the HLA (human lymphocyte antigen) system is encoded by the major histocompatibility complex in humans. It constitutes a very important constraint during organ transplants between individuals by making a distinction between the self and the non-self.
  • HLA factors are involved in the predisposition to a large number of diseases.
  • the antigens of the HLA system have therefore been used in typing methods to determine the characteristics between donors and recipients during organ transplants (FH BACH and JJ VAN ROOD, N. Engl. J. Med., 295, pages 806- 13 (1976)), as well as an individual's predisposition to certain diseases.
  • the HLA system is well characterized and consists of a set of more or less polymorphic loci located in an interval of approximately 2 centimorgans (cM) on the short arm of chromosome 6.
  • cM centimorgans
  • HLA class II antigens represent a determining factor for the success of the transplant, that is to say to avoid graft rejection or the development of graft-host disease
  • the polymorphism of the expression products of the HLA D region genes is usually defined by serological techniques based on the analysis by alloantisera of the HLA gene products expressed on the surface of the cells (JJ Van Rood and A. Van Leeuwen ( 1963) J. Clin Invest 42,1382 - JJ Van Rood, A. Van Leeuwen, JJ Koning, AB Van Oud Ablas (1975) Tissue Antigens 5, 73).
  • the accuracy and reproducibility depend on the batches of will be available. However, even under the best conditions, a very large number of existing alleles cannot be detected by these serological techniques.
  • the limits of the serological analysis result essentially from the absence of monospecific alloantisera, from incomplete discrimination with cross-reactivities between very similar specificities, for example DR3 and DRwl3 or else from an altered expression of the HLA class II molecules. on the surface of cells, for example leukemia cells.
  • HLA class II polymorphism is distributed as follows: locus DRB1: 47 alleles, DRB3 locus: 4 alleles, DRB4 locus: 1 allele, DRB5 locus: 4 alleles, DQB1 locus: 17 alleles, DQA1 locus: 13 alleles, DPB1 locus: 21 alleles, DPA1 locus: 4.
  • DR4 * 0401-0411 The limits of serological typing can be illustrated by the serological specificity DR4, now subdivided into 11 subtypes (DRB1 * 0401-0411) (see JG Bodmer, SGE Marsh, ED Albert, WF Bodmer, B. Dupont, HA Erlich, B. Mach, WR Mayr, P. Parham, T. Sasazuki, GMT Schreuder, JL Strominger, A. Svejgaard and PI Terasaki (1991) Tissue Antigens 37, 97), identifiable only at the DNA sequence level.
  • DRwl3 and DRwl4 by some alloantisera actually contains 10 allelic sequences (DRB1 * 1301-1305 and DRB1 * 1401-1405 (see the publication of Bodmer JG cited above) which, here too, can only be discriminated by genotypic analysis at the DNA sequence level.
  • Genotypic analysis is a new approach for analyzing the diversity of the HLA class II system directly at the gene level.
  • the genotypic analysis is based on the principle of molecular hybridization and the first approach which was proposed is the so-called "RFLP" technique which consists in fragmenting DNA by using restriction enzymes and in analyzing the size of the fragments.
  • RFLP restriction enzymes
  • Specific DNA generated by these enzymes see CT Wake, EO Long and B. Mach (1982) Nature 300, 372 - J. Blhme, M; Andersson, G. Andersson, E. Miller, PA Peterson and L. Rask (1985 ) j. immunol 135, 2149 - JL Bidwell, EA Bidwell, DA Savage, D. Middleton, PT Klouda and BA Bradley (1988) Transplantation 45, 640).
  • RFLP analysis only recognizes some of the allelic differences undetectable by serology, and this technique still has limitations. Indeed, an allele carrying a different sequence is identifiable only if the different nucleotide is in the recognition site of the restriction enzyme used in the analysis and therefore a large number of HLA class II alleles will not be recognized by this analysis. In addition, the RFLP analysis rarely highlights a modification in a coding sequence, and does not provide information on the exact nature of the modification. Finally, this technique is long and cumbersome because it involves using relatively large quantities of nucleic acids which must be digested with several restriction enzymes, electrophoresis and transfers on filters.
  • oligonucleotide typing is the so-called "oligonucleotide typing" method. Thanks to the knowledge of the DNA sequences of HLA class II genes and in particular of the DR ⁇ genes, which are by far the most polymorphic, it is possible to use oligonucleotides which are specific for a given location of the gene sequence as tracers for the analysis of polymorphism by hybridization. These oligonucleotides are chosen so as to be as informative as possible and to allow the identification of the different alleles, on the basis of their sequence differences. In practice, any difference in sequence, even of a single nucleotide, can be detected.
  • oligonucleotide typing technique can be applied to DNA as well, as described in the publication by Angelini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 83, pages 4489 - 4493 (1986), than to the RNA (see C. Ucla, J.J. Van Rood, J. Gorski and B. Mach (1987) J. Clin. Invest. 80, 1155).
  • This new approach is based on the principle of molecular hybridization by using the characteristic properties of nucleic acids which are the possibilities of interacting with a complementary sequence via hydrogen bonds and thus of forming a stable hybrid, according to the laws.
  • known pairings i.e. A-T, GC for DNA and A-U, GC for RNA.
  • synthetic oligonucleotides corresponding to DNA or RNA sequences of known alleles can be used as probes to identify, in a sample, a nucleic sequence called target, containing a sequence complementary to that of the probe.
  • the labeling of the hybrid formed between the target and the probe allows the detection and quantification of the target in the sample.
  • This labeling is carried out by any known marker, such as an enzymatic, chemical or radioactive marker.
  • any known marker such as an enzymatic, chemical or radioactive marker.
  • the first application of typing by oligonucleotide for HLA class II was presented by Angelini et al. in the publication cited above, using the so-called "SOUTHERN" technique according to which the target DNA is deposited on a nylon membrane and the detection is carried out using a labeled oligonucleoditic probe. The technique was then applied to the detection of HLA class II alleles not identifiable by serology. routine (see JM Tiercy, J. Gorski, M. Jeannet and B. Mach (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 198 - JM Tiercy, J.
  • cell typing requires the detection of point mutations in the genome and involves the development of probes sensitive enough to detect and differentiate sequences homologous to a nucleotide closely, and it was found necessary to use short probes, generally of less than 30 nucleotides, which give the test a high specificity, while retaining a good sensitivity.
  • short probes generally of less than 30 nucleotides, which give the test a high specificity, while retaining a good sensitivity.
  • the use of short oligonucleotides provides a wide range of selectivity.
  • the method of the invention can be implemented using a set of nucleotide probes chosen so as to allow typing with a minimum number of probes.
  • This set of probes has the particular advantage of making it possible to operate at a single temperature, in particular at 37 ° C. (although it is possible to operate at another temperature, as will be seen in the experimental part below) after). Such a set of probes is also part of the invention.
  • the set of probes of the invention which will be defined below can be used in the form of detection probes (labeled with a usual tracer agent) in techniques of the Southern type, or, preferably, in the form of capture probes (sandwich or reverse dot blot technique) immobilized on a solid support, either by passive fixation (adsorption) directly or via a ligand), such as a hydrophobic ligand (see for example the patent application European No. 0 405 913), either by the establishment of at least one covalent bond which can be made here again directly or by the intermediary of a ligand capable of fixing covalently on the support (see for example the PCT patent application No. WO 88/01302).
  • the immobilization of the probes can be carried out either using known methods or using other methods which will be described below.
  • probes of the invention will be described mainly in the form of nucleotide sequences. It is obvious to a person skilled in the art that, even for probes intended to detect point mutations, at a given temperature, it is possible to envisage the use of probes of variable length (number of nucleotides), in to a certain extent, thanks in particular to the use of solutions, buffers which more or less promote the stability of the hybridization complexes.
  • the probes of the invention are therefore defined by a sequence which may generally be considered as maximum (in particular if it is desired to work at a relatively low temperature, for example at 37 ° C.), with in addition the indication of a minimum sequence which will still be usable at said temperature and which will be sensitive to a even a one-time mutation.
  • nucleotide probes which can be used in oligonucleotide typing techniques to perform HLA DR typing, these probes being chosen from the following:
  • the probe 101 makes it possible to identify the type DRB1 * 01.
  • the probe 102 makes it possible to identify the type DRB1 * 02.
  • the probe 103 makes it possible to identify the type DRB4 * 01 and the probe 104 is used in the identification of the type DRB1 * 1305.
  • the invention also relates to a set of nucleotide probes, or to an HLA type kit, comprising at least one probe chosen from among probes 101 to 104.
  • the subject of the invention is also such a set of probes further containing at least one probe chosen from the following:
  • the probe 111 is used in its complete form, including the two T not underlined at the 3 'end. It has the same specificity as probe 45.
  • Probe 115 is preferably used in the form of the underlined sequence increased by the two A's not underlined at the 5 'end. It has the same specificity as probe 28.
  • the probes 105 to 110, 112 to 114, 116 and 117 are preferably used in the form of the probes having in the experimental part below the reference numbers 43, 9, 10, 14, 17, 44, 46, 48, 47, 24 and 27.
  • the invention relates in particular to a set of probes as defined above, characterized in that it further comprises at least one of the following probes (the underlined part corresponding to the optimum sequence): - GAGGAGGACTTGCGCT - TACGGGGCTGTGGAG - GGAGCTGCGTAAGT
  • the specific probes indicated above can be used in particular as capture or detection probes. They are preferably used in the form of capture probes immobilized or immobilizable on a solid support.
  • the invention also relates to a method for determining the HLA DR ⁇ typing of an individual, according to the usual typing techniques by oligonucleotides, characterized in that one uses as capture or detection probes, either sequentially or simultaneously, at least part of the probes from the set of probes as defined above:
  • the process of the invention therefore essentially comprises the stages consisting:
  • the information collected is then used to determine the typing according to a pre-established typing plan, taking into account the probes used and knowledge of the HLA DR types and / or associated associated types.
  • This work is simplified by the use of a typing plan, that is to say in practice a table giving directly the types and / or sub-types according to the positive responses (hybridization (s)) observed.
  • a typing plan that is to say in practice a table giving directly the types and / or sub-types according to the positive responses (hybridization (s)) observed.
  • s hybridization
  • the invention relates in particular to a method as defined above, in which said probes are used as capture probes, this process being able to be characterized in that it comprises the steps consisting in: a) immobilizing each capture probe on a solid support, b) bringing each immobilized capture probe into contact with a liquid medium containing at least one target nucleic acid fragment, under predetermined conditions allowing hybridization if the sequence complementary to that of the probe is present in the target and c) detecting the presence of possibly formed hybrids.
  • the probes of the invention make it possible to detect both target fragments of RNA and of DNA.
  • all suitable probes in particular one of the probes described below in Example 5.
  • the capture probe When the capture probe is very short, that is to say less than 20 nucleotides and in particular less than 17 nucleotides, it becomes necessary to use means making it possible to improve the fixation of the probe on a solid support .
  • the attachment of the probe to the support is then carried out in the form of a derivative resulting from the covalent coupling of the probe with a ligand facilitating the attachment to the solid support.
  • the ligand which may comprise a hydrophobic part, is in particular a ligand comprising at least one polar functional group, for exercises an amino group.
  • the functional group can be used to fix the probe on the solid support by establishing a covalent bond. When the polar functional group does not react with the support, it improves the fixation by adsorption on the support, even if the support is hydrophobic.
  • the ligand is for example chosen from proteins and compounds as represented respectively by formulas I and II below:
  • Z represents an alkyl or alkenyl radical of 2 to 12 carbon atoms, linear or branched, unsubstituted or substituted by one or more groups chosen from hydroxy and / or amino groups, and m + represents in particular an alkali or ammonium ion.
  • This ligand is preferably coupled to the 5 'end of the nucleotide sequence of the capture probe
  • This ligand is preferably coupled to the 3 'end of the nucleotide sequence of the capture probe.
  • the ligand is a protein, for example an albumin is chosen, preferably bovine serum albumin, which can be coupled to the 5 ′ or 3 * end of the nucleotide sequence of the capture probe.
  • the support of the present invention can be any support making it possible to immobilize a nucleotide sequence or a derivative according to the invention, either by passive adsorption or by covalence.
  • the supports can be made of any material usually used such as nitrocellulose, nylon, paper, or preferably, a hydrophobic material such as a styrene polymer or a styrene-based copolymer comprising at least 10% by weight of styrene units. .
  • the solid support according to the invention can be without limitation in the form of a microtiter plate, a sheet, a tube, a cone, wells or the like.
  • a sample containing a nucleic acid is obtained from an individual whose HLA DR genotype is to be determined.
  • Any type of tissue containing HLA DR nucleic acid can be used in the context of the present invention. It is thus possible to use nucleic acid fragments (DNA or RNA) obtained after cutting by chemical, enzymatic or analogous means of the nucleic acid present in the sample of the individual.
  • the incorporation of a prior step of amplification of the target DNA or RNA can facilitate the oligonucleotide typing method of the present invention.
  • the principle of the analysis of the HLA polymorphism by hybridization of sequence-specific oligonucleotides remains the same, but a selective amplification step allows enrichment in target sequences, which simplifies the technique (RK Saiki, TL Bugawan, GT Horn, KB Mullis and HA Erlich (1986) Nature 324, 163 - JM Tiercy, M. Jeannet and B. Mach (1990) Eur. J. Immunol. 20, 237).
  • Amplification can be obtained either from DNA or from RNA. It is obvious to a person skilled in the art that the amplification of the HLA DR target sequences in a sample can be accomplished by any known method which makes it possible to obtain sufficient amplification so that the target sequence can be detected by hybridization of nucleic acid to a probe.
  • the nucleic acid in the sample will be DNA, most often genomic DNA.
  • the present invention can also be implemented with other nucleic acids such as messenger RNA or cloned DNA, and the nucleic acid in the sample of the individual can be in the form of 'a single strand or a double strand.
  • the acid nucleic acid is in the double-stranded form, it is necessary to practice a denaturation step to obtain a single-stranded nucleic acid.
  • the probes used in the present invention are sequence specific oligonucleotides (OSS) which, under appropriate conditions, can specifically bind to their complementary sequences. If a particular probe can be used to identify only one allele, then the probe is called OSA, that is, an allele-specific oligonucleotide. A single probe may not be able to identify a specific DR ⁇ allele on its own due to the different nature between various DR ⁇ alleles.
  • OSS sequence specific oligonucleotides
  • the identity of an allele is deduced from a binding model of a set of probes, each individual probe of the set being specific for different parts of the HLA DR gene. Thanks to the choice of multiple probes corresponding to the DNA sequences of the known alleles, the specificity of the oligonucleotide typing method of the present invention makes it possible to identify all the alleles of the DRB1, DRB3 and DRB5 loci. Of course, the method of the present invention could be used to identify the alleles of other extremely polymorphic loci such as DQB1 and DPB1.
  • the probes are chosen to be complementary to specific sequences localized in this region. In the event that new alleles are discovered, these are immediately listed in a HLA class II sequence register, which makes it possible to update the collection of informative tracers and therefore to adapt the methodology to the detection of any new allele.
  • DR of patients on the waiting list for a kidney transplant or the typing of potential kidney donors the DR typing of leukemia patients for whom a bone marrow transplant is envisaged, as well as members of their family or unrelated potential donors , large-scale DR typing for the constitution of registers of voluntary marrow donors, to determine associations between diseases and the HLA system, for example in the case of insulin-dependent diabetes, for applications in predictive medicine or for research paternity and other judicial identifications.
  • genotypic characteristics refers to the set of genotypic characteristics of an individual as opposed to the "phenotype” which are the characterizations of an individual as they emerge from the analysis of gene expression products and in particular proteins .
  • oligonucleotide designates the primers, the probes, the fragments of nucleic acids to be detected, etc.
  • the oligonucleotides can be prepared by any suitable known method.
  • nucleotide probe represents a fragment of natural DNA or RNA, or a natural or synthetic oligonucleotide, or a fragment of synthetic DNA or RNA, unmodified or comprising one or more modified bases such as l 'inosine (symbolized by the letter I), methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5- deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2, 6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • modified bases such as l 'inosine (symbolized by the letter I), methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5- deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2, 6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • these optimal sequences can be extended at the 3 'and / or 5' end by at least one base.
  • certain bases which can be optionally added have been indicated in parentheses as can be seen for example on reading the description above.
  • ligands used in the present invention can be commercially available compounds such as in Table 1 below:
  • An oligonucleotide is synthesized on an automatic 381 A device from the company APPLIED BIOSYSTEMS using phosphoramidite chemistry according to the manufacturer's protocol.
  • the ligand carries a dimethoxytrityl protecting group, such as for compound d, it is necessary to carry out an additional step of deprotection of the trityl group with trichloroacetic acid at the end of the synthesis.
  • the oligonucleotide is dried under vacuum and taken up in 1 ml of dH 2 O.
  • an additional step of cleavage of the monomethoxytrityl group is carried out according to the manufacturer's protocol (CLONTECH and GLEN RESEARCH respectively) after deprotection.
  • the automatic synthesis starts with the silica grafted with the ligand according to the standard protocol.
  • the ligand and oligonucleotide coupling is carried out via the 3 'end of the latter.
  • the oligonucleotides modified at their 5 ′ or 3 ′ ends are purified by high pressure liquid chromatography (HPLC) in reverse phase on a Brownlee RP18 column (10 mm - 25 cm).
  • buffers A and B are as follows.
  • Buffer B 50% Buffer A + 50% CH3CN.
  • the conjugate is purified by ion exchange in HPLC on an AX300 column (BROWNLEE 4.6 x 100 mm) with an NaCl gradient (Table 1).
  • the conjugate peak is dialyzed against water (2 x 1 liter) concentrated under empty, taken up in 1 ml H 2 O and stored at - 20 ° C.
  • buffers A 'and B' are as follows:
  • a ' 20 mM sodium phosphate, pH 7.00; 20% CH 3 CN.
  • the alignments of amino acids of the various alleles of the DR Beta gene are shown in Table 2 in order to define the positions of the mutated amino acids with respect to the chosen consensus sequence (called "DR CONS").
  • These mutations correspond to non-silent mutations at the DNA level, ie mutations which will induce an amino acid change.
  • amino acids are encoded at the DNA level by base triplets.
  • a mutation in the third position will generally not cause an amino acid change.
  • the change of the second base will quite often induce a change of amino acid.
  • a mutation on the first base will always lead to a modification of the amino acid.
  • oligonucleotides were synthesized carrying either a ligand, as described in example 1 and which are summarized in table 4, or coupled to ASB, as described in example 2 and which are summarized in
  • Tr represents the retention time in minutes (min) of the oligonucleotide in HPLC under the conditions described in Example 1 (BROWNLEE RP 18 column (4.6 mm-25 cm) flow rate 1 ml / min).
  • the letter I in sequences 33, 34 and 34 bis represents inosine.
  • Tr represents the retention time in minutes (min) of the oligonucleotide coupled to ASB in HPLC under the conditions described in Example 2.
  • (1M) means that buffer B contains 1M NaCl.
  • (2M) means that buffer B contains 2M NaCl.
  • the oligonucleotide is quantified in picomoles by UV spectrometry by measuring the absorbance at 260 nm according to the APPLIED BIOSYSTEMS protocol.
  • the ASB is assayed by the BRADFORD method (BRADFORD M.M., Anal.Biochem., 72.248 (1976)) in picomoles.
  • the oligo / ASB ratio is the ratio of these 2 values.
  • capture oligonucleotides have been defined which can be synthesized, without ligand, with a ligand or else can be coupled, for example, to ASB.
  • the choice of the sequences of the oligonucleotides synthesized takes account of the alignment of the DNA sequences of the various alleles described in Table 3 of Example 3.
  • the selected oligonucleotide probes, used for example as capture probes, make it possible to carry out a Typing plan as described in Table 6. It is obvious to those skilled in the art that other typing plans can be defined with other oligonucleotides.
  • the sign + signifies that the subtype of the line considered in table 6 gives a hybridization with the probe of the corresponding column.
  • Example 2 the activated oligonucleotide which is dried under vacuum is taken up in 1.25 10 -7 mole (5 mg) of horseradish peroxidase.
  • the purification protocol is identical: the conjugate is stored at -20 ° C in a 50 mM tris HC1 buffer, pH 7.0, 40% glycerol.
  • Table 7 summarizes the different conjugates used for HLA DR detection.
  • Tr represents the retention time in minutes (min) of the oligonucleotide coupled to horseradish peroxidase (HRP) in HPLC under the conditions described in Example 2.
  • (2M) means that buffer B contains 2M NaCl.
  • the oligonucleotide is quantified in picomoles by UV spectrometry by measuring the absorbance at 260 nm according to the APPLIED BIOSYSTEMS protocol.
  • Horseradish peroxidase (HRP) is dosed by UV at 402 nm in picomoles according to ATOR MA, J. Biol. Chem. , 31, 14954 (1987).
  • the oligo / HRP ratio is the ratio of these 2 values.
  • (GT) means that there is an equimolar mixture of the 2 bases G and T at this position.
  • EXAMPLE 6 preparation of genetic material
  • the extraction of nucleic acids from whole blood is carried out in an Applied Biosystems apparatus according to the following protocol: 2 to 6 ml of whole blood are taken up in TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.00, 1 mM EDTA) (sufficient quantity for 6 ml) and are placed in a 30 ml extraction vial. A proteinase K solution (840 units in 20 mM Tris-HCl pH 8.5) is added. The whole is incubated for 1 hour at 55 ° C. with shaking. The excess protein present is eliminated by 2 simultaneous extractions (8.5 ml) with a mixture of phenol chloroform. The whole is stirred for 20 minutes at 60 ° C. After elimination of the organic phase, a new phenolic extraction is carried out.
  • TE buffer 10 mM Tris-HCl pH 8.00, 1 mM EDTA
  • a proteinase K solution 840 units in 20 mM Tris-HCl pH 8.5
  • the whole is incubated for 1 hour at
  • the excess phenol is removed by extraction with chloroform (9.5 ml), 10 minutes at 37 ° C.
  • the DNA contained in the aqueous phase is precipitated by adding 0.5 ml of 3M sodium acetate pH 5.5 and 13.5 ml of isopropanol and then recovered on a filter. The DNA is then taken up in 1 ml of distilled water, then assayed spectrophotometrically at 260 nm.
  • PCR polymerase chain reaction technique
  • Thermocycler Perkin Elmer Ketus
  • 35 temperature cycles will be carried out: - 0.5 minute denaturation at 95 ° C
  • the primers used have the following sequence:
  • primer 1 5'-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3 '
  • a well of a polystyrene microtiter plate (Nunc 439454) are deposited 100 ⁇ l of a solution of an oligonucleotide for capturing a specific DR given at a concentration of 0.15 ⁇ M in PBS 3 x (0 , 45 M NaCl, 0.15 M sodium phosphate pH 7.0). There are as many wells filled as necessary for typing.
  • the capture probe which is used as a positive control is present on all the alleles known to date and has the following sequence:
  • the plate is washed 3 times with 300 ⁇ l of PBS Tween (0.15 M NaCl, 0.05 M sodium phosphate, pH 7.0; 0.5% Tween 20 (Merck
  • the amplification product (100 ⁇ l) as described in Example 7 is denatured with 10 ⁇ l of 2N NaOH for 5 minutes with stirring at room temperature. 10 ⁇ l of 2N acetic acid then a volume of PEG buffer (0.1 M sodium phosphate, pH 7.0, 0.5 M NaCl, 0.65% Tween 20, salmon sperm DNA (Sigma D 9156)
  • nx 50 ⁇ l 0.14 mg / ml, PEG 4,000 (Merck 8O7490) 2%) equivalent to nx 50 ⁇ l (n being the number of capture probes necessary for typing). are added successively to this solution. 50 ⁇ l of this solution are distributed per well followed by 50 ⁇ l of the detection probe (oligonucleotide peroxidase conjugate) at a concentration of 15 nM in the PEG buffer. The plate is incubated for 1 h at 37 ° C. and washed with 3 x 300 ⁇ l of PBS Tween.
  • OPD substrate orthophenylenediamine Cambridge Medical Biotechnology ref / 456
  • OPD buffer 0.05 M citric acid, 0.1 M Na 2 HPO 4 , pH 4.93
  • H 2 O 2 is added immediately at 30 volumes in 1/1000, are added per well.
  • the enzymatic activity is blocked by 100 ⁇ l of 1N H 2 SO 4 and the reading is carried out on Axia Microreader (bioMérieux) at 492 nm.
  • Axia Microreader bioMérieux
  • DNAs, prepared according to the method described in Example 6, are amplified according to the method described in Example 7.
  • GATACTTCTATCACC 3' oligonucleotide of identical sequence but without ligand (referenced 545 nu)
  • TGGACAACTACTG 3 ' oligonucleotide of identical sequence but without ligand (referenced 546 nu)
  • the typing protocol conforms to the general protocol described in Example 8.
  • the probes D1 and D2 (table 7) are used in a 50% - 50% mixture as detection probes.
  • the typing protocol conforms to the general protocol described in Example 8.
  • the probes D1 and D2 (table 7) are used in a 50% - 50% mixture as detection probes.
  • the typing protocol includes the capture probes summarized in Table 9 below:
  • the method described allows us to unambiguously type the 24 DNAs tested.
  • the preferred hybridization temperature for the HLA DR typing described in the present invention is 37 ° C.
  • Example 10 The following example is identical to Example 10 with the exception of the hybridization temperature which was changed from 37 ° C to 45 ° C. Typing is performed on 11 DNAs.
  • the preferred hybridization temperature is 37 ° C. and the preferred hybridization buffer is the PEG buffer, but as the results of Examples 11 and 12 show, it can be seen that it is possible to vary both the hybridization temperature and hybridization buffer.
  • the process of the present invention combines the following practical advantages: optimal specificity with possible discrimination of all the alleles,
  • capture probes were prepared corresponding to the oligonucleotides designated by the reference numbers 101, 102, 103, 104, 115 and 111.
  • capture probes of the invention can be used with the following detection probes:
  • the preferred hybridization temperature is 37 ° C. and the preferred hybridization buffer is the PEG buffer, but as the results of Examples 11 and 12 show, it can be seen that it is possible to vary both the hybridization temperature and hybridization buffer.
  • the process of the present invention combines the following practical advantages: optimal specificity with possible discrimination of all the alleles,
  • capture probes were prepared corresponding to the oligonucleotides designated by the reference numbers 101, 102, 103, 104, 115 and 111.
  • capture probes of the invention can be used with the following detection probes:

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Abstract

Sonde nucléotidique choisie parmi les suivantes: TGGCAGCTTAAGTTT, CCTAAGAGGGAGTG, GCGAGTGTGGAACCT, AAGACAGGCGGGC, ou leurs complémentaires. Ces sondes peuvent être utilisées pour effectuer le typage HLA DR d'un individu, notamment avant transplantation d'organes.

Description

Système de sondes permettant d'effectuer le typage HLA DR, et procédé de typage utilisant lesdites sondes.
La présente invention a pour objet un procédé pour déterminer le génotype HLA de classe II d'un individu et se rapporte plus particulièrement à la détection des gènes polymorphes HLA DR. Ce procédé est applicable notamment au typage HLA en transplantation, au diagnostic médical, à la .médecine légale, etc.
Le système HLA (antigène des lymphocytes humains) est codé par le complexe d'histocompatibilité majeur chez l'homme. Il constitue une contrainte très importante au cours des transplantations d'organes entre les individus en effectuant une distinction entre le soi et le non-soi. De plus, les facteurs du HLA sont impliqués dans la prédisposition à un grand nombre de maladies. Les antigènes du système HLA ont donc été utilisés dans des procédés de typage pour déterminer les caractéristiques entre donneurs et receveurs lors de transplantations d'organes (F. H. BACH et J.J. VAN ROOD, N. Engl. J. Med., 295, pages 806-13 (1976)), ainsi que la prédisposition d'un individu à certaines maladies.
D'un point de vue génétique, le système HLA est bien caractérisé et consiste en un ensemble de loci plus ou moins polymorphes situés dans un intervalle d'environ 2 centimorgans (cM) sur le bras court du chromosome 6. Trois loci dans ce système (HLA- A, B et C) codent pour une classe d'alloantigènes exprimés de façon codominante (classe I). Une autre région (HLA-D) qui contient en fait plusieurs gènes code pour une seconde classe d'alloantigènes exprimés de façon codominante avec un degré important de polymorphisme (classe II). Plusieurs autres loci qui contrôlent notamment les composants C2, C4 et le facteur Bf de la cascade du complément appartiennent également au système HLA (classe III). Le succès des greffes d'organes dépend dans une grande mesure de l'identité HLA (classes I et II) entre receveur et donneur. En conséquence, le typage HLA doit être le plus exact possible. Ce besoin concerne principalement les transplantations de reins (P.J. Morris et A. Ting (1982) Immunol. Rev 66, 103 - G. Opelz (1989) Transpl. Proc. 21,609 - E.L. LAGAAIJ, P.H. Hennemann, M. Ruigrok et al. (1985) New Engl. J. Med 321,701) et les greffes de moelle osseuse (P.G. Beatty, R.A. Clift, E.M. Mickelson et al. (1985) New Engl. J. Med 313,765 - J.M. Hows et B.A. Bradley (1990) British J. Hematol. 76,1). Dans le cadre de la greffe de moelle osseuse, l'identité parfaite au niveau des antigènes HLA classe II représente un facteur déterminant pour le succès de la greffe, c'est-à-dire pour éviter un rejet du greffon ou le développement d'une maladie greffon-contre-hôte (P.G. Beatty, J. Hansen, G.M. Longton et al. (1991) Transplantation 51, 443 - R.C. Ash, J.T. Casper, C.R. Chitambar et al. (1990) New Engl. J. Med. 322, 485 - C. Anasetti, D. Amos, P.G. Beatty et al. (1989) New Engl. J. Med. 320,197).
Le polymorphisme des produits d'expression des gènes de la région HLA D est défini habituellement par des techniques sérologiques basées sur l'analyse par des alloantisera des produits des gènes HLA exprimés à la surface des cellules (J.J. Van Rood et A. Van Leeuwen (1963) J. Clin. Invest. 42,1382 - J.J. Van Rood, A. Van Leeuwen, J.J. Koning, A.B. Van Oud Ablas (1975) Tissue Antigens 5, 73). La précision et la reproductibilité dépendent des lots de sera disponibles. Cependant, même dans les meilleures conditions, un très grand nombre des allèles existants ne sont pas détectables par ces techniques sérologiques. Les limites de l'analyse sérologique résultent essentiellement de l'absence d* alloantisera monospécifiques, d'une discrimination incomplète avec des réactivités croisées entre des spécificités très proches, par exemple DR3 et DRwl3 ou encore d'une expression altérée des molécules HLA classe II à la surface des cellules, par exemple de cellules leucémiques.
Grâce à la biologie moléculaire, on sait maintenant qu'il existe un plus grand nombre de gènes HLA qu'on ne le supposait auparavant et, surtout, beaucoup plus d'allèles différents. Cette diversité est maintenant caractérisée au niveau des séquences d'ADN des différents gènes et allèles. Selon le dernier rapport du comité de nomenclature HLA (voir The WHO Nomenclature Committee for factors of the HLA System (1990) Immunogenetics 31, 131 - and - J.G. Bodmer, S.G.E. Marsh, E.D. Albert, W.F. Bodmer, B. Dupont, H.A. Erlich, B. Mach, W.R. Mayr, P. Parham, T. Sasazuki, G.M.T. Schreuder, J.L. Strominger, A. Svejgaard et P.I. Terasaki (1991) Tissue Antigens 37, 97) , le polymorphisme HLA classe II se répartit comme suit : locus DRB1 : 47 allèles, locus DRB3 : 4 allèles, locus DRB4 : 1 allèle, locus DRB5 : 4 allèles, locus DQB1 : 17 allèles, locus DQA1 : 13 allèles, locus DPB1 : 21 allèles, locus DPA1 : 4 allèles.
Beaucoup de ces allèles échappent à l'analyse sérologique et ne sont identifiables qu'au niveau de l'ADN. On peut illustrer les limites du typage sérologique par la spécificité sérologique DR4, maintenant subdivisée en 11 sous-types (DRB1*0401-0411) (voir J.G. Bodmer, S.G.E. Marsh, E.D. Albert, W.F. Bodmer, B. Dupont, H.A. Erlich, B. Mach, W.R. Mayr, P. Parham, T. Sasazuki, G.M.T. Schreuder, J.L. Strominger, A. Svejgaard et P.I. Terasaki (1991) Tissue Antigens 37, 97), identifiables seulement au niveau de la séquence d'ADN.
De même, la spécificité DRw6, qui peut être subdivisée en
DRwl3 et DRwl4 par quelques alloantisera, contient en réalité 10 séquences alléliques (DRB1*1301-1305 et DRB1*1401-1405 (voir la publication de Bodmer JG citée ci-dessus) qui, là aussi, ne peuvent être discriminées que par l'analyse génotypique au niveau de la séquence d'ADN.
L'analyse génotypique est une nouvelle approche permettant d'analyser la diversité du système HLA classe II directement au niveau des gènes. L'analyse génotypique est basée sur le principe de l'hybridation moléculaire et la première approche qui fut proposée est la technique dite "RFLP" qui consiste à fragmenter l'ADN par utilisation d'enzymes de restriction et à analyser la taille des fragments d'ADN spécifiques générés par ces enzymes (voir C.T. Wake, E.O. Long et B. Mach (1982) Nature 300, 372 - J. Blhme, M; Andersson, G. Andersson, E. Miller, P.A. Peterson et L. Rask (1985) j. immunol. 135, 2149 - J.L. Bidwell, E.A. Bidwell, D.A. Savage, D. Middleton, P.T. Klouda et B.A. Bradley (1988) Transplantation 45, 640).
L'analyse par RFLP ne permet de reconnaître que certaines des différences alléliques indétectables par la sérologie, et cette technique présente encore des limitations. En effet, un allèle portant une séquence différente est identifiable seulement si le nucléotide différent est dans le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction utilisée dans l'analyse et donc un grand nombre d*allèles HLA classe II ne seront pas reconnus par cette analyse. De plus, l'analyse RFLP met rarement en évidence une modification dans une séquence codante, et ne fournit pas d'informations sur la nature exacte de la modification. Enfin, cette technique est longue et lourde car elle implique d'utiliser des quantités relativement importantes d'acides nucléiques qui doivent être digérées avec plusieurs enzymes de restriction, des électrophorèses et des transferts sur filtres.
Pour illustrer les limites de la technique RFLP, on peut mentionner que les sous-types des spécificités DR1, DR4, DRwβ, DRwll ou DRwl3, ne sont pas détectables par RFLP. Une nouvelle technique d'analyse génotypique de HLA classe II a été proposée, qui est la méthode dite "de typage par oligonucléotides". Grâce à la connaissance des séquences d'ADN des gènes de HLA classe II et en particulier des gènes DRβ, qui sont de loin les plus polymorphes, on peut utiliser des oligonucléotides qui sont spécifiques d'un endroit donné de la séquence du gène comme traceurs pour l'analyse du polymorphisme par hybridation. Ces oligonucléotides sont choisis de façon à être les plus informatifs possibles et à permettre l'identification des différents allèles, sur la base de leurs différences de séquences. Dans la pratique, n'importe quelle différence de séquence, même d'un seul nucléotide, peut être détectée.
La technique de typage par oligonucléotides peut être appliquée aussi bien à l'ADN, comme décrit dans la publication d'Angelini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 83, pages 4489 - 4493 (1986), qu'à l'ARN (voir C. Ucla, J.J. Van Rood, J. Gorski et B. Mach (1987) J. Clin. Invest. 80, 1155).
Cette nouvelle approche est basée sur le principe de l'hybridation moléculaire en utilisant les propriétés caractéristiques des acides nucléiques qui sont les possibilités d*interagir avec une séquence complémentaire par l'intermédiaire de liaisons hydrogènes et de former ainsi un hybride stable, selon les lois d'appariement connues, c'est-à-dire A-T, G-C, pour l'ADN et A- U, G-C pour l'ARN. Ainsi, des oligonucléotides de synthèse correspondant à des séquences d'ADN ou d'ARN des allèles connus peuvent être utilisés comme sondes pour identifier, dans un échantillon, une séquence nucléique appelée cible, contenant une séquence complémentaire de celle de la sonde . Le marquage de l'hybride formé entre la cible et la sonde permet la détection et la quantification de la cible dans l'échantillon. Ce marquage est effectué par tout marqueur connu, tel que marqueur enzymatique, chimique ou radioactif. Sur la base de ces principes la première application de typage par oligonucléotide pour le HLA classe II a été présentée par Angelini et al. dans la publication précédemment citée, avec utilisation de la technique dite "SOUTHERN" selon laquelle l'ADN cible est déposé sur une membrane de nylon et la détection est effectuée à l'aide d'une sonde oligonucléoditique marquée. La technique a ensuite été appliquée à la détection d' allèles HLA classe II non identifiables par la sérologie de routine (voir J.M. Tiercy, J. Gorski, M. Jeannet et B. Mach (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 198 - J.M. Tiercy, J. Gorski, H. Bétuel, A.C. Freidel, L. GebÂhrer, M. Jeannet et B. Mach (1989) Human Immunol. 24, 1). Une autre application directe au typage HLA classe II est celle décrite dans la demande de brevet PCT WO 89/11547 utilisant la technique dite "Dot-Blot". Une modification à ces techniques est représentée par la méthode dite "Reverse Dot Blot" qui consiste à fixer sur une membrane de papier, nitrocellulose ou un mélange des deux, une sonde nucléotidique et à effectuer la détection d'une hybridation avec une cible marquée. Cette technique a été appliquée au typage HLA-DQA et à la détection des mutations de la β -thalassémie méditerranéenne (R.K. Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Voi 86, pages 6230-6234 (1989)).
Comme décrit précédemment et expliqué dans les publications et la demande de brevet citées ci-dessus, le typage cellulaire nécessite la détection de mutations ponctuelles dans le génome et implique la mise au point de sondes suffisamment sensibles pour détecter et différencier des séquences homologues à un nucléotide près, et on a trouvé qu'il fallait utiliser des sondes de courte taille, généralement de moins de 30 nucléotides, qui confèrent au test une grande spécificité, tout en conservant une bonne sensibilité. L'utilisation d'oligonucléotides de courte taille permet de disposer d'un grand éventail de sélectivité.
Dans le cas où l'on utilise un test comprenant la fixation d'une sonde sur un support solide reste posé le problème lié à l'immobilisation d'une sonde courte, inférieure à 30 nucléotides, sur un tel support solide. R.K. SAIKI et al., dans la publication précédemment citée, ont proposé une méthode qui consiste à coupler à l'extrémité 3' d'une sonde comprenant entre 15 et 20 bases, une queue poly(dT) de 400 bases et à immobiliser la sonde par l'intermédiaire de cette queue sur un filtre de nylon par exposition à des rayons ultraviolets, de façon à coupler par covalence les bases thymines aux aminés primaires présentes dans le nylon.
Cependant, cette méthode n'est pas entièrement satisfaisante, car elle présente des problèmes de spécificité. En effet, les bases thymines de la sonde peuvent également réagir, sous rayonnement
U.V., avec le support, ce qui implique une diminution de l'efficacité d'hybridation.
Par ailleurs, pour des raisons d'industrialisation, il est souhaitable de mettre au point un procédé de typage qui présente une grande spécificité et une bonne sensibilité, mais qui de plus soit simple à mettre en oeuvre, d'exécution rapide, peu onéreux, automatisable et utilisable pour le typage individuel.
On a maintenant trouvé un nouveau procédé pour déterminer le génotype HLA DR d'un individu, qui. pallie les inconvénients décrits ci-dessus en permettant de détecter et de différencier des séquences homologues à un nucléotide près.
Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre à l'aide d'un ensemble de sondes nucléotidiques choisies de façon à permettre un typage avec un nombre minimum de sondes . Cet ensemble de sondes présente notamment l'avantage de permettre d'opérer à une température unique, notamment à 37° C. (bien qu'il soit possible d'opérer à une autre température, comme on le verra dans la partie expérimentale ci-après). Un tel ensemble de sondes fait également partie de l'invention.
L'ensemble des sondes de l'invention qui sera défini ci-après, peut être utilisée sous la forme de sondes de détection (marquées avec un agent traceur usuel) dans les techniques du type Southern, ou, de préférence, sous la forme de sondes de capture (technique sandwich ou reverse dot blot) immobilisées sur un support solide, soit par fixation passive (adsorption) directement ou par l'intermédiaire d'un ligand), tel qu'un ligand hydrophobe (voir par exemple la demande de brevet européen N° 0 405 913), soit par l'établissement d'au moins une liaison covalente qui peut être faite ici encore directement ou par l'intermédiaire d'un ligand capable de se fixer par covalence sur le support (voir par exemple la demande de brevet PCT N° WO 88/01302). L'immobilisation des sondes peut être réalisée soit à l'aide de procédés connus, soit à l'aide .d'autres procédés qui seront décrits ci-après.
Les sondes de l'invention (sondes nucléotidiques) vont être décrites principalement sous la forme de séquences nucléotidiques. Il est évident pour l'homme du métier que, même pour le cas de sondes destinées à détecter des mutations ponctuelles, à une température donnée, il est possible d'envisager l'utilisation de sondes de longueur (nombre de nucléotides) variable, dans une certaine mesure, grâce notamment à l'emploi de solutions, tampons favorisant plus ou moins la stabilité des complexes d'hybridation. Les sondes de l'invention sont donc définies par une séquence qui pourra être généralement considérée comme maximum (en particulier si on souhaite travailler à température relativement basse, par exemple à 37° C), avec en outre l'indication d'une séquence minimum qui sera encore utilisable à ladite température et qui sera sensible à une mutation même ponctuelle.
Il est évident pour les spécialistes qu'à chaque sonde nucléotidique particulière correspond une sonde complémentaire, qui est bien entendu capable de jouer le même rôle en tant que sonde de capture ou de détection. L'invention s'étend donc à de telles sondes ayant une séquence complémentaire de celles qui seront décrites ci- après.
Il est également évident pour les spécialistes qu'il est généralement possible de remplacer, dans un ensemble de sondes, l'une des sondes reconnaissant une spécificité quelconque X par un système de deux sondes reconnaissant l'une, des spécificités X et Y, et l'autre, des spécificités X et Z, auquel cas des réponses positives à la fois avec la sonde XY et avec la sonde XZ permettent de conclure à la présence de la spécificité X. L'invention s'étend donc à un système de sondes, tel qu'il sera défini ci-après, dans lequel une ou plusieurs sondes sont remplacées par un tel système équivalent de deux sondes ou plusieurs sondes. Bien entendu, un tel système associatif peut être appliqué à un nombre de spécificités supérieur à 2.
L'invention a pour objet des sondes nucléotidiques utilisables dans les techniques de typage par oligonucléotides pour effectuer le typage HLA DR, ces sondes étant choisies parmi les suivantes :
- TGGCAGCTTAAGTTT
- CCTAAGAGGGAGTG
- GCGAGTGTGGAACCT
- AAGACAGGCGGGC.
Les quatreε séquences qui viennent d'être mentionnées sont désignées, respectivement, par les numéros de référence 101, 102, 103 et 104.
La sonde 101 permet d'identifier le type DRB1*01.
La sonde 102 permet d'identifier le type DRB1*02. La sonde 103 permet d'identifier le type DRB4*01 et la sonde 104 sert dans l'identification du type DRB1*1305.
L'invention concerne également un ensemble de sondes nucléotidiques, ou un kit de type HLA, comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes 101 à 104.
L'invention a également pour objet un tel ensemble de sondes contenant en outre au moins une sonde choisie parmi les suivantes :
- GTGGACAACTACTG - GATACTTCTATCACCAA - GCCTGATGAGGAGTAC - TGGCAGGGTAAGTATAAG - GGGCCCTGGTGGACA - TGCGGTATCTGCACA
- GGAGGAGGTTAAGTT - CTGGAAGACGAGCG - TGGAAGACAAGCGG
- TGCGGAGCACTGGA - AACCAGGAGGAGAACGTG - ACTCTACGGGTGAGTG
- GACACCTATTGCAGAC -
La partie soulignée correspondant à une séquence minimum. Les treize séquences qui viennent d'être mentionnées sont désignées respectivement sous les numéros de référence 105 à 117.
Selon un mode de réalisation préféré, la sonde 111 est utilisée sous sa forme complète, y compris les deux T non soulignés à 1 'extrémité 3'. Elle a la même spécificité que la sonde 45.
La sonde 115 est utilisée de préférence sous la forme de la séquence soulignée augmentée des deux A non soulignés à l'extrémité 5'. Elle a la même spécificité que la sonde 28.
Les sondes 105 à 110, 112 à 114, 116 et 117 sont utilisés de préférence sous la forme des sondes ayant dans la partie expérimentale ci-après les numéros de référence 43, 9, 10, 14, 17, 44, 46, 48, 47, 24 et 27.
L'invention concerne notamment un ensemble de sondes tel que défini ci-dessus, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre l'une au moins des sondes suivantes (la partie soulignée correspondant à la séquence optimum) : - GAGGAGGACTTGCGCT - TACGGGGCTGTGGAG - GGAGCTGCGTAAGT
- TTCCTGGAGAGACAC - GGGAGAGATACTTCC.
Les cinq séquences qui viennent d'être mentionnées sont désignées respectivement par les numéros de référence 118 à 122. Ces séquences sont utilisées notamment sous la forme des sondes portant les numéros de référence 42, 42 bis, 52, 37 et 55.
Les sondes spécifiques indiquées ci-dessus peuvent être utilisées notamment comme sondes de capture ou de détection. Elles sont utilisées de préférence sous la forme de sondes de capture immobilisées ou immobilisables sur un support solide.
L'invention a également pour objet un procédé pour déterminer le typage HLA DRβ d'un individu, selon les techniques usuelles de typage par oligonucléotides, caractérisé par le fait que l'on utilise comme sondes de capture ou de détection, soit séquentiellement, soit simultanément, au moins une partie des sondes de l'ensemble de sondes tel que défini ci-dessus :
Dans un procédé automatisé, on utilisera l'ensemble des sondes. Dans d'autres cas, il est évidemment possible de les utiliser l'une après l'autre, et d'arrêter le procédé lorsque les renseignements recueillis suffisent à déterminer le typage.
Le procédé de l'invention comprend donc essentiellement les étapes consistant :
- à mettre en contact selon une technique particulière choisie, des échantillons d'acides nucléiques cibles contenant les régions polymorphes du gène HLA DR d'un individu, avec au moins une partie de l'ensemble des sondes tel que défini ci-dessus,
- à faire incuber, selon les méthodes connues, dans des conditions prédéterminées telles que l'hybridation avec chaque sonde ne se produit que si la cible contient une séquence parfaitement complémentaire de celle de ladite sonde, et
- à déterminer, selon les techniques de détection usuelles, l'hybridation ou l'absence d'hybridation avec chacune des sondes utilisées.
Les informations recueillies sont ensuite utilisées pour determiner le typage en fonction d'un plan de typage préétabli, tenant compte des sondes utilisées et de la connaissance des types HLA DR et/ou sous types associés répertoriés. Ce travail est simplifié par l'utilisation d'un plan de typage, c'est à dire en pratique un tableau donnant directement les types et/ou sous types en fonction des réponses positives (hybridation (s)) observées. Pour l'ensemble des sondes de la présente invention, un tel tableau est donné ci-après dans la partie expérimentale (voir tableau 6). L'invention concerne en particulier un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel on utilise lesdites sondes comme sondes de capture, ce procédé pouvant être caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à : a) immobiliser chaque sonde de capture sur un support solide, b) mettre en contact chaque sonde de capture immobilisée avec un milieu liquide contenant au moins un fragment d'acide nucléique cible, dans des conditions prédéterminées permettant l'hybridation si la séquence complémentaire de celle de la sonde est présente dans la cible et c) détecter la présence d'hybrides éventuellement formés. Bien entendu, les sondes de l'invention permettent de détecter aussi bien des fragments cibles d'ARN que d'ADN. Par ailleurs, il est évident que l'on peut utiliser comme sonde de détection outre les sondes ci-dessus, toutes sondes appropriées, notamment l'une des sondes décrites ci-après dans l'exemple 5.
Lorsque la sonde de capture est très courte, c'est-à-dire inférieure à 20 nucléotides et en particulier inférieure à 17 nucléotides, il devient nécessaire de mettre en oeuvre des moyens permettant d'améliorer la fixation de la sonde sur un support solide. La fixation de la sonde sur le support est effectuée alors sous la forme d'un dérivé résultant du couplage covalent de la sonde avec un ligand facilitant la fixation sur le support solide . Le ligand, qui peut comprendre une partie hydrophobe est notamment un ligand comprenant au moins un groupement fonctionnel polaire, par exerφle un groupement aminé. Le groupement fonctionnel peut servir à fixer la sonde sur le suppport solide par établissement d'une liaison covalente. Lorsque le groupement fonctionnel polaire ne réagit pas avec le support, il améliore la fixation par adsorption sur le support, même si le support est hydrophobe.
Le ligand est par exemple choisi parmi les protéines et les composés tels que représentés respectivement par les formules I et II ci-dessous :
Figure imgf000013_0001
dans laquelle :
Z représente un radical alkyle ou alcényle de 2 à 12 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué par un ou plusieurs groupements choisis parmi les groupements hydroxy et/ou amino, et m+ représente notamment un ion alcalin ou ammonium.
Ce ligand est couplé préférentiellement à l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique de la sonde de capture
Figure imgf000013_0002
dans laquelle n est un nombre entier pouvant varier de 1 à 4 et de préférence n = 1 ou 4.
Ce ligand est couplé préférentiellement à l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique de la sonde de capture. Lorsque le ligand est une protéine, on choisit par exemple une albumine, de préférence l'albumine de sérum de bovin, qui peut être couplée à l'extrémité 5' ou 3* de la séquence nucléotidique de la sonde de capture.
Le support de la présente invention peut être tout support permettant d'immobiliser une séquence nucléotidique ou un dérivé selon l'invention, soit par adsorption passive soit par covalence. Les supports peuvent être réalisés en tout matériau habituellement utilisé tel que nitrocellulose, nylon, papier, ou de préférence, en un matériau hydrophobe tel qu'un polymère de styrène ou un copolymère à base de styrène comprenant au moins 10 % en poids de motifs styrène.
Le support solide selon l'invention peut être sans limitation sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un tube, d'un cône, de puits ou analogues.
Selon le procédé de la présente invention, un échantillon contenant un acide nucléique est obtenu à partir d'un individu dont le génotype HLA DR doit être déterminé. Tout type de tissu contenant de l'acide nucléique HLA DR peut être utilisé dans le cadre de la présente invention. Il est ainsi possible d'utiliser des fragments d'acide nucléique (ADN ou ARN) obtenus après coupure par voie chimique, enzymatique ou analogue de l'acide nucléique présent dans l'échantillon de l'individu.
Cependant l'incorporation d'une étape préalable d'amplification de l'ADN ou de l'ARN cible peut faciliter le procédé de typage par oligonucléotide de la présente invention. Le principe de l'analyse du polymorphisme HLA par hybridation d'oligonucléotides spécifiques de séquences reste le même, mais une étape d'amplification sélective permet un enrichissement en séquences de la cible, ce qui simplifie la technique (R.K. Saiki, T.L. Bugawan, G.T. Horn, K.B. Mullis et H.A. Erlich (1986) Nature 324, 163 - J.M. Tiercy, M. Jeannet et B. Mach (1990) Eur. J. Immunol. 20, 237).
L'amplification peut être obtenue soit à partir d'ADN, soit à partir d'ARN. Il est évident pour un homme du métier que l'amplification des séquences de la cible HLA DR dans un échantillon peut être accomplie par toute méthode connue qui permet d'obtenir une amplification suffisante pour que la séquence de la cible puisse être détectée par hybridation d'un acide nucléique à une sonde.
En général, l'acide nucléique dans l'échantillon sera de l'ADN, le plus souvent de l'ADN génomique. Cependant, la présente invention peut également être mise en oeuvre avec d'autres acides nucléiques tels que de l'ARN messager ou de l'ADN clone, et l'acide nucléique dans l'échantillon de l'individu pourra être sous la forme d'un simple brin ou d'un double brin. Bien entendu, lorsque l'acide nucléique est sous la forme double brin, il est nécessaire de pratiquer une étape de dénaturation pour obtenir un acide nucléique simple brin.
Les sondes utilisées dans la présente invention sont des oligonucléotides spécifiques d'une séquence (OSS) qui, dans des conditions appropriées, peuvent se lier spécifiquement à leurs séquences complémentaires. Si une sonde particulière peut être utilisée pour identifier uniquement un allèle, la sonde est alors appelée OSA, c'est-à-dire oligonucléotide spécifique d'un allèle. Il est possible qu'une seule sonde ne soit pas capable d'identifier à elle seule un allèle spécifique DRβ en raison de la nature différente entre divers allèles DRβ.
Selon le procédé de l'invention, l'identité d'un allèle est déduite à partir d'un modèle de liaison d'un ensemble de sondes, chaque sonde individuelle de l'ensemble étant spécifique de différentes parties du gènes HLA DR. Grâce au choix de multiples sondes correspondant aux séquences d'ADN des allèles connus, la spécificité du procédé de typage par oligonucléotides de la présente invention permet d'identifier tous les allèles des loci DRB1, DRB3 et DRB5. Bien entendu, le procédé de la présente invention pourrait être utilisé pour identifier les allèles d'autres loci extrêmement polymorphes tels que DQB1 et DPB1. Comme les différences alléliques sont essentiellement localisées dans l'exon codant pour le premier domaine des molécules HLA (aa 5-94), les sondes sont choisies pour être complémentaires de séquences spécifiques localisées dans cette région. Au cas ou de nouveaux allèles seraient découverts, ceux-ci sont immédiatement répertoriés dans un registre de séquences HLA classe II, qui permet d'actualiser la collection de traceurs informatifs et donc d'adapter la méthodologie à la détection de tout nouvel allèle.
Pour rationaliser le typage HLA classe II complet, on a proposé d'introduire tout d'abord une première étape du typage DR générique, lequel peut, avec un nombre limité de sondes , reconnaître les principales spécificités HLA-DR, c'est-à-dire HLA- DRl-DRwl8. Cette étape est suffisante pour un grand nombre d'applications cliniques (voir B. Mach et J.M. Tiercy (1991) Human Immunol. 30, 278).
Sur la base des résultats de cette première étape, il est possible de choisir les sondes spécifiques nécessaires pour réaliser, dans un deuxième temps, un micropolymorphisme DRβ, pour détecter le polymorphisme DQBl et si nécessaire pour caractériser les allèles DPB1.
L'analyse des spécificités HLA-DRl-DRwl8 par la technique de typage par oligonucléotides peut être appliquée dans les laboratoires d'histocompatibilité pour le typage DR de routine, en remplacement de la sérologie DR, notamment pour effectuer le typage
DR de patients en liste d'attente pour une greffe rénale ou le typage de donneurs de reins potentiels, le typage DR de patients leucémiques pour lesquels une greffe de moelle osseuse est envisagée, ainsi que des membres de leur famille ou des donneurs potentiels non apparentés, le typage DR à grande échelle pour la constitution de registres de donneurs de moelle volontaires, pour déterminer des associations entre des maladies et le système HLA, par exemple dans le cas de diabètes insulinodépendants, pour des applications en médecine prédictive ou encore pour des recherches de paternité et autres identifications judiciaires.
On donne ci-après quelques définitions de termes utilisés dans la présente demande :
"génotype" fait référence à l'ensemble des caractéristiques génotypiques d'un individu par opposition au "phénotype" qui sont les caractérisations d'un individu telles qu'elles ressortent de l'analyse des produits d'expression du gène et notamment des protéines.
"allèles" sont les différentes formes alternatives d'un même gène qui présentent des différences au niveau de la séquence nucléique. Ces différences se manifestent au niveau de l'ADN, de l'ARN et des protéines.
"polymorphisme" caractérise la diversité introduite dans une population par l'existence d'allèles différents pour un même gène, "oligonucléotide" tel qu'utilisé ici désigne les amorces, les sondes, les fragments d'acides nucléiques devant être détectés, etc.. Les oligonucléotides peuvent être préparés par toute méthode appropriée connue.
"sonde nucléotidique"" représente un fragment d'ADN ou d'ARN naturel, ou un oligonucléotide naturel ou de synthèse, ou un fragment d'ADN ou d'ARN de synthèse, non modifié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine (symbolisée par la lettre I), la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2, 6-purine, la bromo-5- désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation.
Par ailleurs, dans la présente demande lorsque les séquences des sondes de capture sont soulignées, ceci représente la séquence optimale pour un typage selon l'invention. Bien entendu, ces séquences optimales peuvent être rallongées à l'extrémité 3' et/ou 5' par au moins une base. Dans ce cas, certaines bases pouvant être ajoutées facultativement ont été indiquées entre parenthèses comme on peut le voir par exemple à la lecture de la description ci-dessus . Enfin, il est possible pour un homme du métier de modifier la longueur des séquences utilisées en fonction des conditions opératoires (telles que : les températures d'hybridation, de lavage, la nature du tampon d'hybridation et/ou de lavage) et du plan de typage.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre, faite en référence à des exemples non limitatifs illustrant des modes de réalisation préférés du procédé de l'invention.
EXEMPLE 1 :
Les ligands utilisés dans la présente invention et donnés ici à titre d'exemple, peuvent être des composés disponibles dans le commerce tels que dans le tableau 1 ci-après :
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Le couplage d'un ligand phosphoramidite à un oligonucléotide est effectué selon le protocole général suivant :
Un oligonucléotide est synthétisé sur un appareil automatique 381 A de la société APPLIED BIOSYSTEMS en utilisant la chimie des phosphoramidites selon le protocole du constructeur. Le ligand phosphoramidite dissout dans de l'acétonitrile anhydre à une concentration de 0,2 M, est placé en position X du synthétiseur et l'addition du ligand se fait à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide selon le protocole standard de la synthèse automatique lorsque la synthèse de l' oligonucléotide est achevée.
Dans le cas où le ligand est porteur d'un groupement protecteur dimethoxytrityle, tel que pour le composé d, il est nécessaire d'effectuer une étape supplémentaire de déprotection du groupement trityle par l'acide trichloroacétique en fin de synthèse.
Après déprotection une nuit à 55° C dans NH4OH 33 %, suivie d'une précipitation dans de l'éthanol à - 20°C, l'oligonucléotide est séché sous vide et repris dans 1 ml dH2O.
Pour les composés référencés b et c, une étape supplémentaire de clivage du groupement monomethoxytrityle est effectuée selon le protocole du fabricant (CLONTECH et GLEN RESEARCH respectivement) après déprotection.
Dans le cas des composés portant la référence e et f, la synthèse automatique démarre par la silice greffée par le ligand selon le protocole standard. Le couplage ligand et oligonucléotide s'effectue par l'extrémité 3' de ce dernier.
Dans tous les cas, les oligonucléotides modifiés à leurs extrémités 5' ou 3' sont purifiés par chromatographie liquide haute pression (CLHP) en phase inverse sur une colonne Brownlee RP18 (10 mm— 25 cm).
Conditions : débit 4,6 ml/min
Gradient 10 % à 35 % de tampon B en 30 min.
35 % à 100 % de tampon B en 3 min.
Les caractéristiques des tampons A et B sont les suivantes.
Tampon A : 0.1 molaire Triethylammoniumacétate (TEAA) pH = 7,00 Tampon B : 50 % Tampon A + 50 % CH3CN.
EXEMPLE 2 :
Couplage d'un oligonucléotide à l'Albumine de Sérum de boeuf (ASB).
Un oligonucléotide portant le bras aminolink 2 référencé a dans le tableau 1 est synthétisé tel que décrit dans l'exemple 1 :
3. 10 mole d' oligonucléotide sont séchés sous vide et repris dans 25 μl de tampon borate de sodium 0.1 M, pH 9.3. On additionne 500 μl d'une solution à 30 mg/ml de DITC (phénylène-1, 4-diisothiocyanate Fluka 78480) dans le DMF. Le mélange est agité 1,5 h à température ambiante avant l'addition de 3 ml d'H2O. Après extraction de la solution par le butanol (3 x 3 ml), la phase aqueuse restante (500 μl) est séchée sous vide puis reprise par 1.10 -7 mole (6,6 mg) d'ASB (Pierce 30444) dans 400 μl de tampon borate (0,1 molaire pH 9.3).
Après une nuit sous agitation à température ambiante, le conjugué est purifié par échange d'ions en CLHP sur une colonne AX300 (BROWNLEE 4.6 x 100 mm) par un gradient de NaCl (Tableau 1). Le pic du conjugué est dialyse contre de l'eau (2 x 1 litre) concentré sous vide, repris par 1 ml H2O et stocké à - 20° C.
Conditions chromatographiques :
Gradient de : 10 % B' à 56 % B' en 25 min.
56 % B' à 100 % B' en 2 min.
Les caractéristiques des tampons A' et B' sont les suivantes :
A' = 20 mM phosphate de sodium, pH 7,00; 20 % CH3 CN.
B' = Tampon A' + 1 M NaCl ou 2M NaCl. EXEMPLE 3 :
On a représenté dans le tableau 2 les alignements d' acides aminés des différents allèles du gène DR Beta dans le but de définir les positions des acides aminés mutés par rapport à la séquence consensus choisie (appelée "DR CONS") . Ces mutations correspondent à des mutations non silencieuses au niveau de l'ADN c'est à dire des mutations qui induiront un changement d'acide aminé. On sait en effet que les acides aminés sont codés au niveau de l'ADN par des triplets de bases. Une mutation sur la troisième position n'entrainera généralement pas de changement d'acide aminé. Par contre le changement de la seconde base induira assez souvent un changement d'acide aminé. Enfin, une mutation sur la première base entraînera toujours une modification de l'acide aminé.
Dans le cas du typage des différents allèles, on utilise donc le plus souvent les mutations sur l'ADN correspondant aux mutations non silencieuses. Mais il est possible de détecter une mutation de type silencieuse, par exemple dans le but de différencier 2 allèles très proches.
Dans le tableau 3, on a représenté les alignements des nucléotides du gène DRBeta pour tous les allèles connus et publiés dans la littérature à ce jour, par rapport à la même séquence consensus que dans le tableau 2.
La nomenclature utilisée pour désigner les différents allèles et celle proposée lors de la cinquième conférence d'histocompatibilité (Leiden, Hollande, 1991). Les indications entre parenthèses dans le tableau 2 représente la nomenclature précédente.
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
EXEMPLE 4 :
En utilisant les 2 protocoles décrits précédemment on a synthétisé des oligonucléotides portant soit un ligand, tel que décrit dans l'exemple 1 et qui sont résumés dans le tableau 4, soit couplé à l'ASB, tel que décrit dans l'exemple 2 et qui sont résumés dans
Figure imgf000025_0001
* X représente le ligand selon la nomenclature utilisée précédemment dans le tableau 1
** Tr représente le temps de rétention en minutes (min) de l'oligonucléotide en CLHP dans les conditions décrites dans l'exemple 1 (colonne BROWNLEE RP 18(4,6 mm-25 cm) débit 1 ml/min). *** la lettre I dans les séquences 33, 34 et 34 bis représente l'inosine.
Figure imgf000026_0001
* Tr représente le temps de rétention en minutes (min) de l'oligonucléotide couplé à l'ASB en CLHP dans les conditions décrites dans l'exemple 2.
(1M) signifie que le tampon B contient 1M NaCl.
(2M) signifie que le tampon B contient 2M NaCl.
** L'oligonucléotide est quantifié en picomoles par spectrométrie U.V. en mesurant l'absorbance à 260 nm selon le protocole APPLIED BIOSYSTEMS. L'ASB est dosé par la méthode de BRADFORD (BRADFORD M.M., Anal.Biochem., 72,248 (1976)) en picomoles.Le ratio oligo/ASB est le rapport de ces 2 valeurs.
On a défini dans cet exemple des oligonucléotides de capture que l'on peut synthétiser, sans ligand, avec un ligand ou bien coupler par exemple à l'ASB. Le choix des séquences des oligonucléotides synthétisés tient compte de l'alignement des séquences d'ADN des différents allèles décrits dans le tableau 3 de l'exemple 3. Les sondes oligonucléotidiques sélectionnées, utilisées par exemple comme sondes de capture, permettent d'effectuer un plan de typage comme décrit dans le tableau 6. Il est bien évident pour l'homme de l'art que d'autres plans de typage peuvent être définis avec d'autres oligonucléotides.
Figure imgf000027_0001
Dans le tableau 6, les indications entre parenthèses représentent la nomenclature utilisée avant la conférence d'histocompatibilité (1991) des sous types de l' allèle DRB5.
Le signe + signifie que le sous type de la ligne considérée du tableau 6 donne une hybridation avec la sonde de la colonne correspondante.
A l'aide du tableau 6, il est possible d'interpréter facilement les résultats obtenus (hybridation ou absence d'hybridation) avec diverses sondes par exemple une cible donnant une réponse positive avec les sondes 43, 14, 28 et 37 correspond aux types DRB1*0301/DRB1*07.
EXEMPLE 5: préparation des sondes de détection
Selon l'exemple 2 l' oligonucléotide activé et séché sous vide est repris par 1,25 10 —7 mole (5 mg) de peroxydase de raifort
(BOEHRINGER MANHEIM 413470) dans 200 μl de tampon borate de sodium
0,1M, pH 9,3.
Le protocole de purification est identique : le conjugué est stocké à -20°C dans un tampon 50 mM tris HC1 , pH 7,0 ,40% glycérol.
Le tableau 7 résume les différents conjugués utilisés pour la détection HLA DR.
Figure imgf000028_0001
* Tr représente le temps de rétention en minutes (min) de 1' oligonucléotide couplé à la peroxydase de raifort (HRP) en CLHP dans les conditions décrites dans l'exemple 2.
(2M) signifie que le tampon B contient 2M NaCl.
** L'oligonucléotide est quantifié en picomoles par spectrométrie U.V. en mesurant l'absorbance à 260 nm selon le protocole APPLIED BIOSYSTEMS. La peroxydase de raifort (HRP) est dosée par U.V. à 402 nm en picomoles selon ATOR M.A., J.Biol. Chem. , 31, 14954 (1987). Le ratio oligo/HRP est le rapport de ces 2 valeurs. *** la lettre I dans la séquence D2 représente l'inosine .Dans la séquence Dl, (GT) signifie qu'il y a un mélange équimolaire des 2 bases G et T sur cette position. EXEMPLE 6 : préparation du matériel génétique
L'extraction d'acides nucléiques à partir de sang total est effectuée dans un appareil Applied Biosystems d'après le protocole suivant : 2 à 6 ml de sang total sont repris dans du tampon TE (10 mM Tris-HCl pH 8,00, 1 mM EDTA) (quantité suffisante pour 6 ml) et sont déposés dans une ampoule d'extraction de 30 ml. Une solution de protéinase K (840 unités dans 20 mM Tris-HCl pH 8,5) est ajoutée. L'ensemble est incubé sous agitation 1 heure à 55°C. L'excès de protéines présentes est éliminé par 2 extractions simultanées (8,5 ml) par un mélange de phénol chloroforme. L'ensemble est agité pendant 20 minutes à 60°C. Après élimination de la phase organique une nouvelle extraction phénolique est effectuée. L'excès de phénol est éliminé par une extraction au chloroforme (9,5 ml), 10 minutes à 37°C. L'ADN contenu dans la phase aqueuse est précipité par addition de 0,5 ml d'acétate de sodium 3 M pH 5,5 et 13,5 ml d' isopropanol puis récupéré sur un filtre. L'ADN est ensuite repris dans 1 ml d'eau distillée, puis dosé en spectrophotométrie à 260 nm.
EXEMPLE 7 : amplification de l'ADN
L'Amplification enzymatique est effectuée par la technique de réaction en chaîne par la polymérase (PCR) (MULLIS et FALOONA, Meth. in Enzymol. vol. 155, pp 335-350) d'après le protocole suivant :
Dans un tube de type Eppendorf sont ajoutés 0,1 à 2 μg d'ADN purifié ou non dans un volume total de 100 μl du tampon suivant :
- 10 μl de tampon de PCR 10 fois concentré (500 mM KCl, 100 mM Tris- HCl pH 8,3 (20°c), 15 mM MgCl2, 0,1% gélatine)
- 2 μl dNTP (dATP, dCTP, dGTP, TTP) 0,5 μM
- 2 μl de chaque amorce correspondant à 25 pmoles
- 1,5 unités de Taq polymérase (Perkin Elmer Cétus)
- eau distillée (quantité suffisante pour 100 μl)
- 50 μl d'huile de paraffine
Le tube est déposé dans un Thermocycler (Perkin Elmer Cétus) dans lequel seront effectués les 35 cycles de températures suivants: - 0,5 minute de dénaturation à 95°C
- 0,5 minute d'hybridation à 55°C
- 0,5 minute d'élongation à 72°C
Les amorces utilisées ont la séquence suivante :
amorce 1 = 5'-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3'
amorce 2 = 5'-TCGCCGCTGCACTGTGAAG-3' EXEMPLE 8 :
Dans un puits d'une plaque de microtitration en polystyrène (Nunc 439454) sont déposés 100 μl d'une solution d'un oligonucléotide de capture d'une spécificité DR donnée à une concentration de 0,15 μM dans du PBS 3 x (0,45 M NaCl, 0,15 M phosphate de sodium pH 7.0). Il y a autant de puits remplis que nécessaires pour le typage.
Dans tous les cas un contrôle positif doit être ajouté dans le but de vérifier l'efficacité de l'étape d'amplification ainsi que l'étape de détection. La sonde de capture qui est utilisée comme contrôle positif est présente sur tous les allèles connus à ce jour et a la séquence suivante :
5'- GGGGAGTACCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCT - 3'
La plaque est lavée 3 fois avec 300 μl de PBS Tween (0,15 M NaCl, 0,05 M phosphate de sodium, pH 7,0 ; 0,5 % Tween 20 (Merck
822184)). Le produit d'amplification (100 μl) tel que décrit dans l'exemple 7 est dénaturé par 10 μl de NaOH 2 N pendant 5 minutes sous agitation à température ambiante. 10 μl d'acide acétique 2N puis un volume de tampon PEG (Phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,0 , NaCl 0,5 M, Tween 20 0,65 %, ADN de sperme de saumon (Sigma D 9156)
0,14 mg/ml, PEG 4 000 (Merck 8O7490) 2 %) équivalent à n x 50 μl (n étant le nombre de sondes de capture nécessaires au typage). sont additionnées successivement à cette solution. 50 μl de cette solution sont répartis par puits suivis de 50 μl de la sonde de détection (conjugué oligonucléotide peroxydase) à une concentration de 15 nM dans le tampon PEG. La plaque est incubée 1 h à 37° C et lavée par 3 x 300 μl de PBS Tween. 100 μl de substrat OPD (ortho- phenylenediamine Cambridge Médical Biotechnology ref/456) dans un tampon OPD (0,05 M acide citrique, 0,1 M Na2HPO4, pH 4,93) à la concentration de 4 mg/ml auquel on ajoute extemporanément H2O2 à 30 volumes au 1/1000, sont ajoutés par puits. Après 20 min de réaction, l'activité enzymatique est bloquée par 100 μl d'H2SO4 1N et la lecture est effectué sur Axia Microreader (bioMérieux) à 492 nm. EXEMPLE 9:
6 ADN, préparés selon la méthode décrite dans l'exemple 6, sont amplifiés selon la méthode décrite dans l'exemple 7. Le protocole de typage comporte les sondes de capture suivantes 5' a-GATACTTCTATCACC 3' = oligonucléotide de spécificité DR 3 portant le ligand a en 5' (référencé 545 )
5' GATACTTCTATCACC 3' = oligonucléotide de séquence identique mais sans ligand (référencé 545 nu)
5' a-TGGACAACTACTG 3' = oligonucléotide de spécificité DR 4 portant le ligand a en 5' (référencé 546 )
TGGACAACTACTG 3' = oligonucléotide de séquence identique mais sans ligand (référencé 546 nu)
Le protocole de typage est conforme au protocole général décrit dans l'exemple 8.
Les sondes Dl et D2 (tableau 7) sont utilisées en mélange 50%- 50% comme sondes de détection.
Les résultats sont présentés dans le tableau 8 ci-après :
Figure imgf000031_0001
Les 2 sondes de capture sans ligand ne différencient pas les spécificités des ADN alors que les mêmes séquences avec le ligand a permettent d'identifier les spécificités DR2 et DR4 des ADN. EXEMPLE 10:
24 ADN, préparés selon la méthode décrite dans l'exemple 6, sont amplifiés selon la méthode décrite dans l'exemple 7.
Le protocole de typage est conforme au protocole général décrit dans l'exemple 8.
Les sondes D1 et D2 (tableau 7) sont utilisées en mélange 50%- 50% comme sondes de détection.
Le protocole de typage comporte les sondes de capture récapitulées dans le tableau 9 ci-après:
Figure imgf000032_0001
Les résultats du typage sont donnés dans la tableau 10:
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
La méthode décrite nous permet de typer sans ambiguïté les 24 ADN testés.
EXEMPLE 11 :
La température préférentielle d' hybridation pour le typage HLA DR décrit dans la présente invention est 37 °C.
Il est cependant possible de modifier cette température
d' hybridation .
L'exemple suivant est identicjue à l'exemple 10 à l'exception de la température d'hybridation qui a été modifiée de 37°C à 45°C. Le typage est réalisé sur 11 ADN.
Les sondes de capture utilisées sont données dans le tableau 11 ci-après:
Figure imgf000035_0001
Les résultats du typage sont donnés dans le tableau 12 ci-après:
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
La température préférentielle d'hybridation est 37°C et le tampon d'hybridation préférentiel est le tampon PEG, mais comme le montrent les résultats de l'exemple 11 et 12, on voit qu'il est possible de faire varier à la fois la température d'hybridation et le tampon d'hybridation.
Comme cela ressort de la description ci-avant, le procédé de la présente invention combine les avantages pratiques suivants : une spécificité optimale avec discrimination possible de tous les allèles,
une simplicité d'exécution et un coût réduit par rapport à l'analyse sérologique,
une rapidité d'exécution avec obtention des résultats 90 minutes environ après amplification, soit une durée totale inférieure à 12 heures, ce qui est essentiel pour les donneurs de reins,
une compatibilité au typage individuel essentielle pour les typages d'urgence et l'utilisation en petits laboratoires,
un signal quantifiable par mesure de Densité Optique et un traitement éventuel des résultats par un système informatique simple, et une adaptabilité à des systèmes automatiques.
EXEMPLE 13 :
De façon analogue à celle décrite précédemment, on a préparé des sondes de capture correspondant aux oligonucléotides désignés par les numéros de référence 101, 102, 103, 104, 115 et 111.
Ces sondes utilisées comme sonde de capture reconnaissent les spécificités indiquées dans la description.
En outre, on peut utiliser les sondes de capture de l' invention avec les sondes de détection suivantes :
-GCGGTGACGGAGCTGG
-GAACAGCCAGAAGGAC.
Figure imgf000039_0001
La température préférentielle d'hybridation est 37°C et le tampon d'hybridation préférentiel est le tampon PEG, mais comme le montrent les résultats de l'exemple 11 et 12, on voit qu'il est possible de faire varier à la fois la température d'hybridation et le tampon d'hybridation.
Comme cela ressort de la description ci-avant, le procédé de la présente invention combine les avantages pratiques suivants : une spécificité optimale avec discrimination possible de tous les allèles,
une simplicité d'exécution et un coût réduit par rapport à l'analyse sérologique,
une rapidité d'exécution avec obtention des résultats 90 minutes environ après amplification, soit une durée totale inférieure à 12 heures, ce qui est essentiel pour les donneurs de reins,
une compatibilité au typage individuel essentielle pour les typages d'urgence et l'utilisation en petits laboratoires,
un signal quantifiable par mesure de Densité Optique et un traitement éventuel des résultats par un système informatique simple, et une adaptabilité à des systèmes automatiς-ues .
EXEMPLE 13 :
De façon analogue à celle décrite précédemment, on a préparé des sondes de capture correspondant aux oligonucléotides désignés par les numéros de référence 101, 102, 103, 104, 115 et 111.
Ces sondes utilisées comme sonde de capture reconnaissent les spécificités indiquées dans la description.
En outre, on peut utiliser les sondes de capture de l'invention avec les sondes de détection suivantes :
-GCGGTGACGGAGCTGG
-GAACAGCCAGAAGGAC.

Claims

REVENDICATIONS
1. Sonde nucléotidique choisie parmi les suivantes :
- TGGCAGCTTAAGTTT
- CCTAAGAGGGAGTG
- GCGAGTGTGGAACCT
- AAGACAGGCGGGC,
ou leurs complémentaires.
2. Ensemble de sondes oligonucléotidiques permettant d'effectuer le typage HLA DR, comprenant au moins une sonde choisie parmi :
- TGGCAGCTTAAGTTT
- CCTAAGAGGGAGTG
- GCGAGTGTGGAACCT
- AAGACAGGCGGGC,
ou leurs complémentaires.
3. Ensemble de sondes selon la revendication 2, contenant en outre au moins une sonde choisie parmi :
- GTGGACAACTACTG - GATACTTCTATCACCAA - GCCTGATGAGGAGTAC
- TGGCAGGGTAAGTATAAG - GGGCCCTGGTGGACA - TGCGGTATCTGCACA
- GGAGGAGGTTAAGTT - CTGGAAGACGAGCG - TGGAAGACAAGCGG
- TGCGGAGCACTGGA - AACCAGGAGGAGAACGTG - ACTCTACGGGTGAGTG
- GACACCTATTGCAGAC, la partie soulignée correspondant à une séquence minimum,
ou leurs complémentaires.
4. Ensemble de sondes selon la revendication 3, contenant au moins une sonde choisie parmi :
- TGGACAACTACT - GATACTTCTATCACC - CCTGATGAGGAGTA
- GGCAGGGTAAGTATAAG - GGCCCTGGTGGA - GCGGTATCTGCACA
- GGAGGAGGTTAAGTT - TGGAAGACGAGC - GGAAGACAAGCG
- GCGGAGCACTGG - AACCAGGAGGAGAACGT - CTCTACGGGTGAGT
- ACACCTATTGCAGA,
ou leurs complémentaires.
5. Ensemble de sondes selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, contenant en outre au moins une sonde choisie parmi
- GAGGAGGACTTGCGCT - TACGGGGCTGTGGAG - GGAGCTGCGTAAGT
- TTCCTGGAGAGACAC - GGGAGAGATACTTCC.
ou leurs complémentaires.
6. Ensemble de sondes selon la revendication 5, contenant au moins une sonde choisie parmi :
- AGGAGGACTTGCGC - ACGGGGCTGTGGA - GAGCTGCGTAAG
- TTCCTGGAGAGACAC - GGAGAGATACTTC,
ou leurs complémentaires.
7. Ensemble de sondes selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, contenant la sonde :
- AACCAGIAGGAGAACGT,
ou sa complémentaire.
8. Ensemble de sondes selon l'une quelconques des revendications 2 à 7, contenant en outre au moins une des sondes suivantes :
- GCGGTGACGGAGCTGG
- GAACAGCCAGAAGGAC
- CCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC,
ou leurs complémentaires.
9. Procédé pour déterminer le typage HLA DR d'un individu à partir d'un échantillon de l'individu selon les techniques usuelles de typage par oligonucléotides, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme sondes de capture ou de détection, au moins une partie des sondes de l'ensemble de sondes défini dans l'une quelconque des revendications 2 à 8.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que lesdites sondes sont choisies parmi celles mentionnées dans l'une quelconque des revendications 2 à 7.
11. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on utilise lesdites sondes comme sondes de capture.
12. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à :
- immobiliser chaque sonde de capture sur un support solide,
- mettre en contact chaque sonde de capture immobilisée avec un milieu liquide contenant au moins un fragment d'acide nucléique cible, dans des conditions prédéterminées permettant l'hybridation si la séquence complémentaire de celle de la sond est présente dans la cible, et
- détecter la présence d'hybrides éventuellement formés.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que l'étape consistant à mettre en contact chaque sonde de capture immobilisée avec un milieu liquide contenant au moins un fragment d'acide nucléique cible est effectué à une température de 37° C.
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