WO1999020794A1 - Moyens de documentation de repertoires en immunorecepteurs nkr et/ou en immunorecepteurs contreparties activatrices ou non inhibitrices d'immunorecepteurs nkr - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
Definitions
- the present invention relates to means making it possible to document the repertoires of a human or animal individual in NKR (Natural Killer Receptor) immunoreceptors of the type of immunoglobulins or of the type of lectins, and in immunoreceptor activating counterparts, or at least non-inhibiting, NKR immunoreceptors. It also targets their biological applications.
- NKR Natural Killer Receptor
- the immune functions of a man or an animal are defined by several categories of highly diversified molecules, such as in particular the ABO blood group system, the family of MHC molecules (Major Histocompatibility Complex, called in humans , ELLA system - Hiiman Leukocyte Antigen-), the family of receptors for the antigen of T lymphocytes (TCR) and B lymphocytes (BCR).
- MHC molecules Major Histocompatibility Complex
- TCR T lymphocytes
- BCR B lymphocytes
- Immunoglobulin type NKR receptors include KIR (Killer cell Inhibitory Receptor) receptors such as in particular the p58.1, p58.2, p70.INH, pl40.LNH receptors.
- the lectin-type NKR receptors include the NKG2 inhibitory receptors such as in particular the NKG2A and NKG2B receptors. All of these receptors NKR are inhibitory.
- KAR receptors Insert cell Activatory Receptor
- NKG2C receptors NKG2D, NKG2E and NKG2F homologous to the NKG2A and NKG2B receptors.
- NKR receptor activating, or at least non-inhibiting, receptors are hereinafter designated, for the sake of fluidity, NKR counterparts.
- NKR receptors and NKR counterpart receptors are naturally expressed by NK cells and by T-cell subpopulations. Several of these receptors can be expressed by the same cell. All of these receptors, whether they are inhibitors (ie NKR) or whether they are activators or non-inhibitors (ie counterparts of NKR), have in common the ligand of molecules which are not derived from antigen: ligands NKR receptors and NKR counterpart receptors are MHC class I molecules.
- NKR receptor Recognition of its ligand by an NKR receptor triggers the transduction to the cell of a message aimed at inhibiting its activity, eg reduction or cessation of cytolysis, of secretion of cytokines, while recognition of its ligand by a counterpart receptor NKR induces an activating message, or at the very least non-inhibiting message.
- the result between NKR receptors and NKR counterpart receptors thus activated by their ligands corresponds to a signal, generally negative or positive, of activation of the NK and / or T cells which express them.
- the NKR receptors and their counterparts thus participate in the control, positive or negative, of the allogenic reactions of a given immune system vis-à-vis what it then considers as non-self for example, cancerous or infected cells, or much more transplant or transplant cells allo- or xeno-genic.
- NKR receptors and their counterparts participate in the reactions between host and graft during a transplant (or transplant) of cells, tissue or organ which presents (s) a certain degree of antigenic incompatibility with the host.
- oligonucleotide primers currently available do not allow they do not use a polymerase chain reaction capable of discriminating between, for example, an NKR p58.1 and an NKR p58.2, or between im NKR p70.INH and an NKR pl40.INH.
- a polymerase chain reaction capable of discriminating between, for example, an NKR p58.1 and an NKR p58.2, or between im NKR p70.INH and an NKR pl40.INH.
- a step of purification of the targeted receptors eg by FACSca ⁇ j, a step of nucleotide sequencing. Documentation of the NKR repertoire / counterparts of NKR n is therefore currently not achievable routinely in a medical context.
- NK and T cell activation programs The level of stimulation and inhibition of NK and T cell activation programs, and therefore the potential for resistance of an individual vis-à-vis the The development of microbial or parasitic infections, autoimmune diseases, or even mahne cells, cannot therefore be measured, as a result of this lack of suitable means for documenting the NKR repertoires which are counterparts of NKR that the selective effects of type GVL can only be used in therapy, and only GVH reactions or rejection during transplants or allo- o transplants xenogenics cannot be completely ruled out.
- the present invention therefore proposes means making it possible to document, for a given biological sample, the repertoires of NKR immunoreceptors and of immunoreceptor activating counterparts or at least non-inhibiting NKR receptors. These means make it possible in particular to easily distinguish between an NKR receptor and its activating or non-inhibiting counterpart, as well as to distinguish between different NKR receptors, or between different NKR counterparts. It also targets the biological applications, and in particular medical and veterinary, of these means.
- One of the essential aspects according to the invention consists in considering all of the NKR immunoreceptors and NKR counterparts as a repertoire, that is to say as a coherent whole, forming a unit with respect to a type of activity.
- the control of the lymphocyte activation of the man or animal from which said biological sample is taken (negative control for the repertoire of NKR receptors, positive control for the repertoire of NKR counterparts).
- the invention provides, for the first time, means making it possible to document, routinely in a medical or veterinary context, NKR directories and / or NKR counterparts, so as to be able to quickly and effectively analyze physiological and pathological situations related to these directories.
- the means according to the invention have the particular advantage of being easily usable in a medical or veterinary context, for example in a hospital or clinic.
- the present invention relates to an in vitro method for documenting a repertoire of NKR immunoreceptor (s) comprising in particular the KIR receptors p58.1, p58.2, p70.INH, p O.INH, and the receptors NKG2A and NKG2B , and / or a repertoire of NKR counterpart immunoreceptor (s), comprising in particular the KAR p50.1, p50.2, p70.ACT, pl40.ACT receptors, and the NKG2C, NKG2D, NKG2E receptors, NKG2F, these immunoreceptors being hereinafter designated target receptor (s), characterized in that it comprises: i.
- oligonucleotides one being designated 3 'oligonucleotide and the other 5' oligonucleotide, the 3 'and 5' oligonucleotides of the same said pair being both capable, under conditions hybridization corresponding to an incubation for 1 min in a buffer [20 mM Tris-HCl pH8.4; KC1 50mM; 2.5 mM MgCl 2 ] at a temperature between approximately 50 ° C.
- a functional counterpart of a receptor we mean in the present application a receptor with homologous structure, in particular at the extracytoplasmic level, but with a different function: for example, a functional counterpart of the NKR p58.1 receptor is the counterpart receptor of NKR pSO . l, and vice versa; similarly the NKR p58.2 receiver and the NKR p50.2 counterpart receiver are functional counterparts for each other.
- the present method therefore makes it possible in particular to distinguish an NKR receiver (or NKR counterpart) from a functional counterpart receiver of this receptor.
- the pair (s) of 3 'and 5' oligonucleotides is (are) in particular capable of binding, on the DNA or cDNA of a target receptor which corresponds to them, a sequence of oligonucleotides (bounds included ) which is absent from the DNA or cDNA sequence of a receptor with which it (s) is (are) capable (s) of not hybridizing under the hybridization conditions given under i) above.
- said or at least one of said pair (s) of 3 'and 5' oligonucleotides used is also capable, under the same hybridization conditions as those defined in i., Of not being s' hybridize to the DNA or cDNA of a receptor, either NKR or NKR counterpart, other than said target receptor.
- said (or at least one of said pair (s) of 3 'and 5' oligonucleotides capable, under the hybridization conditions defined in i. above, to hybridize to DNA or cDNA of a p58.1 receptor (or p50.1), and not to hybridize to DNA or cDNA of a p50.1 receptor (or respectively ⁇ 58.1) is also capable of not hybridizing under the same conditions of hybridization to the DNA or the cDNA of a p58.2 or p50.2 receptor.
- said, or at least one of said, pair (s) of 3 'and 5' oligonucleotides capable, under the hybridization conditions defined under i. above, to hybridize to the DNA or cDNA of a p58.2 receptor (or p50.2), and not to hybridize to the DNA or cDNA of a p50 receptor .2 (or respectively p58.2) is also capable of not hybridizing under the same hybridization conditions to the DNA or the cDNA of a p58.1 or p50.1 receptor.
- said (or at least one of said) pair (s) of oligonucleotides 3 'and 5 ! capable, under the hybridization conditions defined in i. above, to hybridize to the DNA or cDNA of a p70.INH receptor (or p70.ACT), and not to hybridize to the DNA or cDNA of a p70 receptor .
- ACT (or respectively p70. ⁇ S ⁇ [) is also capable of not hybridizing under the same conditions of hybridization to the DNA or the cDNA of a pl40.INH or pl40.ACT receptor.
- said, or at least one of said, pair (s) of 3 'and 5' oligonucleotides capable, under the hybridization conditions defined under i. above, to hybridize to the DNA or cDNA of a pl40.INH receptor (or pl40.ACT), and not to hybridize to the DNA or cDNA of a pl40 receptor .
- ACT (or respectively pl40.INH) is also capable of not hybridizing under the same conditions of hybridization to the DNA or the cDNA of a p70.INH or p70.ACT receptor.
- the 5 ′ oligonucleotide of a said pair of 3 'and 5' oligonucleotides used for an NKR target receptor is capable, under the hybridization conditions defined under i. above, to hybridize to the DNA or to the cDNA of a receptor counterpart of NKR (or respectively NKR), functional counterpart of said target receptor NKR (or respectively counterpart of NKR).
- the sequence of the oligonucleotide 5 ′ of the so-called pair of 3 'and 5 ′ oligonucleotides used for an NKR target receptor (or NKR counterpart) comprises the sequence of the oligonucleotide 5 ′ of another said pair of 3 ′ and 5 ′ alpha-nucleotides having as target receptor a counterpart receptor for NKR (or respectively NKR), functional counterpart of said target receptor NKR (or respectively counterpart for NKR).
- the 3 ′ oligonucleotide of a said pair of 3 ′ and 5 ′ oligonucleotides, used for a target receptor KAR is capable, under the same so-called hybridization conditions, of hybridize to the DNA or cDNA of said KAR target receptor at the level of a nucleotide sequence which comprises a sequence corresponding, according to the universal genetic code, and taking into account the degeneration of said code, to the amino acid sequence Lys Ile Pro Plie Thr Ile (KIPFTI) or Lys Leu Pro Phe Thr ⁇ e (KLPFTI) (SEQ ID n ° 26 or 27).
- KIPFTI KIPFTI
- KLPFTI Lys Leu Pro Phe Thr ⁇ e
- said (or at least one of said) pair (s) of 3 ′ and 5 ′ oligonucleotides having as target receptor a KIR receptor is chosen from the group of pairs of 3 hgonucleotides 'and 5' consisting of: a 5 'oligonucleotide comprising the sequence SEQ LD No. 1, or a sequence derived therefrom, and at least one 3' oligonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 5, No. 2, No. 6 or No. 7, or a sequence derived therefrom, a 5 'ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No.
- sequence deriving from a first sequence we mean in the present application a sequence derived from the first in particular by inversion, deletion, addition, or substitution of nucleotide (s), and having the hybridization properties that the corresponding nucleic acid to the first sequence present in conditions i. above defined.
- said pair of 3 'and 5' ohgonucleotides having as target receptor a p58.1 receptor corresponds to a 5 'ohgonucleotide comprising SEQ ID No. 1, or a sequence derived therefrom, and an equimix of four 3 'oligonucleotides, each comprising SEQ ID NO: 5, NO 2, NO 6 or NO 7, or a sequence derived therefrom.
- said pair of 3 'and 5' ohgonucleotides having as target receptor a p58.2 receptor corresponds to a 5 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 4, or a sequence derived therefrom , and an equimix of four 3 'oligonucleotides, each comprising SEQ ID NO: 5, NO 2, NO 6 or NO 7, or a sequence derived therefrom.
- said pair of 3 'and 5' oligonucleotides having as target receptor a p70.INH receptor corresponds to a 5 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 9, or a sequence in deriving, and an equimix of four 3 'oligonucleotides, each comprising SEQ ID NO: 5, NO 2, NO 6 or NO 7, or a sequence derived therefrom.
- said pair of 3 'and 5' oligonucleotides having as target receptor a pl40.INH receptor corresponds to an equimix of four 5 'oligonucleotides, each of them comprising SEQ ID # 10, # 11, # 12 or # 13, or a sequence derived therefrom, and a 3 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 14, or a sequence derived therefrom.
- said (or at least one of said) pair (s) of 3 ′ and 5 ′ oligonucleotides having as target receptor a KAR receptor is chosen from the group of 3 ′ pairs of oligonucleotides and 5 'consisting of:
- a 5 'ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 1, or a sequence derived therefrom
- a 3' ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 3, or a sequence derived therefrom
- a 5 'ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 8, or a sequence derived therefrom
- a 3 ′ ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 3, or a sequence derived therefrom
- a 5 'ohgonucleotide comprising the sequence SEQ 3D No. 9, or a sequence derived therefrom
- a 3' ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 3, or a sequence derived therefrom
- a 5 'ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 15, or a sequence derived therefrom, and a 3' ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 3, or a sequence derived therefrom.
- said pair of 3 'and 5' oligonucleotides having as target receptor a p50.1 receptor corresponds to a 5 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 1, or a sequence derived therefrom , and a 3 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 3, or a drifting sequence.
- said pair of 3 ′ and 5 ′ oligonucleotides having as target receptor a p50.2 receptor corresponds to a 5 ′ oligonucleotide comprising SEQ ID No. 8, or a sequence in derived, and a 3 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 3, or a sequence derived therefrom.
- said pair of 3 'and 5' oligonucleotides having as target receptor a p70.ACT receptor corresponds to a 5 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 9, or a sequence derived therefrom, and a 3 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 3, or a sequence derived therefrom.
- ACT receptor corresponds to a 5 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 15, or a sequence derived therefrom, and a 3 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 3, or a sequence derived therefrom.
- said (or at least one of said) pair (s) of 3 'and 5' oligonucleotides having as target receptor an NKG2 receptor is chosen from the group of pairs of 3 'and 5' ohgonucleotides consisting of:
- a 5 'ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 16, or a sequence derived therefrom
- a 3' ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 17, or a sequence derived therefrom
- a 5 'ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 18, or a sequence derived therefrom
- a 3' ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 17, or a sequence derived therefrom
- a 5 'ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 20, or a sequence derived therefrom, and a 3' ohgonucleotide comprising the sequence SEQ ID No. 21, or a sequence derived therefrom.
- said pair of 3 'and 5' oligonucleotides having as target receptor an NKG2A receptor (inhibitor) corresponds to a 5 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 16, or a sequence derived therefrom, and a 3 'ohgonucleotide comprising SEQ ID No. 17, or a sequence derived therefrom.
- said pair of 3 'and 5' oligonucleotides having as target receptor an NKG2B receptor (inhibitor) corresponds to a 5 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 18, or a sequence derived therefrom, and a 3 'ohgonucleotide comprising SEQ ID No. 17, or a sequence derived therefrom.
- said pair of 3 'and 5' oligonucleotides having as target receptor an NKG2C receptor (activator) corresponds to a 5 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 19, or a sequence derived therefrom, and a 3 'ohgonucleotide comprising SEQ ID No. 17, or a sequence derived therefrom.
- said pair of 3 'and 5' oligonucleotides having as target receptor an NKG2D receptor (activator) corresponds to a 5 'oligonucleotide comprising SEQ ID No. 20, or a sequence derived therefrom, and a 3 'ohgonucleotide comprising SEQ ID No. 21, or a sequence derived therefrom.
- Said conditions favorable to the hybridization of the pair (s) of 3 'and 5' alpha-nucleotides brought into contact with the DNA or cDNA of the biological sample advantageously correspond to an incubation for 1 min in a buffer [Tris- 20mM HCl pH8.4; KC1 50mM; 2.5 mM MgCl 2 ] at one temperature between 50 ° C and 65 ° C approximately.
- a buffer Tris- 20mM HCl pH8.4; KC1 50mM; 2.5 mM MgCl 2
- the two 3 'or 5' oligonucleotides of the same said pair are each coupled to a label, in particular coupled to a fluorescent or radioactive label, such as 32 P, allowing the revealing of the hybrids which they possibly form. with said DNA or cDNA populations of said biological sample.
- said pair (s) of oligonucleotide (s) 3 ′ and 5 ′ serve (serve) primers respectively 3 ′ and 5 ′ for extension by DNA polymerase, such as a Taq polymerase.
- DNA polymerase such as a Taq polymerase.
- Conditions favorable to such an extension include, in addition to the addition of DNA polymerase, the addition of 4 dNTPs (deoxyribonucleoside-triphosphate) in the presence of a buffer
- hybrids which may be formed are then, prior to their detection, amplified by at least one PCR (polymerase chain reaction; cf. patents EP 201 184 and EP 200 362) or RT-PCR in the case of cDNA retrotranscribed from of mRNA.
- said hybrids which may be formed are amplified by "Nested PCR” (nested double PCR). Examples of conditions favorable to PCR amplification are given in the examples.
- said detection of the hybrids possibly formed further comprises the resolution on polyacrylamide gel of the reaction mixture resulting from the bringing into contact, as well as the revelation of the presence or absence of electrophoretic strips containing said possibly formed hybrids.
- the documented immunoreceptor repertoire is quantified by reference to the quantities of b-actin measured on the same biological sample, or by reference to the quantities of a molecule specific for a cell type present in said biological sample, such as in particular the CD56 molecules for NK cells.
- step ii. contacting defined above is then carried out with the genomic DNA populations of the biological sample.
- step ii. contact defined above is then carried out with the cDNA populations, transcribed from the mRNA populations of the biological sample.
- Biological samples of human or animal origin particularly suitable for implementing the method according to the invention include peripheral blood, bone marrow, lymphocytes, NK and / or T cells, transgenic cells expressing immunoreceptors , a fraction isolated from these samples.
- the method according to the invention can in particular be applied to the screening of a bank of organs, tissues or cells.
- the method according to the invention also allows the monitoring of the possible appearance of such reactions after allo- or xenogenic transplant or transplantation.
- the method according to the invention can also be applied to the determination of the state of activation of NK and / or T cells at a given time in an animal or a man. It then allows the prediction or the monitoring of the state of resistance of an animal or a man vis-a-vis a viral infection, such as an infection by a VLH, of a parasitic infection, such as malaria, a bacterial infection, vis-à-vis an autoimmune disease, such as rheumatoid arthritis, or even vis-à-vis the development of mahgnes cells such as leukemic cells.
- the predictive use of the method according to the invention is of particular interest in the context of epidemics.
- the method according to the invention can also be advantageously applied to the screening of drugs which are active against infectious diseases, autoimmune diseases, or tumor diseases.
- the present invention also relates to a kit for the implementation of said method comprising in a container, at least one said pair of hgonucleotides, the reagents for carrying out said method or methods such as buffer, marker (optionly coupled to the oligonucleotides of said pair), as well as a manual.
- FIG. 1 represents the products resulting from an amplification by PCR (polymerase chain reaction after RT reverse enzymatic transcription using pairs of oligonucleotides according to the invention serving as primers), coding sequences for p50.2 (Fig. 1A) and p58.2 (Fig.lB) in human NK cells;
- Figure 2 represents the products resulting from a PCR amplification of the coding sequence for p50.2 from the genomic DNA of p50.2 + transgenic mice.
- Example 1 Documentation of the NKR directory / NKR counterparts expressed by a population of human NK cells (RT-PCR).
- RNA preparations were made from cloned and phenotyped human NK cells p50.2 + and / or p58.2 +.
- the immunological technique does not allow to precisely document such a repertoire: the antibody GL183 (Immunotech) recognizes both the inhibitor NKR receptor p58.2 and its activating counterpart p50.2.
- Human NK cells cloned and phenotyped p50.2 " and p58.2 " using the antibody GL183 serve as negative controls.
- RNA preparations are rearranged as follows.
- Trizol Gibco BRL category No. 15596-026
- 100 ⁇ l of Trizol 100 ⁇ l was added to 10 6 ceUules. Mix by pipetting several times, without using a vortex mixer. The solution is left for 5 minutes at room temperature and then 20 ⁇ l of chloroform without isoamyl alcohol are added. Mix again without using a vortex mixer and allow the solution to stand for 5 minutes at room temperature. Then centrifuged at 4 ° C for 15 minutes so as to separate the lower organic phase, which contains DNA, from the upper aqueous phase which contains TARN. The aqueous phase is recovered without disturbing the interface between the aqueous phase and the organic phase.
- RNA pellet is resuspended suspension in 20 ml of H 2 0.
- Table 1 presents the pairs of oligonucleotides used. Here are reported the results relating to the use of the pairs of oligonucleotides C (SEQ ID n ° 4 as a 5 'oligonucleotide and a mixture of SEQ ID n ° 5, n ° 2, n ° 6 and n ° 7 as 3 ′) and D (SEQ ID No. 8 as 5 ′) and SEQ ID No. 3 as 3 ′) presented in Table 1.
- the cDNA sequences based on from which these pairs of oligonucleotides were developed, are presented in Table 2 below (name of the cDNA clones and access number on Genbank). For each pair of oligonucleotides, allelic variants and known variants of excision-splicing (alternative splicing) of the same receptor were thus taken into account.
- Each pair of oligonucleotides is constructed, after alignment of the known cDNA sequences of the different variants of the same target receptor (eg the KIR p58.2), so that this pair can determine, on all of these variants, the bounds of a consensus fragment, without being able to do the same on any variant of the counterpart receptor of the target receptor (eg the KAR p50.2).
- the sequence of each ohgonucleotide of the same pair is then optimized so that the annealing temperature (annealing in English) of each of them is close (e.g. ⁇ T ⁇ 5 ° C).
- Each ohgonucleotide has its own annealing (or hybridization) temperature.
- Annealing (or hybridization) temperature of an ohgonucleotide
- Tm 69.3 + 0.41 (R) - - (in ° C) length in bp
- oligonucleotides of the same pair must both be able to anneal to the target receptor under common reaction conditions, this in order to serve as primers for the amplification of the consensus fragment . If the oligonucleotides of the same pair have close natural annealing temperatures (eg 54 ° C and 56 ° C), they can hybridize to the target receptor, without hybridizing to the corresponding counterpart receptor, at a temperature 54 ° C or 55 ° C.
- the hybridization reaction to the target receptor is preferably carried out at the lower of the two temperatures (eg 49 ° C or 50 ° C), which makes it possible to maintain recognition of its nucleotide target by the ohgonucleotide whose natural annealing temperature is the lowest.
- a decrease in specificity may however occur: It can be observed that certain pairs of alpha-nucleotides manage, under such temperature conditions, to hybridize to the receptor-counterpart of the target receptor.
- One way of remedying this loss of specificity consists in increasing the length of the oligonucleotide whose natural annealing temperature is the lowest, without causing the pair of oligonucleotides considered to lose its specificity.
- RNA 5 ⁇ g of total RNA are transcribed into cDNA by incubation with a reverse transcriptase (RT) using the First Strand DNA-Ready to go kit (Pharmacia). 10 ⁇ l of cDNA on the 33 ⁇ l obtained are brought into contact with the pairs of oligonucleotides C and D which then serve as primers (cf.
- n ° 2 35 cycles including a) denaturation 1 min at 94 ° C b) annealing 1 min at 55 ° C for the C pair and 50 ° C for the D pair of oligonucleotides, c) extension 1 min at 72 ° C,
- n ° 3 (final extension): l min at 72 ° C.
- the duration of the 2c extension can be increased if the fragment to be amplified has a large size (e.g. greater than about 1000-1400bp).
- the temperature of the annealing step 2b depends on the pair of oligonucleotides used as primers (cf. point 2. above). It corresponds to a consensus temperature between the natural annealing temperatures of each of the two paired oligonucleotides (average temperature or lower temperature of the two). This temperature is generally between 45 ° C and 70 ° C, preferably between 50 ° C and 65 ° C.
- Figure 1 illustrates the amphfication by PCR after RT (reverse enzymatic transcription) of the coding sequences for p58.2 and p50.2 of human NK cells.
- FIG. 1A is illustrated the result of the electrophoretic resolution of the products resulting from the amplification by RT-PCR after contacting the pair of primers D according to the invention (cf. table 1) with the cDNA populations of ceUules human NK phenotyped p50.2 + and p58.2 + (lane +) using the antibody GL183, or with the cDNA populations of human NK cells phenotyped p50.2 " and p58.2 " (lane -) using this same GL183 antibody.
- track M molecular weight markers are resolved.
- FIG. 1B the result of the electrophoretic resolution of the products resulting from the amplification by RT-PCR is illustrated after contacting the pair of primers C according to the invention (cf. table 1) with the cDNA populations of this cells.
- track M molecular weight markers are resolved.
- pairs of C and D ohgonucleotides according to the invention make it possible to recognize a phenotype, respectively, p58.2 + and p50.2 + , by recognizing a fragment of, respectively, 653 bp and 533 bp.
- the method according to the invention therefore makes it possible to discriminate between a p58.2 + phenotype (KIR receptor, with inhibitory function) and a p50.2 + phenotype (KAR receptor counterpart of p58.2, with activating function), which does not was so far not achievable under sequencing.
- Example 2 Documentation of the (potential) NKR genetic repertoire / NKR counterparts of a population of p50.2 + transgenic mouse splenocytes (PCR).
- DNA preparations were carried out using p50.2 + transgenic mouse splenocytes.
- the immunological technique does not make it possible to determine if such splenocytes are p50.2 + (KAR receptor, activator) or p58.2 + (KIR receptor, inhibitor, or even p50.2 + and p58.2 + ).
- Non-transgenic mouse splenocytes (p50.2 " ) serve as negative controls. Extraction This step is carried out as described in Example 1.
- the DNA being contained in the lower organic phase, it is this phase which is recovered here after having eliminated the aqueous phase and a little interface.
- Precipitation 30 ⁇ l of 100% ethanol is added and the mixture is left to stand for 5 minutes at room temperature. After centrifugation for 5 minutes at 4 ° C (2,000 g), the supernatant is discarded and the pellet is washed with 100 ⁇ l of 0.1M sodium citrate in 10% ethanol. It is left for 30 minutes at room temperature, mixing from time to time. Centrifuge for 5 minutes at 4 ° C (2,000g). This washing is repeated a second time.
- the DNA pellet obtained is resuspended in 200 ⁇ l of 70% ethanol. It is left for 15 minutes at room temperature, mixing from time to time and it is centrifuged for 5 minutes at 4 ° C. (2000 g).
- the pellet is dried briefly under vacuum (1 to 2 ⁇ g of DNA approximately are obtained) and is resuspended in 10 ⁇ l of 8mM NaOH. In the presence of insoluble material, nhcrocentrifuge 10 minutes at room temperature. The supernatant is transferred to a new tube. The pH is neutralized by adding 1.25 ⁇ l of 0.1 M dHepes per 10 ⁇ l.
- the pairs of ohgonucleotides are prepared as described in Example 1.
- the results relating to the pair D of oligonucleotides are reported here (SEQ ID No. 8 as the 5 'ohgonucleotide and SEQ ID No. 3 as the Ogonucleotide 3 ') according to the invention (see Table 1 below).
- the polymerase chain reaction is carried out as described in Example 1 by bringing the genomic DNA preparations obtained into contact with pairs of oligonucleotides D then serving as primers.
- the products resulting from the amplification are resolved on 2% agarose gel in parallel with molecular weight markers (M).
- FIG. 2 shows the amplification by PCR of the coding sequence for p50.2 from the genomic DNA of p50.2 + transgenic mouse splenocytes: there is illustrated the result of the electrophoretic resolution of the products resulting from ramplification by PCR in contact of the pair of primers D according to the invention (cf. table 1) with the DNA populations of splenocytes of p50.2 J " transgenic mice (lanes +) or of p50.2 " non-transgenic mice (lanes -) .
- the primers D according to the invention make it possible to recognize a 533 bp fragment present on the DNA of murine splenocytes p50.2 + and absent on the DNA of murine splenocytes p50.2 " .
- NKR repertoires and / or counterparts of NKR thus documented can be, in particular using conventional biostatic studies, correlated to given physiological or pathological situations, linked to these repertoires, and to the control of the activation of the cells expressing them. in general. Table 1
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Abstract
L'invention concerne une méthode in vitro de documentation d'un répertoire en immunorécepteur(s) NKR et/ou contreparties de NKR, comprenant (i) l'utilisation d'au moins une paire d'oligonucléotides 3' et 5' capable de s'hybrider à un récepteur cible NKR, ou contrepartie de NKR, et de ne pas s'hybrider à un récepteur contrepartie fonctionnelle de ce récepteur cible; (ii) la mise en contact de cette paire d'oligonucléotides 3' et 5' avec l'ADN ou ADNc d'un échantillon à étudier; et (iii) la détection des hybrides éventuellement formés. L'invention vise également les applications biologiques de cette méthode, notamment criblage de banque d'organes, tissus, cellules en vue de greffes, et à des kits pour sa mise en oeuvre.
Description
Moyens de documentation de répertoires en immunorécepteurs NKR et/ou en immunorécepteurs contreparties activatrices ou non inhibitrices d'immunorécepteurs NKR
La présente invention concerne des moyens permettant de documenter les répertoires d'un individu humain ou animal en immunorécepteurs NKR (Natural Killer Receptor) du type des immimoglobulines ou du type des lectines, et en immunorécepteurs contreparties activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices, d'immunorécepteurs NKR. Elle vise également leurs applications biologiques.
Les fonctions immuriitaires d'un homme ou d'un animal sont définies par plusieurs catégories de molécules hautement diversifiées, telles que notamment le système des groupes sanguins ABO, la famille des molécules du CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité, appelé chez l'homme, système ELLA - Hiiman Leukocyte Antigen-), la famille des récepteurs pour l'antigène des lymphocytes T (TCR) et des lymphocytes B (BCR). L'ensemble des molécules qu'un individu adulte exprime, ou est capable d'exprimer, pour chacune de ces différentes familles constitue, exception faite des vrais jumeaux, un répertoire évolutif qui lui est propre et qui intervient dans la reconnaissance du soi ou du non-soi.
D'autres grands répertoires ont été plus récemment identifiés. Il s'agit du répertoire en récepteurs NKR de type immunoglobuline et du répertoire en récepteurs NKR de type lectine. Les récepteurs NKR de type immunoglobuline comprennent les récepteurs KIR (Killer cell Inhibitory Receptor) tels que notamment les récepteurs p58.1, p58.2, p70.INH, pl40.LNH. Les récepteurs NKR de type lectine comprennent les récepteurs inhibiteurs NKG2 tels que notamment les récepteurs NKG2A et NKG2B. L'ensemble de ces récepteurs
NKR sont à fonction inhibitrice. Des récepteurs qui leur sont hautement homologues, en particulier au niveau extracytoplasmique, assurent toutefois des fonctions activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices : il s'agit des récepteurs KAR (Killer cell Activatory Receptor) homologues aux récepteurs KIR, et des récepteurs NKG2C, NKG2D, NKG2E et NKG2F homologues aux récepteurs NKG2A et NKG2B. Les récepteurs contreparties activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices, de récepteurs inhibiteurs NKR sont ci-après désignés, par souci de fluidité, contreparties de NKR.
Les récepteurs NKR et les récepteurs contreparties de NKR sont naturellement exprimés par les cellules NK et par des sous-populations de cellules T. Plusieurs de ces récepteurs peuvent être exprimés par une même cellule. Tous ces récepteurs, qu'ils soient inhibiteurs (i.e. NKR) ou qu'ils soient activateurs ou non inhibiteurs (i.e. contreparties de NKR), ont en commun d'avoir pour ligand des molécules qui ne sont pas dérivées d'antigène : les ligands des récepteurs NKR et des récepteurs contreparties de NKR sont des molécules du CMH de classe I.
La reconnaissance de son ligand par un récepteur NKR déclenche la transduction à la cellule d'un message visant à inhiber son activité, e.g. diminution ou arrêt de la cytolyse, de la sécrétion de cytokines, alors que la reconnaissance de son ligand par un récepteur contrepartie de NKR y induit un message activateur, ou à tout le moins non inhibiteur. A la résultante entre récepteurs NKR et récepteurs contreparties de NKR ainsi activés par leurs ligands, correspond un signal, globalement négatif ou positif, d'activation des cellules NK et/ou T qui les expriment.
Les récepteurs NKR et leurs contreparties participent ainsi au contrôle, positif ou négatif, des réactions allogéniques d'un système immunitaire donné vis- à-vis de ce qu'il considère alors comme non-soi par exemple, des cellules cancéreuses ou infectées, ou bien encore des cellules de greffe ou transplantation
allo- ou xéno-génique.
Les récepteurs NKR et leurs contreparties participent en effet aux réactions entre hôte et greffon lors d'une greffe (ou transplantation) de cellules, tissu ou organe qui présente(nt) un certain degré d'incompatibilité antigénique avec l'hôte. L'implication de récepteurs NKR et de leurs contreparties dans la tolérance envers des greffes incompatibles, et dans l'effet sélectif de lyse de cellules mahgnes parfois observé après greffe de moelle osseuse, ou effet GVL (Graft Versus Leukemia), a en effet été démontrée in vivo (cf. Cambiaggi et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, p. 8088-8092 ; Albi et al. 1996, Blood, vol. 87, n°9, p. 3993-4000).
Or, les moyens pouvant actuellement être mis en oeuvre dans un contexte médical ne permettent pas de documenter l'ensemble des répertoires d'un patient, d'un organe, d'un tissu ou de cellules.
C'est ainsi qu'actuellement, seule la compatibilité des molécules HLA-A, HLA-B et HLA-DR du donneur et du receveur est vérifiée préalablement à une greffe ou transplantation allo- ou xéno-génique. Ces critères de compatibilité n'apparaissent toutefois pas comme suffisants. Des traitements immunosuppresseurs (par exemple, à base de cyclosporine) doivent compléter ces procédures de greffe ou transplantation de manière à inhiber le système immunitaire du patient. De tels traitements sont à hauts risques pour le patient qui est alors susceptible de développer des infections opportunistes. Ces traitements immunosuppresseurs doivent de plus être maintenus à un certain niveau pendant plusieurs années, et le patient doit alors résister aux effets délétères des médicaments. Finalement, la réussite de telles procédures de greffe ou transplantation reste incertaine. En effet, des rejets de greffe de la part du receveur, ou bien encore, dans le cas de greffes comprenant des cellules immuno-compétentes, des réactions du greffon contre l'hôte (effet GVH, Graft Versus Host) sont malgré tout observés. De telles réactions de rejet ou de GVH conduisent généralement à de très sévères lésions;
actuellement, elles ne peuvent toutefois être totalement écartées, et donc prévenues.
Des effets bénéfiques inattendus de greffes allogéniques ont par ailleurs parfois été observés : des greffes allogéniques de moelle osseuse sur des patients leucémiques aplasiques ont parfois conduit à un effet thérapeutique anti-tumoral par lyse des cellules malignes du receveur et préservation de ses cellules saines. Cet effet thérapeutique sélectif, dans lequel sont impliquées les cellules NK et T, est désigné par GVL (Graft Versus Leukemia). Potentiellement, une greffe (ou une transplantation) de tissu hématopoïétique en général, et de moelle osseuse en particulier, peut conduire à un effet thérapeutique dans le cadre de malignités hématologiques telles qu'une leucémie, par lyse sélective de celles des cellules du receveur qui ne présentent plus les antigènes d'iiistocompatibilité présentés par les cellules saines. Les moyens actuellement disponibles pour le milieu médical ne permettent toutefois pas de prédire si l'organe ou le tissu considéré exercera un effet sélectif GVL pour le receveur considéré. Bien que connu, l'effet sélectif GVL ne peut donc actuellement être mis à profit dans le cadre d'une thérapie anticancéreuse.
Les moyens actuellement développés dans le cadre de recherches expérimentales afin de documenter les différents répertoires de cellules humaines ou animales ne permettent par ailleurs pas de documenter précisément le répertoire en récepteurs NKR et en récepteurs contreparties de NKR : l'identité précise de chaque récepteur NKR ou contrepartie de NKR ne peut être déterminée. Du fait de la forte homologie, en particulier au niveau extracytoplasmique, entre un récepteur NKR et un récepteur contrepartie de ce NKR (e.g. jusqu'à 96% d'homologie entre KIR et KAR), l'utilisation d'anticorps ne permet en effet souvent pas de discriminer entre des NKR qui sont inhibiteurs et leurs contreparties à fonctions activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices. Les amorces oligonucléotidiques actuellement disponibles ne permettent quant à
elles pas la mise en oeuvre d'une amplification en chaîne par polymérase capable de discriminer entre par exemple un NKR p58.1 et un NKR p58.2, ou entre im NKR p70.INH et un NKR pl40.INH. Finalement, pour documenter précisément le répertoire en immunorécepteurs NKR et en leurs contreparties, il faut actuellement avoir recours après une étape de purification des récepteurs visés (e.g. par FACScaηj, à une étape de séquençage nucléotidique. La documentation du répertoire NKR /contreparties de NKR n'est donc actuellement pas réalisable en routine dans un contexte de type médical. Le niveau de stimulation et d'inhibition des programmes d'activation des cellules NK et T, et donc le potentiel de résistance d'un individu vis-à-vis du développement d'infections microbiennes ou parasitaires, de maladies auto-immunes, ou bien encore de cellules mahgnes, ne peut donc être mesuré. Il résulte également de cette absence de moyens adaptés pour la documentation des répertoires NKR contreparties de NKR que les effets sélectifs de type GVL ne peuvent être utilisés en thérapie, et que les réactions GVH ou de rejets lors de greffes ou de transplantations allo- ou xéno-géniques ne peuvent être complètement écartées.
La présente invention propose donc des moyens permettant de documenter, pour un échantillon biologique donné, les répertoires en immunorécepteurs NKR et en immunorécepteurs contreparties activatrices ou à tout le moins non inhibitrices de récepteurs NKR. Ces moyens permettent notamment de distinguer aisément entre un récepteur NKR et sa contrepartie activatrice ou non inhibitrice, ainsi que de distinguer entre différents récepteurs NKR, ou entre différentes contreparties de NKR. Elle vise également les applications biologiques, et en particulier médicales et vétérinaires, de ces moyens. L'un des aspects essentiels selon l'invention consiste à considérer l'ensemble des immunorécepteurs NKR et contreparties de NKR comme un répertoire, c'est-à-dire comme un ensemble cohérent, formant une unité par rapport à un type d'activité, en l'occurence, de manière particulièrement avantageuse, le contrôle de l'activation lymphocytaire de
l'homme ou l'animal dont est issu ledit échantillon biologique (contrôle négatif pour le répertoire des récepteurs NKR, contrôle positif pour le répertoire des contreparties de NKR). L'invention fournit, pour la première fois, des moyens permettant de documenter, en routine dans un contexte médical ou vétérinaire, des répertoires NKR et/ou contreparties de NKR, de manière à pouvoir analyser rapidement et efficacement des situations physiologiques et pathologiques liées à ces répertoires.
Les moyens selon l'invention présentent notamment l'avantage d'être aisément utilisables dans un contexte médical ou vétérinaire, par exemple en hôpital ou clinique.
La présente invention a pour objet une méthode in vitro de documentation d'un répertoire en immunorécepteur(s) NKR comprenant notamment les récepteurs KIR p58.1, p58.2, p70.INH, p O.INH, et les récepteurs NKG2A et NKG2B, et/ou d'un répertoire en immunorécepteur(s) contrepartie(s) de NKR, comprenant notamment les récepteurs KAR p50.1, p50.2, p70.ACT, pl40.ACT, et les récepteurs NKG2C, NKG2D, NKG2E, NKG2F, ces immunorécepteurs étant ci- après désigné(s) récepteur(s) cible(s), caractérisée en ce qu'elle comprend : i. l'utilisation d'au moins une paire d'oligonucléotides, l'un étant désigné oligonucléotide 3' et l'autre oligonucléotide 5', les oligonucleotides 3' et 5' d'une même dite paire étant tous deux capables, dans des conditions d'hybridation correspondant à une incubation pendant 1 min dans un tampon [Tris-HCl 20mM pH8,4; KC1 50mM; MgCl2 2,5mM] à une température comprise entre 50°C et 65°C environ, de s'hybrider à l'ADN ou à l'ADNc d'un récepteur cible NKR, ou contrepartie de NKR, mais ne s'hybridant pas, dans les mêmes conditions d'hybridation, avec l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR, ou respectivement d'un récepteur NKR, contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible, ii. la mise en contact de populations ADN ou ADNc d'un échantillon
biologique d'origine humaine ou animale pour lequel on souliaite documenter le répertoire en immunorécepteur(s) cible(s), avec un excès d'au moins une paire d'ohgonucléotides 3' et 5' selon i. dans des conditions favorables à l'hybridation de cette paire oligonucleotides 3' et 5' sur les ADN ou sur les ADNc de l'échantillon biologique, et iii. la détection des hybrides éventuellement formés entre ces ADN ou ADNc et la ou les paire(s) d'ohgonucléotides 3' et 5'.
Par contrepartie fonctionnelle d'un récepteur, nous entendons dans la présente demande un récepteur à structure homologue, en particulier au niveau extracytoplasmique, mais à fonction différente : par exemple, une contrepartie fonctionnelle du récepteur NKR p58.1 est le récepteur contrepartie de NKR pSO. l, et réciproquement; de même le récepteur NKR p58.2 et le récepteur contrepartie de NKR p50.2 sont l'un pour l'autre des contreparties fonctionnelles.
La présente méthode permet donc notamment de distinguer un récepteur NKR (ou contrepartie de NKR) d'un récepteur contrepartie fonctionnelle de ce récepteur.
La (ou les) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' est (sont) en particulier capables de borner, sur l'ADN ou lΑDNc d'un récepteur cible qui leur correspond, une séquence d'ohgonucléotides (bornes incluses) qui est absente de la séquence ADN ou ADNc d'un récepteur avec lequel elle(s) est (sont) capable(s) de ne pas s'hybrider dans les conditions d'hybridation données sous i) ci-dessus.
De manière avantageuse, ladite ou au moins une desdites paire(s) d'ohgonucléotides 3' et 5' utilisée(s) est en outre capable, dans les mêmes conditions d'hybridation que celles définies sous i., de ne pas s'hybrider à l'ADN ou ADNc d'un récepteur, indifféremment NKR ou contrepartie de NKR, autre que ledit récepteur cible.
Selon une disposition particulière de cette manière avantageuse, ladite (ou
au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' capable, dans les conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN ou ΓADNC d'un récepteur p58.1 (ou p50.1), et de ne pas s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p50.1 (ou respectivement ρ58.1) est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p58.2 ou p50.2.
Selon une deuxième disposition particulière de cette manière avantageuse, ladite, ou au moins une desdites, paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' capable, dans les conditions d'hybridation défimes sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p58.2 (ou p50.2), et de ne pas s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p50.2 (ou respectivement p58.2) est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p58.1 ou p50.1.
Selon une troisième disposition particulière de cette manière avantageuse, ladite (ou au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5! capable, dans les conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p70.INH (ou p70.ACT), et de ne pas s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p70.ACT (ou respectivement p70.πSŒ[) est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur pl40.INH ou pl40.ACT.
Selon une quatrième d sposition particulière de cette manière avantageuse, ladite, ou au moins une desdites, paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' capable, dans les conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur pl40.INH (ou pl40.ACT), et de ne pas s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur pl40.ACT (ou respectivement pl40.INH) est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p70.INH ou p70.ACT.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'oligonucléotide 5'
d'une dite paire d'oligonucléotides 3' et 5' utilisée pour un récepteur cible NKR (ou contrepartie de NKR) est capable, dans les conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN ou à l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR (ou respectivement NKR), contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible NKR (ou respectivement contrepartie de NKR). Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la séquence de l'oligonucléotide 5' d'ime dite paire d'ohgonucléotides 3' et 5' utilisée pour un récepteur cible NKR (ou contrepartie de NKR) comprend la séquence de l'oligonucléotide 5' d'une autre dite paire d'ohgonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur contrepartie de NKR (ou respectivement NKR), contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible NKR (ou respectivement contrepartie de NKR).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, F oligonucléotide 3' d'une dite paire d'oligonucléotides 3' et 5', utilisée pour un récepteur cible KAR, est capable, dans les mêmes dites conditions d'hybridation, de s'hybrider à l'ADN ou ADNc dudit récepteur cible KAR au niveau d'un enchaînement nucléotidique qui comprend une séquence correspondant, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence dudit code, à la séquence d'acides aminés Lys Ile Pro Plie Thr Ile (K I P F T I) ou Lys Leu Pro Phe Thr ïïe (K L P F T I) (SEQ ID n°26 ou 27).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ladite (ou au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur KIR est choisie parmi le groupe de paires d'ohgonucléotides 3' et 5' constitué par : un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ LD n°l, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°4, ou ime séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°5,
n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, au moins un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°10, n°l l, n°12, ou n°13, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°14, ou une séquence en dérivant.
Par séquence dérivant d'une première séquence, nous entendons dans la présente demande une séquence dérivée de la première notamment par inversion, délétion, addition, ou substitution de nucléotide(s), et présentant les propriétés d'hybridation que l'acide nucléique correspondant à la première séquence présente dans les conditions i. ci-avant définies.
Selon une disposition de ce mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'ohgonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p58.1 correspond à un ohgonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°l, ou une séquence en dérivant, et un équimélange de quatre oligonucleotides 3', chacun d'eux comprenant la SEQ ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant.
Selon une autre disposition de ce mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'ohgonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p58.2 correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°4, ou une séquence en dérivant, et un équimélange de quatre oligonucleotides 3', chacun d'eux comprenant la SEQ ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de ce mode de réalisation particuhèrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p70.INH correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et un équimélange de
quatre oligonucleotides 3', chacun d'eux comprenant la SEQ ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de ce mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur pl40.INH correspond à un équimélange de quatre oligonucleotides 5', chacun d'eux comprenant la SEQ ID n°10, n°l l, n°12 ou n°13, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°14, ou une séquence en dérivant.
Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de rinvention, ladite (ou au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur KAR est choisie parmi le groupe de paires d'ohgonucléotides 3' et 5' constitué par :
- un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°l, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant,
- un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°8, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ LD n°3, ou une séquence en dérivant,
- un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ 3D n°9, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant,
- un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°15, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon une disposition de cet autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p50.1 correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°l, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°3, ou
une séquence en dérivant.
Selon une autre disposition de cet autre mode de réalisation particuhèrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p50.2 correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°8, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de cet autre mode de réalisation particuhèrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p70.ACT correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de cet autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur pl40.ACT correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°15, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon encore un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ladite (ou au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2 est choisie parmi le groupe de paires d'ohgonucléotides 3' et 5' constitué par :
- un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°16, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°17, ou une séquence en dérivant,
- un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°18, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°17, ou une séquence en dérivant,
- un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°19, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°17, ou une séquence en dérivant,
- un ohgonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°20, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°21, ou une séquence en dérivant.
Selon une première disposition de cet encore autre mode de réalisation particuhèrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2A (inhibiteur) correspond à im oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°16, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°17, ou une séquence en dérivant.
Selon une deuxième disposition de cet encore autre mode de réalisation particuhèrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2B (inhibiteur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°18, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°17, ou une séquence en dérivant.
Selon une troisième disposition de cet encore autre mode de réalisation particuhèrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2C (activateur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°19, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°17, ou ime séquence en dérivant.
Selon une quatrième disposition de cet encore autre mode de réalisation particuhèrement avantageux, ladite paire d'ohgonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2D (activateur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°20, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°21, ou une séquence en dérivant.
Lesdites conditions favorables à l'hybridation de la ou des paires d'ohgonucléotides 3' et 5' mises en contact avec l'ADN ou l'ADNc de l'échantillon biologique correspondent avantageusement à une incubation pendant 1 min dans un tampon [Tris-HCl 20mM pH8,4; KC1 50mM; MgCl2 2,5mM] à une
température comprise entre 50°C et 65°C environ. De telles conditions sont en particulier présentées dans les exemples.
De manière avantageuse, les deux oligonucleotides 3' ou 5' d'une même dite paire sont chacun couplés à un marqueur, notamment couplée à un marqueur fluorescent ou radioactif, tel que du 32P, permettant la révélation des hybrides qu'ils forment éventueUement avec lesdites populations ADN ou ADNc dudit échantillon biologique.
De manière également avantageuse, ladite (ou lesdites) paire(s) d'oligonucléotide(s) 3' et 5' sert (servent) d'amorces respectivement 3' et 5' pour une extension par ADN polymérase, telle qu'une Taq polymérase. Des conditions favorables à une telle extension comprennent, outre l'ajout d'ADN polymérase, l'ajout des 4 dNTP (désoxyribonucléoside-triphosphate) en présence d'un tampon
Lesdits hybrides éventuellement formés sont alors, préalablement à leur détection, amplifiés par au moins une PCR (amplification en chaîne par polymérase; cf. les brevets EP 201 184 et EP 200 362) ou RT-PCR dans le cas d'ADNc rétrotranscrit à partir d'ARNm. Le cas échéant, lesdits hybrides éventuellement formés sont amplifiés par "Nested PCR" (double PCR emboîtée). Des exemples de conditions favorables à l'amplification par PCR sont donnés dans les exemples.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite détection des hybrides éventuellement formés comprend en outre la résolution sur gel de polyacrylamide du mélange réactionnel issu de la mise en contact, ainsi que la révélation de la présence ou de l'absence de bandes électrophorétiques contenant lesdits hybrides éventueUement formés.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le répertoire en immunorécepteurs documenté est quantifié par référence aux quantités de b- actine mesurées sur le même échantillon biologique, ou par référence aux
quantités d'une molécule spécifique d'un type cellulaire présentes dans ledit échantillon biologique, tel que notamment les molécules CD56 pour les cellules NK.
La méthode selon l'invention peut être appliquée à la documentation d'un répertoire génotypique en immunorécepteurs NKR et/ou en immunorécepteurs contreparties de NKR : l'étape ii. de mise en contact définie ci-dessus est alors réalisée avec les populations ADN génomique de l'échantillon biologique.
La méthode selon l'invention peut également être appliquée à la documentation d'un répertoire d'expression en immunorécepteurs NKR et/ou en immunorécepteurs contreparties de NKR : l'étape ii. de mise en contact définie ci- dessus est alors réalisée avec les populations ADNc, rétro-transcrites des populations ARNm de l'échantiUon biologique.
Des échantiUons biologiques d'origine humaine ou animale particulièrement appropriés à la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention comprennent du sang périphérique, de la moelle osseuse, des lymphocytes, des cellules NK et/ou T, des ceUules transgéniques exprimant des immunorécepteurs, une fraction isolée à partir de ces échantiUons.
La méthode selon l'invention peut être notamment appliquée au criblage d'une banque d'organes, de tissus ou de cellules.
EUe permet ainsi une meilleure prévision :
- de l'acceptation ou de rejet, par un homme ou un animal, de cellules, d'un tissu ou d'un organe génétiquement différent(es),
- de l'inocuité ou de la pathogénicité (effet GVH), pour un homme ou un animal, d'une greffe ou transplantation, en particulier de cellules, tissu, ou organe génétiquement différent(es),
- d'un effet potentiel de type GVL que des cellules, un tissu ou un organe génétiquement différent(es) pourraient exercer sur un homme ou animal.
La méthode selon l'invention permet également le suivi de l'éventuelle
apparition de telles réactions après greffe ou transplantation allo- ou xénogénique.
La méthode selon l'invention peut également être appliquée à la déteπnination de l'état d'activation de cellules NK et/ou T à un instant donné chez un animal ou un homme. Elle permet alors la prévision ou le suivi de l'état de résistance d'un animal ou d'un homme vis-à-vis d'une infection virale, telle qu'une infection par un VLH, d'une infection parasitaire, telle que la malaria, d'une infection bactérienne, vis-à-vis d'une maladie auto-immune, telle que la polyarthrite rhumatoïde, ou bien encore vis-à-vis du développement de cellules mahgnes teUes que des ceUules leucémiques. L'utilisation prévisionnelle de la méthode selon l'invention est d'un intérêt particulier dans le cadre d'épidémies.
La méthode selon l'invention peut également être avantageusement apphquée au criblage de médicaments actifs vis-à-vis de maladies infectieuses, de maladies auto-immunes, ou de maladies tumorales.
La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en oeuvre de ladite méthode comprenant dans un récipient, au moins une dite paire d'ohgonucléotides, les réactifs pour la réalisation de ladite ou lesdites méthode(s) tels que tampon, marqueur (éventuellement couplé aux oligonucleotides de la dite paire), ainsi qu'un mode d'emploi.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à travers les exemples de réalisation suivants, donnés à titre indicatif et non hmitatifs.
Lesdits exemples font référence aux Figures 1 et 2 :
La Figure 1 représente les produits issus d'une amplification par PCR (amplification en chaîne par polymérase après RT transcription enzymatique inverse à l'aide de paires d'oligonucléotides selon l'invention servant d'amorces), des séquences codantes pour p50.2 (Fig. 1A) et p58.2 (Fig.lB) dans des cellules NK humaines;
La Figure 2 représente les produits issus d'une amplification par PCR de la
séquence codante pour p50.2 à partir du DNA génomique de souris transgéniques p50.2+.
Exemple 1 : Documentation du répertoire NKR/contreparties de NKR exprimé par une population de ceUules NK humaines (RT-PCR).
1. Préparation des ARN
Des préparations ARN ont été réalisées à partir de cellules NK humaines clonées et phénotypées p50.2+ et/ou p58.2+. La technique immunologique ne permet pas de documenter précisément un tel répertoire : l'anticorps GL183 (Immunotech) reconnaît à la fois le récepteur NKR inhibiteur p58.2 et sa contrepartie activatrice p50.2. Des cellules NK humaines clonées et phénotypées p50.2" et p58.2" à l'aide de l'anticorps GL183 servent de témoins négatifs.
Les préparations ARN sont réahsées comme suit.
Extraction
100 μl de Trizol (Gibco BRL catégorie n° 15596-026) ont été ajoutés à 106 ceUules. On mélange en pipetant plusieurs fois, sans utiliser de mélangeur à vortex. On laisse la solution 5 minutes à température ambiante puis on ajoute 20 μl de chloroforme sans alcool isoamylique. On mélange à nouveau sans utiliser de mélangeur à vortex et on laisse la solution se reposer 5 minutes à température ambiante. On centrifuge alors à 4°C pendant 15 minutes de manière à bien séparer la phase organique inférieure, qui contient l'ADN, de la phase aqueuse supérieure qui contient TARN. On récupère la phase aqueuse sans perturber l'interface entre phase aqueuse et phase organique.
Précipitation
50 μl d'isopropanol sont ajoutés à la phase aqueuse et on laisse l'ARN précipiter pendant 15 minutes à température ambiante. On centrifuge alors pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé, et le culot est lavé avec 100 μl d'éthanol à 70%. Après centrifugation pendant 5 minutes à 4°C (7500 g), on laisse sécher à l'air libre (sans sécher sous vide). Le culot d'ARN est remis en
suspension dans 20 ml d'H20.
2. Préparation des paires d'oligonucléotides Le tableau 1 ci-dessous présente les paires d'oligonucléotides utilisées. Sont ici rapportés les résultats relatifs à l'utilisation des paires d'oligonucléotides C (SEQ ID n°4 en tant qu'ohgonucléotide 5' et un équunélange de SEQ ID n°5, n°2, n°6 et n°7 en tant qu'ohgonucléotide 3') et D (SEQ ID n°8 en tant qu'ohgonucléotide 5' et SEQ ID n°3 en tant qu'ohgonucléotide 3') présentées dans le tableau 1. Les séquences ADNc, sur la base desquelles ces paires d'oligonucléotides ont été mises au point, sont présentées dans le tableau 2 ci-dessous (nom des clones ADNc et numéro d'accès sur Genbank). Pour chaque paire d'oligonucléotides, ont ainsi été pris en compte les variants alléliques et les variants d'excision- épissage (épissage alternatif) connus d'un même récepteur.
Chaque paire d'ohgonucléotides est construite, après alignement des séquences ADNc connues des différents variants d'un même récepteur cible (e.g. le KIR p58.2), de manière à ce que cette paire puisse déterminer, sur l'ensemble de ces variants, les bornes d'un fragment consensus, sans pour autant pouvoir faire de même sur un quelconque variant du récepteur contrepartie du récepteur cible (e.g. le KAR p50.2). La séquence de chaque ohgonucléotide d'une même paire est ensuite optimisée de manière à ce que la température d'annelage (annealing en anglais) de chacune d'elles soit proche (e.g. ΔT < 5°C).
Chaque ohgonucléotide présente en effet une température d'annelage (ou d'hybridation) qui lui est propre. Cette température d'annelage est fonction du * 4* f"1 rapport R = xlOO et de la longueur de l'oligonucléotide nombre total de bases
(A + T + G + C) considéré, selon la formule : Température d'annelage (ou d'hybridation) d'un ohgonucléotide =
Tm = 69,3 + 0,41(R) - — (en °C) longueur en pb
Or, dans une réaction de type amplification en chaîne par polymérase les oligonucleotides d'une même paire doivent pouvoir tous deux s'anneler au récepteur cible dans des conditions de réaction communes, ceci afin de servir d'amorces à l'amplification du fragment consensus. Si les oligonucleotides d'une même paire présentent des températures propres d'annelage proches (e.g. 54°C et 56°C), Us pourront s'hybrider au récepteur cible, sans pour autant s'hybrider au récepteur contrepartie correspondant, à une température de 54°C ou 55°C.
Si les oligonucleotides d'une même paire présentent par contre des températures propres d'annelage très distantes (e.g. 49°C et 56°C), la réaction d'hybridation au récepteur cible est préférentiellement conduite à la plus basse des deux températures (e.g. 49°C ou 50°C), ce qui permet de maintenir la reconnaissance de sa cible nucléotidique par l'ohgonucléotide dont la température propre d'annelage est la plus basse. Dans cette situation, une diminution de spécificité peut toutefois intervenir : U peut être observé que certaines paires d'ohgonucléotides parviennent, dans de telles conditions de température, à s'hybrider au récepteur-contrepartie du récepteur cible. Une manière de remédier à cette perte de spécificité consiste à augmenter la longueur de l'oligonucléotide dont la température propre d'annelage est la plus basse, sans faire perdre à la paire d'ohgonucléotides considérée sa spécificité.
3. Amplification en chaîne par polymérase après transcription enzvmatique inverse fRT-PCR
5 μg d'ARN totaux sont transcrits en ADNc par incubation avec une transcriptase inverse (RT) à l'aide du kit First Strand DNA-Ready to go (Pharmacia). 10 μl d'ADNc sur les 33 μl obtenus sont mis en contact avec les paires d'oligonucléotides C et D qui servent alors d'amorces (cf. tableau 1): 10 μl de produit issu de RT; Tampon PCR 10X : lOμl; MgCl2 50mM; dXTP 10 mM; Oligonucleotides 3' à 10 μM : 5 μl; Oligonucléotide 5' 10 μM : 5 μl; Taq polymérase : 0,5 μl; H20 : qsp 100 μl. L'amplification par PCR (DNA engine
PTC 200, MJ Research, Massachussets) est réalisée en suivant les étapes suivantes :
- étape n°l (dénaturation initiale) : 5 min à 94°C,
- étape n°2 : 35 cycles comprenant a) dénaturation 1 min à 94°C b) annelage 1 min à 55°C pour la paire C et 50°C pour la paire D d'oligonucléotides, c) extension 1 min à 72°C,
- étape n°3 : (extension finale) : l min à 72°C. La durée de l'extension 2c peut être augmentée si le fragment à amplifier a une grande taiUe (e.g. supérieure à 1000-1400pb environ).
La température de l'étape d'annelage 2b dépend de la paire d'oligonucléotides utilisés comme amorces (cf. point 2. ci-avant). Elle correspond à une température consensus entre les températures propres d'annelage de chacun des deux oligonucleotides faisant paire (température moyenne ou température la plus basse des deux). Cette température est généralement comprise entre 45°C et 70°C, préférentieUement entre 50°C et 65 °C.
10 μl des produits issus de l'amplification par RT-PCR sont résolus par electrophorèse sur gel d'agarose à 2% en parallèle avec des marqueurs de poids moléculaires (M).
Les résultats sont illustrés sur les figures 1A et 1B.
La figure 1 Ulustre l'amphfication par PCR après RT (transcription enzymatique inverse) des séquences codantes pour p58.2 et p50.2 de cellules NK humaines. En figure 1A est iïlustrée le résultat de la résolution électrophorétique des produits issus de l'amplification par RT-PCR après mise en contact de la paire d'amorces D selon l'invention (cf. tableau 1) avec les populations ADNc de
ceUules NK humaines phénotypées p50.2+ et p58.2+ (piste +) à l'aide de l'anticorps GL183, ou avec les populations ADNc de cellules NK humaines phénotypées p50.2" et p58.2" (piste -) à l'aide de ce même anticorps GL183. En piste M, sont résolus des marqueurs de poids moléculaire.
En figure 1B, est illustrée le résultat de la résolution électrophorétique des produits issus de l'amplification par RT-PCR après mise en contact de la paire d'amorces C selon l'invention (cf. tableau 1) avec les populations ADNc de ceUules NK humaines phénotypées p50.2+ et p58.2+ (piste +) à l'aide de l'anticorps GL183, ou avec les populations ADNc de cellules NK humaines phénotypées ρ50.2" et p58.2" (piste -) à l'aide de ce même anticorps GL183. En piste M, sont résolus des marqueurs de poids moléculaire. H peut observé que les paires d'ohgonucléotides C et D selon l'invention permettent de reconnaître respectivement un phénotype, respectivement, p58.2+ et p50.2+, en reconnaissant un fragment de, respectivement, 653 pb et 533pb. La méthode selon l'invention permet donc de discriminer entre un phénotype p58.2+ (récepteur KIR, à fonction inhibitrice) et un phénotype p50.2+ (récepteur KAR contrepartie de p58.2, à fonction activatrice), ce qui n'était jusqu'à présent pas réalisable sous séquençage.
Exemple 2 : Documentation du répertoire génétique (potentiel) NKR/contreparties de NKR d'une population de splénocytes de souris transgéniques p50.2+ (PCR).
1 - Préparation des ADN Des préparations ADN ont été réalisées à partir de splénocytes de souris transgéniques p50.2+. La technique immunologique ne permet pas de déteπniner si de tels splénocytes sont p50.2+ (récepteur KAR, activateur) ou p58.2+ (récepteur KIR, inhibiteur, ou bien encore p50.2+ et p58.2+). Des splénocytes de souris non transgéniques (p50.2") servent de témoins négatifs.
Extraction Cette étape est réahsée comme décrit en exemple 1. Les ADN étant contenus dans la phase organique inférieure, c'est ici cette phase qui est récupérée après avoir éliminé la phase aqueuse et un peu d'interface.
Précipitation On ajoute 30 μl d'éthanol à 100% et on laisse reposer 5 minutes à température ambiante. Après centrifugation pendant 5 minutes à 4°C (2 000g), on jette le surnageant et on lave le culot avec 100 μl de citrate de sodium 0,1M dans de l'éthanol à 10%. On laisse 30 minutes à température ambiante en mélangeant de temps en temps. On centrifuge pendant 5 minutes à 4°C (2 000g). On répète ce lavage une seconde fois.
Le culot d'ADN obtenu est remis en suspension dans 200 μl d'éthanol à 70%. On laisse 15 minutes à température ambiante en mélangeant de temps en temps et on centrifuge pendant 5 minutes à 4°C (2 000g).
Le culot est mis à sécher brièvement sous vide (1 à 2 μg d'ADN environ sont obtenus) et est remis en suspension dans 10 μl de NaOH 8mM. En cas de présence de matériel insoluble, on nhcrocentrifuge 10 minutes à température ambiante. On transfère le surnageant dans un nouveau tube. Le pH est neutralisé en ajoutant 1,25 μl dHepes 0,1 M pour 10 μl.
2 - Préparation des paires d'oligonucléotides
Les paires d'ohgonucléotides sont préparées comme décrit en exemple 1. Sont ici rapportés les résultats relatifs à la paire D d'oligonucléotides (SEQ ID n°8 en tant qu'ohgonucléotide 5' et SEQ ID n°3 en tant qu'ohgonucléotide 3') selon l'invention (cf. tableau 1 ci-dessous).
3 - Amplification en chaîne par polymérase (PCR)
L'amplification en chaîne par polymérase est réalisée comme décrit en exemple 1 en mettant en contact les préparations d'ADN génomiques obtenues avec des paires d'oligonucléotides D servant alors d'amorces.
Les produits issus de l'amplification sont résolus sur gel d'agarose à 2% en parallèle avec des marqueurs de poids moléculaires (M).
Les résultats de résolution électrophorétique sur gel d'agarose à 2% des produits issus de la PCR sont illustrés par la figure 2.
La figure 2 Ulustre l'amplification par PCR de la séquence codante pour p50.2 à partir du DNA génomique de splénocytes de souris transgéniques p50.2+ : y est illustrée le résultat de la résolution électrophorétique des produits issus de ramplifîcation par PCR après mise en contact de la paire d'amorces D selon l'invention (cf. tableau 1) avec les populations ADN de splénocytes de souris transgéniques p50.2J" (pistes +) ou de souris non transgéniques p50.2" (pistes -).
En piste M, sont résolus des marqueurs de poids moléculaires.
Les amorces D selon l'invention permettent de reconnaître un fragment de 533 pb présent sur l'ADN de splénocytes murins p50.2+ et absent sur l'ADN de splénocytes murins p50.2".
Des résultats comparables ont été obtenus avec les paires d'ohgonucléotides A, B et E à L présentées dans le tableau 1 ci-après et ont également permis de documenter les récepteurs visés (cf. colonne "molécule" du tableau 1).
Les répertoires NKR et/ou contreparties de NKR ainsi documentés peuvent être, notamment à l'aide d'études biostatiques classiques, corrélés à des situations physiologiques ou pathologiques données, liées à ces répertoires, et au contrôle de l'activation des ceUules les exprimant en général.
Tableau 1
Tableau 1 (suite)
TABLEAU 2
Claims
1. Méthode in vitro de documentation d'un répertoire en immιmorécepteur(s) NKR comprenant notamment les récepteurs KIR p58.1, p58.2, p70.INH, pi 40. INH, et les récepteurs NKG2A et NKG2B, et/ou d'un répertoire en immunorécepteur(s) contrepartie(s) de NKR, comprenant notamment les récepteurs KAR p50.1, p50.2, p70.ACT, pl40.ACT, et les récepteurs NKG2C, NKG2D, NKG2E, NKG2F, ces immunorécepteurs étant ci-après désigné(s) récepteur(s) cible(s), caractérisée en ce qu'elle comprend : i. l'utilisation d'au moins une paire d'oligonucléotides, l'un étant désigné oligonucléotide 3' et l'autre oligonucléotide 5', les oligonucleotides 3' et 5' d'une même dite paire étant tous deux capables, dans des conditions d'hybridation correspondant à une incubation pendant 1 min dans un tampon [Tris-HCl 20mM pH8,4; KCl 50mM; MgCl2 2,5mM] à une température comprise entre 50°C et 65°C environ, de s'hybrider à l'ADN ou à l'ADNc d'un récepteur cible NKR, ou contrepartie de NKR, mais ne s'hybridant pas, dans les mêmes conditions d'hybridation, avec l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR, ou respectivement d'un récepteur NKR, contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible, ii. la mise en contact de populations ADN ou ADNc d'un échantillon biologique d'origine humaine ou animale pour lequel on souhaite documenter le répertoire en immιmorécepteur(s) cible(s), avec un excès d'au moins une paire d'oligonucléotides 3' et 5' selon i. dans des conditions favorables à l'hybridation de cette paire oligonucleotides 3' et 5' sur les ADN ou sur les ADNc de l'échantillon biologique, et iii. la détection des hybrides éventuellement formés entre ces ADN ou ADNc et la ou les paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5'.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite ou au moins une desdites paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' utilisée(s) est en outre capable, dans les mêmes conditions d'hybridation que celles définies sous i., de ne pas s'hybrider à l'ADN ou ADNc d'un récepteur, indifféremment NKR ou contrepartie de NKR, autre que ledit récepteur cible.
3. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'oligonucléotide 5' dîme dite paire d'oligonucléotides 3' et 5' utilisée pour un récepteur cible NKR (ou contrepartie de NKR) est capable dans les mêmes dites conditions d'hybridation de s'hybrider à l'ADN ou à l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR (ou respectivement NKR), contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible NKR (ou respectivement contrepartie de NKR).
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'oligonucléotide 3' d'une dite paire d'oligonucléotides 3'et 5', utilisée pour un récepteur cible ICAR, est capable, dans les mêmes dites conditions d'hybridation, de s'hybrider à l'ADN ou ADNc dudit récepteur cible KAR au niveau d'un enchaînement nucléotidique qui comprend une séquence correspondant, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence dudit code, à la séquence d'acides aminés Lys Ile Pro Phe Tlir Ile (K I P F T I) ou Lys Leu Pro Phe Tl r Ile (K L P F T I) (SEQ ID n°26 ou 27).
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite (ou au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur KIR est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par : un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°l, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant,
un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°4, ou mie séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou mie séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, au moins un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°10, n°l l, n°12, ou n°13, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°14, ou une séquence en dérivant.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite (ou au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur KAR est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par :
- un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°l, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant,
- un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°8, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant,
- un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°15, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite (ou au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2 est
choisie paπni le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par : un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°16, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°17, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°18, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°17, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°19, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°17, ou une séquence en dérivant,
- un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°20, ou une séquence en dérivant, et un ohgonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°21 , ou une séquence en dérivant. 08. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les deux oligonucleotides 3' ou 5' d'une même dite paire sont chacun couplés à un marqueur, notamment couplée à un marqueur fluorescent ou radioactif, tel que du 32P, permettant la révélation des hybrides qu'ils forment éventuellement avec lesdites populations ADN ou ADNc dudit échantillon biologique.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite (ou lesdites) paire(s) d'oligonucléotide(s) 3' et 5' sert (servent) d'amorces respectivement 3' et 5' pour une extension par ADN polymérase.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que lesdits hybrides éventuellement formés sont amplifiés par au moins une PCR préalablement à leur détection.
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que lesdits hybrides éventuellement formés sont amplifiés
par "Nested PCR" (double PCR emboîtée).
12. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite détection des hybrides éventuellement formés comprend en outre la résolution sur gel de polyacrylamide du mélange réactiomiel issu de la mise en contact, ainsi que la révélation de la présence ou de l'absence de bandes électrophorétiques contenant lesdits hybrides éventuellement foπnés.
13. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la documentation d'un répertoire génotypique en immunorécepteurs NKR et/ou en immunorécepteurs contreparties de NKR.
14. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la documentation d'un répertoire d'expression en immunorécepteurs NKR et/ou en immunorécepteurs contreparties de NKR.
15. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit échantillon biologique d'origine humaine ou animale est du sang périphérique, de la moelle osseuse, des lymphocytes, des cellules NK et/ou T, des cellules transgéniques exprimant des immunorécepteurs, une fraction isolée à partir de ces échantillons.
16. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée au criblage d'une banque d'organes, de tissus ou de cellules.
17. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la prévision ou au suivi de l'acceptation ou du rejet, par un homme ou un animal, de cellules, tissu ou organe génétiquement différent(es).
18. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes,
caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la prévision ou au suivir de l'inocuité ou de la pathogénicité (GVH) d'une greffe ou transplantation, par un homme ou un animal, de cellules, tissu ou organe génétiquement différent(es).
19. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la prévision ou au suivi, pour un homme ou mi animal, d'un effet de type GVL de la part de cellules, tissu ou organe génétiquement différent(es).
20. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la déteπnination de l'état d'activation de cellules NK et/ou T à un instant donné chez un animal ou un homme.
21. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la prévision ou au suivi de l'état de résistance d'un animal ou d'un homme vis-à-vis d'une infection virale, telle qu'une infection par un VIH, d'une infection parasitaire, telle que la malaria, d'une infection bactérienne, vis-à-vis d'une maladie auto-immune, telle que la polyarthrite rhumatoïde, ou bien encore vis-à-vis du développement de cellules malignes telles que des cellules leucémiques.
22. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée au criblage de médicaments actifs vis- à-vis de maladies infectieuses, de maladies auto-immunes, ou de maladies tumorales.
23. Kit pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend, dans im récipient, au moins une dite paire d'oligonucléotides 3' et 5', les réactifs pour la réalisation de ladite ou lesdites méthode(s) tels que tampon, marqueur (éventuellement couplé aux oligonucleotides de la dite paire), ainsi qu'un mode d'emploi.
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