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WO1996033287A1 - Depistage du glaucome juvenile - Google Patents

Depistage du glaucome juvenile Download PDF

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WO1996033287A1
WO1996033287A1 PCT/FR1996/000592 FR9600592W WO9633287A1 WO 1996033287 A1 WO1996033287 A1 WO 1996033287A1 FR 9600592 W FR9600592 W FR 9600592W WO 9633287 A1 WO9633287 A1 WO 9633287A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
marker
sequence
seq
type
description
Prior art date
Application number
PCT/FR1996/000592
Other languages
English (en)
Inventor
Henri-Jean Garchon
Jean-François Bach
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Publication of WO1996033287A1 publication Critical patent/WO1996033287A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Definitions

  • the present invention relates in particular to family screening for predisposition to juvenile glaucoma as well as the possibility of highlighting the gene responsible for this condition. Juvenile glaucoma, which affects nearly 100,000 people in
  • This juvenile glaucoma comes from the combination of ocular hypertension and damage to the optic nerve.
  • effective treatments exist, notably medical and surgical, which make it possible to stop the disease or to slow down its progression.
  • these treatments are only very effective when glaucoma is detected at an early stage, late screenings lead to heavy surgeries which can leave disabilities.
  • juvenile glaucoma is linked to the presence on chromosome 1 of a particular gene or of a particular structure, the presence of a single copy of which is sufficient for the onset of the disease.
  • the chromosome contains sequences which are very polymorphic, that is to say that they have different compositions according to the individuals although being located in the same place on the chromosome, these zones are called “microsatellites” and make the subject of numerous publications.
  • microsatellites being located in the same place, we can consider highlighting the presence of a particular microsatellite which would be linked to the gene that we are looking for.
  • the maximum correlation rate is obtained for a microsatellite marker which is located very close to the gene in question. Indeed, in this case, these two portions of the chromosome are transmitted as they are to the descendants, on the other hand, if the marker is more distant it can be separated from the gene during transmission ("crossing over") and its presence n is more necessarily associated with the presence of the defective gene.
  • microsatellite marker in any individual has, in principle, no meaning. Indeed, in the absence of particular inheritance, this marker often presents no interest and it should also be understood that even when family history reveals an inherited juvenile glaucoma, the presence of the family marker of another family does not is not necessarily critical in predicting the onset of the disease. It is necessary to redo studies of correlation, even if when the families are very close (same region) and even in the absence of known common ancestors, the marker can in some cases be discriminating (linkage imbalance between the marker and the disease).
  • the present invention relates to a method for screening for a predisposition to juvenile glaucoma in a patient, characterized in that the presence of a microsatellite marker linked with the occurrence of juvenile glaucoma in its family, the microsatellite marker being chosen from the markers afm350yhl, afml22xa3, ngal, afm21, afm248wg5, afm278ye5, afm212xbl0, afml57xe7 and NGA5 of chromosome Iq21q31.
  • the detected microsatellite marker is preferably located in the locus corresponding to the region located between the marker afm248wg5 and afm212xbl0.
  • the techniques used to detect the presence of markers are known; it may be a direct detection using a marker complementary probe, but preferably, the methods using an amplification of the marker sequence will be used, for example by methods of the PCR (Polymerase Chain Reaction) type. using primers, one of which is marked with a fluorochrome.
  • the combinations of primer pairs are tested two by two. Then, if the results allow it, a third pair will be introduced and so on.
  • the presence of this microsatellite marker only indicates a predisposition to the occurrence of juvenile glaucoma and this when family history having been analyzed, a link was made between the presence of these markers and the occurrence of juvenile glaucoma.
  • the present invention also relates to the DNA sequence located between the locus comprising the marker afml22xa3 and afm212xbl0, preferably afml 22xa3 and NGA5, which part is linked to the juvenile glaucoma system. Indeed, thanks to previous developments, it is possible to locate the gene implicated in juvenile glaucoma.
  • FIG. 2 represents a more detailed map of the region D1S210 - L854B9 in which the gene for the susceptibility to juvenile glaucoma is located.
  • the markers thus described made it possible to identify artificial chromosome clones of yeast covering the region. 25 YACs covering a maximum distance of 3 Mbases thus define a first level path.
  • genotyping described will make it possible to identify families where the glaucoma gene located on chromosome 1 is not involved, opening the way to the localization of other genes predisposing to glaucoma in other places in the genome.
  • DNA is extracted from peripheral venous blood after cell lysis, protein digestion, organic partition and finally alcoholic precipitation.
  • the blood (20 ml) is taken by peripheral venipuncture from a tube containing EDTA. It is diluted with a volume of double-distilled water. After 10 minutes, the cells are collected by centrifugation at 1600 g for 10 minutes. This manipulation is repeated.
  • the white cells are lysed in the presence of 20 ml of CLB buffer (10 mM Tris pH 7.6, 5 miM MgCl 2 , 0.32 M sucrose, 1% Triton X-100 (v / v).
  • CLB buffer 10 mM Tris pH 7.6, 5 miM MgCl 2 , 0.32 M sucrose, 1% Triton X-100 (v / v).
  • the nuclei are collected by centrifugation at 1600 g This operation is repeated for 10 minutes.
  • the nuclei are washed once in RSB buffer (10 mM Tris pH 8, 10 mM NaCl, 10 mM EDTA). The pellet is resuspended in 2 ml of RSB buffer to which is added sodium lauryl sulfate (1%) and proteinase K (200 ⁇ g / ml). The mixture is incubated at 55 ° C for at least 3 hours and stirred regularly.
  • the DNA solution thus obtained is then extracted with a volume of phenol balanced with a 50 M Tris pH 8 buffer. This operation is repeated and supplemented by extraction with a volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1 v / v) .
  • the DNA is precipitated with a volume of isopropanol, rinsed with ethanol (70%), dried and finally resuspended in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris pH 8, 0.5 mM EDTA).
  • the DNA concentration is evaluated by measuring the absorbance at 260 mm using the equivalence of 50 ⁇ g / ml of DNA for one unit of absorbance. The DNA concentration is then adjusted to 200 ⁇ g / ml.
  • Genomic DNA (200 ⁇ g / ml) 1 ⁇ l
  • nucleotide triphosphate (each 1.25 M) 4 ⁇ l
  • primers each 10 picomoles / ⁇ l 2 x 1 ⁇ l
  • Taq DNA polymerase TM (5 u / ⁇ l) 0.05 ⁇ l. 10 times concentrated PCR buffer 2.5 ⁇ l
  • composition of the PCR buffer 10 x Tris 0.1 M pH 8.3 (at 20 ° C), KC1 0.5
  • the antibody TaqStartTM (Clontech) is added to the final concentration of 0.056 ⁇ M (i.e. an antibody / enzyme molar ratio of 28: 1).
  • the amplification is carried out in a TechneTM PHC-3 thermal cycler with heated cover. After heating to 94 ° C for
  • Each cycle comprises two one-minute periods each at '55 ° C and 94 ° C successively.
  • a final elongation segment of 2 minutes at 72 ° C ends the amplification.
  • NUCLEOTIDE SEQUENCE MARKER (size in bp) of PRIMERS (upstream then downstream) afm350y l JOE- 5 '-TCTTCCCACCACTGCC
  • NGA5 (L854B9) CTGAAACTGAGATAGGAGTGC GAAATGGGAGTTGAGTTACCC
  • amplification products (2 ⁇ l) of the same individual are combined, coprecipitated with ethanol (2.5 volumes, 2 hours at -20 ° C) and allowed to migrate on the same track of acrylamide gel (6% ) - urea (8M), after resuspension in a loading buffer (formamide 2 ⁇ l, 0.5 ⁇ l Blue ABITM, 0.5 ⁇ l GeneScan 2500 Rox, 1 ⁇ l H 2 O) and after thermal denaturation.
  • the electrophoresis is carried out in an ABI 373 automatic sequencer, at a power of 30 Watts for eight hours, the laser beam being placed at a height of 24 cm.
  • Raw data is analyzed with GeneScan Analysis software
  • the likelihood of the presence of the disease gene is estimated using the LIN AGE software.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
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  • Analytical Chemistry (AREA)
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  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention concerne un procédé de dépistage d'une prédisposition au glaucome juvénile chez un individu, caracterisé en ce qu'on caractérise dans un prélèvement biologique chez ledit individu, des marqueurs microsatellites liés avec la survenue du glaucome juvénile dans sa famille, les marqueurs microsatellites étant afm350yhl, afm122xa3, ngal, afm21, afm248wg5, afm278ye5, afm212xb10, afm157xe7 et NGA5 du chromosome 1q21q31.

Description

DEPISTAGE DU GLAUCOME TUNENILE
La présente invention concerne notamment le dépistage familial de la prédisposition au glaucome juvénile ainsi que la possibilité de mettre en évidence le gène responsable de cette affection. Le glaucome juvénile qui touche près de 100 000 personnes en
France y constitue une des principales causes de cécité.
Comme son nom l'indique, Les premiers symptômes se manifestent souvent avant 40 ans par une diminution du champ visuel. Cette affection indolore et d'évolution très progressive est souvent méconnue par le patient et n'est mise en évidence qu'à un stade avancé, souvent irréversible où elle évoluera vers la cécité.
Ce glaucome juvénile provient de la combinaison d'une hypertension oculaire et d'une lésion du nerf optique. Actuellement des traitements efficaces existent, notamment médicaux et chirurgicaux, qui permettent de stopper la maladie ou d'en ralentir l'évolution. Toutefois, ces traitements ne sont très efficaces que lorque le glaucome est dépisté à un stade précoce, les dépistages tardifs conduisent à des chirurgies lourdes qui peuvent laisser des handicaps.
Depuis quelques années, on a pu mettre en évidence le rôle majeur des facteurs génétiques dans la survenue du glaucome junvénile. Il est maintenant certain qu'il s'agit dans la plupart des cas d'une maladie transmise sur le mode mendélien simple dominant; le gène en cause étant situé sur le bras long du chromosome 1 .
C'est-à-dire que le glaucome juvénile est lié à la présence sur le chromosome 1 d'un gène particulier ou d'une structure particulière dont la présence d'une seule copie suffit pour la survenue de la maladie.
Il est donc nécessaire, pour le dépistage précoce de la maladie, de déterminer si ce gène est ou non présent chez le patient. Actuellement, on connaît la région où se situe le gène que l'on nomme "locus de susceptibilité" mais pas sa position exacte ni sa structure. Un "locus de susceptibilité" peut comporter de l'ordre de 10 millions de bases, ce qui rend évidemment la localisation très compliquée d'autant que l'on ignore tout sur la structure du gène. Il n'est donc pas possible de mettre en évidence directement la présence du gène en cause, c'est pourquoi on doit avoir recours à un diagnostic mettant en oeuvre la technique des "microsatellites". Le chromosome comporte des séquences qui sont très polymorphes, c'est-à-dire qu'elles ont des compositions différentes selon les individus bien qu'étant situées au même endroit sur le chromosome, ces zones sont dénommées "microsatellites" et font l'objet de nombreuses publications.
Dans le cas d'une affection de type familial et de caractère dominant, il est possible d'étudier la corrélation de la survenu--, du Q-laucoine juvénile avec un allèle d'un marqueur microsatellite déterminé. Pour un taux de corrélation élevé, on pourra considérer que la présence de l'allèle du microsatellite est un indice de la présence du gène morbide.
Ces microsatellites étant situés au même endroit, on peut envisager de mettre en évidence la présence d'un microsatellite particulier qui serait lié au gène que l'on recherche.
Il est donc nécessaire d'étudier la famille du patient et de disposer de son "histoire", c'est-à-dire d'avoir pour chaque individu de la famille étudiée à la fois la présence de la maladie et la présence d'un marqueur spécifique, en fait allèle d'un microsatellite, qui soit nécessairement ou très probablement associé à la maladie.
Si la famille est suffisamment nombreuse, on pourra déterminer quels sont les marqueurs qui sont statistiquement le plus souvent présent lorsque la maladie est détectée .
Le taux maximum de corrélation est obtenu pour un marqueur microsatellite qui est situé très près du gène en cause. En effet, dans ce cas, ces deux portions du chromosome sont transmises telles quelles à la descendance, par contre, si le marqueur est plus éloigné il peut se trouver séparé du gène lors de la transmission ( "crossing over") et sa présence n'est plus nécessairement associée à la présence du gène défectueux.
Il est donc nécessaire de comprendre que la mise en évidence d'un marqueur microsatellite chez un individu quelconque n'a pas, en principe de signification. En effet, en l'absence d'hérédité particulière, ce marqueur ne présente souvent aucun intérêt et il faut également comprendre que même lorsque l'histoire familiale fait apparaître un glaucome juvénile héréditaire, la présence du marqueur familial d'une autre famille n'est pas nécessairement déterminante pour prédire l'apparition de la maladie. Il est nécessaire de refaire des études de corrélation, même si lorsque les familles sont très proches (même région) et même en l'absence d'ancêtres communs connus, le marqueur peut dans certains cas être discriminant (déséquilibre de liaison entre le marqueur et la maladie). C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé de dépistage d'une prédisposition au glaucome juvénile chez un patient, caractérisé en ce que l'on détecte, dans un prélèvement biologique chez ledit patient, la présence d'un marqueur microsatellite lié avec la survenue du glaucome juvénile dans sa famille, le marqueur microsatellite étant choisi parmi les marqueurs afm350yhl, afml22xa3, ngal, afm21, afm248wg5, afm278ye5, afm212xbl0, afml57xe7 et NGA5 du chromosome Iq21q31.
De façon plus précise, le marqueur microsatellite détecté est de préférence situé dans le locus correspondant à la région située entre le marqueur afm248wg5 et afm212xbl0. Les techniques mises en oeuvre pour détecter la présence des marqueurs sont connues; il peut s'agir d'une détection en direct grâce à une sonde complémentaire du marqueur, mais on utilisera, de préférence, les méthodes mettant en oeuvre une amplification de la séquence marqueur par exemple par des méthodes de type PCR (Polymerase Chain Reaction) à l'aide d'amorces dont l'une est marquée par un fluorochrome.
Afin de simplifier la détection des différents marqueurs en cause, il est possible d'utiliser la PCR "multiplex". Le principe est de réaliser plusieurs réactions de PCR simultanément à partir d'un même échantillon d'ADN génomique. L'intérêt est d'économiser les réactifs ainsi que l'ADN à typer, et de réduire le risque d'erreur en diminuant le nombre de manipulations.
Dans ce but, les combinaisons de paires d'amorces sont testées deux à deux. Puis, si les résultats le permettent, une troisième paire sera introduite et ainsi de suite. Comme cela a été indiqué précédemment, la présence de ce marqueur microsatellite n'indique qu'une prédisposition à la survenue du glaucome juvénile et ceci lorsque l'histoire familiale ayant été analysée, il a été fait un lien entre la présence de ces marqueurs et la survenue du glaucome juvénile. La présente invention concerne également la séquence d'ADN située entre le locus comportant le marqueur afml22xa3 et afm212xbl0, de préférence afml 22xa3 et NGA5, laquelle partie est liée au système du glaucome juvénile. En effet, grâce aux développements précédents, il est possible de localiser le gène mis en cause dans le glaucome juvénile.
La caractérisation des hapLotypes recomb.n-.ms» sv sein de grandes familles, grâce aux marqueurs microsatellites décrits ci-dessus, permet d'ordonner les marqueurs les uns par rapport aux autres. Chez les sujets glaucomateux, ces haplotypes recombinants permettent de mieux cerner la région chromosomique contenant le gène morbide. Une région de trois centiMorgans a été ainsi définie (figure 1 ). La figure 2 représente une carte plus détaillée de la région D1S210 - L854B9 dans laquelle est situé le gène de susceptibilité au glaucome juvénile. Les marqueurs ainsi décrits ont permis d'identifier des clones de chromosome artificiels de levure couvrant la région. 25 YAC couvrant une distance maximale de 3 Mbases définissent ainsi un chemin de premier niveau.
Il est alors possible d'isoler le gène par : - recherche simultanée de nouveaux marqueurs polymorphes et de nouveaux haplotypes recombinants qui permettront de rétrécir encore la région contenant le gène, recherche directe de gènes par plusieurs méthodes : . sélection de transcrits par hybridation . piègeage d'exons
. séquences phylogénétiquement conservées
. îlots CpG
. expansion de triplets
Enfin, le génotypage décrit permettra d'identifier des familles où le gène du glaucome localisé sur le chromosome 1 n'est pas impliqué, ouvrant la voie à la localisation d'autres gènes prédisposant au glaucome en d'autres endroits du génome.
D'autres caractéristiques et modalités de mise en oeuvre du procédé pourront être déduits de la lecture de l'exemple qui suit. Exemple
Méthode de typaee de l'ADN génomique humain avec
9 marqueurs microsatellites de la région Iq21q31.
A) L'ADN est extrait du sang veineux périphérique après lyse cellulaire, digestion protéique, partition organique et finalement précipitation alcoolique.
Le sang (20 ml) est prélevé par ponction veineuse périphérique sur un tube contenant de l'EDTA. II est dilué avec un volume d'eau bidistillée. Après 10 minutes, les cellules sont collectées par centrifugation à 1600 g pendant 10 minutes. Cette manipulation est répétée.
Les cellules blanches sont lysées en présence de 20 ml de tampon CLB (Tris 10 mM pH 7.6, 5 miM MgCl2, sucrose 0.32 M, Triton X-100 1% (v/v). Les noyaux sont collectés par centrifugation à 1600 g pendant 10 minutes. Cette manipulation est répétée.
Les noyaux sont lavés une fois dans le tampon RSB (Tris 10 mM pH 8, NaCl 10 mM, EDTA 10 mM). Le culot est resuspendu dans 2 ml de tampon RSB auquel est ajouté du lauryl sulfate de sodium ( 1 %)et la protéinase K (200 μ g/ml). Le mélange est incubé à 55° C pendant au moins 3 heures et régulièrement agité.
La solution d'ADN ainsi obtenue est ensuite extraite avec un volume de phénol équilibré avec un tampon 50 M Tris pH 8. Cette opération est répétée et complétée par une extration avec un volume de chloroforme/alcool isoamylique (24:1 v/v).
L'ADN est précipité avec un volume d'isopropanol, rincé à l'éthanol (70 %), séché et enfin resuspendu dans 1 ml de tampon TE (Tris 10 mM pH 8, EDTA 0.5 mM). La concentration d'ADN est évaluée par mesure de l'absorbance à 260 mm en utilisant l'équivalence de 50 μg/ml d'ADN pour une unité d'absorbance. La concentration d'ADN est alors ajustée à 200 μg/ml. B ) Amplification de l'ADN génomique pour les marqueurs microsatellites fluorescents. Neuf microsatellites sont utilisés pour déterminer les haplotypes associés à la région Iq21q31 sur le bras long du chromosome 1. Leur liste avec la description des amorces (séquence et addition d'un fluorochrome) est donnée dans le tableau 1.
Les conditions d'amplification communes à ces marqueurs sont les suivantes : Mélange réactionnel :
. ADN génomique (200 μg/ml) 1 μl
. nucléotides triphosphate (chacun 1,25 M) 4 μl
. amorces (chacune 10 picomoles/μl) 2 x 1 μl
. Taq DNA polymérase TM (5 u/μl) 0,05 μl . tampon de PCR 10 fois concentré 2 .5 μl
. H2O, qsp 25 μl
Composition du tampon de PCR 10 x : Tris 0.1 M pH 8.3 (à 20° C), KC1 0.5
M, Mg Cb 15 mM, gélatine (SigmaTM G2500) 1 mg/ml.
Pour l'amplification du marqueur ngal , l'anticorps TaqStartTM (Clontech) est ajouté à la concentration finale de 0.056 μM (soit un rapport molaire anticorps/enzyme de 28:1).
L'amplification est réalisée dans un thermocycleur TechneTM PHC-3 avec couvercle chauffant. Après un chauffage à 94° C pendant
5 minutes, 30 cycles sont effectués. Chaque cycle comprend 2 segments d'une minute chacun à ' 55° C et 94° C successivement. Un segment final d'élongation de 2 minutes à 72° C termine l'amplification.
Tableau. Liste des marqueurs microsatellites utilisés pour haplotyper la région du gène du glaucome juvénile sur le chromosome Iq21q31.
MARQUEUR SÉQUENCE NUCLÉOTIDIQUE (taille en pb) des AMORCES ( amont puis aval ) afm350y l JOE- 5 ' -TCTTCCCACCACTGCC
(189 bp) 5 ' -TGTATTCCTACTGCCCA
af l22xa3 FITC-5 ' -CCTCAGTTCATTCCCATAA
(D1S210 ) ( 121 pb) 5 ' -AGCTGAATCTCACCCAATAACTA
ngal 5'-JOE CCAACTGAGAATTCTATATTTAACC
(200 bp) 5'-TCTGGTAGGGCAGATCTGCTAGAA
afm21 JOE -5 ' -CCTTCCTTTCTAAGGCTG
( 121 bpN) 5 ' -TCTTATCAGTCAGGCA
afm248wg5 FITC-5 ' -TAATGGGTTCAGTGGACCTT
(D1S452 ) (223 pb) 5 ' -TGCAGTTCCATATTCCAGGT
afm278yθ5 JOE-5 ' -TGAGCCGAGATTGAGCC
( 240 bp) 5 ' -CCAGGTCAGAGATGTTGG
a£m212xbl 0 5'-TAJMRA-TCTACCACTTGAATTCCTGT
(D1S242 ) (219 bp) 5 • -ACCACTCCAGTTTGAGCAAC
afml 57xθ7 5 ' -FAM-TGTAAAAGCAAACTGTAGACGAT
( D1S218 ) (274 pb) 5 ' -TTTATGTTATCACCAAGGCTTCT
NGA5 (L854B9) CTGAAACTGAGATAGGAGTGC GAAATGGGAGTTGAGTTACCC Les produits d'amplification (2 μl) d'un même individu sont rassemblés, coprécipités à l'éthanol (2.5 volumes, 2 heures à -20° C) et mis à migrer sur une même piste de gel d'acrylamide (6 %) - urée (8M), après resuspension dans un tampon de charge (formamide 2 μl, 0.5 μl Bleu ABITM, 0.5 μl GeneScan 2500 Rox, 1 μl H2O) et après dénaturation thermique.
L'électrophorèse est réalisée dans un séquenceur automatique ABI 373, sous une puissance de 30 Watts pendant huit heures, le faisceau laser étant placé à une hauteur de 24 cm. Les données brutes sont analysées avec le logiciel GeneScan Analysis
(ABI). Les pics de fluorescence sont identifiés avec le logiciel Genotyper (ABI), permettant ainsi d'assigner les allèles des marqueurs microsatellites. Interprétation des résultats. Ces résultats de typage sont interprétés en fonction du contexte :
- dans une famille où un haplotype de susceptibilité pour le glaucome associé cette région du chromosome 1 a déjà été caractérisé, la comparaison des allèles de l'échantillon testé avec ceux de l'haplotype familial permet de façon simple de déterminer la présence ou l'absence du gène de susceptibilité. En l'état actuel des connaissances, la présence de ce dernier confère un risque de développer la maladie qui est estimé à 80 %. En son absence, le risque rejoint celui de la population générale ( 1 à 2 % selon les études épidémiologiques).
- dans une famille où un haplotype de susceptibilité pour le gène du glaucome associé à cette région du chromosome 1 n'a pas été déjà caractérisé, la vraisemblance de la présence du gène de la maladie est estimée à l'aide du logiciel LIN AGE.
Les résultats observés sur différentes familles ont démontré l'excellent caractère prédictif des marqueurs mis en oeuvre. LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE MEDICALE
CINSERM)
(B) RUE: 101 RUE DE TOLBIAC
(C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75013
(ii) TITRE DE L' INVENTION: DEPISTAGE DU GLAUCOME JUVENILE (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 18
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: MACINTOSH APPLE (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: MAC-OS SYSTEME 7
(D) LOGICIEL: WORD PERFECT VERSION 2.0
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AMONT" af 350yhl
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TCTTCCCACC ACTGCC 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" afm350yhl (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
TGTATTCCTA CTGCCCA 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE
AMONT" afml22xa3
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CCTCAGTTCA TTCCCATAA 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" afml22xa3
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AGCTGAATCT CACCCAATAA CTA 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AMONT" ngal (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CCAACTGAGA ATTCTATATT TAACC 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" ngal
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
TCTGGTAGGG CAGATCTGCT AGAA 24
(2) INFORMATIONS .POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AMONT" afm21 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
CCTTCCTTTC TAAGGCTG 18
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" afm21
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: TCTTATCAGT CAGGCA 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE" NtrCtbUllUlLiUb'
AMONT" afm248wg5
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: TAATGGGTTC AGTGGACCTT 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" afm248wg5
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: TGCAGTTCCA TATTCCAGGT 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AMONT" afm278ye5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
TGAGCCGAGA TTGAGCC 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRΓ TTON: /desc = "AMORCT iwaEσrTDrQUEr
AVAL" afm278ye5
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: CCAGGTCAGA GATGTTGG 18
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AMONT" afm212xbl0
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: TCTACCACTT GAATTCCTGT 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" afm212xbl0 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
ACCACTCCAG TTTGAGCAAC 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE
AMONT" afml57xe7
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: TGTAAAAGCA AACTGTAGAC GAT 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AVAL" afml57xe7
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: TTTATGTTAT CACCAAGGCT TCT 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE AMONT" NGA5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
CTGAAACTGA GATAGGAGTG C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE NUCLEOTIDIQUE
AVAL" NGA5
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: GAAATGGGAG TTGAGTTACC C 21

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de dépistage d'une prédisposition au glaucome juvénile chez un individu, caractérisé en ce qu'on caractérise dans un prélèvement biologique chez ledit individu, des marqueurs microsatellites liés avec la survenue du glaucome juvénile dans sa famille, les marqueurs microsatellites étant afm350yhl, afml2 xa3- "gα 1 qft"7l af ^ft^g'V afm278ye5, afm212xbl0, afml57xe7 et NGA5 du chromosome Iq21q31.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le marqueur est situé sur le locus correspondant à la région située entre le marqueur afm248wg5 et afm212 xblO.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la présence dudit marqueur est détectée par amplification de la zone du marqueur.
4. Procédé selon la revendication 3 , caractérisé en ce que l'amplification est effectuée par PCR.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise une amplification PCR multiplex.
6. Séquence ADN située entre le locus correspondant au marqueur afml22xa3 et afm 212xbl0 et liée à la survenue du glaucome juvénile.
7. Séquence ADN selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est située entre le marqueur afml22xa3 et NGA5.
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