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CN110563841A - 一种人源化抗Grb2单克隆抗体、及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人源化抗Grb2单克隆抗体、及其制备方法和应用 Download PDF

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CN110563841A
CN110563841A CN201910796374.1A CN201910796374A CN110563841A CN 110563841 A CN110563841 A CN 110563841A CN 201910796374 A CN201910796374 A CN 201910796374A CN 110563841 A CN110563841 A CN 110563841A
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grb
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seq
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Abstract

本发明公开了一种人源化抗Grb2单克隆抗体、及其制备方法和应用，属于医药技术领域。所述人源化抗Grb2单克隆抗体，包括轻链互补决定区和重链互补决定区，所述轻链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示，所述重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4‑6所示。本发明还公开了一种人源化抗Grb2单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明提供的人源化抗Grb2单克隆抗体，除了具有与Grb2蛋白、Grb2阳性肿瘤细胞结合的特异性外，还具有人源性，可降低人用的毒副作用。

Description

一种人源化抗Grb2单克隆抗体、及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种人源化抗Grb2单克隆抗体、及其制备方法和应用，属于医药技术领域。
背景技术
自上世纪80年代以来，肿瘤已逐渐成为全球范围内对人类健康和生命威胁最大的恶性疾病。近二十年来随着中国经济社会发展和人民生活水平提高，恶性肿瘤在中国的发病率呈持续上升趋势。化疗、新辅助化疗和手术仍是目前多数实体肿瘤临床治疗的主要策略。自2001年以来，肿瘤分子靶向治疗为实体肿瘤的治疗打开了全新的视野。分子靶向肿瘤药物(Molecularly targeted cancer therapy)通常采用单克隆抗体或小分子物质阻断肿瘤发病机制中特有的信号传导通路或分子，减少治疗带来的副作用，提高了安全性。目前特异性针对受体酪氨酸激酶为靶点(EGFR、HER2、VEGF、PDGF等)的药物已在临床取得了可观的疗效。例如，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)阻断剂吉非替尼(易瑞沙)和受体酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)厄洛替尼(特罗凯)已广泛用于肺癌的临床治疗；anti-EGFR单克隆抗体Cetuximab(西妥昔单抗，商品名：爱必妥)、Panitumumab(帕尼单抗，商品名：Vectibix)也已作为转移性结直肠癌晚期患者重要的靶向治疗药物。
尽管靶向药物给结直肠癌患者长期生存带来了希望，但Cetuximab和Panitumumab单药治疗的响应率仅为8-13％，与结直肠癌主要化疗方案FOLFOX和FOLFIRI联合用药，其有效率较常规化疗方案相比仅提高约16％。即使是初期对anti-EGFR mAb高度敏感的患者，在经过12-18m中位无进展期治疗后，也几乎难逃获得性耐药的厄运。靶向治疗耐药是阻碍结直肠癌患者生存持续获益的最大障碍。因此，如何帮助靶向EGFR治疗耐药的患者再次从靶向药物中获益是目前结直肠癌治疗领域亟待解决的关键问题。
生长因子受体结合蛋白(Growth factor receptor bound protein2，简称Grb2)是一种在诸多细胞中广泛表达的衔接蛋白，由217个氨基酸组成,其分子量约为25kDa。Grb2蛋白结构的最大特点是含有一个位于中央的SH2结构域和两个位于两侧的SH3结构域。SH2和SH3之间由两条柔性的臂链相互连接起来。两条柔性臂链赋予Grb2更大的空间结构变化。Grb2通过调控受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase，RTK)信号通路来调节细胞功能。现已明确Grb2不仅作为主要信号传导分子在胃癌、结直肠癌、食管鳞状细胞癌、宫颈癌等多种肿瘤组织中高表达，其表达水平还与肿瘤的淋巴结转移及预后密切相关。Grb2的异常表达或其所在信号通路的异常活化将减弱肿瘤细胞间或肿瘤细胞与细胞外基质间的黏附、降低胞外基质结构的稳定性、增强细胞骨架的柔韧性和细胞的迁移能力，促进肿瘤血管生成。鉴于Grb2具有重要的病理生理功能，根据Grb2结构特点，涉及筛选针对Grb2的特异性化合物和多肽一直是肿瘤研究的热点。但目前开发的抗Grb2小分子药物远远不能满足临床治疗需求。
目前本行业共识：一种单克隆抗体的结合特异性及亲和力绝大部分程度依赖于抗体的轻链和重链可变区(或称互补决定区，Complementary determinant region,CDR)的氨基酸序列决定，任何具有相同CDR序列的单克隆抗体，其识别靶抗原的特异性、亲和力和所发挥的治疗作用基本相同。美国食品和药品监督管理局(U.S Food and DrugAdministration,FDA)在其指导原则中认定，凡具有相同互补决定区的同类型抗体属于同一种抗体，在临床治疗和药物审批中按照同一种抗体处理。因此，在获得同一种有临床治疗价值的抗体的CDR序列之后，业界很容易根据成熟、公知的现有各项技术将其非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相同生物活性的其他单克隆抗体。
鉴于Grb2在肿瘤组织中表达的特异性，以及相应鼠单抗对裸鼠移植瘤模型的抑制效率，开发针对Grb2的抗体药物将有可能为肿瘤临床治疗提供新靶点的靶向治疗新药。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种人源化抗Grb2单克隆抗体。本申请的发明人通过克隆、鉴定与基因结构的分析，确定了人源化抗Grb2单克隆抗体的CDR区序列。本发明提供的人源化抗Grb2单克隆抗体，除了具有与Grb2蛋白、Grb2阳性肿瘤细胞结合的特异性外，还具有人源性，可降低人用的毒副作用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种人源化抗Grb2单克隆抗体，包括轻链互补决定区和重链互补决定区，所述轻链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。
SEQ ID NO.1-6具体的序列如下：
SEQ ID NO.1：Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys AsnTyr Leu Ala；
SEQ ID NO.2：Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser；
SEQ ID NO.3：Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr；
SEQ ID NO.4：Ser Tyr Trp Ile Glu；
SEQ ID NO.5：Glu Ile Leu Pro Gly Ile Gln Ser Thr Asn Tyr Asn Glu LysPhe Lys Val Arg；
SEQ ID NO.6：Arg Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr。
本发明的有益效果是：
本发明提供的人源化抗Grb2单克隆抗体，除了具有与Grb2蛋白、Grb2阳性肿瘤细胞结合的特异性外，还具有人源性，可降低人用的毒副作用。
本领域共识，抗体的结合特异性和亲和力主要由CDR序列决定，根据目前公知的现有技术，可轻易将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似生物活性的变体。本发明涉及的具有与上述CDR序列完全相同的CDR序列的单克隆抗体变体，具有相类似的生物活性。
本发明涉及的人源化抗Grb2抗体基因的抗体CDR区来自于既往人乳腺癌细胞免疫小鼠制备获得的一株鼠单克隆抗体3B8(研究暂未发表)，经质谱鉴定，该鼠单抗的靶抗原为Grb2。前期研究证实该鼠单克隆抗体可与Grb2结合，动物体内抑瘤实验证实采用该抗体干扰可阻断Grb2体内功能，并显著抑制体内Grb2阳性的肺癌裸鼠移植瘤的生长，抑瘤率高达81.27％；治疗中动物体重未见显著下降，实验动物组织切片H&E染色后，镜下未观察到正常脏器出现病理改变，研究结果初步提示该抗体治疗的毒副作用不明显或较低，用于治疗人Grb2表达强阳性的恶性肿瘤安全性较为可靠，其人源化改造消除其鼠单抗的免疫原性毒性后有望用于临床肿瘤治疗。
本发明的目的之二，是提供上述人源化抗Grb2单克隆抗体的制备方法。本发明提供的制备方法，可以得到人源化抗Grb2单克隆抗体，该单克隆抗体可在动物模型的体内抑制人肺癌的生长和复发，且制备方法简单，操作容易，适合规模化推广应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述人源化抗Grb2单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：提取鼠杂交瘤细胞LC-5A1的总RNA；
步骤2：以步骤1提取的总RNA为模板，合成鼠杂交瘤细胞cDNA的第一条链：
步骤3：以步骤2得到的cDNA为模板，采用轻链上游引物PVL5和轻链下游引物PVL3，扩增轻链互补决定区；采用重链上游引物PVH5和重链下游引物PVH3，扩增重轻链互补决定区；
步骤4：分离、回收、纯化、转染步骤3得到的目的片段，以Pst II和BstE II进行双酶切，并定向克隆入克隆载体pRGWH的相应位点，筛选出阳性重组克隆，进行核苷酸序列分析，构建表达抗Grb2人源化单克隆抗体的表达载体，所述表达载体在pSRNC-Cκ-Grb2或pSRDC-Cγ1-Grb2转染中国仓鼠卵巢细胞进行表达，即得到所述人源化抗Grb2单克隆抗体。
本发明的有益效果是：
本发明提供的制备方法，可以得到人源化抗Grb2单克隆抗体，该单克隆抗体可在动物模型的体内抑制人肺癌的生长和复发，且制备方法简单，操作容易，适合规模化推广应用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述提取鼠杂交瘤细胞LC-5A1的总RNA的方法为：收集1×107鼠单克隆抗体杂交瘤细胞，10,000rpm离心1min，弃上清，加入1mL的Trizol充分溶解细胞，室温静置3min-5min后加入0.2mL氯仿，颠倒混匀；4℃，12,000rpm离心10min，将上清转移至清洁的1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀；室温静置20min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清；75％体积乙醇洗涤2次，空气干燥后，加入50μL的ddH2O溶解沉淀物，即得。
上述提取鼠杂交瘤细胞LC-5A1的总RNA，按照Gibco公司的TRIzolTM Reagent(Invitrogen)试剂盒进行操作，货号为15596026。
上述鼠杂交瘤细胞LC-5A1购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.10898。
进一步，步骤2中，所述合成鼠杂交瘤细胞cDNA的第一条链的反应体系为：20μL总反应体系中，包括4μL的5×缓冲液、10mM的DDT、10g步骤1提取的总RNA、终浓度为0.5mM的dNTP、终浓度为10μg/mL的Oligo(dT)15、40U的RNAsin和200U的MMLV-反转录酶，均匀混合，37℃水浴1h，100℃金属浴灭活。
其中，上述DDT，即D-Dopachrome Tautomerase，中文名称为D多巴色素变位酶，购自Promega公司。
上述dNTP，购自Promega公司。
上述Oligo(dT)15，购自Promega公司。
上述RNAsin，购自Promega公司。
上述MMLV-反转录酶，购自Gibco公司。
进一步，步骤3中，所述轻链上游引物PVL5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述轻链下游引物PVL3的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述重链上游引物PVH5的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述重链下游引物PVH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
SEQ ID NO.9-12的序列具体如下：
SEQ ID NO.9：5'-gacattcagctgacccagtctcca-3'(轻链上游引物PVL5)。
SEQ ID NO.10：5'-gttagatctccagcttggtccc-3'(轻链下游引物PVL3)。
SEQ ID NO.11：5'-aggtsmarctgcagsagtcwgg-3'(s＝c或g，m＝a或c，r＝a或g，w＝a或t)(重链上游引物PVH5)。
SEQ ID NO.12：5'-tgaggagacggtgaccgtcctcccttggccccag-3'(重链下游引物PVH3)。
进一步，步骤3中，所述扩增轻链互补决定区的方法为：100μL总反应体系中，包括10μL的10×缓冲液、2μL浓度为10mM的dNTP、20μL的步骤2得到的cDNA、50pmol的轻链上游引物PVL5和50pmol的轻链下游引物PVL3，混匀后表面覆盖石蜡油，95℃水浴5min后，透过石蜡油加入2U的Taq和Pfu DNA聚合酶，按下述循环执行PCR扩增程序：94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，共30个循环，最后一个循环72℃，10min。
进一步，步骤3中，所述扩增重链互补决定区的方法为：100μL总反应体系中，包括10μL的10×缓冲液、2μL的10mM的dNTP、20μL的步骤2得到的cDNA、50pmol的重链上游引物PVH5和50pmol的重链下游引物PVH3，混匀后表面覆盖石蜡油，95℃水浴5min后，透过石蜡油加入2U的Taq和Pfu DNA聚合酶，按下述循环执行PCR扩增程序：94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，共30个循环，最后一个循环72℃，10min。
上述Taq，购自Promega公司。
上述Pfu DNA聚合酶，购自Promega公司。
本发明的目的之三，是提供一种人源化抗Grb2抗体。本发明提供的人源化抗Grb2抗体，具有人源化抗体，可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种人源化抗Grb2抗体，包括轻链互补决定区和重链互补决定区，所述轻链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的人源化抗Grb2抗体，其轻链蛋白质氨基酸序列包含或由SEQ ID NO.7组成，重链蛋白质氨基酸序列包含或由SEQ ID NO.8组成。在本发明所述的具体实施例中，该人源化抗Grb2抗体是一种具有特定的轻、重链氨基酸序列的重组单克隆抗体，由于该特定抗体的框架区及恒定区均来自于人，又称为重组人源化抗体。
SEQ ID NO.7-8具体的序列如下：
SEQ ID NO.7：
DIVMSQSPSS LAVSVGEKVT MSCKSSQSLL YSSNQKNYLA WYQQKPGQSP KLLIYWASTRDSGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVQAEDLA VYYCKQSYNL RTFGGGTKLE IKSGSGSGQD YSLTISSLESDDTATYYCLQ HGESPYTFGG GTNHPPCMHR WERESLSLAR RVRTSWQMGS HQDSVAVDLG KIILGLCSLLLCKILLWWGH GLL。
SEQ ID NO.8：
QVQLQQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT SYLMHWVKQR PGRGLEWIGR IDPNSGGTKYNEKFKSKATL TVDKPSSTAY MQLSSLTSED SAVYFCARYP YGRAMDYWGQ GTSVTVSSGS PDSGEEAGVGRNHRWWWVSH LLSRHCEGPI HHLQRQCQEQ PVPANEQSEV LGHGLVSLCK TGLGRVLLRL LGPRHHSHSLLSQNDTPICL STGPWICCPN WLHGDPGMPG QGLFPGASDS DLELWIPVQR CAHLPSCPAV TPLHSEQLSDCPLQPSAQRD RHLQRCPPGQ QHQGGQENCA QGLWLPALHM YSPRSIICLH LPPKAQGCPH HYSDSCGHVCCGRHQQGESR GPVQLVCRQC GGAHSSDATP GGAVQQHFPL SQATSHHAPG LAQWQGVQMQ GQQCSFPCPHRENHIQNQYL HPSLYKHSTQ HCLGTL。
本发明的有益效果是：
本发明提供的人源化抗Grb2抗体，具有人源化抗体，可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
需要说明的是，在本申请书中，术语“本发明的抗体”特指本发明所述的“人源化抗Grb2单克隆抗体”，其轻链互补决定区包含SEQ ID NO.1-3所示的CDR区，重链互补决定区包含SEQ ID NO.4-6所示CDR区。
而“人源化抗Grb2抗体”，则是由上述抗体概念包含的、特定的、轻链蛋白质氨基酸序列包含或由SEQ ID NO.7组成，重链蛋白质氨基酸序列包含或由SEQ ID NO.8组成的一种特定完整序列的抗Grb2人源化单克隆抗体，该特定抗Grb2人源化单克隆抗体的完整序列是由本发明所提供的CDR区序列嵌入拼接到特定人抗体FR区序列和恒定区序列构成。
本发明的目的之四，是提供一种分离的多核苷酸。本发明提供的分离的多核苷酸，可以编码上述的人源化抗Grb2单克隆抗体。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种分离的多核苷酸，其编码上述的人源化抗Grb2单克隆抗体。
本发明的有益效果是：
本发明提供的分离的多核苷酸，可以编码上述的人源化抗Grb2单克隆抗体。
根据本领域共识，即使改变编码SEQ ID No.1-3和SEQ ID No.4-6抗体蛋白质的核苷酸序列，只要保留三联密码子后三位所翻译的氨基酸序列、均为编码该抗Grb2人源化抗体的多核苷酸，所述核酸为DNA。
本发明的目的之五，是提供一种表达载体。本发明的表达载体，含有上述的多核苷酸，具体地，本发明将编码人源化嵌合抗体的轻链和重链的多核苷酸分别重组克隆入含有真核启动子的两种载体中，并将所得的表达载体导入真核宿主细胞，通过筛选获得高产量表达的真核宿主细胞，在该宿主细胞的培养上清中含有大量其所分泌的人源化抗体蛋白，根据本领域公知的技术方法可以从中方便地提取并制备。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种表达载体，其含有上述的多核苷酸。
本发明的有益效果是：
本发明的表达载体，含有上述的多核苷酸，具体地，本发明将编码人源化嵌合抗体的轻链和重链的多核苷酸分别重组克隆入含有真核启动子的两种载体中，并将所得的表达载体导入真核宿主细胞，通过筛选获得高产量表达的真核宿主细胞，在该宿主细胞的培养上清中含有大量其所分泌的人源化抗体蛋白，根据本领域公知的技术方法可以从中方便地提取并制备。
根据本领域的共识和通用技术，只要知道所表达抗体的氨基酸序列或核苷酸序列，行业内人员很容易构建出可表达该抗体的多种形式的表达载体。
根据本领域共识，只要知道所需表达抗体的氨基酸或核苷酸序列，利用本领域通用技术能很容易构建出多种形式的该抗体表达载体。载体可衍生自质粒，如F、R1、RP1、Co1、pBR322、TOL、Ti等；粘粒；噬菌体，如λ、Iambdoid、M13、Mu、P1、P22、Q、T-even、T-odd、T2、T4、T7；植物或动物病毒等。载体可用于克隆和/或表达目的及基因治疗目的。包含与一或多种调节表达的核酸分子可操纵地连接编码本发明抗体的一或多种核酸分子的载体也可包括在本发明内。载体的选择依赖于重组程序及使用的宿主。在宿主细胞中导入载体可通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、lipofectamin转染或电穿孔实现。载体可以自主复制或者可以与整合进其中的染色体一同复制。所述载体通常含有一或多种选择标记，所述标记的选择可依赖于选择的宿主细胞，标记包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、Zeocin、单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。具体而言，本发明将编码该抗Grb2人源化嵌合抗体的轻链和重链的多核苷酸分别重组克隆入含有真核启动子的两种载体中，并将所得到的表达载体导入真核宿主细胞，通过筛选获得高产量表达本发明的抗体的真核宿主细胞，在该宿主细胞的培养上清中含有大量其所分泌的该抗Grb2人源化抗体蛋白，根据本领域共识的技术方法可从中方便提取并制备该抗Grb2人源化抗体蛋白，在实施例中，所述表达载体分别是特定的含有该抗Grb2人源化抗体基因和氨甲蝶呤加压扩增表达选择标志基因(dhfr)并可在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的载体pSRNC-Cκ-Grb2-1和pSRDC-Cγ1-Grb2-1。
本发明的目的之六，是提供一种宿主细胞。本发明提供的宿主细胞，含有上述的多核苷酸，提供分泌抗体蛋白的载体。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种宿主细胞，其含有上述的多核苷酸或含有上述的表达载体。
本发明的有益效果是：
本发明提供的宿主细胞，含有上述的多核苷酸，提供分泌抗体蛋白的载体。
所述宿主细胞，包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。使用哺乳动物如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的表达系统通常优先使用于本发明中。在本发明的实施例中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。将pSRNC-Cκ-Grb2-1和pSRDC-Cγ1-Grb2-1导入真核细胞CHO中，通过筛选获得高产量表达本发明的抗体的真核宿主细胞，在该宿主细胞的培养上清中含有大量所分泌的该抗Grb2人源化抗体蛋白，根据本领域的公知常识，可从中方便提取并制备该抗Grb2人源化抗体蛋白。
本发明的目的之七，是提供上述的人源化抗Grb2单克隆抗体或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的宿主细胞在制备人源化抗Grb2阳性的肿瘤药物中的用途。本发明提供的人源化抗Grb2单克隆抗体或多核苷酸或表达载体或上述的宿主细胞可以用于制备人源化抗Grb2阳性的肿瘤药物，用于治疗细胞表面Grb2表达阳性的恶性肿瘤。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述的人源化抗Grb2单克隆抗体或上述的人源化抗Grb2抗体或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的宿主细胞在制备抗人源化抗Grb2阳性的肿瘤药物中的用途。
本发明的有益效果是：
本发明提供的人源化抗Grb2单克隆抗体或人源化抗Grb2抗体或多核苷酸或表达载体或上述的宿主细胞可以用于制备人源化抗Grb2阳性的肿瘤药物，用于治疗细胞表面Grb2表达阳性的恶性肿瘤。
本发明的人源化抗Grb2单克隆抗体可与肿瘤细胞内Grb2蛋白特异性结合，可直接在体内阻断Grb2介导的RTKs相关通路的过度活化，抑制Grb2过表达肿瘤在体内的生长，因此该抗体可用于直接制备抗Grb2表达强阳性肿瘤的靶向治疗或协同RTKs靶向治疗的抗体药物。根据本领域共识，在获得人源化抗Grb2抗体蛋白时，通过加入适当的稳定剂、保护剂、pH调节剂、盐平衡剂、赋形剂等，即可制备成为直接用于人体治疗的抗体药物。在本发明的实施例中，本发明的抗体可用于治疗Grb2表达强阳性的裸鼠抑制瘤。在具体的结直肠癌模型中，所述人源化抗Grb2嵌合抗体可作为药物通过常规给药途径给予患者，所述的给药途径例如但不限于经胃肠外给药，例如静脉输注、局部给药等。合适的剂量依赖于若干参数，包括给药方法和所治疗对象的耐受程度。可以明确的是抗Grb2人源化抗体能明显抑制Grb2过表达的人结直肠癌细胞生长，并呈剂量依赖关系。
定义
单克隆抗体
本申请所使用术语“单克隆抗体”是指来自一群基本同源的抗体，即包含除了可能以很小量存在的天然发生突变之外的相同各个抗体集合。单克隆抗体是针对单一靶位点的高度特异性的抗体，与常规的(多克隆)抗体制备物(包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体均针对靶标上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势可以通过杂交瘤培养而合成，从而避免免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体来自基本上同质的抗体群这一特征，而不需要通过任何特殊方法产生该抗体。
互补决定区(CDR)
本申请所使用术语“互补决定区”是指结合分子如免疫球蛋白可变区中的序列。其通常主要提供在形状和电荷分布方面与抗原上被识别的表位互补的抗原结合位点。CDR区可以特异于线性表位、不连续表位或蛋白质，或蛋白质片段的构象表位，这些表位以其天然构象存在于蛋白质上或在某些情况下作为例如通过在SDS中增溶而变性的形式存在于蛋白质上，表位也可以由翻译后修饰的蛋白质组成。
多核苷酸
本申请所使用术语“多核苷酸”包括脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或具有天然核糖核酸必须性质的类似物，在严格杂交条件下，与天然核苷酸一样和基本上相同核苷酸序列杂交和/或与天然核苷酸一样可以翻译成相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构或调解基因的全长或亚序列。除非特别指出，该术语包括特异的序列及其互补序列。因此，本申请书中术语“多核苷酸”包含具有为了稳定性或其他原因而修饰的主链的DNA。
多肽
本申请所使用术语“多肽”可与“肽”和“蛋白质”互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语用于氨基酸聚合物，其中，一或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人造化学类似物，以及用于天然氨基酸聚合物。这种天然氨基酸的类似物的必须性质是当其掺入蛋白质中时，该蛋白质特异地与相同的但完全由天然氨基酸组成的蛋白质引发的抗体反应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰、但不限于磷酸化、糖基化、脂质附着、硫化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。
特异性结合
本申请所用针对抗体与其结合配偶体例如抗原之间的相互作用而提及的术语“特异性结合”是指所述相互作用依赖于结合配偶体上特定结构的存在，例如抗原决定簇或表位的存在。换言之，当所述结合配偶体存在于其它分子或生物体的混合物中时，所述抗体也优先结合或识别所述结合配偶体。所述结合可以由共价或非共价相互作用，或两种作用共同介导。“特异性结合”也指免疫特异性结合抗原或其片段及非免疫特异性结合其它抗原。免疫特异性结合抗原的结合分子可以以较低亲和性结合其它肽或多肽，如放射性免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、BIACORE或者本领域已知的其它测定法确定。免疫特异性地结合抗原的结合分子或其片段可以与相关抗原交叉反应。优选免疫特异性结合抗原的结合分子或其片段与其它抗原不交叉反应。
变体
本申请所使用术语“变体”指包含与亲代结合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比，改变了一或多个CDR区外的核苷酸和/或氨基酸的核苷酸序列和/或氨基酸序列但仍能竞争性结合亲代结合分子的结合配偶体(例如，Grb2的结合分子)。换言之，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或含有所述氨基酸序列的结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。所述功能变体具有保守的序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，如定点诱变和随机PCR介导的诱变，并可包含天然及非天然核苷酸及氨基酸。
保守的氨基酸取代包括氨基酸残基由具有相似结构或化学性质的氨基酸残基置换。本研究领域已明确具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括具有碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。除此之外，还可以应用上述之外的其它氨基酸残基家族分类。另外，变体也可被非保守的氨基酸取代，例如将氨基酸残基用具有不同结构或化学性质的氨基酸残基置换。相似的小的改变也可以包括氨基酸缺失或插入这两种情况。确定氨基酸残基可以被取代、插入、或缺失而不消除其免疫学活性的技术可以使用本领域通用的计算机软件挖掘。
核苷酸序列中的突变可以是在基因座产生的单一突变(点突变)，或转换或颠换突变，或可以在一个单基因座插入、缺失或改变多个核苷酸。另外，可以在核苷酸序列内的任意数目的基因座中产生一或多个改变。突变可以通过本领域已知的合适方法操作。
人源化抗体
非人抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2片段或者其它结合靶的亚序列)。一般而言，人源化的抗体通常为两个可变区(至少包含一个)，理论上所有CDR均相应于非人免疫球蛋白的那些区域，并且几乎所有FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体可以包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是所选择的人免疫球蛋白模板的部分免疫球蛋白Fc区。
载体
本申请所使用术语“载体”是指一种核酸分子，可以插入另一种核酸分子以用于将其导入宿主中以便其复制，并在特定环境中诱导表达。换言之，载体能转运与其连接的核酸分子。克隆及表达载体均覆盖在本发明所用术语“载体”中，载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)及衍生自噬菌体，或植物(动物、人)的病毒的载体。载体包含由指定宿主识别的复制起源，在表达载体中还涵盖由宿主识别的启动子和其它调节区。含有目标核酸分子的载体通过转化、转染或通过利用病毒进入机制而导入细胞中。某些载体能在其被导入的宿主中自主复制(如具有细菌复制起源的载体可以在细菌中复制)。其它载体可以在导入宿主时整合进宿主基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
宿主
本申请所使用术语“宿主”是指其中已经导入载体如克隆载体或表达载体的细胞。所述细胞可以是原核或真核细胞或生物体。本术语不仅指特定对象细胞，也包括该细胞的后代。由于突变或环境影响导致在后续的世代中可发生某些修饰，因此这种后代可能与亲代细胞相比有差异，但仍包含于本文中提及的“宿主”范围内。
药物学可接受的赋形剂
本申请所使用术语“药物可接受的赋形剂”指与活性分子，如药物、活性物质或结合分子组合的用以制备合适或方便的剂量形式的任何惰性物质。“药物可接受的赋形剂”是在应用剂量和浓度对于受体无毒性并且与包含药物、药剂或结合分子的配置品的其它成分相容的赋形剂。
治疗有效量
本申请所使用术语“治疗有效量”是指本发明所述抗体有效预防、改善和/或治疗肿瘤所使用的剂量。
治疗
本申请所使用术语“治疗”是指用以治愈疾病或阻止或至少延缓疾病进展的治疗性处理和预防措施。需要治疗的对象包括已患有肿瘤或需要预防肿瘤发生的对象。预防包括抑制肿瘤发生或延缓肿瘤发展或抑制或降低与肿瘤相关的一或多种症状的发生、发展和进展。
本申请所使用术语“包含”是指包含所述的要素、整数或步骤；或要素、整数或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或其他要素、整数或步骤组。
附图说明
图1为本发明的人源化抗Grb2单克隆抗体轻链真核表达载体pSRNC-Cκ-Grb2-1结构示意图。
图中，Pw代表弱化的真核启动子；Neo代表氨基糖苷磷酸转移酶(neo)基因；PhCMV-IE代表人巨细胞病毒立早基因启动子及增强子；VL gene代表带有前导肽序列及5'内含子端剪切位点序列的轻链可变区基因片段；Cκgene代表人抗体轻链K链恒定区基因片段；BGHpolyA代表牛生长激素polyA加尾位点；Ap代表氨苄抗性基因。
图2为本发明的人源化抗Grb2单克隆抗体重链真核表达载体pSRDC-Cγ1-Grb2-1结构示意图。
图中，Pw代表弱化的真核启动子；dhfr代表二氢叶酸还原酶基因；PhCMV-IE代表人巨细胞病毒立早基因启动子及增强子；VH gene代表带有前导肽序列及5'内含子端剪切位点序列的重链可变区基因片段；Cγ1gene代表人抗体重链γ1链恒定区基因片段；BGHpolyA代表牛生长激素polyA加尾位点；Ap代表氨苄抗性基因。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：人源化抗Grb2单克隆抗体的制备方法
本实施例的人源化抗Grb2单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：提取鼠杂交瘤细胞LC-5A1的总RNA
鼠杂交瘤细胞LC-5A1购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.10898，液氮保存。提取鼠杂交瘤细胞LC-5A1的总RNA，按照Trizol(Gibco公司)说明书操作，具体是：收集1×107鼠单克隆抗体杂交瘤细胞，10,000rpm离心1min，弃上清。加入1mLTrizol充分溶解细胞，室温静置3-5min后加入0.2mL氯仿，颠倒混匀；4℃，12,000rpm离心10min，将上清转移至清洁的1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀；室温静置20min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清；75％乙醇洗涤2次，空气干燥后加入50μL ddH2O溶解沉淀物。
步骤2：以步骤1提取的总RNA为模板，合成鼠杂交瘤细胞cDNA的第一条链
0.7％非变形琼脂糖凝胶电泳分析从亲本抗Grb2鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株中提取总RNA 18S和28S RNA大小。利用MMLV-反转录酶合成鼠单克隆抗体杂交细胞瘤细胞cDNA第一条链：20μL总反应体系中，包括5×缓冲液4μL、10mM的DDT、10μg步骤1提取的总RNA、终浓度为0.5mM的dNTP、终浓度为10μg/mL的Oligo d(T)15、40U的RNAsin和200U MMLV-反转录酶，均匀混合，37℃水浴1h，100℃金属浴灭活。
其中，上述DDT，即D-Dopachrome Tautomerase，中文名称为D多巴色素变位酶，购自Promega公司。
上述dNTP，购自Promega公司。
上述Oligo(dT)15，购自Promega公司。
上述RNAsin，购自Promega公司。
上述MMLV-反转录酶，购自Gibco公司。
步骤3：以步骤2得到的cDNA为模板，采用轻链上游引物PVL5和轻链下游引物PVL3，扩增轻链互补决定区；采用重链上游引物PVH5和重链下游引物PVH3，扩增重轻链互补决定区。
所述轻链上游引物PVL5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述轻链下游引物PVL3的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述重链上游引物PVH5的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，所述重链下游引物PVH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
SEQ ID NO.9-12的序列具体如下：
SEQ ID NO.9：5'-gacattcagctgacccagtctcca-3'(轻链上游引物PVL5)。
SEQ ID NO.10：5'-gttagatctccagcttggtccc-3'(轻链下游引物PVL3)。
SEQ ID NO.11：5'-aggtsmarctgcagsagtcwgg-3'(s＝c或g，m＝a或c，r＝a或g，w＝a或t)(重链上游引物PVH5)。
SEQ ID NO.12：5'-tgaggagacggtgaccgtcctcccttggccccag-3'(重链下游引物PVH3)。
所述扩增轻链互补决定区的方法为：100μL总反应体系中，包括10μL的10×缓冲液、2μL浓度为10mM的dNTP、20μL的步骤2得到的cDNA、50pmol的轻链上游引物PVL5和50pmol的轻链下游引物PVL3，混匀后表面覆盖石蜡油，95℃水浴5min后，透过石蜡油加入2U的Taq和Pfu DNA聚合酶，按下述循环执行PCR扩增程序：94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，共30个循环，最后一个循环72℃，10min。
所述扩增重链互补决定区的方法为：100μL总反应体系中，包括10μL的10×缓冲液、2μL的10mM的dNTP、20μL的步骤2得到的cDNA、50pmol的重链上游引物PVH5和50pmol的重链下游引物PVH3，混匀后表面覆盖石蜡油，95℃水浴5min后，透过石蜡油加入2U的Taq和PfuDNA聚合酶，按下述循环执行PCR扩增程序：94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，共30个循环，最后一个循环72℃，10min。
上述Taq，购自Promega公司。
上述Pfu DNA聚合酶，购自Promega公司。
结果如图1所示：320bp左右处产物为轻链可变区基因片段，360bp左右处产物为重链可变区基因片段，扩增片段大小与一般抗体可变区基因大小相符。
步骤4：规模化扩增抗Grb2鼠单克隆抗体轻链可变区基因片段，采用玻璃奶吸附法分离回收后以Pvu II和Bg1 II双酶切，并定向克隆入克隆载体pRGWL相应位点，共收集到221个转化克隆。随机挑选15个克隆筛选，获得4个重组克隆。将筛选阳性重组克隆进行核苷酸序列分析，4个克隆的序列完全相同，证实所克隆的抗体轻链可变区基因中存在抗Grb2鼠单克隆抗体轻链可变区基因。随机从4个克隆中挑选其中一个克隆命名为pRGWL-Grb2-1。对比Kabat数据发现，抗Grb2鼠单克隆抗体的VL属于小鼠k轻链第III亚群，轻链CDR1-3序列(SEQ ID NO.1-3)。
规模化扩增抗Grb2鼠单克隆抗体重链可变区基因片段，采用玻璃奶吸附法分离回收后以Pst II和BstE II双酶切，并定向克隆入克隆载体pRGWH相应位点，共收集到346个转化克隆。随机挑选25个克隆筛选，获得11个重组克隆。将其中5个阳性重组克隆进行核苷酸序列分析，5个克隆的序列完全相同，证实所克隆的抗体重链可变区基因中存在抗Grb2鼠单克隆抗体重链可变区基因。随机从5个克隆中挑选其中一个克隆命名为pRGWH-Grb2-1。对比Kabat数据发现，抗Grb2鼠单克隆抗体的VH属于小鼠IgG重链第III亚群，重链CDR1-3序列(SEQ ID NO.4-6)。
SEQ ID NO.1-6具体的序列如下：
SEQ ID NO.1：Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys AsnTyr Leu Ala；
SEQ ID NO.2：Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser；
SEQ ID NO.3：Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr；
SEQ ID NO.4：Ser Tyr Trp Ile Glu；
SEQ ID NO.5：Glu Ile Leu Pro Gly Ile Gln Ser Thr Asn Tyr Asn Glu LysPhe Lys Val Arg；
SEQ ID NO.6：Arg Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr。
实施例2：抗Grb2鼠单克隆抗体的人源化抗体基因及表达载体的构建
采用基因合成法，将抗Grb2鼠单克隆抗体的可变区基因的框架区替换为人抗体的框架区，采用全合成法合成抗Grb2鼠单克隆抗体的人源化抗体可变区基因片段，重组入含有调控序列和人抗体恒定区基因的载体中，构建抗Grb2人源化抗体的完整基因及包含所述基因的真核表达载体。
抗Grb2鼠单克隆抗体的人源化抗体可变区基因的合成：以人源化4D5单抗可变区为模板，采用CDR移植法，将其CDR区替换为相应的3B8单抗的CDR区，保留两端的克隆酶切位点序列。所设计的抗Grb2鼠单克隆抗体的人源化抗体可变区基因所翻译的氨基酸序列，轻、重链基因采用分段合成+重叠PCR连接法，通过商业公司直接合成。与实施例1采用相同的方法，PCR扩增抗Grb2鼠单克隆抗体的人源化抗体轻、重链可变区基因后回收产物酶切，重新克隆入pRGWL和pRGWH载体，测序鉴定克隆序列与原设计的序列相同，分别挑取阳性克隆命名为pRGWL-Grb2-H和pRGWH-Grb2-H并作为构建下述表达载体的扩增模板使用。
通过PCR扩增条带调控序列的可变区基因片段：以经测序鉴定的实施例1中所获得的重组克隆质粒pRGWL-Grb2-H和pRGWH-Grb2-H为模板，使用两端含有BamH I和Not I酶切位点的引物PVLS/PVNP(轻链)和PVHS/PVNP(重链)，PCR扩增带用引导肽和5'-端剪切位点的人源化的VL和VH。通过PCR反应从轻链的重组质粒中扩增出带有引导肽和5'端剪切位点的人源化的VL片段，大小约500bp；从重链的重组质粒中扩增出带有引导肽和5'端剪切位点的人源化的VH片段，大小约700bp。具体而言，使用高精度DNA聚合酶Taq和Pfu DNA聚合酶，其中在100μL的反应体系中含有：10×缓冲液10μL，10mM dNTP 2μL，质粒(pRGWL-Grb2-H和pRGWH-Grb2-H)1μg，扩增引物(轻链上游引物PVLS、轻链下游引物PVNP、重链上游引物PVHS、重链下游引物PVNP)各50pmol，混匀后表面覆盖石蜡油，95℃水浴5min后透过石蜡油加入2UTaq和Pfu DNA聚合酶，按94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，20个循环；最后一个循环72℃，10min，进行PCR扩增。
上述轻链上游引物PVLS的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链下游引物PVNP或重链下游引物PVNP的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，重链上游引物PVHS的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
SEQ ID NO.13-15的序列具体如下：
SEQ ID NO.13：5'-ctcggaattcggatccatgggatggagctgtatcatcc-3'(轻链上游引物PVLS)。
SEQ ID NO.14：5'-ggtccgaattcgcggccgctataaatctctggccatgaag-3'(轻链下游引物PVNP或者重链下游引物PVNP)。
SEQ ID NO.15:
5'-ggtccagcttgcggccgcaactgaggaagcaaagtttaaattctactcacgtttgatcacca-3'(重链上游引物PVHS)。
人源化抗Grb2抗体整合表达载体的构建和鉴定：上述PCR产物采用玻璃奶吸附法分离回收后以BamH I和Not I双酶切，按照《分子克隆(第四版)》所述进行常规DNA重组操作。将VL克隆入pSRNC-Cκ，VH克隆入pSRDC-Cγ1中相应位点，构建成完整的抗Grb2人源化抗体基因的真核表达载体。再分别将VL和VH连入表达载体pSRNC-Cκ和pSRDC-Cγ1后，分别挑取5个克隆进行筛选，经酶切鉴定得到4个轻链重组克隆和5个重链重组克隆。经BamH I和Not I双酶切后可切除相应的VL片段和VH片段，成功构建完整的抗Grb2人源化单克隆抗体基因及真核表达载体。经3次重复核苷酸序列证实，抗Grb2人源化单克隆抗体真核表达pSRNC-Cκ-Grb2和pSRDC-Cγ1-Grb2中的可变区基因序列分别与原设计的人源化可变基因序列完全相同。该套表达载体产k的抗Grb2人源化单克隆抗体的氨基酸序列的SEQ ID NO.7(轻链，恒定区为人抗体Cκ)和SEQ ID NO.8(重链，恒定区为人抗体Cγ1)所示。
SEQ ID NO.7(轻链序列)如下：
IQAFVFVFLWLSGARVSIPCKASQDVSAAVAWYLQKPGHSPTLLIYWTSTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEGPGTLLLSTTLLHSSDVRWRHQAGNQTVGTKLQTGVCCTNCIRHLPTIQTAVNIWRCLSRVLLEQLLPQRHQCQVEDKWQGTTKWRPEQLDPSGQQRQHLQHEQHPHVDQGRVLTTHQLYLYGHSQDINFTHCQELQQERV。
SEQ ID NO:8(重链序列)如下：
EVQLQQSGAELVKPGSSVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARDYYGSRFIYVPETLLCSLWIHFQALWHVLGSPDSGEEAGVGRNHEWWWYSHLLSRHCEGPIHHLQRQCQEQPVPANEQSEVSGHGLVSLCKTGLGRVLLGLLGPRHHSHSLLSQNDTPICLSTGPWICCPNSLHGDPGMPGQGLFPLASDSDLELWIPVQRCAHLPSCPAVIPLHSEQLSDCPLQPSAQRDRHLQRCPPGQQHQGGQENCAQGLWLAALHMYSPRSIICLHLPPKAQGCPHHYSDSQGHVCCGRHQQGESRGPVQLVCRIICGGAHSSDATPGGAVQQHFPLSQPTSHHAPGLAQWQGVQMQGQQCSFPCPHRENHIQNQRQTEGSTGVHHSTSQGADGQGKSQSDLHDNRLLPQRHNSGVAVEWAASGELQEHSAHHEH。
人源化抗Grb2单克隆抗体真核表达载体结构：抗Grb2人源化单克隆抗体真核表达载体分别采用了轻链真核表达载体(pSRNC-Cκ-Grb2)和重链表达载体(pSRDC-Cγ1-Grb2)，其结构示意图如图1和图2所示。
实施例3：人源化抗Grb2抗体表达载体的细胞(CHO细胞)中的诱导表达
将含有10％FBS、0.03mmol/L次黄嘌呤(H)、0.003mmol/L胸腺嘧啶脱氧核苷(T)、0.1mmol/L脯氨酸(Pro)、0.1mmol/L甘氨酸(Gly)、100U/mL青链霉素、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基置于5％CO2，37℃环境中，复苏和培养CHO-dhfr-细胞。按1:10比例，3-4天传代一次。采用基因转染方法，使用Lipofect AMINE试剂(Gibco公司)进行转染，将抗Grb2人源化抗体的轻、重链表达载体共转染至细胞中，使用不含H、T、Gly的培养基进行筛选，待克隆形成后再采用含200μg/mL G418(Gibco公司)选择性培养基进行筛选。结果，各取4μg轻、重链抗体基因表达载体转染至CHO-dhfr-细胞，2周内肉眼可见克隆生长。用山羊抗人k链多克隆抗体包被，山羊抗人IgG-HRP为二抗的间接ELISA法测得抗性克隆混合物培养上清OD490＝1.645，而阴性对照CHO-dhfr-上清OD490仅为0.073，提示转染细胞的上清中含有抗Grb2人源化抗体表达。
实施例4：筛选抗Grb2人源化嵌合抗体高表达株
使用含有10％FBS、100U/mL青链霉素、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基在5％CO2，37℃环境中，复苏和培养转染后的CHO细胞。按1:10比例，3-4天传代一次。采用氨甲蝶呤(MTX)加压扩增表达筛选方法，筛选抗Grb2抗体高表达株。上清液中含有人源化抗Grb2抗体表达的细胞克隆依次采用含3×10-8M和10-7M MTX完全培养基加压培养，每轮加压扩增表达后均采用有限稀释法进行亚克隆，筛选最高产量的克隆株。
将人源化抗Grb2抗体表达载体转染CHO-dhfr-细胞后初次筛选获得的高效表达人源化抗Grb2抗体的克隆7B4(克隆产量可达28.9μg/mL)加入含有3×10-8M MTX的培养基中连续培养30天，当细胞适应3×10-8M MTX压力浓度后(细胞形态和生长速度恢复正常)，其抗体产量可达到41.27μg/mL，克隆8E5继续在1:5传代培养后更换1×10-7M MTX继续加压培养。细胞适应后，抗体产量可达55.27μg/mL，亚克隆后筛选出5F9抗体产量最高的克隆株抗体产量经检测可达112.71μg/mL。
实施例5：抗Grb2人源化抗体的特异性、人源性鉴定
1.抗Grb2人源化抗体的特异性鉴定：采用ELISA法，以1μg/mL重组Grb2蛋白包被酶标板，加样反应后，再加山羊抗人IgG Fc-HRP酶标抗体(Sigma公司)(不与鼠Ig发生交叉反应)或山羊抗鼠IgG Fc-HRP酶标抗体(Sigma公司)孵育，显色，测定OD490。从克隆株5F9细胞上清中采用蛋白A亲和层析柱纯化的抗Grb2人源化抗体可与包被的重组Grb2蛋白结合，并被山羊抗人IgG Fc片段多克隆抗体识别，呈现阳性反应；而未转染CHO-dhfr-细胞培养上清和亲本鼠单克隆抗体5A1呈阴性反应。在以山羊抗鼠IgG Fc-HRP作为二抗时，未转染CHO-dhfr-细胞培养上清和纯化的抗Grb2人源化抗体均呈阴性，而亲本鼠单克隆抗体5A1呈阳性反应。无关抗体人IgG1均为阴性，证实所表达的抗Grb2人源化抗体可与重组Grb2蛋白特异性结合。
表1 ELISA分析抗Grb2人源化抗体的抗原结合特异性
样品 OD490<sup>a</sup> OD490<sup>b</sup>
抗Grb2人源化抗体(100ng/mL) 2.965±0.215 2.761±0.299
人IgG1(100ng/mL) 0.073±0.002 0.073±0.001
亲本鼠单克隆抗体**(100ng/mL) 0.073±0.001 2.461±0.153
PBS对照 0.076±0.003 0.074±0.002
CHO-dhfr细胞上清液 0.074±0.002 0.075±0.003
a利用山羊抗人IgG Fc片段-HRP作为第二抗体；b利用山羊抗小鼠IgG Fc片段-HRP作为第二抗体。
以Grb2高表达的人结肠癌细胞HT29的固定化细胞为靶细胞，加入抗Grb2人源化抗体(10μg/mL)，37℃孵育后再加入山羊抗人IgG-荧光二抗(Sigma公司)，荧光显微镜下观察抗Grb2人源化抗体识别Grb2高表人结肠癌细胞HT29所表达的Grb2蛋白。
2.人源化抗Grb2抗体的人源性鉴定：在ELISA中，用山羊抗人k链(Sigma公司)或山羊抗人IgG多克隆抗体(Sigma公司)包被酶标板，以山羊抗IgG Fc-HRP(Sigma公司)作酶标抗体的ELISA结果(表2)显示，纯化的抗Grb2人源化抗体成强阳性反应，而抗Grb2人源化抗体的亲本鼠单克隆抗体3B8则呈阴性反应。证明纯化的抗Grb2人源化抗体含有人IgG的轻、重链恒定区。
表2通过ELISA检测抗Grb2人源化抗体的人源性
样品(100ng/mL) OD490<sup>a</sup> OD490<sup>b</sup>
抗Grb2人源化抗体(5F9) 2.761±0.299 2.442±0.159
亲本鼠单克隆抗体** 0.076±0.007 0.073±0.004
人IgG1 2.525±0.126 2.361±0.189
PBS对照 0.074±0.003 0.074±0.006
a用山羊抗人IgG包被；b用山羊抗人k链包被。
实施例6：抗Grb2人源化抗体制备治疗药物用于体内Grb2过表达人裸鼠移植瘤治疗
在荷Grb2表达阳性人结肠癌细胞HT29(所述裸鼠右侧背部皮肤注射106个细胞)体内进行抗Grb2人源化抗体体内治疗人结肠癌有效性研究。肿瘤细胞接种后第3天开始腹腔给药治疗，抗Grb2人源化抗体体内治疗分为3个剂量组：3mg/kg体重、10mg/kg体重、30mg/kg体重，同时设立PBS和30mg/kg体重人IgG对照组。每周给药2次。结果如表3所示，抗Grb2人源化抗体可在体内显著抑制人Grb2表达阳性的人结肠癌细胞HT29生长，并呈明显的剂量依赖关系，与治疗同时进行的各实验动物血液学及生长变化的初步研究表明，抗Grb2人源化抗体体内治疗结肠癌时，其血液学指标及小鼠生长变化在实验组和对照组间无显著性差异，初步证实抗Grb2人源化抗体并无明显的体内毒性效应。
表3抗Grb2人源化抗体对人Grb2表达阳性结肠癌细胞瘤重抑瘤率
组别 动物数 平均瘤重(g) 抑制率(％) P值
PBS 10 1.27±0.29 / /
人IgG30mg/kg 10 1.19±0.32 /
抗Grb2人源化抗体3mg/kg 10 0.84±0.11 33.1 <0.05
抗Grb2人源化抗体10mg/kg 10 0.62±0.27 52.7 <0.05
抗Grb2人源化抗体30mg/kg 10 0.35±0.14 75.3 <0.05
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人源化抗Grb2单克隆抗体，其特征在于，包括轻链互补决定区和重链互补决定区，所述轻链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。
2.一种人源化抗Grb2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：提取鼠杂交瘤细胞LC-5A1的总RNA；
步骤2：以步骤1提取的总RNA为模板，合成鼠杂交瘤细胞cDNA的第一条链：
步骤3：以步骤2得到的cDNA为模板，采用轻链上游引物PVL5和轻链下游引物PVL3，扩增轻链互补决定区；采用重链上游引物PVH5和重链下游引物PVH3，扩增重轻链互补决定区；
步骤4：分离、回收、纯化、转染步骤3得到的目的片段，以Pst II和BstE II进行双酶切，并定向克隆入克隆载体pRGWH的相应位点，筛选出阳性重组克隆，进行核苷酸序列分析，构建表达抗Grb2人源化单克隆抗体的表达载体，所述表达载体在pSRNC-Cκ-Grb2或pSRDC-Cγ1-Grb2转染中国仓鼠卵巢CHO细胞进行表达，即得到所述人源化抗Grb2单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的人源化抗Grb2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述提取鼠杂交瘤细胞LC-5A1的总RNA的方法为：收集1×107鼠单克隆抗体杂交瘤细胞，10,000rpm离心1min，弃上清，加入1mL的Trizol充分溶解细胞，室温静置3min-5min后加入0.2mL氯仿，颠倒混匀；4℃，12,000rpm离心10min，将上清转移至清洁的1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀；室温静置20min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清；75％体积乙醇洗涤2次，空气干燥后，加入50μL的ddH2O溶解沉淀物，即得。
4.根据权利要求2所述的人源化抗Grb2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述合成鼠杂交瘤细胞cDNA的第一条链的反应体系为：20μL总反应体系中，包括4μL的5×缓冲液、10mM的DDT、10g步骤1提取的总RNA、终浓度为0.5mM的dNTP、终浓度为10μg/mL的Oligo(dT)15、40U的RNAsin和200U的MMLV-反转录酶，均匀混合，37℃水浴1h，100℃金属浴灭活。
5.根据权利要求2所述的人源化抗Grb2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述轻链上游引物PVL5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述轻链下游引物PVL3的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述重链上游引物PVH5的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述重链下游引物PVH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述扩增轻链互补决定区的方法为：100μL总反应体系中，包括10μL的10×缓冲液、2μL浓度为10mM的dNTP、20μL的步骤2得到的cDNA、50pmol的轻链上游引物PVL5和50pmol的轻链下游引物PVL3，混匀后表面覆盖石蜡油，95℃水浴5min后，透过石蜡油加入2U的Taq和Pfu DNA聚合酶，按下述循环执行PCR扩增程序：94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，共30个循环，最后一个循环72℃，10min；所述扩增重链互补决定区的方法为：100μL总反应体系中，包括10μL的10×缓冲液、2μL的10mM的dNTP、20μL的步骤2得到的cDNA、50pmol的重链上游引物PVH5和50pmol的重链下游引物PVH3，混匀后表面覆盖石蜡油，95℃水浴5min后，透过石蜡油加入2U的Taq和Pfu DNA聚合酶，按下述循环执行PCR扩增程序：94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，共30个循环，最后一个循环72℃，10min。
6.一种人源化抗Grb2抗体，其特征在于，包括轻链互补决定区和重链互补决定区，所述轻链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
7.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的人源化抗Grb2单克隆抗体。
8.一种表达载体，其特征在于，其含有权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求7所述的多核苷酸或含有权利要求8所述的表达载体。
10.权利要求1所述的人源化抗Grb2单克隆抗体或权利要求6所述的人源化抗Grb2抗体或权利要求7所述的多核苷酸或权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的宿主细胞在制备抗人源化抗Grb2阳性的肿瘤药物中的用途。
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