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CN120752341A - 靶向sod1的寡核苷酸 - Google Patents

靶向sod1的寡核苷酸

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CN120752341A
CN120752341A CN202480014695.0A CN202480014695A CN120752341A CN 120752341 A CN120752341 A CN 120752341A CN 202480014695 A CN202480014695 A CN 202480014695A CN 120752341 A CN120752341 A CN 120752341A
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China
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sirna
aco
oligonucleotide agent
oligonucleotide
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CN202480014695.0A
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李龙承
姜武林
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Sino American Ruikang Nucleic Acid Technology Nantong Research Institute Co ltd
Original Assignee
Sino American Ruikang Nucleic Acid Technology Nantong Research Institute Co ltd
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Abstract

本申请涉及用于预防或治疗SOD1相关的神经变性疾病或症状(例如肌萎缩侧索硬化症，ALS)的siRNA和寡核苷酸剂。所述寡核苷酸剂包括双链靶向性寡核苷酸(siRNA)和非靶向单链寡核苷酸(ACO)，其中所述siRNA靶向靶基因SOD1的mRNA区域。

Description

靶向SOD1的寡核苷酸
技术领域
本申请涉及核酸技术领域，具体涉及一种降低SOD1转录水平的寡核苷酸剂及其药物应用。
背景技术
肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种由运动神经元退化引起的成人发病的、致死的麻痹性病症。ALS的特征在于颅、脑干和脊髓运动神经元的进展性、成人发病的退化，从而导致在诊断的3至5年内因呼吸衰竭而死亡。ALS以家族性或散发性形式存在，取决于是否有该疾病的家族史，其中散发性ALS(sALS)占ALS患者的90％。在美国，以下最常见的突变基因占ALS的约75％：染色体9开放阅读框72基因(C9orf72；40％)、超氧化物歧化酶1(SOD1；20％)、反式反应DNA结合蛋白43(TDP43；4％)和在肉瘤中融合/在脂肪肉瘤中易位的突变基因。(FUS/TLS；4％)。C9orf72和SOD1基因中的突变也分别表观地占sALS的约5％至8％和约2％至3％。迄今为止，还没有可用于ALS的有效疗法，需要新的疗法来治疗该疾病。
在ALS的突出已知基因中，SOD1基因仍然是fALS的主要原因，并且被认为是重要的ALS药物靶标。对ALS疾病的首次描述可追溯到至少1824年，由Charles Bell提出。然而，SOD1作为ALS的第一个风险基因是在1993年发现的。1994年第一个SOD1转基因小鼠模型(hSOD1G93A)的建立标志着ALS的研究进入了一个新时代。SOD1突变体最可能经由功能获得而引起疾病，降低其水平可能是有益的。因此，使SOD1转录水平沉默是治疗ALS的重要策略。
发明内容
为此，本申请提供一种对超氧化物歧化酶1(SOD1)的表达具有强抑制作用的寡核苷酸剂。所述寡核苷酸剂包括小干扰RNA(siRNA)，其用于通过靶向SOD1 mRNA并随后经由RNA干扰(RNAi)下调细胞或个体中的SOD1蛋白水平来治疗由诸如ALS的SOD1基因突变引起的疾病或病症。
具体而言，本申请的发明人发现一种具有强效敲低SOD1转录物和高中枢神经系统递送效率的寡核苷酸剂，其包含：(a)siRNA；和(b)非靶向单链辅助寡核苷酸(ACO)，其中所述ACO长度为6～22个核苷酸，其中所述siRNA和ACO共价连接(有或无一种或多种连接组分)以形成所述寡核苷酸剂。
在一些实施方案中，所述siRNA包含形成双链结构的正义链和反义链，其中所述反义链包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含具有0、1、2或3个错配的至少10个连续核苷酸，其与SEQ ID NO:1(表1)的部分核苷酸序列具有至少85％的核苷酸序列互补性或同源性。
在一些实施方案中，所述ACO由RNA、DNA、BNA、LNA、甘油核酸(GNA)和肽核酸(PNA)中的一种或多种组成。在一些实施方案中，所述ACO的长度为6～18个核苷酸。在一些实施方案中，所述正义链的长度至少为10个核苷酸。在一些实施方案中，所述正义链的核苷酸长度范围为10～60个核苷酸。在一些实施方案中，所述正义链的核苷酸长度范围为16～25个核苷酸。在一些实施方案中，所述反义链的核苷酸长度范围为15～35个核苷酸。在一些实施方案中，所述反义链的核苷酸长度范围为19～25个核苷酸。
在某些实施方案中，本申请中公开的寡核苷酸序列的一条链与选自SEQ ID NO:2至269的核苷酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％的同源性或互补性。在某些实施方案中，本申请中公开的寡核苷酸序列的所述正义链与选自SEQ ID NO:2至269的核苷酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％的同源性。在某些实施方案中，本申请中公开的寡核苷酸序列的所述反义链与选自SEQ ID NO:2至269的核苷酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％的互补性。
在本申请的一个方面，提供了一种能够抑制/下调细胞中SOD1转录物的寡核苷酸剂。在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂包含siRNA，其中所述siRNA的正义链具有与选自SEQ ID NO:270至537的核苷酸序列至少85％、至少90％或至少95％同源的核苷酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种包含siRNA的寡核苷酸剂，其中所述siRNA的反义链具有与选自SEQ ID NO:538至805的核苷酸序列至少85％、至少90％或至少95％同源的核苷酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种包含siRNA的寡核苷酸剂，其中所述siRNA包含正义链和反义链，其中所述正义链具有与选自SEQ ID NO:270至537的核苷酸序列至少85％、至少90％或至少95％同源的核苷酸序列，并且所述siRNA的反义链具有与选自SEQ ID NO:538至805的核苷酸序列至少85％、至少90％或至少95％同源的核苷酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种包含siRNA的寡核苷酸剂，其中所述siRNA包含正义链和反义链，其中所述正义链具有与选自SEQ ID NO:808至827和867的核苷酸序列至少85％、至少90％或至少95％同源的核苷酸序列，并且所述siRNA的反义链具有与选自SEQ IDNO:828至849和868的核苷酸序列至少85％、至少90％或至少95％同源的核苷酸序列。
在本申请的另一方面，提供了一种包含siRNA和非靶向ACO的寡核苷酸剂，其中所述ACO包含与选自SEQ ID NO:865的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述ACO与连接组分缀合。在一些实施方案中，所述ACO的5’端或3’端或一个或多个内部核苷酸与连接组分缀合。在一些实施方案中，所述siRNA和ACO通过连接组分共价缀合。在一些实施方案中，所述siRNA的正义链或反义链通过连接组分与所述ACO共价缀合。在一些实施方案中，所述连接组分为以下或包括以下中的一种或多种基团：乙二醇链、烷基链、烯基链、炔基链、肽、RNA、DNA、碳水化合物、硫醇连接基团、磷酸二酯、硫代磷酸酯、磷酰胺、酰胺、氨基甲酸酯、四唑连接基团和苯并咪唑连接基团。在一些实施方案中，所述连接组分为选自以下或包括选自以下中的一种或多种：
a)间隔子亚磷酰胺18(亚磷酰胺酸,N,N-双(1-甲基乙基)-,19,19-双(4-甲氧基苯基)-19-苯基-3,6,9,12,15,18-六氧杂十九烷-1-基(2-氰基乙酯)。
b)间隔子-9(3-[2-[2-[2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基甲氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基-[二(丙-2-基)氨基]膦基]氧代丙腈)；
c)间隔子亚磷酰胺C3(6-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)己基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)；和
d)间隔子C6亚磷酰胺(6-(4,4‘-二甲氧基三苯甲基)己基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
e)二价连接子(DIO)16-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-1,1-双(4-甲氧基苯基)-18-氧代-1-苯基-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十一烷-CPG。
在一些实施方案中，所述ACO与所述siRNA正义链的一个或多个内部核苷酸的3’端或5’端或3’和5’端共价连接。在一些实施方案中，所述ACO与所述siRNA反义链的一个或多个内部核苷酸的3’端或5’端或3’和5’端共价连接。在一些实施方案中，不止一个ACO与siRNA共价连接。在一些实施方案中，2～10个ACO与所述siRNA共价连接。
在一些实施方案中，所述siRNA的至少一个核苷酸是化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述ACO的至少一个核苷酸是化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述ACO具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％或约100％的核苷酸为经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA的正义链具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％或约100％的核苷酸为经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA的所述反义链具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％或约100％的核苷酸为经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个经化学修饰核苷酸的化学修饰是2'糖修饰，其选自2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-MOE)修饰中的一种或多种。在一些实施方案中，所述至少一个化学修饰核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方案中，所述ACO包括至少一种硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方案中，所述ACO包括6～17种硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方案中，所述至少一个经化学修饰核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分。在一些实施方案中，所述至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加(E)-乙烯基膦酸酯部分。在一些实施方案中，所述至少一个经化学修饰核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5-甲基胞嘧啶部分。
在一些实施方案中，所述ACO与一个或多个缀合基团缀合。在一些实施方案中，所述siRNA与一个或多个缀合基团缀合。在一些实施方案中，所述siRNA的正义链或反义链与一个或多个缀合基团缀合。在一些实施方案中，所述一个或多个缀合基团选自：脂质、脂肪酸、荧光团、配体、糖、肽和抗体。在一些实施方案中，所述一个或多个缀合基团选自：细胞渗透肽、聚乙二醇、生物碱、色胺、苯并咪唑、喹诺酮类、氨基酸、胆固醇、葡萄糖和N-乙酰半乳糖胺。
本申请涉及一种包含siRNA和非靶向ACO的寡核苷酸剂，其中所述正义链具有与选自SEQ ID NO:808至827、850至851和856至857的核苷酸序列至少85％、至少90％或至少95％同源性的核苷酸序列，并且所述siRNA的反义链具有与选自SEQ ID NO:828至849和861至863的核苷酸序列至少85％、至少90％或至少95％同源性的核苷酸序列。
本申请包含本申请公开的一种含寡核苷酸剂的载体。
本申请还提供了包含本申请公开的寡核苷酸剂的细胞。在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，任选地为人细胞。在一些实施方案中，细胞是宿主细胞。前述细胞可以是体外的，例如细胞系或细胞株，或者可以存在于或取自哺乳动物体内，例如人体。
本申请还提供了包含本申请公开的寡核苷酸剂的一种药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种药学上可接受的载体，其选自水性载体、脂质体或LNP、聚合物、胶束、胶体、金属纳米颗粒、非金属纳米颗粒、生物缀合物和多肽。本申请还提供了一种药盒，其包含本申请公开的寡核苷酸剂或药物组合物。
本申请提供了一种降低SOD1基因转录水平或SOD1蛋白水平的方法，包括向对象施用本申请公开的药物组合物。
本申请还提供了一种治疗或延缓对象肌萎缩侧索硬化(ALS)发作或进展的方法，该方法包括：向对象施用本申请公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述对象有散发性肌萎缩侧索硬化(sALS)。在一些实施方案中，所述对象患有家族性肌萎缩侧索硬化(fALS)。在一些实施方案中，所述药物组合物可降低SOD1基因转录水平或SOD1蛋白水平。
在一些实施方案中，与不具有ACO的寡核苷酸剂相比，所述寡核苷酸剂的ACO可改善所述siRNA的稳定性、生物利用度、生物分布和/或细胞摄取。
在一些实施方案中，与不具有ACO的寡核苷酸剂相比，所述寡核苷酸剂的ACO可增加所述siRNA在一个或多个靶组织内的生物分布。
在一些实施方案中，与不具有ACO的寡核苷酸剂相比，所述寡核苷酸剂的ACO可增加所述siRNA在两个或多个靶组织内的生物分布。
在一些实施方案中，所述一个或多个靶组织选自：前额叶皮质、小脑、大脑、脊髓、肌肉、肺、眼、肝和肾。
本申请部分涉及包含长度范围为16～35个连续核苷酸的寡核苷酸序列的siRNA，其中连续寡核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1的等长部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同源性或互补性的核苷酸序列，其中所述siRNA可抑制SOD1基因的mRNA转录水平，与SOD1 mRNA的基线水平相比，至少达80％。
本申请的发明人还发现，SOD1基因中siRNA的最佳靶序列/正义链包括具有以下特征的序列：(1)GC含量在35％至65％之间；(2)少于5个连续相同核苷酸；(3)3个或更少的二核苷酸重复；和(4)3个或更少的三核苷酸重复。作为有益的结果，靶序列(例如，包含靶序列的分离核酸序列)与所述siRNA相互作用后，与SOD1 mRNA的基线水平相比，可将细胞中SOD1mRNA转录水平抑制至少80％。至少部分基于这些发现，本公开内容的特征在于与SOD1 mRNA的基线水平相比可抑制细胞中SOD1 mRNA转录水平至少80％的siRNA、组合物和药物组合物。本申请还提供了预防或治疗由SOD1基因突变或个体细胞中SOD1蛋白水平异常诱导的疾病或症状的方法，包括施用本申请描述的任何siRNA、组合物和/或药物组合物。
本领域技术人员从下述的具体实施方式可以很容易理解本申请的其他方面和优点，所述实施方式仅显示和描述本申请的说明性实施方案。本申请能够具有其它不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显方面进行修改，所有这些都不会偏离本发明。因此，这些附图和说明应被视为说明性的，而不是限制性的。
援引加入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此援引加入本申请，如同各出版物、专利或专利申请明确单独地援引加入本申请。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下具体实施方式，可以更好地理解本发明的特征和优点，其说明性实施方案采用了本发明的原理，并有附图(本申请中也称为“图”)，其中：
图1A-1E显示的是筛选可体外敲低SOD1的siRNA。图1A显示HEK293A细胞以10或0.1nM的浓度用每个siRNA双链(共268)转染24小时，每组两个重复。使用基因特异性引物组通过RT-qPCR定量测定SOD1的表达水平。将TBP扩增作为内部参考，以归一化表达数据。图中所示为每个实验平行样的SOD1 mRNA相对于模拟处理(虚线)的表达值。模拟样本在不存在寡核苷酸的情况下转染。图1B显示在以6个递增浓度(即0.0064、0.032、0.16、0.8、4和20nM)处理HEK293A细胞并通过RT-qPCR和PI染色定量中表现最佳的siRNA各自的敲低活性和细胞活力。图中所示为相对于模拟处理(虚线)表现最佳的前5种siRNA(即siSOD1-063、047、104、005和258)的SOD1敲低和细胞毒性结果。图1C为在以8个浓度(即0.00006、0.0002、0.001、0.004、0.016、0.063、0.25和1nM)处理SK-N-AS细胞并用RT-qPCR测量中表现最佳的前5种siRNA的剂量反应曲线。数据为2个实验平行样的平均值±标准差。图1D显示用各siRNA的不同化学修饰变体或非特异性siRNA对照(siCon)在0.1nM下转染SK-N-AS细胞24小时的结果。通过RT-qPCR评估相对于模拟处理的敲低活性。图1E显示各种M3修饰变体(即siSOD1-063M3、047M3、104M3、005M3和258M3)处理SK-N-AS细胞并通过RT-qPCR测量生成的剂量反应曲线。数据为3个实验平行样的平均值±标准差。
图2A-2B显示二次筛选siRNA体外效力和不良细胞毒性。还图示了在初始筛选中以6个指定浓度(即0.0064、0.032、0.16、0.8、4和20nM)转染HEK293A细胞中表现最佳的其余前25种siRNA各自的敲低活性和细胞活力。相对于模拟处理的SOD1敲低和不良细胞毒性结果，分别为RT-qPCR定量(图2A)和PI染色定量(图2B)。
图3显示在T98G细胞中表现最佳的前5种siRNA候选物的剂量依赖性敲低结果。在以8个处理浓度(即0.00006、0.0002、0.001、0.004、0.016、0.063、0.25和1nM)转染T98G细胞24小时中表现最佳的前5种siRNA各自的剂量反应曲线。使用基因特异性引物组通过RT-qPCR定量测定SOD1的表达水平。将TBP扩增作为内部参考，以归一化表达数据。图中所示是2个实验平行样相对于对照组(没有寡核苷酸的情况)的平均值±标准差。
图4A-4B显示表现最佳的前5种siRNA候选物的体外不良细胞毒性。用表现最佳的前5种siRNA，以含明显高于其SOD1敲低IC50值的4个处理浓度(即1.56、6.25、25和100nM)分别转染SK-N-AS细胞和T98G细胞。用100nM的siCon处理作为阴性对照(Neg Con)。模拟样本在不存在寡核苷酸的情况下转染。处理72小时后的不良细胞毒性评估，图4A为量化caspase3/7活性的结果，图4B是将ST-8W试剂代谢作为标志物的细胞活力情况。数据为相对于模拟处理(虚线)的2个实验平行样的平均值±标准差。
图5显示不同化学修饰模式对T98G细胞中siRNA敲低活性的影响。用各种siRNA候选物的4种不同化学修饰变体(即M1、M2、M3或M4)或非特异性siRNA对照物(siCon)在0.1nM下转染T98G细胞24小时。通过RT-qPCR评估相对于模拟处理的敲低活性。数据为2个实验平行样的平均值±标准差。
图6显示M3修饰的siRNA在T98G细胞中的剂量依赖性敲低结果。用各种M3修饰的siRNA候选物(即siSOD1-063M3、047M3、104M3、005M3、258M3和270M3)以梯度处理浓度转染T98G细胞24小时后，生成剂量反应曲线。使用基因特异性引物组通过RT-qPCR定量测定SOD1的表达水平。将TBP扩增作为内部参考，以归一化表达数据。图中所示是3个实验平行样相对于试验组(没有寡核苷酸的情况)的平均值±标准差。
图7A-7D显示siRNA-ACO缀合物在体外的敲低活性。图7A为siRNA-ACO缀合结构的可视化表示，其中14-nt ACO(称为AC1)通过短L9连接子(即间隔子-9连接子)与正义链的3’端缀合。图7B显示，HEK293A和T98G细胞在0.25或2.5nM浓度下用实施例性siRNA-ACO(即siSOD1-005M3-AC1)或AC1仅转染24小时的结果。模拟样本在不存在寡核苷酸的情况下转染。siCon处理作为敲低活性的阴性对照。使用基因特异性引物组通过RT-qPCR定量测定SOD1的表达水平。将TBP扩增作为内部参考，以归一化表达数据。图中所示为每个实验平行样的SOD1 mRNA相对于模拟处理(虚线)的表达值。图7C比较siRNA在T98G细胞中敲低活性的剂量反应曲线，分别为siSOD1-005M3与AC1缀合(siSOD1-005M3-AC1)或不与AC1缀合(siSOD1-005M3)，试验10个处理浓度(即0.0003、0.0009、0.0027、0.0082、0.024、0.074、0.22、0.67、2和6nM)，通过RT-qPCR评估。图7D显示相对于已发表的ASO序列(即ASOSOD1，SEQID NO:864；参见T.Miller等人，新英格兰医学杂志383,109-119(2020))，在序列和化学方面生成的剂量反应曲线，比较siRNA-ACO有(siSOD1-005M3-AC1VP)或无(siSOD1-005M3-AC1)5’VP修饰的敲低活性。
图8A-8B显示siRNA-ACO候选药物的体外敲低活性。在梯度处理浓度下，在SK-N-AS(图8A)和T98G(图8B)细胞中生成各个5’VP修饰的siRNA-ACO(即siSOD1-063M3-AC1VP、047M3-AC1VP、104M3-AC1VP、005M3-AC1VP、258M3-AC1VP和270M3-AC1VP)的剂量反应曲线。使用基因特异性引物组通过RT-qPCR定量测定SOD1的表达水平。将TBP扩增作为内参，以归一化数据。图中所示为SOD1 mRNA相对于模拟转染的表达值。数据为2个实验平行样的平均值±标准差。
图9A-9B显示siRNA-ACO候选药物的体外不良细胞毒性。SK-N-AS和T98G细胞以超过其IC50值的浓度梯度(即1.56、6.25、25和100nM)处理来转染几种主要的siRNA-ACO缀合物(即siSOD1-063M3-AC1VP、047M3-AC1VP、104M3-AC1VP、005M3-AC1VP、258M3-AC1VP)。用100nM的siCon处理作为阴性对照。模拟样本在不存在寡核苷酸的情况下转染。处理72小时后的不良细胞毒性评估，图9A为量化caspase 3/7活性的结果，图9B是将ST-8W试剂代谢作为标志物的细胞活力情况。数据为相对于模拟处理(虚线)的2个实验平行样的平均值±标准差。
图10显示siRNA-ACO对hSOD1G93A小鼠中枢神经系统组织的活性。成年hSOD1G93A小鼠经脑室内(ICV)注射固定分子剂量(20nmol)的各种siRNA-ACO候选药物(即siSOD1-047M3-AC1VP和005M3-AC1VP)。aCSF单药处理作为溶媒对照以建立基线表达，而非特异性siRNA-ACO(即siCON2-AC1VP)作为阴性对照。在用siRNA-ACO候选物(即siSOD1-047M3-AC1VP和005M3-AC1VP)或其非缀合衍生物(即siSOD1-047M3VP和005M3VP)以固定分子剂量(20nmol)经脑室内注射给药后第14天，通过RT-qPCR定量测定脑(即额叶皮质、小脑和大脑)、脊髓(即颈椎、胸椎和腰椎)和外周(即肝脏)组织中的敲低活性。将小鼠Tbp(mTbp或Tbp)扩增作为内参，以归一化表达数据。图中所示为人SOD1(hSOD1或SOD1)相对于aCSF处理的平均表达值±标准差(n＝2～6只小鼠/组)。灰色点状虚线表示相对于基线(线状虚线)的80％敲低。
图11A-11B显示不同中枢神经系统组织中siRNA-ACO敲低活性与组织蓄积之间的剂量依赖性关系。经脑室内注射指定剂量(即50、100、200或400μg)的siSOD1-047M3-AC1VP(图11A)或siSOD1-005M3-AC1VP(图11B)处理成年hSOD1G93A小鼠。处理后第14天，通过RT-qPCR定量测定选定中枢神经系统组织(即小脑、大脑和脊髓)中hSOD1的敲低活性。单独用aCSF处理的动物代表基线时的表达水平和在没有siRNA-ACO处理(0μg)的情况下可检测到的药物量。图11A-11B显示相对于基线(0μg)的SOD1抑制百分比(％)的敲低活性。药物浓度表示为相对于组织样本质量的siRNA-ACO量(μg/g)。数据表示为平均值±标准差(n＝3～4只小鼠/组)。
图12A-12C显示siRNA-ACO单剂量经脑室内注射延迟疾病发作并延长动物存活时间。成年hSOD1G93A小鼠分别在出生后(PND)第85天或PND 60经脑室内注射指定剂量(即50、100、200或400μg)的siSOD1-047M3-AC1VP或siSOD1-005M3-AC1VP。图12A是相对于处理第一天的生长率(即体重百分比变化)(虚线)图，以监测疾病进展。在图12B中，将疾病发作绘制为各处理组处于峰值体重的动物百分比。动物存活率绘制为各处理组中存活动物的百分比，见图12C。每张图中都标明了动物数量(n)。
图13A-13D显示主要siRNA-ACO候选物对应靶位点的致病性SNP。图13A-13B显示siSOD1-005M3-AC1VP(图13A)和siSOD1-047M3-AC1VP(图13B)靶位点内致病性SNP的位置。所示为靶向链序列，其包括与含有指定致病性SNP的hSOD1转录物中靶位点互补的“种子”区域(以灰色突出显示)。核苷酸突变以斜体粗体显示，其中"R"表示嘌呤取代。图13C显示在HEK293A细胞中，用浓度为18nM的siSOD1-047M3-AC1VP或非特异性乱序对照(siCON2-AC1VP)共转染含有保守序列或其致病突变之一(即P.E22G和P.F21C)的荧光素酶报告基因构建体(即pLucSOD1、pLucP.E22G、pLucP.F21C)。在图13D中，与指定浓度(即0.03、0.07、0.22、0.67、2.0、6.0和18nM)的siSOD1-047M3-AC1VP共转染后生成荧光素酶活性的剂量反应曲线。数据表示相对于无siRNA处理的样本，2个实验平行样的平均值±SEM。使用Tukey多重比较检验比较三条剂量反应曲线中每个数据点的平均值，结果表明具有统计学意义(*)。
图14A-14C显示siRNA-ACO两剂给药可延迟疾病发作和延长生存期。雄性和雌性成年hSOD1G93A小鼠分别在PND 68和PND 100进行两次处理：鞘内(IT)注射指定剂量(即75、150或300μg)的siSOD1-047M3-AC1VP。非特异性对照(即siCON3-AC1VP)和ASOSOD1以150μg/次的剂量注射。用aCSF处理作为溶媒对照。图14A中，与背景动物(野生型，WT)相比，以克(g)为单位绘制体重图，以监测疾病进展。在图14B中，将疾病发作绘制为各处理组处于峰值体重的动物百分比。动物存活率绘制为各处理组中存活动物的百分比，见图14C。每张图中都标明了动物数量(n)。
图15A-15D显示siRNA-ACO处理可改善hSOD1G93A小鼠的运动功能。雄性和雌性hSOD1G93A小鼠分别在PND 68和PND 100进行两次处理：鞘内注射指定剂量(即75、150或300μg)的siSOD1-047M3-AC1VP。白天对雄性和雌性hSOD1G93A小鼠进行旷场实验。自动记录每只动物在15分钟内的移动总距离，单位为厘米(cm)。数据绘制为每个处理组的移动距离均值±标准差，见图15A。按处理组评估雄性和雌性动物的握力。重复进行三次握力试验，并记录每只动物的平均值。将每个处理组握力的数据绘制为平均值±标准差，单位为克(g)，见图15B。通过5分钟的转棒试验评估动物疲劳和协调性。实验重复进行三次，记录每只动物跌落的最长潜伏时间(秒)，如图15C所示。在旷场、转棒和/或握力试验之前，使用ALS TDI神经评分(NS)量表对所有动物的运动功能进行评分。实验重复进行三次，记录每只动物跌落的最长潜伏时间(秒)，如图15D所示。显示各处理组在指定时间点的平均NS±标准差。
图16显示siRNA-ACO处理(如图14所示)后每只动物转棒表现的时间比较。与最终时间点(即死亡前的最后一个时间点，见表8)的表现相比，在早期时间点(即PND 90)，通过转棒试验测量其相应处理组中每只动物的跌落潜伏时间(秒)。所有试验均重复进行三次，并记录每只动物的最长潜伏时间。
图17显示siRNA对HeLa细胞中SOD1 mRNA表达的敲低活性。将指定的siRNA(即RD-15757、RD-18972、RD-12500、RD-18973、RD-18948和RD-18949)直接加入含有HeLa细胞的培养基中，以1500nM的浓度培养3天。在不存在寡核苷酸的情况下转染细胞作为模拟处理(未显示)。RD-11566(dsCon2M3v)用作非靶向双链对照。通过两步法RT-qPCR(使用单个PCR反应中设置的基因特异性引物组)定量SOD1 mRNA水平。将TBP扩增作为内参。数值(y轴)代表按TBP归一化后，相对于模拟处理的SOD1 mRNA水平(三个重复转染孔的平均值±SEM)。
图18A-18B显示siRNA对SK-N-AS细胞中SOD1 mRNA表达的敲低活性。将指定的siRNA(即RD-12926、RD-15757、RD-12500、RD-18947、RD-18948、RD-18949、RD-18946、RD-18972和RD-18973)以指定浓度(即0.0002、0.001、0.0039、0.0156、0.0625、0.25、1和4nM)转染到SK-N-AS细胞中24小时。在不存在寡核苷酸的情况下转染细胞作为模拟处理(未显示)。RD-11566(dsCon2M3v)用作非靶向双链对照(未显示)。图18A-18B显示通过两步法RT-qPCR(个体PCR反应中使用基因特异性引物组)定量的SOD1mRNA水平。将TBP扩增作为内参。数值(y轴)代表按TBP归一化后，相对于模拟处理的SOD1 mRNA水平(三个重复转染孔的平均值±SEM)。
具体实施方式
虽然本申请已经展示和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅作为实施例提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员可发现许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本申请描述的发明的实施方案的各种替代方案。
本申请包括通过施用有效量的包含SOD1靶向siRNA的寡核苷酸剂来治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的方法。寡核苷酸剂通过RNA沉默机制(RNAi)干扰SOD1 mRNA转录。本申请的发明人开发了具有强效抑制作用，其递送、生物分布、生物利用度和其他药理学特性均得到改善的SOD1 siRNA，用于治疗肌萎缩侧索硬化。
本申请基于与寡核苷酸剂、组合物和方法相关的研究，其中靶向性寡核苷酸(siRNA等)与寡核苷酸递送载体(ODV)相结合，可以下调/降低基因表达，以改善对遗传病的疗效。术语“寡核苷酸递送载体(ODV)”是指通过将“辅助寡核苷酸(ACO)”与分子(例如，双链体寡核苷酸)缀合以促进分子引入到个体的细胞、组织或器官或被个体的细胞、组织或器官摄取的结构。
本申请的发明人发现，一些siRNA双链序列对SOD1转录的抑制效力优于现有技术中具有相同或相似靶序列的序列。本申请的发明人还发现，对所述siRNA的化学修饰可提高siRNA的体外活性。令人惊讶的是，经由与单链辅助寡核苷酸(ACO或ODV)缀合，寡核苷酸剂(即ODV-siRNA或siRNA-ACO)，当通过脑室内(ICV)和/或鞘内(IT)注射在脑或脊髓组织中给药，实现了中枢神经系统递送，且在中枢神经系统组织中获得了所需的生物分布和生物利用度。
定义
在本申请中，相关术语定义如下：
说明书中给出的每个数值范围将包括落入较宽数值范围的所有较窄数值范围，如同这些较窄数值范围在本申请中明确写出一样。
过渡性术语/短语(及其语法变体)“包括”、“包含”和“组成”包括“基本上由……组成”、“基本上由......构成”、“组成”、“构成”等短语，在整个申请中可互换使用。开放式术语“包括”也包括封闭式术语“由......组成”。本申请中使用的术语“包括”、“具有”和“组成”是同义词，这些术语及其变体应解释为非限制性。
术语“肌萎缩侧索硬化”或"ALS"包括但不限于家族性肌萎缩侧索硬化(fALS)、散发性肌萎缩侧索硬化(sALS)、卢伽雷病、与以下突变基因相关的疾病：染色体9开放阅读框72基因(C9orf72；40％)、超氧化物歧化酶1(SOD1；20％)、反式反应DNA结合蛋白43(TDP43；4％)和在肉瘤中融合/在脂肪肉瘤中易位的突变基因(FUS/TLS；4％)。
本申请中使用的术语“靶基因”可指天然存在于生物体中和/或可以瞬时或稳定地转染或掺入细胞和/或其染色质中的DNA、RNA或DNA/RNA杂交形式的核酸序列、转基因、病毒或细菌序列、染色体或染色体外基因。靶基因可以是蛋白质编码基因或非蛋白质编码基因(如microRNA基因和长非编码RNA基因)，或蛋白质编码基因的转录物，如蛋白质编码基因的信使RNA(mRNA)或互补DNA(cDNA)。“靶序列”、“靶位点”或“靶”可互换使用，系指靶基因序列中的连续寡核苷酸序列，如靶基因的mRNA或cDNA，其与具有或不具有一个或多个错配碱基对的siRNA的正义链或反义链同源或互补。
本申请中使用的术语"SOD1"和“SOD1基因”可以互换使用，系指编码SOD1蛋白的基因，优选哺乳动物基因，更优选人类基因。本申请中使用的术语“SOD1 mRNA”系指由SOD1基因的表达或SOD1基因的转录生成的信使RNA(mRNA)。本申请中使用的术语“SOD1 cDNA”系指由SOD1 mRNA逆转录生成的互补DNA(cDNA)。本申请中使用的术语“SOD1蛋白”系指由SOD1基因的表达或SOD1 mRNA的翻译产生的蛋白。
本申请中使用的术语“SOD1基因的基线表达”或“SOD1 mRNA的基线水平”可以互换使用，系指在未处理siRNA或处理siRNA之前，平行参考(如细胞或个体)的SOD1基因的表达。
术语“寡核苷酸剂”或“寡核苷酸”可互换使用，指核苷酸的聚合物，其包括但不限于DNA、RNA或DNA/RNA杂交体的单链或双链核酸分子、含有规则和不规则交替脱氧核糖基部分和核糖基部分的寡核苷酸链，以及此类寡核苷酸的修饰和天然或非天然存在的框架。本申请所述的抑制靶基因mRNA转录水平的寡核苷酸为小抑制性核酸分子(siRNA)、反义寡核苷酸分子(ASO)或与寡核苷酸递送载体(ODV)缀合的siRNA分子(siRNA-ACO)。
本申请中使用的术语“寡核苷酸链”、“链”和“寡核苷酸序列”可互换使用，是指具有少于35个碱基的短核苷酸序列(包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)中的核苷酸)的总称。在一个非限制性实施例中，链的长度可以是16至25个核苷酸的任何长度。
本申请中使用的术语“对象”和“个体”可互换使用，系指可用本申请所述药物进行处理的任何生物体。术语“患者”系指人类对象或个体，包括本公开内容所述婴儿、儿童和成人。
组合物的“治疗有效量”系指足以实现所需疗效的量，因此不需要治愈或完全缓解。在本申请的实施方案中，疗效系指所述疾病任何指标的改善，且治疗有效量足以使接受治疗个体的具有临床意义的病症/症状出现改善。本申请中短语“治疗有效量”和“有效量”系指足以减少至少约15％、优选至少50％、更优选至少90％，或降低至少约50％、至少约100％、至少约200％、更优选至少约500％，并最优选地防止接受治疗个体的活性、功能和反应出现具有临床意义缺陷的量。
有效量可因对象的体格和体重、疾病类型或本申请所述的特定药物等因素而异。例如，选择本申请所述的不同药物可影响“有效量”。本领域普通技术人员将能够研究申请包含的因素，并确定本申请所述药物的有效量而无需过多的实验。
给药方案可影响有效量。本申请所述的药物可在疾病诊断或病情出现之前或之后施用于对象。此外，可以每日、每周、每月、每季度或按顺序分若干次给药以及交错给药，或者可以连续输注或推注该剂量。此外，根据治疗或预防的紧急程度，可按比例增加或减少施用本申请所述药物(一种或多种)的剂量。
本申请中使用的术语“治疗”具有医学领域中通常理解的含义，因此不需要治愈或完全缓解，并且包括任何有益或期望的临床结果。此类有益或预期的临床结果的非限制性实施例包括：与未经治疗的预期生存期相比，生存期延长、症状减轻(包括以下一种或多种症状)：近端骨骼肌无力和萎缩、不能独立坐下或行走、吞咽困难、呼吸困难等。
本申请中使用的术语“预防”或“延缓”疾病是指抑制疾病的完全发展。
术语“生物样本”系指来源于有机体(如人类对象)的任何组织、细胞、液体或其他材料。在一些实施方案中，所述生物样本系指血清或血液。
本申请中使用的术语“同一性”或“同源性”是指siRNA的一条寡核苷酸链(正义链或反义链)与靶基因区域中的编码链或模板链具有序列相似性。如本申请所用，“同一性”或“同源性”可以是至少约75％、约79％、约80％、约85％、约90％、约95％或99％。在一些实施方案中，所述siRNA具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同于参考序列的残基。为了确定两个核酸序列的同一性百分比，可以将所述序列进行比对以实现最佳比较目的(例如，可以在第一和第二核酸序列之一或两者中引入空位进行最佳比对，并且出于比较目的，可以忽略非同源序列)。随后，比较相应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的某个位置与第二序列中的相应位置被相同的核苷酸占据时，则该位置上的分子相同。两个序列之间的同一性百分比是两个序列共享的相同位置数量的函数，同时考虑了为最佳比对两个序列所需引入的空位数量及每个空位的长度。
可以使用数学算法比较序列并确定两个序列之间的同一性百分比，例如，可以使用Needleman和Wunsch提出的算法(1970年，J.Mol.Biol.48:444-453)，所述算法已被纳入GCG软件包的GAP程序中(可访问www.gcg.com获取)。可以使用E.Meyers和W.Miller提出的算法(1989年，CABIOS,4:11-17)，结合PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，所述算法已被纳入ALIGN程序(2.0版)。应当理解，本申请所述的分子可能具有额外的保守性或非必需核酸取代，所述取代对其功能没有实质性影响。
在本申请的实施方案中，一个靶基因是SOD1。“靶序列”系指所述siRNA的正义寡核苷酸链或反义寡核苷酸与之同源或互补的序列片段。例如，在一些实施方案中，所述SOD1siRNA与人SOD1转录物中的靶选择序列同源或互补。
本申请中使用的术语“非靶向性”是指与靶向性寡核苷酸(例如，siRNA、saRNA等)缀合的所述辅助寡核苷酸(ACO)不特异性地与靶向性寡核苷酸起作用的靶序列互补，和/或所述寡核苷酸(即，ACO)的靶序列与靶向性寡核苷酸(例如，siRNA、saRNA等)特异性地起作用的靶序列不同。本申请公开的靶向性寡核苷酸是与靶序列或其区域特异互补的核酸序列。在一些实施方案中，术语“非靶向性寡核苷酸”可包括除“靶向性序列”外的任何所述寡核苷酸。在某些情况下，“特异性互补”可指靶向性寡核苷酸与靶序列或其区域之间的互补性至少约为95％。非靶向性寡核苷酸(即ACO)不会通过任何已知机制引起生物活性，也不在施用该寡核苷酸时用于对特定对象、对象器官、对象组织或对象细胞中的互补核酸序列(即mRNA)引起指示ASO(即“混合聚体”或“间隙聚体”)功能的活性。非靶向性寡核苷酸(即ACO)是用于便于在施用寡核苷酸缀合物时将其结合的靶向性寡核苷酸(如siRNA、saRNA等)引入特定对象、对象器官、对象组织、对象细胞或对象细胞核中。
本申请中使用的术语"间隙聚体"是指在中心DNA结构两侧具有修饰RNA片段的短DNA反义寡核苷酸(ASO)结构。在一些实施方案中，至少一个所述修饰的RNA片段包含选自锁核酸(LNA)和2’-OMe或2’-F修饰的核苷酸中的一个或多个以增加对靶标的亲和力、增加核酸酶抗性、降低免疫原性和/或减少毒性。在一些实施方案中，间隙聚体包含至少一个用硫代磷酸酯(PS)基团修饰的核苷酸。在一些实施方案中，间隙聚体被设计成与RNA靶片段杂交，并通过诱导RNase H裂解使基因转录物沉默。例如，ASO药物"Tofersen"是一种敲低SOD1mRNA以治疗肌萎缩侧索硬化的间隙聚体。具有本申请中公开的间隙聚体ASO的双作用寡核苷酸(DAO)的可能实施例可以是“siSOD1-Tofersen缀合物”。
本申请中使用的术语“混合聚体”是指一种反义寡核苷酸(ASO)，其特征为其是DNA和结构上化学修饰的核酸类似物的混合物。可选地，混合聚体由完全修饰的核苷酸或核酸类似物组成。在一些实施方案中，混合聚体被设计为结合和掩蔽互补RNA序列，以在空间上阻断蛋白质、因子或其他RNA与所靶向RNA的相互作用。在一些实施方案中，混合聚体被设计成通过置换剪接体来改变前mRNA剪接。在一些实施方案中，混合聚体被设计成结合和隔离microRNA(miRNA)，这种情况下，其也称为“miRNA拮抗物”或“抗miR”。
本申请中使用的术语“正义链”和“正义寡核苷酸链”可互换使用。siRNA分子的正义寡核苷酸链可以包括，例如包含人类基因组中序列的片段或靶基因的序列的siRNA的第一核酸链。
本申请中使用的术语“反义链”和“反义寡核苷酸链”可互换使用。siRNA分子的反义寡核苷酸链可以包括，例如，siRNA双链中的第二核酸链，其与正义寡核苷酸链互补。siRNA的反义链可以与靶基因序列的连续片段互补，并且能够以0、1、2、3、4或5的错配与连续片段结合，而不影响siRNA的功能。
本申请中使用的术语“编码链”是指靶基因中不能被转录的DNA链，其核苷酸序列与转录产生的RNA的序列相同(在RNA中，DNA中的T被U取代)。本申请所述的靶基因启动子的双链DNA序列的编码链是指与所述靶基因DNA编码链位于同一DNA链的启动子序列。
本申请中使用的术语“模板链”是指靶基因DNA双链中的另一条链，其与编码链互补，并且可作为模板转录成RNA且与转录产生的RNA碱基互补(A-U，G-C)。转录时，RNA聚合酶与模板链结合，沿模板链的3'→5'方向移动，催化5'→3'方向的RNA合成。本申请所述的靶基因启动子的双链DNA序列的模板链是指与所述靶基因DNA模板链位于同一DNA链的启动子序列。
本申请中使用的术语“突出端”是指具有未碱基配对核苷酸的寡核苷酸链端(5'或3')，其是延伸超过siRNA内一条链的另一条链。延伸到双链体的3'和/或5'端以外的单链区域称为突出端。在一些实施方案中，突出端的长度为0至6个核苷酸。应当理解，0个核苷酸的突出端即意味着没有突出端。
本申请中使用的术语“天然突出端”是指由与靶序列上的相应位置相同或互补的一个或多个核苷酸组成的突出端。正义链上的天然突出端由与mRNA靶点上相应位置相同的一个或多个核苷酸组成。反义链上的天然突出端由与mRNA靶点上相应位置互补的一个或多个核苷酸组成。
本申请中使用的术语“基因沉默”、“基因表达敲低”、“基因下调”、“基因表达减少”和“基因表达下调”可以互换使用，系指通过测量细胞或基因生物系统内的转录水平、mRNA水平、蛋白质水平、酶活性、甲基化状态、染色质状态或构型、翻译水平或活性或状态，确定某一核酸序列的转录、翻译、表达或活性的减少或下调。可以直接或间接确定这些活性或状态。此外，“基因下调”或“基因表达下调”是指与核酸序列相关的活性降低，无论这种下调的机制如何。例如，基因下调包括转录和转录后层面，减少向RNA转录，进而降低RNA水平，翻译成的蛋白质水平比基线水平更低，从而降低蛋白质的表达。
本申请中使用的术语“短干扰RNA”、"siRNA"和“沉默RNA”可互换使用，系指能够使靶基因表达下调、敲低或沉默的核糖核酸分子。其可以是双链核酸分子。siRNA主要在细胞质中与靶mRNA结合，通过RNA干扰(RNAi)机制在转录后层面下调基因表达。
SiRNA可含有天然核苷酸或化学修饰的核苷酸。修饰可增加核酸酶的稳定性和/或细胞效力。化学修饰的实施例包括硫代磷酸酯主链修饰、2'-脱氧核苷酸、含2'-OCH3的核糖核苷酸、2'-F-核糖核苷酸、2'-甲氧基乙基核糖核苷酸及其组合等。所述siRNA可具有不同的长度(例如，10～200bp)和结构(例如，发夹结构、单/双链、凸起、缺口/间隙、错配)，并在细胞中被处理以敲低靶mRNA。双链siRNA的每条链(钝端)或不对称端(突出端)的核苷酸数量可相同。例如，1～2个核苷酸的突出端可存在于正义链和/或反义链上，也可存在于给定链的5'和/或3'端。
所述siRNA分子的长度通常为约10至约60、约10至约50、约15至约30、约17至约29、约18至约28、约19至约27、约20至约26、约21至约25，和约22至约24个碱基对，并且通常为约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约23、约25、约30、约40或约50个碱基对。此外，术语“小干扰RNA”、“沉默RNA”和"siRNA"也含有核糖核苷酸以外的核酸，包括但不限于修饰核苷酸或类似物。
术语“等长部分”是指与目标序列(例如，来自所述siRNA的连续寡核苷酸序列)进行比较并且与目标序列具有相等长度(相等碱基数)的序列部分。
本申请中使用的术语“序列特异性模式”是指两个核酸片段根据其核苷酸序列的结合或杂交方式，例如Watson-Crick方式(例如A与T、A与U和C与G)或允许形成双链体的任何其他方式(例如Hoogsteen或反向Hoogsteen碱基配对)。
本申请中使用的术语“分离的靶位点”、“靶位点”和“分离的多核苷酸”可以互换使用，系指siRNA与之互补或杂交的核酸靶位点。例如，靶位点的分离核酸序列可以包括与siRNA区域具有互补性或与之杂交的核酸序列。
本申请中使用的术语“互补”系指在两个寡核苷酸链之间形成碱基对的能力。碱基对通常通过反平行寡核苷酸链中核苷酸之间的氢键形成。互补寡核苷酸链的碱基可以Watson-Crick方式(例如A与T、A与U和C与G)配对，或以允许形成双链体的任何其他方式(例如Hoogsteen或反向Hoogsteen碱基配对)配对。
互补性包括完全互补性和不完全互补性。“完全互补性”或“100％互补性”是指来自第一寡核苷酸链的各核苷酸都能与第二寡核苷酸链中相应位置的核苷酸在siRNA分子的双链区域中形成氢键，无碱基对“错配”。“不完全互补性”或“错配”意味着并非两条链的所有核苷酸单元都通过氢键相互结合。例如，对于双链区长度为20个核苷酸的两条寡核苷酸链，如果该双链区中只有两个碱基对能通过氢键形成，则寡核苷酸链具有10％的互补性。在同一实施例中，如果该双链区域中有18个碱基对能通过氢键形成，则该寡核苷酸链具有90％的互补性。实质互补性是指至少约75％、约79％、约80％、约85％、约90％、约95％或99％的互补性。
本申请中使用的术语"ODV"和“寡核苷酸递送载体”可互换使用，系指包括双链或双链RNA(例如siRNA或saRNA)和ACO的寡核苷酸分子，所述ACO通过连接子与双链RNA共价连接，如下文更详细所述。
本申请中使用的术语“共价连接子”、“连接子”和“连接组分”可互换使用，系指连接化合物两部分的有机部分。例如，单链寡核苷酸(如ACO)和dsRNA(如siRNA)、两种dsRNA等中的一种或多种通过例如核酸连接子、肽连接子等共价连接，并且包括二硫键连接子。
本申请中使用的术语“合成”系指寡核苷酸的合成方式，包括任何能够合成或化学修饰RNA的方法，如化学合成、体外转录、载体表达等。
术语“寡核苷酸调节剂”和“寡核苷酸剂”可以互换使用，是指至少包含本发明的一种或多种siRNA或者由其组成的含寡核苷酸物质，具有调节靶基因表达或增强所述siRNA作用的活性，并且可进一步包含与所述siRNA缀合、结合或混合的其他寡核苷酸部分/组分(如ASO或辅助寡核苷酸(ACO))或非寡核苷酸部分/组分。在某些实施方案中，寡核苷酸调节剂包含RNA(例如本发明所述的siRNA)、DNA、BNA、LNA、GNA或PNA。
本申请中使用的术语“LNA”是指锁核酸，其中2′-氧原子和4′-碳原子通过一个额外的桥接连接。本申请中使用的术语“BNA”是指2'-O和4'-氨基乙烯桥接的核酸，其可包含具有N-O键的五元或六元桥接结构。本申请中使用的术语“PNA”是指具有假肽主链的核酸模拟物，该假肽主链由N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元组成，其中核碱基通过羰基亚甲基连接子连接至甘氨酸氮。本申请中使用的术语"GNA"也称为甘油核酸，是一种类似于DNA或RNA的核酸，但其糖-磷酸二酯主链的组成不同，使用丙二醇代替核糖或脱氧核糖。
在本申请中，除非上下文中另有明确规定，否则单数形式(如"一种"、“此”和"该")包括复数对象。
除非另有定义，本申请所使用的技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。
siRNA
本申请的实施方案部分基于以下令人惊讶的发现：寡核苷酸剂(例如siRNA，本申请也称为“SOD1基因siRNA”或“SOD1 siRNA”)能够抑制或下调细胞中SOD1基因的表达。在施用本申请所述的寡核苷酸剂后，功能性SOD1基因转录物的减少可以显著降低或下调细胞或哺乳动物中SOD1 mRNA和SOD1蛋白水平。
具体地，本申请的发明人发现了能够抑制超氧化物歧化酶1(SOD1)表达的功能性寡核苷酸剂，所述功能性寡核苷酸剂包括小干扰RNA(siRNA)，其中所述siRNA包含形成双链的正义链和反义链，其中所述反义链包含含有至少10个具有0、1、2或3个错配的连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列与SOD1 mRNA的部分核苷酸序列具有至少85％的核苷酸序列互补性或同源性。
作为有利的结果，与SOD1 mRNA的基线水平相比，靶序列(例如，包含靶序列的分离核酸序列)在与所述siRNA相互作用时，可以抑制/下调SOD1 mRNA转录物至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少93％、至少96％、至少99％或约100％。在一个实施方案中，SOD1 mRNA降低至少80％。至少部分基于这些发现，本申请的特征在于与SOD1 mRNA的基线水平相比抑制/下调SOD1 mRNA转录至少10％的siRNA、组合物和药物组合物。本申请还提供了预防或治疗由个体中SOD1蛋白过表达、SOD1基因突变和/或SOD1水平高或异常诱导的疾病或病症的方法，包括向所述个体施用本申请描述的任何siRNA、组合物和/或药物组合物。
在某些实施方案中，本申请中公开的寡核苷酸序列与选自SEQ ID NO:2至269的核苷酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％的同源性或互补性。在某些实施方案中，本申请中公开的寡核苷酸序列的所述正义链与选自SEQ ID NO:2至269的核苷酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％的同源性。在某些实施方案中，本申请中公开的寡核苷酸序列的所述反义链与选自SEQ ID NO:2至269的核苷酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％的互补性。
本申请的实施方案还部分基于以下发现：SOD1 mRNA抑制性寡核苷酸剂包含一种siRNA，该siRNA具有与选自SEQ ID NO:270至537的核苷酸序列至少85％、至少90％或至少95％的同源性正义链。
在一些其他实施方案中，所述SOD1 mRNA抑制性寡核苷酸剂包含一种siRNA，其反义链与选自SEQ ID NO:538至805的核苷酸序列同源性至少为85％、至少90％或至少95％。
在一些实施方案中，SOD1 mRNA抑制性寡核苷酸剂包含一种siRNA，其中所述siRNA的所述正义链和反义链与选自SEQ ID NO:808至849、867和868的核苷酸序列分别具有至少85％、至少90％或至少95％同源性的核苷酸序列。
本申请所述寡核苷酸剂的siRNA包含RNA链(反义链)，其具有长度为60个核苷酸或更短的区域，即15～40个核苷酸，通常长度为19～25个核苷酸，该区域基本上与SOD1基因的mRNA转录物的至少一部分互补。使用这些siRNA能够靶向抑制涉及与哺乳动物SOD1表达相关病理基因的mRNA。特别是极低剂量的SOD1 siRNA可以特异性和有效地介导RNAi，从而显著抑制SOD1基因的表达。本申请的发明人已使用细胞试验证明靶向SOD1的siRNA可以特异性地和有效地介导RNAi，从而显著抑制SOD1基因的表达。因此，包含这些siRNA的方法和寡核苷酸剂可用于治疗可通过下调SOD1来调节的病理过程，诸如用于治疗引起SOD1水平升高的紊乱，例如肌萎缩侧索硬化(ALS)。以下具体实施方式公开了如何制备和使用含有siRNA的寡核苷酸剂来抑制SOD1基因表达，以及用来治疗由该基因的表达引起的疾病和紊乱的寡核苷酸剂和方法。
一方面，RNA干扰剂包括与靶RNA序列相互作用以引导靶RNA的裂解的单链RNA。不希望受理论的束缚，将长双链RNA引入植物和无脊椎动物细胞，用一种名为Dicer的III型内切核酸酶将其分解为siRNA(Sharp等人，Genes Dev.2001,15:485)。Dicer这种酶类似核糖核酸酶III，其可将dsRNA加工成19-23个碱基对的短干扰RNA，所述siRNA具有特征性双碱基3’突出端(Bernstein等人，(2001)Nature 409:363)。然后，将所述siRNA整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一个或多个解旋酶解开siRNA双链，使所述互补性反义链能够引导靶识别(Nykanen等人，(2001)Cell 107:309)。在与相应的靶mRNA结合后，所述RISC内的一个或多个内切酶解开靶以诱导沉默(Elbashir等人，(2001)Genes Dev.15:188)。因此，本发明的一个方面涉及一种单链RNA，其促进RISC复合物的形成，以实现靶基因的沉默。
在一些实施方案中，所述siRNA的连续寡核苷酸序列相对于SOD1 mRNA的等长部分具有五个或更少的核苷酸差异或错配，即5、4、3、2、1或0个核苷酸差异或错配。在一些实施方案中，所述siRNA正义链的连续寡核苷酸序列相对于SOD1 mRNA的等长部分具有三个或更少的核苷酸差异或错配，即3、2、1或0个核苷酸差异或错配。在一些实施方案中，所述siRNA反义链的连续寡核苷酸序列相对于SOD1 mRNA的等长部分具有三个或更少的核苷酸差异或错配，即3、2、1或0个核苷酸差异或错配。
在一些实施方案中，本申请公开的SOD1 mRNA不含核苷酸突变。在一些实施方案中，本申请公开的SOD1 mRNA包含至少一个核苷酸突变。在一些实施方案中，本申请公开的SOD1 mRNA在所述siRNA的靶向位点上包含至少一个核苷酸突变。在一些实施方案中，本申请公开的SOD1 mRNA在所述siRNA的靶向位点的上游和/或下游包含至少一个核苷酸突变。
在一些实施方案中，差异或错配位于所述siRNA寡核苷酸序列的中间或3'末端。siRNA分子设计的方法和原理为本领域技术人员所熟知，并且在例如Place等人，MolecularTherapy-Nucleic Acids(2012)1,e15和Li等人，PNAS,2006,vol.103,no.46,17337-17342中进行了详细描述，这些内容全部援引加入本申请。
在一些实施方案中，本申请公开的所述siRNA包括正义链和反义链。所述正义链和所述反义链包含能够形成双链核酸结构的互补区域，所述双链核酸结构通过RNAi机制降低细胞中的SOD1转录水平。本申请中使用的RNAi机制(也称为RNA干扰)是指双链核酸结构能够在转录水平上以序列特异性方式下调靶基因的机制。所述siRNA的正义链和反义链可存在于两条不同的核酸链上，也可存在于同一条核酸链上(例如一条连续核酸序列)。当所述siRNA的正义链和反义链位于两条不同的链上时，其至少一条链具有长度为0至6个核苷酸的3'突出端，从而构成长度为0、1、2、3、4、5或6个核苷酸的突出端，并且在一些情况下，两条链都具有长度为2或3个核苷酸的3’突出端。在某些情况下，所述突出端的核苷酸是胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dT)，或者在某些情况下是选自或互补于其DNA靶标上相应位置的核苷酸的天然突出端。当所述正义链和所述反义链位于一条核酸链上时，在一些情况下，所述siRNA是发夹式单链核酸分子，其中所述正义链和所述反义链的互补区域彼此形成双链核酸结构。在本申请公开的siRNA中，在一些实施方案中，正义链的长度范围为10至60个核苷酸。例如，在一些实施方案中，所述正义链和所述反义链分别包括16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。在一些实施方案中，所述反义链的长度范围为10～60个核苷酸。例如，在一些实施方案中，所述正义链和所述反义链分别包括16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。
在一些实施方案中，本申请公开的反义链能够以序列特异性方式与SOD1基因mRNA上的靶核酸序列相互作用，即所述反义链能够通过氢键作用与靶核酸杂交。在一些实施方案中，反义链具有这样一种核苷酸序列，即当其以5'至3'的方向写入时，所述核苷酸序列包含其靶向的靶核酸靶部分的反向互补。在某些此类实施方案中，反义链具有这样一种核苷酸序列，即当其以5'至3'的方向写入时，所述核苷酸序列包含SOD1基因转录物片段中靶部分的反向互补序列。
ACO
尽管一些先前的研究证明，能够抑制SOD1 mRNA和降低SOD1蛋白表达的siRNA可用于治疗SOD1蛋白相关疾病(例如，肌萎缩侧索硬化(ALS)患者)，但本申请的发明人发现有两个未解决的问题，一个是SOD1 siRNA分子缺乏效力，另一个是缺乏将所述siRNA分子递送至靶器官或组织(如中枢神经系统)细胞的有效递送方法。
将siRNA“递送到细胞中”系指本领域技术人员所理解的细胞有效摄取或吸收。siRNA的吸收或摄取可以通过无辅助的扩散或主动细胞过程，或通过辅助药剂或装置实现。该术语的含义不限于体外细胞；也可以将siRNA“引入”属于活生物体一部分的细胞。在这种情况下，引入细胞将包括递送至生物体。例如，对于体内递送，可将siRNA注射到组织部位或全身给药。体外引入细胞包括本领域已知的方法，如电穿孔和脂质转染。下文描述本领域中未知的其它方法。
当所述siRNA药剂与非靶向单链辅助寡核苷酸(ACO)缀合时，与不含ACO的寡核苷酸剂相比，所述siRNA的生物利用度、生物分布和/或细胞摄取和体内效力显著提高了。特别是在本申请的一些体内实施例中，与不具有ACO的寡核苷酸剂相比，寡核苷酸剂的ACO增加了siRNA在一个或两个或多个靶组织内的生物分布。
因此，本申请还涉及一种寡核苷酸剂，其包含小干扰RNA(siRNA)和ACO且能够抑制超氧化物歧化酶1(SOD1)的表达。
在一些实施方案中，包含一种或多种缀合ACO的寡核苷酸剂可增其在所施用的特定组织中的生物分布，并可增加其通过膜(如血脑屏障)的渗透性和通透率。
在一些实施方案中，所述ACO是一种包含5’端和3’端的寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述siRNA和ACO通过或不通过一种或多种连接组分共价连接成寡核苷酸剂。
在一些实施方案中，所述ACO的长度包括6至22个核苷酸的长度，例如6个或更多核苷酸、7个或更多核苷酸、8个或更多核苷酸、9个或更多核苷酸、10个或更多核苷酸、11个或更多核苷酸、12个或更多核苷酸、13个或更多核苷酸、14个或更多核苷酸、15个或更多核苷酸、16个或更多核苷酸、17个或更多核苷酸、18个或更多核苷酸、19个或更多核苷酸、20个或更多核苷酸、21个或更多核苷酸、22个或更多核苷酸。在一些实施方案中，所述ACO的长度为6至18个连续的寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述ACO的长度可以调节所述寡核苷酸剂在靶组织或目标细胞内的活性和/或生物分布。例如，本申请的发明人发现较短的ACO在整个中枢神经系统中表现出活性，而较长的ACO仅在脑的特定区域(如小脑)中表现出活性。
在本申请的另一方面，还提供了包含siRNA和非靶向ACO的一种寡核苷酸剂，所述ACO包含单链寡核苷酸序列，该序列包含与选自SEQ ID NO:865的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，其中所述ACO包含与选自SEQ IDNO:865的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本申请所述的寡核苷酸剂包含与siRNA共价连接的多于一个ACO，例如2、3、4、5、6、7、9、10个ACO，且在所述ACO和siRNA之间有或没有一个或多个连接子。ACO的数量可以从1到4、2到10个不等，通过多价连接子(例如聚合物连接子)以支链或线性形式与siRNA连接。在一些实施方案中，一种药剂的多个ACO与2个或更多个siRNA共价连接，例如2、3、4、5、6、7、9、10个或更多个siRNA。编号为WO2023280190A1的PCT申请，出于所有目的将其全部内容援引加入本申请，所述PCT申请描述了ACO设计的原理以及与所述siRNA缀合以改善药代动力学性质(包括向细胞辅助递送双链RNA)的ACO实施例。
化学修饰
在本申请公开的siRNA或ACO中，所有核苷酸可以是天然的或非化学修饰的核苷酸，或者至少一个核苷酸是经化学修饰的核苷酸。化学修饰的非限制性实施例包括以下一种或多种组合：
1)对所述siRNA或ACO核苷酸序列中核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
2)对所述siRNA或ACO核苷酸序列中核糖的2'-OH的修饰；
3)对所述siRNA或ACO核苷酸中碱基的修饰；
4)所述siRNA或ACO的核苷酸序列中的至少一个核苷酸是BNA、LNA、GNA或PNA，以及
5)所述ACO核苷酸序列中的至少一个核苷酸为脱氧核糖核苷酸(DNA)。
本申请所述的化学修饰为本领域技术人员所熟知，其中磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中氧的修饰，包括硫代磷酸酯修饰和硼烷磷酸酯修饰。本申请公开的修饰能稳定所述siRNA结构，保持对碱基配对的高特异性和高亲和力。本申请公开的修饰还可稳定ACO结构并维持其递送辅助特性，所述特性诸如寡核苷酸剂在前额叶皮质、小脑、大脑、脊髓(例如，颈椎、胸椎、腰椎)、肌肉、肺、眼、肝脏和肾脏等各种组织中的生物利用度、生物分布和/或细胞摄取。
在一些实施方案中，化学修饰是用硫代磷酸酯(PS)键取代本申请公开的寡核苷酸剂的核苷酸序列主链上的磷酸二酯键。在一些实施方案中，本申请公开的寡核苷酸剂包含至少一种硫代磷酸酯主链修饰。在一些实施方案中，所述ACO包括至少一种PS主链修饰。在一些实施方案中，所述ACO包括6～17个硫代磷酸酯主链修饰。
在一些实施方案中，本申请所述的siRNA或ACO包括至少一个经化学修饰的核苷酸，其在核苷酸的戊糖中的2'-OH处被修饰，即在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如2'-氟修饰、2'-氧甲基修饰、2'-氧亚乙基甲氧基修饰、2,4'-二硝基苯酚修饰、锁核酸(LNA)、2'-氨基修饰或2'-脱氧修饰，例如2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，本申请所述的siRNA或ACO包括至少一个经化学修饰的核苷酸，其在核苷酸的碱基处被修饰，例如，5'-溴尿嘧啶修饰、5'-碘尿嘧啶修饰、N-甲基尿嘧啶修饰或2,6-二氨基嘌呤修饰。
在一些实施方案中，所述siRNA或ACO的化学修饰是在正义或反义序列的5'端添加(E)-乙烯基膦酸酯部分。在一些实施方案中，所述至少一个经化学修饰核苷酸的化学修饰是在正义或反义序列序列的5'端添加5-甲基胞嘧啶部分。
在一些实施方案中，本申请所述的siRNA或ACO核酸的核苷酸序列中的至少一个核苷酸经过化学修饰，例如是锁核苷酸、无碱基核苷酸、甘油核酸(GNA)、吗啉代核苷酸、磷酰胺和包含非天然碱基的核苷酸。在一些实施方案中，本申请公开的siRNA包括具有2′-O-甲基修饰的核苷酸和包含5′-硫代磷酸酯基团的核苷酸的“内光”修饰。
在一些实施方案中，对本申请所述的siRNA或ACO进行化学修饰，以增强稳定性或其他有益特性。本申请中所述的核酸可通过常规方法合成和/或修饰，例如在“Currentprotocols in nucleic acid chemistry”(Beaucage,S.L.等人，(Edrs.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,N.Y.,USA)中所描述的方法，其内容援引加入本申请。修饰包括但不限于(a)末端修饰，例如5′末端修饰(磷酸化、缀合、反式键等)、3′末端修饰(缀合、DNA核苷酸、反式键等)；(b)碱基修饰，例如用稳定化碱基、去稳化碱基或与扩展的伴侣库配对的碱基做替换、去除碱基(无碱基核苷酸)或缀合碱基；(c)糖修饰(例如在2′位或4′位)或糖替换；以及(d)主链修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替换。可用于本申请的siRNA分子的具体实施例包括但不限于含有经修饰主链或不含天然核苷间键的RNA。在一些实施方案中，具有经修饰主链的RNA包括主链中不具有磷原子的RNA等。在一些实施方案中，核苷间主链中不具有磷原子的经修饰RNA也可以是寡核苷。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸在其核苷间主链中将具有磷原子。
修饰的寡核苷酸主链包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、磷酰胺(包括3′-氨基磷酰胺和氨基烷基磷酰胺)、硫代磷酰胺、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键的硼磷酸酯及其2′-5′键合类似物，以及具有反向极性的反义化合物，其中，核苷单元的邻近对是键合的3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'。还包括各种盐、混合盐以及游离酸形式。
在一些实施方案中，所述siRNA或ACO由RNA、DNA、BNA、LNA、GNA或PNA中的一种或多种组成。
共价连接
本申请包括寡核苷酸剂，其包含共价连接的双链靶向性寡核苷酸(即siRNA)和ACO。
在一些实施方案中，本申请所述寡核苷酸剂中的任何寡核苷酸都包括连接组分。在一些实施方案中，siRNA和ACO通过连接组分共价连接。在一些实施方案中，所述siRNA和ACO与共价连接子连接。链的各种组合可以连接，例如，第一和第二dsRNA正义链共价连接，或者例如，第一和第二dsRNA反义链共价连接。
在一些实施方案中，所述siRNA的正义链与所述ACO共价连接。在一些实施方案中，所述siRNA的反义链与所述ACO共价连接。在一些实施方案中，所述ACO与所述siRNA正义链的3’端或5’端或同时与3’端和5’端共价连接。在一些实施方案中，所述ACO与所述siRNA反义链的3’端或5’端或3’和5’端共价连接。在一些实施方案中，不止一个ACO与siRNA共价连接。在一些实施方案中，2～10个ACO与所述siRNA共价连接。在一些实施方案中，不止一个siRNA与ACO共价连接。在一些实施方案中，2～10个siRNA与ACO共价连接。
在一些实施方案中，所述ACO与连接组分缀合。在一些实施方案中，所述ACO的5’端或3’端与连接组分缀合。在一些实施方案中，所述siRNA和ACO通过连接组分共价缀合。在一些实施方案中，所述siRNA的正义链或反义链通过连接组分与所述ACO共价缀合。
连接子通常包括直接键或诸如氧或硫等原子，以及连接单元(如NR1、C(O)、C(O)O、C(O)NR1、SO、SO2、SO2NH)或原子链，如取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可被O、S、S(O)、SO2、N(R')2、C(O)、可裂解连接基团、取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基、取代或未取代杂环基中断或终止，其中R1为氢、酰基、脂肪族或取代脂肪族。
所述缀合物中可包括但不限于各种类型的连接子功能，包括但不限于可裂解连接子和不可裂解连接子，以及可逆连接子和不可逆连接子。
在一些实施方案中，所述连接子是可裂解的连接子。可裂解连接子是指依靠靶细胞内的过程将连接子结合在一起的两部分(如所述ACO和所述dsRNA)释放出来的连接子，例如在细胞质中还原、暴露于溶酶体或胞内体的酸性条件下或被细胞内的特定酶(如蛋白酶)裂解等过程。因此，可裂解连接子允许在缀合物在靶细胞内内化和处理后以其原始形式释放所述dsRNA。可裂解连接子包括但不限于其键可被酶(如肽连接子)、还原条件(如二硫键连接子)或酸性条件(如腙和碳酸盐)裂解的连接子。
在一些实施方案中，连接组分选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、碳水化合物、硫醇连接基团、磷酸二酯、硫代磷酸酯、磷酰胺、酰胺和氨基甲酸酯中的一种或多种。在一些实施方案中，连接组分包括但不限于：间隔子亚磷酰胺18(亚磷酰胺酸,N,N-双(1-甲基乙基)-,19,19-双(4-甲氧基苯基)-19-苯基-3,6,9,12,15,18-六氧杂十九烷-1-基(2-氰基乙酯)；间隔子-9(3-[2-[2-[2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基甲氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基-[二(丙-2-基)氨基]膦基]氧代丙腈)；间隔子亚磷酰胺C3(6-(4,4‘-二甲氧基三苯甲基)己基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)；间隔子C6亚磷酰胺(6-(4,4‘-二甲氧基三苯甲基)己基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)；和二价连接子(DIO)16-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-1,1-双(4-甲氧基苯基)-18-氧代-1-苯基-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十一烷-CPG。在一些实施方案中，所述连接组分包括表15所示的化合物结构。
在一些实施方案中，所述连接组分为间隔子亚磷酰胺18(亚磷酰胺酸,N,N-双(1-甲基乙基)-,19,19-双(4-甲氧基苯基)-19-苯基-3,6,9,12,15,18-六氧杂十九烷-1-基(2-氰基乙酯))。
表15.寡核苷酸剂中使用的连接子
在一些实施方案中，所述siRNA和ACO通过磷酸二酯键共价连接。在一些实施方案中，所述siRNA和ACO通过硫代磷酸酯键共价连接。
在一些实施方案中，所述siRNA包括与所述ACO共价连接的正义链。在一些实施方案中，所述siRNA包括与所述ACO共价连接的反义链。
在一些实施方案中，所述siRNA和ACO通过一个或多个核苷酸共价连接。
共价连接子的非限制性实施例可参见美国专利申请公开号：20200332292，其全部内容援引加入本申请。所述共价连接子可连接所述siRNA和ACO。
在一些实施方案中，所述共价连接子包括RNA和/或DNA和/或肽。所述连接子可以是单链、双链、部分单链或部分双链。在一些实施方案中，所述连接子包括二硫键。所述连接子可以是可裂解的，也可以是不可裂解的。
在一些实施方案中，所述共价连接子包括二硫键，任选二己基二硫键连接子。在一个实施方案中，所述二硫键连接子为
在一些实施方案中，所述共价连接子包括肽键，例如包括氨基酸。在一个实施方案中，所述共价连接子是1～10个氨基酸长连接子，优选包含4～5个氨基酸，任选X-Gly-Phe-Gly-Y，其中X和Y代表任何氨基酸。
在一些实施方案中，所述共价连接子包括HEG、六乙二醇连接子。
ODV-siRNA寡核苷酸剂
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂可降低SOD1基因或SOD1蛋白的表达。向患者施用寡核苷酸剂可治疗或延迟ALS的发作，如家族性或散发性ALS或Leu卢伽雷病。在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂通过例如下调SOD1转录水平或减少全长SOD1 mRNA的量来减少SOD1蛋白的量。在一些实施方案中，SOD1 mRNA降低至少10％(例如，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％)。在一些实施方案中，SOD1 mRNA降低至少80％。在一些实施方案中，SOD1蛋白的量降低到足以减轻与ALS相关的症状。在一些实施方案中，SOD1蛋白降低至少10％(例如，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％)。在一些实施方案中，SOD1蛋白降低至少80％。
在一些实施方案中，降低SOD1基因或SOD1蛋白表达的所述寡核苷酸剂是siRNA-ACO缀合物(或ODV-siRNA)。所述SOD1 siRNA-ACO缀合物可减少或下调存在SOD1基因异常表达或过表达细胞中的SOD1基因表达。
在典型实施方案中，所述寡核苷酸剂中SOD1 siRNA的第一链包括与SOD1基因选定靶区的6～60个核苷酸片段具有至少75％的序列同一性或序列互补性的片段，从而实现所述基因表达的失活或下调。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂具有与siSOD1-047M3-AC1的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列，所述siSOD1-047M3-AC1的反义链具有SEQ IDNO:834的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:850的ODV结构化正义链的片段互补。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂具有与siSOD1-005M3-AC1的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列，所述siSOD1-005M3-AC1的反义链具有SEQ IDNO:842的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:851的ODV结构化正义链的片段互补。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂具有与siCON1-AC1VP的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列，所述siCON1-AC1VP的反义链具有SEQ ID NO:858的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:852的ODV结构化正义链的片段互补。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂具有与siCON2-AC1VP的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列，所述siCON2-AC1VP的反义链具有SEQ ID NO:859的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:853的ODV结构化正义链的片段互补。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂具有与siCON3-AC1VP的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列，所述siCON3-AC1VP的反义链具有SEQ ID NO:860的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:854的ODV结构化正义链的片段互补。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂具有与siSOD1-063M3-AC1VP的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列，所述siSOD1-063M3-AC1VP的反义链具有SEQID NO:861的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:855的ODV结构化正义链的片段互补。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂具有与siSOD1-047M3-AC1VP的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列，所述siSOD1-047M3-AC1VP的反义链具有SEQID NO:848的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:850的ODV结构化正义链的片段互补。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂具有与siSOD1-104M3-AC1VP的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列，所述siSOD1-104M3-AC1VP的反义链具有SEQID NO:862的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:856的ODV结构化正义链的片段互补。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂具有与siSOD1-005M3-AC1VP的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列，其中siSOD1-005M3-AC1VP的反义链具有SEQID NO:849的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:852的ODV结构化正义链的片段互补。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂具有与siSOD1-258M3-AC1VP的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列，所述siSOD1-258M3-AC1VP的反义链具有SEQID NO:863的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:857的ODV结构化正义链的片段互补。
此外，为了促进所述siRNA进入细胞，可在上述修饰的基础上在所述siRNA的正义或反义链的末端引入本申请公开的除所述ACO以外的化学缀合基团，以促进通过由脂质双分子层组成的细胞膜以及细胞核膜和细胞核内的mRNA区域的作用。
在一些实施方案中，本申请公开的siRNA共价连接至一个或多个缀合基团。在一些实施方案中，缀合基团改变所连接寡核苷酸的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药代动力学、稳定性、结合、吸收、组织分布、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除。在一些实施方案中，缀合基团使连接的寡核苷酸具有新的性质，例如能够检测寡核苷酸的荧光团或报告基团。某些缀合基团和缀合部分已在前文中进行了描述，例如：胆固醇基团(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4，1053-1060)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1993,3,2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.AcidsRes.,1992,20,533-538)、脂肪链，例如10-癸二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO 1,1991,10,1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75,49-54)、磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-磷酸三乙胺(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)、金刚烷乙酸的棕榈酰基(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)、十八胺或六氨基羰基氧基胆固醇基团(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)、生育酚基团(Nishina等人，Molecular Therapy Nucleic Acids,2015,4,e220；and Nishina等人，Molecular Therapy,2008,16,734-740)或GalNAc簇(如WO2014/179620)。
在一些实施方案中，本申请所述的siRNA涉及所述siRNA的正义链或反义链，其与选自以下的一个或多个缀合基团缀合：嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、维生素部分、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、巯基胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、荧光团和染料。
在一些实施方案中，缀合基团包括活性原料药，例如阿司匹林、华法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹磺基肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、芬戈莫德、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛、巴比妥类、头孢菌素、磺胺类药物、降糖药、抗菌药或抗生素。
在一些实施方案中，本申请所述的siRNA与选自以下的一个或多个缀合基团缀合：脂质、脂肪酸、荧光团、配体、糖类、肽和抗体。
在一些实施方案中，本申请所述的siRNA涉及的所述siRNA正义链或反义链与选自以下的一个或多个偶联基团缀合：细胞穿透肽、聚乙二醇、生物碱、色胺、苯并咪唑、喹诺酮、氨基酸、胆固醇、葡萄糖和N-乙酰半乳糖胺。
在一些实施方案中，与实施方案中公开的一个或多个缀合基团缀合的siRNA直接接触、转移、递送或给予细胞或对象。
包含siRNA的细胞
在与细胞接触后，本申请公开的寡核苷酸剂可有效抑制或下调细胞中SOD1基因的表达，例如下调表达至少10％(例如，与SOD1转录物的基线水平相比)。
在一些实施方案中，本申请涉及包含本申请公开的寡核苷酸剂的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞，例如前额叶皮质、小脑、脊髓(例如颈椎、胸椎、腰椎)、肌肉、肝脏和肾脏等各种组织中的人细胞。
本申请公开的细胞可以是体外的或离体的，例如细胞系或细胞株，或者可以存在于哺乳动物体内，例如人体。本申请公开的人体是患有由SOD1基因突变、SOD1 mRNA水平异常和/或SOD1蛋白在中枢神经系统中过表达引起的疾病或症状的对象。
在一些实施方案中，所述细胞来自患有ALS对象的中枢神经系统组织。在一些实施方案中，所述细胞来自患有ALS的对象。在一些实施方案中，所述细胞来自患有阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和唐氏综合征(DS)的对象。
包含siRNA的组合物
本申请的另一方面提供一种能够通过RNA干扰的作用机制(MoA)下调SOD1 mRNA转录物水平的组合物或药物组合物，包括本申请公开的寡核苷酸剂，用以治疗或预防SOD1相关疾病(特别是肌萎缩侧索硬化)的发作。
在一些实施方案中，本申请涉及包含本申请siRNA的组合物或药物组合物。
在一些实施方案中，本申请涉及本申请所述的一种包含siRNA和ACO的组合物或药物组合物。在一些实施方案中，本申请涉及包含由本申请所述的连接组分共价连接的siRNA和ACO的组合物或药物组合物。
在一个实施方案中，药学上可接受的载体包括水性载体、脂质体或LNP、聚合物、胶束、胶体、金属纳米颗粒、非金属纳米颗粒、生物缀合物(例如GalNAc)和多肽中的一种或多种。在一个实施方案中，所述水性载体可以是例如不含RNase的水或不含RNase的缓冲液。根据本申请，所述组合物可含有1～150nM(例如1～100nM、1～50nM、1～20nM、10～100nM、10～50nM、20～50nM、20～100nM、50nM)的所述寡核苷酸剂或编码全长或部分所述寡核苷酸剂的核酸。
在一些实施方案中，所述组合物包含1～150nM本申请所述的寡核苷酸剂。
另一个实施方案提供包含本申请所述寡核苷酸剂和治疗性惰性载体、稀释剂或药学上可接受的辅料的药物组合物或药物，以及使用本申请所述寡核苷酸剂制备这些组合物和药物的方法。
通过混合本申请所述药物和载体或辅料可制备典型制剂。合适的载体和辅料为本领域技术人员所熟知，并且详述于例如AnselH.C.等人，Ansel's PharmaceuticalDosageForms and Drug Delivery Systems(2004；Lippincott，Williams&Wilkins，费城)；Gennaro A.R.等人，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2000；Lippincott，Williams&Wilkins，费城)；和Rowe R.C，Handbook of PharmaceuticalExcipients(2005；Pharmaceutical Press，芝加哥)中。所述制剂还可包含一种或多种缓冲液、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂、稀释剂和其它已知添加剂，以很好地呈现药物(即本申请的药剂或其药物组合物)或有助于生产药品(即药物)。
本申请所述组合物以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂递送部位、给药方法、给药时间表以及医师已知的其他因素。
对于本申请所述的寡核苷酸剂组合物，可通过肠胃外输注递送，包括鞘内、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、膀胱内、脑室内、玻璃体内或皮下给药；或通过口服、鼻内、吸入、阴道或直肠给药递送。
另一方面，本申请提供根据本申请所述任一实施方案的寡核苷酸剂或根据本申请所述任一实施方案的组合物在制备用于治疗个体基因或蛋白质相关疾病的药物中的用途。根据某些实施方案的用途，所述病症可包括与SOD1相关的病症，包括ALS、AD、PD和/或DS。还提供某些实施方案的用途，其中所述个体是哺乳动物，优选人类。
药盒
另一方面，本申请所述的任何组合物均可以一种或多种药盒的形式提供，任选地包括所述组合物的使用说明。也就是说，药盒可包括寡核苷酸剂或组合物或药物组合物在本申请所述任何方法中的使用说明。本申请使用的“药盒”通常指一个包装、组件或容器(例如隔热容器)，包括本申请的一个或多个组分或实施方案，和/或与本申请相关的其他组分，例如，如前所述。药盒的任何药剂或组分均可以液体形式(例如溶液)或固体形式(例如干燥粉末、冷冻剂等)提供。
在某些情况下，所述药盒包括一个或多个组分，这些组分可在同一个或两个或多个容器中，和/或其任何组合中。所述容器能够容纳液体，而非限制性实施例包括瓶、小瓶、广口瓶、试管、烧瓶、烧杯等。在某些情况下，所述容器是防溢的(当关闭时，无论容器的方向如何，液体都不能从容器中流出)。
与本申请所述的药剂、组合物和方法相关的其他组合物或组分的实施例包括但不限于：稀释剂、盐、缓冲液、螯合剂、防腐剂、干燥剂、抗菌剂、针头、注射器、包装材料、管、瓶、烧瓶、烧杯等，例如用于使用、修饰、组装、储存、包装、制备、混合、稀释和/或保存特定用途的组分。在使用任何组分的液体形式的实施方案中，液体可为浓缩或可直接使用形式。
在其他实施方案中，所述药盒可提供用于使用药盒以及本申请所述组分和/或方法的说明书，或者包括指示此类信息的网站或任何形式的其它资源。例如，所述说明书可包括与药盒相关的组分和/或其他组分的使用、修饰、混合、稀释、保存、组装、储存、包装和/或制备的说明。在一些情况下，所述说明书还可以包括用于组分运输的说明书，例如，在室温、零下温度、低温等条件下运输或储存的说明。所述说明书可以对药盒用户有用的任何形式提供，例如书面或口头(例如电话)、数字、光学、视觉(例如录像带、DVD等)和/或电子通信(包括互联网或基于网络的通信)等形式。
使用方法
本申请的另一方面涉及本申请所述用于治疗诸如ALS等疾病的治疗方法中的寡核苷酸剂。
通过非限制性实施方案，本申请提供了一种降低SOD1基因转录水平或SOD1蛋白水平的方法，包括向对象施用本申请公开的药物组合物。
在一些实施方案中，本申请涉及一种治疗或延缓对象肌萎缩侧索硬化(ALS)发作或进展的方法，该方法包括：向对象施用本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述对象有散发性肌萎缩侧索硬化(sALS)。在一些实施方案中，所述对象患有家族性肌萎缩侧索硬化(fALS)。在一些实施方案中，所述药物组合物可降低SOD1基因转录水平或SOD1蛋白水平。
在一些实施方案中，与不具有ACO的寡核苷酸剂相比，所述寡核苷酸剂的ACO可改善所述siRNA的稳定性、生物利用度、生物分布和/或细胞摄取。
在一些实施方案中，与不具有ACO的寡核苷酸剂相比，所述寡核苷酸剂的ACO可增加所述siRNA在一个或多个靶组织内的生物分布。
在一些实施方案中，与不具有ACO的寡核苷酸剂相比，所述寡核苷酸剂的ACO可增加所述siRNA在两个或多个靶组织内的生物分布。
在一些实施方案中，一个或多个靶组织选自：前额叶皮质、小脑、大脑、脊髓、肌肉、肺、眼、肝和肾。
在一些实施方案中，本申请所述寡核苷酸剂可实现全长SOD1蛋白的减少，与单独施用相同量没有ODV结构的双链寡核苷酸(例如siRNA物质)相比，其减少到的量更低，显示出更高的效力，而毒性或不必要的副作用降低。在一些实施方案中，本申请所述寡核苷酸剂可实现全长SOD1蛋白的减少，与单独用相同量所述siRNA处理获得的累加效应相比，其减少到的量更低。
具体而言，本申请所述寡核苷酸剂可抑制/下调SOD1 mRNA转录物至少10％(例如，与基线SOD1 mRNA转录物相比，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％)。在一些实施方案中，对于一种体外细胞系，以10nM浓度对细胞或对象施用所述实施方案中公开的寡核苷酸剂时，处理所得的SOD1 mRNA转录物与对照组中的基线SOD1mRNA转录物相比，被抑制/下调至少50％、60％、70％、77％、79％、81％、84％、85％和88％。在一些实施方案中，寡核苷酸剂可抑制或下调约80％的SOD1 mRNA转录物。
在一些实施方案中，通过将实施方案中公开的寡核苷酸剂以至少0.01nM，例如0.02nM、0.05nM、0.08nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.8nM、1nM、5nM、10nM、25nM、50nM、75nM、100nM或150nM的浓度施用于细胞，来抑制/下调SOD1基因的表达。在一些实施方案中，通过向细胞或对象施用所述实施方案公开的寡核苷酸剂，SOD1基因编码蛋白(SOD1蛋白)被抑制/下调。与SOD1蛋白的基线表达相比，所述SOD1蛋白敲低达到至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％)。在一些实施方案中，寡核苷酸剂可抑制或下调约80％的SOD1蛋白的表达。在一些实施方案中，通过将实施方案中公开的寡核苷酸剂以至少0.01nM，例如0.02nM、0.05nM、0.08nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.8nM、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、10nM、25nM、50nM、75nM、100nM或150nM的浓度施用于细胞，来抑制/下调所述SOD1蛋白。
在一些实施方案中，实施方案中公开的寡核苷酸剂在细胞中具有剂量依赖性敲低活性。在一些实施方案中，所述寡核苷酸剂在细胞中敲低SOD1 mRNA转录物的IC50小于10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.8nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.08nM、0.06nM、0.04nM、0.02nM、0.01nM、0.008nM或0.005nM。
本申请的另一方面涉及一种预防或治疗由个体中SOD1蛋白过表达、SOD1基因突变和/或高SOD1 mRNA水平诱导的紊乱或病症的方法，包括向个体施用有效量的所述siRNA、寡核苷酸剂或包含本申请公开的寡核苷酸剂组合物。在一些实施方案中，本申请公开的siRNA的有效量可以是0.01nM至50nM范围内的浓度，例如0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.08nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.8nM、1nM、5nM、10nM、25nM、50nM、75nM、100nM或150nM。在一些实施方案中，所述紊乱或病症为肌萎缩侧索硬化。在一些实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一些实施方案中，所述个体是人类。
在本申请提供的任何实施方案中，此类细胞可以是离体细胞，如细胞系等，或可存在于哺乳动物体内，如人类。在一些实施方案中，人类是患有SOD1蛋白相关疾病或ALS、AD、PD或DS的患者或个人。
本申请的另一方面涉及使用本申请所述的施用途径向个体施用有效量的寡核苷酸剂或其组合物。在一些实施方案中，所述施用途径选自以下一种或多种：肠胃外输注、经口给药、鼻内给药、吸入给药、阴道给药和直肠给药。在一些实施方案中，所述施用途径选自以下的一种或多种：鞘内、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、膀胱内、脑室内、玻璃体内和皮下给药。
给药方案和施用途径
本申请的各方面涉及包含本申请的寡核苷酸剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含本申请的寡核苷酸剂和药学上可接受的载体、治疗惰性载体、稀释剂或药学上可接受的辅料。本申请公开的药物组合物将开发成预防或治疗SOD1蛋白相关疾病或ALS的药物。
本申请的各方面还涉及使用本申请的寡核苷酸剂来制备这种组合物的方法。
本申请的另一方面涉及本申请寡核苷酸剂在生产本申请公开的药物组合物中的用途。
本申请的另一个方面涉及根据本申请所述任何一个实施方案的寡核苷酸剂或根据本申请所述任何一个实施方案的组合物在制造用于预防或治疗由个体中SOD1蛋白过表达、SOD1基因突变和/或高SOD1蛋白水平诱导的基因或蛋白相关症状的药物中的用途。根据某些实施方案的用途，所述疾病可以包括SOD1蛋白/突变相关的包括ALS在内的紊乱或病症。根据某些实施方案的用途，由异常SOD1蛋白的过表达诱导的症状是ALS。还涉及某些实施方案的用途，其中所述个体是哺乳动物，例如人类。
本申请的多种寡核苷酸剂或组合物的给药剂量范围可以相互差别较大，且分别符合各自情况下的个体要求。在一些实施方案中，当所述对象小于1周龄、小于1月龄、小于3月龄、小于6月龄、小于1岁、小于2岁、小于15岁或大于15岁时，首次施用本申请的药物组合物。
所述寡核苷酸剂的单次给药剂量范围为0.01mg/kg至1000mg/kg，例如约0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、40、50、75、100、120、150、200、250、300、400、500、750或1000mg/kg。本申请所述的剂量可包含本申请所述的任何寡核苷酸剂序列中的两个或多个。
在一些实施方案中，拟定的给药频率为近似值。例如，在一些实施方案中，如果拟定的给药频率为第1天首次给药和在第29天第二次给药，则ALS患者可在接受首次给药后25、26、27、28、29、30、31、32、33或34天接受第二次给药。在一些实施方案中，如果拟定的给药频率为第1天首次给药和第15天第二次给药，则ALS患者可在接受首次给药后10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天接受第二次给药。在一些实施方案中，如果拟定的给药频率为第1天首次给药和第85天第二给药，则ALS患者可在接受首次给药后80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90天接受第二次给药。
在一些实施方案中，将基于对象年龄、对象体重和/或其他可能需要调整注射参数的因素来调整注射剂量和/或体积。
在一些实施方案中，所述药物组合物包括共溶剂体系。举例来说，此类共溶剂体系包括苯甲醇、非极性表面活性剂、水混溶性有机聚合物和水相。在一些实施方案中，此类共溶剂体系用于疏水性化合物。此类共溶剂体系的非限制性实施例是VPD共溶剂体系，其为无水乙醇溶液，包含3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80TM和65％w/v聚乙二醇300。在不显著改变其溶解度和毒性特性的情况下，此类共溶剂体系的比例可以有较大差别。此外，共溶剂组分的种类可以有所不同：例如，可以使用其他表面活性剂代替聚山梨酯80TM；聚乙二醇的级分大小有所不同；其他生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；其他糖或多糖可以代替葡萄糖。
与本申请所述的寡核苷酸剂、组合物、药物组合物和方法相关的其他组合物或组分的实施例包括但不限于：稀释剂、盐、缓冲液、螯合剂、防腐剂、干燥剂、抗菌剂、针头、注射器、包装材料、管、瓶、烧瓶、烧杯等，例如用于使用、修饰、组装、储存、包装、制备、混合、稀释和/或保存特定用途的组分。在使用任何组分的液体形式的实施方案中，液体可为浓缩或可直接使用形式。
在一些实施方案中，用于核酸治疗的脂质部分可应用于本申请中，以递送本申请公开的寡核苷酸剂分子。在这些方法中，将核酸(例如本申请所述的一种或多种寡核苷酸剂)引入由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的预成型脂质体或脂质复合物中。在某些方法中，在不存在中性脂质的情况下，形成具有单阳离子或多阳离子脂质的寡核苷酸剂复合物。在一些实施方案中，选择脂质部分以增加药剂向特定细胞或组织中的分布。在一些实施方案中，选择脂质部分以增加药剂在脂肪组织中的分布。在一些实施方案中，选择脂质部分以增加药剂在特定细胞或肌肉组织中的分布。
在一些实施方案中，所述药物组合物包括递送系统。递送系统的实施例包括但不限于脂质体和乳剂。某些递送系统可用于制备某些药物组合物，包括包含疏水性化合物的组合物。在一些实施方案中，使用某些有机溶剂，如二甲基亚砜。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种组织特异性递送分子，其设计用于将本申请的一种或多种药剂递送至特定组织或细胞类型。例如，在一些实施方案中，药物组合物包括包被有组织特异性抗体的脂质体。
在一些实施方案中，可通过载体递送或施用寡核苷酸剂。可以使用可用于基因递送的任何载体。在一些实施方案中，可以使用病毒载体。可用于本申请的病毒载体的非限制性实施例包括但不限于人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MMSV)、小鼠干细胞病毒(MSCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、辛德毕斯病毒(SIN)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、水疱性口炎病毒(VSV)、牛痘病毒(VV)、腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒和逆转录病毒。
在一些实施方案中，所述载体为重组AAV载体(rAAV)。AAV载体是相对较小的DNA病毒，可以稳定和位点特异性的方式整合到其所感染细胞的基因组中。它们能够感染多种类型的细胞，而不会对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且似乎与人类病理无关。所述AAV基因组已被克隆、测序和表征。其包含约4700个碱基，每端含有约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，作为病毒复制的起点。所述基因组的其余部分分为两个具有衣壳化功能的基本区域：基因组左侧部分，包含参与病毒复制和病毒基因表达的rep基因；以及基因组右侧部分，包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因。
本公开内容的制剂、药物组合物或药物均以符合良好医疗实践(goodmedicalpractice)的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体对象的临床状况、病症的原因、药剂递送部位、给药方法、给药时间表以及医师已知的其他因素。
对于本公开内容的制剂、药物组合物或药物，可通过肠胃外输注递送，包括鞘内、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、膀胱内、脑室内、玻璃体内或皮下给药；或通过口服、鼻内、吸入、阴道或直肠给药递送。
通过混合本公开内容的siRNA和载体或辅料，制备本公开内容中寡核苷酸调节剂的典型制剂。合适的载体和辅料为本领域技术人员所熟知，并且详述于例如AnselH.C.等人，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(2004；Lippincott，Williams&Wilkins，费城)；Gennaro A.R.等人，Remington:The Science andPractice of Pharmacy(2000；Lippincott，Williams&Wilkins，费城)；和Rowe R.C，Handbook of Pharmaceutical Excipients(2005；Pharmaceutical Press，芝加哥)中。所述制剂还可包含一种或多种缓冲液、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂、稀释剂和其它已知添加剂，以很好地呈现药物(即本公开内容的siRNA或其药物组合物)或有助于生产药品(即药物)。
实施例
以下实施例旨在为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并不旨在限制本申请所涉及发明的范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已努力确保所用数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则“份”单位均为重量，分子量为重量平均分子量，温度单位为摄氏度，压力等于或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp：碱基对；kb：千碱基；pl：皮升；s或sec：秒；min：分钟；h或hr：小时；aa：氨基酸；nt：核苷酸；i.m.：肌肉注射；i.p.：腹腔注射；s.c.：皮下注射；i.c.v.或ICV：脑室内注射，等。
实施例1.敲低人SOD1的siRNA候选药物开发
从NCBI核苷酸数据库中检索人SOD1转录物序列(NM_000454.5)。所述序列包括一个位于核苷酸78和542之间的465bp开放阅读框(ORF)，其用作为siRNA设计的模板(表1)。
表1.用于siRNA设计的SOD1 cDNA序列
设计并合成了总共268个siRNA双链体，分别长度为21个核苷酸(nt)，且具有连续不超过4个重复核苷酸而GC含量在35％～65％之间。其靶位点和同源siRNA链序列见表2。在0.1和10nM浓度下，使用高通量RT-qPCR评估了HEK293A细胞中每种siRNA的敲低活性。根据平均敲低活性，对数据进行排序，其中121种siRNA在10nM时将SOD1降低90％以上(图1A)。作为效力的指标，69种和15种siRNA在0.1nM浓度处理下将SOD1水平分别降低了50％和75％以上。在HEK293A细胞中，对25种siRNA进行6个浓度(即0.0064、0.032、0.16、0.8、4和20nM)的额外一轮筛选，以证明具有剂量依赖性活性，其中碘化丙啶(PI)被整合到样本制备物中以监测核酸含量的变化，作为不良细胞毒性的指标(图2)。图1B显示敲低活性最强的前5种siRNA(即siSOD1-063、047、104、005和258)的数据，同时也表明不存在明显的细胞毒性(即PI染色减少<20％)。
随后为5种siRNA候选物中的每一种生成剂量反应曲线，以验证其在代表神经元疾病的模型细胞系(包括SK-N-AS(图1C)和T98G(图3)细胞)中的效力。如表3所示，两种细胞系中每种双链的体外效力均在低皮摩尔范围内。还在远高于外推IC50值的200倍的浓度下处理72小时后评估了不良细胞毒性。如图4A-B所示，仅未检出siSOD1-047和005对SK-N-AS或T98G细胞凋亡或细胞数量的影响，而其余候选物(即siSOD1-063、104和258)对T98G细胞的caspase 3/7活性呈剂量依赖性反应，与细胞活力呈负相关。而SK-N-AS细胞似乎对处理更耐受，观察到的细胞活力保持相似模式。
将代表不同双链长度(即分别为20、21、22和23nt)的几种药物化学模式(称为M1、M2、M3或M4)应用于每种主要候选物，所述模式包括在各核苷酸的选定位置进行硫代磷酸酯(PS)主链修饰以及2'-O-甲基化(2'Ome)或2'-氟(2'F)取代，并筛选其对靶mRNA的敲低活性。如图1D所示，SK-N-AS细胞中0.1nM处理浓度下，M3变体(即siSOD1-063M3、047M3、104M3、005M3和258M3)通常比其他化学修饰的siRNA具有更好的敲低活性。在T98G细胞中也观察到几乎相同的模式(图5)。为了进一步表征效力，在SK-N-AS(图1E)和T98G(图6)细胞系中生成了M3修饰双链(即siSOD1-063M3、047M3、104M3、005M3、258M3和270M3)的剂量反应曲线。如表3所示，化学修饰后通常保留了良好的体外效力。
通过共享经典siRNA通常不耐受的药物化学，开发了辅助寡核苷酸(ACO)缀合物，以赋予与ASO相似的自递送特性。因此，每个M3变体(即siSOD1-063M3、047M3、104M3、005M3和258M3)的正义链通过短连接子(L9，即间隔子-9连接子)与14-核苷酸ACO(称为AC1)共价连接，其中在所述ACO内的每个位置具有PS主链取代和2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)修饰(图7A)。如图7B所示，在0.25和2.5nM浓度下，单独使用AC1处理在体外未检测到SOD1敲低活性，而仅在其与siRNA缀合时才观察到活性。其他剂量反应分析显示，与仅经化学修饰的双链(即siSOD1-005M3)相比，AC1缀合(即siSOD1-005M3-AC1)导致siRNA效力损失约10倍(图7C)。然而，在所述导向链的5’末端用5’-(E)-乙烯基膦酸酯(5’VP)修饰后(即siSOD1-005M3-AC1VP)，效力恢复(图7D)。将序列和化学性质均与Tofersen(一种正在进行临床研究的反义寡核苷酸ASO，其以抑制突变的SOD1mRNA水平机制，已在ALS治疗中显示出治疗获益；参见T.Miller等人，新英格兰医学杂志383,109-119(2020))相似的ASO(即ASOSOD1，SEQ IDNO:864)作为对比，两种siRNA-ACO变体(即siSOD1-005M3-AC1或siSOD1-005M3-AC1VP)的SOD1敲低作用均比ASOSOD1更强，无论其5’VP修饰如何(图7D)。
随后使用M3化学修饰和5’VP修饰(即siSOD1-063M3-AC1VP、047M3-AC1VP、104M3-AC1VP、005M3-AC1VP、258M3-AC1VP和270M3-AC1VP)合成SiRNA-ACO缀合物，用于下游体内筛选。给药前，生成SK-N-AS和T98G细胞中的剂量反应曲线，以验证每种siRNA-ACO候选物在抑制突变型SOD1 mRNA水平方面的活性(图8A-8B)。如表3所示，与非缀合形式相比，其体外效力通常保存良好。还在处理后72小时定量测定了细胞凋亡和细胞活力，以测量化学修饰和ACO缀合是否引起任何细胞毒性变化。如图9A-9B所示，在SK-N-AS和T98G细胞中，siSOD1-047M3-AC1VP和005M3-AC1VP通常不受影响，对细胞健康的影响微乎其微，而siSOD1-104M3-AC1VP保留了不良细胞毒性迹象，其余候选物(即siSOD1-063M3-AC1VP和258M3-AC1VP)与其未修饰形式相比，在体外安全性方面有所改善(即caspase 3/7活性降低)(图4A-B)。
表3.候选药物的体外效力
*IC50值±标准差，将SOD1基因敲低一半的siRNA浓度；
“/”表示未检测。
实施例2.siRNA-ACO候选药物的体内筛选
hSOD1G93A转基因的半合子小鼠表达突变型人SOD1，并表现出与ALS相似的疾病表型，包括神经元受损导致的运动功能进行性丧失和寿命缩短(P.Weydt等人,Neuroreport14,1051-1054(2003)；P.H.Tu等人，Proc Natl Acad Sci USA 93,3155-60(1996))。为检测体内敲低活性，通过脑室内注射等摩尔量(即20nmol/剂)的siRNA-ACO(即siSOD1-047M3-AC1VP或siSOD1-005M3-AC1VP)来处理hSOD1G93A小鼠，并以非缀合物(即siSOD1-047M3VP或siSOD1-005M3VP)为对照，以证明AC1缀合可促进体内敲低活性。所有siRNA-ACO均以aCSF制备，所述aCSF单独处理作为溶媒对照以建立基线表达，而siCON2-AC1VP作为siRNA-ACO活性的阴性对照。如图10所示，与非缀合型同源物相比，两种siRNA-ACO双链体均在脑的所有组织(即额叶皮质、小脑和大脑)和脊髓(即颈椎、胸椎和腰椎)中具有较高的敲低活性，而在外周组织(即肝脏)中的活性极低。与ASOSOD1相比，还表征了siSOD1-005M3-AC1VP相对于其非5’VP对照(即siSOD1-005M3-AC1)的敲低持久性。综上所述，AC1缀合和5’VP修饰的组合为我们的siRNA提供了体内持久效果所需的增强活性。
实施例3.siRNA-ACO单次脑室内注射处理可延缓hSOD1G93A小鼠的疾病进展并延长其存活时间
在PND 85或60时，通过脑室内注射分别以50、100、200或400mg/剂的siRNA-ACO候选物(即siSOD1-047M3-AC1VP或siSOD1-005M3-AC1VP)处理成年hSOD1G93A小鼠。给药后第14天，在动物亚组中定量测定CNS组织(即小脑、大脑和脊髓)中的药物浓度和hSOD1表达水平。如图11A-B所示，siSOD1-047M3-AC1VP和siSOD1-005M3-AC1VP的活性和组织蓄积均呈剂量依赖性，其中SOD1敲低与所述CNS组织内siRNA-ACO浓度增加呈负相关。预计在每个组织中引起ED50(中位有效剂量)反应的药物浓度汇总，见表4。
表4.触发中位反应的siRNA-ACO的ED50和组织浓度
*每克(g)组织中siRNA-ACO的质量(mg)。
ND：无法确定
在剩余动物中，绘制了体重变化图以监测生长速率和疾病进展。如图12A所示，与aCSF治疗相比，经siSOD1-047M3-AC1VP或siSOD1-005M3-AC1VP治疗的所有组的体重均持续增加。此外，如生长速率恢复至起始体重所需的时间(虚线)所示，疾病相关体重减轻以剂量依赖性方式延缓。当记录到峰值体重减轻10％时，确认了每只动物的疾病进展。通过Kaplan-Meier曲线绘制数据，显示各治疗组动物何时转为疾病进展(图12B)。收集数据，直到动物不可避免地死于疾病，并生成存活曲线(图12C)。总之，siSOD1-047M3-AC1VP(表5)和siSOD1-005M3-AC1VP(表6)治疗均延缓了疾病进展并延长了动物存活时间，其中与溶媒对照组相比，最高剂量(即400mg)分别将寿命延长了70天和111.5天。
表5.PND 85时单剂量给药siSOD1-047M3-AC1VP后动物发病和存活的中位年龄
*与aCSF组相比，P<0.001
与aCSF组相比，P<0.01
表6.PND 60时单剂量给药siSOD1-005M3-AC1VP后动物发病和存活的中位年龄
*与aCSF组相比，P<0.001
实施例4.siRNA-ACO靶位点的致病性突变影响先导物选择
siSOD1-005M3-AC1VP所述靶位点内的致病性单核苷酸多态性(SNP)的计算机模拟分析显示，共有5个SNP，其中4个位于与其“种子”序列互补的区域内(图13A)。已知该区域的错配会抑制siRNA活性，这可以从其治疗库中排除全球约8.9～12.4％的ALSSOD1患者(O.Abel等人，Hum Mutat 33,1345-51(2012)；https://alsod.ac.uk/，肌萎缩侧索硬化在线数据库-ALSoD)。相反，siSOD1-047M3-AC1VP在其靶位点(即P.E22G和P.F21C)内仅有2起致病性SNP报告，分别约占全球ALSSOD1群体的4.04％和2.70％(图13B)。将含有与siSOD1-047M3-AC1VP导向链完全互补的保守序列或致病突变之一(即P.E22G和P.F21C)的荧光素酶报告基因构建体(即pLucSOD1、pLucP.E22G和pLucP.F21C)与siRNA-ACO一起共转染到HEK293A细胞中。荧光素酶活性的敲低对siSOD1-047M3-AC1VP具有特异性，因为用乱序对照(即siCON2-AC1VP)转染不会减少报告基因的表达(图13C)。剂量反应数据表明，与靶位点保守序列相比，P.E22G突变对siSOD1-047M3-AC1VP敲低活性/效力无任何显著影响，而P.F21C对治疗具有部分耐受性，表现出不完全敲低和效力较低(图13D)。
实施例5.通过IT注射siRNA-ACO延缓hSOD1G93A小鼠的疾病进展、延长生存期并改善运动功能
基于预期的患者群体，选择siSOD1-047M3-AC1VP用于进一步体内分析。在PND 68和100时，雄性和雌性hSOD1G93A小鼠通过IT注射接受两次连续siSOD1-047M3-AC1VP给药，剂量为75、150或300μg/剂量。非特异性siRNA-ACO(即siCON3-AC1VP)用作疗效的阴性对照。对动物体重进行了监测，与野生型动物(即WT)相比，所有剂量的siSOD1-047M3-AC1VP治疗对雄性小鼠的获益相似，而雌性小鼠的体重增加似乎更明显地呈剂量依赖性(图14A)。还绘制了疾病进展(即峰值体重减轻10％)和动物存活率，其中siSOD1-047M3-AC1VP治疗延缓了雄性和雌性小鼠的疾病进展并延长了生存期(图14B-C)。雄性和雌性动物经IT注射siRNA-ACO治疗后疾病进展和中位生存天数汇总，见表7。总体而言，与溶媒对照组相比，siCON3-AC1VP未提供治疗获益，而等剂量的siSOD1-047M3-AC1VP(即150mg)分别将雄性和雌性动物的生存期延长了61天和29天。
表7.经IT注射给药siSOD1-047M3-AC1VP后雄性和雌性小鼠发病和存活的中位年龄
*与aCSF组相比，P<0.001
与aCSF组相比，P<0.01
还评估了雄性和雌性小鼠组的神经肌肉表现。通过旷场漫游(图15A)、转棒试验(图15B)和握力(图15C)行进的距离均显示，siSOD1-047M3-AC1VP治疗极大地改善了hSOD1G93A小鼠的运动功能，且通常持续到研究结束。将每只动物在可测量体重减轻之前的早期时间点(即PND 90)的转棒表现与其各自的最后一个时间点进行比较，进一步表明与对照组或ASOSOD1相比，siSOD1-047M3-AC1VP治疗保留或改善了大多数动物的神经肌肉表现(图16)。每只动物转棒表现的潜伏时间汇总见表8。
在旷场、转棒和/或握力试验之前，使用ALS治疗开发研究所(ALS TDI)神经评分(NS)系统对所有动物的运动功能进行评分。如图15D所示，在aCSF和siCON3-AC1VP对照组中，所有小鼠在约PND 130时均出现了异常张开(即NS2)，其严重程度随时间持续增加(即≥NS3)。相反，在研究过程中的任何时间点，所有siSOD1-047M3-AC1VP剂量的平均评分均未超过NS2，尤其是最高剂量组(即300mg)，其中平均NS基本保持在NS1左右。与载体和siCON3-AC1VP对照组相比，ASOSOD1治疗组的NS也有所改善。然而，到PND 150时，尽管在150mg剂量下ASOSOD1比siSOD1-047M3-AC1VP分子过量约3倍，但NS开始以与对照组相似的斜率增加。
总之，siRNA-ACO缀合物为SOD1 siRNA提供了临床开发所需的药理学特性，包括递送至所述CNS以及提供强效和持久活性的良好组织生物分布。通过ICV或IT注射局部递送至hSOD1G93A小鼠，延缓了疾病发作/进展，并延长了动物的生存期，与在序列和化学上类似于Tofersen的ASO化合物相比疗效更优。这些结果清楚地表明，与目前的临床治疗方式(即Tofersen)相比，siRNA在靶向和敲低SOD1治疗ALS方面有很大改善。
实施例6.siRNA对HeLa和SK-N-AS细胞中SOD1 mRNA表达的敲低活性
为了评估siRNA的敲低活性，将指定的siRNA(即RD-15757、RD-18972、RD-12500、RD-18973、RD-18948和RD-18949)以1500nM的浓度直接加入HeLa细胞的培养基中，转染3天。未经任何处理的细胞用作模拟对照，经RD-11566处理的细胞用作双链对照。如图17所示，与RD-11566相比，所有siRNA均导致了SOD1 mRNA水平发生不同程度的降低(范围为1-32％)，而RD-12500导致的降低幅度最大(32％)。
为了进一步评估siRNA的剂量依赖性敲低活性，将指定的siRNA(即RD-12926、RD-15757、RD-12500、RD-18947、RD-18948、RD-18949、RD-18946、RD-18972和RD-18973)以指定浓度(即0.0002、0.001、0.0039、0.0156、0.0625、0.25、1和4nM)加入SK-N-AS细胞中，转染24小时。通过两步法RT-qPCR定量分析的SOD1 mRNA水平，见图18A和18B。外推得到EC50值，以确定每种受检siRNA(对SOD1 mRNA呈剂量依赖性敲低)达到最大活性时的效力。SK-N-AS细胞中siRNA处理后的EC50值汇总见表9。
表9.SK-N-AS细胞中siRNA处理后的EC50值
材料与方法
高通量筛选靶向人SOD1的siRNA
以人SOD1(hSOD1)cDNA序列(NM_000454.5)的开放阅读框(ORF)为模板，通过内部算法设计siRNA。在无药物化学的情况下，共合成了268个长度为19个核苷酸的双链体(表2)。HEK293A细胞的铺板和转染在96孔板中进行，每孔板含有32个siRNA和8个质控对照处理，浓度为2种(即0.1和10nM)，每组两个重复。培养细胞24小时，并通过Fluent System 780液体处理系统(Tecan，Hombrechtikon，瑞士)，使用含碘化丙啶(PI)的优化配方，该配方基于一步法RT-qPCR的细胞裂解(CL)缓冲液，实现自动裂解，如前所述(K.Shatzkes等人，SciRep 4,4659(2015))。在样本制备过程中加入PI，通过对粗裂解物中的总核酸含量进行染色来监测细胞数量的变化(例如，不良细胞毒性)。在Infinite M200 Pro酶标仪(Tecan)上，于535nm激发和615nm发射波长下，通过光密度(OD)对染色进行定量。随后将样本转移至384孔板中，使用一步法TB Green PrimeScript RT-PCR试剂盒II(Takara，Kyoto，日本)在480实时PCR系统(Roche,Basel，瑞士)上进行RT-qPCR分析。通过Echo 525声学液体处理器(Beckman Coulter，Brea，美国加利福尼亚州)自动制备PCR反应。随后仅对最佳的前30种siRNA在6种浓度(即0.0064、0.032、0.16、0.8、4和20nM)下进行了二次筛选。所有样本进行三次重复扩增。
siRNA合成
在Ractigen Therapeutics(中国如东)使用HJ-12合成仪(中国北京海精高创科技有限公司)在固相载体上内部合成寡核苷酸序列，随后使用乙腈梯度在UniPS柱(中国苏州纳微科技股份有限公司)上通过RP-HPLC纯化。通过缓冲液交换在无菌水中复溶每个序列。短暂加热链混合物并冷却至室温，对等摩尔量的每条链进行退火处理，形成相应的双链。在预测分子量下，通过凝胶电泳分离单条带，以确认双链体的形成。使用ESI-MS对双链体进行鉴定，同时使用XBridge Protein BEH SEC 125A柱(Waters Corporation,Milford，美国马萨诸塞州)通过SEC-HPLC分析了总体纯度。使用终点显色内毒素定量试剂盒(Bioendo，中国厦门)通过酶原因子C定量测定每批的内毒素水平。所有对照双链体和化学修饰序列见表10。
细胞培养和处理
将HEK293A细胞(科佰，中国南京，目录号：CBP60436)和SK-N-AS细胞(普诺赛，中国武汉，目录号：CL-0621)在添加有10％牛血清(Sigma-Aldrich)、青霉素(100U/ml，Gibco)和链霉素(100mg/ml，Gibco)的DMEM培养基中培养。将T98G细胞(Cobioer，目录号：CBP60301)在添加有有10％ FBS、1％ NEAA、丙酮酸钠(1mM)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100ug/ml)的MEM培养基中培养。将人宫颈癌细胞HeLa(ATCC)细胞在添加有10％牛血清和1％青霉素/链霉素的改良RPMI 1640培养基(Gibco,Thermo Fisher Scientific,Carlsbad，美国加利福尼亚州)中培养。所有细胞系均在37℃、5％CO2的潮湿环境中培养。根据生产商的方案，在不含抗生素的生长培养基中使用Lipofectamine RNAiMax(ThermoFisher，Waltham，美国马萨诸塞州)进行转染。
RT-qPCR
一步法逆转录-定量聚合酶链式反应(一步法RT-qPCR)
转染结束后，弃去培养基，每孔用150μL PBS洗涤细胞一次。弃去PBS后，每孔加入100μl细胞裂解液，室温孵育5分钟。每孔取0.5μl细胞裂解液，在罗氏Lightcycler 480实时PCR仪中，使用一步法TB GreenTM PrimeScripTM RT-PCR试剂盒II(Takara，RR086A)进行RT-qPCR分析。使用Echo 525声学液体处理器(Beckman Coulter)制备PCR反应。每个转染样本设3个复孔进行扩增。PCR反应条件见表11。
表11.PCR反应准备
反应条件如下：逆转录反应(第1阶段):42℃5分钟，95℃10秒；PCR反应(第2阶段):95℃5秒，59℃20秒，72℃10秒，40次扩增循环；熔解曲线(第3阶段)。将人SOD1基因扩增为靶基因。将人TBP或小鼠Tbp作为参考基因，并扩增作为RNA载量的内部对照。引物序列见表12。
表12.RT-qPCR检测的引物序列
两步法RT-qPCR
使用Bioprep-24均质仪(Allsheng，中国杭州)在总RNA分离试剂(Biosharp，中国合肥)中对冷冻于RNALater(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)中的动物组织进行匀浆。向去除水相的匀浆中加入三氯甲烷，并与异丙醇混合。根据生产商的方案，使用RNeasyRNA试剂盒(Qiagen)从组织制备物中提取总RNA。使用Auto-Pure 96A(Allsheng)核酸提取系统从细胞培养物中提取RNA。通过带gDNAEraser的PrimeScript RT试剂盒(Takara，Shlga，日本)，使用1μg总RNA进行逆转录(RT)反应。在罗氏LightCycler480多孔板384(罗氏，参考号：4729749001，美国)上使用SYBR Premix Ex Taq II(Takara，Shlga，日本)，结合人SOD1(hSOD1)特异性引物组和人(即TBP)或小鼠(即mTbp)样本的内部对照，扩增所得cDNA，进行三次重复扩增。扩增后绘制熔解曲线，以确认引物特异性。反应条件如下：逆转录反应(第1阶段)：42℃5分钟，95℃10秒；PCR反应(第2阶段)：95℃5秒，60℃30秒，72℃10秒；40次扩增循环；熔解曲线(第3阶段)。PCR反应条件见表13和表14。引物序列见表12。
表13.RT反应
表14.RT-qPCR反应
为了计算siRNA转染样本中SOD1 mRNA相对于对照处理(模拟)的表达水平(Erel)，将靶基因和内参基因的平均Ct值代入公式1，
Erel＝2(CtTm-CtTs)/2(CtRm-CtRs)
(公式1)
其中，CtTm是模拟处理样本中靶基因的Ct值；CtTs是siRNA处理样本中靶基因的Ct值；CtRm是模拟处理样本中内参基因的Ct值；CtRs是siRNA处理样本中内参基因的Ct值。
Caspase3/7活性测定
使用Caspase-Glo 3/7测定系统(Promega，Madison，美国威斯康星州)在细胞培养物中定量测定Caspase 3/7活性。简言之，将发光底物直接加入培养基中，并在37℃下孵育20分钟。随后在Infinite M200 Pro酶标仪(Tecan)上测量发光。将各孔的发光值扣除空白的背景信号，并通过未处理(模拟)对照组对数据进行归一化处理，计算Caspase 3/7相对活性。
细胞活力测定
根据生产商的方案，使用CCK-8测定法(Dojindo，Mashiki-machi，日本)测定体外细胞活力。简言之，将含有WST-8底物的新鲜培养基加入组织培养板的每个孔中，并在37℃下孵育至少1小时。在Infinite M200 Pro酶标仪(Tecan)上于450nm处测量吸光度。将各孔的OD值中扣除空白对照的背景信号，并通过未处理(模拟)对照组对数据进行归一化处理，来计算相对活力。
荧光素酶报告基因构建体和敲低评估
将含有P.E22G或P.F21C突变SNP的靶序列克隆到萤火虫荧光素酶基因(luc2)下游NheI和SalI限制性内切酶(RE)位点之间的荧光素酶报告基因载体pmirGLO(Promega)的多克隆位点(MCS)中，以分别生成构建体pLucP.E22G和pLucP.F21C。还创建了一个对照报告基因构建体(即pLucSOD1)，其包含与siSOD1-047M3-AC1VP导向链完全互补的hSOD1保守序列。在DH5a细菌(Tolobio，中国上海)中亚克隆所有构建体，并选择菌落进行DNA测序，以确认靶序列的插入。通过midiPrep(Qiagen，Hilden，德国)将实施例性菌落放大，用于质粒分离。在无抗生素的情况下，将HEK293A细胞以30,000个细胞/孔铺板于96孔细胞培养板中。使用0.3μlLipofectamine 2000(ThermoFisher)以100ng/孔的报告基因质粒之一(即pLucP.E22G、pLucP.F21C或pLucSOD1)和指定浓度的siSOD1-047M3-AC1VP或乱序对照对细胞进行共转染。将未加入受试物(0nM)的孔作为未处理对照。培养细胞24小时，并根据生产商的方案，使用Dual-Glo荧光素酶测定系统(Promega)定量测定荧光素酶活性。简言之，在50μl被动裂解缓冲液(Promega)中裂解细胞，其中20μl裂解物与20μl Dual-Glo荧光素酶试剂混合，并在室温下孵育10分钟。随后在Infinite 200Pro酶标仪(Tecan)上测量发光，以定量荧光素酶活性。测量后，向各孔中加入20μl Dual-Glo Stop&Glo试剂(Promega)，并在室温下再孵育10分钟。再次测量发光以定量测定海肾荧光素酶活性，用于对荧光素酶报告基因结果进行归一化处理。结果计算为经海肾荧光素酶数据归一化处理后的报告基因数据相对于未处理对照组数据之比敲低百分比(％KD)＝1-(siRNA处理组比值/未处理组比值)*100。siRNA处理组比值＝siRNA处理组的萤火虫荧光素酶活性/siRNA处理组的海肾荧光素酶活性，未处理组比值＝未处理组的萤火虫荧光素酶活性/未处理组的海肾荧光素酶活性。
动物处理和分组
亲代转基因hSOD1G93A小鼠(品系ID号：004435)购自Jackson实验室(美国缅因州巴尔港)，并通过南通大学(中国江苏省南通市)进口到中国。在6周龄时将小鼠运送至动物机构，随后在为本研究提供动物的南通大学进行饲养。所有动物操作程序均获得南通大学实验动物管理和使用委员会的批准。动物给药制剂在使用前新鲜制备，方法是将冻干寡核苷酸溶于aCSF中，制备储备溶液，以稀释至预期给药浓度。根据体重和性别，将动物随机分配至各研究组。任何健康状况不佳或有明显异常的动物均已从实验中剔除。使用GraphPadPrism(Windows)8.3.0版(GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥)，通过普通单因素方差分析模型对随机分组进行分析。雌性hSOD1G93A小鼠的重量通常比其同窝雄鼠轻约20-25％。
脑室内(ICV)注射
新鲜制备Avertin(1.2％)，并经0.2μm过滤器除菌。在立体定位仪中，以0.30～0.35ml/10g的剂量通过腹腔(IP)注射对小鼠给药，以快速诱导麻醉长达30分钟。在动物头皮上切开约11.5mm的切口，并将25号针头连接到含有适当siRNA制剂的Hamilton注射器上，置于前囟水平。将针头移动到适当的前/后和内侧/外侧坐标(前/后0.2mm，右侧内侧/外侧1mm)。以约1μl/s的速率向侧脑室注射共10μl。注射后，缓慢拔出针头，缝合伤口。
鞘内(IT)注射
在麻醉诱导室内用3.0％异氟烷进行麻醉，持续10分钟。剃除尾根注射部位周围的毛发，并用75％乙醇清洗。确定L5～L6棘突之间的间隙，并将与装有适当药物制剂的微升注射器相连接的30G针头缓慢插入硬膜内，直至观察到甩尾。随后固定针头位置，在1分钟内注射总体积为10μl的溶液。
动物组织中siRNA-ACO的定量分析
使用Bioprep-24均质仪(Allsheng)在裂解缓冲液(0.5％ CA-630、1mM EDTA、150mM NaCl)中制备组织裂解物。随后将样本加热至95℃，使样本蛋白失活。连续稀释加有siRNA-ACO的未处理裂解液，配制成8个浓度水平，绘制标准曲线。使用PrimeScript RT试剂盒(Takara)与特异于siRNA导向链的定制茎环引物缀合，进行逆转录(RT)反应。在480Real-Time PCR系统(Roche)上使用SYBR Premix Ex Taq II(Takara)反应混合物和导向链cDNA的特异性引物对每个样本进行三次重复扩增。扩增后绘制熔解曲线，以确认引物特异性。根据相应的标准曲线，通过线性回归外推siRNA的绝对量。组织浓度计算为siRNA绝对质量(ng)相对于裂解用组织样本总重量(g)的比值。
临床观察和终点标准
注射后观察动物长达4小时，此后每天观察直至终点。在受试物给药前和给药后，按记录的时间点测定体重。与处理当天相比初始体重减轻>20％，或神经评分为NS4的动物符合终点标准。
神经功能评分
对于通过IT注射给药的动物，使用ALS治疗开发研究所(ALS TDI)神经评分(NS)系统评估小鼠的运动缺陷体征。该系统旨在根据hSOD1G93A小鼠常见的后肢功能障碍对疾病进展进行客观评估(T.Hatzipetros等人，Journal of Visualized Experiments(2015)，https:/doi.org/10.3791/53257)。根据以下4分量表分配NS：如果没有运动功能障碍体征(即症状前)，为0分，如果用尾巴悬挂时后肢震颤明显(即首发症状)，为1分，如果存在步态异常(即轻瘫发作)，为2分，如果至少1条后肢拖拽(即部分麻痹)，为3分，如果无法在10秒内自行恢复(即终点麻痹)，为4分。
旷场实验
在白天，将每只小鼠置于旷场(50cm长×50cm宽×50cm高)的角落，并允许其自由穿梭15分钟。顶置摄像机记录了每只动物的行进路径。通过自动跟踪软件Samart 3.0(Bioseb，Vitrolles，法国)分析视频片段，以计算总行进距离。
转棒试验
数据采集前对动物进行为期3天的训练。将小鼠置于静止转棒装置(上海欣软信息科技有限公司，中国上海)上，转棒直径为60mm。转速在300秒内从0加速至30rpm。将潜伏期记录为每只动物从转棒上跌落所需的时间。每只动物重复测试三次，选择最大值表示潜伏期。
握力试验
将小鼠放到网格板上，让其前爪和后爪抓住网格。轻拉尾巴，在XR501握力计(鑫软信息技术)上以质量为单位测量最大肌力，直至动物放开抓握。每只动物重复测试三次，选择平均值表示握力。
统计分析
使用GraphPad Prism(Windows)8.3.0版进行数据分析。通过4参数浓度-抑制模型，使用非线性回归外推剂量反应曲线和IC50值。如有规定，使用Tukey多重比较检验比较平均值，以确定不同剂量反应曲线之间的统计学差异。通过3参数浓度-反应模型，使用非线性回归，计算组织中与敲低活性相关的药物量(包括ED50值外推)。通过Kaplan-Meier图绘制时间分层数据(即峰重分析和动物存活率)，使用Mantel-Cox检验验证统计学显著性。
虽然本申请已经展示和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅作为实施例提供。本发明不受说明书中具体实施例的限制。虽然已经参照上述说明书对本发明进行了描述，但是实施方案的描述和图示不具有限制性意义。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员现在将发生许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的各个方面并不局限于各种条件和变量的具体描述、配置或相对比例。应当理解，在实施本发明过程中可以采用本申请描述的发明的实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明还将涵盖任何此类替代、修改、变体或等效物。以下权利要求定义了本发明的范围，并涵盖了这些权利要求范围内的方法、结构及其等效物。

Claims (53)

1.一种siRNA，包含一条正义链与一条反义链形成双链结构，其中所述两条链中，至少一条链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸分子的一部分具有至少85％的核苷酸序列互补性或同源性，并且其中所述siRNA能够在细胞中抑制/下调超氧化物歧化酶1(SOD1)基因转录。
2.如权利要求1所述的siRNA，其中所述两个链中，至少一条链与SEQ ID NO:1核苷酸序列的一部分具有0、1、2或3个错配；和/或
其中所述核苷酸序列的一部分包括选自SEQ ID NO:2至269中任一序
列；和/或
其中所述正义链与SEQ ID NO:270至537中任一序列具有至少85％的核苷酸序列同源性；和/或
其中所述反义链与SEQ ID NO:538至805中的任一序列具有至少85％的核苷酸序列同源性；和/或
其中所述siRNA能够抑制/下调细胞中超氧化物歧化酶1(SOD1)基因转录，使之较SOD1mRNA基线水平降低至少10％；和/或
其中所述正义链包括至少10个连续核苷酸；和/或
其中所述反义链包括至少10个连续核苷酸；和/或
其中所述正义链和所述反义链构成包括0、1、2或3个错配。
3.如权利要求1所述的siRNA，其中所述siRNA包括包含SEQ ID NO:n的正义链，以及包含SEQ ID NO:n+268的反义链，n为270至537之间的任一整数。
4.如权利要求1所述的siRNA，其中所述siRNA的至少一个核苷酸是位于所述正义链、所述反义链或所述两链中的经化学修饰的核苷酸；和/或
其中所述经化学修饰的核苷酸是在所述链的5'端、3'端、两端或内部修饰的核苷酸；和/或
其中所述siRNA的所述正义链、所述反义链和/或所述两链中至少50％的核苷酸是经化学修饰。
5.如权利要求4所述的siRNA，其中所述经化学修饰的核苷酸是选自以下的一种或多种：2’糖修饰、碱基修饰、硫代磷酸酯(PS)主链修饰、在所述核苷酸序列的5’端添加5'-磷酸酯部分或5-甲基胞嘧啶部分。
6.如权利要求5所述的siRNA，其中所述2′糖修饰是选自以下的一种或多种：2′-氟-2′-脱氧核苷(2′-F)修饰、2′-O-甲基(2′-O-Me)修饰和2′-O-(2-甲氧基乙基)(2′-O-MOE)修饰；和/或
其中所述5'-磷酸酯部分的添加为所述核苷酸序列的5′端新增一个或多个(E)-乙烯基膦酸酯部分。
7.如权利要求4所述的siRNA，其中所述正义链与SEQ ID NO:808至827、867(在所述5’端添加或未添加(E)-乙烯基膦酸酯部分)的序列具有至少85％的核苷酸序列同源性；和/或
其中所述反义链与SEQ ID NO:828至849、868(在所述5’端添加或未添加(E)-乙烯基膦酸酯部分)的序列具有至少85％的核苷酸序列同源性。
8.如权利要求4所述的siRNA，其中所述siRNA包含含有SEQ ID NO:m的正义链和含有SEQ ID NO:m+20的反义链，m是808至827之间的任一整数；或其中所述siRNA包含含有SEQID NO:814的正义链和含有SEQ ID NO:848的反义链；含有SEQ ID NO:822的正义链和含有SEQ ID NO:849的反义链；或含有SEQ ID NO:814的正义链和含有SEQ ID NO:866的反义链。
9.一种寡核苷酸剂，包括：
(a)权利要求1～8中任一项所述的小干扰RNA(siRNA)；和
(b)一个非靶向单链寡核苷酸(辅助寡核苷酸，ACO)，
其中所述ACO长度约为6～22个核苷酸，其中所述siRNA和所述ACO共价连接，没有或具有一种或多种连接组分，以形成所述寡核苷酸剂。
10.如权利要求9所述的寡核苷酸剂，其中所述ACO由一种或多种RNA、DNA、BNA、LNA、GNA和PNA组成。
11.如权利要求9所述的寡核苷酸剂，其中所述ACO的长度约为6～18个核苷酸。
12.如权利要求11所述的寡核苷酸剂，其中所述ACO的长度约为8～16个核苷酸。
13.如权利要求9所述的寡核苷酸剂，其中所述siRNA包含长度范围为约16～25个核苷酸的正义链；和/或
其中所述siRNA包含长度范围为约19～25个核苷酸的反义链。
14.如权利要求9所述的寡核苷酸剂，其中所述寡核苷酸剂能够抑制/下调细胞中超氧化物歧化酶1(SOD1)基因转录水平至少50％。
15.如权利要求9所述的寡核苷酸剂，其中所述ACO包括5’端和3’端，并且其中所述ACO的所述5’端或所述3’端与连接组分缀合。
16.如权利要求9所述的寡核苷酸剂，其中所述siRNA的所述正义链和/或所述反义链通过一种或多种连接组分与所述ACO共价连接。
17.如权利要求9所述的寡核苷酸剂，其中所述连接组分选自以下连接形式中的一种或多种：乙二醇链、烷基链、烯基链、炔基链、肽、RNA、DNA、碳水化合物、硫醇连接基团、磷酸二酯、硫代磷酸酯、磷酰胺、酰胺、氨基甲酸酯、四唑连接基团和苯并咪唑连接基团。
18.如权利要求17所述的寡核苷酸剂，其中所述连接组分选自：
a)间隔子亚磷酰胺18(亚磷酰胺酸,N,N-双(1-甲基乙基)-,19,19-双(4-甲氧基苯基)-19-苯基-3,6,9,12,15,18-六氧杂十九烷-1-基(2-氰基乙酯)；
b)间隔子-9(3-[2-[2-[2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基甲氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基-[二(丙-2-基)氨基]膦基]氧代丙腈)；
c)间隔子亚磷酰胺C3(6-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)己基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)；和
d)间隔子C6亚磷酰胺(6-(4,4‘-二甲氧基三苯甲基)己基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
e)二价连接子(DIO)16-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-
1,1-双(4-甲氧基苯基)-18-氧代-1-苯基-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十一烷-
CPG。
19.如权利要求9所述的寡核苷酸剂，其中所述ACO与siRNA的正义链的所述3’端，或所述5’端，或所述3端和5’端两者共价连接；和/或
其中所述ACO与所述siRNA反义链的3’端、或5’端、或同时与3’端和5’端两者共价连接；和/或
其中所述ACO与所述siRNA的一个或多个内部核苷酸共价连接。
20.如权利要求9所述的寡核苷酸剂，其中一个、两个或多个ACO与所述siRNA共价连接。
21.如权利要求9～20任一项所述的寡核苷酸剂，其中所述ACO的至少一个核苷酸经化学修饰。
22.如权利要求9～20任一项所述的寡核苷酸剂，其中所述ACO的至少约50％的核苷酸是经化学修饰的核苷酸。
23.如权利要求21所述的寡核苷酸剂，其中所述至少一种经化学修饰的核苷酸具有选自以下项的2′-糖修饰：2′-氟-2′-脱氧核苷(2′-F)修饰、2′-O-甲基(2′-O-Me)修饰和2′-O-(2-甲氧基乙基)(2′-O-MOE)修饰中的一种或多种。
24.如权利要求21所述的寡核苷酸剂，其中所述至少一种化学修饰的核苷酸的化学修饰为硫代磷酸酯(PS)主链修饰。
25.如权利要求24所述的寡核苷酸剂，其中所述ACO包含6～17个硫代磷酸酯(PS)主链修饰。
26.如权利要求13所述的寡核苷酸剂，其中所述反义链包括在所述核苷酸序列的所述5’端添加(E)-乙烯基膦酸酯部分。
27.如权利要求21所述的寡核苷酸剂，其中所述至少一种化学修饰核苷酸的所述化学修饰是在该核苷酸序列的5’端添加5-甲基胞嘧啶部分。
28.如权利要求10所述的寡核苷酸剂，其中所述ACO和/或所述siRNA与一个或多个缀合基团缀合。
29.如权利要求38所述的寡核苷酸剂，其中所述siRNA的所述正义链和/或所述反义链与一个或多个缀合基团缀合。
30.如权利要求38所述的寡核苷酸剂，其中所述一个或多个缀合基团选自：脂质、脂肪酸、荧光团、配体、糖、肽和抗体。
31.如权利要求38所述的寡核苷酸剂，其中所述一个或多个缀合基团选自：细胞渗透肽、聚乙二醇、生物碱、色胺、苯并咪唑、喹诺酮类、氨基酸、胆固醇、葡萄糖和N-乙酰半乳糖胺。
32.如权利要求10～38中任一项所述的寡核苷酸剂，其中所述siRNA的所述正义链和所述反义链与选自以下所述的核苷酸序列具有至少85％的同源性：
a)RD-12926(SEQ ID NO:867和SEQ ID NO:868)，
b)siSOD1-063M1(SEQ ID NO:808和SEQ ID NO:828)，
c)siSOD1-063M2(SEQ ID NO:809和SEQ ID NO:829)，
d)siSOD1-063M3(SEQ ID NO:810和SEQ ID NO:830)，
e)siSOD1-063M4(SEQ ID NO:811和SEQ ID NO:831)，
f)siSOD1-047M1(SEQ ID NO:812和SEQ ID NO:832)，
g)siSOD1-047M2(SEQ ID NO:813和SEQ ID NO:833)，
h)siSOD1-047M3(SEQ ID NO:814和SEQ ID NO:834)，i)siSOD1-047M4(SEQ ID NO:815和SEQ ID NO:835)，
j)siSOD1-104M1(SEQ ID NO:816和SEQ ID NO:836)，
k)siSOD1-104M2(SEQ ID NO:817和SEQ ID NO:837)，
l)siSOD1-104M3(SEQ ID NO:818和SEQ ID NO:838)，
m)siSOD1-104M4(SEQ ID NO:819和SEQ ID NO:839)，
n)siSOD1-005M1(SEQ ID NO:820和SEQ ID NO:840)，
o)siSOD1-005M2(SEQ ID NO:821和SEQ ID NO:841)，
p)siSOD1-005M3(SEQ ID NO:822和SEQ ID NO:842)，
q)siSOD1-005M4(SEQ ID NO:823和SEQ ID NO:843)，
r)siSOD1-258M1(SEQ ID NO:824和SEQ ID NO:844)，
s)siSOD1-258M2(SEQ ID NO:825和SEQ ID NO:845)，
t)siSOD1-258M3(SEQ ID NO:826和SEQ ID NO:846)，
u)siSOD1-258M4(SEQ ID NO:827和SEQ ID NO:847)，
v)siSOD1-270M3(SEQ ID NO:814和SEQ ID NO:866)，
w)siSOD1-047M3VP(SEQ ID NO:814和SEQ ID NO:848)，
x)siSOD1-005M3VP(SEQ ID NO:822和SEQ ID NO:847)，
y)siSOD1-047M3-AC1(SEQ ID NO:850和SEQ ID NO:834)，
z)siSOD1-005M3-AC1(SEQ ID NO:851和SEQ ID NO:842)，aa)siCON1-AC1VP(SEQ IDNO:852和SEQ ID NO:858)，bb)siCON2-AC1VP(SEQ ID NO:853和SEQ ID NO:859)，cc)siCON3-AC1VP(SEQ ID NO:854和SEQ ID NO:860)，dd)siSOD1-063M3-AC1VP(SEQ ID NO:855和SEQ ID NO:861)，ee)siSOD1-047M3-AC1VP(SEQ ID NO:850和SEQ ID NO:848)，
ff)siSOD1-104M3-AC1VP(SEQ ID NO:856和SEQ ID NO:862)，
gg)siSOD1-005M3-AC1VP(SEQ ID NO:852和SEQ ID NO:847)，
hh)siSOD1-258M3-AC1VP(SEQ ID NO:857和SEQ ID NO:863)，以及
ii)siSOD1-270M3-AC1VP(SEQ ID NO:850和SEQ ID
NO:866)。
33.如权利要求10所述的寡核苷酸剂，其中与不具有ACO的寡核苷酸剂相比，所述寡核苷酸剂的ACO可改善所述siRNA的稳定性、生物利用度、生物分布和/或细胞摄取。
34.如权利要求10所述的寡核苷酸剂，与不具有所述ACO的寡核苷酸剂相比，其中所述寡核苷酸剂的所述ACO增加了siRNA在一个或多个靶组织内的生物分布。
35.如权利要求44所述的寡核苷酸剂，其中所述靶组织选自：前额叶皮质、大脑、小脑、脊髓、肌肉、肺、眼、肝和肾。
36.一种载体，该载体包含如权利要求1～9中任一项所述的siRNA和/或权利要求10～35中任一项所述的寡核苷酸剂。
37.一种细胞，该细胞包含如权利要求1～9中任一项所述的siRNA、权利要求10～35中任一项所述的寡核苷酸剂和/或权利要求36所述的载体。
38.如权利要求37所述的细胞，其中所述细胞存在于哺乳动物体内。
39.如权利要求37所述的细胞，其中所述细胞存在于人体内。
40.如权利要求37所述的细胞，其中所述细胞为体外、体内或离体宿主细胞。
41.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1～9中任一项所述的siRNA、权利要求10～35中任一项所述的寡核苷酸剂、权利要求36所述的载体和/或权利要求37～40中任一项所述的细胞，以及药学上可接受的载体。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体，载体选自水性载体、脂质体或LNP、聚合物、胶束、胶体、金属纳米颗粒、非金属纳米颗粒、生物缀合物和多肽。
43.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述药物组合物降低SOD1基因转录水平或SOD1蛋白水平。
44.一种药盒，该药盒包括权利要求1～9中任一项所述的siRNA、权利要求10～35中任一项所述的寡核苷酸剂、权利要求36所述的载体、权利要求37～40中任一项所述的细胞和/或权利要求41～43中任一项所述的药物组合物。
45.一种降低SOD1基因转录水平或SOD1蛋白水平的方法，该方法包括向对象施用如权利要求41～43中任一项所述的药物组合物。
46.一种治疗或延缓与SOD1基因突变、SOD1基因表达异常或SOD1蛋白异常蓄积相关的神经退行性疾病或症状的发作或进展的方法，所述方法包括：向对象施用如权利要求41～43中任一项所述的药物组合物。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症选自肌萎缩侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和唐氏综合征(DS)。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述药物组合物经鞘内或脑室内施用给对象。
49.如权利要求57所述的方法，其中与不具有ACO的寡核苷酸剂相比，所述寡核苷酸剂的ACO可改善所述siRNA的稳定性、生物利用度、生物分布和/或细胞摄取。
50.如权利要求1～9中任一项所述的siRNA、权利要求10～35中任一项所述的寡核苷酸剂、权利要求36的载体、权利要求37～40中任一项所述的细胞和/或权利要求41～43中任一项所述的药物组合物在制造用于治疗或延缓SOD1相关神经退行性疾病或症状发作或进展的药物中的用途。
51.如权利要求64所述的用途，其中所述SOD1相关的神经退行性疾病或症状选自肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和唐氏综合征(DS)。
52.如权利要求1～9中任一项所述的siRNA、权利要求10～35中任一项所述的寡核苷酸剂、权利要求36的载体、权利要求37～40中任一项所述的细胞和/或权利要求41～43中任一项所述的药物组合物用于治疗或延缓SOD1相关神经退行性疾病或症状的发作或进展。
53.如权利要求52所述的siRNA、寡核苷酸剂、载体、细胞和/或药物组合物，其中所述神经疾病或病症选自肌萎缩侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和唐氏综合征(DS)。
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