[go: up one dir, main page]

CN1449441A - 生产重组人的甲状旁腺激素的酵母转化株及其用于生产该激素的方法 - Google Patents

生产重组人的甲状旁腺激素的酵母转化株及其用于生产该激素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1449441A
CN1449441A CN01814919A CN01814919A CN1449441A CN 1449441 A CN1449441 A CN 1449441A CN 01814919 A CN01814919 A CN 01814919A CN 01814919 A CN01814919 A CN 01814919A CN 1449441 A CN1449441 A CN 1449441A
Authority
CN
China
Prior art keywords
yeast
hpth
strain
gene
yps3
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN01814919A
Other languages
English (en)
Inventor
相琪·李
贤阿·加奈
凤贤·郑
修民·高
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Institute Of Biological Sciences And Biotechnology
Dong Kook Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Korea Institute Of Biological Sciences And Biotechnology
Dong Kook Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Institute Of Biological Sciences And Biotechnology, Dong Kook Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Korea Institute Of Biological Sciences And Biotechnology
Publication of CN1449441A publication Critical patent/CN1449441A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/94—Saccharomyces
    • Y10S435/942—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种新的生产人的甲状旁腺激素的啤酒酵母突变株系。这种新的株系中能编码蛋白酶yapsin家系Yapsin 1，Yapsin 2和Yapsin 3的至少一种基因发生了阻断，并且其基因组中有人的甲状旁腺激素基因。培养这种新的株系可以在培养基上大量生产完整的人的甲状旁腺激素(hPTH)。

Description

生产重组人的甲状旁腺激素的酵母转化株及其用于生产该激素的方法
技术领域
本发明涉及人的甲状旁腺激素(以下简称为hPTH)的生产。具体地说，本发明涉及运用啤酒酵母的突变菌株生产人的甲状旁腺激素，其中该突变菌株中能编码天冬氨酸蛋白酶yapsin家系YPS1，YPS2及YPS3的至少一个基因被阻断，并且被载有一个hPTH基因的表达载体转化。
背景技术
hPTH是一种由甲状旁腺产生的含有84个氨基酸基的肽链，其作用是在肾和骨骼中维持钙的内环境平衡，其生理学作用是促进钙的新陈代谢及成骨作用。在美国和欧洲，雌激素及降血钙素是人们一度曾用于治疗骨质疏松症的主要药物，但是现在却发现它们阻碍了骨的吸收。上述发现导致了全世界的制药公司对hPTH进行了广泛和深入的研究，以期通过利用hPTH可以促进骨生成的功能来治疗骨质疏松症。特别是，随着现代社会逐渐老龄化，人们更加关注骨质疏松症的预防和治疗。由于上述原因，目前已经有许多的研究机构开始运用生物技术的方法来大规模地生产hPTH，hPTH已经被认为是一种很有市场前景的治疗骨质疏松症传统药物的替代物。
例如，由于原核生物有相对高的表达效率，因此曾经有许多的研究人员尝试运用大肠杆菌作为宿主细胞来大规模生产重组hPTH。然而运用大肠杆菌生产重组蛋白过程中，很难进行蛋白质分子的再折叠及纯化。相反，酶母是一种单细胞的真核生物，它与高级物种在基因转录、翻译及蛋白质分泌的体系方面很相似，所以用酵母做为宿主细胞的优点是可以正确地表达和分泌折叠后的蛋白及活性蛋白。而且，酵母几乎不分泌细胞外蛋白，这个特点使得人们很容易回收和纯化外源性蛋白，因此酵母是适宜做生产重组蛋白的宿主细胞。况且，啤酒酵母是一种美国食品及药物管理局(FDA)确定的一般认为安全的微生物，它对人体无害且不会产生内毒素。由于上述原因，啤酒酵母一直以来被当做hPTH的表达系统来进行研究。然而，尽管作为生产重组hPTH的表达宿主细胞，啤酒酵母具有很多的优点，但是该酵母无法在工业上应用，原因是酵母本身所具有的蛋白水解酶会降解它所分泌的细胞外重组hPTH，因此只能回收到少量的完整的hPTH分子(Gabrielsen et al.，Gene 90,255(1990))。
在过去的十年中，人们已经对如何解决重组hPTH的蛋白水解酶问题进行了深入的研究。例如，人们发现hPTH在Arg-25和Lys-26之间被剪切，该剪切的位点与酵母高尔基体中的一种蛋白酶KEX2的识别位点是一致的，在这些认识的基础上，人们构建了一个hPTH替代的突变株，在该突变株氨基酸序列的第26位点处由谷氨酸取代了赖氨酸，目的是防止KEX2降解蛋白质，而KEX2是一个假设的剪切hPTH的蛋白酶(Reppe et al.，J.Biol.Chem.266，14198(1991))。运用基因重组技术，把一个hPTH相关蛋白直接连接到酵母泛素基因的3’端来生产一个不可切断的hPTH相关蛋白(Rian et al.，Eur.J.Biochem.，213，641(1993))。然而，如果作为医药使用的话，这种生产蛋白的突变株通常被认为是新药，因此，需要进行一些应急性的试验以获得药物使用的许可权。使用基因融合技术时，需要去除基因上的融合位点，因为该位点的存在使得hPTH的产量相对地低。
在不使用hPTH蛋白突变株或是融合技术来防止hPTH降解的基础上，研究人员发现了一种新的方法，即在培养基上加入L-精氨酸达到高浓度，这样就可以显著地抑制hPTH的分解(Chung and Park，Biotechnol.Bioeng.57，245(1998))。上述事实表明，hPTH的分解主要是由于细胞外蛋白酶的作用而不是细胞内蛋白酶Kex2p的作用。通过这个发现，研究人员推断Yap3p(酵母天冬氨酸蛋白酶3)与KEX2一样可以切断单个或两个氨基酸的C端或中间位点，然后连接到酵母细胞质的膜上，使得hPTH分解后分泌到酵母的培养基上。在这个推论的基础上，研究人员又构建了YAP3基因阻断酵母株(yap3Δ)，运用该株系构建了一个hPTH生产系统。通过在烧瓶里培养，发现这个生产系统有效性最高可达80％地防止hPTH的分解，因此可以大量地生产完整的hPTH分子(Kang et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，50，187(1998)；Korean Pat.No.0246932，yielded Dec.8，1999)。但是，尽管生产hPTH的效率要远比野生株系高出许多，人们又发现在高浓度培养基中培养的后期，YAP3Δ突变株却使得hPTH被大量分解(Song and Chung，Process Biochem 35，503(2000))，这表明在培养后期，hPTH不是被Yap3p所分解，而是被其他的蛋白酶所分解。有人报道在啤酒酵母中发现了天冬氨酸蛋白酶MKc7p，该酶的结构和功能类似于Yap3p(Komano and Fuller，Proc Natl AcadSci，USA，92，10752(1995))。研究人员创造了一个两个基因都被阻断的酵母株系(yap3Δ/mkc7Δ)用于观察在培养阶段末期中蛋白酶对hPTH分解的影响。但是并没有发现yap3Δ株与yap3Δ/mkc7A株有什么显著的区别(Choi，et al.，J.Microbiol Biotechnol 9，679(1999))。这些发现表明：MKc7p蛋白酶尽管与Yap3p有很高的同源性(53％同源性)，而且参与了在没有Kex2p作用的情况下对pro-a-mating因子的处理，但实际上并未对hPTH的分解起很大的作用。
通过最近揭示的有关啤酒酵母的基因组的分析，有人对YAP3(最近被称为YPS1)的同源基因进行了研究，发现除了PEP4和BAR1外还有三种新的基因编码未知的天冬氨酸蛋白酶(Olsen et al.，Biochem.J.339，407(1999))。假定象编码天冬氨酸蛋白酶的yapsin家系的新成员的YPS1和YPS2一样，这三个基因可以相应地命名为YPS3、YPS6、YPS7。YPS3与YPS1和YPS2有50％的同源性，YPS6与BAR1有35％的同源性，而YPS7与PEP4有25％的同源性。从YPS3与YPS1的同源性中，本发明的研究人员推断出在yps1Δ株系(前yap3Δ)培养过程末期，可能是yapsin3的作用，使得hPTH分解。
发明内容
基于现有技术状况，本发明的目的是提供一种蛋白表达系统，该表达系统可以高效生产hPTH。
本发明的另一个目的是提供一种高效生产hPTH的方法。
有了对hPTH后翻译(posttranslational)修饰的了解，使得我们能够进行修饰和改进，最后导致了本发明的产生。
通过对hPTH生物学方法生产的深入而详尽的研究，本发明的研究人员发现，yapsin基因的阻断会导致hPTH啤酒酵母重组体的内源性降解的显著下降。
本发明的一个方面是提供一种啤酒酵母突变株，其中YPS1基因和YPS3基因或者所有的YPS1、YPS2及YPS3基因都被阻断了。
本发明的另一个方面提供了一种用啤酒酵母突变株作为生产母体来生产hPTH的方法。
附图说明
通过参照下面的详细说明及附图，可以更好地理解本发明的目的、特征及有益效果。
图1.是构建一个用pop-out URA3选择性标记物阻断YPS3基因的DNA序列组件过程示意图。
图2.是阻断啤酒酵母YPS3基因及回收URA3选择性标记物过程示意图。
图3.是在培养24小时(a图所示)和48小时(b图所示)后，来自下列物质的培养物的hPTH分子的变性凝胶电泳SDS-PAGE图：啤酒酵母2805(第1条电泳泳道)，啤酒酵母2805/pG10-hPTH1(第2条电泳泳道和第3条电泳泳道)，啤酒酵母SY28Y3/pG10-hPTH1(第4条电泳泳道和第5条电泳泳道)，啤酒酵母SY28Y4/pG10-hPTH1(第6条电泳泳道和第7条电泳泳道)，(C)表示的是1μg的纯hPTH，(M)表示预染蛋白质分子量标记物，其中带i表示完整的hPTH(1-84a.a.)，带d1表示被截断的hPTH(27-84a.a.)，带d2代表hPTH(1-80a.a.)。
图4.在培养了24小时(a图所示)和48小时后(b图所示)，得自下列物质的培养物的hPTH分子变性凝胶电泳SDS-PAGE图：啤酒酵母L3262(第1条电泳泳道)，啤酒酵母L3262/pG10-hPTH1(第2条电泳泳道和第3条电泳泳道)，啤酒酵母SLH15/pG10-hPTH1(第4条电泳泳道和第5条电泳泳道)，啤酒酵母SLH16/pG10-hPTH1(第6条电泳泳道和第7条电泳泳道)，啤酒酵母SLH17/pG10-hPTH1(第9条电泳泳道和第9条电泳泳道)，啤酒酵母SLH18/pG10-hPTH1(第10条电泳泳道和第11条电泳泳道)，(C)表示的是1μg的纯hPTH的，(M)表示预染蛋白质分子量标记物，其中带i表示完整的hPTH(1-84a.a.)，带d1表示被截断的hPTH(27-84a.a.)，带d2代表hPTH(1-80a.a.)。
图5.是得自下列物质的培养物的hPTH分子的SDS-PAGE变性凝胶电泳图，它们已生长72小时，其间向培养基中不停地加半乳糖：啤酒酵母L3262(第1条电泳泳道)，YPS1/YPS3双基因缺陷型啤酒酵母L3262(a图所示)：啤酒酵母L3262/pG10-hPTH1(第2条电泳泳道到第7条电泳泳道)，啤酒酵母SLH11/pG10-hPTH1(第8条电泳泳道到第13条电泳泳道)，啤酒酵母L3262的YPS1/YPS2/YPS3三基因缺陷型啤酒酵母(b图所示)：啤酒酵母SLH16/pG10-hPTH1(第2条电泳泳道到第7条电泳泳道)，啤酒酵母SLH18/pG10-hPTH1(第8条电泳泳道到第13条电泳泳道)，(C)表示的是1μg的纯hPTH，(M)表示的是预染蛋白质分子量标记物，带i表示完整的hPTH(1-84a.a.)带d1表示被截断的hPTH(27-84a.a.)，带d2代表hPTH(1-80a.a.)。
具体实施方式
本发明涉及一种用酵母宿主细胞生产重组hPTH的方法，该酵母宿主细胞不能生产蛋白酶yapsin家系YPS1、YPS2、YPS3中至少一种蛋白。
蛋白酶Yapsin1(以下简称为YPS1)，Yapsin2(以下简称为YPS2)或Yapsin3(以下简称为YPS3)具有外蛋白酶活性，可以将hPTH的C端或N端残基切除，因而使得从酵母细胞中很难生产完整的hPTH分子。从而，本发明包括了一种用酶母突变株作为宿主细胞高产量地生产完整的hPTH分子的方法，该突变株的特点是不能表达三种蛋白酶YPS1、YPS2及YPS3中的至少一种。
人们认为在生产hPTH过程中，YPS1和YPS2主要是在培养转化株的早期阶段起作用，而YPS3则主要在晚期培养阶段有分解hPTH的作用。在YPS1基因阻断的yps1Δ菌株中，由于没有YPS1的作用，在培养的早期阶段可以大量回收hPTH。但由于YPS3的蛋白水解酶作用，使得在培养后期收获的hPTH量就很少了。
因此，为了在整个培养酵母宿主的过程中提高hPTH的产量，优选地，我们使用了YPS1和YPS3缺陷型突变株(yps1Δ/yps3Δ)，更优选地是用YPS1、YPS2和YPS3三基因缺陷型突变株(yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ)同时作为宿主细胞。
通过使用一种选择性酶标记物，可以从含有YPS1、YPS2及YPS3基因的组中阻断至少一个基因就可以使相应的酶缺失。
该酵母选择性标记物无需特别的限制，但是优选的是能够进行pop-out的标记。本发明的一个优选的实施方案中，我们使用一个盒式的URA3的选择性标记物，这个pop-out试剂盒包括一种酵母选择性标记物，该标记物含有编码YPS1、YPS2及YPS3的N端和C端的基因片段，这样酶母基因组中靶基因如yps1、yps2及yps3就可以用同源重组的方法被阻断。任何可以筛选这种酵母的选择性标记物都可以应用。在这里，运用URA3选择性标记物阻断yps3基因得到的突变株yps3Δ标记为yps3∷URA3。
按照本发明，一个hPTH基因是由一个表达载体运载到酵母中的。因此，本发明涉及一个有hPTH基因镶嵌的重组表达载体。这个适用于本发明的表达载体具有在酵母中表达基因以及控制表达过程的手段。载体的选择及重组载体的构建对于本领域的技术人员来说是显而易见的，因此将在下面的实施例中具体地描述。
另一方面，本发明涉及一个转化株，该转化株是由yps1Δ/yps3Δ或yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ酵母突变株和重组表达载体制备的。
在本发明的一个优选实施例中，重组载体pG10-hPTH1被转化到啤酒酵母突变株系(yps1Δ/yps3Δ及yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ)中，以制备成转化株SLH16/pG10-hPTH及SLH18/pG10-hPTH，该转化株保存在韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)韩国典型培养物保藏中心，保藏号分别为KCTC0815BP和KCTC0816BP，保藏日均为2000年7月6日。
下面将要阐明的实施例将会使人们对本发明有一个更加深入的理解，但是下面的实施例绝非是对本发明的限制。
                        实验菌株及质粒
为了在啤酒酵母中表达hPTH，我们选择了质粒pG10-hPTH1，该质粒含有一个由GAL10启动子∷ppL∷hPTHdb？∷GAL7终止子组成的hPTH表达DNA序列组件，(Chung and Park，Biotechnol.Bioeng.57,245(1998))。一个由来源于pTcUR3的1.8kb的BamHI片断制成一个pop-outURA3选择性标记物(URA3∷tc5)盒(kang et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，575-582(2000))。制备YPS3-缺陷型啤酒酵母使用的亲本细胞是啤酒酵母2805和啤酒酵母L3262a(Kang et al.，J.Microbiol.Biotechnol.，8，42-48(1998))。还有，本发明使用的细胞是酵母菌株SLH11(Kang et al.，Appl.Micribiol.Biotechnol.，59，187(1998))，SLH12及SLH14(Choi et al.，J.Biosci.Bioengin.，89，77(2000))，上述三个菌株都是YPS1基因(以前称为YAP3)缺陷或是YPS2基因(以前称为MKC7)缺陷，或是两个基因都缺陷。上述酵母菌株的生物学特征总结在下面的表1中。
                                 表1
                       本发明使用的啤酒酵母菌株
  菌株                       特征描述/基因类型
2805                           亲本株(MATa pep4∷His3 prb-Δ1.6R can1 his3-20 ura3-52)
  S2SY3                 酵母2805的yps1-缺陷型菌株(MATa pep4∷His3 prb-Δ1.6R can1 his3-20 ura3-52 yps1∷tc5)
  L3262                           亲本株(MATa ura3-52 leu2-3，112 his4-34)
  SLH11                 酵母L3262的yps1-缺陷型菌株(MATa ura3-52 leu2-3，112 his4-34 yps1∷LEU2)
SLH12                 酵母L3262的yps2-缺陷型菌株(MATa ura3-52 leu2-3，112 his4-34 yps2∷LEU2)
SLH14                 酵母L3262的yps3-缺陷型菌株(MATa ura3-52 leu2-3，112 his4-34 yps1∷HIS4 yps2∷LEU2)
                    培养基组成及培养条件
当用URA3盒转化酵母株来阻断YPS3基因、或是用表达载体pG10-hPTH1转化酵母株的时候，我们使用的是仅在尿嘧啶呈缺陷型的合成培养基SC-URA。为了从获得的yps3∷URA3突变株回收URA选择性标记物，使用的是一种5-FOA(5-fluorotate)培养基(Adams et al.，Methods in yeast genetics.Cold Spring Harbor Laboratory Press，[1997].)。为了用于在启动子GAL10控制下诱导hPTH表达过程，使用的培养基是YPDG(酵母提取物1％，Bacto蛋白胨2％，葡萄糖1％，半乳糖1％)，培养物在该培养基上生长48小时。实施例1 构建YPS3-缺陷型酵母突变株
图1所示，构建一个包含URA3盒的重组载体，该为了是用于阻断YPS3基因的。
导致YPS3基因阻断的同源性重组所需要YPS3基因的N端和C端片段是由PCR反应(聚合酶链式反应)通过使用两对引物来合成的，这两对引物是根据GenBank中注册的啤酒酵母的序列合成的。为了便于以后的基因操作，用于扩增N端片段的一组引物(5’-GAC GAATTCCAGAAACGTCTGAGTGGAG-3’及5’-GCA GGATCCGTACTCTACCGAATGCCG-3’)被设计成分别在其5′-端具有EcoRI和BamHI限制性识别性位点(下划线位置)，而扩增C端片段的一组引物5’-CGC GGATCCCTATGCAGACCAGTGTGG-3’及5’-CGC TCTAGACTGCATGCAAGGTCTGAC-3’)则在其5′-端具有BamHI和XbaI的限制性位点(下划线位置)。PCR反应是在热循环的环境下进行的，比如Perkin Elmer公司制造的PCR仪＂GeneAmp PCR 2400＂，具有25个热循环周期，每一个热循环周期都包括95℃/30秒的变性过程，55℃/30秒的温热过程，以及72℃/30秒的延伸过程，这样就可以从啤酒酵母基因组中分别制备编码YPS3基因的N端和C端区域的一个800个碱基和一个700个碱基的DNA片段。该PCR产物、即YPS3基因的N端和C端片段分别被限制性酶EcoRI/BamHI和BamHI/Xba两次切割，然后把切割完的产物连接到之前已经被EcoRI/XbaI处理过的载体pBluescriptII KS(+)(Stratagen公司生产)上。在位于上述重组载体pB-YPS3NC的两端片段的BamHI识别位点上，使用URA3 pop-out选择性标志，就构建出了用于阻断YPS3基因的pB-yps3∷URA3：tc5载体。
下一步，如图2所示，使用URA3弹夹来阻断啤酒酵母的YPS3基因，然后回收URA3选择性标记物。
详细地，把经过限制性酶EcoRI/XbaI处理载体pB-yps3∷URA3：tc5后得到的DNA片段转染到啤酒酵母株系2805，L3262a，SLH11(yps1Δ)，SLH12(yps2Δ)及SLH14(ypsΔ/yps2Δ)中，然后在SC-URA筛选培养基上初步筛选Ura+转化株。然后进行PCR反应来检测该Ura+转化株中是否阻断了YPS3基因，然后把筛选出的yps3∷URA3：tc5转化株涂到5-FOA板上，筛选通过同源性重组技术得到的URA3基因pop-out的yps3∷tc克隆。
然后再用PCR来标识在最后得到的yps3Δ突变株中的YPS3基因阻断，以得到yps3缺陷株S28Y4，SLH15，SLH16，SLH17以及SLH18，上述菌株的其他yapsin蛋白酶基因也有可能是有缺陷的。这些突变株的特征总结在下面的表2中。
                                表2
                         Yps3缺陷型酵母株系
株系                            特征描述/基因类型
S28Y4                      酵母2805的yps3-缺陷型菌株(MATa pep4∷His3 prb-Δ1.6R canl his3-20 ura3-52 yps3∷tc5)
SLH15                      酵母L3262的yps3-缺陷型菌株(MATa ura3-52 leu2-3，112 his4-34 yps3∷tc5)
SLH16                酵母L3262的yps1/yps3-双基因缺陷型菌株(MATa ura3-52 leu2-3，112 his4-34 yps1∷LEU2 yps3∷tc5)
SLH17                酵母L3262的yps2/yps3-双基因缺陷型菌株(MATa ura3-52 leu2-3，112 his4-34 yps2∷HIS4 yps3∷tc5)
SLH18             酵母L3262的yps1/yps2/yps3-三基因缺陷型菌株(MATa ura3-52 leu2-3，112 his4-34 yps1∷LEU2 yps2∷HIS4 yps3∷tc5)
实施例2：构建表达hPTH的重组酵母菌株及对表达hPTH的分析
用表达载体PG10-hPTH1转化野生型啤酒酵母2805、L3262以及啤酒酵母突变株S28Y4，SLH15(yps3Δ)，SLH16(yps1Δ/yps3Δ)，SLH17(yps2Δ/yps3Δ)及SLH18(yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ)，然后筛选Ura+转化株。对这些能够表达hPTH的重组酵母菌株进行分析。
将这些酵母突变株在选择性最低的培养液(氨基酸缺陷型酵母氮基0.67％，葡萄糖2％，酪蛋白氨基酸0.5％)中，在30℃的环境下预培养24小时。取每种培养物的2％，接种到YPDG培养基(酵母提取物1％，bacto蛋白胨2％，葡萄糖1％，半乳糖1％)中，然后在30℃的条件下培养48小时。在培养过程中，分别在24小时和48小时时提取样品。每个样品取500μl，在5000rpm的条件下离心5分钟，以便获取上清液。在上清液中分别加入占上清液1/10体积的DOC(脱氧胆酸)和TCA(三氯乙酸)，在0℃下保存30分钟，沉淀蛋白质。在12000rpm条件下离心10分钟，产生一个球状物，用丙酮冲洗，去掉残存在沉淀蛋白质中的TCA溶液，然后溶于25μl的裂解缓冲液中，在100℃加热5分钟，获得胞外蛋白片段。取10μl的胞外蛋白片段置于15％聚丙烯酰胺凝胶上(pH8.8，10厘米宽，8cm长，0.7mm厚)电泳1.5小时(125V和25毫安)。凝胶上跑的蛋白可以通过染上考马斯蓝来观察。样品的24小时电泳结果如图3a所示，样品的48小时电泳结果如图3b所示。
从电泳照片可以看到，这些啤酒酵母株分泌的重组hPTH在变性凝胶电泳SDS-PAGE上分离出来，显现出三条带：i代表完整的蛋白质分子(1-84)；d1代表N端被截断的蛋白质分子(27-84)；d2代表C端被截断的蛋白质分子(1-80)。把位于i带和d1带的蛋白质放到一个聚二氟乙烯(PVDF)膜上。通过借助Milligen/Biosearch M600蛋白测序仪可以测定i和d1带上该蛋白质N端区域的N端氨基酸序列分别为Ser-Val-Ser-Glu-Ile和Lys-Leu-Gln-Asp-Val，这就表明，i带的hPTH是完整的蛋白质分子，而d1带的hPTH是被截断的分子(27-84)，该hPTH分子缺少N端的26个氨基酸残基。至于d2带上的蛋白质，尽管其电泳带显示为14kDa，分子量大于完整的hPTH分子，但是通过高性能液体色谱(HPLC)、MALDI质谱及C端氨基酸测序，却发现该hPTH分子在C端被截断(1-79，80)，缺少4到5个氨基酸残基。据报道，导致该电泳结果的原因是hPTH分子的C端被剪切，从使得了该蛋白质构象发生了变化(Vad et[AL.，]Protein Expr.Purif.13：396-402(1998))。实施例3：hPTH在Yapsin蛋白酶缺陷型突变株中的表达形式
为了检测阻断YPS1基因和YPS3基因对于hPTH表达的影响，我们对没有经过转化的野生型啤酒酵母2805、转化过的啤酒酵母突变株2805/pG10-hPTH1、转化过的yps1Δ突变株S28Y3/pG10-hPTH1、及转化过的yps3Δ突变株S28Y4/pG10-hPTH1所分泌的hPTH分子进行变性电泳SDS-PAGE。电泳结果如图3所示。
从电泳图像中可以看出来，经过转化的野生型菌株中没有表达hPTH分子(如电泳泳道1所示)。在转化过的野生型2805株中表达了大约50％或更多的hPTH分子，该hPTH分子是以被截断的d1带的形式存在的(如电泳泳道3和带4所示)。就yps1Δ的突变株S28Y3而言，在培养24小时后，分泌到介质中的hPTH分子仅占hPTH总量的5％或者更少。相反，在培养了48小时后，我们发现大约有总量的30-40％的hPTH以d1带的形式存在。仅仅阻断了YPS3基因的突变株S28Y4与转化的野生型菌株在hPTH表达形式上却没有什么差别：在培养了24小时之内有大约50％或更多的hPTH以被截断的形式分泌出来。
结合这些和在图3所示的试验结果，表明在培养早期，可以引起hPTH剪切的主要的蛋白酶是Yapsin1，而在培养过程后期起作用的则是除了Yapsin1以外的其他的蛋白酶。然而，在仅仅阻断了YPS3基因的菌株中，并没有发现很显著的变化，其原因是在培养过程早期，Yapsin1酶已经大量地剪切了hPTH。
相应地，我们把YPS3基因和其余Yapsin家系的基因YPS1和YPS2一起进行了阻断，对hPTH的表达形式进行了试验。在本试验中，以未经转化过的野生型的啤酒酵母L3262为对照，经过转化的酵母L3262/pG10-hPTH1，转化的yps3Δ突变株SLH15/pG10-hPTH1，转化的yps1Δ/yps3Δ突变株SLH16/pG10-hPTH1，转化的yps2Δ/yps3Δ突变株SLH17/pG10-hPTH1及转化的yps1Δ/yps2Δ/yps2Δ突变株SLH18/pG10-hPTH1中都表达了hPTH。与上述试验一样，对这些分泌的蛋白也进行了电泳，温育24小时后样品的电泳结果如图4a所示，温育48小时后样品电泳结果如图4b所示。
从图4可以看出，在培养了24小时后，在非经转化的菌株中没有产生hPTH(如电泳泳道1所示)。而在转化的野生型菌株(如电泳泳道2和3所示)、YPS3缺陷型菌株(如电泳泳道4和5所示)、YPS2和YPS3双基因缺陷型菌株(如电泳泳道6和7所示)中有约产生50％的hPTH产生，以N端截断d1带的形式存在。48小时后，我们发现hPTH的剪切现象愈加严重，截断的hPTH的比例在上升。另一方面，有趣的是，在培养48小时，发现YPS1和YPS1双基因缺陷型突变株中没有hPTH产生(如电泳泳道6和7所示)，而YPS1，PYS2，YPS3三基因缺陷型菌株中则有N端截断的d1带形式的hPTH产生(如电泳泳道10和11所示)。而且，试验显示，YPS1和YPS3双基因缺陷菌株分泌的截断的蛋白(d2带)约占总蛋白量的20％，而在培养YPS1/YPS2/YPS3三基因缺陷型菌株48小时之后，仍可以看到i带的完整的hPTH分子。这些结果结合起来表明，野生型酵母菌的hPTH降解问题可以通过阻断YPS1/YPS2/YPS3三个基因得到的突变株来解决。实施例4：在高浓度的培养基中hPTH的表达形式
我们进行了一项试验，以检测我们上面试验所得到yapsin蛋白酶缺陷型突变株所产生的hPTH是否可以承受蛋白质水解作用。在这个实验中，我们在烧杯中不断地加入半乳糖以模仿发酵罐中高浓度培养基的环境。在YPDG肉汤中保温培养了24小时后，这些菌株又培养了72小时，在72小时这段时间中，要每24小时加入半乳糖以保持肉汤中半乳糖的浓度为2％。
在这种情况下，以未经转化的野生型啤酒酵母L3262作为对照，转化的L3262/pG10-hPTH1，转化的yps1Δ突变株SLH11/pG10-hPTH1，转化的yps1Δ/yps3Δ突变株SLH16/pG10-hPTH1，以及转化的yps1Δ/yps2Δ/yps2Δ突变株SLH18/pG10-hPTH1中都有hPTH的产生。把分泌的蛋白以上面同样的方式进行电泳，L3262/pG10-hPTH1菌株和SLH11/pG10-hPTH1菌株的电泳结果如图5a所示，SLH16/pG10-hPTH1株和SLH18/pG10-hPTH1株的电泳结果如图5b所示。
如图5所示，野生型酵母在培养了24小时后收获的hPTH(图5a中电泳泳道2-7所示)差不多约有50％已经以N端截断d1的形式存在。另一方面，在不断添加半乳糖的高浓度培养基中，培养YPS1Δ缺陷型突变株(如图5a中电泳泳道8-13所示)和YPS1Δ/YPS3Δ双基因缺陷型突变株(如图5b电泳泳道2-7所示)，24小时hPTH并没有发生降解，而在培养了48小时后却发生了显著的降解反应。相反，当培养达到72小时的时候，所收集到的YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ突变株培养物中(如图5b中电泳泳道8-13所示)没有N端被截断的d1形式的hPTH分子，相反却发现完整的hPTH分子(i带)的数量在明显地增长。在培养了144小时后，该三基因缺陷型突变菌的培养物中并没有发现截断形式的hPTH分子产生。这个试验结果清楚地表明在高浓度培养的后期，hPTH的降解问题可以通过运用阻断YPS1，YPS2和YPS3基因的突变体来得以解决。
如以上所述，所制备的Yapsin1(以前称YPA3)基因和Yapsin3基因的缺陷型酵母突变株(YPS1Δ/YPS3Δ)，或者三个基因Yapsin1，Yapsin2(以前称MKC7)以及Yapsin3的基因缺陷型酵母突变株(YPS1Δ/YPS2Δ/YPS3Δ)可以高产量地分泌完整的用于治疗多种不适症的hPTH分子，这是由于它们不能降解激素的肽链所致。
上面对本发明进行了直观描述。文中使用的术语是为了切合对本发明的描述，而不是为了进行限制。根据上面的教导，可以对本发明进行多种改进和变化。因此，在后附的权利要求定义的范围内，可以以不同于本文中所具体描述的方式实施本发明。
关于用于专利程序的微生物保藏的国际相互承认的布达佩斯条约
                 原始保藏的收据(译文)致：李相琪(RHEE.Sang Ki)
Ga-101.Geukdong Villa，Gwangjang-dong，Gwangjin-ku，Seoul 143-210，韩国汉城
I.微生物的定义
保藏人所提供的申请保藏菌株：Saccharomyces           cerevisiaeSLH16/pG10-hPTH 保藏机构出具的保藏号：KCTC 0815BP
II.科学描述和/或建议的分类命名
与I中所定义的微生物同时提交的文件：[×]一份科学的描述；[  ]建议的分类命名；(对适用的情况划×)
III.收据和受理
该国际保藏机构接受于2000年6月30日所收到的上述I中所定义的微生物。
IV.请求转变保藏的收据
    上述I中所定义的微生物已由该国际保藏机构在时收到，将原始保藏转变为符合布达佩斯条约的保藏的请求也于收到。
V.国际保藏机构
名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)韩国 大田 该国际保藏机构的授权代表的签字BAE.Kyung Sook，主任日期：2000年7月6日
关于用于专利程序的微生物保藏的国际相互承认的布达佩斯条约
                原始保藏的收据(译文)致：李相琪(RHEE.Sang Ki)
Ga-101.Geukdong Villa，Gwangjang-dong，Gwangjin-ku，Seoul 143-210，韩国汉城
I.微生物的定义
保藏人所提供的申请保藏菌株：Saccharomyces             cerevisiaeSLH18/pG10-hPTH 保藏机构出具的保藏号：KCTC 0816BP
II.科学描述和/或建议的分类命名
与I中所定义的微生物同时提交的文件：[×]一份科学的描述；[  ]建议的分类命名；(对适用的情况划×)
III.收据和受理
该国际保藏机构接受于2000年6月30日所收到的上述I中所定义的微生物。
IV.请求转变保藏的收据
    上述I中所定义的微生物已由该国际保藏机构在时收到，将原始保藏转变为符合布达佩斯条约的保藏的请求也于收到。
V.国际保藏机构
名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)韩国 大田 该国际保藏机构的授权代表的签字BAE.Kyung Sook，主任日期：2000年7月6日

Claims (8)

1.一种用酵母宿主细胞生产重组的人甲状旁腺激素(hPTH)的方法，包括以下步骤：
使酵母宿主细胞进行缺陷型突变，即阻断酵母细胞中能编码蛋白酶yapsin家系Yapsin1，Yapsin2和Yapsin3的至少一个基因；
用载有一个编码人的甲状旁腺激素的基因的表达载体转化酵母宿主细胞，且
在适宜的培养基中培养该转化的酵母宿主细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中该缺陷型突变是通过使用一种酵母选择性标志物来阻断能编码蛋白酶yapsin家系Yapsin1，Yapsin2和Yapsin3的至少一个基因而实现的。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中酵母宿主细胞在YPS1和YPS3基因上被阻断。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中酵母宿主细胞在YPS1、YPS2和YPS3基因上被阻断。
5.一种酵母菌株，是由载有人的甲状旁腺激素的一个基因的表达载体转化酵母yps1Δyps3Δ突变株构建的。
6.如权利要求5所述的酵母菌株，其中该酵母菌株是啤酒酵母SLH16/pG10-hPTH(菌种保藏号为KCTC 0815BP)，表达载体为pG10-hPTH1。
7.一种酵母菌株，是由载有人的甲状旁腺激素的一个基因的表达载体转化酵母yps1Δyps2Δyps3Δ突变株构建的。
8.如权利要求7所述的酵母菌株，其中该酵母菌株是啤酒酵母SLH18/pG10-hPTH(菌种保藏号为KCTC 0816BP)，表达载体为pG10-hPTH1。
CN01814919A 2000-08-31 2001-08-27 生产重组人的甲状旁腺激素的酵母转化株及其用于生产该激素的方法 Pending CN1449441A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2000-0051267A KR100386836B1 (ko) 2000-08-31 2000-08-31 재조합 인체 부갑상선 호르몬을 생산하는 형질전환효모 및재조합 인체 부갑상선 호르몬의 생산방법
KR2000/0051267 2000-08-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1449441A true CN1449441A (zh) 2003-10-15

Family

ID=36829916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN01814919A Pending CN1449441A (zh) 2000-08-31 2001-08-27 生产重组人的甲状旁腺激素的酵母转化株及其用于生产该激素的方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7244591B2 (zh)
EP (1) EP1313848B1 (zh)
JP (1) JP3957630B2 (zh)
KR (1) KR100386836B1 (zh)
CN (1) CN1449441A (zh)
AU (1) AU2001280242A1 (zh)
DE (1) DE10196565B4 (zh)
ES (1) ES2258371B1 (zh)
GB (1) GB2381273B (zh)
WO (1) WO2002018570A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2258371B1 (es) * 2000-08-31 2007-05-16 Dong Kook Pharmaceutical Co. Ltd. Levadura transformante productora de hormona paratiroidea humana y procedimiento para producir la hormona.
KR100470978B1 (ko) * 2003-01-02 2005-03-10 한국생명공학연구원 앱신 다중 결손 효모 변이 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법
DE60325906D1 (de) 2003-08-08 2009-03-05 Amgen Fremont Inc Antikörper gegen parath-hormon (pth) und ihre verwendungen
US7318925B2 (en) * 2003-08-08 2008-01-15 Amgen Fremont, Inc. Methods of use for antibodies against parathyroid hormone
DE602006018634D1 (de) 2005-08-03 2011-01-13 Asahi Glass Co Ltd Transformierte Hefezellen UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON FREMDPROTEIN
WO2008120107A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Oxyrane (Uk) Limited Glycosylation of molecules
EP2483399B1 (en) 2009-09-29 2019-03-27 Universiteit Gent Hydrolysis of mannose-1-phospho-6-mannose linkage to phospho-6-mannose
US20130053550A1 (en) 2009-11-19 2013-02-28 Oxyrane Uk Limited Yeast strains producing mammalian-like complex n-glycans
WO2012042386A2 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Oxyrane Uk Limited Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins
SG189110A1 (en) 2010-09-29 2013-05-31 Oxyrane Uk Ltd De-mannosylation of phosphorylated n-glycans
US20150031081A1 (en) * 2011-12-30 2015-01-29 Oxyrane Uk Limited Methods and materials for reducing degradation of recombinant proteins
EP2825193B1 (en) 2012-03-15 2019-11-13 Oxyrane UK Limited Methods and materials for treatment of pompe's disease
WO2023215221A2 (en) * 2022-05-02 2023-11-09 North Carolina State University Engineered microorganisms with enhanced protein expression and secretion

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5420242A (en) * 1986-10-22 1995-05-30 Kaare M. Gautvik Production of human parathyroid hormone from microorganisms
EP0604706A1 (en) * 1986-10-22 1994-07-06 GAUTVIK, Kaare M., Dr. Production of human parathyroid hormone from microorganisms
KR100246932B1 (ko) * 1997-09-12 2000-03-15 박호군 Yap3 유전자가 결손된 신규한 효모균주 및 그를 이용한 재조합 인체 부갑상선호르몬의 생산
WO1999037758A2 (en) * 1998-01-27 1999-07-29 The Board Of Regents Of The University And Community College System Of Nevada On Behalf Of The University Of Nevada-Reno Expression of proteolytically-sensitive peptides
ES2258371B1 (es) * 2000-08-31 2007-05-16 Dong Kook Pharmaceutical Co. Ltd. Levadura transformante productora de hormona paratiroidea humana y procedimiento para producir la hormona.

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002018570A1 (en) 2002-03-07
GB2381273B (en) 2004-12-22
EP1313848B1 (en) 2006-07-05
JP2004507270A (ja) 2004-03-11
EP1313848A1 (en) 2003-05-28
DE10196565T1 (de) 2003-07-03
ES2258371A1 (es) 2006-08-16
KR20020017754A (ko) 2002-03-07
US20040029252A1 (en) 2004-02-12
JP3957630B2 (ja) 2007-08-15
US7244591B2 (en) 2007-07-17
AU2001280242A1 (en) 2002-03-13
GB2381273A (en) 2003-04-30
GB0303081D0 (en) 2003-03-19
ES2258371B1 (es) 2007-05-16
DE10196565B4 (de) 2007-02-01
KR100386836B1 (ko) 2003-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116948013B (zh) 重组小分子胶原蛋白及其表达系统与制备方法
EP1930428B1 (en) transformed yeast host cells AND METHOD OF PRODUCING FOREIGN PROTEIN
US8114632B2 (en) Method of producing biologically active polypeptide having insulinotropic activity
CN1449441A (zh) 生产重组人的甲状旁腺激素的酵母转化株及其用于生产该激素的方法
EP0438200A1 (en) Method for the expression of heterologous genes in the yeast Pichia pastoris, expression vectors and transformed microorganisms
CN105601720A (zh) 一种可有效提高蛋白分泌表达效率的信号肽及其应用
KR20040002806A (ko) 한세눌라 폴리모르파 앱신 유전자 결손 변이주 및 이를이용한 재조합 단백질 생산 방법
Egel-Mitani et al. Yield improvement of heterologous peptides expressed in yps1-disrupted Saccharomyces cerevisiae strains
EP0399455B1 (en) Stably transformed yeast host cells and their use for the production of albumin
CN113249241B (zh) 一种酿酒酵母蛋白酶缺失菌株的构建及其应用
CN118755746A (zh) 重组质粒、构建方法及μ-芋螺毒素肽的原核表达方法
CN109852601B (zh) 一种可高效应用的n-糖基化褐藻胶裂解酶突变体及基因工程菌构建方法
JP5148879B2 (ja) 難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ｔｆｐ）を明らかにする方法、タンパク質融合因子（ｔｆｐ）ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法
CN117925430A (zh) 一种抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用
Verripsab et al. From gene to product in yeast: production of fungal cutinase
KR20040062304A (ko) 앱신 다중 결손 효모 변이 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법
CN117777276B (zh) 一种促进马克斯克鲁维酵母分泌表达人乳铁蛋白的方法
KR100246932B1 (ko) Yap3 유전자가 결손된 신규한 효모균주 및 그를 이용한 재조합 인체 부갑상선호르몬의 생산
US8956848B2 (en) UBP1 protease mutant, and its coding sequence, their application and methods of production
CN1954083B (zh) 用于生产重组蛋白的翻译融合伙伴的快速筛选方法和由此筛选的翻译融合伙伴
CN1309712A (zh) 在转化的酵母细胞中生产蛋白质的方法
JP2521240B2 (ja) プロモ―タ―
JP2521239B2 (ja) 分泌配列
CN114702560A (zh) 一种钝齿棒杆菌表面蛋白Ncgl1337及其在表面展示系统中的应用
CN117757778A (zh) 高比活的牛源肠激酶轻链突变体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20031015