CZ135797A3 - Virový materiál a nukleotidové fragmenty asociované s roztroušenou sklerozou užitečné pro diagnostické, preventivní a terapeutické účely - Google Patents
Virový materiál a nukleotidové fragmenty asociované s roztroušenou sklerozou užitečné pro diagnostické, preventivní a terapeutické účely Download PDFInfo
- Publication number
- CZ135797A3 CZ135797A3 CZ971357A CZ135797A CZ135797A3 CZ 135797 A3 CZ135797 A3 CZ 135797A3 CZ 971357 A CZ971357 A CZ 971357A CZ 135797 A CZ135797 A CZ 135797A CZ 135797 A3 CZ135797 A3 CZ 135797A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- nucleotide
- msrv
- sequences
- Prior art date
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 216
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims description 215
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 92
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims description 39
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims description 31
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 11
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 title description 2
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 150
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 128
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 111
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 111
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 101
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 70
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 64
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 64
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 64
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 57
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 48
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 39
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 38
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 38
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 claims description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 37
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 31
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 claims description 30
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 29
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 28
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 26
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 25
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 23
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 23
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 19
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 17
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 claims description 17
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 14
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 claims description 14
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 10
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 9
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 8
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 4
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 119
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 67
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 57
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 45
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 39
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 36
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 34
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 27
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 27
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 21
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 19
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 17
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 15
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101100224485 Arabidopsis thaliana POL2B gene Proteins 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101100170950 Methanocella arvoryzae (strain DSM 22066 / NBRC 105507 / MRE50) polC gene Proteins 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 10
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 10
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 9
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- QPJSUIGXIBEQAC-UHFFFAOYSA-N n-(2,4-dichloro-5-propan-2-yloxyphenyl)acetamide Chemical compound CC(C)OC1=CC(NC(C)=O)=C(Cl)C=C1Cl QPJSUIGXIBEQAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004437 Endogenous Retroviruses Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical class C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 2
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241001484259 Lacuna Species 0.000 description 2
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- -1 phenylacetamidomethyl Chemical group 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 244000000066 protist pathogen Species 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000007419 viral reactivation Effects 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 5-methyl-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 6-(4-aminophenyl)sulfonylpyridin-3-amine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=N1 XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZXKNLCPUNZPFGY-LEWSCRJBSA-N Ala-Tyr-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N ZXKNLCPUNZPFGY-LEWSCRJBSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 241000813323 Maize streak Reunion virus Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150078890 POLG gene Proteins 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical group [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000677647 Proba Species 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- OWCVUSJMEBGMOK-YUMQZZPRSA-N Ser-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O OWCVUSJMEBGMOK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N Thr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 230000006690 co-activation Effects 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- AQEFLFZSWDEAIP-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl ether Chemical compound CC(C)(C)OC(C)(C)C AQEFLFZSWDEAIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- GEUFMGZEFYJAEJ-UHFFFAOYSA-N tris(2-methylpropyl)silicon Chemical compound CC(C)C[Si](CC(C)C)CC(C)C GEUFMGZEFYJAEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
Description
TV
Virový materiál a nukleotidové fragmenty asociované s roztroušenou sklerojtou užitečné pro diagnostické, preventivní a terapeutické účely
Oblast techniky
Roztroušená sklerosa (MS) je demyelinizační onemocnění centrálního nervového systému (CNS), jehož příčina doposud zůstává neznámá.
Mnoho studií podporuje hypotesu virové etiologie onemocnění, ale žádný z testovaných virů nebyl prokázán jako zamýšlené příčinné agens: souhrn virů uvažovaných během několika let u MS sestavili E.Norby (1) a R.T. Johnson (2).
Nově byl izolován retrovirus odlišný od známých lidských retrovirů od pacientů trpících MS (3, 4 a 5). Autoři byli také schopni ukázat, že tento retrovirus může být přenesen in vitro, že pacienti trpící MS produkují protilátky schopné rozpoznat proteiny asociované s infekcí leptomeningeálních buněk tímto retrovirem a že pozdější exprese může být silně stimulována okamžitými časnými geny některých herpes virů (6) .
Všechny tyto výsledky ukazují na roli alespoň jednoho neznámého retrovirů nebo virů u MS, kde tyto viry mají aktivitu reversní transkriptasy, která je detekovatelná podle metody, kterou publikoval H. Perron (3) a která je kvalifikována jako ”LM7-like RT aktivita. Obsah publikace označené (3) je do předkládaného vynálezu vložen jako odkaz.
«HÍ
Novestudie provedené přihlašovateli umožnili, že mohly být získány dvě kontinuální buněčné linie infikované přirozenými izoláty pocházejícími od dvou různých pacientů trpících MS kultivační metodou popsanou v dokumentu WO-A-93/20188, jehož obsah je v předkládaném vynálezu uveden jako odkaz. Tyto dvě buněčné linie, odvozené od buněk lidského chorioidálního plexu, označené LM7PC a PLI-2, byly uskladněny v ECACC 22.7.1992 a 8.1.1993, v příslušném pořadí, pod čísly 92072201 a 93010817, v souladu s podmínkgmi Budapešťské smlouvy. Kromě toho, virové izoláty mající LM7-like RT aktivitu byly také uskladněny v ECACC pod souhrnným označením kmeny. Kmen nebo izolát nesený na PLI-2 linii, označený POL-2, byl uskladněn v ECACC 22.7.1992 pod číslem V92072202. Kmen nebo izolát nesený na LM7PC linii, označený MS7PG, byl uskladněn v ECACC 8.1.1993 pod číslem V93010816.
Od kultur a izolátů uvedených výše, charakterizovaných biologickými a morfologickými kriterii, byl dalším krokem pokus o charakterizaci materiálu nukleových kyselin asociovaných s virovými částicemi produkovanými v těchto kulturách.
Část genomu, která již byla charakterizována, byla použita pro vývoj testů pro molekulární detekci virového genomu a imunoserologických testů, za použití aminokyselinových sekvencí kódovaných sekvencemi nukleotidů virového genomu, aby se detekovala imunitní odpověď namířená proti epitopům asociovaným s infekcí a/nebo s virovou expresí.
Tyto prostředky umožnily, aby byla potvrzena asociace mezi MS a expresí sekvencí identifikovaných u pacientů citovaných dále. Nicméně, virový systém objevený přihlašovateli je ve vztahu ke • · komplexnímu retrovirovému systému. Ve skutečnosti, sekvence, které byly nalezeny uzavřeny v extracelulárních virových částicích produkovaných různými kulturami buněk od pacientů trpících MS jasně ukázaly, že zde existuje společné umístění retrovirových genomů, které jsou příbuzné, ale odlišné od přirozeného retrovirového genomu, který produkuje infekční virové částice. Tento fenomén byl pozorován mezi replikativními retroviry a mezi endogenními retroviry patřícími do stejné rodiny, nebo i mezi heterologními retroviry. Zazanamenání endogenních retrovirů je velmi významné v kontextu našeho objevu, protože, v případě MSRV-1 bylo pozorováno, že endogenní retrovirové sekvence obasahující sekvence homologní k MSRV-1 genomu existují v normální lidské DNA. Existence endogenních retrovirových elementů (ERV) příbuzných k MSRV-1 v celém nebo v části jejich genomu vysvětluje skutečnost, že exprese MSRV-1 retrovirů v lidských buňkách je schopná interagovat s blízce příbuznými endogenními sekvencemi. Tyto interakce j sou nacházeny v případě patogenních a/nebo infekčních endogenních retrovirů (například některých ekotropních kmenů viru myší leukemie), a v případě exogenních retrovirů, jejichž nukleotidová sekvence může být nacházena částečně nebo plně, ve formě ERV, v genomu hostitelského zvířete (např. myší exogenní virus mamárního tumoru přenášený mlékem). Tyto interakce se skládají zejména z (i) transaktivace nebo koaktivace ERV replikativním retrovirem, (ii) a nelegitimní enkapsidace RNA příbuzné k ERVS, nebo ERV - nebo i buněčné RNA - která jednoduše nese kompatibilní enkapsidační sekvence, v retrovirových částicích produkovaných expresí replikativních kmenů, které jsou někdy přenosné a někdy se svou vlastní patogenitou, a (iii) více nebo méně významných rekombinací mezi koenkapsidovanými genomy, zejména ve fázi reversní transkripce, které vedou ke tvorbě hybridního genomu, • · který je někdy přenosný a někdy má svou vlastní patogenitu.
Tak, (i) v purifikovaných virových částicích byly nalezeny různé sekvence příbuzné k MSRV-1; (ii) molekulární analýza různých regionů MSRV-l retrovirového genomu by měla být provedena systematickou analýzou koenapsidovaných, interferujících a/nebo rekombinovaných sekvencí, které jsou generovány infekcí a/nebo expresí MSRV-1; dále, některé klony mohou mít defektní části sekvence produkované retrovirovou replikací a templátovými chybami a/nebo chybami transkripce reversní transkriptasy; (iii) rodiny sekvencí příbuzných ke stejnému regionu retrovirového genomu poskytuje prostředky pro celkovou diagnostickou detekci, která může být optimalizována identifikací invariabilních regionů v exprivovaných klonech, a identifikací čtecích rámečků odpovědných za produkci antigenů a/nebo patogenních polypeptidů, které mohou být produkovány pouze částí, nebo jenom jedním, z exprivovaných klonů, a, za těchto podmínek, umožňuje systémová analýza klonů exprivovaných v regionu daného genu hodnocení frekvence variací a/nebo rekombinací MSRV-1 genomu v tomto regionu a definování optimálních sekvencí pro aplikace, zejména pro diagnostické aplikace; (iv) patologie způsobená retrovirem jako je MSRV-1 může být přímým účinkem jeho exprese a proteinů nebo peptidů produkovaných v důsledku této exprese, ale také může být účinkem aktivace, enkapsidace nebo rekombinace příbuzných nebo heterologních genomů a proteinů nebo peptidů produkovaných v důsledku tohoto; proto, tyto genomy asociované s expresí a/nebo infekcí MSRV-1 jsou integrální částí potenciální patogenity tohoto viru, a proto tvoří prostředky pro diagnostickou detekci a speciální terapeutický cíl. Podobně, jakékoliv agens asociované s nebo kofaktor těchto interakcí • · · · • ·
S odpovědný za tuto patogenesi, jako je MSRV-2 nebo glyotoxický faktor, které jsou popsány v patentové přihlášce publikované pod č. FR-2716198, se mohou účastnit ve vývoji celkové a velmi účinné strategie pro diagnostiku, prognosu, terapeutické monitorování a/nebo integrovanou terapii MS jako takové, ale také jiných onemocnění asociovaných se stejnými agens.
V tomto kontextu byl proveden paralelní objev u jiného autoimunitního onemocnění, revmatoidní artritidy (RA), který byl popsán ve francouzské patentové přihlášce podané pod č.
95/02960. Tento objev ukazuje, že aplikování metodických postupů podobných těm, které jsou použity v tomto vynálezu na MS je možné identifikovat retrovirus exprivovaný u RA, který má sekvence popsané pro MSRV-1 u MS, a také koexistenci asociované MSRV-2 sekvence také popsané u MS. Co se týče MSRV-1, sekvence detekované společně u MS a RA je příbuzná pol a gag genům. Za nynějšího stavu znalostí je možné asociovat popsané gag a pol sekvence s MSRV-1 kmeny exprivovanými u těchto dvou onemocnění.
Předkládaná patentová přihláška se týká různých výsledků, které jsou navíc k těm, které jsou již chráněny francouzskými patentovými přihláškami:
| - č. | 92/04322 | ze | 3.4.1992, publikovaná pod č. | 2689519; |
| - č. | 92/13447 | ze | 3.11.1992, publikovaná pod č | . 2689521; |
| - c. | 92/13443 | ze | 3.11.1992, publikovaná pod č | . 2689520; |
| v - c. | 94/01529 | ze | 4.2.1994, publikovaná pod č. | 2715936; |
| - č. | 94/01531 | ze | 4.2.1994, publikovaná pod č. | 2715939; |
| v - c. | 94/01530 | ze | 4.2.1994, publikovaná pod č. | 2715936; |
| v - c. | 94/01532 | ze | 4.2.1994, publikovaná pod č. | 2715937; |
| - c. | 94/14322 | ze | 24.11.1994, publikovaná pod | č. 2727428; |
• · · ·
-ač. 94/15810 ze 23.12.1994, publikovaná pod č. 2728585.
Oblast vynálezu
Předkládaný vynález se týká, v první řadě, virového materiálu, v izolovaném nebo purifikovaném stavu, který může být rozpoznán nebo charakterizován různými způsoby:
- jeho genom obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence vykazující, pro jakoukoliv sérii 100 sousedících monomerů, alespoň 50% a preferovaně 70% homologii s uvedenými sekvencemi SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:
52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, v příslušném pořadí, a jejich komplementárními sekvencemi;
- region jeho genomu obsahuje env a pol geny a část gag genu, s vyloučením subregionu majícího sekvenci identickou nebo ekvivalentní SEQ ID NO: 1, kódující jakýkoliv polypeptid vykazující, pro jakoukoliv souvislou sérii alespoň 30 aminokyselin, alespoň 50% a lépe 70% homologii s peptidovou sekvencí kodovanou jakoukoliv nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 46 , SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:
52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, a jejich komplementárních sekvencí;
- pol gen obsahuje nukleotidovou sekvenci částečně nebo úplně identickou nebo ekvivalentní SEQ ID NO: 57, s vyloučením SEQ ID NO: 1;
- gag gen obsahuje nukleotidovou sekvenci částečně nebo úplně identickou nebo ekvivalentní SEQ ID NO: 88.
Jak bylo ukázáno výše, podle předkládaného vynálezu, virový materiál jak je definován výše je asociován s MS. A jak je definováno s ohledem na pol nebo gag gen MSRV-l, a přesněji na sekvence SEQ ID NO: 51, 56, 57, 59, 60, 61, 88 a 89, tento virový materiál je asociován s RA.
Předkládaný vynález se také týká různých nukleotidových fragmentů, které každý obsahuje nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny, která obsahuje:
(a) všechny genomové sekvence, částečně nebo úplně, pol genu MSRV-l viru, kromě úplné sekvence nukleotidového fragmentu definovaného SEQ ID NO: 1;
(b) všechny genomové sekvence, částečně nebo úplně, env genu MSRV-l;
(c) všechny částečné genomové sekvence gag genu MSRV-l;
(d) všechny genomové sekvence překrývající pol gen a env gen MSRV-l viru, a překrývající pol gen a gag gen;
(e) všechny sekvence, částečné nebo úplné, klonu vybraného ze skupiny obsahující klony FBd3 (SEQ ID NO: 46), t pol (SEQ ID NO:
51), JLBcl (SEQ ID NO: 52), JLBc2 (SEQ ID NO: 53) a GM3 (SEQ ID NO: 56), FBdl3 (SEQ ID NO: 58), LB19 (SEQ ID NO: 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO: 60), FP6 (SEQ ID NO: 61), G+E+A (SEQ ID NO: 89), S vyloučením jakékoliv nukleotidové sekvence identické k nebo ležící v sekvenci definované SEQ ID NO: 1;
(f) sekvence komplementární k uvedeným genomovým sekvencím;
(g) sekvence ekvivalentní k uvedeným sekvencím (a) až (e) , zejména nukleotidovým sekvencím vykazujícím pro jakoukoliv sérii 100 sousedících monomerů, alespoň 50% a preferovaně 70% homologii s uvedenými sekvencemi (a) až (d).
za podmínky, že tento nukleotidový fragment neobsahuje nebo se neskládá ze sekvence ERV-9 jak je popsána v LA MANTIA et al. (18) .
Termín genomové sekvence, částečné nebo úplné, zahrnuje všechny sekvence asociované s koenkapsidací nebo s koexpresí, nebo rekombinované sekvence.
Preferovaně, takový fragment obsahuje:
- buď nukleotidové sekvence identické k částečné nebo úplné genomové sekvenci pol genu MSRV-1 viru, kromě úplné sekvence nukleotidového fragmentu definovaného SEQ ID NO: 1, nebo identické k jakékoliv sekvenci ekvivalentní k uvedené částečné nebo celkové genomové sekvenci, zejména k té, která je homologní k dalším;
- nebo nukleotidové sekvence identické k částečné nebo úplné genomové sekvenci env genu MSRV-1 viru, nebo identické k jakékoliv sekvenci komplementární k uvedené nukleotiové sekvenci, nebo identické k jakékoliv sekvenci ekvivalentní k uvedené nukleotidové sekvenci, zejména k té, která je homologní k dalším.
Jednotlivě, vynález se týká nukleotidových fragmentů obsahujících kódující nukleotidovou sekvenci, která je částečně nebo úplně identická s nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z:
- nukleotidové sekvence definované SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62 nebo SEQ ID NO: 89;
- sekvencí komplementárních k SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62 nebo SEQ ID NO:89;
- sekvencí ekvivalentních, a zejména homologních, k SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62 nebo SEQ ID NO: 89;
- sekvencí kódujících celou nebo část polypeptidové sekvence definované SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 63 nebo SEQ ID NO: 90;
- sekvencí kódujících celou nebo část peptidové sekvence ekvivalentní, a zejména homologní, k SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:
nebo SEQ ID NO: 90, které mohou být rozpoznány sérem pacientů infikovaných MSRV-1 virem, nebo ve kterých byl MSRV-1 virus reaktivován.
Vynález se také týká jakékoliv nukleokyselinové proby pro detekci patogenního a/nebo infekčního agens asociovaného s MS, • · · · · · · · · ·· · · • · · · · · · ···· • · · · » · · · ···· * • · · ···· · · · «···· ·· ·· · ·» která je schopná specifické hybridizace s jakýmkoliv fragmentem jak byl definován výše, náležícímu nebo ležícímu v genomu uvedeného patogenního agens. Týká se, kromě toho, jakékoliv nukleokyselinové proby pro detekci patogenního a/nebo infekčního agens asociovaného s RA, která je schopná specifické hybridizace s jakýmkoliv fragmentem jak je definován výše s odkazem na pol a gag geny, a zejména s ohledem na sekvence SEQ ID NO: 40, 51, 56, 59, 60, 61, 62, 89 a SEQ ID NO: 39, 63 a 90.
Vynález se také týká primerů pro amplifikaci polymerizací RNA nebo DNA virového materiálu, obsahujícího nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní k alespoň jedné části nukleotidové sekvence jakéhokoliv fragmentu jak byl definován výše, zejména k nukleotidové sekvenci vykazující pro jakoukoliv sérii 10 sousedících monomerů, alespoň 70% homologii s alespoň uvedenou částí uvedeného fragmentu. Preferovaně je nukleotidové sekvence takového primeru identická k jakékoliv sekvenci vybrané ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 47 až SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55 a SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 86.
V obecné rovině vynález také obsahuje RNA nebo DNA, a zejména replikační vektor, obsahující fragment virového materiálu jak je definován výše, nebo nukleotidový fragment jak je definován výše.
Vynález se také týká různých peptidů kódovaných otevřeným čtecím rámečkem patřícím k nukleotidovému fragmentu jak je definován výše, zejména nějakého polypeptidu, například oligopeptidu, tvořícího nebo obsahujícího antigenní determinantu rozpoznávanou sérem pacientů infikovaných MSRV-1 virem a/nebo u kterých byl MSRV-1 virus reaktivován. Preferovaně, tento
polypeptid je antigenní a je kodován otevřeným čtecím rámečkem začínajícím, ve směru 5'- 3', v nukleotidu 181 a končícím v nukleotidu 330 SEQ ID NO: 1.
Jednotlivě, vynález se týká antigenního polypeptidu rozpoznávaného sérem pacientů infikovaných MSRV-1 virem a/nebo u kterých byl MSRV-1 virus reaktivován, jehož peptidová sekvence je částečně nebo úplně identická nebo je ekvivalentní sekvenci definované SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 63 nebo SEQ ID NO: 87; taková sekvence je identická, například, k jakékoliv sekvenci vybrané ze skupiny obsahující sekvence SEQ ID NO: 41 až SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 63 a SEQ ID NO: 87.
Předkládaný vynález také nabízí mono- nebo polyklonální protilátky namířené proti MSRV-1 viru, které jsou získány imunologickou reakcí lidského nebo zvířecího organismu s imunogenním agens skládajícím se z antigenního polypeptidu jak je definován výše.
Vynález se dále týká:
- reagens pro detekci MSRV-1 viru, nebo jeho dřívější expozici, obsahující, jako reaktivní složku, peptid, konkrétně antigenní peptid, jak je definován výše, nebo anti-ligand, konkrétně protilátku k uvedenému peptidu;
- všechny diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice obsahující jeden nebo více peptidů, konkrétně antigenních peptidů, tak jak jsou definovány výše, nebo jeden nebo více antiligandů, konkrétně protilátek k peptidům, které byly diskutovány výše; taková kompozice je preferrovaně, a • · · · · ···· · · · · ···· · · · 9 · · například, vakcinová kompozice.
Vynález se také týká jakékoliv diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice, zejména pro inhibici exprese alespoň jednoho patogenního a/nebo infekčního agens asociovaného s MS obsahujícího nukleotidový fragment tak, jak je definován výše nebo polynukleotid, zejména oligonukleotid, jehož sekvence je částečně identická k sekvenci uvedeného fragmentu, s tou výjimkou, že fragment má sekvenci nukleotidů SEQ ID NO:· 1. Podobně, týká se také jakékoliv diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice, zejména pro inhibici exprese alespoň jednoho patogenního a/nebo infekčního agens asociovaného s RA obsahujícího nukleotidový fragment tak, jak je definován výše odkazem na pol a gag geny, a zejména s ohledem na sekvence SEQ ID NO: 40, 51, 56, 59, 60, 61, 62 a 89.
Podle vynálezu se mohou tyto stejné fragmenty nebo polynukleotidy, zejména oligonukleotidy, účastnit na všech vhodných kompozicích pro detekování, podle jakéhokoliv vhodnného procesu nebo metody, patologických a/nebo infekčních agens asociovaných s MS nebo RA, v příslušném pořadí, v biologickém vzorku. V takovém procesu je RNA a/nebo DNA, o které se soudí, že náleží nebo že pochází z uvedeného patologického a/nebo infekčního agens, a/nebo jejich komplementární RNA a/nebo DNA, uvedena do kontaktu s takovou kompozicí.
Předkládaný vynález se také týká jakéhokoliv procesu pro detekci přítomnosti nebo expozice takovým patologickým a/nebo infekčním agens v biologickém vzorku, a to uvedením tohoto vzorku do kontaktu s peptidem, zejména antigenním peptidem tak, jak je definován výše, nebo anti-ligandem, zejména protilátkou k * · ♦ · · · · • · ·· ·· · · tomuto peptidů, jak je definována výše.
V praxi, a například, obsahuje prostředek pro detekci MSRV-1 viru reagens jak je definováno výše, doplněné pevným nosičem, který je imunologicky kompatibilní s reagens, a prostředky pro uvedení biologického vzorku, například vzorku krve nebo mozkomíšního moku, který pravděpodobně obsahuje anti-MSRV-1 protilátky, do kontaktu s tímto reagens za podmínek umožňujících možnou imunologickou reakci, kde výše uvedené prostředky jsou spojeny s prostředky pro detekci imunitních komplexů tvořených s tímto reagens.
Nakonec, vynález se také týká detekce anti-MSRV-1 protilátek v biologickém vzorku, například vzorku krve nebo mozkomíšního moku, podle toho, který tento vzorek je uveden do kontaktu s reagens jak je definováno výše, skládajícího se z protilátky, za podmínek umožňujících jejich možnou imunologickou reakci, a potom je detekována přítomnost imunitních komplexů tvořených s reagens.
Před podrobným popisem vynálezu budou nyní definovány různé termíny použité v popisu a v patentových nárocích.
- kmen nebo izolát znamená jakoukoliv infekční a/nebo patogenní biologickou frakci obsahující, například, viry a/nebo bakterie a/nebo parasity, vyvolávající patogenní a/nebo antigenní účinky, které exisutuje v kultuře nebo v živém hostiteli; jako příklad, virový kmen podle výše uvedené definice může obsahovat koinfekční agens, například patogenní protista, ·· ······ ·· ·· • · · · · · · · · • · · » · · · · ···· · • · · · · · · ··· ··· «» ·· «· ·· ··
- termín MSRV použitý v předkládaném popisu označuje jakékoliv patogenní a/nebo infekční agens asociované s MS, zejména virové druhy, atenuované kmeny uvedených virových druhů nebo defektní interferující částice obsahující koenkapsidované genomy, nebo alternativní genomy rekombinované s částí MSRV-1 genomu, odvozeného od tohoto druhu. Viry, a zejména viry obsahující RNA, se vyznačují variabilitou vznikající z relativně vysokého stupně spontánních mutací (7), jak bude uvedeno dále pro definování významu ekvivalence,
- lidský virus znamená virus schopný infikování lidské bytosti, nebo virus, který je nesen lidskou bytostí,
- z pohledu všech přirozených nebo indukovaných variací a/nebo rekombinací předmětů z dalšího popisu, definovaných výše a v nárocích, které mohou být uvažovány při provedení předkládaného vynálezu, byly vyjádřeny tak, aby definovaly ekvivalenty nebo deriváty různých biologických materiálů definovaných dále, v určité homologní nukleotidové nebo peptidové sekvenci,
- varianta viru nebo patogenního a/nebo infekčního agens podle předkládaného vynálezu zahrnuje alespoň jeden antigen rozpoznávaný alespoň jednou protilátkou namířenou proti alespoň jednomu korespondujícímu antigenu uvedeného viru a/nebo uvedenému patogennímu a/nebo infekčnímu agens, a/nebo genom jakékoliv části, která je detekována alespoň jednou hybridizační probou a/nebo alespoň jedním nukleotidovým amplifikačním primerem specifickým pro uvedený virus a/nebo patogenní a/nebo infekční agens, jako například, pro MSRV-1 virus, primery a probami majícími nukleotidovou sekvenci vybranou ze SEQ ID NO:
až SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 16 až SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31 až SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:
47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 45 a jejich komplementárních sekvencí, za konkrétních hybridizačních podmínek dobře známých odborníkům v oboru.
- podle předkládaného vynálezu je nukleotidový fragment nebo oligonukleotid nebo polynukleotid seskupení monomerů, nebo biopolymerů, charakterizované informativní sekvencí přirozených nukleových kyselin, který je schopen hybridizace s jakýmkoliv jiným nukleotidovým fragmentem za předem určených podmínek, a je možné ho sestavit tak, aby obsahoval monomery různé chemické struktury a aby ho bylo možno získat z molekuly přirozené nukleové kyseliny a/nebo genetickou rekombinací a/nebo chemickou syntesou; nukleotidový fragment může být identický s genomovým fragmentem MSRV-1 viru diskutovanému v předkládaném vynálezu, zejména genu tohoto viru, například pol nebo env v případě uvedeného viru,
- tak, monomerem může být přirozený nukleotid nukleové kyseliny, jehož stavebními složkami jsou cukr, fosfátová skupina a dusíkatá baze; v RNA je cukrem ribosa, v DNA je cukrem 2-deoxyribosa; podle toho, zda nukleová kyselina je DNA nebo RNA je dusíkatá baze vybrána z adeninu, guaninu, uracilu, cytosinu a thyminu; nebo může být nukleotid modifikován v alespoň jednom ze tří stavebních elementů; například, modifikace se může vyskytovat v bazích, za generování baží jako je inosin,
5-methyldeoxycytidin, deoxyuridin, 5-(dimethyamino)deoxyuridin,
2,6-diaminopurin, 5-bromodeoxyuridin a jakákoliv jiná modifikovaná baze navozující hybridizaci; v cukru může modifikace spočívat v náhradě alespoň jedné deoxyribosy «I* ·· ···· ·· · · • · · · · · · · • · · · · · ·· • · · · · > ···· · polyamidem (8) , au fosfátové skupiny může modifikace spočívat v jejím nahrazení estery vybranými, jednotlivě, z esterů difosfátu, alkyl- a arylfosfonátu a fosforothioatu,
- informační sekvence znamená jakoukoliv uspořádanou sérii monomerů, jejichž chemický charakter a řád v referenčním směru vytváří nebo jinak znamená funkční informaci stejné kvality, jako má přirozená nukleová kyselina,
- hybridizace znamená proces, během kterého, za vhodných podmínek, se párují dva nukleotidová fragmenty mající dostatečně komplementární sekvence za tvorby komplexní struktury, zejména dubletu nebo tripletu, preferovaně ve formě šroubovice,
- proba obsahuje nukleotidový fragment syntetizovaný chemicky nebo získaný trávením nebo enzymatickým štěpením delšího nukleotidového fragmentu, a obsahuje alespoň šest monomerů, výhodně od 10 do 100 monomerů a lépe 10 až 30 monomerů, a má specificitu hybridizace za určitých podmínek; preferovaně, proba mající méně než 10 monomerů není použita samostatně, ale je použita za přítomnosti jiné proby stejně krátké nebo jiné; za jistých speciálních podmínek může být užitečné použít proby velikosti vyšší než 100 monomerů; proba může být použita, zejména, pro diagnostické účely, jako molekuly, které jsou, například, záchytné a/nebo detekční proby,
- záchytná proba může být imobilizována na pevném nosiči jakýmikoliv vhodnými prostředky, to znamená přímo nebo nepřímo, například kovalentní vazbou nebo pasivní adsorpcí,
- detekční proba může být značena prostředky značení
vybranými, například, z radioaktivních izotopů, enzymů vybraných například z peroxidasy a alkalické fosfatasy a těch, které jsou schopné hydrolyzace chromogenních, fluorogenních nebo luminiscentních substrátů, chromoforických chemických sloučenin, hromogenních, fluorogenních nebo luminiscentních sloučenin, analogů nukleotidových baží a biotinu,
- proby použité pro diagnostické účely podle vynálezu mohou být použity v jakýchkoliv známých technikách hybridizace, a zejména v technikách nazývaných DOT-BLOT (9) , SOUTHERN BLOT (10), NORTHERN BLOT, což je technika identická k SOUTHER BLOT, ale s RNA jako cílem, a SANDWICH technice (11); výhodně je v předkládaném vynálezu použita SANDWICH technika, která obsahuje specifickou záchytnou probu a/nebo specifickou detekční probu, kdy se rozumí, že záchytná proba a detekční proba musí mít alespoň částečně odlišnou nukleotidovou sekvenci,
- jakákoliv proba podle předkládaného vynálezu může hybridizovat in vivo nebo in vitro s RNA a/nebo s DNA, aby blokovala fenomen replikace, zejména translace a/nebo transkripce, a/nebo aby degradovala uvedenou DNA a/nebo RNA.
- primer je proba obsahující alespoň šest monomerů, a výhodně od 10 do 30 monomerů, mající specificitu hybridizace za určitých podmínek pro iniciaci enzymatické polymerizace, například v amplifikační technice jako je PCR (polymerasová řetězová reakce), v elongačních procesech jako je sekvencování, v metodě reversní transkripce a podobně,
- dvě nukleotidové nebo peptidové sekvence jsou nazývány ekvivalentními nebo odvozenými jedna od druhé, nebo vzhledem k
referenční sekvenci, pokud funkčně korespondující biopolymery mohou provádět v podstatě stejnou roli, bez toho, že by byly identické, vzhledem k použité aplikaci nebo použití, nebo technice, ve které se účastní; dvě sekvence jsou, zejména, ekvivalentní, pokud jsou získány v důsledku přirozené variability, zejména spontálních mutací druhů, ze kterých byly identifikovány, nebo v důsledku indukované variability, jako jsou dvě homologní sekvence, kdy homologie bude definována dále,
- variabilita znamená jakoukoliv spontánní nebo indukovanou modifikaci sekvence, zejména substituci a/nebo inserci a/nebo deleci nukleotidů a/nebo nukleotidových fragmentů, a/nebo extensi a/nebo zkrácení sekvence v jednom nebo v obou koncích; nepřirozená variabilita může být následkem použití technik genetického inženýrství, například volby primerů syntesy, degenerovaných nebo jinak vybraných pro amplifikaci nukleové kyseliny; tato variabilita se může sama manifestovat v modifikacích jakékoliv počáteční sekvence, považované za referenční sekvenci, a může být vyjádřena jako stupeň homologie ve vztahu k uvedené referenční sekvenci,
- homologie charakterizuje stupeň identity dvou nukleotidových nebo peptidových fragmentů při srovnání; je měřena jako procento identity, které je určeno přímým srovnáním nukleotidových nebo peptidových sekvencí, ve vztahu v referenčním nukleotidovým nebo peptidovým sekvencím,
- toto procento identity může být specificky určeno pro nukleotidové fragmenty, zejména klony podle předkládaného vynálezu, které jsou homologní s fragmenty identifikovanými, pro MSRV-l virus, SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 46,
| SEQ | ID NO: | 51 | až SEQ ID NO | : 53, SEQ | ID NO: 40, | SEQ ID NO: | 56 a |
| SEQ | ID NO: | 57, | stejně jako | pro proby | a primery | ident i f ikovanými | |
| SEQ | ID NO: | 20 | až SEQ ID NO | : 24, SEQ | ID NO: 26, | SEQ ID NO: | 16 až |
| SEQ | ID NO: | 19, | SEQ ID NO: | 31 až SEQ | ID NO: 33, | SEQ ID NO: | 45, |
| SEQ | ID NO: | 47, | SEQ ID NO: | 48, SEQ ID | NO: 49, SEQ ID NO: 50 | SEQ | |
| ID NO: 55, | SEQ | ID NO: 40, | SEQ ID NO: | 56 a SEQ | ID NO: 57; |
například, nejmenší procento identity pozorované mezi různými obecnými konsensuálními sekvencemi nukleových kyselin získaných od fragmentů MSRV-1 virové RNA, pocházející z LM7PC a PLT-2 linií podle protokolu popsaného dále, je 67% v regionu popsaném na obrázku 1,
- jakýkoliv nukleotidový fragment je nazýván ekvivalentním nebo odvozeným od referenčního fragmentu, pokud má nukleotidovou sekvenci ekvivalentní sekvenci referenčního fragmentu; podle výše uvedené definice jsou dále uvedené zejména ekvivalentní referenčnímu nukleotidovému fragmentu:
a) jakýkoliv fragment schopný alespoň částečné hybridizace s komplementem referenčního fragmentu,
b) jakýkoliv fragment, jehož sestavení s referenčním fragmentem vede k demonstraci většího počtu identických sousedících baží, než u jiného fragmentu pocházejícího z jiné taxonomické skupiny,
c) jakýkoliv fragment vzniklý, nebo který může vzniknout, z přirozené variability druhů, ze kterých je získán,
d) jakýkoliv fragment, který může vzniknout z technik genetického inženýrství aplikovaných na referenční fragment,
e) jakýkoliv fragment obsahující alespoň osm sousedních nukleotidů kódujících peptid, který je homologní nebo identický k peptidu kódovanému referenčním fragmentem,
f) jakýkoliv fragment, který se liší od referenčního fragmentu insercí, delecí nebo substitucí alespoň jednoho monomeru, nebo extensí nebo zkrácením v jednom nebo v obou jeho koncích; například, jakýkoliv fragment korespondující referenčnímu fragmentu sousedící v jednom nebo obou svých koncích s nukleotidovou sekvencí nekódující polypeptid,
- polypeptid znamená jakýkoliv peptid o alespoň dvou aminokyselinách, zejména oligopeptid nebo protein, extrahovaný, separovaný nebo významně izolovaný nebo syntetizovaný lidským zásahem, zejména ten, který je získán chemickou syntesou nebo expresí v rekombinantním organismu,
- polypeptid částečně kódovaný nukleotidovým fragmentem znamená polypeptid mající alespoň tři aminokyseliny kódované alespoň devíti sousedícími monomery z uvedeného nukleotidového fragmentu,
- aminokyselina je nazývána analogickou k jiné aminokyselině, pokud její příslušné fyzikálně chemické vlastnosti, jako je polarita, hydrofobicita a/nebo bazicita a/nebo acidita a/nebo neutralita jsou v podstatě totožné; tak je leucin analogický k izoleucinu.
- jakýkoliv peptid je nazýván ekvivalentním nebo odvozeným od referenčního polypeptidu, pokud mají srovnávané polypeptidy v podstatě stejné vlastnosti, a zejména stejné antigenní, * ·« · · · ·«· · · ·· »· · · ·· · « · · · • · ·«· · · · ···· · • · * « · · · ··· ·«··· · · · · It · · imunologické, enzymatické a/nebo molekulární rozpoznávací charakteristiky; následující jsou zejména ekvivalentní referenčnímu polypeptidu:
a) jakýkoliv polypeptid mající sekvenci, ve které byla alespoň jedna aminokyselina nahrazena analogní aminokyselinou,
b) jakýkoliv polypeptid mající ekvivalentní peptidovou sekvenci, získanou přirozenými nebo indukovanými variacemi uvedeného referenčního polypeptidu a/nebo nukleotidového fragmentu kódujícího uvedený polypeptid,
c) mimotop uvedeného referenčního polypeptidu,
d) jakýkoliv polypeptid, v jehož sekvenci je jedna nebo více aminokyselin L-serie nahrazena aminokyselinou D-serie, a naopak,
e) jakýkoliv polypeptid, do jehož sekvence byla zavedena modifikace postraních řetězců aminokyselin, jako například acetylace amino funkcí, karboxylace thiol funkcí, esterifikace karboxy funkcí,
f) jakýkoliv polypeptid, v jehož sekvenci byla modifikována jedna nebo více peptidových vazeb, jako například, karba, retro, inverso, retro-inverso, redukované a methylenoxy vazba,
g) jakýkoliv polypeptid, u kterého je alespoň jeden antigen rozpoznáván protilátkou namířenou proti referenčnímu polypeptidu,
- procento identity charakterizující homologii dvou
44 ·»···· 44 44 • 4 · · 4 · * 4 · 4 4 • · · · · · 4 · ·» 4 4 4 • 4 · · · · · 4 4 4
4···· 4 4 · 4 44 44 srovnávaných peptidových fragmentů je, podle předkládaného vynálezu, alespoň 50% a lépe alespoň 70%.
Z hlediska skutečnosti, že viry mající enzymatickou aktivitu reversní transkriptasy mohou být geneticky charakterizovány stejně dobře v RNA i v DNA formě, bude jak virová DNA, tak virová RNA označena pro charakterizaci sekvencí týkajících se virů majících takovou aktivitu reversní transkriptasy, nazývaných MSRV-1 podle předkládaného vynálezu.
Vyjádření pořadí použité v předkládaném popisu a nárocích, jako první nukleotidové sekvence nejsou pojmuty tak, že vyjadřují určité pořadí, ale tak, aby jasněji definovaly vynález.
Detekce substance nebo agens jak je uvedena dále znamená identifikaci a kvantifikaci, nebo separaci nebo izolaci, uvedené substance nebo uvedeného agens.
Popis obrázků na připojených výkresech
Vynález bude lépe srozumitelný po přečtení podrobného popisu, který následuje dále a který je připraven s ohledem na připojené obrázky, kde:
Obrázek 1 ukazuje obecné konsensuální sekvence nukleových kyselin MSRV-1B klonů amplifikované PCR technikou v pol regionu, který definoval Shih (12), z virové DNA pocházející z LM7PC a PLI-2 linií, a které byly identifikovány pod referenčními SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5a SEQ ID NO: 6, a obecný konsensus s amplifikačními primery nesoucími • ·· ·· ···· ·· ·· ···· ·· · · · · · • · · · · · · r·· · · • · ···· ··· referenční SEQ ID NO: 7;
Obrázek 2 dává definici funkčního čtecího rámečku pro každý typ MSRV-1B/PCR pol rodiny, kde uvedené rodiny A až D jsou definovány, v příslušném pořadí, nukleotidovými sekvencemi SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5a SEQ ID NO: 6 popsanými na obrázku 1;
Obrázek 3 dává příklad konsensu MSRV-2B sekvence, identifikovaný SEQ ID NO: 11;
Obrázek 4 representuje aktivitu reversní transkriptasy (RT) v dmp (desintegrace za minutu) v sacharosových frakcích odebraných z purifikačního gradientu virionů produkovaných B lymfocyty v kultuře od pacientů trpících MS;
Obrázek 5 ukazuje, za stejných pokusných podmínek jako obrázek 4, test aktivity reversní transkriptasy v kultuře B lymfocytů získané od kontrol bez MS;
Obrázek 6 ukazuje nukleotidovou sekvenci klonu PSJ17 (SEQ ID NO: 9);
Obrázek 7 ukazuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 8 klonu označeného M003-P004;
Obrázek 8 ukazuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 2 klonu Fll-l; část umístěná mezi šipkami v regionu primeru koresponduje variabilitě způsobené volbou primeru, který byl použit pro klonování Fll-l; na tomto samém obrázku je ukázána translace na aminokyseliny;
• · · · · ·
Obrázek 9 ukazuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a možný funkční čtecí rámeček SEQ ID NO: 1 ve smyslu aminokyselin; na této sekvenci je podtržena konsensuální sekvence pol genu;
Obrázky 10 a 11 ukazují výsledky PCR, ve formě fotografie agarosového gelu impregnovaného ethidium bromidem pod ultrafialovým světlem, amplifikačních produktů získaných z primerů identifikovaných SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 19;
Obrázek 12 representuje, v matrixové formě, homologii mezi SEQ ID NO: 1 MSRV-1 a sekvencí endogenního retroviru označeného HSERV9; tato nejméně 65% homologie je ukázána nepřerušovanou linií, absence linie znamená homologii menší než 65%;
Obrázek 13 ukazuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 46 klonu FBd ;
Obrázek 14 ukazuje homologii sekvence mezi klonem FBd3 a HSERV-9 retrovirem;
Obrázek 15 ukazuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 51 klonu t pol;
Obrázky 16 a 17 ukazují, v příslušném pořadí, nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 52 a SEQ ID NO: 53 klonů JLBcl a JLBc2, v příslušném pořadí;
Obrázek 18 ukazuje homologii sekvence mezi klonem JLBcl a klonem FBd3;
Obrázek 19 ukazuje homologii sekvence mezi klonem JLBc2 a klonem FBd3;
Obrázek 19 ukazuje homologii sekvence mezi klonem JLBcl a klonem JLBc2;
Obrázky 21 a 22 ukazují homologii sekvence mezi HSERV-9 retrovirem a klony JLBcl a JLBc2, v příslušném pořadí;
Obrázek 23 ukazuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 56 klonu GM3;
Obrázek 24 ukazuje homologii sekvence mezi retrovirem HSERV-9 a klonem GM3;
Obrázek 25 ukazuje lokalizaci různých studovaných klonů, ve vztahu ke genomu známého retroviru ERV9;
Obrázek 26 ukazuje pozici klonů Fll-1, M003-P004, MSRV-1B a PSJ17 v regionu zde označeném MSRV-1 pol*;
Obrázek 27, rozdělen do tří následujících obrázků 27a, 27b a 27c, ukazuje možný čtecí rámeček pokrývající celý pol gen;
Obrázek 28 ukazuje, podle SEQ ID NO: 40, nukleotidovou sekvenci kódující peptidovy fragment POL2B mající aminokyselinovou sekvenci identifikovanou SEQ ID NO: 39;
Obrázek 29 ukazuje OD hodnoty (Elisa test) při 492 nm získané pro 29 sér MS pacientů a 32 sér od zdravých kontrol testovaných za použití anti-IgG protilátky;
• ·
Obrázek 30 ukazuje OD hodnoty (Elisa test) při 492 nm získané pro 36 sér MS pacientů a 42 sér od zdravých kontrol testovaných za použití anti-IgM protilátky;
Obrázky 31 až 33 uakzují výsledky získané (relativní intesita bodů) pro 43 přesahujících oktapeptidů pokrývajících aminokyselinovou sekvenci 61 - 110, za použití Spotscan techniky, respektive s poolem MS séra, s poolem kontrolního séra a s poolem MS séra po odhalení pozadí korespondujícího s maximem signálu detekovaného na alespoň jednom oktapeptidů s kontrolním sérem (intensita = 1), kdy tato séra byla ředěna 1/50. Sloupec zcela vpravo representuje representuje standard grafického rozsahu nepříbuzný k serologickému testu;
Obrázek 34 ukazuje SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 42 dvou polypeptidů obsahujících imunodominantu (lakunu), zatímco SEQ ID NO: 43 a SEQ ID NO: 44 representuje imunoreaktivní polypeptidy specifické pro MS;
Obrázek 35 ukazuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 59 klonu LB19 a tři potenciální čtecí rámečky SEQ ID NO: 59 ve smyslu aminokyselin;
Obrázek 36 ukazuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 88 (GAG*) a potenciální čtecí rámeček SEQ ID NO: 88 ve smyslu aminokyselin;
Obrázek 37 ukazuje homologii sekvence mezi klonem FBdl3 a HSERV-9 retrovirem; v tomto obrázku nepřerušovaná linie znamená procento homologie vyšší než 70% a absence linie znamená menší procento homologie;
• ·
Obrázek 38 znamená nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 61 klonu FP6 a tři potenciální čtecí rámečky SEQ ID NO: 61 ve smyslu aminokyselin;
Obrázek 39 znamená nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 89 klonu G+E+A a tři potenciální čtecí rámečky SEQ ID NO: 89 ve smyslu aminokyselin;
Obrázek 40 ukazuje čtecí rámeček nalezený v regionu E a kódující MSRV-1 retrovirovou proteasu identifikovanou SEQ ID NO: 90;
Obrázek 41 ukazuje odpověď každého séra od pacientů trpících MS, ukázaných symbolem (+), a od zdravých pacientů, symbolizovaných (-), testovaných s anti-IgG protilátkou, vyjádřenou jako čistou optickou densitu při 492 nm;
Obrázek 42 ukazuje odpověď každého séra od pacientů trpících MS, ukázaných symbolem (+) a (QS), a od zdravých pacientů, symbolizovaných (-), testovaných s anti-IgM protilátkou, vyjádřenou jako čistou optickou densitu při 492 nm.
• ·
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Získání klonů označených MSRV-1B a MSRV-2B, definování, v příslušném pořadí, retrovirů MSRV-1 a koinfekčního agens MSRV-2, pomocí nested PCR amplifikace konzervovaných pol regionů retrovirů na virionových přípravcích pocházejících z LM7PC a PLI-2 linií
Byla použita PCR technika odvozená od techniky, kterou popsal Shih (12). Tato technika umožňuje odstranit všechny stopy kontaminující DNA ošetřením všech složek reakčního media DNAsou. Současně umožňuje, za použití různých, ale překrývajících se primerů ve dvou následných sériích PCR amplifikačních cyklů, zvýšit šanci amplifikace cDNA syntetizované z množství RNA, které je malé na začátku a dále redukované ve vzorku ničivým účinkem DNAsy na RNA. Skutečně, DNAasa je použita za podmínek aktivity v přebytku, který umožňuje odstranění všech stop kontaminující DNA před inaktivací tohoto enzymu zůstávajícího ve vzorku zahřátím na 85 °C po dobu 10 minut. Tato varianta PCR techniky, kterou popsal Shih (12) byla použita na cDNA syntetizovanou z nukleových kyselin frakcí infekčních částic purifikovaných na sacharosovém gradientu podle techniky, kterou popsal H. Perron (13) z POL-2 izolátu (ECACC č. V92072202) produkovaného PLI-2 linií (ECACC č. 92072201) na jedné straně a z MS7PG izolátu (ECACC č. V93010816) produkovaného LM7PC linií (ECACC č. 93010817) na druhé straně. Tyto kultury byly získány podle metod, které tvoří předmět patentových přihlášek publikovaných pod čísly WO 93/20188 a WO 93/20189.
Po klonování produktů amplifikovaných touto technikou za pomoci TA Cloning KitR a po analýze sekvence za použití Applied Biosystems model 373A Automatic Sequencer, byly sekvence analyzovány za použití GeneworksR softwaru v poslední dosažitelné versi od GenebankR databanky.
Sekvence klonované a sekvencované z těchto vzorků korespondovaly, částečně, dvěma typům sekvence: první typ sekvence byl nalezen ve většině klonů (55% klonů pocházejících z POL-2 izolátů PLI-2 kultur a 67% klonů pocházejících z MS7PG izolátů LM7PC kultur), která koresponduje rodině pol sekvencí velmi podobné, ale odlišné od, endogenního lidského retroviru označeného ERV-9 nebo HSERV-9, a druhý typ sekvence, která koresponduje sekvencím velmi silně homologním k sekvenci přisuzované jinému patogennímu a/nebo infekčnímu agens označenému MSRV-2.
První typ sekvence, representující většinu klonů, se skládá ze sekvencí, jejichž variabilita umožňuje definování čtyř podrodin sekvencí. Tyto podrodiny jsou dostatečně podobné jedna k druhé pro to, aby bylo možné považovat je za kvazi-druhy pocházející ze stejného retroviru, jako je to dobře známo pro HIV-1 retrovirus (14), nebo za výsledek interference s několika endogenními proviry koregulovánými v produkujících buňkách. Tyto více nebo méně defektní elementy jsou citlivé na stejné regulační signály pravděpodobně generované replikativními proviry, protože patří do stejné rodiny endogenních retrovirů (15). Tato nová rodina endogenních retrovirů, nebo alternativně tento nový druh retrovirů, ze kterého byly kvazi-druhy získány v kultuře, a který obsahuje konsensus sekvencí popsaný dále, je označen MSRV-1B.
Obrázek 1 předkládá obecné konsensuální sekvence sekvencí různých MSRV-1B klonů sekvencovaných v tomto pokusu, kde jsou tyto sekvence identifikovány, v příslušném pořadí, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5a SEQ ID NO: 6. Tyto sekvence vykazují homologii ve smyslu nukleových kyselin v rozsahu od 70% do 88% s HSERV9 sekvencí označenou X57147 a M37638 v GenebankR databazi. Byly definovány čytři konsensuální sekvence nukleových kyselin representativní pro různé kvazi-druhy pravděpodobně endogenního retroviru MSRV-1B, nebo různých podrodin endogenního retroviru MSRV-1B. Tyto representativní konsensuální sekvence jsou presentovány na obrázku 2, s translací do aminokyselin. Funkční čtecí rámeček existuje pro každou podrodinu těchto MSRV-1B sekvencí, a je možno pozorovat, že funkční otevřený čtecí rámeček koresponduje v každém případě s aminokyselinovou sekvencí ukázanou ve druhé řadě pod sekvencí nukleové kyseliny. Obecný konsensus MSRV-1B sekvence, identifikovaný SEQ ID NO: 7a získaný touto PCR technikou v pol regionu, je presentován na obrázku 1.
Druhý typ sekvence representující většinu sekvencovaných klonů je representován sekvencí MSRV-2B presentovanou na obrázku 3 a identifikovanou SEQ ID NO: 11. Rozdíly pozorované v sekvencích korespondujících k PCR primerům jsou vysvětleny použitím degenerovaných primerů ve smíšené formě použitých za různých technických podmínek.
MSRV-2B sekvence (SEQ ID NO: 11) je dostatečně divergentní od retrovirových sekvencí již popsaných v databankách pro to, aby bylo naznačeno, že tento region sekvence patří novému infekčnímu agens, označenému MSRV-2. Toto infekční agens bude, v zásadě, na základě analýzy prvních získaných sekvencí, příbuzné retrovirů,
·· ···· ale z pohledu techniky použité pro získání této sekvence, může být také DNA virus, jehož genom kóduje enzym, který má také náhodně aktivitu reversní transkriptasy, jak v případě, například, viru hepatitidy B, HBV (12). Kromě toho, náhodný charakter degenerovaných primerů použitých pro tuto PCR amplifikační techniku může velmi dobře umožnit, v důsledku dosud nezjištěných homologií sekvence nebo konzervovaných míst v genu pro příbuzný enzym, amplifikaci nukleové kyseliny pocházející z prokaryotických nebo eukaryotických patogenů a/nebo koinfekčních agens (protistů).
Příklad 2
Získání klonů označených MSRV-1B a MSRV-2B, definování rodiny MSRV-l a MSRV-2 pomocí nested PCR amplifikace konzervovaných pol regionů retrovirů na přípravcích B lymfocytů od nového případu MS
Stejná PCR technika, modifikovaná podle techniky, kterou popsal Shih (12), byla použita pro amplifikaci a sekvencování materiálu RNA nukleové kyseliny v purifikované frakci virionů v peaku LM-podobné aktivity reversní transkriptasy na sacharosovém gradientu podle techniky, kterou popsal H. Perron (13) a podle protokolu uvedeného v příkladu 1, ze spontální lymfoblastoidní linie získané samoimortalizací v kultuře B lymfocytů od MS pacienta, který byl seropozitivní na virus Epstein Barrové (EBV), po zavedení krevních lymfoidních buněk v kultuře do vhodného kultivačního media obsahujícího vhodnou koncentraci cyklosporinu A. Representace aktivity reversní transkriptasy v sacharosové frakci odebrané z purifikačního gradientu virionů produkovaných touto linií je předložena na ·« ···· obrázku 4. Podobně, supernatanty kultur B linie získané za stejných podmínek kontrol bez MS byly ošetřeny za stejných podmínek, a test na aktivitu reversní transkriptasy ve frakcích sacharosového gradientu ověřil negativní pozadí a je presentován na obrázku 5. Frakce 3 gradientu korespondující MS B linii a stejná frakce bez aktivity reversní transkriptasy kontrol bez MS byly analyzovány stejnou RT-PCR technikou jako předtím, kdy tato technika je odvozena od Shih (12), a potom následovaly stejné kroky klonování a sekvencování jako jsou popsány v příkladu 1.
Je zejména pozoruhodné, že MSRV-1 a MSRV-2 typ sekvence jsou nacházeny pouze v materiálu asociovaném s peakem LM7-podobné aktivity reversní transkriptasy pocházejícím z MS B lymfoblastoidní linie. Tyto sekvence nebyly nalezeny v materiálu od kontrolních (bez MS) B lymfoblastoidních linií u 26 rekombinantních klonů vybraných náhodně. Pouze Mo-MuLV typ kontaminující sekvence, pocházející z komerční reversní transkriptasy použité pro krok syntesy cDNA, a sekvence bez nějaké analogie s retroviry, byly nalezeny u těchto kontrol, v důsledku konsensuální amplifikace homologní polymerasové sekvence, která je produkována touto PCR technikou. Dále, absence koncentrovaných cílů, které soutěží o amplifikační reakci v kontrolním vzorku, umožňuje amplifikaci ředěných kontaminantů. Rozdíly ve výsledcích jsou manifestně vysoce signifikantní (chi-squared, p<0,001).
Příklad 3
Získání klonu PSJ17, definování retroviru MSRV-1, za pomoci reakce endogenní reversní transkriptasy s virionovými přípravky pocházejícími z PLI-2 linie.
• · ···* ·· ·* • · • ·· ··· * <
• · 4 ·· ··
Tento příklad je zaměřen na získání reversně transkribovaných DNA sekvencí ze předpokládáné retrovirové RNA v izolátu za použití aktivity reversní transkriptasy přítomné v tomto izolátu. Tato reversní transkriptasová aktivita může teoreticky účinkovat pouze za přítomnosti retrovirové RNA navázané na primer tRNA nebo hybridizované s krátkými řetězci DNA již reversně transkribované v retrovirových částicích (16).
Tak, získání specifických retrovirových sekvencí v materiálu kontaminovaném buněčnými nukleovými kyselinami bylo optimalizováno podle těchto autorů prostředky specifické enzymatické amplifikace částí virových RNA s aktivitou virové reversní transkriptasy. Na tomto konci určili autoři jisté fyzikálně-chemické podmínky, za kterých může být tato enzymatická aktivita reversní transkripce na RNA obsažené ve virionech účinná in vitro. Tyto podmínky korespondují technickému popisu protokolu, který je uveden dále (endogenní RT reakce, purifikace, klonování a sekvencování).
Molekulární přístup se skládal z použití přípravku koncentrovaného, ale nepurifikovaného virionu získaného ze supernatantů kultur PLI-2 linie, připravených následujícím způsobem: supernatanty kultur jsou odebírány dvakrát týdně, precentrifugovány při 10000 rpm po dobu 30 minut pro odstranění buněčné drtě a potom zmrazený při -80 °C nebo použity pro následující kroky. Čerstvé nebo rozmražené supernatanty jsou centrifugovány na základě 30% glycerol-PBS při 100000 x g (nebo 30000 rpm na typu 45 T LKB-HITACHI rotoru) po 2 hodiny při 4 °C. Po odstranění supernatantu je sedimentovaná peleta odebrána v malém objemu PBS a vytváří frakci koncentrovaného, ale nepurifikovaného virionu. Tento koncentrovaný, ale • · · ·
·· ·· nepurifikovaný virový vzorek byl použit pro provedení takzvané endogenní reversně transkripční reakce, jak je popsána dále.
Objem 200 μΐ virionu podle protokolu popsaného výše a obsahující aktivitu reversní transkriptasy asi 1-5 milionů dpm, je rozmražován při 37 °C dokud se neobjeví kapalná fáze a potom je umístěn na led. 5-krát koncentrovaný pufr byl připraven z následujících složek: 500 mM Tris-HCl pH 8,2; 75 mM NaCl; 25 mM MgCl2; 75 mM DTT a 0,10% NP 40; 100 μΐ 5xpufr + 25 μΐ 100 mM roztoku dATP + 25 ml 100 mM roztoku dTTP + 25 ml 100 μΜ roztoku dGTP + 25 μΐ 100 mM roztoku dCTP + 100 ml destilované vody + 200 ml virionové suspense (RT aktivita 5 milionů DPM) v PBS bylo smícháno a inkubováno při 42 °C po dobu 3 hodin. Po této inkubaci je reakční směs přidána přímo do pufrované směsi fenol/- chloroform/izoamyl alkohol (Sigma ref. P 3803); vodná fáze je odebrána a jeden objem sterilní destilované vody je přidán do organické fáze reextrahovaného reziduálního meteriálu nukleové kyseliny. Odebrané vodné fáze jsou kombinovány a obsažené nukleové kyseliny jsou precipitovány přidáním 3 M octanu sodného pH 5,2 do 1/10 objemu + 2 objemy ethanolu + l μΐ glykogenu (Boehringer Mannheim ref. 901 393) a umístěním vzorku při -20 °C po dobu 4 hodin přes noc při +4 °C. Precipitát získaný po centrifugaci je potom promyt 70% ethanolem a resuspendován v 60 ml destilované vody. Produkty této reakce byly potom purifikovány, klonovány a sekvencovány podle protokolu, který bude nyní popsán: byly generovány tupě zakončené DNA s nespárovanými adeniny na koncích: nejprve byla provedena filling in reakce: 25 μΐ dříve purifikovaného DNA roztoku bylo smíseno s 2 μΐ 2,5 M roztoku obsahujícího, v ekvimolárních množstvích, dATP + dGTP + dCTP/Ι μΐ T4 DNA polymerasy (Boehringer Mannheim ref. 1004 786) /5 μΐ 10 x
inkubační pufr pro restrikční enzym (Boehringer Mannheim ref. 1417 975) / 1 μΐ 1% roztoku hovězího sérového albuminu / 16 μΐ sterilní destilované vody. Tato směs byla inkubována po dobu 20 minut při 11 °C. 50 μΐ TE pufru a 1 μΐ glykogenu (Boehringer Mannheim ref. 901 393) byly přidány do směsi před extrakcí nukleových kyselin fenole/chloroform/izoamyl alkoholem (Sigma ref. P 3803) a precipitací octanem sodným jak je popsáno výše. DNA precipitovaná po centrifugaci je resuspendována v 10 μΐ 10 mM Tris pufru pH 7,5. 5 μΐ této suspense bylo potom smíseno s 20 μΐ 5x Taq pufru, 20 μΐ 5 mM dATP, 1 μΐ (5U) Taq DNA polymerasy (Amplitaq™) a 54 μΐ sterilní destilované vody. Tato směs je inkubována po dobu 2 hodin při 75 °C s olejovým filmem na povrchu roztoku. DNA suspendovaná ve vodném roztoku odebraném z pod olejového filmu po inkubaci je precipitována jak je popsáno výše a resuspendována v 2 μΐ sterilní destilované vody. Získaná DNA byla insertována do plasmidu za použití TA Cloning™ kitu. 2 μΐ DNA roztoku byly smíseny s 5 μΐ sterilní destilované vody, 1 μΐ 10-krát koncentrovaného ligačního pufru lOx LIGATION BUFFER, 2 μΐ pCR™ VECTOR (25 ng/ml) a 1 μΐ T4 DNA LIGASE. Tato směs byla inkubována přes noc při 12 °C. Následující kroky byly provedeny podle instrukcí TA CloningR kitu (British Biotechnology). Na konec procedury byly bílé kolonie rekombinantních bakterií (bílé) seškrábnuty, aby mohly být kultivovány a aby mohla být provedena extrakce plasmidů inkorporovaných podle takzvané miniprep procedury (17). Plasmidový přípravek z každé rekombinantní kolonie byl rozstřižen vhodným restrikčním enzymem a analyzován na agarosovém gelu. Plasmidy mající insert detekovaný pod UV světlem po barvení gelu ethidium bromidem byly vybrány pro sekvencování insertu, po hybridizaci s primery komplementárními k Sp6 promotoru přítomnému na klonovacím plasmidu TA klonovacího
• ·
kitu R. Reakce předcházející sekvencování byla potom provedena podle metody doporučené pro použití sekvencovacího kitu Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, ref. 401384) a automatické sekvencování bylo provedeno na Applied Biosystems Automatics Sequencer, model 373 A aparátu podle doporučení výrobce.
Diskriminační analýzy na počítačových databankách sekvence klonované z DNA fragmentů přítomných v reakční směsi umožnily odhalení retrovirového typu sekvence. Korespondující klon PSJ17 byl zcela sekvencován a získaná sekvence, presentovaná na obrázku 6 a identifikovaná SEQ ID NO: 9, byla analyzována za použití GenebankR databank. Identická sekvence již popsaná nebyla nalezena analýzou databank. Pouze částečná homologie s některými retrovirovými elementy byla nalezena. Nejužitečnější relativní homologie se týká endogenního retroviru označeného ERV-9, nebo HSERV-9, v souladu s odkazem (18).
Příklad 4
PCR amplifikace sekvence nukleové kyseliny obsažené mezi 5' regionem definovaným klonem pol MSRV-1B a 3' regionem definovaným klonem PSJ17
Bylo definováno pět oligonukleotidů, M001, M002-A, M003-BCD, P004 a P005 tak, aby amplifikovaly RNA pocházející z
Ί purifikovaných POL-2 virionů. Kontrolní reakce byly provedeny tak, aby potvrdily přítomnost kontaminantů (reakce s vodou). Amplifikace se skládala z RT-PCR kroku podle protokolu popsaného v příkladu 2, po kterém následovala nested PCR podle PCR protokolu popsaného v dokumentu EP-A-0569272. V prvním PCR cyklu
• · • · byly použity primery M001 a P004 nebo P005. Ve druhém PCR cyklu byly použity primery M002-A nebo M003-BCD a primer P004.
Primery jsou umístěny následovně:
M002-A
M003-BCD
M001 _ P004 P005 ____ RNA
POL-2 <--------------> <---------------------------------> pol MSRV-1B PSJ17
Jejich složení je primer M001: GGTCITICCICAIGG (SEQ ID NO: 20) primer M002-A: TTAGGGATAGCCCTCATCTCT (SEQ ID NO: 21) primer M003-BCD: TCAGGGATAGCCCCCATCTAT (SEQ ID NO: 22) primer PO04: AACCCTTTGCCACTACATCAATTT (SEQ ID NO: 23) primer P005: GCGTAAGGACTCCTAGAGCTATT (SEQ ID NO: 24)
Produkt získaný nested amplifikací, a který byl označen M003-P004, je presentován na obrázku 7 a korespondueje sekvenci SEQ ID NO: 8.
Příklad 5
Amplifikace a klonování části MSRV-1 retrovirového genomu za použití sekvence již identifikované, ve vzorku viru purifikovaném v peaku aktivity reversní transkriptasy
PCR technika odvozená od techniky, kterou publikoval Frohman • · · · • · • · · · • · ·· · · (19) byla použita. Odvozená technika umožňuje, za použití specifického primeru v 3' konci genomu, který má být amplifikován, elongovat sekvenci směrem k 5'- regionu genomu, který má být analyzován. Tato technická varianta je popsána v dokumentaci firmy Clontech Laboratories lne., (Palo Alto, California, USA) dodávané spolu s jejím výrobkem 5'-AmpliFINDER™ RACE Kit, který byl použit na frakci virionu purifikovanou jak je popsáno výše.
Specifické 3' primery použité v protokolu kitu pro syntesu ČDNA a pro PCR amplifikaci jsou, v příslušném pořadí, komplementární k následujícím MSRV-1 sekvencím:
cDNA: TCATCCATGTACCGAAGG (SEQ ID NO: 25) amplifikace: ATGGGGTTCCCAAGTTCCCT (SEQ ID NO: 26)
Produkty pocházející z PCR byly purifikovány po purifikaci na agarosovém gelu podle běžných metod (17) a potom byly resuspendovány v 10 ml destilované vody. Protože jedna vlastnost Taq polymerasy spočívá v přidání adeninu v 31 konci každého ze dvou DNA řetězců, byla získaná DNA insertována přímo do plasmidu za použití TA Cloning™ kitu (British Biotechnology). 2 μΐ DNA roztoku byly smíchány s 5 μΐ sterilní destilované vody, 1 μΐ 10-krát koncentrovaného ligačního pufru 10' LIGATION BUFFER, 2 μΐ pCR™ VECTOR (25 ng/ml) a 1 /il T4 DNA LIGASA . Směs byla inkubována přes noc při 12 °C. Následující kroky byly provedeny podle instrukcí TA Cloning™ kitu (British Biotechnology). Na konec procedury byly bílé kolonie rekombinantních bakterií (bílé) seškrábnuty, aby mohly být kultivovány a aby mohla být provedena extrakce plasmidů inkorporovaných podle takzvané miniprep procedury (17). Plasmidový přípravek z každé
rekombinantní kolonie byl rozstřižen vhodným restrikčním enzymem a analyzován na agarosovém gelu. Plasmidy mající insert detekovaný pod UV světlem po barvení gelu ethidium bromidem byly vybrány pro sekvencování insertu, po hybridizaci s primerem komplementárním k Sp6 promotoru přítomnému na klonovacím plasmidu TA klonovacího kitu R. Reakce předcházející sekvencování byla potom provedena podle metody doporučené pro použití sekvencovacího kitu Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle seguencing kit (Applied Biosystems, ref. 401384) a automatické sekvencování bylo provedeno na Applied Biosystems Automatics Sequencer, model 373 A aparátu podle doporučení výrobce.
Tato technika byla nejprve aplikována na dvě frakce virionů purifikované jak je popsáno dále na sacharose z POL-2 izolátu produkovaného PLI-2 linií na jedné straně a z MS7PG izolátu produkovaného LM7PC linií na straně druhé. Supernatanty kultur jsou odebírány dvakrát týdně, precentrifugovány při 10000 rpm po dobu 30 minut pro odstranění buněčné drtě a potom zmrazený při -80 °C nebo použity pro následující kroky. Čerstvé nebo rozmražené supernatanty jsou centrifugovány na podkladě 30% glycerolu-PBS při 100000 x g (nebo 30000 rpm na typu 45 T LKB-HITACHI rotoru) po 2 hodiny při 4 °C. Po odstranění supernatantu je sedimentovaná peleta odebrána v malém objemu PBS a vytváří frakci koncentrovaného, ale nepurifikovaného virionu. Koncentrovaný virus je potom aplikován na sacharosový gradient ve sterilním PBS pufru (15 až 50% hmotnost/hmotnost) a ultracentrifugován při 35000 rpm (100000 g) po dobu 12 hodin při +4 °C v odstředivém rotoru. Je odebráno 10 frakcí a z každé frakce je odebráno 20 μΐ po homogenizaci pro testování aktivity reversní transkriptasy podle techniky, kterou popsal H. Perron • ·
·· ···· (3). Frakce obsahující peak LM7-podobné RT aktivity jsou potom ředěny ve sterilním PBS pufru a ultracentrifugovány po jednu hodinu při 35000 rpm (100000 g) pro sedimentaci virových částic. Peleta purifikovaného virionu takto získaná je potom odebrána v malém množství pufru, který je vhodný pro extrakci RNA. Reakce cDNA syntesy zmíněná výše je potom provedena na této RNA extrahované z purifikovaného extracelulárního virionu. PCR amplifikace podle techniky uvedené výše umožňuje získání klonu Fl-11, jehož sekvence, identifikovaná SEQ ID NO: 2, je ukázána na obrázku 8.
Tento klon umožňuje definovat, s různými dříve sekvencovanými klony, region značné délky (1,2 kb) representativní pro pol gen MSRV-1 retroviru, jak je presentován na obrázku 9. Tato sekvence, označená SEQ ID NO: 1, je znovu vytvořena z různých klonů přesahujících se navzájem na svých koncích, což koriguje artefakty asociované s primery a s amplifikačními nebo klonovacími technikami, které mohou arteficiálně úplně přerušovat čtecí rámeček. Tato sekvence bude identifikována pod označením MSRV-1 pol* region. Stupeň její homologie s HSERV sekvencí je ukázán na obrázku 12.
Na obrázku 9 je potenciální čtecí rámeček s jeho translací na aminokyseliny presentován pod sekvencí nukleové kyseliny.
Příklad 6
Detekce specifických MSRV-1 a MSRV-2 sekvencí v různých vzorcích plasmy pocházející od pacientů trpících MS nebo od kontrol • · · * ·· ··
PCR technika byla použita pro detekci MSRV-l a MSRV-2 genomů v plasmě získané odběrem krve od pacientů trpících MS a od non-MS kontrol na EDTA.
Extrakce RNA z plasmy byla provedena podle techniky, kterou popsal P. Chomzynski (20), po přidání jednoho objemu pufru obsahujícího guanidinium thiokyanát k 1 ml zmražené plasmy uskladněné při -80 °C po odběru.
Pro MSRV-2 byla PCR provedena za stejných podmínek a s následujícími primery:
- 5' primer, identifikovaný SEQ ID NO: 14
5' GTAGTTCGATGTAGAAAGCG 3';
- 3' primer, identifikovaný SEQ ID NO: 15
5' GCATCCGGCAACTGCACG 3'.
Nicméně, podobné výsledky byly také získány s následujícími PCR primery ve dvou následných amplifikacích za použití nested PCR s vzorky nukleových kyselin neošetřených DNAsou.
Primery použité pro tento první krok 40 cyklů s hybridizační teplotou 48 °C jsou:
- 5' primer, identifikovaný SEQ ID NO: 27
5' GCCGATATCACCCGCCATGG 3', korespondující 5' MSRV-2 primeru, pro první PCR se vzorky od pacientů,
- 3' primer, identifikovaný SEQ ID NO: 28
5' GCATCCGGCAACTGCACG 3', korespondující 3' MSRV-2 primeru, pro první PCR se vzorky od pacientů.
Po tomto kroku je 10 μΐ produktu amplifikace odebráno a použito pro provedení druhé, takzvané nested PCR amplifikace s primery umístěnými v již amplifikovaném regionu. Tento druhý krok probíhá při 35 cyklech s teplotou hybridizace primeru (tepelného zpracování) 50 °C. Reakční objem je 100 μΐ.
Primery použité pro tento druhý krok jsou následující:
- 5'primer, identifikovaný SEQ ID NO: 29
5' CGCGATGCTGGTTGGAGAGC 3', korespondující k 5'MSRV-2 PCR primeru, pro nested PCR na vzorcích od pacientů,
- 3'primer, identifikovaný SEQ ID NO: 30
5' TCTCCACTCCGAATATTCCG 3', korespondující k 3'MSRV-2 PCR primeru, pro nested PCR na vzorcích od pacientů.
Pro MSRV-1 byla amplifikace provedena ve dvou krocích. Kromě toho, vzorek nukleové kyseliny je předem ošetřen DNAsou a je provedeno kontrolní PCR bez RT (AMV reversní transkriptasa) ve dvou amplifikačních krocích tak, aby se potvrdilo, že RT-PCR amplifikace pochází exklusivně z MSRV-1 RNA. V případě pozitivní kontroly bez RT je počáteční aliquota vzorku RNA znovu ošetřena DNAsou a znovu amplifikována.
Protokol pro ošetření DNAsou postrádající RNAsovou aktivitu je následující: extrahovaná RNA je rozdělena do aliquot za přítomnosti inhibitoru RNAsy (Boehringer Mannheim) ve vodě ošetřené DEPC v konečné koncentraci ^g na 10 μΐ; k těmto 10 μΐ je přidán 1 μΐ RNAsa prosté DNAsy (Boehringer Mannheim) a 1,2 • · μΐ pufru ο pH 5 obsahujícího Ο,1Μ/1 octanu sodného a 5 mM/l MgSO4; směs je inkubována po dobu 15 minut při 20 °C a umístěna při 95 °C na dobu 1,5 minuty v thermocykleru.
První MSRV-l RT-PCR krok je proveden podle varianty RNA amplifikační metody jak je popsána v patentové přihlášce č. EP-A-0569272. Konkrétně, krok cDNA syntesy je proveden při 42 °C po dobu jedné hodiny; PCR amplifikace probíhá při 40 cyklech s teplotou hybridizace primerů (tepelného zpracování) 53 °C. Reakční objem je 100 μΐ.
Primery použité pro tento druhý krok jsou následující:
- 5'primer, identifikovaný SEQ ID NO: 16
5' AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3'
- 3'primer, identifikovaný SEQ ID NO: 17
5' TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3'.
Po tomto kroku je 10 μΐ produktu amplifikace odebráno a použito pro provedení druhé, takzvané nested PCR amplifikace s primery umístěnými v již amplifikovaném regionu. Tento druhý krok probíhá při 35 cyklech s teplotou hybridizace primerů (tepelného zpracování) 53 °C. Reakční objem je 100 μΐ.
Primery použité pro tento druhý krok jsou následující:
- 5'primer, identifikovaný SEQ ID NO: 18
5' TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3';
- 3'primer, identifikovaný SEQ ID NO: 19 ·· • · · ·
5' AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3'.
Obrázky 10 a 11 předkládají výsledky PCR ve formě fotografie agarosových gelů impregnovaných ethidium bromidem pod ultrafialovým světlem, kde na těchto gelech byla provedena elektroforesa produktů amplifikovaných PCR aplikovaných separátně do různých jamek.
Horní fotografie (obrázek 10) ukazuje výsledky specifické MSRV-2 amplifikace.
Jamka číslo 8 obsahuje směs markérů molekulové hmotnosti DNA a jamky 1 až 7 representují, v pořadí, produkty amplifikované z celkové RNA plasem pocházejících od 4 zdravých kontrol bez MS (jamky 1 až 4) a od 3 pacientů trpících MS v různých stadiích onemocnění (jamky 5 až 7).
V této sérii je materiál MSRV-2 nukleové kyseliny detekován v plasmě v jednom případě MS ze 3 testovaných a v žádné ze 4 testovaných kontrolních plasem. Jiné výsledky získané v rozsáhlejší sérii potvrzují tyto výsledky.
Dolní fotografie (obrázek 11) ukazuje výsledky specifické amplifikace MSRV-1 nested RT-PCR:
jamka č. 1 obsahuje PCR produkt produkovaný vodou samotnou, bez přidání AMV reversní transkriptasy; jamka č. 2 obsahuje PCR produkt produkovaný vodou samotnou, s přidáním AMV reversní transkriptasy; jamka č. 3 obsahuje směs markérů molekulové hmotnosti DNA; jamky č. 4 až 13 obsahují, popořadě, produkty amplifikované z celkových RNA extrahovaných z frakcí sacharosového gradientu (odebíraných v sestupném směru), kde v ···· • » · · • · · · tomto gradientu byla centrifugována do rovnováhy peleta pocházející ze supernatantu kultury infikované MSRV-1 a MSRV-2, podle protokolu, který popsal H. Perron (13); do jamky č. 14 nebylo aplikováno nic; do jamek 15 až 17 byly aplikovány produkty amplifikované z celkové RNA plasem pocházejících od 3 pacientů trpících MS v různých stadiích onemocnění.
MSRV-1 retrovirový genom je kromě toho nacházen ve frakcích sacharosového gradientu obsahujících vrchol aktivity reversní transkriptasy měřené podle techniky, kterou popsal H. Perron (13), s velmi silnou intesitou (frakce 5 gradientu, umístěná do jamky č. 8). Slabá amplifikace proběhla v první frakci (jamka č. 4), což pravděpodobně koresponduje RNA uvolněné lyžovanými částicemi, které připluly na povrch gradientu; podobně, agregovaná drú byla sedimentována v poslední frakci (dno tuby), a nesla s sebou několik kopií MSRV-1 genomu, který dával amplifikaci při nízké intensitě.
Ze tří testovaných plasem v této sérii byla MSRV-1 RNA přítomna v jednom případě a produkovala velmi intesivní amplifikaci (jamka č. 17).
V této sérii, MSRV-1 retrovirový RNA genom pravděpodobně korespondující s částicemi extracelulárního viru přítomnými v plasmě v mimořádně malém množství byl detekován nested RT-PCR v jednom případě MS ze tří testovaných. Jiné výsledky získané v rozsáhlejší studii potvrzují tyto výsledky.
Kromě toho, specificita sekvencí amplifikovaných těmito PCR technikami může být ověřena a hodnocena za použití ELOSA techniky, kterou popsal F. Mallet (21) a která je v dokumentu ·♦
FR- A-2663040.
Pro MSRV-1 může být produkt nested PCR popsané výše testován ve dvou ELOSA systémech umožňujících separátní detekci konsensu A a konsensu B+C+D MSRV-1, které korespondují podrodinám popsaným v příkladu 1 a obrázkách 1 a 2. Skutečně, sekvence těsně odpovídající konsensu B+C+D jsou nacházeny v RNA vzorcích pocházejících z MSRV-1 virionů purifikovaných z kultur nebo amplifikovaných v extracelulárních biologických tekutinách od MS pacientů, zatímco sekvence těsně odpovídající konsensu A jsou nacházeny v normální lidské celulární DNA.
ELOSA/MSRV-1 systém pro zachycení a specifickou hybridizaci PCR produktů podrodiny A využívá zachycení oligonukleotidem cpVlA s amino vazbou na 5' konci a biotynylovaného detekčního oligonukleotidu dpVlA, které mají sekvence, v příslušném pořadí:
- cpVlA identifikovaný SEQ ID NO: 31
5' GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3’, korespondující ELOSA záchytnému oligonukleotidu pro produkty MSRV-1 nested PCR provedené s primery identifikovanými SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO:
17, volitelně s následnou amplifikací primery identifikovanými SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 19 na vzorcích od pacientů;
- dpVlA identifikovaný SEQ ID NO: 32
5' CATCTITTTGGICAGGCAITAGC 3' , koresponduj ící ELOSA záchytnému oligonukleotidu pro podrodinu A produktů MSRV-1 nested PCR provedené s primery identifikovanými SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17, volitelně s následnou amplifikací primery identifikovanými SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 19 na vzorcích od pacientů.
• · · · • ·
ELOSA/MSRV-1 systém pro zacycení a specifickou hybridizaci PCR produktů podrodiny B+C+D využívá stejný biotynylovaný detekční oligonukleotid dpVlA a záchytný oligonukleotid cpVlB s amino vazbou na 5' konci, který má tuto sekvenci:
- dpVlB identifikovaný SEQ ID NO: 33
5' CTTGAGCCAGTTCTCATACCTGGA 3', koresponduj ící ELOSA záchytnému oligonukleotidu pro podrodinu B+C+D produktů MSRV-1 nested PCR provedené s primery identifikovanými SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 17, volitelně s následnou amplifikaci primery identifikovanými SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 19 na vzorcích od pacientů.
Tento ELOSA detekční systém umožňuje ověření toho, že žádný z PCR produktů takto amplifikovaných z DNAsou ošetřených vzorků od MS pacientů neobsahuje sekvenci podrodiny A a že jsou všechny pozitivní na konsensus podrodin B, C a D.
Pro MSRV-2 byla hodnocena podobná ELOSA technika na izolátech pocházejících z infikovaných buněčných kultur, za použití následujících primerů pCR amplifikace,
- 5'primeru, identifikovaného SEQ ID NO: 34
5' AGTGYTRCCMCARGGCGCTGAA 3', který koresponduje 5' MSRV-2 PCR primeru, pro PCR na vzorky z kultur,
- 3' primeru, identifikovaného SEQ ID NO: 35
5' GMGGCCAGCAGSAKGTCATCCA 3', který koresponduje 3' MSRV-2 PCR primeru, pro PCR na vzorky z kultur, a záchytných oligonukleotidů s amino vazbou na 5' konci cpV2
a biotynylováného detekčního oligonukleotidu dpV2 majím jejich příslušné sekvence:
- cpV2 identifikovaný SEQ ID NO: 36
5' GGATGCCGCCTATAGCCTCTAC 3', koresponduj ící ELOSA záchytnému oligonukleotidu pro produkty MSRV-2 PCR provedené s primery identifikovanými SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 35, nebo volitelně s degenerovanými primery definovanými Shihem (12).
- dpV2 identifikovaný SEQ ID NO: 37
5' AAGCCTATCGCGTGCAGTTGCC 3', koresponduj ící ELOSA detekčnímu oligonukleotidu pro produkty MSRV-2 PCR provedené s primery identifikovanými SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 35, nebo volitelně s degenerovanými primery definovanými Shihem (12).
Tento PCR amplifikační systém s páry primerů odlišnými od těch, které byly popsány dříve pro amplifikaci na vzorku od pacientů umožnil potvrdit infekci in vitro kultur a vzorků nukleových kyselin použitých ve studiích molekulární biologie MSRV-2.
Dohromady, první výsledky PCR detekce genomu patogenních a/nebo infekčních agens ukazují, že je možné, že volný virus může cirkulovat v krvi pacienta v akutní, virulentní fázi, mimo nervový systém. Toto je v souladu s téměř invariabilní přítomností mezer v hematoencefalické barieře u pacientů v aktivní fázi MS.
·· ···· ·· ··
Příklad 7: Získání sekvencí env genu retrovirového genomu MSRV-1
Jak již bylo popsáno v příkladu 5, byla použita PCR technika odvozená od techniky, kterou publikoval Frohman (19). Odvozená technika umožňuje, za použití specifických primerů v 3' konci genomu, který má být amplifikován, prodlou=žit sekvenci směrem k 5' regionu genomu, který je analyzován. Tato technická varianta je popsána v dokumentaci firmy Clontech Laboratories lne., (Palo Alto, California, USA) dodávané spolu s jejím výrobkem 5'-AmpliFINDER™ RACE Kit, který byl použit na frakci virionu purifikovanou jak je popsáno výše.
Pro provedení amplifikace 3' regionu MSRV-1 retrovirového genomu obsahujícího region env genu byla provedena studie pro určení konsensuální sekvence v LTR regionech stejného typu jako je defektní endogenní retrovirus HSERV-9 (18, 24), se kterým vykazuje MSRV-1 retrovirus částečnou homologii.
Stejné specifické 3' primer byl použit v protokolu kitu pro syntesu cDNA a PCR amplifikaci, jej o sekvence je:
GTGCTGATTGGTGTATTTACAATCC (SEQ ID NO: 45)
Syntesa komplementární DNA (cDNA) a jednosměrná PCR amplifikace s výše uvedeným primerem byly provedeny v jednom kroku za použití metody popsané v patentu EP-A-0569272.
Produkty pocházející z PCR byly extrahovány po purifikaci na agarosovém gelu podle běžných metod (17) a potom byly resuspendovány v 10 ml destilované vody. Protože jednou »· ····
vlastností Taq polymerasy je přidání adeninu na 3' konec každého ze dvou DNA řetězců, byla získaná DNA insertována přímo do plasmidu za použití TA Cloning™ kitu (British Biotechnology). 2 μΐ DNA roztoku byly smíseny s 5 μΐ sterilní destilované vody, 1 μΐ 10-krát koncentrovaného ligačního pufru lOx LIGATION BUFFER, 2 μΐ pCR™ VECTOR (25 ng/ml) a 1 μΐ T4 DNA LIGASE. Tato směs byla inkubována přes noc při 12 °C. Následující kroky byly provedeny podle instrukcí TA CloningR kitu (British Biotechnology). Na konec procedury byly bílé kolonie rekombinantních bakterií (bílé) seškrábnuty, aby mohly být kultivovány a aby mohla být provedena extrakce plasmidů inkorporovaných podle takzvané miniprep procedury (17). Plasmidový přípravek z každé rekombinantní kolonie byl rozstřižen vhodným restrikčním enzymem a analyzován na agarosovém gelu. Plasmidy mající insert detekovaný pod UV světlem po barvení gelu ethidium bromidem byly vybrány pro sekvencování insertu, po hybridizaci s primery komplementárními k Sp6 promotoru přítomnému na klonovacím plasmidu TA klonovacího kituR. Reakce předcházející sekvencování byla potom provedena podle metody doporučené pro použití sekvencovacího kitu Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, ref. 401384) a automatické sekvencování bylo provedeno na Applied Biosystems Automatics Sequencer, model 373 A (lakuna) aparátu podle doporučení výrobce.
Tento technický přístup byl aplikován na virion koncentrovaný jak je popsáno dále ze směsi supernatantů kultur produkovaných B lymfoblastoidními liniemi jak jsou popsány v příkladu 2, vzniklými z lymfocytů od pacientů trpících MS a majících aktivitu reversní transkriptasy, která je detekovatelná podle metody, kterou popsal Perron et al., (3): supernatanty kultur • · ·· ···· ·· ··
amplifikaci RNA pocházející z koncentrovaných virionů kmenů P0L2 a MS7PG. Kontrolní reakce byly provedeny tak, aby potvrdily přítomnost kontaminantů (reakce s vodou). Amplifikace se skládala z prvního kroku RT-PCR podle protokolu popsaného patentové přihlášce EP-A-0569272, po kterém následoval druhý krok PCR provedené na 10 ml produktu prvního kroku s primery vnitřními k amplifikovanému prvnímu regionu (nested PCR.
V prvním PCR cyklu byly použity primery F1 a B4. Ve druhém PCR cyklu byly použity primery F6 a B4. Primery jsou umístěny následovně:
F1 F6 Bl B4 ___ RNA
MSRV-1
PSJI7 FBd3 <-------------------------/-------5' pol MSRV-1 3' pol MSRV-1 /
5' env
Jejich složení je primer F1: TGATGTGAACGGCATACTCACTG (SEQ ID NO: 47) primer B4: CCCAGAGGTTAGGAACTCCCTTTC (SEQ ID NO: 48) primer F6 : GCTAAAGGAGACTTGTGGTTGTCAG (SEQ ID NO: 49) primer bl: CAACATGGGCATTTCGGATTAG (SEQ ID NO: 50)
Produkt získaný nested amplifikací, a který byl označen t pol je presentován na obrázku 15, koresponduje sekvenci SEQ ID NO: 51.
• · · · ·· ··
··
Příklad 9: Získání nových sekvencí, exprivovaných jako RNA v buňkách v kultuře produkující MSRV-1 a obsahujících env region MSRV-1 retrovirového genomu
Knihovna cDNA byla produkována podle postupu popsaného výrobcem cDNA synthesis module, cDNA rapid adaptor ligation module, cDNA rapid cloning module and lambda gtlO in vitro packaging module kitů (Amersham, ref RPN1256Y/Z, RPN1712, RPN1713, RPN1717, N334Z), z messengerové RNA extrahované z buněk B lymfoblastoidní linie jak je popsána v příkladu 2, vzniklé z lymfocytů od pacienta trpícího MS a majících aktivitu reversní transkriptasy, která je detekovatelná technikou, kterou popsal Perron et al., (3) .
Byly definovány oligonukleotidy pro amplifikaci cDNA klonované do knihovny nukleové kyseliny mezi 3' region klonu PSJ17 (pol) a 5' (LTR) region klonu FBd3. Kontrolní reakce byly provedeny tak, aby testovaly přítomnost kontaminantů (reakce s vodou). PCR reakce provedené na nukleových kyselinách klonovaných do knihovny s různými páry primerů umožnily amplifikaci sérií (lakun) klonů navazujících pol sekvenci na env nebo LTR sekvence MSRV-1.
Dva klony jsou representativní pro sekvence získané v buněčné cDNA knihovně:
- klon JLBcl, jehož sekvence SEQ ID NO: 52 je presentována na obrázku 16;
- klon JLBc2, jehož sekvence SEQ ID NO: 53 je presentována na obrázku 17.
Sekvence klonů JLBcl a JLBc2 jsou homologní k sekvenci klonu FBd3, jak je jasné z obrázků 18 a 19. Homologie mezi klonem JLBcl a klonem JLBc2 je ukázána na obrázku 20.
Homologie mezi klony JLBcl a JLBc2 na straně jedné a sekvencí HSERV9 na straně druhé je presentována, v příslušném pořadí, na obrázcích 21 a 22.
Bude zazne^náno, že region homologie mezi JLB1 a JLB2 a FBd3 obsahuje, s několika variacemi sekvence a velikosti insertu, další sekvenci nepřítomnou (insertovanou) v env sekvenci HSERV-9, jak je popsáno v příkladu 9.
Bude také zaznamenáno, že klonovaný pol region je vysoce homologní k HSERV-9, nemá čtecí rámeček (nesoucí chyby sekvence indukované použitými technikami, i včetně automatického sekvenátoru) a liší se od MSRV-1 sekvence získané od virionů. Ve světle skutečnosti, že tyto sekvence byly klonovány z RNA buněk exprivujících MSRV-1 částice je pravděpodobné, že pocházejí z endogenních retrovirovych elementů příbuzných k ERV9 rodině; toto je pravděpodobnější pro skutečnost, že pol a env geny jsou přítomny na stejné RNA, která jasně není genomovou RNA MSRV-1. Některé z těchto ERV9 elementů nesou funkční LTR, které mohou být aktivovány replikativními viry kódujícími homologní nebo heterologní transaktivátory. Za těchto podmínek, vztahy mezi MSRV-1 a HSERV-9 činí pravděpodobným transaktivaci defektních (nebo jiných) endogenních ERV9 elementů homologními, nebo i identickými, MSRV-1 transaktivujícími proteiny.
Takový fenomén může indukovat virovou interferenci mezi expresí MSRV-1 a příbuznými endogenními elementy. Taková
·» ···· ·· • · · · • · ·· ·*· · · • · * purifikovanou jak je popsáno výše.
Pro provedení amplifikace 5' regionu MSRV-1 retrovirového genomu začínajícího od již sekvencované pol sekvence (klon Fll-l) a dosahující ke gag genu byly definovány MSRV-1 specifické primery.
Specifické 3' primery použité v protokolu kitu pro syntesu cDNA a PCR amplifikaci, v příslušném pořadí, komplementární k následujícím sekvencím MSRV-1:
CDNA: (SEQ ID NO: 54)
CCTGAGTTCTTGCACTAACCC
Amplifikace: (SEQ ID NO: 55)
GTCCGTTGGGTTTCCTTACTCCT
Produkty pocházející z PCR byly extrahovány po purifikaci na agarosovém gelu podle běžných metod (17) a potom byly resuspendovány v 10 ml destilované vody. Protože jednou vlastností Taq polymerasy je přidání adeninu na 3' konec každého ze dvou DNA řetězců, byla získaná DNA insertována přímo do plasmidu za použití TA Cloning™ kitu (British Biotechnology). 2 μΐ DNA roztoku byly smíseny s 5 μΐ sterilní destilované vody, 1 μΐ 10-krát koncentrovaného ligačního pufru lOx LIGATION BUFFER, 2 μΐ pCR™ VECTOR (25 ng/ml) a 1 μΐ T4 DNA LIGASE. Tato směs byla inkubována přes noc při 12 °C. Následující kroky byly provedeny podle instrukcí TA CloningR kitu (British Biotechnology). Na konec procedury byly bílé kolonie rekombinantních bakterií (bílé) seškrábnuty, aby mohly být kultivovány a aby mohla být provedena extrakce plasmidů
»« ···· ·· ·· • · · • ·· ··· · · • · · ·· ·· inkorporovaných podle takzvané miniprep procedury (17).
Plasmidový přípravek z každé rekombinantní kolonie byl rozstřižen vhodným restrikčním enzymem a analyzován na agarosovém gelu. Plasmidy mající insert detekovaný pod UV světlem po barvení gelu ethidium bromidem byly vybrány pro sekvencování insertu, po hybridizaci s primerem komplementárním k Sp6 promotoru přítomnému na klonovacím plasmidu TA klonovacího kituR. Reakce předcházející sekvencování byla potom provedena podle metody doporučené pro použití sekvencovacího kitu Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, ref. 401384) a automatické sekvencování bylo provedeno na Applied Biosystems Automatics Sequencer, model 373 A (lakuna) aparátu podle doporučení výrobce.
Tento technický přístup byl aplikován na vzorek virionu koncentrova jak je popsáno dále ze směsi supernatantů kultur produkovaných B lymfoblastoidními liniemi jak jsou popsány v příkladu 2, vzniklými z lymfocytů od pacientů trpících MS a majících aktivitu reversní transkriptasy, která je detekovatelná podle metody, kterou popsal Perron et al., (3): supernatanty kultur jsou odebírány dvakrát týdně, precentrifugovány při 10000 rpm po dobu 30 minut pro odstranění buněčné drtě a potom zmrazený při -80 °C nebo použity pro následující kroky. Čerstvé nebo rozmražené supernatanty jsou centrifugovány na podkladě 30% glycerol-PBS při 100000 x g po 2 hodiny při 4 °C. Po odstranění supernatantu vytváří sedimentovaná peleta vzorek koncentrovaného, ale nepurifikovaného virionu. Takto získaná peleta je potom umístěna v malém objemu vhodného pufru pro extrakci RNA. Reakce syntesy cDNA uvedená výše je provedena na této RNA extrahované z koncentrovaného extracelulárního virionu.
• · · · • ·
RT-PCR amplifikace podle této techniky uvedené výše umožňuje získání klonu GM3, jehož sekvence, identifikovaná SEQ ID NO:
56, je ukázána na obrázku 23.
Na obrázku 24 je homologie sekvence mezi klonem GMP3 a HSERV-9 retrovirem ukázaná na matricovém grafu nepřerušovanou linií pro jakoukoliv částečnou homologii vyšší nebo rovnou 65%.
Závěrem, obrázek 25 ukazuje lokalizaci různých klonů studovaných výše, ve vztahu ke známému ERV9 genomu. Na obrázku 25 je, protože MSRV-1 env region je delší než referenční ERV9 env gen, ukázán další region nad místem inserce podle V, kdy je bráno v úvahu, že insertovaný materiál vykazuje variabilitu sekvence a velikosti mezi ukázanými klony (JLBcl, JLBc2 a FBd3), a obrázek 26 ukazuje pozici různých studovaných klonů v pol* regionu MSRV-1.
Pomocí klonu GM3 popsaného výše může být definován pravděpodobný čtecí rámeček, pokrývající celý pol gen, ve vztahu k SEQ ID NO: 57, který je ukázán v následujících obrázcích 27 a až 27c.
Příklad 11: Detekce anti-MSRV-1 specifických protilátek v lidském séru
Identifikace sekvence pol genu MSRV-1 retroviru a otevřeného čtecího rámečku tohoto genu umožnila určení aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 39 regionu uvedeného genu, označeného SEQ ID NO: 40 (viz obrázek 28).
• · • · • · · ·
Různé syntetické peptidy korespondující fragmentům proteinové sekvence reversní transkriptasy MSRV-1 kódované pol genem byly testovány na jejich antigenní specificitu s ohledem na sérum od pacientů trpících MS a od zdravých kontrol.
Peptidy byly syntetizovány chemicky syntesou na pevné fázi podle Merrifieldovi techniky (Barany G., Merrifielsd R.B., 1980, v Peptides, 2, 1 - 284, Gross E a Meinhofer J., Eds., Academie Press, New York). Praktické detaily jsou zde popsány dále.
a) Syntesa peptidů
Peptidy byly syntetizovány na fenylacetamidomethyl (PAM)/polystyren/divinylbenzenové pryskyřici (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA) za použití Applied Biosystems 430A automatického syntetizéru. Aminokyseliny jsou spojovány ve formě hydroxybenzotriazolových (HOBT) esterů. Použité aminokyseliny jsou získány od Novabiochem (Lauflerlfingen, Switzerland) nebo Bachem (Bubendorf, Switzerland).
Chemická syntesa byla provedena za použití protokolu dvojitého párování s N-methylpyrrolidonem (NMP) jako rozpouštědlem. Peptidy byly odstřiženy od pryskiřice, stejně jako protektivní skupiny postraního řetězce, simultáně, za použití kyseliny fluorovodíkové (HF) ve vhodném přístroji (typ I štěpícího přístroje, Peptide Institute, Osaka, Japan).
Pro 1 g peptidylové pryskyřice je použito 10 ml HF, 1 ml anisolu a 1 ml dimethylsulfid 5 DMA. Směs je míchána po dobu 45 minut při -2 °C. HF je potom odevaporována ve vakuu. Po intensivním promytí etherem je peptid eluován z pryskyřice 10%
kyselinou octovou a potom je lyofilizován.
Peptidy jsou purifikovány preparativní kapalinovou chromatografii s vysokou rozlišovací schopností na VYDAC C18 typu kolony (250 x 21 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA) . Eluce je provedena acetonitrilem za gradientu s průtokem 22 ml/min. Odebrané frakce jsou monitorovány elucí za izokratických podmínek na VYDAC11 analytické koloně (250 x 4,6 mm) při průtoku 1 ml/min. Frakce mající stejný čas retence jsou shromážděny a lyofilizovány. Převládající frakce je potom analyzována analytickou kapalinovou chromatografii s vysokou rozlišovací schopností za použití systému popsaného výše. Peptid je potom považován za akceptovatelně čistý, manifestuje-li se v jediném peaku representujícím ne méně než 95% chromatogramu.
Purifikované peptidy jsou potom analyzovány s tím, že předmětem monitorování je jejich aminokyselinové složení, za použití Applied Biosystems 420H automatického analyzátoru aminokyselin. Měření (průměrné) chemické molekulové hmotnosti peptidů je získáno za použití LSIMS hmotnostního spektrometru v pozitivním iontovém modu na VG. ZAB.ZSEQ dvojitě zaměřujícím přístroji připojeném na DEC-VAX 2000 získaného systému (VG analytical Ltd, Manchester, England).
Reaktivita různých peptidů byla testována proti sérům pacientů trpících MS a proti sérům zdravých kontrol. Toto umožnilo vybrat peptid označený POL2B, jehož sekvence je ukázána na obrázku 28 v identifikované SEQ ID NO: 39, dále, kódované pol genem MSRV-1 (nukleotidy 181 - 330) .
• · * • ·
b) Antigenní vlastnosti:
Antigenní vlastnosti POL2B peptidu byly demonstrovány podle ELISA protokolu popsaného dále.
Lyofilizovaný P0L2B peptid byl rozpuštěn ve sterilní destilované vodě v koncentraci 1 mg/ml. Tento zásobní roztok byl rozdělen do aliquot a udržován při +4 °C pro použití do dvou týdnů, nebo byl zmrazen při -20 °C pro použití během dvou měsíců. Aliquota je ředěna v PBS (fosfátem pufrovaný salinický roztok) roztoku tak, aby byla získána konečná koncentrace peptidu 1 ^g/ml. 100 μΐ tohoto ředění je umístěno do každé jamky mikrotitrační plotny (high binding plastová, COSTAR ref:
3590). Plotny jsou překryty adhesivním typem krytí ploten a jsou uchovávány přes noc při +4 °C pro fázi adsorpce peptidu na plast. Adhesivum je odstraněno a plotny jsou třikrát promyty objemem 300 μΐ roztoku A (1 x PBS, 0,05% Tween 20R), a potom invertovány přes adsorbentní tkáň. Takto vyprázdněné plotny jsou naplněny 200 μΐ na jamku roztokem B (roztok A + 10% kozí sérum) , potom pokryty adhesivem a inkubovány po dobu 45 minut až 1 hodiny při 37 °C. Plotny jsou potom třikrát promyty roztokem A popsaným výše.
Testovací vzorky séra jsou předem ředěny 1/50 v roztoku B a 100 μΐ každého ředěného testovaného séra je umístěno do jamek každé mikrotitrační plotny. Negativní kontrola je umístěna v jedné jamce každé plotny, ve formě 100 μΐ pufru B. Plotny překryté adhesivem jsou potom inkubovány po dobu 1 až 3 hodin při 37 °C. Plotny jsou potom promyty třikrát roztokem A jak je popsán výše. Paralalně, peroxidasou značená kozí protilátka namířená proti lidskému IgG (Sigma Immunochemicals ref. A6029) • · · ·· ···· ·· ·· ···· · · · · · · · ··· ·· · ···· • · · · · · · · · · · · · • · · ···· ··· ····· ·· · · · · ·· nebo IgM (Cappel ref. 55228) je ředěna v roztoku B {ředění 1/5000 pro anti-IgG a 1/1000 pro anti-IgM). 100 μΐ vhodného ředění značené protilátky je potom umístěno do každé jamky mikrotitračních ploten a plotny pokryté adhezivem jsou inkubovány po dobu 1 až 2 hodin při 37 °C. Další promytí ploten je potom provedeno jak je popsáno výše. Paralelně, peroxidasový substrát je připraven podle instrukcí Sigma fast OPD kit (Sigma Immunochemicals, ref. P9187) . 100 μ± roztoku substrátu je umístěno do každé jamky a plotny jsou potom umístěny chráněny před světlem po dobu 20 až 30 minut při pokojové teplotě.
Po stabilizaci barevné reakce jsou plotny umístěny ihned v ELISA spektrofotometrické čtečce ploten a optická densita (OD) každé jamky je čtena při vlnové délce 492 nm. Alternativně, 30 μΐ IN HC1 je dodáno do každé jamky pro ukončení reakce a plotny jsou potom odečítány ve spektrofotometru během 24 hodin.
Serologícké vzorky jsou vloženy dvakrát nebo třikrát a optická densita (OD) korespondující k testovanému séru je počítána jako průměr OD hodnot získaných pro stejný vzorek při stejném ředění.
Čistá OD každého séra koresponduje průměrné OD séra minus průměrná OD negativní kontroly (roztok B: 0,05% Tween 20R, 10% kozí sérum).
c) detekce anti-MSRV-1 IgG protilátek ELISA:
Technika popsaná výše byla použita s POLB2 peptidem pro testování přítomnosti anti-MSRV-l specifických IgG protilátek v séru 29 pacientů, u kterých byla stanovena definitivní nebo • · · ·
pravděpodobná diagnosa MS podle kriterií daných Poserem (23) a v séru 32 zdravých kontrol (dárci krve).
Obrázek 29 ukazuje výsledky pro každé testované sérum s ant-IgG protilátkou. Každý vertikální sloupec representuje čistou optickou densitu (OD při 492 nm) testovaného séra. Ordináta dává čistou OD na vrcholu vertikálních sloupců. Prvních 29 vertikálních sloupců nalevo od vertikální přerušované čáry representuje séra 29 testovaných případů MS a 32 vertikálních sloupců ležících napravo od vertikální přerušované čáry representují séra od 32 zdravých kontrol (dárci krve).
Průměr čistých OD hodnot pro testovaná MS séra je 0,62. Diagram umožňuje odhalení 5 kontrol, jejichž čistá OD je vyšší než skupinové hodnoty kontrolní populace. Tyto hodnoty mohou representovat přítomnost specifických IgG u seropozitivních bezpříznakových pacientů. Metody byly proto hodnoceny tak, aby byl určen statistický práh pozitivity testu.
Průměr čistých OD hodnot pro kontroly, včetně kontrol s vysokými čistými OD hodnotami, ej 0,36. Bez 5 kontrol, jejichž čisté OD hodnoty jsou vyšší než nebo rovny 0,5 je průměr negativních kontrol 0,33. Standartní odchylka negativních kontrol je 0,10. Teoretický práh pro pozitivitu může být vypočítán podle vzorce:
prahová hodnota (průměr čistých OD hodnot seronegativních kontrol) + (2 nebo 3 x standartní odchylka čistých OD hodnot seronegativních kontrol).
V prvním případě jsou považováni za bezpříznakové • · seropozitivní a prahová hodnota je rovna 0,33 + (2 x 0,10) = 0,53. Negativní výsledky representují nespecifické pozadí přítomnosti protilátek namířených specificky proti epitopu peptidu.
Ve druhém případě, pokud je sada kontrol skládající se z dárců krve zjevně v dobrém zdravotním stavu vzata jako referenční základ, bez vyloučení sér, které jsou, z tohoto pohledu, seropozitivní, pak je standartní odchylka pro non MS kontroly 0,116. Prahová hodnota je potom 0,36 + (2 x 0,116) = 0,59 .
Podle této analýzy je test specifický pro MS. Z tohoto pohledu je vidět, že test je specifický pro MS, protože, jak je ukázáno v tabulce 1, žádná kontrola nemá čistou OD nad tento práh. Ve skutečnosti tento výsledek odráží skutečnost, že titry protilátek u pacientů s MS jsou, ve většině případů, vyšší než u zdravých kontrol, které byly v kontaktu s MSRV-1.
Tabulka 1
MS
Kontrola
0,681 ;
0,3515
1,0425
0.56
0,5675
0,3565
0,63
0,449
0,588
0,2825
0,645 '0.55
0,6635
0,576
0,7765
0,5745
0,513
0.52
0,2535
0.55
0.51
0,4325 !
0,426
0,451 • · · · <
• · « ·· ··
0.7255
0,227
0,859
0,6435
0,5795
0,8655
0,671
0,596
0,662
0,602
0,625
0,53
0,565
0,517.
0,607.
0,3705
0,397
0,4395
0,3905
0,265
0,4295
0,291
0,347
0,4495
0,3725
0,181
0,2725
0,426
0,1915
0.222
0,395
0,34
0,307 i 0.491
0,219
0,2265
0,2605
Průměrná hodnota _ Standartní odchylka 2_ Prahová hodnota _
0,62
0,14
0,33
0.10
0,53
·· ·* • · · · · « · · ·· • · »·« · · • · · · ·· ·· ··
Podle této první metody výpočtu, a jak je ukázáno na obrázku 29 a korespondující tabulce 1, 26 z 29 MS sér dávají pozitivní výsledky (čistá OD vyšší nebo rovna 0,50), což ukazuje na přítomnost IgG specificky namířených proti POL2B peptidů, a proto proti části enzymu reversní transkriptasy MSRV-1 retroviru kódované jeho pol genem a v důsledku toho proti MSRV-1 retroviru. Tak, asi 90% testovaných MS pacientů reagovalo proti epitopu nesenému POL2B peptidem a mělo cirkulující IgG namířené proti tomuto epitopu.
Pět z 32 dárců krve ve zjevně dobrém zdravotním stavu vykazovalo pozitivní výsledek. Proto, je jasné, že přibližně 15% bezpříznakové populace může mít kontakt s epitopem neseným POL2B peptidem za podmínek, které vedly k aktivní imunizaci, která se manifestuje sama v persistenci specifických sérových IgG. Tyto podmínky jsou kompatibilní s imunizací proti reversní transkriptase MSRV-1 retroviru v průběhu infekce s (a/nebo reaktivace) MSRV-1 retroviru. Absence jasné neurologické patologie projevující se jako MS u těchto seropozitivních kontrol může naznačovat, že to jsou zdravý nosiči a že eliminovali infekční virus poté, co byli sami imunizováni, nebo že vytvářejí rizikovou populaci chronických nosičů. Skutečně, epidemiologická data ukazující, že patogenní agens přítomná v prostředí s vysokou prevalencí MS mohou být příčinou tohoto onemocnění naznačují, že frakce populace bez MS musí nutně být v kontaktu s takovým patogenním agens. Bylo ukázáno, že MSRV-1 retrovirus vytváří celé nebo část tohoto patogenního agens způsobujícího MS a je proto normální pro kontroly vybrané ze zdravé poulace, že mají IgG typ protilátek proti složkám MSRV-1 retroviru. Tak, rozdíl v seroprevalenci mezi MS a kontrolní populací je mimořádně signifikantní: chi-squared test, p <
0,001. Tyto výsledky proto svědčí pro etiologickou roli MSRV-1 u MS.
d) Detekce anti MSRV-1 IgM protilátky ELISA
ELISA technika s POLB2 peptidem byla použita pro testování přítomnosti anti-MSRV-1 specifických IgM protilátek v séru 36 pacientů, u kterých byla stanovena definitivní nebo pravděpodobná diagnosa MS podle kriterií daných Poserem (23) a v séru 42 zdravých kontrol (dárci krve).
Obrázek 30 ukazuje výsledky pro každé testované sérum s ant-IgM protilátkou. Každý vertikální sloupec representuje čistou optickou densitu (OD při 492 nm) testovaného séra. Ordináta dává čistou OD na vrcholu vertikálních sloupců. Prvních 36 vertikálních sloupců nalevo od vertikální linie oddělující souřadnicovou osu representuje séra 36 testovaných případů MS a 32 vertikálních sloupců ležících napravo od vertikální přerušované čáry representují séra od 42 zdravých kontrol (dárci krve). Horizontální linie nakreslená ve středu diagramu representuje teoretický práh definující hranici pozitivních výsledků (u kterých leží vrchol sloupce nad) a negativních výsledků (kde je vrchol sloupce pod).
Průměr čistých OD hodnot pro testované případy MS je 0,19.
Průměr čistých OD hodnot pro kontroly je 0,09.
Standartní odchylka negativních kontrol je 0,05.
Vzhledem k malému rozílu mezi průměrem a standartní odchylkou
u kontrol může být práh teoretické pozitivity vypočítán podle vzorce:
prahová hodnota (průměr čistých OD hodnot seronegativních kontrol) + (3 x standartní odchylka čistých OD hodnot seronegativních kontrol).
Prahová hodnota je proto rovna 0,09 + (3 x 0,05) = 0,26; nebo, v praxi, 0,25.
Negativní výsledky representují nespecifické pozadí přítomnosti protilátek namířených specificky proti epitopu peptidu.
Podle této analýzy, a jak je ukázáno na obrázku 30 a v korespondující tabulce 2, je IgM test specifický pro MS, protože žádná kontrola neměla čistou OD nad práh. 7 z 36 MS sér produkovalo pozitivní IgM výsledky; nyní studie klinických dat ukázaly, že tyto pozitivní séra byly odebrány během prvního ataku MS nebo během akutního ataku u neléčených pacientů. Je známo, že IgM namířené proti patogenním agens jsou produkovány během primární infekce nebo během reaktivace po latentní fázi uvedeného patogenního agens.
Rozdíl v seroprevalenci mezi MS a kontrolní populací je mimožádně signifikantní: chi-sguared test, p < 0,001.
Tyto výsledky proto svědčí pro etiologickou roli MSRV-1 u MS.
Detekce IgM a IgG protilátek proti POL2B peptidu umožňuje hodnocení průběhu infekce MSRV-1 a/nebo virové reaktivace MSRV-1.
• · · · · · * · • ·
Tabulka 2
MS Kontrola
e) Vyhledávání imunodominantních epitopů v POL2B peptidu:
Pro redukci nespecifického pozadí a pro optimalizaci detekce odpovědí anti-MSRV-1 protilátek byla provedena syntéza oktapeptidů, v následných krocích o jedné aminokyselině, pokrývajících celou sekvenci determinovanou POL2B, podle protokolu popsaného dále.
Chemická syntesa překrývajících se oktapeptidů pokrývajících aminokyselinovou sekvenci 61 - 110 ukázanou jako SEQ ID NO: 39 byla provedena na aktivované celulosové membráně podle techniky, kterou popsal Berg et al., (1989, J. Ann. Chem. SOc., 111: 8024 8026) a která je prodávána Cambridge Research Biochemicals pod obchodním názvem Spotscan. Tato technika umožňuje simultání syntesu velkého počtu peptidů a jejich analýzu.
Syntesa je provedena s esterifikovanými aminokyselinami, ve kterých je a-amino skupina chráněna FMOC skupinou (Nova Biochem) a skupiny postraních řetězců jsou chráněny skupinami jako je trityl, terč.buthylester nebo terč.buthylether. Esterifikované aminokyseliny jsou solubilizovány v N-methylpyrrolidonu (NMP) v koncentraci 300 nM a 0,9 μΐ je aplikováno na skvrny usazené bromofenolové modře. Po 15 minutové inkubaci je další aplikace aminokyselin provedena podle další 15 minutové inkubace. Pokud proběhla vazba mezi dvěma aminokyselinami správně, pak je pozorována barevná modifikace (změna z modré na žlutou-zelenou). Po trojím promytí v DMF je proveden krok acetylace s anhydridem kyseliny octové. Dále, terminální aminoskupiny peptidů v procesu syntesy jsou deprotektovány 20% pyridinem v DMF. Kapky depozita jsou znovu barveny 1% roztokem bromofenolové modři v DMF, promyty třikrát methanolem a sušeny. Tato sada operací tvoří jeden cyklus « · · · · « • · · · ι • · ·· ·· přidání aminokyseliny, a tento cyklus je opakován, dokud není syntesa dokončena. Když byly přidány všechny aminokyseliny, je NH2-terminální skupina poslední aminokyseliny deprotektována 20% piperidinem v DMF a acetylována anhydridem kyseliny octové. Skupiny chránící postraní řetězec jsou odstraněny směsí dichlormethan/ kyselina trifluoroctová/triisobutylsilan (5 ml/ ml/ 250 ml). Imunoreaktivita peptidů je potom testována ELISA.
Po dvojí syntese různých oktapeptidů na dvou různých membránách jsou tyto vypláchnuty methanolem a promyty v TBS (0,1 M Tris pH 7,2), potom jsou inkubovány přes noc při pokojové teplotě v saturačním pufru. Po několika promytích v TBS-T (0,1 M Tris pH 7,2 - 0,05% Tween 20) je jedna membrána inkubována s ředěním 1/50 referenčního séra od pacienta trpícího MS a druhá membrána s 1/50 ředěním ze zásoby sér zdravých kontrol. Membrány jsou inkubovány po dobu 4 hodin při pokojové teplotě. Po promytí TBS-T je přidán β-galaktosidasou značený anti-lidský imunoglobulinový konjugát (prodávaný Cambridge Research
Biochemicals) v ředění 1/200 a směs je inkubována po dobu dvou hodin při pokojové teplotě. Po promytí membrán 0,05% TBS-T a PBS je imunoreaktivita různých skvrn vizualizována přidáním
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktopyranosidu v draselné formě'. Intensita zabarvení skvrn je hodnocena kvantitativně s relativní hodnotou od 0 do 5 jak je ukázáno na připojených obrázcích 31 až 33.
Tímto způsobem je možné určit dva imunodominantní regiony v každém konci POL2B peptidu, které korespondují, v příslušném pořadí, aminokyselinovým sekvencím 65 - 75 (SEQ ID NO: 41) a 92 109 (SEQ ID NO: 42) podle obrázku 34, a které leží, v příslušném pořadí, mezi oktapeptidy Phe-Cys-Ile-Pro-Val-Arg-Pro-Asp (FCIPVRPD) a Arg-Pro-Asp-Ser-Gln-Phe-Leu-Phe (RPDSQFLF) a Thr-Val-Leu-Pro-Gln-Gly-Phe-Arg (TVLPQGFR) a Leu-Phe-Gly-Gln-Ala -Leu-Ala-Gln (LFGQALAQ), a region, který je méně reaktivní, alejasně více specifický, protože neprodukuje jakékoliv pozadí s kontrolním sérem, representovaný oktapeptidy Leu-Phe-Ala-Phe-GluAsp-Pro-Leu (LFAFEDPL) (SEQ ID NO: 43) a
Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu-Asn (FAFEDPLN) (SEQ ID NO: 44).
Tyto regiony umožňují definovat nové peptidy, které jsou více specifické a více imunoreaktivní za použití obvyklých technik.
Je proto možné, v důsledku objevů provedených a metod vyvinutých vynálezci, provést diagnostiku MSRV-1 infekce a/nebo reaktivace a hodnotit terapii MS na základě její účinnosti negativizovat detekci těchto agens v tělesných tekutinách pacienta. Dále, časná detekce u jedinců dosud nevykazujících neurologické příznaky MS může umožňit stanovení terapie, která by byla účinější s ohledem na klinický průběh díky faktu, že by mohla předcházet lézím, které korespondují s nástupem neurologických onemocnění. V současnosti nemůže být diagnosa MS stanovena před nástupem symptomatologie neurologických lézí a proto není stanovena žádná léčba před nástupem klinického obrazu naznačujícího léze centrálního nervového systému, které jsou již signifikantní. Diagnosa MSRV-1 a/nebo MSRV-2 infekce a/nebo reaktivace u lidí má proto rozhodující význam a předkládaný vynález poskytuje prostředky pro její provedení.
Je proto možné, kromě provedení diagnosy MSRV-1 infekce a/nebo reaktivace, hodnotit terapii MS na základě její účinnosti v negativizaci detekce těchto agens v tělesných tekutinách pacienta.
Příklad 12: Získání klonu LB19 obsahujícího část GAG genu MSRV-1 retroviru
Byla použita PCR technika odvozená od techniky, kterou popsal Gonzales-Quintial R. et al., (19) a Plaza et al. (25).
Z celkové RNA extrahované z frakcí virionu purifikovaných jak je popsáno výše byla syntetizována cDNA za použití specifického primeru (SEQ ID NO: 64) v 3' konci genomu, který má být amplifikován, za použití EXPAND™ REVERSE TRANSCRIPTASE (Boehringer Mannheim).
cDNA:
AAGGGGCATG GACGAGGTGG TGGCTTATTT (SEQ ID NO: 65) (antisense)
Po purifikaci byla na 5' konec cDNA přidána póly G smyčka za použití Terminál transferases kit prodávaného společností Boehringer Mannheim, podle protokolu výrobce.
Kotvící PCR byla provedena za použití následujících 5' a 3' primerů:
AGATCTGCAG AATTCGATAT CACCCCCCCC CCCCCC (SEQ ID NO: 91) (sense) a AAATGTCTGC GGCACCAATC TCCATGTT (SEQ ID NO: 64) (antisense).
Dále byla provedena semi-nested kotvící PCR za použití následujících 5' a 3' primerů:
AGATCTGCAG AATTCGATAT CA (SEQ ID NO: 92) (sense) a
AAATGTCTGC GGCACCAATC TCCATGTT (SEQ ID NO: 64) (antisense).
Produkty vzniklé v PCR byly purifikované po purifikaci na
agarosovém gelu za použití běžných metod (17) a potom byly resuspendovány v 10 μΐ destilované vody. Protože jednou z vlastností Taq polymerasy je přidání adeninu v 3' konci každého ze dvou DNA řetězců byla získaná DNA insertována přímo do plasmidu za použití TA Cloning™ kitu (British Biotechnology).
μΐ DNA roztoku byly smíseny s 5 μΐ sterilní destilované vody, μΐ 10-krát koncentrovaného ligačního pufru lOx LIGATION BUFFER, 2 μΐ pCR™ VECTOR (25 ng/ml) a 1 μΐ T4 DNA LIGASE. Tato směs byla inkubována přes noc při 12 °C. Následuj ící kroky byly provedeny podle instrukcí TA CloningR kitu (British Biotechnology). Na konec procedury byly bílé kolonie rekombinantních bakterií (bílé) seškrábnuty, aby mohly být kultivovány a aby mohla být provedena extrakce plasmidů inkorporovaných podle takzvané miniprep procedury (17). Plasmidový přípravek z každé rekombinantní kolonie byl rozstřižen vhodným restrikčním enzymem a analyzován na agarosovém gelu. Plasmidy mající insert detekovaný pod UV světlem po barvení gelu ethidium bromidem byly vybrány pro sekvencování insertu, po hybridizaci s primery komplementárními k Sp6 promotoru přítomnému na klonovacím plasmidu TA klonovacího kitu R. Reakce předcházející sekvencování byla potom provedena podle metody doporučené pro použití sekvencovacího kitu Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, ref. 401384) a automatické sekvencování bylo provedeno na Applied Biosystems Automatics Sequencer, model 373 A aparátu podle doporučení výrobce.
PCR amplifikace podle techniky uvedené výše byla použita na cDNA syntetizovanou z nukleových kyselin frakcí infekčních částic purifikovaných na sacharosovém gradientu, podle techniky, kterou popsal H. Perron (13), ze supernatantů kultur B lymfocytů od «ví
pacientů trpících MS, imortalizovaných virem Epstein-Barrové (EBV) kmen B95 a exprivujících retrovirové částice asociované s aktivitou reversní transkriptasy jak popsal Perron et al. , (3) a
Francouzská patentová přihláška MS 10, 11 a 12. Klon LB19, jehož sekvence, identifikovaná SEQ ID NO: 59, je presentován na obrázku 35.
Klon umožňuje definovat, s dříve sekvencovaným klonem GM3 a klonem G+E+A (viz příklad 15), region o 690 párech baží representativní pro signifikantní část gag genu MSRV-1 retroviru, jak je presentován na obrázku 36. Tato sekvence označená SEQ ID NO: 88 je rekonstituovaná z různých klonů přesahujících se ve svých koncích. Tato sekvence je identifikovaná pod jménem MSRV-1 gag* region. Na obrázku 36 je presentován potenciální čtecí rámeček s translací do aminokyselin pod sekvencí nukleových kyselin.
Příklad 13: Získání klonu FBdl3 obsahujícího region pol genu příbuzný k MSRV-1 retroviru a zjevně nekompletní ENV region obsahující potenciální čtecí rámeček (ORF) pro glykoprotein
Extrakce virových RNA: RNA byly extrahovány podle metody stričně popsané dále.
Pool supernatantu kutury B lymfocytů od pacientů trpících MS (650 ml) je centrifugován po dobu 30 minut při 10000 g. Získaná virová peleta je resuspendována v 30 μΐ PBs/10 mM MgCl2. Materiál je ošetřen směsí DNAsy (100 mg/ml)/RNAsy (50 mg/ml) po dobu 30 minut při 37 °C a potom proteinasou K (50 mg/ml) po dobu 30 minut při 46 °C.
Nukleové kyseliny jsou extrahovány v jednom objemu směsi fenolu/0,1% SDS (objem/objem) zahřáté na 60 °C a potom jsou reextrahovány jedním objemem fenol/chloroform (1:1; objem/objem).
Precipitace materiálu je provedena 2,5 V ethanolu za přítomnosti 0,1 V octanu sodného pH = 5,2. Peleta získaná po centrifugaci je resuspendována v 50 μΐ sterilní DEPC vody.
Vzorek je znovu ošetřen 50 mg/ml RNAasa prosté DNAsy po dobu 30 minut při pokojové teplotě, extrahován jedním objemem fenol/chloroform a precipitován za přítomnosti octanu sodného a ethanolu.
Získaná RNA je kvantifikována čtením OD při 260 nm. Přítomnost MSRV-1 a absence DNA kontaminantů je monitorována PCR a MSRV-1 specifickou RTPCR asociovanou se specifickou ELOSA pro MSRV-1 genom.
Syntesa cDNA:
mg RNA je použito pro syntesu cDNA nastartovanou poly(DT) oligonukleotidem podle instrukcí v cDNA Synthesis Module kitu (ref. RPN 1256, Amersham) s několika modifikacemi: Reversní transkripce je provedena při 45 °C místo doporučovaných 42 °C.
Produkt syntesy je purifikován dvojí extrakcí a dvojí purifikací podle instrukcí výrobce.
Přítomnost MSRV-1 je potvrzena MSRV-1 PCR asociovanou se specifickou ELOSA pro MSRV-1 genom.
PCR pro velké vzdálenosti: (LD-PCR)
500 ng cDNA je použito pro krok LD-PCR (EXpand Long Template System; Boehringer (ref. 1681 842)).
Bylo použito několik párů oligonukleotidů. Mezi nimi také pár definovaný následujícími primery:
5' primer: GGAGAAGAGC AGCATAAGTG G (SEQ ID NO: 66)
3' primer: GTGCTGATTG GTGTATTTAC AATCC (SEQ ID NO: 67).
Podmínky amplifikace jsou následující:
°C 10 sekund °C 30 sekund °C 5 minut;
cyklů, potom 20 cyklů se zvýšením o 20 sekund v každém cyklu elongační doby. Na konci této první amplifikace jsou 2 μΐ produktu amplifikace podrobeny druhé amplifikaci za stejných podmínek jako bylo popsáno výše.
LD-PCR reakce jsou provedeny na Perkin model 9600 PCR přístroji v tenkostěných mikrotubách (Boehringer).
Produkty amplifikace jsou monitorovány elektroforesou 1/5 amplifikačního objemu (10 μΐ) na 1% agarosovém gelu. Pro pár primerů popsaný výše je získán proužek o asi 1,7 Kb.
Klonování amplifikovaného fragmentu:
Produkt PCR byl purifikován pasáží přes preparativní agarosový gel a potom přes Costar kolonu (Spin; D. Dutcher) podle návodu • · · · ···· ·· ·· • · · · ····
dodavatele.
μΐ purifikovaného roztoku jsou spojeny s 50 ng vektoru PCRII podle návodu dodavatele (TA Cloning Kit; British Biotechnology)).
Získaný rekombinantní vektor je izolován transformací kompetentních DH5aF' bakterií. Bakterie jsou selektovány za použití jejich resistence na ampicilin a ztráty metabolismu pro Xgal (= bílé kolonie). Molekulární struktura rekombinantního vektoru je potvrzena minipreparací plasmidu a hydrolýzou enzymem EcoRl.
FBdl3, klon pozitivní pro všechna tato kriteria, byl selektován. Příprava velkého množství rekombinantního plasmidu byla provedena za použití Midiprep Quiagen kitu (ref. 12243) podle návodu dodavatele.
Sekvencování klonu FBdl3 je provedeno za pomoci Perkin Prism Ready aplitaq FS dye terminátor kitu (ref. 402119) podle instrukcí výrobce.Reakční sekvence jsou zavedeny do Pekin typ 377 nebo 373A automatického sekvenátoru. Strategie sekvencování se skládá z procházení genu na obou řetězcích klonu FBdl3.
Sekvence klonu FBdl3 je identifikována SEQ ID NO: 58.
Na obrázku 37 je ukázána homoogie sekvence mezi klonem FBdl3 a HSERV-9 retroviru na matricovém grafu nepřerušovanou linií pro jakoukoliv parciální homologii vyšší nebo rovnu 70%. Můžeme vidět, že zde existuje homologie v krajních regionech klonu (s pol genem na 5' konci a s env genem a potom LTR na 3' konci), ale že vnitřní region je zcela odlišný a nevykazuje žádnou homologii, v · · · · ani slabou, s env genem HSERV-9. Dále, je zřejmé, že klon FBdl3 obsahuje delší env region než je region popsaný pro defektní endogenní HSERV-9; může být proto pozorováno, že vnitřní divergentní region vytváří insert mezi regiony částečně homologní s defektními geny HSERV-9.
Tato další sekvence určuje potenciální orf, označený ORF B13,který je representován jeho aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 87.
Molekulární struktura klonu FBdl3 byla analyzována za použití GeneWork softwaru a Genebank a SwissProt databank.
Bylo objeveno 5 glykosylačních míst.
Protein nemá signifikantní homologii s dosud známými sekvencemi.
Je pravděpodobné, že tento protein pochází z rekombinace endogenního retrovirového elementu (ERV) navázaného na replikaci MSRV-1.
Takový fenomén nepostrádá generování exprese polypeptidu, nebo i endogenních retrovirových proteinů, které nemusí být nutně tolerovány imunitním systémem. Takové schéma aberantní exprese endogenních elementů příbuzných MSRV-1 a/nebo jím indukovaných pravděpodobně zmnožuje aberantní antigeny a proto má tendenci indukovat autoimunitní procesy jako jsou ty, které jsou pozorovány u MS. Jasně vytváří nový element, který doposud nebyl popsán. Skutečně, průzkum databank sekvencí nukleových kyselin dostupných ve versi č. 19 (1996) Entrezsoftwaru (NCBI, NIH, • ·· 4» 4··· »· 44 •444 44 4 4444
444 4 44 4444 4
444» 444 • 4444 44 44 4« ··
Bethseda, USA) neidentifikoval známé homologní sekvence obsahující celý env region tohoto klonu.
Příklad 14: Získání klonu FP6 obsahujícího část pol genu, s regionem kódujícím enzym reversní transkriptasu homologní ke klonu pol* MSRV-1 a 3' pol region odlišný od ekvivalentních sekvencí popsaných v klonech pol*, tpol, FBd3, JLBcl a JLBc2.
3' RACE byla provedena na celkové RNA extrahované z plasmy pacieta trpícího MS. Zdravá kontrolní plasma ošetřená za stejných podmínek byla použita jako negativní kontrola. Syntesa cDNA byla provedena za použití následujícího modifikovaného oligo(dT) primeru:
5' GACTCGCTGC AGATCGATTT TTTTTTTTTT TTTT 3, (SEq ID N0: 68) a Boehringer Expand RT reversní transkriptasy podle podmínek doporučovaných společností.
PCR byla provedena s enzymem Klentaq (Clontech) za následuících podmínek: 94 °C 5 minut, potom 93 °C 1 minutu, 58 °C 1 minutu, 68 °C 3 minuty po 40 cyklů a 68 °C po 8 minut a s konečným reakčním objemem 50 μΐ.
Primery použité pro PCR:
5' primer, identifikovaný SEQ ID NO: 69 5' GCCATCAAGC CACCCAAGAA CTCTTAACTT 3';
3' primer, identifikovaný SEQ ID NO: 68 (= stejný jako pro cDNA) • ·· «* ···· ·· ·· ·· ♦ · · · · · · · · ·«· ·· · · · ·· «· ··· · · · ·· · · · ··· · · · · · · · ··· ·* ·· ·» *· ··
Druhá, takzvaná semi-nested PCR byla provedena s 5' primerem umístěným v regionu již amplifikováném. Tato druhá PCR byla provedena za stejných experimentálních podmínek jako první PCR, za použití 10 μΐ produktu amplifikace pocházejícího z první PCR.
Primery použité pro semi-nested PCR:
5' primer, identifikovaný SEQ ID NO: 70 5' CCAATAGCCA GACCATTATA TACACTAATT 3';
3' primer, identifikovaný SEQ ID NO: 68 (= stejný jako pro cDNA)
Primery SEQ ID NO: 69 a SEQ ID NO: 70 jsou specifické pro pol* region: pozice č. 403 až č. 422 a č. 641 až č. 670, v příslušném pořadí.
Produkt amplifikace by tak získán z extracelulární RNA extrahované z plasmy pacientů trpících MS. Korespondující fragment nebyl pozorován v plasmě od zdravých kontrol. Tento amplifikační produkt byl klonován následujícím způsobem.
Amplifikovaná DNA byla insertována do plasmidu za použití TA Cloning™ kitu. 2 μΐ DNA roztoku byly smíseny s 5 μΐ sterilní destilované vody, 1 μΐ 10-krát koncentrovaného ligačního pufru 10X LIGATION BUFFER, 2 μΐ pCR™ VECTOR (25 ng/ml) a 1 μΐ T4 DNA LIGASE. Tato směs byla inkubována přes noc při 12 °C. Následující kroky byly provedeny podle instrukcí TA Cloning1* kitu (British Biotechnology). Na konec procedury byly bílé kolonie rekombinantních bakterií (bílé) seškrábnuty, aby mohly být kultivovány a aby mohla být provedena extrakce plasmidů inkorporovaných podle takzvané miniprep procedury (17).
·· ··
Plasmidový přípravek z každé rekombinantní kolonie byl rozstřižen vhodným restrikčním enzymem a analyzován na agarosovém gelu. Plasmidy maj ící insert detekovaný pod UV světlem po barvení gelu ethidium bromidem byly vybrány pro sekvencování insertu, po hybridizaci s primery komplementárními k Sp6 promotoru přítomnému na klonovacím plasmidu TA klonovacího kitu R. Reakce předcházející sekvencování byla potom provedena podle metody doporučené pro použití sekvencovacího kitu Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, ref. 401384) a automatické sekvencování bylo provedeno na Applied Biosystems Automatics Sequencer, model 373 A aparátu podle doporučení výrobce.
Získaný klon, označený FP6, umožňuje definování regionu o 467 bp, který je 89% homologní k pol* regionu MSRV-l retrovirů a regionu o 1167 bp, který je 64% homologní k pol regionu ERV-9 (č. 1634 až 2856) .
Klon FP6 je representován na obrázku 38 jeho nukleotidovou sekvencí identifikovanou SEQ ID NO: 61. Tři potenciální čtecí rámečky tohoto klonu jsou ukázány jejich aminokyselinovou sekvencí pod nukleotidovou sekvencí.
Příklad 15: Získání regionu označeného G+E+A obsahujícího ORF pro retrovirovou proteasu, pomocí PCR amplifikace sekvence nukleové kyseliny obsažené mezi 5' regionem definovaným koněm GM3 a 3' regionem definovaným klonem pol*, z RNA extrahované z poolu plasem od pacientů trpících MS
Oligonukleotidy specifické pro MSRV-l sekvence již • · • · identifikované vynálezci byly definovány pro amplifikaci retrovirové RNA pocházející z virionů přítomných v plasmě pacientů trpících MS. Kontrolní reakce byly provedeny tak, aby monitorovaly přítomnost kontaminantů (reakce s vodou). Amplifikace se skládala z kroku RT-PCR následovaného nested PCR. Byly definovány páry primerů pro amplifikaci tří překrývajících se regionů (označených G, E a A)na regionech definovaných sekvencemi klonů GM3 a ol* popsaných výše.
Semi nested RT-PCR pro amplifikaci regionu G:
- v prvním RT-PCR cyklu jsou použity následující primery: primer 1: SEQ ID NO: 71 (sense) primer 2: SEQ ID NO: 72 (antisense)
- v druhém PCR cyklu jsou použity následující primery: primer 1: SEQ ID NO: 73 (sense) primer 4: SEQ ID NO: 74 (antisense)
Nested RT-PCR pro amplifikaci regionu E:
- v prvním RT-PCR cyklu jsou použity následující primery:
primer 5: SEQ ID NO: 75 (sense) primer 6: SEQ ID NO: 76 (antisense)
- v druhém PCR cyklu jsou použity následující primery:
primer 7: SEQ ID NO: 77 (sense) primer 8: SEQ ID NO: 78 (antisense)
Semi-nested RT-PCR pro amplifikaci regionu A:
• · • * · · • · ·♦ ··
- v prvním RT-PCR cyklu jsou použity následující primery: primer 9: SEQ ID NO: 79 (sense) primer 10: SEQ ID NO: 80 (antisense)
- v druhém PCR cyklu jsou použity následující primery: primer 9: SEQ ID NO: 81 (sense) primer 11: SEQ ID NO: 82 (antisense)
Primery a regiony G, E a A, které definují, jsou umístěny následovně:
cDNA
G 4 2
7 E 8 6
A 11 10
GM3 POL*
Sekvence regionu definovaného různými klony G, E a A byla určena po klonování a sekvencování produktů nested amplifikace.
Klony G, E a A byly sestaveny dohromady prostřednictvím PCR s primery 1 na 5' konci fragmentu G a 11 na 3' konci fragmentu A, kde tyto primery byly popsány výše. Fragment G+E+A o asi 1580 bp byl amplifikován a insertován do plasmidu za použití TA Cloning (obchodní známka) kitu. Sekvence produktu amplifikace korespondujícího G+E+A byla určena a byla provedena analýza G+E a E+A přesahů. Sekvence je ukázána na obrázku 39 a koresponduje sekvenci SEQ ID NO: 89.
Čtecí rámeček kódující MSRV-1 retrovirovou proteasu byl nalezen v regionu E. Aminokyselinová sekvence proteasy, identifikovaná SEQ ID NO: 90, je presentována na obrázku 40.
Příklad 16: Získání klonu LTRGAG12, příbuzného endogennímu retrovirovému elementu (ERV) blízkému MSRV-1, v DNA MS lymfoblastoidní linie produkující viriony a exprivující MSRV-1 retrovirus
Nested PCRbyla provedena na DNA extahované z lymfoblastoidní linie (B lymfocyty imortalizované EBV virem kmene B95, jak je popsáno výše a jak je odborníkům v oboru dobře známo) exprivující MSRV-1 retrovirus a pocházející z lymfocytů periferní krve od pacientů s MS.
V prvním PCR kroku jsou použity následující primery:
primer 4327: CTCGATTTCT TGCTGGGCCT TA (SEQ ID NO: 83) primer 3512: GTTGATTCCC TCCTCAAGCA (SEQ ID NO: 84)
Tento krok zahrnoval 35 amplifikačních cyklů s následujícími podmínkami: 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 54 °C a 4 minuty při 72 °C.
Ve druhém PCR kroku jsou použity následující primery:
primer 4294: CTCTACCAAT CAGCATGTGG (SEQ ID NO: 85) primer 3591: TGTTCCTCTT GGTCCCTAT (SEQ ID NO: 86)
Tento krok zahrnoval 35 amplifikačních cyklů s následujícími podmínkami: 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 54 °C a 4 minuty při • · • · • · · · • · • · °C.
Produkty pocházející z PCR byly purifikovány po purifikaci na agarosovém gelu podle běžných metod (17) a potom byly resuspendovány v 10 ml destilované vody. Protože jedna vlastnost Taq polymerasy spočívá v přidání adeninu v 3' konci každého ze dvou DNA řetězců, byla získaná DNA insertována přímo do plasmidu za použití TA Cloning™ kitu (British Biotechnology). 2 μΐ DNA roztoku byly smíchány s 5 μΐ sterilní destilované vody, 1 μΐ 10-krát koncentrovaného ligačního pufru 10' LIGATION BUFFER, 2 μΐ pCR™ VECTOR (25 ng/ml) a 1 μΐ T4 DNA LIGASA. Směs byla inkubována přes noc při 12 °C. Následující kroky byly provedeny podle instrukcí TA Cloning™ kitu (British Biotechnology). Na konec procedury byly bílé kolonie rekombinantních bakterií (bílé) seškrábnuty, aby mohly být kultivovány a aby mohla být provedena extrakce plasmidů inkorporovaných podle takzvané miniprep procedury (17). Plasmidový přípravek z každé rekombinantní kolonie byl rozstřižen vhodným restrikčním enzymem a analyzován na agarosovém gelu. Plasmidy mající insert detekovaný pod UV světlem po barvení gelu ethidium bromidem byly vybrány pro sekvencování insertu, po hybridizaci s primerem komplementárním k Sp6 promotoru přítomnému na klonovacím plasmidu TA klonovacího kitu R. Reakce předcházející sekvencování byla potom provedena podle metody doporučené pro použití sekvencovacího kitu Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, ref. 401384) a automatické sekvencování bylo provedeno na Applied Biosystems Automatics Sequencer, model 373 A aparátu podle doporučení -výrobce.
Tak může být získán klon označený LTRGAG12 a je representován
jeho vnitřní sekvencí identifikovanou SEQ ID NO: 60.
Tento klon pravděpodobně representuje endogenní elementy blízké ERV-9, přítomné v lidské DNA, zejména v DNA od pacientů trpících MS a je schopen interferovat s expresí MSRV-1 retroviru a proto je schopen účinkovat v patogenesi asociován s MSRV-1 retrovirem a je schopen sloužit jako markér pro specifickou expresi v této patologii.
Příklad 17: Detekce anti-MSRV-1 specifických protilátek v lidském séru
Identifikace sekvence pol genu MSRV-1 retroviru a otevřeného čtecího rámečku pro tento gen umožnila určení aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 63 regionu uvedeného genu, označeného SEQ ID NO: 62.
Různé syntetické peptidy korespondující fragmentům proteinové sekvence MSRV-1 reversní transkriptasy kódované pol genem byly testovány na jejich antigenní specificitu s ohledem na séra pacientů trpících MS a zdravých kontrol.
Peptidy byly syntetizovány chemicky syntesou na pevné fázi podle Merrifieldovi techniky (22). Praktické detaily jsou popsány dále.
a) Syntesa peptidů
Peptidy byly syntetizovány na fenylacetamidomethyl (PAM)/ polystyren/divinylbenzen pryskyřice (Applied Biosystems, lne. Foster City, CA) za použití Applied Biosystems 430A automatického syntetizéru. Aminokyseliny jsou spojovány ve formě hydroxybenzotriazolových (HOBT) esterů. Použité aminokyseliny jsou získány od Novabiochem (Lauflerlfingen, Switzerland) nebo Bachem (Bubendorf, Switzerland).
Chemická syntesa byla provedena za použití protokolu dvojitého párování s N-methylpyrrolidonem (NMP) jako rozpouštědlem. Peptidy byly odstřiženy od pryskyřice, stejně jako protektivní skupiny postraního řetězce, simultáně, za použití kyseliny fluorovodíkové (HF) ve vhodném přístroji (typ I štěpícího přístroje, Peptide Institute, Osaka, Japan).
Pro 1 g peptidyl pryskyřice je použito 10 ml HF, 1 ml anisolu a l ml dimethylsulfid 5 DMS. Směs je míchána po dobu 45 minut při -2 °C. HF je potom odevaporována ve vakuu. Po intensivním promytí etherem je peptid eluován z pryskyřice 10% kyselinou octovou a potom je lyofilizován.
Peptidy jsou purifikovány preparativní kapalinovou chromatografií s vysokou rozlišovací schopností na VYDAC C18 typu kolony (250 x 21 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA) . Eluce je provedena acetonitrilovým gradientem s průtokem 22 ml/min. Odebrané frakce jsou monitorovány elucí za izokratických podmínek na VYDACR C18 analytické koloně (250 x 4,6 mm) při průtoku 1 ml/min. Frakce mající stejný čas retence jsou shromážděny a lyofilizovány. Převládající frakce je potom analyzována analytickou kapalinovou chromatografii s vysokou rozlišovací schopností za použití systému popsaného -výše. Peptid je potom považován za akceptovatelně čistý, manifestuje-li se v jediném peaku representujícím ne méně než 95% chromatogramu.
• · • · · ·
Purifikované peptidy jsou potom analyzovány s tím, že předmětem monitorování je jejich aminokyselinové složení, za použití Applied Biosystems 420H automatického analyzátoru aminokyselin. Měření (průměrné) chemické molekulové hmotnosti peptidů se provede za použití LSIMS hmotnostního spektrometru v pozitivním iontovém modu na VG. ZAB.ZSEQ přístroji se dvojím zesílením připojeném na DEC-VAX 2000 systému (VG analytical Ltd, Manchester, England).
Reaktivita různých peptidů byla testována proti sérům pacientů trpících MS a proti sérům zdravých kontrol. Toto umožnilo vybrat peptid označený S24Q, jehož sekvence je identifikovaná SEQ ID NO: 63 kodovanou nukleotidovou sekvencí pol genu MSRV-1 (SEQ ID NO: 62).
b) Antigenní vlastnosti:
Antigenní vlastnosti S24Q peptidů byly demonstrovány podle ELISA protokolu popsaného dále.
Lyofilizovaný S24Q peptid byl rozpuštěn ve sterilní 10% kyselin octové v koncentraci 1 mg/ml. Tento zásobní roztok byl rozdělen do aliquot a udržován při +4 °C pro použití do dvou týdnů, nebo byl zmrazen při -20 °C pro použití během dvou měsíců. Aliquota je ředěna v PBS (fosfátem pufrovaný salinický roztok) roztoku tak, aby byla získána konečná koncentrace peptidů 5 ^g/ml. 100 μΐ tohoto ředění je umístěno do každé jamky Nunc Maxisorb (obchodní název) mikrotitračních ploten. Plotny jsou překryty adhesivním typem krytí ploten a jsou uloženy po dobu 2 hodin při +37 °C pro fázi adsorpce peptidů na plast. Adhesivum je odstraněno a plotny jsou třikrát promyty objemem ··· 99
300 μΐ roztoku A (1 χ PBS, 0,05% Tween 20R), a potom invertovány přes adsorbentní tkáň. Takto vyprázdněné plotny jsou naplněny 250 μΥ na jamku roztokem B (roztok A + 10% kozí sérum), potom pokryty adhesivem a inkubovány po dobu 1 hodiny při 37 °C.
Plotny jsou potom třikrát promyty roztokem A popsaným výše.
Testovací vzorky séra jsou předem ředěny 1/50 v roztoku B a 100 μΐ každého ředěného testovaného séra je umístěno do jamek každé mikrotitrační plotny. Negativní kontrola je umístěna v jedné jamce každé plotny, ve formě 100 μΐ pufru B. Plotny překryté adhesivem jsou potom inkubovány po dobu 1 hodiny 30 minut při 37 °C. Plotny jsou potom promyty třikrát roztokem A jak je popsán výše. Pro IgG odpověď je peroxidasou značená kozí protilátka namířená proti lidskému IgG (prodávaná Jackson Immuno Research lne.) ředěna v roztoku B (ředění 1/10000). 100 μΐ vhodného ředění značené protilátky je potom umístěno do každé jamky mikrotitračních ploten a plotny pokryté adhezivem jsou inkubovány po dobu 1 hodiny při 37 °C. Další promytí ploten je potom provedeno jak je popsáno výše. Paralelně, peroxidasový substrát je připraven podle instrukcí bioMérieux kitů. 100 μΥ roztoku substrátu je umístěno do každé jamky a plotny jsou potom umístěny chráněny před světlem po dobu 20 až 30 minut při pokojové teplotě.
Po stabilizaci barevné reakce je 50 μΥ Color 2 (bioMérieux obchodní název) umístěno do každé jamky pro zastavení reakce. Plotny jsou ihned umístěny v ELISA spektrofotometrické čtečce ploten a optická densita (OD) každé jamky je čtena při vlnové délce 492 nm.
Serologické vzorky jsou vloženy dvakrát nebo třikrát a • · ··· ·
*· *· optická densita (OD) korespondující k testovanému séru je počítána jako průměr OD hodnot získaných pro stejný vzorek při stejném ředění.
Čistá OD každého séra koresponduje průměrné OD séra minus průměrná OD negativní kontroly (roztok B: 0,05% Tween 20R, 10% kozí sérum).
c) detekce anti-MSRV-1 IgG protilátek ELISA:
Technika popsaná výše byla použita s S24Q peptidem pro testování přítomnosti anti-MSRV-1 specifických IgG protilátek v séru 15 pacientů, u kterých byla stanovena definitivní nebo pravděpodobná diagnosa MS podle kriterií daných Poserem (23) a v séru 15 zdravých kontrol (dárci krve).
Obrázek 41 ukazuje výsledky pro každé testované sérum s ant-IgG protilátkou. Každý vertikální sloupec representuje čistou optickou densitu (OD při 492 nm) testovaného séra. Ordináta dává čistou OD na vrcholu vertikálních sloupců. Prvních 15 vertikálních sloupců nalevo od vertikální přerušované čáry representuje séra 15 zdravých kontrol (dárci krve) a 15 vertikálních sloupců ležících napravo od vertikální přerušované čáry representují séra od 15 testovaných případů MS. Diagram umožňuje odhalení 2 kontrol, jejichž OD je vyšší než skupinové hodnoty pro kontrolní populaci. Tyto hodnoty mohou representovat přítomnost specifických IgG u bezpříznakových seropozitivních pacientů. Dvě metody byly proto hodnoceny pro určení statistického prahu pozitivity testu.
Průměr čistých OD hodnot pro kontroly, včetně kontrol • · * • r · · • · · • · · · • · · ·· 9 ·· ·· ···· • * · • · · • · · * • · · · ·· ·· »· ·« • · · • · · • « » · · • · · »· ·· s vysokými čistými OD hodnotami, je 0,129. Bez 2 kontrol, jejichž čisté OD hodnoty jsou vyšší než 0,2, je průměr negativních kontrol 0,107 a standartní odchylka je 0,03. Teoretický práh pro pozitivitu může být vypočítán podle vzorce:
prahová hodnota (průměr čistých OD hodnot negativních kontrol) + (2 nebo 3 x standartní odchylka čistých OD hodnot negativních kontrol).
V prvním případě jsou považováni za bezpříznakové seropozitivní a prahová hodnota je rovna 0,11 + (3 x 0,03) = 0,20. Negativní výsledky representují nespecifické pozadí přítomnosti protilátek namířených specificky proti epitopu peptidu.
Ve druhém případě, pokud je sada kontrol skládající se z dárců krve zjevně v dobrém zdravotním stavu vzata jako referenční základ, bez vyloučení sér, které jsou, z tohoto pohledu, seropozitivní, pak je standartní odchylka pro non MS kontroly 0,116. Prahová hodnota je potom 0,13 + (3 x 0,06) = 0,31.
Podle této analýzy je test specifický pro MS. Z tohoto pohledu je vidět, že test je specifický pro MS, protože, jak je ukázáno v tabulce 1, žádná kontrola nemá čistou OD nad tento práh. Ve skutečnosti tento výsledek odráží skutečnost, že titry protilátek u pacientů s MS jsou, ve většině případů, vyšší než u zdravých kontrol, které byly v kontaktu s MSRV-1.
Podle této první metody -výpočtu, a jak je ukázáno na obrázku 41 a v tabulce 3, 6 z 15 MS sér dává pozitivní výsledky (čistá OD • ·
vyšší nebo rovna 0,20), což ukazuje na přítomnost IgG specificky namířených proti S24Q peptidu, a proto proti části enzymu reversní transkriptasy MSRV-l retroviru kódované jeho pol genem a v důsledku toho proti MSRV-l retroviru.
Tak, asi 40% testovaných MS pacientů reagovalo proti epitopu nesenému S24Q peptidem a mělo cirkulující IgG namířené proti tomuto epitopu.
Dva z 15 dárců krve ve zjevně dobrém zdravotním stavu vykazovali pozitivní výsledek. Proto, je jasné, že přibližně 13% bezpříznakové populace může mít kontakt s epitopem neseným S24Q peptidem za podmínek, které vedly k aktivní imunizaci, která se manifestuje sama v persistenci specifických sérových IgG. Tyto podmínky jsou kompatibilní s imunizací proti reversní transkriptase MSRV-l retroviru v průběhu infekce s (a/nebo reaktivace) MSRV-l retroviru. Absence jasné neurologické patologie projevující se jako MS u těchto seropozitivních kontrol může naznačovat, že to jsou zdraví nosiči a že eliminovali infekční virus poté, co byli sami imunizováni, nebo že vytvářejí rizikovou populaci chronických nosičů. Skutečně, epidemiologická data ukazující, že patogenní agens přítomná v prostředí s vysokou prevalencí MS mohou být příčinou tohoto onemocnění, naznačují, že frakce populace bez MS musí nutně být v kontaktu s takovým patogenním agens. Bylo ukázáno, že MSRV-l retrovirus vytváří celé nebo část tohoto patogenního agens způsobujícího MS a je proto normální pro kontroly vybrané ze zdravé poulace, že mají IgG typ protilátek proti složkám MSRV-l retroviru.
Nakonec, detekce anti-S24Q protilátek u pouze jednoho ze dvou • · • · testovaných případů MS může odrážet skutečnost, že tento peptid nerepresentuje imunodominantní MSRV-1 epitop, že inter-individuální kmenové variace mohou indukovat imunizaci proti různým peptidovým motivům ve stejném regionu nebo že průběh onemocnění a léčby může časem modulovat protilátkovou odpověď proti S24Q peptidu.
Tabulka 3
Kontroly
MS
Průměrná hodnota Standartní odchylka Prahová hodnota
0.101
0.136
0.058
0.391
0.126
0.37
0.131
0.119
0.105
0.267
0.294
0.141
0.116
0.102
0.088
0.18
0.105
0.411
0.172
0.164
0.137
0.049
0.223
0.644
0.08
0.268
0.073
0.065
0.132
0.074
0.129
0.06
0.31 • · • ·
d) Detekce anti MSRV-1 IgM protilátek ELISA
ELISA technika s S24Q peptidem byla použita pro testování přítomnosti anti-MSRV-1 specifických IgM protilátek ve stejném séru jako bylo uvedeno výše.
Obrázek 42 ukazuje výsledky pro každé testované sérum s ant-IgM protilátkou. Každý vertikální sloupec representuje čistou optickou densitu (OD při 492 nm) testovaného séra. Ordináta dává čistou OD na vrcholu vertikálních sloupců. Prvních 15 vertikálních sloupců nalevo od vertikální linie oddělující souřadnicovou osu representuje séra 15 zdravých kontrol (dárci krve) a 15 vertikálních sloupců ležících napravo od vertikální přerušované čáry representují séra od 15 testovaných případů MS.
Průměr čistých OD hodnot pro testované případy MS je 1,6.
Průměr čistých OD hodnot pro kontroly je 0,7.
Standartní odchylka negativních kontrol je 0,6.
Práh teoretické pozitivity může být vypočítán podle vzorce:
prahová hodnota (průměr čistých OD hodnot negativních kontrol) + (3 x standartní odchylka čistých OD hodnot negativních kontrol).
Prahová hodnota je proto rovna 0,7 + (3 x 0,6) = 2,5;
Negativní výsledky representují nespecifické pozadí přítomnosti protilátek namířených specificky proti epitopu • ·
peptidu.
Podle této analýzy, a jak je ukázáno na obrázku 42 a v korespondující tabulce 4, je IgM test specifický pro MS, protože žádná kontrola neměla čistou OD nad práh. 6 z 15 MS sér produkovalo pozitivní IgM výsledky.
Rozdíl v seroprevalenci mezi MS a kontrolní populací je mimožádně signifikantní: chi-squared test, p < 0,002.
Tyto výsledky proto svědčí pro etiologickou roli MSRV-1 u
MS.
Tak, detekce IgM a IgG protilátek proti S24Q peptidu umožňuje hodnocení, samostatně nebo v kombinaci s jinými MSRV-1 peptidy, průběhu infekce MSRV-1 a/nebo virové reaktivace MSRV-1.
Kontroly
MS 97
1,449
0,974
0,371
6,117
0,448
2,883
Tabulka 4 0,456
1,945 0,885 1,787 2,235 0,273 0,301 1,766 0,138 0,668
0,16
2,603
1,073
0,802
1,366
0,245
0,283
0,147
0,262
2,441
0,585
0,287
0,356
0,589
Průměrná hodnota
Standartní odchylka 0,6 Prahová hodnota 2,5
Je možné, v důsledku nových objevů a nových metod vyvinutých vynálezci, umožnit zlepšení provedení diagnostických testů pro MSRV-l infekci a/nebo reaktivaci a hodnocení terapie MS a/nebo RA na základě její účinnosti v negativizaci detekce těchto agens v tělesných tekutinách pacienta. Dále, časná detekce u jedinců ještě nevykazujících neurologické příznaky MS nebo revmatické příznaky RA by mohla umožnit stanovení léčby, která bude o mnoho účinnější s ohledem na následující klinický průběh díky skutečnosti, že bude předcházet lézím, které korespondují nástupu klinického onemocnění. V současnosti nemůže být diagnosa MS • · stanovena před nástupem symptomatologie lézí a proto není stanovena žádná léčba před rozvojem klinického obrazu naznačujícího léze, které jsou již signifikantní. Diagnosa MSRV-1 a/nebo MSRV-2 infekce a/nebo reaktivace u lidí má proto rozhodující význam, a předkládaný vynález poskytuje prostředky pro j ej i provedení.
Je proto možné, kromě provedení diagnosy MSRV-1 infekce a/nebo reaktivace, hodnotit terapii MS na základě její účinnosti v negativizaci detekce těchto agens v tělesných tekutinách pacienta.
• · · ·
Odkazy:
(1) Norrby E., Prog. Med. Virol., 1978; 24, 1-39.
(2) Johnson R.T., Handbook of clinical neurology, 47 Deinyelinating diseases, Vinken P. and Bruyn G.W., eds. Amsterdam, Elsevier Science Publishing, 1985, 319-336.
(3) Perron H. et al., Res. Virol. 1989, 140, 551-561.
(4) Perron H. et al., Current concepts in multiple sclerosis Wiethólter et al., eds. Amsterdam, Elsevier, 1991, 111-116.
(5) Perron H. et al., The Lancet 1991, 337, 862-863.
(6) Perron H. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 65-72.
(7) Fields and Knipe, Fondamental Virology 1986, Rev Press N.Y.
(8) Nielsen P.E. et al., Science 1991; 254, 1497-1500.
(9) Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, 1982.
(10) Southern. E.M., J. Mol. Biol. 1975, 98., 503.
(11) Dunn A.R. and Hassel J.A., Cell 1977, 12., 23, (12) Shih et al., J. Virol. 1989, 63, 64-75.
(13) Perron H. et al., Res. Vir. 1992, 143, 337-350.
(14) Meyerhans et al., Cell 1989, 58., 901-910.
(15) Linial M.L. and Miller A.D., Current topics in microbiology and immunobiology. Retroviruses, strategies of replication vol. 157, 125-152;
Swanstrom R. and Vogt P.K., editors, Springer-Verlag, Heidelberg 1990.
(16) Lori F. et al., J. Virol. 1992, 66, 5067-5074.
(17) Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.
(18) La Mantia et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1513-1520.
(19) Gonzales-Quintial R, Baccala R, Pope R M and Theofilopoulos N, J. Clin. Invest, Vol. 97, Number 5, ppl335-1343, 1996.
(20) Chomzynski P. and N. Sacchi, Analytical Biochemie try 1987, 162, 156-159.
w Mallefc et al. .
Journal of Clinical Microbiology
100 ····
1993; 31, 1444-1449.
(22) G. Barany and R.B. Merrifielsd, 1980, In the Peptides, 2_, 1-284, Gross E and Meienhofer J, Eds., Academie Press, New York.
(23) Poser et al., Gbers G.C. eds. The diagnosis of multiple sclerosis Thieme Stratton lne, New York 1984: 225-229.
(24) La Mantia et al. , Nucleic Acid Research 1989, 17, 5913-22.
(25) PLAZA, A; KONO, D.H.; THEOFILOPOULOS, A.N. NEW HUMAN VjS 12DD GENES AND POLYMORPHIC VARIANTS. J. Imm; 147(12): 4360-4365, 1991.
• · · · • ·
101
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) Biomerieux (B) Ulice: ne (C) Město: Marcy L'Etoile (E) Země: Francie (F) Poštovní kod: 69280 (ii) Název vynálezu:
(iii) Počet sekvencí: 92 (iv) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (EPO) (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1158 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA • · • ·
102 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 1:
CCCTTTGCCA CTACATCAAT TTTAGGAGx AGGAAACCCA ACGGACAGTG GAGGTTAGTG €0 CAAGAACTCA GGATTATCAA TGAGGCTGTT GTTCCTCTAT ACCCAGCTGT ACCTAACCCT 120 TATACAGTGC TTTCCCAAAT ACCAGAGGAA GCAGAGTGGT TTACAGTCCT GGACCTTAAG 180 GATGCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT GACTCTCAAT TCTTGTTTGC CTTTGAAGAT 240 CCTTTGAACC CAACQTCTCA ACTCACCTGG ACTGTTTTAC CCCAAGGGTT CAGGGATAGC 300 CCCCATCTAT TTGGCCAGGC ATTAGCCCAA GACTTGAGTC AATTCTCATA CCTGGACACT 3 CO CTTGTCCTTC AGTACATGGA TGATTTACTT TTAGTCGCCC GTTCAGAAAC CTTGTGCCAT 420
CAAGCCACCC AAGAACTCTT AACTTTCCTC ACTACCTGTG GCTACAAGGT TTCCAAACCA 480 AAGGCTCGGC TCTGCTCACA GGAGATTAGA TACTNAGGGC TAAAATTATC CAAAGGCACC 540 AGGGCCCTCA GTGAGGAACG TATCCAGCCT ATACTGGCTT ATCCTCATCC CAAAACCCTA 600 AAGCAACTAA GAGGGTTCCT TGGCATAACA GGTTTCTGCC GAAAACAGAT TCCCAGGTAC 660 ASCCCAATAG CCAGACCATT ATATACACTA ATTANGGAAA CTCAGAAAGC CAATACCTAT 720 TTAGTAAGAT GGACACCTAC AGAAGTGGCT TTCCAGGCCC TAAAGAAGGC CCTAACCCAA 780 GCCCCAGTGT TCAGCTTGCC AACAGGGCAA GATTTTTCTT TATATGCCAC AGAAAAAACA 840 GGAATAGCTC TAGGAGTCCT TACGCAGGTC TCAGGGATGA GCTTGCAACC CGTGGTATAC 900 CTGAGTAAGG AAATTGATGT AGTGGCAAAG GGTTGGCCTC ATNGTTTATG GGTAATGGNG 960 GCAGTAGCAG TCTNAGTATC TGAAGCAGTT AAAATAATAC AGGGAAGAGA TCTTNCTGTG 1020 TGGACATCTC ATGATGTGAA CGGCATACTC ACTGCTAAAG GAGACTTGTG GTTGTCAGAC 1080 AACCATTTAC TTAANTATCA GGCTCTATTA CTTGAAGAGC CAGTGCTGNG ACTGCGCACT 1140 TGTGCAACTC TTAAACCC 1158 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 297 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 2:
CCCTTTGCCA CTACATCAAT TTTAGGAGTA AGGAAACCCA ACGGACAGTG GAGGTTAGTG 60 CAAGAACTCA GGATTATCAA TGAGGCTGTT GTTCCTCTAT ACCCAGCTGT ACCTAACCCT 120 TATACAGTGC TTTCCCAAAT ACCAGAGGAA GCAGAGTGGT TTACAGTCCT GGACCTTAAG 180 GATGCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT GACTCTCAAT TCTTGTTTGC CTTTGAAGAT 240 CCTTTGAACC CAACGTCTCA ACTCACCTGG ACTGTTTTAC CCCAAGGGTT CAAGGGA 297
103
(2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 85 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3:
GTTTAGGGAT ANCCCTCATC TCTTTGGTCA GGTACTGGCC CAAGATCTAG GCCACTTCTC AGGTCCAGSN ACTCTGTYCC TTCAG (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 86 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 4:
GTTCAGGGAT AGCCCCCATC TATTTGGCCA GGCACTAGCT CAATACTTGA GCCAGTTCTC ATACCTGGAC AYTCTYGTCC TTCGGT (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristiky sekvence:
104
(A) Délka: 85 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 5:
GTTCARRGA TAGCCCCCATC TATTTGGCCW RGYATTAGCC CAAGACTTGA GYCAATTCTC ATACCTGGA CACTCTTGTCC TTYRG (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 85 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 6:
GTTCAGGGAT AGCTCCCATC TATTTGGCCT GGCATTAACC CGAGACTTAA GCCAGTTCTY 60 ATACGTGGAC ACTCTTGTCC TTTGG 85 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 111 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý «4 * · « ·
105
»· e* • » · · • · · · • · · · · • · · ·« ·· (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 7:
GTGTTGCCAC AGGGGTTTAR RGATANCYCY CATCTMTTTG GYCWRGYAYT RRCYCRAKAY 60 YTRRGYCAVT TCTYAKRYSY RGSNAYTCTB KYCCTTYRGT ACATGGATGA C 111 (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 645 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 8:
| TCAGGGATAG | CCCCCATCTA TTTGGCCAGG CATTAGCCCA AGACTTGAGT CAATTCTCAT | 60 |
| ACCTGGACAC | TCTTGTCCTT CAGTACATGG ATGATTTACT TTTAGTCGCC CGTTCAGAAA | 120 |
| CCTTGTGCCA | TCAAGCCACC CAAGAACTCT TAACTTTCCT CACTACCTGT GGCTACAAGG | 180 |
| TTTCCAAACC | AAAGQCTCGG CTCTGCTCAC AGGAGATTAG ATACTNAGGG CTAAAATTAT | 240 |
| CCAAAGGCAC | CAGGGCCCTC AGTGAGGAAC GTATCCAGCC TATACTGGCT TATCCTCATC | 300 |
| CCAAAACCCT | AAAGCAACTA AGAGGGTTCC TTGGCATAAC AQGTTTCTGC CGAAAACAGA | 360 |
| TTCCCAGGTA | CASCCCAATA GCCAGACCAT TATATACACT AATTANGGAA ACTCAGAAAG | 420 |
| CCAATACCTA | TTTAGTAAGA TGGACACCTA CAGAAGTGGC TTTCCAGGCC CTAAAGAAGG | 480 |
| CCCTAACCCA | AGCCCCAGTG TTCAGCTTGC CAAČÁGGGCA AGATTTTTCT TTATATGCCA | 540 |
| CAGAAAAAAC | AGGAATAGCT CTAGGAGTCC TTACGCAGGT CTCAGGGATG AGCTTGCAAC | 600 |
| CCGTGGTATA | CCTGAGTAAG GAAATTGATG TAGTGGCAAA GGGTT | 645 |
(2) Informace pro SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 741 párů baží
106 ·· · · · · • · · · · • » · · · · • · » · · ··· ·· ·· ···· «
·· ·· • · • · · · • · ··
A ···· · • · · ·· (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 9:
| CAAGCCACCC | AAGAACTCTT | AAATTTCCTC | ACTACCTGTG | GCTACAAGGT | TTCCAAACCA | 60 |
| AAGGCTCAGC | TCTGCTCACA | GGAGATTAGA | TACTTAGGGT | TAAAATTATC | CAAAGGCACC | 120 |
| AGGGGCCTCA | GTGAGGAACG | TATCCAGCCT | ATACTGGGTT | ATCCTCATCC | CAAAACCCTA | 180 |
| AAGCAACTAA | GAGGGTTCCT | TAGCATGATC | AGGTTTCTGC | CGAAAACAAG | ATTCCCAGGT | 240 |
| ACAACCAAAA | TAGCCAGACC | ATTATATACA | CTAATTAAGG | AAACTCAGAA | AGCCAATACC | 300 |
| TATTTAGTAA | GATGGACACC | TAAACAGAAG | GCTTTCCAGG | CCCTAAAGAA | GGCCCTAACC | 360 |
| CAAGCCCCAG | TGTTCAGCTT | GCCAACAGGG | CAAGATTTTT | CTTTATATGG | CACAGAAAAA | 420 |
| ACAGGAATCG | CTCTAGGAGT | CCTTACACAG | GTCCGAGGGA | TGAGCTTGCA | ACCCGTGGCA | 480 |
| TACCTGAATA | AGGAAATTGA | TGTAGTGGCA | AAGGGTTGGC | CTCATNGTTT | ATGGGTAATG | 540 |
| GNGGCAGTAG | CAGTCTNAGT | ATCTGAAGCA | GTTAAAATAA | TACAGGGAAG | AGATCTTNCT | 600 |
| GTGTGGACAT | CTCATGATGT | GAACGGCATA | CTCACTGCTA | AAGGAGACTT | GTGGTTGTCA | 660 |
| GACAACCATT | TACTTAANTA | TCAGGCTCTA | TTACTTGAAG | AGCCAGTGCT | GNGACTGCGC | 720 |
| ACTTGTGCAA | CTCTTAAACC | C | 741 |
(2) Informace pro SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 93 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 10:
TGQAAAGTGT TGCCACAGGG CGCTGAAGCC TATCGCGTGC AGTTGCCGGA TGCCGCCTAT €0
AGCCTCTACA TGGATGACAT CCTGCTGGCC TCC 93 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:
• ·
107 ·· ·· · ···· • ··· · ·· ···· · ·· ···· ··· ··· ·· ·· · · ·· (i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 96 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 11:
TTGGATCCAG TGYTGCCACA GGGCGCTGAA GCCTATCGCG TGCAGTTGCC GGATGCCGCC 6Γ TATAGCCTCT ACGTGGATGA CCTSCTGAAG CTTGAG 96 (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 748 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 12:
| TGCAAGCTTC | ACCGCTTGCT | GGATGTAGGC | CTCAGTACCG | GNGTGCCCCG | CGCGCTGTAG | 60 |
| TTCGATGTAG | AAAGCGCCCG | GAAACACGCG | GGACCAATGC | GTCGCCAGCT | TGCGCGCCAG | 120 |
| CGCCTCGTTG | CCATTGGCCA | GCGCCACGCC | GATATCACCC | GCCATGGCGC | CGGAGAGCGC | 180 |
| CAGCAGACCG | GCGGCCAGCG | GCGCATTCTC | AACGCCGGGC | TCGTCGAACC | ATTCGGGGGC | 240 |
| GATTTCCGCA | CQACCGCGAT | GCTGGTTGGA | GAGCCAGGCC | CTGGCCAGCA | ACTGGCACAG | 300 |
| GTTCAGGTAA | CCCTGCTTGT | CCCGCACCAA | CAGCAGCAGG | CGGGTCGGCT | TGTCGCGCTC | 360 |
| GTCGTGATTG | GTGATCCACA | CGTCAGCCCC | GACGATGGGC | TTCACGCCCT | TGCCACGCGC | 420 |
| TTCCTTGTAG | ANGCGCACCA | GCCCGAAG C | ATTGGCGAGA | TCGGTCAGCG | CCAAGGCGCC | 480 |
| CATGCCATCT | TTGGCGGCAG | CCTTGACGGC | ATCGTCGAGA | CGGACATTGC | CATCGACGAC | 540 |
| GGAATATTCG | GAGTGGAGAC | GGAGGTGGAC | GAAGCGCGGC | GAATTCATCC | GCGTATTGTA | 600 |
| ACGGGTGACA | ccttccgcaa | AGCATTCCGG | ACGTGCCCGA | TTGACCCGGA | GCAACCCCGC | 660 |
| ACGGCTGCGC | GGGCAGTTAT | AATTTCGGCT | TACGAATCAA | CGGGTTACCC | CAGGGCGCTG | 720 |
| AAGCCTATCG | CGTGCAGTTG | CCGGATGC | 748 |
• * • ·
108 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 18 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 13:
GCATCCGGCA ACTGCACG (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 14:
GTAGTTCGAT GTAGAAAGCG (2) Informace pro SEQ ID NO: 15:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 18 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý
109
(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 15:
GCATCCGGCA ACTGCACG 18 (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 23 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 16:
AGGAGTAAG GAAACCCAACG GAC 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 19 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 17:
TAAGAGTTGC ACAAGTGCG
110 • · · ·
(2) Informace pro SEQ ID NO: 18:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 21 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 18:
TCAGGGATAG CCCCCATCTA T 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 24 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 19:
AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT 24 (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 15 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý
111 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:
(B) umístění: 5, 7, 10, 13 (D) jiné informace: G representuje inosin (i) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 20:
GGTCGTGCCG CAGGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 21 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 21:
TTAGGGATA GCCCTCATCTC T (2) Informace pro SEQ ID NO: 22:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 21 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární
112
(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 22:
TCAGGGATAG CCCCCATCTA T 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 24 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 23:
AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT (2) Informace pro SEQ ID NO: 24:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 23 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 24:
GCGTAAGGAC TCCTAGAGCT ATT
113 (2) Informace pro SEQ ID NO: 25:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 18 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 25:
TCATCCATGT ACCGAAGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 26:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 26: ATGGGGTTCC CAAGTTCCCT (2) Informace pro SEQ ID NO: 27:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleotidová ··♦·
114 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 27:
GCCGATATCA CCCGCCATGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 28:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 18 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 28:
GCATCCGGCA ACTGCACG (2) Informace pro SEQ ID NO: 29:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA • · • · · ·
115
(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: CGCGATGCTG GTTGGAGAGC (2) Informace pro SEQ ID NO: 30:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO:
TCTCCACTCC GAATATTCCG (2) Informace pro SEQ ID NO: 31:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 26 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: GATCTAGGCC ACTTCTCAGG TCCAGS (2) Informace pro SEQ ID NO: 32:
29:
30:
31:
(i) Charakteristiky sekvence:
116 • · ··· · ·· ···· · • · · ♦·♦· ··· ····· ·· · · ·· · · (A) Délka: 23 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:
(B) umístění: 6, 12, 19 (D) jiné informace: G representuje inosin (i) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 32:
CATCTGTTTG GGCAGGCAGT AGC 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 33:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 24 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 33:
CTTGAGCCAG TTCTCATACC TGGA 24 (2) Informace pro SEQ ID NO: 34:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 22 párů baží
117 • · · · ···· ·· ·« • · ·· · ···· ··· · ·· · · · · · ·· · · · · · · · ··· ·· ·· ·· ·· ·· (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 34:
AGTGYTRCCM CARGGCGCTG AA 22 (2) Informace pro SEQ ID NO: 35:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 22 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 35:
GMGGCCAGCA GSAKGTCATC CA 22 (2) Informace pro SEQ ID NO: 36:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 22 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA • 9 ····
118 ·· ·
«· ·* «* · · · • · ·· ··» · · •« · ·· ·· (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 36:
GGATGCCGCC TATAGCCTCT AC 22 (2) Informace pro SEQ ID NO: 37:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 22 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 37:
AAGCCTATCG CGTGCAGTTG CC 22 (2) Informace pro SEQ ID NO: 38:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 40 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 38:
TAAAGATCTA GAATTCGGCT ATAGGCGGCA TCCGGCAAGT (2) Informace pro SEQ ID NO: 39:
(i) Charakteristiky sekvence:
• · • ·
119
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 39: viz obrázek 28 (2) Informace pro SEQ ID NO: 40:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 40: viz obrázek 28 (2) Informace pro SEQ ID NO: 41:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární • · • ·
120 • · · · · · · • · · · (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 41: viz obrázek 34 (2) Informace pro SEQ ID NO: 42:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 42: viz obrázek 34 (2) Informace pro SEQ ID NO: 43:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 43:
viz obrázek 34
2) Informace pro SEQ ID NO: 44:
121 (i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 44: viz obrázek 34 (2) Informace pro SEQ ID NO: 45:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 45:
(2) Informace pro SEQ ID NO: 46:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární • · ·· ····
122 (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 46: viz obrázek 13 (2) Informace pro SEQ ID NO: 47:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 23 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 47:
TGATGTGAAC GGCATACTCA CTG 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 48:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 24 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 48:
CCCAGAGGTT AGGAACTCCC TTTC ηΛ (2) Informace pro SEQ ID NO: 49:
• · • · • · » · • ·
123 »· ·· (i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 49:
GCTAAAGGAG ACTTGTGGTT GTCAG (2) Informace pro SEQ ID NO: 50:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 22 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 50:
CAACATGGGC ATTTCGGATT AG 22 (2) Informace pro SEQ ID NO: 51:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA
124
(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 51: viz obrázek 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 52:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 52: viz obrázek 16 (2) Informace pro SEQ ID NO: 53:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 53: viz obrázek 17 (2) Informace pro SEQ ID NO: 54:
(i) Charakteristiky sekvence:
125
• · · · • · · • · · ♦
(A) Délka: 21 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 54 CCTGAGTTCT TGCACTAACC C (2) Informace pro SEQ ID NO: 55:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 23 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 55 GTCCGTTGGG TTTCCTTACT CCT (2) Informace pro SEQ ID NO: 56:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA • ·
(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 56: viz obrázek 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 57:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 57: viz obrázek 27 (27 a až 27c) (2) Informace pro SEQ ID NO: 58:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1722 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 58:
TGGAGAATAG CAGCATAAGT TGGCTGGCAG AAAAARGAGA AAGTCAGAGA AAGAAAAAAA GAGAAAGAAG TAGTAAAGAA AAAACAGTAT TCTGTCTACC TAGCCAAGGC ATATTCTTCT CCACTAACTG GACAGGCACC TGAACCTTAG CAGGAAATCA GACCCTATTG GTACCTGTCA CAACTAATAT CCCTATTTAT AGGGTTAGGA GGTTTATCTA CTTCATTATC CTACTACCAT CAAGAAATAA TGAAATCTAT TCTTACTTTA ACTCTCCAAA ACCGCCGAGG CCCACACCTC TTCTTAGGGG AAGAGTGTTG TTTTTACACT TGGCATTTAC AGGAAAGGGC TTCTGATATC
AAGTAGGGAA AGACAGCAAG AAGTAAAGAA 60 GAGAGGAAGA AACAAAGAAG AACTTGAAGA 120 ACCCTATTCC TTTAAAAGCC AGGGTAAATT 180 TATGTGGAAC ATCAACCTAT ATCTGCCTCC 240 TCTTTCTAAG TCCCAACATT AACATTGCCC 300 AAGCTAAAGT CCCGTCAGTG CAGAGCCATA 360 ATGGCTACTG CTACAGGAAC TGGAATAGCC 420 ACACTCTCAA AGAATTTCTC AGACAGTTTG 480 CAATCCCAAT TAGACTCTTT GGCAGCAATG 540 CTCACTGCTG AGAAAGGAGG ACTCTGCACC 600 AACCÁGTCAG GGATAGTACG AGATGCCACC 660 AGACAATGCC TTTCAAACTC TTATACCAAC 720 • ·
127 • · · ··
CTCTGGAGTT GGGCAACATG GCTTCTTCCA TTTCTAGGTC CCATGGCAGC CATCTTGCTG 780 TTACTCACCT TTGGGCCCTG TATTTTTAAG CTTCTTGTCA AATTTGTTTC CTCTAGGATC 840 GAAGCCATCA AGCTACAGAT GGTCTTACAA ATGGAACCCC AAATGAGTTC AACTAACAAC 900 TTCTACCAAG GACCCCTGGA ACGATCCACT GGCACTTCCA CTAGCCTAGA GATTCCCCTC 960 TGGAAGACAC TACAACTGCA GGGCCCCTTC TTTGCCCCTA TCCAGCAGGA AGTAGCTAGA 1020 GCGGTCATCG GCCAAATTCC CAACAGCAGT TGGGGTGTCC TGTTTAGAGG GGGGATTGAA 1080 GAGGTGACAG CCTGCTGGCA GCCTCACAGC CCTCGTTGGY TCTCAGTGCC TCCTCAGCCT 1140 TGGTGCCCAC TCTGGCCGTG CTTGAGGAGC CCTTCAGCCT GCCACTGCAC TGTGGGAGCC 1200 TCTTTCTGGQ CTGGACAAGG CCGGAGCCAG CTCCCTCAGC TTGCAGGGAG GTATGGAGGG 1260 AGAGATGCAG GCGOGAACCA GGGCTGCGCA TGGCGCTTGC GGGCCAGCAT GAGTTCCAGG 1320 TGGGCGTGGG CTCGGCGGGC CCCACACTCG GGCAGTGAGG GGCTTAGCAC CTGGGCCAGA 1380 CAGATGCTGT GCTCAACTTC TTCGCTGGGC CTTAGCTGCC TTCCCCGTGG GGCAGGGCTY 1440
CGGGAACMTG CAGCCTGCCC ATGCTTGAGC CCCCCACCCC GCCGTGGGTT CYTGCACAGC 1500 CCAAGCTTCC CGGACAAGCA CCACCCCTTA TCCACGGTGC CCAGTCCCAT CAACCACCCA 1560 AGGGTTGAGG AGTGCGGGCA CACAGCGCGG GATTGGCAGG CAGTTCCACT TGCGGCCTTG 1620 GTGCGGGATC CACTGCGTGA AGCCAGCTGG GCTCCTGAGT CTCGTGGGGA CTTGGAGAAT 1680 CTTTATGTCT AGCTAAGGGA TTGTAAATAC ACCAATCAGC AC 1722 (2) Informace pro SEQ ID NO: 59:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 495 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 59:
| CTTCCCCAAC | TAATAAGGAC | CCCCCTTTCA | ACCCAAACAG | TCCAAAAGGA | CATAGACAAA | 60 |
| GGAGTAAACA | ATGAACCAAA | GAGTGCCAAT | ATTCCCTGGT | TATGCACCCT | CCAAGCGGTG | 120 |
| GGAGAAGAAT | TCGGCCCAGC | CAGAGTGCAT | GTACCTTTTT | CTCTCTCACA | CTTGAAGCAA | 180 |
| ATTAAAATAG | ACNTAGGTNA | ATTNTCAGAT | AGCCCTGATG | GYTATATTGA | TGTTTTACAA | 240 |
| GGATTAGGAC | AATCCTTTGA | TCTGACATGG | AGAGATATAA | TATTACTGCT | AAATCAGACG | 300 |
| CTAACCTCAA | ATGAGAGAAG | TGCTGCCATA | ACTGGAGCCC | GAGAGTTTGG | CAATCTCTGG | 360 |
| TATCTCAGTC | AGGTCAATGA | TAGGATGACA | ACGGAGGAAA | GAGAACGATT | CCCCACAGGG | 420 |
| CAGCAGGCAG | TTCCCAGTGT | AGCTCCTCAT | TGGGACACAG | AATCAGAACA | TGGAGATTGG | 480 |
| TGCCGCAGAC | ATTTA | 495 |
• ·
(2) Informace pro SEQ ID NO: 60:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 2503 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 60:
| CCAAGAACCC | ACCAATTCCG | GANCACATTT | TGGCGACCAC | GAAGGGACTT | TCGCATATCG | 60 |
| CCAAGCGGTG | AGACAATAGC | CGAGCGGTGA | gacctttccc | AATCGCCAAG | CAGTGAGTAC | 120 |
| CATCAGACCC | CTTTCACTTG | CTATTCTGTC | CTATCTTTCT | TTAGAATTCG | GGGGCTAAAT | 180 |
| ACCGGGCATC | TGTCAGCCAT | TTAAAAGTGA | CTAGCGGGCC | GCCGGACTAA | AGACACGGGT | 240 |
| GTCAAGCTTT | CTGGGAAAGG | GCTCTCTAAC | AACCCCCAAC | TCTTTGGAGT | TGGGACCGTT | 300 |
| GGTTTGCCTA | GAACCAGCTT | CCGCTTTTCC | TGTACTTCTG | GGCTGAGCCG | TGGGTTGACA | 360 |
| GTGAAGGAAA | GCCATGCATC | TCCGGGGTCT | CGMCAACATG | TTGGTTGACC | CTGCGGCCAT | 420 |
| GAGTGGAACT | CTCAAAAGCA | TGTCGCCCAA | GCGACACTCG | CCTATCTATC | CTATCTATCC | 480 |
| TGACCCTTGC | CCTCTGGGTC | CTAATGCCTG | CCAGACAAAC | TTCCTCTCGC | CTCTCTTCTC | 540 |
| TGAAGCTAGA | ACCGCTTCTA | AAAATTGCTA | CCTGGTCTCT | GGTGCTTTTC | CTARTTTCTC | 600 |
| CTATAAAGAA | TGAWTTCTAG | TATTAAACTC | CAGGACTCTG | TTACCTTCTT | TAGGCACCCG | 660 |
| GGCTCACCAA | TCAGAAAGAC | ACAGTTTTTG | CCCAAGGCCC | CATCGTAGTG | GGGACTACCT | 720 |
| GGAATTTTAG | GATCCCTCCT | CAGACTAACA | GGCCTAACAA | AAGTTATTCC | TGAAGCTAGG | 780 |
| ATATGGGGAG | CCTCAGAAAT | TGTATCCCTC | CTATTCATAT | AAGTGAGAAC | AAAAGGTGTC | 840 |
| ACTCTTCCAA | CCCTGAAGAT | CCCCTCCCTC | CCTCAGGGTA | TGGCCCTCCA | TTTCATTTTT | 900 |
| GTGGCATAAC | atctttatag | GATGGGGTAA | AGTCCCAATA | CTAACAGGAG | AATGCTTAGG | 960 |
| ACTCTAACAG | GTTTTTGAGA | ATGCGTCAGT | AAGPGCCACT | AAATCTGATT | TTTCTCAGTC | 1020 |
| GGTCCTCCTT | GTGGTCTAGG | AGGACAGGCA | AGGTTGTGCA | GGTTTTCGAG | AATGCGTCAG | 1080 |
| TAAGGACCAC | TAAATCCGAC | CTTCCTCGGT | CCTCCATGTG | GTCTGGGAGG | AAAACTAGTG | 1140 |
| TTTCTGCTGC | TGCGTCGGTG | AGCGCAACTA | TTCAAGTCAG | CAGGGTCCAG | GGACCGTTGC | 1200 |
| AGGTTCTTGG | GCAGGGGTTG | TTTCTGCTGC | TGCATTGGTG | AATGCAACTA | TTCTGATCAG | 1260 |
| CAGGGTCCCA | GGACCATTGC | AGGTCCTTGG | GCAGGGAGAG | AAACAAAACA | AACCAAAACT | 1320 |
| GTGGGCGGTT | TTGTCTTTCA | TATGGGAAAC | ACTCAGGCAT | CAACAGGTTC | ACCCTTGAAA | 1380 |
| TGCATCCTAA | GCCATTGGGA | CCAATTTGAC | CCACAAACCC | TGAAAAAGAG | GAGGCTCATT | 1440 |
| TTTTCCTGCA | CTACGGCTTG | GCCCCAATAT | TCTCTTTYTG | ATGGGGAAAA | ATGGCCACCT | 1500 |
| GAGGGAAGCA | CAAATTACAA | TAYTATCCTA | CAGCYTGATC | TTTTCTGTAA | GAGGGAAGGC | 1560 |
| AAATGGAGTG | AATACCTTAT | GTCCAAGCTT | TCTTTTCATT | GAGGGAGAAT | ACACAACTAT | 1620 |
| GCAAAGCTTG | caatttacat | CCCACAGGAG | GACCCTTCAG | CTTACCCCCA | TATCCTAGCC | 1680 |
129
φ ·
| TCCCTATAGC | ttcccttcct | ATTGATGATA | ctcctcctct | AATCTCCCCT | GCCCAGAAGG | 1740 |
| AAATAAGCAA | AGAAATCTCC | AAAGGTCCAC | AAAAACCCCC | GGGCTATCGG | TTATGTCCCT | 1800 |
| TCAAGYTGTA | GGGGGAGGGG | AATTTGGCCC | AACCCGGGTG | CATGTCCCTT | CTCCCTCTCT | 1860 |
| GATTTAAAGC | AGATCAAGGC | AGACCTGGGG | AAGTTTTCAG | ATGATCCTGA | TAGGTACATA | 1920 |
| GATGTCCTAC | AGGGTCTAGG | GCAAACCTTT | GACCTCACTT | GGAGAGACGT | CATGCTACTG | 1980 |
| TTAGATCAAA | CCCTGGCCTT | TAATGAAAAG | AATGCGGCTT | TAGCTGCAGC | CTGAGAGTTT | 2040 |
| GGAGATACCT | GGTATCCTAG | TCAAGTAAAT | GAAAGAATGA | CAGCCGAAGA | AAGGGACAAC | 2100 |
| TTCCTTACTG | GTCAGCAACC | CATCCCCAGT | ATGGATCCCC | ACTGGGACTT | TGACTCAGAT | 2160 |
| CATGGGGACT | GGAGTCGTAA | ACATCTGTTG | atctgtgttc | TGGAAGGACT | AAGGAGAATT | 2220 |
| GGGAAAAAGC | CCATGAATTA | TTCAATGATA | TCCACCATAA | CCCAGGGAAA | GGAAGAAAAT | 2280 |
| CCTTCTGCCT | TCCTCGAGCG | GCTACAAGAG | GCCTTAAGAA | AATÁTACTCC | CCTGTCACCC | 2340 |
| GAATCACTCG | AGGGTCAATT | GATTCTAAAA | GATAAGTTTA | TTACCCAATC | AGCCACAGAT | 2400 |
| ATCAGGAGAA | AGCTCCAAAA | GCAAGCCCTG | AGCCTGAACA | AAATCTAGAG | ACATTATTAA | 2460 |
| ACCTGGCAAC | CTTGGTGTTC | TATAATAGGG | ACCAAGAGGA | ACA | 2503 |
(2) Informace pro SEQ ID NO: 61:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1167 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 61:
AAGGAAACTC AGAAAGCCAA TACCCATTTA TTCCAGGCCC TAAAGAAATC CCTAACCCAA GACTTTTCTT TATATGTCAC AGAAAAACAG AAGGGACAAG CTTGCAACCT GTGGCATACC GTTGGCCTCA TTGTTTACAG GTAGGGCAGC AATAATACAG GGAAGAGATC TTACTGTGTG TGCTAAAGAG GACTTGTGGC TGTCAGACAA TGAAGTGCCA GTGCTGCGAC TGCACATTTG AGACAATGAA GAAAAGATAG AACATAACTG TCGAGGGGAC CTTCTAGAGG TTCCCTTGAC AAGTTCCTTG GCAGAAAAAG GACTTTGAAA AATACTTGAA AGTAATCGCC TCACTCCAGG CCTCACTTGG GCACTAGAAT TAGGAGAAGG GTATGCTTAC CTAGTCCTCC ATGCCCATGC TTCTGAGGGA ACACCTATCA ACCATCAGGG AGAAACCTAA AGAGGTGGCA GTCTTACACT
GTAAGATGGA CACCAGAAGC AGAAGCAGCT 60 GCCCCAGTGT TAAGCTTGCC AACGGGGCAA 120 GAATAGCTCT AGGAGTCCTT ACACAGGTCC 180 TGAGTAAGGA AACTGATGTA NTGGCAAAGG 240 AGTAGCAGTC TTAGTTTCTG AAACAGTTAA 300 GACATCTCAT GATGTGAACG GCATACTCAC 360 CCATTTACTT AAATAGCAGG TTCTATTACT 420 TGCAACTCTT AACCCAGCCA CATTTCTTCC 480 TCAACAAGTA ATTGCTCAAA CCTATGCTGC 540 TGATCCCGAC CTCAACTTGT ATACTGATGG 600 AGCGGGGTAT GCAGTGATCA GTGATAATGG 660 AACTAGTGCT CACCTGGCAG AACTAATAGC 720 AAAAAGGGTA AATATATATT CAGACTCTAA 780 AGCAATATGG AGAGAGAGGG AATTCCTAAC 840 ÁAGCCATTAG GAGATTATTA TTGGCTGTAC 900 GCCAGGGTCA TCAGGAAGAA GAGGAAAGGG 960 • ·
130
AAATAGAAGG CAATCGCCAA GCGGATATTG AAGCAAAAAA AGCCGCAAGG CAGGACTCTC 1020 CATTAGAAAT GCTTATAGAA GGACCCCTAG TATGGGGTAA TCCCCTCTGG GAAACCAAGC 1080 CCCAGTACTC AGCAGGAAAA ATAGAATAGG AAACCTCACA AGGACATACT TTCCTCCCCT 1140 CCAGATGGCT AGCCACTGAG GAAGGAA 1167 (2) Informace pro SEQ ID NO: 62:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 78 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 62:
TCCAAAGGCA CCAGGGCCCT CAGTGAGGAA CGTATCCAGC CTATACTGGC TTATCCTCAT 60 78
CCCAAAACCC TAAAGCAA (2) Informace pro SEQ ID NO: 63:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 26 aminokyselinových zbytků (B) Typ: aminokyselina (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 63:
Ser Lys Gly Thr Arg Ala Leu Ser Glu Glu Arg Ile Gin Pro Ile Leu
10 15
Ala Tyr Pro His Pro Lys Thr Leu Lys Gin
25 (2) Informace pro SEQ ID NO: 64:
• · • · · · · ·
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 28 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 64:
AAATGTCTGC GGCACCAATC TCCATGTT 28 (2) Informace pro SEQ ID NO: 65:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 30 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 65:
AAGGGGCATG GACGAGGTGG TGGCTTATTT 30 (2) Informace pro SEQ ID NO: 66:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 21 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ·· ····
132 (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 66:
GGAGAAGAGC AGCATAAGTG G 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 67:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 67:
GTGCTGATTG GTGTATTTAC AATCC (2) Informace pro SEQ ID NO: 68:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 34 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 68:
GACTCGCTGC AGATCGATTT TTTTTTTTTT TTTT
133 • ·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 69:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 30 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 69:
GCCATCAAGC CACCCAAGAA CTCTTAACTT 30 (2) Informace pro SEQ ID NO: 70:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 30 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 70:
CCAATAGCCA GACCATTATA TACACTAATT (2) Informace pro SEQ ID NO: 71:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 23 párů baží (B) Typ: nukleotidová • · ·· ··· ·
134
(C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 71:
GCCATAACTG CAACCCAAGA GTT 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 72:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 23 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 72:
GGACGAGGTG GTGGCTTATT TCT 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 73:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 73:
AACTTGCGTG CTAGAAGGAC TAAGG • · » ·
135 ·· ··
(2) Informace pro SEQ ID NO: 74:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 24 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 74:
AACTTTTCCC TTTTCCAGAT CCTC (2) Informace pro SEQ ID NO: 75:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 22 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 75:
GCATACCAGG CAAGTGGACA TT 22 (2) Informace pro SEQ ID NO: 76:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý ·« ··»·
136 ·· • · · < · ··· · • · • · ·· ·» ·· (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 76: CTGTCCGTTG GGTTTCCTTA CTCCT (2) Informace pro SEQ ID NO: 77:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 24 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 77: GAGGCTCTGG AAAAGGGAAA AGTT (2) Informace pro SEQ ID NO: 78:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 78:
CTGTCCGTTG GGTTTCCTTA CTCCT • ·
137 • · · · · · ·· *·
(2) Informace pro SEQ ID NO: 79:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 79:
AGGAGTAAGG AAACCCAACG GACAG 25 (2) Informace pro SEQ ID NO: 80:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 80:
TGTATATAAT GGTCTGGCTA TTGGG 25 (2) Informace pro SEQ ID NO: 81:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý • · • · · ·
138 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 81:
AGGAGTAAGG AAACCCAACG GACAG 25 (2) Informace pro SEQ ID NO: 82:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 26 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 82:
TTCGGCAGAA ACCTGTTATG CCAAGG 26 (2) Informace pro SEQ ID NO: 83:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 22 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 83:
CTCGATTTCT TGCTGGGCCT TA
139
• · · ·· ·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 84:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 84:
GTTGATTCCC TCCTCAAGCA (2) Informace pro SEQ ID NO: 85:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 85:
CTCTACCAAT CAGCATGTGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 86:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 19 párů baží (B) Typ: nukleotidová • · · ·
140 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 86: TGTTCCTCTT GGTCCCTAT (2) informace pro SEQ ID NO: 87:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 433 aminokyselinových zbytků (B) Typ: aminokyselina (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 87:
MATATGTGIA GLSTSLSYYH TLSKNFSDSL QEIMKSILTL QSQLDSLAAM 50
TLQNRRGPHL LTAEKGGLCT FLGEECCFYT NQSGIVRDAT WHLQERASDI 100
RQCLSNSYTN LWSWATWLLP FLGPMAAILL LLTFGPCIFK LLVKFVSSRI 150
EAIKLQMVLQ MEPQMSSTNN FYQGPLERST GTSTSLEIPL WKTLQLQGPF 200
FAPIQQEVAR AVIGQIPNSS WGVLFRGGIE EVTACWQPHS PRWXSVPPQP 250
WCPLWPCLRS PSACHCTVGA SFWAGQGRSQ LPQLAGRYGG RDAGGNQGCA 300
WRLRASMSSR WAWARRAPHS GSEGLSTWAR QMLCSTSSLG LSCLPRGAGL 350
REXAACPCLS PPPRRGFLHS PSFPDKHHPL STVPSPINHP RVEECGHTAR 400
DWQAVPLAAL VRDPLREASW APESGGDLEN LYV 433 kz; xnrormace pro SEQ ID NO: 88:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 693 párů baží (B) Typ: nukleotidové (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární • 9
141 (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 88:
CTTCCCCAAC TAATAAGGAC CCCCCTTTCA ACCCAAACAG TCCAAAAGGA CATAGACAAA 60 GGAGTAAACA ATGAACCAAA GAGTGCCAAT ATTCCCTGGT TATGCACCCT CCAAGCGGTG 120 GGAGAAGAAT TCGGCCCAGC CAGAGTGCAT GTACCTTTTT CTCTCTCACA CTTGAAGCAA 180 ATTAAAATAG ACNTAGGTNA ATTNTCAGAT AGCCCTGATG GYTATATTGA TGTTTTACAA 240 GGATTAGGAC AATCCTTTGA TCTGACATGG AGAGATATAA TATTACTGCT AAATCAGACG 300 CTAACCTCAA ATGAGAGAAG TGCTGCCATA ACTGGAGCCC GAGAGTTTGG CAATCTCTGG 360 TATCTCAGTC AGGTCAATGA TAGGATGACA ACGGAGGAAA GAGAACGATT CCCCACAGGG 420 CAGCAGGCAG TTCCCAGTGT AGCTCCTCAT TGGGACACAG AATCAGAACA TGGAGATTGG 480 TGCCGCAGAC ATTTACTAAC TTGCGTGCTA GAAGGACTAA GGAAAACTAG GAAGACTATG 540 AATTATTCAA TGATGTCCAC TATAACACAG GGGAAAGGAA GAAAATCCTA CTGCCTTTCT 600 GGAGAGACTA AGGGAGGCAT TGAGGAAGCA TACCAGGCAA GTGGACATTG GAGGCTCTGG 660 AAAAGGGAAA AGTTGGGCAA ATTGAATGCC TAA 693 (2) Informace pro SEQ ID NO: 89:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1577 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 89:
| AACTTGCGTG | CTAGAAGGAC | TAAGGAAAAC | TAGGAAGACT | ATGAATTATT | CAATGATGTC | 60 |
| CACTATAACA | CAGGGGAAAG | GAAGAAAATC | CTACTGCCTT | TCTGGAGAGA | CTAAGGGAGG | 120 |
| CATTGAGGAA | GCATACCAGG | CAAGTGGACA | TTGGAGGCTC | TGGAAAAGGG | AAAAGTTGGG | 180 |
| CAAATTGAAT | GCCTAATAGG | GCTTGCTTCC | AGTGCAGTCT | ACAAGGACGC | TTTAGAAAAG | 240 |
| ATTGTCCAAG | TAGAAATAAG | CCGCCCCTCG | TCCATGCCCC | TTATGTCAAG | GGAATCACTG | 300 |
| GAAGGCCTAC | TGCCCCAGGG | GACGAAGGTC | CTCTGAGTCA | GAAGCCACTA | ACCTGATGAT | 360 |
| CCAGCAGCAG | GACTGAGGGT | GCCCGGGGCA | AGTGCCAGCC | CATGCCATCA | CCCTCAGAGC | 420 |
| CCCGGGTATG | TTTGACCATT | GAGAGCCAGG | AAGTTAACTG | TČTCCTGGAC | ACTGGCGCAG | 480 |
| CCTTCTCAGT | CTTACTTTCC | TGTCCCAGAC | AATTGTCCTC | uAGATCTGTC | ACTATCCGAG | 540 |
| GGGTCCTAAG | ACAGCCAGTC | ACTACATACT | TCTCTCAGCC | ACTAAGTTGT | GACTGGGGAA | 600 |
| CTTTACTCTT | TTCACATGCT | TTTCTAATTA | TGCCTGAAAG | CCCCACTCCC | TTGTTAGGGA | 660 |
| GAGACATTTT | AGCAAAAGCA | GGGGCCATTA | TACACCTGAA | CATAGGAAAA | GGAATACCCA | 720 |
| TTTGCTGTCC | CCTQCTTGAG | GAAGGAATTA | ATCCTGAAGT | CTGGGCAATA | GAAGGACAAT | 780 |
| ATGGACAAGC | AAAGAATGCC | CGTCCTGTTC | AAGTTAAACT | AAAGGATTCT | GCCTCCTTTC | 840 |
| CCTACCAAAG | GAAGTACCCT | CTTAGACCCG | AGGCCCTACA | AGGACTCAAA | AGATTGTTAA | 900 |
142
| GGACCTAAAA | GCCCAAGGCC | TAGTAAAACC | ATGCAGTAGC | CCCTGCAATA | CTCCAATTTT | 960 |
| AGGAGTAAGG | AAACCCAACG | GACAGTGGAG | GTTAGTGCAA | GATCTCAGGA | TTATTAATGA | 1020 |
| GGCTGTTTTT | CCTCTATACC | CAGCTGTATC | TAGCCCTTAT | ACTCTGCTTT | CCCTAATACC | 1080 |
| AGAGGAAGCA | GAGTAGTTTA | CAGTCCTGGA | CCTTAAGGAT | GCCTCTTTCT | GCATCCCTGT | 1140 |
| ACATCCTGAT | TCTCAATTCT | TGTTTGTCTT | TGAAGATCCT | TTGAACCCAA | TGTCTCAATT | 1200 |
| CACCTGGACT | GTTTTACCCC | AGGGGTTCCG | GGATAGCCCC | CATCTATTTG | GCCAGGCATT | 1260 |
| AGCCCAAGAC | TTGAGCCAAT | TCTCATACCT | GGACATCTTG | TCCTTCGGTA | TGGGATGATT | 1320 |
| TAATTTTAGC | CACCCGTTCA | GAAACCTTGT | GCCATCAAGC | CACCCAAGCG | TTCTTAAATT | 1380 |
| TCCTCACTCC | GTGTGGCTAC | AAGGTTTCCA | AACCAAAGGC | TCAGCTCTGC | TCACAGCAGG | 1440 |
| TTAAATACTT | AGGGTTAAAA | TTATCCAAAG | GCACCAGGGC | CCTCTGTGAG | GAATGTATCC | 1500 |
| AACCTGTACT | GGCTTATCTT | CATCCCAAAA | CCCTAAAGCA | ACTAAGAAGG | TCCTTGGCAT | 1560 |
| AACAGGTTTC | TGCCGAA | 1577 |
(2) Informace pro SEQ ID NO: 90:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 182 aminokyselinových zbytků (B) Typ: aminokyselina (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 90:
SSSRTBGARG KCQPMPSPSE PRVCLTIESQ EVNCLLDTGA APSVLLSCPR 50
QLSSRSVTIR GVLRQPVTTY FSQPLSCDWG TLLFSHAFLI MPESPTPLLG 100
RDILAKAGAI IHLNIGKGIP ICCPLLEEGI NPEVWAIEGQ YGQAKNARPV 150
QVKLKDSASF PYQRKYPLRP EALQGLKRLL RT 182 (2) Informace pro SEQ ID NO: 91:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 36 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 91:
AGATCTGCAG AATTCGATAT CACCCCCCCC CCCCCC
143 (2) Informace pro SEQ ID NO: 92:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 22 párů baží (B) Typ: nukleotidová (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 92:
AGATCTGCAG AATTCGATAT CA
Claims (46)
144
I? a t θ ra t o v θ n sl x? θ 3c y
1. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, ve kterém genom obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, jejich komplementárních sekvencí a jejich ekvivalentních sekvencí, zejména nukleotidové sekvence vykazující, pro jakýchkoliv 100 následujících sousedících monomerů, alespoň 50% a lépe alespoň 70% homologii s uvedenými sekvencemi SEQ ID NO: 46, SEQ ID.NO:
51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, v příslušném pořadí, a jejich komplementárními sekvencemi.
2. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, ve kterém region genomu obsahující env a pol geny a část gag genu, s vyloučením subregionů majícím sekvenci identickou nebo ekvivalentní SEQ ID NO: 1, kóduje jakýkoliv polypeptid vykazující, pro jakýchkoliv následujících alespoň 30 aminokyselin, alespoň 50% a lépe alespoň 70% homologii s peptidovou sekvencí kodovanou jakoukoliv nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:
51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, a jejich komplementárních sekvencí.
3. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, ve kterém pol gen obsahuje nukleotidovou sekvenci částečně nebo zcela identickou nebo ekvivalentní k SEQ ID NO: 88.
• · A • ·
4. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, ve kterém gag gen obsahuje nukleotidovou sekvenci částečně nebo zcela identickou nebo ekvivalentní k SEQ ID NO: 88.
5. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, asociovaný s roztroušenou sklerosou, ve kterém genom obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, jejich komplementárních sekvencí a jejich ekvivalentních sekvencí, zejména nukleotidové sekvence vykazující, pro jakýchkoliv 100 následujících sousedících monomerů, alespoň 50% a lépe alespoň 70% homologii s uvedenými sekvencemi SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, v příslušném pořadí, a jejich komplementárními sekvencemi.
6. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, asociovaný s roztroušenou sklerosou, ve kterém region genomu obsahující env a pol geny a část gag genu, s vyloučením subregionu majícího sekvenci identickou nebo ekvivalentní SEQ ID NO: 1, kóduje jakýkoliv polypeptid vykazující, pro jakýchkoliv následujících alespoň 30 aminokyselin, alespoň 50% a lépe alespoň 70% homologii s peptidovou sekvencí kodovanou jakoukoliv nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, a jejich komplementárních sekvencí.
7. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, • · asociovaný s roztroušenou sklerosou(ve kterém pol gen obsahuje nukleotidovou sekvenci částečně nebo zcela identickou nebo ekvivalentní k SEQ ID NO: 57, s vyloučením SEQ ID NO: 1.
8. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, asociovaný s roztroušenou sklerosou, ve kterém gag gen obsahuje nukleotidovou sekvenci částečně nebo zcela identickou nebo ekvivalentní k SEQ ID NO: 88.
9. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, asociovaný s revmatoidní artritidou, ve kterém genom obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, jejich komplementárních sekvencí a jejich ekvivalentních sekvencí, zejména nukleotidové sekvence vykazující, pro jakýchkoliv 100 následujících sousedících monomerů, alespoň 50% a lépe alespoň 70% homologii s uvedenými sekvencemi SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, v příslušném pořadí, a jejich komplementárními sekvencemi.
10. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, asociovaný s revmatoidní artritidou, ve kterém region genomu obsahující pol gen a část gag genu, s vyloučením subregionu majícího sekvenci identickou nebo ekvivalentní SEQ ID NO: 1, kóduje jakýkoliv polypeptid vykazující, pro jakýchkoliv následujících alespoň 30 aminokyselin, alespoň 50% a lépe alespoň 70% homologii s peptidovou sekvencí kodovanou jakoukoliv nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 89, a jejich komplementárních sekvencí.
• · • · · · • ·
147
11. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, asociovaný s revmatoidní artritidou, ve kterém pol gen obsahuje nukleotidovou sekvenci částečně nebo zcela identickou nebo ekvivalentní k SEQ ID NO: 57, s vyloučením SEQ ID NO: 1.
12. Virový materiál, v izolovaném nebo v purifikovaném stavu, asociovaný s revmatoidní artritidou, ve kterém gag gen obsahuje nukleotidovou sekvenci částečně nebo zcela identickou nebo ekvivalentní k SEQ ID NO: 88.
13. Nukleotidový fragment obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z:
a) všech genomových sekvencí, částečných nebo úplných, pol genu MSRV-l viru, kromě úplné sekvence nukleotidového fragmentu definovaného SEQ ID NO: 1;
b) všech genomových sekvencí, částečných nebo úplných, env genu MSRV-l;
c) všech částečných genomových sekvencí gag genu MSRV-l;
d) všech genomových sekvencí přesahujících pol gen a env gen MSRV-l viru a přesahujících pol gen a gag gen;
e) všech sekvencí, částečných nebo úplných, klonu vybraného ze skupiny obsahující klony FBd3 (SEQ ID NO: 46), t pol (SEQ ID NO: 51), JLBcl (SEQ ID NO: 52), JLBc2 (SEQ ID NO: 53), GM3 (SEQ ID NO: 56), FBdl3 (SEQ ID NO: 58), LB19 (SEQ ID NO: 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO: 60), FP6 (SEQ ID NO: 61), G+E+A (SEQ ID NO: 89), S vyloučením jakékoliv nukleotidové sekvence identické s nebo • ·
148 ležící v sekvenci definované SEQ ID NO: l;
f) sekvencí komplementárních k uvedeným genomovým sekvencím;
g) sekvencí ekvivalentních k uvedeným sekvencím (a) až (e), zejména nukleotidových sekvencí vykazujících, pro jakýchkoliv následujících 100 sousedících monomerů, alespoň 50% a lépe 70% homologii s uvedenými sekvencemi (a) až (e) , kde uvedený nukleotidový fragment neobsahuje ani se neskládá ze sekvence ERV-9.
14. Nukleotidový fragment obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z:
a) všech genomových sekvencí, částečných nebo úplných, pol genu MSRV-1 viru, kromě úplné sekvence nukleotidového fragmentu definovaného SEQ ID NO: 1;
b) všech částečných genomových sekvencí gag genu MSRV-1;
c) všech genomových sekvencí přesahujících pol gen a env gen MSRV-1 viru a přesahujících pol gen a gag gen;
d) všech sekvencí, částečných nebo úplných, klonu vybraného ze Skupiny obsahující klony t pol (SEQ ID NO: 51), GM3 (SEQ ID NO: 56), LB19 (SEQ ID NO: 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO: 60), FP6 (SEQ ID NO: 61), G+E+A (SEQ ID NO: 89), s vyloučením jakékoliv nukleotidové sekvence identické s nebo ležící v sekvenci definované SEQ ID NO: 1;
149
e) sekvencí komplementárních k uvedeným genomovým sekvencím;
sekvencí ekvivalentních k uvedeným sekvencím (a) až (e), zejména nukleotidových sekvencí vykazujících, pro jakýchkoliv následuj cích 100 sousedících monomerů, alespoň 50% a lépe 70% homologii s uvedenými sekvencemi (a) až (e) , kde uvedený nukleotidový fragment neobsahuje ani se neskládá ze sekvence ERV-9.
15. Fragment podle nároku 14 obsahující nukleotidovou sekvenci identickou k částečné nebo úplné sekvenci pol genu MSRV-1 viru, kromě úplné sekvence nukleotidového fragmentu definovaného SEQ ID NO: 1, nebo identickou k jakékoliv sekvenci ekvivalentní uvedené částečné nebo úplné genomové sekvenci, zejména k té, která je homologní k posledně uvedené.
16. Nukleotidový fragment podle nároku 15 obsahující kódující nukleotidovou sekvenci, která je částečně nebo plně identická s nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z:
- nukleotidové sekvence vybrané ze sekvencí SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62 a SEQ ID NO: 89;
- sekvencí komplementárních k SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62 nebo SEQ ID NO: 89;
- sekvencí ekvivalentních, a zejména homologních k SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 89;
sekvencí kódujících celou nebo část peptidové sekvence • · · ·
150 definované SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 63 nebo SEQ ID NO: 90;
- sekvencí kódujících celou nebo část peptidové sekvence ekvivalentní, zejména homologní, k SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 63 nebo SEQ ID NO: 90, která může být rozpoznána sérem pacienta infikovaného MSRV-1 virem, nebo u kterého byl MSRV-1 virus reaktivován.
17. Fragment podle nároku 13 obsahující nukleotidovou sekvenci identickou k částečné nebo úplné genomové sekvenci env genu MSRV-l viru, nebo identickou k jakékoliv sekvenci komplementární k uvedené nukleotidové sekvenci, nebo identickou k jakékoliv sekvenci ekvivalentní k uvedené nukleotidové sekvenci, zejména k té, která je homologní k posledně uvedené.
18. Fragment podle nároku 13 obsahující nukleotidovou sekvenci identickou k částečné nebo úplné sekvenci klonu vybraného ze skupiny obsahující klony FBd3 (SEQ ID NO: 46), t pol (SEQ ID NO: 51), JLBcl (SEQ ID NO: 52), JLBc2 (SEQ ID NO: 53), GM3 (SEQ ID NO: 56), FBdl3 (SEQ ID NO: 58), LB19 (SEQ ID NO: 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO: 60), FP6 (SEQ ID NO: 61), G+E+A (SEQ ID NO: 89), S vyloučením jakékoliv nukleotidové sekvence identické s nebo ležící v sekvenci definované SEQ ID NO: 1.
19. Fragment podle nároku 14 obsahující nukleotidovou sekvenci identickou k částečné nebo úplné sekvenci klonu vybraného ze skupiny obsahující klony t pol (SEQ ID NO: 51), GM3 (SEQ ID NO: 56), LB19 (SEQ ID NO: 59), LTRGAG12 (SEQ ID NO: 60), FP6 (SEQ ID NO: 61), G+E+A (SEQ ID NO: 89), s vyloučením jakékoliv nukleotidové sekvence identické s nebo ležící v sekvenci definované SEQ ID NO: 1.
• ·
151
20. Proba nukleové kyseliny pro detekci patogenních a/nebo infekčních agens asociovaných s roztroušenou sklerosou, která je schopna specifické hybridizace s jakýmkoliv fragmentem podle jakéhokoliv z nároků 13 až 19, náležícímu k nebo umístěnému v genomu uvedeného patogenního agens.
21. Proba nukleové kyseliny pro detekci patogenních a/nebo infekčních agens asociovaných s revmatoidní artritidou, která je schopna specifické hybridizace s jakýmkoliv fragmentem podle jakéhokoliv z nároků 14, 15, 16 a 19, náležícímu k nebo umístěnému v genomu uvedeného patogenního agens.
22. Primer pro amplifikaci polymerizací RNA nebo DNA virového materiálu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu podle jakéhokoliv z nároků 13 až 19, zejména nukleotidovou sekvenci vykazující, pro jakýchkoliv 10 sousedících monomerů, alespoň 70% homologii s alespoň uvedenou částí uvedeného fragmentu.
23. Primer podle nároku 22, jehož nukleotidové sekvence je identická k jakékoliv ze sekvencí vybraných ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 47 až SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55 a SEQ ID NO:
64 až SEQ ID NO: 86.
24. RNA nebo DNA, a zejména replikační vektor, obsahující genomový fragment virového materiálu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 12 nebo fragment podle jakéhokoliv z nároků 13 až 19.
25. Peptid kódovaný jakýmkoliv otevřeným čtecím rámečkem patřícím nukleotidovému fragmentu podle jakéhokoliv z nároků 13 ·· ··· ·
152 • ·· až 19, zejména polypeptid, například oligopeptid tvořící nebo obsahující antigenní determinanty rozpoznávané sérem pacienta infikovaného MSRV-1 virem, a/nebo u kterého byl MSRV-1 virus reaktivován.
26. Antigenní polypeptid podle nároku 25, kde otevřený čtecí rámeček, který ho kóduje, začíná, v 5' - 3' směru, v nukleotidu 181 a končí v nukleotidu 330 SEQ ID NO: 1.
27. Polypeptid, zejména antigenní oligopeptid nacházený v séru pacientů infikovaných MSRV-l virem, a/nebo u kterých byl MSRV-1 virus reaktivován, jehož peptidová sekvence je částečně nebo zcela identická nebo je ekvivalentní sekvenci definované SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 87.
28. Antigenní oligopeptid podle nároku 27, jehož peptidová sekvence je identická se sekvencí vybranou ze skupiny skládající se ze sekvencí SEQ ID NO: 41 až SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 63 a SEQ ID NO: 87.
29. Peptid kódovaný jakýmkoliv otevřeným čtecím rámečkem patřícím nukleotidovému fragmentu podle jakéhokoliv z nároků 14, 15, 16 a 19, zejména polypeptid, například oligopeptid tvořící nebo obsahující antigenní determinanty rozpoznávané sérem pacienta infikovaného MSRV-1 virem, a/nebo u kterého byl MSRV-1 virus reaktivován.
30. Antigenní polypeptid podle nároku 29, kde otevřený čtecí rámeček, který ho kóduje, začíná, v 5' - 3' směru, v nukleotidu 181 a končí v nukleotidu 330 SEQ ID NO: 1.
153 • ·
31. Polypeptid, zejména antigenní oligopeptid nacházený v séru pacientů infikovaných MSRV-l virem, aúnebo u kterých byl MSRV-l virus reaktivován, jehož peptidová sekvence je částečně nebo zcela identická nebo je ekvivalentní sekvenci definované SEQ ID NO: 39 nebo SEQ ID NO: 63.
32. Antigenní oligopeptid podle nároku 31, jehož peptidová sekvence je identická se sekvencí vybranou ze skupiny skládající se ze sekvencí SEQ ID NO: 41 až SEQ ID NO: 44 a SEQ ID NO: 63.
33. Mono- nebo polyklonální protilátka namířená proti MSRV-l viru, která je získána imunologickou reakcí lidského nebo zvířecího organismu s imunogenním agens skládajícím se z antigenního polypeptidu podle jakéhokoliv z nároků 25 až 28.
34. Mono- nebo polyklonální protilátka namířená proti MSRV-l viru, která je získána imunologickou reakcí lidského nebo zvířecího organismu s imunogenním agens skládajícím se z antigenního polypeptidu podle jakéhokoliv z nároků 29 až 32.
35. Reagens pro detekci MSRV-l viru, nebo pro detekci expozice uvedenému viru, které obsahuje, jako reaktivní složku, peptid, zejména antigenní peptid, podle jakéhokoliv z nároků 25 až 32, nebo anti-ligand, zejména protilátku k uvedenému peptidu.
36. Diagnostická, profylaktická nebo terapeutická kompozice obsahující peptid, zejména antigenní peptid, podle jakéhokoliv z nároků 25 až 28, nebo anti-ligand, zejména protilátku k uvedenému peptidu, podle nároku 33.
37. Diagnostická, profylaktická nebo terapeutická kompozice ·« ·« ····
154 obsahující peptid, zejména antigenní peptid, podle jakéhokoliv z nároků 29 až 32, nebo anti-ligand, zejména protilátku k uvedenému peptidu, podle nároku 34.
38. Aktivní imunoterapeutická kompozice, zejména vakcinová kompozice, podle nároků 36 nebo 37.
39. Diagnostická, profylaktická nebo terapeutická kompozice, zejména pro inhibici exprese alespoň jednoho patogenního a/nebo infekčního agens asociovaného s roztroušenou sklerosou, obsahující nukleotidový fragment podle jakéhokoliv z nároků 13 až 19 nebo polynukleotid, zejména oligonukleotid, jehož sekvence je částečně identická se sekvencí uvedeného fragmentu, s výjimkou toho, že fragment má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1.
40. Diagnostická, profylaktická nebo terapeutická kompozice, zejména pro inhibici exprese alespoň jednoho patogenního a/nebo infekčního agens asociovaného s revmatoidní artritidou, obsahující nukleotidový fragment podle jakéhokoliv z nároků 14, 15, 16 a 19 nebo polynukleotid, zejména oligonukleotid, jehož sekvence je částečně identická se sekvencí uvedeného fragmentu, s výjimkou toho, že fragment má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1.
41. Způsob pro detekci patologického a/nebo infekčního agens asociovaného s roztroušenou sklerosou v biologickém vzorku vyznačující se tím, že RNA a/nebo DNA, o které se předpokládá, že náleží k nebo pochází z uvedeného patologického a/nebo infekčního agens, nebo její komplementární RNa a/nebo DNA, je uvedena do kontaktu s kompozicí obsahující nukleotidový fragment podle jakéhokoliv z nároků 13 až 19 nebo • · · · · · • ·
155 ·· polynukleotid, zejména oligonukleotid, jehož sekvence je částečně identická se sekvencí uvedeného fragmentu s výjimkou toho, že fragment má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1.
42. Způsob pro detekci patologického a/nebo infekčního agens asociovaného s revmatoidní artritidou v biologickém vzorku vyznačující se tím, že RNA a/nebo DNA, o které se předpokládá, že náleží k nebo pochází z uvedeného patologického a/nebo infekčního agens, nebo její komplementární RNa a/nebo DNA, je uvedena do kontaktu s kompozicí obsahující nukleotidový fragment podle jakéhokoliv z nároků 14, 15, 16 a 19 nebo polynukleotid, zejména oligonukleotid, jehož sekvence je částečně identická se sekvencí uvedeného fragmentu s výjimkou toho, že fragment má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1.
43. Způsob pro detekci přítomnosti nebo expozice patologického a/nebo infekčního agens asociovaného s roztroušenou sklerosou v biologickém vzorku vyznačující se tím, že uvedený vzorek je uveden do kontaktu s peptidem, zejména s antigenním peptidem, podle jakéhokoliv z nároků 25 až 28, nebo anti-ligandem, zejména s protilátkou k uvedenému peptidu, podle nároku 33.
44. Způsob pro detekci přítomnosti nebo expozice patologického a/nebo infekčního agens asociovaného s revmatoidní artritidou v biologickém vzorku vyznačující se tím, že uvedený vzorek je uveden do kontaktu s peptidem, zejména s antigenním peptidem, podle jakéhokoliv z nároků 29 až 32, nebo anti-ligandem, zejména s protilátkou k uvedenému peptidu, podle nároku 34.
·· ····
156 ·· ·· • · · · • · ·· • · ·*· · · • · · · ·· ·♦
45. Prostředek pro detekci MSRV-1 viru obsahující reagens podle nároku 35, doplněné pevným nosičem, který je imunologicky kompatibilní s uvedeným reagens, který obsahuje prostředky pro uvedení biologického vzorku, jako je vzorek krve nebo mozkomíšního moku, který pravděpodobně obsahuje anti-MSRV-l protilátky, do kontaktu s uvedeným reagens za podmínek umožňujících možnou imunologickou reakci, a prostředky pro detekci imunitního komplexu tvořeného s uvedeným reagens.
46. Způsob pro detekci anti-MSRV-l protilátek v biologickém vzorku, jako je vzorek krve nebo mozkomíšního moku, vyznačující se tím, že uvedený vzorek a reagens podle nároku 35, skládající se z protilátky, jsou uvedeny do kontaktu za podmínek umožňujících možnou imunologickou reakci a potom je detekována přítomnost imunitních komplexů tvořených s uvedeným reagens.
WO 97/06260
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9509643A FR2737500B1 (fr) | 1995-08-03 | 1995-08-03 | Materiel viral et fragments nucleotidiques associes a la sclerose en plaques, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ135797A3 true CZ135797A3 (cs) | 1998-06-17 |
Family
ID=9481811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ971357A CZ135797A3 (cs) | 1995-08-03 | 1996-08-02 | Virový materiál a nukleotidové fragmenty asociované s roztroušenou sklerozou užitečné pro diagnostické, preventivní a terapeutické účely |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6001987A (cs) |
| EP (2) | EP1916304B1 (cs) |
| JP (2) | JP4444372B2 (cs) |
| AT (2) | ATE374252T1 (cs) |
| AU (1) | AU730080B2 (cs) |
| BG (1) | BG62977B1 (cs) |
| BR (1) | BR9606566A (cs) |
| CA (1) | CA2201282C (cs) |
| CZ (1) | CZ135797A3 (cs) |
| DE (1) | DE69637264T2 (cs) |
| ES (2) | ES2379011T3 (cs) |
| FR (1) | FR2737500B1 (cs) |
| HU (1) | HUP9900425A3 (cs) |
| IS (1) | IS4455A (cs) |
| NO (1) | NO971493L (cs) |
| NZ (1) | NZ316080A (cs) |
| PL (1) | PL319512A1 (cs) |
| SK (1) | SK56797A3 (cs) |
| WO (1) | WO1997006260A1 (cs) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2737500B1 (fr) * | 1995-08-03 | 1997-08-29 | Bio Merieux | Materiel viral et fragments nucleotidiques associes a la sclerose en plaques, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
| US7241876B2 (en) | 1996-01-11 | 2007-07-10 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer |
| US6759217B2 (en) * | 1996-03-26 | 2004-07-06 | Oncomedx, Inc. | Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
| US7785842B2 (en) * | 1996-03-26 | 2010-08-31 | Oncomedx, Inc. | Comparative analysis of extracellular RNA species |
| US8043835B1 (en) | 1996-03-26 | 2011-10-25 | Oncomedx, Inc. | Methods for detecting and monitoring cancer using extracellular RNA |
| US6329179B1 (en) * | 1996-03-26 | 2001-12-11 | Oncomedx, Inc. | Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
| CA2268069A1 (en) * | 1996-10-04 | 1998-04-09 | Chronix Biomedical | Diagnostic detection of nucleic acids |
| JP4226657B2 (ja) * | 1996-11-26 | 2009-02-18 | ベーイーオー メリュー | 診断、予防、及び治療のための、多発性硬化症に関連するウイルス性物質及びヌクレオチド断片 |
| US8440396B2 (en) * | 1997-03-14 | 2013-05-14 | Oncomedx, Inc. | Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
| US20070009934A1 (en) * | 1997-03-14 | 2007-01-11 | Kopreski Michael S | Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
| FR2762601B3 (fr) * | 1997-04-29 | 1999-06-04 | Bio Merieux | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utilisations |
| FR2762600B1 (fr) * | 1997-04-29 | 1999-11-05 | Bio Merieux | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utlisations |
| WO1999002696A1 (fr) * | 1997-07-07 | 1999-01-21 | Bio Merieux | Sequences retroviraux endogenes, associees a des maladies auto-immunes et/ou a des perturbations de la grossesse |
| FR2765588A1 (fr) | 1997-07-07 | 1999-01-08 | Bio Merieux | Materiel nucleique retroviral et fragments nucleotidiques notamment associes a la sclerose en plaques et/ou la polyarthrite rhumatoide, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
| US20040176314A1 (en) * | 1997-07-07 | 2004-09-09 | Bio Merieux | Endogenetic retroviral sequences, associated with autoimmune diseases or with pregnancy disorders |
| JP2002511277A (ja) * | 1998-04-08 | 2002-04-16 | エムエス・リサーチ・アクティーゼルスカブ | 多発性硬化症および他の脱髄性疾患の診断 |
| FR2780069B1 (fr) * | 1998-06-23 | 2002-06-28 | Inst Nat Sante Rech Med | Famille de sequences nucleiques et de sequences proteiques deduites presentant des motifs retroviraux endogenes humains et leurs applications |
| US20060204989A1 (en) * | 1998-09-22 | 2006-09-14 | Kopreski Michael S | Comparative analysis of extracellular RNA species |
| US20090233276A1 (en) * | 1998-09-22 | 2009-09-17 | Oncomedx, Inc. | Method Enabling the Use of Extracellular Ribonucleic Acid (RNA) Extracted from Plasma or Serum to Detect, Monitor or Evaluate Cancer or Premalignant Conditions |
| US8163524B2 (en) * | 1998-09-22 | 2012-04-24 | Oncomedx, Inc. | Comparative analysis of extracellular RNA species |
| FR2788784A1 (fr) * | 1999-01-21 | 2000-07-28 | Bio Merieux | Fragment nucleique endogene associe a une maladie auto-immune, procede de marquage et reactif |
| EP1029917A1 (en) | 1999-02-15 | 2000-08-23 | Bio Merieux | The LTR region of MSRV-1 and the proteins it encodes, and probes and methods for detecting MSRV-1 retrovirus |
| EP1204754A2 (en) * | 1999-08-20 | 2002-05-15 | Curagen Corporation | Polynucleotides expressed in activated t-lymphocytes and proteins encoded thereby |
| DE10012875B4 (de) * | 2000-03-16 | 2004-04-01 | Infineon Technologies Ag | Mobilfunkempfänger |
| WO2001070941A2 (en) * | 2000-03-21 | 2001-09-27 | Ms Research A/S | An infective endogenous retrovirus in association with demyelinating diseases e.g. multiple sclerosis |
| ATE502119T1 (de) * | 2001-07-25 | 2011-04-15 | Oncomedx Inc | Verfahren zur bewertung pathologischer krankheitszustände unter verwendung extrazellulärer rna |
| US20030104454A1 (en) * | 2001-11-05 | 2003-06-05 | Kopreski Michael S. | Method for detection of DNA methyltransferase RNA in plasma and serum |
| US20100159464A1 (en) * | 2001-11-05 | 2010-06-24 | Oncomedx, Inc. | Method for Detection of DNA Methyltransferase RNA in Plasma and Serum |
| US20090136942A1 (en) * | 2007-09-18 | 2009-05-28 | Oncomedx, Inc. | Analysis of Extracellular RNA |
| WO2010030931A1 (en) * | 2008-09-11 | 2010-03-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Oligonucleotides targeting human endogenous retrovirus 9 (erv-9) long terminal repeat (ltr) and methods of use |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ191327A (en) * | 1978-08-24 | 1981-07-13 | W B Martin | Pasteurellosis vaccine comprising antigenic material derived from the a1 and a2 serotypes of pasteurella haemolytica |
| US4311686A (en) * | 1979-04-30 | 1982-01-19 | The Immunology Development Corporation | Methodology for the immunodiagnosis of multiple sclerosis and/or malignant diseases from blood sample analysis |
| US4396600A (en) * | 1980-12-18 | 1983-08-02 | Gus Gallucci | Adult schistosome worm-derived antigenic substance and method of obtaining same |
| US4388298A (en) * | 1982-07-14 | 1983-06-14 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Propagation of hemorrhagic enteritis virus in a turkey cell line and vaccine produced |
| GB8324800D0 (en) * | 1983-09-15 | 1983-10-19 | Pasteur Institut | Antigens |
| US4520113A (en) * | 1984-04-23 | 1985-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions |
| US4647773A (en) * | 1984-04-23 | 1987-03-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of continuous production of retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS |
| NZ218050A (en) * | 1985-11-13 | 1989-05-29 | Wistar Inst | Test for the presence of htlv-1v |
| US4900553A (en) * | 1987-09-11 | 1990-02-13 | Case Western Reserve University | Method of reducing glial scar formation and promoting axon and blood vessel growth and/or regeneration through the use of activated immature astrocytes |
| EP0326395A2 (en) * | 1988-01-29 | 1989-08-02 | City Of Hope | Method of detecting and identifying certain viral sequences |
| FR2651581B1 (fr) * | 1989-09-06 | 1994-05-13 | Centre Nal Recherc Scientifique | Moyens pour le diagnostic de neuropathies demyelinisantes, en particulier de la sclerose en plaques. |
| US5219837A (en) * | 1990-06-21 | 1993-06-15 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of stimulating myelination of cells |
| US5158976A (en) * | 1990-10-29 | 1992-10-27 | The Children's Medical Center Corporation | Controlling glutamine/glutamate related neuronal injury |
| DE69233158T2 (de) * | 1991-03-07 | 2004-05-13 | Connaught Technology Corp., Greenville | Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe |
| DK173091D0 (da) * | 1991-10-11 | 1991-10-11 | Schleroseforeningen The Danish | Biologisk materiale |
| FR2689520B1 (fr) | 1992-04-03 | 1996-07-19 | Bio Merieux | Procede et milieu de culture pour l'obtention de cellules infectees par un virus associe a la sclerose en plaques. |
| FR2689521B1 (fr) * | 1992-04-03 | 1996-07-19 | Bio Merieux | Procede d'obtention et maintien d'une culture cellulaire viable, infectee par un virus associe a la sclerose en plaques, et produits biologiques derives de ladite culture. |
| DK0642585T3 (da) * | 1992-05-18 | 2006-05-15 | Genentech Inc | Aktiviering af oligomeriserende receptorer ved anvendelse af fusionerede receptorligander |
| GB9310657D0 (en) * | 1993-05-24 | 1993-07-07 | Univ London | Retrovirus |
| US5580766A (en) * | 1994-01-14 | 1996-12-03 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Retroviral vector particles for transducing non-proliferating cells |
| WO1995021256A1 (fr) | 1994-02-04 | 1995-08-10 | Bio Merieux | Virus msrv1 et agent pathogene et/ou infectant msrv2 associes a la sclerose en plaques, leurs constituants nucleiques et leurs applications |
| US5691147A (en) * | 1994-06-02 | 1997-11-25 | Mitotix, Inc. | CDK4 binding assay |
| US5710037A (en) * | 1994-06-10 | 1998-01-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Retroviral vector particles |
| FR2731356B1 (fr) * | 1995-03-09 | 1997-04-30 | Bio Merieux | Virus msrv-1 et agent pathogene et/ou infectant msrv-2 associes a la polyarthrite rhumatoide |
| FR2737500B1 (fr) * | 1995-08-03 | 1997-08-29 | Bio Merieux | Materiel viral et fragments nucleotidiques associes a la sclerose en plaques, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
-
1995
- 1995-08-03 FR FR9509643A patent/FR2737500B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-08-02 SK SK567-97A patent/SK56797A3/sk unknown
- 1996-08-02 AT AT96420265T patent/ATE374252T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-02 BR BR9606566A patent/BR9606566A/pt unknown
- 1996-08-02 PL PL96319512A patent/PL319512A1/xx unknown
- 1996-08-02 JP JP50817997A patent/JP4444372B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 AT AT07018564T patent/ATE541933T1/de active
- 1996-08-02 CA CA2201282A patent/CA2201282C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 ES ES07018564T patent/ES2379011T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 HU HU9900425A patent/HUP9900425A3/hu unknown
- 1996-08-02 CZ CZ971357A patent/CZ135797A3/cs unknown
- 1996-08-02 DE DE69637264T patent/DE69637264T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 WO PCT/FR1996/001244 patent/WO1997006260A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1996-08-02 AU AU68232/96A patent/AU730080B2/en not_active Ceased
- 1996-08-02 ES ES96420265T patent/ES2293645T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 EP EP07018564A patent/EP1916304B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 EP EP96420265A patent/EP0789077B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 US US08/691,563 patent/US6001987A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-03-25 BG BG101355A patent/BG62977B1/bg unknown
- 1997-03-26 IS IS4455A patent/IS4455A/is unknown
- 1997-03-27 NZ NZ316080A patent/NZ316080A/en unknown
- 1997-04-02 NO NO971493A patent/NO971493L/no not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-08-16 US US09/374,766 patent/US6579526B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-05-07 US US10/430,442 patent/US20030186391A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-08-08 US US11/463,109 patent/US7932350B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-11-20 JP JP2009265658A patent/JP5143814B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7932350B2 (en) | Viral material and nucleotide fragments associated with multiple sclerosis, for diagnostic, prophylactic and therapeutic purposes | |
| US7674888B2 (en) | Viral material and nucleotide fragments associated with multiple sclerosis, for diagnostic, prophylactic and therapeutic purposes | |
| US6184025B1 (en) | Viral isolates associated with multiple sclerosis | |
| CA2169603C (en) | Retrovirus from the hiv group and its use | |
| US6548635B1 (en) | Retrovirus from the HIV type O and its use (MVP-2901/94) | |
| JP2002515725A (ja) | カポジ肉腫および腹膜後繊維腫症に関連するガンマヘルペスウイルスのｄｎａポリメラーゼ | |
| JP4272264B2 (ja) | 診断予防及び治療的使用のための、特に多発性硬化症及び／又は慢性関節リウマチに関連した、レトロウイルス核材料及びヌクレオチドフラグメント | |
| US20040176314A1 (en) | Endogenetic retroviral sequences, associated with autoimmune diseases or with pregnancy disorders |