DE69637264T2

DE69637264T2 - Virales Material und Multiple-Sklerose assoziierte Nukleotidfragmente mit diagnostischen, prophylaktischen und therapeutischen Verwendungen

Info

Publication number: DE69637264T2
Application number: DE69637264T
Authority: DE
Inventors: Herve Perron; Glaucia Paranhos-Baccala; Frederic Beseme; Florence Komurian-Pradel; Frederic Bedin; Colette Jolivet-Reynaud; Bernard Mandrand
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1995-08-03
Filing date: 1996-08-02
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2016-08-03
Also published as: CZ135797A3; BG101355A; ES2379011T3; HUP9900425A2; DE69637264D1; AU730080B2; US20070117189A1; EP1916304A2; PL319512A1; US20030186391A1; ES2293645T3; SK56797A3; JP5143814B2; JP2010047604A; CA2201282A1; NO971493L; ATE374252T1; ATE541933T1; BR9606566A; US6001987A

Description

Bei der multiplen Sklerose (MS) handelt es sich um eine demyelinisierende Krankheit des Zentralnervensystems (ZNS), deren vollständige Ursache noch immer unbekannt ist.
In zahlreichen Arbeiten wurde die Hypothese einer viralen Ätiologie der Krankheit vorgebracht, es hat sich aber keines der bekannten Viren, die geprüft wurden, als das gesuchte verursachende Agens erwiesen: Eine Übersicht über die Viren, die im Lauf der Jahre bei MS untersucht wurden, wurde von E. Norrby (1) und R. T. Johnson (2) erstellt.
In jüngster Zeit wurde bei MS-Patienten ein Retrovirus, das sich von den bekannten menschlichen Retroviren unterscheidet, isoliert (3, 4 und 5). Die Autoren konnten auch zeigen, daß dieses Retrovirus in-vitro übertragen werden konnte, daß MS-Patienten Antikörper produzierten, die Proteine, die mit der Infektion von leptomeningealen Zellen mit diesem Retrovirus assoziiert sind, erkennen können, und daß die Expression dieses Retrovirus massiv durch die unmittelbar-frühen Gene von gewissen Herpesviren stimuliert werden kann (6).
Alle diese Ergebnisse sprechen dafür, daß mindestens ein unbekanntes Retrovirus oder ein Virus mit einer nach dem von H. Perron (3) publizierten Verfahren nachweisbaren reverse Transkriptase-Aktivität, die mit der Bezeichnung "Typ LM7-RT-Aktivität" bezeichnet wird, bei MS ein Rolle spielen. Der Inhalt der mit (3) bezeichneten Veröffentlichung wird durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.
Die Arbeiten der Anmelderin haben es in jüngster Zeit ermöglicht, mit einem Kulturverfahren wie in dem Dokument WO-A-93 20188 , deren Inhalt durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen wird, beschrieben zwei kontinuierliche Zelllinien, die mit na türlichen Isolaten von zwei verschiedenen MS-Patienten infiziert waren, zu erhalten. Diese zwei Linien, die von menschlichen Plexus-choroideus-Zellen stammten und LM7PC und PLI-2 genannt wurden, wurden am 22. Juli 1992 bzw. am 8. Januar 1993 unter den Nummern 92 072201 und 93 010817 in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der E.C.A.C.C. hinterlegt. Weiterhin wurden auch die Virusisolate mit LM7-Typ-RT-Aktivität bei der E.C.A.C.C. unter der allgemeinen Bezeichnung "Stämme" hinterlegt. Der "Stamm" bzw. das Isolat, das von der Linie PLI-2 geborgen wird und die Bezeichnung POL-2 trägt, wurde bei der E.C.A.C.C. am 22. Juli 1992 unter der Nr. V92072202 hinterlegt. Der "Stamm" bzw. das Isolat, das von der Linie LM7PC geborgen wird und die Bezeichnung MS7PG trägt, wurde bei der E.C.A.C.C. am 8. Januar 1993 unter der Nr. V93010816 hinterlegt.
Ausgehend von den oben genannten Kulturen und Isolaten, die aufgrund von biologischen und morphologischen Kriterien charakterisiert wurden, hat man sich anschließend bemüht, das mit den in diesen Kulturen produzierten Viruspartikeln assoziierte Nukleinsäurematerial zu charakterisieren.
Die bereits charakterisierten Teile des Genoms wurden für die Durchführung von molekularen Nachweistests des Virusgenoms und von immunserologischen Tests verwendet, wobei die von den Nukleotidsequenzen des Virusgenoms codierten Aminosäuresequenzen dazu verwendet wurden, um die gegen die mit der Infektion einhergehenden Epitope und/oder die Virusexpression gerichtete Immunreaktion nachzuweisen.
Mit diesen Mitteln konnte bereits ein Zusammenhang zwischen MS und der Expression von in den anderswo zitierten Patenten identifizierten Sequenzen bestätigt werden. Das von der Anmelderin entdeckte Virussystem weist jedoch Ähnlichkeit mit einem komplexen Retrovirussystem auf. Die gefundenen Sequenzen, die in den von den verschiedenen Zellkulturen von MS-Patienten produzierten extrazellulären Viruspartikeln verkapselt sind, zeigen deutlich, daß eine gemeinsame Verkapselung von Retrovirusgenomen, die verwandt sind, sich jedoch von dem "wilden" Retrovirusgenom, das die infizierenden Viruspartikel produziert, unterscheiden, stattfindet. Dieses Phänomen wurde bei replizierenden Retroviren und bei endogenen Retroviren, die zu der gleichen Familie gehören, ja so sogar heterolog sind, beobachtet. Der Begriff des endogenen Retrovirus ist im Zusammenhang mit unserer Entdeckung sehr wichtig, da man bei MSRV-1 beobachtet hat, daß endogene Retrovirussequenzen, die Sequenzen umfassen, welche zu dem MSRV-1-Genom homolog sind, in normaler menschlicher DNA existieren. Die Existenz von endogenen Retroviruselementen (ERV), die in bezug auf die Gesamtheit oder einen Teil ihres Genoms eine Ähnlichkeit mit MSRV-1 aufweisen, erklärt die Tatsache, daß die Expression des Retrovirus MSRV-1 in den menschlichen Zellen mit nahe verwandten endogenen Sequenzen eine Wechselwirkung eingehen könnten. Diese Wechselwirkungen findet man auch bei pathogenen und/oder infektiösen endogenen Retroviren (z. B. bei gewissen ökotropen Stämmen des Maus-Leukämievirus), bei exogenen Retroviren, deren Nukleotidsequenz teilweise oder ganz in Form von ERVs im Genom des Wirtstiers wiedergefunden werden kann (z. B. exogenes Virus des Mamma-Karzinoms der Maus, das durch die Milch übertragen wird) wieder. Diese Wechselwirkungen bestehen hauptsächlich aus (i) einer Transaktivierung oder Coaktivierung der ERVs durch das replizierende Retrovirus, (ii) einer "illegitimen" Verkapselung von RNA mit Ähnlichkeit zu ERVs, oder ERVs – nämlich Zell-RNA – die einfach kompatible Verkapselungsequenzen aufweisen, in Retroviruspartikeln, die durch die Expression des replizierenden Stamms erzeugt wurden, die manchmal übertragbar sind und manchmal eine wirkliche Pathogenität aufweisen, sowie (iii) mehr oder weniger stark ausgeprägte Rekombinationen zwischen den gemeinsam verkap selten Genomen, insbesondere während den Phasen der reversen Transkription, die zur Bildung von Hybridgenomen führen und die manchmal übertragbar sind und manchmal eine wirkliche Pathogenität aufweisen.
So (i) wurden unterschiedliche Sequenzen mit Ähnlichkeit zu MSRV-1 in den gereinigten Viruspartikeln wiedergefunden; (ii) muß die molekulare Analyse der unterschiedlichen Regionen des Genoms des Retrovirus MSRV-1 unter systematischer Analyse der mitverkapselten, störenden und/oder rekombinierten Sequenzen, die durch die Infektion und/oder Expression von MSRV-1 erzeugt wurden, durchgeführt werden; weiterhin können gewisse Klone defiziente Sequenzabschnitte aufweisen, die durch die Replikation des Retrovirus sowie die Matrizen- und/oder Transkriptionsfehler der reversen Transkriptase erzeugt wurden; (iii) sind die Sequenzfamilien mit Ähnlichkeit zu einer gleichen Genomregion des Retrovirus die Grundlagen eines diagnostischen Pauschalnachweises, der dadurch optimiert werden kann, daß man gleichbleibende Regionen zwischen den exprimierten Klonen identifiziert und Leseraster, die für die Produktion von Antigen-Polypeptiden und/oder Pathogenen, die nur von einem Teil, ja sogar einem einzigen, der exprimierten Klone unter diesen Bedingungen produziert werden können, verantwortlich sind, identifiziert, mit Hilfe der systematischen Analyse von Klonen, die in einer Region eines gegebenen Gens exprimiert werden, kann man die Variationshäufigkeit und/oder die Rekombinationshäufigkeit des MSRV-1-Genoms in dieser Region auswerten und die optimalen Sequenzen für die Anwendungen, insbesondere diagnostische Anwendungen, definieren; (iv) kann die von einem Retrovirus wie MSRV-1 hervorgerufene Pathologie eine direkte Auswirkung von seiner Expression und der Proteine oder Peptide, die dadurch produziert wurden, jedoch auch eine Auswirkung der Aktivierung, der Verkapselung, der Rekombination von ähnlichen oder heterologen Genomen und von Proteinen oder Peptiden, die dadurch produziert wurden, sein; so stel len diese mit der Expression von bzw. Infektion mit MSRV-1 assoziierten Genome einen integrierenden Teil der möglichen Pathogenität dieses Virus dar und sind daher Grundlagen für den diagnostischen Nachweis und bestimmte therapeutische Angriffspunkte. Ebenso kann jegliches Agens, das diese Wechselwirkungen, die für die entsprechende Pathogenie verantwortlich sind, assoziiert oder ein Cofaktor dafür ist, wie MSRV-2 oder der unter der Nr. FR-2 716 198 veröffentlichten Patentanmeldung beschriebene gliotoxische Faktor, an der Ausarbeitung einer hochwirksamen diagnostischen Pauschalstrategie, einer prognostischen Pauschalstrategie, einer der Behandlung folgenden und/oder in einer Therapie integrierten Pauschalstrategie, insbesondere von MS, jedoch auch von jeder anderen Krankheit, die mit den gleichen Agentien einhergeht, teilnehmen.
In diesem Zusammenhang hat man eine parallele Entdeckung bei einer anderen Autoimmunkrankheit, nämlich der rheumatoiden Polyarthritis (RP), gemacht, die in der unter der Nr. 95 02960 eingereichten französischen Patentanmeldung beschrieben ist. Diese Entdeckung zeigt, daß man dadurch, daß man ähnliche methodologische Ansätze wie diejenigen, die bei den Arbeiten der Anmelderin an MS verwendet wurden, angewandt hat, ein bei RP exprimiertes Retrovirus, das ebenfalls die bei MS für MSRV-1 beschriebenen Sequenzen aufweist, sowie das gleichzeitige Vorliegen einer assoziierten MSRV-2-Sequenz, die ebenso bei MS beschrieben wird, identifizieren kann. In bezug auf MSRV-1 betreffen die gemeinsam bei MS und bei RP nachgewiesenen Sequenzen die Gene pol und gag. Mit dem gegenwärtigen Wissensstand kann man die beschriebenen Sequenzen gag und pol mit den MSRV-1-Stämmen, die bei diesen beiden Krankheiten exprimiert werden, in Zusammenhang bringen.

Die vorliegende Patentanmeldung betrifft unterschiedliche Ergebnisse, die diejenigen, die bereits in den untenstehenden französischen Patentanmeldungen be schrieben sind, ergänzen:

-	Nr.	92	vom 03.04.1992,	Veröffent	Nr.	2 689 519;
		04322		lichungs
				nummer
-	Nr.	92	vom 03.11.1992,	Veröffent	Nr.	2 689 521;
		13447		lichungs
				nummer
-	Nr.	92	vom 03.11.1992,	Veröffent	Nr.	2 689 520;
		13443		lichungs
				nummer
-	Nr.	94	vom 04.02.1994,	Veröffent	Nr.	2 715 936;
		01529		lichungs
				nummer
-	Nr.	94	vom 04.02.1994,	Veröffent	Nr.	2 715 939;
		01531		lichungs
				nummer
-	Nr.	94	vom 04.02.1994,	Veröffent	Nr.	2 715 936;
		01530		lichungs
				nummer
-	Nr.	94	vom 04.02.1994,	Veröffent	Nr.	2 715 937;
		01532		lichungs
				nummer
-	Nr.	94	vom 24.11.1994,	Veröffent	Nr.	2 727 428;
		14322		lichungs
				nummer
sowie
-	Nr.	94	vom 23.12.1994,	Veröffent	Nr.	2 728 585;
		15810		lichungs
				nummer

Die vorliegende Erfindung betrifft in erster Linie verschiedene Nukleotidfragmente, umfassend, oder bestehend aus, einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) den Sequenzen der Klone FBd3 (SEQ ID Nr. 46), t pol (SEQ ID Nr. 51), JLBc1 (SEQ ID Nr. 52), JLBc2 (SEQ ID Nr. 53), GM3 (SEQ ID Nr. 56),
(b) die zu diesen genomischen Sequenzen komplementären Sequenzen.

Zu den genomischen Sequenzen zählt man alle durch Coenkapsidation oder durch Coexpression assoziierten Sequenzen, oder rekombinierte Sequenzen.
Die Erfindung betrifft auch jegliche Nukleinsäuresonde für den Nachweis eines pathogenen und/oder infektiösen Agens, das mit MS assoziiert ist, wobei diese Sonde spezifisch an jegliches Fragment wie zuvor definiert, das zu dem Genom dieses pathogenen Agens gehört oder darin vorliegt, hybridisieren kann.
Insbesondere stammt die Nukleotidsequenz einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonde aus der Reihe der Sequenzen von 100 aufeinanderfolgenden Monomeren eines Fragments aus der Reihe der Fragmente, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 51, SEQ ID Nr. 52, SEQ ID Nr. 53, aus der Reihe der Sequenzen von 30 oder 100 aufeinanderfolgenden Monomeren des Fragments, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID Nr. 56 angegeben ist; sowie den zu diesen Sequenzen komplementären Nukleotidsequenzen.
Außerdem betrifft die Erfindung einen Primer für die Amplifikation mittels Polymerisation einer RNA oder einer DNA eines Virusmaterials, umfassend eine Nukleotidsequenz, die mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz eines beliebigen Fragments wie oben definiert identisch ist, insbesondere eine Nukleotidsequenz aus einer Sequenz von 30 aufeinanderfolgenden Monomeren der SEQ ID Nr. 56 und der zu dieser Sequenz komplementären Sequenz. Vorzugsweise ist die Primer-Sequenz mit der SEQ ID Nr. 49 identisch.
Allgemein ausgedrückt umfaßt die Erfindung jede beliebige RNA oder DNA, insbesondere jeglichen Replikationsvektor, umfassend ein wie oben definiertes Nukleotidfragment.
Die Erfindung bezieht sich auch auf verschiedene Peptide, die von jeglichem offenen Leseraster codiert werden, das zu einem Nukleotidfragment wie oben definiert gehört, insbesondere auf jegliches Polypeptid, zum Beispiel jegliches Oligopeptid, das eine antigene Determinante, die von Seren von mit MSRV-1-Virus infizierten Patienten und/oder von Patienten, bei denen das MSRV-1-Virus reaktiviert worden ist, erkannt wird, bildet oder enthält. Vorzugsweise ist dieses Polypeptid antigen, und wird von dem offenen Leseraster, das in 5'-3'-Richtung beim Nukleotid 181 beginnt und beim Nukleotid 330 von SEQ ID Nr. 1 aufhört, codiert.
Insbesondere weist ein antigenes Polypeptid, das von Seren von mit MSRV-1-Virus infizierten Patienten und/oder von Patienten, bei denen das MSRV-1-Virus reaktiviert worden ist, erkannt wird, eine Peptidsequenz auf, die mit der Sequenz, die von SEQ ID Nr. 39, SEQ ID Nr. 63 und SEQ ID Nr. 87 teilweise oder vollständig identisch ist oder dieser Sequenz äquivalent ist; solch eine Sequenz ist zum Beispiel mit der gesamten Sequenz ausgewählt aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID Nr. 41 bis SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 63 und SEQ ID Nr. 87 beinhaltet, identisch.
So werden in der vorliegenden Erfindung auch mono- oder polyklonale Antikörper gegen das MSRV-1-Virus vorgestellt, die durch immunologische Reaktion eines menschlichen oder tierischen Organismus auf ein immunogenes Agens erhalten werden, das aus einem antigenen Polypeptid wie zuvor definiert besteht.
Anschließend befaßt sich die Erfindung mit:

– Nachweisreagentien für das MSRV-1-Virus oder für Kontakt mit diesem Virus, enthaltend als Reagenswirkstoff ein Polypeptid, insbesondere ein antigenes Polypeptid, wie oben definiert, oder einen Antikörper gegen dieses Peptid;
– alle diagnostischen, prophylaktischen oder therapeutischen Zusammensetzungen, enthaltend ein oder mehrere Peptide, insbesondere antigene Peptide, wie oben definiert, oder einen oder mehrere Antikörper gegen Peptide, die zuvor betrachtet wurden; solch eine Zusammensetzung ist vorzugsweise und beispielsweise eine Impfstoffzusammensetzung.

Die Erfindung befaßt sich weiterhin mit jeglicher diagnostischen, prophylaktischen oder therapeutischen Zusammensetzung, insbesondere zum Hemmen der Expression mindestens eines pathogenen und/oder infektiösen Agens, das mit MS assoziiert ist, die ein Nukleotidfragment wie oben definiert enthält.
Erfindungsgemäß können die genannten Fragmente oder Polynukleotide, insbesondere Oligonukleotide, Bestandteil von allen entsprechenden Zusammensetzungen für den Nachweis mittels jeglichen geeigneten Verfahrens bzw. jeder geeigneter Methode eines pathologischen und/oder infektiösen Agens, das mit MS bzw. RP assoziiert ist, in einer biologischen Probe sein. Bei solch einem Verfahren bringt man eine RNA und/oder eine DNA, von der angenommen wird, daß sie zu diesem pathologischen und/oder infektiösen Agens gehört oder von diesem stammt und/oder ihre komplementäre RNA und/oder DNA mit dieser Zusammensetzung in Kontakt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von oder des Kontakts mit einem pathologischen und/oder infektiösen Agens in einer biologischen Probe, indem man diese Probe mit einem Peptid, insbesondere einem antigenen Peptid wie oben definiert in Kontakt bringt, insbesondere einen Antikörper eines Peptids, wie oben definiert.
In der Praxis umfaßt beispielsweise ein Nachweismittel des MSRV-1-Virus ein Reaktionsmittel wie oben definiert, getragen auf einem festen Träger, der immunolo gisch mit dem Reagens kompatibel ist, und ein Mittel zum in-Kontakt-bringen der biologischen Probe, zum Beispiel einer Blut- oder Gehirnliquorprobe, bei der die Möglichkeit besteht, daß sie anti-MSRV-1-Antikörper enthält, unter Bedingungen, die eine gegebenenfalls stattfindende immunologische Reaktion ermöglichen, mit dem Reagens in Kontakt, was alles mit Nachweismitteln des mit dem Reagens gebildeten Immunkomplexes erfolgt.
Abschließend betrifft die Erfindung auch den Nachweis von anti-MSRV-1-Antikörpern in einer biologischen Probe, zum Beispiel in einer Blut- oder Hirnliquorprobe, wobei man diese Probe mit einem Reagens wie oben definiert, bestehend aus einem Antikörper, in Kontakt bringt, und zwar unter Bedingungen, die eine mögliche Immunreaktion ermöglichen, und man anschließend das Vorliegen eines mit dem Reagens gebildeten Immunkomplexes nachweist.
Die Erfindung betrifft auch die folgenden Verwendungen:
Verwendung einer Nukleinsäuresonde zum in-vitro-Nachweisen eines pathogenen und/oder infektiösen Agens, das mit Multipler Sklerose assoziiert ist, wobei die Sonde 10 bis 100 aufeinanderfolgende Monomere eines Fragments wie oben definiert enthält.
Verwendung eines Primers für die Amplifikation durch Polymerisation einer RNA oder einer DNA eines Virusmaterials, das mit Multipler Sklerose assoziiert ist, wobei der Primer eine Nukleotidsequenz von 10 bis 30 aufeinanderfolgenden Monomeren, die mit der Nukleotidsequenz eines Fragments wie oben definiert identisch ist, enthält.
Bevor die Erfindung genauer dargelegt wird, werden nun verschiedene Begriffe, die in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet werden, definiert:

– Unter "Stamm" oder "Isolat" versteht man jegliche infizierende und/oder pathogene biologische Fraktion, die zum Beispiel Viren und/oder Bakterien und/oder Parasiten enthält und die ein pathogenes und/oder antigenes Potential erzeugt, das von einer Kultur oder einem lebenden Wirt geborgen wird; so kann zum Beispiel ein wie oben definierter Virusstamm ein mitinfizierendes Agens, zum Beispiel einen pathogenen Protisten, enthalten;
– der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "MSRV" bezeichnet jegliches pathogene und/oder infizierende Agens, das mit MS assoziiert ist, insbesondere eine Virusart, die attenuierten Stämme dieser Virusart, oder die defizienten Partikel, die interferieren oder miteingekapselte Genome oder auch Genome, die mit einem Teil des MSRV-1-Genoms rekombiniert haben, die sich von dieser Art ableiten, umfassen. Es ist bekannt, daß Viren, insbesondere Viren, die RNA enthalten, im Anschluß insbesondere an relativ hohe spontane Mutationsraten (7), eine Variabilität aufweisen, was im folgenden für die Definition des Begriffs der Äquivalenz in Betracht gezogen werden wird;
– unter menschlichem Virus versteht man ein Virus, das den Menschen infizieren bzw. vom Menschen geborgen werden kann;
– man muß sich über all die natürlichen oder induzierten Variationen und/oder Rekombinationen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung gefunden werden können, im Klaren sein.
– Die Variante eines erfindungsgemäßen Virus oder pathogenen und/oder infektiösen Agens umfaßt mindestens ein Antigen, das von mindestens einem Antikörper erkannt wird, der gegen mindestens ein Antigen, das diesem Virus und/oder diesem pathogenen und/oder infektiösen Agens entspricht, und/oder gegen ein Genom gerichtet ist, wobei jeglicher Teil davon von mindestens einer Mybridisierungssonde nachgewiesen wird, und/oder mindestens einen Nukleotid-Amplifikationsprimer, der für die ses Virus und/oder pathogene und/oder infektiöse Agens spezifisch ist und die zum Beispiel bei dem Virus mit der Bezeichnung MSRV-1 eine Nukleotidsequenz aus der Reihe SEQ ID Nr. 20 bis SEQ ID Nr. 24, SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 16 bis SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 31 bis SEQ ID Nr. 33, SEQ ID Nr. 45, SEQ ID Nr. 47, SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 49, SEQ ID Nr. 50, SEQ ID Nr. 45 und ihren komplementären Sequenzen aufweisen, unter bestimmten Hybridisierungsbedingungen, die dem Fachmann gut bekannt sind;
– erfindungsgemäß ist ein Nukleotidfragment oder ein Oligonukleotid oder ein Polynukleotid eine Aneinanderreihung von Monomeren, oder ein Biopolymer, die bzw. das durch die informationstragende Sequenz der natürlichen Nukleinsäuren charakterisiert ist und fähig ist, mit einem beliebigen anderen Nukleotidfragment unter vorbestimmten Bedingungen zu hybridisieren, wobei die Aneinanderreihung Monomere mit unterschiedlichen chemischen Strukturen enthalten kann und ausgehend von einem natürlichen Nukleinsäuremolekül und/oder durch genetische Rekombination und/oder durch chemische Synthese erhalten werden kann; ein Nukleotidfragment kann mit einem Genomfragment des MSRV-1-Virus, mit dem sich die vorliegende Erfindung befaßt, insbesondere einem Gen des letztgenannten, bei diesem Virus zum Beispiel pol oder env, identisch sein;
– so kann ein Monomer ein natürliches Nukleinsäurenukleotid sein, dessen Bausteine ein Zucker, eine Phosphatgruppe und eine Stickstoffbase sind; bei der RNA handelt es sich bei dem Zucker um Ribose, bei der DNA handelt es sich bei dem Zucker um Desoxy-2-ribose; je nachdem, ob es sich um DNA oder RNA handelt, stammt die Stickstoffbase aus der Gruppe Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin, Thymin; das Nukleotid kann jedoch auch in mindestens einem der drei Bausteine modifiziert sein; so kann die Modifikation zum Beispiel bei den Basenansätzen erfolgen, wodurch modifizierte Basen wie Inosin, Methyl-5-desoxycytidin, Desoxyuridin, Dimethylamino-5-desoxyuridin, Diamino-2,6-purin, Brom-5-desoxyuridin und jegliche sonstige modifizierte Basen, die die Hybridisierung begünstigen, geschaffen werden; beim Zucker kann die Modifikation darin bestehen, daß man mindestens eine Desoxyribose durch ein Polyamid (8) ersetzt, und bei der Phosphatgruppe kann die Modifikation darin bestehen, daß man sie durch Ester, insbesondere Ester aus der Gruppe Diphosphatester, Alkyl- und Arylphosphonat sowie Phosphorthioat, ersetzt;
– unter "informationstragende Sequenz" versteht man jegliche geordnete Anreihung von Monomeren, deren chemische Natur und Ordnung in einer Bezugsrichtung gegebenenfalls eine funktionsfähige Information von der gleichen Qualität wie die der natürlichen Nukleinsäuren darstellt;
– unter Hybridisierung versteht man den Vorgang, bei dem unter entsprechenden Arbeitsbedingungen zwei Nukleotidfragmente mit ausreichend komplementären Sequenzen zu einer komplexen Struktur, insbesondere einer Doppel- oder Dreifachstruktur, vorzugsweise in Form einer Helix, paaren;
– eine Sonde umfaßt ein chemisch synthetisiertes oder mittels Verdauung oder enzymatischer Restriktion eines längeren Nukleotidfragments erhaltenes Nukleotidfragment, das mindestens sechs Monomere, vorteilhafterweise 10 bis 100 Monomere, vorzugsweise 10 bis 30 Monomere umfaßt und eine Hybridisierungsspezifität unter bestimmten Bedingungen aufweist; vorzugsweise wird eine Sonde, die weniger als 10 Monomere besitzt, nicht allein verwendet, sondern in Gegenwart von anderen Sonden, die genauso kurz sind oder nicht; unter gewissen spezifischen Bedingungen kann es nützlich sein, Sonden mit einer Größe von über 100 Monomeren zu verwenden; eine Sonde kann insbesondere für diagnos tische Zwecke verwendet werden, wobei es sich zum Beispiel um Fang- und/oder Nachweissonden handeln wird;
– die Fangsonde kann auf jede beliebige Art und Weise, also direkt oder indirekt, zum Beispiel kovalent oder durch passive Adsorption, auf einem festen Träger immobilisiert sein;
– die Nachweissonde kann mit einem Marker, insbesondere aus der Gruppe der radioaktiven Isotope, mit Enzymen, insbesondere aus der Gruppe Peroxydase und alkalische Phosphatase und denjenigen, die ein chromogenes, fluorigenes oder lumineszierendes Substrat zu hydrolysieren vermögen, mit chemischen chromophoren Verbindungen, mit chromogenen, fluorigenen oder lumineszierenden Verbindungen, mit Nukleotidbasenanalogen und mit Biotin markiert sein;
– die Sonden, die erfindungsgemäß für diagnostische Zwecke verwendet werden können, können bei allen bekannten Hybridisierungstechniken verwendet werden, insbesondere bei den Techniken, die unter den Bezeichnungen "DOT-BLOT" (9), "SOUTHERN-BLOT" (10), "NORTHERN-BLOT", wobei es sich um eine Technik handelt, die mit der "SOUTHERN-BLOT"-Technik identisch ist, bei der jedoch RNA als Angriffspunkt verwendet wird, die SANDWICH-Technik (11) bekannt sind; vorteilhafterweise verwendet man bei der vorliegenden Erfindung die SANDWICH-Technik, die eine spezifische Fangsonde und/oder spezifische Nachweissonde umfaßt, wobei gilt, daß die Fangsonde und die Nachweissonde eine zumindest teilweise unterschiedliche Nukleotidsequenz aufweisen müssen,
– jede erfindungsgemäße Sonde kann in vivo oder in vitro mit RNA und/oder DNA hybridisieren, um Replikationserscheinungen, insbesondere Translation und/oder Transkription, zu blockieren und/oder um diese DNA und/oder RNA abzubauen,
– ein Primer ist eine Sonde, die mindestens sechs Monomere, vorteilhafterweise 10 bis 30 Monomere, umfaßt, die eine Hybridisierungsspezifität unter bestimmten Bedingungen aufweisen, mit dem Zweck, eine enzymatische Polymerisation zu initiieren, zum Beispiel bei einer Amplifikationstechnik wie der PCR (Polymerase Chain Reaction), bei einem Elongationsvorgang wie der Sequenzierung, bei einer reversen Transkriptionsmethode oder ähnlichem,
– zwei Nukleotid- oder Peptidsequenzen werden als äquivalent oder voneinander abstammend oder von einer Referenzsequenz abstammend bezeichnet, wenn die entsprechenden Biopolymere ohne identisch zu sein bei der jeweiligen Anwendung oder Verwendung oder bei der Technik, an der sie beteiligt sind, im wesentlichen die gleiche Rolle spielen können; Sequenzen, die insbesondere äquivalent sind, sind zwei Sequenzen, die aufgrund der natürlichen Variabilität erhalten wurden, insbesondere aufgrund der spontanen Mutation der Art, aus der sie identifiziert worden sind, oder aufgrund induzierter Mutation, sowie zwei homologe Sequenzen, wobei Homologie im folgenden definiert wird,
– unter "Variabilität" versteht man jegliche spontane oder induzierte Modifikation einer Sequenz, insbesondere durch Substitution und/oder Insertion und/oder Deletion von Nukleotiden und/oder Nukleotidfragmenten, und/oder Verlängerung und/oder Verkürzung der Sequenz an mindestens einem Ende; eine unnatürliche Variabilität kann das Ergebnis der verwendeten Gentechnikmethoden sein, zum Beispiel das Ergebnis der Auswahl von degenerierten oder nicht degenerierten synthetischen Primern, die für die Amplifikation einer Nukleinsäure gewählt wurden; diese Variabilität kann sich in Modifikationen in einer beliebigen Ausgangssequenz, die als Referenz aufgefaßt wird, äußern und kann durch einen Homologiegrad in bezug auf diese Referenzsequenz ausgedrückt werden,
– die Homologie charakterisiert den Grad der Identi tät von zwei Nukleotid- oder Peptidfragmenten, die verglichen werden; sie wird mit dem Prozentsatz der Identität, die insbesondere durch direkten Vergleich von Nukleotid- oder Peptidsequenzen in bezug auf Referenznukleotid- oder -peptidsequenzen bestimmt wird, gemessen,
– dieser Prozentsatz der Identität wurde spezifisch für die Nukleotidfragmente bestimmt, insbesondere für Klone, die für die vorliegende Erfindung von Bedeutung sind, für Homologe zu den für das MSRV-1-Virus durch die SEQ ID Nr. 1 bis NR. 9, SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 51 bis SEQ ID Nr. 53, SEQ ID Nr. 40, SEQ ID Nr. 56 und SEQ ID Nr. 57 identifizierten Fragmente sowie für die Sonden, die zu den Sonden homologen Primer und die Primer, die durch SEQ ID Nr. 20 bis SEQ ID Nr. 24, SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 16 bis SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 31 bis SEQ ID Nr. 33, SEQ ID Nr. 45, SEQ ID Nr. 47, SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 49, SEQ ID Nr. 50, SEQ ID Nr. 55, SEQ ID Nr. 40, SEQ ID Nr. 56 und SEQ ID Nr. 57 homologen Primer; beispielsweise beträgt der niedrigste Prozentsatz der Identität, der zwischen den unterschiedlichen allgemeinen Konsensus-Nukleinsäuren, die gemäß einem weiter unten ausgeführten Protokoll ausgehend von MSRV-1-Virus-RNA-Fragmenten der Linien LM7PC und PLI-2 erhalten wurden, beobachtet wurde, 67% in der in Abbildung 1 beschriebenen Region,
– ein Nukleotidfragment wird als einem Referenzfragment äquivalent bzw. von einem Referenzfragment abgeleitet bezeichnet, wenn es eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu der Referenzfragmentsequenz äquivalent ist; gemäß der obigen Definition sind die folgenden insbesondere äquivalent zu einem Referenznukleotidfragment: (a) ein Fragment, das zumindest teilweise mit der Komplementärsequenz des Referenzfragments hybridisieren kann, (b) ein Fragment, dessen Alignment mit dem Refe renzfragment zum Nachweis von mehr identischen aufeinanderfolgenden Basen führt als mit einem beliebigen anderen Fragment, das von einer anderen taxonomischen Gruppe stammt, (c) ein Fragment, das das Ergebnis der natürlichen Variabilität der Art, von der es stammt, ist oder sein kann, (d) ein Fragment, das das Ergebnis von auf das Referenzfragment angewandte Gentechnikmethoden sein kann, (e) ein Fragment, das mindestens acht aufeinanderfolgende Nukleotide enthält und das für ein Peptid codiert, das mit dem von dem Referenzfragment codierten Peptid homolog oder dazu identisch ist, (f) ein Fragment, das sich von dem Referenzfragment durch Insertion, Deletion, Substitution von mindestens einem Monomer, Verlängerung oder Verkürzung an mindestens einem seiner Enden unterscheidet; zum Beispiel ein Fragment, das dem Referenzfragment, das an mindestens einem seiner Enden von einer Nukleotidsequenz, die nicht für ein Polypeptid codiert, flankiert ist, entspricht,
– unter Polypeptid versteht man insbesondere ein beliebiges Peptid aus mindestens zwei Aminosäuren, insbesondere ein Oligopeptid oder Protein, das durch menschliche Manipulation extrahiert, abgetrennt oder im wesentlichen isoliert oder synthetisiert wird, insbesondere diejenigen, die durch chemische Synthese oder durch Expression in einem rekombinanten Organismus erhalten werden,
– unter "Polypeptid, das teilweise von einem Nukleotidfragment codiert wird" versteht man ein Polypeptid, das mindestens drei Aminosäuren aufweist, die von mindestens neun aufeinanderfolgenden Monomeren, die in diesem Nukleotidfragment enthalten sind, codiert werden,
– eine Aminosäure wird als analog zu einer anderen Aminosäure bezeichnet, wenn ihre jeweiligen chemisch-physikalischen Eigenschaften wie Polarität, Hydrophobität und/oder Alkalität und/oder Azidität und/oder Neutralität im wesentlichen gleich sind; so ist ein Leucin zu einem Isoleucin analog,
– ein Polypeptid wird als äquivalent zu einem Referenzpolypeptid bzw. davon abgeleitet bezeichnet, wenn die Polypeptide, die verglichen werden, im wesentlichen die gleichen Eigenschaften, insbesondere die gleichen antigenen Eigenschaften, immunologischen Eigenschaften, enzymologischen Eigenschaften und/oder Eigenschaften der molekularen Erkennung, aufweisen; die folgenden sind insbesondere zu einem Referenzpolypeptid äquivalent: (a) ein Polypeptid, das eine Sequenz aufweist, bei der mindestens eine Aminosäure durch eine analoge Aminosäure substituiert worden ist, (b) ein Polypeptid mit einer äquivalenten Peptidsequenz, das durch natürliche oder induzierte Variation dieses Referenzpolypeptids und/oder des Nukleotidfragments, das für dieses Polypeptid codiert, erhalten wird, (c) ein Mimotop dieses Referenzpolypeptids, (d) ein Polypeptid, in dessen Sequenz eine oder mehrere Aminosäuren der Reihe L durch eine Aminosäure der Reihe D ersetzt sind und umgekehrt, (e) ein Polypeptid, in dessen Sequenz eine Modifikation der Seitenketten der Aminosäuren eingeführt worden ist, wie zum Beispiel eine Acetylierung der Aminofunktion, eine Carboxylierung der Thiolfunktionen, eine Veresterung der Carbonsäurefunktionen, (f) ein Polypeptid, in dessen Sequenz eine oder mehrere Peptidbindungen modifiziert worden sind, wie zum Beispiel Carba-Bindungen, Retro-Bindungen, Reverso-Bindungen, Retro-Reverso-Bindungen, reduzierte Bindungen sowie Methylenoxy-Bindungen, (g) ein Polypeptid, bei dem mindestens ein Antigen von Antikörpern, die gegen ein Referenzpolypeptid gerichtet sind, erkannt wird, der Prozentsatz der Identität, der die Homologie von zwei Peptidfragmenten, die verglichen werden, charakterisiert, beträgt erfindungsgemäß mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70%.

In Anbetracht dessen, daß ein Virus mit der enzymatischen Aktivität einer reversen Transkriptase genetisch sowohl in RNA-Form als auch in DNA-Form charakterisiert werden kann, wird sowohl auf virale DNA als auch auf virale RNA für die Charakterisierung der Sequenzen, die sich auf ein Virus beziehen, das eine solche reverse Transkriptase-Aktivität aufweist, erfindungsgemäß MSRV-1 genannt, Bezug genommen werden.
Die in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen verwendeten Ordnungsbezeichnungen wie "erste Nukleotidsequenz" werden nicht gewählt, um eine bestimmte Ordnung zu bezeichnen, sondern um die Erfindung deutlicher zu definieren.
Unter Nachweis einer Substanz oder eines Agens versteht man im folgenden Text nicht nur eine Identifikation, sondern auch eine quantitative Bestimmung oder eine Abtrennung oder Isolation von dieser Substanz oder diesem Agens.
Die Erfindung wird beim Durchlesen der folgenden detaillierten Beschreibung, die auf die beigelegten Abbildungen Bezug nimmt, besser verstanden werden, wobei die Abbildungen folgendes darstellen:
1 zeigt allgemeine Nukleinsäurekonsensussequenzen von MSRV-1B-Klonen, die mittels PCR-Technik in der von Shih (12) definierten „pol"-Region ausgehend von Virus-DNA der Linien LM7PC und PLI-2 amplifiziert wurden und die mit den Be zeichnungen SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 identifiziert sind sowie die gemeinsame Konsensussequenz mit Amplifikations-Primern mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 7,
2 zeigt die Definition eines funktionellen Leserasters für jede Familie des MSRV-1B/"PCR pol"-Typs, wobei diese Familien A bis D durch die Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 bzw. SEQ ID Nr. 6, die in 1 beschrieben sind, definiert sind,
3 zeigt ein Beispiel für Konsensus-Sequenzen von MSRV-2B, das die Bezeichnung SEQ ID Nr. 11 trägt,
4 ist eine Darstellung der reversen Transkriptase-Aktivität (RT-Aktivität) in dpm (Desintegrationen pro Minute) in Saccharosefraktionen von einem Aufreinigungsgradienten von Virionen, die von in Kultur gezüchteten B-Lymphozyten eines MS-Patienten produziert wurden,
5 zeigt die quantitative Bestimmung der reversen Transkriptase-Aktivität in der Kultur einer von einer MS-freien Kontrolle stammenden B-Lymphozyten-Linie unter den selben Versuchsbedingungen wie für 4,
6 zeigt die Nukleotidsequenz des Klons PSJ17 (SEQ ID Nr. 9),
7 zeigt die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 des Klons mit der Bezeichnung M003-P004,
8 zeigt die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 des Klons F11-1; der Teil zwischen den zwei Pfeilen in der Primer-Region entspricht einer Variabilität, die durch die Auswahl des Primers für die Klonierung von F11-1 bedingt ist; in der selben Abbildung ist die Translation in Aminosäuren dargestellt;
9 zeigt die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 sowie ein funktionelles Leseraster in den Aminosäuren von SEQ ID Nr. 1; in dieser Sequenz sind die Konsensus-Sequenzen des pol-Gens unter strichen,
die 10 und 11 zeigen die Ergebnisse einer PCR von mit Primern mit den Bezeichnungen SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 18 und SEQ ID Nr. 19 erhaltenen Identifikationsprodukten in Form einer Photographie eines mit Ethidiumbromid imprägnierten Agarosegels unter UV-Licht;
12 zeigt eine Matrixdarstellung der Homologie zwischen SEQ ID Nr. 1 des MSRV-1 und derjenigen eines endogenen Retrovirus mit der Bezeichnung HSERV9; diese Homologie von mindestens 65% wird durch einen einfachen Strich dargestellt, das Fehlen eines Strichs bedeutet eine Homologie von weniger als 65%;
13 zeigt die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 46 des Klons FBd3,
14 zeigt die Sequenzhomologie zwischen dem Klon FBd3 und dem Retrovirus HSERV-9;
15 zeigt die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 51 des Klons t pol;
16 und 17 zeigen die Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 52 bzw. SEQ ID Nr. 53 der Klone JLBc1 bzw. JLBc2;
18 zeigt die Sequenzhomologie zwischen dem Klon JLBc1 und dem Klon FBd3,
und 19 die Sequenzhomologie zwischen Klon JLBc2 und FBd3;
20 zeigt die Sequenzhomologie zwischen den Klonen JLBc1 und JLBc2;
21 und 22 zeigen die Sequenzhomologie zwischen dem Retrovirus HSERV-9 und den Klonen JLBc1 bzw. JLBc2;
23 zeigt die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 56 des Klons GM3;
24 zeigt die Sequenzhomologie zwischen dem Retrovirus HSERV-9 und dem Klon GM3;
25 zeigt die Lage der verschiedenen untersuchten Klone im Bezug auf das Genom des bekannten Retrovirus ERV9;
26 zeigt die Position der Klone F11-1, M003-P004 und PSJ17 in der im folgenden MSRV-1 pol * genannten Region;
27, die in die aufeinanderfolgenden drei 27a, 27b und 27c geteilt ist, zeigt ein mögliches Leseraster, das die Gesamtheit des pol-Gens abdeckt;
28 zeigt gemäß SEQ ID Nr. 40 die Nukleotidsequenz, die für das Peptidfragment pol2B codiert, das die in SEQ ID Nr. 39 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist;
29 zeigt die OD-Wörter (ELISA-Tests) bei 492 nm, die mit 29 Seren von MS-Patienten und 32 Seren von gesunden Kontrollen bei Prüfung mit einem anti-IgG-Antikörper erhalten wurden;
30 zeigt die OD-Wörter (ELISA-Tests) bei 492 nm, die mit 36 Seren von MS-Patienten und 42 Seren von gesunden Kontrollen bei Prüfung mit einem anti-IgM-Antikörper erhalten wurden;
31 bis 33 zeigen die Ergebnisse (relative Intensität der Spots) die mit der Spotscan-Technik mit 43 überlappenden Octapeptiden, die die Aminosäuresequenz 61–110 abdecken, erhalten wurden, und zwar mit einem Pool von MS-Seren, einem Pool von Kontrollseren bzw. dem Pool der MS-Seren nach Abziehen des entsprechenden Rauschens, das mit dem Kontrollserum an mindestens einem Octapeptid nachgewiesenen Maximalsignal entspricht (Intensität = 1), wobei diese Seren auf 1/50 verdünnt worden waren. Der Balken ganz rechts zeigt einen Standard für den graphischen Maßstab ohne Bezug auf den serologischen Test;
34 zeigt SEQ ID Nr. 41 und SEQ ID Nr. 42 von zwei Polypeptiden, die Immundominanten umfassen, während SEQ ID Nr. 43 und 44 für MS spezifische immunreaktive Polypeptide zeigen;
35 zeigt die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 59 des Klons LB19 sowie drei mögliche Leseraster in Aminosäuren von SEQ ID Nr. 59;
36 zeigt die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 88 (GAG*) und ein mögliches Leseraster in Aminosäuren von SEQ ID Nr. 88;
37 zeigt die Sequenzhomologie zwischen dem Klon FBd13 und dem Retrovirus HSERV-9; gemäß dieser Darstellung bedeutet der durchgezogene Strich einen Homologieprozentsatz von gleich 70% oder darüber und das Fehlen des Strichs bedeutet einen geringeren Homologieprozentsatz;
38 zeigt die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 61 des Klons FP6 und drei mögliche Leseraster in Aminosäuren von SEQ ID Nr. 61;
39 zeigt die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 89 des Klons G + E + A und drei mögliche Leseraster in Aminosäuren von SEQ ID Nr. 89;
40 zeigt ein Leseraster in der Region E, das für eine MSRV-1-Retrovirus-Protease gemäß SEQ ID Nr. 90 codiert;
41 zeigt die Reaktion von jedem Serum von MS-Patienten, das mit dem Symbol (+) bezeichnet ist, und von gesunden Probanten, das mit (–) bezeichnet ist, im Test mit einem anti-IgG-Antikörper, ausgedrückt als reine optische Dichte bei 492 nm;
42 zeigt die Reaktion von jedem Serum von MS-Patienten, das mit den Symbolen (+) und (QS) bezeichnet ist, und von gesunden Probanten, das mit (–) bezeichnet ist, im Test mit einem anti-IgM-Antikörper, ausgedrückt als reine optische Dichte bei 492 nm;
BEISPIEL 1: GEWINNUNG VON KLONEN MIT DER BEZEICHNUNG MSRV-1B UND MSRV-2B, DIE EIN RETROVIRUS MSRV-1 BZW. EIN COINFEKTIÖSES AGENS MSRV-2 DEFINIEREN, DURCH AMPLIFIKATION VON KONSERVIERTEN POL-REGIONEN VON RETROVIREN AN VIRIONENPRÄPARATEN DER LINIEN LM7PC UND PLI-2 DURCH AMPLIFIKATION MITTELS „NESTED"-PCR
Man verwendete eine PCR-Technik, die sich von der von Shih (12) veröffentlichten Technik ableitet. Mit dieser Technik kann man durch Behandeln aller Komponenten des Reaktionsmediums mittels DNase alle Spuren von kontaminierender DNA eliminieren. Parallel dazu kann man damit dadurch, daß man unterschiedliche, jedoch überlappende, Primer in zwei aufeinanderfolgenden Serien von PCR-Amplifikationszyklen einsetzt, die Chancen verbessern, daß eine cDNA amplifiziert wird, die ausgehend von einer zu Beginn niedrigen RNA-Menge, die in der Probe noch mehr durch die parasitierende Wirkung der DNase auf die RNA herabgesetzt ist, synthetisiert worden ist. Die DNase wird nämlich unter Bedingungen überschüssiger Aktivität eingesetzt, die es ermöglichen, alle Spuren von kontaminierender DNA zu eliminieren, bevor dieses Enzym, das noch in der Probe verbleibt, durch 10minütiges Erhitzen auf 85°C inaktiviert wird. Diese Variante der PCR-Technik, die von Shih (12) beschrieben wurde, wurde bei einer cDNA eingesetzt, die ausgehend von Nukleinsäuren von Fraktionen von auf Saccharosegradient nach der von H. Perron (13) beschriebenen Technik aufgereinigten infektiösen Partikeln synthetisiert wurde, und zwar erstens ausgehend von dem Isolat „POL-2" (ECACC Nr. V92072202), das von der Linie PLI-2 (ECACC Nr. 92072201) produziert wurde, und zweitens von dem Isolat MS7PG (ECACC Nr. V93010816), das von der Linie LM7PC (ECACC Nr. 93010817) produziert wurde. Diese Kulturen wurden nach Methoden erhalten, die den Gegenstand der unter den Nummern WO 93/20188 und WO 93/20189 veröffentlichten Patentanmeldungen bilden.
Nach Klonieren mit dem TA Cloning Kit^® der nach dieser Technik amplifizierten Produkte und Sequenzanalyse mit Hilfe eines Sequenzierautomaten „Automatic Sequencer, Modell 373A" von Applied Biosystems wurden die Sequenzen mit der Software Geneworks^® an der letzten von der Datei Genebank^® verfügbaren Version analysiert.
Die ausgehend von diesen Proben klonierten und sequenzierten Sequenzen entsprechen insbesondere zwei Arten von Sequenzen: einer ersten Art von Sequenz, die sich auch bei den meisten Klonen findet (55% der Klone aus den Isolaten POL-2 der Kultur PLI-2 und 67% der Klone aus den Isolaten MS7PG der Kulturen LM7PC), die einer Sequenzfamilie „pol" entspricht, die dem endogenen menschlichen Retrovirus mit der Bezeichnung ERV-9 oder HSERV-9 ähnlich ist, sich davon jedoch unterscheidet, und einer zweiten Art von Sequenz, die Sequenzen entspricht, die eine sehr starke Homologie mit einer Sequenz aufweisen, die einem anderen infektiösen Agens und/oder Pathogen mit der Bezeichnung MSERV-2 zugeordnet wird.
Die erste Art von Sequenz, die die Mehrheit der Klone darstellt, besteht aus Sequenzen, aufgrund deren Variabilität man vier Unterfamilien von Sequenzen definieren kann. Diese Unterfamilien sind zueinander so nahe, daß man sie beinahe als Quasi-Arten, die von ein- und demselben Retrovirus stammen, was bereits gut für das Retrovirus HIV-1 (14) bekannt ist, oder als Ergebnis von Interferenz mit verschiedenen endogenen Proviren, die in den Zellen, in denen sie produziert werden, gemeinsam reguliert werden, ansehen kann. Diese mehr oder weniger defizienten endogenen Elemente sind gegenüber denselben Regulationssignalen empfindlich, die gegebenenfalls von einem replizierenden Provirus erzeugt werden, da sie zur selben Familie von endogenen Retroviren gehören (15). Diese neue Familie von endogenen Retroviren bzw. diese neue Retrovirus-Art, von der man in Kultur zur Entstehung von Quasi-Arten gelangt ist, und die eine Konsensussequenz wie unten beschrieben enthält, wird MSRV-1B genannt.
1 zeigt die allgemeinen Konsensus-Sequenzen der unterschiedlichen MSRV-1B-Klone, die bei diesem Versuch sequenziert wurden, wobei diese Sequenzen SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 bzw. SEQ ID Nr. 6 genannt werden. Diese Sequenzen weisen eine Nukleinsäurehomologie zu der in der Datei Genebank^® X57147 und M37638 genannten HSERV9-Sequenz von 70% bis 88% auf. Vier „Konsensus"-Nukleinsäuresequenzen, die für die unterschiedlichen Quasi-Arten eines gegebenenfalls exogenen Retrovirus MSRV-1B oder für unterschiedliche Unterfamilien eines endogenen MSERV-1B-Retrovirus repräsentativ sind, wurden definiert. Diese repräsentativen Konsensussequenzen sind in 2 mit der Translation in Aminosäuren dargestellt. Es existiert ein funktionelles Leseraster für jede Unterfamilie dieser MSRV-1B-Sequenzen, und man kann sehen, daß das funktionelle offene Leseraster jedesmal der Aminosäuresequenz, die in der zweiten Zeile unter der Nukleinsäuresequenz steht, entspricht. Die allgemeine Konsensussequenz der Sequenz MSRV-1B mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 7, die mit dieser PCR-Technik in der „pol"-Region erhalten wurde, ist in 1 dargestellt.
Die zweite Art von Sequenz, die die meisten sequenzierten Klone repräsentiert, wird durch die Sequenz MSRV-2B dargestellt,, die in 3 gezeigt wird, und SEQ ID Nr. 11 genannt wird. Die bei den Sequenzen, die den PCR-Primern entsprechen, beobachteten Unterschiede lassen sich dadurch erklären, daß man unter unterschiedlichen Versuchsbedingungen eine Mischung von degenerierten Primern eingesetzt hat.
Die Sequenz MSRV-2B (SEQ ID Nr. 11) weicht von den in den Dateien beschriebenen Retrovirussequenzen so stark ab, daß man vorbringen kann, daß es sich dabei um eine Sequenzregion handelt, die zu einem neuen infektiösen Agens mit der Bezeichnung MSRV-2 gehört. Dieses infektiöse Agens wäre a priori nach Analyse der ersten erhaltenen Sequenzen mit einem Retrovirus verwandt, es könnte sich in Anbetracht der für die Gewinnung dieser Sequenz verwendeten Technik jedoch auch um ein DNA-Virus handeln, dessen Genom für ein Enzym codiert, welches zusätzlich über eine reverse Transkriptase-Aktivität verfügt, wie dies zum Beispiel beim Hepatitis-B-Virus, HBV, der Fall ist (12). Weiterhin kann es, aufgrund von unerwarteten Sequenzhomologien oder von in dem Gen eines verwandten Enzyms konservierten Stellen, der zufallsmäßige Charakter der für diese PCR-Amplifikationstechnik eingesetzten degenerierten Primer durchaus auch ermöglicht haben, daß eine Nukleinsäure amplifiziert wurde, die von einem pathogenen und/oder coinfizierenden Agens prokaryontischer oder eukaryontischer Natur (Protist) stammt.
BEISPIEL 2: GEWINNUNG VON KLONEN MIT DER BEZEICHNUNG MSRV-1B UND MSRV-2B, DIE EINE FAMILIE MSRV-1 BZW. MSRV-2 DEFINIEREN, DURCH AMPLIFIKATION MITTELS „NESTED"-PCR VON KONSERVIERTEN POL-REGIONEN VON RETROVIREN AUS LYMPHOZYT-B-PRÄPARATEN EINES NEUEN FALLS VON MULTIPLER SKLEROSE
Dieselbe nach der Technik von Shih (12) modifizierte PCR-Technik wurde auch für die Amplifikation und Sequenzierung des RNA-Nukleinsäurematerials eingesetzt, welches in einer Virionenfraktion vorkommt, und die nach den in Beispiel 1 erwähnten Protokollen auf Saccharosegradient nach der von H. Perron beschriebenen Technik (13) beim Peak der reversen Transkriptase-Aktivität „des LM7-Typs" aufgereinigt wurde, und zwar aus einer spontan entstandenen Lymphoblastoidlinie, die durch Autoimmortalisierung von in Kultur gezogenen B-Lymphozyten eines für das Epstein-Barr-Virus (EBV) seropositiven MS-Patienten erhalten wurde, und zwar nach Kultivierung von Blutlymphoidzellen in einem entsprechenden Kulturmedium, das eine entsprechende Cyclosporin-A-Konzentration enthält. Eine Darstellung der reversen Transkriptase-Aktivität in den Saccharosfraktionen, die auf einen Reinigungsgradienten von Virionen, die von dieser Linie produziert wurden, entnommen wurden, ist in 4 dargestellt. Ebenso wurden Kulturüberstände einer Linie B, die unter denselben Bedingungen ausgehend von einer MS-freien Kontrolle gewonnen wurden, unter denselben Bedingungen behandelt, und die quantitative Bestimmung der reversen Transkriptase- Aktivität in den Fraktionen des Saccharosegradienten erwies sich überall als negativ (Rauschen); dies ist in 5 dargestellt. Fraktion 3 des Gradienten, der der Linie B mit MS entspricht, und dieselbe Fraktion ohne reverse Transkriptase-Aktivität des nicht-MS-Kontrollgradienten wurden mit der gleichen RT-PCR-Technik wie zuvor gemäß Shih (12) analysiert, worauf dieselben Klonierungs- und Sequenzierungsschritte wie in Beispiel 1 beschrieben folgten.
Es ist äußerst bemerkenswert, daß die Sequenzen des MSRV-1-Typs und des MSRV-2-Typs auch in dem einzigen Material auftreten, das mit einem Peak der reversen Transkriptase-Aktivität „des LM7-Typs" aus der MS-Lymphoblastoid-B-Linie assoziiert ist. Diese Sequenzen traten bei Material der Kontroll-Lymphoblastoid-B-Linie (nicht-MS) in 26 zufällig gewählten rekombinanten Klonen nicht auf. Nur diejenigen kontaminierenden Sequenzen des Mo-MuLV-Typs, die von der für den cDNA-Synthese-Schritt eingesetzten im Handel erwerblichen reversen Transkriptase stammten, und Sequenzen ohne bestimmte Analogie zu Retroviren traten bei dieser Kontrolle auf, und zwar aufgrund der „Konsensus"-Amplifikation von homologen Polymerasesequenzen, die bei dieser PCR-Technik durchgeführt wird. Außerdem ermöglicht das Fehlen eines konzentrierten Angriffspunkts, der mit der Amplifikationsreaktion im Wettbewerb steht, in der Kontrollprobe die Amplifikation von verdünnten Kontaminanten. Der Unterschied zwischen den Ergebnissen ist nachweislich hochsignifikant (Chi-2, p < 0,001).
BEISPIEL 3: GEWINNUNG EINES KLONS PSJ17, DER EINEN RETROVIRUS MSRV-1 DEFINIERT, DURCH EINWIRKUNG VON ENDOGENER REVERSER TRANSKRIPTASE AUF EIN VIRIONENPRAPARAT DER LINIE PLI-2.
Mit diesem Ansatz möchte man DNA-Sequenzen gewinnen, die von mutmaßlich retroviraler RNA in dem Isolat re vers transkribiert worden sind, und zwar unter Verwendung der in diesem Isolat vorliegenden reversen Transkriptase-Aktivität. Diese reverse Transkriptase-Aktivität kann theoretisch nur in Gegenwart einer Retrovirus-RNA, die an eine tRNA gebunden oder mit kurzen, bereits in den Retroviruspartikeln revers transkribierten DNA-Strängen hybridisiert ist, funktionieren (16). So wurde die Gewinnung von spezifischen Retrovirussequenzen in einem mit Zell-Nukleinsäuren kontaminierten Material gemäß diesen Autoren optimiert, und zwar durch spezifische enzymatische Amplifikation von Virus-RNA-Abschnitten mittels einer viralen reversen Transkriptase-Aktivität. Die Autoren haben dafür die jeweiligen chemisch-physikalischen Bedingungen bestimmt, unter denen diese Enzymaktivität der reversen Transkription, die auf in den Virionen enthaltene RNA einwirkt, in vitro wirksam sein könnte. Diese Bedingungen entsprechen der Vollbeschreibung der Protokolltechniken, die unten dargestellt sind (Reaktion der endogenen RT, Aufreinigung, Klonierung und Sequenzierung).
Der molekulare Ansatz bestand darin, daß man ein ausgehend von Kulturüberständen der Linie PLI-2, die gemäß den unten beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, gewonnenes konzentriertes, jedoch nicht aufgereinigtes, Virionenpräparat verwendete; die Kulturüberstände werden zweimal pro Woche geerntet, 30 Minuten bei 10000 U/min vorzentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen und anschließend bei –80°C tiefgefroren oder als solche für die folgenden Schritte verwendet. Die frischen oder aufgetauten Überstände werden bei 100000 g (bzw. 30000 U/min in einem LKB-HITACHI-Rotor Typ 45 T) 2 Stunden lang über ein 30%iges PBS-Glycerin-Kissen bei 4°C zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wird das sedimentierte Pellet in einem kleinen Volumen PBS aufgenommen; es bildet die konzentrierte, jedoch nicht aufgereinigte, Virionenfraktion. Diese konzentrierte, jedoch nicht aufgereinigte, Virusprobe wird für eine sogenannte endogene reverse Transkriptionsreaktion ein gesetzt, und zwar wie im folgenden beschrieben.
Ein Volumen von 200 μl gemäß dem oben beschriebenen Protokoll aufgereinigter Virionen mit einer reversen Transkriptase-Aktivität von ungefähr 1–5 Millionen dpm wird bei 37°C so lange aufgetaut, bis eine flüssige Phase erscheint und anschließend auf Eis gegeben. Mit den folgenden Bestandteilen wird ein 5fach konzentrierter Puffer hergestellt: 500 mM Tris-HCl pH 8,2, 75 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 75 mM DTT und 0,10% NP 40; 100 μl 5X Puffer + 25 μl 100 mM dATP-Lösung + 25 μl einer 100 mM dTTP-Lösung + 25 μl einer 100 mM dGTP-Lösung + 25 μl einer 100 mM dCTP-Lösung + 100 μl steriles destilliertes Wasser + 200 μl Virionensuspension (RT-Aktivität 5 Millionen DPM) in PBS wurden vermischt und 3 Stunden bei 42°C inkubiert. Nach dieser Inkubation wird der Ansatz direkt einer mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Sigma Nr. P 3803) gepufferten Mischung gegeben; die wäßrige Phase wird gewonnen und die organische Phase wird mit einem volumensterilen destillierten Wasser versetzt, um das verbleibende Nukleinsäurematerial zu extrahieren. Die gewonnenen wäßrigen Phasen werden vereinigt und die enthaltenen Nukleinsäuren werden durch Versetzen mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 + 2 Volumina Ethanol + 1 μl Glykogen (Boehringer-Mannheim Nr. 901 393) und 4stündiges Aufbewahren der Probe bei –20°C oder über Nacht bei +4°C gefällt. Der nach Zentrifugation erhaltene Niederstand wird anschließend mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 60 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Die Produkte dieser Reaktion wurden anschließend aufgereinigt, kloniert und nach dem im folgenden beschriebenen Protokoll sequenziert: Es entstanden DNAs mit kohäsiven Enden mit ungepaarten Adeninresten an den Enden: Zunächst wurde eine "Auffüll"-reaktion durchgeführt: 25 μl der zuvor aufgereinigten DNA-Lösung wurden mit 2 μl einer 2,5 mM Lösung, die in äquimolaren Mengen dATP + dGTP + dTTP + dCTP/1 μl T4-Polymerase-DNA (Boehringer-Mannheim Nr. 1004 786)/5 μl 10X "incubation buffer for restriction enzyme" (Boehringer-Mannheim Nr. 1417 975)/1 μl einer 1%igen Rinderserumalbumin-Lösung/16 μl steriles destilliertes Wasser enthielt, vermischt. Diese Mischung wurde 20 Minuten lang bei 11°C inkubiert. Man versetzt mit 50 μl TE-Puffer und 1 μl Glykogen (Boehringer-Mannheim Nr. 901 393) und extrahiert anschließend die Nukleinsäuren mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Sigma Nr. P 3803) und fällt mit Natriumacetat wie zuvor beschrieben. Die nach Zentrifugation niedergeschlagene DNA wird in 10 μl 10 mM Tris-Puffer pH 7,5 suspendiert. Anschließend werden 5 μl dieser Suspension mit 20 μl 5X Taq-Puffer, 20 μl 5 mM dATP, 1 μl (5U) Taq-DNA-Polymerase (Amplitaq^TM) und 54 μl sterilem destilliertem Wasser vermischt. Diese Mischung wurde 2 Stunden lang bei 75°C mit einem Ölfilm auf der Oberfläche der Lösung inkubiert. Die DNA, die in der wäßrigen Lösung, die nach der Inkubation unter dem Ölfilm entnommen wurde, suspendiert ist, wird wie zuvor beschrieben gefällt und in 2 μl sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Die erhaltene DNA wurde mit dem TA Cloning^TM Kit in ein Plasmid insertiert. Die 2 μl DNA-Lösung wurden mit 5 μl sterilem destilliertem Wasser, 1 μl eines 10fach konzentrierten Ligationspuffers "10X LIGATION BUFFER", 2 μl "pCR^TM VECTOR" (25 ng/ml) und 1 μl "TA DNA LIGASE" vermischt. Diese Mischung wurde eine Nacht lang bei 12°C inkubiert. Die folgenden Schritte wurden gemäß den Anweisungen des TA Cloning^® Kits (British Biotechnology) durchgeführt. Am Ende dieses Arbeitsschritts wurden die weißen Kolonien der rekombinanten Bakterien (white) vereinzelt und anschließend kultiviert und damit eine Extraktion der aufgenommenen Plasmide nach dem sogenannten "Miniprep"-Verfahren durchgeführt (17). Das Plasmidpräparat von jeder rekombinanten Kolonie wurde mit einem entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten und auf Agarosegel analysiert. Die Plasmide mit einem Insert, das nach Markierung des Gels mit Ethidiumbromid unter UV-Licht nachgewiesen wurde, wurden nach Hybridisierung mit einem komplementären Primer des auf dem Klonierungsplasmid des TA-Cloning-Kits^® vorhandenen Sp6-Promoters für die Sequenzierung des Inserts selektiert. Die Reaktion vor der Sequenzierung wurde dann nach dem empfohlenen Verfahren für die Verwendung des Sequenzierkits "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, Nr. 401384) durchgeführt, und die automatische Sequenzierung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Gerät "Automatic Sequencer, Modell 373 A" Applied Biosystems durchgeführt.
Die diskriminierende Analyse an Computer-Dateien der Sequenzen, die ausgehend von den in der Reaktionsmischung vorliegenden DNA-Fragmenten kloniert wurden, gestattete den Nachweis einer Sequenz des Retrovirus-Typs. Der PSJ17 entsprechende Klon wurde vollständig sequenziert, und die erhaltene Sequenz, die in 6 dargestellt ist und die Bezeichnung SEQ ID Nr. 9 trägt, wurde mit Hilfe der Software "Geneworks^®" an den aktualisierten "Genebank^®"-Dateien analysiert. Mit der Datei-Analyse konnte man keine bereits beschriebene identische Sequenz auffinden. Es konnte nur eine partielle Homologie mit gewissen bekannten Retroviruselementen gefunden werden. Die interessanteste relative Homologie betrifft ein endogenes Retrovirus mit der Bezeichnung ERV-9, bzw. HSERV-9, gemäß den Literaturangaben (18).
BEISPIEL 4: PCR-AMPLIFIKATION DER NUKLEINSÄURESEQUENZ, DIE ZWISCHEN DER 5'-REGION, DIE VON DEM KLON "POL MSRV-1B" DEFINIERT WIRD, UND DER 3'-REGION, DIE VON DEM KLON PSJ17 DEFINIERT WIRD, ENTHALTEN IST
Fünf Oligonukleotide, nämlich M001, M002-A, M003-BCD, P004 und P005, wurden für die Amplifikation der RNA von aufgereinigten POL-2-Virionen definiert. Es wurden Kontrollreaktionen durchgeführt, um das Vorhandensein von Kontaminanten (Reaktion mit Wasser) festzustellen. Die Amplifikation besteht aus einem RT-PCR-Schritt gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll und einer anschließenden "nested"-PCR gemäß den in der Schrift EP-A-0 569 272 beschriebenen PCR-Protokoll. Im ersten RT-PCR-Zyklus werden die Primer M001 und P004 oder P005 verwendet. Im zweiten PCR-Zyklus werden die Primer M002-A oder M003-BCD und der Primer P004 verwendet. Die
Primer weisen die folgende Lage auf:
Ihre Zusammensetzung lautet:
Das erhaltene Produkt der "nested"-Amplifikation erhält die Bezeichnung M003-P004 und ist in 7 dargestellt; es weist die Sequenz SEQ ID Nr. 8 auf.
BEISPIEL 5: AMPLIFIKATION UND KLONIERUNG EINES ÄBSCHNITTS DES MSRV-1-RETROVIRUS-GENOMS MIT HILFE EINER BEREITS IDENTIFIZIERTEN SEQUENZ IN EINER PROBE VON AUFGEREINIGTEM VIRUS MIT PEAK DER REVERSEN TRANSKRIPTASE-AKTIVITAT
Es wurde eine PCR-Technik, die sich von der von Frohman (19) veröffentlichten Technik ableitet, eingesetzt. Mit dieser abgeleiteten Technik kann man mit einem Primer, der für das 3'-terminale Ende des zu amplifizierenden Genoms spezifisch ist, die Sequenz in Richtung der 5'- Region des zu analysierenden Genoms elongieren. Diese abgewandelte Technik ist in der Schrift der Firma "Clontech Laboratories Inc.", (Palo-Alto Kalifornien, USA), die gemeinsam mit ihrem Produkt "5'-AmoliFINDER^TM RACE Kit" geliefert wird, beschrieben; dieses Kit wurde wie beschrieben bei einer Fraktion von wie oben beschrieben aufgereinigten Virionen angewandt.
Die bei dem Protokoll des Kits für die Synthese der cDNA und die PCR-Amplifikation eingesetzten 3'-spezifischen Primer sind jeweils zu den folgenden MSRV-1-Sequenzen komplementär.
Die bei der PCR erhaltenen Produkte wurden nach Aufreinigung auf Agarosegel nach traditionellen Methoden (17) aufgereinigt und anschließend in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert. Eine der Eigenschaften der Taq-Polymerase besteht darin, daß sie am 3'-Ende von jedem der zwei DNA-Stränge ein Adenin anfügt; die erhaltene DNA wurde mit Hilfe des TA Cloning^TM-Kits (British Bio technology) direkt in ein Plasmid insertiert. Die 2 μl DNA-Lösung wurden mit 5 μl sterilem destilliertem Wasser, 1 μl eines 10fach konzentrierten Ligationspuffers "10X LIGATION BUFFER", 2 μl "pCR^TM VECTOR" (25 ng/ml) und 1 μl "TA DNA LIGASE" vermischt. Diese Mischung wurde eine Nacht bei 12°C inkubiert. Die folgenden Schritte wurden gemäß den Anweisungen des TA Cloning^®-Kits (British Biotechnology) durchgeführt. Am Ende des Vorgangs wurden die weißen Kolonien der rekombinanten Bakterien (white) vereinzelt und anschließend kultiviert und damit eine Extraktion der aufgenommenen Plasmide nach dem sogenannten "Miniprep"-Verfahren (17) durchgeführt. Das Plasmidpräparat von jeder rekombinanten Kolonie wurde mit einem entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten und auf Agarosegel analysiert. Die Plasmide mit einem Insert, das nach Markierung des Gels mit Ethidiumbromid unter UV-Licht nachgewiesen wurde, wurden nach Hybridisierung mit einem komplementären Primer des auf dem TA Cloning^®-Kits vorhandenen Sp6-Promoters für die Sequenzierung des Inserts selektiert. Die Reaktion vor der Sequenzierung wurde dann nach dem im folgenden Verfahren für die Verwendung des Sequenzierkits "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, Nr. 401384) durchgeführt und die automatische Sequenzierung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Gerät "Automatic Sequencer, Modell 373 A" Applied Biosystems durchgeführt.
Diese Technik wurde zuerst bei zwei wie oben beschrieben aufgereinigten Virionenfraktionen angewandt, und zwar auf Saccharose ausgehend erstens von dem von der Linie PLI-2 produzierten Isolat "POL-2" und zweitens dem von der Linie LM7PC produzierten Isolat MS7PG. Die Kulturüberstände werden zweimal pro Woche geerntet, 30 Minuten bei 10000 U/min vorzentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen und anschließend bei –80°C tiefgefroren oder als solche für die folgenden Schritte verwendet. Die frischen oder aufgetauten Überstände werden bei 100000 g (bzw. 30000 U/min in einem LKB-HITACHI-Rotor Typ 45 T) 2 Stunden lang über ein 30%iges PBS-Glycerin-Kissen bei 4°C zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wird das sedimentierte Pellet in einem kleinen Volumen PBS aufgenommen; es bildet die konzentrierten, jedoch nicht aufgereinigten, Virionenfraktion. Das konzentrierte Virus wird anschließend in einem sterilen PBS-Puffer (15 bis 50% w/w) auf einen Saccharosegradienten aufgetragen und bei 35000 U/min (100000 g) 12 Stunden lang bei +4°C in einem Ausschwingrotor ultrazentrifugiert. Man erhält 10 Fraktionen, und von jeder Fraktion werden nach Homogenisierung 20 μl entnommen, um nach der von H. Perron (3) beschriebenen Methode die reverse Transkriptase-Aktivität zu bestimmen. Die Fraktionen, die den Peak der RT-Aktivität "des LM7-Typs" enthalten, werden anschließend mit sterilem PBS- Puffer verdünnt und eine Stunde lang bei 35000 U/min (100000 g) ultrazentrifugiert, um die Viruspartikel abzusedimentieren. Das so erhaltene aufgereinigte Virionenpellet wird nun in einem kleinen Volumen Puffer, der sich für die RNA-Extraktion eignet, aufgenommen. Die oben erwähnte cDNA-Synthesereaktion wird mit dieser RNA, die von aufgereinigten extrazellulären Virionen extrahiert wurde, durchgeführt. Mit der weiter oben beschriebenen PCR-Amplifikationstechnik konnte der Klon F1-11 erhalten werden, dessen Sequenz mit SEQ ID Nr. 2 bezeichnet ist und in 8 dargestellt ist.
Mit diesem Klon kann man mit den verschiedenen zuvor sequenzierten Klonen eine Region mit großer Länge (1,2 kB) definieren, die dem "pol"-Gen des MSRV-1-Retrovirus entspricht, wie dies in 9 dargestellt ist.
Diese Sequenz mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 1 wird ausgehend von unterschiedlichen Klonen, die sich an ihren Enden überlappen, wiederhergestellt, wobei die durch die Primer und die Amplifikations- oder Klonierungstechniken bedingten Artefakte, die künstlich das Leseraster des ganzen unterbrechen würden, korrigiert wurden. Diese Sequenz trägt im folgenden die Bezeichnung "MSRV-1-pol*-Region". Das Ausmaß ihrer Homologie mit der Sequenz HSERV-9 ist in 12 dargestellt.
In 9 ist das mögliche Leseraster mit seiner Translation in Aminosäuren unter der Nukleinsäuresequenz dargestellt.
BEISPIEL 6: NACHWEIS VON FÜR MSRV-1 UND MSRV-2 SPEZIFISCHEN SEQUENZEN IN VERSCHIEDENEN PROBEN VON PLASMA VON MS-PATIENTEN BZW. KONTROLLEN.
Zum Nachweis der MSRV-1 und MSRV-2-Genome in Plasmen, die nach Entnahme von Blut von MS-Patienten und Nicht-MS-Kontrollen auf EDTA erhalten wurden, wurde eine PCR- Technik eingesetzt.
Die Extraktion von RNAs aus dem Plasma erfolgte nach der von P. Chomzynski (20) beschriebenen Technik nach Versetzen mit einem Volumen Puffer, der Guanidiniumthiocyanat enthielt, zu 1 ml Plasma, das nach der Gewinnung bei –80°C tiefgefroren aufbewahrt wurde.
Bei MSRV-2 erfolgte die PCR unter denselben Bedingungen, und zwar mit den folgenden Primern:

– 5'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 14 5' GTAGTTCGATGTAGAAAGCG 3':
– 3'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 15 5' GCATCCGGCAACTGCACG 3'.

Es wurden jedoch auch ähnliche Ergebnisse mit den folgenden PCR-Primern in zwei aufeinanderfolgenden "nested"-PCR-Amplifikationen mit Nukleinsäureproben, die nicht mit DNase behandelt worden waren, erhalten.
Bei den Primern, die in diesem ersten Schritt von 40 Zyklen bei einer Hybridisierungstemperatur von 48°C eingesetzt wurden, handelt es sich um die folgenden:

– 5'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 27 5' GCCGATATCACCCGCCATGG 3', entsprechend einem 5'-MSRV-2-PCR-Primer, für eine PCR an Patientenproben,
– 3'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 28 5' GCATCCGGCAACTGCACG 3', entsprechend einem 3'-MSRV-2-PCR-Primer, für eine PCR an Patientenproben.

Nach diesem Schritt entnimmt man 10 μl des Amplifikationsprodukts und verwendet diese für eine zweite sogenannte "nested"-PCR-Amplifikationen, bei der die Primer innerhalb der bereits amplifizierten Region liegen. Diese zweite Schritt erfolgt über 35 Zyklen bei einer Primer-Hybridisierungstemperatur ("Annealing") von 50°C. Das Reaktionsvolumen beträgt 100 μl.
Bei den für diesen zweiten Schritt eingesetzten Primern handelt es sich um die folgenden:

– 5'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 29 5' CGCGATGCTGGTTGGAGAGC 3', entsprechend einem 5'-MSRV-2-PCR-Primer, für eine "nested"-PCR an Patientenproben,
– 3'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 30 5' TCTCCACTCCGAATATTCCG 3', entsprechend einem 3'-MSRV-2-PCR-Primer, für eine "nested"-PCR an Patientenproben.

Für MSRV-1 erfolgte die Amplifikation in zwei Schritten. Außerdem wird die Nukleinsäureprobe zuvor mit DNase behandelt, und es wird ein Kontroll-PCR ohne RT (AMV reverse Transkriptase) an den zwei Amplifikationsschritten durchgeführt, um sicherzustellen, daß die RT-PCR-Amplifikation ausschließlich von der MSRV-1-RNA stammt. Ist die Kontrolle ohne RT positiv, so wird die anteilige RNA-Probe erneut mit DNase behandelt und erneut amplifiziert.
Das Protokoll der Behandlung mit DNase ohne RNase-Aktivität lautet folgendermaßen. Die extrahierte RNA wird in Gegenwart von "RNase Inhibitor" (Boehringer-Mannheim) in DEPC-Wasser in einer Endkonzentration von 1 μg pro 10 μl in Portionen geteilt; zu diesen 10 μl gibt man 1 μl "RNase-free DNase" (Boehringer-Mannheim) und 1,2 μl Puffer mit pH 5, der 0,1 M/l Natriumacetat und 5 mM/l MgSO₄ enthält; die Mischung wird 15 Minuten lang bei 20°C inkubiert und innerhalb von 1,5 Minuten in einem "Thermocycler" auf 95°C gebracht.
Der erste Schritt der RT-PCR mit MSRV-1 erfolgt nach einer Abwandlung des RNA-Amplifikationsverfahrens gemäß der Patentanmeldung Nr. EP-A-0 569 272 . Insbesondere erfolgt der Schritt der cDNA-Synthese über eine Stunde bei 42°C; die PCR-Amplifikation erstreckt sich über 40 Zyklen, wobei die Hybridisierungstemperatur der Primer ("Annealing") 53°C beträgt. Das Reaktionsvolumen beträgt 100 μl.
Bei den für diesen ersten Schritt eingesetzten Primern handelt es sich um die folgenden:

– 5'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 16 5' AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3';
– 3'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 17 5' TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3'.

– 5'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 18 5' TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3';
– 3'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 19 5' AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3'.

In den 10 und 11 sieht man die Ergebnisse der PCR in Form von Photographien von mit Ethidiumbromid versetzten Agarosegelen unter Ultraviolettlicht; in. diesen Gelen war eine Elektrophorese der PCR-Amplifikationsprodukte, die getrennt in die einzelnen Vertiefungen aufgetragen worden waren, durchgeführt worden.
Die Photographie oben (10) zeigt das Ergebnis der MSRV-2-spezifischen Amplifikation.
Vertiefung Nummer 8 enthält eine Mischung von DNA-Molekulargewichtsmarkern, während die Vertiefungen 1 bis 7 der Reihe nach die Produkte enthalten, die ausgehend von Gesamt-RNAs von Plasmen von 4 MS-freien gesunden Kontrollen (Vertiefungen 1 bis 4) und von 3 MS-Patienten in verschiedenen Krankheitsstadien (Vertiefungen 5 bis 7) amplifiziert wurden.
In dieser Reihe wird MSRV-2-Nukleinsäurematerial im Plasma eines MS-Falls von den 3 geprüften Fällen, jedoch in keinem der 4 Kontrollplasmen, nachgewiesen. Weitere Ergebnisse, die in größeren Versuchsreihen erhalten wurden, bestätigen diese Ergebnisse.
Die Photographie unten (11) zeigt das Ergebnis der MSRV-1-spezifischen Amplifikation mittels "nested"-RT-PCR:
die Vertiefung Nummer 1 enthält das mit nur Wasser erhaltene PCR-Produkt ohne Zusatz von AMV reverser Transkriptase; die Vertiefung Nummer 2 enthält das mit nur Wasser erhaltene PCR-Produkt mit Zusatz von AMV reverser Transkriptase; die Vertiefung Nummer 3 enthält eine Mischung von DNA-Mokekulargewichtsmarkern; die Vertiefungen 4 bis 13 enthalten der Reihe nach die Amplifikationsprodukte der Gesamt-RNAs, die von Saccharosegradientfraktionen extrahiert wurden (Entnahme von oben nach unten), wobei auf diesem Gradienten ein Virionenpellet von einem Überstand einer mit MSRV-1 und MSRV-2 infizierten Kultur gemäß dem von H. Perron (13) beschriebenen Protokoll zentrifugiert worden war, bis sich ein Gleichgewicht eingestellt hatte; in die Vertiefungen 15 bis 17 wurden Amplifikationsprodukte von RNA aufgetragen, die von Plasmen von 3 verschiedenen MS-Patienten in verschiedenen Krankheitsstadien stammten.
Das MSRV-1-Retrovirusgenom findet sich in derjenigen Fraktion des Saccharosegradienten, die den gemäß von H. Perron (3) beschriebenen Peak der reversen Transkriptase-Aktivität enthielt, und zwar in hoher Intensität (Fraktion 5 des Gradienten, aufgetragen in die Vertiefung Nr. 8). In der ersten Fraktion (Vertiefung Nr. 4) fand eine schwache Amplifikation statt, die vermutlich RNA entspricht, die durch lysierte Teilchen, die an der Oberfläche des Gradienten schwammen, freigesetzt wurde; ebenso zogen aggregierte Zelltrümmer, die in der letzten Fraktion sedimentierten, (Boden des Röhrchens) einige Kopien des MSRV-1-Genoms mit sich, die zu einer Amplifikation mit schwacher Intensität geführt haben.
An den 3 in der Versuchsreihe geprüften MS-Plasmen trat die MSRV-1-RNA in einem Fall auf, was zu einer sehr intensiven Amplifikation führte (Vertiefung Nr. 17).
In dieser Versuchsreihe wurde bei einem MS-Fall von den 3 geprüften Fällen das RNA-Genom des MSRV-1-Retrovirus, das vermutlich extrazellulären Viruspartikeln, die in dem Plasma in äußerst niedriger Anzahl vorlagen, entsprach, mittels "nested"-RT-PCR nachgewiesen. Weitere Ergebnisse, die in ausführlicheren Versuchsreihen erhalten wurden, bestätigen diese Ergebnisse.
Außerdem kann die Spezifität der mit diesen PCR-Techniken amplifizierten Sequenzen mittels der "ELOSA"-Technik, wie sie von F. Mallet (21) sowie in der Schrift FR-A-2 663 040 beschrieben wurde, bestätigt und ausgewertet werden.
Bei MSRV-1 können die Produkte der oben beschriebenen nested-PCR in zwei ELOSA-Systemen geprüft werden, mit denen getrennt eine Konsensussequenz A und eine Konsensussequenz B + C + D des MSRV-1, die den in dem Beispiel und in den 1 und 2 beschriebenen Unterfamilien entsprechen, nachgewiesen werden konnten. Die Sequenzen, die in der Nähe der Konsensussequenz B + C + D liegen, treten nämlich im wesentlichen in den RNA- Proben auf, die von MSRV-1-Virionen stammen, welche aus Kulturen aufgereinigt wurden oder in extrazellulären biologischen Flüssigkeiten von MS-Patienten amplifiziert wurden, während die Sequenzen, die in der Nähe der Konsensussequenz A liegen, im wesentlichen in normaler menschlicher Zell-DNA auftreten.
Das ELOSA/MSRV-1-System für das Einfangen und die spezifische Hybridisierung von PCR-Produkten der Unterfamilie A wird ein Fang-Oligonukleotid cpV1A eingesetzt, das eine Aminobindung am 5'-Ende und ein biotinyliertes Nachweis-Oligonukleotid dpV1A enthält, die jeweils die folgende Sequenz aufweisen:

– cpV1A, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 31 5' GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3', entsprechend dem ELOSA-Fang-Oligonukleotid der Produkte der nested-PCR an MSRV-1, die mit den Primern mit der Bezeichung SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17, und der gegebenenfalls eine Amplifikation mit den Primern mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 18 und SEQ ID Nr. 19 folgte, an Patientenproben durchgeführt wurde;
– dpV1A, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 32 5' CATCTITTTGGICAGGCAITAGC 3', entsprechend dem ELOSA-Fang-Oligonukleotid der Unterfamilie A von Produkten der "nested"-PCR an MSRV-1, die mit den Primern mit der Bezeichung SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17, und der gegebenenfalls eine Amplifikation mit den Primern mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 18 und SEQ ID Nr. 19 folgte, an Patientenproben durchgeführt wurde.

Bei dem ELOSA/MSRV-1-System für das Einfangen und die spezifische Hybridisierung von PCR-Produkten der Unterfamilie B + C + D verwendet man dasselbe biotinylierte Nachweis-Oligonukleotid dpV1A sowie ein Fang-Oligonukleotid cpV1B mit einer Aminbindung am 5'-Ende und der folgenden Sequenz:

– dpV1B, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 33 5' CTTGAGCCAGTTCTCATACCTGGA 3', entsprechend dem ELOSA-Fang-Oligonukleotid der Unterfamilie B + C + D von Produkten der "nested"-PCR an MSRV-1, die mit den Primern mit der Bezeichung SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17, und der gegebenenfalls eine Amplifikation mit den Primern mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 18 und SEQ ID Nr. 19 folgte, an Patientenproben durchgeführt wurde.

Mit diesem ELOSA-Nachweissystem konnte man überprüfen, daß keines der PCR-Produkte, die so von Plasmen von MS-Patienten, die mit DNase behandelt worden waren, amplifiziert worden waren, eine Sequenz der Unterfamilie A erzielt und daß alle mit der Konsenssequenz der Unterfamilien B, C und D positiv waren.
Bei MSRV-2 wurde eine ähnliche ELOSA-Technik an Isolaten ausgewertet, die von Kulturen von infizierten Zellen stammten, und zwar unter Verwendung der folgenden PCR-Amplifikations-Primer:

– 5'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 34 5' AGTGYTRCCMCARGGCGCTGAA 3', entsprechend einem 5'-PCR-Primer für MSRV-2, für die PCR von Kulturproben,
– 3'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 35 5' GMGGCCAGCAGSAKGTCATCCA 3', entsprechend einem 3'-PCR-Primer für MSRV-2, für die PCR von Kulturproben, sowie das Fang-Oligonukleotid cpV2 mit Aminbindung am 5'-Ende und das biotinylierte Nachweis-Oligonukleotid dpV2, deren jeweilige Sequenzen folgendermaßen lauten:
– cpV2, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 36 5' GGATGCCGCCTATAGCCTCTAC 3', entsprechend einem ELOSA-Fang-Oligonukleotid für Produkte der MSRV-2-PCR, die mit den Primern SEQ ID Nr. 34 und SEQ ID Nr. 35, oder gegebenenfalls mit den von Shih (12) definierten Primern durchgeführt wurde,
– dpV2, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 37 5' AAGCCTATCGCGTGCAGTTGCC 3', entsprechend einem ELOSA-Fang-Oligonukleotid für Produkte der MSRV-2-PCR, die mit den Primern SEQ ID Nr. 34 und SEQ ID Nr. 35, oder gegebenenfalls mit den von Shih (12) definierten Primern durchgeführt wurde.

Mit diesem PCR-Amplifikationssystem mit einem Primer-Paar, das sich von den zuvor für die Amplifikation an Patientenproben beschriebenen Primern unterscheidet, konnte die Infektion von in-vitro-Kulturen und von für molekularbiologische Arbeiten verwendeten Nukleinsäureproben mit MSRV-2 bestätigt werden.
Schlußendlich zeigen die ersten Ergebnisse des PCR-Nachweises des Genoms von pathogenen und/oder infektiösen Agentien, daß es wahrscheinlich ist, daß freies "Virus" außerhalb des Nervernsystems im Blutkreislauf von Patienten mit akutem Ausbruchstadium zirkulieren kann. Dies ist mit quasi systematisch vorliegenden "Frontlücken" in der Blut-Hirn-Schranke von Patienten, die sich in einer aktiven MS-Phase befinden, vereinbar.
BEISPIEL 7: GEWINNUNG VON SEQUENZEN DES "ENV"-GENS DES MSRV-1-RETROVIRUS-GENOMS
Wie bereits im Beispiel 5 beschrieben, wurde eine von der von Frohman (19) veröffentlichten Technik abgeleitete PCR-Technik eingesetzt. Mit dieser abgeleiteten Technik kann man mit Hilfe eines 3'-spezifischen Primers des zu amplifizierenden Genoms die Sequenz in Richtung der 5'-Region des zu analysierenden Genoms verlängern. Diese methodologische Variante ist in der Schrift der Firma "Clontech Laboratories Inc.", (Palo-Alto, Kalifornien, USA) beschrieben, die mit dem Produkt "5'-AmpliFINDER^TM RACE Kit" dieser Firma, das an einer Fraktion von aufgereinigten Virionen wie oben beschrieben eingesetzt wurde, mitgeliefert wird.
Um eine Amplifikation der 3'-Region des MSRV-1-Retrovirus-Genoms durchzuführen, wobei die Region des "env"-Gens mit umfaßt ist, wurde eine Untersuchung durchgeführt, um eine Konsensus-Sequenz in den LTR- Regionen desselben Typs wie denjenigen des defizienten endogenen Retrovirus HSERV-9 (18, 24) zu bestimmen, zu dem das vorliegenden Retrovirus MSRV-1 partielle Homologien aufweist.
Derselbe 3'-spezifische Primer wurde auch in dem Protokoll des Kits für cDNA-Synthese und die PCR-Amplifikation eingesetzt; seine Sequenz lautet:
Die Synthese der komplementären DNA (cDNA) und die PCR-Amplifikation in eine Richtung mit dem obengenannten Primer erfolgten in einem Schritt, und zwar nach dem in dem Patent EP-A-0 569 272 beschriebenen Verfahren.
Die bei der PCR erhaltenen Produkte wurden nach Aufreinigung auf Agarosegel nach traditionellen Methoden (17) extrahiert und anschließend in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert. Eine der Eigenschaften der Taq-Polymerase besteht darin, daß sie am 3'-Ende von jedem der zwei DNA-Stränge ein Adenin anfügt; die erhaltene DNA wurde mit Hilfe des TA Cloning^TM-Kits (British Biotechnology) direkt in ein Plasmid insertiert. Die 2 μl DNA-Lösung wurden mit 5 μl sterilem destilliertem Wasser, 1 μl eines 10fach konzentrierten Ligationspuffers "10X LIGATION BUFFER", 2 μl "pCR^TM VECTOR" (25 ng/ml) und 1 μl "TA DNA LIGASE" vermischt. Diese Mischung wurde eine Nacht bei 12°C inkubiert. Die folgenden Schritte wurden gemäß den Anweisungen des TA Cloning^®-Kits (British Biotechnology) durchgeführt. Am Ende des Vorgangs wurden die weißen Kolonien der rekombinanten Bakterien (white) vereinzelt und anschließend kultiviert und damit eine Extraktion der aufgenommenen Plasmide nach dem sogenannten "Miniprep"-Verfahren (17) durchgeführt. Das Plasmidpräparat von jeder rekombinanten Kolonie wurde mit einem entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten und auf Agarosegel analysiert. Die Plasmide mit einem Insert, das nach der Markierung des Gels mit Ethidiumbromid unter UV-Licht nachgewiesen wurde, wurden nach Hybridisierung mit einem komplementären Primer des auf dem TA Cloning-Kit^® vorhandenen Sp6-Promoters für die Sequenzierung des Inserts selektiert. Die Reaktion vor der Sequenzierung wurde dann nach dem empfohlenen Verfahren für die Verwendung des Sequenzierkits "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, Nr. 401384) durchgeführt und die automatische Sequenzierung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Gerät "Automatic Sequencer, Modell 373 A" Applied Biosystems durchgeführt.
Dieser methodologische Ansatz wurde auf eine konzentrierte Virionenprobe wie im folgenden beschrieben angewandt, und zwar ausgehend von einer Mischung von Kulturüberständen, die von B-Lymphoblastoid-Linien wie in Beispiel 2 beschrieben produziert wurden, wobei diese Linien ausgehend von Lymphozyten mit MS erstellt wurden und eine nach der von Perron und Mitarbeitern (3) beschriebenen Technik nachweisbaren reversen Transkriptase-Aktivität aufweisen: Die Kulturüberstände werden zweimal pro Woche geerntet, 30 Minuten bei 10000 U/min vorzentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen und anschließend bei –80°C tiefgefroren oder als solche für die folgenden Schritte verwendet. Die frischen oder aufgetauten Überstände werden bei 100000 g 2 Stunden lang über ein 30%iges PBS-Glycerin-Kissen bei 4°C zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wird das sedimentierte Pellet in einem kleinen Volumen PBS aufgenommen; es bildet die konzentrierte, jedoch nicht aufgereinigte, Virionenfraktion. Das so erhaltene aufgereinigte Virionenpellet wird nun in einem kleinen Volumen Puffer, der sich für die RNA-Extraktion eignet, aufgenommen. Die oben erwähnte cDNA-Synthesereaktion wird mit dieser RNA, die von konzentrierten extrazellulären Virionen extrahiert wurde, durchgeführt.
Mit der RT-PCR-Amplifikation nach der oben beschriebe nen Technik konnte der Klon FBd3 erhalten werden, dessen Sequenz die Bezeichnung SEQ ID Nr. 46 trägt und in 13 dargestellt ist.
In 14 ist die Sequenzhomologie zwischen dem Klon FBd3 und dem Retrovirus HSERV-9 in der Graphik durch einen durchgezogenen Strich dargestellt, der für eine partielle Homologie von gleich oder größer 65% gilt. Man stellt fest, daß Homologien in den flankierenden Regionen des Klons existieren (wobei das pol-Gen in 5'-Richtung und das env-Gen und anschließend LTR in 3'-Richtung liegen) existieren, daß jedoch die Region innerhalb völlig unterschiedlich ist und keinerlei Homologie, nicht einmal eine schwache Homologie, mit dem "env"-Gen von HSERV9 aufweist. Außerdem scheint es, daß der Klon FBd3 eine längere "env"-Region enthält, als diejenige, die für das defiziente endogene HSERV-9 beschrieben ist; auf diese Weise kann man feststellen, daß die innere, unterschiedliche Region ein "insert" zwischen den Regionen mit partieller Homologie zu den definzienten HSERV-9-Genen bildet.
BEISPIEL 8: AMPLIFIKATION, KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DER REGION DES MSRV-1-RETROVIRUS-GENOMS, DIE ZWISCHEN DEN KLONEN PSJ17 UND FBd3 LIEGT
Vier Oligonukleotide, nämlich F1, B4, F6 und B1, wurden definiert, um die RNA, die von konzentrierten Virionen der Stämme POL2 und MS7PG stammt, zu amplifizieren. Es wurden Kontrollreaktionen durchgeführt, um das Vorhandensein von Kontaminanten (Reaktion mit Wasser) festzustellen. Die Amplifikation besteht aus einem RT-PCR-Schritt gemäß dem in der Patentanmeldung EP-A-0 569 272 beschriebenen Protokoll gefolgt von einem zweiten PCR-Schritt, die mit 10 μl Produkt des ersten Schritts durchgeführt werden, und zwar mit den Primern, die innerhalb der ersten amplifizierten Region liegen ("nested"-PCR). Im ersten RT-PCR-Zyklus werden die Primer F1 und B4 verwendet. Im zweiten PCR-Zyklus werden die Primer F6 und B1 verwendet. Die Primer weisen die folgende Lage auf:
Ihre Zusammensetzung lautet:
Das erhaltene Produkt der "nested"-Amplifikation erhält die Bezeichnung "t pol" und ist in 15 dargestellt; es weist die Sequenz SEQ ID Nr. 51 auf.
BEISPIEL 9: GEWINNUNG VON NEUEN SEQUENZEN, DIE ALS RNA IN KULTIVIERTEN ZELLEN, DIE MSRV-1 PRODUZIEREN, EXPRIMIERT WERDEN UND DIE EINE "ENV"-REGION DES MSRV-1-RETROVIRUS-GENOMS ENTHALTEN
Mit der vom Hersteller des Kits "cDNA synthesis module, cDNA rapid adaptor ligation module, cDNA rapid cloning module, lambda gt10 in vitro packaging module" (Amersham, Nr. RPN1256Y/Z, RPN1712, RPN1713, RPN1717, N334Z) beschriebenen Vorgehensweise wurde eine cDNA-Bibliothek erstellt, und zwar ausgehend von Messenger-RNA, die von Zellen einer B-Lymphoblastoid-Linie wie in Beispiel 2 beschrieben extrahiert wurde, wobei diese Linie ausge hend von Lymphozyten eines MS-Patienten erstellt wurde und eine nach der von Perron und Mitarbeitern (3) beschriebenen Technik nachweisbare reverse Transkriptase-Aktivität aufweist.
Es wurden Oligonukleotide für die Amplifikation der cDNA, die in die Nukleinsäurebibliothek zwischen die 3'-Region des Klons PSJ17 (pol) und der 5'-Region (LTR) des Klons FBd3 kloniert worden ist, zu amplifizieren. Es wurden Kontrollreaktionen durchgeführt, um das Vorhandensein von Kontaminanten (Reaktion mit Wasser) festzustellen. Mit PCR-Reaktionen, die an den Nukleinsäuren, die in die Bibliothek mit verschiedenen Primer-Paaren kloniert worden waren, durchgeführt wurden, konnte eine Reihe von Klonen amplifiziert werden, in denen die pol-Sequenzen mit env-Sequenzen oder LTR-Sequenzen des MSRV-1-Typs verbunden waren.
Zwei Klone sind für die in der Zell-cDNA-Bibliothek erhaltenen Sequenzen repräsentativ:

– Klon JLBc1, dessen Sequenz SEQ ID Nr. 52 in Abbildung 16 dargestellt ist;
– Klon JLBc2, dessen Sequenz SEQ ID Nr. 53 in Abbildung 17 dargestellt ist.

Die Sequenzen der Klone JLBc1 und JLBc2 sind zu denen des Klons FBd3 homolog, wie auch dies aus den 18 und 19 hervorgeht. Die Homologie zwischen dem Klon JLBc1 und JLBc2 ist in 20 dargestellt.
Die Homologien zwischen einerseits den Klonen JLBc1 und JLBc2 und andererseits der HSERV9-Sequenz sind jeweils in den 21 und 22 dargestellt.
Es ist festzustellen, daß die Region der Homologie zwischen JLBc1 und JLBc2 und FBd3 mit gewissen Sequenz- und Größenvariationen des "Inserts" die zusätzliche ("insertierte") Sequenz, die in der Sequenz env HSERV-9 fehlt, wie in Beispiel 8 dargestellt, umfaßt.
Ebenfalls festzustellen ist, daß die klonierte "pol"-Region eine starke Homologie mit HSERV-9 aufweist, kein Leseraster besitzt (unter Berücksichtigung der durch die verwendeten Techniken bis inklusive dem Sequenzierautomaten induzierten Sequenzfehler) und von MSRV-1-Sequenzen, die ausgehend von Virionen gewonnen werden, abweicht. Angesichts der Tatsache, daß diese Sequenzen ausgehend von RNA von Zellen, die MSRV-1-Partikel exprimieren, kloniert wurden, ist wahrscheinlich, daß sie von endogenen Retrovirus-Elementen, die mit der ERV9-Familie verwandt sind, stammen; dies trifft umso mehr zu, als die Gene pol und env auf derselben RNA vorliegen, bei der es sich offensichtlich nicht um die genomische RNA von MSRV-1 handelt. Gewisse dieser ERV9-Elemente weisen funktionsfähige LTRs auf, die von replizierenden Viren aktiviert werden können, welche für homologe oder heterologe Transaktivatoren codieren. Unter diesen Bedingungen macht es die Verwandtschaft zwischen MSRV-1 und HSERV-9 wahrscheinlich, daß defiziente (bzw. nichtdefinziente) endogene ERV9-Elemente durch homologe, ja sogar identische, MSRV-1-Transaktivatorproteine transaktiviert werden.
Solch ein Phänomen kann eine virale Interferenz zwischen der Expression von MSRV-1 und verwandten endogenen Elementen induzieren. Solch eine Interferenz führt im allgemeinen zu einer Expression, die als "defizientinterferierend" bezeichnet wird und von der gewisse Charakteristiken in mit MSRV-1 infizierten untersuchten Kulturen auftraten. Außerdem tritt bei solch einem Phänomen auch eine Expression von Polypeptiden auf, nämlich endogenen Retrovirusproteinen, die nicht unbedingt vom Immunsystem toleriert werden. Solch ein Schema der aberranten Expression von mit MSRV-1 verwandten endogenen Elementen, die von letzterem induziert wird, neigt dazu, die aberranten Antigene zu vermehren und daher zur Induktion von Autoimmunvorgängen, wie sie bei der MS beobachtet werden, beizutragen.
Es muß jedoch unbedingt festgestellt werden, daß sich die Klone JLBc1 und JLBc2 von der beschriebenen Sequenz ERV9 oder HSERV9 insofern unterscheiden, als sie eine längere env-Region aufweisen, die eine zusätzliche Region umfaßt, welche von ERV9 völlig verschieden ist. Man kann daher ihre Verwandtschaft mit der endogenen ERV9-Familie definieren, sie bilden jedoch offenbar neuartige Elemente, die bis dato noch nicht beschrieben worden sind. Durch Abfrage in Version Nr. 15 (1995) der Software "Entrez" (NCBI, NIH, Bethesda, USA) verfügbaren Dateien von Nukleinsäuresequenzen war es nämlich nicht möglich, eine bekannte homologe Sequenz in der env-Region dieser Klone zu identifizieren.
BEISPIEL 10: GEWINNUNG VON SEQUENZEN, DIE IN DER 5'-pol- UND 3'-gag-REGION DES MSRV-1-RETROVIRUSGENOMS LIEGEN
Wie dies bereits in Beispiel 5 gezeigt wurde, wurde eine PCR-Technik eingesetzt, die sich von der von Frohman (19) veröffentlichten Technik ableitet. Mit dieser abgeleiteten Technik kann man mit einem Primer, der für das 3'-terminale Ende des zu amplifizierenden Genoms spezifisch ist, die Sequenz in Richtung der 5'-Region des zu analysierenden Genoms elongieren. Diese abgewandelte Technik ist in der Schrift der Firma "Clontech Laboratories Inc.", (Palo-Alto Kalifornien, USA), die gemeinsam mit ihrem Produkt "5'-AmpliFINDER^TM RACE Kit" geliefert wird, beschrieben; dieses Kit wurde wie beschrieben bei einer Fraktion von wie oben beschrieben aufgereinigten Virionen angewandt.
Um eine Amplifikation der 5'-Region des MSRV-1-Retrovirusgenoms durchzuführen, die von der bereits sequenzierten pol-Sequenz (Klon F11-1) bis zu dem gag-Gen reicht, wurden spezifische MSRV-1-Primer definiert.
Die bei dem Protokoll des Kits für die Synthese der cDNA und die PCR-Amplifikation eingesetzten 3'-spezifischen Primer sind jeweils zu den folgenden MSRV-1-Sequenzen komplementär.
Die bei der PCR erhaltenen Produkte wurden nach Aufreinigung auf Agarosegel nach traditionellen Methoden (17) extrahiert und anschließend in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert. Eine der Eigenschaften der Taq-Polymerase besteht darin, daß sie am 3'-Ende von jedem der zwei DNA-Stränge ein Adenin anfügt; die erhaltene DNA wurde mit Hilfe des TA Cloning^TM-Kits (British Biotechnology) direkt in ein Plasmid insertiert. Die 2 μl DNA-Lösung wurden mit 5 μl sterilem destilliertem Wasser, 1 μl eines 10fach konzentrierten Ligationspuffers "10X LIGATION BUFFER", 2 μl "pCR^TM VECTOR" (25 ng/ml) und 1 μl "TA DNA LIGASE" vermischt. Diese Mischung wurde eine Nacht bei 12°C inkubiert. Die folgenden Schritte wurden gemäß den Anweisungen des TA Cloning^®-Kits (British Biotechnology) durchgeführt. Am Ende des Vorgangs wurden die weißen Kolonien der rekombinanten Bakterien (white) vereinzelt und anschließend kultiviert und damit eine Extraktion der aufgenommenen Plasmide nach dem sogenannten "Miniprep"-Verfahren (17) durchgeführt. Das Plasmidpräparat von jeder rekombinanten Kolonie wurde mit einem entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten und auf Agarosegel analysiert. Die Plasmide mit einem Insert, das nach der Markierung des Gels mit Ethidiumbromid unter UV-Licht nachgewiesen wurde, wurden nach Hybridisierung mit einem komplementären Primer des auf dem TA Cloning-Kit^® vorhandenen Sp6-Promoters für die Sequenzierung des Inserts selektiert. Die Reaktion vor der Sequenzierung wurde dann nach dem empfohlenen Verfahren für die Verwendung des Sequenzierkits "Prism ready reaction kit dye deoxyter minator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, Nr. 401384) durchgeführt und die automatische Sequenzierung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Gerät "Automatic Sequencer, Modell 373 A" Applied Biosystems durchgeführt.
Dieser methodologische Ansatz wurde auf eine wie unten beschriebene konzentrierte Virionenprobe angewandt, und zwar ausgehend von einer Mischung von Kulturüberständen, die von Lymphoblastoid-B-Linien wie in Beispiel 2 beschrieben produziert worden waren, wobei diese Linien ausgehend von Lymphozyten von MS-Patienten erstellt wurden und eine mittels der von Perron und Mitarbeitern (3) beschriebenen Technik nachweisbare reverse Transkriptase-Aktivität aufwiesen: Die Kulturüberstände werden zweimal pro Woche geerntet, 30 Minuten bei 10000 U/min vorzentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen und anschließend bei –80°C tiefgefroren oder als solche für die folgenden Schritte verwendet. Die frischen oder aufgetauten Überstände werden bei 100000 g 2 Stunden lang über ein 30%iges PBS-Glycerin-Kissen bei 4°C zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wird das sedimentierte Pellet in einem kleinen Volumen PBS aufgenommen; es bildet die konzentrierte, jedoch nicht aufgereinigte, Virionenfraktion. Das so erhaltene aufgereinigte Virionenpellet wird nun in einem kleinen Volumen Puffer, der sich für die RNA-Extraktion eignet, aufgenommen. Die oben erwähnte cDNA-Synthesereaktion wird mit dieser RNA, die von konzentrierten extrazellulären Virionen extrahiert wurde, durchgeführt.
Mit der RT-PCR-Amplifikation nach der oben beschriebenen Technik konnte der Klon GM3 erhalten werden, dessen Sequenz die Bezeichnung SEQ ID Nr. 56 trägt und in 23 dargestellt ist.
In 24 ist die Sequenzhomologie zwischen dem Klon GMP3 und dem Retrovirus HSERV-9 in der Graphik durch einen durchgezogenen Strich dargestellt, der für eine partielle Homologie von gleich oder größer 65% gilt.
Zusammenfassend wird in 25 die Lage der verschiedenen zuvor untersuchten Klone im Vergleich zu dem bekannten ERV9-Genom dargestellt. In 25 ist die MSRV-1-env-Region länger als das ERV9-env-Bezugsgen, und die zusätzliche Region ist oberhalb des Insertionspunkts mit einem "V" dargestellt, wobei gilt, daß das insertierte Material eine Sequenz- und Größenvariabilität zwischen den dargestellten Klonen (JLBc1, JLBc2, FBd3) aufweist. In 26 ist die Position von unterschiedlichen Klonen dargestellt, die in der MSRV-1-pol*-Region untersucht wurden.
Aufgrund des zuvor beschriebenen Klons GM3 war es möglich, ein mögliches Leseraster zu definieren, das die Gesamtheit des pol-Gens gemäß SEQ ID Nr. 57 abdeckt, was in den aufeinanderfolgenden 27a bis 27c dargestellt ist.
BEISPIEL 11: NACHWEIS VON SPEZIFISCHEN ANTI-MSRV-1-ANTIKÖRPERN IN HUMAN-SERUM
Durch Identifikation der Sequenz des pol-Gens des Retrovirus MSRV-1 und eines offenen Leserasters dieses Gens konnte man die Sequenz SEQ ID Nr. 39 in Aminosäuren einer Region dieses Gens mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 40 bestimmen (vgl. 28).
Unterschiedliche synthetische Peptide, die Fragmenten der Proteinsequenz der von dem pol-Gen codierten reversen Transkriptase von MSRV-1 entsprechen, wurden auf ihre spezifische Antigenität gegenüber Seren von MS-Patienten und gesunden Kontrollen getestet.
Die Peptide wurden chemisch durch Festphasen-Synthese nach der Merrifield-Technik (Barany G und Merrifieldd R. B, 1980, In the Peptides, 2, 1–284, Gross E und Mei enhofer J, Hersg. Academic Press, New York) synthetisiert. Die praktischen Vorgehensweisen sind wie unten beschrieben.
a) Peptidsynthese:
Die Peptide wurden mit einem Syntheseautomaten "Applied Biosystems 430A" an einem Phenylacetamidomethylharz (PAM)/Polystyrol/Divinylbenzol (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) synthetisiert. Die Aminosäuren werden in Form von Hydroxybenzotriazol (HOBT)-Estern gekoppelt. Die verwendeten Aminosäuren stammen von Novabiochem (Laüflerfingen, Schweiz) oder Bachem (Bubendorf, Schweiz).
Die chemische Synthese erfolgte nach einem Doppelkopplungsprotokoll mit N-Methylpyrrolidon (NMP) als Lösungsmittel. Die Peptide wurden vom Harz und von dem seitlichen Schutz gleichzeitig mit Hilfe von Fluorwasserstoffsäure (HF) in einem geeigneten Gerät (Typ I-Spaltapparat, Peptide Institute, Osaka, Japan) abgespalten.
Pro 1 g Peptidylharz werden 10 ml HF, 1 ml Anisol und 1 ml Dimethylsulfid 5DMS eingesetzt. Die Mischung wird 45 Minuten lang bei –2°C gerührt. Anschließend wird der HF im Vakuum abgedampft. Nach intensivem Waschen mit Ether wird das Peptid vom Harz mit l0%iger Essigsäure eluiert und anschließend lyophilisiert.
Die Peptide werden mittels präparativer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an einer VYDAC-Säule des Typs C18 (250 × 21 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA) aufgereinigt. Die Elution erfolgt mittels eines Acetonitrilgradienten mit einer Durchflußrate von 22 ml/min. Die aufgefangenen Fraktionen werden durch Elution unter isokratischen Bedingungen an einer analytischen VYDAC^®-C18-Säule (250 × 4,6 mm) mit einer Durchflußrate von 1 ml/min überprüft. Die Fraktionen, die dieselbe Retentionszeit aufweisen, werden vereinigt und lyophilisiert. Die Hauptfraktion wird anschließend durch analytische Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit dem oben beschriebenen System analysiert. Das Peptid, dessen Reinheit als akzeptabel gilt, äußert sich in einem einzelnen Peak, der mindestens 95% des Chromatogramms darstellt.
Die gereinigten Peptide werden anschließend mit einem automatischen Aminosäureanalysator "Applied Biosystems 420H" analysiert, um ihre Aminosäurezusammensetzung zu überprüfen. Die Messung des (mittleren) chemischen Molekulargewichts der Peptide erfolgt mittels LSIMS-Massenspektrometrie im positiven Ionenmodus, und zwar mit einem Gerät mit doppelter Fokussierung VG. ZAB. ZSEQ in Verbindung mit einem "DEC-VAX 2000" Datenerfassungssystem (VG analytical Ltd. Manchester, Großbritannien).
Die Reaktivität der unterschiedlichen Peptide wurde mit Seren von MS-Patienten und Seren von gesunden Kontrollen geprüft. Auf diese Weise konnte man ein Peptid mit der Bezeichnung POL2B auswählen, dessen Sequenz in 28 in der Identifikation SEQ ID Nr. 39 unten dargestellt ist und das vom pol-Gen von MSRV-1 (Nukleotide 181 bis 330) codiert wird.
b) Antigene Eigenschaften:
Die antigenen Eigenschaften des Peptids POL2B wurden mit dem unten beschriebenen ELISA-Protokoll nachgewiesen.
Das lyophilisierte Peptid POL2B wurde in sterilem destilliertem Wasser in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Diese Stammlösung wurde in aliquote Portionen geteilt und bei +4°C für die Verwendung innerhalb von 14 Tagen aufbewahrt oder bei –20°C für die Verwendung innerhalb von 2 Monaten tiefgefroren. Ein aliquoter Teil wird in einer PBS (phosphate buffer saline)-Lösung verdünnt, um zu einer Peptidendkonzentration von 1 Mikrogramm/ml zu gelangen. 100 Mikroliter dieser Verdün nung wurden in jedes Näpfchen von Mikrotiterplatten ("high-binding"-Plastik, COSTAR Nr. 3590) gegeben. Die Platten werden mit einem "plate-sealer"-Klebeband verschlossen und für die Absorptionsphase des Peptids auf das Plastik über Nacht bei +4°C aufbewahrt. Das Klebeband wird entfernt und die Platten werden dreimal mit einem Volumen von 300 Mikrolitern einer Lösung A (1× PBS, 0,05% Tween 20^®), und anschließend auf Saugmaterial umgekehrt und 45 Minuten bis 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Platten wie oben beschrieben dreimal mit Lösung A gewaschen.
Die zu prüfenden Serumproben werden zuvor mit Lösung B auf 1/50 verdünnt, und 100 Mikroliter von jedem verdünnten zu prüfenden Serum werden in die Näpfchen jeder Mikrotiterplatte gegeben. In ein Näpfchen von jeder Platte wird eine Negativkontrolle gegeben, und zwar in Form von 100 Mikrolitern Puffer B. Die mit Klebeband bedeckten Platten werden nun 1 bis 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Platten dreimal wie oben beschrieben mit Lösung A gewaschen. Parallel dazu wird ein peroxydasemarkierter Ziegen-Antikörper gegen menschliche IgG (Sigma Immunochemicals Nr. A6029) oder IgM (Cappel Nr.: 55228) mit Lösung B verdünnt (Verdünnung 1/5000 für Anti-IgG und 1/1000 für Anti-IgM). 100 Mikroliter der jeweiligen Verdünnung des markierten Antikörpers werden nun in jedes Näpfchen von Mikrotiterplatten gegeben, und die mit Klebeband verschlossenen Platten werden 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Platten wieder wie zuvor beschrieben gewaschen. Parallel dazu wird das Substrat der Peroxydase gemäß den Anweisungen des Kits "Sigma fast OPD kit" (Sigma Immunochemichals, Nr. P9187) hergestellt. 100 Mikroliter Substratlösung werden in jedes Näpfchen gegeben, und die Platten werden lichtgeschützt 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Sofort nachdem sich die Farbreaktion stabilisiert hat werden die Platten in ein spektrophotometrisches ELISA- Platten-Lesegerät eingegeben, und die optische Dichte (OD) von jedem Näpfchen wird bei einer Wellenlänge von 492 nm abgelesen. Alternativ dazu werden 30 Mikroliter 1 N HCl in jedes Näpfchen gegeben, um die Reaktion zu stoppen, und die Platten werden innerhalb von 24 Stunden im Spektralphotometer abgelesen.
Die serologischen Proben werden in zweifacher oder dreifacher Wiederholung aufgegeben, und die optische Dichte (OD), die dem geprüften Serum entspricht, wird dadurch berechnet, daß man den Mittelwert der für ein- und dieselbe Probe bei ein- und derselben Verdünnung erhaltenen OD-Werte berechnet.
Der Netto-OD-Wert von jedem Serum entspricht dem mittleren OD-Wert des Serums, von dem der mittlere OD-Wert der Negativkontrolle (Lösung B: PBS, 0,05% Tween 20^®, 10% Ziegenserum) abgezogen wird.
c) Nachweis von IgG-Antikörpern gegen MSRV-1 mittels ELISA:
Für die Untersuchung auf das Vorhandensein von spezifischen IgG-Antikörpern gegen MSRV-1 im Serum von 29 Patienten, für die gemäß den Kriterien von Poser (23) eine MS-Diagnose von "sicher" oder "wahrscheinlich" erstellt wurde, sowie von 32 gesunden Kontrollen (Blutspendern) wurde die oben beschriebene Technik mit dem Peptid POL2B eingesetzt.
In 29 sind die Ergebnisse von jedem Serum, das mit einem Anti-IgG-Antikörper geprüft wurde, dargestellt. Jeder senkrechte Balken bedeutet die optische Netto-Dichte (OD bei 492 nm) eines geprüften Serums. Die Ordinatenachse gibt die Netto-OD am oberen Ende der vertikalen Balken an. Die 29 ersten vertikalen Balken, die links von der gestrichelten vertikalen Linie liegen, stellen die Seren von 29 geprüften MS-Fällen dar, und die 32 vertikalen Balken, die rechts von der vertikalen gestrichelten Linie liegen, stellen die Seren von 32 gesunden Kontrollen (Blutspendern) dar.
Der Mittelwert der Netto-OD-Werte der geprüften MS-Patienten beträgt 0,62. Aus der Graphik sind 5 Kontrollen ersichtlich, deren Netto-OD oberhalb der Gruppenwerte der Kontrollpopulation liegen. Diese Werte können das Vorliegen von spezifischen IgGs bei nichtkranken seropositiven Patienten darstellen. Es wurden daher zwei Methoden ausgewertet, um den statistischen Schwellenwert für das Positivsein des Tests zu bestimmen.
Der Mittelwert der Netto-OD-Werte der Kontrollen, darunter auch der Kontrollen mit erhöhten Netto-OD-Werten, beträgt 0,36. Ohne die 5 Kontrollen, deren Netto-OD-Werte gleich oder größer 0,5 sind, beträgt der Mittelwert der "Negativkontrollen" 0,33. Die Standardabweichung der Negativkontrollen beträgt 0,10. eine theoretische Positivitätsschwelle kann gemäß der folgenden Formel errechnet werden:
Schwellenwert (Mittelwert der Netto-OD-Werte der seronegativen Kontrollen) + (2 oder 3 × Standardabweichung der Netto-OD-Werte der seronegativen Kontrollen).
Im ersten Fall wird angenommen, daß nichtkranke Seropositive vorliegen und daß der Schwellenwert gleich 0,33 + (2 × 0,10) = 0,53 beträgt. Die negativen Ergebnisse stellen einen unspezifischen "Hintergrund" des Vorhandenseins von Antikörpern, die spezifisch gegen ein Epitop des Peptids gerichtet sind, dar.
Im zweiten Fall beträgt, wenn die Gesamtheit der Kontrollen, die aus Blutspendern in offenbar guter Gesundheit besteht, als Bezugsbasis angenommen wird und ohne daß die Seren von a-priori Seropositiven ausgeschlossen werden, die Standardabweichung der "Nicht-MS-Kontrollen" 0,116. Der Schwellenwert beträgt nun 0,36 + (2 × 0,116) = 0, 59.

Gemäß dieser Analyse ist der Test für MS spezifisch. Diesbezüglich stellt man fest, daß der Test für MS spezifisch ist, da wie in Tabelle 1 dargestellt keine Kontrolle einen Netto-OD-Wert oberhalb dieses Schwellenwerts aufweist. Dieses Ergebnis spiegelt also die Tatsache wider, daß die Antikörpertiter bei MS-Patienten hauptsächliche stärker erhöht sind als diejenigen von gesunden Kontrollen, die mit MSRV-1 in Kontakt gekommen sind. TABELLE NR. 1

	MS	KONTROLLEN
	0,681		0,3515
	1,0425		0,56
	0,5675		0,3565
	0,63		0,449
	0,588		0,2825
	0,645	0,55
	0,6635	0,52
	0,576		0,2535
	0,7765	0,55
	0,5745	0,51
	0,513		0,426
	0,4325		0,451
	0,7255		0,227
	0,859		0,3905
	0,6435		0,265
	0,5795		0,4295
	0,8655		0,291
	0,671		0,347
	0,596		0,4495
	0,662		0,3725
	0,602		0,181
	0,525		0,2725
	0,53		0,426
	0,565		0,1915
	0,517		0,222
	0,607		0,395
	0,3705		0,34
	0,397		0,307
	0,4395		0,219
		0,491
			0,2265
			0,2605

MITTELWERT	0,62		0,33
STANDARDABWEICHUNG	0,14		0,10
SCHWELLENWERT			0,53

In Abhängigkeit der ersten Berechnungsweise und wie in 29 und in der zugehörigen Tabelle 1 dargestellt, führen 26 von 29 MS-Seren zu einem positiven Ergebnis (Netto-OD gleich oder größer 0,50), was das Vorliegen von IgGs, die spezifisch gegen das Peptid POL2B, also gegen einen Teil des Enzyms reverser Transkriptase des Retrovirus MSRV-1, das von dessen pol-Gen codiert wird, und daher gegen das Retrovirus MSRV-1 gerichtet sind, anzeigt. So haben ungefähr 90% der geprüften MS-Patienten gegen einen Epitop, der auf dem Peptid POL2B liegt, reagiert und weisen zirkulierende IgGs, die gegen dieses Peptid gerichtet sind, auf.
Fünf offenbar gesunde Blutspender von 32 Blutspendern ergeben ein positives Resultat. So scheint es, daß ungefähr 15% der nichtkranken Bevölkerung in Kontakt mit einem Epitop auf dem Peptid POL2B gestanden sein können, und zwar unter Bedingungen, die zu einer aktiven Immunisierung geführt haben und die sich durch das Verbleiben von spezifischen Seren-IgGs ausdrücken. Diese Bedingungen sind mit einer Immunisierung gegen die reverse Transkriptase des Retrovirus MSRV-1 bei Infektion mit (und/oder Reaktivierung des) Retrovirus MSRV-1 kompatibel. Das Fehlen einer offensichtlichen neurologischen Pathologie, die bei diesen seropositiven Kontrollen MS auslöst, kann anzeigen, daß es sich um gesunde Träger handelt, die nach Immunisierung ein infektiöses Virus eliminiert haben oder daß sie eine Population von risikobehafteten chronischen Trägern darstellen. Die Tatsache, daß die epidemiologischen Daten zeigen, daß ein in der Umwelt von Regionen mit starkem MS-Vorkommen vorhandenes pathogenes Agens der Grund für diese Krankheit sein kann, impliziert, daß ein Teil der MS-freien Population zwingenderweise in Kontakt mit so einem pathogenen Agens gewesen sein muß. Es wurde gezeigt, daß das Retrovirus MSRV-1 ganz oder teilweise diese "pathogene Agens" darstellt, das MS bedingt, und daß es daher normal ist, daß Kontrollen, die einer ge sunden Population entnommen wurden, Antikörper des IgG-Typs gegen Komponenten des Retrovirus MSRV-1 aufweisen. Der Unterschied der Seroprävalenz zwischen MS-Fällen und der Kontrollpopulation ist höchst signifikant: "Chi-2"-Test, p < 0,001. Diese Ergebnisse sprechen daher dafür, daß das MSRV-1 eine etiopathogene Rolle bei MS spielt.
d) Nachweis von IgM-Antikörpern gegen MSRV-1 mittels ELISA:
Für die Untersuchung auf das Vorhandensein von spezifischen IgM-Antikörpern gegen MSRV-1 im Serum von 36 Patienten, für die gemäß den Kriterien von Poser (23) eine MS-Diagnose von "sicher" oder "wahrscheinlich" erstellt wurde sowie von 42 gesunden Kontrollen (Blutspendern) wurde die ELISA-Technik mit dem Peptid POL2B eingesetzt.
In 30 sind die Ergebnisse von jedem Serum, das mit einem Anti-IgM-Antikörper geprüft wurde, dargestellt. Jeder senkrechte Balken bedeutet die optische Netto-Dichte (OD bei 492 nm) eines geprüften Serums. Die Ordinatenachse gibt die Netto-OD am oberen Ende der vertikalen Balken an. Die 36 ersten vertikalen Balken, die links von der gestrichelten vertikalen Linie liegen, stellen die Seren von 36 geprüften MS-Fällen dar, und die vertikalen Balken, die rechts von der vertikalen gestrichelten Linie liegen, stellen die Seren von 42 gesunden Kontrollen (Blutspendern) dar. Die horizontale Linie in der Mitte der Graphik stellt einen theoretischen Schwellenwert dar, der die positiven Ergebnisse (bei denen das obere Ende des Balkens oberhalb liegt) von den negativen Ergebnissen (bei denen das obere Ende des Balkens unterhalb liegt) abgrenzt.
Der mittlere Netto-OD-Wert der geprüften MS-Fälle beträgt 0,19.
Der mittlere Netto-OD-Wert der geprüften Kontrollen be trägt 0,09.
Die Standardabweichung der Negativkontrollen beträgt 0,05.
Angesichts des geringen Unterschieds zwischen dem Mittelwert und der Standardabweichung der Kontrollen kann der Schwellenwert für das theoretische Positivsein folgendermaßen berechnet werden: Schwellenwert (Mittelwert der Netto-OD-Werte der seronegativen Kontrollen) + (3 × Standardabweichung der Netto-OD-Werte der seronegativen Kontrollen).
Der Schwellenwert beträgt daher 0,09+ (3 × 0,05) = 0,26; bzw. in der Praxis 0,25.
Die negativen Ergebnisse stellen einen unspezifischen "Hintergrund" des Vorhandenseins von spezifisch gegen ein Epitop des Peptids gerichteten Antikörpern dar.
Gemäß dieser Analyse, und wie in 30 und der dazugehörigen Tabelle 2 dargestellt, ist der IgM-Test spezifisch für MS, da keine Kontrolle einen Netto-OD-Wert oberhalb des Schwellenwerts aufweist. 7 von 36 MS-Seren führen zu einem positiven IgM-Ergebnis; die Untersuchung von klinischen Daten zeigt, daß diese positiven Seren während eines ersten MS-Schubs oder einem akuten Schub bei nichtbehandelten Kranken entnommen wurden. Es ist bekannt, daß die gegen pathogene Agentien gerichteten IgMs bei Primärinfektionen oder bei Reaktivierungen nach einer Latenzperiode dieses pathogenen Agens produziert werden. Der Unterschied der Seroprävalenz zwischen MS-Fällen und der Kontrollpopulation ist höchst signifikant: "Chi-2"-Test, p < 0,001.
Diese Ergebnisse sprechen daher dafür, daß das MSRV-1 eine etiopathogene Rolle bei MS spielt.

Mittels des Nachweises der IgM- und IgG-Antikörper gegen das Peptid POL2B kann man das Entstehen einer Infektion durch MSRV-1 und/oder einer Reaktivierung des MSRV-1-Virus auswerten. TABELLE NR. 2

	MS	KONTROLLEN
	0,064	0,243
	0,087	0,11
	0,044	0,098
	0,115	0028
	0,089	0,094
	0,025	0,038
	0,097	0,176
	0,108	0,146
	0,018	0,049
	0,234	0,161
	0,274	0,113
	0,225	0,079
	0,314	0,093
	0,522	0,127
	0,306	0,02
	0,143	0,052
	0,375	0,062
	0,142	0,074
	0,157	0,043
	0,168	0,046
	1,051	0,041
	0,104	0,13
	0,187	0,153
	0,044	0,107
	0,053	0,178
	0,153	0,114
	0,07	0,078
	0,033	0,118
	0,104	0,177
	0,187	0,026
	0,044	0,024
	0,053	0,046
	0,153	0,116
	0,07	0,04
	0,033	0,028
	0,973	0,073
		0,008
		0,074
		0,141
		0,219
		0,047
		0,017

MITTELWERT	0,19	0,09
STANDARDABWEICHUNG	0,23	0,05
SCHWELLENWERT		0,26

e) Suche nach immundominaten Epitopen auf dem Peptid POL2B:
Um den unspezifischen Hintergrund zu verringern und den Nachweis von Antikörperreaktionen gegen MSRV-1 zu optimieren, wurden Octapeptide, die sich der Reihe nach um eine Aminosäure verschoben und die Gesamtheit der durch POL2B bestimmten Sequenz abdecken, nach dem unten beschriebenen Protokoll synthetisiert.
Die chemische Synthese von überlappenden Octapeptiden, die die Sequenz der Aminosäuren 61–110, die in der Bezeichnung SEQ ID Nr. 39 dargestellt ist, abdecken, erfolgte auf einer aktivierten Cellulosemembran gemäß der Technik von BERG und Mitarbeitern (1989. J. Ann. Chem. Soc., 111, 8024–8026), die von Cambridge Research Biochemicals unter der Handelsbezeichnung Spotscan im Handel erhältlich ist. Mit dieser Technik kann man eine Vielzahl von Peptiden gleichzeitig synthetisieren und analysieren.
Die Synthese wird mit veresterten Aminosäuren durchgeführt, deren α-Aminogruppe durch eine FMOC-Gruppe (Nova Biochem) und die Seitengruppen durch Schutzgruppen wie Trityl, t-Butylester oder t-Butylether geschützt sind. Die veresterten Aminosäuren werden in N-Methylpyrrolidon (NMP) in einer Konzentration von 300 nM vorgelöst, und 0,9 μl werden als Bromphenolblau-Aufgabeflecken aufgegeben. Nach 15minütiger Inkubation werden nochmals Aminosäuren aufgegeben, wonach sich eine weitere 15minütige Inkubation anschließt. Wenn die Kopplung zwischen zwei Aminosäuren korrekt erfolgt, so beobachtet man eine Farbänderung (Umschlag von blau nach grünlich-gelb). Nach dreimaligem Waschen mit DMF folgt ein Acetylierungsschritt mit Essigsäureanhydrid. Anschließend werden die im Verlauf der Synthese aminierten endständigen Gruppen der Peptide mit 20% Piperidin in DMF entschützt. Die Aufgabeflecken werden mit einer 1%igen Bromphenolblaulösung in DMF erneut ge färbt, dreimal mit Methanol gewaschen und getrocknet. Die Gesamtheit dieser Arbeitsschritte stellt einen Additionszyklus von einer Aminosäure dar, und dieser Zyklus wird solange wiederholt, bis die Synthese beendet ist. Wenn alle Aminosäuren angefügt sind, wird die NH₂-terminale Gruppe der letzten Aminosäure mit 20% Piperidin in DMF entschützt und mit Essigsäureanhydrid acetyliert. Die Schutzgruppen der Seitenkette werden mit einer Mischung von Dichlormethan/Trifluoressigsäure/Triisobutylsilan (5 ml/5 ml/250 μl) entfernt. Die Immunreaktivität der Peptide wird anschließend mittels ELISA geprüft.
Nach der doppelten Synthese von unterschiedlichen Octapeptiden an zwei unterschiedlichen Membranen werden diese mit Methanol gespült und mit TBS (Tris 0,1 M pH 7,2) gewaschen und anschließend eine Nacht lang bei Raumtemperatur in Sättigungspuffer inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit TBS-T (Tris 0,1 M pH 7,2 – 0,05% Tween 20) wird eine Membran mit einer 1/50fachen Verdünnung eines Referenzserums, das von einem MS-Patienten stammt, und die andere Membran mit einer 1/50fachen Verdünnung eines Pools von Seren von gesunden Kontrollen inkubiert. Die Membranen werden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen mit TBS-T wird mit einem mit β-Galactosidase markierten Konjugat gegen Human-Immunglobuline (Vertrieb durch Cambridge Research Biomedicals) in 1/200facher Verdünnung versetzt und das Ganze wird zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen der Membrane mit 0,05%igem TBS-T und mit PBS wird die Immunreaktivität bei verschiedenen Flecken durch Versetzen mit 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-galactopyranosid in Kalium entwickelt. Die Färbungsintensität der Flecken wird qualitativ mit einem Wert von 0 bis 5 wie in den beigelegten 31 bis 33 geschätzt.
Auf diese Weise kann man zwei immundominate Regionen an jedem Ende des Peptids POL2B bestimmen, die den Amino säuresequenzen 65–75 (SEQ ID Nr. 41) bzw. 92–109 (SEQ ID Nr. 42) gemäß 34 entsprechen und die zwischen den Octapeptiden Phe-Cys-Ile-Pro-Val-Arg-Pro-Asp (FCIPVRPD) und Arg-Pro-Asp-Ser-Gln-Phe-Leu-Phe (RPDSQFLF) bzw. Thr-Val-Leu-Pro-Gln-Gly-Phe-Arg (TVLPQGFR) und Leu-Phe-Gly-Gln-Ala-Leu-Ala-Gln (LFGQALAQ) umfaßt sind, sowie eine weniger reaktionsfähige, jedoch aufgrund der Tatsache, daß sie mit dem Kontrollserum keinerlei Hintergrund produziert, offenbar spezifischere Region, die durch die Octapeptide Leu-Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu (LFAFEDPL) (SEQ ID Nr. 43) und Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu-Asn (FAFEDPLN) (SEQ ID Nr. 44) dargestellt wird, bestimmen.
Mit diesen Regionen lassen sich neue Peptide bestimmen, die gemäß den üblichen Techniken stärker spezifisch und immunreaktionsfähig sind.
Auf diese Weise kann man aufgrund der von den Erfindern gemachten Entdeckungen und eingesetzten Methoden ein Diagnostikum der Infektion und/oder Reaktivierung von MSRV-1 herstellen und eine Therapie bei MS aufgrund der Wirksamkeit, den Nachweis dieser Agentien in biologischen Flüssigkeiten von Patienten zu "negativieren" auswerten. Weiterhin könnte der frühzeitige Nachweis bei Patienten, die noch keine neurologischen MS-Symptome aufweisen, ermöglichen, mit einer Behandlung zu beginnen, die umso wirksamer auf die darauffolgende klinische Entwicklung ist als sie dem Läsionsstadium, das dem Auftreten von neurologischen Problemen entspricht, vorangeht. Bis heute kann keine MS-Diagnose vor dem Beginn einer neurologischen Läsionssymptomatologie erfolgen, und es wird daher mit keiner Behandlung begonnen, bevor ein klinisches Bild, das bereits beträchtliche Läsionen des Zentralnervensystems beinhaltet, auftritt. Die Diagnose einer Infektion und/oder Reaktivierung von MSRV-1 und/oder MSRV-2 beim Menschen ist daher ausschlaggebend, und die vorliegende Erfindung stellt die Mittel hierzu bereit.
Zusätzlich zur Diagnose der Infektion und/oder Reaktivierung von MSRV-1 ist es daher möglich, eine MS-Therapie aufgrund ihrer Wirksamkeit den Nachweis dieser Agentien in biologischen Flüssigkeiten von Patienten zu "negativisieren", auszuwerten.
BEISPIEL 12: GEWINNUNG EINES KLONS LB19, DER EINEN TEIL DES GAG-GENS DES RETROVIRUS MSRV-1 ENTHÄLT
Es wurde eine PCR-Technik, die sich von der von Gonzalez-Quintial R et al. (19) und PLAZA et al (25) veröffentlichten Technik ableitet, eingesetzt. Ausgehend von Gesamt-RNAs, die von einer wie oben beschrieben aufgereinigten Virionenfraktion extrahiert wurden, wurde cDNA mit Hilfe eines 3'-spezifischen Primers (SEQ ID Nr. 64) des zu amplifizierenden Genoms synthetisiert, und zwar mit der EXPAND^TM REVERSE TRANSCRIPTASE (BOEHRINGER MANNHEIM).
Nach der Reinigung wird mit Hilfe des "Terminal transferase kit", das von der Firma Boehringer Mannheim vertrieben wird, nach den Anweisungen des Herstellers ein Poly-G-Schwanz an das 5'-Ende der cDNA angefügt.
Mit Hilfe der folgenden 5'- und 3'-Primer
wird eine "anchored" PCR durchgeführt. Anschließend wird mit den folgenden 5'- und 3'-Primern:
eine "semi-nested anchored" PCR durchgeführt.
Die PCR-Produkte wurden nach Aufreinigung an Agarosegel nach traditionellen Verfahren (17) aufgereinigt und anschließend in 10 Mikrolitern destilliertem Wasser suspendiert. Eine der Eigenschaften der Taq-Polymerase besteht darin, ein Adenin an das 3'-Ende von jedem der beiden DNA-Stränge anzufügen, wobei die erhaltene DNA direkt mit dem TA Cloning^TM Kit (British Biotechnology) in ein Plasmid insertiert wurde. Die 2 μl DNA-Lösung wurden mit 5 μl sterilem destilliertem Wasser, 1 μl 10fach konzentriertem "10X LIGATION BUFFER" Ligationspuffer, 2 μl "pCR^TM VECTOR" (25 ng/ml) und 1 μl "T4 DNA LIGASE" vermischt. Diese Mischung wurde über Nacht bei 12°C inkubiert. Die folgenden Schritte wurden gemäß den Anweisungen des TA Cloning°-Kits (British Biotechnology) durchgeführt. Am Ende dieses Vorgangs wurden die weißen Kolonien der rekombinanten Bakterien (white) vereinzelt und anschließend kultiviert und damit eine Extraktion der aufgenommenen Plasmide nach dem sogenannten "miniprep"-Verfahren durchgeführt (17). Das Plasmidpräparat von jeder rekombinanten Kolonie wurde mit einem entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten und auf Agarosegel analysiert. Die Plasmide mit einem Insert, das nach Markierung des Gels mit Ethidiumbromid unter UV-Licht nachgewiesen wurde, wurden nach Hybridisierung mit einem komplementären Primer des auf dem Klonierungsplasmid des TA Cloning^®-Kits vorhandenen Sp6-Promoters für die Sequenzierung des Inserts selektiert. Die Reaktion vor der Sequenzierung wurde dann nach dem empfohlenen Verfahren für die Verwendung des Sequenzierkits "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, Nr. 401384) durchgeführt, und die automatische Sequenzierung wurde mit dem Gerät "Automatic Sequencer, Modell 373 A" von Applied Biosystems nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Die PCR-Amplifikation gemäß der oben beschriebenen Technik wurde auf eine cDNA angewandt, die ausgehend von Nukleinsäuren von Fraktionen von auf Saccharosegra dient nach dem von H. Perron (13) beschriebenen Verfahren aufgereinigten infektiösen Partikeln synthetisiert wurde, und zwar ausgehend von Kulturüberständen von B-Lymphozyten eines MS-Patienten, die mit dem Stamm B95 des Epstein-Barr-Virus (EBV) immortalisiert wurden, und Retroviruspartikel, die mit einer reversen Transkriptaseaktivität wie von Perron und Mitarbeitern (3) und in den französischen Patentanmeldungen MS 10, 11 und 12 beschrieben wurde, assoziiert sind, exprimieren. Klon LB19, dessen Sequenz mit SEQ ID Nr. 59 bezeichnet wird, ist in 35 dargestellt.
Mit diesem Klon kann man mit dem zuvor sequenzierten Klon GM3 und dem Klon G + E + A (vgl. Beispiel 15) eine 690 Basenpaare lange Region definieren, die einen wesentlichen Teil des gag-Gens des Retrovirus MSRV-1 wie in 36 dargestellt, bildet. Diese Sequenz mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 88 wird ausgehend von unterschiedlichen Klonen, die sich an ihren Enden überlappen, zusammengestellt. Diese Sequenz trägt die Bezeichnung MSRV-1-"gag*"-Region. In 36 ist ein mögliches Leseraster mit der Translation in Aminosäuren unterhalb der Nukleinsäuresequenz dargestellt.
BEISPIEL 13: GEWINNUNG EINES KLONS FBD13, DER EINE MIT DEM RETROVIRUS MSRV-1 VERWANDTE REGION DES pol-GENS UND EINE SCHEINBAR UNVOLLSTÄNDIGE ENV-REGION ENTHALTEND EIN MÖGLICHES LESERASTER (ORF) FÜR EIN GLYKOPROTEIN ENTHÄLT.
Extraktion von Virus-RNAs: die RNAs wurden nach der im folgenden kurz beschriebenen Methode extrahiert.
Ein "Pool" von Kulturüberständen von B-Lymphozyten von MS-Patienten (650 ml) wird 30 Minuten lang bei 10000 g zentrifugiert. Das erhaltene Virus-Pellet wird in 300 Mikrolitern PBS/10 mM MgCl₂ suspendiert. Das Material wird 30 Minuten lang bei 37°C mit einer Mischung von DNase (100 mg/ml)/RNase (50/mg/ml) und anschließend 30 Minuten bei 46°C mit Proteinase K (50/mg/ml) behandelt.
Die Nukleinsäuren werden mit einem Volumen einer auf 60°C erhitzten Mischung von Phenol/0,l%(V/V)SDS extrahiert und anschließend nochmals mit einem Volumen Phenol/Chloroform (1/1; V/V) extrahiert.
Die Fällung des Materials erfolgt mit 2,5 V Ethanol in Gegenwart von 0,1 V Natriumacetat, pH 5,2. Das nach Zentrifugation erhaltene Pellet wird in 50 Mikrolitern sterilem DEPC-Wasser suspendiert.
Die Probe wird nochmals 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 50 mg/ml "RNase free" DNase behandelt, mit einem Volumen Phenol/Chloroform extrahiert und in Gegenwart von Natriumacetat und Ethanol gefällt.
Die erhaltene RNA wird durch Bestimmung der OD bei 260 nm quantitativ bestimmt. Das Vorliegen von MSRV-1 und das Fehlen von kontaminierender DNA wird mit einer PCR und einer RT-PCR, die für MSRV-1 spezifisch ist, kontrolliert, und zwar in Kombination mit einem für das MSRV-1-Genom spezifischen ELOSA-Tests.
cDNA-Synthese:
5 mg RNA werden für die Synthese einer cDNA eingesetzt, und zwar unter Verwendung eines polyDT-Oligonukleotid-Primers gemäß den Anweisungen des Kits "cDNA Synthesis Module" (Nr. RPN 1256, Amersham), wobei gewisse Modifikationen durchgeführt wurden: Die reverse Transkription wird statt wie empfohlen bei 42°C bei 45°C durchgeführt.
Das Syntheseprodukt wird durch doppelte Extraktion und doppelte Aufreinigung nach den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt.
Das Vorliegen von MSRV-1 wird mit einer MSRV-1-PCR in Assoziation mit einem für das MSRV-1-Genom spezifischen ELOSA-Test verifiziert.
"Long Distance PCR": (LD-PCR)
Für den LD-PCR-Schritt (Expand Long Template System; Boehringer (Nr. 1681 842)) werden 500 mg cDNA eingesetzt.
Es werden mehrere Oligonukleotidpaare eingesetzt. Darunter befindet sich das Paar, das von den folgenden Primern definiert wird:
Die Amplifikationsbedingungen lagen folgendermaßen:
10 Sekunden bei 94°C
30 Sekunden bei 56°C
5 Minuten bei 68°C;
10 Zyklen sowie anschließend 20 Zyklen mit jeweils 20 weiteren Sekunden pro Zyklus auf die Elongationszeit. Nach dieser ersten Amplifikation wird mit 2 Mikrolitern des Amplifikationsprodukts eine zweite Amplifikation unter denselben Bedingungen wie oben durchgeführt.
Die LD-PCRs werden in einem PCR-Gerät von Perkin, Modell 9600, in dünnwandigen Mikroröhrchen durchgeführt (Boehringer).
Die Amplifikationsprodukte werden mittels Elektrophorese von 1/5 des Amplifikationsvolumens (10 Mikroliter) in 1%igem Agarosegel kontrolliert. Für das oben beschriebene Primerpaar erhält man eine Bande von ungefähr 1,7 kB.
Klonierung des amplifizierten Fragments:
Das PCR-Produkt wurde dadurch gereinigt, daß es auf ein präparatives Agarosegel und anschließend auf eine Costar-Säule (Spin; D. Dutcher) aufgegeben wurde; dies erfolgte nach den Anweisungen des Zulieferers.
2 Mikroliter der gereinigten Lösung werden gemäß den Anweisungen des Zulieferers (TA Cloning Kit; British Biotechnology)) mit 50 ng PCRII-Vektor vereinigt.
Der erhaltene rekombinate Vektor wird durch Transformation von kompetenten DH5aF'-Bakterien isoliert. Die Bakterien werden aufgrund ihrer Resistenz gegen Ampicillin und Verlust des Xgal-Metabolismus (=weiße Kolonien) selektiert. Die molekulare Struktur des rekombinanten Vektors wird durch Plasmid-Miniprep und Hydrolyse durch das Enzym EcoR1 bestätigt.
Es wird FBd13, ein für alle diese Kriterien positiver Klon, ausgewählt. Eine Präparation im größeren Maßstab des rekombinanten Plasmids wurde mit Hilfe des Kits Midiprep Quiagen (Nr. 12243) gemäß den Anweisungen des Zulieferers durchgeführt.
Die Sequenzierung des Klons FBd13 erfolgt mit dem Kit Prism Ready Amplitaq ES dye terminator Perkin (Nr. 402119) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Sequenzreaktionen werden auf einen Sequenzierautomaten von Perkin, Typ 377 oder 373A, aufgegeben. Die Sequenzierungsstrategie besteht in einem "Gene Walking", das an den beiden Strängen des Klons FBd13 durchgeführt wird.
Die Sequenz des Klons FBd13 wird mittels SEQ ID Nr. 58 identifiziert.
In 37 ist die Sequenzhomologie zwischen dem Klon FBd13 und dem Retrovirus HSERV-9 in der Graphik durch einen durchgezogenen Strich für jegliche partielle Homologie von gleich oder größer 70% dargestellt. Man findet, daß Homologien zwischen den flankierenden Regionen des Klons (mit dem pol-Gen in 5'-Richtung und dem env-Gen und anschließend dem LTR in 3'-Richtung) existieren, daß die innenliegende Region jedoch völlig unterschiedlich ist und keinerlei Homologie, nicht einmal eine schwache Homologie, mit dem env-Gen von HSERV-9 aufweist. Außerdem scheint es, daß der Klon FBd13 eine längere "env"-Region enthält als für das defiziente HSERV-9-Endogen beschrieben wurde; so findet man, daß die abweichende innenliegende Region ein "Insert" zwischen den Regionen mit partieller Homologie zu den definzienten HSERV-9-Genen darstellt.
Diese zusätzliche Sequenz beschreibt ein potentielles ORF mit der Bezeichnung ORF B13, das durch seine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 87 dargestellt ist.
Die molekulare Struktur des Klons FBd13 wurde mit Hilfe der Software GeneWork und der Dateien Genebank und SwissProt analysiert.
Es wurden 5 Glykosylierungsstellen gefunden.
Das Protein weist keine signifikante Homologie mit bereits bekannten Sequenzen auf.
Vermutlich stammt dieser Klon von einer Rekombination mit einem endogenen Retroviruselement (ERV), die mit der Replikation von MSRV-1 gekoppelt ist.
Solch ein Phänomen bedingt die Expression von Polypeptiden, nämlich endogenen Retrovirus-Proteinen, die nicht unbedingt vom Immunsystem toleriert werden. Ein solches Schema der aberranten Expression von endogenen Elementen, die mit MSRV-1 verwandt sind und/oder von diesem induziert werden, ist imstande, aberrante Antigene zu vermehren und daher zur Induktion von Orthoimmunvorgängen, wie man sie bei MS beobachtet, beizutragen. Es handelt sich offenbar um ein neuartiges Phänomen, das bis dato noch nicht beschrieben wurde. Die Abfrage von Nukleinsäuredateien, die in der Version Nr. 19 (1996) der Software "Entrez" (NCBI, NIH, Bethesda, USA) verfügbar sind, hat es nämlich nicht ermöglicht, eine bekannte homologe Sequenz, die die Gesamtheit der env-Region dieses Klons umfaßt, zu identifizieren.
BEISPIEL 14: GEWINNUNG EINES KLONS FP6 ENTHALTEND EINEN TEIL DES pol-GENS, MIT EINER CODIERREGION FÜR DAS ENZYM REVERSE TRANSKRIPTASE MIT HOMOLOGIE ZUM KLON POL* MSRV-1, UND EINER 3'pol-REGION, DIE VON DEN FÜR DIE KLONE POL*, tpol, FBd3, JLBc1 UND JLBc2 BESCHRIEBENEN ÄQUIVALENTEN SEQUENZEN ABWEICHT.
An der vom Plasma eines MS-Patienten extrahierten Gesamt-RNA wurde eine 3'RACE durchgeführt. Ein Plasma einer gesunden Kontrolle, das unter denselben Bedingungen behandelt wurde, wurde als Negativkontrolle eingesetzt. Die cDNA-Synthese erfolgte mit dem folgenden modifizierten Oligo-dT-Primer:
und der reversen Transkriptase "Expand RT" von Boehringer unter den von dieser Firma empfohlenen Bedingungen. Mit dem Enzym Klentaq (Clontech) wurde eine PCR unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 5 Minuten bei 94°C, danach 1 Minute bei 93°C, 1 Minute bei 58°C, 3 Minuten bei 68°C über 40 Zyklen und 8 Minuten bei 68°C mit einem Reaktionsendvolumen von 50 μl.
Für die PCR verwendete Primer:

– 5'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 69 5' GCC ATC AAG CCA CCC AAG AAC TCT TAA CTT 3';
– 3'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 68 (der gleiche wie für die cDNA)

Eine zweite, sogenannte "semi-nested" PCR, wurde mit einem 5'-Primer, der innerhalb der bereits amplifizierten Region lag, durchgeführt. Diese zweite PCR wurde unter den gleichen Versuchsbedingungen wie denjenigen, die bei der ersten PCR verwendet wurden, angewandt, und zwar unter Verwendung von 10 μl Amplifikationsprodukt aus der ersten PCR.
Primer, die für die "half-nested" PCR verwendet wurden:

– 5'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 70 5' CCA ATA GCC AGA CCA TTA TAT ACA CTA ATT 3';
– 3'-Primer, mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 68 (der gleiche wie für die cDNA)

Die Primer SEQ ID NR. 69 und SEQ ID Nr. 70 sind für die pol^*-Region spezifisch: Positionen 403 bis 422 bzw. 641 bis 670.
Ausgehend von extrazellulärer RNA, die vom Plasma eines MS-Patienten extrahiert wurde, wurde so ein Amplifikationsprodukt erhalten. Beim Plasma einer gesunden Kontrolle wurde das entsprechende Fragment nicht beobachtet. Dieses Amplifikationsprodukt wurde folgendermaßen kloniert.
Die amplifizierte DNA wurde mit Hilfe des "TA Cloning^TM"-Kits in ein Plasmid insertiert. Die 2 μl DNA-Lösung wurden mit 5 μl sterilem destilliertem Wasser, 1 μl eines 10fach konzentrierten Ligationspuffers mit der Bezeichnung "10X LIGATION BUFFER", 2 μl "pCR^TM VEC-TOR" (25 ng/ml) sowie 1 μl "T4 DNA LIGASE" vermischt. Diese Mischung wurde 1 Nacht bei 12°C inkubiert. Die folgenden Schritte wurden entsprechend den Anweisungen des "TA Cloning^®"-Kits (British Biotechnology) durchgeführt. Am Ende des Vorgangs wurden die weißen Kolonien der rekombinanten Bakterien (white) vereinzelt und anschließend kultiviert und damit eine Extraktion der aufgenommenen Plasmide nach dem sogenannten "Miniprep"-Verfahren (17) durchgeführt. Das Plasmidpräparat von jeder rekombinanten Kolonie wurde mit einem entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten und auf Agarosegel analysiert. Die Plasmide mit einem Insert, das nach Markierung des Gels mit Ethidiumbromid unter UV-Licht nachgewiesen wurde, wurden nach Hybridisierung mit einem komplementären Primer des auf dem Klonierungsplas mid des "TA Cloning^®"-Kit vorhandenen Sp6-Promoters auf die Sequenzierung des Inserts selektiert. Die Reaktion vor der Sequenzierung wurde dann nach dem empfohlenen Verfahren für die Verwendung des Sequenzierkits "Prism Ready Reaktion Kit Dye Deoxyterminator Cycle Sequencing Kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) durchgeführt, und die automatische Sequenzierung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers an dem Gerät "Automatic Sequencer, Modell 373 A" Applied Biosystems durchgeführt.
Mit dem erhaltenen Klon mit der Bezeichnung FP6 kann man eine 467 Bp große Region, die zu 89% zu der pol*-Region des Retrovirus MSRV-1 homolog ist, und eine 1167 Bp große Region, die zu 64% zu der pol-Region von ERV-9 homolog ist, definieren (Nr. 1634 bis 2856).
Klon FP6 ist in 38 mit seiner Nukleotidsequenz mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 61 dargestellt. Die drei möglichen Leseraster diese Klons sind durch ihre Aminosäuresequenz unterhalb der Nukleotidsequenz dargestellt.
BEISPIEL 15: GEWINNUNG EINER REGION MIT DER BEZEICHNUNG G + E + A, DIE EIN ORF FÜR EINE RETROVIRUS-PROTEASE ENTHÄLT, DURCH PCR-AMPLIFIKATION DER NUKLEOTIDSEQUENZ ZWISCHEN DER 5'-REGION, DIE DURCH DEN KLON "GM3" DEFINIERT IST, UND DER 3'-REGION, DIE DURCH DEN KLON POL* DEFINIERT IST, AUSGEHEND VON RNA, DIE VON EINEM POOL VON PLASMEN VON MS-PATIENTEN EXTRAHIERT WURDE.
Für die Amplifikation von Retrovirus-RNA, die von Virionen stammt, welche im Plasma von MS-Patienten vorliegen, wurden spezifische Oligonukleotide eingesetzt, die für bereits von der Anmelderin identifizierte MSRV-1-Sequenzen spezifisch sind. Kontrollreaktionen wurden durchgeführt, um das Vorhandensein von Kontaminanten zu überprüfen (Reaktion mit Wasser). Die Amplifikation besteht aus einem RT-PCR-Schritt, gefolgt von einer "nested" PCR. Für die Amplifikation von drei überlap penden Regionen (mit der Bezeichnung G, E und A) an den von den Sequenzen der Klone GM3 und pol*, die oben beschrieben wurden, definierten Regionen, wurden Primerpaare definiert.
"Semi-nested" RT-PCR für die Amplifikation der Region G:

– im ersten RT-PCR-Zyklus werden die folgenden Primer eingesetzt: Primer 1: SEQ ID Nr. 71 (sense) Primer 2: SEQ ID Nr. 72 (antisense)
– im zweiten PCT-Zyklus werden die folgenden Primer eingesetzt: Primer 1: SEQ ID Nr. 73 (sense) Primer 4: SEQ ID Nr. 74 (antisense)

"Semi-nested" RT-PCR für die Amplifikation der Region E:

– im ersten RT-PCR-Zyklus werden die folgenden Primer eingesetzt: Primer 5: SEQ ID Nr. 75 (sense) Primer 6: SEQ ID Nr. 76 (antisense)
– im zweiten PCT-Zyklus werden die folgenden Primer eingesetzt: Primer 7: SEQ ID Nr. 77 (sense) Primer 8: SEQ ID Nr. 78 (antisense)

"Semi-nested" RT-PCR für die Amplifikation der Region A:

– im ersten RT-PCR-Zyklus werden die folgenden Primer eingesetzt: Primer 9: SEQ ID Nr. 79 (sense) Primer 10: SEQ ID Nr. 80 (antisense)
– im zweiten PCT-Zyklus werden die folgenden Primer eingesetzt: Primer 9: SEQ ID Nr. 81 (sense) Primer 11: SEQ ID Nr. 82 (antisense)

Die Lage der Primer und der Regionen G, E und A, die sie definieren, lautet:
Die Sequenz der von den unterschiedlichen Klonen G, E und A definierten Region wurde nach Klonierung und Sequenzierung der Produkte der "nested" Amplifikation bestimmt.
Die Klone G, E und A wurden mittels PCR mit dem 5'-Primer 1 des Fragments G und dem 3'-Primer 11 des Fragments A, die oben beschrieben sind, zusammengefügt. Ein G + E + A-Fragment mit einer Größe von ungefähr 1580 Bp wurde amplifiziert und in ein Plasmid mit Hilfe des Kits "TA Cloning" (Warenzeichen) eingefügt. Die Sequenz des Amplifikationsprodukts, das G + E + A entspricht, wurde bestimmt und die überlappenden Bereiche G + E und E + A wurden analysiert. Die Sequenz ist in 39 dargestellt und entspricht der Sequenz SEQ ID Nr. 89.
In Region E wurde ein für eine Protease des Retrovirus MSRV-1 codierendes Leseraster gefunden. Die Aminosäuresequenz der Protease mit der Bezeichnung Sequenz SEQ ID Nr. 90 ist in 40 dargestellt.
BEISPIEL 16: GEWINNUNG EINES KLONS LTRGAG12, DER MIT EINEM ENDOGENEN RETROVIRUS-ELEMENT (ERV), DAS MSRV-1 ÄHNLICH IST, VERWANDT IST, IN DER DNA EINER MSLYMPHOBLASTOID-LINIE, DIE VIRIONEN PRODUZIERT UND DAS RETROVIRUS MSRV-1 EXPRIMIERT
An DNA, die von einer Lymphoblastoidlinie (mit dem Virus EBV, Stamm B95, wie oben beschrieben und fachbekannt immortalisierte B-Lymphozyten), die das Retrovirus MSRV-1 produziert und von peripheren Blutlymphozyten eines MS-Patienten stammt, extrahiert wurde, wurde eine "nested" PCR durchgeführt.
Im ersten PCR-Schritt werden die folgenden Primer eingesetzt:
Dieser Schritt umfaßt 35 Amplifikationszyklen unter den folgenden Bedingungen: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 54°C und 4 Minuten bei 72°C.
Im zweiten PCR-Schritt werden die folgenden Primer eingesetzt:
Dieser Schritt umfaßt 35 Amplifikationszyklen unter den folgenden Bedingungen: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 54°C und 4 Minuten bei 72°C.
Die PCR-Produkte wurden nach Aufreinigung an Agarosegel nach traditionellen Verfahren (17) aufgereinigt und anschließend in 10 Mikrolitern destilliertem Wasser suspendiert. Eine der Eigenschaften der Taq-Polymerase besteht darin, ein Adenin an das 3'-Ende von jedem der beiden DNA-Stränge anzufügen, wobei die erhaltene DNA direkt mit dem TA Cloning^TM Kit (British Biotechnology) in ein Plasmid insertiert wurde. Die 2 μl DNA-Lösung wurden mit 5 μl sterilem destilliertem Wasser, 1 μl eines 10fach konzentrierten Ligationspuffers mit der Bezeichnung "10X LIGATION BUFFER", 2 μl "pCR^TM VECTOR" (25 ng/ml) sowie 1 μl "T4 DNA LIGASE" vermischt. Diese Mischung wurde 1 Nacht bei 12°C inkubiert. Die folgenden Schritte wurden entsprechend den Anweisungen des "TA Cloning^®"-Kits (British Biotechnology) durchgeführt. Am Ende dieses Vorgangs wurden die weißen Kolonien der rekombinanten Bakterien (white) vereinzelt und anschlie ßend kultiviert und damit eine Extraktion der aufgenommenen Plasmide nach dem sogenannten "miniprep"-Verfahren durchgeführt (17). Das Plasmidpräparat von jeder rekombinanten Kolonie wurde mit einem entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten und auf Agarosegel analysiert. Die Plasmide mit einem Insert, das nach Markierung des Gels mit Ethidiumbromid unter UV-Licht nachgewiesen wurde, wurden nach Hybridisierung mit einem komplementären Primer des auf dem Klonierungsplasmid des TA Cloning-Kits^® vorhandenen Sp6-Promoters für die Sequenzierung des Inserts selektiert. Die Reaktion vor der Sequenzierung wurde dann nach dem empfohlenen Verfahren für die Verwendung des Sequenzierkits "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, Nr. 401384) durchgeführt, und die automatische Sequenzierung wurde mit dem Gerät "Automatic Sequencer, Modell 373 A" von Applied Biosystems nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Auf diese Weise konnte ein mit LTRGAG12 bezeichneter Klon erhalten werden, der mit SEQ ID Nr. 60 bezeichnet wird.
Dieser Klon scheint für endogene Elemente ähnlich ERV-9, das in menschlicher DNA, insbesondere in DNA von MS-Patienten, vorliegt, und die die Expression des Retrovirus MSRV-1 stören können und daher eine Rolle in der mit dem Retrovirus MSRV-1 assoziierten Pathologie spielen könnten und als spezifischer Expressionsmarker bei der betreffenden Pathologie dienen könnten, repräsentativ zu sein.
BEISPIEL 17: NACHWEIS VON SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN GEGEN MSRV-1 IN HUMAN-SERUM
Durch Identifikation der Sequenz des pol-Gens des Retrovirus MSRV-1 und eines offenen Leserasters dieses Gens konnte man die Sequenz SEQ ID Nr. 63 in Aminosäuren einer Region dieses Gens mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 62 bestimmen.
Unterschiedliche synthetische Peptide, die Fragmenten der Proteinsequenz der von dem pol-Gen codierten reversen Transkriptase von MSRV-1 entsprechen, wurden auf ihre spezifische Antigenität gegenüber Seren von MS-Patienten und gesunden Kontrollen getestet.
Die Peptide wurden chemisch durch Festphasen-Synthese nach der Merrifield-Technik (22) synthetisiert. Die praktischen Vorgehensweisen sind wie unten beschrieben.
a) Peptidsynthese:
Die Peptide wurden mit einem Syntheseautomaten "Applied Biosystems 430A" an Phenylacetamidomethylharz (PAM)/Polystyrol/Divinylbenzol (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) synthetisiert. Die Aminosäuren werden in Form von Hydroxybenzotriazol (HOBT)-Estern gekoppelt. Die verwendeten Aminosäuren stammen von Novabiochem (Laüflerfingen, Schweiz) oder Bachem (Bubendorf, Schweiz).
Die chemische Synthese erfolgte nach einem Doppelkopplungsprotokoll mit N-Methylpyrrolidon (NMP) als Lösungsmittel. Die Peptide wurden vom Harz und von dem seitlichen Schutz gleichzeitig mit Hilfe von Fluorwasserstoffsäure (HF) in einem geeigneten Gerät (Typ I-Spaltapparat, Peptide Institute, Osaka, Japan) abgespalten.
Pro 1 g Peptidylharz werden 10 ml HF, 1 ml Anisol und 1 ml Dimethylsulfid 5 DMS eingesetzt. Die Mischung wird 45 Minuten lang bei –2°C gerührt. Anschließend wird der HF im Vakuum abgedampft. Nach intensivem Waschen mit Ether wird das Peptid vom Harz mit l0%iger Essigsäure eluiert und anschließend lyophilisiert.
Die Peptide werden mittels präparativer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an einer VYDAC-Säule des Typs C18 (250 × 21 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA) aufgereinigt. Die Elution erfolgt mittels eines Acetonitrilgradienten mit einer Durchflußrate von 22 ml/min. Die aufgefangenen Fraktionen werden durch Elution unter isokratischen Bedingungen an einer analytischen VYDAC^®-C18-Säule (250 × 4,6 mm) mit einer Durchflußrate von 1 ml/min überprüft. Die Fraktionen, die dieselbe Retentionszeit aufweisen, werden vereinigt und lyophilisiert. Die Hauptfraktion wird anschließend durch analytische Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit dem oben beschriebenen System analysiert. Das Peptid, dessen Reinheit als akzeptabel gilt, äußert sich in einem einzelnen Peak, der mindestens 95% des Chromatogramms darstellt.
Die gereinigten Peptide werden anschließend mit einem automatischen Aminosäureanalysator "Applied Biosystems 420H" analysiert, um ihre Aminosäurezusammensetzung zu überprüfen. Die Messung des (mittleren) chemischen Molekulargewichts der Peptide erfolgt mittels LSIMS-Massenspektrometrie im positiven Ionenmodus, und zwar mit einem Gerät mit doppelter Fokussierung VG. ZAB. ZSRQ in Verbindung mit einem "DEC-VAX 2000" Datenerfassungssystem (VG analytical Ltd. Manchester, Großbritannien).
Die Reaktivität der unterschiedlichen Peptide wurde mit Seren von MS-Patienten und Seren von gesunden Kontrollen geprüft. Auf diese Art und Weise konnte ein Peptid mit der Bezeichnung S24Q selektiert werden, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 63 angegeben ist und das von einer Nukleotidsequenz des pol-Gens von MSRV-1 (SEQ ID Nr. 62) codiert wird.
b) Antigene Eigenschaften:
Die antigenen Eigenschaften des Peptids S24Q wurden mit dem unten beschriebenen ELISA-Protokoll nachgewiesen.
Das lyophilisierte Peptid S24Q wurde in 10%iger Essigsäure in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Diese Stammlösung wurde in aliquote Portionen geteilt und bei +4°C für die Verwendung innerhalb von 14 Tagen aufbewahrt oder bei –20°C für die Verwendung innerhalb von 2 Monaten tiefgefroren. Ein aliquoter Teil wird in einer PBS (phosphate buffer saline) verdünnt, um zu einer Peptidendkonzentration von 5 Mikrogramm/ml zu gelangen. 100 Mikroliter dieser Verdünnung wurden in jedes Näpfchen von Nunc-Maxisorb-Mikrotiterplatten (Warenzeichen) gegeben. Die Platten werden mit einem "plate-sealer"-Klebeband verschlossen und für die Absorptionsphase des Peptids auf das Plastik zwei Stunden bei +37°C aufbewahrt. Das Klebeband wird entfernt und die Platten werden dreimal mit einem Volumen von 300 Mikrolitern einer Lösung A (1× PBS, 0,05% Tween 20^®) gewachsen, und anschließend auf Saugmaterial umgekehrt. Nach Abtropfen werden die Platten mit 250 Mikrolitern einer Lösung B (Lösung A + 10% Ziegenserum) pro Näpfchen gefüllt, dann mit einem Klebeband verschlossen und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Platten wie oben beschrieben dreimal mit Lösung A gewaschen.
Die zu prüfenden Serumproben werden zuvor mit Lösung B auf 1/100 verdünnt, und 100 Mikroliter von jedem verdünnten zu prüfenden Serum werden in die Näpfchen jeder Mikrotiterplatte gegeben. In ein Näpfchen von jeder Platte wird eine Negativkontrolle gegeben, und zwar in Form von 100 Mikrolitern Puffer B. Die mit Klebeband bedeckten Platten werden nun l½ Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Platten dreimal wie oben beschrieben mit Lösung A gewaschen. Für die IgG-Reaktion wird ein mit Peroxydase markierter Ziegen-Antikörper gegen Human-IgG (vertrieben von Jackson Immuno Research Inc.) mit Lösung B verdünnt (Verdünnung 1/10000). 100 Mikroliter der jeweiligen Verdünnung des markierten Antikörpers werden nun in jedes Näpfchen von Mikrotiterplatten gegeben, und die mit Klebeband verschlossenen Platten werden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Platten wieder wie zuvor beschrieben gewaschen. Parallel dazu wird das Substrat der Peroxydase gemäß den Anweisungen der bioMérieux-Kits hergestellt. 100 Mikroliter Substratlösung werden in jedes Näpfchen gegeben, und die Platten werden lichtgeschützt 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Sobald sich die Farbreaktion stabilisiert hat, werden 50 Mikroliter Color 2 (Handelsname, bioMérieux) in jedes Näpfchen gegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Platten werden sofort in ein spektrophotometrisches ELISA-Plattenlesegerät eingesetzt und die optische Dichte (OD) von jedem Näpfchen wird bei einer Wellenlänge von 492 nm abgelesen.
Die serologischen Proben werden in zweifacher oder dreifacher Wiederholung aufgegeben, und die optische Dichte (OD), die dem geprüften Serum entspricht, wird dadurch berechnet, daß man den Mittelwert der für ein- und dieselbe Probe bei ein- und derselben Verdünnung erhaltenen OD-Werte berechnet.
Der Netto-OD-Wert von jedem Serum entspricht dem mittleren OD-Wert des Serums, von dem der mittlere OD-Wert der Negativkontrolle (Lösung B: PBS, 0,05% Tween 20^®, 10% Ziegenserum) abgezogen wird.
c) Nachweis von IgG-Antikörpern gegen MSRV-1 (S24Q) mittels ELISA:
Für die Untersuchung auf das Vorhandensein von spezifischen IgG-Antikörpern gegen MSRV-1 im Serum von 15 Patienten, für die gemäß den Kriterien von Poser (23) eine MS-Diagnose von "sicher" oder "wahrscheinlich" erstellt wurde sowie von 15 gesunden Kontrollen (Blutspendern) wurde die oben beschriebene Technik mit dem Peptid S24Q eingesetzt.
In 41 sind die Ergebnisse von jedem Serum, das mit einem Anti-IgG-Antikörper geprüft wurde, dargestellt. Jeder senkrechte Balken bedeutet die optische Netto-Dichte (OD bei 492 nm) eines geprüften Serums. Die Ordinatenachse gibt die Netto-OD am oberen Ende der vertikalen Balken an. Die 15 ersten vertikalen Balken, die links von der gestrichelten vertikalen Linie liegen, stellen die Seren von 15 gesunden Kontrollen (Blutspendern) dar, und die 15 vertikalen Balken, die rechts von der vertikalen gestrichelten Linie liegen, stellen die Seren von 15 geprüften MS-Fällen dar. Die Grafik ermöglicht das Identifizieren von 2 Kontrollen, deren OD-Wert über den gruppierten Werten der Kontrollpopulation liegt. Diese Werte können das Vorliegen von spezifischen IgGs bei nichtkranken seropositiven Patienten darstellen. Es wurden daher zwei Methoden ausgewertet, um den statistischen Schwellenwert für das Positivsein des Tests zu bestimmen.
Der Mittelwert der Netto-OD-Werte der Kontrollen, darunter auch der Kontrollen mit erhöhten Netto-OD-Werten, beträgt 0,129 und die Standardabweichung beträgt 0,06. Ohne die 2 Kontrollen, deren OD-Werte größer 0,2 sind, beträgt der Mittelwert der "Negativkontrollen" 0,107 und die Standardabweichung 0,03. Eine theoretische Positivitätsschwelle kann gemäß der folgenden Formel errechnet werden: Schwellenwert (Mittelwert der Netto-OD-Werte der seronegativen Kontrollen) + (2 oder 3 × Standardabweichung der Netto-OD-Werte der seronegativen Kontrollen).
Im ersten Fall wird angenommen, daß nichtkranke Seropositive vorliegen und daß der Schwellenwert gleich 0,11 + (3 × 0,03) = 0,20 beträgt. Die negativen Ergebnisse stellen einen unspezifischen "Hintergrund" des Vorhandenseins von Antikörpern, die spezifisch gegen ein Epitop des Peptids gerichtet sind, dar.
Im zweiten Fall beträgt, wenn die Gesamtheit der Kontrollen, die aus Blutspendern in offenbar guter Gesundheit besteht, als Bezugsbasis angenommen wird und ohne daß die Seren von a-priori Seropositiven ausgeschlossen werden, die Standardabweichung der "Nicht-MS-Kontrollen" 0,116 beträgt. Der Schwellenwert beträgt nun 0,13 + (3 × 0,06) = 0,31.
Gemäß dieser Analyse ist der Test für MS spezifisch. Diesbezüglich stellt man fest, daß der Test für MS spezifisch ist, da wie in Tabelle 1 dargestellt keine Kontrolle einen Netto-OD-Wert oberhalb dieses Schwellenwerts aufweist. Dieses Ergebnis spiegelt also die Tatsache wider, daß die Antikörpertiter bei MS-Patienten hauptsächliche stärker erhöht sind als diejenigen von gesunden Kontrollen, die mit MSRV-1 in Kontakt gekommen sind.
In Abhängigkeit der ersten Berechnungsweise und wie 41 und in der zugehörigen Tabelle 3 dargestellt, führen 6 von 15 MS-Seren zu einem positiven Ergebnis (OD gleich oder größer 0,2), daß das Vorliegen von IgGs, die spezifisch gegen das Peptid S24Q, also gegen einen Teil des Enzyms reverser Transkriptase des Retrovirus MSRV-1, das von dessen pol-Gen codiert wird, und daher gegen das Retrovirus MSRV-1 gerichtet sind, angibt.
So haben ungefähr 40% der geprüften MS-Patienten gegen einen Epitop, der auf dem Peptid S24Q liegt, reagiert und weisen zirkulierende IgGs, die gegen dieses Peptid gerichtet sind, auf.
Zwei offenbar gesunde Blutspender von 15 ergeben ein positives Resultat. So scheint es, daß ungefähr 13% der nichtkranken Bevölkerung in Kontakt mit einem Epitop auf dem Peptid S24Q gekommen sein können, und zwar unter Bedingungen, die zu einer aktiven Immunisierung geführt haben und die sich durch das Verbleiben von spezifischen Seren-IgGs ausdrücken. Diese Bedingungen sind mit einer Immunisierung gegen die reverse Transkriptase des Retrovirus MSRV-1 bei Infektion mit (und/oder Reak tivierung des) Retrovirus MSRV-1 kompatibel. Das Fehlen einer offensichtlichen neurologischen Pathologie, die bei diesen seropositiven Kontrollen MS auslöst, kann anzeigen, daß es sich um gesunde Träger handelt, die nach Immunisierung ein infektiöses Virus eliminiert haben oder daß sie eine Population von risikobehafteten chronischen Trägern darstellen. Die Tatsache, daß die epidemiologischen Daten zeigen, daß ein in der Umwelt von Regionen mit starkem MS-Vorkommen vorhandenes pathogenes Agens der Grund für diese Krankheit sein kann, impliziert, daß ein Teil der MS-freien Population zwingenderweise in Kontakt mit so einem pathogenen Agens gewesen sein muß. Es wurde gezeigt, daß das Retrovirus MSRV-1 ganz oder teilweise dieses "pathogene Agens" darstellt, das MS bedingt, und daß es daher normal ist, daß Kontrollen, die einer gesunden Population entnommen wurden, Antikörper des IgG-Typs gegen Komponenten des Retrovirus MSRV-1 aufweisen.

Schließlich kann der Nachweis von Antikörpern gegen S24Q bei nur einem von zwei geprüften MS-Fällen die Tatsache widerspiegeln, daß dieses Peptid kein immundominates Epitop von MSRV-1 darstellt, daß Variationen zwischen einzelnen Stämmen zu einer Immunisierung gegen ein Peptidmotiv, das innerhalb derselben Region abweicht, induzieren können oder auch daß die Evolution der Krankheit und die durchgeführten Behandlungen im Verlauf der Zeit die Antikörperreaktion gegen das Peptid S24Q modulieren können. TABELLE NR. 3

KONTROLLEN	MS-Fälle
0,101	0,136
0,058	0,391
0,126	0,37
0,131	0,119
0,105	0,267
0,294	0,141
0,116	0,102
0,088	0,18
0,105	0,411
0,172	0,164
0,137	0,049
0,223	0,644
0,08	0,268
0,073	0,065
0,132	0,074

MITTELWERT 0,129
STANDARDABWEICHUNG 0,06
SCHWELLENWERT 0,31

d) Nachweis von IgM-Antikörpern gegen MSRV-1 mittels ELISA:
Zur Untersuchung des Vorhandenseins von spezifischen IgM-Antikörpern gegen MSRV-1 in denselben Seren wie oben wurde die ELISA-Technik mit dem Peptid S24Q eingesetzt.
In 42 sind die Ergebnisse von jedem Serum, das mit einem Anti-IgM-Antikörper geprüft wurde, dargestellt. Jeder senkrechte Balken bedeutet die optische Netto-Dichte (OD bei 492 nm) eines geprüften Serums.
Die Ordinatenachse gibt die Netto-OD am oberen Ende der vertikalen Balken an. Die 15 ersten vertikalen Balken, die links von der vertikalen Linie, die die Abszissenachse schneidet, liegen, stellen die Seren von 15 gesunden Kontrollen (Blutspender) dar, und die vertikalen Balken, die rechts von der vertikalen gestrichelten Linie liegen, stellen die Seren von 15 geprüften MS-Fällen dar.
Der mittlere OD-Wert der geprüften MS-Fälle beträgt 1,6.
Der mittlere Netto-OD-Wert der Kontrollen beträgt 0,7.
Die Standardabweichung der Negativkontrollen beträgt 0,6.
Die theoretische Schwelle für das Positivsein kann gemäß der folgenden Formel errechnet werden: Schwellenwert = (Mittelwert der OD-Werte der negativen Kontrollen) + (3 × Standardabweichung der OD-Werte der negativen Kontrollen).
Der Schwellenwert beträgt daher 0,7 + (3 × 0,6) = 2,5; Die negativen Ergebnisse stellen einen unspezifischen "Hintergrund" des Vorhandenseins von spezifisch gegen ein Epitop des Peptids gerichteten Antikörpern dar.
Gemäß dieser Analyse, und wie in 42 und der dazugehörigen Tabelle 4 dargestellt, ist der IgM-Test spezifisch für MS, da keine Kontrolle einen Netto-OD-Wert oberhalb des Schwellenwerts aufweist. 6 von 15 MS-Seren führen zu einem positiven IgM-Ergebnis.
Der Unterschied der Seroprävalenz zwischen MS-Fällen und der Kontrollpopulation ist höchst signifikant: "Chi-²"-Test, p<0,002.
Diese Ergebnisse sprechen daher dafür, daß das MSRV-1 eine etiopathogene Rolle bei MS spielt.

So kann man mit dem Nachweis der Antikörper IgM und IgG gegen das Peptid S24Q, allein oder in Kombination mit anderen MSRV-1-Peptiden, den Verlauf einer Infektion mit MSRV-1 und/oder die Reaktivierung des MSRV-1-Virus auswerten. TABELLE NR. 4

KONTROLLEN	MS
1,449	0,974
0,371	6,117
0,448	2,883
0,456	1,945
0,885	1,787
2,235	0,273
0,301	1,766
0,138	0,668
0,16	2,603
1,073	0,802
1,366	0,245
0,283	0,147
0,262	2,441
0,585	0,287
0,356	0,589

MITTELWERT 0,7
STANDARDABWEICHUNG 0,6
SCHWELLENWERT 2,5

Die neuen von den Erfindern gemachten Entdeckungen und die von ihnen entwickelten neuen Methoden erlauben nun die optimierte Durchführung von diagnostischen Tests für die Infektion und/oder Reaktivierung von MSRV-1 und die Auswertung einer MS- und/oder RP-Therapie aufgrund ihrer Wirksamkeit, den Nachweis dieser Agentien in biologischen Flüssigkeiten von Patienten zu "negativisieren". Weiterhin könnte der frühzeitige Nachweis bei Patienten, die noch keine neurologischen Symptome von MS oder rheumatologische Symptome der RP aufweisen, ermöglichen, mit einer Behandlung zu beginnen, die umso wirksamer auf die darauffolgende klinische Entwicklung ist als sie dem Läsionsstadium, das dem Auftreten von klinischen Problemen entspricht, vorangeht. Bis heute kann keine MS oder RP-Diagnose vor dem Beginn einer Symptomatologie von Läsionen erfolgen, und es wird daher mit keiner Behandlung begonnen, bevor ein klinisches Bild, das bereits beträchtliche Läsionen beinhaltet, auftritt. Die Diagnose einer Infektion und/oder Reaktivierung von MSRV-1, und/oder MSRV-2 beim Menschen ist daher ausschlaggebend, und die vorliegende Erfindung stellt die Mittel hierzu bereit.
Zusätzlich zur Diagnose der Infektion und/oder Reaktivierung von MSRV-1, ist es daher möglich, eine MS-Therapie aufgrund ihrer Wirksamkeit den Nachweis dieser Agentien in biologischen Flüssigkeiten von Patienten zu "negativisieren", auszuwerten.
LITERATURANGABEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nukleotidfragment, das eine Nukleotidsequenz aus der Gruppe (a) SEQ ID NR. 46, SEQ ID NR. 51, SEQ ID NR. 52, SEQ ID NR. 53 und SEQ ID NR. 56; (b) die zu diesen genomischen Sequenzen komplementären Sequenzen enthält bzw. aus solch einer Nukleotidsequenz besteht.
Nukleinsäuresonde für den Nachweis eines pathogenen und/oder infektiösen Agens, das mit multipler Sklerose assoziiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Nukleotidsequenz aus einer Sequenz von 100 aufeinanderfolgenden Monomeren eines Fragments aus der Reihe der Fragmente, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NR. 46, SEQ ID NR. 51, SEQ ID NR. 52, SEQ ID NR. 53 angegeben sind, besteht, oder dadurch, daß ihre Nukleotidsequenz aus einer Sequenz von 30 oder 100 aufeinanderfolgenden Monomeren des Fragments, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NR. 56 angegeben ist, besteht; sowie den zu diesen Sequenzen komplementären Nukleotidsequenzen.
Primer für die Amplifikation mittels Polymerisation einer RNA oder einer DNA eines Virusmaterials, dadurch gekennzeichnet, daß seine Nukleotidsequenz aus einer Sequenz von 30 aufeinanderfolgenden Monomeren des Fragments, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NR. 56 angegeben ist, besteht; und der zu dieser Sequenz komplementären Nukleotidsequenz.
Primer für die Amplifikation mittels Polymerisation einer RNA oder einer DNA eines Virusmaterials, dadurch gekennzeichnet, daß seine Nukleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 49 identisch ist.
RNA oder DNA, insbesondere Replikationsvektor, die/der ein Fragment nach Anspruch 1 enthält.
Monoklonaler oder Polyklonaler Antikörper gegen das MSRV-1-Virus, dadurch gekennzeichnet, daß er durch immunologische Reaktion eines menschlichen oder tierischen Organismus auf ein immunogenes Agens erhalten wird, das aus einem antigenen Polypeptid besteht, das von einem Nukleotidfragment nach Anspruch 1 kodiert wird, wobei das Polypeptid eine antigene Determinante, die von Seren von mit MSRV-1-Virus infizierten Patienten und/oder von Patienten, bei denen das MSRV-1-Virus reaktiviert worden ist, erkannt wird, bildet oder enthält.
Nachweisreagens für das MSRV-1-Virus oder für Kontakt mit diesem Virus, dadurch gekennzeichnet, daß es als Reagenswirkstoff ein Polypeptid, das von einem Nukleotidfragment nach Anspruch 1 kodiert wird, wobei das Polypeptid eine antigene Determinante, die von Seren von mit MSRV-1-Virus infizierten Patienten und/oder von Patienten, bei denen das MSRV-1-Virus reaktiviert worden ist, erkannt wird, bildet oder enthält, oder einen Antikörper gegen dieses Peptid enthält.
Diagnostische, prophylaktische oder therapeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid, das von einem Nukleotidfragment nach Anspruch 1 kodiert wird, wobei das Polypeptid eine antigene Determinante, die von Seren von mit MSRV-1-Virus infizierten Patienten und/oder bei denen das MSRV-1-Virus reaktiviert worden ist, erkannt wird, bildet oder enthält, oder einen Antikörper gegen dieses Peptid nach Anspruch 6 enthält.
Immuntherapeutisch aktive Zusammensetzung, insbesondere Impfstoffzusammensetzung, nach Anspruch 8.
Diagnostische, prophylaktische oder therapeutische Zusammensetzung, insbesondere zum Hemmen der Expression mindestens eines pathogenen und/oder infektiösen Agens, das mit multipler Sklerose assoziiert ist, die ein Nukleotidfragment nach Anspruch 1 enthält.
Verfahren zum Nachweisen eines pathologischen und/oder infektiösen Agens, das mit multipler Sklerose assoziiert ist, in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine RNA und/oder eine DNA, von der angenommen wird, daß sie zu diesem pathologischen und/oder infektiösen Agens gehört oder von diesem stammt, oder deren komplementäre RNA und/oder DNA, mit einer Zusammensetzung, die ein Nukleotidfragment nach Anspruch 1 enthält, in Kontakt bringt.
Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins oder des Kontakts mit einem pathologischen und/oder infektiösen Agens, das mit multipler Sklerose assoziiert ist, in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einem Polypeptid in Kontakt bringt, das von einem Nukleotidfragment nach Anspruch 1 kodiert wird, wobei das Polypeptid eine antigene Determinante, die von Seren von mit MSRV-1-Virus infizierten Patienten und/oder von Patienten, bei denen das MSRV-1-Virus reaktiviert worden ist, erkannt wird, bildet oder enthält, oder einen Antikörper gegen dieses Peptid nach Anspruch 6 enthält.
Vorrichtung zum Nachweisen des MSRV-1-Virus, das ein Reagens nach Anspruch 7 enthält, das sich auf einem festen Träger, der immunologisch mit dem Reagens kompatibel ist, befindet, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Mittel zum in-Kontaktbringen einer biologischen Probe, wie einer Blutprobe oder einer Cerebrospinalflüssigkeitsprobe, die anti-MSRV-1-Antikörper enthalten kann, mit dem Reagens, und zwar unter Bedingungen, die eine mögliche Immunreaktion ermöglichen, sowie Mittel zum Nachweisen des mit dem Reagens gebildeten Immunkomplexes enthält.
Verfahren zum Nachweisen von anti-MSRV-1-Antikörpern in einer biologischen Probe, wie einer Blutprobe oder einer Cerebrospiralflüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe und ein Reagens nach Anspruch 7, das aus einem Antikörper besteht, in Kontakt bringt, und zwar unter Bedingungen, die eine mögliche Immunreaktion ermöglichen, und man anschließend das Vorliegen eines mit dem Reagens gebildeten Immunkomplexes nachweist.
Verwendung einer Nukleinsäuresonde zum in-vitro-Nachweisen eines pathogenen und/oder infektiösen Agens, das mit Mutipler Sklerose assoziiert ist, wobei die Sonde 10 bis 100 aufeinanderfolgende Monomere eines Fragments wie es in Anspruch 1 definiert ist enthält.
Verwendung eines Primers für die Amplifikation durch Polymerisation einer RNA oder einer DNA eines Virusmaterials, das mit Mutipler Sklerose assoziiert ist, wobei der Primer eine Nukleotidsequenz von 10 bis 30 aufeinanderfolgenden Monomeren, die mit der Nukleotidsequenz eines Fragments wie es in Anspruch 1 definiert ist identisch ist, enthält.