DE10111433A1

DE10111433A1 - Replikationskompetente molekulare Klone von porcinem endogenem Retrovirus der Klasse A und Klasse B,abgeleitet von Schweine- und humanen Zellen

Info

Publication number: DE10111433A1
Application number: DE10111433A
Authority: DE
Inventors: Ralf R Toenjes; Ulrich Krach
Original assignee: BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND LET; Paul-Ehrlich-Institut
Current assignee: Bundesrepublik Deutschland Letztvertreten Durch De
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2001-03-09
Publication date: 2002-09-19
Also published as: CA2438385A1; US20040142449A1; EP1366171A2; WO2002072836A3; AU2002253114A1; WO2002072836A2

Abstract

Die Erfindung betrifft funktionelle, replikationskompetente vollständige provirale PERV-A- und PERV-B-Klone, die direkt aus dem Schweinegenom isoliert werden, d. h. "native" PERV und erlaubt den Vergleich proviraler PERV-Sequenzen unterschiedlicher Ursprünge auf molekularer, struktureller und zellulärer Ebene.

Description

Die Erfindung betrifft replikationskompetente molekulare Klone von porcinem endogenem Retrovirus (PERV).

Hintergrund der Erfindung

Die bessere Kenntnis der zellulären und molekularen Basis einer Transplantatabstoßung und die Herstellung transgener Spendertiere, die Gene tragen, die einen Schutz gegenüber einer Abstoßung vermitteln (Bach, F. H. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7190-7195), gaben den Anlass, die Xenotransplantation, d. h. die therapeutische Verwendung von tierischen Zellen, Geweben und Organen einzusetzen, um den Mangel von allogenen Transplantaten zu beseitigen (Dorling, A. et al., 1997, Lancet 349: 867-871). Schweine sind als Spender für Xenotransplantate aufgrund der verwandten Physiologie, der Einfachheit einer Züchtung und aus ethischen Gründen bevorzugt (Fishman, J. A. 1994, Xenotransplantation 1: 47-57). Bisher umfassten klinische Versuche die Implantation von fötalem neuronalem Gewebe als Therapie der Parkinson- und Huntington-Krankheit (Deacon, T., J. et al., 1997, Nat. Med. 3: 350-353; Fink, J. S. et al., 2000, Cell Transplantation 9: 273-278), die Implantation oder Infusion pankreatischer Inselzellen als Behandlung von insulinabhängiger Diabetes mellitus (Groth, C. G. et al. 1994, Lancet 344: 1402- 1404), extrakorporale Nierenperfusion (Breimer, M. E. et al., 1996, Xenotransplantation 3: 328- 339), künstliche biologische Leberapparate (Mullon, C. und Z. Pitkin, 1999, Exp. Opin. Invest. Drugs 8: 229-235) und die Perfusion durch ganze Leberpräparate oder die Implantation von ganzen Leberpräparaten als Behandlung eines Leberversagens (Chari, R. S. et al., 1994, N. Engl. J. Med. 331: 234-237; Cramer, D. V., 1995, Transplant. Proc. 27: 80-83).

Große Bedenken wurden im Hinblick auf die Möglichkeit aufgeworfen, neue mikrobielle Stoffe aus dem Tier in den Empfänger einzubringen, was zu einer Xenozoonose führt (Allan, J. S. 1996, Nat. Med. 2: 18-21; Fishman, J. A. 1997, Kidney Int. 51 (Suppl. 58): 41-45; Michaels, M. G. und R. L. Simmons, 1994, Transplantation 57: 1-7; Stoye, J. P. und J. M. Coffin 1995, Nat. Med. 1: 1100). Im Hinblick darauf nimmt man an, dass die Züchtung und Haltung von Schweinen unter spezifisch-pathogen-freien (SPF) Bedingungen das Risiko für eine Übertragung von exogenen Stoffen senkt. Jedoch sind diese Verfahren nicht geeignet, um das Auftreten von Viren, die über die Keimbahn übertragen werden, d. h. porcine endogene Retroviren (PERV) (Patience, C. et al., 1997, Nat. Med. 3: 282-286), und DNA-Viren zu vermeiden, die ohne Symptome in ihrem natürlichen Wirt persistieren können und intrauterin oder transplazentar übertragen werden, wie Herpesviren (Ehlers, B. et al., 1999, J. Gen. Virol. 80: 971-978).

In Bezug auf PERV sind etwa 50 Intergrationsstellen in dem Genom verschiedener Schweinerassen vorhanden (Akiyoshi, D. E. et al., 1997, Nature 389: 681-682; Patience, C. et al., 1997, Nat. Med. 3: 282-286) und mindestens drei Klassen von PERV sind bekannt (LeTissier, P. et al., 1997, Nature 389: 681-682, Takeuchi, Y. et al., 1998, J. Virol. 72: 9986-9991). Diese Klassen, PERV-A, -B, und -C, weisen eine starke Sequenzhomologie in den Genen für die gruppenspezifischen Antigene (gag) und die Polymerase (pol) auf, unterscheiden sich jedoch in den Envelope (env)-Genen, die den Wirtsbereich bestimmen. In jüngerer Zeit wurde eine neue Klasse eines env-Gens von PERV, die als Env-D bezeichnet wird, beschrieben (WO 00/11187).

In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass PERV, die von verschiedenen Schweinezelllinien freigesetzt werden, menschliche Zellen in vitro infizieren können (Martin, U. et al., 1998, Lancet 352: 692- 694; Wilson, C. A. et al., 2000, J. Virol. 74: 49-56; Wilson, C. A. et al., 1998, J. Virol. 72: 3082- 3087). PERV-C, auch bezeichnet als PERV-MSL (Akiyoshi, D. E. et al., 1998, J. Virol. 72: 4503- 4507), ist ecotrop im Vegleich zu PERV-A und PERV-B, die polytrop sind, wie aus Pseudotypisierungsexperimenten unter Verwendung der entsprechenden env-Gene für MLV- Vektoren abgeleitet wurde (Takeuchi, Y. et al., 1998, J. Virol. 72: 9986-9991). Ferner wurde in jüngerer Zeit die Klonierung der vollständigen proviralen Sequenzen von replikationskompetentem PERV-B beschrieben, die von infizierten menschlichen 293-Zellen (293 PERV-PK; Czauderna, F. et al., 2000, J. Virol. 74: 40284038) abgeleitet waren. Diese Daten, zusätzlich zu der Charakterisierung einer proviralen Sequenz von PERV-C (PERV-MSL; Akiyoshi, D. E. et al., 1998, J. Virol. 72: 4503-4507), zeigen, dass das Schweinegenom intakte Proviren trägt, die ähnlich zu denjenigen sind, die bei mehreren anderen Spezies, einschließlich des Menschen, vorgefunden wurden (Tönjes, R. R. et al., 1999, J. Virol. 73: 9187-9195).

Die retrospective Untersuchung von 160 Patienten, die mit porcinen Zellen und Geweben behandelt worden waren, gab keinen Hinweis auf eine Transmission von PERV (Paradis, K. G. et al., Science 285: 1236-1241), jedoch wurde bisher nicht der Versuch einer Langzeit- Transplantation eines gesamten vaskularisierten Organs unternommen. Jedoch zeigten jüngere Untersuchungen bei Verwendung von immundefizienten NOD/SCID-Mäusen eine PERV- Infektion in mehreren Gewebekompartimenten nach einer Transplantation von Pankreasinseln aus Schwein (Van der Laan, L. J. W. et al., 2000, Nature, 407: 90-94).

Aus dem Vorstehenden wird deutlich, dass derartige vertikal übertragene endogene Retroviren ein Infektionsrisiko für eine Transplantation von Zellen, Geweben und Organen aus einem Schwein in den Menschen darstellen. Eine Expression und mögliche Replikation von PERV, selbst in einer geringen Menge, hat eine große Bedeutung für die Verwendung von Organen und Geweben aus Schweinen für die Xenotransplantation. Daher ist die Herstellung PERV-freier Schweinestämme für eine Xenotransplantation erforderlich.

Eine Vorraussetzung für die Herstellung PERV-freier Schweinestämme ist die Identifizierung "nativer" replikationskompetenter Retroviren in dem Schweinegenom. Die Identifizierung dieser "nativen" Retroviren würde ein Screening verschiedener Schweinerassen auf das Auftreten infektiöser PERV ermöglichen und entsprechend die Identifzierung von Schweinerassen ermöglichen, die niedrigere Mengen von PERV produzieren oder aufgrund von Polymorphismen einzelne Proviren nicht aufweisen.

Bisher wurden "native" replikationskompetente PERV nicht aus dem Schweinegenom isoliert. Somit ist ein genetisches Screening von Schweinerassen auf das Auftreten infektiöser PERV nicht möglich, was stark das Infektionsrisiko für einen Patienten erhöht, der ein Xenotransplantat aus Schwein erhält.

Für die Lösung dieses Problems ist die Isolierung "nativer" replikationskompetenter PERV aus dem Schweinegenom erforderlich, um diese Proviren vollständig zu charakterisieren und chromosomal zuzuordnen und/oder Integrationsstellen-spezifische Sequenzinformation für Screening-Zwecke bereitzustellen.

Erfindungsgemäß werden zum ersten Mal funktionelle, replikationskompetente, vollständig lange, provirale PERV-A- und PERV-B-Klone bereitgestellt, die direkt aus dem Schweinegenom isoliert wurden, d. h. "native" PERV, und es wird der Vergleich proviraler PERV-Sequenzen mit einer unterschiedlichen Abstammung auf molekularer, struktureller und zellulärer Ebene ermöglicht. Insbesondere wird erfindungsgemäß die Klonierung und Charakterisierung proviraler Sequenzen von PERV-A und PERV-B beschrieben, die aus der porcinen Nierenzelllinie PK15 abgeleitet sind (Patience, C. et al., 1997, Nat. Med. 3: 282-286).

Ferner wird erfindungsgemäß die Isolierung "nativer" infektiöser PERV-A- und PERV-B-Klone beschrieben, die aus einer porcinen künstlichen bakteriellen Bibliothek (Rogel-Gaillard et al., 1999, Cytogenet. Cell Genet. 85: 205-211) abgeleitet sind, was weiterhin die Kartierung proviraler Sequenzen aus PERV bei Chromosomenpositionen einer spezifischen Schweinerasse ermöglichte.

Detaillierte Beschreibung der Eindung

Erfindungsgemäß werden zum ersten Mal "native" replikationskompetente molekulare Klone porciner endogener Retroviren (PERV) beschrieben. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, das die Identifizierung und darauffolgende Isolierung solcher Klone ermöglicht. Ferner umfasst die Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die für replikationskompetente PERV kodieren, und Verfahren für einen Nachweis replikationskompetenter PERV in einer biologischen Probe. Ferner werden erfindungsgemäß genomische Sequenzen aus Schwein bereitgestellt, die genomische Integrationsstellen der erfindungsgemäßen replikationskompetenten PERV flankieren.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung einen replikationskompetenten molekularen Klon von porcinem endogenem Retrovirus (PERV), wobei der molekulare Klon aus porcinen Zellen isoliert wurde und bei einer Transfektion in zugängliche Zellen replikationskompetent ist.

Der Begriff "replikationskompetent" beschreibt hier die Fähigkeit eines Klons, bei einer Transfektion/Infektion von zugänglichen Zellen eine produktive Infektion der Zellen zu bewirken, d. h. die infizierten Zellen setzen Viruspartikel frei. Beispiele von Zellen, die einer PERV-Infektion zugänglich sind, umfassen menschliche 293-Zellen (Patience, C. et al., 1997, Nat. Med. 3: 282-286, Takeuchi, Y., C, et al., 1998, J. Virol. 72: 9986-9991) und HeLa-Zellen (ECACC 93021013) sowie kanine D17-Zellen und feline PG-4-Zellen, die von der European Collection Of Cell Cultures (ECACC) erhältlich sind.

In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der replikationskompetente molekulare Klon ein PERV-A- oder PERV-B-Klon. Eine Isolierung solcher Klone kann durch den Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen. Somit betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Isolierung eines replikationskompetenten molekularen Klons von PERV, das die Schritte a) der Herstellung einer DNA-Bibliothek aus einer porcinen Zelllinie, wobei die Zelllinie infektiöse PERV-Partikel freisetzt, b) des Screenings der DNA-Bibliothek mit einer PERV-spezifischen pro/pol-Sonde, c) der Isolierung von Klonen, die provirale Sequenzen enthalten, die mit der PERV-spezifischen pro/pol-Sonde reagieren, aus der DNA-Bibliothek, d) der Analyse der proviralen Sequenzen aus der DNA-Bibliothek durch PCR, wobei PCR-Primer verwendet werden, die für PERV-A- und PERV-B-env-Gene spezifisch sind, und e) der Bestimmung des Auftretens eines proviralen ORF in den isolierten proviralen Sequenzen durch einen Protein-Verkürzungstest (protein truncation test, PTT; Roest, P. A. M. et al., Hum. Molec. Genet. 2: 1719-1721; Tönjes, R. R. et al., 1999, J. Virol. 73: 9187-9195), wobei das TNT T7 Quick-gekoppelte Transkriptions-/Translationssystem (Promega, Mannheim, Deutschland) gemäß den Herstellervorschriften verwendet wird, umfasst.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach dem Schritt e) des vorstehend beschriebenen Verfahrens die Replikationskompetenz des isolierten Klons bestimmt durch f) Transfektion von zugänglichen Zellen mit dem isolierten Klon und g) Nachweis einer produktiven Infektion zugänglicher Zellen durch indirekte Immunfluoreszenzanalyse unter Einsatz eines PERV- spezifischen Gag p10-Antiserums (Krach, U. et al., 2000, Xenotransplantation 7: 221-229) und Bestimmung der Reverse Transkriptase-Aktivität in den Überständen der infizierten zugänglichen Zellen (RT-Test; Czauderna F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038), wobei der C-Typ RT- Aktivitätstest (Cavidi Tech Ab, Uppsala, Schweden) gemäß den Herstellervorschriften (Protokoll B) eingesetzt wird.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Herstellung PERV-spezifischer Antiseren. Insbesondere betrifft die Erfindung ein PERV-spezifisches p30- oder p15E-Antiserum. Diese Antiseren können für den Nachweis einer produktiven Infektion zugänglicher Zellen eingesetzt werden (vgl. Fig. 11, 12 und 13).

In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die porcine Zelllinie, die für eine Herstellung einer DNA-Bibliothek eingesetzt wird, PK15 (Patience, C. et al., 1997, Nat. Med. 3: 282-286).

In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der replikationskompetente molekulare Klon von PERV-A oder PERV-B PK15-PERV-A(58) bzw. PK15-PERV-B(213). PK15-PERV-A(58) wird durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert, die SEQ ID NO: 1 entspricht (vgl. auch Fig. 14). PK15-PERV-B(213) wird durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert, die SEQ ID NO: 2 entspricht (vgl. auch Fig. 15).

Diese Klone wurden gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt isoliert: Zuerst wurde eine DNA-Bibliothek aus der porcinen Zelllinie PK15 hergestellt, die infektiöse PERV-Partikel freisetzt (Patience, C. et al., 1997, Nat. Med. 3: 282-286). Die Bibliothek wurde mit einer PERV- spezifschen pro/pol-Sonde gescreent, um "native" provirale Sequenzen zu isolieren. Nach drei Runden eines Screenings wurden 68 Klone bis zur Homogenität gereinigt. Eine Unterscheidung dieser Klone durch PCR unter Verwendung von Primern, die für env-A- und env-B-Gene spezifisch sind, ergab 41 PERV-A-Klone bzw. 10 PERV-B-Klone. Die verbleibenden 17 Klone ergaben weder env-A- noch env-B-Amplifikate. Ferner umfassten diese Klone keine Sequenzen von env der Klasse C oder D und wurden somit als defizient im Hinblick auf die geeigneten env- Gensequenzen betrachtet und von einer weiteren Untersuchung ausgeschlossen.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde das Auftreten eines proviralen ORF in den isolierten Klonen durch PTT-Analysen sodann untersucht (Roest, P. A. M. et al., 1993, Hum. Molec. Genet. 2: 1719-1721; Tönjes, R. R. et al., 1999, J. Virol. 73: 9187-9195). Während die meisten der isolierten Klone in einem oder mehreren der drei ORF verkürzt waren, wiesen drei Klasse A-Klone, λPK15-PERV-A(42), λPK15-PERV-A(45) und λPK15-PERV-A(58), und ein Klasse B-Klon, λPK15-PERV-B(213), alle drei Leserahmen auf Restriktionsenzymuntersuchungen und eine partielle Sequenzierung legten nahe, dass die drei PERV-A-Sequenzen identisch waren. Daher wurde nur der Klon λPK15-PERV-A(58) für weitere Experimente ausgewählt und als pPK15-PERV-A(58) nach Subklonierung des NotI-Inserts aus dem Bakteriophagen λ in pBS bezeichnet. Der Klon λPK15-PERV-B(213) wurde nach einer Subklonierung des entsprechenden λ-Inserts, was das Plasmid pPK15-PERV-B(213) ergab, weiter untersucht.

Zusammenfassend ergab das erfindungsgemäße Verfahren die Klone PK15-PERV-A(58) und PK15-PERV-B(213). Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde die Fähigkeit der Viren PK15-PERV-A(58) und PK15-PERV-B(213), zugängliche Zelllinien zu infizieren, durch einen Nachweis der Gag-Expression und von viralen Partikeln in zellfreien Überständen infizierter Zellen unter Verwendung von RT-Tests gezeigt (vgl. Fig. 4, 5, 6).

Der Klon 293-PERV-A(42), der aus einer menschlichen 293-Zelllinie isoliert worden war, die produktiv mit PERV infiziert worden war (293-PERV-PK) (Czauderna F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038), wurde entsprechend untersucht. Da der Klon 293-PERV-A(42) aus infizierten humanen Zellen kloniert worden war, ist er kein "nativer", sondern ein "humanisierter" PERV- Klon.

Die hier beschriebenen PERV-Klone zeigten eine RT-Aktivität auf 293-Zellen von 15 mU/ml für 293-PERV-A(42) und 4 mU/ml für PK15-PERV-B(213) (Fig. 7). Die am besten zugängliche Zelllinie für 293-PERV-A(42) war die feline Zelllinie PG-4, die RT-Aktivitäten von bis 500 mU/ml aufwies (Fig. 7A). Ferner wurde eine niedrigere, jedoch transiente Aktivität bei kaninen D17-Zellen gemessen (Fig. 7A), was mit einer zuvor veröffentlichen Untersuchung des Wirtsbereichs übereinstimmt (Takeuchi, Y. et al., 1998, J. Virol. 72: 9986-9991).

PK15-PERV-A(58) zeigte eine signifikant niedrigere Aktivität von bis zu drei logarithmischen Stufen im Vergleich zu 293-PERV-A(42) und mit der Ausnahme von 293-Zellen wurde nur eine transiente Aktivität von knapp über dem Hintergrund für die anderen untersuchten Zelllinien gemessen (Fig. 7B).

Infektionsuntersuchungen mit dem Klon PK15-PERV-B(213) zeigten nur niedrige Aktivitäten auf HeLa-Zellen (2-4 mU/ml bis zu Tag 50) und transiente Aktivitäten auf 293-Zellen (4 mU/ml bei Tag 21). Diese Ergebnisse unterscheiden sich von vorherigen Ergebnissen, bei denen ein wirksamer Eintritt von pseudotypisiertem MLV durch PERV-B-env vermittelt wurde (Takeuchi, Y. et al., 1998, J. Virol. 72: 9986-9991). Alle anderen getesteten Zelllinien zeigten nur Hintergrundaktivitäten.

Die Untersuchung der Gag-Expression in infizierten Zelllinien durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von PERV-spezifischen Antiseren zeigte Muster, die ähnlich zu denjenigen waren, die zuvor für PERV-infizierte Zelllinien beschrieben wurden (Krach, U. et al., 2000, Xenotransplantation 7: 221-229) (Fig. 5).

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung replikationskompetente molekulare Klone von PERV, die durch ein anderes als das zuvor beschriebene Verfahren erhalten wurden. Daher betrifft die Erfindung in dieser Ausführungsform replikationskompetente PERV-A- und PERV-B-Klone, die von einer porcinen bakteriellen künstlichen chromosomalen Bibliothek abgeleitet sind, die anhand von primären Fibroblasten hergestellt wurde, die von großen weißen Schweinen abgeleitet waren (Rogel-Gaillard et al., 1999, Cytogenet. Cell Genet. 85: 205-211). In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung den PERV-A-Klon PERV-A(Bac- 130A12) und den PERV-B-Klon PERV-B(Bac-192B9).

PERV-A(Bac-130A12) wird durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert, die SEQ ID NO: 3 entspricht (Fig. 16). PERV-B(Bac-192B9) wird durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert, die SEQ ID NO: 4 entspricht (Fig. 17).

Die Replikationskompetenz dieser Klone konnte durch indirekte Immunfluoreszenzanalyse transfizierter oder infizierter Zeillinien nachgewiesen werden, wobei ein PERV-spezifisches Antiserum gegen Gag p10 verwendet wurde. Wie für 293-Zellen gezeigt (Fig. 6), wurde eine Gag-Expression in einer steigenden Anzahl von Zellen für den Klon PERV-A(Bac-130A12) nach einer Inkubation mit p10-Antiserum 7, 10 und 35 Tage nach Transfektion beobachtet, was die Replikationskompetenz dieses Provirus zeigte. Bei PERV-B(Bac-192B9) wurde eine Immunreaktivität bis 10 Tage nach der Transfektion nachgewiesen, die sich jedoch verringerte, falls die Zellen für längere Zeiträume kultiviert wurden (Fig. 6). Die anfängliche Immunreaktivität von mit PERV-B(Bac-192B9) transfizierten Zellen kann durch eine transiente LTR-vermittelte Expression von Gag kurz nach der Transfektion aufgrund der Defizienz dieses Klons, eine produktive Infektion zu bewirken, erklärt werden (vgl. nachstehend).

Die durch die Immunfluoreszenzanalysen erhaltenen Ergebnisse wurden durch eine Messung der Aktivität der viralen RT bestätigt. Zellfreie Kulturüberstände von menschlichen HeLa- und 293- Zellen, die mit den Klonen PERV-A(Bac-130A12) bzw. PERV-B(Bac-192B9) transfiziert und/oder infiziert worden waren, wurden bis zu 45 Tage nach der Transfektion (p. t)/nach Infektion (p. i.) (Fig. 8) gewonnen. Für den Klon PERV-A(Bac-130A12) wurde eine RT-Aktivität auf HeLa-Zellen (bis zu 190 mU/ml) nachgewiesen (Fig. 8). Keine RT-Aktivität wurde bei dem Klon PERV-B(Bac-192B9) gemessen.

Zusätzlich zur Bereitstellung "nativer" replikationskompetenter molekularer Klone von PERV betrifft die Erfindung ferner Nukleinsäuresequenzen, die für replikationskompetente molekulare Klone von PERV-A und PERV-B kodieren. Besonders bevorzugt sind die durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 identifizierten Nukleinsäuresequenzen, die für die molekularen Klone PK15-PERV-A(58), PK-15-PERV-B(213), PERV-A(Bac-130A12) bzw. PERV-B(Bac-192B9) kodieren.

Die proviralen Sequenzen PK15-PERV-A(58) (SEQ ID NO: 1), PK15-PERV-B(213) (SEQ ID NO: 2), PERV-A(Bac-130A12) (SEQ ID NO: 3) und PERV-B(Bac-192B9) (SEQ ID NO: 4) sind 8918, 8763, 8918 bzw. 8840 bp lang. Die LTRs sind 668 bp (293-PERV-A(42)), 707 bp (PK15- PERV-A(58)) und 630 bp (PK15-PERV-B(213)) lang und zeichnen sich durch das Auftreten unterschiedlicher Anzahlen sowie eines unterschiedlichen strukturellen Aufbaus von 18 bp und 21 bp langen Unterwiederholungen aus (Fig. 3). PERV-A(Bac-130A12) und PERV-B(Bac- 192B9) tragen LTRs mit 702 bp bzw. 668 bp. Obwohl PERV-B(Bac-192B9) eine Klasse B- PERV-Sequenz ist, trägt sie eine LTR-Struktur, die ähnlich zu einer bisher nur in einem Typ A- PERV aufgefundenen ist.

Ein Vergleich der Nukleotid- und Aminosäuresequenzen zeigte, dass PK15-PERV-B(213) stark homolog, jedoch unterschiedlich zu dem zuvor beschriebenen Klon PERV-B(43) ist (Czauderna F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038). PK15-PERV-A(58) zeigt eine starke Homologie zu PERV MSL in LTR, gag und pro/pol (gag, 97,6%; pro/pol, 97,5%) mit der Ausnahme von env (69,3%), für das PK15-PERV-A(58) eine stärkere Verwandtschaft zu 293-PERV-A(42)- Sequenzen (Fig. 2C) zeigt. Die geringere Gesamthomologie von PK15-PERV-A(58) im Vergleich zu 293-PERV-A(42) (Tabelle 1) wird durch die phylogenetischen Abstände von Gag und Pro/Pol wiedergegeben (Fig. 2A, B). Aufgrund dieser Daten scheint PK15-PERV-A(58) eine Hauptgruppe mit PERV-MSL zu bilden, ungeachtet der env-Sequenz.

Der LTR des Klons PERV-A(Bac-130A12) ist 702 bp lang, während das gag-Gen bei dem Nukleotid (nt) 1153 beginnt und co-linear mit dem offenen Leserahmen (ORF) von pro/pol (nt 2728-6309) ist. Das Stoppkodon bei nt 2727, das beide Gene trennt, wird durch eine tRNA_gln supprimiert, wie zuvor beschrieben (Akiyoshi et al., 1998, J. Virol. 72: 4503-4507; Czauderna et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038). Das env-Gen überlappt partiell mit pro/pol und bildet einen neuen ORF (nt 6185-8149). Der Klon PERV-A(Bac-130A12) wurde chromosomal zugeordnet und liegt bei 1q2.4.

PERV-B(Bac-192B9) zeigt eine ähnliche Struktur mit einem LTR aus 668 bp und gag (nt 1115- 2689)-, pro/pol (nt 2690-6277)- bzw. env (nt 8173-8123)-Genen. Jedoch unterbrechen zwei Stoppkodons bei nt 4687 und nt 5251 innerhalb der pro/pol-Sequenz den ORF und verhindern, dass sich dieser Klon repliziert (Fig. 6). Die chromosomale Lage von PERV-B(Bac-192B9) ist 7p1.1. Daher kartiert dieses Provirus bei dem Schweine-Leukozyten-Antigen (SLA) (Rogel- Gaillard et al., 1999, Cytogenet. Cell Genet. 85: 205-211).

Sequenzen von PERV-A(Bac-130A12) und PERV-B(Bac-192B9) zeigten eine nahe Verwandtschaft zu den zuvor beschriebenen proviralen PERV-Sequenzen. PERV-A(Bac- 130A12) ist nahezu identisch mit PK15-PERV-A(58) (Krach et al., 2000, Xenotransplantation 7: 221-229), wobei die Homologie für die LTRs und die viralen Gene bei etwa 99% liegt. Jedoch scheinen beide Klone bei verschiedenen chromosomalen Positionen zu kartieren, wie aus den flankierenden Sequenzen abgeleitet wurde. PERV-A(Bac-130A12) zeigt im Vergleich zu 293- PERV-A (42) (Czauderna et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038; Krach et al., 2000, Xenotransplantation 7: 221-229) etwas niedrigere Homologien von etwa 95% in den retroviralen Genen und eine völlig andere LTR-Struktur. PERV-B(Bac-192B9) zeigt eine hohe Homologie (etwa 98%) zu dem Klon 293-PERV-B(33) (Czauderna et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038).

Jedoch ist der LTR dieses Provirus ähnlich zu dem des Klasse A-Klons 293-PERV-A(42), der eine charakteristische Struktur einer 39 bp-Wiederholung in U3 trägt (Czauderna et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038).

Die in 293-PERV-A(42), PK15-PERV-A(58) und PK15-PERV-B(213) gefundenen Polymorphismen haben weder eine Bedeutung für die stark konservierten Motive in pro/pol für Säuger Typ C-Retroviren (Tabelle 2) noch in dem Fall von PK15-PERV-A(58) für die Regionen in den env-Genen, die für die Bestimmung des Wirtsbereichs wichtig sind (VRA, VRB, und PRO) (LeTissier, P. et al., 1997, Nature 389: 681-682).

Die Erfindung betrifft ferner vom Schweinegenom abgeleitete Sequenzen, die die proviralen Integrationsstellen flankieren.

Außer der Aufklärung der Nukleinsäuresequenzen von PK15-PERV-A(58) (SEQ ID NO: 1), PK15-PERV-B(213) (SEQ ID NO: 2), PERV-A(Bac-130A12) (SEQ ID NO: 3) und PERV-B(Bac- 192B9) (SEQ ID NO: 4) wurden die flankierenden Sequenzen dieser Klone in dem Schweinegenom bestimmt.

Die Nukleinsäuresequenzen, die den 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen von PK15-PERV-A(58) entsprechen, sind durch SEQ ID NO: 5 bzw. 6 identifiziert. Die Nukleinsäuresequenzen, die den 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen von PK15-PERV-B(213) entsprechen, sind durch SEQ ID NO: 7 bzw. 8 identifiziert. Die flankierenden Sequenzen von PK15-PERV-A(58) und PK15- PERV-B(213) sind auch in Fig. 18A, 18B bzw. 19A, 19B gezeigt.

Der Klon PERV-A(Bac-130A12) wurde chromosomal zugeordnet und kartiert bei Chromosom 1q2.4 (Rogel-Gaillard et al., 1999, Cytogenet. Cell Genet. 85: 205-211). Die chromosomale Position von PERV-B(Bac-192B9) ist 7p1.1 und kartiert daher bei dem SLA. Die Nukleinsäuresequenzen, die den 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen von PERV-A(Bac-130A12) entsprechen, sind durch SEQ ID NO: 9 bzw. 10 (Fig. 20A und 20B) identifiziert. Die Nukleinsäuresequenzen, die den 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen von PERV-B(Bac-192B9) entsprechen, sind durch SEQ ID NO: 11 bzw. 12 (Fig. 21A und 21B) identifiziert.

Die erfindungsgemäßen Daten legen nahe, dass das Schweinegenom eine begrenzte Anzahl infektiöser PERV-Sequenzen an bestimmten Integrationsstellen trägt. Somit können die erfindungsgemäßen flankierenden Sequenzen für einen Nachweis spezifischer und funktioneller PERV verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Oligonukleotide, die 12-60 Nukleotide, vorzugsweise 15-40 Nukleotide und insbesondere 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 bis 30 Nukleotide der 5'- und/oder 3'-flankierenden Sequenzen von PK15-PERV-B(213), PK15-PERV- A(58), PERV-A(Bac-130A12) und/oder PERV-B(Bac-192B9) umfassen, oder Oligonukleotide, die zu den vorstehend erwähnten flankierenden Sequenzen komplementär sind und 12-60 Nukleotide, vorzugsweise 15-40 Nukleotide und insbesondere 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 bis 30 Nukleotide umfassen oder die mit den vorstehend genannten flankierenden Sequenzen hybridisieren und 17-60 Nukleotide, vorzugsweise 17-40 Nukleotide und insbesondere 18, 19 oder 20 bis 30 Nukleotide umfassen, in einem Verfahren zum Nachweis integrierter PERV eingesetzt. Beispiele von Verfahren zum Nachweis integrierter PERV gemäß der Erfindung sind PCR und Southern-Blot-Analyse.

Der Begriff "hybridisieren" bedeutet erfindungsgemäß, dass die erfindungsgemäßen Oligonukleotide selektiv mit Nukleinsäuresträngen unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen hybridisieren, die merkliche Mengen einer nachweisbaren Bindung an nicht spezifische Nukleinsäuren minimieren. Hochstringente Bedingungen können für eine selektive Hybridisierung wie bekannt und hier beschrieben verwendet werden. Bei der Verwendung von Oligonukleotiden, die an die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen flankierenden Sequenzen hybridisieren, sind die Oligonukleotide mindestens 17 Nukleotide, vorzugsweise 18, 19 oder 20 bis 30 Nukleotide lang und besitzen eine Homologie von mindestens etwa 70%, etwa 90%, etwa 95%, etwa 98% oder 100% zu den komplementären Sequenzen der vorstehend beschriebenen flankierenden Sequenzen.

In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Nachweis des Auftretens von replikationskompetenten PERV in einer Probe bereitgestellt, das den Nachweis einer Nukleinsäuresequenz umfasst, die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 oder Teilen davon entspricht.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Polypeptid, das von der Gag- und/oder der Env-Sequenz abgeleitet ist, die durch die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 4 kodiert wird.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Vaccinen für die Immunisierung eines Wirts gegen ein replikationskompetentes PERV, die eine wirksame Menge eines Polypeptids umfassen, das von den Gag- und Env-Sequenzen abgeleitet ist, die durch die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 4 kodiert werden.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Herstellung von PERV-freien Schweinen. Basierend auf der Identifizierung von "nativen" replikationskompetenten Retroviren in dem Schweinegenom gemäß der Erfindung ist es nun möglich, verschiedene Schweinerassen auf das Auftreten spezifischer infektiöser PERV zu screenen und entsprechend Schweinerassen zu identifizieren, die PERV-frei sind.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Figuren weiter veranschaulicht.

FIGUREN

Fig. 1 Strukturen von 293-PERV-A(42), PK15-PERV-A(58) und PK15-PERV-B(213). Provirale Sequenzen von 293-PERV-A(42), PK15-PERV-A(58) bzw. PK15-PERV-B(213) sind 8849 bp, 8918 bp bzw. 8763 bp lang.
Die Gene sind als offene Kästchen gezeigt und das erste und letzte Nukleotid des LTR und der Gene sind angegeben (Zahlen in Klammern, PK15-PERV-A(58) und PK15-PERV-B(213)). Pfeile geben die transkriptionelle Startstelle (cap), die Primer-Bindestelle (PBS), den Splice- Donor (SD) und den Splice-Akzeptor (SA) und die poly(A)-Anfügestelle (p(A)) an. Die nt- Positionen entsprechen dem molekularen Klon 293-PERV-B(33) (Czauderna F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038) (Zugangsnummer AJ133816).

Fig. 2 Phylogenetische Verwandtschaft von PERV-Proteinen.
Die Phylogramme basieren auf vollständigen offenen Leserahmen für Gag (A), Pro/Pol (8), und Env (C) (vgl. auch Tabelle 1). Relative Entfernungen sind durch Maßstabsbalken angegeben (0,1 bedeutet 10% Divergenz). Die Phylogramme wurden mit Hilfe von Phylip 3.574c und den Prodist- und Neighbor-Programmen erstellt (http:/ / evolution.genetics.washing ton.edu/phylip.html).

Fig. 3 Schematische Struktur des 5'-LTR von 293-PERV-A(42), PK15-PERV-A(58), und PK15-PERV-B(213). Die LTRs sind 668 bp (293-PERV-A(42)), 702 bp (PK15-PERV-A(58)) und 630 bp (PK15-PERV-B(213)) lang. Wiederholungsboxen, die aus 18-bp und 21-bp langen Unterwiederholungen bestehen, sind als schwarze und graue Kästchen eingezeichnet.

Fig. 4 Provirale Integration von PERV.
Nachweis eines 729 bp pro/po/-Amplifikationsprodukts durch PCR. Spur 1, 7 und 11, 293- Zellen; Spur 2, 8 und 12, HeLa-Zellen; Spur 3, 9 und 13, D17-Zellen; Spur 4, 10 und 14, PG-4- Zellen; Spur 5, Molekulargewichtsmarker; Spur 6 Positivkontrolle; Spur 15, Wasserkontrolle. Spur 1 bis Spur 4, PK15-PERV-B(213); Spur 7 bis Spur 10, 293-PERV-A(42); Spur 11 bis Spur 14, PK15-PERV-A(58).

Fig. 5 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse von mit 293-PERV-A(42) infizierten HeLa-Zellen (Bild A) und von mit PK15-PERV-A(58) infizierten 293-Zellen (Bild B). Die Zellen wurden mit PERV Gag p10-Antiserum inkubiert (Krach, U. et al., 2000, Xenotransplantation 7: 221-229). Vergrößerung: 400 ×.

Fig. 6 Expression der Klone PERV-A(Bac-130A12) und PERV-B(Bac-192B9). Nachweis von PERV-Gag durch einen indirekten Immunfluoreszenztest bei unterschiedlichen Zeitpunkten nach einer Transfektion von BAC DNA unter Verwendung eines Antikörpers gegen p10. A-C, mit PERV-A(Bac130A12) transfizierte 293-Zellen, 7, 21 bzw. 35 Tage nach der Transfektion (p. t.). D-F, mit PERV-B(Bac-192B9) transfizierte 293-Zellen, 7, 21 bzw. 35 Tage p. t..

Fig. 7 Replikation von 293-PERV-A(42) und PK15-PERV-A(58).
RT-Aktivität in zellfreien Kulturüberständen von mit 293-PERV-A(42) (Bild A) und PK15- PERV-A(58) (Bild B) infizierten Zellen. Die Zelllinien 293, HeLa, D17 und PG-4 wurden bis zu 51 Tage nach Infektion (p. i.) untersucht. MoMLV RT wurde als Standard verwendet.

Fig. 8 Nachweis der reverse Transkriptase-Aktivität in zellfreien Kulturüberständen von HeLa- Zellen bei einer Transfektion von Bac DNA der Klone PERV-A(Bac-130A12) und PERV- B(Bac-192B9).

Fig. 9 Lage und Aminosäuresequenzen von für eine Immunisierung von Kaninchen verwendeten PERV-Peptiden.
Die Positionen der Peptide in den Protein- bzw. Gensequenzen sind dargestellt. Die Positionen betreffen den Klon PERV-B(33)/ATG (Czauderna et al., 2000). As, Aminosäure, nt, Nukleotid.

Fig. 10 Immunoblotting bei Verwendung von α-p30U und α-p15E.
Spuren 1 und 3, Lysat der Zelllinie 293 PERV-PK; Spuren 2 und 4, Sucrosegradienten-gereinigte Viruspartikel. Spuren 1 und 2, Inkubation mit α-p30U-Antiserum; Spuren 3 und 4, α-p15E- Antiserum. Die Pfeile bezeichnen das p30Protein (Spur 2) und das Env-Vorläuferprotein (p73, Spur 3) und das glycosylierte Env (p90^gly, Spur 3) mit apparenten Molekulargewichten von 73 kDa bzw. 90 kDa.

Fig. 11 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse der PERV Gag-Expression unter Verwendung von α-p30U-Antiserum.
Bilder A, C und E, α-p30U-Antiserum; Bilder B, D und F, Präimmunserum. A und B, Gag- exprimierende Insektenzellen; C und D, nicht-infizierte 293-Zellen; E und F, 293 PERV-PK- Zellen. Vergrößerung: 400 ×.

Fig. 12 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse der PERV Gag-Expression unter Verwendung von α-p30D-Antiserum.
Bilder A und C, α-p30D-Antiserum; Bilder B und D, Präimmunserum. A und B, Gag exprimierende Insektenzellen; C und D, 293 PERV-PK-Zellen. Vergrößerung: 400 ×.

Fig. 13 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse der PERV Env-Expression unter Verwendung von α-p15E-Antiserum.
Bilder A, B, D, F, H, α-p15E-Antiserum; Bilder C, E, G, Präimmunserum. A, Env-A- exprimierende Insektenzellen; B, Env-B-exprimierende Insektenzellen, C, Env-Aexprimierende Insektenzellen; D und E, 293 PERV-PK-Zellen; F und G, 293-Zellen, infiziert mit dem molekularen Klon PERV-B(33)/ATG; H, nicht-infizierte 293-Zellen. Vergrößerung: 400×.

Fig. 14 Nukleinsäuresequenz des Klons PK15-PERV-A(58) (SEQ ID NO: 1).

Fig. 15 Nukleinsäuresequenz des Klons PK15-PERV-B(213) (SEQ ID NO: 2).

Fig. 16 Nukleinsäuresequenz des Klons PERV-A(Bac-130A12) (SEQ ID NO: 3).

Fig. 17 Nukleinsäuresequenz des Klons PERV-B(Bac-192B9) (SEQ ID NO: 4).

Fig. 18 Chromosomale 5' (Fig. 18A)- und 3' (Fig. 18B)-flankierende Sequenz von PK15- PERV-A(58).

Fig. 19 Chromosomale 5' (Fig. 19A)- und 3' (Fig. 19B)-flankierende Sequenz von PK15- PERV-B (213).

Fig. 20 Chromosomale 5' (Fig. 20A)- und 3' (Fig. 20B)-flankierende Sequenz von PERV- A(Bac-130A12).

Fig. 21 Chromosomale 5' (Fig. 21A)- und 3' (Fig. 21B)-flankierende Sequenz von PERV-B (Bac-192B9).

Die Erfindung wird weiter durch die nachstehenden nicht begrenzenden Beispiele veranschaulicht.

BEISPIELE Beispiel 1 Herstellung und Screening von porcinen und humanen λ-Bakteriophagen-Bibliotheken

Eine genomische DNA-Bibliothek aus PK15-Zellen wurde unter Verwendung des lambda FixII/XhoI partiellen Auffüllvektors (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) wie zuvor beschrieben hergestellt (Czauderna, F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038). Die Herstellung einer genomischen Bibliothek aus der Zelllinie 293 PERV-PK wurde genauso wie das Screening von Bakteriophagen-Bibliotheken mit einer ³²P-markierten PERV pro/pol-Sonde beschrieben (Czauderna, F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038). Eine Subklonierung von DNA-Inserts aus gereinigten λ-Klonen in pBS-KS (Stratagene) erfolgte wie beschrieben (Czauderna, F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038).

Beispiel 2 Herstellung von porcinen genomischen BAC-Bibliotheken und Herstellung von BAC DNA

Die porcine BAC-Bibliothek wurde aus großen weißen Schweinen unter Verwendung des pBeloBAC11-Vektors, wie zuvor beschrieben, hergestellt (Rogel-Gaillard et al., 1999, Cytogenet. Cell Genet. 85: 205-211). Dieses Genom trug 20-30 Kopien von PERV, wie durch Southern-Blot- Hybridisierung gezeigt (Rogel-Gaillard et al., 1999, Cytogenet. Cell Genet. 85: 205-211). 33 BAC-Klone wurden durch in situ-Fluoreszenzhybridisierung an 22 verschiedenen Positionen auf 14 Chromosomen kartiert (Rogel-Gaillard et al., 1999, Cytogenet. Cell Genet. 85: 205-211). Vier dieser Klone wurden in dieser Untersuchung verwendet und sind als PERV-A(Bac-130A12), PERV-B(Bac-192B9), PERV-A(Bac-242D4) und PERV-B(Bac-484G4) bezeichnet. DNA aus einzelnen BAC-Klonen wurde mit Hilfe herkömmlicher alkalischer Lyse von Bakterien, gefolgt von CsCl-Gradientenzentrifugation der DNA (50 000 xg, über Nacht) hergestellt. Ethidiumbromid wurde aus der DNA durch Extraktion mit Isobutanol entfernt und CsCl wurde sodann durch Ethanolfällung entfernt.

Beispiel 3 Identifizierung der offenen Leserahmen von PERV

Isolierte PERV-Sequenzen wurden auf offene Leserahmen (ORF) durch den Protein- Verkürzungstest (PTT) mit Hilfe des TNT T7 Quick-gekoppelten Transcriptions- /Translationssystems (Promega, Mannheim, Deutschland) gemäß den Herstellervorschriften getestet.

Die Gensequenzen für gag, pol und env wurden in Verbindung mit einem T7-Promotor unter Verwendung der Oligonukleotide T7-PERV-gag-for (CTT GTG CGT CCT TGT CTA CAG, nt 1087-1107), PERV-gag-rev (CTT CAA AGT TAC CCT GGG CTC G; nt 2737-2716), T7- PERV-pol-for (GCT ACA ACC ATT AGG AAA AC, nt 2794-2813), PERV-pol-rev (GAG TTC GGG CTG TCC ACA AGG, nt 6304-6284), T7-PERV-env-for (CCA CTA GAC ATT TGA AGT TC, nt 6116-6136), und PERV-env-rev (GTT AAT AGT TCT AAT CTT AGA AC, nt 8163-8141) amplifiziert.

Beispiel 4 Sequenzanalysen von vollständigen PERV-Sequenzen (LTRs und offene Leserahmen)

Die DNA-Sequenzen beider Stränge isolierter molekularer Klone wurden durch Primer- Wanderung, basierend auf des 293-PERV-B(33)-Sequenz (Zugangsnummer AJ133816) wie zuvor beschrieben bestimmt (Czauderna, F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038), wobei ein ABI 373A- oder 377-DNA-Sequenziersystem (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) gemäß den Herstellervorschriften verwendet wurde.

a. Analyse von offenen Leserahmen

Der Klon 293-PERV-A(42), der von humanen 293-Zellen abgeleitet ist, und der Klon PK15- PERV-A(58), der aus PK15-Zellen isoliert wurde, weisen Nukleinsäuresequenzen einer Länge von 8849 Basenpaaren (bp) bzw. 8918 bp auf. Das gag-Gen von 293-PERV-A(42) beginnt bei Nukleotid (nt) 1115 und ist co-linear mit dem pro/pol-ORF (nt 2690-6274) (Fig. 1). Das Amber (UAG)-Stoppkodon bei nt 2689, das beide Gene trennt, wird durch tRNA_Gln, wie zuvor beschrieben, supprimiert (Akiyoshi, D. E. et al., 1998, J. Virol. 72: 4503-4507; Czauderna, F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038). Das env-Gen liegt am 3'-Ende der proviralen Sequenz (nt 6150-8132) und bildet einen neuen Leserahmen.

PK15-PERV-A(58) zeigt eine ähnliche Struktur und umfasst die Gene für gag (nt 1153-2727), pro/pol (nt 2728-6309) bzw. env (nt 6185-8149). Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuren (As) der PERV-A (293-PERV-A(42) und PK15-PERV-A(58))-Sequenzen zeigte eine Homologie von 95,8% für Gag, 97,5% für Pro/Pol und 98,3% für Env im Vergleich zu 293-PERV-A(42) (Tabelle 1).

PK15-PERV-B(213) zeigt eine Sequenz mit 8763 bp und ORF für gag (nt 1077-2651), pro/pol (nt 2652-6239), und env (nt 6112-8085).

Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von PK15-PERV-B(213) zeigen eine starke Homologie im Vergleich zu 293-PERV-A(42) für Gag (99,6%) bzw. Pro/Pol (98,9%) (Tabelle 1). Der Vergleich der Env-Sequenzen von PK15-PERV-B(213) und 293-PERV-A(42) zeigt 68,0% Homologie zueinander. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von PK15-PERV-B(213) und des zuvor charakterisierten 293-PERV-B(43) (Czauderna F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038) zeigte eine starke Homologie für Gag (99,4%), Pro/Pol (99,3%) und Env (99,1%).

PK15-PERV-B(213) trägt das längste pro/pol-Gen. Das Gen trägt ein zusätzliches Kodon (nt 6234-6237, das für Glutamin kodiert) im Vergleich zu pro/pol von 293-PERV-A(42) und PK15- PERV-A(58) und ein weiteres zusätzliches Kodon (nt 5951-5953, das für Arginin kodiert) im Vergleich zu PK15-PERV-A(58). In ähnlicher Weise findet sich in pro/pol von 293-PERV-A(42) ein zusätzliches Arginin (nt 5989-5991) im Vergleich zu PK15-PERV-A(58). Somit trägt PK15- PERV-A(58) das kürzeste pro/pol-Gen.

Das env-Gen von PK15-PERV-A(58) zeigt eine Verkürzung von 18 nt im Vergleich zu 293- PERV-A(42) (nt 8115-8132) am 3'-Ende der Sequenz. Die spezifischen Unterschiede des env von PERV-A und PERV-B spiegeln sich auch durch den Unterschied von 9 nt in der Länge zwischen den Sequenzen des env von PK15-PERV-B(213) und 293-PERV-A(42) (1973 nt bzw. 1982 nt) wieder.

Die Homologiedaten sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

TABELLE 1

Vergleich der Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des gag-, pro/pol- und env-ORF von 293- PERV-A(42) mit PK15-PERV-A(58) und PK15-PERV-B(213)

Prozent Nukleotidhomologie und Aminosäurehomologie (in Klammern) mit dem Gen (Protein) von 293-PERV-A(42)

Ferner zeigen die vorstehend beschriebenen proviralen PERV-Klone stark konservierte Aminosäuremotive von Typ C-Retroviren aus Säugern (Akiyoshi, D. E. et al., 1998, J. Virol. 72: 4503-4507; Czauderna, F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038), wie in Tabelle 2 zusammengefasst.

TABELLE 2

Stark konservierte Aminosäuremotive von Typ C-Retroviren aus Säugern, die in 293-PERV- A(42), PK15-PERV-A(58) und PK15-PERV-B(213) vorhanden sind

Fußnoten ¹

Motiv in MoMLV (Shinnick, T. M. et al., 1981, Nature 293: 543-548) und PERV-MSL (Akiyoshi, D. E. et al., 1998, J. Virol. 72: 4503-4507);
²

(Oroszlan, S. et al., 1981, Virology 115: 262-271);
³

identisch in BaEV (Zugangsnr.: D10032), GaLV (Zugangsnr.: NC_001885) und KoRV (AF 151794);
⁴

(Green, L. M. und J. M. Berg. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4047-4051, 24);
⁵

(Coffin, J. 1996. Retroviridae: the viruses und their replication, Seiten 1767-1847. In B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, et al. (Hrsg.), Fields virology, 3. Auflage, Lippincott-Raven Publishers, Hagerstown, Md.);
⁶

in PK15-PERV-A(58), 7. Aminosäure ist Lysin;
⁷

(Xiong, Y. und T. H. Eickbush. 1990, EMBO J. 9: 3353-3362);
⁸

(Akiyoshi, D. E. et al., 1998, J. Virol. 72: 4503-4507; LeTissier, P. et al., 1997, Nature 389: 681- 682).

Die Sequenzen der Klone PERV-A(Bac-130A12) (SEQ ID NO: 3) und PERV-B(Bac-192B9) (SEQ ID NO: 4) wurden bestimmt, was Proviren mit 8918 bp bzw. 8840 bp ergab. Während die Sequenzen der LTRs und viralen Gene getrennt voneinander bestimmt wurden, wurden sie für diese Untersuchung zusammengefügt. Das gag-Gen des Klons PERV-A(Bac-130A12) erstreckt sich von nt 1153 bis nt 2727 und der pro/pol-ORF liegt im gleichen Leserahmen (nt 2728-6309). Das env-Gen bildet den dritten ORF (nt 6185-8149). Der Klon PERV-A(Bac-130A12) wurde chromosomal zugeordnet und kartiert bei 1q2.4 (Rogel-Gaillard et al., 1999, Cytogenet. Cell Genet. 85: 205-211).

PERV-B(Bac-192B9) zeigt eine ähnliche Struktur und trägt gag (nt 1115-2689)-, pro/pol (nt 2837-6277)- bzw. env (nt 8173-8123)-Gene. Jedoch unterbrechen zwei Stoppkodons bei nt 4687 und nt 5251 innerhalb der pro/pol-Sequenz den offenen Leserahmen (ORF) und verhindern als Konsequenz, dass sich dieser Klon repliziert (Fig. 8). Die chromosomale Lage von PERV-B(Bac- 192B9) ist 7p1.1 und kartiert daher bei dem SLA.

Die Sequenzen von PERV-A(Bac-130A12) und PERV-B(Bac-192B9) zeigten eine nahe Verwandtschaft zu proviralen PERV-Sequenzen, die zuvor beschrieben wurden (Czauderna et al., 2000). PERV-A(Bac-130A12) ist nahezu identisch zu PK15-PERV-A(58) und weist eine Homologie von etwa 99% für die LTRs und die viralen Gene auf. Jedoch scheinen beide Klone bei verschiedenen chromosomalen Positionen zu kartieren, wie aus den flankierenden Sequenzen abgeleitet wurde. PERV-A(Bac-130A12) zeigt im Vergleich zu 293-PERV-A(42) (Czauderna F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038) eine etwas geringere Homologie von etwa 95% in den retroviralen Genen und eine völlig andere LTR-Struktur. PERV-B(Bac-192B9) zeigt eine starke Homologie (etwa 98%) zu dem Klon 293-PERV-B(33) (Czauderna F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038). Jedoch ist der LTR dieses Provirus ähnlich zu dem des Klasse A-Klons 293- PERV-A(42), der eine charakteristische 39-bp-Wiederholungsstruktur in U3 trägt (Czauderna F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038).

Die Homologiedaten für SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

TABELLE 3

Vergleich der Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der gag-, pro/pol- und env-ORF von PERV- A(Bac-130A12) und PERV-B(Bac-192B9) mit anderen proviralen PERV-Sequenzen

b. Analyse von LTR-Sequenzen

Die langen terminalen Wiederholungen (LTR) von PK15-PERV-A(58) und PK15-PERV-B(213) (Fig. 3) zeigen größere Unterschiede. Die LTR dieser proviralen PERV sind durch die invertierte Wiederholungssequenz TGAAAGG/CCTTTCA, wie für die zuvor charakteristierten Klone 293- PERV-B(33) und 293-PERV-B(43) beschrieben (Czauderna F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028- 4038), begrenzt. Ferner findet sich eine Box mit 39-bp-Wiederholungen in der U3-Region von 293-PERV-A(42) und PK15-PERV-B(213), wobei jede Wiederholung aus Unterwiederholungen mit 21 bp- und 18 bp-Motiven besteht. Im Fall von 293-PERV-A(42) finden sich drei konsekutive Wiederholungen, die sich von nt 331 bis nt 447 erstrecken. Der LTR von PK15- PERV-B(213) zeigt zwei Wiederholungen (nt 331-408). In beiden LTRs findet sich eine 18-bp- Wiederholung, die der Triplex- bzw. Duplex-Wiederholungsbox vorausgeht. Somit gleicht der LTR von PK15-PERV-B(213) dem LTR des molekularen Klons 293-PERV-B(43) (Czauderna, F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038), wobei eine Homologie von 99,0% vorhanden ist.

Der LTR von PK15-PERV-A(58) trägt eine 21-bp- und eine 18-bp-Unterwiederholung, wobei beide zwei nt-Austausche aufweisen, die voneinander getrennt sind (nt 417-437 bzw. nt 462-480) (Fig. 3). Die U3-Sequenz von PK15-PERV-A(58) zeigt Homologien von 59,0% und 65,2% im Vergleich zu dem LTR von 293-PERV-A(42) bzw. PK15-PERV-B(213). Im Gegensatz dazu zeigen die R- und U5-Sequenzen von PK15-PERV-A(58) Homologien von 97,5% für 293- PERV-A(42) und 88,0% für PK15-PERV-B(213).

Beispiel 5 Phylogenetische Verwandtschaft von PERV-Klonen

Ein Vergleich der Proteine verschiedener PERV, einschließlich PERV-MSL (Akiyoshi, D. E. et al., 1998, J. Virol. 72: 4503-4507), der Klone 293-PERV-B(33)/ATG und 293-PERV-B(43) (Czauderna, F. et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038), sowie der Klone 293-PERV-A(42), PK15- PERV-A(58) und PK15-PERV-B(213), die hier beschrieben sind, zeigte eine unterschiedliche Zuordnung einzelner Klone durch eine phylogenetische Untersuchung (Fig. 2).

Die Phylogramme basieren auf den vollständigen offenen Leserahmen für Gag (A), Pro/Pol (B), und Env (C) (vgl. auch Tabelle 1). Relative Abstände sind durch Maßstabsbalken (0,1 bedeutet 10% Divergenz) angegeben.

Die Phylogramme wurden mit Hilfe von Phylip 3.574c und den Prodist- und Neighbor- Programmen erstellt (http:/ / evolution.genetics.washington.edu/phylip.html).

Im Fall von Gag wurde eine Häufung der Klone, die aus humanen 293-Zellen abgeleitet waren, gezeigt, während das Gag von PK15-PERV-A(58) zu dem Gag von PERV-MSL näher verwandt ist als zu dem Gag von PK15-PERV-B(213) (Fig. 2A). Somit scheint die Selektion, die durch serielle Passagierung von PERV auf humanen Zellen erreicht wurde (Czauderna, F, et al., 2000, J. Virol. 74: 4028-4038; Patience, C. et al., 1997, Nat. Med. 3: 282-286) einen bestimmten Gag- Typ bevorzugt zu haben (Fig. 2A). Die Pro/Pol-Sequenzen zeigen eine Verteilung gemäß der jeweiligen PERV-Klasse (Fig. 2B). Im Hinblick auf die klassenspezifische Zuordnung, insbesondere im Fall der Klasse B-Klone, könnte basierend auf Pro/Pol-Sequenzen spekuliert werden, dass die verschiedenen PERV-B-Klone aus einem Vorläufer-Provirus entstanden sind (Fig. 2B). Der "native" Klon PK15-PERV-B(213) ist zu den von 293 abgeleiteten Klonen 293- PERV-B(33) und 293-PERV-B(43) nahe verwandt. Jedoch zeigen die zwei PERV-A-Klone eine höhere Divergenz für Pro/Pol. Env zeigt eine klassenähnliche Verteilung (LeTissier, P. et al., 1997, Nature 389: 681-682) wie erwartet, wobei die Klasse B-Sequenzen einen Zweig bilden (Fig. 2C). Interessanterweise liegen die Klone 293-PERV-A(42) und PK15-PERV-A(58) proximal zu PERV-MSL in Env. PERV-MSL zeigt eine allgemeine Proximität zu PK15-PERV- A(58) für alle drei ORF.

Beispiel 6 Nachweis einer proviralen PERV-Integration

Für den Nachweis einer proviralen PERV-Integration wurde genomische DNA aus verschiedenen Zeillinien isoliert, die durch Standardverfahren bis zur Konfluenz vermehrt worden waren (Sambrook, J., E. F. Fritsch, und T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y). Die genomische DNA wurde sodann durch PCR auf das Auftreten von proviralen Integrationen untersucht.

Für eine Analyse durch PCR wurde eine provirale Integration von PERV durch Amplifikation von pro/pol-Sequenzen mit Hilfe der Oligonukleotide PK1 (5'-TTG ACT TGG CAG TGG GAC GGG TAA C-3', Nukleotid (nt) 2886-2910) und PK6 (5'-GAG GGT CAC CTG AGG GTG TTG GAT-3', nt 3700-3677) in einer ersten Amplifikation und PK2 (5'-GGT AAC CCA CTC GTT TCT GGT CA-3', nt 2905-2927) und PK5 (5'-CTG TGT AGG GCT TCG TCA AAG ATG-3', nt 3657-3634) in einer ineinandergesetzten (nested) Amplifikation getestet. Die nt-Positionen betreffen 293-PERV-A(42).

Alle in den Infektionsuntersuchungen verwendeten Zelllinien, 293, HeLa, D17, und PG-4, zeigten das erwartete 729 bp-Ampliflkationsprodukt nach einer Infektion, wie für 293-PERV- A(42), PK15-PERV-A(58), und PK15-PERV-B(213) (Fig. 4) dargestellt. Das Vorhandensein episomaler PERV-DNA wurde durch Verwendung von Cäsiumchlorid-Gradienten-gereinigter genomischer DNA aus infizierten Zeillinien für die Amplifikation des 729 bp pro/pol-Fragments ausgeschlossen.

Beispiel 7 Nachweis einer produktiven Infektiösität verschiedener PERV-Klone durch indirekte Immunfluoreszenzanalyse

Da verschiedene Zelllinien als zugänglich für eine PERV-Infektion beschrieben wurden (Takeuchi, Y. et al., 1998, J. Virol. 72: 9986-9991), wurde die Fähigkeit von 293-PERV-A(42), PK15-PERV-A(58), und PK15-PERV-B(213), Zellen produktiv zu infizieren, durch indirekte Immunfluoreszenzanalysen unter Verwendung eines PERV-spezifischen Gag p10-Antiserums untersucht (Krach, U. et al., 2000, Xenotransplantation 7: 221-229). Humane 293- und HeLa- Zellen sowie kanine D17-Zellen und feline PG-4-Zellen wurden mit PERV infiziert und 48 bis 72 Stunden nach Infektion (p. i.) mit 2% Formaldehyd fixiert. Indirekte Immunfluoreszenzanalysen erfolgten wie zuvor beschrieben (Krach, U. et al., 2000, Xenotransplantation 7: 221-229). Unterschiedliche Signale wurden für alle drei Viren nach einer Inkubation mit dem Antikörper erhalten (Fig. 5). 293-PERV-A(42) und PK15-PERV-B(58) zeigten eine signifikante Gag- Expression 8-12 Tage nach Infektion in allen Zelllinien, ähnlich zu dem Muster, das bei 293- Zellen vorgefunden wurde, die mit dem molekularen Klon 293-PERV-B(33)/ATG infiziert wurden (Krach, U. et al., 2000, Xenotransplantation 7: 221-229; Daten nicht gezeigt). PK15- PERV-B(213) zeigte jedoch eine niedrigere Gag-Expression (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 8 Nachweis des Auftretens infektiöser replikationskompetenter Viruspartikel durch RT- Analyse

Um das Auftreten infektiöser und replikationskompetenter Viruspartikel zu bestätigen, wurden die RT-Aktivitäten in dem Überstand von Zelllinien im Verlauf einer Infektion mit PERV bestimmt. Membran-gefilterte zellfreie Überstände wurden auf die RT-Aktivität unter Einsatz des C-Typ RT-Aktivitätstests (Cavidi Tech Ab, Uppsala, Schweden) gemäß den Herstellervorschriften (Protokoll B) getestet.

Eine Infektiosität wurde durch Beimpfen von semi-konfluenten Kulturen zugänglicher Zelllinien mit zellfreien Überständen von Produktionszellen nach Filtration durch Membranen mit einer Porengröße von 0,45 µm (Sartorius, Göttingen, Deutschland) getestet. Zellfreie Überstände aus D17-, PG-4-, HeLa- und 293-Zellen, die mit den molekularen Klonen 293-PERV-A(42), PK15- PERV-A(58) und PK15-PERV-B(213) infiziert worden waren, wurden bis zu 51 Tage nach der Infektion (p. i.) gewonnen.

Im Fall des Klons 293-PERV-A(42) wurde eine RT-Aktivität von bis zu 500 mU/ml bei PG-4- Zellen gemessen (Fig. 7A). Ferner zeigte 293-PERV-A(42) anfänglich eine Aktivität von 100 mU/ml (Tag 13) nach Infektion von D17-Zellen, die vom Tag 20 an abnahm. 293-PERV-A(42) zeigte nur eine schwache RT-Aktivität auf HeLa-Zellen am Tag 51 und replizierte nicht auf 293- Zellen. Der Klon PK15-PERV-A(58) zeigte RT-Aktivitäten, die kaum über dem Hintergrund lagen (Fig. 7B). Im Gegensatz zu dem Klon 293-PERV-A(42) zeigte der Klon PK15-PERV- A(58) eine RT-Aktivität auf 293-Zellen am Tag 40 p. i. PK15-PERV-B(213) zeigte RT- Aktivitäten bei einer Infektion von 293- und HeLa-Zellen (Daten nicht gezeigt). Im Fall von 293- Zellen wurde eine transiente Aktivität von bis zu 4 mU/ml am Tag 21 nachgewiesen. HeLa- Zellen zeigten RT-Aktivitäten in einem Bereich von 2 bis 4 mU/ml bis zum Tag 57. Alle anderen Zelllinien zeigten nur Hintergrundaktivitäten (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 9 Herstellung von PERV-flankierenden Sequenzen für ein Screening von proviralen Integrationsstellen

Chromosomale Sequenzen, die benachbart zu den proviralen Sequenzen der Klone PERV-A(Bac- 130A12), PERV-B(Bac-192B9) liegen, wurden durch inverse PCR nachgewiesen, wobei Verfahren eingesetzt wurden, die im wesentlichen den beschriebenen entsprechen (Tönjes et al., 1999, J. Virol. 73: 9187-9195). Die Amplifikationsprodukte wurden in pGEM-T Easy kloniert und die Sequenzen wurden bestimmt. Restriktionsenzyme und Oligonukleotid-Primer, die für geeignete inverse PCR-Reaktionen verwendet wurden, sind in Tabelle 4 angegeben.

TABELLE 4

Sequenzen und Positionen von Oligonukleotid-Primern, die für eine inverse PCR für die Herstellung benachbarter chromosomaler Sequenzen der Klone PERV-A(Bac-130A12) und PERV-B(Bac-192B9) verwendet wurden

Beispiel 10 Unterscheidung von PERV-Klassen durch PCR

Für eine Unterscheidung proviraler Sequenzen von PERV-A und PERV-B wurden env-A- und env-B-spezifische Oligonukleotid-Primer in PCR-Experimenten verwendet. Die verwendeten Oligonukleotide sind env-A-for (CAA TCC TAC CAG TTA TAA TCA ATT, nt 6638-6661), env-A-rev (TCG ATT AAA GGC TTC AGT GTG GTT, nt 7334-7311), env-B-for (GTG GAT AAA TGG TAT GAG CTG GGG, nt 6711-6734), und env-B-rev (CTG CTC ATA AAC CAC AGT ACT ATA, nt 7287-7264). Die nt-Positionen für env-A und env-B betreffen 293-PERV- A(42) bzw. PK15-PERV-B(213).

Zugangsnummern der Nukleotidsequenzen

Die für die Homologieuntersuchungen verwendeten Sequenzen sind 293-PERV-B(33) (AJ133816), 293-PERV-B(43) (AJ133818), und PERV-MSL (AF038600).

Beispiel 11 Herstellung und Testen von PERV-Antikörpern a. Herstellung von PERV-Antiseren

Die Peptide p30U (NH2-PGW DYN TAE GRE SLC- COOH, Aminosäuren (As) 303-316, Nukleotide (nt) 907-948), p30D (NH2-LRG ASR RPT NLA KVC-COOH, As 327-340, nt 979-1020), und p15E (NH2-VLR QQY QGL LSQ GET DL- COOH, As 641-657, nt 1921-1971), die von den Gag- und Env-Sequenzen von PERV abgeleitet waren, wurden für die Herstellung von Antiseren verwendet (Fig. 9). Die Positionen betreffen den Klon PERV-B(33)/ATG (Czauderna et al., 2000).

Die Antigene wurden von Eurogentec (Belgien) synthetisiert, durch HPLC gereinigt und mit Hämocyanin der Napfschnecke (KLH) für die Immunisierungen gekoppelt. Polyklonale Antiseren wurden in Kaninchen unter Verwendung von entweder vollständigem Freundschem Adjuvans für die erste Immunisierung oder unvollständigem Freundschem Adjuvans für die Verstärkerimmunisierungen hergestellt.

b. Zellen

293-humane embryonale Nierenzellen (ECACC, Nr. 85120602) und 293-Zellen, die konstitutiv PERV produzieren (293 PERV-PK) wurden freundlicherweise von Dr. Weiss, London, bereitgestellt. Zusätzlich wurden 293-Zellen verwendet, die mit dem molekularen Klon PERV-B(33)/ATG infiziert worden waren, der infektiöse Virionen produzierte (Czauderna et al., 2000). SHi5-Insektenzellen (Hi5-Zellen, für ein Wachstum in serumfreien Medien angepasst) wurden zuvor beschrieben (Krach et al., 2000). Eine Expression der Gag- und Env-Proteine von PERV erfolgte durch Infektion von Shi5-Zellen mit den rekombinanten Baculoviren Bac-PERV- G, Bac-PERV-E(A) oder Bac-PERV-E(B), die die gag (nt 1145-2728)-, env-A (nt 6153-8114)- oder env-B (nt 6183-6208)-Gene von PERV tragen, und darauffolgende Immunfluoreszenz untersuchungen. Die exprimierten Sequenzen waren von den Klonen PERV-A(42) [env-A] und PERV-B(33) [gag, env-B] (Czauderna et al., 2000) abgeleitet und wurden in den Baculovirus- Transfervektor pBac2cp (Calbiochem-Novablochem, Deutschland) kloniert. Rekombinante Baculoviren wurden wie beschrieben hergestellt (Krach et al., 2000).

c. Indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie

Zellen wurden bis zur Konfluenz auf Deckgläsern vermehrt, mit 2% Formaldehyd 20 min fixiert und dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Nach Permeabilisierung mit 0,5% Triton X-100 für 10 min und Blockieren für 10 min mit 1% BSA-Lösung wurden die Zellen mit einer 1 : 500-Verdünnung von entweder Antiserum oder Präimmunserum für 30 min inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit einer 1 : 1000-Verdünnung von Indocarbocyanin-konjugiertem anti-Kaninchen-Immunglobulin- Sekundärantikörper (Dianova, Deutschland) für 30 min. Eine indirekte Immunfluoreszenz für die Untersuchung der Gag- oder Env-Proteinexpression von PERV erfolgte mit Hilfe eines Laser- Abtastmikroskops wie zuvor beschrieben (Tönjes et al., 1997).

d. Immunoblotting

Sucrose-Gradienten-gereinigte PERV-Partikel und Lysate der Zelllinie 293 PERV-PK wurden durch 10% SDS-Polyacrylamidgelelectrophorese (SDS PAGE) und Western- Blotting unter Verwendung von Polyvinylidendifluorid-Membranen (Millipore, Deutschland) untersucht. Die Blots wurden mit einer 1 : 1000-Verdünnung von Antiseren 1 Stunde oder über Nacht, gefolgt von einer 1 : 10 000-Verdünnung von Protein G-konjugierter Meerrettich- Peroxidase (BioRad, Deutschland) für 1 Stunde inkubiert. Immunreaktive Proteine auf den Membranen wurden mit Hilfe des ECL-Systems und einer Exposition für 15-20 sec auf Hpyerfilm ECL (Amersham-Pharmacia, Deutschland) nachgewiesen.

e. Reinigung von PERV-Partikeln

Retrovirale Partikel wurden aus Kulturüberständen von 293 PERV-PK-Zellen durch Zentrifugation mit einem Sucrosekissen isoliert. Die Stammlösungen wurden für eine weitere Verwendung bei -80°C gelagert.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Replikationskompetenter molekularer Klon von porcinem endogenem Retrovirus (PERV), wobei der molekulare Klon aus porcinen Zellen isoliert wurde und bei einer Transfektion in zugängliche Zellen replikationskompetent ist.

2. Replikationskompetenter molekularer Klon gemäß Anspruch 1, wobei der Klon ein PERV-A-Klon ist.

3. Replikationskompetenter molekularer Klon gemäß Anspruch 2, wobei der Klon durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die SEQ ID NO: 1 entspricht.

4. Replikationskompetenter molekularer Klon gemäß Anspruch 1, wobei der Klon ein PERV-B-Klon ist.

5. Replikationskompetenter molekularer Klon gemäß Anspruch 4, wobei der Klon durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die SEQ ID NO: 2 entspricht.

6. Replikationskompetenter molekularer Klon von PERV-A oder PERV-B, wobei der Klon aus einer porcinen bakteriellen künstlichen chromosomalen Bibliothek isoliert wurde.

7. Replikationskompetenter molekularer Klon gemäß Anspruch 6, wobei der Klon ein PERV-A-Klon ist, wobei der PERV-A-Klon durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die SEQ ID NO: 3 entspricht.

8. Replikationskompetenter molekularer Klon gemäß Anspruch 6, wobei der Klon ein PERV-B-Klon ist, wobei der PERV-B-Klon durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die SEQ ID NO: 4 entspricht.

9. Env-Polypeptid, das durch die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 4 kodiert wird.

10. Gag-Polypeptid, das durch die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 4 kodiert wird.

11. Porcine Nukleinsäuresequenz, wobei die Nukleinsäuresequenz die 5'- oder 3'-flankierende Sequenz der Integrationsstelle eines replikationskompetenten molekularen Klons in dem porcinen Genom ist.

12. Porcine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 10, wobei die Nukleinsäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
der 5'-flankierenden Sequenz des PERV-A-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 5,
der 3'-flankierenden Sequenz des PERV-A-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 6,
der 5'-flankierenden Sequenz des PERV-B-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 7,
der 3'-flankierenden Sequenz des PERV-B-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 8,
der 5'-flankierenden Sequenz des PERV-A-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 9,
und den 3'-flankierenden Sequenzen des PERV-A-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 10,
den 5'-flankierenden Sequenzen des PERV-B-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 11,
und/oder den 3'-flankierenden Sequenzen des PERV-B-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 12.

13. Oligonukleotid für den Nachweis von integrierten PERV, wobei das Oligonukleotid 12-60 Nukleotide umfasst von:
der 5'-flankierenden Sequenz des PERV-A-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 5,
der 3'-flankierenden Sequenz des PERV-A-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 6,
der 5'-flankierenden Sequenz des PERV-B-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 7,
der 3'-flankierenden Sequenz des PERV-B-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 8,
der 5'-flankierenden Sequenz des PERV-A-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 9,
und den 3'-flankierenden Sequenzen des PERV-A-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 10,
den 5'-flankierenden Sequenzen des PERV-B-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 11,
und/oder den 3'-flankierenden Sequenzen des PERV-B-Klons, identifiziert durch SEQ ID NO: 12,
oder ein Oligonukleotid, das zu einer der flankierenden Sequenzen komplementär ist und 12-60 Nukleotide umfasst,
oder das an die flankierenden Sequenzen hybridisiert und 17-60 Nukleotide umfasst.

14. Oligonukleotid gemäß Anspruch 12, wobei das Oligonukleotid 20 bis 30 Nukleotide umfasst.

15. Verfahren zum Nachweis des Auftretens infektiöser PERV-Partikel in einer Probe, wobei das Verfahren den Nachweis infektiöser PERV unter Verwendung der Oligonukleotide gemäß den Ansprüchen 12 bis 13 umfasst.

16. Verfahren zum Nachweis des Auftretens infektiöser PERV-Partikel in einer Probe, umfassend den Nachweis der Nukleinsäuresequenzen eines replikationskompetenten molekularen Klons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.

17. Verfahren zum Nachweis des Auftretens infektiöser PERV-Partikel in einer Probe, umfassend den Nachweis der Polypeptide gemäß Anspruch 9.

18. Vaccine für eine Immunisierung eines Wirts gegen ein replikationskompetentes PERV, umfassend eine wirksame Menge von Polypeptiden gemäß Anspruch 9.

19. Verfahren zur Isolierung eines replikationskompetenten molekularen Klons von PERV, umfassend die Schritte:

a) Herstellen einer DNA-Bibliothek aus der porcinen Zelllinie PK15, wobei die Zelllinie infektiöse PERV-Partikel freisetzt,
b) Screening der DNA-Bibliothek mit einer PERV-spezifischen pro/pol-Sonde,
c) Isolierung von Klonen, die provisale Sequenzen enthalten, die mit der PERV- Spezifischen pro/pol-Sonde reagieren, aus der DNA-Bibliothek,
d) Untersuchung der proviralen Sequenzen aus der DNA-Bibliothek durch PCR, wobei PCR-Primer eingesetzt werden, die spezifisch für PERV-A- und PERV-B- env-Gene sind, und
e) Bestimmen des Auftretens eines proviralen ORF in den isolierten proviralen Sequenzen durch einen Protein-Verkürzungstest (PTT).

20. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei nach dem Schritt (e) die Replikationskompetenz des isolierten Klons bestimmt wird durch

a) Transfektion von zugänglichen Zellen mit dem isolierten Klon und
b) Nachweis einer Expression und produktiven Infektion zugänglicher Zellen durch indirekte Immunfluoreszenzanalyse unter Verwendung eines PERV-spezifischen Gag p10-Antiserums und Bestimmen der reverse Transkriptase-Aktivität in den Überständen der infizierten zugänglichen Zellen.

21. Verfahren gemäß den Ansprüchen 19 und 20, wobei in Schritt (a) eine porcine bakterielle künstliche chromosomale Bibliothek aus primären Fibroblasten hergestellt wird, die von großen weißen Schweinen abgeleitet sind.