DE60115849T2

DE60115849T2 - Methode und katalytisches system zur stereoselektiven invertierung eines chiralen zentrums in einer chemischen verbindung

Info

Publication number: DE60115849T2
Application number: DE60115849T
Authority: DE
Inventors: Weiguo Liu; Scott Laneman; John David AGER; Phillip Paul TAYLOR
Original assignee: EXCELSYN MOLECULAR DEV Ltd; EXCELSYN MOLECULAR DEVELOPMENT Ltd FLINTSHIRE
Current assignee: EXCELSYN MOLECULAR DEV Ltd; EXCELSYN MOLECULAR DEVELOPMENT Ltd FLINTSHIRE
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2001-02-22
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-02-23
Also published as: AU2001247218A1; WO2001062948A2; US20010021519A1; US6365380B2; WO2001062948A3; DE60115849D1; ATE312936T1; EP1257659A2; EP1257659B1; JP2003523750A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von chiralen organischen Verbindungen über katalysierte Reaktionen. Noch spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein katalytisches System, das sowohl ein metallisch katalysiertes Wasserstoff-Übertragungssystem, als auch ein enzymatisch oder mikrobiologisch katalysiertes Oxidationssystem einschließt. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenso auf ein Verfahren zur Verwendung dieses Systems für die Herstellung von optisch aktiven Aminosäuren.
KURZE BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Die traditionelle chemische Katalyse bezieht sich im Allgemeinen auf Verfahren, in welchen chemische Reaktionen durch Säuren, Basen, Metalle, Metallsalze oder organometallische Verbindungen katalysiert werden, während die Biokatalyse dazu verwendet wird, um Reaktionen zu beschreiben, welche durch Proteine, Enzyme, andere Biomoleküle oder Mikroorganismen katalysiert werden. Die traditionelle chemische Katalyse befand sich in der chemischen Industrie lange in Verwendung für die Herstellung von Petrochemikalien, Feinchemikalien und Spezialitätenchemikalien. Obwohl die Fermentation schon lange für die Herstellung von gewissen Bedarfschemikalien angewendet wurde, hat in jüngster Zeit die Biokatalyse sich auf Herstellung von hochwertigen Feinchemikalien, insbesondere chiralen chemischen Zwischenprodukten für Pharmazeutika und andere biologisch aktive Mittel fokussiert.
Jede Art der Katalyse weist ihre Vorteile und Nachteile auf. Die traditionelle chemische Katalyse bezieht hohe Temperatur, hohen Druck und niedrige chemische Selektivität ein, ist aber typischer Weise kosteneffektiv und effizient. Die Biokatalyse arbeitet unter milden Reaktionsbedingungen und hoher chemischer Selektivität und Stereoselektivität, ist aber gewöhnlich mit hohen Kosten verbunden. Diese zwei Arten von Katalyse werden gewöhnlicher Weise in sehr unterschiedlichen Verfahren angewendet und sind nur sehr selten miteinander verknüpft. Katalytische Übertragungs-Hydrierungsreaktionen zum Beispiel wurden breitgefächert in der Reduktion einer Vielzahl von funktionellen Gruppen von organischen Verbindungen angewendet, wie die Reduktion von Ketonen und Aldehyden (Ram S.; Spicer, L. D.; Tetrahedron Lett. 1988, 29(31), 3741), Olefinen (Ranu, B. C.; Sarkar, A.; Tetrahedron, Lett. 1994, 35(46), 8649), Aziden (Gartiser, T.; Selve, C.; Delpuech, J.-J.; Tetrahedron Lett. 1983, 24(15), 1609), Epoxiden (Dragovich, P. S.; Prins, T. J.; Zhou, R.; J. Org. Chem. 1995, 60, 4922), Nitraten (Barett, A. G. M.; Spilling, C. D.; Tetrahedron Lett. 1988, 29, 5733) und aromatischen Ringen (Balezewski, P.; Joule, J. A.; Syn. Commun., 1990, 20, 2851).
Die Veröffentlichung WO 9814602-A offenbart ein Verfahren der Herstellung von D-Aminosäuren durch Fermentation.
Ein katalytisches Übertragungs-Hydrierungssystem bezieht typischer Weise einen metallischen oder Metallkomplexkatalysator wie Palladium-Kohlenstoff und eine Wasserstoffquelle wie Ammoniumformat oder Cyclohexen ein. Die Wasserstoffquelle gibt Wasserstoff oder Hydrid frei, wenn die Reaktion fortschreitet. Ein Hauptvorteil gegenüber der herkömmlichen katalytischen Hydrierung, welche spezielle Geräte zur Handhabung von Wasserstoffgas und Druck benötigt, ist, dass die Reduktion gewöhnlicher Weise unter atmosphärischem Druck ohne einen großen Überschuss von Wasserstoffgas durchgeführt wird. Obwohl viele verschiedene Katalysatoren und Wasserstoffquellen in katalytischen Übertragungs-Hydrierungssystemen verwendet wurden, ist ein Ammoniumformat/Palladium auf Kohlenstoff (Pd-C)-System das vielseitigste und praktischste katalytische Wasserstoff-Übertragungsmittel. Es wurde für die Reduktion verschiedener Funktionalitäten verwendet (Johnstone, R. A. W.; Wilby, A. H.; Entwistle, I. D.; Chem. Rev., 1985, 85, 129). Nach unserem besten Stand des Wissens wurde das System jedoch nie in Kombination mit einem biokatalytischen System oder in der Gegenwart von Biokatalysatoren wie Enzymen oder Mikroorganismen angewendet.
Mit Ausnahme von Glycerin besteht jede der herkömmlichen Aminosäuren als eines von zwei optischen Isomeren, linksdrehend oder rechtsdrehend genannt, abhängig von der Richtung, in welcher sie eine Ebene von polarisiertem Licht zum Drehen bringen. Durch Festlegung werden Aminosäuren ebenso als D- oder L- bezeichnet, darauf beruhend, ob die Konfiguration um den α-Kohlenstoff der Aminosäure dem D- oder L-Stereoisomer (Enantiomer) von Glyceraldehyd, dem beliebigen Standard, entspricht. Beruhend auf diesem Standard sind die meisten natürlich vorkommenden Aminosäuren L-Aminosäuren, trotz dem, dass einige von ihnen rechtsdrehend sind, wenn sie in einer wässrigen Lösung bei neutralem pH-Wert platziert werden.
Auf der anderen Seite sind Aminosäureoxidasen und Aminosäuredeaminasen Klassen von Enzymen, welche die stereoselektive Oxidation einer Aminosäure katalysieren, um die entsprechende Ketosäure zu erzeugen. Gemäß ihrer Stereoselektivität werden jene Enzyme, die nur die L-Aminosäuren oxidieren, L-Aminosäureoxidasen (oder Deaminasen) genannt, während jene, welche nur auf die D-Aminosäuren wirken, D-Aminosäureoxidasen (oder Deaminasen) genannt werden.
In der Anwesenheit von sowohl L- als auch D-Aminosäuren werden die L-Aminosäureoxidasen (und Deaminasen) nur die L-Aminosäuren oxidieren, während sie die D-Aminosäuren unberührt lassen, wohingegen die D-Aminosäurenoxidasen (Deaminasen) genau das Gegenteil tun werden. Beruhend auf dieser hoch stereoselektiven Natur wurden die Enzyme in Kombination mit anderen Enzymen oder chemischen Reagenzien für die stereospezifische Umwandlung von Aminosäuren von einem Enantiomer in das andere verwendet. L-Aminosäuredeaminasen (und Oxidasen) wurden in Kombination mit D-Aminosäuretransaminasen für die stereospezifische Umwandlung von L-Aminosäure zu D-Aminosäure angewendet. Die L-Aminosäuredeaminase katalysiert die Umwandlung von L-Aminosäuren zu den α-Ketosäuren, welche als Substrate zu D-Aminosäuren zugeführt und auf diese Weise in D-Aminosäuren umgewandelt werden.
Eine andere Anwendung bezieht die Verwendung von Aminosäureoxidaseenzymen in Kombination mit Natriumborhydrid ein. In diesem Fall katalysiert eine Aminosäureoxidase die stereoselektive Dehydrierung der α-Aminogruppe in einer Aminosäure, um ein Imin-Zwischenprodukt zu erzeugen, welches augenblicklich zu dem racemischen Amin oder der racemischen Aminosäure durch Natriumborhydrid, welches in dem System vorhanden ist, zurück reduziert wird. Weil das Enzym nur auf ein spezifisches Enantiomer der Aminosäure wirkt, ohne das andere zu beeinflussen, wandelt dieses Enantiomer sich konstant in das Racemat um, während es dem anderen Enantiomer ermöglicht, zu akkumulieren. Das Endergebnis dieser dynamischen Auflösung ist die komplette Umwandlung der Aminosäure von einem Enantiomer in das andere.
Zum Beispiel ist die Synthese von L-Prolin aus D-Prolin unter Verwendung von D-Aminosäureoxidase und Natriumborhydrid bekannt, siehe Huh, et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 74, Nr. 3, 189–190 (1992). In ähnlicher Weise wurde die Synthese von L-Pipecolinsäure aus D-Pipecolinsäure unter Verwendung von D-Aminosäureoxidase und Natriumborhydrid ebenso beschrieben, siehe Huh, et al., BioSci. Biotech. Biochem., 56(12), 2081–2082 (1992). Die Umwandlung von D-Alanin zu L-Alanin unter Verwendung von D-Aminosäureoxidase und Natriumborhydrid und die Umwandlung von L-Leucin zu D-Leucin unter Verwendung von L-Aminosäureoxidase und Natriumborhydrid sind ebenso bekannt, siehe Hafner et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 68, Nr. 5, 987–991 (1971).
Die Verwendung von Natriumborhydrid in Kombination mit Aminosäureoxidaseenzymen, um Aminosäuren von einem Enantiomer in das andere Enantiomer stereospezifisch umzuwandeln, weist verschiedene Nachteile auf, die seine industrielle Anwendung begrenzen. Natriumborhydrid und einige seiner Derivate sind gegenüber Wasser empfindlich und zersetzen sich in Säure oder neutralem pH leicht, bei welchem die Aminosäureoxidaseenzyme seine maximale Aktivität und Stabilität besitzt. Damit die Reduktion effektiv fortschreitet, war das Hydridreagenz häufig langsam zuzugeben, in vielfachen Intervallen über eine lange Zeitspanne und in großem molaren Überschuss. Der große Überschuss von Borhydrid führt häufig zu einer schnellen Deaktivierung oder Zerstörung der Oxidaseenzyme, wie auch zu einem signifikanten Anstieg der Kostenstruktur für ein potentielles industrielles Verfahren. Zusätzlich zu diesem Problem werden die Reaktionen unter Verwendung von gereinigten Enzymen ausgeführt, welche nur in sehr kleinen Mengen zu großen Kosten erhältlich sind.
Daher wäre es in höchstem Maße wünschenswert, ein katalytisches Hydrierungssystem in Kombination mit einem Aminosäureoxidasesystem zur Verfügung zu stellen, um die stereospezifische Umwandlung von Aminosäure zu bewirken. In dieser neuen Kombination würde das Imin-Zwischenprodukt, das von der Aminosäureoxidase katalysierten Dehydrierung erzeugt wurde, durch katalytische Hydrierung anstatt von Borhydridreduktion zu der Aminosäure zurück reduziert werden. Das katalytische Hydrierungssystem würde einen metallischen Katalysator und einen kostengünstigen Sauerstoffdonator umfassen, welche zusammen eine effiziente Reduktionskraft erzeugen würden, ohne die Aminosäureoxidasenzyme zu schädigen oder insbesondere bevorzugt die Mikroorganismuszellen, welche diese Enzyme herstellen. Ein solches Katalysatorsystem würde die stereospezifische Umwandlung von Aminosäuren zu ihren entsprechenden Enantiomeren in einem industriellen Maßstab auf einer praktikablen und kosteneffektiven Grundlage ermöglichen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein katalytisches System nach Anspruch 1 zur Verfügung, welches eine katalytische Übertragungs-Hydrierung mit Aminosäureoxidase (oder Aminosäuredeaminase) katalysierten Oxidationsreaktionen kombiniert. Die vorliegende Erfindung. stellt auch ein Verfahren zur stereoselektiven Umwandlung von Aminosäuren von einem Enantiomer in das andere oder von racemischen Mischungen zu dem optisch aktiven Isomer zur Verfügung. Das Katalysatorsystem der vorliegenden Erfindung schließt bevorzugt ein: (i) ein Metall, Metallsalz oder Metallkomplex-Katalysator; (ii) eine Wasserstoffquelle; (iii) ein Enzym, welches dazu fähig ist, die chemische Verbindung in dem chiralen Zentrum gemäß Anspruch 1 zu oxidieren, oder einen Mikroorganismus, welcher dazu fähig ist, ein Enzym herzustellen, das dazu fähig ist, die chemische Verbindung an den chiralen Zentrum gemäß Anspruch 1 zu oxidieren, und (iv) ein Oxidationsmittel wie Sauerstoff. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt den Schritt der Behandlung einer Aminosäure mit einem Katalysatorsystem der vorliegenden Erfindung ein.
Die vorliegende Erfindung kann zum Umwandeln von optisch aktiven Aminosäuren zu ihren entgegengesetzten Stereoisomeren oder zum Übertragen von racemischen Aminosäuren zu ihren optisch aktiven Stereoisomeren verwendet werden. Auf diese Weise wird hierin ein Katalysatorsystem und ein Verfahren zur Herstellung von Deaminosäuren aus ihren entsprechenden L-Aminosäuren oder racemischen Mischungen zur Verfügung gestellt.
In der vorliegenden Erfindung wird eine D-Aminosäure durch Behandeln ihrer entsprechenden L-Aminosäure oder einer racemischen Mischung mit einem Aminosäuredeaminaseenzym in der Gegenwart eines metallischen Katalysators, eines Oxidationsmittels, einer Wasserstoffquelle und optional aber bevorzugt eines Puffers hergestellt.
Diese Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure durch Behandeln ihrer entsprechenden L-Aminosäure oder der Mischung von D- und L-Aminosäuren mit Mikroorganismuszellen zur Verfügung, welche ein Aminosäuredeaminaseenzym herstellen, in der Gegenwart eines Metallkatalysators, eines Oxidationsmittels, einer Wasserstoffquelle und optionell aber bevorzugt eines Puffers.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Aminosäureoxidasen sind eine Klasse von Oxidoreduktasen, die die α-Aminogruppe von Aminosäuren stereoselektiv oxidieren, um die entsprechende Ketosäure herzustellen. Es wird angenommen, dass die Oxidation die enzymatische Dehydrierung der α-Aminogruppe der Aminosäure einbezieht, um ein Imin-Zwischenprodukt zu bilden, welches eine nicht katalysierte Hydrolyse durchläuft, um die Ketosäure zu ergeben. Die enzymatische Oxidationsreaktion ist stereoselektiv. Daher kann nur die L- oder die D-Aminosäure durch ein vorgegebenes Aminosäureoxidaseenzym oxidiert werden. Die gleiche Reaktion wird ebenso durch Aminosäuredeaminaseenzyme katalysiert. In einem gewissen pH-Wert-Bereich ist es möglich, das Imin-Zwischenprodukt einer Metall katalysierten Hydrierungsreaktion auszusetzen, um die Aminosäure in racemischer Form zu regenerieren.
Es wurde entdeckt, dass gewisse katalytische Übertragungs-Hydrierungssysteme in Kombination mit Aminosäureoxidaseenzymen und Aminosäuredeaminaseenzymen verwendet werden können, ohne deren enzymatische Aktivität und Stabilität zu beeinflussen. Überraschender Weise wurde ebenso entdeckt, dass diese metallischen Katalysatorsystemen mit Mikroorganismuszellen kompatibel sind, einschließlich mutierter Stränge von E. coli, welche dazu fähig sind, solche Enzyme herzustellen. Daher ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, Aminosäuren zu ihren entsprechenden Enantiomeren durch Behandlung mit einem Katalysatorsystem umzuwandeln, welches ein katalytisches Übertragungs-Hydrierungssystem und ein biokatalytisches Oxidationssystem umfasst, ohne den Biokatalysator zu zerstören.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Ammoniumformat in das Katalysatorsystem sowohl als Puffersalz für den Biokatalysator als auch als Wasserstoffdonator für die katalytische Übertragungs-Hydrierung eingeschlossen. Die metallischen Katalysatoren in Kombination mit Ammoniumformat bilden Wasserstoff-Übertragungssysteme, welche mit den Enzymen oder Mikroorganismuszellen kompatibel sind. Die Nützlichkeit dieser Erfindung ist nicht auf die zuvor beschriebene stereospezifische Aminosäure-Umwandlungsreaktion begrenzt. Anstatt dessen ist die potentielle Anwendbarkeit dieser Erfindung viel breiter. Weil metallisch katalysierte Wasserstoff-Übertragungs-Hydrierungen zum Beispiel, welche einen geeigneten Wasserstoffdonator wie Ammoniumformat verwenden, für die Reaktion einer großen Vielzahl von organischen und chemischen Gruppen wie Olefine, Ketone, Aldehyde, Nitrile und aromatische Ringe bekannt sind, kann das Katalysatorsystem dieser Erfindung mit Enzymen oder Mikroorganismuszellen gekoppelt werden, welche die Verbindungen als Substrate verwenden, oder diese als Produkte herstellen, um chemische und stereoselektive Reaktionen einschließlich einer großen Anzahl von chemischen Verbindungen zur Verfügung zu stellen.
Das Katalysatorsystem der vorliegenden Erfindung wurde auf die Umwandlung von L-Aminosäuren zu D-Aminosäuren mit guter Ausbeute und hoher optischer Reinheit angewendet. Der prozentuale enantiomere Überschuss (ee) einer D-Aminosäure, die über ihre entsprechende L-Aminosäure gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, kann durch Subtrahieren der vorliegenden Menge von L-Aminosäure von der vorliegenden Menge der D-Aminosäure, Dividieren des Ergebnisses durch die gesamte Menge von D- und L-Aminosäure und Multiplizieren mit 100 bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine L-Aminosäure oder eine racemische Mischung einer Aminosäure zu D-Aminosäure durch Behandeln der L-Aminosäure oder der racemischen Aminosäure mit Aminosäuredeaminase und Ammoniumformat/Pd-C gemäß des Verfahrens dieser Erfindung umgewandelt. Die sich ergebende D-Aminosäure wird aus der Reaktion wiederhergestellt, um die D-Aminosäure zu ergeben. Die hergestellten D-Aminosäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung wohl bekannter Verfahren für einen Fachmann isoliert werden. Zum Beispiel wird die Reaktionsmischung gefiltert oder zentrifugiert, um sowohl den biologischen als auch den chemischen Katalysator zu entfernen. Das Filtrat oder der Überstand wird durch Vakuumdestillation auf ein kleines Volumen konzentriert. Das Produkt wird durch die Einstellung des pH-Wertes ausgeschieden und ferner durch Rekristallisation gereinigt. Andere herkömmliche Isolationsverfahren für Aminosäuren können angewendet werden, wie Extrahieren der Produktlösung mit einem geeigneten mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel einschließlich n-Butanol oder durch Leiten der Produktlösung durch eine Ionenaustauschkolonne.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das Katalysatorsystem dieser Erfindung einen Puffer ein. Geeignete Puffer zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen ein jene, sind aber darauf nicht begrenzt, welche in einem pH-Wert-Bereich von etwa 5,0 bis etwa 8,0 wirkungsvoll sind, einschließlich Ammoniumformat, Natrium- oder Kaliumphosphaten, Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloride (TRIS Hcl) und Mischungen davon. Bevorzugt ist der Puffer Ammoniumformat.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließt das Katalysatorsystem der vorliegenden Erfindung einen Mikroorganismus ein, welcher dazu fähig ist, ein Enzym herzustellen, das dazu fähig ist, ein chirales Zentrum einer chiralen chemischen Verbindung nach Anspruch 1 zu oxidieren. In dieser Ausführungsform wird ein katalytisches System ohne die Notwendigkeit zum Isolieren des Oxidasenznyms zur Verfügung gestellt. Bevorzugt sind der metallische Katalysator und die Mikroorganismuszellen darin kompatibel, dass keiner von beiden einen bemerkenswerten schädlichen Effekt auf die Aktivität des anderen ausübt.
Die Enzyme, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen bevorzugt Aminosäureoxidaseenzyme, Aminosäuredeaminaseenzyme, welche allgemein kommerziell erhältlich sind, un dMischungen davon ein. Zum Beispiel können sowohl D- als auch L-Aminosäureoxidasen aus verschiedenen unterschiedlichen Ursprüngen von Sigma-Aldrich Fine Chemicals bezogen werden. Die Auswahl von in dem Verfahren der Erfindungen zu verwendenden Enzymen wird von der speziellen gewünschten stereospezifischen Reaktion abhängen. Wo es zum Beispiel gewünscht ist, eine L-Aminosäure zu einer D-Aminosäure umzuwandeln, ist das bevorzugte Enzym eine L-Aminosäureoxidase oder Deaminase.
Mikroorganismuszellen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen bevorzugt jene ein, welche das Enzym nach Anspruch 1 herstellen, und mit den metallischen Katalysatorsystem dieser Erfindung kompatibel sind. Insbesondere bevorzugt sind die Mikroorganismuszellen E. coli Zellen, welche das gewünschte Enzym herstellen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen E. coli Zellen, welche ein L-Aminosäuredeaminaseenzym herstellen. Ein Strang von E. coli, welcher ein L-Aminosäuredeaminaseenzym herstellt, kann durch Einführen in die Zellen eines Plasmids hergestellt werden, welches das Gen trägt, das für die Synthese von L-Aminosäuredeaminase kodiert ist. Ein Plasmid, welches ein solches Gen trägt, kann wie in dem U.S. Patent Nr. 5,728,555 beschrieben hergestellt werden.
Die metallischen Katalysatoren, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen bevorzugt jene ein, welche mit den Enzymen und Mikroorganismuszellen der Erfindung kompatibel sind. Exemplarische metallische Katalysatoren schließen Palladium auf Kohlenstoff (Pd-C), Palladium auf Bariumsulfat, Palladium-Ruß und Mischungen davon ein. Bevorzugt ist der metallische Katalysator Palladium auf Kohlenstoff.
Die Oxidationsmittel, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen atmosphärischen Sauerstoff, Wasserstoffperoxid, NAD und Mischungen davon ein. Bevorzugt ist das Oxidationsmittel atmosphärischer Sauerstoff.
Die Wasserstoffquellen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Ammoniumformat, Natriumformat, Triethylammoniumformat, H₂ und Mischungen davon ein. Bevorzugt ist die Wasserstoffquelle Ammoniumformat. Wenn Ammoniumformat als Wasserstoffquelle und als Puffer verwendet wird, ist die bevorzugte Konzentration von Ammoniumformat etwa 0,1 M bis etwa 3,0 M.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann bei Temperatur- und pH-Wertbereichen ausgeführt werden, in welchen der Katalysator und die Enzyme stabil sind. Der bevorzugten Temperaturbereich ist etwa 15°C bis etwa 40°C. Insbesondere bevorzugt ist der Temperaturbereich von etwa 20°C bis etwa 37°C. Der bevorzugte pH-Bereich ist etwa 5,0 bis etwa 8,0, insbesondere bevorzugt etwa 6,0 bis etwa 7,0.
Die Konzentration des metallischen Katalysators, der eine katalytische Menge des Katalysators in dem Verfahren dieser Erfindung zur Verfügung stellt, wird von dem besonderen angewendeten metallischen Katalysator abhängen und liegt bevorzugt in dem Bereich von 1,0 Mol-% bis etwa 100 Mol-% beruhend auf dem Gewicht des Reaktanden. Der bevorzugte Konzentrationsbereich für den Katalysator Palladium auf Kohlenstoff ist etwa 10 Mol-% bis etwa 50 Mol-%.
Ein speziell bevorzugtes Katalysatorsystem weist ein Verhältnis des Katalysators Palladium auf Kohlenstoff zu Substrat zwischen etwa 0,001 bis 1,0 und etwa 0,1 bis 1,0 auf.
Die Konzentration des Enzyms oder der Mikroorganismuszelle, welche eine katalytische Menge eines gewünschten Enzyms in dem Verfahren dieser Erfindung zur Verfügung stellt, liegt bevorzugt in dem Bereich von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 10,0 Gew.-% beruhend auf dem Gewicht der gesamten Reaktionsmischung. Der am meisten bevorzugte Konzentrationsbereich für das Enzym oder die Mikroorganismuszellen ist etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 1,0 Gew.-% beruhend auf dem Gewicht der gesamten Reaktionsmischung.
Die Konzentration des Puffers, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist der, welcher den pH-Wert der Reaktion bei etwa 5,0 bis etwa 8,0 aufrecht erhalten wird. Bevorzugt wird der Puffer in einer Menge vorhanden sein, welche zum Aufrechterhalten des pH-Werts der Reaktion bei etwa 6,0 wirkungsvoll ist. Das kann zum Beispiel unter Verwendung einer effektiven Menge von einem einmolaren Ammoniumformatpuffer bewerkstelligt werden.
Die nun folgenden Beispiele sind als Illustration von gewissen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung gedacht, und es ist keine Begrenzung der Erfindung erwünscht.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung des BioChem Katalysators
Der Mikroorganismusstrang Escherichia coli NS 3302, welcher Aminosäuredeaminaseenzyme enthält, wurde in unseren Labors konstruiert und aufrecht erhalten, wie in dem U.S. Patent Nr. 5,728,555 beschrieben wurde. Die Produktion und Fermentation des Strangs NS 3302 wurde so ausgeführt, dass sie einem zweistufigen Standardprotokoll wie folgt folgte.

Die Kolonien des Strangs NS 3302 wurden von einer Petri-Schale in einen 280 ml Fernbachkolben eingeimpft, welcher einen Liter des folgenden Wachstumsmediums enthielt:

Kaliumphosphat (zweibasisch)	13 g
Kaliumphosphat (einbasisch)	2 g
Ammoniumphosphat	4 g
Eisenammoniumcitrat	0,24 g
Hefeextrakt	2 g
Magnesiumsulfat	1 g
L-Isoleucin	0,5 g
L-Leucin	0,5 g
L-Valin	0,5 g
Wasser	930 ml

Nach der Sterilisierung wurden die folgenden Komponenten zugegeben:

Glucose (50% w/v Brühe) 70 ml

Chloramphenicol 0,01 g
Der Kolben wurde in einen Rüttler-Brutschrank bei 30°C unter Bewegung ausgebrütet. Der Strang wurde auf 1000 bis 1900 Klett-Einheiten angewachsen und dazu verwendet, den Fermentierer einzuimpfen. Der Fermentierer war ein Biolafitt 78–100 (St. Germain- en Laye, France) 20L. Der Fermentierer wurde unter den folgenden Bedingungen betrieben:

Bewegung 500 rpm

Temperatur 30°C

Druck 0,7 Bar

pH (Aufrechterhalten mit NH₃) 7,2

Belüftung 1 vvm

Eingesetztes Volumen 11 1

Einimpfung 50 ml

Betriebszeit 19 Std.

Das Fermentationsmedium wurde aus den folgenden Komponenten, pro Liter, wenn nicht anderweitig angegeben, aufgebaut:

Magnesiumsulfat (7·H₂0)	5,35 g
Eisenammoniumcitrat	0,13 g
Kaliumphosphat (zweibasisch)	4,6 g
Mangansulfat	0,023 g
Kaliumiodid	0,74 mg
Nickelsulfat	0,74 mg
Antischaummittel (Mazur Mazu DF204)	0,4 ml
Hefeextrakt	10 g
L-Isoleucin	0,5 g
L-Leucin	0,5 g
L-Valin	0,5 g
Cobaltsulfat	0,054 mg
Natriummolybdat (2H₂O)	0,054 mg
Kupfersulfat	0,088 mg
Zinkchlorid	0,428 mg
Leitungswasser	11 l

Vor der Animpfung wurde Glucose zugegeben, um eine Konzentration von 25 g pro Liter zu erreichen. Nachdem die anfängliche Glucose vollständig dezimiert worden war, wurde Glucose mit einer variablen Rate zugeführt, um für die verbleibende Zeit weniger als 1 g/l zu erreichen, bis zu einer gesamten Zugabe von 512 g. Das abschließende Volumen in dem Behälter war 11,4 1. Die Herstellung des Aminosäuredeaminaseenzyms war in den abschließenden drei Stunden der Fermentation Temperatur induziert. Die Induktionstemperatur war 42°C und begann, nachdem die Kultur 35 OD (Spectronic 20 Genesys von Spectronic Instruments) erreicht hatte.
Nach den drei Stunden der Temperaturinduktion wurden die Zellen auf 15°C gekühlt und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer DC-10 Amicon Labscale Ultrafiltrationseinheit und eines das Molekulargewicht abschneidenden Technologiegrößen-Klassifizierers AG 500 9-E geerntet. Die konzentrierten Zellen, welche etwa 125 g getrockneter Zellen pro Liter enthielten, wurden bei 4°C gelagert und direkt als Katalysator für die Biotransformationsreaktionen verwendet.
Beispiel 2
Umwandlung von L-Phenylalanin zu D-Phenylalanin
L-Phenylalanin (20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit Ameisensäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurde zugegeben und die Suspension mit 0,1 ml des nach Beispiel 1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden gehalten, während sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und der Überstand auf den D-Phenylalanin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
Tabelle 1 Umwandlung von L-Aminosäuren zu D-Aminosäuren
Wie Tabelle 1 zeigt, wurde das Katalysatorsystem dieser Erfindung dazu verwendet, eine Anzahl von L-Aminosäure zu ihren entsprechenden Enantiomeren umzuwandeln. Die Stereospezifität jeder Reaktion wird durch den enantiomeren Überschuss angezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Erfindung für die Umwandlung von allen der in Tabelle 1 aufgeführten Aminosäuren mit der Ausnahme von L-Valin (ee 65%) und L-Isoleucin (ee 50%) wirkungsvoll war. Alle anderen L-Aminosäuren wurden zu ihren entsprechenden D-Enantiomeren mit einem enantiomeren Überschuss von mindestens 95% umgewandelt.
Beispiel 3
Umwandlung von L-Valin zu D-Valin
L-Valin (20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit Ameisensäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension mit 0,1 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden aufbewahrt, während sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und der Überstand auf den D-Valin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
Beispiel 4
Umwandlung von L-Tyrosin zu D-Tyrosin
L-Tyrosin (20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit Ameisensäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension mit 0,1 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden aufbewahrt, während sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und der Überstand auf den D-Tyrosin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
Beispiel 5
Umwandlung von L-Tryptophan zu D-Tryptophan
L-Tryptophan (20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit Ameisensäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension mit 0,1 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden aufbewahrt, während sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und der Überstand auf den D- Tryptophan-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
Beispiel 6
Umwandlung von L-Methionin zu D-Methionin
L-Methionin (20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit Ameisensäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension mit 0,1 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden aufbewahrt, während sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und der Überstand auf den D-Methionin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
Beispiel 7
Umwandlung von L-Nor-Leucin zu D-Nor-Leucin
L-Nor-Leucin (20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit Ameisensäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension mit 0,1 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden aufbewahrt, während sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und der Überstand auf den D-Nor-Leucin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
Beispiel 8
Umwandlung von L-Nor-Valin zu D-Nor-Valin
L-Nor-Valin (20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit Ameisensäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension mit 0,1 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden aufbewahrt, während sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und der Überstand auf den D-Nor-Valingehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
Beispiel 9
Umwandlung von L-Leucin zu D-Leucin
L-Leucin (20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit Ameisensäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension mit 0,1 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden aufbewahrt, während sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und der Überstand auf den D-Leucin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
Beispiel 10
Umwandlung von L-Iso-Leucin zu D-Iso-Leucin
L-Iso-Leucin (20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit Ameisensäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension mit 0,1 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden aufbewahrt, während sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und der Überstand auf den D-Iso-Leucin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
Andere Variationen und Modifikationen dieser Erfindung werden für einen Fachmann offensichtlich sein. Diese Erfindung ist nicht begrenzt, außer durch den beigefügten Anspruchsatz.

Claims

Katalytisches System zur stereoselektiven Umwandlung von Aminosäuren von einem Enantiomer in das andere, oder von einer racemischen Mischung zu dem optisch aktiven Isomer, welches umfasst: (i) einen Metallkatalysator; (ii) ein enzymatisches System, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus einem Aminosäure-Oxidase-Enzym, einem Aminosäure-Deaminase-Enzym, einem Aminosäure-Dehydrogenase-Enzym, Mikroorganismus-Zellen, welche eine oder mehrere dieser Enzyme erzeugen, und Mischungen davon besteht; (iii) ein Oxidationsmittel; (iv) eine Wasserstoffquelle.
Das katalytische System nach Anspruch 1, wobei der Metallkatalysator aus der Gruppe ausgewählt wurde, welche aus einem Metall, einem Metallsalz, einem Metallkomplexkatalysator und Kombinationen davon besteht.
Das katalytische System nach Anspruch 1, wobei der Metallkatalysator aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus Palladium auf Kohlenstoff, Palladiumruß, Palladium auf Aluminiumoxid und Mischungen davon besteht.
Das katalytische System nach Anspruch 3, wobei der Metallkatalysator Palladium auf Kohlenstoff ist.
Das katalytische System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das enzymatische System ein L-Aminosäure-Deaminase-Enzym ist.
Das katalytische System nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Mikroorganismus-Zellen ein Bakterienstamm von E-Coli sind.
Das katalytische System nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Oxidationsmittel atmosphärischer Sauerstoff ist.
Das katalytische System nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Wasserstoffquelle aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus Ammoniumformat, H₂, Cyclohexen und Mischungen davon besteht.
Das katalytische System nach Anspruch 8, wobei die Wasserstoffquelle Ammoniumformat ist.
Das katalytische System nach einem der Ansprüche 1 bis 9, welches ferner einen Puffer enthält.
Das katalytische System nach Anspruch 10, wobei der Puffer aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus Ammoniumformat, Kaliumphosphat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan und Mischungen davon besteht.
Das katalytische System nach Anspruch 11, wobei der Puffer Ammoniumformat ist.
Das katalytische System nach Anspruch 12, wobei das katalytische System einen pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 8,0 aufweist.
Verfahren zur stereoselektiven Umwandlung von Aminosäuren von einem Enantiomer in das andere, oder von einer racemischen Mischung zu dem optisch aktiven Isomer, welches die Schritte des Behandelns einer Aminosäure mit einem katalytischen System nach einem der Ansprüche 1 bis 13 umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Metallkatalysator Palladium auf Kohlestoff ist.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Enzym ein L-Aminosäure-Deaminase-Enzym ist.
Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus L-Phenylalanin, L-Valin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Methionin, L-Nor-Leucin, L-Nor-Valin, L-Leucin und L-Iso-Leucin, Derivaten davon und Mischungen davon besteht.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei das Verfahren bei einem pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 8,0 ausgeführt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Verfahren bei einer Temperatur von etwa 15,0°C bis etwa 40°C ausgeführt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Konzentration des Ammoniumformats etwa 0,1 M bis 3,0 M ist.
Das Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Verhältnis des Palladiums auf Kohlenstoffkatalysator zum Substrat zwischen etwa 0,001 bis 1,0 und etwa 0,1 bis 1,0 liegt.
Das Verfahren nach Anspruch 21, welches ferner das Wiederherstellen einer D-Aminosäure oder eines geschützten Derivats davon aus der Reaktionsmischung umfasst.