DE60123828T2

DE60123828T2 - Lysat-klärung und nukleinsäureisolierung mit silanisierten silicamatrizes

Info

Publication number: DE60123828T2
Application number: DE60123828T
Authority: DE
Inventors: M. Rex Cedarburg BITNER; J. Daniel Middleton SIMPSON; G. Roderick McFarland FLEMMING; C. Susan Verona KOLLER
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 2000-11-13
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2021-11-09
Also published as: CA2428532A1; JP4198461B2; EP1341910B1; CA2428532C; ATE342355T1; AU2594202A; EP1341910A1; WO2002038758A1; JP2004513634A; AU2002225942B2; DE60123828D1; ES2273915T3

Description

FACHGEBIET
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Verwendung modifizierter Silicamatrizen zum Reinigen von Lösungen von zerstörtem biologischem Material, wie z.B. Zelllysaten oder Homogenaten von pflanzlichem und tierischem Gewebe. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher Matrizen zur Isolierung von Targetnucleinsäuren, wie z.B. Plasmid-DNA, Chromosomen-DNA, DNA-Fragmenten, Gesamt-RNA, mRNA oder RNA/DNA-Hybriden aus Nicht-Targetmaterial, wie z.B. Proteinen, Lipiden, Zelltrümmern und Nicht-Targetnucleinsäuren. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung silanisierter Silicamatrizen bei der Lysat-Reinigung und Targetnucleinsäureisolation.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es sind verschiedene Verfahren zum Isolieren von Targetnucleinsäuren aus biologischem Material oder anderen Arten von Materialien, die Nucleinsäuren enthalten, entwickelt worden. Wenn sich die Targetnucleinsäure im Inneren einer Zelle befindet, muss die Zellmembran zerstört werden und die Inhalte der Zelle in die Lösung um die Zelle freigesetzt werden, bevor die Targetnucleinsäure aus dem anderen Zellmaterial isoliert werden kann. Eine solche Zerstörung kann mit mechanischen Mitteln (z.B. durch Beschallung oder durch Mischung in einem Mixer), durch Enzymverdau (z.B. durch Verdau mit Proteasen) oder chemische Mittel (z.B. durch alkalische Lyse gefolgt von der Addition einer Neutralisationslösung) erreicht werden. Was auch für Mittel zur Zerstörung einer Zelle verwendet werden, das Endprodukt, das hierin als Lysatlösung bezeichnet wird, besteht aus dem Targetmaterial und vielen Verunreinigungen, einschließlich Zelltrümmern.
Es werden häufig Zentrifugation oder Filtration eingesetzt, um eine Lysatlösung von so vielen großen Kontaminanten wie möglich zu reinigen, bevor das Targetnucleinsäurematerial isoliert wird. Leider kann weder die Filtration noch Zentrifugation einfach automatisiert werden. Insbesondere wird weder die Filtration noch Zentrifugation typischerweise auf grundlegenden automatischen Pipettiergerät-Verdünner-Statio nen, wie z.B. dem Biomek^®-2000 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Kalifornien), durchgeführt.
Viele Materialien und Verfahren sind zur Verwendung zum Isolieren von Nucleinsäuren aus gereinigten Lysatlösungen entwickelt worden. Ein solches Verfahren ist die Extraktion einer Nucleinsäure aus einem Agarose-Gel nach Fraktionierung der Nucleinsäure mittels Gelelektrophorese. Bekannte Mittel zur Extraktion von Nucleinsäuren aus Gelschichten umfassen die Dialyse, Lösungsmittelextraktion und den Enzymverdau der Agarose. Solche Systeme zur Nucleinsäurenextraktion aus einer Agarose-Gelschicht sind tendenziell sehr arbeitsintensiv und können nicht automatisiert werden. Außerdem neigen kleinere DNA- oder RNA-Fragmente (d.h. weniger als 100 Basenpaare) dazu, im Extraktionsprozess verloren zu gehen.
Andere Systeme zur Nucleinsäureextraktion basieren auf Silica, wie z.B. jene, die Glas mit kontrollierten Poren; in Silicateilchen eingebettete Filter; Silicagelteilchen; Harze, die Silica in Form von Diatomeenerde umfassen; Glasfasern oder Gemische der oben genannten umfassen. Jedes solche Festphasentrennsystem auf Silica-Basis wird so konfiguriert, dass es Nucleinsäurematerialien reversibel bindet, wenn diese mit einem Medium in Kontakt gebracht werden, das solche Materialien in Gegenwart chaotroper Mittel enthält. Die Festphasen auf Silica-Basis sind konstruiert, um an das Nucleinsäurematerial gebunden zu bleiben, während die Festphase einer externen Kraft, wie z.B. Zentrifugation oder Vakuumfiltration, ausgesetzt ist, um die Matrix und das daran gebundene Nucleinsäurematerial von den übrigen Komponenten der Medien zu trennen. Das Nucleinsäurematerial wird dann von der Festphase eluiert, indem die Festphase einer Elutionslösung, wie z.B. Wasser oder Elutionspuffer, ausgesetzt wird. Zahlreiche Marktanbieter stellen auf Silica basierende Harze bereit, die zur Anwendung in Zentrifugations- und/oder Filtrationsisolationssystemen, wie z.B. Produkten der Wizard^®-DNA-Reinigungssysteme von Promega Corporation (Madison, Wisconsin, USA) oder QiaPrep^®-DNA-Isolationssystemen von Qiagen Corp. (Chatsworth, Kalifornien, USA), konstruiert sind. Leider erfordert die oben beschriebene Art der Festphasen auf Silicabasis jeweils die Verwendung von Zentrifu gation oder Filtration, um in jedem Verfahren die verschiedenen Isolationsschritte durchführen zu können, wodurch die Nützlichkeit dieser Festphasen in automatisierten Systemen eingeschränkt ist.
Magnetisch reagierende Festphasen, wie z.B. paramagnetische oder superparamagnetische Teilchen, bieten einen Vorteil, den keine der oben beschriebenen Festphasen auf Silicabasis bietet. Solche Teilchen können durch Ein- und Ausschalten eines magnetischen Feldes aus einer Lösung getrennt werden, indem ein Behälter auf ein magnetisches Trenngerät gebracht und wieder entfernt wird oder ein magnetisches Trenngerät auf einen Behälter gebracht und wieder entfernt wird. Diese Aktivitäten könnten ganz einfach automatisiert werden.
Magnetisch reagierende Teilchen sind zur Verwendung bei der Isolation von Nucleinsäuren durch direkt reversible Adsorption von Nucleinsäuren auf Teilchen entwickelt worden. Siehe z.B. auf Silicagel basierende poröse Teilchen, die geschaffen wurden, um direkt reversibel an DNA zu binden, wie z.B. paramagnetische MagneSil^TM-Teilchen (Promega) oder paramagnetische Biomag^®-Perlen (Polysciences, Warrington, Pennsylvania, USA). Siehe auch US-Patent Nr. 6.027.945. Zur Isolation von Nucleinsäuren sind auch magnetisch reagierende Glasperlen mit einer kontrollierten Porengröße entwickelt worden. Siehe z.B. „Magnetic Porous Glass"-(MPG-)Teilchen von CPG, Inc. (Lincoln Park, New Jersey, USA); oder poröse magnetische Glasteilchen, die in US-Patent Nr. 4.395.271; 4.233.169 oder 4.297.337 beschrieben sind. Das Nucleinsäurematerial bindet tendenziell eng an Glas, jedoch so, dass es schwierig sein kann, Nucleinsäuren von solchen magnetischen Glasteilchen zu trennen, wenn sie einmal an diese gebunden sind. Infolge sind Elutionseffizienzen magnetischer Glasteilchen im Vergleich zu den Elutionseffizienzen von Teilchen mit geringeren Mengen eines eine Nucleinsäure bindenden Materials, wie z.B. Silica, tendenziell gering.
Es ist eine Vielzahl von Silicamatrizen entwickelt worden, die aus einer Silica-Festphase mit kovalent daran gebundenen Liganden besteht, die geschaffen sind, um an einer Ionenaustausch- oder Umkehrphasenwechselwirkung mit Nucleinsäuren teilzunehmen. Solche Systeme sind jedoch im Allgemeinen zur Verwendung als Festphase eines Flüssigkeitschromatographiesystems, zur Verwendung in einem Filtrationssystem oder zur Verwendung mit Zentrifugation zur Trennung der Festphase von verschiedenen Lösungen konstruiert. Die Komplexität solcher Systeme variiert von einer einzigen Spezies eines Liganden, der kovalent an die Oberfläche eines Filters gebunden ist, wie in DEAE-modifizierten Filtern (z.B. CONCERT^®-Isolationssystem, Life Technology Inc., Gaithersburg, Maryland, USA), über eine Säule, die zwei verschiedene Festphasen umfasst, die durch einen porösen Teiler voneinander getrennt sind (z.B. US-Patent Nr. 5.660-984), über ein Chromatographieharz mit pH-abhängigen ionisierbaren Liganden, die kovalent an dieses gebunden sind (z.B. US-Patent Nr. 5.652.348), bis hin zu Mixed-Mode-Harzen oder Mischbettharzen mit Ionenaustauschliganden und Umkehrphasenliganden auf denselben oder unterschiedlichen Festphasenkomponenten der Harze (z.B. L. M. McLaughlin, Chem. Rev. 89, 309–319 (1989)).
Es sind Matrizen entwickelt worden, die zur reversiblen Bindung durch Affinitätswechselwirkung an spezifische Targetmaterialien gebunden sind. Manche dieser Matrizen nützen die Affinität des Poly(A)-Schwanzes der mRNA für Oligo(dT), um mRNA zu isolieren, entweder durch direktes Binden von Oligo(dT) an die Oberfläche einer Festphase (z.B. US-Patent Nr. 5.610.274) oder durch Bereitstellung einer Festphase, die mit Streptavidin und biotinyliertem Oligo(dT) beschichtet ist, die sowohl an Streptavidin als auch an die mRNA in einer Lösung natürlich bindet (z.B. PolyATract-mRNA-Isolationssystem Serie 9600^TM der Promega Corporation (Madison, Wisconsin, USA) und mit Streptavidin beschichtete ProActive^@-Mikrosphärenteilchen der Bangs Laboratories (Carmel, Indiana, USA)).
Um die kovalente Bindung verschiedener Liganden an Silica-Festphasen zu erleichtern, ist Silanisierung als Kopplungsmittel eingesetzt worden, um chromatographische Matrizen zum Isolieren von Gelöststoffen, wie z.B. Nucleinsäuren, zu produzieren. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.672.040 (Spalte 13, Zeilen 3–22); US-Patent Nr. 5.734.020; 4.695.392; und 5.610.274). In solchen Reaktionen reagiert eine Silanverbindung, wie z.B. 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, mit der Oberfläche einer Fest phase, wie z.B. einem auf Silica basierenden Material oder mit einem Eisenoxid, sodass das Silan daran gebunden wird. Die resultierende Matrix umfasst hoch reaktive Reste, wie z.B. die Epoxidgruppe am Terminus der Alkoxykette von 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, die nach Reaktion mit der Oberfläche der Festphase verfügbar bleiben. Matrizen mit solch reaktiven Gruppen sind in der Produktion von Ionenaustausch-, Umkehrphasen-, Mischbett-, Mixed-Mode- und Affinitätsharzen als Zwischenprodukte verwendet worden.
Jedes der oben beschriebenen Systeme hat in Bezug auf Lösungsbedingungen, die zum isolieren von Nucleinsäuren erforderlich sind, und in Bezug auf die Klasse jener Substrate, aus welchen Nucleinsäuren am besten isoliert werden können, seine Grenzen. Bis jetzt sind keine Materialien und Verfahren entwickelt worden, die zum ebenso effizienten Isolieren von Nucleinsäuren mit einem geringem Molekulargewicht (z.B. unter 1000 Basenpaaren) von Substraten, wie z.B. Pflanzenölen oder Agarose-Gelschichten, verwendet werden können wie Nucleinsäuren mit einem höherem Molekulargewicht. Aufgrund der heutigen Notwendigkeit, Viren und Belege für genetische Veränderungen von pflanzlicher Materie zu detektieren, aus welcher diese Öle hergestellt werden, besteht auch großer Bedarf, kleine Nucleinsäuremengen dieser Substrate zu isolieren. Es werden auch Materialien und Verfahren benötigt, die es ermöglichen, so viele Schritte wie möglich zu automatisieren, um rasch und effizient Targetnucleinsäuren aus Zellen oder Säugetiergewebe zu isolieren. Insbesondere werden Verfahren und Materialien zum Reinigen von Lösungen von zerstörtem biologischem Material und zum Isolieren von Targetnucleinsäuren aus solchen gereinigten Lösungen benötigt, worin arbeitsintensive Schritte, wie z.B. Filtration oder Zentrifugation, nicht erforderlich sind. Die vorliegende Erfindung befasst sich mit jeder dieser Anforderungen.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt unter Einsatz einer ersten Silica-Festphase mit einer Vielzahl erster Silanliganden, die kovalent daran gebunden sind, ein Mittel zur Reinigung einer Lösung von zerstörtem biologischem Material bereit, worin die ersten Silanliganden geschaffen sind, um an Nicht-Targetnucleinsäure im zerstörten biologischen Material zu adsorbieren. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt auch ein Mittel zum Isolieren einer Targetnucleinsäure aus einer Lösung bereit, wie z.B. gereinigte Lysatlösung, umfassend die Targetnucleinsäure und zumindest ein Nicht-Targetmaterial, wobei eine zweite Silica-Festphase mit einer Vielzahl daran kovalent gebundenen zweiter Silanliganden verwendet wird, worin die zweiten Silanliganden geschaffen sind, um selektiv an die Targetnucleinsäure in einer Nucleinsäureadsorptionslösung zu adsorbieren. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird eine Lösung des zerstörten biologischen Materials mit der ersten Silica-Festphase in der ersten Lösung gereinigt und Targetnucleinsäurematerial vorn resultierenden gereinigten Lysat mittels Adsorption an die zweite Silica-Festphase in einer Nucleinsäureadsorptionslösung entfernt.
In der ersten Ausführungsform des oben beschriebenen vorliegenden Verfahrens wird eine Lösung von zerstörtem biologischem Material, wie z.B. ein Zelllysat oder ein Homogenisat von Säugetiergewebe, gemäß den folgenden Schritten gereinigt: (a) Bereitstellung einer ersten silanisierten Silicamatrix, umfassend eine Silica-Festphase mit einer Vielzahl von Silanliganden, die kovalent daran gebunden sind, und (b) Kombination der ersten silanisierten Silicamatrix mit einer ersten Lösung, umfassend ein zerstörtes biologisches Material, eine Targetnucleinsäure und eine chaotrope Salzkonzentration, die ausreichend hoch ist, um selektive Adsorption des zerstörten biologischen Materials an die Matrix zu fördern, wodurch ein erster Komplex geformt wird. Das zerstörte biologische Material wird bevorzugt in Gegenwart einer ausreichend hohen chaotropen Salzkonzentration in die Matrix eingeführt, um selektive Adsorption des zerstörten biologischen Nicht-Target-Materials an die Matrix zu fördern, wobei die Targetnucleinsäure in Lösung bleibt.
In der zweiten Ausführungsform des Verfahrens der oben beschriebenen vorliegenden Erfindung wird eine Targetnucleinsäure aus einer zweiten Lösung, einer Nucleinsäureadsorptionslösung, umfassend die Targetnucleinsäure und zumindest ein Nicht-Targetmaterial, isoliert. Die zweite Lösung kann aus jeder beliebigen Zahl ver schiedener Quellen ausgewählt sein, einschließlich, aber nicht ausschließlich, ein gereinigtes Lysat, ein pflanzliches Öl, ein gereinigtes Homogenisat von Säugetiergewebe, ein gereinigtes Lysat aus pflanzlichem Material oder eine Lösung, umfassend eine Targetnucleinsäure, die durch Gelelektrophorese in einem Agarosegel fraktioniert ist. Diese Ausführungsform des Verfahrens umfasst die folgenden Schritte: (a) Bereitstellung einer zweiten silanisierten Silicamatrix, umfassend eine Silica-Festphase mit einer Vielzahl von Silanliganden der allgemeinen Formel (I) unten, die daran kovalent gebunden sind; (b) Kombination der zweiten silanisierten Silicamatrix mit der Nucleinsäureadsorptionslösung, worin der pH der Nucleinsäureadsorptionslösung niedriger als pH 8,0 ist und die Konzentration des chaotropen Salzes in der Lösung ausreichend gering ist, sodass die Targetnucleinsäure selektiv an die zweite silanisierte Silicamatrix adsorbiert, wodurch ein zweiter Komplex gebildet wird.
Jeder Silanligand der Vielzahl von Silanliganden der ersten und zweiten silanisierten Silicamatrix ist bevorzugt von der allgemeinen Formel (I):
worin R₁ und R₂ jeweils eine Untereinheit sind, der aus der aus einer Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Hydroxyl, einer Alkylkette mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen, die durch einen Oxyrest unterbrochen ist, bestehenden Gruppe ausgewählt sind, worin bis zu fünf der Kohlenstoffatome mit einer Gruppe substituiert sind, die aus der Gruppe aus einem Halogen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Cyano mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und einem Hydroxy bestehenden Gruppe ausgewählt ist; worin R₃ eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist, die mit zumindest einem Hydroxy, einer Alkylkette mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist, die durch zumindest eine Oxygruppe unterbrochen ist, worin bis zu zehn Kohlenstoffatome mit einer Gruppierung substituiert sind, die aus der aus einem Halogen, Cyano mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxy und Epoxy bestehenden Gruppe ausgewählt ist. R₁ und R₂ können auch unabhängig Verbindungen mit anderen Silanliganden sein, um Polymere höherer Ordnung zu erzeugen.
In wieder einer anderen Ausführungsform besteht die vorliegende Erfindung aus einem Set, das in einem einzigen Behälter eine Vielzahl silanisierter Silicamagnetteilchen enthält, umfassend eine Silica-Festphase mit einer Vielzahl von Silanliganden, die kovalent an die Oberfläche jedes Teilchens gebunden sind, wobei jeder Ligand eine Struktur der Formel I, siehe oben, aufweist.
Die Verfahren und Materialien der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Targetnucleinsäuren zu isolieren, einschließlich aber nicht ausschließlich Plasmid-DNA, DNA-Fragmente, Gesamt-RNA, mRNA, RNA/DNA-Hybride, amplifizierte Nucleinsäuren und genomische DNA aus einer Vielzahl von Kontaminanten, einschließlich aber nicht ausschließlich Agarose von einem Agrosegel, Nicht-Targetnucleinsäuren und Nicht-Targetkomponenten von Bakterien, Tiergewebe, Blutzellen und Pflanzenöl oder anderes Pflanzenmaterial. Die Verfahren und Materialien der vorliegenden Erfindung sind zum Isolieren sowohl von DNA-Molekülen mit geringem Molekulargewicht (d.h. weniger als etwa 150 Basenpaaren) und DNA mit höherem Molekulargewicht wirksam. Anwendungen der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zum Isolieren von Nucleinsäuren aus einer Vielzahl verschiedener Medien werden aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung, siehe unten, hervorgehen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Fotografie von Plasmid-DNA, die unter Einsatz verschiedenster in Beispiel 5 beschriebener Mittel aus einem Lysat von E.-coli-Bakterienzellen isoliert worden ist, nach Fraktionierung auf einem Agarose-Gel mittels Gelelektrophorese.
2 ist eine Fotografie von DNA, die unter Einsatz verschiedenster in Beispiel 6 nachstehend beschriebener Mittel aus Sonneblumensamen isoliert worden ist, nach Fraktionierung auf einem Agarose-Gel mittels Gelelektrophorese.
3A ist eine Fotografie einer Nucleinsäureadsorptionslösung, die eine DNA-Leiter enthält, nach Adsorption der DNA an mit Glycidyl modifizierten Silicamagnetteilchen und Fraktionierung auf einem Agarose-Gel mittels Gelelektrophorese, wie in Beispiel 8 beschrieben.
3B ist eine Fotografie von DNA, die mittels Gelelektrophorese fraktioniert worden ist, nach Elution von verschiedenen mit Glycidyl modifizierten Silicamagnetteilchen, wie in Beispiel 8 beschrieben.
4 ist eine Fotografie von DNA, die von einem Agarose-Gel-Silica isoliert worden ist, nach Fraktionierung mittels Gelelektrophorese, wie in Beispiel 9 beschrieben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. Definitionen
Der Begriff „Alkylkette" bezeichnet wie hierin verwendet ein geradkettiges Alkan.
Der Begriff „chaotropes Mittel" bezeichnet wie hierin verwendet Salze bestimmter Ionen, die bei Vorliegen in einer ausreichend hohen Konzentration in einer wässrigen Lösung bedingen, dass darin vorliegende Proteine sich entfalten und Nucleinsäuren ihre Sekundärstruktur verlieren. Es wird davon ausgegangen, dass chaotrope Ionen diese Wirkungen haben, weil sie Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke, die in flüssigem Wasser bestehen, zerstören, wodurch sie denaturierte Proteine und Nucleinsäuren thermodynamisch stabiler machen als ihre korrekt gefalteten oder strukturierten Gegenstücke. Chaotrope Ionen umfassen Guanidinium, Iodid, Perchlorat und Trichloracetat. Chaotrope Mittel umfassen Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat (das manchmal als Guanidinisothiocyanat bezeichnet wird), Natriumiodid, Natriumperchlorat und Natriumtrichloracetat.
Der Begriff „zerstörtes biologisches Material" bezeichnet wie hierin verwendet Material, das keine Targetnucleinsäure ist und freigesetzt wird, wenn biologische Materialien, wie z.B. Bakterienzellen, Säugetiergewebe, Blutzellen oder Pflanzenmaterial, zerstört werden. Zerstörtes biologisches Material umfasst Proteine, Lipide, Zelltrümmer und Nicht-Targetnucleinsäuren, ist aber nicht auf diese beschränkt.
Der hierin verwendete Begriff „Glasteilchen" bezeichnet Teilchen kristalliner oder glasartiger Silica bzw. Siliciumdioxide, obwohl kristalline Silica formell kein „Glas" sind, weil sie nicht amorph sind, oder Glasteilchen, die primär aus Siliciumdioxid bestehen. Der Begriff umfasst Quarz, glasartiges Silica, Controlled-Pore-Glas-Teilchen und Glasfasern.
Der hierin zum Bezeichnen von magnetischen Silica-Teilchen verwendete Begriff „magnetisch" umfasst Materialien, die paramagnetische oder superparamagnetische Materialien sind. Der Begriff „magnetisch" umfasst wie hierin verwendet temporär magnetische Materialien, wie z.B. ferromagnetische oder ferromagnetische Materialien. Wenn nachstehend nicht anders angegeben, umfassen die in dieser Erfindung verwendeten magnetischen Silicateilchen bevorzugt einen superparamagnetischen Kern, der mit Siliciumdioxid beschichtet ist und über eine hydratisierte, Siliciumdioxid-hältige Adsorptionsoberfläche (d.h. eine Oberfläche, die durch die Gegenwart von Silanolgruppen gekennzeichnet ist) verfügt.
Der Begriff „Nucleinsäure" bezeichnet wie hierin verwendet jedes beliebige DNA- oder RNA-Molekül oder ein DNA/RNA-Hybridmolekül. Der Begriff umfasst Plasmid-DNA, amplifizierte DNA- oder RNA-Fragmente, Gesamt-RNA, mRNA, genomische DNA und chromosomale DNA.
Der Begriff „pH-abhängige Ionenaustausch-Silicamagnetteilchen" bezeichnet wie hierin verwendet Silicamagnetteilchen mit einer Vielzahl von Ionenaustauschliganden, die daran kovalent gebunden sind und welche bei einem pH-Wert als Kationenaustauscher und bei einem anderen pH-Wert als Anionenaustauscher wirken. Solche Magnetteilchen sind zur Anwendung in den Verfahren und Sets der vorliegenden Erfindung besonders gut geeignet, weil Substrate durch hydrophobe Wechselwirkungen selektiv an die hydratisierte, Siliciumdioxid-hältige Adsorptionsoberfläche des Teilchens wie auch mittels Ionenaustausch an Ionenaustauschliganden oder sowohl an die Oberfläche als auch an Ionenaustauschliganden adsorbieren können, abhängig von den Lösungsbedingungen.
Der Begriff „Festphase" wird hierin im Sinn einer Standardchromatographie verwendet, um eine unlösliche, üblicherweise starre Matrix oder stationäre Phase zu beschreiben, die mit einem Gelöststoff, in diesem Fall mit einer Targetnucleinsäure, in einem Gelöststoff-Gemisch wechselwirkt. Der Terminus Festphase umfasst wie hierin verwendet speziell stationäre Phasen in Flüssigkeitschromatographie (LC), Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), Teilchenmatrizen, die in Filter eingebettet oder an diese gebunden sind, und magnetische oder nicht-magnetische poröse Matrixteilchen, die mit Gelöststoffen wechselwirken, wenn sie direkt einem Gelöststoff-Gemisch zugesetzt werden.
Der Begriff „Silicagel" bezeichnet wie hierin verwendet Silicagel von Chromatographie-Reinheit, eine Substanz, die von einer Reihe verschiedener Quellen zu beziehen ist. Silicagel wird meistens durch Ansäuerung einer Lösung hergestellt, die Silicat enthält, z.B. durch Ansäuerung von Natriumsilicat auf einen pH von weniger als 11, wonach die angesäuerte Lösung gelieren gelassen wird. Siehe z.B. die Diskussion über die Herstellung von Silica in Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Band 21, 4. Auflage, Mary Howe-Grant (Hrsg.), John Wiley & Sons (Verleger), 1021 (1997).
Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Silicamagnetteilchen" auf Silica basierende Festphasen, die weiters aus Materialien bestehen, die kein magnetisches Feld besitzen, aber einen magnetischen Dipol formen, wenn sie einem magnetischen Feld ausgesetzt sind, d.h. Materialien, die in Gegenwart eines magnetischen Felds magnetisiert werden, aber welche bei Fehlen eines solchen Feldes selbst nicht magnetisch sind.
Der Begriff „Oberfläche" bezeichnet wie hierin verwendet den Abschnitt des Trägermaterials einer Festphase, der direkt mit einer Lösung in Kontakt tritt, wenn die Festphase damit kombiniert wird.
Der Begriff „Targetnucleinsäure" bezeichnet wie hierin verwendet besondere Spezies von Nucleinsäure, die in jeder beliebigen besonderen Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert werden sollen. Die Targetnucleinsäure ist bevorzugt DNA, bevorzugt DNA von weniger als etwa 60 Kilobasenpaaren, bevorzugt zumindest etwa 1000 Basenpaaren, noch bevorzugter zumindest etwa 500 Basenpaaren, noch bevorzugter zumindest etwa 250 Basenpaaren, noch bevorzugter zumindest etwa 150 Basenpaaren, noch bevorzugter zumindest etwa 100 Basenpaaren und noch bevorzugter zumindest etwa 50 Basenpaaren. Die Targetnucleinsäure ist bevorzugt DNA von zumindest 25 Basenpaaren.
Die Verfahren und Sets der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um eine Lösung von zerstörtem biologischem Material zu reinigen und/oder eine Targetnucleinsäure aus einer Lösung zu isolieren, vorzugsweise aus einer Lösung von geklärtem zerstörtem biologischem Material. In zumindest einem Schritt des Verfahrens wird in einer Lösung zwischen einer Matrix und einer Festphase ein Komplex ausgebildet, bevorzugt eine Magnetteilchenmatrix. Der resultierende Komplex wird dann aus der Lösung isoliert oder entfernt. Wenn die Matrix ein Magnetteilchen ist, wird sie bevorzugt in Gegenwart eines Magnetfelds entfernt. Magnetteilchen oder andere Festphasen, die zur Anwendung in jedem beliebigen gegebenen Schritt der Verfahren und Sets der vorliegenden Erfindung geeignet sind, haben die Fähigkeit, mit dem Gelöststoff von Interesse in diesem besonderen Schritt des Verfahrens einen Komplex auszubilden.
Der Gelöststoff ist die Art von Material, das unter Einsatz einer Matrix gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung aus einer Lösung isoliert oder entfernt werden soll. Das zerstörte biologische Material ist der Gelöststoff in dem das Lysat oder Homogenisat reinigenden Verfahren der Erfindung. Eine Targetnucleinsäure ist der Gelöststoff, wenn eine Matrix zum Isolieren der Targetnucleinsäure aus jeder beliebigen Lösung, welche die Targetnucleinsäure und anderes Material umfasst, wie z.B. ein gereinigtes Lysat, ein pflanzliches Öl oder ein gereinigtes Homogenisat von Säugetiergewebe, verwendet wird.
Die Bedingungen, welche die Bildung eines Komplexes aus einer Matrix und einem Gelöststoff fördern, variieren abhängig von der Natur des Gelöststoffes und den Eigenschaften der Matrix. Wenn die Matrix aus Ionenaustauschmagnetteilchen oder pH-abhängigen Ionenaustauschteilchen besteht, wird der Komplex zum Beispiel bevorzugt infolge von Ionenaustausch zwischen dem Gelöststoff und den Ionenaustauschliganden an der Oberfläche der Teilchen ausgebildet. Zur Förderung einer solchen Ionenaustauschwechselwirkung muss in der Lösung zumindest ein wenig Salz vorliegen, um den Ionenaustausch mit dem Gelöststoff zu fördern, und der pH der Lösung muss in dem Bereich liegen, in welchem der Ionenaustauschligand eine geeignete Ladung zum Austausch mit dem Gelöststoff aufweist. Wenn die Matrix aus Silica oder Silicamagnetteilchen besteht, wird der Komplex bevorzugt infolge hydrophober Wechselwirkungen zwischen dem Gelöststoff und den Teilchen ausgebildet. Wenn die Matrix aus pH-abhängigen Ionenaustausch-Silicamagnetteilchen besteht, kann der Komplex infolge hydrophober Wechselwirkungen zwischen dem Gelöststoff und den Siliciumdioxid-hältigen Oberflächen der Teilchen, infolge des Ionenaustausches zwischen dem Gelöststoff und dem Ionenaustauschliganden oder infolge einer Kombination der zwei Arten von Wechselwirkungen gebildet werden. Wenn die Matrix aus silanisierter Silica oder silanisierten Silicamagnetteilchen besteht, wird der Komplex bevorzugt unter Bedingungen geformt, welche die Wasserstoffbrückenbildung zwischen dem Gelöststoff und der Matrix fördern.
Wenn der Gelöststoff ein zerstörtes biologisches Material ist, wie es z.B. in einem Zellysat oder Gewebshomogenisat zu finden ist, und die Matrix aus Silicamagnetteilchen oder pH-abhängigen Ionenaustausch-Silicamagnetteilchen besteht, wird der Komplex aus der Matrix und Gelöststoff bevorzugt in einer Lösung ausgebildet, die nicht mehr als Spurenmengen von Alkohol oder chaotropen Salzen umfasst. Sowohl Alkohol als auch chaotrope Salze, wie z.B. Guanidinthiocyanat oder Guanidinisothiocyanat, fördern die Adsorption von Nucleinsäurematerialien an solche Teilchen. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass das vorliegende Verfahren der Zelllysatclearance in Gegenwart von Alkohol oder chaotropen Salzen durchgeführt werden kann, wenn die Konzentration solcher Silicamagnetteilchen oder pH-abhängiger Ionenaustauschteilchen in einem Homogenisat oder einer Lysatlösung niedrig genug waren, um die Lösung zu reinigen, aber nicht hoch genug, um sich an eine signifikante Menge der Targetnucleinsäure in der Lösung zu binden.
Wenn der Gelöststoff ein zerstörtes biologisches Material ist und die Matrix eine erste silanisierte Silica-Festphase, wie z.B. erste silanisierte Silicamagnetteilchen, wird der Komplex aus Matrix und Gelöststoff, ein erster Komplex, bevorzugt in einer ersten Lösung ausgebildet, die eine ausreichend hohe Konzentration eines chaotropen Salzes umfasst, um die selektive Adsorption des zerstörten biologischen Materials an die Matrix zu fördern. Die zur Förderung der Adsorption an die Matrix erforderliche Konzentration des chaotropen Salzes hängt von der Zusammensetzung und Konzentration der Silanliganden ab, die an die Oberfläche der Festphase der silanisierten Silicamatrix angebracht sind, und von der Natur des zerstörten biologischen Materials, das daran adsorbiert werden soll. Eine Konzentration eines beliebigen chaotropen Salzes, welche ausreichend ist, um die selektive Adsorption jedes beliebigen zerstörten biologischen Materials an jede beliebige gegebene silanisierte Silicamatrix zu fördern, kann mithilfe eines einfachen Titrierungsversuchs bestimmt werden. Wenn ein chaotropes Salz vorliegt, ist die Konzentration des chaotropen Salzes bevorzugt nicht mehr als 3,5 M, noch bevorzugter nicht mehr als etwa 3,0 M. Wenn in der ersten Lösung andere Salze, wie z.B. Kaliumacetat oder Natriumchlorid, vorliegen, kann die zur Förderung der Adsorption des zerstörten biologischen Materials an die Matrix erforderliche Konzentration des chaotropen Salzes variieren.
Wenn der Gelöststoff eine Targetnucleinsäure ist, wird der Komplex bevorzugt in Gegenwart von zumindest einem Mittel ausgeführt, von dem bekannt ist, dass es die reversible Adsorption der Targetnucleinsäure an die Magnetteilchen fördert. Die reversible Adsorptionsreaktion wird bevorzugt mittels spezifischer Adsorption zwischen der Targetnucleinsäure und Magnetteilchen ausgeführt, wobei das Nicht-Targetmaterial in Lösung bleibt. Wenn die Targetnucleinsäure Plasmid-DNA ist, die aus einer gereinigten Lysatlösung isoliert wird, wird die Plasmid-DNA z.B. unter Bedingungen mit einer Matrix kombiniert, unter welchen die Plasmid-DNA damit einen Komplex ausbildet, während Nicht-Targetmaterialien, wie z.B. Proteine, Lipide und chromosomale DNA, in Lösung bleiben. Wenn die Matrix eine Ionenaustauschmatrix ist, wird der Komplex in Gegenwart eines Gegenions und in einer Lösung mit einem pH ausgebildet, bei welchem die Ionenaustauschliganden die Fähigkeit haben, mit der Targetnucleinsäure auszutauschen. Wenn die Matrix aus Silica oder Silicamagnetteilchen besteht, wird die Bildung des Komplexes bevorzugt in Gegenwart eines Mittels durchgeführt, das aus der Gruppe bestehend aus Alkohol mit niedrigen Molekulargewicht, einer hohen Konzentration eines nicht-chaotropen Salzes und eines chaotropen Salzes oder einer Kombination davon ausgewählt ist. Für Adsorptionsverfahren und Desorption von Targetnucleinsäuren an solche Silicamagnetteilchen, die zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, siehe Internationale Patentanmeldung Nummer PCT/US98/01149 für METHODS OF ISOLATING BIOLOGICAL TARGET MATERIALS USING SILICA MAGNETIC PARTICLES, veröffentlicht als WO 98/31840.
Wenn die Matrix eine zweite silanisierte Silicamatrix ist, wie z.B. zweite silanisierte Silicamagnetteilchen, wird der Komplex aus Matrix und Nucleinsäure-Eluent in einer Nucleinsäureadsorptionslösung ausgebildet, die konfiguriert ist, um die Adsorption von Nucleinsäuren an die Matrix durch Wasserstoffenbrückenbildung zu fördern. Bevorzugte Bedingungen zur Förderung der Wasserstoffbrückenbildung mit der zweiten silanisierten Matrix sind hierin nachstehend beschrieben.
In einem Aspekt ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verwendung einer ersten silanisierten Silicamatrix zur Reinigung einer ersten Lösung, umfassend zerstörtes biologisches Material, eine Targetnucleinsäure und ein chaotropes Salz. Sobald ein erster Komplex ausgebildet ist, kann die erste Lösung durch Trennung des ersten Komplexes von der Lösung gereinigt werden.
Jedes beliebige einer Vielzahl verschiedener Mittel kann eingesetzt werden, um den ersten Komplex von der Lösung zu trennen, abhängig von der Natur der silanisierten Silicamatrix. Wenn die Festphase der silanisierten Silicamatrix ein Silicamagnetteilchen ist (nachstehend ein „silanisiertes Silicamagnetteilchen"), kann die Matrix durch Zentrifugation, durch Filtration oder unter Einsatz eines Magnetfelds vom ersten Komplex abgetrennt werden. Die Matrix besteht bevorzugt aus silanisierten Silica magnetteilchen, und der erste Komplex wird bevorzugt in Gegenwart eines Magnetfelds von der ersten Lösung abgetrennt. Die Verwendung eines Magnetfelds und von Magnetteilchen ist bevorzugt, weil sie eine Automatisierung des Isolationsprozesses ermöglichen. Wenn die Festphase der silanisierten Silicamatrix Glasfaser oder Diatomeenerde ist oder andere ähnliche, feste Formen von Silicamaterial, wird der Komplex bevorzugt unter Einsatz von Zentrifugation oder Filtration von der ersten Lösung abgetrennt.
Die wie zuvor beschrieben hergestellte gereinigte Lösung enthält zumindest ein wenig Nicht-Targetmaterial, wie z.B. zerstörtes biologisches Material, das nicht an die erste silanisierte Silicamatrix in der Lösung adsorbierte. Verschiedene Verfahren können auf geeignete Weise verwendet werden, um die Targetnucleinsäure von der gereinigten Lösung zu isolieren, einschließlich aber nicht ausschließlich Adsorption der Targetnucleinsäure an eine zweite silanisierte Silicamatrix in einer Nucleinsäureadsorptionslösung, wie hierin nachstehend beschrieben, Alkoholfällung der Nucleinsäure und Adsorption der Targetnucleinsäure an Silicamagnetteilchen (z.B. paramagnetische MagneSil^TM-Teilchen (Promega) oder Controlled-Pore-Glas-Teilchen (CPG, Inc., New. Jersey)), Verwendung eines auf Lösung basierenden Nucleinsäureisolationsverfahrens (z.B. Molecular Cloning, 2. Auflage, herausgegeben von Sambrook et al., 1.21–1.52 (1989)), Agarosegelreinigung, Kapillargelelektrophorese oder Verwendung eines oder mehrerer anderer auf Festphase basierenden Verfahren (z.B. Wizard^® Plus SV Minipreps (Promega)). Es können ebenfalls pH-abhängige Ionenaustauschsilicamagnetteilchen verwendet werden (Bitner et al., Advances in Nucleic Acid and Protein Analyses, Manipulation, and Sequencing Proceedings of SPIE, Band 3926, 126–133 (2000), und US-Patentanmeldung Nummer 09/312,172, eingereicht am 14. Mai 1999). Wenn die Targetnucleinsäure mRNA ist, wird sie bevorzugt unter Einsatz eines Systems, das Oligo(dT) verwendet, um spezifisch an den Poly(A)-Schwanz von mRNA (z.B. PolyATrakt-mRNA-Isolationssystem (Promega); US-Patent Nr. 5.734.020 oder 5.610.274) zu adsorbieren, aus der gereinigten Lösung isoliert. Wenn die Targetnucleinsäure eine spezifische, einzigartige Sequenz enthält, die nicht von Nicht-Targetnucleinsäuren geteilt wird, kann es auch unter Ein satz eines Oligonucleotids isoliert werden, das komplementär zu der auf einer Trägerfläche immobilisierten Sequenz ist (z.B. US-Patent Nr. 5.683.875).
Diese besondere Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens stellt ein ausgezeichnetes Mittel zur effizienten Reinigung einer Lösung von zerstörtem biologischen Material bereit, wodurch die Effizienz der Verfahren gesteigert wird, die verwendet werden, um Targetnucleinsäure von der resultierenden gereinigten Lösung zu isolieren. Dieselbe Art von Matrix, die verwendet wird, um das zerstörte biologische Material zu reinigen, d.h. eine silanisierte Silicamatrix, kann auch verwendet werden, um die Targetnucleinsäure von der gereinigten Lösung oder von anderen Lösungen wie nachstehend beschrieben zu isolieren.
In einer anderen Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wird eine zweite silanisierte Silicamatrix mit einer Nucleinsäureadsorptionslösung kombiniert, welche die Targetnucleinsäure und zumindest ein Nicht-Targetmaterial unter Bedingungen enthält, die so entworfen sind, dass sie die Adsorption der Targetnucleinsäure an die zweite silanisierte Matrix mittels Wasserstoffbrückenbildung fördern. Die Nucleinsäureadsorptionslösung kann z.B. eine gereinigte Bakterienlysatlösung, ein gereinigtes Homogenisat von Säugetiergewebe, ein gereinigtes Lysat von Pflanzengewebe, pflanzliches Öl oder eine Lösung einer Nucleinsäure von einer Agarosegelschicht und das Agarose-Gel sein. Die Nucleinsäureadsorptionslösung verfügt bevorzugt über einen pH von bis zu pH 8,0, bevorzugt einen pH von weniger als etwa 7,0 und noch bevorzugter einen pH von weniger als etwa 6,0. Der pH der Nucleinsäureadsorptionslösung ist bevorzugt zumindest etwa pH 3,5, noch bevorzugter zumindest etwa pH 4,0. Wenn die Nucleinsäurelösung ein chaotropes Salz umfasst, ist die Konzentration des chaotropen Salzes niedrig genug, um eine selektive Adsorption der Targetnucleinsäure an die Matrix zu ermöglichen, wodurch das Nicht-Targetmaterial in Lösung bleibt. Wenn das chaotrope Salz Guanidinthiocyanat ist, ist es bevorzugt in der ersten Lösung in einer Konzentration von etwa 0,2 bis etwa 1,0 M gegenwärtig, noch bevorzugter etwa 0,3 bis etwa 0,5 M, am bevorzugtesten etwa 0,4 M Guanidinthiocyanat. Wenn das chaotrope Salz Guanidinhydrochlorid ist, ist es in der ersten Lösung bevorzugt in einer Konzentration von etwa 0,4 bis etwa 1,2 M gegenwärtig, noch bevorzugter von etwa 0,5 bis etwa 0,7 M, am bevorzugtesten etwa 0,6 M Guanidinhydrochlorid. Wenn andere Salze, wie z.B. Kaliumacetat oder Natriumchlorid, die keine chaotropen Mittel sind, in der ersten Lösung gegenwärtig sind, kann die Konzentration des chaotropen Salzes in der Nucleinsäureadsorptionslösung, welche die Adsorption der Nucleinsäure an die zweite Matrix ermöglicht, variieren.
Die Nucleinsäureadsorptionslösung umfasst weiters bevorzugt einen Alkohol mit geringem Molekulargewicht, wie z.B. Ethanol oder Isopropanol. Wenn der Alkohol Isopropanol ist, ist er bevorzugt in einer Konzentration von zumindest 25 Vol.-% bis etwa 50 Vol.-%, bevorzugter von zumindest 30 Vol.-% bis etwa 45 Vol.-%, vorhanden. Wenn der Alkohol Ethanol ist, ist er bevorzugt in einer Konzentration von zumindest 50 Vol.-% und bis zu etwa 90 Vol.-% gegenwärtig, noch bevorzugter in einer Konzentration von zumindest 60 Vol.-% und bis zu etwa 80 Vol.-%.
Wenn der zweite Komplex ausgebildet ist, kann er unter Einsatz jedes beliebigen der Separationsmittel, die zur Verwendung zur Trennung des ersten Komplexes von der ersten Lösung, siehe oben, als geeignet beschrieben werden, von der Lösung abgetrennt werden.
Der zweite Komplex wird bevorzugt zumindest einmal mit einer Waschlösung gewaschen, um Salze oder andere Kontaminanten, die nicht-spezifisch mit dem Komplex assoziiert sind, zu entfernen. Die Waschlösung hat vorzugsweise einen pH von nicht mehr als etwa pH 8,0, noch bevorzugter einen pH von nicht mehr als etwa 6,0. Die Waschlösung umfasst bevorzugt Wasser, noch bevorzugter „Nanopure^®"-Wasser (Millipore, Bedford, Massachusetts, USA), destilliertes entionisiertes Wasser oder nucleasefreies Wasser (Promega). Wenn die Dichte der Silanliganden auf der Oberfläche des zweiten silanisierten Magnetteilchens niedrig genug ist, wird die Targetnucleinsäure in einem Waschschritt mit Wasser vom zweiten Komplex freigesetzt. Unter diesen Umständen umfasst die Waschlösung weiters bevorzugt einen Alkohol mit geringem Molekulargewicht, wie z.B. Ethanol oder Isopropanol. Die Targetnucleinsäure bleibt an die zweite silanisierte Silicamatrix in Gegenwart von Waschlösungen mit variierenden nicht-chaotropen Salzkonzentrationen (z.B. 300 mM bis etwa 5 M NaCl) adsorbiert, vorausgesetzt, dass der pH der Lösung niedrig genug bleibt. Zumindest eine der im Waschschritt verwendeten Waschlösungen verfügt vorzugsweise über eine Salzkonzentration von zumindest 1 M. Der zweite Komplex wird vor Elution am bevorzugtesten dreimal gewaschen, wie nachstehend beschrieben.
Die Targetnucleinsäure kann ohne jegliche Waschschritte vom zweiten Komplex eluiert werden. Jedoch sichern die Waschschritte ein vollständigeres Isolieren der Targetnucleinsäure von Nicht-Targetmaterialien und sind daher bevorzugt. Die Targetnucleinsäure wird bevorzugt durch Kombination des Komplexes mit einer Elutionslösung mit einem pH von zumindest etwa pH 8,0, noch bevorzugter zumindest etwa pH 9,0 und am bevorzugtesten zumindest etwa pH 9,5, vom zweiten Komplex eluiert.
Wenn die Targetnucleinsäure Plasmid-DNA ist, kann die silanisierte Silicamatrix der vorliegenden Erfindung direkt zu einem gereinigten Lysat von Bakterien zugesetzt werden, das mit der Plasmid-DNA transformiert, mit einer alkalischen Lyselösung lysiert und mit einer Neutralisationslösung behandelt wurde, vorausgesetzt, die Lösungsbedingungen werden wie nötig angepasst, um eine Adsorption der Plasmid-DNA an die Matrix zu fördern. Alkalische Lyseverfahren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind in Sambrook et al., Molecular Cloning, Band 1, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Hrsg.), 1.25–1.28 (1989), und in Technical Bulletin Nr. 202, 225 und 259 (Promega Corp.) zu finden. Die Neutralisationslösungen, die in diesen Verfahren verwendet werden, senken den pH der Lysatlösung tatsächlich auf unter pH 5,0, ein pH, bei welchem die Plasmid-DNA einfach an die silanisierte Silicamatrix adsorbiert, vorausgesetzt, die Konzentration jedes beliebigen chaotropen Salzes in der Lösung ist niedrig genug, um selektive Adsorption der DNA an die Matrix zu ermöglichen. Zu dem gereinigten Lysat wird bevorzugt ein Alkohol mit geringem Molekulargewicht zugesetzt, um jedes beliebige chaotrope Salz zu verdünnen und eine solche Adsorption zu fördern. Wenn der Komplex an die Matrix adsorbiert, um den zweiten Komplex auszubilden, kann der Komplex gewaschen und wie oben beschrieben behandelt werden, um die Plasmid-DNA daraus zu eluieren.
Wenn die Targetnucleinsäure RNA oder eine andere Art von DNA als Plasmid-DNA ist, wird die Adsorption der Targetnucleinsäure an die Matrix bevorzugt unter Bedingungen ausgeführt, die so entworfen sind, dass sie eine bevorzugte Adsorption des Targets an die Matrix fördern. Wenn in einer Lösung sowohl RNA als auch DNA vorliegt, kann das Nicht-Targetnucleinsäurematerial unter Einsatz von RNase beziehungsweise DNAse verdaut werden, um das Nicht-Targetmaterial vor Adsorption des Targetmaterials an die Matrix zu eliminieren. Unter gewissen Umständen können die Lösungsbedingungen auch so beschaffen sein, dass die bevorzugte Adsorption der spezifischen Targetnucleinsäure an die Matrix gefördert wird. Die spezifischen Lösungsbedingungen, die erforderlich sind, um vorzugsweise die Adsorption und Desorption von DNA oder RNA an die Matrix zu fördern, hängen von den Eigenschaften der Matrix selbst ab und müssen daher für jede Ausführungsform der in einer bestimmten Anwendung verwendeten Matrix bestimmt werden.
Die in dem Verfahren verwendete und im Set der vorliegenden Erfindung enthaltene silanisierte Silicamatrix umfasst eine Silica-Festphase mit einer Vielzahl von Silanliganden, die kovalent daran gebunden sind. Die Silica-Festphase der silanisierten Silicamatrix umfasst Silica, vorzugsweise in Form von Silicagel, Siliciumdioxid, festem Silica, wie z.B. Glasfaser, Glasperlen oder Diatomeenerde oder eines Gemisches aus zwei oder mehreren der oben angeführten Mittel. Die Zusammensetzungen der Silica-Festphase, die zur Verwendung in den Matrizen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen das Gemisch aus Silicagel und Silicaglas, das in US-Patent Nr. 5.658.548 beschrieben ist, die in PCT-Veröffentlichung Nummer WO 98/31840 beschriebenen Silicamagnetteilchen und die von Promega Corporation verkauften Festphasen zur Verwendung in der Plasmid-DNA-Isolation, d.h. Wizard^®-Minipreps-DNA-Reinigungsharz. Silicagelteilchen sind besonders für die Verwendung als Silica-Festphase in den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Silicamatrizen bevorzugt. Silicagelteilchen bleiben bei viel höherem Druck stabil als aus weichem Gelträgermaterial hergestellte Festphasen, wodurch die Silicagel-Festphasen für HPLC wie auch für LC und Chargentrennungsanwendungen geeignet sind.
Die im Verfahren und Set der vorliegenden Erfindung eingesetzte Matrix liegt vorzugsweise in einer Form vor, die von einem Gemisch von Gelöststoffen, welches die Targetnucleinsäure und zumindest einen Kontaminanten enthält, durch Anwendung einer externen Kraft abgetrennt werden kann, nachdem das Gemisch aus Gelöststoffen damit kombiniert wurde. Fachleute wissen, dass die Art der externen Kraft, die zur Verwendung zur Trennung der Matrix vom Gemisch der Gelöststoffe geeignet ist, von jener Form abhängt, in welcher die Matrix dem Gemisch der Gelöststoffe präsentiert wird, und auch von den physikalischen Eigenschaften der Festphasenkomponente der Matrix. Zum Beispiel kann die Schwerkraft eingesetzt werden, um eine silanisierte Silicamatrix vom Gemisch der Gelöststoffe zu trennen, wenn die Matrix in Form eines auf eine LC-Säule aufgeladenen Chromatographieharzes vorliegt, wenn die Festphase der Matrix in Form von Silicateilchen (z.B. Controlled-Pore-Glas, Silicagelteilchen oder Silicamagnetteilchen) vorliegt, die zu einem Gemisch aus Gelöststoffen chargenweise zugesetzt werden und dann mittels Dekantierung oder Filtration davon entfernt werden, oder wenn die Matrix in Form einer Silicafaser oder eines Filters mit einer Silica-Festphase in Form von Teilchen oder Chromatographieharz vorliegt, das darin eingebettet ist oder daran gebunden ist.
Wenn die Matrix die stationäre Phase einer Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäule (HPLC-Säule) ist, ist die externe, im Isolationsverfahren verwendete Kraft eine Hochdruckflüssigkeit. Andere Formen externer Kräfte, die zur Anwendung im Verfahren der Erfindung geeignet sind, umfassen Vakuumfiltration (z.B. wenn die Festphasenkomponente der Matrix aus Controlled-Pore-Glas-, Silicagel- oder Silicagmagnetteilchen oder aus Gemischen einer oder mehrere der obigen Arten von Teilchen besteht, die in einen Filter eingebettet oder an diesen gebunden sind), Zentrifugation (z.B. wenn die Matrix partikulär ist, einschließlich Magnetteilchen) oder Magnetkräfte (z.B. wenn die Matrix magnetische oder paramagnetische Teilchen umfasst).
Wenn die Festphasenkomponente der Matrix ein Silicagelteilchen ist, ist sie am bevorzugtesten ein Silicamagnetteilchen. Ein Silicamagnetteilchen kann unter Einsatz jedes beliebigen der zuvor beschriebenen externen Mittel zur Verwendung mit anderen Arten von Festphasen, wie z.B. den oben beschriebenen, aus einer Lösung ge trennt werden. Jedoch kann ein Silicamagnetteilchen, anders als die anderen Festphasen, mittels Magnetkraft, einem raschen und effizienten Mittel zum Trennen einer Matrix aus einer Lösung, aus einer Lösung getrennt werden.
Wenn die Festträgerkomponente der Matrix ein Silicamagnetteilchen ist, wird die Größe des Teilchens bevorzugt wie folgt ausgewählt. Kleinere Silicamagnetteilchen stellen wie hierin nachstehend beschrieben einen größeren Oberflächenbereich (auf Basis einer pro-Gewicht-Einheit) zur Modifikation bereit. Jedoch sind kleinere Teilchen im Vergleich zu größeren Teilchen eingeschränkt, was die Menge des magnetischen Materials betrifft, das in solche Teilchen aufgenommen werden kann. Die mittlere Teilchengröße der Silicamagnetteilchen, die in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beträgt etwa 1 bis 15 μm, noch bevorzugter etwa 3 bis 10 μm und am bevorzugtesten etwa 4 bis 7 μm. Die Teilchengrößenverteilung kann ebenfalls variieren. Jedoch ist eine relativ enge monomodale Teilchengrößenverteilung bevorzugt. Die monomodale Teilchengrößenverteilung ist bevorzugt so, dass etwa 80 Gew.-% der Teilchen innerhalb eines 10-μm-Bereichs der mittleren Teilchengröße liegen, noch bevorzugter innerhalb eines 8-μm-Bereichs und am bevorzugtesten innerhalb eines 6-μm-Bereichs.
Die Festträgerkomponente der Matrix der vorliegenden Erfindung kann porös oder nicht-porös sein. Wenn der Festträger porös ist, liegen die Poren bevorzugt in einem kontrollierten Größenbereich, der ausreichend groß ist, um das Targetnucleinsäurematerial ins Innere des Festphasenteilchens eindringen zu lassen und an funktionelle Gruppen oder Silica auf der inneren Oberfläche der Poren zu binden. Jedoch ist der Festträger bevorzugt porös, um eine ausreichende Ligandendichte zur Ausbildung eines Komplexes mit einem der oben beschriebenen Gelöststoff, d.h. dem zerstörten biologischen Material, oder der Target-Nucleinsäure sicherzustellen. Das Gesamtporenvolumen eines Silicamagnetteilchens, das durch Stickstoff-BET-Verfahren gemessen wird, beträgt bevorzugt zumindest etwa 0,2 m²/g der Teilchenmasse. Das Gesamtporenvolumen der porösen Silicamagnetteilchen, die zur Verwendung als Komponenten der in der vorliegenden Erfindung verwendeten silanisierten Silica matrix bevorzugt sind, welches mittels Stickstoff-BET gemessen wird, beträgt bevorzugt zumindest etwa 50% des Porenvolumens und ist in Poren enthalten, die einen Durchmesser von 600 Å oder größer aufweisen.
Silicamagnetteilchenfestphasen können Substanzen enthalten, wie z.B. Übergangsmetalle oder flüchtige organische Verbindungen, welche die Nützlichkeit der Targetnucleinsäuren, die mit solchen Substanzen im Wesentlichen kontaminiert sind, negativ beeinflussen können. Insbesondere können solche Kontaminanten das Downstream-Verfahren, die Analyse und/oder Verwendung dieser Materialien beeinflussen, z.B. durch Hemmung der Enzymaktivität oder durch Nicken oder Zersetzen der Targetnucleinsäuren, die damit isoliert werden. Jede dieser Substanzen, die in den Silicamagnetteilchenkomponenten der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Matrizen gegenwärtig sind, liegen bevorzugt in einer Form vor, die sich nicht einfach aus dem Teilchen heraus in das isolierte biologische Targetmaterial löst, das gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde. Eisen ist zumindest ein solcher unerwünschter Kontaminant, besonders wenn das biologische Targetmaterial eine Targetnucleinsäure ist.
Eisen in Form von Magnetit ist im Kern der besonders bevorzugten Formen der Silicamagnetteilchen gegenwärtig, die als Festphasenkomponente der Matrizen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eisen hat einen breiten Absorptionspeak zwischen 260 und 270 Nanometer („nm"). Die Targetnucleinsäuren haben einen Absorptionspeak bei etwa 260 nm, daher kann Eisenkontamination in einer Targetnucleinsäurenprobe die Genauigkeit der Ergebnisse der quantitativen spektrophotometrischen Analyse solcher Proben negativ beeinflussen. Alle eisenenthaltenden Magnetteilchen, die unter Einsatz der vorliegenden Erfindung zum Isolieren von Targetnucleinsäuren verwendet werden, produzieren vorzugsweise kein isoliertes Targetnucleinsäurematerial, welches ausreichend mit Eisen kontaminiert ist, da das Eisen bei oder um 260 nm mit der spektrophotometrischen Analyse des Materials interferiert.
Die am meisten bevorzugten Silicamagnetteilchen, die in den silanisierten Silicamagnetteilchen in den Verfahren und Sets der vorliegenden Erfindung als Festphasen verwendet werden, sind mit Siliciumdioxid beschichtete Teilchen, die in der Internationalen Patentanmeldungsveröffentlichung Nummer WO 98/31461 beschrieben sind. Die bevorzugten Silicamagnetteilchen lösen nicht mehr als 50 ppm, noch bevorzugter nicht mehr als 10 ppm und am bevorzugtesten nicht mehr als 5 ppm der Übergangsmetalle heraus, wenn sie wie folgt untersucht werden. Insbesondere werden die Teilchen wie folgt getestet: 0,33 g der Teilchen (im Ofen bei 110°C getrocknet) werden mit 20 ml von wässriger 1 N HCl Lösung (unter Einsatz von entionisiertem Wasser) vereinigt. Das resultierende Gemisch wird dann nur zum Dispergieren der Teilchen gerührt. Nach etwa 15 Minuten der Gesamtkontaktzeit wird dann ein Teil der Flüssigkeit des Gemisches auf ihren Metallgehalt getestet. Es kann jegliches herkömmliche Elementaranalyseverfahren verwendet werden, um die Menge des Übergangsmetalls in der resultierenden Flüssigkeit zu quantifizieren, jedoch ist eine induktiv gekoppelte Plasmaspektroskopie (ICP) bevorzugt. Silicamagnetteilchen, die der oben zitierten Beschreibung für besonders bevorzugte Teilchen entsprechen, werden unter dem Markennamen „MagneSil^TM Paramagnetic Particles" (Promega Corporation) verkauft.
Jegliche Quelle magnetischer Kraft, die ausreichend stark ist, um die Silicamagnetteilchen aus einer Lösung zu trennen, können in den Nucleinsäureisolationsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Jedoch wird die magnetische Kraft bevorzugt in Form einer magnetischen Trennstation, wie z.B. „MagneSphere^® Technology Magnetic Separation Stands" (Katalognummern Z5331 bis 3 oder Z5341 bis 3) der Promega Corporation, bereitgestellt.
Die silanisierte Silicamatrix, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird bevorzugt unter Einsatz eines Silanisierungsreagens der allgemeinen Formel R₀R₁R₂SiR₃ (II) hergestellt, worin R₀ einem Alkoxyrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, bevorzugt -OCH₃, -OC₂H₅ oder -OC₃H₇, oder einem Halogenatom, bevorzugt -Cl, oder einer Dialkylamingruppe mit identischen oder unterschiedlichen Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen entspricht, R₁ und R₂ einem Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, bevorzugt -CH₃, -C₂H₅ oder -C₃H₇, oder einem Alkoxyrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, bevorzugt -OCH₃, -OC₂H₅ oder -OC₃H₇, oder einem Halogenatom oder einem Alkylrest mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen entsprechen, der durch zumindest eine Oxy- oder Aminogruppe unterbrochen ist, worin der Rest auch einmal oder mehrmals mit Halogen, Cyano, Nitro, Amin, Monoalkylamino, Dialkylamino, Hydroxy oder Aryl substituiert sein kann, und R₃ einer Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder einem Alkylrest entspricht, der durch zumindest eine Oxy- oder Aminogruppe unterbrochen ist, worin der Rest auch einmal oder mehrmals mit Halogen, Cyano, Nitro, Amino Monoalkylamino, Dialkylamino, Alkoxy, Hydroxy, Aryl und/oder Epoxy, bevorzugt ein Epoxy der allgemeinen Formel (III), substituiert sein kann.
Das Silanisierungsreagens ist bevorzugt 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan. Das Verhältnis von Silan zur Silica-Festphase kann angepasst werden, um Matrizen mit unterschiedlichen Dichten der an die Oberfläche der Festphase gebundenen Silanliganden zu ergeben.
Das Silanisierungsreagens kann direkt zur Silica-Festphase hinzugegeben werden, um damit zu reagieren. Jedoch wird das Silanisierungsreagens bevorzugt in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Toluol, gelöst, bevor es zur Silica-Festphase hinzugegeben wird und damit reagiert. Die Silanisierungsreaktion kann bei jeder beliebigen Temperatur stattfinden, bei welcher das Silanisierungsreagens stabil ist und mit der Silica-Festphase reagiert. Die Reaktion wird bevorzugt durch Inkubation des Gemisches aus Reagens und Festphase bei Raumtemperatur zumindest 4 Stunden lang ausgeführt, noch bevorzugter zumindest 6 Stunden lang.
Jede einer Vielzahl von Silanliganden, die an die Silica-Festphase in der silanisierten Silicamatrix, welche im Verfahren und Set der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gebunden ist und wie zuvor beschrieben hergestellt wird, hat eine Struktur, die durch die oben angeführte allgemeine Formel (I) ausgedrückt wird. Die bevorzugteste Form des an die Silica-Festphase der silanisierten Silicamatrix gebundenen Liganden weist die Struktur der allgemeinen Formel (IV)
auf, worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander -OH, -CH₃, -OCH₃, -OCH₂CH₃ sind.
Die Festphasenmatrix der vorliegenden Erfindung ist zur Verwendung zur Isolation von Targetnucleinsäuren geschaffen. Sowohl die zuvor beschriebene Ligandenkonfiguration als auch Ligandendichte können angepasst werden, um eine optimale Adsorption und Desorption einer bestimmten Targetnucleinsäure sicherzustellen. Siehe unten Beispiel 8 für ein Beispiel, in welchem silanisierte Silicamagnetteilchen mit variierenden Ligandendichten verwendet wurden, um DNA-Fragmente variierender Längen zu isolieren, um so die Festphase mit einer zur Isolation von kurzen DNA-Fragmenten (d.h. eine Länge von weniger als 150 Basenpaaren) geeigneten Ligandendichte zu identifizieren.
Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele lehren verschiedene Ausführungsformen der Erfindung. In den Beispielen und den anderen Teilen der Patentbeschreibung und der Patentansprüche sind Volumina und Konzentrationen wenn nicht anders angegeben bei Raumtemperatur erhobene Werte. Die Silicamagnetteilchen, die in den nachstehenden Beispielen verwendet werden, waren alle poröse MagneSil^TM-Teilchen mit allgemein bevorzugten Dimensionen und einer hierin beschriebenen Siliciumdioxid-Beschichtung und wurden wie in Beispiel 3 nachstehend beschrieben modifiziert. Die porösen MagneSil^TM-Teilchen, die in den nachstehenden Beispielen verwendet wurden, wurden aus einer von 2 Chargen von Teilchen mit den folgenden Eigenschaften ausgewählt: (1) eine BET-Oberfläche von 55 m²/g, ein Porenvolumen von 0,181 ml/g für Teilchen von einem Durchmesser < 600 Å, ein Porenvolumen von 0,163 ml/g für Teilchen mit einem Durchmesser > 600 Å, eine mittlere Teilchengröße von 5,3 μm und eine Eisenauslaugung von 2,8 ppm wenn sie wie hierin wie zuvor beschrieben unter Einsatz von ICP getestet wurden; oder (2) eine BET-Oberfläche von 49 m²/g, ein Porenvolumen von 0,160 ml/g (Durchmesser < 600 Å), ein Porenvolumen von 0,163 ml/g (Durchmesser > 600 Å), eine mittlere Teilchengröße von 5,5 μm und eine Eisenauslaugung von 2,0 ppm.
Ein Fachmann auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung kann die Lehren der vorliegenden Offenbarung verwenden, um Matrizen auszuwählen, die zur Verwendung im Verfahren und im Set der vorliegenden Erfindung anders als die spezifische Ausführungsform der silanisierten Silicamagnetteilchen, die wie in Beispiel 3 beschrieben produziert und in den folgenden Beispielen verwendet wurden, geeignet sind. Insbesondere sollten die Beispiele nicht als den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränkend interpretiert werden. Fachleuten auf dem Gebiet der chromatographischen Trennungen und Molekularbiologie sind andere modifizierte Silicamagnetteilchen und Verfahren zur Verwendung derselben zum Isolieren von Targetmaterial gemäß der vorliegenden Erfindung bekannt.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sollen verschiedene Aspekte der Erfindung veranschaulichen, ohne deren Schutzumfang einzuschränken.
BEISPIEL 1 – GELELEKTROPHORESE
Proben von Targetnucleinsäuren, die gemäß den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren isoliert worden waren, wurden auf Kontamination mit Nicht-Targetnucleinsäuren und auf deren Größe wie folgt getestet. Die Proben wurden auf einem Agarose-Gel geeigneter Dichte fraktioniert (z.B. wurde ein 1,0% Agarose-Gel verwendet, um Plasmid-DNA zu analysieren, während ein 4,0% Agarose-Gel zur Analyse von RNA verwendet wurde). Die fraktionierte Nucleinsäure wurde durch Färbung des Gels mit einem auf Nucleinsäure sensiblen Farbstoff, wie z.B. Ethidiumbromid, detektiert. Dann wurde das resultierende fraktionierte gefärbte Gel fotografiert.
In einigen Fällen wurden auf demselben Gel wie die Targetnucleinsäure Größenstandards fraktioniert und dazu verwendet, die ungefähre Größe der Targetnucleinsäure zu bestimmen. In jedem Fall, indem ein Geltest durchgeführt wurde, wurde das Foto der fraktionierten Nucleinsäure auf Kontamination durch Nicht-Targetnucleinsäuren untersucht. Zum Beispiel wurden Bilder fraktionierter Proben von Plasmid-DNA auf RNA, die auf demselben Gel wesentlich schneller läuft als die DNA, und auf chromosomale DNA getestet, die auf demselben Gel wesentlich langsamer läuft als Plasmid-DNA. Es wurden auch Bilder isolierter Plasmid-DNA untersucht, um zu bestimmen, ob der Großteil der Plasmid-DNA, die im Bild gezeigt wird, eine intakte supergeknäuelte Plasmid-DNA ist.
BEISPIEL 2 – ABSORPTIONSSPEKTROPHOTOMETRIE
Proben von Targetnucleinsäuren, die von verschiedenen Medien wie nachstehend beschrieben isoliert worden waren, wurden auch unter Einsatz von Absorptionsspektrophotometrie analysiert. Bei Wellenlängen von 260, 280 und 230 Nanometern (nm) wurden Absorptionsmessungen durchgeführt. Aus den Messungen wurden A₂₆₀/A₂₈₀-Adsorptionsverhältnisse berechnet. Es wurde interpretiert, dass ein A₂₆₀/A₂₈₀ von mehr als 1,70 oder gleich 1,70 angibt, dass die hierin analysierte Probe relativ frei von Proteinkontamination war. Aus den Absorptionsmessungen bei 260 nm (A₂₆₀) wurde die Konzentration der Nucleinsäure in jeder Probe bestimmt. Ein A₂₆₀ von 1,0 ergibt 50 μg/ml doppelsträngige DNA. Kontaminanten, die Peptidbindungen oder aromatische Gruppierungen, wie z.B. Protein und Phenol, enthalten, absorbieren bei 230 nm.
BEISPIEL 3 – HERSTELLUNG VON GLYCIDYL-MODIFIZIERTEN MAGNESIL^TM-TEILCHEN
MagneSil^TM-Teilchen (Promega) wurden mittels Filtrierung aus einer Wassersuspension getrocknet, mit Aceton gewaschen, dann bei Raumtemperatur über Nacht in einem Abzug getrocknet, gefolgt von Trocknung bei 60–70°C unter Vakuum über einen Zeitraum von zumindest 2 Stunden. Die Teilchen wurden in einem Exsikkator aufbewahrt, bis sie in der Silanisierungsreaktion verwendet wurden.

1. 5 g der MagneSil^TM-Teilchen wurden in 200 ml Toluol in einem mit einem motorisierten Rührer ausgestatteten Kolben suspendiert.
2. 15 ml 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan wurden in 100 ml Toluol gelöst und zu dem Reaktionskolben hinzugegeben.
3. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur etwa 6 Stunden lang ohne Rückflusserhitzen gerührt, ausgenommen die in den nachstehenden Beispielen bereitgestellten Ausnahmen.
4. Die Teilchen wurden zumindest dreimal in dem im obigen Schritt 2 verwendeten Toluol gewaschen, wodurch die Teilchen jedes Mal in einem magnetischen Feld vom Lösungsmittel abgetrennt wurden. Dieselben Teilchen wurden auch zumindest zweimal auf dieselbe Art und Weise in Aceton gewaschen.
5. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Teilchensuspension filtriert, in einem Abzug bei Raumtemperatur getrocknet und dann weiters unter Vakuum bei 60–70°C getrocknet.

Eine Probe getrockneter Teilchen, die einer Elementaranalyse unterworfen wurden, entsprachen den silanisierten Silicamagnetteilchen mit der Struktur der allgemeinen Formel (VI), siehe unten. Die Wellenlinie in der nachstehenden Formel steht für die Oberfläche der MagneSil^TM-Teilchen
worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander -OH, -CH₃, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ sind. Die silanisierten MagenSil^TM-Teilchen, die wie zuvor beschrieben produziert wurden, werden hierin nachstehend als „Glycidyl-MagneSil-Teilchen" beschrieben. Die Glycidyl-MagneSil-Teilchen wurden in den nachstehenden Beispielen verwendet.
BEISPIEL 4 – HERSTELLUNG EINES LYSATS VON PLASMID-DNA
E.-coli-Bakterienzellen, DH5α-Stamm, wurden mit pGEM^®-3zf⁺-Plasmid-DNA (Promega) transformiert, über Nacht bei 37°C in „Luria Broth"-(„LB"-)Medium gezüchtet und dann mittels Zentrifugation geerntet.
Die folgenden Lösungen wurden verwendet, um ein Lysat der geernteten Zellen wie nachstehend beschrieben herzustellen.
Zellresuspensionslösung:

50 mM Tris-HCl, pH 7,5
10 mM EDTA
100 μg/ml DNase-freie Ribonuclease A (RNase A)

Neutralisationslösung, pH 4,2

0,5 K⁺
4,2 M GTC (Guanidinthiocyanat)
1,9 M OAc^–

Zelllyselösung

0,2 M NaOH
1% SDS (Natriumdodecylsulfat)

Wie folgt wurde ein Lysat der transformierten Zellen hergestellt:

1. Die Zellen aus 1 bis 10 ml Bakterienkultur wurden mittels Zentrifugation der Kultur über einen Zeitraum von 1–2 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge geerntet. Die geernteten Zellen wurden in 250 μl Zellresuspensionslösung resuspendiert und in ein Mikrozentrifugenröhrchen transferiert. Die resultierende Lösung der resuspendierten Zellen war trüb.
2. Zu der Lösung der resuspendierten Zellen wurden dann 250 μl Zelllyselösung hinzugefügt und mittels Inversion gemischt, bis die Lösung relativ klar wurde, was anzeigte, dass die resuspendierten Zellen lysiert hatten.
3. Zu dem resultierenden Lysat wurden 350 μl Neutralisationslösung hinzugefügt und gemischt. Das Lysat wurde trüb, nachdem die Neutralisationslösung hinzugefügt worden war.

Jede Lysatprobe, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde mittels Zentrifugation oder unter Einsatz von MagneSil^TM-Teilchen oder Glycidyl-MagneSil-Teilchen wie nachstehend beschrieben gereinigt.
BEISPIEL 5 – VERGLEICH VON LYSATREINIGUNG UND PLASMID-DNA-ISOLATION MIT GLYCIDYL-MAGNESIL-TEILCHEN VERSUS MAGNESIL^TM-TEILCHEN MIT UND OHNE ISOPROPANOL
A. Lysatreinigung und Isolation von DNA
100 ml einer über Nacht gezüchteten Kultur von DH5α-Zellen, die mit pGEM^®-3zf⁺ (Promega) transformiert worden waren, wurden in 36 verschiedene Röhrchen aliquotiert, mittels Zentrifugation geerntet und wie im obigen Beispiel 4 beschrieben behandelt, um ein Lysat davon herzustellen. Das resultierende Lysat wurde unter Einsatz eines der folgenden drei Verfahren gereinigt. Lysate aus einem Satz von 12 Röhr chen wurden mittels 10-minütige Zentrifugation bei 16,000 × g und durch Entfernung in ein separates, sauberes Röhrchen gereinigt. Lysate aus einem anderen Satz von 12 Röhrchen wurden unter Einsatz von 5 mg MagneSil^TM-Teilchen (50 μl von 100 mg/ml) gereinigt. Die Lysatlösungen aus dem letzten Satz von 12 Röhrchen wurden unter Einsatz von 5 mg Glycidyl-MagneSil gereinigt. In jedem Fall, in welchem Magnetteilchen verwendet wurden, konnten die Teilchen an das Material, wie z.B. Lipide, Proteine und Zelltrümmer, in jedem Röhrchen adsorbieren, wurden mittels magnetischer Kraft auf eine Seite des Röhrchens gezogen, und das übrige gereinigte Lysat wurde in ein sauberes Röhrchen entfernt.
Jeder Satz von 12 Proben wurde in drei Untermengen von jeweils vier (4) Proben unterteilt. Die folgenden Arten paramagnetischer Teilchen und Lösungen wurden zum ersten Probensatz hinzugefügt, um an die darin enthaltene Plasmid-DNA zu adsorbieren: (a) zu der ersten Probe jedes Satzes von vier Proben wurden MagneSil^TM-Teilchen (100 μl von 100 mg/ml) ohne Isopropanol hinzugefügt, (b) zu dem zweiten Satz von vier Proben wurden MagneSil^TM-Teilchen (100 μl von 100 mg/ml) gemeinsam mit 600 μl Isopropanol pro Probe hinzugefügt, und (c) zu dem dritten Satz von vier Proben wurden Glycidyl-MagneSil-Teilchen mit 600 μl Isopropanol pro Probe hinzugefügt. Alle Proben wurden periodisch gemischt und bei 20°C 10 Minuten lang inkubiert.
Die Teilchen wurden aus jeder Lösung unter Einsatz magnetischer Kraft entfernt, und die Überstände wurden entfernt und verworfen.
Jeder Teilchensatz wurde dreimal mit 1,0 ml einer Waschlösung (80 Vol.-% Ethanol, 20 Vol.-% Nanopure-Wasser) gewaschen. Nach der dritten Waschung wurden die Teilchen bei 20°C 20 Minuten lang luftgetrocknet.
Letztendlich wurden zu jeder Probe 100 μl einer Elutionslösung (200 mM TrisHCl pH 9,5) hinzugefügt. Die Teilchen plus Elutionslösung wurden bei 65°C 5 Minuten lang ohne Kappe inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurden zu jedem Röhrchen 10 μl Nanopure-Wasser hinzugefügt, um das Gesamtvolumen der Lösung in jedem Röhrchen wieder auf 100 μl zu bringen. Alle Röhrchen wurden 5 Minuten lang bei 16.000 × g zentrifugiert, und die Überstände wurden wie nachstehend beschrieben zur Analyse in saubere Röhrchen transferiert.
B. Analyse der Ergebnisse
Eine Probe jedes der wie oben beschrieben hergestellten Eluenten wurde mittels Gelelektrophorese wie im obigen Beispiel 1 beschrieben analysiert. In zwei Spuren des Gels wurden DNA-Leitern laufen gelassen, um nachzuweisen, dass die Größe der Banden der Eluenten-DNA der für die Plasmid-DNA erwarteten Größe entsprach. Die Testergebnisse der Gelelektrophorese sind in 1 dargestellt. Die erwartete Größe wurde bestätigt. Es wurde in jeder Probe eine intakte Plasmid-DNA detektiert, und es gab in keiner Probe Hinweise auf Abbau oder RNA-Kontamination. Die Reihenfolge, in welcher die Proben auf das Gel aufgeladen wurden, ist in Tabelle 1 nachstehend angeführt.
TABELLE
Die Menge an DNA in allen Proben, die durch Reinigung eines Lysats mit MagneSil^TM-Teilchen produziert wurde, war weit geringer als die Menge der DNA, die durch Reinigung mit Glycidyl-MagneSil-Teilchen erzeugt wurde, unabhängig davon, welches der drei getesteten Protokolle verwendet wurde, um Plasmid-DNA aus den dadurch produzierten gereinigten Lysaten zu isolieren. Die Menge und Qualität der DNA schien innerhalb jedes Satzes von zwölf gereinigten und getesteten Lysatproben vergleichbar, unabhängig vom Verfahren, das zur Isolation der DNA aus diesen verwendet wurde. Insbesondere zeigten die Geltestergebnisse, dass die gesamte Plasmid-DNA intakt und frei von Kontamination zu sein schien.
Es wurde ebenfalls wie in Beispiel 2 beschrieben an allen Eluentenproben, die wie in Abschnitt A unmittelbar zuvor beschrieben produziert wurden, ein spektrophotometrischer Test durchgeführt. Jeder spektrophotometrischer Scan wurde auf 20 μl jedes Eluenten ausgeführt, der mit 380 μl von 200 mM TrisHCl, pH 9,5 in einer 400-μl-Küvette verdünnt worden war. Der Durchschnitt der Messungen aus jedem Satz der oben beschriebenen vier Proben ist in Tabelle II nachstehend angeführt:
TABELLE II
Die Ausbeute der DNA, die aus Lysaten isoliert wurde, welche unter Einsatz von Gycidyl-MagneSil-Teilchen gereinigt worden waren, war, wie die A₂₆₀-Messungen in Tabelle II zeigen, mit der Ausbeute der DNA von Lysaten vergleichbar, die mittels Zentrifugation gereinigt worden waren. Die Ausbeute der DNA, die aus Lysaten isoliert wurde, die mit MagneSil^TM-Teilchen gereinigt worden waren, war signifikant geringer als die Ausbeute, die unter Einsatz eines der anderen getesteten Lysatreinigungsverfahren erhalten wurde.
Die spektrophotometrischen Testergebnisse in der obigen Tabelle II zeigen auch, dass bei Verwendung desselben Verfahrens zur Reinigung dreier Sätze von Lysatproben und von DNA, die daraus unter Einsatz dreier verschiedener oben beschriebenen Isolationsverfahren isoliert wurde, die DNA-Menge, die aus jeder Probe in dem Satz isoliert wurde, unabhängig davon, welches Isolationsverfahren verwendet wurde, vergleichbar war. Die Reinheit aller oben isolierten DNA-Proben schien hoch zu sein, mit Ausnahme der Reinheit der mit MagneSil^TM-Teilchen ohne Isopropanol (Proben 13–16) gereinigten und isolierten Proben. Mit Ausnahme dieser speziellen Proben wiesen alle Proben A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnisse von zumindest 1,75 auf, die eine hohe Reinheit anzeigten. Jedoch wies jene DNA, die mithilfe von Glycidyl-MagneSil-Teilchen (mit Isopropanol) isoliert wurde, in jedem Satz von Proben, die unter Einsatz desselben Lysatreinigungsverfahrens verarbeitet wurden, die höchste Reinheit auf, wobei jene DNA, die unter Einsatz von MagneSil^TM-Teilchen mit demselben hinzugefügten Isopropanol isoliert wurde, die nächsthöchste Reinheit aufwies und jene DNA, die mit MagneSil^TM-Teilchen ohne Hinzufügung von Isopropanol isoliert wurde, die geringste Reinheit der drei Verfahren hatte, wie durch A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnisse festgestellt wurde.
Die spektrophotometrischen Ergebnisse entsprachen den im oben beschriebenen Geltest erhaltenen Ergebnissen.
BEISPIEL 6 – HERSTELLUNG EINES LYSATS AUS SONNENBLUMENSAMEN UND DARAUS GEREINIGTER DNA
Frische Sonnenblumensamen wurden geschält, und die Samen wurden separat in einer Lösung lysiert, welche etwa 1 M chaotropes Salz enthielt, die (pro Probe) aus Folgendem bestand: 250 μl „Wizard^® Genomic Nuclei"-Lyselösung (Promega Kat.-Nr. A7943) + 500 μl von (4 M GTC, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5) + 5 μl von RNase A, zweimal mit einer Stahlperle in einem Retsch-Mixer (Hann, Deutschland) gemischt, jeder Mischzyklus über einen Zeitraum von zwei Minuten.
Vier Samen wurden auf diese Art und Weise verarbeitet, zwei davon enthielten auch 100 mg Polyvinylpolypyrrolidon (hierin nachstehend PVPP) (Sigma P-6755, St. Louis, Missouri), welches vor Mischung im Retsch-Mixer hinzugefügt wurde. Die anderen zwei enthielten kein PVPP.
Eine Probe mit PVPP und eine Probe ohne PVPP wurden 10 Minuten lang bei 16.000 × g zentrifugiert, um das Lysat zu reinigen. Die andere Probe mit PVPP und die andere Probe ohne PVP wurden jeweils mit 20 μl (2 mg) Glycidyl-MagneSil-Teilchen gemischt, und die Trümmer und Teilchen wurden mittels Magnetkraft auf eine Seite des Röhrchens gezogen.
Die Überstände aus den vier Proben wurden entfernt, um 1,5-ml-Röhrchen, die 25 μl (2,5 mg) MagneSil^TM-Teilchen enthielten, zu reinigen, und wurden 10 Minuten lang inkubiert, sodass die DNA sich an die MagneSil^TM-Teilchen binden konnte. Die Überstände wurden dann entfernt und die Teilchen dreimal mit einer Waschlösung gewaschen, die 1 ml von 25% Isopropanol, 25% Ethanol, 0,2 M NaCl, und 10 mM EDTA enthielt, wobei die Überstände nach jeder Waschung entfernt wurden. Die Teilchen wurden bei 20°C 20 Minuten lang getrocknet und in 100 μl von 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0 eluiert.
10 μl jeder Eluentenprobe wurden auf ein Agarose-Gel aufgeladen und mittels Gelelektrophorese getrennt. In 2 ist eine Fotografie des resultierenden Gels zu sehen, das mit Ethidiumbromid gefärbt wurde. Die Ergebnisse des Geltests zeigen, dass mittels Zentrifugation und mit magnetischer Reinigung unter Einsatz von Glycidyl-MagneSil-Teilchen ähnliche DNA-Ausbeuten erreicht wurden. Die Proben, die PVPP enthielten, zeigten reduzierte Ausbeuten, aber die Ausbeute unter Einsatz von Glycidyl-MagneSil-Teilchen zur Reinigung war höher als die Ausbeute aus den Proben, die mittels Zentrifugation gereinigt wurden.
Alle vier Proben zeigen gute Amplifikation in PCR (Polymerasekettenreaktion) und RAPD (statistisch amplifizierte polymorphe DNA, siehe US-Patent 5.126.239).
BEISPIEL 7 – ISOLATION VON DNA AUS MAISKEIMÖL
Proben von Maiskeimöl aus einem lokalen Supermarkt wurden auf ihren DNA-Gehalt getestet. Für dieses Beispiel wurde eine Flasche verwendet, die visuell wahrnehmbare DNA enthielt (nicht alle Flaschen enthielten genügend DNA, um mithilfe eines mit Ethidiumbromid gefärbten 4% Agarose-Gels sichtbar gemacht werden zu können). Obgleich das nachstehend beschriebene Verfahren die DNA aus diesen anderen Ölproben reinigt, sind die Ergebnisse jedoch nicht so einfach sichtbar.
Zu vier Röhrchen, die jeweils 20 ml Maiskeimöl enthielten, wurden pro Röhrchen folgende Lösungen hinzugefügt: 200 μl der „Wizard^® Genomic Nuclei"-Lyselösung + 100 μl der „SV Total RNA"-Lyselösung + 200 μl von „SV Total RNA"-Verdünnungslösung (siehe Beispiel 6 für Zusammensetzungen der Lyselösung). Die Röhrchen wurden während einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur mehrere Male energisch gemischt. Die Röhrchen wurden dann 5 Minuten lang bei 3.000 × g zentrifugiert, und die unteren wässrigen Phasen wurden entfernt, um die Röhrchen zu reinigen. Zwei dieser Röhrchen wurden zusammengemischt, um Proben des extrahierten Materials zu erhalten. Von den übrigen zwei Röhrchen enthielt eine Probe 100 μl der hinzugefügten MagneSil^TM-Teilchen und die andere 100 μl der Glycidyl-MagneSil-Teilchen.
Zu jedem dieser Röhrchen wurden 50 μl von 1,32 M Kaliumacetat, pH 4,8, hinzugefügt. Zu jedem Röhrchen wurden dann 400 μl Isopropanol hinzugefügt, und die Röhrchen wurden während einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur durch periodisches Verwirbeln gemischt.
Die Röhrchen wurden dann 5 Minuten lang auf einen magnetischen Ständer platziert, und die Überstände wurden entfernt. Die Teilchen wurden in 1,0 ml Nanopure-Wasser resuspendiert, und die Überstände wurden entfernt. Dieser Wasserwaschschritt wurde für eine Gesamtzahl an 3 Waschschritten zweimal wiederholt. Die DNA wurde dann in 50 μl von 200 mM Tris HCl pH 9,5 eluiert.
Als die Eluenten wie in Beispiel 1 beschrieben mittels Gelelektrophorese analysiert wurden, wurde festgestellt, dass die DNA unter Einsatz von Glycidyl-MagneSil-Teilchen aus Maiskeimöl isoliert wurde. Jedoch wurde in der Probe, die unter Einsatz von MagneSil^TM-Teilchen verarbeitet wurde, keine DNA-Menge detektiert.
BEISPIEL 8 – REINIGUNG VON DNA UNTER EINSATZ VON GLYCIDYL-MAGNESIL-TEILCHEN
DNAs variierender Längen wurden an Glycidyl-MagneSil-Teilchen gebunden und von diesen eluiert. 50 μl (5 mg) von mit Glycidyl modifizierten MagneSil^TM-Teilchen mit variierenden Ligandendichten wurden zu 30 μl von Promegas 100-bp-DNA-Leiter (Kat.-Nr. G6951) hinzugefügt. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 30 μl von 66 mM KOAc pH 4,8 hinzugefügt, mittels Verwirbeln gemischt und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Inkubation wurden die Teilchen aus der Lösung in einem magnetischen Feld getrennt und Aliquote, der Lösung aus diesem entfernt. 11 μl jeder Aliquote wurden neben einer 3-μl-Probe der 100-bp-Leiter dann Elektrophorese unterzogen. 3A ist eine Fotografie der Er gebnisse der Gelelektrophorese, welche zeigt, dass die DNA in Lösung blieb und an die mit Glycidyl modifizierten MagneSil^TM-Teilchen mit niedrigeren Ligandendichten (Spuren 3–6) nicht gebunden war. Jedoch wurde in den Glycidyl-MagneSil-Teilchen mit hoher Ligandendichte, die wie im obigen Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurden, keine ungebundene DNA festgestellt.
Die Lösung wurde daraufhin aus jedem Röhrchen entfernt, und die Teilchen wurden zweimal mit 2,0 ml Nanopure-Wasser gewaschen. Die DNA wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in 50 μl von 10 mM Tris HCl pH 8,0 gewaschen, und nach magnetischer Trennung wurden 10 μl der eluierten Lösung neben einer Probe von 10 μl Elutionslösung, die durch Mischung der Glycidyl-MagneSil-Teilchen in eine Lösung mittels kurzem Verwirbeln erhalten worden war, Elektrophorese unterzogen. Dies wurde mit der 3-μl-Probe der Promega-100-bp-DNA-Leiter-Lösung verglichen. 3B ist eine Fotografie der Ergebnisse der Gelelektrophorese, welche zeigt, dass die DNA während den Wasserwaschungen (Spur 3) auf den Glycidyl-MagneSil-Teilchen mit hoher Ligandendichte blieb und dass die Banden mit geringerem Molekulargewicht (z.B. 100 bp) mit ähnlicher Wirksamkeit gereinigt wurden wie die größeren DNA-Fragmente (z.B. 600 bp). Spur 4 des Gels ist eine Aliquote der Glycidyl-MagneSil-Teilchen, die nach Elution Elektrophorese unterzogen wurden. Spur 1 des Gels ist die DNA-Leiter. Die Menge der DNA, die an die übrigen Glycidyl-modifizierten MagneSil^TM-Teilchen gebunden war und daraus eluiert wurde, nahm mit sinkender Ligandendichte signifikant ab.
BEISPIEL 10 – REINIGUNG VON DNA AUS AGAROSE-GEL-SCHICHTEN UNTER EINSATZ VON GLYCIDYL-MAGNESIL-TEILCHEN UND MAGNESIL^TM-TEILCHEN
Promegas 25-bp-DNA-Leiter (Katalognummer G4511) wurde 20 Minuten lang bei 200 V auf einem 1% Agarose-Gel laufen gelassen (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, Maine), und die Agarose-Gel-Schichten, welche die DNA enthielten, wurden aus dem Gel ausgeschnitten. Die Gelschichten wogen 3,7 g und wurden in einem 50-ml-Röhrchen mit 3,7 ml von 4,2 M Guanidinthiocyanat, 0,5 M Kalium, 1,9 M Acetat, pH 4,2 kombiniert. Das Röhrchen wurde 30 Minuten lang bei 60°C inkubiert, bis alle Gelfragmente gelöst waren.
500-μl-Proben der resultierenden geschmolzenen Gelschichtlösung wurden zu 1,5-ml-Röhrchen hinzugefügt, die entweder 50 μl (5 mg) von Glycidyl-MagneSil oder 50 μl (5 mg) von MagneSil^TM-Teilchen enthielten. Zu zwei Proben jedes Teilchens wurde kein Isopropanol (IPA) hinzugefügt, und zu vier Proben jeder Teilchenart wurden 500 μl IPA hinzugefügt (bei insgesamt 12 Proben). Diese Röhrchen wurden 20 Minuten lang bei 20°C inkubiert, sodass die DNA an die Teilchen binden konnte, und die Röhrchen wurden für 5 Minuten in einen magnetischen Trennständer platziert.
Die Lösungen wurden dann aus den Röhrchen entfernt. Die Röhrchen wurden dann entweder mit Wasser (zweimal mit 1,0 ml pro Waschschritt) oder 80% Ethanol (dreimal mit 1,0 ml pro Waschschritt) wie nachstehend beschrieben gewaschen. Nach der Waschung wurden die mit Ethanol gewaschenen Teilchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur getrocknet.
Die getrockneten Teilchen wurden mit 30 μl von 200 mM Tris HCl pH 9,5 kombiniert, um die daran adsorbierte DNA zu eluieren. 10 μl jeder Eluentenprobe wurden auf ein 4% Agarosegel geladen und mittels Gelelektrophorese wie in Beispiel 1 beschrieben fraktioniert.
4 ist eine Fotografie des Elektrophoresegels, das wie zuvor beschrieben hergestellt wurde. Tabelle 3 zeigt, welche Proben auf die oberen Spuren des Gels in 4 aufgeladen wurden. Tabelle IV zeigt die Proben, die auf jede der Spuren der unteren Hälfte des Gels in 4 aufgeladen wurden.
TABELLE III (obere Wells)
TABELLE IV (untere Wells)
Wie in 4 zu sehen ist, banden die Glycidyl-MagneSil-Teilchen die Fragmente der 25-bp-DNA-Leiter mit geringerem Molekulargewicht (die 25-bp-Fragmente waren nicht so einfach zu sehen), die MagneSil^TM-Teilchen banden unter den getesteten Bedingungen diese aber nicht so gut wie die Glycidyl-MagneSil-Teilchen. Es ist anzumerken, dass die relativen Ausbeuten der 50-bp-, 75-bp-, 100-bp- und 125-bp-Fragmente unter Einsatz von Glycidyl-MagneSil, wie in den Spuren 5, 6, 8 und 9 zu sehen ist, miteinander vergleichbar waren. Die Verwendung von Glycidyl-MagneSil ermöglicht auch die Gewinnung von DNA nach Waschung mit Wasser unter diesen Bedingungen (bei einem sauren pH), was den bei der Verwendung von Alkoholwaschungen erforderlichen Trocknungsschritt unnötig macht.

Claims

Verfahren zum Reinigen einer Lösung von zerstörtem biologischem Material gemäß folgenden Schritten: (a) Bereitstellung einer ersten silanisierten Silicamatrix, die eine feste Silicaphase mit einer Vielzahl von Silanliganden umfasst, die kovalent daran gebunden sind, worin jeder der Liganden in der Vielzahl der Silanliganden folgende allgemeine Formel aufweist:
worin R₁ und R₂ jeweils eine Untereinheit sind, die aus der aus Kohlenwasserstoffketten mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Halogenatomen, dem Wasserstoffatom, Hydroxy, sowie Alkylketten mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen, die durch einen Oxyrest unterbrochen sind, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin bis zu fünf der Kohlenstoffatome mit einer Gruppe substituiert sind, die aus der aus Halogenen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Cyano oder Nitrilen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxy und einer Bindung zu einem anderen Silanliganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und worin R₃ eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, die mit zumindest einem Hydroxy substituiert ist; oder eine Alkylkette mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen ist, die durch zumindest eine Oxygruppe unterbrochen ist, worin bis zu zehn Kohlenstoffatome mit einer Gruppierung substituiert sind, die aus der aus Halogenen, Cyano oder Nitrilen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Epoxy sowie einer Bindung zu einem anderen Silanliganden bestehenden Gruppe ausgewählt sind; und (b) Vereinigen der ersten silanisierten Silicamatrix mit einer ersten Lösung, die zerstörtes biologisches Material, ein Targetnucleinsäurematerial und ein chaotropes Salz in einer Konzentration umfasst, die ausreicht, um selektive Adsorption des zerstörten biologischen Materials an die Matrix zu fördern, wodurch ein erster Komplex gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das zerstörte biologische Material ein Bakterienzelllysat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das zerstörte biologische Material durch pflanzliches Material zerstört wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Konzentration des chaotropen Salzes in Schritt (b) zumindest 0,5 M beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Konzentration des chaotropen Salzes in Schritt (b) bis zu 3,5 M beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin jeder der Liganden in der Vielzahl von Silanliganden folgende allgemeine Formel aufweist:
worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander -OH, -CH₃, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die feste Silicaphase ein erstes Silicamagnetteilchen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das weiters folgenden Schritt umfasst: (i) Trennen des ersten Komplexes von der ersten Lösung, wodurch eine geklärte Lösung erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die feste Silicaphase ein erstes Silicamagnetteilchen ist und der erste Komplex von der ersten Lösung in Gegenwart eines magnetischen Felds abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, worin der erste Komplex von der ersten Lösung mittels Zentrifugieren abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, das einen Schritt umfasst, bei dem die geklärte Lösung mit einer zweiten Silicamatrix in einer zweiten Lösung kombiniert wird, worin die Targetnucleinsäure spezifisch an die zweite Silicamatrix adsorbiert wird, wodurch ein zweiter Komplex gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die zweite Silicamatrix eine Vielzahl von zweiten Silicamagnetteilchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die zweite Silicamatrix eine Vielzahl von zweiten silanisierten Silicamagnetteilchen ist und die zweite Lösung einen pH von bis zu 8,0 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die erste Silicamatrix dieselbe wie die zweite Silicamatrix ist.
Verfahren zum Isolieren einer Targetnucleinsäure aus einer Nucleinsäureadsorptionslösung, folgende Schritte umfassend: (a) Bereitstellung einer silanisierten Silicamatrix, die eine feste Silicaphase mit einer Vielzahl von Silanliganden umfasst, die kovalent daran gebunden sind, worin jeder der Liganden in der Vielzahl der Silanliganden folgende allgemeine Formel aufweist:
worin R₁ und R₂ jeweils eine Untereinheit sind, die aus der aus Kohlenwasserstoffketten mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Halogenatomen, dem Wasserstoffatom, Hydroxy, sowie Alkylketten mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen, die durch einen Oxyrest unterbrochen sind, bestehenden Gruppe ausgewählt sind, worin bis zu fünf der Kohlenstoffatome mit einer Gruppe substituiert sind, die aus der aus Halogenen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Cyano oder Nitrilen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen und Hydroxy bestehenden Gruppe ausgewählt sind; worin R₃ eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, die mit zumindest einem Hydroxy substituiert ist; oder eine Alkylkette mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen ist, die durch zumindest eine Oxygruppe unterbrochen ist, worin bis zu zehn Kohlenstoffatome mit einer Gruppierung substituiert sind, die aus der aus Halogenen, Cyano oder Nitrilen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Epoxy sowie einer Bindung zu einem anderen Silanliganden bestehenden Gruppe ausgewählt sind; (b) Vereinigen der silanisierten Silicamatrix mit einer Nucleinsäureadsorptionslösung mit einem pH von bis zu 8,0, wobei die Nucleinsäureadsorptionslösung die Targetnucleinsäure und zumindest ein Nichttargetmaterial umfasst, worin die Targetnucleinsäure selektiv an die silanisierte Silicamatrix adsorbiert wird, wodurch ein Komplex gebildet wird; und (c) Abtrennen des Komplexes von der Nucleinsäureadsorptionslösung.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Nucleinsäureadsorptionslösung ein Pflanzenöl umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, worin die Nucleinsäureadsorptionsiösung weiters eine Konzentration an niedermolekularem Alkohol umfasst, die ausreicht, um die Adsorption der Targetnucleinsäure an die zweite silanisierte Silicamatrix zu fördern.
Verfahren nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, worin die Adsorptionslösung weiters 0,2 bis 1,2 M eines chaotropen Salzes umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das chaotrope Salz aus der aus Guanidinhydrochlorid und Guanidinthiocyanat bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, worin die feste Silicaphase der Silicamatrix ein Silicamagnetteilchen ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin der Komplex in Gegenwart eines magnetischen Felds von der Nucleinsäureadsorptionslösung abgetrennt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, das weiters das Waschen des Komplexes in einer Waschlösung mit einem pH von bis zu 8,0 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die Waschlösung eine Konzentration von zumindest 30% eines niedermolekularen Alkohols umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, das weiters das Vereinigen des Komplexes mit einer Elutionslösung mit einem pH von zumindest 8,0 umfasst, wodurch die Targetnucleinsäure vom Komplex desorbiert wird.
Verfahren nach Anspruch 24, worin die Elutionslösung ein Puffer mit einem pH von zumindest 9,0 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 25, worin die Targetnucleinsäure aus der aus Plasmid-DNA, genomischer DNA und Gesamt-RNA bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 26, worin jeder der Vielzahl von Silanliganden die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder der Formeln R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander -OH, -CH₃, -OCH₃ oder -OCH₂CH₃ sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 27, worin die Targetnucleinsäure ein Molekulargewicht von zumindest 25 Basenpaaren aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 27, worin die Targetnucleinsäure ein Molekulargewicht von zumindest 50 Basenpaaren aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 27, worin die Targetnucleinsäure ein Molekulargewicht von zumindest 100 Basenpaaren aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 27, worin die Targetnucleinsäure ein Molekulargewicht von zumindest 150 Basenpaaren aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 27, worin die Targetnucleinsäure ein Molekulargewicht von zumindest 250 Basenpaaren aufweist.
Set zum Reinigen einer Lösung von zerstörtem biologischem Material und zur Isolierung einer Targetnucleinsäure aus einer Lösung, die in einem einzigen Behälter Folgendes umfasst: eine Vielzahl von silanisierten Silicamagnetteilchen, die eine feste Silicaphase mit zumindest einem Liganden umfasst, wobei zumindest ein Ligand kovalent an die Oberfläche jedes der Teilchen gebunden ist, wobei der Silanligand eine Struktur der folgenden Formel aufweist:
worin R₁ und R₂ jeweils eine Untereinheit sind, die aus der aus Kohlenwasserstoffketten mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Halogenatomen, dem Wasserstoffatom, Hydroxy, sowie Alkylketten mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen, die durch einen Oxyrest unterbrochen sind, bestehenden Gruppe ausgewählt sind, worin bis zu fünf der Kohlenstoffatome mit einer Gruppe substituiert sind, die aus der aus Halogenen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Cyano oder Nitrilen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen und Hydroxy bestehenden Gruppe ausgewählt sind; worin R₃ eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, die mit zumindest einem Hydroxy substituiert ist; oder eine Alkylkette mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen ist, die durch zumindest eine Oxygruppe unterbrochen ist, worin bis zu zehn Kohlenstoffatome mit einer Gruppierung substituiert sind, die aus der aus Halogenen, Cyano oder Nitrilen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Epoxy sowie einer Bindung zu einem anderen Silanliganden bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Set nach Anspruch 33, worin die Targetnucleinsäure weniger als 150 Basenpaare umfasst.
Set nach Anspruch 33, worin die Targetnucleinsäure weniger als 100 Basenpaare umfasst.