DE68924026T2

DE68924026T2 - Biosensor und dessen herstellung.

Info

Publication number: DE68924026T2
Application number: DE68924026T
Authority: DE
Inventors: Takashi Iijima; Mariko Kawaguri; Shiro Nankai; Mayumi Ohtani
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1989-03-30
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2009-03-31
Also published as: DE68924026T3; DE68924026D1; US5120420A; WO1989009397A1; US5120420B1; EP0359831A1; EP0359831B2; EP0359831B1; EP0359831A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Biosensoren, die eine spezifische Komponente in verschiedenen Probenlösungen aus dem lebenden Körper schnell und leicht mit hoher Genauigkeit quantitativ bestimmen können, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In den letzten Jahren sind verschiedene, eine spezifische, katalytische, Enzymen eigene Wirkung verwendende Biosensoren entwickelt worden, und insbesondere ist versucht worden, Biosensoren auf dem klinischen Gebiet anzuwenden. In der heutigen Zeit, wo Untersuchungsgegenstände und Probenzahlen zunehmen, sind Biosensoren, die schnelle Analyse bieten können, gewünscht worden.
Einen Glucosesensor als Beispiel nehmend, hat Diabetes heutzutage merklich zugenommen, und zur Messung und Kontrolle des Blutzuckerspiegels im Blut benötigt es eine sehr lange Zeit, da konventionellerweise Blut zentrifugiert und Plasma für die Messung vorgesehen wird. So wird ein Sensor, der Messung mit Gesamtblut durchführen kann, benötigt. Als handlichen Typ gibt es einen Stab-ähnlichen Träger, der mit einem Träger darauf versehen ist, der ein Enzym, das fähig ist, nur mit Glucose zu reagieren, und einen Farbstoff enthält, der eine Änderung nach Enzymreaktion oder durch das Produkt der Enzymreaktion verursacht, wie ein für die Untersuchung von Urin verwendeter Teststreifen. Der Stab hat das System, daß Blut auf den Träger getropft und nach einer bestimmten Zeitdauer eine Änderung des Farbstoffs visuell oder optisch bestimmt wird. Jedoch ist die Störung aufgrund gefärbter Stoffe im Blut schwerwiegend, was in einer niedrigen Genauigkeit resultiert.
Nun wird ein Mehrfachschichttyp-Analysenträger, wie in Fig. 1 gezeigt, vorgeschlagen (offengelegte Japanische Gebrauchsmuster-Anmeldung Nr. 54-178495). Der Träger hat den Aufbau umfassend einen transparenten Träger 51, der darauf der Reihenfolge nach mit einer Reagensschicht 52, einer Verteilerschicht 53, einer wasserabweisenden Schicht 54 und einer Filterschicht 55 versehen ist. Die Messung hat das folgende System: Wenn eine Blutprobe von oben aufgetropft wird, werden feste Bestandteile im Blut, wie rote Blutkörperchen, Plättchen etc., durch die Filterschicht 55 entfernt, das Blut tritt gleichmäßig hindurch in die Verteilerschicht 53 durch ein Loch 56 in der wasserabweisenden Schicht, und eine Reaktion läuft in der Reagensschicht 52 ab. Nach Vollendung der Reaktion wird ein Licht aus der Pfeilrichtung durch den transparenten Träger 51 eingestrahlt, wodurch eine Substratkonzentration durch Colorimetrie bestimmt wird. Das System hat einen komplizierten Aufbau, verglichen mit dem konventionellen handlichen Stab-ähnlichen Träger, aber seine Genauigkeit ist verbessert, da Blutzellen entfernt werden, etc. Jedoch dauert der Durchtritt von Blut und die Reaktion eine lange Zeit, so daß die wasserabweisende Schicht 54, die Trocknen der Probe verhindert, benötigt wird. Zusätzlich ist Inkubation bei einer hohen Temperatur zur Reaktionsbeschleunigung erforderlich. So bringt das System Probleme mit sich, daß Vorrichtungen und Träger kompliziert werden.
Auf der anderen Seite ist ein Biosensor, ,wie in Fig. 2 gezeigt, als das System zur quantitativen Analyse eines spezifischen Bestandteils in einer Probe wie Blut, etc. aus dem lebenden Körper mit hoher Genauigkeit, ohne Durchführung von Arbeitsgängen wie Verdünnen, Schütteln etc. der Probenlösung, vorgeschlagen worden (zum Beispiel offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 59-166852). Der Biosensor umfaßt eine isolierende Basisplatte 63 mit einer darin eingebetteten Meßelektrode 64 und einer Gegenelektrode 65 aus Platin, etc., mit Leitungen 61 bzw. 62, und die freiliegenden Bereiche dieser Elektroden sind mit einem porösen Material 66 bedeckt, das darauf eine Oxidoreduktase und einen Elektronenakzeptor trägt. Wenn eine Probenlösung auf das poröse Material aufgetropft wird, werden die Oxidoreduktase und der Elektronenakzeptor in der Probenlösung verteilt, wodurch eine Enzymreaktion mit einem Substrat in der Probenlösung abläuft und der Elektronenakzeptor reduziert wird. Nach Reaktionsvollendung wird der reduzierte Elektronenakzeptor elektrochemisch oxydiert, und eine Substratkonzentration in der Probe wird aus einem in diesem Fall erhaltenen Stromlevel für die Oxidation bestimmt. In solch einem Aufbau benötigen die Elektroden jedoch Arbeitsvorgänge, wie Waschen etc., während das poröse Material für jede Analyse ausgewechselt werden kann, um dadurch leicht eine Messung zu ermöglichen. Wenn es auf der anderen Seite möglich ist, die Vorrichtung einschließlich des Elektrodensystems für jede Messung zu verwerfen, werden die Arbeitsvorgänge für die Messung extrem einfach, aber unter Gesichtspunkten von Elektrodenmaterialien, wie Platin etc., Aufbau und dergleichen, ist die Vorrichtung unvermeidlich sehr teuer. Für den Aufbau von Platinelektroden kann auch die Zerstäubungsmethode oder Abscheidungsmethode angewendet werden, aber Produktionskosten steigen.
Als ein das Elektrodensystem enthaltendes Einweg-System ist ein in der offengelegten Japanischen Patentanmeldung Nr. 61-294351 beschriebener Biosensor vorgeschlagen worden. Wie in Fig. 3 gezeigt, werden in diesem Biosensor die Elektrodensysteme 72 (72'), 73 (73') und 74 (74'), zusammengesetzt aus Kohlenstoff etc., auf einer isolierenden Basisplatte 71 durch Siebdruck etc. gebildet; nach Aufbringen einer isolierenden Schicht 75 darauf werden die Elektrodensysteme mit einem porösen Material 77, das darauf eine Oxidoreduktase und einen Elektronenakzeptor trägt, bedeckt, und das Ganze wird mit einem Halterahmen 76 und einer Abdeckung 78 integriert. Wenn eine Probenlösung auf das poröse Material getropft wird, werden die Oxidoreduktase und der Elektronenakzeptor in der Probenlösung gelöst, wodurch eine Enzymreaktion mit einem Substrat in der Probenlösung abläuft und der Elektronenakzeptor reduziert wird. Nach Vollendung der Reaktion wird der reduzierte Elektronenakzeptor elektrochemisch oxydiert und eine Substratkonzentration in der Probe aus einem in diesem Fall erhaltenen Stromlevel für die Oxidation bestimmt.
In dem vorangehenden konventionellen Aufbau wird die Basisoberfläche einschließlich des Elektrodensystems nicht immer gleichförmig befeuchtet, so daß Luftblasen zwischen dem porösen Material und der Basisplatte zurückbleiben, wodurch ein Ansprechstrom beeinflußt wird oder seine Reaktionsrate gelegentlich herabgesetzt wird. Wenn ferner Feuchtigkeit einer Umgebung gering ist, verdampft die Feuchtigkeit in einer Probenlösung während der Messung, so daß eine Änderung im Ansprechverhalten beobachtet wird. Wenn darüber hinaus eine Substanz, die leicht an die Elektroden adsorbiert wird, oder eine Substanz, wie Ascorbinsäure oder dergleichen, die leicht oxydiert wird, in einer Probenlösung zugegen ist, wird das Ansprechverhalten des Sensors durch eine solche Substanz beeinflußt.
Daher sind als Sensoren zur Messung eines spezifischen Bestandteils in einer lebensnotwendigen Probenlösung, wie Blut oder dergleichen, einfach und schnell mit hoher Genauigkeit, Sensoren erwünscht, die durch bloßes Aufbringen einer Spurenmenge von Probenlösung Meßdaten liefern können, ohne die Probenlösung zu verdünnen oder zuvor quantitativ zu bestimmen. Darüber hinaus sind Sensoren vom Einweg-Typ erwünscht, die frei von Arbeitsvorgängen wie Waschen, Wischen etc. sind.
Schließlich wird festgestellt, daß, außer den obigen plattenartigen Vorrichtungen, EP- A-0267724 Testvorrichtungen zum Ausführen mikrochemischer Tests, worin ein chemisch oder elektrochemisch aktives Material auf eine innere Oberfläche eines Behälters aufgebracht wird, offenbart.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Der Biosensor der vorliegenden Erfindung umfaßt eine isolierende Basisplatte, worauf das Elektrodensystem vorgesehen ist, bestehend aus mindestens einer Meßelektrode und einer Gegenelektrode und auf dem Elektrodensystem einer ein Enzym und einen Elektronenakzeptor enthaltenden Reaktionsschicht. Weiterhin wird durch Integrieren dieser Einheit mit einem Überzug bzw. einer Abdeckung ein Raum, die Reaktionsschicht einschließend, gebildet, der mit einer Einlaßöffnung zum Einführen einer Probenlösung in den Raum und einer Auslaßöffnung zum Ablassen eines Gases in dem Raum durch Einfließen der Probenlösung versehen ist. Eine durch die Reaktion zwischen dem Enzym und der Probenlösung verursachte Konzentrationsänderung einer Substanz wird durch das Elektrodensystem wahrgenommen, um dadurch eine Substratkonzentration in der Probenlösung zu bestimmen.
Darüber hinaus kann das Elektrodensystem auch aus einem Mehrfachsatz von Elektrodensystemen bestehen, und Reaktionsschichten, entsprechend dem Mehrfachsatz von Elektrodensystemen, sind vorgesehen, wodurch die unabhängigen Sensorsysteme aufgebaut werden können. Durch diese Vorgehensweise können zwei oder mehr Substratkonzentrationen gleichzeitig bestimmt werden. Darüber hinaus können auch zwei Paare von Elektrodensystemen verwendet werden, worin ein Elektrodensystem zur Messung und ein anderes Elektrodensystem als Bezug verwendet wird. Durch Bestimmen einer Differenz im Ansprechverhalten zwischen den Elektrodensystemen kann Störung durch Ascorbinsäure etc. eliminiert werden.
Weiterhin wird durch Integrieren der Basisplatte, des Elektrodensystems und der Reaktionsschicht mit dem Überzug bzw. der Abdeckung ein Raum gebildet, und die Oberfläche der den Raum aufbauenden Teile wird hydrophil gemacht, wodurch eine bestimmte Menge von Probenlösung in den oben beschriebenen Raum, durch einen einfachen Arbeitsvorgang durch bloßes in-Kontakt-Bringen einer Spurenmenge einer Probenlösung mit der Einlaßöffnung des Sensors, leicht eingebracht werden kann.
Die eingebrachte Probenlösung löst den Elektronenakzeptor, Enzym und hydrophile, hochmolekulare Substanz in der Reaktionsschicht, wo eine Enzymreaktion abläuft, unter Umwandlung der Probenlösung in eine viskose Flüssigkeit. Durch die Enzymreaktion wird ein reduzierter Elektronenakzeptor hergestellt, ansprechend auf die Substratkonzentration in der Probemlösung. Dann wird der reduzierte Elektronenakzeptor elektrochemisch auf der Meßelektrode oxydiert, um die Substratkonzentration aus einem Stromlevel für die Oxidation zu bestimmen.
In dem Biosensor der vorliegenden Erfindung wird eine hydrophile, hochmolekulare Substanz verwendet, so daß der Einfluß von festen Bestandteilen, wie roten Blutkörperchen und dergleichen, in einer Blutprobe auf die Elektroden verhindert werden kann, und gleichzeitig, durch Vorsehen des Raumes, Verflüssigung der Probenlösung auf den Elektroden wirksam verhindert werden kann. So kann ein Einfluß durch Vibration während der Messung verhindert werden.
Auf der anderen Seite besteht die Reaktionsschicht in dem Biosensor der vorliegenden Erfindung aus einer Enzymschicht und einer darauf vorgesehenen Elektronenakzeptorschicht. Weiterhin sind, durch Vorsehen einer hydrophilen hochmolekularen Substanzschicht zwischen diesen Schichten, das Enzym und der Elektronenakzeptor voneinander getrennt, um einen Biosensor mit ausgezeichneten Haltbarkeitseigenschaften zu liefern.
Erfindungsgemäß kann ein das Elektrodensystem einschließender Einweg-Biosensor so aufgebaut sein, daß eine Substratkonzentration in der Probe, zum Beispiel eine Glucosekonzentration in Blut, rasch in einem einfachen Arbeitsgang mit hoher Genauigkeit, durch bloße Zugabe einer extremen Spurenmenge von Probenlösung bestimmt werden kann, ohne Verdünnen oder quantitatives Bestimmen der Probenlösung im voraus.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine veranschaulichende Zeichnung, die ein Beispiel herkömmlicher Glucosesensoren zeigt. Fig. 2 und 3 zeigen veranschaulichend herkömmliche Enzymelektroden verwendende Glucosesensoren. Fig. 4 zeigt eine perspektivische Ansicht eines auseinandergenommenen Biosensors, der eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist. Fig. 5 zeigt eine Außenansicht des Biosensors. Fig. 6 zeigt veranschaulichend eine Querschnittsansicht des Biosensors. Fig. 7 zeigt eine Ansprechcharakteristik des Biosensors. Fig. 8 zeigt eine perspektivische Ansicht eines auseinandergenommenen Biosensors, der eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist. Fig. 9 zeigt eine Außenansicht des Biosensors. Fig. 10, 12 und 13 zeigen perspektivische Ansichten auseinandergenommener Biosensoren, die andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind. Fig. 11 zeigt eine perspektivische Ansicht eines auseinandergenommenen Biosensors, der eine andere Ausführungsform des Standes der Technik ist. Fig. 14 zeigt eine Beziehung zwischen Ascorbinsäurekonzentration und Ansprechcharakteristik. Fig. 15 zeigt eine Beziehung zwischen dem Teilchendurchmesser von Kaliumferricyanid und der Zeit, nach der die Reaktion vollständig ist.

BESTE ANWENDUNGSWEISEN DER ERFINDUNG

Beispiel 1

In den folgenden erklärenden Zeichnungen in den Beispielen wird die gleiche Numerierung für gemeinsame Elemente verwendet, und ihre Erklärung ist teilweise weggelassen.
Als eine Ausführungsform des Biosensors ist ein Glucosesensor erklärt. Fig. 4 zeigt eine perspektivische Ansicht eines auseinandergenommenen Glucosesensors, hergestellt als eine Ausführungsform des Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung. Fig. 5 zeigt eine Außenansicht des Biosensors. Fig. 6 zeigt veranschaulichend eine Querschnittsansicht des Biosensors, der erhalten wird, wenn der in Fig. 5 gezeigte Biosensor in der Mitte in Längsrichtung aufgeschnitten wird. In Fig. 4 ist eine in Fig. 6 gezeigte Reaktionsschicht 14 nicht gezeigt.
Nachfolgend wird ein Verfahren zur Herstellung des Sensors beschrieben. Silberpaste wird auf eine isolierende Basisplatte 1, zusammengesetzt aus Polyethylenterephthalat, durch Siebdruck aufgedruckt, um Leitungen 2, 3 (3') zu bilden. Als nächstes wird eine einen Harzbinder enthaltende leitende Kohlenstoffpaste aufgedruckt. Durch Trocknen durch Erhitzen wird das Elektrodensystem, bestehend aus einer Meßelektrode 4 und einer Gegenelektrode 5 (5'), gebildet. Darüber hinaus wird eine isolierende Paste aufgedruckt, um teilweise das Elektrodensystem zu bedecken, um so den freiliegenden Bereich der Elektroden festzulegen und den unnötigen Teil der Leitungen zu bedecken. Durch eine Wärmebehandlung wird eine isolierende Schicht 6 gebildet.
Als nächstes wird der freigelegte Bereich des Elektrodensystems 4, 5 (5') poliert und dann an Luft bei 100ºC für 4 Stunden wärmebehandelt. Nachdem der Elektrodenteil so aufgebaut wurde, wird eine 0,5 %ige wässrige Lösung von Carboxymethylcellulose (nachfolgend einfach als CMC bezeichnet) als die hydrophile, hochmolekulare Substanz auf die Elektroden verteilt und getrocknet, um eine CMC-Schicht zu bilden. Eine Lösung von Glucoseoxidase (GOD) als Enzym in Phosphatpufferlösung wird darauf aufgetragen und getrocknet, um eine Reaktionsschicht 14 zu bilden, die aus CMC-GOD-Schicht besteht. In diesem Fall bilden CMC und GOD eine dünne Schicht mit einer Dicke von mehreren Mikrometern in einem teilweise vermischten Zustand.
Als nächstes werden drei Teile von dieser Basisplatte 1, ein Abstandshalter 7, bestehend aus einer Harzplatte und einem Überzug bzw. einer Abdeckung 9, in einer solchen räumlichen Anordnung zwischen den betreffenden Teilen, wie durch die gestrichelten Linien wie in Fig. 4 gezeigt, zusammengefügt, um den Sensor, wie in der Außenansicht in Fig. 5 gezeigt, zu integrieren. Hier hat der Abstandshalter eine Dicke von ungefähr 300 um und hat eine Form, daß der zentrale Teil in eine U- Form weggeschnitten wird mit einer Breite von 2 mm und einer Länge von 7 mm. Das Ende des Schnitteils wird eine Einlaßöffnung 10 einer Probenlösung und der zentrale Teil bildet einen Raum 8, wenn integriert. Darüber hinaus besitzt der Überzug bzw. die Abdeckung 9 ein Loch mit einem Durchmesser von 2 mm und bildet eine Auslaßöffnung 11, wenn integriert.
Wenn die Einlaßöffnung am Ende des Glucosesensors, wie oben beschrieben aufgebaut, mit einer Glucosestandardlösung (200 mg/dl) in Kontakt gebracht wird, die eine Probenlösung ist, wird die Probenlösung durch die Einlaßöffnung 10 in das Innere eingebracht. In diesem Fall wird die Luft in dem Raum 8 rasch durch die Auslaßöffnung 11 abgelassen, und gleichzeitig wird der Raum mit der Probenlösung bis nahe an die Auslaßöffnung aufgefüllt. So verteilt sich die Probenlösung rasch auf der Elektrodenoberfläche, um den Raum auszufüllen, so daß irgendwelche zurückbleibenden Luftblasen nicht bemerkt werden.
Dies ist vermutlich so, weil die Probenlösung in eine Richtung durch Vorsehen der Einlaßöffnung und der Auslaßöffnung fließen würde, und wegen der hydrophilen, hochmolekularen, zuvor auf den Elektroden gebildeten Substanzschicht würde Benetzen auf der Elektrodenoberfläche verbessert werden, so daß das Gas glatt gegen die Flüssigkeit ausgetauscht wird.
Weiter kann die Probenlösung durch vorheriges Behandeln der Oberflächen der den Raum bildenden Teile, wie der Überzug bzw. die Abdeckung, Abstandshalter, etc., mit einem oberflächenaktiven Mittel, um sie hydrophil zu machen, glatter eingebracht werden.
Auf der anderen Seite löst die zugesetzte Probenlösung CMC darin, um die Flüssigkeit viskos zu machen. Glucose in der Probenlösung reagiert mit dem Enzym durch die Wirkung von auf die Elektroden aufgebrachter Glucoseoxidase, um Wasserstoffperoxid zu bilden. Daher wird die Meßelektrode durch Anlegen einer Spannung von 1 V zwischen den Elektroden eine Minute nach Einbringen der Probenlösung in die Anodenrichtung polarisiert. Durch Anlegen einer Spannung zur Anodenrichtung oben beschrieben, wird ein oxydierender Strom für das erzeugte Wasserstoffperoxid erhalten. Dieser Stromlevel entspricht der Konzentration von Glucose, die ein Substrat ist.
Als ein Beispiel der Ansprechcharakteristik des wie oben beschrieben aufgebauten Sensors wird die Beziehung zwischen einem Stromlevel 5 Sekunden nach Anlegen von Spannung und einer Glucosekonzentration in Fig. 7, A, gezeigt, was anzeigt, daß eine gute Ansprechcharakteristik erhalten wurde.
Weiter wurde in Bezug auf 30 Glucosesensoren mit der gleichen Spezifikation wie oben beschrieben die gleiche Probenlösung mit den Sensoren getestet. Ein Variationskoeffizient war ungefähr 5 %.
Darüber hinaus wurde der Einfluß durch Verdampfen unter Feuchtigkeitsbedingungen von 30 % und 80 %, unter Verwendung von je 10 Sensoren untersucht und mit dem in Fig. 3 gezeigten Glucosesensor, der in einer konventionellen Bauweise durch Ausprobieren hergestellt wurde, verglichen. In den erfindungsgemäßen Glucosesensoren war der Einfluß vernachlässigbar, sogar nach 5 Minuten Standzeit. Jedoch war die Verdampfung in den Sensoren mit einer konventionellen Bauweise um ungefähr 3 % höher unter der geringeren Feuchtigkeitsbedingung 2 Minuten danach.
Wie oben beschrieben, kann der Glucosesensor der vorliegenden Erfindung mit der oben beschriebenen Bauweise rasch eine Spurenmenge der Probenlösung in die Reaktionsschichtzone absorbieren und eine Glucosekonzentration einfach und rasch mit hoher Genauigkeit ohne Einfluß durch Umgebungsfeuchtigkeit, etc., bestimmen.

Beispiel 2

Das Verfahren war ziemlich das gleiche wie in Beispiel 1, bis die CMC-GOD Schicht gebildet wurde. Danach wurde weiter eine Reaktionsschicht, zusammengesetzt aus einer CMC-GOD-Elektronenakzeptorschicht, darauf nach der folgenden Methode gebildet.
Oberflächenaktives Mittel, Lecithin (Phosphatidylcholin), wurde in Toluol gelöst, um 1 gew.-%ige Lösung herzustellen und Mikrokristalle (ein mittlerer Teilchendurchmesser von weniger als 10 um) von Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptor wurden in der Lösung dispergiert. Dann wurde Toluol abgedampft, um die Reaktionsschicht, zusammengesetzt aus CMC-GOD-Elektronenakzeptorschicht, auf dem Elektrodensystem zu bilden, worauf mit einem Abstandshalter und einem Überzug bzw. einer Abdeckung wie in Beispiel 1 integriert wurde. So wurde ein Glucosesensor mit der in Fig. 5 gezeigten Bauweise erhalten.
Als nächstes wurde eine Glucosestandardlösung durch den Endteil des Sensors wie oben beschrieben eingebracht. Durch Anlegen einer Spannung von 600 mV zwischen den Elektroden nach ungefähr einer Minute, wurde durch die Enzymreaktion gebildetes Kaliumferricyanid auf der Meßelektrode oxydiert. Ein Stromlevel in diesem Fall wurde 5 Sekunden nach Anlegen der Spannung gemessen. Als Ergebnis wurde eine extrem gut lineare Beziehung zwischen der Glucosekonzentration und dem Ansprechstromlevel erhalten, wie in Fig. 7, B gezeigt. Weiter wurde, 30 Sensoren verwendend, ein Variationskoeffizient untersucht. Der Variationskoeffizient war 2.6 % mit Bezug auf die Glucosestandardlösung und 3 % mit Bezug auf die gesamte Blutprobe, die extrem gut waren. Weiter wurde mit Bezug auf Einfluß von Verdampfüng ein Test, in einer Weise ähnlich Beispiel 1, ausgeführt und ähnliche Effekte wurden erhalten, wie oben beschrieben.
In dem obigen Beispiel wurde Kaliumferricyanid, wenn die Konzentration von Lecithin größer als 0,01 Gew.-% war, wirksam in Toluol dispergiert, so daß Tropfen leicht wurde, um eine dünne Kaliumferricyanid-Lecithinschicht zu bilden. Wo kein Lecithin gegenwärtig ist, wurden Fehler, daß die Kaliumferricyanidschicht nicht gleichmäßig gebildet oder die Basisplatte beim Biegen abgelöst wurde, bemerkt. Jedoch konnte die Kaliumferricyanidschicht, die gleichmäßig war und sich nur mit Schwierigkeit ablöste, durch Einbringen von Lecithin leicht gebildet werden. Mit steigender Lecithinkonzentration löste sich die Kaliumferricyanidschicht schwieriger ab, aber eine Auflösungsrate von Kaliumferricyanid nahm auch ab. Daher wird. 0,01 bis 3 Gew.-% für eine geeignete Konzentration gehalten. Polyethylenglykolalkylphenylether (Warenzeichen: Triton X) wurde anstelle von Lecithin verwendet. Um feine Teilchen von Kaliumferricyanid in Toluol zu dispergieren, war mehr als 0, 1 % nötig, aber eine gute Kaliumferricyanidschicht konnte wie in dem Fall der Verwendung von Lecithin gebildet werden. Als das oberflächenaktive Mittel gibt es zusätzlich zu dem oben beschriebenen Beispiel Ölsäure, Polyoxyethylenglycerinfettsäureester, Cyclodextrin, etc. Oberflächenaktive Mittel sind nicht besonders beschränkt, so lange wie sie den Elektronenakzeptor in einem organischen Lösungsmittel dispergieren können und nicht die Enzymaktivität beeinflussen. Als das organische Lösungsmittel zum Vermischen des Elektronenakzeptors damit können Lösungsmittel, wie Toluol, Petrolether etc., verwendet werden, so lange sie einen minimierten Einfluß auf GOD Aktivität und die gedruckten Elektroden besitzen.
Mit Bezug auf den Teilchendurchmesser des oben verwendeten mikrokristallinen Kaliumferricyanids wurden kommerziell erhältliche Kristalle von Kaliumferricyanid zu Pulvern gemahlen, und Kristalle mit einem bestimmten Teilchendurchmesser wurden durch Sieben gesammelt, um eine Kaliumferricyanidschicht zu bilden. Die Ansprechverhalten der gleichen aus Kristallen verschiedener Teilchendurchmesser hergestellten Glucosesensoren, wie oben beschrieben, wurden miteinander verglichen. Fig. 15 zeigt eine Sieb-Maschengröße auf der Abszisse und auf der Ordinate eine Zeit zur Vollendung der Reaktion bis 400 mg/dl Glucose. Zahlen in Klammern zeigen eine Größe (um) der Maschenöffnung an. Wie in Fig. 15 gezeigt, wurden die Kristalle mit einer kleineren Teilchengröße schneller aufgelöst und die zur Reaktionsvollendung benötigte Zeit war kürzer. In dem mit durch 145er Maschen (Japanischer Industriestandard) passiertem Kaliumferricyanid (Teilchengröße von 100 um oder weniger) hergestellten Sensor war die Reaktion innerhalb von 2 Minuten vollendet. Zudem konnten, wenn die Kaliumferricyanidschicht hergestellt wurde, Kristalle mit einem kleineren Teilchendurchmesser eine gleichförmige Schicht bilden und lieferten weniger Ungleichmäßigkeiten im Ansprechverhalten. Mikrokristalle von Kaliumferricyanid konnten durch Mahlen zu Pulvern gebildet werden, aber Umkristallisieren einer wässrigen Kaliumferricyanidlösung aus Ethanol konnte leicht Kristalle mit einem Teilchendurchmesser von nicht mehr als 10 um erzeugen. Wenn die Kaliumferricyanidschicht aus solchen Kristallen gebildet wurde, wurde die Schicht dicht und die Zeit zur Reaktionsvollendung konnte verkürzt werden.
Wenn Kaliumferricyanid, fein zerteilt in Teilchendurchmesser von weniger als 100 um, mit Toluol vermischt wurde und die Mischung getropft wurde, wurde Toluol rasch verdampft, und die Kaliumferricyanidschicht konnte in einem mikrokristallinen Zustand gebildet werden, so daß eine Auflösungsrate rasch war und rasche Messung erreicht wurde. Weiter konnte durch Verwendung des organischen Lösungsmittels die Kaliumferricyanidschicht getrennt auf der CMC-GOD-Schicht gebildet werden, wodurch Haltbarkeitseigenschaften verbessert werden konnten.
Durch Vorsehen der Einlaßöffnung und der Auslaßöffnung in dem oben beschriebenen Beispiel, können, zusätzlich zu der in Fig. 4 bis 6 gezeigten Anordnung, Öffnungen in dem Überzug bzw. der Abdeckung 9 bzw. der Basisplatte 1 vorgesehen und als Einlaßöffnung 10 und Auslaßöffnung 11 verwendet werden, wie in der perspektivischen Ansicht des auseinandergenommenen Sensors in Fig. 8 und in der Außenansicht in Fig. 9 gezeigt.
Darüber hinaus kann der Abstandshalter, wie in der perspektivischen Ansicht des auseinandergenommenen Sensors in Fig. 10 gezeigt, in zwei Teile 7 und 7' geteilt werden, und die Teile können als der Abstandshalter 8, die Einlaßöffnung 10 und die Auslaßöffnung 11 verwendet werden. Darüber hinaus wurde die Form des Endteils des Biosensors, mit dem in Fig. 5 gezeigten Aufbau, wie in der in Fig. 11 gezeigten Außenansicht gerundet. So wurde ein Teil, der mit der Probenlösung in Kontakt gebracht wurde, fast auf die Einlaßöffnung 10 begrenzt, wenn die Probenlösung eingebracht wurde. So wanderte die Probenlösung nicht um die Peripherie der Einlaßöffnung, konnte aber sogar in einer kleinen Menge glatt eingebracht werden.

Beispiel 3

Der in Fig. 12 gezeigte Elektrodenteil wurde in einer Weise ähnlich Beispiel 1 aufgebaut. D.h. Silberleitungen 3, 21, 22 und 23, dazu korrespondierend Gegenelektrode 3 und drei Meßelektroden 41, 42 und 43 wurden auf einer Basisplatte gebildet, um drei Paare von Elektrodensystemen, die die Gegenelektrode gemeinsam besitzen, aufzubauen. Als nächstes wurde eine aus CMC-GOD-Elektronenakzeptorschicht zusammengesetzte Reaktionsschicht um jede der Meßelektroden in einer Weise ähnlich Beispiel 2 gebildet.
Dann wurden ein Abstandshalter und ein Überzug bzw. eine Abdeckung zusammengefügt, um sie wie in Beispiel 1 zu integrieren. Hierin wird der Abstandshalter teilweise weggeschnitten zu einer "Kamm-ähnlichen" Form, und der weggeschnittene Teil bildet einen Raum 8. Der Raum ist in die betreffenden Elektrodensysteme unterteilt, aber ist fortlaufend als ein Ganzes um einen gemeinsamen Raum zu bilden. Darüber hinaus wird das Ende die Einlaßöffnung 10.
Entsprechend dem auf diesen jeweiligen Elektrodensystemen unterteilt konstruierten Raum sind drei Öffnungen in dem Überzug bzw. der Abdeckung 9 gebildet, um Auslaßöffnungen 11, 12 und 13 zu bilden. Wenn die Einlaßöffnung 10 mit einer Probenlösung in Kontakt gebracht wird, wird die Probenlösung rasch in den Raum eingebracht, während sie die Luft in dem Raum durch die drei Auslaßöffnungen hinausdrängt.
Ein Ansprechverhalten auf die Glucosestandardlösung wurde in Bezug auf die drei Elektrodensysteme in einer Weise ähnlich Beispiel 2 gemessen, und sein Mittelwert wurde bestimmt, um es zu einem Ansprechverhaltenslevel für einen Sensor zu machen. Der Test wurde durchgeführt mit 30 Glucosesensoren mit der gleichen Spezifikation. Der Variationskoeffizient war 2 %.
In dem Sensor vom Einweg-Typ ist es für verbesserte Zuverlässigkeit wichtig, die Faktoren für Fehler, eine Differenz im Elektrodengebiet jedes Sensors einschließend, zu minimieren. Die Differenz zwischen den Sensoren ist ein Grund für das Verursachen einer Differenz im Fehler von Meßdaten der gleichen Probenlösung. Jedoch kann, wie oben beschrieben, Messung mit höherer Genauigkeit durch Vorsehen einer Vielzahl von Elektrodensystemen für den gleichen Sensor und Erhalten eines Mittelwerts der Ansprechverhaltenslevel rasch erreicht werden.
Fig. 12 zeigt die Ausführungsform mit 3 Paaren von Elektroden, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt und kann weiter eine große Anzahl von Elektrodensystemen vorsehen. Darüber hinaus ist die Gestalt des Raumes nicht auf die in den Figuren gezeigte beschränkt, desgleichen die Gestalt oder Anordnung der Elektrodensysteme.

Beispiel 4

Fig. 13 zeigt eine Variation des Aufbaus mit einer Vielzahl der Elektrodensysteme. In einer schon beschriebenen Weise, ähnlich Beispiel 1, wurden auf der Basisplatte Silberleitungen 21, 22 und 3 und zwei Paare der ihnen entsprechenden Elektrodensysteme, bestehend aus Meßelektroden 41 und 42 und einer gemeinsamen Gegenelektrode 5, aufgebaut. Als nächstes werden, wie in Beispiel 2, nachdem eine Reaktionsschicht zusammengesetzt aus CMC-GOD-Kaliumferricyanidschicht auf jedem der Elektrodensysteme gebildet wurde, ein Abstandshalter 7 und ein Überzug bzw. eine Abdeckung 9 daran angefügt. Hierin hat der Abstandshalter zwei Öffnungen, die unabhängig Räume 81 und 82 bilden, und Auslaßöffnungen 11 und 12 entsprechend den Öffnungen und die gemeinsam verwendete Einlaßöffnung 10 werden in dem Überzug bzw. der Abdeckung vorgesehen.
Mit Bezug auf den Glucosesensor mit dem oben beschriebenen Aufbau, wie in Fig. 3 gezeigt, wurde ein Durchschnitt von den Ansprechverhaltenswerten von zwei Paaren von den Elektrodensystemen zur Glucosestandardlösung genommen und zu einem Meßwert für einen Sensor gemacht. Wenn 30 Sensoren mit der gleichen Spezifikation getestet wurden, war der Variationskoeffizient 2,2 %.
So kann in dem in Fig. 13 gezeigten Sensor Messung mit höherer Genauigkeit ausgeführt werden. Zusätzlich können, da der Sensor die unabhängigen Räume besitzt, verschiedene Probenlösungen mit einem Sensor gemessen werden, oder der Sensor kann für Messung unter verschiedenen Bedingungen in Zeit, Temperatur, etc. vorgesehen werden.
In dem oben beschriebenen Beispiel war eine Öffnung in dem Überzug bzw. der Abdeckung vorgesehen, um sie zu einer gemeinsamen Einlaßöffnung zu machen, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Ausführungsform beschränkt. Es ist wichtig, das Meßsystem eine Vielzahl von Paaren der Elektrodensysteme und eine Vielzahl von unabhängigen Räumen umfassend aufzubauen. Daher können auch zwei Öffnungen vorgesehen werden, und Einlaßöffnungen zu den betreffenden Räumen können aufgebaut werden.

Beispiel 5

Unter Verwendung des Elektrodenteils, Abstandshalters und Überzugs bzw. der Abdeckung mit in Fig. 13 gezeigten Konstruktionen wurde ein unten beschriebener Glucosesensor konstruiert. Zuerst wurde eine aus CMC-GOD zusammengesetzte Reaktionsschicht auf einer Meßelektrode 41 in einer Weise ähnlich Beispiel 1 gebildet. Auf der anderen Seite wurde CMC-Schicht alleine auf einer Meßelektrode 42 gebildet.
Mit Bezug auf den Glucosesensor mit zwei Paaren der Elektrodensysteme, erhalten, wie oben beschrieben, wurde eine Ascorbinsäure in verschiedenen Konzentrationen enthaltende Glucosestandardlösung (200 mg/dl) auf die Einlaßöffnung 10 getropft und auf jedes der Elektrodensysteme aufgebracht. Als nächstes wurde wie in Beispiel 1 eine Spannung von 1 V ungefähr 1 Minute nach Auftropfen angelegt, und ein Stromlevel wurde 5 Sekunden danach gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 14 gezeigt. Der Ausstoß des Elektrodensystems der CMC-GOD-Schicht ist durch A und der Ausstoß (Bezugsausstoß) des Elektrodensystems der CMC-Schicht alleine ist durch B gezeigt. Wie aus der Zeichnung ersichtlich ist, steigt der Ausstoß von A, wenn die Konzentration von Ascorbinsäure steigt, und andererseits wird ein ähnlicher Anstieg bemerkt mit dem Ausstoß von B. Dies zeigt an, daß die Empfindlichkeiten der betreffenden Elektrodensysteme gegenüber Ascorbinsäure beinahe gleich zueinander sind. Wenn eine Differenz im Ausstoß zwischen beiden Elektrodensystemen (A - B) davon erfaßt wird, kann ein auf Glucose basierender Stromlevel erhalten werden. So kann durch Verwendung von zwei Paaren der Elektrodensysteme ein Fehler aufgrund elektrodensensitiver Substanzen stark reduziert werden. Solch ein Effekt wurde auch mit Harnsäure etc., zusätzlich zu Ascorbinsäure, bemerkt.
So kann durch Konstruieren des Sensors durch Vorsehen von zwei Paaren der Elektrodensysteme und Bilden einer hydrophilen, hochmolekularen Substanz-Enzymschicht auf einem Elektrodensystem und einer hydrophilen, hochmolekularen Substanzschicht alleine auf einem anderen Elektrodensystem eine Substratkonzentration in der störende Substanzen enthaltenden Probenlösung mit guter Genauigkeit gemessen werden.
In dem Obigen kann, nachdem CMC-GOD-Schicht auf beiden Elektrodensystemen gebildet wurde, lokales Erwärmen durch Laser oder Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen, etc. auch auf nur ein Elektrodensystem angewendet werden, wodurch GOD inaktiviert wird, um das Elektrodensystem für Bezugsausstoß vorzubereiten. So sind die Konstruktionen in den beiden Elektrodensystemen identisch außer für Enzymaktivität, so daß Ausstoßströme aufgrund Störfaktoren in den beiden Elektrodensystemen viel besser miteinander übereinstimmen können, was in einer verbesserten Erkennungsgenauigkeit mit dem Sensor resultiert.
In der vorangehenden Ausführungsform ist das Elektrodensystem, worin der Elektrodenteil zwei Elektroden der Meßelektrode und die Gegenelektrode umfaßt, beschrieben worden. Durch Konstruktion des Elektrodensystems durch drei darüber hinaus Silber/Silberchlorid enthaltende Elektroden kann die Genauigkeit weiter verbessert werden. Eine Ausführungsform zur Konstruktion des Elektrodensystems umfaßt das Drucken von 3 Silberleitungen auf eine Basisplatte, dann Drucken einer Kohlenstoffpaste auf lediglich die Endteile von zwei Leitungen, um einen Isolierschicht-Überzug aufzubringen, Behandeln der Oberfläche des Endteils der verbleibenden Leitung, in der Silber freiliegt, um Silberchlorid in eine Silber/Silberchloridelektrode zu überführen. So könnte das Elektrodensystem in einer solchen Weise aufgebaut werden.

Beispiel 6

In Beispiel 5 wurden eine aus CMC-GOD-Kaliumferricyanidschicht zusammengesetzte Reaktionsschicht und eine aus CMC-Kaliumferricyanid zusammengesetzte Schicht auf der Meßelektrode 41 beziehungsweise der Meßelektrode 42 in einer Weise ähnlich Beispiel 2 gebildet. Messung wurde in einer Weise ähnlich Beispiel 5 durchgeführt, außer daß die angelegte Spannung 0,6 V war. Einfluß von Ascorbinsäure konnte wie oben beschrieben ausgeschlossen werden.

Beispiel 7

In Beispiel 5 wurde eine aus CMC-GOD-Kaliumferricyanidschicht zusammengesetzte Reaktionsschicht auf der Meßelektrode 41 in einer Weise ähnlich Beispiel 2 gebildet. Weiter wurde auf der Meßelektrode 42 die CMC-Schicht gebildet, und eine aus Glucoseoxidase, Mutarotase und B-Glucosidase zusammengesetzte Enzymschicht wurde dann darauf gebildet, und weiter wurde eine aus Kaliumferricyanid zusammengesetzte Elektronenakzeptorschicht gebildet, um eine Reaktionsschicht zu erzeugen. Messung wurde durch Anlegen einer Spannung von 0,6 V und Verwendung einer wässrigen, Glucose und Saccharose enthaltenden Lösung als Probenlösung durchgeführt. Mit der Meßelektrode 41 wurde ein Strom in Reaktion auf die Glucosekonzentration erhalten, und ein Strom in Reaktion auf die Gesamtkonzentration von Glucose und Saccharose wurde mit der Meßelektrode 42 erhalten. Aus einer Differenz zwischen diesen Stromleveln konnte die Saccharosekonzentration bestimmt werden. So können zwei Substratkonzentrationen gemessen werden.

Beispiel 8

Nachdem der Elektrodenteil in einer Weise ähnlich Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde eine 0,5 %ige wässrige Lösung von Carboxymethylcellulose (hiernach einfach als CMC bezeichnet) als hydrophile, hochmolekulare Substanz auf die Elektroden aufgetragen und getrocknet, um eine CMC-Schicht zu bilden. Als nächstes wurde eine Lösung von Glucoseoxidase in Wasser darauf aufgetragen und getrocknet, um eine CMC-GOD-Schicht zu bilden. In diesem Fall bildeten CMC und GOD eine dünne Schicht mit einer Dicke von mehreren Mikrometern in einem teilweise vermischten Zustand. Darüber hinaus wurde eine 0,5 %ige ethanolische Lösung von Polyvinylpyrrolidon (hiernach einfach als PVP bezeichnet) aufgetragen, um die erste aus dieser CMC-GOD-Schicht zusammengesetzte Schicht völlig zu überziehen, und getrocknet, um eine zweite, aus PVP-Schicht zusammengesetzte Schicht zu bilden. Eine Mischung von mikrokristallinem Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptor und 1 %iger Lösung eines oberflächenaktiven Mittels, Lecithin, in Toluol, wurde getropft und auf die PVP-Schicht aufgetragen und getrocknet, um eine dritte, aus Kaliumferricyanid Lecithinschicht zusammengesetzte Schicht zu bilden, gefolgt von Integrieren mit einem Abstandshalter und einem Überzug bzw. einer Abdeckung wie in Beispiel 1.
Durch Verwenden von Toluol, in dem PVP geringfügig löslich ist, als ein Lösungsmittel in dem Fall des Bildens der Kaliumferricyanid-Lecithinschicht ist es möglich, die Kaliumferricyanid-Lecithinlösung gleichmäßig auf die PVP-Schicht aufzutragen. Als Ergebnis kann die gleichmäßige Kaliumferricyanid-Lecithinschicht erhalten werden.
So konnten die Verwendung eines Lösungsmittels, in dem die die zweite Schicht aufbauende hydrophile, hochmolekulare Substanz als das Lösungsmittel zum Auftragen des Elektronenakzeptors und das oberflächenaktive Mittel die extrem gleichmäßige Elektronenakzeptorschicht bilden (dritte Schicht).
Eine Glucosestandardlösung wurde in den wie oben konstruierten Glucosesensor durch die Einlaßöffnung eingebracht. Durch Anlegen einer Spannung von +0,6 V an die Meßelektrode in der Anodenrichtung eine Minute danach wurde ein Ansprechstrom 5 Sekunden danach gemessen. Eine gut lineare Beziehung wurde bis zu der Konzentration von mehr als 900 mg/dl erhalten. Es wurden auf den oben beschriebenen Glucosesensor 5 ul einer Blutprobe getropft und es wurde eine Minute danach ein Ansprechstrom gemessen. Es wurde ein Ansprechverhalten mit sehr guter Reproduzierbarkeit erhalten.
Mit Bezug auf zwei Sensoren, z. B. den durch das oben beschriebene Verfahren hergestellten Glucosesensor und den gleichen Glucosesensor, ausgenommen, daß die zweite aus hydrophiler, hochmolekularer Substanz zusammengesetzte Schicht nicht vorgesehen war, wurde ein Haltbarkeitstest bei 35ºC für 30 Tage in einem getrockneten Zustand durchgeführt. Unter Verwendung einer Glucosestandardlösung (90 mg/dl) als Probenlösung, wurde das Sensor-Ansprechverhalten nach 30 Tagen verglichen. Der Sensor, in dem die zweite aus der hydrophilen, hochmolekularen Substanz zusammengesetzte Schicht nicht gebildet war, zeigte einen CV-Wert von 5,3, aber der Sensor, in dem die zweite Schicht aus PVP zusammengesetzt war, zeigte einen extrem guten CV-Wert von 2,5.

Beispiel 9

Die CMC-GOD-Schicht und die PVP-Schicht wurden in einer Weise ähnlich Beispiel 8 hergestellt. Eine Mischung von mikrokristallinem Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptor und 0,5 %iger Lösung eines oberflächenaktiven Mittels, Lecithin, in Ethanol wurde getropft und auf die PVP-Schicht aufgetragen und getrocknet, um eine Kaliumferricyanid-Lecithinschicht zu bilden. Durch Verwendung von Ethanol, in dem PVP leicht löslich ist, als Lösungsmittel in dem Fall des Bildens der Kaliumferricyanid- Lecithinschicht ist es möglich, an einem Punkt auf der PVP-Schicht konzentrierend zu entwickeln. So war es möglich, sich auf die Meßelektrode des Sensors zu konzentrieren, um die gleichmäßige Kaliumferricyanid-Lecithinschicht zu konstruieren, so daß der Sensor, in dem ein stabiles Ansprechverhalten nur durch Auftragen der minimal benötigten Menge erhalten wurde, hergestellt werden konnte.
Ansprechcharakteristika auf die Glucosestandardlösung des wie oben konstruierten Glucosesensors wurden in einer Weise ähnlich Beispiel 8 bestimmt. Eine gut lineare Beziehung wurde bis zu einer Konzentration von mehr als 900 mg/dl erhalten. Zusätzlich wurde eine Reaktion mit sehr guter Reproduzierbarkeit auch in dem Fall der Verwendung von Blut als Probenlösung erhalten. Darüber hinaus wurde, mit Bezug auf den Glucosesensor, in dem die zweite aus hydrophiler, hochmolekularer Substanz zusammengesetzte Schicht vorgesehen war, und den gleichen Glucosesensor, ausgenommen, daß die zweite aus hydrophiler, hochmolekularer Substanz zusammengesetzte Schicht nicht vorgesehen war, ein Haltbarkeitstest bei 35ºC für 30 Tage in einem getrockneten Zustand in einer Weise ähnlich Beispiel 8 durchgeführt. Der Sensor, in dem die zweite Schicht aus PVP zusammengesetzt war, zeigte extrem guten CV-Wert in der 30 Tage danach gemessenen Reaktion.
In der Konstruktion nach dem Stand der Technik war die GOD-CMC-Schicht schon in Kontakt mit der Kaliumferricyanid-Lecithinschicht zu der Zeit, als der Sensor hergestellt wurde, so daß es schwierig war, die Haltbarkeitseffizienz zu verbessern. Die hydrophile, hochmolekulare, aus PVP zusammengesetzte Substanzschicht, die im oben beschriebenen Beispiel 8 und gegenwärtigen Beispiel 9 verwendet wurde, spielt eine Rolle, um die GOD- CMC-Schicht vollständig von der Kaliumferricyanid-Lecithinschicht in einem getrockneten Zustand zu trennen.
Zusätzlich ist die hydrophile, hochmolekulare Substanzschicht extrem wirksam, um eine stabile Sensorreaktion sicherzustellen, auch in dem Fall, daß Substanzen in einer Probenlösung gegenwärtig sind, die leicht an die Elektrode oder elektrodenaktive Substanzen adsorbiert werden. Sogar in dem Fall, daß eine Glucosekonzentration durch den oben beschriebenen Glucosesensor unter Verwendung von Blut als Probenlösung bestimmt wurde, wurde eine stabile Sensorreaktion, unabhängig von Viskosität oder dergleichen der Probenlösung, erhalten.
In den oben beschriebenen Beispielen 1 bis 9 ist eine Ausführungsform der bevorzugten räumlichen Anordnung zwischen der Einlaßöffnung und der Auslaßöffnung, verbunden mit dem Raum, veranschaulichend in den Zeichnungen gezeigt. Die Auslaßöffnung kann auch als die Einlaßöffnung und die Einlaßöffnung als die Auslaßöffnung verwendet werden. Darüber hinaus sind die in den betreffenden Zeichnungen gezeigten Abstandshalter und Überzüge bzw. Abdeckungen aus unabhängigen Materialien zusammengesetzt, aber nicht darauf beschränkt. In Massenproduktion ist es vorteilhaft, ein integriertes Überzug- bzw. Abdeckteil mit einer Überzug- bzw. Abdeckform durch Formen oder dergleichen zu bilden.
Weiter wurde eine Probenlösung durch hydrophil-Machen der Oberfläche von den den Raum aufbauenden Materialien glatter durch die Einlaßöffnung eingebracht. Die Wirkung wurde entweder durch Verwendung von hydrophilen Materialien oder durch vorheriges Behandeln der den Raum aufbauenden Oberflächenmaterialien mit einem oberflächenaktiven Mittel, um sie hydrophil zu machen, erhalten.
Auf der anderen Seite kann ein Zwischenraum zwischen der Basisplatte und dem Überzug bzw. der Abdeckung durch Variieren der Dicke von Abstandshalter oder der Größe eines dementsprechenden Teils gesteuert werden. Wenn jedoch der Zwischenraum zu groß ist, wird eine für das Auffüllen des Raumes benötigte Menge der Probenlösung groß, und es ist auch unvorteilhaft, die Probenlösung durch ein Kapillarphänomen einzubringen. Wenn der Zwischenraum zu klein ist, wächst ein Widerstand zwischen den Elektroden an oder eine Stromverteilung ist verzerrt. Nach dem Vorhergehenden liegt der Zwischenraum vorzugsweise in einem Bereich von 0,05 bis 1,0 mm, besser 0,1 bis 0,5 mm.
In den Beispielen wurde CMC als die hydrophile, hochmolekulare Substanz verwendet. Wie schon festgestellt wurde, liegt ihre Rolle darin, den Einfluß von adsorbierbaren, in einer Probenlösung enthaltenen, an die Elektrode adsorbierten Substanzen auf die Reaktion zu verhindern, zusätzlich zu der glatten Einbringung der Probenlösung. Darüber hinaus liegt ihre Rolle auch in der Trennung der Enzymschicht von der Elektronenakzeptorschicht durch die hydrophile, hochmolekulare Substanzschicht, um dadurch die Haltbarkeitseigenschaft weiter zu verbessern. Als die hydrophile, hochmolekulare Substanz kann Gelatine, Methylcellulose und dergleichen verwendet werden, zusätzlich zu CMC, und hydrophile, hochmolekulare Substanzen von Stärke, Carboxymethylcellulose, Gelatine, Acrylat, Vinylalkohol, Vinylpyrrolidon und Maleinsäureanhydrid sind bevorzugt. Diese Wasser-absorbierenden oder wasserlöslichen hydrophilen, hochmolekularen Substanzen werden in einer geeigneten Konzentration gelöst und die anfallende Lösung wird als Überzug aufgetragen und getrocknet, um eine hydrophile, hochmolekulare Substanzschicht mit einer notwendigen Schichtdicke zu bilden.
In den vorangehenden Beispielen ist das Elektrodensystem, in dem der Elektrodenteil aus zwei Elektroden aus einer Meßelektrode und einer Gegenelektrode aufgebaut ist, dargelegt worden. Jedoch kann durch Konstruieren des Elektrodensystems mit drei Elektroden, weiter eine Bezugselektrode einschließend, die Genauigkeit weiter verbessert werden. Als Materialien für die Elektrode ist in den Beispielen veranschaulichter Kohlenstoff als ein stabiles und nicht teures Material geeignet, aber die Materialien sind nicht darauf beschränkt. Andere Edelmetall-Materialien und oxydierte Materialien können auch verwendet werden.
Weiterhin können als Elektronenakzeptor, obwohl das in den Beispielen verwendete Kaliumferricyanid exzellent in Stabilität und Reaktionsrate ist, auch Redoxverbindungen, wie Chinonverbindungen oder Ferrocenverbindungen etc., verwendet werden, zusätzlich zu Kaliumferricyanid.
Darüber hinaus ist die Oxidoreduktase nicht auf die in den vorangehenden Beispielen gezeigte Glucoseoxidase beschränkt, sondern verschiedene Enzyme, wie Alkoholoxidase, Cholesteroloxidase etc., können verwendet werden.

GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT

Der Biosensor der vorliegenden Erfindung kann rasch eine spezifische Komponente in verschiedenen Probenlösungen in einer genauen und einfachen Weise bestimmen. Daher ist sein Verwendbarkeitswert bei klinischen Untersuchungen extrem hoch.

Claims

1. Biosensor zum Bestimmen einer Substratkonzentration in einer Probenlösung, umfassend eine Basisplatte (1) umfassend ein von einer Reaktionsschicht (14) überzogenes Elektrodensystem (4,5;5',41,42,43), worauf das Elektrodensystem (4,5;5',41,42,43) und die Reaktionsschicht (14) einen Raum (8;81,82) gebildet haben, der durch einen Abstandshalter (7,7') und einen Überzug (9) definiert wird, wobei der Raum (8;81,82) mit einer Einlaßöffnung (10) zum Einführen der Probenlösung in den Raum und mit einer Auslaßöffnung (11,12,13) zum Ablassen des Gases in den Raum (8;81,82) durch Einfließenlassen der Probenlösung versehen ist, das Elektrodensystem (4,5;5',41,42,43) mit mindestens einer Elektrode zur Messung (4,41,42,43) und einer Gegenelektrode (5,5') ausgestattet ist, wobei sich mindestens ein Enzym auf der Reaktionsschicht (14) befindet, wobei eine Änderung in der Konzentration einer Substanz in der Reaktion zwischen dem Enzym und der Probenlösung mit dem Elektrodensystem (4,5;5',41,42,43) zur Bestimmung einer Substratkonzentration in der Probenlösung erfaßt wird.

2. Biosensor nach Anspruch 1, worin das Elektrodensystem (5,41,42,43) einen Mehrfachsatz von Elektrodensystemen umfaßt und dem Mehrfachsatz von Elektrodensystemen entsprechende Reaktionsschichten (14) und ein gemeinsamer Raum (8) vorgesehen sind.

3. Biosensor nach Anspruch 1, worin das Elektrodensystem (5;5',41,42) einen Mehrfachsatz von Elektrodensystemen umfaßt und dem Mehrfachsatz von Elektrodensystemen entsprechende Reaktionsschichten (14) und Räume (81,82) vorgesehen sind.

4. Biosensor nach Anspruch 1, worin ein Elektrodensystem (4,5;5',41,42,43), umfassend mindestens eine Elektrode zur Messung (4;41,42,43) und eine Gegenelektrode (5,5'), auf einer isolierenden Basisplatte (1) gebildet ist, eine Reaktionsschicht (14) auf der Oberfläche des Elektrodensystems (4,5,5';41,42,43) gebildet ist und die Reaktionsschicht (14) eine Enzymschicht, zusammengesetzt aus einer Oxidoreduktase und einer hydrophilen hochmolekularen Substanz, die darauf eine Elektronenakzeptorschicht gebildet hat, umfaßt.

5. Biosensor nach Anspruch 1, worin ein Elektrodensystem (4,5,5',41,42,43), umfassend mindestens eine Elektrode zur Messung (4;41,42,43) und eine Gegenelektrode (5,5'), auf einer isolierenden Basisplatte (1) gebildet ist, eine Reaktionsschicht (14) auf der Oberfläche des Elektrodensystems (4,5,5';41,42,43) gebildet ist und die Reaktionsschicht (14) eine Enzymschicht, zusammengesetzt aus einer Oxidoreduktase und einer hydrophilen hochmolekularen Substanz, die darauf eine ein oberflächenaktives Mittel enthaltende Elektronenakzeptorschicht gebildet hat, umfaßt.

6. Biosensor nach Anspruch 4 oder 5, worin die Elektronenakzeptorschicht feine Teilchen eines Elektronenakzeptors mit einer Teilchengröße von nicht größer als 100 um umfaßt.

7. Biosensor nach Anspruch 4 oder 5, worin die hydrophile hochmolekulare Substanz irgendein Vertreter, ausgewählt aus hydrophilen hochmolekularen Substanzen von Stärke, Carboxymethylzellulose, Gelatine, Acrylat, Vinylalkohol, Vinylpyrrolidon und Maleinanhydrid oder einer Mischung davon, ist.

8. Biosensor nach Anspruch 1, worin die Oberfläche eines den Raum aufbauenden Materials hydrophil ist.

9. Biosensor nach Anspruch 2 oder 3, worin das Elektrodensystem (5,41,42) zwei Sätze von Elektrodensystemen, umfassend mindestens eine Elektrode zur Messung (41,42) und eine Gegenelektrode (5,5'), hauptsächlich zusammengesetzt aus Kohlenstoff, eine Reaktionsschicht (14), zusammengesetzt aus einer hydrophilen hochmolekularen Substanz und einer Oxidoreduktase, auf einem Elektrodensystem (5,5',41) vorgesehen, und eine hydrophile hochmolekulare Substanzschicht oder eine Schicht, zusammengesetzt aus einer hydrophilen hochmolekularen Substanz und einer inaktivierten Oxidoreduktase, auf einem anderen Elektrodensystem (5,5',42) vorgesehen, umfaßt.

10. Biosensor nach Anspruch 2 oder 3, worin das Elektrodensystem (5,5',41,42) zwei Sätze von Elektrodensystemen, umfassend mindestens eine Elektrode zur Messung (41,42) und eine Gegenelektrode (5,5'), hauptsächlich zusammengesetzt aus Kohlenstoff, eine Reaktionsschicht, zusammengesetzt aus einer hydrophilen hochmolekularen Substanz, einer Oxidoreduktase und einem Elektronenakzeptor, auf einem Elektrodensystem (5,5',41) vorgesehen, und eine Schicht, zusammengesetzt aus einer hydrophilen hochmolekularen Substanz und einem Elektronenakzeptor, auf einem anderen Elektrodensystem (5,5',42) vorgesehen, umfaßt.

11. Biosensor nach Anspruch 9 oder 10, worin das Elektrodensystem (5,5';4;41,42,43) eine Elektrode zur Messung (4;41,42,43) und eine Gegenelektrode (5,5'),hauptsächlich zusammengesetzt aus Kohlenstoff, und eine Bezugselektrode (74), umfassend Silber/Silberchlorid, umfaßt.

12. Biosensor nach Anspruch 1, worin das Elektrodensystem (4,5,5';41,42,43) aus einem Material, hauptsächlich zusammengesetzt aus Kohlenstoff, gebildet auf einer isolierenden Basisplatte (1) durch Siebdruck, hergestellt ist.

13. Biosensor nach Anspruch 1, worin ein Elektrodensystem (4,5,5';41,42,43), umfassend mindestens eine Elektrode zur Messung (4;41,42,43) und eine Gegenelektrode (5,5'), auf einer isolierenden Basisplatte (1) gebildet ist, eine Reaktionsschicht (14) auf dem Elektrodensystem gebildet ist und die Reaktionsschicht eine erste Schicht, zusammengesetzt aus einer hydrophilen hochmolekularen Substanz und einer Oxidoreduktase, eine zweite Schicht, zusammengesetzt aus einer hydrophilen hochmolekularen Substanz, und eine dritte, einen Elektronenakzeptor enthaltende Schicht umfaßt.

14. Biosensor nach Anspruch 13, worin die hydrophile hochmolekulare Substanz in der ersten Schicht und der zweiten Schicht ausgewählt ist aus hydrophilen hochmolekularen Substanzen von Stärke, Carboxymethylzellulose, Gelatine, Acrylat, Vinylalkohol, Vinylpyrrolidon und Maleinanhydrid oder einer Mischung davon.

15. Biosensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, worin der Abstandshalter und der Überzug integral ausgebildet sind.

16. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors, umfassend das Bilden eines Elektrodensystems, umfassend mindestens eine Elektrode zur Messung und eine Gegenelektrode, auf einer isolierenden Basisplatte, Überziehen des Elektrodensystems mit einer wässrigen Lösung einer hydrophilen hochmolekularen Substanz und einer wässrigen Lösung einer Oxidoreduktase und dann Trocknen zur Bildung einer Enzymschicht, Verteilen einer Mischung eines Elektronenakzeptors und eines organischen Lösungsmittels auf der Enzymschicht, Entfernen des organischen Lösungsmittels zur Bildung einer Elektronenakzeptorschicht, und dann Integrieren dieser Einheit mit einem Überzug zur Bildung eines Raums zur Aufnahme einer Probe und um eine Einlaßöffnung und eine Auslaßöffnung zu haben.

17. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors nach Anspruch 16, worin vor der Bildung der Elektronenakzeptorschicht eine Lösung einer hydrophilen hochmolekularen Substanz in einem organischen Lösungsmittel auf der Enzymschicht verteilt wird, um eine Schicht einer hydrophilen hochmolekularen Substanz zu bilden.

18. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors nach Anspruch 16 oder 17, worin eine Mischung des Elektronenakzeptors, des oberflächenaktiven Mittels und des organischen Lösungsmittels auf der Enzymschicht verteilt wird und das organische Lösungsmittel entfernt wird, um eine Elektronenakzeptorschicht zu bilden.

19. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors nach Anspruch 18, worin die Elektronenakzeptorschicht feine Teilchen eines Elektronenakzeptors mit einer Teilchengröße von nicht mehr als 100 um umfaßt.