DE69534041T2

DE69534041T2 - Verfahren zur herstellung von beta lactam antibiotika durch mikroorganismen mit erhoehter ligaseaktivitaet

Info

Publication number: DE69534041T2
Application number: DE69534041T
Authority: DE
Inventors: Svend Kaasgaard; Nyegaard Claus KRISTIANSEN; Henrik Molgaard
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1994-09-28
Filing date: 1995-09-27
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2015-09-28
Also published as: CN1271208C; AU701665B2; KR970706393A; US6180360B1; AU3744095A; WO1996010085A1; CN1162337A; CA2201485A1; DE69534041D1; HUT77042A; EP0783582A1; US5942411A; JPH10506287A; ATE290084T1; EP0783582B1; ES2236714T3; MX9702270A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Biosynthese von β-Lactam-Antibiotika. Insbesondere betrifft die Erfindung in vivo- und in vitro-Verfahren zur Herstellung von β-Lactam-Antibiotika.
Ferner kommt ein neuartiges Enzym in Betracht, das in vorteilhafter Weise bei der Biosynthese von β-Lactam-Antibiotika verwendet werden kann. Ferner betrifft die Erfindung ein DNA-Konstrukt, das für dieses neuartige Enzym kodiert, einen rekombinanten Vektor (oder Transformationsvehikel), der das DNA-Konstrukt umfasst, und schließlich eine Zelle, die das DNA-Konstrukt oder den rekombinanten Vektor umfasst.
Hintergrund der Erfindung
Biosyntheseweg für Penicillin
Die erste Stufe bei der Biosynthese von Penicillin beinhaltet die Bildung des Tripeptids δ-(L-α-Aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valin (ACV) aus L-α-Aminoadipinsäure, L-Cystein und L-Valin (Fawcett et al., Biochem. J., Bd. 157 (1976), S. 651–660). Die Umsetzung wird durch das multifunktionelle Enzym δ-(L-α-Aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valin-synthetase (ACV-Synthetase) mit ATP und Mg²⁺ als Cofaktoren katalysiert (Banko et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 109 (1987), S. 2858–2860).
ACV-Synthetase (ACVS) wurde aus Aspergillus nidulans (Van Liempt et al., J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989), S. 3680–3684), Cephalosporium acremonium (Baldwin et al., J. Antibiot., Bd. 43 (1990), S. 1055–1057) und Streptomyces clavuligerus gereinigt (Jensen et al., J. Bacteriol., Bd. 172 (1990), S. 7269–7271, und Zhang et al., Biotechnol. Lett., Bd. 12 (1990), S. 649–654). Die Reinigung von ACV-Synthetase aus Penicillium chrysogenum wurde nicht veröffentlicht. Jedoch wurde ACV-Synthetase aus P. chrysogenum von Diez et al. kloniert (J. Biol. Chem., Bd. 265 (1990), S. 16358–16365).
Das lineare Tripeptid ACV wird in Gegenwart von Isopenicillin N-synthase (auch als Cyclase oder Isopenicillin-N-synthetase (IPNS) bezeichnet), Eisen(II)ionen, Sauerstoff und einem Elektronendonator (z. B. Ascorbat) in Isopenicillin N (IPN) umgewandelt. Isopenicillin N-synthase wurde erstmals von Ramos et al. aus P. chrysogenum isoliert (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Bd. 27 (1985), S. 380–387) und das Isopenicillin-N-synthase-Strukturgen aus P. chrysogenum wurde von Carr et al. kloniert (Gene, Bd. 48 (1986), S. 257–266).
Diese ersten beiden Stufen bei der Biosynthese von Penicillinen stellen gemeinsame Stufen von Penicillin und Cephalosporin erzeugenden Pilzen und Bakterien dar.
Bei einigen Pilzen, z. B. bei P. chrysogenum und A. nidulans, kann die α-Aminoadipyl-Seitenkette von Isopenicillin N durch andere Seitenketten, die intrazellulären Ursprungs sind oder exogen bereitgestellt werden, ersetzt werden. Der Austausch wird durch eine Acyltransferase (als Acyl-coenzym A:Isopenicillin N-Acyltransferase oder Acyl-coenzym A:6-Aminopenicillansäure-Acyltransferase bezeichnet) katalysiert. Es ist noch unklar, ob diese Umwandlung in vivo über eine zweistufige Reaktion abläuft, bei der zunächst die L-α-Aminoadipyl-Seitenkette unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure (6-APA) entfernt wird, wonach sich die Acylierungsstufe anschließt, oder ob es sich bei der Umwandlung um einen direkten Austausch der Seitenketten handelt. Gereinigte Acyltransferase aus P. chrysogenum weist sowohl eine Isopenicillin N-Amidohydrolase-Aktivität als auch eine Acyl-coenzym A:6-Aminopenicillansäure-Acyltransferase-Aktivität auf (Alvarez et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Bd. 31 (1987), S. 1675–1682).
Die Gene, die für ACV-Synthetase (pcbAB), Isopenicillin N-synthase (pcbC) und Acyl-coenzym A:6-Aminopenicillansäure-Acyltransferase (penDE) kodieren, finden sich im gleichen Cluster in P. chrysogenum und A. nidulans (Diez et al., J. Biol. Chem., Bd. 265 (1990), S. 16358–16365, und Smith et al., Bio/Technology, Bd. 8 (1990), S. 39–41).
Eine Amplifikation des pcbC-penDE-Genclusters von P. chrysogenum Wis 54-1255, der für Isopenicillin N-synthase (IPNS) bzw. Acyltransferase (AT) kodiert, führte zu einer starken Verbesserung von 40% der Produktausbeuten (Veenstra et al., J. Biotechnol., Bd. 17 (1991), S. 81–90). Über erhöhte Antibiotika-Ausbeuten wurde auch bei A. nidulans-Transformanten mit einem Gehalt an Mehrfachkopien von pcbAB (kodierend für ACV-Synthetase (ACVS)) und pcbC-Genen (kodierend für Isopenicillin N-synthetase (INPS)) berichtet (McCabe et al., J. Biotechnol., Bd. 17 (1991), S. 91–97).
EP-200425 (Eli Lilly) beschreibt Vektoren, die für Isopenicillin N-synthetase (IPNS) kodieren. Die Vektoren ermöglichen eine hochgradige Expression von IPNS in C. acremonium und E. coli. Gemäß der Beschreibung eignen sich Cephalosporium-Vektoren für die Verbesserung des Stammes im Hinblick auf eine Erhöhung des Wirkungsgrads und der Ausbeute von Fermentationen zur Herstellung von Penicillin- und Cephalosporin-Antibiotika. Die Vektoren können ferner modifiziert werden, so dass man Vektoren zur Erhöhung der Produktionsausbeuten und des Wirkungsgrads von P. chrysogenum, Streptomyces clavuligerus und dergl. bei Fermentationen erhält.
EP-357119 (Gist Brocades) beschreibt die Cluster-Antibiotika-Biosynthese-Gene, die für IPNS, AT und ACVS kodieren und die in vorteilhafter Weise zur Verbesserung der Herstellung des Antibiotikums in Mikroorganismen und für die Isolierung anderer Gene, die bei der Biosynthese des Antibiotikums beteiligt sind, verwendet werden. Die Erfindung wird beispielhaft durch die verbesserte Erzeugung von Penicillin in P. chrysogenum belegt, wobei die Isolierung eines oder mehrerer weiterer Cluster-Biosynthesegene und die Expression von Cluster-Penicillin-Biosynthesegenen in Acremonium chrysogenum erfolgen.
Aktivierung der Seitenkette
Um die α-Aminoadipinsäure-Seitenkette in der durch Acyltransferase katalysierten Reaktion zu ersetzen, muss die Carbonsäuregruppe der neuen Seitenkette aktiviert werden. Diese Aktivierung stellt einen der am wenigsten aufgeklärten Teile der Biosynthese von Penicillinen dar. Es wurden zwei Theorien vorgelegt.
Die am stärksten akzeptierte Theorie besteht darin, dass das Enzym die Veresterung von Carbonsäuren zu Coenzym A-thioestern durch einen zweistufigen Mechanismus katalysiert, der über die Pyrophosphorolyse von ATP (Adenosintriphosphat) in Gegenwart von Mg²⁺ abläuft. Zunächst bilden die Carbonsäure (die neue Seitenkette), ATP und das Enzym einen Komplex, was zur Bildung eines Acyl-AMP-Enzymkomplexes führt. Anschließend reagiert dieser Komplex mit Coenzym A unter Freisetzung von Acylcoenzym A und AMP (Adenosinmonophosphat).
Die andere Theorie beruht auf der Bildung eines Acyl-S-glutathion-Zwischenprodukts, das in den entsprechenden Acylcoenzym A-ester umgewandelt werden kann (Ferrero et al., J. Antibiot., Bd. 43 (1990), S. 684–691).
Eine Phenacyl:Coenzym A-Ligase aus P. chrysogenum, die zur Katalyse der Synthese von Phenoxyacetyl-coenzym A und Phenylacetyl-coenzym A in Gegenwart von ATP, Mg²⁺, Coenzym A und Phenoxyessigsäure oder Phenylessigsäure befähigt ist, wurde von Brunner, Röhr und Zinner (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., Bd. 349 (1968), S. 95–103), Brunner und Röhr (Methods Enzymol, Bd. 43 (1975), S. 476–481; Kogekar und Deshpande, Ind. J. Biochem. Biophys., Bd. 19 (1982), S. 257–261, und Kurzatkowski, Med. Dosw. Mikrobiol., Bd. 33 (1981), S. 15–29, beschrieben. Gemäß Brunner et al. zeigt die Ligase einen ähnlichen Aktivitätsgrad gegenüber Phenylessigsäure, Phenoxyessigsäure und Essigsäure. Jedoch wurde das Enzym nie bis zu einer homogenen Beschaffenheit gereinigt.
Martinez-Blanco et al. (J. Biol. Chem., Bd. 267 (1992), S. 5474–5481) beschreiben eine Acetyl-coenzym A-synthetase aus P. chrysogenum Wis 54-1255, die nicht nur Essigsäure, sondern auch Phenylessigsäure als Substrat bei der Synthese der entsprechenden Acyl-coenzym A-ester akzeptiert, genauso wie die von Brunner et al. beschriebene Ligase. Jedoch wird von Martinez-Blanco et al. die Aktivität gegenüber Phenoxyessigsäure nicht beschrieben. Gemäß Martinez-Blanco et al. handelt es sich bei der Acetyl-coenzym A-synthetase um ein Homodimeres (α₂) mit einem Molekulargewicht von 139 000 Dalton, bestimmt durch Gelfiltration, und von 70 000 Dalton, bestimmt durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese), und einem isoelektrischen Punkt zwischen pH-wert 5,6 und 6,0.
Das für die Acetyl-coenzym A-synthetase von Martinez-Blanco et al. kodierende Gen wurde von Martinez-Blanco et al. (Gene, Bd. 130 (1993), S. 265–270) charakterisiert. Das Gen, das als acuA bezeichnet wurde, enthält fünf Introns und kodiert für ein Polypeptid mit 669 Aminosäuren. Dieses Polypeptid weist ein Molekulargewicht von 74 287 auf.
Gouka et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., Bd. 38 (1993), S. 514–519) und Van Hartingsveldt et al. (WO 92/07079) beschreiben die Isolierung und Sequenz eines Acetyl-coenzym A-synthetase (facA)-Gens aus P. chrysogenum, das für ein Protein mit 669 Aminosäuren, entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 74 000 Dalton (unter Ansetzung eines durchschnittlichen Molekulargewichts von 110 g/Mol für jede Aminosäure), kodiert. Die Gensequenzen für das facA-Gen von Gouka et al. und acuA von Martinez-Blanco et al. zeigten keine Unterschiede.
Eine ausführliche Charakterisierung der Phenylacyl-coenzym A-Ligasen, die von Brunner et al. und von Kogekar und Deshpande beschrieben wurden, wurde nicht veröffentlicht.
In ihrer aktivierten Form kann die neue Seitenkette, die die α-Aminoadipinsäure-Seitenkette in der durch Acyltransferase katalysierten Reaktion ersetzen soll, in Form eines Coenzym A-thioesters oder eines anderen Thioesters vorliegen, da andere Thioester (z. B. Acyl-S-cysteinyl-glyzin und Acyl-N-glutathion) als Substrate für die Acyltransferase beschrieben wurden. Als weitere Möglichkeit kann das Dipeptid (Cysteinyl-glycin) durch CoASH in einer nicht-enzymatischen Reaktion substituiert werden, bevor es in die Acyltransferase-Reaktion eintritt (Ferrero et al., J. Biol. Chem., Bd. 265 (1990), S. 7084–7090).
Nach der Bildung kann die Thionylgruppe der Thioester rasch einem Austausch mit anderen Thiolen (z. B. Mercaptoethanol, 1,4-Dithiotheit, ACV und Coenzym A) in einer nicht-enzymatischen Umsetzung unterliegen.
Allgemeine Ausführungen über Ligasen
Ligasen, die zur Enzym-Unterklasse 6.2.1., Säure-Thiol-Ligasen (Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc., 1992) gehören und auch als Acyl-coenzym A-synthetasen oder Acylcoenzym A-thiokinasen bezeichnet werden, katalysieren die Bildung von Acyl-coenzym A-thioester aus einer Carbonsäure und Coenzym A in Gegenwart von ATP und Mg²⁺.
Mehrere Ligasen oder Acyl-coenzym A-synthetasen aus verschiedenen Quellen wurden identifiziert, z. B. Acetyl-coenzym A-synthetase, Propionyl-coenzym A-synthetase (Groot, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 441 (1976), S. 260–267); Butyryl-coenzym A-synthetase (Wanders et al., J. Biol. Chem., Bd. 240 (1965), S. 29–33); Fettsäureacyl-coenzym A-synthetasen (Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge, langer Kettenlänge und sehr langer Kettenlänge) (Waku, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 1124 (1992), S. 101–111, Übersichtsartikel); Benzoyl-coenzym A-ligase aus Pseudomonas sp (Auburger, Appl. Microbiol. Biotechnol., Bd. 37 (1992), S. 789–795) und Phenylacetyl-coenzym A-ligasen (Martinez-Blanco et al., J. Biol. Chem., Bd. 265 (1990), S. 7084–7090; und Vitovski, FEMS Microbiol. Letters, Bd. 108 (1993), S. 1–6). Die meisten dieser Enzyme weisen breite Substratspezifitäten auf.
Die Acyl-coenzym A-synthetasen (Ligasen) sind im allgemeinen Schlüsselenzyme im primären Stoffwechsel von Fettsäuren und Essigsäure und in den Anfangsstufen beim Abbau von aromatischen Säuren, wobei sie über die Bildung der energiereichen Thioesterbindung die Acylgruppe der Carbonsäure aktivieren.
In vivo-Erzeugung von β-Lactamen
Zahlreiche der so genannten natürlichen β-Lactame (z. B. Penicillin-DF, Isopenicillin N, 6-APA, Cephalosporin C und dergl.) sind instabil, aus der Fermentationsbrühe schwierig zu reinigen, weisen nur eine begrenzte antibiotische Wirkung auf und/oder werden in geringen Ausbeuten erzeugt.
Durch Ersatz der Seitenketten der natürlichen β-Lactame beispielsweise mit Phenoxyessigsäure oder Phenylessigsäure gelangt man zur Bildung von Penicillinen (Penicillin V bzw. Penicillin G), die stabiler sind, leichter isoliert werden können und eine höhere antibiotische Aktivität aufweisen.
Bei den einzigen, direkt fermentierten Penicillinen von gewerblichem Interesse handelt es sich um Penicillin V und Penicillin G, die durch Zugabe von Phenoxyessigsäure bzw. Phenylessigsäure zum Fermentationstank erzeugt werden. Die Zugabe von alternativen Vorstufen, z. B. 2-Thiophenessigsäure oder 3-Thiophenessigsäure, während der Fermentation von P. chrysogenum führt zu anderen Penicillinen. Einige zugesetzte Vorstufen, z. B. 1-Phenyl-n-alkane oder 1-Phenoxy-n-alkane können teilweise innerhalb der P. chrysogenum-Zellen metabolisiert werden, bevor sie als Substrat für die Acyltransferase bei der Erzeugung von Penicillinen eingesetzt werden (Szarka, Advances in Biotechnology, Bd. 3 (1980), S. 167–173; Szarka et al., US-4 250 258; und Szarka et al., US-4 208 481). Bei der Biosynthese der sog. natürlichen Penicilline, z. B. Penicillin DF, Penicillin K, Penicillin F und Penicillin H leiten sich die Seitenketten Hexansäure, Octansäure, 3-Hexensäure bzw. Heptansäure vermutlich vom primären Stoffwechsel ab.
In einigen Fällen wirkt die Phenoxyacetyl- oder Phenylacetyl-Seitenkette ferner als Schutzgruppe während der Fermentation und der Gewinnung des β-Lactams, da das isolierte Penicillin V oder G durch organisch-chemische oder enzymatische Vorgänge unter Bildung von 6-APA hydrolysiert wird, was wiederum den Grundbaustein für neue, halbsynthetische Penicilline darstellt, die im Vergleich zu natürlichen Penicillinen sowie zu Penicillin V oder G verbesserte pharmakologische Eigenschaften aufweisen.
Gleichermaßen sind bei der Herstellung von Cephalosporinen die natürlichen Cephalosporine von begrenztem pharmazeutischem Wert, da ihre Isolierung zu schwierig ist und sie nur eine geringe antibiotische Wirkung besitzen. Ferner ist es schwierig, sie in neue Cephalosporine von höherem pharmazeutischem Wert umzuwandeln.
Es müssen eine Reihe von Stufen durchgeführt werden, um das fermentierte Cephalosporin in das gewünschte Antibiotikum umzuwandeln. Beispielsweise stellt bei der Herstellung der oralen Cephalosporine Cephalexin und Cefadroxil Penicillin V oder G das Ausgangsprodukt dar, das durch eine Reihe von chemischen Reaktionen in Cephalosporin umgewandelt wird, wobei die Phenoxyacetyl- oder Phenylacetyl-Seitenkette als Schutzgruppe erhalten bleibt. Nach der Ringerweiterung entsteht V-DCA bzw. G-DCA (V/G-Desacetoxycephalosporansäure), wonach die Seitenkette durch Hydrolyse in einem ähnlichen Verfahren wie bei der Hydrolyse von Penicillin V oder G entfernt wird. Schließlich wird eine neue Seitenkette (z. B. D-Phenylglycin oder D-p-Hydroxyphenylglycin) durch ein organisch-chemisches Verfahren addiert.
Bei der Herstellung von Cephalosporinen aus Cephalosporin C kann die D-α-Aminoadipinsäure entweder durch chemische Hydrolyse oder durch ein zweistufiges, organisch-chemisches, enzymatisches Verfahren entfernt werden. Die erhaltene 7-ACA (7-Aminocephalosporansäure) wird sodann unter Bildung des angestrebten Produkts acyliert.
Sowohl die Reaktionen, die zur Bildung von V-DCA und G-DCA führen, als auch die Hydrolyse von Cephalosporin C zu 7-ACA werden im großtechnischen Maßstab durchgeführt, sind aber schwierig zu steuern und teuer und ergeben im allgemeinen nur geringe Ausbeuten.
Um dieses Problem zu umgehen, wurden mehrere Alternativen vorgeschlagen, von denen die eine die Umwandlung von P. chrysogenum mit der Epimerase und Expandase z. B. aus Streptomyces umfasst (vergl. C. Cantwell et al., Bd. 248 (1992), S. 283–289). Die Autoren haben gezeigt, dass das transformierte P. chrysogenum zur Bildung von Desacetoxycephalosporansäure befähigt war. Jedoch wurde kein V-DCA gefunden. Cantwell vertrat die Auffassung, dass die Expandase durch gentechnische Bearbeitung modifiziert werden kann, um ihre Substratspezifität so zu verändern, dass sie Penicillin V oder G als Substrat akzeptiert. Im Anschluss daran ließe sich V/G-DCA direkt durch Fermentation bilden.
S. Gutierrez et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 225 (1991), S. 56–64, transformierten C. acremonium mit der Acyltransferase aus P. chrysogenum und konnten die Bildung von Penicillin G durch das tranformierte C. acremonium nachweisen, jedoch wurde die Anwesenheit von G-DCA nicht bewiesen.
EP-532341 (Merck & Co., Inc.) beschreibt die Fermentation von Adipoyl-7-ADCA (Adipoyl-7- aminodesacetoxycephalosporansäure) in P. chrysogenum, das mit der Expandase aus Streptomyces clavuligerus transformiert ist. Die Adipoyl-7-ADCA kann sodann aus der Fermentationsbrühe extrahiert und durch eine Adipoyl-acylase, z. B. aus Pseudomonas, hydrolysiert werden.
ES-2 016 476 beschreibt die biochemische in vitro-Herstellung von Phenylacetyl-coenzym A und Benzylpenicillin (Penicillin G). Phenylacetyl-coenzym A wird hergestellt, indem man Phenylacetyl-coenzym A-ligase aus Pseudomonas putida 10 bis 180 Minuten bei 10–45°C und einem pH-Wert von 5–10 mit ATP, Phenylessigsäure und MgCl₂ inkubiert. Benzylpenicillin wird hergestellt, indem man die Phenylacetyl-coenzym A-ligase und die Acyl-coenzym A:6-Aminopenicillansäure-Acyl-transferase aus Penicillium chrysogenum 30–180 Minuten bei 10–40°C und einem pH-Wert von 5,5–9 mit 6-Aminopenicillansäure und Phenylessigsäure, ATP, Coenzym A und MgCl₂ inkubiert.
ES-2 033 590 beschreibt die in vitro-Herstellung von verschiedenen Penicillinen, die sich von Benzylpenicillin (Penicillin G) ableiten. Die Herstellung umfasst die Inkubation eines Enzymsystems, das Phenylacetyl-coenzym A-ligase aus Pseudomonas putida und Acyl-coenzym Aaminopenicillansäure-acyltransferase aus Penicillium chrysogenum umfasst, und von Substraten, wie 6-Aminopenicillansäure, ATP, Coenzym A, MgCl₂, Dithiotreit (DTT) und Vorläufern der Penicilline.
Im Stand der Technik wurden Verfahren zur Herstellung bestimmter Penicilline und Cephalosporine beschrieben, die in vitro-Stufen umfassen. Die meisten dieser Verfahren sind schwierig zu steuern, aufwändig und/oder teuer.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, einige der vorstehend beschriebenen Schwierigkeiten zu überwinden. Dies wird vorgenommen, indem man verbesserte Verfahren zur Herstellung von β-Lactam-Antibiotika bereitstellt, wobei die Verfahren in Gegenwart einer erhöhten Ligase-Aktivität, verglichen mit der Ligase-Aktivität, die bei Fermentation mit dem originalen Mikroorganismus allein unter den originalen Fermentationsbedingungen vorhanden ist, stattfinden.
Die Erfindung betrifft ferner ein neues Enzym mit Ligase-Aktivität, das eine hohe Substratspezifität gegenüber wichtigen β-Lactam-Vorläufern, wie Phenoxyessigsäure, Phenylessigsäure und Adipinsäure, und eine geringe Spezifität gegenüber Essigsäure aufweist.
Erfindungsgemäß kann das Enzym von den filamentösen Pilzen Penicillium chrysogenum, A. nidulans oder Cephalosporium acremonium abgeleitet werden.
Das neue Enzym kann in Verbindung mit der Biosynthese verschiedener β-Lactam-Antibiotika verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur in vitro-Herstellung von β-Lactam-Antibiotika.
In Betracht kommt ferner ein DNA-Konstrukt, das für das neue Enzym mit Ligase-Aktivität kodiert.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Bereitstellung eines rekombinanten Vektors (oder Transformationsvehikels), der dieses DNA-Konstrukt umfasst.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Zelle, die das DNA-Konstrukt oder den rekombinanten Vektor umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Konzentrationen an ACV und Isopenicillin N als Funktion der Fermentationsdauer.
2 zeigt das pH-Optimum für die Ligase-Aktivität.
3 zeigt das Temperaturoptimum für die Ligase-Aktivität.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Da die Wirtschaftlichkeit der Herstellung einen wichtigen Faktor bei der Erzeugung von β-Lactamen darstellt, besteht ein Bedürfnis nach verbesserten Verfahren, die zu einer erhöhten Fermentationsausbeute führen, sowie nach Verfahren, die leichter zu steuern und weniger aufwändig und infolgedessen billiger sind.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, derartige verbesserte Verfahren zur Herstellung von β-Lactam-Antibiotika bereitzustellen.
Es wurde nunmehr überraschenderweise festgestellt, dass derartige verbesserte Verfahren bereitgestellt werden können, wenn die Herstellung von β-Lactam-Antibiotika von Interesse in Gegenwart einer erhöhten Ligase-Aktivität stattfindet.
Erfindungsgemäß umfasst ein derartiges verbessertes Verfahren zur Herstellung eines β-Lactam-Antibiotikums folgende Stufen:

i) Züchten eines Mikroorganismus, der das genannte β-Lactam-Antibiotikum bilden kann und
ii) Gewinnen des genannten β-Lactam-Antibiotikums in im wesentlichen reiner Form, wobei die Züchtung (Fermentation) in Gegenwart einer erhöhten Ligase-Aktivität stattfindet, verglichen mit der Ligase-Aktivität, die vorliegt, wenn die Fermentation mit dem originalen Mikroorganismus allein unter den originalen Fermentationsbedingungen durchgeführt wird.

Eine erhöhte Ligase-Aktivität ist als eine verstärkte Umwandlung der in Frage stehenden Carbonsäure zum entsprechenden Acyl-coenzym A-ester definiert, verglichen mit dem unmodifizierten Original-Mikroorganismus und/oder den originalen Fermentationsbedingungen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung fehlt dem originalen Mikroorganismus, der zur Bildung von β-Lactamen befähigt ist, die Ligase-Aktivität oder er weist nur eine geringe derartige Aktivität auf.
Die verstärkte Expression der Ligase-Aktivität kann auf eine beliebige geeignete Art und Weise erreicht werden.
Als ein Beispiel lässt sich gemäß einer Ausführungsform der Erfindung die Ligase-Aktivität durch eine Modulation der physikalischen Bedingungen des Fermentationsvorgangs, z. B. der Temperatur und des pH-Werts, erhöhen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, den Mikroorganismus Verbindungen oder Mitteln auszusetzen, die zu einer erhöhten Expression von Ligase führen. Die Natur dieser Verbindung oder dieses Mittels hängt beispielsweise von dem Promotor ab, der für die Initiation der Expression der Ligase verwendet wird. Ferner kann durch Störung der zellulären Steuermechanismen, die die Ligase-Expression steuern, eine erhöhte Expression der Ligase-Aktivität erreicht werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die Ligase-Aktivität oder erhöhte Ligase-Aktivität durch Modifikation des Mikroorganismus erreicht.
Dies kann nach bekannten Verfahren erfolgen, indem man beispielsweise mindestens eine Kopie des DNA-Konstrukts oder eines rekombinanten Vektors, die ein Gen, das für ein Enzym mit Ligase-Aktivität kodiert, umfassen, in den originalen, zu fermentierenden Mikroorganismus einführt.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Ligase-Aktivität oder erhöhte Ligase-Aktivität durch zufällige oder ortsspezifische Mutagenese des Mikroorganismus erreicht.
Ferner lässt sich die Modifikation, die zu einer erhöhten Ligase-Aktivität führt, durch Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Additionen des Ligase-Enzyms gemäß den nachstehenden Ausführungen erreichen.
Alternativ kann die Ligase-Aktivität oder erhöhte Ligase-Aktivität erzielt werden, indem man ein Enzym mit Ligase-Aktivität während der Herstellung des β-Lactam-Antibiotikums zusetzt.
In einer alternativen Ausführungsform leitet sich das DNA-Konstrukt von einer Spezies ab, die von dem Mikroorganismus, in den das Konstrukt einzuführen ist, abweicht.
Die Einführung des DNA-Konstrukts oder des Transformationsvehikels kann gemäß den nachstehenden Ausführungen nach bekannten Verfahren erfolgen.
In bestimmten Fällen ist es erstrebenswert, die gesamte Biosynthese eines β-Lactams, einschließlich der Expression des Enzyms mit Ligase-Aktivität, auf einen anderen Mikroorganismus, der selbst nicht zur Bildung des β-Lactams befähigt ist, zu übertragen. Dies kann der Fall sein, wenn der Empfänger-Mikroorganismus (Wirt) beispielsweise 1) leichter transformiert wird, 2) zur Expression der biosynthetischen Enzyme in hohen Konzentrationen befähigt ist, 3) bessere Wachstumseigenschaften aufweist oder 4) weniger Verunreinigungen, die die Gewinnung stören können, erzeugt. Somit lässt sich eine höhere Gesamtausbeute des β-Lactams erzielen.
Alternativ können neue biosynthetische Wege in einem Organismus erstrebenswert sein.
Erfindungsgemäß stammen der vorerwähnte Empfänger- oder Wirtsmikroorganismus aus der Gruppe, die Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus, Nocardia, Streptomyces, Bacillus, Cerospora, Microspora, andere Eubacteria, andere Actinomycetes oder filamentöse Pilze umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform gehört der Mikroorganismus zu einer Spezies aus der Gruppe, die Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Cephalosporium acremonium, Aspergillus nidulans, Nocardia lactamdurans und Streptomyces clavuligerus umfasst.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die Expression der Ligase-Aktivität mit der Expression von anderen Genen, die zum β-Lactam-Biosyntheseweg gehören, synchronisiert. Bei diesen Genen kann es sich beispielsweise um die pcbAB-, pcbC- und/oder penDE-Gene handeln.
Das vorerwähnte β-Lactam-Antibiotikum stammt aus der Gruppe, die die Penicilline, Cephalosporine, Cephamycine, Monobactame und Nocardicine umfasst.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Antibiotikum um ein Cephalosporin oder ein Penicillin, wie Penicillin V, Penicillin G, V-DCA, G-DCA, 7-(L-α-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-cephalosporansäure (Isocephalosporin C), Adipoyl-7-ADCA oder Adipoyl-7-ACA.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung findet die Züchtung des Mikroorganismus unter Bedingungen statt, die die Expression der DNA-Sequenz induzieren, was zur Bildung des aktivierten Seitenketten-Coenzym A-thioesters führt, der wiederum in Gegenwart von Acyltransferase (AT) zur Bildung eines β-Lactams mit einem Gehalt an der Seitenkette führt.
Die Züchtung des modifizierten Mikroorganismus findet vorzugsweise unter Bedingungen statt, die die Expression des DNA-Konstrukts oder rekombinanten Vektors induzieren, was zu einer erhöhten Bildung des Coenzyms A-thioesters der Säure, die der Seitenkette im erwünschten β-Lactam-Antibiotikum entspricht, führt, was wiederum einen erhöhten Fluss durch die Stufe der Biosynthese des β-Lactams, bei der die β-Lactam-Seitenkette in den β-Lactam-Kern eingeführt wird, ermöglicht.
Ferner kann die Züchtung des Mikroorganismus unter Bedingungen, die in Abhängigkeit vom Promotor die Expression der Ligase induzieren, stattfinden.
Im speziellen Fall der Erzeugung von Penicillin V oder Penicillin G führt eine Erhöhung der Aktivität der Ligase beispielsweise durch gentechnische Bearbeitung zu einem erhöhten Stoffwechselfluß durch die letzte Stufe der Biosynthese.
Nachstehend werden die Vorteile der erfindungsgemäßen verbesserten Verfahren aufgeführt:
Erstens kann ein erfindungsgemäßes Verfahren eine deutlich erhöhte Anreicherungsausbeute des β-Lactam-Antibiotikums von Interesse ergeben.
Zweitens wird aufgrund der Bildung von weniger Abfallprodukt(en) die Gewinnung und Reinigung der β-Lactam-Antibiotika in im wesentlichen reiner Form erleichtert.
Drittens ermöglicht die Erfindung die Erzeugung der β-Lactam-Antibiotika von Interesse ohne Bildung einer erheblichen Menge an Abfallprodukten. Dadurch werden die Verfahren effizienter und zwar aufgrund der Tatsache, dass mehr Energie für die Synthese der Produkte von Interesse zur Verfügung steht. Ferner können Abfallprodukte in nachteiliger Weise den Biosyntheseweg stören.
Viertens ist die Ausbeute des β-Lactam-Antibiotikums von Interesse, zu jedem Zeitpunkt des Fermentationsverfahrens im Vergleich zu Fermentationsverfahren, bei denen Mikroorganismen mit fehlender oder geringer Aktivität der Ligase verwendet werden, deutlich erhöht. In diesem Zusammenhang kann es sich bei der Ausbeute um die Gesamtausbeute oder um die Ausbeute innerhalb einer bestimmten Zeitspanne handeln.
Alle vorerwähnten Vorteile bewirken, dass die Verfahren zur Herstellung gewerblich wichtiger β-Lactam-Antibiotika kostengünstiger erfolgen.
Bei der Herstellung von Penicillin V und Penicillin G, wo während der Fermentation eine Anreicherung von ACV und Isopenicillin N beobachtet wird, führt eine erfindungsgemäße Erhöhung der Ligase-Aktivität zu einer Abnahme der Anreicherung dieser Zwischenprodukt-Metaboliten, sofern die Umwandlung von Isopenicillin N zu Penicillin V einen "Flaschenhals" darstellt.
Die Expression der Ligase-Aktivität oder eben die Erhöhung der Ligaseaktivität in Mikroorganismen mit gar keiner oder nur geringer Ligase-Aktivität, die erfindungsgemäß erfolgt, kann zu einer nicht-enzymatischen Entfernung von Seitenketten von β-Lactam-Antibiotika-Zwischenprodukten führen, die bei der Erzeugung beispielsweise von Penicillinen und Cephalosporinen überflüssig sind.
Ferner kann die Gewinnung und anschließende enzymatische Hydrolyse der fermentierten β-Lactame erleichtert werden, wenn die Seitenketten der so genannten natürlichen β-Lactame durch hydrophobe Seitenketten, wie Phenoxyessigsäure oder Phenylessigsäure, ersetzt werden, die leicht durch eine enzymatische Hydrolyse unter Verwendung von Penicillin V-acylasen oder Penicillin G-acylasen (die in der β-Lactam-Industrie bei der Herstellung von 6-APA bekannt sind) entfernt werden können.
Dies eröffnet somit die Möglichkeit zur in vivo-Herstellung bestimmter, gewerblich wichtiger β-Lactam-Antibiotika-Zwischenprodukte, wie V-DCA und G-DCA.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass es möglich ist, bestimmte β-Lactam-Antibiotika unter Anwendung von vollständig enzymatisch katalysierten Verfahren herzustellen, so dass keinerlei chemische Verfahren eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden V-DCA oder G-DCA in vivo vollständig durch enzymatische Maßnahmen erzeugt, indem man den Wirtsmikroorganismus erfindungsgemäß dazu induziert, eine erhöhte Ligase-Aktivität zu exprimieren. Ferner ist eine Acyltransferase (AT) vorhanden (z. B. die Acyl-coenzym A:Isopenicillin N-Acyltransferase aus P. chrysogenum) sowie Enzyme, die zur Umwandlung von Penicillinen in Cephalosporine befähigt sind (z. B. Expandase aus S. clavuligerus). Die Erfindung betrifft ferner ein neues Enzym, das erfindungsgemäß eingesetzt werden kann.
Kürzlich wurde ein geeignetes neuartiges Enzym, das Ligase-Aktivität aufweist, erhalten und charakterisiert.
Dieses neue erfindungsgemäße Enzym ist eine Acyl-coenzym A-synthetase (Ligase) und führt bei der Herstellung von β-Lactam-Antibiotika zu einem erhöhten Fluss in Richtung des Produkts von Interesse.
Eine charakteristische Eigenschaft des erfindungsgemäßen Enzyms besteht darin, dass es eine hohe Spezifität in Bezug auf bestimmte wichtige gewerbliche β-Lactam-Antibiotika-Vorstufen aufweist.
Da die erfindungsgemäße Ligase keine offensichtliche Aktivität in Bezug auf Essigsäure aufweist, ist es nicht wahrscheinlich, dass eine erhöhte Expression der Ligase-Aktivität die intrazelluläre Verfügbarkeit des Acetyl-coenzym A, eines der Schlüsselmetaboliten im primären Metabolismus, stört. Somit ist die Gefahr einer Beeinträchtigung des primären Stoffwechsels verringert, verglichen mit Manipulationen (z. B. gentechnisch oder chemisch), die zu einer erhöhten Expression von Ligase führen, die eine Aktivität gegenüber Essigsäure und Phenylessigsäure und/oder Phenoxyessigsäure und/oder Adipinsäure aufweisen.
Speziell ist das erfindungsgemäße neue Enzym mindestens 10- bis 100-fach, vorzugsweise 10³-fach und insbesondere bis zu 10⁴- und 10⁵-fach gegenüber Phenoxyessigsäure aktiver als gegenüber Essigsäure.
Ferner weist das erfindungsgemäße Enzym eine Substratspezifität auf, die mindestens 10- bis 100-fach, vorzugsweise 10³-fach und insbesondere bis zu 10⁴- oder 10⁵-fach gegenüber Phenylessigsäure aktiver ist als gegenüber Essigsäure.
Wie vorstehend erwähnt, handelt es sich beim erfindungsgemäßen Enzym um eine Acyl-coenzym A-synthetase, insbesondere um eine Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase. Nachstehend wird das Enzym als "Ligase" bezeichnet.
Das scheinbare Molekulargewicht einer katalytisch aktiven Form der Ligase liegt im Bereich von 40 000 bis 60 000 Dalton und beträgt insbesondere etwa 50 000, bestimmt durch Gelfiltration.
Die Ligase weist ein scheinbares Aktivitätsoptimum im pH-Bereich von 7,0 bis 9,0 und insbesondere im pH-Bereich von 8,0 bis 8,5 auf. In vitro weist das Enzym bei einem pH-Wert von 7 oder darunter nur eine geringe Aktivität auf, was vermutlich auf die geringe Stabilität der Ligase bei einem pH-Wert unter 7,5 zurückzuführen ist.
Das Temperaturoptimum für Ligase-Aktivität beträgt 35 bis 45°C, wobei die höchste Aktivität bei etwa 40°C auftritt.
Der isoelektrische Punkt (pI) der Ligase scheint über dem pH-Wert 7,25 zu liegen, wahrscheinlicher über pH-Wert 9 und unter etwa pH-Wert 12.
Das Enzym kann aus Zellextrakten von P. chrysogenum durch Fällung mit Ammoniumsulfat und durch Elution aus mit verschiedenen Gelen gepackten Säulen (z. B. Phenylsepharose, Cibacron-Blau und Sephacryl^R S-200) gereinigt werden. Ein Beispiel für eine Reinigung der Ligase wird nachstehend angegeben. Jedoch können auch andere bekannte Verfahren, die zur Reinigung von Proteinen herangezogen werden können, eingesetzt werden, z. B. andere Säulenmaterialien, wie Reaktiv Red, Sepharose^R Q FF und Sepharose S FF.
Erfindungsgemäß wurde gezeigt, dass die Ligase dazu befähigt ist, die Bildung von Phenoxyacetyl-coenzym A, Phenylacetyl-coenzym A, Adipoyl-coenzym A und Hexanoyl-coenzym A aus Mg²⁺, ATP, CoASH und Phenoxyessigsäure, Phenylessigsäure, Adipinsäure bzw. Hexansäure zu katalysieren. Bei Tests in den gleichen Systemen (beispielsweise in den folgenden Beispielen beschrieben) zeigt die Ligase keine signifikante Aktivität gegenüber Essigsäure.
Das Enzym ist in vitro instabil, jedoch wird durch Zugabe von ATP, Mg²⁺ und Mercaptoethanol, Dithiothreit (DTT), Ascorbinsäure oder von anderen Reduktionsmitteln die Aktivität während der Reinigung und Lagerung erheblich stabilisiert. Das Vorliegen einer hohen Konzentration von Ammoniumsulfat oder Glycerin stabilisiert das Enzym ebenfalls.
Auf der Grundlage des Verbrauchs von CoASH beim Test beträgt die Aktivität gegenüber Phenylessigsäure etwa 80% der Aktivität gegenüber Phenoxyessigsäure, und zwar unter den im nachstehenden Beispiel 6 beschriebenen Testbedingungen.
Nur beim Testen in Abwesenheit von anderen Thiolen (z. B. Mercaptoethanol, Dithiothreit (DTT)) wurde eine direkte Phenoxyacetyl-coenzym A-Syntheseaktivität beobachtet. Jedoch führt die Inkubation von Ligase mit ATP, Mg²⁺, CoASH, Phenoxyessigsäure und beispielsweise Mercaptoethanol zur Bildung einer Verbindung, die das gleiche UV-Spektrum wie der Thioester von Phenoxyessigsäure und Mercaptoethanol, Phenoxyacetyl-S-CH₂-CH₃ aufweist, der ebenfalls als Substrat für die Acyltransferase (AT) dienen kann.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Enzym immunoreaktiv mit einem Antikörper, der gegen eine gereinigte erfindungsgemäße Ligase, die sich von Penicillium chrysogenum-Stamm B10 ableitet, erzeugt worden ist.
Die immunochemischen Eigenschaften des Enzyms lassen sich immunologisch durch Kreuzreaktions-Identitätstests bestimmen. Die Identitätstests können durch das bekannte Ouchterlony-Doppelimmunodiffusionsverfahren oder durch Tandem-Kreuzimmunoelektrophorese gemäß N. H. Axelsen, Handbook of Immunoprecipitations-in-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications, Kapitel 5 und 14 (1983), durchführen. Die Ausdrücke "antigene Identität" und "partielle antigene Identität" sind im gleichen Buch, Kapitel 5, 19 und 20 beschrieben.
Beim erfindungsgemäßen Enzym handelt es sich um ein Polypeptid.
Im vorliegenden Kontext umfassen erfindungsgemäße Enzyme reife Proteine oder Vorläuferformen davon sowie funktionelle Fragmente davon, die im wesentlichen die Aktivität der Polypeptide von voller Länge aufweisen.
Ferner kommen erfindungsgemäß Homologe dieser Enzyme in Frage. Derartige Homologe umfassen eine Aminosäuresequenz mit einem Identitätsgrad von mindestens 50 bis 70%, vorzugsweise 70 bis 80% und insbesondere bis zu 100% mit der Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms.
Der Identitätsgrad kann nach herkömmlichen Verfahren bestimmt werden; vergl. z. B. Altshul et al., Bull. Math. Bio., Bd. 48 (1986), S. 603–616, und Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89 (1992), S. 10915–10919. Kurz zusammengefasst, zwei Aminosäuresequenzen werden so ausgerichtet, dass die Ausrichtungsbewertungen unter Anwendung einer Lückenöffnungsstrafe von 10, einer Lückenerweiterungsstrafe von 1 und einer Blosum 62-Bewertungsmatrix von Henikoff und Henikoff (a.a.O.) optimiert werden.
Alternativ kann es sich bei den Homologen des erfindungsgemäßen Enzyms um ein Enzym handeln, das durch eine Nucleotidsequenz kodiert wird, die mit einer Oligonucleotidsonde hybridisiert, die auf der Grundlage der Nucleotidsequenz des Enzyms mit Ligase-Aktivität hergestellt worden ist.
Moleküle, mit denen die Oligonucleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden mit üblichen Nachweisverfahren (z. B. Southern-Blotting) nachgewiesen.
Homologe des vorliegenden Polypeptids können eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen aufweisen. Diese Veränderungen sind vorzugsweise von untergeordneter Natur, d. h. es handelt sich um konservative Aminosäuresubstitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins nicht beeinträchtigen, um geringe Deletionen, typischerweise von 1 bis etwa 30 Aminosäuren, um kleine amino- oder carboxylendständige Erweiterungen, z. B. einen aminoendständigen Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid mit bis zu etwa 20–25 Resten oder eine kleine Erweiterung, die die Reinigung erleichtert, z. B. ein Polyhistidin-Trakt, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne; vergl. allg. Ford et al., Protein Expression and Purification, Bd. 2 (1991), S. 95–107. Zu Beispielen für konservative Substitutionen gehören solche innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (z. B. Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (z. B. Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (z. B. Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (z. B. Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (z. B. Phenylalanin, Trypthophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (z. B. Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass derartige Substitutionen außerhalb der für die Funktion des Moleküls kritischen Regionen vorgenommen werden können und immer noch ein aktives Enzym ergeben. Aminosäuren, die für die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wesentlich sind, und daher vorzugsweise keiner Substitution unterliegen, können nach bekannten Verfahren identifiziert werden, beispielsweise durch eine ortsgerichtete Mutagenese oder eine Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham und Wells, Science, Bd. 244 (1989), S. 1081–1085). Bei der letztgenannten Technik werden Mutationen von jedem Rest im Molekül eingeführt. Die erhaltenen mutanten Moleküle werden auf ihre biologische Aktivität getestet (z. B. auf die Ligase-Aktivität), um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Stellen der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung können ebenfalls durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, die durch Techniken, wie durch NMR, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung ermittelt wird; vergl. beispielsweise de Vos et al., Science, Bd. 255 (1992), S. 306–312; Smith et al., J. Mol. Biol., Bd. 224 (1992), S. 899–904; Wlodaver et al., FEBS Lett., Bd. 309 (1992), S. 59–64.
Beim Homologen kann es sich um eine allele Variante handeln, d. h. eine alternative Form eines Gens, die durch Mutation entsteht, oder um ein verändertes Enzym, das durch das mutierte Gen kodiert wird, wobei die Variante aber im wesentlichen die gleiche Aktivität wie das erfindungsgemäße Enzym aufweist. Somit können Mutationen "stumm" sein (keine Veränderung des kodierten Enzyms) oder sie können für Enzyme mit einer veränderten Aminosäuresequenz kodieren.
Beim Homologen des erfindungsgemäßen Enzyms kann es sich auch um ein Spezies-Homologes handeln, d. h. um ein Enzym mit einer ähnlichen Aktivität, das sich von einer anderen Spezies ableitet.
Ein Homologes des Enzyms kann isoliert werden, indem man eine Genom- oder cDNA-Bibliothek einer Zelle der in Frage stehenden Spezies herstellt und ein Screening auf DNA-Sequenzen, die für die Gesamtheit oder einen Teil des Homologen kodieren, unter Verwendung synthetischer Oligonucleotidsonden gemäß üblichen Techniken, wie sie beispielsweise von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, beschrieben werden, oder mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Primer gemäß den Angaben von Sambrook et al., a.a.O., durchführt.
Weitere Homologe des vorliegenden Enzyms sind solche, die immunologisch kreuzreaktiv mit Antikörpern sind, die gegen das erfindungsgemäße Enzym erzeugt worden sind.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines DNA-Konstrukts, das für das Enzym mit Ligase-Aktivität kodiert.
Der hier verwendete Ausdruck "DNA-Konstrukt" bezeichnet beliebige Nucleinsäuremoleküle, die von cDNA, genomischer DNA, synthetischer DNA oder RNA stammen. Der Ausdruck "Konstrukt" bezeichnet ein Nucleinsäuresegement, das einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann und das auf einer vollständigen oder partiellen, natürlich auftretenden Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert, basieren kann. Das Konstrukt kann gegebenenfalls weitere Nucleinsäuresegmente enthalten.
Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt, das für das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert, kann in geeigneter weise von genomischer oder cDNA abstammen, z. B. kann es durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Absuchen auf DNA-Sequenzen, die für die Gesamtheit oder einen Teil des Polypeptids kodieren, durch Hybridisieren unter Verwendung synthetischer Oligonucleotidsonden gemäß üblichen Techniken (vergl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) erhalten werden. Für die vorliegenden Zwecke handelt es sich bei der DNA-Sequenz, die für das Polypeptid kodiert, vorzugsweise um ein Produkt, das von filamentösen Pilzen oder Bakterien stammt.
Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt, das für das Polypeptid kodiert, kann auch synthetisch durch eingeführte übliche Verfahren hergestellt werden, z. B. durch das Phosphoamidit-Verfahren gemäß Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters, Bd. 22 (1981), S. 1859–1869, oder durch das von Matthes et al., EMBO Journal, Bd. 3 (1984), S. 801–805, beschriebene Verfahren. Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonucleotide synthetisiert, z. B. in einem automatisierten DNA-Synthesegerät, gereinigt, einem Annealing unterworfen, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
Ferner kann es sich bei dem DNA-Konstrukt um ein gemischt synthetisches und genomisches, gemischt synthetisches und cDNA- oder gemischt genomisches und cDNA-Herkunftsprodukt, das durch Ligation von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (je nachdem, was zutreffend ist) hergestellt worden ist, handeln, wobei die Fragmente den verschiedenen Teilen des gesamten Nucleinsäurekonstrukts entsprechen und wobei man sich üblicher Techniken bedient.
Das DNA-Konstrukt kann auch durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung spezifischer Primer hergestellt werden, z. B. gemäß US-4 683 202 oder Saiki et al., Science, Bd. 239 (1988), S. 487–491. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung leitet sich die DNA-Sequenz von einem filamentösen Pilz der Gattung Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium und vorzugsweise von einem Stamm von P. chrysogenum, C. acremonium oder A. nidulans und ganz besonders von P. chrysogenum Stamm B10 ab.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Vektor oder Transformationsvehikel, die das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt umfassen, das für das Enzym mit Ligase-Aktivität kodiert. Der rekombinante Vektor, in den das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt eingesetzt ist, kann ein beliebiger Vektor sein, der zweckmäßigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterworfen wird. Die Wahl des Vektors hängt häufig von der Wirtszelle ab, in die er einzuführen ist. Somit kann es sich beim Vektor um einen autonom replizierenden Vektor handeln, d. h. einen Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann es sich um einen Vektor handeln, der bei Einführung in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem oder den Chromosomen, in die er integriert worden ist, repliziert wird.
Beim Vektor handelt es sich vorzugsweise um einen Expressionsvektor, bei dem die für das erfindungsgemäße Polypeptid kodierende DNA-Sequenz funktionell mit zusätzlichen Segmenten, die für die Transkription der DNA erforderlich sind, verknüpft ist. Im allgemeinen leitet sich der Expressionsvektor von Plasmid- oder viraler DNA ab oder kann Elemente von beiden enthalten. Der Ausdruck "funktionell verknüpft" bedeutet, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie für den vorgesehenen Zweck zusammenwirken, z. B. beginnt die Transkription in einem Promotor und verläuft durch die für das Polypeptid kodierende DNA-Sequenz.
Beim Promotor kann es sich um eine beliebige DNA-Sequenz handeln, die eine transkriptionelle Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt und die von Genen abgeleitet sein kann, die für Proteine kodieren, die zur Wirtszelle homolog oder heterolog sind.
Zu Beispielen für geeignete Promotoren zur Verwendung in filamentösen Pilzwirtszellen gehören beispielsweise der ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J., Bd. 4 (1985), S. 2093–2099) oder der tpiA-Promotor. Zu Beispielen für andere geeignete Promotoren gehören solche, die sich von Genen ableiten, die für folgendes kodieren: A. oryzae-TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei-Aspartat-proteinase, A. niger-neutrale-α-Amylase, A. niger-säurestabile-α-Amylase, A. niger- oder A. awamori-Glucoamylase (gluA), Rhizomucor miehei-Lipase, A. oryzae-alkalische-Protease, A. oryzae-Triosephosphat-isomerase oder A. nidulans-Acetamidase. Bevorzugt werden die TAKA-Amylase und gluA-Promotoren.
Häufig ist es vorteilhaft, identische oder ähnliche Promotoren zu verwenden, um zwei oder mehr der biosynthetischen Gene zu regulieren, mit dem Ziel, eine synchronisierte Bildung der an der Synthese von β-Lactam- Antibiotika beteiligten Zwischenprodukte zu erreichen. wenn die Bildung der Zwischenprodukte nicht synchronisiert ist, kann es zu einer Anreicherung von Zwischenprodukten (Flaschenhals) kommen. Infolgedessen wird möglicherweise die Bildung des β-Lactam-Antibiotikums zurückgehalten.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Promotor des Ligase-Gens durch einen Promotor aus einem anderen Gen, das an der Biosynthese von β-Lactamen beteiligt ist, ersetzt.
Ein spezielles Beispiel für einen geeigneten Promotor ist der AT-Promotor, der in der unveröffentlichten dänischen Patentanmeldung 1118/94 beschrieben ist.
Zu Beispielen für geeignete Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Wirtszellen gehören der Promotor des Bacillus stearothermophilus-maltogenen Amylase-Gens, des Bacillus licheniformis-alpha-Amylase-Gens, des Bacillus amyloliquefaciens BAN-Amylase-Gens, des Bacillus subtilis-alkalische-Protease-Gens oder des Bacillus pumilus-Xylosidase-Gens oder die lambda-Phagen PR oder PL-Promotoren oder die E. coli-lac-, -trp- oder -tac-Promotoren.
Die für das erfindungsgemäße Enzym kodierende DNA-Sequenz kann ferner gegebenenfalls funktionell mit einem geeigneten Terminator verknüpft sein.
Der erfindungsgemäße rekombinante Vektor kann vorteilhafterweise eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, sich in der in Frage stehenden Wirtszelle zu replizieren.
Der rekombinante Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, z. B. das für Dihydrofolat-reductase (DHFR) kodierende Gen oder das Schizosaccharomyces pombe TPI-Gen (beschrieben von P. R. Russell, Gene, Bd. 40 (1985), S. 125–130) oder ein Gen, das Resistenz gegenüber einem Arzneistoff verleiht, z. B. gegen Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Phleomycin, Chloramphenicol, Neomycin, Hygromycin oder Methotrexat. Für filamentöse Pilze gehören zu Beispielen für selektierbare Marker amdS, pyrG, argB, niaD und sC.
Um ein erfindungsgemäßes Lipase-Enzym an die erwünschte Position innerhalb der Wirtszelle oder im Fermentationsmedium zu dirigieren, kann eine Zielsignalsequenz oder eine sekretorische Signalsequenz (auch als Leadersequenz, prepro-Sequenz oder pre-Sequenz bezeichnet) im rekombinanten Vektor vorgesehen sein. Die Zielsignalsequenz oder sekretorische Signalsequenz werden mit der für das Enzym kodierenden DNA-Sequenz im korrekten Leseraster verbunden. Sekretorische Sequenzen werden üblicherweise in 5'-Stellung zur für das Enzym kodierenden DNA-Sequenz positioniert, während die Zielsignalsequenzen üblicherweise in 3'-Stellung zur DNA-Sequenz positioniert werden. Bei der Zielsignalsequenz oder der sekretorischen Signalsequenz kann es sich um die Sequenzen handeln, die normalerweise mit dem Enzym assoziiert sind, oder sie können aus einem Gen stammen, das für ein anderes Protein mit der erwünschten Signalsequenz kodiert.
Zur Verwendung in filamentösen Pilzen kann das Signalpeptid zweckmäßigerweise von einem Gen, das für eine Aspergillus sp.-Amylase oder -Glucoamylase, einem Gen, das eine Rhizomucor miehei-Lipase oder -Protease, eine Humicola lanuginosa-Lipase und dergl. kodiert, abgeleitet sein. Das Signalpeptid ist vorzugsweise von einem Gen abgeleitet, das für eine A. oryzae TAKA-Amylase, eine A. niger-neutrale α-Amylase, eine A. niger-säurestabile-Amylase oder eine A. niger-Glucoamylase kodiert.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei der Zielsequenz vorzugsweise um ein Zielsignal, das dazu befähigt ist, die Lipase-Aktivität an die angestrebte Position innerhalb der Zelle zu dirigieren (z. B. zu den Mikrokörpern). Häufig ist es erstrebenswert, dass potentielle Zielsignale aufrechterhalten werden. Jedoch kann das Zielsignal durch andere Signale mit der gleichen Funktion ersetzt werden. Wenn ferner die Ligase-Kodierungssequenz, der ein geeignetes Lipase-Zielsignal fehlt, in einen Organismus inseriert wird, kann dieses zugesetzt werden, damit die Ligase-Expression an der gewünschten Position innerhalb der Wirtszelle stattfindet.
Zur Verwendung in filamentösen Pilzen wird ein Beispiel für ein peroxysomales Zielsignal (PTS) mit der Fähigkeit zur Translokation von zytosolischen Passagierproteinen zu den Peroxysomen (als Mikrokörper klassifiziert) beispielsweise in Neurospora crassa von Keller et al., J. Cell Biol., Bd. 114 (1991), S. 893–904, beschrieben.
Die zur Ligation der DNA-Sequenzen, die für das vorliegende Enzym, den Promotor und gegebenenfalls für den Terminator und/oder die sekretorische Signalsequenz bzw. die Zielsignalsequenz kodieren, und zu deren Insertion in geeignete Vektoren, die die für die Replikation erforderlichen Informationen enthalten, eingesetzten Verfahren sind dem Fachmann geläufig (vergl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Aufgabe der Erfindung ist es ferner eine Zelle, die ein DNA-Konstrukt oder einen rekombinanten Vektor gemäß der Erfindung umfasst, bereitzustellen.
Die für das vorliegende Polypeptid kodierende DNA-Sequenz, die in die Wirtszelle eingeführt wird, kann zu dem in Frage stehenden Wirt entweder homolog oder heterolog sein. Bei homologer Beziehung zur Wirtszelle, d. h. sie wird in der Natur von der Wirtszelle erzeugt, kann sie funktionell mit einer anderen Promotorsequenz oder gegebenenfalls mit einer anderen sekretorischen Signalsequenz und/oder Terminatorsequenz, als diese in ihrer natürlichen Umgebung vorliegen, verknüpft sein. Der Ausdruck "homolog" umfasst eine cDNA, eine halbsynthetisch oder synthetisch erzeugte DNA und eine Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das für den in Frage stehenden Wirtsorganismus nativ ist. Der Ausdruck "heterolog" umfasst eine DNA-Sequenz, die von der Wirtszelle in der Natur nicht exprimiert wird. Somit kann die DNA-Sequenz von einem anderen Organismus stammen oder es kann sich um eine synthetische Sequenz handeln.
Bei der Wirtszelle, in die das DNA-Konstrukt oder der rekombinante Vektor gemäß der Erfindung eingeführt werden, kann es sich um eine beliebige Zelle handeln, die so beeinflusst werden kann, dass sie zur Erzeugung des vorliegenden Polypeptids (Enzym) befähigt ist. Hierzu gehören vorzugsweise filamentöse Pilze und Bakterienzellen.
Zu Beispielen für bakterielle Wirtszellen, die bei Züchtung zur Erzeugung des erfindungsgemäßen Enzyms befähigt sind, gehören gram-positive Bakterien, wie Stämme von Bacillus, z. B. Stämme von B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium oder B. thuringiensis, oder Stämme von Streptomyces, wie S. lividans, S. murinus oder S. clavuligarus, oder gram-negative Bakterien, wie Escherichia coli. Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation oder unter Verwendung kompetenter Zellen auf an sich bekannte Weise vorgenommen werden (vergl. Sambrook et al., a.a.O.).
Bei Expression des Enzyms in Bakterien, wie E. coli, kann dieses Enzym im Zytoplasma typischerweise in Form von unlöslichen Granalien (bekannt als Einschlußkörper) zurückgehalten werden, oder es kann in den periplasmatischen Raum durch eine bakterielle Sekretionssequenz abgegeben werden. Im erstgenannten Fall werden die Zellen lysiert und Granalien gewonnen und denaturiert, wonach das Polypeptid durch Verdünnen des Denaturierungsmittels erneut gefaltet wird. Im letztgenannten Fall kann das Enzym aus dem periplasmatischen Raum durch Aufbrechen der Zellen, z. B. durch Ultraschallbehandlung oder durch osmotischen Schock, aufgebrochen werden, um den Inhalt des periplasmatischen Raums freizusetzen, wonach das Enzym gewonnen wird.
Zu Beispielen für Zellen von filamentösen Pilzen gehören Penicillium spp., Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp., Trichoderma spp. oder Cephalosporine spp., insbesondere Stämme von P. chrysogenum, P. notatum, A. oryzae, A. nidulans, A. niger oder C. acremonium. Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung und die Transformation der Protoplasten sowie die anschließende Regeneration der Zellwand in an sich bekannter Weise beinhaltet. Die Verwendung von Aspergillus spp. für die Expression von Proteinen wird beispielsweise in EP-272 277, EP-238 023 und EP-184 438 beschrieben. Die Transformation von F. oxysporum kann beispielsweise gemäß Malardier et al., Gene, Bd. 78 (1989), S. 147–156 durchgeführt werden.
Wenn ein filamentöser Pilz als Wirtszelle verwendet wird, kann er mit dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt transformiert werden, zweckmäßigerweise durch Integration des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom, wodurch man eine rekombinante Wirtszelle erhält. Diese Integration wird im allgemeinen als Vorteil angesehen, da es wahrscheinlicher ist, dass die DNA-Sequenz in stabiler weise in der Zelle erhalten bleibt. Eine Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann gemäß herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, z.B. durch homologe oder heterologe Rekombination.
Die vorstehend beschriebene transformierte oder transfizierte Wirtszelle wird sodann in einem geeigneten Nährmedium unter Bedingungen gezüchtet, die die Expression des vorliegenden Enzyms ermöglichen, wonach das erhaltene Enzym aus der Kultur gewonnen werden kann.
Bei dem Medium, das zur Züchtung der Zellen verwendet wird, kann es sich um beliebige herkömmliche Medien handeln, die für die Züchtung der Wirtszellen geeignet sind, z. B. um minimale oder komplexe Medien, die entsprechende Ergänzungsstoffe enthalten. Geeignete Medien können von gewerblichen Lieferanten bezogen werden oder lassen sich nach veröffentlichten Rezepturen herstellen (z. B. gemäß dem Katalog der American Type Culture Collection).
Das von den Zellen erzeugte Enzym kann sodann aus dem Kulturmedium nach herkömmlichen Verfahren gewonnen werden, wozu die Abtrennung der Wirtszellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, die Ausfällung der proteinhaltigen Komponenten des Überstands oder Filtrats mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, die Reinigung durch eine Vielzahl von chromatographischen und/oder elektrophoretischen Verfahren, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, isoelektrische Fokussierung, Affinitätschromatographie und dergl. gehören, und zwar je nach dem Typ des in Frage stehenden Polypeptids.
Sofern das Enzym in der Wirtszelle intrazellulär vorliegt, werden zunächst die Zellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen. Anschließend werden die Zellen einer Homogenisierung unterworfen, um sie zu öffnen. Sodann werden die proteinhaltigen Komponenten des Überstands oder Filtrats mittels eines Salzes gemäß den vorstehenden Ausführungen ausgefällt. Schließlich wird das Enzym auf die vorstehend beschriebene Weise gereinigt.
In einer erfindungsgemäßen Auführungsform handelt es sich bei der Wirtszelle um eine bakterielle Zelle eines gram-positiven Bakteriums, z. B. der Gattung Bacillus oder Streptomyces, oder um eine Zelle eines gram-negativen Bakteriums, z. B. der Gattung Escherichia. Beim filamentösen Pilz handelt es sich beispielsweise um einen Pilz der Gattung Aspergillus, Cephalosporium oder Penicillium.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Wirtszelle um P. chrysogenum und C. acremonium.
Methoden und Materialien
Stämme:

B10: P. chrysogenum-Stamm (erhältlich von Panlabs, 11804 North Creek Parkway South, Bothell WA 98011–8805, USA).
P8: P. chrysogenum-Stamm (erhältlich von Panlabs)

Materialien:

LCS-Schrägagar: (J. Lein, "The Panlabs Penicillin Strain Improvement Program", S. 105–139, in Z. Vanek und Z. Hostálek (Herausgeber), Overproduction of Microbial Metabolites, Strain Improvement and Process Control Strategies, Butterworth, Boston (1986)).
LCS-Medium: Lactose-monohydrat, 1,5%, Maisquellflüssigkeit 0,5%, Pepton 0,5%, NaCl 0,4%, MgSO4·7H₂O 0,05%, KH₂PO₄ 0,06%, FeCl₃·6H₂O 0,0005%.
Tween^R-80: Merck Art. 822187
P-1 Anzuchtmedium: (J. Lein, a.a.O. (1986)
P-2 Fermentationsmedium: (J. Lein, a.a.O. (1986)

Vektor

pUC19: 2,6 kb-Asp719-SalI-Fragment

Selektiver Transformationsmarker:
E. coli Tn5-Phleomycin-Resistenzgen, exprimiert durch Aspergillus oryzae TPI (Triosephosphat-isomerase)-Promotor und Aspergillus niger-AMG (Amyloglucosidase)-Terminator.
Ausrüstung:

Sepharose^R S FF-Säule (Pharmacia Biotech)
Phenyl-Sepharose CL 4B-Säule (150 ml) (Pharmacia Biotech)
PD10-Säule (Pharmacia Biotech)
Supelcosil RP C-18 DB-Säule (250 × 4,6 mm)-Supelguard (Supelco)
Flow-one/Beta-Serie 100-Radioaktivitätsdetektor (Radiomatic)
Yttriumsilicat-Fließzelle (Radiomatic)
Sephacryl S-200-Säule (181 ml) (Pharmacia Biotech)
Chromatofocussing PBE^R 94-Säule (20 ml) (Pharmacia Biotech)
Pharmacia LKB PhastSystem (Pharmacia Biotech)
Cibacron Blue 3GA-Säule (Sigma)
ABI 1000S-Photodiodengitter-HPLC-Detektor (Applied Biosystems)
HPLC (Waters)
Applied Biosystems 394 DNA/RNA-Synthesegerät
Applied Biosystems 473-Aminosäure-Sequenziergerät
Waters^R 991-Photodiodengitter-Detektor.

Referenzenzyme und Verbindungen:

Acetyl-coenzym A (Sigma)
Acetyl-coenzym A-synthetase (Sigma)
Rinderserumalbumin ("BSA") (Sigma A7638)
Gelfiltration-Kalibrations-Testpackung (Pharmacia Biotech)
Phenoxyessigsäure-coenzym A-ester (M. J. Alonso et al., J. Antibiot., Bd. 41 (1988), S. 1074–1084
Phenylessigsäure-coenzym A-ester (Sigma)

Adipinsäure-coenzym A-ester wurde folgendermaßen hergestellt: Adipoylchlorid (0,14 ml; Aldrich) wurde zu einer gründlich gerührten und mit Eiswasser gekühlten Suspension des Natriumsalzes von Coenzym A (400 mg; 5,152 × 10^–4 mmol; Sigma) in Aceton (60 ml; Merck PA) + Wasser (0, 6 ml) + 0,2 M KHCO₃ (zur Erhöhung des pH-Werts auf > 7) unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde auf etwa 7,7 gebracht. Anschließend wurde bei der gleichen Temperatur etwa 60 Minuten lang gerührt. Sodann wurde das Aceton teilweise unter vermindertem Druck entfernt. Das erhaltene Produkt wurde in kaltem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute 0,0890 g. Schließlich wurde das Produkt der Ultrafiltration unterworfen.
Puffer

Puffer A: 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,5, 1,36 M Ammoniumsulfat, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM Ascorbinsäure, 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid)
Puffer B: 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,5, 0,68 M Ammoniumsulfat, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM Ascorbinsäure, 1 mM PMSF
Puffer C: 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,5, 20% Glycerin, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM MgCl₂, 5 mM Ascorbinsäure, 1 mM PMSF
Puffer D: wie Puffer C, 150 mM KCl.
Puffer E: 10 mM Tris/HCl, 20% Glycerin, 4 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, 5 mM ATP, 5 mM Ascorbinsäure und 1 mM PMSF, pH-Wert 8,2.
Puffer F: 50 mM Tris/HCl, 20% Glycerin, 4 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, 5 mM ATP und 5 mM Ascorbinsäure, pH-Wert 7,5.

Lösungen:

Lösung A: 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,5; 35% Ammoniumsulfat, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 1 mM PMSF, 5 mM Mercaptoethanol.
Lösung B: 10 μl 9,25 M MgCl₂, 50 μl 0,1 M ATP in 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,0; 50 μl 20 mM CoASH in 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,0 und 30 μl 0,2 M Phenoxyessigsäure oder Phenylessigsäure oder Adipinsäure oder Hexansäure in 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,0; 5-minütiges Mischen und Äquilibrieren bei 25°C.
Lösung C: 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,5; Ammoniumsulfat (20% Sättigung), 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM Ascorbinsäure, 1 mM PMSF, 4 mM MgCl₂.
Lösung D: 5 ml enthalten 1,2 M MgSO₄, 10 mM NaH₂PO₄, pH-Wert 5,8, 150 mg Novozym234 (Charge #1199), 100 μl Chitinase (Sigma, 4 U/ml).
Lösung E: 0,6 M Sorbit, 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,0 Lösung F: 1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM CaCl₂.
Lösung G: 60% PEG4000 (BDH #29576), 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM CaCl₂.
Lösung H: 20% (Vol./Vol.) Acetonitril in 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5.
Lösung I: 13% Methanol in 20 mM Natriumphosphat, pH-Wert 2,5
Substratlösung A: 100 μl 0,25 M MgCl₂, 500 μl 0,1 M ATP in 50 mM Tris/HCl, 500 μl 20 mM CoASH in 50 mM Tris/HCl und 300 μl 0,067 M Kaliumacetat in 50 mM Tris/HCl.
Lösungsmittel A: 15% (Vol./Vol.) Acetonitril in 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5.
Lösungsmittel B: 5% (Vol./Vol.) Acetonitril in 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5.

Methoden:
A) Klonieruag der Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase aus P. chrysogenum
Genomische DNA aus P. chrysogenum, wird gemäß dem Verfahren von Schwarz-Sommer et al. (EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 1021–1028) isoliert und teilweise mit Sau3A verdaut. Fragmente mit einer Größe von 15–23 kb werden sodann isoliert und in lambda-EMBL3-BamHI-Arme (Promega) ligiert.
Bei Reinigung bis zur homogenen Beschaffenheit kann eine partielle Aminosäuresequenz der Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase durch Anwendung eines Edman-Abbaus auf die Ligase oder ein Fragment davon unter Verwendung eines Applied Biosystems 473-Aminosäure-Sequenziergeräts bestimmt werden. Aus der Aminosäuresequenz lassen sich degenerierte Primer durch das Phosphoramidit-Verfahren gemäß Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters, Bd. 22 (1981), S. 1859–1869, z. B. unter Verwendung eines Applied Biosystems 394 DNA/RNA-Synthesegeräts, herstellen.
Durch Screening der genomischen Bibliothek von P. chrysogenum-DNA, die in lambda-EMBL3 durch das Plaque-Hybridisierungsverfahren (Maniatis et al., (1982), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) konstruiert worden ist, lässt sich ein Klon isolieren, der mit dem degenerierten Primer, der spezifisch für das Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase-Gen ist, hybridisiert.
Die Region des lambda-Klons, die das funktionelle Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase-Gen enthält, wird in den pUC19-Vektor zusammen mit dem Tn5-Phleomycin-Resistenzgen subkloniert. Das erhaltene Plasmid kann für die Transformation beispielsweise von P. chrysogenum verwendet werden.
B) Transformation von P. chrysogenum
Penicillium chrysogenum-Stamm B10 (Stamm mit hoher Ausbeute) wird in zwei Kolben mit 100 ml LCS-Medium 36 Stunden bei 26°C gezüchtet. Das Myzel wird an Myra-Cloth gewonnen und gründlich mit 500 ml 0,6 M MgSO₄ gewaschen. Sodann wird das Myzel in ein Kunststoffröhrchen gebracht, in 5 ml Lösung D suspendiert und 5 Minuten auf Eis gestellt. Die Myzelsuspension wird mit 750 μl BSA (12 mg/ml) versetzt und weitere 1 bis 2 Stunden unter mäßigem Schütteln bei 30°C inkubiert. Die Protoplastenbildung wird mit einem Lichtmikroskop kontrolliert.
Protoplasten werden an Myra-Cloth gesammelt und sorgfältig über 5 ml Lösung E geschichtet. Nach langsamer 15-minütiger Zentrifugation bis 2000 U/min werden die an der Grenzphase zwischen Lösung E und Lösung D befindlichen Protoplasten abpipettiert und durch Zugabe von 2 Volumenteilen Lösung F verdünnt. Nach erneuter 5-minütiger Zentrifugation mit 2500 U/min wird das Protoplastenpellet 2 mal mit Lösung F gewaschen. Die isolierten Protoplasten werden durch Zugabe von Lösung F auf 1–2 × 10⁷ Zellen/ml verdünnt. 100 μl Protoplasten werden für die Transformation eingesetzt.
10 μg DNA, die durch CsCl-Dichtegradientenzentrifugation (Maniatis et al., (1982), a.a.O.) hergestellt worden ist, wird zu den Protoplasten gegeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Sodann werden 200 μl Lösung G zugegeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Anschließend werden 3 Volumenteile 1,2 M Sorbit zugesetzt. Sodann wird das Protoplasten-DNA-Aggregat 10 Minuten mit 2500 U/min zentrifugiert. Hierauf wird das Pellet durch Zugabe von 300 μl 1,2 M Sorbit resuspendiert und auf 3 selektiven Platten (jeweils 100 μl) mit einem Gehalt an 50 μg/ml Phleomycin auf LCS-Schrägagar ausgestrichen. Die Platten werden bei 26°C inkubiert, bis Transformanten auftreten.
Die Transformanten lassen sich sodann isolieren und auf ihr Vermögen zur Erzeugung von Penicillin durch Fermentation in Schüttelkolben testen.
C) Fermentation von P. chrysogenum
Lyophilisierte Sporen von Penicillium chrysogenum-Stamm B10 oder P8 (Panlabs) wurden nach Suspendieren in destilliertem Wasser mit einem Gehalt an 0,1% (Vol./Vol.) Tween^R-80 auf jeweils 10 ml LCS-Schrägagar inokuliert. Nach 10-tägiger Inkubation bei 25°C wurden die Sporen von jeder Schrägagar-Oberfläche in 10 ml 0,1% Tween^R-80 suspendiert. Eine 5 ml-Portion dieser Suspension wurde zur Inokulation von 50 ml P-1-Anzuchtmedium in 300 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben verwendet. Die Anzuchtkulturen wurden bei 25°C auf einem Drehschüttler mit 290 U/min inkubiert. Nach 48 Stunden wurden 2 ml-Aliquotanteile der Anzuchtkultur zur Inokulation des P-2-Fermentationsmediums (jeweils 35 ml in 300 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben) (Lardöl durch Olivenöl ersetzt) verwendet. Die Kulturen wurden bis zur Härte bei 25°C mit 290 U/min inkubiert.
D) Ernte, Extraktion und Präzipitation
Die Zellen einer 3 Tage alten Kultur von P. chrysogenum wurden durch Filtration isoliert und rasch mit 5 Volumina 0,9% Natriumchloridlösug gewaschen. Sodann wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Mörser homogenisiert. Das Enzym wurde durch Suspendieren in Lösung A extrahiert. Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Extrakt wurde auf eine 50%-ige Ammoniumsulfat-Sättigung gebracht. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt. Das Enzym konnte sodann durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% ausgefällt werden. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet in Lösung C gelöst.
E) Phenyl-Sepharose^R CL 4B-Säulenchromatographie
2280 mg Protein (95 ml) (vom vorstehenden Abschnitt) wurden auf eine Phenyl-Sepharose CL 4B-Säule (150 ml), die in Puffer A äquilibriert war, aufgesetzt. Strömungsgeschwindigkeit: 60 ml pro Stunde. Die Säule wurde mit 500 ml Puffer A gewaschen. Anschließend folgte ein Gradient von 100% Puffer B bis 100% Puffer C, Gesamtvolumen 1800 ml. Fraktionen von 8 ml wurden gewonnen.
Sämtliche Fraktionen wurden auf Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase-Aktivität und Acetyl-coenzym A-synthetase- Aktivität analysiert. Die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase-Aktivität wurde zwischen den Fraktionen Nr. 115–277 eluiert, wobei ein Aktivitätsmaximum in der Fraktion Nr. 175 auftrat. Die Acetyl-coenzym A-synthetase-Aktivität wurde zwischen den Fraktionen Nr. 108–157 eluiert, wobei ein Aktivitätsmaximum in der Fraktion Nr. 118 auftrat.
F) Cibacron-Blau-Säulenchromatographie
Die Fraktionen Nr. 143–225 der Phenyl-Sepharose-Chromatographie wurden vereinigt. Das Protein wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 65 ausgefällt. Der Niederschlag wurde in 10 ml Puffer C resuspendiert und unter Verwendung einer PD10-Säule entsalzt. Endgültiges Probenvolumen: 16 ml.
Die Probe wurde auf eine Säule, die mit 20 ml Cibacron-Blau gepackt und mit Puffer C äquilibriert war, aufgesetzt. Sodann wurde die Säule mit 10 Säulenvolumina Puffer C gewaschen und mit einem KCl-Gradienten (0–0,25 M KCl) mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml pro Stunde eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 8,3 ml gewonnen. Die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase-Aktivität wurde zwischen den Fraktionen Nr. 36 und Nr. 65 mit einem Maximum in der Fraktion Nr. 45 eluiert.
G) Gelfiltration S-200 (Super fine)
Die Fraktionen Nr. 36–56 der Cibacron-Blau-Chromatographie wurden vereinigt und durch Ultrafiltration (Ausschlußgrenze 10 000) eingeengt und an einer PD10-Säule zu Puffer D entsalzt. 7 mg Protein (3,3 ml) wurden auf eine Sephacryl S-200-Säule (181 ml), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Säule wurde mit Puffer D (Fließgeschwindigkeit 10 ml pro Stunde) eluiert. Aliquotanteile von 1 ml wurden gewonnen und getestet. Die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase wurde in den Fraktionen 72 bis 118 eluiert und zeigte ein Aktivitätsmaximum in der Fraktion 87.
H) Chromatofokussierung mit PBE^R 94
Die Fraktionen Nr. 79–107 wurden vereinigt, durch Ultrafiltration (Aussschlußgrenze 10 000) eingeengt und an einer PD10-Säule unter Verwendung von Puffer E entsalzt. Endgültiges Probenvolumen: 3,0 ml.
Die Probe wurde auf eine 20 ml PBE^R 94-Säule, die in Puffer E äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Säule wurde mit Puffer E mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde eluiert. Fraktionen von 1,5 ml wurden gewonnen. Die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase-Aktivität wurde in den Fraktionen Nr. 11–40 eluiert, wobei ein Aktivitätsmaximum in der Fraktion Nr. 17 erhalten wurde.
I) Sepharose^R S FF-Säulenchromatographie
Das Protein (149 mg) in einer Aliquotmenge aus den vereinigten Fraktionen Nr. 143–225 der Phenyl-Sepharose-Chromatographie (vergl. die vorstehenden Ausführungen) wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 65% gefällt. Der Niederschlag wurde in Puffer F gefällt und unter Verwendung einer PD10-Säule entsalzt. Endgültiges Probenvolumen: 28 ml.
Die Probe wurde auf eine 50 ml Sepharose S FF-Säule, die in Puffer F äquilibriert worden war, aufgesetzt. Nach Aufsetzen der Probe wurde die Säule mit 150 ml Puffer F gewaschen und mit einem KCl-Gradienten (0–0,3 M KCl) eluiert. Bei sämtlichen Stufen wurde eine Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml pro Stunde und eine Fraktionsgröße von 5 ml angewandt. Die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase-Aktivität wurde zwischen den Fraktionen 45 und 120 eluiert, wobei ein Maximum in der Fraktion Nr. 48 auftrat, während der Hauptproteinpeak in der Fraktion Nr. 16 auftrat.
J) Direkter Test auf Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase und Phenylacetyl-coenzym A-synthetase
Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 100 μl Enzymlösung zu Lösung B mit einem Gehalt an Phenoxyessigsäure (oder Phenylessigsäure) und CoASH gestartet. Nach 30-minütiger Inkubation bei 25°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 240 μl 0,5% Trifluoressigsäure gestoppt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt. Die Menge des gebildeten Phenoxyessigsäure-coenzym A-esters (oder Phenylessigsäure-coenzym A-esters) wurde durch HPLC analysiert.
Nachweis des Phenoxyessigsäure-coenzym A-esters oder des Phenylessigsäure-coenzym A-esters durch HPLC:
Säule: Supelcosil RP C-18 DB mit Supelguard
Detektion: UV-Detektion bei 260 nm
Lösungsmittel A: 15% (Vol./Vol.) Acetonitril in 25 mM N
atriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5.
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Retentionszeit für Phenoxyessigsäure-coenzym A-ester: 9,7 Minuten und 9,0 Minuten für Phenylessigsäure-coenzym A-ester. Phenoxyessigsäure-coenzym A-ester und Phenylacetyl-coenzym A-ester wurden quantitativ relativ zu einem Standard bestimmt.
K) Direkter Test auf Adipoyl-coenzym A-synthetase
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 Volumenteil Enzym zu 1,4 Volumenteilen Lösung B mit einem Gehalt an Adipinsäure (eingestellt auf pH-Wert 8,5) gestartet. Ein typisches Inkubationsgemisch bestand aus 250 μl Enzym und 350 μl Lösung B. Die Inkubation wurde bei 30°C durchgeführt. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben aus dem Inkubationsgemisch entnommen und mit einer gleichen Menge an 0,5% Trifluoressigsäure versetzt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt. Die Menge des gebildeten Adipoyl-coenzym A-esters wurde durch HPLC analysiert.
Nachweis von Adipoyl-coenzym A-ester durch HPLC:
Säule: Supelcosil RP C-18 DB
Detektion: UV-Detektion bei 257 nm
Elutionsmittel: 5% Acetonitril in 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 5,6.
Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/min
Retentionszeit für Adipoyl-coenzym A-ester: 11,4 Minuten
Adipoyl-coenzym A-ester wurde als Referenz verwendet.
L) Direkter Test auf Hexanoyl-coenzym A-synthetase
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 Volumenteil Enzym zu 1,4 Volumenteilen Lösung B mit einem Gehalt an Hexansäure (eingestellt auf pH-Wert 8,5) gestartet. Ein typisches Inkubationsgemisch bestand aus 250 μl Enzym und 350 μl Lösung B. Die Inkubation erfolgte bei 30°C. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben aus dem Inkubationsgemisch entnommen und mit einer gleichen Menge an 0,5% Trifluoressigsäure vermischt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt. Die Menge des gebildeten Hexanoyl-coenzym A-esters wurde durch HPLC analysiert.
Nachweis von Hexanoyl-coenzym A-ester durch HPLC:
Säule: Supelcosil RP C-18 DB
Detektion: UV-Detektion bei 257 nm
Elutionsmittel: 15% Acetonitril in 25 mM
Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Retentionszeit für Hexanoyl-coenzym A-ester: 20,4 Minuten.
M) Direkter Test auf Acetyl-coenzym A-synthetase
Die Substratlösung A wurde vermischt. Der pH-Wert wurde mit 4 M KOH auf 8,0 eingestellt. 40 μl Essigsäure-1-¹⁴C, Natriumsalz (41,8 mCi/mmol, 1,0 mCi/ml) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 35°C äquilibriert.
Test: 25 μl Enzym und 35 μl Substratlösung A wurden vermischt und 30 Minuten bei 35°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 60 μl 0,5% Trifluoressigsäure gestoppt. Etwaiger gebildeter Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt. Die Menge des gebildeten Acetyl-coenzym A-esters wurde durch HPLC unter Ergänzung mit einem Radioaktivitätsdetektor analysiert. Nicht-radioaktive Verbindungen wurden durch UV-Detektion bei 210 nm unter Anordnung in Serie mit einem Radiomatic-Detektor nachgewiesen.
Nachweis von Acetyl-coenzym A-ester durch HPLC:
Säule: Supelcosil RP C-18 DB-Säule mit Supelguard
Detektion: radioaktive Verbindungen wurden unter Verwendung eines Flow-one/Beta-Serie 100 Radioaktivitätsdetektors (Radiomatic), der mit einer 250 μl-Yttriumsilicat-Fließzelle ausgerüstet war, detektiert.
UV-Detektion bei 210 nm
Lösungsmittel B: 5% (Vol./Vol.) Acetonitril in 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5.
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Retentionszeit für Acetyl-coenzym A-ester: 6,9 Minuten.
Als Standard wurde Acetyl-coenzym A (Sigma) unter Inkubation des Substratgemisches A mit Acetyl-coenzym A-synthetase (Sigma) und unter anschließender Analyse des gebildeten ¹⁴C-Acetyl-coenzym A durch HPLC verwendet.
N) Nachweis von Penicillin V und Penicillin G durch HPLC
Nach der Inkubation wurde das Fläschchen 10 Minuten auf Eis gestellt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand durch HPLC auf Penicillin V oder Penicillin G unter Anwendung der folgenden Bedingungen analysiert:
Säule: Supelcosil LC C-18 DB-Säule (250 × 4,6 mm) mit Supelcoguard
Detektion: UV-Detektion bei 215 nm
Lösungsmittel: Lösungsmittel H
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Injektionsvolumen: 10 μl
Die Retentionszeit (RT) für Penicillin V betrug 13,3 Minuten und für Penicillin G 8,7 Minuten.
O) Probenvorbereitung für die HPLC-Bestimmung von ACV und IPNS
Eine Probe von 2 ml wurde aus dem Schüttelkolben entnommen und rasch auf 0–4°C gekühlt, 25-fach mit 25 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,5, verdünnt und ultrafiltriert (Ausschlußgrenze 10 000). Sodann wurde Dithiothreit (DTT) zum Filtrat bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben. Die Proben wurden durch HPLC analysiert.
Säule: Supelcosil LC 18 DB-Säule (250 × 4,6 mm) mit Supelguard
Detektion: UV-Detektion bei 210 nm
Lösungsmittel: Lösungsmittel I
Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min
Temperatur: 35°C
Injektionsvolumen: 10 μl
Die Retentionszeiten (RT) für Isopenicillin N und ACV betrugen 5,7 bzw. 17 Minuten.
P) Extraktion von Acyl-coenzym A aus P. chrysogenum
Acyl-coenzym A-Verbindungen aus P. chrysogenum wurden gemäß dem Verfahren von Barbara E. Corkey und Jude T. Deeney, "Acyl CoA Regulation of Metabolism and Signal Transduction", Progress in Clinical and Biological Research, Bd. 321 (1990), S. 217–232, extrahiert.
P. chrysogenum (Stamm B10 oder Stamm P8) wurden in Schüttelkolben gemäß den Angaben im Abschnitt "A) Fermentation von P. chrysogenum" gezüchtet. Nach 4-tägiger Züchtung in P-2-Medium (pH-Wert 6,1) wurden die Zellen rasch in Salz/Eis-Bad abgekühlt und 30 Sekunden mit 22000 g_av zentrifugiert. Das Pellet wurde nach Zellenernte innerhalb von 3 Minuten in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach Zugabe von zwei Volumenteilen 0,6 N Trichloressigsäure wurden die Zellen aufgetaut. Nach einer Ultraschallbehandlung von 30 Sekunden wurden die Zellextrakte durch Zentrifugation (12000 g_av für 30 Sekunden) isoliert. Die Trichloressigsäure wurde durch Extraktion mit Diethylether bis zum Erreichen eines pH-Werts in der wässrigen Phase von 6 entfernt. Die wässrige Phase (mit einem Gehalt an den Acyl-coenzym A-Verbindungen) wurde lyophilisiert. Die Probe wurde schließlich in 25 nM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5, gelöst und durch HPLC unter Anwendung der unter "Nachweis von Phenoxyessigsäure-coenzym A" angegebenen Bedingungen analysiert.
Q) Markierung von Phenoxyessigsäure-Metaboliten in P. chrysogenum
P. chrysogenum (B10 oder P8) wurden in Schüttelkolben gemäß den Angaben im Abschnitt "Fermentation von P. chrysogenum" gezüchtet. Nach 4-tägiger Züchtung in P-2-Medium (pH-Wert 6,1) wurden 10 ml Zellen auf 50 ml fassende Erlenmeyer-Kolben mit einem Gehalt an 250 μl [1-¹⁴C]-Phenoxyessigsäure (72 μCi/ml, 9,7 μCi/μmol) übertragen. Die Kolben wurden anschließend unter Schütteln bei 26°C inkubiert.
Nach 1, 15, 30, 60, 120, 240 und 360 Minuten wurden 1 ml Zellen entfernt, sofort auf 0°C abgekühlt und 1 Minute bei 22000 g_av zentrifugiert. Das Pellet wurde in 500 μl 5 Phosphorsäure suspendiert und mit 500 μl Methanol versetzt. Das Gemisch wurde 1 Minute mit Ultraschall behandelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand durch HPLC unter Verwendung eines Radioaktivitätsdetektors zur Identifizierung von markierten Metaboliten analysiert.
HPLC-Bedingungen:

Säule: Supelcosil LC 18 DB-Säule (250 × 4,6 mm) mit Supelguard
Detektion: Radiomatic A-140 mit einer Yttriumsilicat-Fließzelle
Lösungsmittel 1: 25 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,5
Lösungsmittel 2: Acetonitril Gradient:
Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/min

Die einzigen Peaks, die im Chromatogramm auftraten, entsprachen Phenoxyessigsäure (RT: 14,5 min), p-Hydroxyphenoxyessigsäure (RT: 8,4 min) und Penicillin V (RT: 34 min). Die Peaks für p-Hydroxyphenoxyessigsäure und Penicillin V waren erst nach 60-minütiger Inkubation nachweisbar.
Beispiele
Beispiel 1
Ligase-Aktivität in einem Stamm von P. chrysogenum mit hoher und geringer Erzeugung
Die Ausbeuten an Penicillin bei Fermentation des P. chrysogenum-Stammes P8 werden im allgemeinen als nieder bis mittelmäßig angesehen, während der P. chrysogenum-Stamm B10 als Stamm mit hoher Ausbeute angesehen wird.
Die Stämme von P. chrysogenum (B10 und P8) wurden gemäß den Angaben im Abschnitt "Fermentation von P. chrysogenum" fermentiert. Die Zellen wurden geerntet. Die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase wurde gemäß den Angaben in Abschnitt "B) Ernte, Extraktion und Fällung" extrahiert. Die Aktivität von Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase (Ligase) in den beiden Extrakten wurden gemäß den Angaben in Abschnitt "Direkte Tests auf Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase und Phenylycetyl-coenzym A-synthetase" bestimmt.
Die Ergebnisse für die Bestimmung der Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
Tabelle 1
Dieses Beispiel belegt klar, dass die Aktivität von Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase mit der Penicillin-Erzeugung des Stammes korreliert.
Beispiel 2
Anreicherung von Zwischenprodukt-Metaboliten
P. chrysogenum (B10) wurde in Schüttelkolben gemäß den Angaben in Abschnitt "A) Fermentation von P. chrysogenum" gezüchtet. Nach Inokulation in P-2-Fermentationsmedium wurden die Konzentrationen von ACV und Isopenicillin N in der Kulturbrühe durch HPLC jeweils 7 Tage lang bestimmt, wobei man sich des vorstehenden Verfahrens bediente.
Die Konzentrationen von ACV und Isopenicillin N als Funktion der Fermentationszeit sind in 1 angegeben.
Die Figur belegt klar eine Anreicherung von ACV und Isopenicillin N in der Kulturbrühe einer P. chrysogenum-Fermentation.
Beispiel 3
In vitro-Synthese von Penicillin V und Penicillin G
Ein Gemisch aus 25 μl 60 mM Phenoxyessigsäure, 25 μl 40 mM ATP, 25 μl 6 mM Coenzym A und 10 μl 6 mM 6-Aminopenicillansäure wurde bei 30°C in Gegenwart von 10 μl Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase (aus den vereinigten Fraktionen Nr. 11–40 der Chromatofokussierung-PBE^R 94-Chromatographie (vorstehend beschrieben)) und 10 μl Acylcoenzym A:6-Aminopenicillansäure-Acyltransferase (gereinigt aus P. chrysogenum gemäß Emilio Alvarez et al. In "Purification to Homogeneity and Characterization of Acyl-coenzyme A:6-Aminopenicillanic Acid Acyltransferase of Penicillium Chrysogenum", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Bd. 31 (11) (1987), S. 1675–1682, inkubiert.
Für die in vitro-Synthese von Penicillin G wurde die Phenoxyessigsäure durch 25 μl 60 mM Phenylessigsäure ersetzt.
Nach 15 Minuten wurde die Inkubation durch Zugabe von 100 μl Methanol gestoppt. Das Fläschchen wurde 10 Minuten auf Eis gestellt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand durch HPLC auf Penicillin V oder Penicillin G gemäß den vorstehenden Angaben analysiert.
Identifizierung von Penicillin V oder Penicillin G
Die Identifizierung der Penicillin V- oder Penicillin G-Peaks im Chromatogramm wurde durch Versetzen mit Standardlösung an Penicillin V bzw. Penicillin G und durch Vergleich des UV-Spektrums an den Peak-Wendepunkten und am Scheitel mit dem Spektrum der beiden Penicillin-Standards unter Verwendung eines ABI 1000S-Photodioden-Gitter-HPLC-Detektros gemäß den vorstehenden Angaben verifiziert.
Wenn entweder Coenzym A, 6-Aminopenicillansäure ATP oder die Phenoxyessigsäure oder Phenylessigsäure aus dem Reaktionsgemisch weggelassen wurden, wurde kein Penicillin V oder G synthetisiert.
Dies bestätigt, dass das isolierte Enzym eine Phenoxyacetyl-coenzym A-Aktivität und Phenylessigsäure-coenzym A-Aktivität (Ligase-Aktivität) aufweist.
Beispiel 4
In vitro-Synthese von V-DCA
Ein Gemisch aus 25 μl Phenoxyessigsäure, 25 μl 40 mM ATP, 25 μl 6 mM Coenzym A und 10 μl 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) wurde bei 30°C in Gegenwart von 10 μl Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase (aus den vereinigten Fraktionen Nr. 11–40 der Chromatofokussierung-PBE^R-Chromatographie (vorstehend beschrieben)) und 10 μl Acyltransferase (gereinigt aus P. chrysogenum gemäß Emilio Alvarez in "Purification to Homogeneity and Characterization of Acyl-Coenzyme A:6-Aminopenicillanic Acid Acyltransferase of Penicillium Chrysogenum", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Bd. 31 (11) (1987), S. 1675–1682, inkubiert.
Nach 15 Minuten wurde die Inkubation durch Zugabe von 100 μl 0,5% Trifluoressigsäure gestoppt. Das Fläschchen wurde 10 Minuten auf Eis gestellt. Nach Einengen wurde der Überstand durch HPLC auf V-DCA unter Anwendung der Chromatographiebedingungen gemäß Abschnitt "O) Markierung von Phenoxyessigsäure-Metaboliten P. chrysogenum" analysiert. Retentionszeit für V-DCA: 32 Minuten.
Identifikation von V-DCA
Die Identifikation des V-DCA-Peaks im Chromatogramm wurde durch Zusatz von Standardlösungen von V-DCA und durch Vergleich des UV-Spektrums am Peak-Scheitel mit dem Spektrum von V-DCA-Standard unter Verwendung eines Waters^R 991-Photodiodengitter-Detektors verifiziert.
Beispiel 5
Bestimmung des Molekulargewichts durch Gelfiltration
Das Molekulargewicht der Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase (Ligase) wurde durch Vergleich des Elutionsvolumens der im Abschnitt "Gelfiltration S-200 (super fine)" beschriebenen Gelfiltration mit den Elutionsvolumina für aufgesetzte Standards aus der Gelfiltrations-Kalibrationstestpackung (Ribonuclease A (13700 Dalton), Chymotrypsinogen A (25000 Dalton), Ovalbumin (43000 Dalton), Rinderserumalbumin (67000 Dalton) und Aldolase (158000 Dalton) an der gleichen Säule und unter Anwendung der gleichen Bedingungen, wie sie vorstehend angegeben wurden, bestimmt. Die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase weist ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 50000 Dalton auf.
Beispiel 6
Isoelektrischer Punkt (pI)
Der isoelektrische Punkt (pI) wurde durch Veränderung des pH-Werts im Puffer F (pH-Wert 7,5), der bei der Sepharose S FF-Säulenchromatographie (vorstehend beschrieben) verwendet wurde, auf 8,5 bestimmt. Unter Konstanthalten der übrigen Parameter wurde festgestellt, dass die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase (Ligase) auf der Säule während der Elution mit Puffer F nicht zurückgehalten wurde (pH-Wert auf 8,5 eingestellt).
Dies zeigt, dass der pH-Wert, an dem die Nettoladung des Enzyms 0 ist (d.h. der isoelektrische Punkt) über 7,25 liegt.
Beispiel 7
Phenoxyacetyl-coenzym A in Extrakten
Um einen Hinweis für das Vorliegen von Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase-(Ligase)-Aktivität zu erhalten, wurde Acyl-coenzym A gemäß den Angaben im Abschnitt "Extraktion von Acyl-coenzym A aus P. chrysogenum" extrahiert und durch HPLC analysiert.
Obgleich die Nachweisgrenze im HPLC-Test unter 50 pmol liegt, konnte kein Phenoxyessigsäure-coenzym A in den Zellextrakten identifiziert werden. Auch eine Extraktion von markierten Phenoxyessigsäure-Metaboliten ergab keine nachweisbare Phenoxyessigsäure-coenzym A-synthetase in Zellextrakten gemäß den Angaben im Abschnitt "Markierung von Phenoxyessigsäure-Metaboliten in P. chrysogenum".
Beispiel 8
Charakterisierung
Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase-(Ligase), die bei der Reinigung (vorstehend beschrieben) erhalten wurde, wurde für die weitere Charakterisierung des Enzyms herangezogen.
Temperatur- und pH-Optimum
Die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase wurde gemäß den Angaben im Abschnitt "Direkter. Test auf Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase" unter Anwendung von Temperaturen von 15–50°C und unter Variation der pH-Werte im Test von 6,5 bis 9,0 getestet.
Wie in 2 dargestellt, erreichte die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase-Aktivität ein Maximum um einen pH-Wert von 8–8,5. 3 zeigt ein Temperaturoptimum um etwa 40°C.
Substratspezifität
Bei Inkubation der Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase mit Phenoxyessigsäure, Phenylessigsäure, Adipinsäure, Hexansäure und Essigsäure unter Anwendung der im Abschnitt "Direkter Test auf Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase" im Abschnitt "Direkter Test auf Acetyl-coenzym A-synthetase", im Abschnitt "Direkter Test auf Adipoyl-coenzym A-synthetase" und im Abschnitt "Direkter Test auf Hexanoyl-coenzym A-synthetase" angegebenen Testbedingungen wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:
Bestimmung des scheinbaren K_M-Werts für ATP, Phenoxyessigsäure, Coenzym A und MgCl₂
Die Aktivität von Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase wurde gemäß den Angaben im Abschnitt "Direkter Test auf Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase" in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der Substrate, die jeweils einzeln vorlagen, getestet. Die scheinbaren (unter den in diesem Test angewandten Bedingungen) K_M-Werte wurden aus Eadie-Hofstee-, Hanes- und Lineweaver-Burk-Diagrammen gemäß den Angaben von Nicholas C. Price & Lewis Stenens in "Fundamentals of Enzymology", Oxford University Press, S. 123 (1982), bestimmt. Aus den Diagrammen ist klar ersichtlich, dass die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase in bezug auf die einzelnen Substrate der Michaelis-Menten-Kinetik folgte.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2

K_M: bedeutet die Michaelis-Konstante.

Hemmung von Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase durch Phenylessigsäure und Essigsäure
Die Aktivität von Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase wurde gemäß den Angaben im Abschnitt "Direkter Test auf Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase" in Gegenwart verschiedener Konzentrationen entweder an Phenylessigsäure oder Essigsäure bei verschiedenen Konzentrationen von Phenoxyessigsäure getestet.
Die in diesem Test verwendeten Konzentrationen an Phenoxyessigsäure betrugen 1,7, 3,3, 6,6, 20 und 42 mM. Die Konzentrationen an Phenylessigsäure und Essigsäure betrugen 0, 1,0, 5,0, 10 bzw. 25 mM.
Aus Lineweaver-Burk-Diagrammen wurde bestätigt, dass Phenylessigsäure als kompetitiver Inhibitor für die Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase wirkte, während Essigsäure nicht als kompetitiver Inhibitor für Phenoxyacetyl-coenzym A-synthetase unter den angewandten Testbedingungen wirkte.

Claims

Enzym mit Ligaseaktivität, das aus Penicillium chrysogenum erhältlich ist und gegenüber Phenoxyessigsäure sowie Phenylessigsäure mindestens 10 Mal aktiver ist als gegenüber Essigsäure, wobei das Enzym ein scheinbares Molekulargewicht zwischen 40.000 und 60.000 Dalton, bestimmt durch Gelfiltration, und ein scheinbares Aktivitätoptimum im Bereich von pH 7,0–9,0 sowie ein scheinbares Aktivitätsoptimum im Temperaturbereich von 35–45°C aufweist.
Enzym nach Anspruch 1, das gegenüber Adipinsäure mindestens 10 Mal aktiver ist als gegenüber Essigsäure.
Enzym nach Anspruch 1 oder 2, das gegenüber Hexansäure mindestens 10 Mal aktiver ist als gegenüber Essigsäure.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 50.000 Dalton, bestimmt durch Gelfiltration.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch ein scheinbares Aktivitätsoptimum im Bereich von pH 8,0–8,5.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch ein scheinbares Aktivitätsoptimum bei einer Temperatur von etwa 40°C.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Fadenpilz erhalten wird, der zu der Gattung Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium, vorzugsweise aus einem Stamm von P. chrysogenum oder C. acremonium, insbesondere aus P. chrysogenum Stamm B10 erhalten wird.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es gegenüber einem Antikörper immunologisch reaktiv ist, der gegen die genannte gereinigte Ligase von P. chrysogenum Stamm B10 gezüchtet worden ist.
Verwendung des Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Fermentationsverfahren zur Herstellung eines β-Lactam-Antibiotikums.
DNA-Konstrukt mit einer DNA-Sequenz, die ein Enzym gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert, wobei die DNA-Sequenz aus Penicillium chrysogenum erhältlich ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, worin die DNA-Sequenz, welche das Enzym kodiert, aus einem Fadenpilz der Gattung Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium, vorzugsweise aus einem Stamm von P. chrysogenum oder C. acremonium, insbesondere aus P. chrysogenum Stamm B10, erhalten wird.
Rekombinanter Vektor oder Transformationsvehikel, enthaltend das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 10 oder 11.
Vektor oder Transformationsvehikel nach Anspruch 12, worin die DNA-Sequenz, welche das Enzym kodiert, mit einer Promotorsequenz und gegebenenfalls mit einer Therminatorsequenz funktionell verbunden ist.
Vektor oder Transformationsvehikel nach Anspruch 13, worin die Promotorsequenz von einem anderen Gen stammt, das an der Biosynthese von β-Lactamen beteiligt ist, und nicht von dem Gen, das die Ligase kodiert.
Vektor oder Transformationsvehikel nach einem der Ansprüche 12 bis 14, worin das DNA-Konstrukt mit einer Sequenz funktionell verbunden ist, die ein Zielsignal oder ein Sekretionssignal kodiert.
Mikrobielle Wirtszelle, die ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 10 oder 11 oder einen Vektor oder ein Transformationsvehikel gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15 aufweist.
Mikrobielle Wirtszelle nach Anspruch 16, die eine bakterielle Wirtszelle oder eine Pilzwirtszelle ist.
Mikrobielle Wirtszelle nach Anspruch 17, worin der bakterielle Wirt ein grampositives Bakterium, das z. B. zur Gattung Bacillus oder Streptomyces gehört, oder ein gramnegatives Bakterium, das z. B. zur Gattung Escherichia gehört, und der Pilzwirt ein Fadenpilz, der z. B. zur Gattung Aspergillus, Cephalosporium oder Penicillium gehört, ist.
Verfahren zum Herstellen eines β-Lactam-Antibiotikums mit den Stufen i) des Züchtens eines Mikroorganismus, der das genannte β-Lactam-Antibiotikum bilden kann, welches mit einem DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 10 oder 11 oder mit einem Vektor oder einem Transformationsvehikel gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15 transformiert wird, und ii) des Gewinnens des genannten β-Lactam-Antibiotikums.
Verfahren nach Anspruch 19, worin der transformierte Mikroorganismus aus der Gruppe Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus, Nocardia, Streptomyces, Bacillus, Cerospora, Microspora, anderen Eubakterien, anderen Actinomyceten und Fadenpilzen stammt.
Verfahren nach Anspruch 20, worin der transformierte Mikroorganismus zu der Spezies Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Cephalosporium acremonium, Aspergillus nidulans, Nocardia lactamdurans und Streptomyces clavuligerus gehört.
Verfahren zum Herstellen eines β-Lactam-Antibiotikums, wobei eine Carbonsäure, Coenzym A, ein Enzym mit Ligaseaktivität gemäß Anspruch 1 bis 8, Acyltransferase und ein β-Lactam-Zwischenprodukt inkubiert werden.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die genannte Ligaseaktivität durch Einsatz von Enzymen mit Ligaseaktivität bei der Herstellung von β-Lactamen hervorgerufen wird.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, worin das β-Lactam-Zwischenprodukt Isopenicillin N (IPN), 6-Aminopenicillansäure (6-APA), 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA), 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) und 7-Aminodeacetylcephalosporansäure, 7-(L-α-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-cephalosporansäure (Isocephalosporin C), Adipoyl-7-ADCA oder Adipoyl-7-ACA ist.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die Carbonsäure Phenoxyessigsäure, Phenylessigsäure, Adipinsäure, Hexansäure, 2-Thiophenessigsäure oder 3-Thiophenessigsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 22 bis 25, worin die Inkubation in Gegenwart von Mg²⁺ und ATP stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 22 bis 26, worin die Inkubation in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie Dithiothreitol (DTT), Mercaptoethanol, Ascorbinsäure oder Glutathion stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 22 bis 27, worin die Inkubation bei einer Temperatur zwischen 10 und 60°C, vorzugsweise zwischen etwa 15 und 50°C, insbesondere zwischen 20 und 45°C, stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 22 bis 28, worin die Inkubation bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise bei etwa pH 8, stattfindet.