KR970706393A - 향상된 리가제 활성을 갖는 미생물들을 응용하는 β-락탐 항생물질의 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 β-락탐 항생물질 생합성에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 생체내에서 및 생체외에서 β-락탐 항생물질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한 β-락탐 생합성에 포함된 일정 단계들을 촉매화할 수 있는 신규 효소가 기대된다. 또한, 본 발명은 상기 신규 효소를 엔코드하는 DNA 축조물, 상기 DNA 축조물을 포함하는 재조합 벡터 또는 형질전환 운반체, 그리고 최종적으로 상기 DNA 축조물 또는 재조합 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
Description
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 발효기간의 함수로서 ACV 및 이소페니실린 N의 농도들을 도시하고 있다, 제2도는 리가제 활성에 대한 pH 최적치를 도시하고 있다, 제3도는 리가제 활성에 대한 온도 최적치를 도시하고 있다.
Claims (48)
- (ⅰ) β-락탐 항생물질을 생산할 수 있는 미생물을 발효하는 단계와, (ⅱ) 상기 β-락탐 항생물질을 실질적으로 순수한 형태로 복구하는 단계로 이루어지고, 상기 발효는, 원 미생물만으로 원 발효 조건하에서 발효할 때 나타내는 리가제 활성에 비교하여, 향상된 리가제 활성의 존재하에서 일어나는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 원 미생물은 리가제 활성이 부족하거나 낮은 리가제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 리가제 활성의 발현이 발효공정의 물리적 조건을 조절함에 의해 증가되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제3항에 있어서, 리가제 활성의 발현이 발효 동안에 온도를 조절함에 의해서 증가되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제4항에 있어서, 리가제 활성의 발현이 발효 동안에 pH를 조절함에 의해 증가되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제1항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서, 상기 리가제 활성이 미생물에 리가제의 발현을 유도하는 화합물 또는 시약을 처리함에 의해 증가되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 있어서, 상기 리가제 활성이 발효될 미생물의 세포성 조절대사를 방해함에 의해 증가되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제1항 내지 제7항의 어느 한 항에 있어서, 상기 리가제 활성 또는 증가된 리가제 활성이 상기 미생물을 수식함에 의해 획득되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제8항에 있어서, 상기 리가제 활성 또는 향상된 리가제 활성이 상기 미생물을 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이시킴에 의해 획득되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제1항 내지 제9항의 어느 한 항에 있어서, 리가제 활성의 발현을 달성하거나 리가제 활성의 발현을 향상시키는 것은 리가제 활성을 나타내는 효소를 엔코드하는 유전자 또는 DNA 서열을 포함하는 DNA 축조물 또는 재조합 벡터의 하나 이상의 복사체를 발효될 상기 원 미생물로 도입하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제8항 내지 제10항의 어느 한 항에 있어서, 상기 수식은 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제10항에 있어서, 상기 DNA 축조물은 그것이 도입되는 미생물과 다른 종으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제1항 내지 제12항의 어느 한 항에 있어서, 상기 원 미생물은 Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus, Nocardia, Streptomyces, Bacillus, Cerospora, Microspora, 다른 Eubacteria, 다른 Actinomycetes 및 섬유성 진균으로 구성된 군으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제13항에 있어서, 상기 원 미생물은 Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Cephalosporium acremonium acremonium, Aspergillus nidulans, Nocardia lactamdurans 및 Streptomyces clavuligerus로 구성된 군으로부터 유래되는 종들에 속하는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제1항 내지 제14항의 어느 한 항에 있어서, 상기 리가제 활성의 발현이 β-락탐 생합성 경로에 속하는 다른 유전자들의 발현과 동시에 일어나는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제15항에 있어서, 상기 리가제 활성의 발현이 pcbAB, pcbC 및/또는 penDE 유전자들의 발현과 동시에 일어나는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 원 미생물이 생성할 수 있는 β-락탐 항생물질은 페니실린, 세파로스포린, 세파마이신, 모노-박탐 및 노카르디신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제17항에 있어서, 상기 항생물질이 세파로스포린 또는 페니실린이고, 바람직하게는 페니실린 V, 페니실린 G, V-DCA, G-DCA, 7-(L-α-5-아미노-5-카르복시발레라미도)-세파로스포란산(이소세파로스포린 C), 아디포일-7-ADCA, 또는 아디포일-7-ADCA인 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제8항 내지 제18항의 어느 한 항에 있어서, 상기 수식된 미생물의 배양은 소정의 β-락탐 항생물질에 존재하는 측쇄에 대응하는 증가된 양의 카르복시산의 조효소 A 티오에스테르를 결과적으로 생산하는 상기 DNA 축조물의 발현을 유도하는 조건하에서 실행되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제8항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물의 배양은 아실트랜스퍼라레(AT)의 존재하에서 상기 측쇄를 포함하는 β-락탐의 형성을 이끌어내는 활성화된 촉매 조효소 A 티오에스테르를 결과적으로 생산하는 상기 DNA 축조물의 발현을 유도하는 조건하에서 실행되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 제1항 내지 제20항의 어느 한 항에 있어서, 상기 리가제 효소는 아세트산 보다는 페녹시아세트산 및 페닐아세트산에 대하여 10배 이상 활성적이고, 겔여과에 의해 결정된 약 50,000 달토의 겉보기 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생물질의 생산방법.
- 리가제 활성을 나타내는 효소로서, 아세트산 보다는 페녹시아세트산에 대하여 10배 이상의 활성이 있는 것을 특징으로 하는 신규효소.
- 제22항에 있어서, 상기 효소는 아세트산 보다는 페닐아세트산에 대하여 10배 이상의 활성이 있는 것을 특징으로 하는 신규효소.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 효소는 아세트산 보다는 아디프산에 대하여 10배 이상의 활성이 있는 것을 특징으로 하는 신규효소.
- 제22항 내지 제24항의 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 아세트산 보다는 헥산산에 대하여 10배 이상의 활성이 있는 것을 특징으로 하는 신규효소.
- 제22항 내지 제25항의 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 겔 여과에 의해 결정될 때, 40,000 내지 60,000 달톤, 특히 약 50,000 달톤의 겉보기 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 신규효소.
- 제22항 내지 제26항의 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 pH 7.0 내지 9.0 범위에서, 특히 pH 8.0 내지 8.5 범위에서 겉보기 pH 최적치 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 신규효소.
- 제22항 내지 제27항의 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 35 내지 45℃ 범위에서, 특히 약 40℃에서 겉보기 온도활성 최적치를 갖는 것을 특징으로 하는 신규효소.
- 제22항 내지 제28항의 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 Aspergillus, Penicillium 또는 Cephalosporium 속에 속하는 섬유성 진균에 의해 생산되고, 바람직하게는 P. chrysogenum 또는 acremonium 스트레인, 특히 P. chrysogenum 스트레인 B10으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 신규효소.
- 제22항 내지 제29항의 어느 한 항에 있어서, 상기 효소가 P. chrysogenum 스트레인 B10으로부터 유래된 상기 정제된 리가제에 대한 항체와 면역 반응할 수 있는 것을 특징으로 하는 신규효소.
- 제22항 내지 제30항의 어느 한 항에 의한 효소를 엔코드하는 DNA 축조물.
- 제31항에 있어서, DNA 서열이 Aspergillus, Penicillium 또는 Cephalosporium 속에 속하는 섬유성 진균으로부터 유래하는 바람직하게는 P. chrysogenum 또는 C. acremonium 스트레인으로부터 유래하는, 특히 Penicillium 스트레인 B10으로부터의 유래하는 것을 특징으로 하는 DNA 축조물.
- 제31항 또는 제32항에 의한 DNA 축조물을 포함하는 재조합 벡터 또는 형질전환 운반체.
- 제33항에 있어서, 상기 DNA 축조물이 조정하기 쉽게 프로모터 서열에 연결되고 선택적으로 터미네이터 서열에 연결되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 또는 형질전환 운반체.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 리가제 유전자의 프로모터가 β-락탐 생합성에 포함된 다른 유전자 유래의 프로모터로 대치되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 또는 형질전환 운반체.
- 제33항 내지 제35항의 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 축조물이 표적화신호 또는 분비신호를 엔코드하는 서열에 조정하기 쉽게 연결되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 또는 형질전환 운반체.
- 제31항 또는 제32항에 의한 DNA 축조물 또는 제32항 내지 제36항의 어느 한 항에 의한 벡터를 포함하는 세포.
- 제37항에 있어서, 상기 세포가 미생물 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제38항에 있어서, 상기 세포가 세균 세포 또는 진균 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제39항에 있어서, 상기 세균 세포는 예를 들어 Bacillus 또는 Streptomyces 속의 G(+)세균의 세포 또는 예를 들어 Escherichia 속의 G(-) 세균세포, 그리고 예를 들어 Aspergillus, Cephalosporium, 또는 Penicillium 속의 섬유성 진균 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 카르복시산, 조효소 A, 제22항 내지 제30항에 의한 리가제 활성을 나타내는 효소, 아실트랜스퍼라제 및 β-락탐 중간체를 배양하는 것으로 이루어지는 β-락탐 생산방법.
- 제41항에 있어서, 상기 리가제 활성이 β-락탐의 생성에서 리가제 활성을 나타내는 효소들을 사용함에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 생산방법.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 β-락탐 중간체가 이소페니실린 N(IPN), 6-아미노페니실란산(6-APA), 7-아미노세파로스포란산(7-ACA), 7-아미노데스아세톡시-세파로스포란산(7-ADCA) 및 7-아미노디아세틸세파로스포란산, 7- (L-α-5-아미노-5-카르복시발레라미도)-세파로스포란(이소세파로스포린 C), 아디포일-7-ADCA, 또는 아디포일-7-ACA인 것을 특징으로 하는 β-락탐 생산방법.
- 41항에 있어서, 상기 카로복시산이 페녹시아세트산, 페닐아세트산, 아디프산, 헥산산, 2-티오페네아세트산 또는 3-티오페네아세트산인 것을 특징으로 하는 β-락탐 생산방법.
- 제41항 내지 제44항의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 Mg2+및 ATP 존재하에 수행되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 생산방법.
- 제41항 내지 제45항의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 디티오트레이톨 (DTT), 머캅토에탄올, 아스코르브산 또는 글루타티온과 같은 환원제의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 생산방법.
- 제41항 내지 제46항의 어느 한 항에 있어서, 배양이 10℃ 내지 60℃, 바람직하게는 15℃ 내지 50℃, 특히 20℃ 내지 45℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 생산방법.
- 제41항 내지 제47항의 어느 한 항에 있어서, 배양이 pH 5.5 내지 9, 바람직하게는 약 pH 8에서 수행되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 생산방법.※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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