DE69607191T2

DE69607191T2 - Spezifische bindungspartner für menschlichen transformierenden wachstumsfaktor und verfahren

Info

Publication number: DE69607191T2
Application number: DE69607191T
Authority: DE
Inventors: Louise Bacon; Alexander Green; Henry Jackson; Stuart Johnson; Richard Pope; Ronald Tempest; Elizabeth Thomson; John Vaughan; James Williams; Jane Wilton
Original assignee: Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-07
Publication date: 2000-09-28
Anticipated expiration: 2016-10-08
Also published as: ATE190650T1; AU7140596A; PT945464E; EP0853661B1; DE69607191D1; GR3033436T3; JP2000500643A; CA2233042A1; ATE199091T1; ES2156035T3; GB9620920D0; ES2146020T3; GB9601081D0; CA2599488A1; WO1997013844A1; DE69611766D1; AU702049B2; JP4387458B2; GB2305921B; EP0945464A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft spezifische Bindungselemente für menschlichen transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGFβ), sowie Materialien und Verfahren, die damit in Zusammenhang stehen. Im Speziellen betrifft sie spezifische Bindungselemente, die Human-Antikörper-Bindungsdomänen umfassen. Human-Antikörper gegen Human-TGFβ können isoliert und zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere fibrotischer Erkrankungen und auch Immun-/Entzündungserkrankungen, verwendet werden. Das Isolieren von Anti-Selbst-Antikörpern von auf Phagen freigelegten Antikörper-Segmentrepertoires wurde beschrieben (A. D. Griffiths et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993); A. Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994); A. D. Griffiths et al., EMBO J. 13, 3245-3260 (1994); C. Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10003-10007 (1993); WO93/11236). Die vorliegende Erfindung stellt jedoch spezifische Antikörper gegen bestimmte Isoformen von TGFβ bereit, Antikörper, die unerwartete und vorteilhafte Eigenschaften besitzen.
TGFβ ist ein Cytokin, das bekanntlich an vielen Zellvorgängen beteiligt ist, wie z. B. Zellvermehrung und -differenzierung, Embryonalentwicklung, extrazellulärer Matrixbildung, Knochenentwicklung, Wundheilung, Hämopoese sowie Immun- und Entzündungsreaktionen (A. B. Roberts & M. Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology, M. B. Sporn & A. B. Roberts (Hrsg.), Springer Heidelberg, S. 419-472 (1990); J. Massague et al., Annual Rev. Cell Biol. 6, 597-646 (1990)).
Die Ansammlung überschüssiger extrazellulärer Matrices ist mit verschiedenen Fibrosen verbunden. Daher besteht ein Bedarf an der Eindämmung von Wirksubstanzen wie TGFβ1 und TGFβ2, um deren schädliche Wirkungen bei solchen Erkrankungen zu verhindern, was eine Anwendung von Human-Antikörpern gegen Human-TGFβ ist.
Die Modulation von Immun- und Entzündungsreaktionen durch TGFβs umfasst (i) die Hemmung der Vermehrung aller T-Zellen-Untergruppen, (ii) Hemmwirkungen auf die Vermehrung und Funktion von B-Lymphozyten, (iii) Regulierung der natürlichen Killer- Zellaktivität und der T-Zellen-Reaktion, (iv) Regulierung der Zytokinproduktion durch Immunzellen, (v) Regulierung der Makrophagenfunktion und (vi) Leukozyten-Rekrutierung und Aktivierung.
Eine weitere Anwendung von Antikörpern gegen TGFβ kann jene bei der Behandlung von Immun-/Entzündungserkrankungen, wie z. B. primärchronischer Polyarthritis, sein, wo diese Funktionen eingedämmt werden müssen.
Es ist eine schwierige Aufgabe, ein Antikörperfragment zu isolieren, das für TGFβ derselben Spezies spezifisch ist. Tiere produzieren normalerweise keine Antikörper gegen Selbst-Antigene, ein Phänomen, das als Toleranz bezeichnet wird (G. J. Nossal, Science 245, 147-153 (1989)). Im Allgemeinen führt Impfen mit einem Selbstantigen nicht zur Produktion zirkulierender Antikörper. Es ist daher schwierig, Human-Antikörper gegen Human-Selbstantigene zu züchten. Außerdem bestehen auch ethische Probleme beim Impfen von Menschen. Im Zusammenhang mit dem Züchten von Nicht-Human-Antikörpern, die für TGFβ spezifisch sind, gibt es eine Anzahl von Problemen. TGFβ ist ein immunsuppressives Molekül, und weiters gibt es starke Sequenzkonservierung zwischen Human- und Mäuse-TGFβ-Molekülen. Mäuse- und Human-TGFβ1 unterschieden sich nur durch einen Aminosäurerest, einen Wechsel von Alanin (beim Menschen) zu Serin (bei Mäusen) an einem unzugänglichen Rest (R. Derynck et al., J. BioI. Chem. 261, 4377-4379 (1986)). Mäuse- und Human-TGFβ2 unterscheiden sich nur an drei Resten; Rest 59 (T bei Mäusen, S beim Menschen); Rest 60 (K bei Mäusen, R beim Menschen) und Rest 94 (N bei Mäusen; K beim Menschen). Das macht es schwierig, in Mäusen Antikörper gegen Human-TGFβ zu züchten. Weiters können alle gezüchteten Antikörper nur gegen einen eingeschränkten Satz von Epitopen gerichtet sein.
An Human-TGFβ1 und Human-TGFβ2 bindende polyklonale Antikörper sowohl gegen neutralisierende als auch nicht-neutralisierende Epitope sind in Kaninchen (Danielpour et al., Growth Factors 2, 61-71 (1989); A. Roberts et al., Growth Factors 3, 277-286 (1990)), in Hühnern (R&D Systems, Minneapolis) und in Truthähnen (Danielpour et al., J. Cell Physiol. 138, 79-86 (1989)) gezüchtet worden. Peptide, die partielle TGFβ-Se quenzen darstellen, sind auch als Immunogene zum Züchten neutralisierender polyklonaler Antiseren in Kaninchen verwendet worden (W. A. Border et al., Nature 346, 371- 374 (1990); K. C. Flanders, Biochemistry 27, 739-746 (1988); K. C. Flanders et al., Growth Factors 3, 34-52 (1990)). Zusätzlich gab es eingeschränkte Berichte über das Isolieren von monoklonalen Mäuse-Antikörpern gegen TGFβ. Nach der Immunisierung mit Rinder-TGFβ2 (identisch mit Human-TGFβ2), wurden drei nicht-neutralisierende monoklonale Antikörper isoliert, die für TGFβ1 und TGFβ2 spezifisch waren (J. R. Dasch et al.,). Immunol. 142, 1536-1541 (1989)). In einem anderen Bericht wurden nach der Immunisierung mit Human-TGFβ1 neutralisierende Antikörper isoliert, die entweder für TGFβ1 spezifisch waren oder mit TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3 kreuzreagierten (C. Lucas et al., J. Immunol. 145, 1417-1422 (1990)). Ein neutralisierender monoklonaler Mäuse- Antikörper, der sich sowohl an TGFβ2- als auch TGFβ3-Isoformen bindet, ist im Handel von Genzyme Diagnostics erhältlich.
Der vorliegende Text offenbart das erstmalige Isolieren von Human-Antikörpern, die gegen Human-TGFβ1 und gegen Human-TGFβ2 gerichtet sind. Ein monoklonaler Mäuse- Antikörper, der gegen Human-TGFβ1 gerichtet ist, ist von R&D Systems verfügbar. Dieser Antikörper bewirkt in einem Neutralisationsassay nur schwache Neutralisierung von TGFβ1. Neutralisierende monoklonale Mäuse-Antikörper sind auch von Mäusen produziert worden, die mit Human-TGFβ1-Peptiden immunisiert wurden, welche die Aminosäurepositionen 48 bis 60 (mit TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3 reaktiver Antikörper) und die Aminosäurepositionen 86-101 (für TGFβ1 spezifischer Antikörper; M. Hoefer & F. A. Anderer, Cancer Immunol. Immunother. 41, 302-308 (1995)) umfassen.
Phagen-Antikörper-Technologie (WO 92/01047; PCT/GB92/00883; PCT/GB92/01755; WO 93/11236) bietet die Möglichkeit, Human-Antikörper gegen Human-TGFβ direkt zu isolieren. In der Anmeldung WO 93/11 236 wurde das Isolieren von Anti-Selbst-Antikörpern aus Phagen-Freilegungssammlungen ("phage display libraries") geoffenbart, und es wurde vorgeschlagen, dass für TGFβ spezifische Antikörper aus Phagen-Freilegungssammlungen isoliert werden können.
Die vorliegende Anmeldung zeigt, dass Antikörper unterschiedlicher Spezifitäten für TGFβ-Moleküle isoliert werden können. TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3 sind eine eng verwandte Gruppe von Cytokinen. Sie sind Dimere, die aus zwei Monomeren mit 112 Aminosäuren bestehen, die über eine Zwischenketten-Disulfidbrücke verbunden sind. TGFβ1 unterscheidet sich von TGFβ2 durch 27 hauptsächlich konservative Änderungen und von TGFβ3 durch 22 hauptsächlich konservative Änderungen. Diese Unterschiede wurden mit der 3D-Struktur in Zusammenhang gebracht (M. Schlunegger & M. G. Grutter, Nature 358, 430-434 (1992)). Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben Antikörper isoliert, die hauptsächlich für TGFβ1 spezifisch sind (sehr schwache Kreuzreaktivität mit TGFβ2), Antikörper, die hauptsächlich für TGFβ2 spezifisch sind (sehr schwache Kreuzreaktivität mit TGFβ1); und Antikörper, die sich sowohl an TGFβ1 als auch TGFβ2 binden. Daher müssen diese drei verschiedenen Arten von Antikörpern, jeder Typ mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten, verschiedene Epitope an den TGFβ2- Molekülen binden: die Antikörper weisen schwache Kreuzreaktivität mit THFβ3 auf, wie durch Bindungsuntersuchungen unter Einsatz von Biosensorassays (z. B. BIACoreTM), ELISA und Radiorezeptorassays bewertet. Der am umfassendsten untersuchte Antikörper 6B1 IgG4 weist im Vergleich zu TGFβ2 eine unter Einsatz eines Biosensors ermittelte Kreuzreaktivität mit TGFβ3 von 9% auf, was anhand ihrer relativen Dissoziationskonstanten bestimmt wurde.
TGFβ-Isoformen werden zunächst als inaktive, latente Formen von Zellen exportiert (R. Pircher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 136, 30-37 (1986); L. M. Wakefield et al., Growth Factors 1, 203-218 (1989)). Diese inaktiven Formen werden durch Proteasen in Plasma aktiviert, um die aktive Form von TGFβ zu erzeugen. Es ist diese aktive Form von TGFβ2, die sich an Rezeptoren bindet, welche die Ablagerung extrazellulärer Matrix und die anderen biologischen Wirkungen von TGFβ fördert. Die aktive Form von TGFβ stellt einen relativ geringen Anteil an im Plasma befindlichem TGFβ dar. Daher sollte, damit ein neutralisierender Antikörper gegen TGFβ für die Verhinderung von Fibrose möglichst wirksam ist, der Antikörper die aktive, nicht aber die latente Form er kennen. In Beispiel 6 wird gezeigt, dass ein bevorzugter Antikörper gemäß vorliegender Erfindung ("6B1 IgG4") die aktive, nicht aber die latente Form von TGFβ2 erkennt.
Das Epitop von 6B1 IgG4 ist unter Einsatz einer Kombination aus Peptidfreilegungssammlungen und Inhibitionsuntersuchungen identifiziert worden, bei denen Peptide vom TGFβ2-Bereich verwendet wurden, die anhand von Phagen identifiziert wurden, die ausgehend von Peptidphagenfreilegungssammlung selektiert wurden. Dies wird in den Beispielen 11 und 14 beschrieben. Die aus der Peptidsammlung identifizierte Sequenz lautet RVLSL, und sie stellt die Aminosäuren 60 bis 64 von TGFβ2 dar (Beispiel 11). Es ist auch gezeigt worden, dass sich der Antikörper 6B1 IgG4 an ein Peptid bindet, das den Aminosäuren 56 bis 69 von TGFβ2 (TQHSRVLSLYNTIN) mit einer Drei-Aminosäure-Verlängerung (CGG) am N-Terminus entspricht. RVLSL ist das minimale Epitop, bei 6B1 IgG4 ist die Bindung an weitere angrenzende Aminosäuren wahrscheinlich. Tatsächlich können, wenn das Epitop dreidimensional ist, andere nicht-zusammenhängende Sequenzen vorhanden sein, an die sich der Antikörper bindet. 6B1 IgG4 zeigt viel schwächere Bindung an das Peptid, das den Aminosäuren 56 bis 69 von TGFβ1 entspricht (CGG-TQYSKVLSLYNQHN).
Die Ergebnisse von Beispiel 14 sprechen für die Zuordnung des Epitops von 6B1 IgG4 auf TGFβ2 zu den Aminosäuren im Bereich der Reste 60 bis 64. Das in diesen Beispiel verwendete Peptid (die Reste 56 bis 69) entspricht den Aminosäuren von α-Helix H3 (M. P. Schlunegger & M. G. Grutter, Nature 358, 430-434 (1992); auch bekannt als α3- Helix (S. Daopin et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 17, 176-192 (1993)). TGFβ2 bildet ein Kopf-zu-Schwanz-Dimer mit der α-Helix H3 (auch als Heel bezeichnet) einer Untereinheit, die eine Schnittstelle mit Fingerbereichen (einschließlich der Reste 24 bis 37 und von Resten im Bereich der Aminosäuren 91 bis 95; auch als Finger 1 und 2 bezeichnet) von der anderen Untereinheit bildet (S. Daopin et al., s. o.). Es ist vorgeschlagen worden, dass die primären strukturellen Merkmale, die mit dem TGFβ2- Rezeptor wechselwirken, aus Aminosäuren am C-terminalen Ende der α-Helix H3 einer Kette gemeinsam mit den Resten von Finger 1 und 2 der anderen Kette bestehen (D. L. Griffith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 878-883 (1996)). Die Identifizierung eines Epitops für 6B1 IgG4 innerhalb der α-Helix H3 von TGFβ2 steht in Einklang damit, dass 6B1 IgG4 die Rezeptorbindung verhindert und die biologische Aktivität von TGFβ2 neutralisiert.
Wie oben angeführt, können, wenn das Epitop für 6B1 IgG4 dreidimensional ist, andere nicht zusammenhängende Aminosäuren vorhanden sein, an die sich der Antikörper binden kann.
Es gibt frühere Hinweise, dass Antikörper, die gegen diesen Bereich von TGFβ2 gerichtet sind, möglicherweise für TGFβ2 spezifisch sind und dessen Aktivität neutralisieren. Flanders et al. (Development 113, 183-191 (1991)) haben gezeigt, dass polyklonale Antiseren gegen die Reste 50 bis 75 von reifem TGFβ2 in Kaninchen gezüchtet werden können und dass diese Antikörper TGFB2, aber in Western blots den TGFβ1 erkannten. In einer früheren Arbeit zeigten K. C. Flanders et al. (Biochemistry 27, 739-746 (1988)), dass in Kaninchen gezüchtete polyklonale Antikörper gegen die Aminosäuren 50 bis 75 von TGFβ2 die biologische Aktivität von TGFβ1 neutralisieren können. Der in dieser Anmeldung isolierte Antikörper 6B1 IgG4 ist ein Human-Antikörper, der gegen die Aminosäuren in diesem Bereich gerichtet ist, was die biologische Aktivität von Human- TGFβ2 neutralisiert. Es ist überraschend, dass ein solcher neutralisierender Antikörper gegen TGFβ2 bei Menschen (wo Immunisierung mit einem Peptid aus ethischen Gründen nicht eingesetzt werden kann) direkt aus einem Phagenfreilegungs-Antikörperrepertoire isoliert werden kann.
Das Wissen, dass die Reste der α-Helix H3 ein neutralisierendes Epitop für TGFβ2 bilden, bedeutet, dass Phagen freilegende, neutralisierende Antikörper durch Selektion aus Phagenantikörperrepertoires durch Bindung an ein Peptid aus diesem Bereich erhältlich sind, das an ein Trägerprotein, wie z. B. Rinderserumalbumin oder Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin, gekoppelt ist. Diese Ansatz kann eingesetzt werden, um Antikörper, die in der Lage sind, die biologische Aktivität von TGFβ1 zu neutralisieren, durch Selektion mittels Peptid TQYSKVLSLYNQHN, gebunden an ein Trägerprotein, zu selektieren. Es ist möglich, dass ein solcher Ansatz auf Peptide von Rezeptorbindungsbereichen von TGFβ-Isoformen ausgedehnt wird, die nicht die H3-α-Helix sind.
Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben weiters gezeigt, dass Antikörper, die für TGFβ spezifisch sind, durch Isolieren von Sammlungen erhältlich sind, die von verschiedenen Quellen von Immunglobulingenen abgeleitet sind: von Repertoires natürlicher variabler Immunglobulindomänen, z. B. von immunisierten oder nicht- immunisierten Wirten; und synthetischen Repertoires, die von Keimlinien V-Genen, kombiniert mit synthetischen CDR3s abgleitet sind. Die Eigenschaften dieser Antikörper im Einzelketten-Fv- und Gesamt-IgG4-Format werden beschrieben.
Wie oben angeführt, schlägt die WO 93/11236 vor, dass Human-Antikörper, die gegen Human-TGFβ gerichtet sind, aus Phagenfreilegungssammlungen isoliert werden können. Hierin wird gezeigt, dass die Phagenfreilegungssammlungen, aus denen Anti-Selbst-Antikörper in der WO 93/11236 isoliert wurden, als Quelle für Human-Antikörper dienen können, die für bestimmte TGFβ-Isoformen spezifisch sind. Beispielsweise wurden in Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung der für TGFβ1 spezifische Antikörper 1A-E5 und die für TGFβ2 spezifischen Antikörper 2A-H11 und 2A-A9 aus der "synthetischen Sammlung" isoliert, die in den Beispiel 5 bis 7 der WO 92/11236 und bei Nissim et al. (1994; s.o.) beschrieben wird. Außerdem war die Phagenfreilegungssammlung, die von Peripherblutlymphozyten (PBLs) eines nicht immunisierten Menschen stammte (Beispiele 1 bis 3 der WO 93/121236), die Quelle für den für RGFβ1 spezifischen Antikörper 1B2. Phagenfreilegungssammlungen, die in der Folge unter Einsatz von Antikörpergenen hergestellt wurden, die von Human-Mandeln und -Knochenmark abgeleitet wurden, stellen ebenfalls Quellen von für Human-TGFβ spezifischen Antikörpern dar. Daher ist Human-TGFβ ein Beispiel für ein Human-Selbst-Antigen, gegen das Antikörper aus "großen universellen Sammlungen" isoliert werden können. Human-Antikörper gegen Human-TGFβ mit verbesserten Eigenschaften kann durch Ketten-Shuffling erhalten werden, indem beispielsweise die VH-Domänen von aus einer Sammlung stammenden Antikör pern mit den VL-Domänen einer anderen Sammlung kombiniert werden, wodurch der Pool von für jede VH-Domäne getesteten VL-Partnern erweitert wird. Beispielsweise wird bei den Antikörpern 6B1, 6A5 und 6H1, die für TGFβ2 spezifisch sind, die 2A-H11 VH-Domäne, die aus der "synthetischen Sammlung" isoliert wurde, kombiniert mit einer Leichtkette aus der PBL-Sammlung eingesetzt.
Daher können die VH- und VL-Domänen von Antikörpern, die für TGFβ spezifisch sind, von Phagenfreilegungssammlungen bereitgestellt werden, die von umgeordneten V-Genen, wie z. B. jenen in PBLs, Mandeln und Knochenmark, und von V-Domänen, die von mit synthetischen CDRs kombinierten klonierten Keimlinien-V-Segmenten abgeleitet sind. Es wird auch gezeigt, dass es einen vielfältigen Bereich von Antikörpern gibt, die für TGFβ1 und TGFβ2 spezifisch sind. Bei den Antikörpern, die sowohl gegen TGFβ1 als auch TGFβ2 isoliert worden sind, sind hauptsächlich V-Gene eingesetzt worden, die von VH-Keimlinien der VH3-Familie stammen. Es ist eine gröβere Vielzahl von variablen Leichtkettenbereichen sowohl vom λ- als auch vom κ-Typ eingesetzt worden.
Einzelne Antikörper, die isoliert worden sind, weisen unerwarteterweise vorteilhafte Eigenschaften auf. Beispielsweise ist gezeigt worden, dass sich die Antikörper, die gegen TGFβ2 gerichtet sind (6H1, 6A5 und 6B1), mit langsamen Off-Raten an TGFβ2 binden (Off-Raten-Konstanten koff in der Größenordnung von 10&supmin;³ s&supmin;¹ Lind Dissoziationskonstanten von unter 10&supmin;&sup8; M), um die TGFβ2-Aktivität in Assays in vitro zu neutralisieren und bei Anwendungen in vivo wirksam zu sein. Es ist gezeigt worden, dass sich der Antikörper 6B1 IgG4 bei Immunhistochemie an Säugetiergeweben spezifisch an TGFβ2 bindet und nicht mit anderen Antigenen in menschlichem Gewebe kreuzreagiert. Die Eigenschaften dieser Antikörper können sie für therapeutische Anwendungen besonders geeignet machen. Die Tatsache, dass diese Antikörper die gleiche Schwerkette aufweisen, zeigt, dass VH-Domänen mit einer Anzahl verschiedener Leichtketten wirksam sein können, obwohl mit unterschiedlichen Leichtketten Unterschiede in der Potenz oder subtile Epitopänderungen vorliegen können. Wie in den Beispielen 3 und 4 und Tabellen 4 und 5 gezeigt, ist 6B1 IgG4 der wirksamste Antikörper beim Neutralisieren von TGFβ2-Aktivität im Radiorezeptorassay und im TF1-Proliferationsassay. Es ist jedoch zu erwarten, dass seine Eigenschaften qualitativ den Antikörpern 6A5 und 6H1 ähnlich sind, mit denen er eine VH-Domäne gemeinsam hat. Daher ist zu erwarten, dass die Reduktion der Nervenvernarbung, die bei der Behandlung mit 6A5-Einzelketten-Fv und 6H1 IgG4, wie in Beispiel 5 gezeigt, beobachtet wird, mit 6B1 reproduziert wird. Die gegen TGFβ1 (insbesondere 1B2 und seine Derivate) gerichteten Antikörper weisen ebenfalls unerwarteterweise vorteilhafte Eigenschaften auf. Es ist gezeigt worden, dass Antikörper 27C1/10A6, der durch Kettenshuffling, Spickung und Umwandlung in Gesamtantikörper-IgG4 von 1B2 abgeleitet wurde, in einem Vernarbungsmodell in vitro wirksam ist. Die VH-Domäne dieses Antikörpers wurde durch stellengerichtete "Spick"- Mutagenese vom Stammantikörper 7A3 abgeleitet. Es wurde eine große Anzahl gespickter Klone erhalten, die im In vitro-Assay ähnliche Eigenschaften aufweisen. Es kann im Vergleich zu 27C1 eine Anzahl von Änderungen im CDR3 des VH geben, beispielsweise unterscheidet sich 28A-H11 in 7 der 14 Positionen, von denen 2 nicht-konservative Änderungen sind. Daher können bis zu 50 0% der Reste im VH CDR2 geändert werden, ohne dass die Bindungseigenschaften betroffen sind.
Es ist gezeigt worden, dass für Human-TGFβ1 und Human-TGFβ2 spezifische Antikörper in Tiermodellen zur Behandlung fribrotischer und anderer Erkrankungen, wie z. B. primärchronischer Polyarthritis, wirksam sind, wo TGFβ überexprimiert wird. Es ist gezeigt worden, dass Antikörper gegen TGFβ bei der Behandlung von Glomerulonephritis (W. A. Border et al., Nature 346, 371-374 (1990)); Nervenvernarbung (A. Logan et al., Eur. J. Neurosci. 6, 355-363 (1994)); Hautvernarbung (M. Shah et al., Lancet 339, 213- 214 (1992); M. Shah et al., J. Cell Science 107, 1137-1157 (1994); M. Shah et al., 108, 985-1002 (1995)); Lungenfibrose (S. N. Gin et al., Thorax 48, 959-966 (1993)); Arterienschäden (Y. G. Wolf, L. M. Rasmussen & E. Ruoslahti, J. Clin. Invest. 93, 1172-1178 (1994)) und primärchronischer Polyarthritis (Wahl et al., J. Exp. Medicine 177, 225-230 (1993)) wirksam ist. Es ist darauf hingewiesen worden, dass TGFβ3 bei Hautvernarbung antagonistisch gegen TGFβ1 und TGFβ2 wirkt (M. Shah et al. (1995), s. o.). Daher sollten Antikörper gegen TGFβ1 oder TGFβ2 mit scheinbarer schwacher Kreuzreaktivität gegen TGFβ3, wie durch Bindungsstudien unter Einsatz von Biosensorassays (z. B. BIA- CoreTM), ELISA oder Radiorezeptorassay bewertet, wie in dieser Anmeldung geoffenbart, d. h. Antikörper, die sich im Vergleich zu TGFβ3 bevorzugt an TGFβ1 oder TGFβ2 binden, bei diesen oder anderen Zuständen, wie z. B. fibrotischen Zuständen, bei denen es wünschenswert ist, den Fibrose fördernden Wirkungen von TGFβ1 und TGFβ2 entgegenzuwirken, vorteilhaft sein. Ein Antikörper, der stark mit TGFβ3 kreuzreagiert, hat jedoch in einem Tiermodell für primärchronische Arthritis (Wahl et al. (1993), s. o.) starke Wirkung gezeigt.
Es ist wahrscheinlich, dass es zu den obengenannten Zuständen ebenso weitere Anwendungen gibt, wie es mehrere andere in vitro-Modelle von Erkrankungen gibt, wo sich Antikörper gegen TGFβ als vielversprechend bezüglich therapeutischer Wirksamkeit erwiesen haben. Von besonderer Wichtigkeit kann die Verwendung von Antikörpern gegen TGFβ zur Behandlung von Augenerkrankungen sein, die mit Okularfibrose verbunden sind, einschließlich proliferativer Retinopathie (R. A. Pena et al., siehe unten), Netzhautablösung und in der Postglaukom-Ableitungschirurgie (P. T. Khaw et al., Eye 8, 188- 185 (1994)). Connor et al. (J. Clin. Invest. 83, 1661-1666 (1989)) haben gezeigt, dass in Glaskörper-Auszügen von Patienten mit intraokularer Fibrose, die mit proliferativer Retinopathie verbunden ist, viel größere Mengen an TGFβ2 vorhanden waren als bei Patienten mit unkomplizierter Netzhautablösung ohne Okularfibrose, und dass die biologische Aktivität dieses TGFβ2 mit Antikörpern gegen TGFβ2 neutralisiert werden kann. Darüber hinaus haben Pena et al. (Invest. Opthalmology. Vis. Sci. 35, 2804-2808 (1994)) gezeigt, dass Antikörper gegen TGFβ2 die durch TGFβ2 stimulierte Kollagenkontraktion hemmen. Kontraktion des Glaskörpergels durch Fibroblasten und andere Zelttypen spielt eine entscheidende Rolle beim Erkrankungsverlauf der proliferativen Retinopathie, d. h. Vorgängen, von denen angenommen wird, dass sie durch TGFβ2 vermittelt werden.
Es gibt andere Indizien, die darauf hinweisen, dass TGFβ2 die wichtigste intraokulare Fibrose fördernde TGFβ-Isoform ist. Es ist gezeigt worden, dass TGFβ2 die vorherrschen de Isoform von TGFβ2 in der Nervennetzhaut, im Netzhautpigment-Epithelchoroid und im Glaskörper des menschlichen Auges ist (Pfeffer et al., Exp. Eye Res. 59, 323-333 (1994)) und ist in wässriger Lösung in Proben von menschlichen Augen zu finden, die Kataraktextraktion mit Intraokularlinsen-Implantation unterzogen wurden (Jampel et al., Current Eye Research 9, 963-969 (1990)). Nicht transformierte Human-Netzhautpigment-Epithelzellen sekretieren vorwiegend TGFβ2 (Kvanta, Opthalmic Res. 26, 361-367 (1994)).
Andere Erkrankungen, bei denen die Behandlung mit Antikörpern gegen TGFβ möglich ist, sind Respiratory-Distress-Syndrom bei Erwachsenen, Leberzirrhose, Postmyokardinfarkt, Post-Gefäßplastik-Restenose, Keloidvernarbung und Sclerodermie. Das erhöhte Ausmaß an Expression von TGFβ2 bei Osteoporose (Erlenbacher et al., J. Cel) Biol. 132, 195-210 (1996)) bedeutet, dass es sich dabei um eine Erkrankung handelt, die potentiell durch gegen TGFβ2 gerichtete Antikörper behandelbar ist.
Die Verwendung von Antikörpern gegen TGFβ zur Behandlung von Erkrankungen war bereits Gegenstand von Patentanmeldungen betreffend Fibrose (WO 91/04748); Hautvernarbung (WO 92/17206); Makrophagendefizienz-Erkrankungen (PCT/US93/00998); Makrophagen-Pathogeninfektionen (PCT/US93/02017); Nervenvernarbung (PCT/US93/ 03068); Gefäßerkrankungen (PCT/US93/03795); Verhinderung von Katharakten (WO 95/13827). Die in der vorliegenden Anmeldung geoffenbarten Human-Antikörper gegen Human-TGFβ sollten bei diesen Zuständen wertvoll sein.
Gemäß vorliegender Erfindung wird gezeigt, dass die Human-Antikörper sowohl gegen Human-TGFβ1 als auch gegen Human-TGFβ2 bei der Behandlung von Fibrose in Tiermodellen für Nervenvernarbung und Glomerulonephritis entweder im Einzelzellen-FV- oder Gesamt-Antikörper-Format wirksam sein können. Dabei handelt es sich um die erste Offenbarung der Wirksamkeit von Antikörpern, die nur gegen TGFβ2 gerichtet sind, als alleinige Behandlung bei diesen Indikationen, obwohl in einem Lungenfibrosemodell (Gin et al., Thorax 48, 959-966 (1993), s. o.) eine gewisse Wirksamkeit von Anti körpern gegen TGFβ2 nur beim Lungenfibrose-Modell beobachtet worden ist. Die Wirksamkeit der Human-Antikörper gegen Human-TGFβ bei der Behandlung von Fibrosen ist durch Messen einer Abnahme in der Anhäufung von Komponenten der extrazellulären Matrix, einschließlich Fibronectin und Laminin, in Tiermodellen ermittelt worden.
Der Beweis für die Wirksamkeit der Antikörper gegen TGFβ2 und TGβ1, wie hierin beschrieben, bei der Verhinderung von Nervenvernarbung im Tiermodellversuch legt nahe, dass diese Antikörper wahrscheinlich auch bei anderen Erkrankungszuständen, die durch TGFβ vermittelt werden, wirksam sind. Zum Vergleich ist gezeigt worden, dass von Truthähnen isolierte Antiseren, die gegen TGFβ-Isoformen gerichtet sind (Danielpour et al., Cell Physiol. 138, 79-86 (1989)) für die Verhinderung von Hautvernarbung (Shah et al., J. Cell Science 108, 985-1002 (1995)), Nervenvernarbung (Logan et al., s. o.) und bei in vitro-Versuchen in Bezug auf proliferative Retinopathie (Connor et al., s. o.) wirksam sind.

TERMINOLOGIE

"Spezifisches Bindungselement"

Dies beschreibt ein Element eines Paares von Molekülen, die Bindungsspezifität für einander aufweisen. Die Elemente eines spezifischen Bindungspaares können natürlichen Ursprungs oder vollständig oder teilweise synthetisch hergestellt sein. Ein Element des Paares von Molekülen weist einen Bereich an seiner Oberfläche oder einen Hohlraum auf, der sich spezifisch an eine bestimmte räumlich und polare Organisation des anderen Elements des Molekülpaares bindet und daher komplementär dazu ist. Daher haben die Elemente des Paares die Eigenschaft, sich spezifisch aneinander zu binden. Beispiele für Typen spezifischer Bindungspaare sind Antigen-Antikörper, Biotin-Avidin, Hormon-Hormonrezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat. Die vorliegende Anmeldung betrifft Reaktionen vom Antigen-Antikörper-Typ.

"Antikörper"

Dieser Begriff beschreibt ein Immunglobulin, das entweder natürlich oder teilweise oder vollständig synthetisch hergestellt ist. Der Begriff umfasst auch jedes Polypeptid oder Protein mit einer Bindungsdomäne, die eine Antikörper-Bindungsdomäne oder dazu homolog ist. Sie können natürlichen Ursprungs oder vollständig oder teilweise synthetisch hergestellt sein. Beispiele für Antikörper sind die Immunglobulin-Isotypen und deren Isotyp-Unterklassen; Fragmente, die eine Antigen-Bindungsdomäne umfassen, wie z. B. Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; sowie Diakörper.
Es ist möglich, unter Verwendung von monoklonalen und anderen Antikörpern DNA- Rekombinationstechniken einzusetzen, um andere Antikörper oder heterozygote Moleküle zu erzeugen, welche die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Derartige Verfahren können die Einführung von DNA, die für den variablen Bereich des Immunglobulins kodiert, - oder die Komplementarität bestimmenden Bereiche (CDRs) - eines Antikörpers in die konstanten Bereiche (oder die konstanten plus Rahmenbereiche) eines anderen Immunglobulins umfassen. Siehe beispielsweise EP-A-184.187, GB- A-2.188.638 oder EP-A-239.400. Ein Hybridom oder eine andere Antikörper produzierende Zelle kann genetischer Mutation oder anderen Änderungen unterzogen werden, welche gegebenenfalls die Bindungsspezifität der produzierten Antikörper verändern können.
Da Antikörper auf vielfältige Weise modifiziert werden können, sollte der Begriff "Antikörper" so ausgelegt werden, dass er jegliche spezifische Bindungselemente oder Substanzen mit einer Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität umfasst. Somit umfasst der Begriff auch Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließlich jeglicher Polypeptide, die eine Immunglobulin-Bindungsdomäne umfassen, gleichgültig, ob sie natürlich oder vollständig oder teilweise synthetisch sind. Daher sind auch heterozygote Moleküle enthalten, die eine Immunglobulin-Bindungsdomäne umfassen, oder ein Äquivalent dazu, die/das an ein anderes Polypeptid fusioniert ist. Klonierung und Expression von heterozygoten Antikörpern werden in der EP-A-0.120.694 und der EP-A-0.125.023 beschrieben.
Es ist gezeigt worden, dass Fragmente eines Gesamt-Antikörpers die Funktion der Bindung von Antigenen erfüllen können. Beispiele für Bindungsfragmente sind (i) das Fab- Fragment, das aus VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen besteht; (ii) das Fd-Fragment, das aus VH- und CH1-Domänen besteht; (iii) das Fv-Fragment, das aus VL- und VH-Domänen eines einzelnen Antikörpers besteht; (iv) das dAb-Fragment (E.S. Ward, et al., Nature 341, 544-546 (1989)), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) isolierte CDR-Bereiche; (vi) F(ab')2-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei verbundene Fab-Fragmente umfasst (vii) einkettige Fv-Moleküle (scFv), worin eine VH-Domäne und eine VL-Domäne über einen Peptidlinker miteinander verbunden sind, der ermöglicht, dass die beiden Domänen assoziieren, um eine Antigen-Bindungsstelle zu bilden (Bird et al., Science 242, 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)); (viii) bispezifische einkettige Fv-Dimere (PCT/US92/09965) sowie (ix) "Diakörper", mehrwertige oder multispezifische Fragmente, die durch Genfusion konstruiert werden (WO 94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993)).
Diakörper sind Multimere von Polypeptiden, wobei jedes Polypeptid eine erste Domäne, die einen Bindungsbereich einer Immunglobulin-Leichtkette umfasst, und eine zweite Domäne umfasst, die einen Bindungsbereich einer Immunglobulin-Schwerkette umfasst, wobei die beiden Domänen verbunden sind (z. B. durch einen Peptidlinker), aber nicht in der Lage sind, miteinander zu assoziieren, um eine Antigen-Bindungsstelle zu bilden: Antigen-Bindungsstellen werden durch die Assoziation der ersten Domäne eines Polypeptids innerhalb des Multimers mit der zweiten Domäne des anderen Polypeptids innerhalb des Multimers gebildet (WO 94/13804).
Wenn bispezifische Antikörper verwendet werden sollen, kann es sich dabei um herkömmliche bispezifische Antikörper handeln, die auf unterschiedliche Weise hergestellt werden können (P. Holliger und G. Winter, Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), z. B. chemisch oder aus Hybrid-Hybridomen hergestellt werden können, oder es kann sich um eines der obengenannten bispezifischen Antikörperfragmente handeln. Es kann bevorzugt werden, scFv-Dimere oder Diakörper anstelle von Gesamt-Antikörpern zu verwenden. Diakörper und scFv können ohne einen Fc-Bereich hergestellt werden, indem nur variable Domänen verwendet werden, wobei die Wirkungen von anti-idiotypischer Reaktion potentiell verringert werden. Andere Formen bispezifischer Antikörper umfassen die einkettigen "Janusins", wie von Traunecker et al., Embo Journal 10, 3655- 3659 (1991), beschrieben.
Bispezifische Diakörper, im Gegensatz zu bispezifischen Gesamt-Antikörpern, können auch besonders nützlich sein, weil sie leicht konstruiert und in E.coli exprimiert werden können. Diakörper (und viele andere Polypeptide, wie z. B. Antikörperfragmente) mit geeigneten Bindungsspezifitäten können leicht unter Einsatz von Phagenfreilegung (WO 94/13804) aus Sammlungen selektiert werden. Wenn ein Arm des Diakörpers konstant zu halten ist, beispielsweise mit einer Spezifität, die gegen Antigen X gerichtet ist, kann eine Sammlung, wo der andere Arm variiert wird, hergestellt und Antikörper mit geeigneter Spezifität selektiert werden.

"Antigen-Bindungsdomäne"

Dies beschreibt den Teil eines Antikörpers, der den Bereich umfasst, der sich spezifisch an einen Teil eines oder ein gesamtes Antigen bindet und komplementär dazu ist. Wenn ein Antigen groß ist, kann sich ein Antikörper nur an einen bestimmten Teil des Antigens binden, der als Epitop bezeichnet wird. Eine Antigen-Bindungsdomäne kann von einer oder mehreren variablen Antikörper-Domänen gebildet werden. Vorzugsweise umfasst eine Antigen-Bindungsdomäne einen variablen Antikörper-Leichtketten-Bereich (VL) und einen variablen Antikörper-Schwerketten-Bereich (VH).

"Spezifisch"

Dieser Begriff kann verwendet werden, um die Situation zu bezeichnen, in der ein Element eines spezifischen Bindungspaares keine signifikante Bindung an Moleküle mit Ausnahme seines/seiner spezifischen Bindungspartner(s) aufweist. Der Begriff ist auch anwendbar, wenn beispielsweise eine Antigen-Bindungsdomäne für ein bestimmtes Epi top spezifisch ist, das von einer Anzahl von Antigenen getragen wird, und in diesem Fall kann sich das spezifische Bindungselement, das die Antigen-Bindungsdomäne trägt, an die verschiedenen Antigene binden, die das Epitop tragen.

"Neutralisierung"

Das bezeichnet die Situation, in der die Bindung eines Moleküls an ein anderes Molekül zur Aufhebung oder Hemmung der biologischen Effektorfunktion des anderen Moleküls führt.
Eine Variante, ein Derivat oder eine Mutante eines Antikörper können durch Modifikation des Ausgangsmoleküls durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren oder durch Bindung eines anderen Moleküls erhalten werden. Die Änderungen können auf Nukleotid- oder Proteinebene durchgeführt werden. Beispielsweise kann das kodierte Polypeptid ein Fab-Fragment sein, das dann an einen Fc-Schwanz aus anderer Quelle gebunden wird. Alternativ dazu kann eine Markierung, wie z. B. ein Enzym, Fluorescein usw., angeknüpft werden.

"Umfassen"

Dieser Begriff wird allgemein im Sinn von "enthalten" verwendet, d. h. Ermöglichen des Vorhandenseins eines oder mehrerer Merkmale oder Komponenten.
Die vorliegende Erfindung stellt allgemein ein spezifisches Bindungselement bereit, das eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne umfasst. Im Speziellen stellt sie ein spezifisches Bindungselement für Human-TGFβ2 bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ein spezifisches Bindungselement bereit, das eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne umfasst, die für TGFβ2 spezifisch ist und schwache Kreuzreaktivität mit TGFβ3 aufweist. Die Kreuzreaktivität kann unter Anwendung eines oder aller der folgenden Assays bewertet werden: Biosensor (z. B. BIACoreTM), ELISA und Radiorezeptor. Die vorliegende Erfindung stellt ein spezifisches Bindungsele ment bereit, das eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne umfasst, die für Human-TGFβ2 spezifisch ist, der sich im Vergleich zu TGFβ3 bevorzugt an diese Isoform bindet.
Das spezifische Bindungselement kann in Form eines Antikörper-Fragments, wie z. B. Einzelketten-Fv (scFv), vorliegen. Andere Typen von Antikörper-Fragmenten können ebenfalls eingesetzt werden, wie z. B. Fab, Fab, F(ab')&sub2;, Fabc, Facb oder ein Diakörper (G. Winter & C. Milstein, Nature 349, 293-299 (1991); WO 94/13804). Das spezifische Bindungselement kann in Form eines Gesamt-Antikörpers vorliegen. Der Gesamt-Antikörper kann in einer der Formen von Antikörper-Isotypen, beispielsweise IgG, IgA, IgE und IgM, und einer der Formen von Isotyp-Unterklassen, z. B. IgG1 oder IgG4, vorliegen.
Das spezifische Bindungselement kann auch in Form eines durch Engineering hergestellten Antikörpers vorliegen, beispielsweise bispezifische Antikörpermoleküle (oder Fragmente wie F(ab')&sub2;), die einen Antigen-Bindungsarm (d. h. spezifische Bindungsdomäne) gegen TGFβ und einen weiteren Arm gegen eine andere Spezifität aufweisen. Tatsächlich können die spezifischen Bindungselemente, die gegen TGFβ1 und/oder TGFβ2 gerichtet sind, in einem bispezifischen Diakörper-Format kombiniert werden. Beispielsweise können die Antikörper 31G9, der gegen TGFβ1 gerichtet ist, und 6H1, der gegen TGFβ2 gerichtet ist, kombiniert werden, um ein einzelnes Dimer-Molekül mit beiden Spezifitäten zu ergeben.
Die Bindungsdomäne kann einen Teil einer oder eine gesamte VH-Domäne umfassen, für die ein Keimlinien-Gensegment oder ein umgeordnetes Gensegment kodiert. Die Bindungsdomäne kann einen Teil der oder die gesamte VL-κ-Domäne oder VL-λ-Domäne umfassen.
Für die Bindungsdomäne kann eine geänderte oder Varianten-Form eines Keimliniengens mit einer oder mehreren Nukleotidänderungen (Addition, Deletion, Substitution und/oder Insertion) kodieren, z. B. mit etwa oder weniger als etwa 25, 20, 15, 10 oder 5, 4, 3, 2 oder 1 Änderung(en), die in einem oder mehreren Rahmen und/oder CDRs vorliegen können.
Die Bindungsdomäne kann eine VH3-Gensequenz einer der folgenden Keimlinien: DP49-Keimlinie; DP53-Keimlinie; DP50-Keimlinie; DP46-Keimlinie; oder eine umgeordnete Form davon umfassen.
Eine bevorzugte VH-Domäne für Anti-TGFβ2-spezifische Bindungselemente gemäß vorliegender Erfindung ist 6H1 VH, deren Sequenz in Fig. 2(a)(i) gezeigt wird. 6H1 kann mit einer Vielzahl von VL-Domänen gepaart werden, wie hierin beispielhaft angeführt. Es können auch Aminosäuresequenzvarianten von 6H1 VH eingesetzt werden.
Das spezifische Bindungselement neutralisiert die Wirkung von TGFβ2 in vitro und/oder in vivo.
Das spezifische Bindungselement kann ein Antikörper mit hoher Affinität sein. Bevorzugte Affinitäten werden hierin an anderer Stelle erörtert.
Die Bindungsdomäne kann die 6H1 VH-Domäne umfassen, welche die in Fig. 2(a)(i) gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Die Bindungsdomäne kann eine VL-Domäne umfassen, die eine der in den Fig. 2(b)(i) bis (iii) gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist.
Das spezifische Bindungselement kann in Form von scFv vorliegen.
Eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne kann einen oder mehrere CDRs (Komplementaritätsbestimmungsbereiche) mit einer der in den Figuren gezeigten Aminosäuresequenz umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bindungs domäne eines oder mehrere der in den Figuren gezeigten CDRs CDR1, CDR2 und/oder CDR3, insbesondere eine der in Fig. 19 gezeigten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bindungsdomäne eine gezeigte VH CDR3-Sequenz, insbesondere wie in Fig. 19 gezeigt. Das spezifische Bindungselement kann alle oder einen Teil der Rahmenbereiche umfassen, die in den Figuren, insbesondere Fig. 19, als die CDRs flankierend oder dazwischen liegend gezeigt werden, oder andere Rahmenbereiche, die modifizierte Versionen der gezeigten umfassen.
So genanntes "CDR-Grafting", bei dem eine oder mehrere CDR-Sequenzen eines ersten Antikörpers innerhalb eines Rahmens von Sequenzen angeordnet werden, die nicht von diesem Antikörper stammen, z. B. von einem anderen Antikörper stammen, wird in der EP-B-0.239.400 geoffenbart.
Ein spezifisches Bindungselement, das eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne gemäß vorliegender Erfindung umfasst, kann eines sein, das mit einem beliebigen spezifischen Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 3 um Bindung konkurriert. Konkurrenz zwischen Bindungselementen kann leicht in vitro getestet werden, beispielsweise durch Markieren eines der Bindungselemente mit einem spezifischen Reportermolekül, das in Gegenwart eines oder mehrerer anderer unmarkierter Bindungselemente detektiert werden kann, um die Identifizierung spezifischer Bindungselemente zu ermöglichen, die sich an das gleiche Epitop oder ein überlappendes Epitop binden.
Bevorzugte spezifische Bindungselemente für TGFβ2 konkurrieren mit dem Antikörper 6B1, wie an anderer Stelle hierin detaillierter erörtert, um die Bindung an TGFβ2. Sie können das Epitop RVLSL oder ein Peptid binden, das die Aminosäuresequenz RVLSL umfasst, insbesondere ein Peptid, das eine α-Helix-Konfiguration annimmt. Sie können sich an das Peptid TQHSRVLSLYNTIN binden. Beim Testen darauf kann ein Peptid mit dieser Sequenz plus CGG am N-Terminus verwendet werden. Spezifische Bindungselemente gemäß vorliegender Erfindung können so beschaffen sein, dass ihre Bindung von TGFβ2 durch ein Peptid gehemmt wird, das RVLSL umfasst, wie z. B. ein Peptid mit der Sequenz TQHSRVLSLYNTIN. Beim Testen darauf kann ein Peptid mit dieser Sequenz plus CGG am N-Terminus verwendet werden.
TQHSRVLSLYNTIN entspricht der α-Helix H3 (Reste 56-69) von TGFβ2, wie an anderer Stelle hierin erörtert. Der dazu äquivalente Bereich in TGFβ1 entspricht der Sequenz TQYSKVLSLYNQHN. Anti-TGFβ1-Antikörper, die diesen Bereich binden, sind beispielsweise durch Panning eines Peptids mit dieser Sequenz (oder mit CGG am N-Terminus) gegen eine Phagenfreilegungssammlung erhältlich. Spezifische Bindungselemente, die das Peptid binden, könne anhand ihrer Bindung selektiert werden und können bezüglich TGFβ1-Aktivität neutralisierend wirken. Die Bindung solcher spezifischer Bindungselemente an TGFβ1 kann durch das Peptid TQYSKVLSLYNQHN (gegebenenfalls mit CGG am N-Terminus) gehemmt werden.
Ein spezifisches Bindungselement gemäß vorliegender Erfindung, das für TGFβ2 spezifisch ist, kann keine oder im Wesentlichen keine Bindung der latenten Form von TGFβ2 aufweisen, d. h. für die aktive Form von TGFβ2 spezifisch sein. In Beispiel 6 wird gezeigt, dass 6B1 diese Eigenschaft besitzt.
6B1 ist besonders geeignet für den therapeutischen Einsatz bei der Behandlung von Fibrosen, weil es die folgenden vorteilhaften Eigenschatten aufweist. 6B1 bindet sich an TGFβ2 mit einer Dissoziationskonstante von 2,3 nM in der einkettigen Form und 0,89 nM für die Gesamt-Antikörperform, 6B1 IgG4 (Beispiel 13). Der Antikörper 6B1 IgG4 neutralisiert die biologische Aktivität von TGFβ2 im Anti-Proliferationsassay (IC&sub5;&sub0; 2 nM; Beispiele 7 und 10) und in einem Radiorezeptorassay (IC&sub5;&sub0; unter 1 nM; Tabelle 6). Der Antikörper bindet sich an das Peptid TQHSRVLSLYNTIN (TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;) aus der α-Helix H3 von TGFβ2 und erkennt das entsprechende Peptid von TGFβ1 in geringerem Ausmaß. 6B1 erkennt die aktive, nicht jedoch die latente Form von TGFβ2 (Beispiel 6), erkennt TGFβ2 in Säugetiergewebe mittels ICC und zeigt keine nicht-spezifische Bindung an andere Human-Gewebe (Beispiel 12). Der Antikörper bindet sich gegenüber TGFβ3 bevorzugt an TGFβ2, wobei die Kreuzreaktivität mit TGFβ3 9% beträgt, was aus dem Verhältnis der Dissoziationskonstanten bestimmt wurde.
Die anderen in dieser Anmeldung beschriebenen Antikörper, welche die 6H1 VH-Domäne enthalten, 6H1 und 6A5, weisen ähnliche Eigenschatten auf. Deren Dissoziationskonstanten wurden mit 2 nM für 6H1 IgG4 (Beispiel 2) und 0,7 nM für das Einzelketten- Fv von 6A5 bestimmt (Tabelle 1). 6H1 IgG4 neutralisiert die biologische Aktivität von TGFβ2 mit IC&sub5;&sub0;-Werten von 12 bis 15 nM (Beispiele 7 und 10). 6A5 und 6H1 hemmen die Rezeptorbindung von TGFβ2 in einem Radiorezeptorassay mit IC&sub5;&sub0;-Werten von etwa 1 nM im Einzelketten-Fv-Format und 10 nM oder darunter im Gesamt-Antikörper-, d. h. IgG4-Format. Sowohl 6H1 IgG4 als auch 6A5 scFv erwiesen sich als wirksam bei der Prävention von Nervenvernarbung (Beispiel 5).
Daher werden zunächst gegen Human-TGFβ2 gerichtete Human-Antikörper bereitgestellt, die geeignete Eigenschaften für die Behandlung von Erkrankungen aufweisen, die durch das schädliche Vorhandensein von TGFβ2 gekennzeichnet sind. Derartige Antikörper neutralisieren TGFβ2 und weisen vorzugsweise eine Dissoziationskonstante für TGFβ2 von weniger als etwa 100 nM, mehr bevorzugt etwa 10 nM, insbesondere unter etwa 5 nM, auf. Die Antikörper binden sich gegenüber TGFβ3 bevorzugt an TGFβ2, weisen vorzugsweise weniger als 20% Kreuzreaktivität mit TGFβ3 (anhand des Verhältnisses der Dissoziationskonstanten gemessen) auf und zeigen insbesondere weniger als etwa 10% Kreuzreaktivität. Der Antikörper erkennt bevorzugt die aktive, nicht jedoch die latente Form von TGFβ2.
Bei Antikörpern gegen TGFβ1 sind die Eigenschaften, die gewünscht werden, damit ein Antikörper zur Behandlung von Fibrosen wirksam ist, ähnlich. Derartige Antikörper neutralisieren bevorzugt TGFβ1 und weisen eine Dissoziationskonstante für TGFβ1 von weniger als etwa 100 nM, mehr bevorzugt unter etwa 10 nM, insbesondere unter etwa 5 nM, auf. Die Antikörper binden sich gegenüber TGFβ3 bevorzugt an TGFβ1 und weisen vorzugsweise weniger als etwa 20% Kreuzreaktivität mit TGFβ3 (anhand des Verhält nisses der Dissoziationskonstanten gemessen) auf und zeigen insbesondere weniger als etwa 10% Kreuzreaktivität. Der Antikörper erkennt vorzugsweise die aktive, nicht jedoch die latente Form von TGFβ1. Der Antikörper 31G9 weist eine Dissoziationskonstante von 12 nM auf (Tabelle 5). Die Antikörper CS37 scFv und 27C1/10A6 IgG4 weisen IC&sub5;&sub0;-Werte in einem Radiorezeptorassay von 8 nM bzw. 9 nM auf, was auf eine Dissoziationskonstante im Bereich weniger Nanomol hinweist. Es wurde gezeigt, dass 27C1/10A6 IgG4 in einem Nervenvernarbungsmodell wirksam ist. Die Kreuzreaktivität der Antikörper der 1B2-Linie mit TGβ3 ist sehr schwach (Beispiel 9).
Zusätzlich zur Antikörpersequenz kann das spezifische Bindungselement auch andere Aminosäuren umfassen, die beispielsweise ein Peptid oder Polypeptid bilden, oder dem Molekül zusätzlich zur Fähigkeit, Antigen zu binden, eine weitere funktionelle Charakteristik verleihen.
Beispielsweise kann das spezifische Bindungselement eine Markierung, ein Enzym oder ein Fragment davon usw. umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Polynukleotid bereit, das für ein spezifisches Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 10 kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Konstrukte in Form von Plasmiden, Vektoren, Transkriptions- oder Expressionskassetten bereit, die zumindest ein obiges Polynukleotid umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine rekombinante Wirtszelle bereit, die ein oder mehrere obige Konstrukte umfasst.
Ein spezifisches Bindungselement gemäß vorliegender Erfindung kann durch Expression aus kodierender Nukleinsäure hergestellt werden. Nukleinsäure, die für ein beliebiges bereitgestelltes spezifisches Bindungselement kodiert, stellt selbst einen Aspekt der vor liegenden Erfindung dar, ebenso wie ein Verfahren zur Herstellung des spezifischen Bindungselements, wobei das Verfahren die Expression aus kodierender Nukleinsäure dafür umfasst. Die Expression kann zweckmäßig herbeigeführt werden, indem unter geeigneten Bedingungen rekombinante Wirtszellen kultiviert werden, welche die Nukleinsäure enthalten. Nach der Produktion durch Expression kann ein spezifisches Bindungselement unter Einsatz jeder geeigneten Technik isoliert und/oder gereinigt und dann auf geeignete Weise eingesetzt werden.
Spezifische Bindungselemente und dafür kodierende Nukleinsäuremoleküle und Vektoren gemäß vorliegender Erfindung können isoliert und/oder gereinigt bereitgestellt werden, beispielsweise aus ihrer natürlichen Umgebung, in im Wesentlichen reiner oder homogener Form oder - im Fall von Nukleinsäure - frei oder im Wesentlichen frei von Nukleinsäure oder Genen mit einem anderen Ursprung als die Sequenz, die für ein Polypeptid mit der erforderlichen Funktion kodiert. Nukleinsäure gemäß vorliegender Erfindung kann DNA oder RNA umfassen und kann ganz oder teilweise synthetisch sein. Der Begriff "Isolat" umfasst alle diese Möglichkeiten.
Die Nukleinsäure kann für eine der in beliebigen Figuren gezeigten Aminosäuresequenzen oder beliebige funktionell äquivalente Formen kodieren. Bei den eingesetzten Nukleotidsequenzen kann es sich um eine der in den Figuren gezeigten oder eine Variante, ein Allel oder ein Derivat davon handeln. Änderungen können im Nukleotidbereich durch Addition, Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotide vorgenommen werden, wobei sich diese Änderungen je nach Degeneration des genetischen Codes auf der Aminosäure-Ebene widerspiegeln können oder auch nicht.
Systeme zum Klonieren und Exprimieren eines Polypeptids in einer Vielzahl verschiedener Wirtszellen sind allgemein bekannt. Geeignete Wirtszellen sind Bakterien, Säugetierzellen, Hefe- und Baculovirus-Systeme. Säugetier-Zelllinien, die nach dem Stand der Technik zur Expression eines heterologen Polypeptids bekannt sind, sind China-Hams ter-Eierstockzellen, HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen und viele andere. Ein üblicher bevorzugter bakterieller Wirt ist E.coli.
Die Expression von Antikörpern und Antikörperfragmenten in prokaryotischen Zellen, wie z. B. E. coli, ist nach dem Stand der Technik allgemein bekannt. Ein Überblick findet sich beispielsweise bei A. Plückthun, Bio/Technology 9, 545-551 (1991). Die Expression in eukaryotischen Zellen in Kultur steht Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ebenfalls als Möglichkeit zur Produktion eines spezifischen Bindungselements zur Verfügung, wobei jüngere Berichte beispielsweise M. E. Reff, Curr. Opinion Biotech. 4, 573- 576 (1993), J. J. Trill et al., Curr. Opinion Biotech 6, 553-560 (1995), zu entnehmen sind.
Es können geeignete Vektoren gewählt oder konstruiert werden, die geeignete Regulationssequenzen enthalten, einschließlich von Promotorsequenzen, Terminatorsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen, Markergene und gegebenenfalls andere Sequenzen. Vektoren können gegebenenfalls Plasmide, virale z. B. Phagen oder Phagemid sein. Weitere Details siehe beispielsweise Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2. Auflage, Sambrook et al. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Viele bekannte Techniken und Vorschriften zur Manipulation von Nukleinsäure, beispielsweise zur Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression, sowie Analyse von Proteinen werden im Detail in Short Protocols in Molecular Biology, 2. Aufl., Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons (1992), beschrieben. Die Offenbarungen von Sambrook et al. sowie Ausubel et al. sind durch Verweis hierin aufgenommen.
Daher stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle bereit, die Nukleinsäure wie hierin geoffenbart enthält. Wieder ein anderer Aspekt stellt ein Verfahren bereit, das das Einbringen solcher Nukleinsäure in eine Wirtszelle umfasst. Für das Einbringen kann jede verfügbare Technik eingesetzt werden. Bei eukaryotischen Zellen sind geeignete Techniken Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran, Elektro poration, Lipsom-vermittelte Transfektion und Transduktion unter Einsatz von Retroviren oder anderen Viren, z. B. Vaccinia oder - bei Insektenzellen - Baculovirus. Bei bakteriellen Zellen sind geeignete Techniken beispielsweise Calciumchlorid-Transformation, Elektroporation und Transfektion unter Einsatz von Bakteriophagen.
Dem Einbringen kann das Herbeiführen oder Ermöglichen von Expression aus der Nukleinsäure, beispielsweise durch Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen zur Expression des Gens, folgen.
In einer Ausführungsform wird die Nukleinsäure gemäß vorliegender Erfindung in das Genom (z. B. Chromosom) der Wirtszelle integriert. Die Integration kann nach Standardtechniken durch Einschluss von Sequenzen erfolgen, welche die Rekombination mit dem Genom fördern.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, das die Verwendung eines Konstrukts, wie oben beschrieben, in einem Expressionssystem zum Exprimieren eines spezifischen Bindungselements oder obigen Polypeptids umfasst.
Nach der Herstellung eines spezifischen Bindungselements kann es beispielsweise auf eine der hierin geoffenbarten Arten verwendet werden, wie z. B. zur Formulierung einer Zusammensetzung, eines pharmazeutischen oder diagnostischen Produkts, wie z. B. eines Sets, das zusätzlich zum spezifischen Bindungselement ein oder mehrere Reagenzien zum Bestimmen der Bindung des Elements an Zellen, wie erörtert, umfasst. Eine Zusammensetzung kann zusätzlich zum spezifischen Bindungselement zumindest eine andere Komponente umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Pharmazeutika bereit, die ein obiges spezifisches Bindungselement, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Exzipienten, umfassen.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung eines obigen spezifischen Bindungselements zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Affektion vor, bei der es vorteilhaft ist, den Fibrose fördernden Wirkungen von TGFβ entgegenzuwirken. Die Affektion kann eine Fibrose sein, die durch eine Anhäufung von Komponenten der extrazellulären Matrix in einem Gewebe gekennzeichnet ist. Die Komponenten der extrazellulären Matrix können Fibronectin oder Laminin sein.
Die Affektion kann aus folgender Gruppe ausgewählt sein: Glomerulonephritis, Nervenvernarbung, Hautvernarbung, Augenvernarbung, Lungenfibrose, Arterienverletzung, proliferative Retinopathie, Netzhautablösung, Respiratory-Distress-Syndrom bei Erwachsenen, Leberzirrhose, Postmyokardinfarkt, Post-Gefäßplastik-Restenose, Keloidvernarbung, Sklerodermie, Gefäßerkrankungen, Katarakt, Glaukom, proliferative Retinopathie.
Die Affektion kann Nervenvernarbung oder Glomerulonephritis sein.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung eines obigen spezifischen Bindungselements zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Immun-/Entzündungserkrankungsaffektion bereit, bei der es vorteilhaft ist, den Wirkungen von TGFβ entgegenzuwirken. Beispiele für solche Affektionen sind primärchronische Polyarthritis, Makrophagendefizienz-Erkrankung und Makrophagenpathogen-Erkrankung.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, welches das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines obigen spezifischen Bindungselements an einen Patienten zur Behandlung einer Affektion umfasst, bei der es vorteilhaft ist, den Fibrose fördernden Wirkungen von TGFβ entgegenzuwirken. Fibrosen wurden zuvor angeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, welches das Verabreichen einer prophylaktisch wirksamen Menge eines obigen spezifischen Bindungselements an einen Patienten zur Verhinderung einer Affektion umfasst, bei der es vorteilhaft ist, die Fibrose fördernden Wirkungen von TGFβ zu verhindern. Fibrosen wurden zuvor angeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren bereit, die das Verabreichen prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksamer Mengen eines obigen spezifischen Bindungselements an Patienten zur Vorbeugung gegen eine oder Behandlung einer Immun-/Entzündungserkrankungsaffektion umfasst, bei der es vorteilhaft ist, den Wirkungen von TGFβ entgegenzuwirken. Beispiele für Affektionen sind oben angeführt.
Somit liefern verschiedene Aspekte der Erfindung Behandlungsverfahren, welche die Verabreichung eines bereitgestellten spezifischen Bindungselements umfassen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein solches spezifisches Bindungselement umfassen, sowie die Verwendung eines solchen spezifischen Bindungselements zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung, beispielsweise in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welches das Formulieren des spezifischen Bindungselements mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.
Gemäß vorliegender Erfindung können bereitgestellte Zusammensetzungen an Individuen verabreicht werden, wobei es sich um beliebige Säugetiere, insbesondere Nagetiere, z. B. Mäuse, Pferde, Schweine, Schafe, Ziegen, Rinder, Hunde, Katzen oder Menschen, handeln kann. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer "therapeutisch wirksamen Menge", wobei es sich um eine Menge handelt, die ausreicht, um bei einem Patienten positive Wirkung zu zeigen. Ein solche positive Wirkung kann zumindest die Linderung von zumindest einem Symptom sein. Die tatsächlich verabreichte Menge sowie die Rate und der Zeitverlauf der Verabreichung hängen von der Art und der Schwere der behandelten Affektion ab. Die Verschreibung der Behandlung, z. B. Entscheidungen bezüglich Dosierung usw., liegen im Verantwortungsbereich des praktischen Arztes und anderer Spezialisten. Geeignete Antikörperdosen sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt; siehe J. A. Ledermann et al., Int. J. Cancer 47, 659-664 (1991); K. D. Bagshawe et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4, 915-922 (1991).
Eine Zusammensetzung kann allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen, je nach zu behandelnder Affektion, entweder gleichzeitig oder nacheinander verabreicht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung können zusätzlich zum Wirkbestandteil einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere Materialien enthalten, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind. Derartige Materialien sollten nicht-toxisch sein und sollten die Wirksamkeit des Wirkbestandteils nicht negativ beeinflussen. Die genaue Beschaffenheit des Trägers oder anderen Materials hängt vom Weg der Verabreichung ab, die oral oder durch Injektion, z. B. intravenös, erfolgen kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können in Tabletten-, Kapsel-, Pulver oder flüssiger Form vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger, wie z. B. Gelatine, oder ein Adjuvans, umfassen. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen allgemein einen flüssigen Träger, wie z. B. Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische Salzlösung, Dextrose oder andere Saccharidlösungen oder Glykole, wie z. B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, können enthalten sein.
Zur intravenösen Injektion oder Injektion an der befallenen stelle liegt der Wirkbestandteil in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vor, die pyrogenfrei ist und geeignete(n) pH, Isotonie und Stabilität aufweist. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sind durchaus in der Lage, geeignete Lösungen herzustellen, indem beispielsweise isotonische Vehikel, wie z. B. Natriumchlorid-Injektionslösung, Ringer-Injektionslösung, Laktierte Ringer-Injektionslösung eingesetzt werden. Konservierungsmittel, Stabilisato ren, Puffer, Antioxidantien und/oder andere Additive können gegebenenfalls auch enthalten sein.
Weitere Aspekte der Erfindung und Ausführungsformen werden Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar sein. Damit die vorliegende Erfindung vollständig verstanden wird, seien nur zur Veranschaulichung, nicht jedoch als Einschränkung, die nachfolgenden Beispiele angeführt.
Es wird auf die folgenden Figuren verwiesen.
Fig. 1 zeigt die DNA- und Proteinsequenzen von Antikörpern, die für TGFβ1 spezifisch sind. Fig. 1(a) zeigt die Aminosäure und kodierenden Nukleinsäuresequenzen von variablen Antikörper-Domänen von Antikörpern gegen TGFβ1, die direkt aus Repertoires isoliert wurden: Fig. 1(a)(i) - 1B2 VH (auch als 7A3 VH bekannt); Fig. 1(a)(ii) - 31G9 VH; Fig. 1(a)(iii) - 31G9 VL. Fig. 1(B) zeigt die Sequenz der Aminosäure und jene der kodierenden Nukleinsäuresequenz von variablen Antikörper-Leichtketten-Domänen von Antikörpern gegen TGFβ1, die durch Ketten-Shuffling isoliert wurden; Fig. 1(b)(i) - 7A3 VL, Fig. 1(b)(ii) - 10A6 VL. Fig. 1(c)(i) zeigt die Aminosäure- und die kodierende Nukleinsäuresequenz für 27C1 VH von einem Antikörper gegen TGFβ1, der aus einem CDR3-Spikingversuch isoliert wurde.
Fig. 2 zeigt die DNA und Proteinsequenzen von Antikörpern, die für TGFβ2 spezifisch sind. Fig. 2(a) zeigt Aminosäure- und kodierende Nukleinsäuresequenzen für variable Domänen von Antikörpern gegen TGFβ2, die direkt aus Repertoires isoliert wurden; Fig. 2(a)(i) - 2A-H11 VH (auch als 6H1 VH bekannt); Fig. 2(a)(ii) - 2A-A9 VH (auch als 11E6 VH bekannt). Fig. 2(b) zeigt Aminosäure- und kodierende Nukleinsäuresequenzen von variablen Antikörperdomänen von Antikörpern, die für TGFβ2 spezifisch sind, isoliert nach Kettenshuffling: Fig. 2(b)(i) - 6H1 VL; Fig. 2(b)(ii) - 6A5 VL; Fig. 2(b)(iii) - 6B1 VL; Fig. 2(b)(iv) 11E6 VL; (v) Fig. 2(b)(v) - 14 F12 VL.
Fig. 3 zeigt die Proteinsequenzen von VH CDR3 von Klonen, die durch "Spickungs"- Mutagenese von 1B2 abgeleitet wurden. Die Unterschiede zu 1B2 VH CDR3 sind fett gedruckt.
Fig. 4 zeigt die DNA und Proteinsequenz der VH- und VL-Domänen von VT37, die zwischen TGFβ1 und TGFβ2 kreuzreaktiv sind.
Fig. 5 zeigt die DNA-Sequenz und kodierte Aminosäuresequenz im Bereich des Schwerketten-VH-Leaders vom Vektor vhcassette 2. Die Restriktionsenzyme HindIII, SfiI, PstI, BstEII, BamHI und EcoRI spalten an den angegebenen Punkten.
Fig. 9 zeigt eine Karte von Vektor pG4D100 (nicht im Maßstab). Mehrfachklonierungsstelle (MCS): 5'-HindIII-PacI-BamHI-(XanI)-(PmlI)-(NheI)-AscI-(BssHII)-XhoI-PmeI-BsiWI- 3'. In Klammern gezeigte Restriktionsstellen sind nicht einzigartig.
Fig. 7 zeigt die DNA-Sequenz, einschließlich Intron, und kodierte Aminosäuresequenz im Bereich des Leichtketten-VL-Leaders für den Vektor vlcassettel (vlcassette CAT1). Die Restriktionsenzyme HindIII, ApaLI, SacI, XhoI und BamHI spalten an den angegebenen Stellen (ApaLIi innerhalb des Leaders).
Fig. 8 zeigt eine Karte von Vektor pLN10 (nicht im Maßstab). Mehrfachklonierungsstelle (MCS): 5'-HindIII-(SphI)-(PstI)-SalI-XbaI-BamHI-3' (1224-1259). In Klammern gezeigte Restriktionsstellen sind nicht einzigartig.
Fig. 9 zeigt eine Karte von Vektor pKN100 (nicht im Maßstab). Mehrfachklonierungsstelle (MCS): 5'-MluI-(AvaI)-HindIII-(SphI)-(PstI)-SalI-XbaI-BamHI-3'. In Klammern gezeigte Restriktionsstellen sind nicht einzigartig.
Fig. 10 zeigt die prozentuelle Neutralisierung der TGFβ2-Aktivität durch Einzelketten- Fv-Antikörper in einem Assay unter Einsatz der Vermehrung der Erythroleukämie-Zelllinie TF1 bei unterschiedlichen nM-Konzentrationen von scFv.
Fig. 11 zeigt die Neutralisierung von TGFβ2-Aktivität durch Gesamt-IgG4-Antikörper in einem Assay unter Einsatz der Vermehrung der Eurythroleukämie-Zelllinie TF1 bei unterschiedlichen nM-Konzentrationen der Antikörper.
Fig. 12 zeigt die Wirkung der Behandlung von Tieren mit Antikörpern auf Nervenvernarbung, gemessen anhand der Ablagerung von Fibronectin (Fig. 12(a)) und Laminin (Fig. 12(b)), die mittels der integrierten Fluoreszenzintensität detektiert wird. Die grafischen Darstellungen zeigen Streuungsplots von Datenpunkten für einzelne Tiere. Das Balkendiagramm zeigt die mittlere integrierte Fluoreszenzintensität der Gruppe.
Fig. 13 zeigt die Ergebnisse eines ELISA zum Messen der Kreuzreaktivität der Antikörper 6B1 IgG4 und 6A5 IgG4 mit TGFβ-Isoformen und nicht-spezifischen Antigenen. Fig. 13(a) zeigt die Kreuzreaktivität von 6B1 IgG4 auf eine Reihe nicht-spezifischer Antigene und TGFβs, wobei die OD bei 405 nm für jedes Antigen aufgetragen ist. 1 - Interleukin 1; 2 - Human-Lymphotoxin (TNFβ); 3 - Human-Insulin; 4 - Human-Serumalbumin; 5 - ssDNA; 6 - Oxazolon-Rinderserumalbumin; 7 - Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin; 8 - Hühnereiweiß-Trypsininhibitor; 9 - Chymotrypsinogen; 10 - Cytochrom C; 11 - GADPH; 12 - Eialbumin; 13 - Hühnerei-Lysozym; 14 - Rinderserumalbumin; 15 - TNFα, 16 - TGFβ1; 17 - TGFβ2; 18 - TGFβ3; 19 - nur PBS. Fig. 13(b) zeigt die OD bei 405 nm für den Antikörper 6A5 IgG4 gegen die gleiche Reihe von Antigenen. Sowohl in Fig. 13 (a) als auch Fig. 13(b) wurden die Antigene 1 bis 15 verwendet, um die Platte mit einer Konzentration von 10 ug/ml in PBS zu beschichten. Die TGFβs wurden mit 0,2 ug/ml in PBS beschichtet. Die Beschichtung erfolgte bei 4ºC über Nacht. Pro Napf wurden 100 ug jedes Antigens und Doppelansätze jedes Antigens für jedes zu testende IgG eingesetzt. IgG-Proben wurden mit den beschichteten Antigenen bei 37ºC 2 h lang nach dem Blockieren mit 2% Marvel-PBS inkubiert. Der markierte zweite Antikörper war ein Mäuse-Anti-Human-Fc1-alkalische Phosphatase-Konjugat, und das zum Detektieren von gebundenem zweiten Antikörper eingesetzte Substrat war PNPP (1 mg/ml), wobei das Absorptionsvermögen bei 405 nm abgelesen wurde.
Fig. 14 zeigt die Aminosäuresequenz und jene der kodierenden Nukleinsäure für die VL-Domäne des TGFβ1-spezifischen Antikörpers CS37.
Fig. 15 zeigt Daten eines ELISA, bei dem die Bindung von 6B1 IgG4 an BSA, konjugiert entweder mit Peptid TGFβ&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; oder Peptid TGFβ1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;, auf eine ELISA-Platte aufgetragen, detektiert wird. 6B1 IgG4 wurde in unterschiedlichen Konzentrationen (ug/ml) inkubiert und das Absorptionsvermögen bei 405 nm nach Zusatz der Detektionsmittel gemessen. OD 405 nm-Ergebnisse sind für die verschiedenen Konzentrationen für BSA- TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; ("β2-Peptid" - Rauten) und BSA-TGFβ1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; (β1-Peptid - Quadrate) aufgetragen.
Fig. 16 zeigt die prozentuelle Neutralisation der TGFβ2-Anti-Proliferationswirkung auf TF1-Zellen durch Gesamt-Antikörper, 6H1 IgG4, 6B1 IgG4 und den monoklonalen Mäuse-Antikörper von Genzyme in unterschiedlichen Konzentrationen (nM IgG).
Fig. 17 zeigt die prozentuelle Neutralisation der TGF-β1-Anti-Proliferationswirkung auf TF1-Zellen durch Gesamt-Antikörper, 6H1 IgG4, 6B1 IgG4 und den monoklonalen Mäuse-Antikörper von Genzyme in unterschiedlichen Konzentrationen (nM IgG).
Fig. 18 zeigt die prozentuelle Neutralisation der TGFβ3-Anti-Proliferationswirkung auf TF1-Zellen durch Gesamt-Antikörper, 6H1 IgG4, 6B1 IgG4 und den monoklonalen Mäuse-Antikörper von Genzyme in unterschiedlichen Konzentrationen (nM IgG).
Fig. 19 zeigt Aminosäure- und kodierende DNA-Sequenzen von Bereichen von Antikörpern, die gegen TGFβ2 gerichtet sind, wobei CDR-Sequenzen kursiv gedruckt sind: Fig. 19(i) 2A-H11 VH (auch als 6H1 VH bekannt); Fig. 19(ii) 6B1 VL; Fig. 19(iii) 6A5 VL und Fig. 19(iv) 6H1 VL.
Fig. 20 zeigt den Vektor p6H1 VH-γ4 (7263 bp). Das für 6H1 VH kodierende Gen ist als HindIII-ApaI-Restriktionsfragment insertiert.
Fig. 21 zeigt den Vektor p6B1λ (10151 bp). Das für 6B1 VL kodierende Gen ist als EcoRI-BstBI-Restriktionsfragment insertiert.
Fig. 22 zeigt den Vektor p6B1γ4gs (14176 bp). Die Gene, die für die Schwer- und Leichtketten von 6BI IgG4 kodieren, sind in einem einzigen Vektor kombiniert.
Fig. 23 zeigt die Ergebnisse von Kompetitions-ELISA-Versuchen, wie in Beispiel 6 beschrieben. Nach der Inkubation über Nacht mit TGβ2 wurden die Platten mit den folgenden Lösungen 1 bis 4 behandelt (die Nummer entspricht jener in der Figur): 1-400 ul Hams F12/DMEM (Reagens leer), 2-400 ul Hams F12/DMEM plus 4 ug 6B1 IgG4- Antikörper (positiver Vergleich), 3-400 ul unbehandeltes konditioniertes PC3-Medium plus 4 ug 6B1 IgG4-Antikörper (latente TGFβ&sub2;-Probe), 4-400 ul säureaktiviertes konditioniertes PC3-Medium plus 4 ug 6B1 IgG4-Antikörper (aktive TGFβ2-Probe).
Alle hierin erwähnten Dokumente sind durch Verweis hierin aufgenommen.

Liste der Beispiele

Beispiel 1 - Isolierung von für TGFβ1 spezifischen Antikörpern, für TGFβ2 spezifischen Antikörpern und für TGFβ1 und TGFβ2 spezifischen Antikörpern.
Beispiel 2 - Konstruktion von Zelllinien, die Gesamt-Antikörper exprimieren.
Beispiel 3 - Neutralisation der TGFβ-Aktivität durch Antikörper, bewertet unter Einsatz von In vitro-Assays.
Beispiel 4 - Inhibierung durch Antikörper von TGFβ, die sich an Rezeptoren binden. Beispiel 5 - Verhinderung von Nervenvernarbung unter Einsatz von Antikörpern gegen TGFβ.
Beispiel 6 - Bestimmung der Bindung von 681 IgG4 an aktive oder latente Form von TGFβ&sub2;.
Beispiel 7 - Neutralisation der Hemmwirkung von TGFβ-Isoformen auf die Zellproliferation durch gegen TGFβ2 gerichtete Antikörper.
Beispiel 8 - Hemmung der Bindung anderer TGFβ-Isoformen an Rezeptoren durch gegen TGFβ2 gerichtete Antikörper, gemessen mittels Radiorezeptorassay.
Beispiel 9 - Bewertung von TGFβ1-Antikörpern bezüglich potentieller therapeutischer Verwendung.
Beispiel 10 - Konstruktion einer stark exprimierenden Zelllinie für 6B1 IgG4 unter Einsatz des Glutamin-Synthase-Selektionssystems und Bewertung in einem Neutralisationsassay.
Beispiel 11 - Bestimmung des Epitops auf TGFβ2 für den Antikörper 6B1 unter Einsatz einer Peptid-Phagenfreilegungssammlung.
Beispiel 12 - Bestimmung der Bindung von 6B1 IgG4 an Gewebe durch Immuncytochemie (ICC).
Beispiel 13 - Bestimmung der kinetischen Parameter von 6B1 IgG4 und Einzelketten-Fv bei der Bindung an TGFβ2.
Beispiel 14 - Bindung eines Peptids, das den Resten 56 bis 69 von TGFβ2 entspricht, an 6B1 IgG4.

BEISPIEL 1

Isolierung und Charakterisierung von Antikörpern, die sich an TGFβ1 und TGFβ2 binden

1. Identifizierung und Charakterisierung von Antikörpern gegen Human-TGFβ-1 durch Selektion naiver und synthetischer Phagenantikörper-Repertoires

Antikörper-Repertoires

Die folgenden Antikörper-Repertoires wurden eingesetzt:
1. Peripherblut-Lymphozyten-(PBL-)Sammlung: von nicht immunisierten Menschen (J. D. Marks, H. R. Hoogenboom, T. P. Bonnert, J. McCafferty, A. D. Griffiths & G. Winter, J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991))
2. Synthetische Sammlung: (A. Nissim, H. R. Hoogenboom, I. M. Tomlinson, G. Flynn, C. Midgley, D. Lane und G. Winter, EMBO J. 13, 692-698 (1994)), von klonierten Human-Keimlinien-VH-Genen und synthetischen CDR3s mit einer fixen Leichtkette
3. Mandelsammlung: von den Mandeln eines nicht immunisierten Menschen. Mandel- B-Zellen wurden aus frisch entfernten (innerhalb von 2 h verarbeiteten) ganzen Mandeln isoliert, die vom Adenbrookes Hospital, Hills Road, Cambridge, U. K. zur Verfügung gestellt wurden. Die Mandeln wurden in eine Petrischale eingelegt, die 5 ml PBS enthielt, und mit einer Skalpellklinge zerkleinert, um die Zellen freizusetzen. Die Suspension wurde in ein frisches Röhrchen übertragen und große Bruchstücke 5 min lang unter Schwerkrafteinwirkung absetzen gelassen. Die Zellsuspension wurde dann auf 10 ml Lymphoprep in einem 50 ml Polypropylenröhrchen (Falcon) geschichtet, bei 1000 · g 20 min lang bei Raumtemperatur zentrifugiert (ungebremst) und Zellen an der Grenzfläche mit einer Glaspipette gewonnen. Diese wurden auf ein Endvolumen von 50 ml in RPMI-Medium bei 37ºC verdünnt und bei 500 · g 5 min lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen weitere zweimal mit RPMI gewaschen.
Polyadenylierte RNA wurde aus pelletierten Zellen unter Verwendung des "QuickprepTM mRNA Kit" (Pharmacia Biotech, Milton Keynes, U. K.) hergestellt. Der gesamte Output an Zellen von einer Mandel (etwa 1 · 10&sup6; Zellen) wurde unter Verwendung einer Oligo (dT)-Cellulose-Spun-Säule genau wie in der beigefügten Vorschrift behandelt. mRNA wurde wie beschrieben mit Ethanol gefällt und in 40 ml Rnase-freiem Wasser resuspendiert.
Die cDNA-Synthesereaktion wurde unter Einsatz des "First-Strand cDNA Synthesis Kit" (Pharmacia Biotech, Milton Keynes, U. K.) wie folgt durchgeführt:
RNA 20 ul (10 min lang vor Verwendung auf 67ºC erhitzt)
Erststrang-Puffer 11 ul
DTT-Lösung 1 ul
pd(N)&sub6;-Primer 1 ul
Nach vorsichtigem Vermischen wurde die Reaktion 1 h lang bei 37ºC inkubiert.
Human-VH-Gene wurden aus Mandel-cDNA amplifiziert, wobei die neun Rückwärts- Primer auf Familienbasis (VH 1b/7a-6a Back-Sfi, die eine Sfi I-Stelle am 5'-Ende einführen; Tabelle 1) gemeinsam mit einem äquimolaren Gemisch der vier JH-Vorwärts-Primer (JH 1-2, 3, 4-5, 6, for; Marks et al. (1991), s. o.). So wurden 9 primäre PCR-Amplifikationen durchgeführt. Jedes Reaktionsgemisch (50 ul) umfasste 2 ul cDNA-Templat, 25 pmol Rückwärts-Primer, 25 umol Vorwärts-Primer, 250 uM dNTPs, 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, und 2,5 um Taq-Polymerase (Boehringer). Das Reaktionsgemisch wurde mit Mineral-(Paraffin-)Öl überlagert und unter Verwendung eines Techne-Thermocyclers 30 Zyklen unterzogen (90ºC für 1 min. 55ºC für 1 min. 72ºC für 1 min). Die Produkte wurden auf einem 1% (w/v) Agarosegel gereinigt, vom Gel unter Verwendung von "Geneclean" (Bio 101 Inc.) isoliert und in 15 ul Wasser resuspendiert. Die amplifizierten VH-Gene wurden durch PCR-Assemblierung (Marks et al. (1991), s. o.) gemeinsam mit dem (Gly&sub4;, Ser)&sub3;-Linker (J.S. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-83 (1988)) mit Human-VL-Genen rekombiniert, die von PBLs abgeleitet waren (Marks et al. (1991), s. o.). Die VH-Linker-VL-Antikörperkonstrukte wurden in die SfiI- und NotI-Stellen des Phagemidvektors pCANTAB6 kloniert (J. McCafferty, et al., Appl. Biochem. Biotech. 47, 157-173 (1994)), was eine Sammlung von 6 · 10&sup7; Klonen ergab.
4. Große Einzelketten-Fv-Sammlung: von Lymphoidgeweben, einschließlich von Mandeln, Knochenmark und Peripherblut-Lymphozyten.
Polyadenylierte RNA wurde unter Einsatz des "Quickprep mRNA Kit" (Pharmacia) aus den B-Zellen verschiedener Lymphgewebe von 43 nicht-immunisierten Spendern erhalten. Erststrang-cDNA wurde aus mRNA unter Verwendung eines "Erststrang-cDNA-Synthese"-Sets (Pharmacia) synthetisiert, wobei statistische Hexamere zum Primen der Synthese eingesetzt wurden. V-Gene wurden unter Verwendung familienspezifischer Primer für VH-, Vκ und Vλ-Gene amplifiziert, wie zuvor beschrieben (Marks et al., s. o.) und in der Folge durch PCR-Assemblierung mit dem (Gly&sub4;, Ser)&sub3;-scFv-Linker rekombiniert. Die VH-Linker-VL-Antikörperkonstrukte wurden in die Sfi I- und Not I-Stellen des Phagemidvektors pCANTAB 6 kloniert. Ligation, Elektroporation und Ausplattieren der Zellen erfolgte wie zuvor beschrieben (Marks et al., s. o.). Die Sammlung wurde gegenüber der zuvor beschriebenen etwa 1000fach vergrößert, indem die eingesetzten Mengen an Vektor und Insert erhöht wurden und Mehrfach-Elektroporationen durchgeführt wurden. Dies erzeugte ein scFv-Repertoire, das Berechnungen zufolge etwa 1,3 · 10¹&sup0; einzelne Rekombinationen aufwies, von denen durch Bst NI-Fingerprinting gezeigt wurde, dass sie extrem divers waren.

a) Induktion von Phagenantikörper-Sammlungen

Die vier verschiedenen obigen Phagenantikörper-Repertoires wurden bezüglich Antikörper gegen TGFβ-1 selektiert. Die synthetischen (Nissim er al. (1994), s. o.), Mandel-, "großen" scFv- und PBL- (Marks et al. (1991), s.o.) VH-Repertoires wurden jeweils wie folgt behandelt, um Phagemidteilchen sicherzustellen. In 500 ml vorgewärmtes (37ºC) 2YTAG (2YT-Medium, ergänzt mit 100 mg/ml Ampicillin und 2% Glucose) in einem 2 I-Spitzkolben wurden etwa 3 · 10¹&sup0; Zellen einer Glycerin-Stammkultur (-70ºC) der entsprechenden Sammlung eingeimpft. Die Kultur wurde bei 37ºC unter guter Belüftung gezüchtet, bis die OD600nm 0,7 erreichte (etwa 2 h). M13K07-Helferphagen (Stratagene) wurden der Kultur bis zu einer Infektionsmultiplizität (moi) von etwa 10 zugegeben (wobei angenommen wird, dass eine OD600nm von 1 jeweils 5 · 10&sup8; Zellen pro ml Kultur entspricht). Die Kultur wurde stationär bei 37ºC 15 min lang inkubiert, gefolgt von 45 min unter leichter Belüftung (200 U/min) bei der gleichen Temperatur. Die Kultur wurde zentrifugiert und der Überstand vom Zellpellet abgegossen. Die Zeilen wurden in 500 ml 2YTAK (2YT-Medium, ergänzt mit 100 mg/ml Ampicillin und 50 mg/ml Kanamycin) resuspendiert, und die Kultur wurde über Nacht bei 30ºC unter guter Belüftung (300 U/min) inkubiert. Phagenteilchen wurden durch drei Polyethylenglykol-(PEG-)Fällungen gereinigt und aufkonzentriert (J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (1990), Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbour, New York) und in PBS auf 10¹² transduzierende Einheiten (tu)/ml resuspendiert (Ampicillin-resistente Klone).

b) Panning der Phagenantikörper-Sammlung auf TGFβ-1

Von den vier Repertoires induzierte Phagen wurden jeweils getrennt auf TGFβ-1 gepannt. Ein Immunröhrchen mit 75 mm · 12 mm (Nung; Maxisorp) wurde mit 2 ml rekombiniertem Human-TGFβ-1 (0,5 ug/ml; Genzyme) in PBS über Nacht bei 4ºC beschichtet. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde das Röhrchen mit 3% MPBS (3 % "Marvel"-Magermilchpulver, 1 · PBS) gefüllt und zum Blockieren 2 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Wäsche wurde wiederholt, Phagemidteilchen (10¹³ tu) in 2 ml 3%-MPBS wurden zugegeben und das Röhrchen stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert. Das Röhrchen wurden 20-mal mit PBST (0,1%), dann 20-mal mit PBS gewaschen. Gebundene Phagenteilchen wurden aus dem Röhrchen eluiert, indem 2 ml 100 mM-Triethylamin zugegeben wurden und das Röhrchen stationär bei Raumtemperatur 10 min lang inkubiert wurde. Das eluierte Material wurde sofort neutralisiert, indem es in ein Röhrchen pipettiert wurde, das 1 ml 1 M-Tris-HCl (pH 7,4) enthielt. Die Phagen wurden bei 4ºC gelagert. 1,5 ml der eluierten Phagen wurden eingesetzt, um 20 ml logarithmisch wachsende E. coli TG1 (T. J. Gibson (1984), Doktorarbeit, University of Cambridge, UK) zu infizieren. Die infizierten Zellen wurden 1 h lang bei 37ºC unter leichter Belüftung in 2YT-Kulturlösung gezüchtet und dann auf 2YTAG-Medium in Platten mit 243 mm · 243 mm (Nung) plattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 30ºC inkubiert. Kolonien wurden von den Platten in 10 ml 2YT-Kulturlösung geschabt und zur Lagerung bei -70ºC 15 Vol.-% Glycerin zugegeben.
Glycerin-Stammkulturen aus der ersten Panningrunde jedes der vier Repertoires für TGFβ-1 wurden jeweils unter Verwendung von Helferphagen sichergestellt, um Phagemidteilchen für die zweite Panningrunde abzuleiten. 250 ul Glycerin-Stammlösung wurden eingesetzt, um 50 ml 2YTAG-Kulturlösung zu impfen und in einem 250 ml-Spitzkolben bei 37ºC unter guter Belüftung inkubiert, bis die OD600nm 0,7 erreichte (etwa 2 h). M13K07-Helferphage (moi = 10) wurde der Kultur zugegeben, die dann bei 37ºC 15 min lang stationär inkubiert wurde, gefolgt von 45 min unter leichter Belüftung (200 U/min) der gleichen Temperatur. Die Kultur wurde zentrifugiert und der Überstand vom Zellpellet abgegossen. Die Zellen wurden in 50 ml vorgewärmtem 2YTAK resuspendiert und die Kultur unter gutem Belüften über Nacht bei 30ºC inkubiert. Phagenteilchen wurden durch PEG-Fällung gereinigt und konzentriert (Sambrook et al. (1990), s. o.) und in PBS mit 1013 tu/ml resuspendiert.
Aus der ersten Panningrunde jedes der drei Repertoires induzierte Phagen wurden ein zweites Mal im Wesentlichen wie oben beschrieben selektiert, mit der Ausnahme, dass die Panningröhrchen nur mit 1 ml TGFβ-1 (0,5 ug/ml, Genzyme) beschichtet und das den Röhrchen zugegebenen Phagenvolumen ähnlich verringert wurde. Nach ausgiebigem Waschen wurden gebundene Phagen aus dem Röhrchen unter Einsatz von 1 ml 100 mM Triethylamin eluiert und durch Zugabe von 0,5 ml M Tris.HCl (pH 7,4) neutralisiert, wie zuvor beschrieben. Das Verfahren des Phagenzüchtens und Panning wurde in einer dritten und einer vierten Selektionsrunde wiederholt.

c) Züchten einzeln selektierter Klone für Immungssays

Einzelne Kolonien aus den Selektionen der dritten und der vierten Runde wurden eingesetzt, um 100 ul 2YTAG in einzelne Näpfe von 96 Napf-Gewebekulturplatten (Corning) einzuimpfen. Die Platten wurden unter mäßigem Rütteln (200 U/min) bei 30ºC über Nacht inkubiert. Glycerin wurde jedem Napf bis 15% zugegeben, und diese Masterplatten wurden bei -70ºC gelagert, bis sie für die Analyse bereit waren.

d) ELISA zum Identifizieren von Anti-TGFβ-1 scFv

Für TGFβ-1 spezifische Klone wurde durch ELISA identifiziert, wobei auf Phagen freigelegtes scFv oder lösliches scFv eingesetzt wurde.

i. Phagen-ELISA

Zellen von den Masterplatten wurden in frische 96 Napf-Gewebekulturplatten eingeimpft, die 100 ml 2YTAG pro Napf enthielten. Diese Platten wurden bei 37ºC 6 bis 8 h lang inkubiert, bis sich die Zellen in den Näpfen logarithmisch vermehrten (OD&sub6;&sub0;&sub0; 0,2- 1,0). M13K07 wurde jedem Napf bis zu einem moi von 10 zugegeben und 15 min lang stationär und dann 45 min lang unter leichtem Rütteln (100 U/min), beides bei 37ºC, inkubiert. Die Platten wurden mit 200 U/min 10 min lang zentrifugiert und der Überstand eluiert. Jedes Zellpellet wurde in 100 ml 2YTAK resuspendiert und bei 30ºC über Nacht inkubiert.
Jede Platte wurde mit 2.000 U/min zentrifugiert und der 100 ul-Überstand aus jedem Napf gewonnen und in 20 ul 18% M6PBS (18% Magermilchpulver, 6 · PBS) stationär bei Raumtemperatur 1 h lang blockiert. Unterdessen wurden flexible Mikrotiterplatten, die entweder mit 50 ul 0,2 mg/ml TGFβ-1 in PBS oder 50 ul PBS allein (was eine unbeschichtete Vergleichsplatte lieferte) über Nacht stationär bei 4ºC blockiert worden waren, wurden dreimal in PBS gewaschen und 2 h lang stationär bei 37ºC in 3MPBS blockiert. Diese Platten wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und 50 ul vorblockierter Phagen jedem Napf sowohl der mit TGFβ-1 beschichteten als auch der unbeschichteten Platte zugegeben. Die Platten wurden stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert, woraufhin die Phagen abgegossen wurde. Die Platten wurden durch dreimaliges Inkubieren für 2 min in PBST, gefolgt von dreimaligem Inkubieren für 2 min in PBS, jeweils bei Raumtemperatur, gewaschen.
Jedem Napf sowohl der mit TGFβ-1 beschichteten als auch der unbeschichteten Platte wurden 50 ul einer 1 : 10.000-Verdünnung von Schafs-Anti-fd-Antikörper (Pharmacia) in 3MPBS zugegeben und die Platten bei 37ºC stationär 1 h lang inkubiert. Jede Platte wurde gewaschen, wie oben beschrieben, und 50 ul einer 1 : 50.000-Verdünnung von Esels-Anti-Schafs-alkalische Phosphatase-Konjugat (Sigma) in 3MPBS zugegeben und stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert. Die Platten wurden wie oben beschrieben gewaschen, gefolgt von zwei Spülungen in 0,9% NaCl. Die Aktivität alkalischer Phosphatase wurde sichtbar gemacht, indem entweder das chromogene Substrat pNPP (Sigma) oder das Ampak-System (Dako) eingesetzt wurde. Das von jedem Klon erzeugte Absorptionssignal wurde durch Messen der optischen Dichte bei entweder 405 nm (pNPP) oder 492 nm (Ampak) gemessen, wobei ein Mikrotiterplatten-Leser eingesetzt wurde. Klone wurden für weitere Analyse ausgewählt, wenn das auf der mit TGFβ-1 beschichteten Platte erzeugte ELISA-Signal zumindest doppelt so stark wie das auf der unbeschichteten Platte war.

ii. Lösungs-ELISA

Zellen von den Masterplatten wurden in frische 96 Napf-Gewebekulturplatten eingeimpft, die 100 ul 2YTAG pro Napf enthielten. Diese Platten wurden bei 30ºC 8 h lang inkubiert und dann mit 2.000 U/min 10 min lang zentrifugiert und der Überstand eluiert. Jedes Zellpellet wurde in 100 ul 2YTA (2YT-Medium, ergänzt mit 100 ug/ml Ampicillin) resuspendiert, das 10 mM IPTG (Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid) enthielt und bei 30ºC über Nacht inkubiert.
Jede Platte wurde mit 2.000 U/min zentrifugiert, der 100 ul-Überstand von jedem Napf gewonnen und in 20 ul 18% M6PBs stationär bei Raumtemperatur 1 h lang blockiert. Unterdessen wurden flexible Mikrotiterplatten, die über Nacht stationär bei 4ºC entweder mit 50 ul 0,2 ug/ml TGFβ-1 in PBS oder 50 ul PBS allein blockiert worden waren, dreimal in PBS gewaschen und 2 h lang stationär bei 37ºC in 3% MPBS blockiert. Diese Platten wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und 50 ul vorblockiertes lösliches scFv jedem Napf sowohl der mit TGFβ-1 beschichteten als der unbeschichteten Platte zugegeben. Die Platten wurden stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert, woraufhin die scFv-Lösungen abgegossen wurden. Die Platten wurden durch dreimaliges Inkubieren für 2 min in PBST (PBS, das 1% Tween enthält) gewaschen, gefolgt von dreimal 2 min in PBS, jeweils bei Raumtemperatur.
Jedem Napf sowohl der mit TGFβ-1 beschichteten als auch der unbeschichteten Platte wurden 50 ml einer 1 : 200-Verdünnung des Anti-myc-tag-Mäuse-Antikörpers 9E10 (S. Munro & H. R. B. Pelham, Cell 46, 291-300 (1986)) in 3MPBs zugegeben und die Platten bei 37ºC stationär 1 h lang inkubiert. Jede Platte wurde gewaschen, wie oben beschrieben, und 50 ul einer 1 : 5.000-Verdünnung Ziegen-Anti-Mäuse-alkalische Phosphatase- Konjugat (Pierce) in 3MPBs zugegeben und stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, wie oben beschrieben, gefolgt von zwei Spülungen in 0,9 % NaCl. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde sichtbar gemacht, indem entweder das chromogene Substrat pNPP (Sigma) oder das Ampak-System (Dako) eingesetzt wurde. Das von jedem Klon erzeugte Absorptionssignal wurde bewertet, indem die optische Dichte unter Einsatz eines Mikrotiterplattenlesers entweder bei 405 nm (pNPP) oder 492 nm (Ampak) gemessen wurde. Die Klone wurden für weitere Analyse ausgewählt, wenn das auf der mit TGFβ-1 beschichteten Platte erzeugte Signal zumindest doppelt so stark war wie das auf der unbeschichteten Platte.

iii. Spezifitäts-ELISA

Klone, bei denen gegenüber unbeschichteten Näpfen Bindung von TGFβ-1 identifiziert wurde, wie oben beschrieben, wurden für die feine Spezifität weiter analysiert. Spezifitäts-ELISAs wurden unter Verwendung von scFv durchgeführt, der entweder auf Phagen freilag oder in Lösung vorlag, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, daß 5 ml Medium in 50 ml Falcon-Röhrchen mit jedem Klon geimpft und gezüchtet wurden, um das Phagen- oder lösliche scFv zu erzeugen, das im ELISA eingesetzt wurde. Mikrotiterplatten-Näpfe wurden mit 50 ul von entweder 0,2 ug/ml TGFβ-1, 0,2 ug/ml TGFβ-2, 10 ug/ml Rinderserumalbumin (BSA) oder PBS (unbeschichteter Napf) beschichtet. Nach dem Vorblockieren sowohl des Phagen (oder löslichen scFv) als auch der Mikrotiterplatten wurden 50 ul blockierter Phage (oder lösliches scFv) jedes Klons einem Napf zugesetzt, der entweder mit TGFβ-1, TGFβ-2, BSA beschichtet oder unbeschichtet war. Wie oben wurde die Aktivität alkalischer Phosphatase sichtbar gemacht, indem entweder das chromogene Substrat pNPP (Sigma) oder das Ampak-System (Dako) eingesetzt wurde. Klone wurden als für TGFβ-1 spezifisch erachtet, wenn das im mit TGFβ-1 beschichteten Napf erzeugte ELISA-Signal zumindest um das 5fache stärker war als das Signal für TGFβ-2, BSA oder einen unbeschichteten Napf.

iv. Spezifitätsbestimmung durch BIACoreTM

Dass die Antikörper für TGFβ1 im Vergleich zu TGFβ2 spezifisch sind (erhalten von R&D Systems Abingdon) wurde auch durch die relative Bindung an die BlACoreTM-Sensorchips gezeigt, die mit dem geeigneten Antigen beschichtet waren. TGFβ1 und TGFβ2 wurden nach den Anweisungen der Hersteller durch Aminbindung an Biosensor CM5- Sensorchips (Pharmacia) immobilisiert. Einzelketten-Fv-Fragmente (35 ul; gereinigt durch Immobilisierungs-Metallaffinitätschromatographie, wie in Beispiel 4 beschrieben) wurden mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ul/min über das immobilisierte Antigen injiziert. Die Menge an gebundenem TGFβ wurde als Gesamtzunahme an Resonanzeinheiten (RUs) über diesen Zeitraum bewertet. Für 31G9 scFv wurde eine Zunahme von 1059RUs mit einem TGFβ1-Chip festgestellt, und 72 RUs wurden mit einem TGFβ2-Chip festgestellt. Daher ist die Bindung an TGFβ1 viel stärker als an TGFβ2.

e) Sequenzierung von TGFβ1-spezifischen ScFv-Antikörpern

Die Nukleotidsequenz der TGFβ-1-spezifischen Antikörper wurde bestimmt, indem zuerst vektorspezifische Primer eingesetzt wurden, um die insertierte DNA aus jedem Klon zu amplifizieren. Zellen einer einzelnen Kolonie auf einer 2YTAG-Agarplatte wurden als Templat für eine Polymerase-Kettenreaktions-(PCR-)Amplifizierung der insertierten DNA eingesetzt, wobei die Primer pUC19reverse und fdtetseq eingesetzt wurden (Tabelle 1). Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 30 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 2 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Die PCR-Produkte wurden unter Einsatz eines "PCR Clean-up Kit" (Promega) in einem Endvolumen von 50 ul H&sub2;O gereinigt. Zwischen 2 und 5 ul jedes Insertpräparats wurden als Templat zur Sequenzierung eingesetzt, wobei das Taq Dye-Terminator-Zyklussequenzierungs- System (Applied Biosystems) eingesetzt wurde. Die Primer mycseq10 und PCR-L-Link wurden eingesetzt, um die Leichtkette jedes Klons zu sequenzieren, und PCR-H-Link und pUC19reverse, um die Schwerkette zu sequenzieren (Tabelle 1)

f) Sequenz und Quelle der anfänglichen TGFβ-1-spezifischen ScFv-Antikörper

Vier verschiedene TGFβ-1-spezifische Antikörper wurden aus den Selektionen unter Verwendung der oben beschriebenen vier Sammlungen isoliert. Namen, Ursprung und Schwer- und Leichtketten-Keimlinien aller Klone sind nachstehend angeführt. Die vollständige Sequenz der VH-Domänengene der Klone 1-B2 und 31-G6 sind in Fig. 1(a) zusammen mit dem VL-Domänengen von scFv 31-G9 angeführt.
So wurden diese Ausgangsisolate aus Sammlungen erhalten, die von verschiedenen Quellen abgeleitet wurden - sowohl natürlichen V-Genen von nicht immunisierten Menschen als auch synthetischen Sammlungen von klonierten Keimlinien-V-Genen gemeinsam mit synthetischen CDRs.

2. Affinitätsreifung der anfänglichen TGFβ-1-spezifischen ScFv-Antikörper

a) Leichtketten-Shuffling des TGFβ-1-spezifischen ScFv-Antikörpers 1-B2

i. Konstruktion von Repertoires

Die Schwerkette von Klon 1-B2 wurde mit dem vollständigen Repertoire von Leichtketten rekombiniert, die von PBL- und großen (von Mandeln stammenden) scFv-Repertoires abgeleitet wurden. Die 1-B2-Schwerkette wurde durch PCR unter Einsatz der Primer HuJh4-5For (Tabelle 1) und pUC19reverse amplifiziert. Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 30 Zyklen von 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde über ein 1%iges Agarose- TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VH darstellende Bande herausgeschnitten und aus dem Agarosegel unter Einsatz von Geneclean Kit (Bio 101) eluiert.
Die PBL- und Mandel-Leichtketten wurden mittels PCR amplifiziert, wobei die Primer fdtetseq und ein Gemisch aus RL1, 2 & 3 eingesetzt wurde (Tabelle 1). Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 30 Zyklen von 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde über ein 1%- iges AGarose-TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VL darstellende Bande heraus geschnitten und aus dem Agarosegel unter Verwendung des Geneclean Kit (Bio 101) eluiert.
Etwa 50 ng amplifizierte 1-B2-Schwerkette und 50 ng entweder amplifizierte von PBL stammende oder amplifizierte von Mandel stammende Leichtkette wurden kombiniert und mit Natriumacetat und Ethanol gefällt, wobei 25 ug Glykogen als Träger eingesetzt wurden. Die gefällte DNA wurde durch Zentrifugieren mit 13.000 U/min in einer Mikrozentrifuge pelletiert, luftgetrocknet und in 26 ul H&sub2;O resuspendiert. Dies wurde in einer Assemblierungsampflizierung nach der Zugabe von Reaktionspuffer auf 1X, dNTPs auf 200 nM und 5 Einheiten Taq-Polymerase eingesetzt. Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 20 Zyklen von 94ºC für 1 min. 60ºC für 1 min und 72ºC für 1 min 30 s, gefolgt von 10 min bei 72ºC. 10 ul jeder Assemblierung wurden als Templat in einer "Durchzugs"-("pull-through"-)Amplifizierung mit den Primern fdtetseq und pUC19reverse eingesetzt. Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 25 Zyklen von 94ºC für 1 min. 60ºC für 1 min und 72ºC für 1 min 30 s, gefolgt von 10 min bei 72ºC.
Das Durchzugsamplifizierungs-Produkt wurde über 1% Agarose-TAE abgetrennt und die die Durchzugs-VH-VL darstellende Bande herausgeschnitten und unter Verwendung von Geneclean Kit eluiert. Dies wurde mit den Restriktionsendonukleasen SfiI und NotI (NEB) gespalten und in den Phagemidvektor pCantab 6 ligiert (Amersham-Ligationssystem), der zuvor mit Sfi 1 und Not I gespalten worden war. Das Ligationsprodukt wurde eingesetzt, um elektrokompetete TG1-Zellen zu transformieren, auf 2YTAG-Platten plattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Etwa 1 · 10&sup5; einzelne Klone wurden aus dem Leichtketten-Shuffling der 1-B2-Schwerkette mit den von PBL stammenden Leichtketten und etwa 1 · 10&sup6; beim Shuffling mit den von Mandeln stammenden Leichtketten erzeugt.

ii. Selektion von Leichtketten-Umordnungs-Repertoires

Die beiden Leichtketten-Shuffling-Repertoires wurden auf TGFB-1-spezifische Antikörper selektiert. Phagemidteilchen wurden aus jedem Repertoire gewonnen, wie zuvor für die Ausgangssammlungen beschrieben. Gewonnene Phagen wurden 1 h lang in einem Endvolumen von 100 ul 3MPBS vorblockiert. Etwa 10¹¹ tu Phagen wurden in der ersten Selektionsrunde und zwischen 10&sup9; und 10¹&sup0; Für nachfolgende Selektionen eingesetzt. Für die Selektionen der ersten Runde wurde biotinylierter TGFβ1 bis zu einer Endkonzentration von 100 nM den vorblockierten Phagen zugegeben und stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert.
Für jede Selektion wurden 100 ul Dynabeads-Suspension (Dynal) auf einem Magneten getrennt, die Perlen gewonnen und 2 h lang in 1 ml 3MPBS vorblockiert. Die Perlen wurden auf einem Magneten gewonnen, im Gemisch aus Phagemid und biotinyliertem TGFβ1 resuspendiert und bei Raumtemperatur 15 min lang inkubiert, während sie kopfüber gewendet wurden. Die Perlen wurden auf einem Magneten gesammelt und viermal mit PBST gewaschen, gefolgt von drei Wäschen in PBS. Nach jeder Wäsche wurden die Perlen auf einem Magneten gesammelt und in der nächsten Wäsche erneut suspendiert. Schließlich wurde die Hälfte der Perlen in 10 ul 50 mM DTT resuspendiert (die andere Hälfte der Perlen wurde zur Sicherheit bei 4ºC gelagert) und bei Raumtemperatur 5 min lang inkubiert. Die gesamte Perlensuspension wurde dann eingesetzt, um 5 ml logarithmisch vermehrender TG1-Zellen zu infizieren. Diese wurden bei 437ºC inkubiert, 15 min lang stationär und dann mit mäßigem Schwenken für 45 min. auf 2YTAG- Platten aufplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert.
Kolonien wurden von Platten in 10 ml 2 YT-Kulturlösung abgeschabt und 15 Vol.-% Glycerin zugegeben, um sie bei -70ºC zu lagern. Eine 250 ul-Aliquote jeder Plattenabschabung wurde eingesetzt, um 2YTAG zu impfen, und Phagemidteilchen sichergestellt, wie zuvor beschrieben. Für jedes Repertoire wurden drei Selektionsrunden durchgeführt, bei denen biotinylierter TGFβ-1 eingesetzt wurde und die im Wesentlichen identisch mit der oben beschriebenen ersten Selektionsrunde waren. Alle Selektionen erfolg ten bei 100 nM TGFβ-1, mit Ausnahme der dritten Selektionsrunde des von Mandeln stammenden Leichtketten-Repertoires, worin die Konzentration des biotinylierten TGFβ- 1 in der Selektion auf 50 nM verringert war.

iii. Identifizierung von TGHFβ-1-spezifischen ScFv-Antikörpern aus Leichtketten-Shuffling-Repertoires

ScFv-Antikörper, die für TGFβ-1 spezifisch waren, wurden sowohl durch Phagen- als auch Lösungs-ELISA identifiziert und sequenziert, wie zuvor beschrieben. Es wurden drei neue TGFB-1-spezifische scFv-Antikörper identifiziert, zwei mit von PBL stammenden Leichtketten und einer mit einer von Mandeln stammenden Leichtkette. Alle drei wiesen die zuvor beschriebene 1B2-Schwerkettensequenz (DP49) auf. Die Sequenzen sind nachstehend zusammengefasst, und die vollständige Sequenz für jedes VL-Domänengen ist in Fig. 1 (b) angegeben.
So kann die von der PBL-Sammlung stammende VH-Domäne 1 B2 mit VL-Domänen kombiniert werden, die sowohl von PBL- als auch von Mandel-Sammlungen stammen.

b) CDR3-"Spickung" der TGFβ1-spezifischen ScFv-Antikörpers 1B2

i. Konstruktion "gespickter" Repertoires

Zunächst wurde der mutagene 84mer-Oligonukleotid-Primer 1B2 mutVHCDR3 synthetisiert (siehe Tabelle 1). Dieser Primer wurde zu 10% "gespickt", d. h. bei jeder Nukleotidposition darin besteht eine 10%ige Wahrscheinlichkeit, dass ein nicht-parentales Nukleotid eingebaut wird. Die 1-B2-Schwerkette wurde mit PCR amplifiziert, wobei die Primer pUC19reverse und 1B2 mutVHCDR3 eingesetzt wurden. Die Ampflizierungsbe dingungen bestanden aus 30 Zyklen von 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde über ein 1%iges Agarose-TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VH darstellende Bande herausgeschnitten und aus dem Agarosegel unter Verwendung von Geneclean Kit (Bio 101) eluiert.
Die parentale 1B2-Leichtkette wurde mittels PCR amplifiziert, wobei die Primer fdtetseq und RL3 (Tabelle 1) eingesetzt wurden. Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 30 Zyklen von 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde über ein 1%iges Agarose-TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VL darstellende Bande herausgeschnitten und aus dem Agarosegel unter Verwendung von Geneclean Kit (Bio 101) eluiert.
Etwa 50 ng amplifizierte "gespickte" 1-B2-Schwerkette und 50 ng amplifizierte parentale 1B2-Leichtkette wurden kombiniert und mit Natriumacetat und Ethanol gefällt, wobei 25 ug Glykogen als Träger eingesetzt wurden. Die gefällte DNA wurde durch Zentrifugieren mit 13.000 U/min in einer Mikrozentrifuge pelletiert, luftgetrocknet und in 26 ul H&sub2;O resuspendiert. Das Ergebnis wurde bei einer Assemblierungsamplifizierung nach Zugabe von Reaktionspuffer auf 1X, dNTPs auf 200nM und 5 Einheiten Taq-Polymerase eingesetzt. Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 25 Zyklen von 94ºC für 1 min, 65ºC für 4 min. 5 ul jeder Assemblierung wurden als Templat in einer "Durchzugs"-Amplifizierung mit den Primern fdtetseq und pUC19reverse eingesetzt. Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 30 Zyklen von 94ºC für 1 min. 55ºC für 2 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC.
Das Durchzugsamplifizierungsprodukt wurde über 1% Agarose-TAE aufgetrennt, die die "gespickte" Durchzugs-VH-VL darstellende Bande herausgeschnitten und eluiert, wobei das Geneclean Kit eingesetzt wurde. Dieses wurde mit den Restriktionsendonukleasen Sfi I und Not I (NEB) gespalten und in den Phagemidvektor pCantab 6 ligiert (Amersham-Ligationssystem), der zuvor mit Sfi I und Not I gespalten worden war. Das Ligationsprodukt wurde eingesetzt, um elektrokompetete TG1-Zellen zu transformieren, auf 2YTAG-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Etwa 4 · 10&sup6; einzelne Klone wurden aus diesem VH CDR3-"Spicken" des 1-B2 VH CDR3 erzeugt.

ii. Selektion des 1B2 CDR3-Spickrepertoires

Das Repertoire wurden in einer Panningrunde auf 1 ug/ml TGFβ-1 bezüglich neuem TGFβ-1-spezifischem scFv-Antikörper selektiert, gefolgt von zwei Selektionsrunden mit biotinyliertem TGFβ-1 mit 50 nM, wobei bereits beschriebene Verfahren eingesetzt wurden.

iii. Identifizierung von TFβ-1-spezifischen ScFv-Antikörpern aus dem 1B2 CDR3-Spick- Repertoire

Für TGFβ-1 spezifische ScFv-Antikörper wurden sowohl durch Phagen- als auch Lösungs- und Phagen-ELISA identifiziert und sequenziert, wie bereits beschrieben. Klon 27C1 wurde aus dem gespickten Repertoire isoliert. Er ist praktisch identisch mit Klon 1B2, aber mit drei Unterschieden im Schwerketten-CDR3. Die vollständige Sequenz von Klon 27C1 ist in Fig. 1(c) angegeben. Die 27C1 VH-Domäne wurde bei der Konstruktion des Gesamtantikörpers 27C1/10A6 IgG4 (Beispiel 2) mit der 10A6 VL-Domäne kombiniert. Die Eigenschaften dieses Antikörpers sind detaillierter in den Beispielen 2 bis 6 beschrieben. Zusätzlich zu 27C1 wurde eine große Anzahl anderer Antikörper isoliert, wobei bis zu 7 der 14 Aminosäuren in CDR3 der VH-Domäne unterschiedlich waren (Fig. 3). Diese weisen eine ähnliche Präferenz für die Bindung von TGFβ1 gegenüber TGFβ2 auf.

3. Identifizierung und Charakterisierung von Antikörpern gegen Human-TGFβ-2 durch Selektion naiver und synthetischer Phagen-Antikörper-Repertoires

a) Induktion von Phagen-Antikörper-Sammlungen

Zwei verschiedene Phagen-Antikörper-Repertoires wurden bezüglich Antikörper gegen TGFβ-2 selektiert. Die synthetischen VH- (Nissim et al. (1994)) und Mandel- (wie zuvor beschrieben konstruiert) Repertoires wurden jeweils behandelt, wie für TGFβ-1 beschrieben, um Phagemidteilchen sicherzustellen.

b) Panning der Phagen-Antikörper-Sammlung auf TGFβ-2

Von den beiden Repertoires induzierte Phagen wurden jeweils getrennt auf TGFβ-2 bezüglich TGFβ-1 gepannt, wie zuvor beschrieben, wobei jedoch 0,5 mg/ml TGFβ-2 als Beschichtungsantigen eingesetzt wurde.

c) Identifizierung und Sequenzierung von TGFβ-2-spezifischen ScFv-Antikörpern

Einzelne Kolonien aus den Selektionen der dritten und vierten Runde wurden sowohl durch Phagen- als auch Lösungs-ELISA, wie zuvor beschrieben, auf TGFβ-1 gescreent, wobei jedoch flexible Mikrotiterplatten eingesetzt wurden, die mit 0,2 mg/ml TGFβ-2 anstelle von TGFβ-1 beschichtet waren. Die Klone wurden für weitere Analyse ausgewählt, wenn das auf der mit TGFβ-2 beschichteten Platte erzeugte ELISA-Signal zumindest doppelt so stark wie auf der unbeschichteten Platte war. Für den Spezifitäts-ELISA, wie zuvor für TGFβ-1 beschrieben, wurden Klone als für TGFβ-2 spezifisch angesehen, wenn das ELISA-Signal, das im mit TGFβ-2 beschichteten Napf erzeugt wurde, zumindest um das Fünffache stärker als das Signal war, das entweder auf TGFβ-1, BSA oder einem unbeschichteten Napf erzeugt wurde.

d) Sequenz und Quelle der anfänglichen TGFβ-2-spezifischen ScFv-Antikörper

Vier verschiedene TGFβ-2-spezifische Antikörper wurden aus den Selektionen isoliert, wobei die beiden oben beschriebenen Sammlungen eingesetzt wurden. Jeder Klonname, sein Ursprung und seine Schwer- und Leichtketten-Keimlinie sind nachstehend angeführt. Die vollständige Sequenz der VH-Domänengene von 2A-H11 und 2A-A9 ist in Fig. 2 (a) angeführt.
So sind Human-Antikörper, die sich an Human-TGFβ2 binden, aus verschiedenen Quellen isoliert worden - sowohl natürlichen V-Genen von nicht immunisierten Menschen als auch synthetischen Sammlungen von klonierten Keimlinien-V-Genen gemeinsam mit synthetischen CDRs.

4. Leichtketten-Shuffling der TGFB-2-spezifischen ScFv-Antikörper 2A-H11 und 2A-A9

a) Konstruktion von Repertoires

Die Schwerketten der Klone 2A-H11 und 2A-A9 wurden mit dem vollständigen Repertoire von Leichtketten kombiniert, die von PBL- und großen (von Mandeln stammenden) scFv-Repertoires stammten, wie zuvor für den TGFβ-1-spezifischen scFv-Antikörper 1-B2 beschrieben. Beide von der Rekombination mit dem PBI-Leichtketten-Repertoire erzeugten Repertoires lagen bei etwa 1 · 10&sup5;, die von der Rekombination mit dem Mandel- Leichtketten-Repertoire erzeugten bei etwa 1 · 10&sup6;.

b) Selektion von Leichtketten-Shuffling-Repertoires

Die Leichtketten-Shuffling-Repertoires wurden unter Einsatz von biotinyliertem TGFβ-2 für TGFβ-2-spezifische Antikörper selektiert, wie zuvor für die Selektion der TGFβ-1- Leichtketten-Shuffling-Repertoires beschrieben. Für alle Selektionen der ersten und der zweiten Runde wurde eine Konzentration von 100 nM biotinyliertem TGFβ-2 einge setzt. Für die dritte Selektionsrunde des von PBL stammenden Leichtketten-Shuffling-Repertoires wurde biotinylierter TGFβ-2 in Konzentrationen von 100 nM und 1 nM eingesetzt. Für die dritte Selektionsrunde der von Mandeln stammenden Leichtketten-Shuffling-Repertoires wurde biotinylierter TGFβ-2 in einer Konzentration von 50 nM eingesetzt.

c) Identifizierung von TGFβ-2-spezifischen ScFv-Antikörpern von Leichtketten-Shuffling- Repertoires

Für TGFβ-2 spezifische ScFv-Antikörper wurden sowohl durch Phagen- als auch Lösungs-ELISA identifiziert und sequenziert, wie zuvor beschrieben. Es wurden fünf neue TGFβ-2-spezifische scFv-Antikörper identifiziert. Die Sequenzen sind nachstehend zusammengefasst, und die vollständige Sequenz jedes Klons ist in Fig. 2(b) angegeben.

d) Spezifitätsbestimmung mittels ELISA

Klone, die gegenüber unbeschichteten Näpfen als TGFβ-2 bindend identifiziert wurden, wurden weiters bezüglich Feinspezifität analysiert. Spezifitäts-ELISAs wurden unter Verwendung von scFv, entweder auf einem Pagen freigelegt oder in Lösung, wie oben beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 5 ml Medium in 50 ml Falcon-Röhrchen mit jedem Klon geimpft und gezüchtet wurde, um den Phagen oder lösliches scFv zu erzeugen, das im ELISA eingesetzt wurde. Mikrotiterplattennäpfe wurden mit 50 ul von entweder 0,2 ug/ml TGFβ-1, 0,2 ug/ml TGFβ-2, 10 ug/ml Rinderserumalbumin (BSA) oder PBS (unbeschichtete Näpfe) beschichtet. Nach dem Vorblockieren sowohl der Phagen (oder löslichen scFv) als auch der Mikrotiterplatten wurden 50 ul blockierte Phagen (oder lösliche scFv) jedes Klons einem Napf zugegeben, der entweder mit TGFβ-1, TGFβ-2, BSA beschichtet oder ein unbeschichteter Napf war. Wie oben wurde die Aktivität alkalischer Phosphatase sichtbar gemacht, indem entweder das chromogene Substrat pNPP (Sigma) oder das Ampak-System (Dako) eingesetzt wurde. Klone wurden als für TGFβ-2 spezifisch betrachtet, wenn das im mit TGFβ-2 beschichteten Napf erzeugte ELISA-Signal zumindest um das Fünffache stärker war als das Signal auf entweder TGFβ-1, BSA oder einem unbeschichteten Napf. Kreuzreaktivität mit nichtverwandten Antigenen wurde am ausgeprägtesten für Anti-TGFβ2-Antikörper im Gesamt- Antikörperformat ermittelt, siehe Beispiel 2. Die Kreuzreaktivität von 6B1 IgG4 und 6A5 IgG4 mit TGFβ1 und TGFβ3 (erhalten von R&D Systems, Abingdon) erwies sich ebenfalls als sehr gering.

e) Spezifitätsbestimmung durch BIACoreTM

Es wurde auch durch relative Bindung an die mit dem geeigneten Antigen beschichteten BIACore-Sensorchips gezeigt, dass die Antikörper für TGFβ2 gegenüber TGFβ1 spezifisch waren. TGFβ1 und TGFβ2 wurden über Aminbindung an Biosensor CM5-Sensorchips (Pharmacia) gemäß den Anweisungen der Hersteller immobilisiert. Einzelketten- Fv-Fragmente (35 ul; gereinigt durch Immobilisierungs-Metallaffinitätschromatographie) wurden über das immobilisierte Antigen mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ul/min injiziert. Die Menge an gebundenem TGFβ wurde als Gesamtzunahme an Resonanzeinheiten (RUs) über diesen Zeitraum ermittelt. Für die Einzelketten-Fv-Fragmente 6H1, 6A5 und 14F12 ergaben diese Fragmente insgesamt 686, 480 bzw. 616 RUs für den mit TGFβ1 beschichteten Sensorchip und 77, 71 bzw. 115 RUs für den mit TGFβ2 beschichteten Sensorchip.

5. Bildung von biologischen Anti-THFβ-2-Neutralisatoren mit höherer Affinität

a) Rekombination von Schwerketten, die von Anti-TGFβ1-scFv mit hoher Affinität stammen, mit Leichtketten, die von Anti-TGFβ1- und Anti-TFβ2-scFv stammen, die gute Eigenschaften aufweisen

Antikörper, die durch Spicken von CDR3 des scFv-Antikörpers 1-B2 abgeleitet wurden (Abschnitt 2b), binden TGFβ-1 mit hoher Affinität. Um die Chance zu verbessern, neutralisierende Antikörper mit hoher Affinität zu erhalten, wurde beschlossen, VHs, die von Anti-TGFβ1-scFv hoher Affinität stammten, Ketten-Shuffling mit VLs zu unterziehen, die von scFV-Klonen mit vielversprechenden Eigenschaften abgeleitet wurden, und insbesondere mit jenen, die fähig sind, die Aktivität von TGFβ-2 in vitro zu neutralisieren.
Schwerketten wurden nach der Selektion auf TGFβ-1 (Abschnitt 2a.ii) mittels PCR aus dem Repertoire von CDR3-gespickten 1-B2-Klonen amplifiziert, wobei die Primer pUC19reverse und PCR-H-Link eingesetzt wurden (Tabelle 1). Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 30 Zyklen von 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde über ein 1%iges Agarose-TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VH darstellende Bande herausgeschnitten und aus dem Agarosegel eluiert, wobei das Geneclean Kit (Bio 101) eingesetzt wurde.
Leichtketten wurden mittels PCR von jedem der Anti-TGFβ-1-spezifischen Neutralisatoren (7-A3, 10-A6 und 14-A1, Abschnitt 2a.iii) und jedem der Anti-TGFβ-2-spezifischen Neutralisatoren (6H1, 6A5, 6B1, 11E6 und 14F12; Abschnitt 4c) amplifiziert, wobei die Primer fdtetseq1 und PCR-L-Link eingesetzt wurden (Tabelle 1). Es wurden die gleichen PCR-Bedingungen eingesetzt, wie für die VH-Amplifizierung beschrieben, Jedes VL- PCR-Produkt wurde dann getrennt über 1%iges Agarose-TAE-Gel gereinigt, wie oben beschrieben. Gereinigte Produkte wurden schließlich in etwa äquimolaren Mengen (wie mittels eines analytischen Agarosegels abgeschätzt) vermischt, um einen VL-"Pool" bereitzustellen.
Etwa 50 ng amplifizierte Schwerketten und 50 ng amplifizierte gepoolte Leichtketten wurden kombiniert und mit Natriumacetat und Ethanol gefällt, wobei 25 ug Glykogen als Träger eingesetzt wurden. Die gefällte DNA wurde durch Zentrifugieren mit 13.000 U/min in einer Mikrozentrifuge pelletiert, luftgetrocknet und in 243 ul H&sub2;O resuspen diert. Dies wurde in einer Assemblierungsamplifikation nach Zugabe von Reaktionspuffer, dNTPs auf 200 nM und 5 Einheiten Taq-Polymerase eingesetzt. Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 20 Zyklen von 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 2 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. 5 ul der Assemblierung wurden als Templat in einer 50 ul "Durchzugs"-Amplifikation mit den Primern fdtetseq und pUC19reverse eingesetzt. Die Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 30 Zyklen von 94ºC für 1 min, 55ºC für 1 min und 72ºC für 2 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC.
Das Durchzugsamplifikations-Produkt wurde über 1%ige Agarose-TAE aufgetrennt und die Bande, die das Durchzugs-VH-VL darstellte, herausgeschnitten und eluiert, wobei das Geneclean Kit eingesetzt wurde. Dies wurde mit den Restriktionsendonukleasen SfiI und NotI (NEB) gespalten und in den Phagemidvektor pCantab 6 (McCafferty et al. (1994), s. o.) ligiert, der zuvor mit Sfi 1 und Not I gespalten worden war, wobei das Amersham-Ligationssystem eingesetzt wurde. Das Ligationsprodukt wurde eingesetzt, um elektrokompetete TG1-Zellen zu transformieren, auf 2YTAG-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Es wurde ein Repertoire aus etwa 3 · 10&sup6; einzelnen Klonen erzeugt.

b) Selektion des Ketten-Shuffling-Repertoires

Das Ketten-Shuffling-Repertoire wurde durch eine einzelne Panningrunde auf TGFβ-1 (1 ug/ml) selektiert, wie zuvor beschrieben (Abschnitt 1b).

c) Identifizierung von TGFβ-1-spezifischen scFv-Antikörpern

Für TGFβ-1 spezifische scFv-Antikörper wurden durch Phagen-ELISA identifiziert und sequenziert, wie bereits beschrieben (Abschnitte 1d.i und 1e). Neue TGFβ-1-spezifische scFV-Antikörper wurden identifiziert. Fünf neue Klone mit hoher Affinität wurden isoliert - CS32, der 31G9 VH und 7A3 VL umfasst; CS39, der 31G9 VH und 6H1 VL umfasst, CS37, der 31G9 VH (Fig. 1(a)(iii)) und 11E6 VL mit einer Ile für-Val-Substitution an Rest 2 umfasst (in Fig. 14 angegebene VL-Sequenz); CS35, der 31G9-Schwerkette mit den Substitutionen Glu für Gln an Rest 1, Gln für Glu an Rest 5 sowie 14F13 VL um fasst; und SC38, der 31G9 VH mit den Substitutionen Thr für Gln an Rest 3, Glu für Gln an Rest 5, Leu für Phe an Rest 27, Ile für Asn an Rest 56 und Arg für Gln an Rest 105 sowie 6A5 VL umfasst.

d) Off-Rate-Bestimmung für Einzelketten-Fv-Fragmente, die sich an TGFβ1 und TGFβ2 binden

Die in diesem Beispiel beschriebenen Off-Rates für die Bindung an TGFβ1 oder TGFβ2 der Einzelketten-Fv-Fragmente wurden bestimmt, wie von Karisson et al. (R. Karlsson et al., J. Immunol. Methods 145, 229-240 (1991)) beschrieben. Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 2 zusammen mit den Dissoziationskonstanten für jene, die ermittelt worden sind, gezeigt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Antikörper mit hoher Affinität isoliert worden sind.

6. Identifizierung und Charakterisierung eines Antikörpers, der sowohl mit Human- TGFβ-1 als auch TGFβ-2, nicht jedoch mit TGFβ-3 kreuzreagiert, durch die Selektion eines großen ScFv-Repertoires

a) Panning der Sammlung und Identifizierung von Bindern

Die (bereits beschriebene) große scFv-Sammlung wurde induziert, Phagemidteilchen sichergestellt und gepannt, wie bereits beschrieben, wobei folgende Modifikationen vorgenommen wurden. Für die erste Panning-Runde wurden 10¹² tu Sammlungsphagen in 0,5 ml PBS eingesetzt (anstelle der üblichen 2 ml), für die zweite Runde wurden 3,5 · 10&sup9; Phagen in 0,5 ml PBS eingesetzt. Die Immunröhrchen waren sowohl in der ersten als auch in der zweiten Selektionsrunde mit 10 ug TGFβ-2 in 0,5 ml PBS beschichtet. Einzelne Kolonien aus der zweiten Selektion wurden durch ELISA gescreent, wobei 0,2 ug/ml TGFβ-1 eingesetzt wurden. Klone, die TGFβ-1 banden, wurden weiter auf TGFβ- 2, TGFβ-3, BSA und PBS gescreent. Die Klone wurden als für sowohl TGFβ-1 als auch TGFβ-2 spezifisch erachtet, wenn das in den mit TGFβ-1 und mit TGFβ-2 beschichteten Näpfen erzeugte ELISA-Signal beide zumindest etwa um das Fünffache stärker waren als das Signal auf TGFβ-3, BSA und dem unbeschichteten Napf.

c) Identifizierung eines TGFβ-1/TGFβ-2 kreuzreaktiven ScFv-Antikörpers

Ein einzelner scFv-Antikörper, der sowohl für TGFβ-1 als auch TGFβ-2 spezifisch war, wurde sowohl durch Phagen- als auch Lösungs-ELISA identifiziert und sequenziert, wie bereits beschrieben. Die vollständige Sequenz der VL-Domäne des Antikörpergens VT37 ist in Fig. 4 angeführt. Die Dissoziationskonstante dieses Einzelketten-Fv-Antikörpers wurde durch Analyse unter Einsatz von BICoreTM für TGFβ1 mit 4 nM und für TGFβ2 mit 7 nM ermittelt. Die Kreuzreaktivität für TGFβ3 wurde ebenfalls ermittelt. Gereinigter VT37scFv mit 8,3 ug/ml wurde über BIACoreTM Sensorchips geschickt, die mit TGFβ1 (mit 500 RUs); TGFβ2 (mit 450 RUs) oder TGFβ3 (mit 5500 RUs) beschichtet waren. Die relative Reaktion für die VT37 scFv-Bindung war: TGFβ1-391 RU gebunden; TGFβ2-261 RU gebunden oder TGFβ3 - 24 RU gebunden. So bindet sich dieser Antikörper stark an TGFβ1 und TGFβ2, aber die Bindung an TGFβ3 ist nicht über dem Hintergrund nachweisbar.

BEISPIEL 2

Konstruktion von Zelllinien, die Gesamt-Antikörper exprimieren

Zur Konstruktion von Zelllinien, die IgG4-Antikörper exprimieren, wurden variable Domänen in Vektoren kloniert, die den Human-γ-Konstantbereich für die VH-Domäne oder den Human-κ- oder -λ-Konstantbereich für die VL-Domänen exprimieren.
Um den Gesamt-Antikörper 27C1/10A6 IgG4 (spezifisch für TGFβ&sub1;) zu konstruieren, wurde 27C1 VH-DNA aus dem oben in Beispiel 1 isolierten Klon erhalten. Das VH-Gen wurde mittels PCR amplifiziert, indem die Oligonukleotide VH3BackSfiEu und VHJH6- ForBam (Tabelle 1) mit Zyklen von 1 min bei 94ºC, 1 min bei 55ºC, 1,5 min bei 72 ºC eingesetzt wurden. Nach der Spaltung mit SfiI und BamHI wurde das VH-Gen in den Vektor vhcassette2 (Fig. 5) kloniert, der mit SfiI und BamHI gespalten worden war. Ligierte DNA wurde in E. coli TG1 transformiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden erhalten, und jene, die das korrekte Insert enthielten, durch DNA-Sequenzierung identifiziert.
Plasmid-DNA von diesen Kolonien wurde hergestellt und die DNA mit HindIII und BamHI gespalten. Das HindIII-BamHI-Restriktionsfragment wurde in den Human-IgG4- Schwerketten-Expressionvektor pG4D100 (Fig. 6) ligiert, der mit HindIII und BamHI gespalten worden war, und die DNA durch Elektroporation in E.coli TG1 transfiziert. Die Sequenz des VH-Geninserts wurde wiederum durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Für die Leichtkette wurde das in Beispiel 1 isolierte VL-Gen von 10A6 zuerst mutagenisiert, um seine innere BamHI-Stelle unter Einsatz von stellengerichteter Mutagenese (Amersham RPN1523) mit dem Oligonukleotid ΔBamHI zu entfernen (Tabelle 1). Das resultierende VLDBamH1-Gen wurde durch PCR amplifiziert, wobei die Oligonukleotide Vλ3/4BackEuApa und HuJλ2-3ForEuBam eingesetzt wurden (Tabelle 1). Nach der Spaltung des amplifizierten Inserts mit ApaLI und BamHI wurde das VL-Gen in den Vektor vlcassetteCAT1 kloniert (Fig. 7), mit ApaLI und BamHI gespalten. Ampicillin-resistente Kolonien wurden erhalten, und jene, die das korrekte Insert enthielten, wurden durch DNA-Sequenzierung identifiziert.
Plasmid-DNA wurde aus diesen Kolonien erhalten und die DNA mit Hind III und Bam- HI gespalten. Das HindIII-BamHI-Restriktionsfragment, das die Leadersequenz und die VL-Domäne enthielt, wurde in den Human-λ-Leichtketten-Expressionsvektor pLN10 ligiert (Fig. 8), der mit HindIII und BamHI gespalten worden war. Nach der Elektroporation wurden Transformanten in E.coli durch DNA-Sequenzierung überprüft.
Plasmid-DNA wurde aus dem pG4D100-27C1-Klon und dem pLN10-10A6-Klon erhalten. Diese DNA wurde dann durch Elektroporation in DUKXB11 China-Hamster-Eierstock-(CHO)-Zellen co-transfiziert (290 V; 960 uF). Die Zellen wurden dann 2 Tage lang in nicht-selektivem Medium (α-MEM plus Nukleoside) gezüchtet. Die Zellen wurden dann in ein selektives Medium (α-MEM plus 1 mg/ml G418 ohne Nukleoside) übertra gen und in 96 Napf-Platten gezüchtet. Kolonien wurden dann in 24 Napf-Platten übertragen und Proben durch Sandwich-ELISA auf assemblierten Human-IgG4-Antikörper und durch Bindung an TGFβ1 in ELISA untersucht (wie in Beispiel 1). Für den Sandwich-ELISA wurde Ziegen-Anti-Human-IgG4 auf die ELISA-Platte aufgetragen und zurückgehaltenes Human-IgG4 unter Einsatz von Ziegen-Anti-Human-λ-Leichtketten-alkalische Phosphatase-Konjugat detektiert. Stark exprimierende Zelllinien wurden dann mittels Amplifizierung der insertierten Gene abgeleitet, wobei Selektion in Gegenwart von Methotrexat eingesetzt wurde (R. J. Kaufman, Methods Enzymol. 185, 537-566 (1990)).
Der Gesamt-Antikörper 6H1 IgG4 (spezifisch für TGFβ2) wurde auf ähnliche Weise wie die obige Konstruktion von 27C1/10A6 IgG4 konstruiert. Das 6H1 VH-Gen (Beispiel 2) wurde wie oben für 27C1 in pG4D100 kloniert, mit der Ausnahme, dass die PCR-Amplifizierung mit den Oligonukleotiden VH3BackSfiEu und. VHJH1-2FORBam durchgeführt wurde. Das 6H1 VL-Gen (Beispiel 2) wurde in vlcassetteCAT1 wie oben subkloniert, mit der Ausnahme, dass die PCR-Amplifizierung mit den Oligonukleotiden Vk2- BackEuApa und HuJk3FOREuBam durchgeführt wurde. Da jedoch das 6H1 VL eine κ- Leichtkette ist, wurde das HindIII-BamHI-Fragment in den Human-κ-Leichtketten-Expressionsvektor pKN100 (Fig. 9) subkloniert, der mit HindIII und bamHI gespalten worden war. Stark exprimierende Zelllinien wurden dann wie oben beschrieben isoliert. Klone, die Antikörper exprimierten, wurden von Kulturplatten durch Sandwich-ELISA für assemblierte Human-IgG4-Antikörper (detektiert unter Verwendung von Ziegen-Anti-Human-κ-Leichtketten-Konjugat) und durch Bindung an TGFβ2 im ELISA (wie in Beispiel 2) identifiziert.
Um die Gesamt-Antikörper 6A5 IgG4 und 6B1 IgG4 zu konstruieren, wurde das gleiche 6H1 VH-Konstrukt in pG4D100 eingesetzt wie für 6H1IgG4, da diese Antikörper alle das gleiche VH-Gen aufweisen. Die 6B1- und 6A5-Gene wurden jeweils wie oben für die 10A6-Leichtkette in vlcasseteCAT1 subkloniert, mit der Ausnahme, dass die PCR- Amplifizierung mit den Nukleotiden Vλ3backEuApa und HuJλ2-3ForEuBam durchgeführt wurde. Das HindIII-BamHI-Restriktionsfragment wurde dann wie oben in pLN10 subkloniert. Klone, die Antikörper exprimierten, wurden aus Kulturplatten durch Sandwich-ELISA für den assemblierten Human-IgG4-Antikörper identifiziert (detektiert unter Einsatz von Ziegen-Anti-Human-K-Leichtketten-Konjugat und durch Bindung an TGFβ2 im ELISA wie in Beispiel 2).

Eigenschaften von Gesamt-Antikörper-Konstrukten

Reinigung der Gesamt-Antikörper

Serumfreier Überstand von CHO-Zellen, die das relevante IgG erzeugten, wurde vor der Reinigung durch Zentrifugieren mit 8.000 U/min (Beckman JS2-21) geklärt. Der Überstand wurde auf eine vorgepackte HiTrap-Protein A-Sepharose-Affinitätssäule von Pharmacia mit einer Größe von entweder 1 oder 5 ml mit Bindungskapazitäten von 25 bzw. 120 mg aufgetragen. Jedes IgG hatte eine eigene Säule, um jegliche potentielle Übertragung von Material von einer Reinigung zu einer anderen zu vermeiden. Die Säule wurde mit dem 10fachen Säulenvolumen an 1xPBS auf phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) äquilibriert, bevor der Überstand geladen wurde. Als der gesamte Überstand mit einer Strömungsrate von 2-4 ml/min auf die Säule geladen worden war, wurde die Säule wiederum je nach Säulengröße mit dem 10fachen Säulenvolumen an 1xPBS gewaschen, um jegliches nicht-spezifisch gebundene Material zu beseitigen. Elution des gebundenen Proteins erfolgte unter Einsatz von 0,1 M Natriumacetat, eingestellt auf pH 3,3 mit Eisessig. Das eluierte Material wurde in 8 Fraktionen mit 1,5 ml Volumen gesammelt, und die ermittelte Proteinmenge durch Messen des Absorptionsvermögens bei 280 nm und Multiplizieren dieses Werts mit 0,7 ermittelt, um einen Wert in mg/ml zu erhalten. Dieser wurde dann mit 0,5 ml 1M Tris-HCl, pH 9,0, pro 1,5 ml-Fraktion neutralisiert und die proteinhältigen Fraktionen gepoolt und gegen 1 xPBS dialysiert, um Puffer-Austausch des IgG vorzunehmen. Die Säule wurde wieder auf neutralen pH eingestellt, indem das 10fache Säulenvolumen an 1xPBS hindurchgeleitet wurde, und wurde in 20% Ethanol als Konservierungsmittel gelagert, bis sie wieder benötigt wurde.
Eine Probe wurde dann auf 10-15% SDS-PAGE (Phast System, Pharmacia) laufen gelassen und mit Silber gefärbt. Dies ermöglichte eine Bewertung der Reinheit des IgG-Präparats. Selbige wurde üblicherweise mit etwa 80-90 0/0 ermittelt, wobei nur wenige andere Banden auf dem gefärbten Gel auftraten.

Bindungsspezifität mittels ELISA

Es wurde gezeigt, dass die IgG4-Antikörper 6B1 und 6A5 sehr niedrige Kreuzreaktivität für TGFβ1 und TGFβ2 und keine nachweisbare Kreuzreaktivität mit einer Reihe nicht- spezifischer Antigene aufwiesen: Interleukin-1; Human-Lymphotoxin (TNFb); Human-Insulin; Human-Serumalbumin; einstrangige DNA; Oxazolon-Rinderserumalbumin; Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin, Hühnereiweiß-Trypsininhibitor; Chymotrypsinogen; Cytochrom C; Glyceradehydphosphat-Dehydrogenase; Eialbumin; Hühnerei- Lysozym; Rinderserumalbumin und Tumornektrosefaktor α - (TNFα) (Fig. 13(a) und (b)). Ebenso banden sich die Antikörper 6B1, 6A5 und 5H1 IgG stark an TGFβ2, das auf einen BIACoreTM-Sensorchip aufgetragen war, aber nicht nennenswert an mit TGFβ1 oder TGFβ3 beschichtete Chips.

Bindungseigenschaften von Gesamt-Antikörpern mittels BIACoreTM

Die Affinitätskonstanten der obigen Antikörper wurden mittels BIACoreTM ermittelt, indem das Verfahren von Karlsson et al., J. Immunol. Methods 145, 299-240 (1991), s. o., eingesetzt wurde und mit etwa 5 nM für 27C1/10A6 IgG4 für TGFβ1 und 2 nM für 6H1 igG4 für TGFβ2 ermittelt. Der Antikörper 27C1/10A6 IgG4 zeigte auch gewisse Kreuzreaktivität mit auf Biosensor-Chips aufgetragenem TGFβ2, aber die Dissoziationskonstante ist für TGFβ2 im Vergleich zu TGFβ1 etwa um das 10fache oder mehr größer. Es gab keine nennenswerte Kreuzreaktivität mit auf BIACoreTM-Sensorchip aufgetragenem Lysozym.
Neutralisierung und Hemmung der Radiorezeptorbindung durch IgG4-Antikörper gegen TGFβ1 und TGFβ2 wird in den Beispielen 3 und 4 beschrieben.

BEISPIEL 3

Neutralisation der Hemmwirkung von TGF β1 und TGF β2 auf die Zellvermehrung durch Antikörper

Die neutralisierende Aktivität der Antikörper, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, wurde in einer Modifikation eines Bioassays auf TGFβ getestet, wie von Randall et al., J. Immunol. Methods 164, 61-67 (1993), beschrieben. Dieser Assay basiert auf der Fähigkeit von TGF β&sub1; und TGF β&sub2;, die durch Interleukin-5 induzierte Proliferation der Erythroleukämie-Zelllinie TF1 zu hemmen, und in der Lage zu sein, diese Hemmung mit spezifischen TGF β-Antikörpern umzukehren.

Verfahren

Zellen und Aufrechterhaltung

Die Human-Erythroleukämie-Zelllinie TF1 wurde in RPMI 1640-Medium, das mit 5% Kalbsfötenserum, Penicillin/Streptomycin und 2 ng/ml rhGM-SCF ergänzt war, in einem feucht gehaltenen Inkubator, der 5% CO&sub2; enthielt, bei 37ºC gezüchtet. Kulturen wurden passagiert, wenn sie eine Dichte von 2 · 10&sup5;/ml erreicht hatten, und auf eine Dichte von 5 · 10&sup5;/ml verdünnt.

Cytokine und Antikörper

rhGM-CSF und rhIL-5 wurden von R&D Systems erhalten, rhTGF β&sub2; wurde von AMS Biotechnology erhalten. Kaninchen-Anti-TGF β2-Antikörper stammte von R&D Systems und Mäuse-Anti-TGF β1,2,3 von Genzyme. Andere Antikörper gegen TGF β&sub2; waren wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.

Titration der Proliferationshemmung durch TGF β&sub2;

Verdoppelnde Verdünnungen von TGF β&sub2; (800 pM - 25 pM) zur Erstellung einer Dosis- Response-Kurve wurden auf einer sterilen Mikrotiterplatte in 100 ul RPMI 1640-Medium, das 5% Kalbfötenserum und Antibiotika enthielt, angefertigt. Alle Verdünnungen wurden zumindest in Vierfach-Ansätzen durchgeführt. Zusätzliche Näpfe, die für Vergleiche mit Reagens und Zellen alleine 100 ul des obigen Mediums enthielten, waren ebenfalls enthalten.
TF1-Zellen wurden zweimal in serumfreiem RPMI 1640-Medium gewaschen und in RPMI 1640-Medium, das mit 5% Kalbfötenserum, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin ergänzt war, sowie 4 ng/ml rhIL-5 in einer Dichte von 2,5 · 10&sup5;/ml resuspendiert. 100 ul-Aliquoten wurden der zuvor hergestellten Verdünnungsreihen zugegeben und die Platte 48 h lang in einem befeuchteten Inkubator, der 5% CO&sub2; enthielt, bei 37ºC inkubiert.
Die Zellproliferation wurde kolorimetrisch durch Zugabe von 40 ul CellTiter96-Substrat (Promega) gemessen, wobei die Platte für weitere 4 h zum Inkubator zurückgeführt wurde und das Absorptionsvermögen schließlich bei 490 nm bestimmt wurde. Die prozentuelle Hemmung für jede Konzentration von TGF β&sub2; im Vergleich zu Näpfen mit Zellen alleine wurde dann berechnet.

Assay auf Neutralisierung der TGF β&sub2;-Hemmwirkung durch Anti-TGF β&sub2;-Antikörper

Die Neutralisation von TGF β&sub2; wurde bestimmt, indem verdoppelnde Verdünnungen jedes gereinigten Antikörpers in 100 ul Medium wie oben durchgeführt wurden. TGFβ&sub2; wurde jeder Antikörperverdünnung zugegeben, um eine Endkonzentration zu ergeben, die gleich jener war, die 50% Hemmung in der oben beschriebenen Titration ergab. Jede Verdünnung wurde in Vierfach-Ansätzen hergestellt. Zusätzliche Näpfe wurden für Vergleiche mit Antikörper alleine, Zellen alleine und Reagens hergestellt. Die Zellpräparierung und Bestimmung der Zellproliferation wurde wie oben beschrieben durchgeführt.

Ergebnisse

Es wurde gezeigt, dass TGF β&sub2; die Proliferation von TF1-Zellen in einer Konzentration von 50 pM um 50% hemmt. Diese Konzentration wurde für alle Neutralisierungsversuche eingesetzt.
Diese Assays zeigten, dass die TGF β&sub2;-Aktivität sowohl für scFv-Fragmente (Fig. 10) als auch für IgG4-Antikörper (Fig. 11) in Abhängigkeit von der Dosis neutralisiert wurde. Die Antikörperkonzentration, die 50% Hemmung ergab, wurde aus der Grafik bestimmt und ist in Tabelle 4 angegeben.

BEISPIEL 4

In einem Radiorezeptorassay gemessene Hemmung der TGFβ-Bindung an Rezeptoren durch Antikörper

Einzelketten-Fv-Fragmente und Gesamt-IgG4-Antikörper von verschiedenen Klonen wurden exprimiert und gereinigt und ihre Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von TGFβ an Rezeptoren in einem Radiorezeptorassay gemessen.

Reinigung von scFv

ScFvs, die einen Polyhistidinschwanz enthalten, werden durch Immobilisierungs-Metallaffinitätschromatographie gereinigt. Der bakterielle Klon, der das entsprechende Plasmid enthält, wird in 50 ml 2TY-Medium eingeimpft, das 2% Glucose und 100 mg/ml Ampicillin (2TYAG) enthält, und über Nacht bei 30ºC gezüchtet. Am nächsten Tag wird die Kultur zu 500 ml vorgewärmtem 2TYAG zugegeben und bei 30ºC 1 h lang gezüchtet. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und 500 ml 2TY zugegeben, das Ampicillin und 1 mM IPTG enthält, und bei 30ºC 4 h lang gezüchtet. Die Zellen werden dann durch Zentrifugieren gesammelt und in 30 ml eiskaltem 50 mM Tris HCl, pH 8,0, 20% (w/v) Saccharose, 1 mM EDTA, resuspendiert. Nach 15 min Kopfüber-Vermischen bei 4ºC wird das Gemisch mit 12.000 U/min 145 min lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und ihm etwa 1 ml NTA-Agarose (Qiagen 30210) zugegeben und bei 4ºC 30 min lang vermischt. Die Agaroseperlen werden ausgiebig mit 50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl gewaschen und in eine kleine Säule gefüllt. Nach weiterem Waschen mit 50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 7,4, wird scFv mit 50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 7,4, eluiert. 0,5 ml-Fraktionen werden abgenommen und die Protein enthaltenden Fraktionen durch Messen der A280nm identifiziert. Gepoolte Fraktionen werden eingeengt und scFv durch Gelfiltration in PBS auf einer Superdex 75-Säule (Pharmacia) weiter gereinigt.

Reinigung von Gesamtantikörpern

Vollständige IgG4-Antikörper wurden gereinigt, wie in Beispiel 2 beschrieben

Radiorezeptorassay für TGF-β

Die Neutralisation der TGF-β-Aktivität wird durch die Fähigkeit der scFvs und IgGs, die Bindung von ¹²&sup5;-I-markiertem TGF-β an seine Rezeptoren auf Human-Lungenkarzinomzellen A549 zu hemmen, gemessen.
A549-Zellen (ATCC CCL 185) werden in glucosereichem Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (Sigma D-6546), ergänzt mit 10% Kalbfötenserum (PAA), 2 mM Glutamin (Sigma G-7513), Penicillin/Streptomycin (Sigma P-0781), MEM mit nichtessentiellen Aminosäuren (Sigma M-7145), gezüchtet.
Zellen werden in 1-2 · 10&sup5; Zellen /ml / Napf in den Näpfen von 24-Napf-Clusterplatten verteilt und 24 h lang in serumfreiem DMEM gezüchtet. Zell-Monoschichten werden zweimal mit serumfreiem DMEM und 0,5 ml-Bindungsmedium (DMEM/Hams F12 (Sigma D-6421)) gewaschen, das 0,1 Vol.-% BSA enthielt und jedem Napf zugesetzt wurde.
Aliquoten von ¹²&sup5;I-TGF-β1 oder -β2 (70-90 TBq/mmol; Amersham International) mit 20 pM werden mit Antikörper in Bindungsmedium bei Raumtemperatur 1 h lang vorinkubiert. Proben von 0,5 ml TGF-β/Antikörper-Gemischen werden dann in Doppelansätzen den Zellmonoschichten zugegeben und 1 bis 2 h lang bei 37ºC inkubiert. Vergleichs näpfe enthalten TGF-β allein. Ungebundener TGF-β wird durch viermaliges Waschen mit Hank's Gleichgewichts-Salzlösung mit 0,1% BSA entfernt. Zellen werden in 0,8 ml 25 mM Tris HCl, pH 7,5, 10% Glycerin, 1% Triton X-100 bei Raumtemperatur 20 min lang solubilisiert. Der Inhalt jedes Napfs wird entfernt und ¹²&sup5;I in einem γ-Zähler gemessen. Die Effizienz jedes scFv oder IgG wird anhand der Konzentration an Antikörper- Kombinationsstellen gemessen, die zum Hemmen der Bindung von TGF-β um 50% (IC50; Tabelle 5) erforderlich ist. Daher liegen die IC50-Werte unter 10 nM und in manchen Fällen unter 1 nM, was auf sehr potente Antikörper hinweist.

BEISPIEL 5

Verhinderung der Narbenbildung durch Antikörper gegen TGF β1 und TGF β2 in verletztem Zentralnervensystem von Ratten

Logan et al., Eur. 3 Neuroscience 6, 355-363 (1994), zeigten in einem Rattenmodell von ZNS-Veletzung die verbessernde Wirkung eines neutralisierenden Truthahn-Antiserums gegen TGF β&sub1; auf die Ablagerung von Faser-Nervengewebe und die Bildung einer begrenzenden Gliamembran, welche die Läsion umgibt. Eine Studie wurde durchgeführt, um die Wirkungen neutralisierender, durch Engineering erzeugter Human-Antikörper, die sowohl gegen TGF β&sub1; als auch TGF β&sub2; gerichtet sind, im gleichen Rattenmodell zu untersuchen. Die Ableitung der Antikörper, die bei dieser Untersuchung eingesetzt werden, wurde in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.

Verfahren

Tiere und chirurgischer Eingriff

Gruppen von 5 weiblichen Sprague-Dawley-Ratten (250 g) wurden mit einer Intraperitoneal-Injektion anästhesiert. Die anästhesierten Ratten hatten eine stereotaktisch definierte Läsion in der rechten Okzipitalkortex (Logan et al., Brain Res. 587, P215-227 (1992)) und das Seitenventrikel wurde operativ mit einer Kanüle versehen und gleichzeitig exteriorisiert (Logan et al. (1994), s. o.).

Neutralisation von TGF β

Tieren wurden täglich intraventrikulär 5 ul gereinigte Anti-TGF β-Antikörper injiziert (Tabelle 3), die in einem Vehikel aus künstlicher Rückenmarksflüssigkeit verdünnt waren, wie von Logan et al. (1994), s. o., beschrieben. 14 Tage nach der Läsion wurden alle Tiere perfusionsfixiert und 7 mm Polyesterwachs-Schnitte wurden zur histochemischen Bewertung der Läsionsstelle durch Immunfluoreszenz-Färbung angefertigt.

Fluoreszenz-Immunhistochemie und Bildanalyse

Morphologische Veränderungen innerhalb der Wundstelle wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern gegen Fibronectin und Laminin verfolgt, die durch Anti- Spezies-FITC-Konjugate detektiert wurden (Logan et al. (1994), s. o.). Diese Veränderungen wurden durch Bildanalyse unter Einsatz eines Leitz-Konfokalmikroskops, das mit einem Biorad MRC500 Laser-Scanningsystem verbunden war, halbquantitativ bewertet. Die Ablesungen wurden an Standardpositionen auf halbem Weg entlang der Läsion vorgenommen.

Ergebnisse

Wirkung von Antikörpern gegen TGF β an der Stelle der ZNS-Verletzung

Die Quantifizierung der spezifischen relativen Fluroeszenz für jeden Antikörper wird in den Fig. 12a und b gezeigt. Laminin ist ein Maß für die Bildung der Glia limitans exter na entlang der Wundränder und bildet gemeinsam mit Fibronectin eine Matrix für faseriges Gewebe innerhalb des Zentrums der Wunde. Die Quantifizierung durch Bildanalyse dieser beiden Proteine ermöglicht das Bestimmen des Vernarbungsgrads an der Wundstelle.
Verglichen zum Salzlösungs-Vergleich (Fig. 12 a,b) gibt es eine beträchtliche Verringerung der Fibronectin- und Laminin-Immunlokalisierung in der Wunde in den mit Anti- TGF β-Antikörper behandelten Gehirnen. Das weist daher darauf hin, dass diese durch Engineering hergestellten Human-Antikörper, die gegen Epitope auf TGF β&sub1; und TGF β&sub2; gerichtet sind, die Auswirkungen der Verletzung am ZNS sowohl getrennt als auch gemeinsam verbessern, indem sie die Ablagerung der Zellmatrixproteine Fibronectin und Laminin innerhalb der Wundstelle verhindern. Zuvor hatten Logan et al. (1994), s. o.) die Wirksamkeit eines polyklonalen Truthahn-Antiserums, das gegen TGF β&sub1; gerichtet ist, gezeigt. Das ist ein erster Bericht über irgendwelche Antikörper gegen TGF β&sub2;, deren Wirksamkeit in diesem Modell gezeigt worden ist.

BEISPIEL 6

Bestimmung der Bindung von 6B1 IgG4 an aktive oder latente Form von TGF β&sub2;

TGFβ&sub2; wird ausschließlich als biologisch inaktiver oder latenter Komplex synthetisiert und sekretiert (Pircher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 158, 30-37 (1986)). Der latente Komplex besteht aus disulfidverbundenem TGFβ&sub2;-Homodimer, das nicht-kovalent an latenzassoziiertes Peptid (LAP) gebunden ist. Die Aktivierung von TGFβ&sub2; erfolgt, wenn es aus seinem verarbeiteten Vorläufer freigesetzt wird. Aktives TGFβ&sub2; kann mit LAP reversibel dissoziieren und reassoziieren, was zum Ein- bzw. Ausschalten seiner biologischen Wirksamkeit führt.
Es ist gezeigt worden, dass kultivierte PC-3-Adenokarzinom-Zellen (Ikeda et al., Biochemistry 26, 2406-2410 (1987)) beinahe ausschließlich latenten TGFβ&sub2; sekretieren, was eine geeignete Quelle für die Bestimmung der Bindung an die aktive oder latente Form von TGFβ&sub2; durch den Antikörper 6B1 IgG4 bereitstellt.

Verfahren

Zellkultur

PC-3 Prostata-Adenokarzinom-Zellen wurden bis zur Konfluenz in mit 10% FBS ergänztem Medium gezüchtet. Die Zellen wurden 3x mit PBS gewaschen und Zellen weitere 7 Tage lang in Serumfreiem Hams F12/DMEM, ergänzt mit 1,4 · 10&supmin;&sup5; M Tamoxifen (Brown et al., Growth Factors 3, 35-43 (1990)) kultiviert. Das Medium wurde entfernt, durch Zentrifugieren geklärt und in zwei 15 ml-Aliquoten unterteilt. Eine Aliquote wurde 15 min lang durch Zutropfen von 5 M HCl angesäuert, bis pH 3,5 erreicht war, und dann durch die ähnliche Zugabe von 5 M NaOH/1M HEPES, pH 7,4, neutralisiert. Dieses Verfahren aktiviert den latenten TGFβ2 quantitativ.

Kompetitions-ELISA

16 Näpfe einer ELISA-Platte wurden über Nacht mit 100 ul 200 ng/ml TGFβ&sub2; in PBS bei 4ºC beschichtet. Die Platte wurde 3x mit PBS Tween gewaschen und bei 37ºC mit 200 ul 3% Marvel in PBS blockiert.
Die folgenden Proben wurden bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert.
400 ul Hams F12/DMEM (Reagens-Blindvergleich)
400 ul Hams F12/DMEM plus 4 ug 6B1 IgG4-Antikörper (positiver Vergleich)
400 ul säureaktiviertes konditioniertes PC 3-Medium plus 4 ug 6B1 IgG4-Antikörper (aktive TGFβ&sub2;-Probe)
400 ul unbehandeltes konditioniertes PC 3-Medium plus 4 ug 6 B1 IgG4-Antikörper (latente TGFβ&sub2;-Probe)
Die ELISA-Platte wurde von Blockierungslösung entleert und 100 ul einer der obigen Lösungen zu sensibilisierten Näpfen vierfach zugegeben und bei Raumtemperatur 2 h lang inkubiert. Die Platte wurde 3x mit PBS/Tween gewaschen und die Näpfe mit 100 ul Ziegen-Anti-Human-IgG-γ-Ketten-alkalische Phosphatase-Konjugat, verdünnt 1 : 5000 in 1% Marvel/PBS, erneut gefüllt. Nach 1 h wurden die Näpfe 3x mir PBS/Tween gewaschen, und gebundener Antikörper wurde mit p-NPP-Substrat anhand des Absorptionsvermögens bei 405 nm bestimmt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse dieses Versuchs werden in Fig. 23 gezeigt.
Dieses Ergebnis zeigt deutlich, dass die Vorinkubation mit aktiviertem TGFβ2 die Bindung von 6B1 an TGFβ2, der an eine ELISA-Platte gebunden ist, hemmt, während die latente Form dies nicht tut. Dies beweist, dass sich solches 6B1 IgG4 nur an die aktive Form von TGFβ2 bindet.

BEISPIEL 7

Neutralisation der Hemmwirkung von TGFβ-Isoformen auf die Zellproliferation durch Antikörper gegen TGFβ2

Die neutralisierende Aktivität von 6B1 IgG4, 6H1 IgG4 (gereinigt wie in Beispiel 2) und eines monoklonalen Mäuse-Antikörpers (Genzyme; J. R. Dasch et al., s. o.) wurde für jede der TGFβ-Isoformen, TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3, im TF1-Zellvermehrungsassay wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen. Die Konzentration der TGFβ-Isoform betrug in jedem Assay 100 pM.
Wie in Fig. 16 gezeigt, neutralisiert 6B1 IgG4 TGFβ2 stark mit einem IC&sub5;&sub0; von etwa 2 nM (Tabelle 6). Das ist mit 10 nM für den monoklonalen Mäuse-Antikörper von Genzyme und 12 nM für 6H1 IgG4 vergleichbar. Weder 6B1 IgG4 noch 6H1 IgG4 neutrali sieren TGFβ1 signifikant (Fig. 17). Es gibt jedoch beträchtliche Neutralisierung von TGFβ3 durch sowohl 6B1- (IC&sub5;&sub0; etwa 11 nM) als auch 6H1-IgG4 (etwa 20 nM; Fig. 18). Das ist wesentlich niedriger als die Neutralisationspotenz des monoklonalen Genzyme- Antikörpers (IC&sub5;&sub0; etwa 0,1 nM).
Sowohl 6B1 IgG4 als auch 6H1 IgG4 sind stärkere Neutralisatoren von TGFβ2-Aktivität als von TGFβ3-Aktivität. Die Neutralisation von TGFβ3-Aktivität ist stärker, als aufgrund der relativen Bindung dieser beiden Isoformen durch die Antikörper (Beispiel 2) und die relative Bindung in einem Radiorezeptorassay (Beispiel 8) vorherzusagen wäre.

BEISPIEL 8

Mittels Radiorezeptorassay gemessene Hemmung der Bindung anderer TGFβ-Isoformen durch Antikörper gegen TGFβ2

Die Fähigkeit von 681 IgG4 zur Hemmung der Bindung von TGFβ-Isoformen gegen Rezeptoren wurde in einem Radiorezeptorassay wie in Beispiel 4 beschrieben gemessen.
6B1 IgG4 gehemmte die Bindung von ¹²&sup5;I-TGFβ2 mit einem IC&sub5;&sub0; von 0,05 nM. Es gab keine wesentliche Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-TGFβ1, während für ¹²&sup5;I-TGFβ3 6B1 IgG4 die Bindung mit einem IC&sub5;&sub0; von etwa 4 nM hemmte (Tabelle 6). Das weist auf die Potenz von 6B1 IgG4 in diesem Assay und seine Selektivität für die Neutralisation von TGFβ2-Aktivität hin. Die Kreuzreaktivität mit TGβ3 in diesem Assay liegt unter 2%.
Daher hemmt 6B1 IgG4 die Bindung von TGFβ2 an seine Rezeptoren im Vergleich zur Bindung von TGFβ3.

BEISPIEL 9

Bewertung von TGFβ1-Antikörpern für die therapeutische Verwendung

Die in Beispiel 1 isolierten Antikörper wurden durch in vitro-Messungen der Fähigkeit zur Hemmung von TGFβ1-Bindung an seine Rezeptoren und in vitro-Bindungseigenschaften bezüglich ihres potentiellen therapeutischen Werts bewertet.
In Beispiel 4 (Tabelle 5) zeigte CS32 die stärkste Hemmung der getesteten Antikörper für die Bindung von ¹²&sup5;I-TGFβ1 an Rezeptoren auf A549-Zellen. Ein weiterer Vergleich wurde zwischen CS32 und weiteren Antikörpern (CS35, CS37 und CS48) durchgeführt, die isoliert wurden, wie im Versuch aus Beispiel 1, Abschnitt 5c, beschrieben. Es wurde gezeigt, dass CS37 in diesem Assay mit einer IC&sub5;&sub0; von etwa 8 nM der potenteste dieser Antikörper war, verglichen mit 40 nM für CS32. Der IC50-Wert für CS32 ist höher als im vorherigen Assay (Tabelle 5), weil die Art des Assays mit sich bringt, dass der absolute Wert für IC&sub5;&sub0; mit den Assaybedingungen variieren kann.
Die Antikörper 1A-E5 und 1AH-6 (Beispiel 1, Abschnitt 1f) und davon abgeleitete Antikörper waren viel weniger potent als von 1B2 abgeleitete Antikörper beim Neutralisieren von TGFβ-Aktivität in diesem Radiorezeptorassay.
Daher war CS37 der potenteste Antikörperkandidat, wie durch die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-TGFβ1 an seinen Rezeptor bewertet.

Bewertung der Bindung an TGFβ3 durch Anti-TGFβ1-Antikörper

Es wurde gezeigt, dass sich die Antikörper 14A1 und 10A6 (Beispiel 1, Abschnitt 2(a) (iii)) gegenüber TGFβ2 und TGFβ3 bevorzugt an TGFβ1 binden, indem das gleiche Spezifitäts-ELISA eingesetzt wurde, wie in Beispiel 1, Abschnitt (d)(iii), eingesetzt wurde, mit der Ausnahme, dass Mikrotiterplatten mit 50 ul von entweder 0,2 ug/ml TGFβ1; 0,2 ug/ml TGFβ2; 0,2 ug/ml TGFβ3; 10 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) oder PBS (der unbeschichtete Napf) beschichtet wurden. Es wurde gezeigt, dass die Klone für TGFβ1 spezifisch sind, da das im mit TGFβ1 beschichteten Napf erzeugte Signal zumindest um das Fünffache stärker war als das Signal auf TGFβ2 und TGFβ3.
Antikörper, die von der gleichen 1B2-Linie stammten wie diese Antikörper, wie z. B. 27C1/10A6 IgG4 (der die gleiche VL enthält wie 10A6, und die 27C1 VH wurde durch Mutagenese von CDR3-Resten hergestellt) sollten die gleiche Kreuzreaktivität gegenüber TGβ3 aufweisen.

BEISPIEL 10

Konstruktion einer stark exprimierenden Zelllinie für 6B1 IgG4 unter Einsatz des Glutaminsynthase-Selektionssystems und Bewertung in einem Neutralisierungsassay

Konstruktion von p6H1 VH γ4

6B1 VH wurde aus 6H1 pG4D100 (Beispiel 2) durch PCR unter Einsatz der Oligonukleotide P16 und P17 amplifiziert. Diese DNA wurde durch PCR mit einem 158 bp DNA-Fragment von M13VHPCR1 (R. Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837 (1989)) verbunden, das eine Signalsequenz, Spleißstellen und ein Intron enthielt, wobei die Oligonukleotide P10 und P17 eingesetzt wurden. Das PCR-Produkt wurde mit HindIII und ApaI gespalten und in HindIII-ApaI-gespaltenes pγ4 kloniert (Lonza Biologics plc). Ein Plasmid mit der korrekten Insertion wurde identifiziert und als p6H1 VH γ4 bezeichnet (siehe Fig. 20). Das VH-Gen und die Flankierungsbereiche wurden in diesem Stadium sequenziert.

Konstruktion von 6B1ΔBaqm pLN10

Das VL-Gen von 6B1 wurde aus dem Klon von 6B1 scFv in pCANTAB6 amplifiziert (Beispiel 1) und in pUC119 subkloniert. Das VL-Gen wurde dann durch In vitro-Mutagenese mutiert, um eine interne BamHI-Stelle zu entfernen, wodurch die DNA-Sequenz, nicht aber die Proteinsequenz modifiziert wurde. In vitro-Nlutagenese wurde unter Einsatz des Oligonukleotids LamΔBamHI durchgeführt (Tabelle 1), wobei ein Set von Amersham International plc eingesetzt wurde. Das mutierte VL-Gen wurde unter Einsatz der Primer Vλ3backEuApa und HuJλ2-3-ForEuBam amplifiziert und als ApaLI-BamHI- Fragment in den Vektor vlcassetteCAT1 subkloniert. Das VL-Gen wurde dann als Hind- III-BamHI-Fragment in den Vektor pLN10 kloniert (Fig. 8), um den Vektor 6B1ΔBam pLN10 zu erzeugen.

Konstruktion von p6B1λ

Das 6B1 Vλ-Gen wurde durch PCR aus p6B1ΔBampLN10 amplifiziert, wobei die Oligonukleotide P22 und P26 eingesetzt wurden. Das Cλ-Gen wurde durch PCR aus pLN10- 10A6 amplifiziert (Beispiel 2), wobei die Oligonukleotide P25 und P19 eingesetzt wurden. Die 2 DNAs wurden durch Überlappungs-PCR unter Einsatz der Oligonukleotide P22 und P19 verbunden und das Produkt mit BstBI und EcoRI gespalten und in BstBI- EcoRI-gespaltenes pMR 15.1 kloniert (Lonza Biologics plc). Ein Plasmid mit der korrekten Insertion wurde identifiziert und als p6B1λ bezeichnet (Fig. 21).

Konstruktion des fertigen Expressionsvektors p6B1γ4gs

p6H1 VHγ4 und p65B1λ wurden mit BamHI und NotI gespalten, Fragmente wurden gereinigt und miteinander ligiert. Ein Plasmid der gewünschten Konfiguration wurde aus Transformanten identifiziert und als p6B1γ4gs bezeichnet (Fig. 22).

Transfektion von NSO mit p6B1 γ4gs

Stabile Transfektanden, die 6B1 IgG4 sekretieren, wurden selektiert, indem in BSO- Myelomzellen p6B1 eingebracht wurde, was das Wachsturn in glutaminfreiem (G-) Medium ermöglicht (C. R. Bebbington et al., Bio/Technology 10, 169-175 (1992)). 40 ug p6B1 γ4gs wurden durch Spaltung mit Pvul linearisiert. Die DNA wurde in 1,5 · 10&sup7; NSO-Zellen elektroporiert. Zellen wurden dann zu G + DEM/10% FCS zugegeben und 50 ul-Aliquoten in 6 · 96-Napf-Platten verteilt und 24 h lang stehengelassen. Das Medium wurde dann durch Zugabe von 150 ul G-DMEM/10% FCS selektiv gemacht. Drei Wochen später wurden gs&spplus;-Transfektanten durch ELISA auf die Fähigkeit zum Sekretieren von Human-IgG4λ-Antikörper gescreent. Die besten Produzenten wurden expandiert und weiter analysiert. Aus dieser Analyse wurde 5D8 als Produktionszelllinien- Kadidat ausgewählt. 5D8 wurde einmal durch Grenzverdünnung kloniert, wobei die Zelllinie 5D8-2A6 erhalten wurde.

Bewertung von 6B1 IgG4, abgeleitet von der Zelllinie 5D8-2A6 im TF1-Neutralisationsassay

6B1 IgG54 wurde aus der GS/NSO-Zelllinie 5D8-2A6 gereinigt, die in serumfreiem Medium gezüchtet wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben. Der 6B1 IgG4-Antikörper wurde im TF1-Neutralisationsassay untersucht, wie in Beispiel 3 beschrieben. In diesem Assay wurde ein IC&sub5;&sub0;-Wert von 1,8 nM erhalten. Nachfolgende Assays von Präparaten von 6B1 IgG4, die von der 5D8-2A6-Zelllinie abgeleitet waren, zeigten IC&sub5;&sub0;-Werte im Bereich von 0,65 bis 2 nM. Diese sind mit den Werten vergleichbar, die für 6B1 IgG4 erhalten wurden, das aus einer CHO-Zelllinie abgeleitet wurde (IC&sub5;&sub0; von 15 nM). Die für die IC&sub5;&sub0; für 6B1 IgG4 und 6H1 IgG4 in diesem Beispiel erhaltenen Werte sind aufgrund von Verbesserungen im Assay und bei der Expression und Reinigung der Antikörper zuverlässiger als jene, die in Beispiel 3 erhalten wurden, und werden in Tabelle 4 gezeigt. Es kann jedoch erwartet werden, dass der IC&sub5;&sub0;-Wert entsprechend den jeweiligen Bedingungen des Assays variiert.
Daher sorgt der 6B1 IgG4 für die potente Neutralisation von TGFβ2 und eignet sich zur Verwendung als Therapeutikum.

BEISPIEL 11

Bestimmung des Epitops auf TGFβ2 für den Antikörper 6B1 unter Verwendung einer Peptid-Phagenfreilegungssammlung

Der Antikörper 6B1 wurde durch Epitopkartierung weiter charakterisiert. Das erfolgte unter Verwendung eines Peptidphagen-Freilegungssammlung, um Peptidsequenzen zu selektieren, die sich spezifisch an 6B1 binden. Diese Peptidsequenzen wurden dann mit der Aminosäuresequenz von TGFβ2 verglichen. Die Korrelation zwischen Peptidsequenzen, die sich an 6B1 binden, und passenden Teilen der TGFβ2-Aminosäurese quenz weist auf ein Epitop von TGFβ2 hin, an das sich 6B1 bindet. Ein "Epitop" ist jener Teil der Oberfläche eines Antigens, an den sich ein spezifischer Antikörper bindet.
In diesem Beispiel wurde die eingesetzte Peptidsammlung konstruiert, wie von Fisch et al. (I. Fisch et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 7761-7766 (1996)) beschrieben, um eine Phagenfreilegungssammlung von 1 · 10¹³ unabhängigen Klonen zu ergeben. Phagen freilegende Peptide, die sich an den Antikörper 6B1 binden, wurden aus dieser Sammlung durch Panning selektiert. Dies erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
Gereinigter 6B1 IgG4-Antikörper mit 10 ug/ml in 4 ml PBS wurde durch Inkubieren über Nacht mit 4ºC auf ein Kunststoffröhrchen (Nung; maxisorp) aufgebracht. Nach dem Waschen und Blockieren mit MPBS (siehe Beispiel 1) wurde eine Aliquote der Peptidsammlung, die 5 · 10¹³ Phagen in 4 ml 3% MPBS enthielt, dem Röhrchen zugegeben und bei Raumtemperatur 1,5 h lang inkubiert. Das Röhrchen wurde 10-mal mit PBST (0,1%), dann 10-mal mit PBS gewaschen. Gebundene Phagenteilchen wurden aus dem Röhrchen durch Zugabe von 4 ml 100 mM Triethylamin und stationäres Inkubieren der Röhrchen für 10 min bei Raumtemperatur eluiert. Die eluierten Phagen wurden dann in ein Röhrchen gefüllt, das 2 ml 1 M-Tris-HCl (pH 7,4) und 10 ml 2YT-Kulturlösung enthielt. Die Phagen wurden dann zu 20 ml logarithmisch wachsenden E.coli TG1-Zellen zugegeben und 1 h lang unter Rütteln mit 100 U/min bei 37ºC gezüchtet. Die infizierten Zellen wurden dann auf 2YT-Agarmedium mit 15 ug/ml Tetracyclin in 243 mm · 243 mm-Teller (Nung) aufplattiert. Die Platten wurden bei 30ºC 18 h lang inkubiert. Kolonien wurden von den Platten in 10 ml 2TY-Kulturlösung geschabt, die 15 Vol.-% Glycerin enthielt, um sie bei -70ºC zu lagern.
250 ul Zellen aus der ersten Selektionsrunde wurden eingesetzt, um 500 ml 2YT-Kulturlösung (die 15 ug/ml Tetracyclin enthielt) in einen 2l-Spitzkolben zu impfen, und über Nacht bei 30ºC unter Rütteln mit 280 U/min gezüchtet. Eine 2 ml-Aliquote dieser Kultur wurde dann entnommen und zentrifugiert, um alle Zellen zu entfernen. 1 ml dieses Phagenüberstands wurde dann für eine zweite Selektionsrunde eingesetzt, wie oben be schrieben. Das Muster des Phagenwachstums und Panning wurden in einer dritten und einer vierten Selektionsrunde wiederholt.
Einzelne Kolonien aus der vierten Selektionsrunde wurden eingesetzt, um 100 ml 2YT- Kulturlösung (die 15 ug/ml Tetracyclin enthielt) in einzelne Näpfe von 96 Napf-Gewebekulturplatten zu impfen und über Nacht unter leichtem Rütteln mit 100 U/min bei 30 ºC gezüchtet. Glycerin wurde in einer Endkonzentration von 15 Vol.-% zugegeben, und diese Masterplatten wurden bei -70ºC gefroren gelagert.
Diese Klone wurde mittels ELISA auf Klone gescreent, die sich spezifisch an den Antikörper 6B1 banden. Zellen von den Masterplatten wurden eingesetzt, um 96 Napf-Gewebekulturplatten zu impfen, die 100 ul 2YT-Kulturlösung (die 15 ug/ml Tetracyclin enthielt) pro Napf zu impfen, und über Nacht unter leichtem Rütteln mit 100 U/min bei 30ºC gezüchtet. Die Platten wurden dann mit 2.000 U/min zentrifugiert. Die 100 ul- Phagenüberstände aus jedem Napf wurden gewonnen und jeweils mit 100 ul 4% Magermilchpulver in 2xPBS vermischt. 100 ul eines jeden davon wurden dann durch Phagen-ELISA getestet. Gereinigter 6B1 IgG4-Antikörper mit 10 mg/ml in PBS wurde durch Inkubieren über Nacht bei 4ºC auf flexible Mikrotiterplatten aufgetragen. Vergleichsplatten, die mit einem irrelevanten IgG4-Antikörper in 10 mg/ml beschichtet waren, wurden ebenfalls hergestellt. Die ELISAs wurden durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben und mit dem chromogenen Substrat pNPP (Sigma) sichtbar gemacht.
Etwa 20% aller analysierten Klone banden sich an die 6B1-beschichtete Platte. Keiner der analysierten Klone band sich an ELISA-Platten, die mit dem irrelevanten Antikörper beschichtet waren. Die Bindung schien daher für die Bindungsstelle des Antikörpers 6B1 spezifisch zu sein.
Klone, die 6B1 banden, wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert wie von Fisch et al. beschrieben. Es wurden insgesamt 31 verschiedene Klone sequenziert. Diese wurden unter Einsatz von Mac Vector-Software auf mögliche Übereinstimmungen mit der Se quenz von TGFβ2 analysiert. Von diesen Klonen zeigten 12 geringe Übereinstimmung mit der Sequenz von TGFβ2, und 10 wiesen keinerlei Ähnlichkeit auf. Es gab jedoch 4 verschiedene Klone (von denen einige mehr als einmal selektiert worden waren), die geeignete Übereinstimmung mit einem Bereich der TGFβ2-Sequenz zwischen den Aminosäurepositionen 56 bis 69 aufwiesen. Tabelle 8 zeigt die Aminosäuresequenz des Exons jedes dieser Klone, das für die Bindung an 6B1 verantwortlich zu sein scheint.
Keiner dieser Klone stimmt genau mit der Sequenz von TGFβ2 überein, noch gibt es eine einzige klare Konsenssequenz zwischen den Peptidklonen. Dennoch zeigt eine sorgfältige Untersuchung der Sequenzen eine Übereinstimmung mit den Resten 60 bis 64 von TGFβ2 (Tabelle 8). Das Aneinanderreihen von vier Klonen mit L an Position 64 zeigt 2 Klone mit R an Position 60, 1 Klon mit V an Position 61, 2 mit L an Position 62 und 3 mit S an Position 63. Dies ergibt die Sequenz RVLSL, die den Resten 60 bis 64 entspricht, die einen Teil der α-Helix bilden, die den Heelbereich von TGFβ2 bildet. Von einem Antikörper, der diese Sequenz erkennt, wird nicht erwartet, dass er mit jedem Aminosäurerest in der Helix Kontakt herstellt, und daher könnte ein Peptid, das diese Sequenz nachahmt, beträchtliche Sequenzvariation an den Positionen aufweisen, die den Teilen der Helix entsprechen, die keinen Kontakt herstellen. Es wird angenommen, dass die erkannte α-Helix einen Teil des Rezeptorbindungsbereichs von TGFβ2 bildet (D. L. Griffith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 878-883 (1996)).

BEISPIEL 12

Bestimmung der Bindung von 6B1 IgG4 an TGFβ2 in Säugetiergewebe und des Fehlens von Kreuzreaktivität mittels Immunhistochemie

Um TGFβ2 in Formalin-fixierten Gewebeabschnitten zu detektieren, die das Cytokin exprimieren, wird der Gewebeabschnitt allgemein mit einer Protease, nämlich Pronase E, behandelt. Dieser Spaltungsschritt demaskiert das Antigen, wodurch möglicherweise latenter TGFβ2 aktiviert wird, was aktiven TGFβ2 ergibt. 6B1 IgG4 detektiert nur die aktive Form von TGF β2 (Beispiel 6).
Unter Einsatz von 6B1 IgG4 und Immunhistochemischen Verfahren wurde die Verteilung von TGFβ2 in einer in Formalin fixierten, in Wachs eingebetteten normaler Rattenniere und versuchsweise mit Läsion versehenem Rattengehirngewebe nach der Pronase E-Spaltung bestimmt.
Die Reaktivität von 6B1 IgG4 in gefrorenen Cryostat-Abschnitten von aceton-nachfixiertem normalem Human-Gewebe wurde ebenfalls ermittelt, um zu bestimmen, ob eine Bindung an andere Antigene in diesen Geweben vorlag.

Verfahren

Rattengewebe

In Paraffin eingebettete Rattengewebe wurden entwachst und mit einer Reihe Alkohole rehydriert. Die Schnitte wurden dann genau 8 min mit 0,1% Pronase E behandelt und dann in Wasser gewaschen. TGFβ2 wurde in den Schnitten unter Einsatz von 6B1 IgG4 mit 500 nmg/ml nach jener Vorschrift detektiert, die mit einem Vectastain ABC (Avidin- Biotin-Komplex) Set von Vector Laboratories bereitgestellt wurde. Auf den Nierenschnitten wurde gebundener Antikörper mit alkalischer Phosphatase lokalisiert, und auf Rattengehirngewebe wurde Peroxidase eingesetzt.

Human-Gewebe

Es wurden folgende Humangewebeproben eingesetzt: Nebenniere, Aorta, Blut, Dickdarm, Dünndarm, Gehirn, Niere, Lymphknoten, Leber, Lunge, Milz, Bauchspeicheldrüse, Skelettmuskel, Herzmuskel, Schilddrüse, Nerven, Haut, Auge.
Cryostatschnitte und -abstriche wurden 15 min lang in Aceton fixiert, bevor 6B1 IgG4- Antikörper angewandt wurde, der mit FITC markiert war, wobei ein Sigma Immunoprobe-Set eingesetzt wurde. Der markierte Antikörper wurde 18 h lang bei 4ºC inkubiert, dann unter Einsatz eines indirekten Verfahren uvV alkalischer Phosphatase detektiert (Detektion mit einem Anti-FITC-Antikörper gefolgt von Enzym-konjugiertem Anti-Spezies-Antikörper). In Fällen, wo endogene Aktivität von alkalischer Phosphatase nicht unterdrückt werden konnte, wurde ein Peroxidasedetektionsverfahren eingesetzt. In diesem Fall wurde keine Pronase-Spaltung eingesetzt, daher detektierte dieses Verfahren nur Antigene, mit denen der Antikörper kreuzreagiert.

Ergebnisse

Rattengewebe

Rattennieren zeigten positive Färbung in Röhrchen, die sowohl auf der apikalen als auch der basolateralen Seite vorhanden war, was das Vorhandensein von TGF β2 in den Geweben zeigt.
Verletztes Rattengehirn am Tag 5 nach der Verletzung zeigte positive Färbung von Neuronen, Astrocyten und Makrophagen, die in normalem Gehirn fehlten. Das weist darauf hin, dass TGF β2 im Rattengehirn exprimiert wird.

Humangewebe

Unter Einsatz fixierter Cryostatschnitte der oben angeführten Gewebe wurde keine spezifische Färbung von Gewebe beobachtet. Daher kreuzreagiert 6B1 IgG4 nicht mit Antigenen in diesen Geweben und bindet sich bei therapeutischer Verwendung in Gewebeschnitten nur an aktiven TGF β2, was durch immunhistochemische Verfahren detektiert wird.

BEISPIEL 13

Kinetische Analyse der Bindung von 6B1-Einzelketten-Fv und 6B1 IgG4 an TGFβ-Isoformen

Oberflächenplasmonresonanz (SPR) kann eingesetzt werden, um Echtzeit-Wechselwirkungen zwischen einem immobilisierten Liganden und einem Analyten zu untersuchen und aus diesen Daten kinetische Konstanten abzuleiten. Dies wurde unter Einsatz des BIAcore 2000 Systems (Pharmacia Biosensor) mit auf Oberflächen immobilisierten Antigenen und Antikörpern als Analyten durchgeführt.
Beim System werden die optischen Eigenschatten von Oberflächenplasmonresonanz eingesetzt, um Änderungen der Proteinkonzentration innerhalb einer Dextranmatrix zu detektieren. Antigen ist in einer festgelegten Menge kovalent an die Dextranmatrix gebunden, und wenn eine Antikörper enthaltende Lösung über die Oberfläche fließt, an der dieses befestigt ist, bindet sich Antikörper an das Antigen, und es gibt eine nachweisbare Änderung der lokalen Proteinkonzentration und daher eine Zunahme im SPR- Signal. Wenn die Oberfläche mit Puffer gewaschen wird, dissoziieren Antikörper und Antigen, und dann gibt es eine Reduktion des SPR-Signals, so dass die Geschwindigkeit von Assoziation und Dissoziation sowie die zu einer bestimmten Zeit an das Antigen gebundene Antikörper-Menge gemessen werden können. Die Änderungen des SPR-Signals werden in Form von Resonanzeinheiten (RU) aufgezeichnet und bezogen auf die Zeit entlang der Y-Achse eines Sensorgramms aufgetragen.
Die Dichte von immobilisierten Liganden an der Oberfläche eines BIACore-Chips ist wichtig, wenn kinetische Daten aus den angefertigten Sensorgrammen abgeleitet werden. Sie muss ziemlich niedrig sein, so dass nur eine geringe Menge an Analyt-Antikörper zur Sättigung der Chipoberfläche erforderlich ist. Aus Gründen der Einfachheit ist die Dichte einer Chipoberfläche in RUs angegeben, und die ideale Menge für einen Liganden wie TGFβ2 oder TGFβ3 (25 kDa) beträgt 400-600 RUs, bezogen auf die Grundlinie, die bei der Immobilisierung des Liganden an der Oberfläche festgelegt wird. Die tatsächliche Menge an TGFβ, die zugegeben werden muss, um die richtige Dichte zu erhalten, muss durch Untersuchungen bestimmt werden, ist aber reproduzierbar, sobald die richtige Konzentration gefunden worden ist.
Die Immobilisierung des Liganden an der Dextranmatrix der Chipoberfläche wird über Aminogruppen auf Lysin-Seitenketten im Protein und Carboxylgruppen in der Dextran matrix erleichtert. Die Carboxylgruppen im Dextran werden mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) und N-Ethyl-N'-(3-diethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) aktiviert, das Antigen in saurer Lösung wird dann an die Oberfläche gebunden, und schließlich werden alle nicht-umgesetzten Carboxylgruppen mit Ethanolamin blockiert.
Die Immobilisierung von Ligand wird durch das BIACore 2000-Gerät automatisiert, und alle Schritte werden im Autosampler oder in der Durchflusszelle auf der Dextranoberfläche des Chips durchgeführt. Der während des gesamten Immobilisierungsverfahrens und der Analyse der Proben eingesetzte Puffer ist Hepes-gepufferte Salzlösung (HBS) mit einem Tensid (Pharmacia Biosensor). Die Chips (Pharmacia, CM5) weisen einen Dextranüberzug auf einer dünnen Goldschicht auf. NHS mit 100 mM und EDC mit 400 mM werden durch den Autosampler vermischt, und dann wird ein fixes Volumen über die Durchflusszellen-Oberfläche injiziert. Dem folgt eine Injektion von Antigen in einem geeigneten Puffer. Im Fall von TGFβ wurde eine Oberfläche mit der richtigen Dichte erhalten, indem 25-30 ug/ml Lösung von TGFβ2 (AMS) oder TGFβ3 (R&D Systems) in 10 mM Acetat eingesetzt wurden. Nach der Injektion des Liganden wird der Chip unter Einsatz von 1 M Ethanolamin blockiert. Die Gesamtmenge an gebundenem TGFβ wurde anhand der Gesamtzunahme der Resonanzeinheiten über diesen Zeitraum bewertet.
Um die kinetischen Parameter zu bestimmen, wurde eine Reihe von Verdünnungen der Antikörperproben in HBS von etwa 500 ug/ml hinunter bis zu weniger als 1 ug/ml, üblicherweise durch verdoppelnde Verdünnungen, vorgenommen. Nachdem der Antikörper über die Antigenoberfläche injiziert worden ist, wird die Oberfläche mit HBS gewaschen, dann durch Abstrippen des gebundenen Antikörpers mit einem Schub von 100 mM HCl regeneriert. Bei höheren Antikörper-Konzentrationen wird das Antigen auf der Chipoberfläche gesättigt und die Off-Rate wird beim Waschen mit Puffer in der Dissoziationsphase bestimmt. Zum Bestimmen der On-Rate werden niedrigere Antikörper- Konzentrationen eingesetzt, was eine lineare Bindungsphase im Sensorgramm ergibt, was die kon-Bestimmung ermöglicht.
Die Verdünnungsreihe wurde an einem anderen Präparat des gleichen Antikörpers wiederholt.
Um die Sensorgramme zu manipulieren, um die kinetischen Konstanten kon und koff zu erhalten, wird das BIAevaluation-Softwarepaket eingesetzt. Für jede Bindungskurve, die bei den Berechnungen eingesetzt wurde, wurde darauf geachtet, dass die Bedingungen für die Bestimmung der kinetischen Konstanten geeignet waren.
6B1 IgG4 wurde aus der GS/NSO-Zelllinie aus Beispiel 10 gereinigt, wie in Beispiel 2 beschrieben. 6B1-Einzelketten-Fv wurde intrazellulär in E.coli exprimiert, in vitro umgefaltet (unter Einsatz der Methodik von WO 94/18227) und gereinigt, was ein homogenes Produkt ergab. Die Werte von kon und koff wurden für 6B1 IgG4 für die Bindung sowohl an TGβ2 als auch TGFβ3 bestimmt, und für Einzelketten-Fv 6B1 für die Bindung an TGFβ2. Die Dissoziationskonstante wurde berechnet, indem koff durch kon dividiert wurde. Die Werte für diesen kinetischen Parameter sind in Tabelle 7 angegeben.
Somit zeigen 6B1 scFv und 6B1 IgG4 sehr niedrige Dissoziationskonstanten von 2,3 nM bzw. 0,89 nM für TGFβ2 und es liegt 9% Kreuzreaktivität mit TGFβ3 vor (wie durch das Verhältnis der Dissoziationskonstanten von 6B1 IgG4 für TGFβ3 und TGFβ2 beurteilt). Zum Vergleich wurden in früheren Studien, wo die Standardfehler gröβer und die Werte weniger präzise waren, die Kd-Werte für TGFβ2 mit 0,7 nM für 6A5 scFv (Tabelle 2) und 2 nM für 6H1 IgG4 (Beispiel 2) ermittelt. Die Kd-Werte für alle gegen TGFβ2 gerichteten Antikörper, welche die gleiche 6H1 VH-Domäne aufweisen, liegen unter 10 nM.

BEISPIEL 14

Bindung eines den Resten 56 bis 69 von TGFβ2 entsprechenden Peptids an 6B1 IgG4

Es wurde ein Peptid synthetisiert, das den Aminosäuren von TGFβ2 entspricht, welche die Reste RVLSL umgeben, d. h. das von der Selektion von Phagen aus der Peptid-Freilegungssammlung identifizierte Epitop (Beispiel 11).
Das 17-Mer-Peptid CGG-TQHSRVLSLYNTIN (TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;; synthetisiert von Cambridge Research Biochemicals) enthält die Reste 56 bis 69 von TGFβ2 mit RVLSL (Reste 60 bis 64) in seiner Mitte. Die N-terminale Verlängerung CGG ist ein Spacer mit einem Cysteinrest zur Erleichterung der Bindung des Peptids an Trägerprotein. Das Peptid, das den Resten 56 bis 69 von TGFβ1 entspricht (TGβ1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;; CGG-TQYSKVLSLYNQHN) wurde ebenfalls synthetisiert. Als Vergleich wurde das irrelevante Peptid GPEASRPPKLHPG eingesetzt.
Zwei Ansätze wurden durchgeführt, um zu bestätigen, das das Epitop auf TGFβ2 für 6B1 IgG4 die Aminosäuren RVLSL umfasst.
(i) Bewertung der Fähigkeit von 6B1 IgG4 zur Bindung an TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; und TGFβ1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;, gebunden an BSA, mittels ELISA
(ii) Bewertung der Fähigkeit von Peptiden zur Bindung an 6B1 IgG4, aufgetragen auf BIAcore Sensorchips

(i) Bewertung der Fähigkeit von 6B1 IgG4 zur Bindung an TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; und TGFβ1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;, gebunden an BSA, durch ELISA

Die Bindung von 6B1 IgG4 an die an BSA konjugierten synthetischen Peptide TGFβ2&sub5;&sub6;&submin; &sub6;&sub9; und TGFβ1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; wurde in einem ELISA-Assay bewertet. Das wurde mit der Bindung des Vergleichsantikörpers 2G6 IgG4 verglichen, bei dem es sich um einen durch Engineering hergestellten Antikörper mit einer Schwerkette, die eine VH von einem Anti körper enthält, der gegen das Hapten NIP gerichtet ist, kombiniert mit einer Leichtkette handelt, die eine VL von einem Antikörper enthält, der gegen Lysozym gerichtet ist.

Verfahren

Jeweils 2 mg der Peptide TGFB1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; und TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; wurden an BSA konjugiert, wobei ein Inject Activated Immunogen Conjugation-Set (Pierce) eingesetzt wurde.
Eine Immunosorp-Mikrotiterplatte (Nung) wurde über Nacht mit 10 ug/ml der konjugierten Peptide in PBS beschichtet (Reihen A-D TGFβ1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;, Reihen E-F TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;) mit 100 ul/Napf. Die Näpfe wurden 3x mit PBS-Tween gewaschen und die folgenden Zusätze vorgenommen: Spalte - 100 ul PBS in jedem Napf als Reagensvergleich; Spalte 2, Reihen A, B, E und F - 200 ul 6B1 IgG4 10 ug/ml; Spalte 2, Reihen C, D, G und H - 200 ul 2G6 IgG4 10 ug/ml
In alle übrigen Näpfe wurden 100 ul PBS gefüllt. Um verdoppelnde Verdünnungen der Antikörper herzustellen, wurden 100 ul jedes Napf in Spalte 2 entfernt und in den nächsten Napf in Spalte 3 gefüllt. Die Probe wurde vermischt, 100 ul entfernt und dem nächsten Napf in Spalte 4 zugegeben. Dieser Vorgang wurde die Platte entlang wiederholt, wobei zumindest 100 ul verworfen wurden. Die Platte wurde dann bei 4ºC 18 h lang inkubiert.
Nach 3x Waschen mit PBS-Tween wurden die Näpfe mit 100 ul eines Konjugats von Ziegen-F(ab')&sub2;-Fragment an alkalische Phosphatase wiederbefüllt, das für die Human- IgG-γ-Kette spezifisch war, verdünnt 1 : 1.000 in PBS, und eine weitere Stunde lang inkubiert. Nach 3 weiteren Wäschen mit PBS-Tween zeigte sich gebundener Antikörper mit p-NPP-Substrat für 20 min.

Ergebnisse

Es wurde gezeigt, dass sich 6B1 IgG4 an beide konjugierte Peptide (Fig. 15) band, aber das mit TGB1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; erhaltene ELISA-Signal war viel schwächer als jenes, das mit TGFβ2&sub5;&sub6;&submin; &sub6;&sub9; in einer äquivalenten Konzentration von 6B1 IgG4 erhalten wurde. Eine etwa 8- bis 10-mal höhere Konzentration an 6B1 IgG4 war erforderlich, um mit TGβ1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; ein zu TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; äquivalentes Signal zu erhalten. Mit dem Vergleichs-2G6 IgG4-Antikörper wurde mit keinem der Peptid-BSA-Konjugate ein Signal erhalten. 6B1 IgG4 bindet sich daher stark an TGFb2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;, und bindet TGFβ1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;, gebunden an BSA, schwächer.

(ii) Bewertung der Fähigkeit von Peptiden zur Bindung an 6B1 IgG4, aufgetragen auf einen BIAcore Sensorchip

Die Bindung von 6B1 IgG4 an TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; wurde durch die Bindung des Peptids an 6B1 IgG4 bestätigt, das auf einen BIACore-Sensorchip aufgetragen war. Die Bestimmung der Bindungseigenschaften durch Oberflächenplasmonresonanz unter Einsatz des Pharmacia BIACore 2000 wurde in Beispiel 13 beschrieben. Das Verfahren zur Herstellung eines mit 6B1 IgG4 beschichteten BIACore-Sensorchips war wie jenes für die Kopplung mit TGFβ2, wie in Beispiel 13 beschrieben, mit der Ausnahme, dass 6B1 IgG4 in 5 ug/ml in 10 mM Acetatpuffer, pH 3,5, gebunden wurde. Eine Oberfläche mit 5000 RU wurde unter Einsatz von 25 ul 6B1 IgG4 erzeugt.
20 ul der Peptide wurden auf die 6B1-Oberfläche mit 1 mg/ml aufgebracht, wobei die Oberfläche unter Einsatz eines Säurepulses regeneriert wurde, um gebundenes Peptid zwischen Proben zu entfernen. Das Ausmaß an Bindung wurde durch Festlegen einer Grundlinienreaktion des absoluten RU vor dem Injizieren und anschließendes Subtrahieren desselben vom Wert bei 20 s nach vollständiger Injektion bewertet, was eine relative Reaktion in RU ergab. Dies wurde als Ausmaß der Bindung an die 6B1-Oberfläche angenommen.
Die erhaltene Bindung wird in Tabelle 9 gezeigt. Es gibt ein sehr geringes Ausmaß an Bindung des irrelevanten Peptids. TGFβ1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9; schien sich spezifisch in einer geringen Menge an 6B1 IgG4 zu binden. Das TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;-Peptid band sich an 6B1 IgG4 spezifisch und viel stärker.
Das geringe Ausmaß von Bindung von 6B1 IgG4 an das TGFβ1-Peptid im ELISA und BIACore-Assay ist nicht unerwartet, wenn in Betracht gezogen wird, dass 10 der 14 TGFβ-Aminosäuren mit dem TGFβ2-Peptid identisch sind. Nichtsdestoweniger bindet sich 681 IgG4 an das TGFβ2&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;-Peptid viel stärker als an clas TGFB1&sub5;&sub6;&submin;&sub6;&sub9;-Peptid. Das Ausmaß an Unterscheidung zwischen diesen TGFβ1- und TGFβ2-Peptiden ist jedoch viel geringer als bei den Radiorezeptor- (Tabelle 6) und Neutralisationsassays (Tabelle 6 und die Fig. 16 und 17) mit nativen Isoformen. Bei diesen Assays neutralisiert 6B1 IgG4 TGFβ2 stark, hat aber geringe Auswirkungen auf biologische TGFβ1-Aktivität. Diese größere Unterscheidung reflektiert vermutlich den Kontext der Reste der Peptide in den nativen Isoformen.

SCHLUSSFOLGERUNGEN

Diese Ergebnisse sprechen für die Zuordnung des Epitops von 6B1 IgG4 auf TGFB2 zu den Aminosäuren im Bereich der Reste 60 bis 64. Das in diesem Beispiel eingesetzte Peptid, die Reste 56 bis 69, entspricht den Aminosäuren von α-Helix H3 (M. P. Schlunegger & M. G. Grutter, Nature 358, 430-434 (1992)). TFβ2 bildet ein Kopf-an-Schwanz- Dimer mit der α-Helix H3 (auch als Heel bezeichnet) einer Untereinheit, die eine Grenzfläche mit Fingerbereichen (einschließlich der Reste 24 bis 37 und Reste im Bereich der Aminosäuren 91 bis 95; auch als Finger 1 und 2 bezeichnet) von der anderen Untereinheit (S. Daopin et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 17, 176-192 (1993)). Es ist vorgeschlagen worden, dass die primären Strukturmerkmale, die mit dem TGFβ2-Rezeptor wechselwirken, aus Aminosäuren am C-terminalen Ende der α-Helix H3 von einer Kette gemeinsam mit Resten der Finger 1 und 2 der anderen Kette bestehen (D. L. Griffith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 878-883 (1996)). Die Identifizierung eines Epitops für 6B1 IgG4 innerhalb der α-Helix H3 von TGFβ2 steht damit im Einklang, dass 6B1 IgG4 die Rezeptorbindung verhindert und die biologische Aktivität von TGFβ2 neutralisiert.
Wenn das Epitop für 6B1 IgG4 dreidimensional ist, kann es andere nicht zusammenhängende Epitope geben, an die sich der Antikörper binden kann.
Es gibt frühere Hinweise dafür, dass Antikörper, die gegen diesen Bereich von TGFβ2 gerichtet sind, für TGFβ2 spezifisch sein und seine Aktivität neutralisieren können. Flanders et al. (Development 113, 183-191 (1991)) zeigten, dass polyklonale Antiseren gegen die Reste 50 bis 75 von reifem TGFβ2 in Kaninchen gezüchtet werden können und dass die Antikörper in Westernblots TGFβ2, nicht aber TGFβ1 erkannten. In einer früheren Arbeit zeigten K. C. Flanders et al. (Biochemistry 27, 739-746 (1988)), dass polyklonale Antikörper, die in Kaninchen gegen die Aminosäuren 50 bis 75 von TGFβ1 gezüchtet werden können, die biologische Aktivität von TGFβ1 neutralisieren können. Beim Antikörper, der isoliert und charakterisiert worden ist, d. h. 6B1 IgG4, handelt es sich um einen Human-Antikörper, der gegen Aminosäuren in diesem Bereich gerichtet ist und die biologische Aktivität von Human-TGFβ2 neutralisiert. Es ist überraschend, dass ein solcher neutralisierender Antikörper gegen TGFβ2 bei Menschen (wo die Immunisierung mit einem Peptid aus ethischen Gründen nicht eingesetzt werden kann) direkt aus einem Phagenfreilegungs-Antikörperrepertoire isoliert werden kann. Tabelle 1: Oligonukleotidprimer, die bei der Identifizierung und Charakterisierung von TGFβ1-Antikörpern eingesetzt werden Tabelle 2: Eigenschaften von Einzelketten-Fv-Fragmenten zur Bindung an TGFβ1 oder TGFβ2, bestimmt unter Einsatz von BIACore Tabelle 3: Tägliche Dosismengen für einzelne Tiere in jeder Gruppe Tabelle 4: I. C.&sub5;&sub0;-Werte für Antikörper im TF1-Assay
nd = nicht bestimmt

Tabelle 5: I. C.&sub5;&sub0;-Werte für Antikörper, gemessen unter Einsatz eines Radiorezeptorassays

Anti-TGF-β1-Antikörper IC&sub5;&sub0;, nM

7A3 scFv > 100
31G9 scFv 30
CS32 scFv 4.5
CS39 scFv ~60
27C1/10A6 IgG 9
VT37 scFv ~100

Anti-TGFβ2-Antikörper IC&sub5;&sub0;, nM

6A5 scFv 1.5
6A5 IgG ~6
6B1 scFv 0.3
6B1 IgG 0.6
6H1 scFv 0.22
6H1 IgG ~10
11E6 IgG 1.6
14F12 scFv 3
VT37 scFv 2 Tabelle 6. Wirksamkeit der Neutralisierung von TGFβ-Isoformen Tabelle 7: Kinetische Parameter von 6B1 IgG4 und 6B1-Einzelketten-Fv

Tabelle 8: Peptidsequenzen von Phagen, die sich an 6B1 IgG4 binden

Diese Tabelle zeigt die Aminosäuresequenz von 4 Phagen-Peptidfreilegungsklonen, die eine Übereinstimmung mit der Sequenz von TGFβ2 aufweisen. Diese Klone sind unterhalb des relevanten Teils der Sequenz von TGFβ2 angeordnet, die von den Aminosäurepositionen 56 bis 77 gezeigt wird.
TGFβ2 TQHSRVLSLYNTINPEASASPC
Klon 1 RQLSLQQRMH
Klon 2 DPMDMVLKLC
Klon 3 WSEFMRQSSL
Klon 3 VESTSLQFRG Tabelle 9: Bindung von Peptiden von TGFβ an 6B1 IgG4, immobilisiert auf einem BIACore-Chip

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: Cambridge Antibody Technoogy Limited
(B) STRASSE: The Science Park, Melbourn
(C) STADT: Royston
(D) GRAFSCHAFT: Cambridgeshire
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: SG8 6JJ
(A) NAME: Thomson, Julia Elisabeth
(B) STRASSE: 19 Elm Way, Melbourne
(C) STADT: Royston
(D) GRAFSCHAFT: Herts
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: SG8 6UH
(A) NAME: Vaughan, Tristan John
(B) STRASSE: 9 Villa Road, Impington
(C) STADT: Cambridge
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: CB4 4NZ
(A) NAME: William, Andrew James
(B) STRASSE: 27 Green Streent, Forest Gate
(C) STADT: London
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: E7 8DA
(A) NAME: Green, Jonathan Alexander
(B) STRASSE: 21 Balsham Road
(C) STADT: Linton
(D) GRAFSCHAFT: Cambridgeshire
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: CB1 6LD
(A) NAME: Jackson, Ronald Henry
(B) STRASSE: 31 Kingston STreet
(C) STADT: Cambridge
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: CB1 2NU
(A) NAME: Bacon, Louise
(B) STRASSE: Foxhill Wing, Hinton Way
(C) STADT: Great Shelford
(D) GRAFSCHAFT: Cambs
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: CB2 5AN
(A) NAME: Johnson, Kevin Stuart
(B) STRASSE: 79 West Drive
(C) STADT: Caldecote Highfields
(D) GRAFSCHAFT: Cambs
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: CB3 7NY
(A) NAME: Wilton, Alison Jane
(B) STRASSE: 46 Huntingdon Road
(C) STADT: Cambridge
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: CB3 0HH
(A) NAME: Tempest, Philip Ronald
(B) STRASSE: 43 High Street, West Wratting
(C) STADT: Cambridge
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: CB1 5CU
(A) NAME: Pope, Anthony Richard
(B) STRASSE: 179 Gwydir Street
(C) STADT: Cambridge
(E) STAAT: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: CB1 2LW
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Spezifische Bindungselemente für menschlichen transformierenden Wachstumsfaktor-β; Materialien und Verfahren
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 110
(iv) COMPUTERLESBAREFORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Floppydisk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Relase Nr. 1.0, Version Nr. 1.25 (EPO)
(v) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
ANMELDUNGSNUMMER: PCT/GB96/02450
(vi) PRIORITÄTSANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: GB 9520496.3
(B) EINREICH DATUM: 6. Oktober 1995
(vi) PRIORITÄTSANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: GB 9601081.4
(B) EINREICHDATUM: 19. Jänner 1996

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 1

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 1

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 2

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 2

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 3

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 3

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 4

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 4

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 5

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 345 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1..345 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 5

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 6

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 115 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 6

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 7

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 369 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1...369 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 7

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 8

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 123 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 8

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 9

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 369 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(Q) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1...369 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 9

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 10

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 123 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 10

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 11

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 369 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1...369 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 11

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 12

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 123 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 12

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 13

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 324 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1..324 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 13

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 14

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 108 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 14

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 15

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 342 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1..342 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 15

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 16

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 114 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 16

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 17

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 330 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1..330 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 17

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 18

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 110 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 18

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 19

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 19

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 20:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 20

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 21

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 21

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 22

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 22

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 23

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 23

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 24

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 24

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 25

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 25

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 26

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 26

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 27

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
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(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 28

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 28

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 29

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
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(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 30

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 30

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 31

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 31

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 32

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 32

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 33

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 33

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 34

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 34

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 35

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 35

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 36

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 350 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 36

GAGATTCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC GTGGTCCAGC CTGGGAGATC CCTGAGACTC 60
TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT AGCTATGCTA TGCACTGGGT CCGCCAGGCT 120
CCAGCCAAGG GGCTGGAGTG GGTGGCAGTT ATATCATATG ATGGAAGCAA TAAATACTAC 180
GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAG AGCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC AAGAGCGGGG 300
TTGGAAACGA CGTGGGGCCA AGGAACCCTG GTCACCGTCT CCTCAAGTGG 350

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 37

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 117 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ.-ID-NR: 37

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 38

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 324 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1..324 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 38

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 39

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 108 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 39

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 40

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 327 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1..327 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 40

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 41

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 109 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 41

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 42

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 330 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1.330 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 42

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 43

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 43

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 44

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 324 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1..324 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 44

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 45

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 108 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 45

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 46

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 321 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1..321 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 46

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 47

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 107 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 47

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 48

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 327 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1..327 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 48:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 49

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 109 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 49

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 50

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 144 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSiTION: 1..144 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 50:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 51

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 48 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR: 51

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 52

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 144 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 52:

GAATTCGGAT CCACTCACCT GAGGAGACGG TGACCGTGGT CCCTTGGCAC CGGACTGCTG 60
CAGTTGCACC TGGCTGTGGG CCCCAGGGGC CACGGCGAGC AGGCAAAACA CGCGCCAGGT 120
CCAGTCCATG GTGGCGGCAA GCTT 144

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 53

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 234 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 53:

AAGCTTCGCC ACCATGGGAT GGAGCTGTAT CATCCTCTTC TTGGTAGCAA CAGCTACAGG 60
TAAGGGGCTC ACAGTAGCAG GCTTGAGGTC TGGACATATA TATGGGTGAC AATGACATCC 120
ACTTTGCCTT TCTCTCCACA GGTGTGCACT CCGACATTGA GCTCACCCAG TCTCCAGACA 180
AAGCTCGAGC TGAAACGTGA GTAGAATTTA AACTTTGCTT CCTCAATTGG ATCC 234

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 54

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 54:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 55

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 55:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 56

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 56:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 57

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 234 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 57:

GGATCCAATT GAGGAAGCAA AGTTTAAATT CTACTCACCT TTCAGCTCGA GCTTTCTCTG 60
GAGACTGGGT GAGCTCAATG TCGGAGTGCA CACCTGTGGA GAGAAAGGCA AAGTGGATGT 120
CATTGTCACC CATATATATG TCCAGACCTC AAGCCTGCTA CTGTGAGCCC CTTACCTGTA 180
GCTGTTGCTA CCAAGAAGAG GATGATACAG CTCCATCCCA TGGTGGCGAA GCTT 234

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 58

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 324 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL. CDS
(B) POSITION: 1..324 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 58:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 59

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 108 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 59:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 60

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 345 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL. CDS
(B) POSITION: 1..345 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 60:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 61

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 115 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 61:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 62

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 330 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL. CDS
(B) POSITION: 1..330 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 62:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 63

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 110 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 63:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 64

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 327 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1.327 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 64:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 65

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 109 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 65:

2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 66

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 324 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1..324 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 66:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 67

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 108 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 67:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 68

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 84 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 68:

CGTGGTCCCT TTGCCCCAGA CGTCCACACC ACTAGAATCG TAGCCACTAT ATTCCCCAGT 60
TCGCGCACAG TAATACACAG CCGT 84

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 69

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 69:

AGCGGATAAC AATTTCACAC AGG 23

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 70

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 70:

GTCGTCTTTC CAGACGTTAG T 21

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 71

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 71:

ACCGCCAGAG CCACCTCCGC C 21

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 72

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 72:

GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG T 21

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 73

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 73:

CTCTTCTGAG ATGAGTTTTT G 21

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 74

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 24 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 74:

TGAGGAGACG GTGACCAGGG TTCC 24

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 75

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 68 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 75:

GMACCCTGGT CACCGTCTCC TCAGGTGGAG GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC AGCGGCGGTG 60
GCGGATCG 68

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 76

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 68 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 76:

GGACAATGGT CACCGTCTCT TCAGGTGGAG GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC AGCGGCGGTG 60
GCGGATCG 68

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 77

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 77:

GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAGGTGGAG GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC AGCGGCGGTG 60
GCGGATCG 68

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 78

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 56 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 78:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGRTGC AGCTGGTGCA RTCTGG 56

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 79

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 79:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCSAGGTCC AGCTGGTRCA GTCTGG 56

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 80

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 80:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGRTCA CCTTGAAGGA GTCTGG 56

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 81

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 81:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCSAGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGG 56

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 82

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 82:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCGAGGTGC AGCTGGTGGA GWCYGG 56

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 83

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 83:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGGTGC AGCTACAGCA GTGGGG 56

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 84

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 84:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGSTGC AGCTGCAGGA GTCSGG 56

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 85

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 85:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCGARGTGC AGCTGGTGCA GTCTGG 56

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 86

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 56 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 86:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGGTAC AGCTGCAGCA GTCAGG 56

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 87

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 62 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 87:

AGCTCGGTCC TCGCAACTGC GGCCCCTGGG GCCCACAGCG AGGTGCAGCT GGTGGAGTCT 60
GG 62

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 88

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 54 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 88:

CGAGTCATTC TGCACTTGGA TCCACTCACC TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCC 54

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 89

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 89:

GAGAATCGGT CTGGGATTCC TGAGGGCCGG 30

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 90

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 53 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 90:

AGCTCGGTCC TCGCAACTGG TGTGCACTCC CACGTTATAC TGACTCAGGA CCC 53

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 91

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 49 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 91:

GGTCCTCGCA ACTGCGGATC CACTCACCTA GGACGGTCAG CTTGGTCCC 49

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 92

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 92:

CGAGTCATTC TGCACTTGGA TCCACTCACC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TGCC 54

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 93

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 93:

AGCTCGGTCC TCGCAACTGG TGTGCACTCC GATGTTGTGA TGACTCAGTC TCC 53

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 94

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 49 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 94:

GGTCCTCGCA ACTGCGGATC CACTCACGTT TGATATCCAC TTTGGTCCC 49

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 95

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 95:

AGCTCGGTCC TCGCAACTGG TGTGCACTCC TCGTCTGAGC TGACTCAGGA CCC 53

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 96

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 96:

CCGGCCCTCA GGAATCCCAG ACCGATTCTC 30

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 97

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 97:

CTAAGCTTAC TGAGCACACA GGACCTCACC 30

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 98

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 52 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 98:

TTTGGATATC TCTCCACAGG TGTCCACTCC GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TG 52

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 99

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 43 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 99:

ATGGGCCCTT GGTGGAAGCT GAAGAGACGG TGACCAGGGT GCC 43

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 100

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 59 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 100:

TTGAATTCAG GTGGGGGCAC TTCTCCCTCT ATGAACATTC CGTAGGGGCG ACTGTCTTC 59

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 101

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 101

TTAACGATTT CGAACGCCAC CATGGGATGG AGCTGTATCA TCCTC 45

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 102

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 43 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 102:

GTCCTAGGTG AGTAGATCTA TCTGGGATAA GCATGCTGTT TTC 43

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 103

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 29 Basen paare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 103:

GATCTACTCA CCTAGGACGG TCAGCTTGG 29

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 104

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 104:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 105

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 105:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 106

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 106:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 107

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 107:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 108

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 108:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 109

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 109:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID-NR. 110

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 110:

Claims

1. Isoliertes spezifisches Bindungselement, das eine für Human-TGF-β spezifische Human-Antikörper/Antigen-Bindungsdomäne umfasst, welche die Human-TGF-β-Isoform TGF-β2 mit einer Dissoziationskonstante bindet, die um zumindest das Fünffache niedriger als ihre Dissoziationskonstante für TGF-β3 ist, und die TGF-β2 neutralisiert,

wobei die Human-Antikörper/Antigen-Bindungsdomäne die VH-Domäne 6H1 VH umfasst, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(a)(i) gezeigt wird.

2. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper/Antigen-Bindungsdomäne eine VL-Domäne umfasst, die ausgewählt ist aus:

6B1 VL, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(b)(iii) gezeigt wird,

6H1 VL, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(b)(i) gezeigt wird, und

6A5 VL, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(b)(ii) gezeigt wird.

3. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 2, worin die VL-Domäne 6B1 VL ist, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(b)(iii) gezeigt wird.

4. Isoliertes spezifisches Bindungselement, das eine Human-Antikörper/Antigen-Bindungsdomäne umfasst, die in ELISA um die Bindung an TGF-β2 mit einem spezifischen Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 3 konkurriert, das sich mit TGF-β2 mit einer Dissoziationskonstanten bindet, die zumindest um das Fünffache niedriger als seine Dissoziationskonstante für TGF-β3 ist, und das TGF-β2 neutralisiert.

5. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 4, das bei ELISA um die Bindung an TGF-β2 mit einem spezifischen Bindungselement nach Anspruch 3 konkurriert.

6. Spezifisches Bindungselement nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das ein einkettiges Fv-Antikörpermolekül umfasst.

7. Spezifisches Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das zusätzlich zu den die Human-Antikörper/Antigen-Bindungsdomäne bildenden eine oder mehrere weitere Aminosäuren umfasst.

8. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 7, das einen konstanten Antikörperbereich umfasst.

9. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 8, das einen ganzen Antikörper umfasst.

10. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 8 oder 9, worin der konstante Antikörperbereich der IgG4-Isotyp ist.

11. Nukleinsäureisolat, das für ein spezifisches Bindungselement nach einem der vorangegangenen Ansprüche kodiert.

12. Nukleinsäure nach Anspruch 11, die Teil eines Expressionsvektors ist.

13. Verfahren, welches die Verwendung von Nukleinsäure nach Anspruch 11 oder 12 in einem Expressionssystem zur Produktion eines spezifischen Bindungselements nach einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst.

14. Wirtszelle, die Nukleinsäure nach Anspruch 11 oder 12 enthält.

15. Wirtszelle nach Anspruch 14, die fähig ist, das spezifische Bindungselement unter geeigneten Kulturbedingungen zu produzieren.

16. Verfahren zur Produktion eines spezifischen Bindungselements nach einem der Ansprüche 1 bis 10, welches das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 15 unter geeigneten Bedingungen zur Produktion des spezifischen Bindungselements umfasst.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das spezifische Bindungselement nach der Produktion aus der Zellkultur isoliert wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin nach der Isolation das spezifische Bindungselement zur Formulierung einer Zusammensetzung verwendet wird, die zumindest eine zusätzliche Komponente umfasst.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.

20. Zusammensetzung, die ein spezifisches Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.

21. Spezifisches Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Individuums, um für das Individuum schädlichen Wirkungen von TGF-β entgegenzuwirken.

22. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 21, worin die Wirkungen Fibrose fördernde Wirkungen sind.

23. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 22, worin das Individuum eine Affektion aufweist, die aus der aus Glomerulonephritis, Nervenvernarbung, Hautvernarbung, Augenvernarbung, Lungenfibrose, Arterienverletzung, proliferativer Retinopathie, Netzhautablösung, Respiratory-Distress-Syndrom bei Erwachsenen, Leberzirrhose, Postmyokardinfarkt, Post-Gefäßplastik-Restenose, Keloidvernarbung, Sklerodermie, Gefäßerkrankungen, Katarakt und Glaukom bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

24. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 23, worin der Zustand Nervenvernarbung oder Glomerulonephritis ist.

25. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 22, worin die Wirkungen zu einer Immun- oder Entzündungserkrankung als Affektion beitragen.

26. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 25, worin die Affektion aus der aus primärchronischer Polyarthritis, Makrophagendefizienzerkrankung und Makrophagenpathogeninfektion bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

27. Verwendung eines spezifischen Bindungselements nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individuums, um für das Individuum schädlichen Wirkungen von TGF-β entgegenzuwirken.

28. Verwendung nach Anspruch 27, worin die Wirkungen Fibrose fördernde Wirkungen sind.

29. Verwendung nach Anspruch 28, worin das Individuum eine Affektion aufweist, die aus der aus Glomerulonephritis, Nervenvernarbung, Hautvernarbung, Augenvernarbung, Lungenfibrose, Arterienverletzung, proliferativer Retinopathie, Netzhautablösung, Respiratory-Distress-Syndrom bei Erwachsenen, Leberzirrhose, Postmyokardinfarkt, Post- Gefäßplastik-Restenose, Keloidvernarbung, Sklerodermie, Gefäßerkrankungen, Katarakt und Glaukom bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

30. Verwendung nach Anspruch 29, worin die Affektion Nervenvernarbung oder Glomerulonephritis ist.

31. Verwendung nach Anspruch 27, worin die Wirkungen zu einer Immun- oder Entzündungserkrankung als Affektion beitragen.

32. Verwendung nach Anspruch 31, worin die Affektion aus der aus primärchronischer Polyarthritis, Makrophagendefizienzerkrankung und Makrophagenpathogeninfektion bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

33. Verfahren zum Erhalten einer Antikörper/Antigen-Bindungsdomäne mit den Eigenschaften, für Human-TGF-β spezifisch zu sein, die Human-TGF-β-Isoform TGF-β2 mit einer Dissoziationskonstante zu binden, die zumindest um das Fünffache niedriger als ihre Dissoziationskonstante für TGF-β3 ist, und TGF-β2 zu neutralisieren, wobei das Verfahren das Bereitstellen einer VH-Domäne, die eine Aminosäuresequenzvariante der VH-Domäne 6H1 VH ist, durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der in Fig. 2(a)(i) gezeigten Aminosäuresequenz, das Kombinieren der so bereitgestellten VH-Domäne mit einer oder mehreren VL-Domänen, und das Testen der VH/VL-Kombination oder Kombinationen bezüglich der Eigenschaften umfasst, um eine Antikörper/Antigen-Bindungsdomäne mit den Eigenschaften zu identifizieren.

34. Verfahren nach Anspruch 33, worin die VL-Domäne oder die VL-Domänen aus

6B1 VL, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(b)(iii) gezeigt wird,

6H1 VL, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(b)(i) gezeigt wird, und

6A5 VL, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(b)(ii) gezeigt wird,

ausgewählt ist bzw. sind.

35. Verfahren nach Anspruch 33, worin die VL-Domäne oder VL-Domänen durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in einer oder mehreren VL-Domäne(n) bereitgestellt wird bzw. werden, die aus

6B1 VL, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(b)(iii) gezeigt wird,

6H1 VL, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(b)(i) gezeigt wird, und

6A5 VL, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2(b)(ii) gezeigt wird,

ausgewählt ist bzw. sind.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 35, worin eine Antikörper/Antigen- Bindungsdomäne, die als die Eigenschatten aufweisend identifiziert wird, als isoliertes einkettiges Fv-Antikörpermolekül produziert wird.

37. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 33, worin eine Antikörper/Antigen- Bindungsdomäne, die als die Eigenschaften aufweisend identifiziert wird, in einem Polypeptid produziert wird, das zusätzlich zu den die Antikörper/Antigen-Bindungsdomäne bildenden eine oder mehrere weitere Aminosäuren umfasst.

38. Verfahren nach Anspruch 37, worin das Polypeptid einen konstanten Antikörperbereich umfasst.

39. Verfahren nach Anspruch 38, worin das Polypeptid einen ganzen Antikörper umfasst.

40. Verfahren nach Anspruch 38 oder 39, worin der konstante Antikörperbereich der IgG-Isotyp ist.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 bis 40, worin die als die Eigenschaften aufweisend identifizierte Antikörper/Antigen-Bindungsdomäne durch Expression aus kodierender Nukleinsäure produziert wird.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 bis 41, worin die als die Eigenschaften aufweisend identifizierte Antikörper/Antigen-Bindungsdomäne in einer Zusammensetzung formuliert ist, die zumindest eine zusätzliche Komponente umfasst.

43. Verfahren nach Anspruch 42, worin die Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.

44. Verfahren, die das Herbeiführen oder Ermöglichen von Bindung eines spezifischen Bindungselements nach einem der Ansprüche 1 bis 10 an die TGF-β2-Isoform von Human-TGF-β in vitro umfasst.

45. Verfahren nach Anspruch 44, worin die Bindung des spezifischen Bindungselements die Isoform oder Isoformen neutralisiert.