DE69627690T2

DE69627690T2 - Liposomale formulierungen von mitoxantron

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Publication number: DE69627690T2
Application number: DE69627690T
Authority: DE
Inventors: B. Bally; W. Barber; W. Chang; J. Lim; D. Madden
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1995-10-11
Filing date: 1996-10-09
Publication date: 2003-12-11
Anticipated expiration: 2016-10-10
Also published as: EP0859599B1; WO1997013499A1; US5858397A; ATE238038T1; EP0859599A1; AU7123296A; ES2194114T3; JPH11513392A; DE69627690D1

Description

DER ERFINDUNG ZUGRUNDELIEGENDER ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK

Mitoxantron ist ein in der Chemotherapie verwendetes Anthracendion-Derivat. Es hat Antitumoraktivität in einer breiten Anzahl von experimentellen und menschlichen Tumormodellen gezeigt (Shenkenberg T. D. et al., Annals of Internal Medicine, 105: 67-81 (1986)). Phase III Studien zeigen in Kombination mit anderen Mitteln oder als alleiniges Mittel Aktivität bei nicht-Hodgkin's Lymphom, Myelom, vorgeschrittenem Brustkrebs, Blasen-, Eierstock- und Leberzellencarcinomen (Shenkenberg T. D. et al., Annals of Internal Medicine, 105: 67-81 (1986)). Die toxische Nebenwirkung von Mitoxantron ist Rückenmarkssuppression im Gegensatz zu einem anderen verwandten Anthracyclin, wie Doxorubicin, das eine dosisbegrenzende Cardiotoxizität hat (Saleton S., Cancer Treatment Reviews, 14: 297-303 (1987)). Zusätzlich dazu erwies sich, daß Mitoxantron eine niedrigere Kurz- und Langzeit-Toxizität hat als Doxorubicin (Ehninger G. et al., Clin. Pharmacokinet, 18: 365-380 (1990)). Der genaue Wirkungsmechanismus für Mitoxantron wird noch untersucht, aber es hat sich gezeigt, daß es ein DNA Interchelator ist. Als Ergebnis wird angenommen, daß die Hauptantitumoraktivität dadurch verliehen wird, daß Brüche der DNA- Stränge herbeigeführt werden und ein Komplex mit Topoisomerase 11 gebildet wird (Ehninger G. et al., Clin. Pharmacokinet, 18: 365-380 (1990)).
Es ist in vorklinischen Tiermodellen anerkannt, daß die therapeutische Aktivität von Cytostatika durch die Verwendung von Liposomformulierungen verbessert werden kann. Allgemein erzeugen Liposomen pharmakokinetische und pharmakoverteilende Eigenschaften, die eine vergrößerte therapeutische Aktivität oder verringerte mit Arzneimitteln verbundene Toxizität ergeben. Obwohl der Mechanismus der therapeutischen Aktivität für liposomale Cytostatika nicht gut verstanden wird, haben Studien nahegelegt, daß ein erhöhtes Aussetzen der Stelle des Tumorwachstums mit Arzneimittel ein wichtiges Merkmal ist. Ein Anstieg des Niveaus des Tumorarzneimittels ist die Folge der bevorzugten Ansammlung des Liposomenträgers innerhalb der Tumore. Es ist wichtig zu beachten, daß es keinen Beweis gibt, der nahelegt, daß die einkapselte Form des Arzneimittels therapeutisch aktiv ist, obwohl postuliert wird, daß die Antitumoraktivität durch die Arzneimittelfreisetzung aus den regional lokalisierten Liposomen vermittelt wird.
Forscher, die liposomale Cytostatika entwickeln, haben aus den oben genannten Gründen bei der Verwendung liposomaler Lipidzusammensetzungen betont, daß i) sie weniger permeabel für das eingekapselte Mittel sind und ii) sie eine erhöhte Zirkulationslebensdauer haben. Liposomen, die in dem Plasmaraum für eine verlängerte Zeitdauer gehalten werden, zeigen eine größere Tendenz, sich in den Bereichen von Tumorwachstum anzusammeln. Die Kinetik dieses Extravasationsprozesses, bei dem die Liposomen den Blutraum verlassen und in eine extravasakuläre Region eintreten, ist jedoch langsam. Aus diesem Grund kann eine wirksame Lieferung des Arzneimittels nur mit Liposomen erreicht werden, die das Arzneimittel effektiv zurückhalten.
Studien mit liposomaler Formulierung des Anthracyclins Doxorubicin legen nahe, daß Eigenschaften, die wirksam die Lieferung des Arzneimittels an die Tumore fördern, auch die therapeutische Aktivität gefährden. Ein Ausgleich zwischen Retention von Doxorubicin (um die Arzneimittelansammlung an einem Ort des Tumorwachstums zu maximieren) und Freisetzung (um die Therapie zu bewirken) ist nicht erreicht worden. Zusätzlich zeigte eine liposomale Formulierung von Doxorubicin, die das Arzneimittel nach der intravenösen Verabreichung freisetzt, erhöhte Toxizität und erhöhte Ansammlung von Doxorubicin im Herzgewebe.
Was auf dem Fachgebiet benötigt wird, sind neue liposomale Formulierungen von chemotherapeutischen Mitteln, die nicht die oben angegebenen Nachteile haben. Überraschenderweise stellt die vorliegende Erfindung solche Zusammensetzungen zur Verfügung.
Die WO 88/06442 offenbart eine Liposomenzusammensetzung, die ein Tumorwachstum hemmendes Mittel, ein Lipid und eine die Freisetzung hindernde Pufferkombination enthält. Unter vielen Tumorwachstum hemmenden Mitteln wird Mitoxantron genannt. In einer Liste von Phospholipiden ist Dimyristoylphosphatidylcholin enthalten. Eines der Beispiele betrifft die Einkapselung von Mitoxantron durch Ei-Phosphatidylcholin Vesikeln.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erindung stellt Zusammensetzungen bereit, die für die Behandlung von soliden Tumoren und für die Erhöhung des therapeutischen Index von Mitoxantron geeignet sind. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind liposomale Formulierungen von Mitoxantron, in denen die Liposomen eine Mischung von Cholesterin und 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin enthalten.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Wirkung der Temperatur auf das mittels pH- Gradient vorgenommene Laden von Mitoxantron in DSPC/Chol (A) und DMPC/Chol (B) Liposomen: 37ºC ( ); 50ºC ( ); 65ºC ( ).
Fig. 2 zeigt die Freisetzung von Mitoxantron aus DSPC/Chol ( ) und DMPC/Chol ( ) Liposomen in HBS bei 37ºC.
Fig. 3 zeigt die in vivo Freisetzung von Mitoxantron aus DSPC/Chol ( ) und DMPC/Chol) Liposomen.
Fig. 4 zeigt die prozentuale Änderung des Körpergewichts von BDF1 Mäusen während der Wirksamkeitsstudien als ein Mittel zur Bestimmung der maximal tolerierten Dosen (MTD). Die hier gezeigten Werte sind die Werte von den bestimmten MTD'S: DSPC/Chol bei 20 mg/kg ( ), DMPC/Chol bei 20 mg/kg ( ) und freies Mitoxantron bei 10 mg/kg ( ).
Fig. 5 zeigt das prozentuale Überleben von BDF1 Mäusen, die mit 104 L1210 Zellen injiziert wurden, i.v. über die seitliche Schwanzvene 24 Stunden bevor sie mit 10 mg/kg Dosen von freiem Mitoxantron ( ), DSPC/Chol ( ) und DMPC/Chol ( ) liposomalen Formulierungen behandelt wurden. Unbehandelte Tiere dienten als Kontrollen ( ).
Fig. 6 zeigt die Menge des Lipids und Arzneimittels, die sich in der Leber von CD1 Mäusen während einer Zeitspanne von 48 Tagen bei DMPC/Chol liposomalem Mitoxantron ( ) und DSPC/Chol liposomalem Mitoxantron ( ) angesammelt hatte.
Fig. 7 zeigt die Änderungen in der Verteilung und Wirksamkeit infolge der Einfügung von 5 mol-% DSPE-PEG in DMPC/Chol Liposomenformulierungen von Mitoxantron (A ist ohne zugesetztes DSPE-PEG und B ist mit zugesetztem DSPE-PEG). Fig. 7Azeigt den Unterschied in den Arzneimittelniveaus in CD1 Mäusen. Fig. 7B zeigt den Unterschied in den mittleren Überlebenszeiten von BDF1 Mäusen mit einer L1210 Tumorbelastung. Die Dosis für beide Versuche betrug 10 mg/kg.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Abkürzungen und Definitionen

Hier verwendete Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen: Chol, Cholesterin; DMPC, 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin; DSPC, 1,2-sn-Distearoylphosphatidylcholin; EDTA, Ethylendiamintetraessigsäure, ILS, Anstieg in der Lebensdauer; HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperidin-N'-2-ethansulfonsäure; HBS, HEPES gepufferte Salzlösung; MLV, multilamellare Vesikeln, PEG-DSPE, Poly(ethylenglykol)-modifiziertes Distearoylphosphatidylethanolamin; RES, retikuloendotheliales System; LUV, große unilamellare Vesikeln; PEG, Poly(ethylenglykol), ³H-CDE, ³H-Cholesterylhexadecylether.
Der hier gebrauchte Begriff "Mitoxantron" bezieht sich auf die freie Base ebenso wie auf jedes ihrer pharmazeutisch akzeptablen Salze.

Beschreibung der Ausführungsformen

Der therapeutische Index der meisten Cytostatika ist eng, mit ernsten toxischen Nebenwirkungen, die innerhalb desselben Dosierungsbereichs auftreten, der für die Vermittlung einer wirksamen Therapie erforderlich ist. Eine Vielzahl von experimentellen Strategien ist entwickelt worden, um den therapeutischen Index von Cytostatika zu verbessern. Diese Strategien haben ein gemeinsames Ziel: Die Arzneimittelspezifität zu verbessern. Der Hauptnutzen, der für die Verwendung von Liposomen als Träger von Cytostatika postuliert wird, ist der durch Liposomen vermittelte Anstieg der Lieferung des Arzneimittels an die Krankheitsstelle und die Abnahme der Lieferung des Arzneimittels an Stellen der Zielorgantoxizität (Sugarmann S. M. et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology, 12: 231- 242 (1992)). Als ein Ergebnis ist es wichtig, Liposomen zu entwickeln, die (i) eine größere Neigung haben, sich innerhalb der Krankheitsstellen anzusammeln (Bally M. B. et al., Cancer Chemother. Pharamacol., 34: 137-146 (1994)); Gabizon A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 6949-6953 (1988); Gabizon A. A. et al., Cancer Res., 52: 891-896 (1992); Ogihara-Umeda I, et al., Cancer Res., 54: 463-467 (1994); Uchiyama K. et al., Intl. J. of Pharm., 121: 195-203 (1995); Wu N. Z., Cancer Res., 53: 3765-3770 (1993)); (ii) optimiert wurden bezüglich der Maximierung der pro Liposom enthaltenen Arzneimittelmenge (Mayer L. D. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1025: 143-151 (1990); Bally M. B, et al., Liposomes as Drug Carriers, G. Gregoriadis (ed.), S. 841-853, John Wilery and Sons, Ltd., Chichester (1988)); (iii) die Charakteristik der Arzneimittelretention vergrößern (Mayer L. D. et al., Cancer Res., 49: 5922-5930 (1989); Boman N. L. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1152: 253-258 (1993)) und (iv) die Zirkulationslebensdauer des mit dem Arzneimittel beladenen Trägers erhöhen (Gabizon A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci 85: 6949-6953 (1988); Gabizon A. A., Cancer Res., 52: 891-896 (1992)). Das mit dieser Argumentation verbundene Dilemma betrifft jedoch die Annahme und Evidenz, daß die therapeutisch aktive Komponente einer liposomalen Cytostatikumformulierung das freie Arzneimittel ist. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die einen Ausgleich schaffen zwischen der Maximierung der Liposomlieferung an den Ort der Krankheit und der Charakteristik einer gesteuerten Arzneimittelfreisetzung. Gesteuerte Arzneimittelfreisetzung kann für bestimmte Arzneimittel durch relativ einfache Änderungen in der liposomalen Lipidzusammensetzung erreicht werden (Boman N. L. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1152: 253-258 (1993)). Wie hier gezeigt, kann bei Verwendung des Cytostatikums Mitoxantron eine gesteuerte Arzneimittelfreisetzung signifikante Verbesserung der therapeutischen Aktivität erzeugen.
Daher stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine liposomale Formulierung von Mitoxantron enthält. Die Liposomen werden aus einer Mischung von Cholesterin und 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin hergestellt. Vorzugsweise enthalten die Liposomen etwa 50% bis etwa 70% 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin und etwa 30% bis etwa 50% Cholesterin. Bevorzugter enthalten die Liposomen etwa 55% 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin und etwa 45% Cholesterin.
In einer Gruppe bevorzugter Ausführungsformen enthält die pharmazeutische Zusammensetzung außerdem ein PEG-Lipid-Konjugat, vorzugsweise PEG-Cer-C&sub1;&sub4;, PEG-Cer-C&sub2;&sub0; oder MePEGS-2000- DSPE, das in einer Menge von etwa 1 Gew.-% bis etwa 8 Gew.-% vorliegt.
In einer anderen Gruppe von bevorzugten Ausführungsformen werden die Zusammensetzungen außerdem einen auf ein Ziel gerichteten Rest enthalten, wie solche, die in der gleichzeitig anhängigen US-SN 08/316 394 beschrieben sind, die durch Nennung Teil der Beschreibung ist. Verfahren zum Anhängen einer auf ein Ziel gerichteten Spezies, wie einem Protein oder Antikörper, werden auch darin beschrieben.
Für die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung war es überraschend, daß Unterschiede in Raten der Ansammlung und der Leckage von Arzneimittel bei DMPC/Chol und DSPC/Chol Liposomen in vitro nicht entdeckt wurden, selbst wenn die Liposomen mit einem Serum, das Puffer enthält, inkubiert wurden. Die Phasenübergangstemperaturen (Tc) für DSPC und DMPC sind 55,3ºC bzw. 23,9ºC, und es wurde erwartet, daß die Permeabilitätscharakteristik die Unterschiede im Übergang vom Gel in die flüssigkristalline Phase dieser Phospholipide widerspiegeln würde. Vorherige Studien mit Vincristin zeigten eine gute Korrelation zwischen Phospholipid Tc und der Arzneimittelleckage (Boman N. L. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1152: 253-258 (1993)). Es war auch überraschend, daß der Kollaps des transmembranen pH-Gradienten eine geringe Auswirkung auf die Charakteristik der Arzneimittelretention für jede liposomale Formulierung hatte. Diese Daten stehen im Gegensatz zu früheren Ergebnissen mit Vincristin (Boman N. L. et al., ibid.) und Doxorubicin (Mayer L. D. et al., Biochim. Biophys. Acta 857: 123-126 (1986)). Darüberhinaus ist vorgeschlagen worden, daß nach der durch den pI-J-Gradienten vermittelten Aufnahme Arzneimittel, wie Mitoxantron, unlösliche Fällungen innerhalb der Liposomen bilden können (Mayer L. D. et al., Biochim. Biophys. Acta 816: 294-302 (1985)). Entsprechend kann die Permeabilitätscharakteristik des Arzneimittels in einer gefällten Form weniger abhängig von der Membrancharakteristik oder der Existenz eines restlichen transmembranen pH-Gradienten sein. Es ist jedoch unverständlich, warum Unterschiede in der Arzneimittelpermeabilität in vivo offensichtlich werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können mit Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind. Typischerweise werden die Liposomen aus den gewünschten Lipiden gebildet und dann mit Mitoxantron beladen.
Eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Liposomen steht zur Verfügung, wie sie z. B. beschrieben sind in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), den US Patenten Nr. 4 186 183, 4 217 344, 4 235 871, 4 261 975, 4 485 054, 4 501 728, 4 774 085, 4 837 028, 4 946 787, der PCT Veröffentlichung Nr. WO 91/17424, Deamer and Bangham Biochim. Biophys. Acta, 443: 629-634 (1976); Fraley et al.,- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348-3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta, 812: 55-65 (1985); Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, 858: 161-168 (1986); Williams et al., Proc. Nathl. Acad. Sci. 85: 242-246 (1988), dem Text Liposomes, Marc. J. Ostro, ed., Marcel Dekker Inc. New York, 1983, Kapitel 1 und Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40: 89 (1986), alle sind durch Nennung Teil der Beschreibung. Geeignete Verfahren umfassen z. B. Beschallung, Extrusion, Hochdruck-Homogenisierung, Mikrofluidisierung, Detergensdialyse, durch Calcium induzierte Fusion von kleinen Liposomvesikeln und Verfahren der Etherinfusion, alle sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt. Ein Verfahren stellt multilamellare Vesikeln mit heterogenen Größen her. Bei diesem Verfahren werden die Vesikel bildenden Lipide in einem geeigneten organischen Lösemittel oder Lösemittelsystem gelöst und unter Vakuum getrocknet oder einem inerten Gas, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden. Falls gewünscht, kann der Film wieder in einem geeigneten Lösemittel, wie tertiärem Butanol, gelöst und dann lyophilisiert werden, um eine homogenere Lipidmischung zu bilden, die in einer leichter zu hydratisierenden pulverähnlichen Form vorliegt. Dieser Film ist mit einer wäßrigen, gepufferten Lösung bedeckt und wird hydratisieren gelassen, typischerweise während eines Zeitraums von 15-60 Minuten unter Bewegung. Die Größenverteilung der resultierenden multilamellaren Vesikeln kann zu kleineren Größen hin verschoben werden, indem die Lipide unter stärkeren Bewegungsbedingungen hydratisiert werden oder indem lösende Detergentien, wie Desoxycholat, zugegeben werden.
Unilamellare Vesikeln werden im allgemeinen durch Beschallung oder Extrusion hergestellt. Beschallung wird im allgemeinen mit einem Tip-Beschallungsgerät, wie einem Branson Tip-Beschallungsgerät, in einem Eisbad durchgeführt. Typischerweise wird die Suspension mehreren Beschaltungszyklen unterworfen. Die Extrusion wird mit Biomembranextrudern, wie dem LIPEX BIOMEMBRANE EXTRUDERR, durchgeführt. Eine definierte Porengröße in den Extrusionsfiltern kann unilamellare liposomale Vesikeln mit spezifischen Größen erzeugen. Die Liposomen können auch mittels Extrusion durch ein keramisches Filter, wie ein CERAFLOW MICROFILTERR, das von Norton Company, Worcester MA erhältlich ist, gebildet werden.
Nach der Liposomherstellung können die Liposomen, die durch die Bildung nicht auf eine geeignete Größe gebracht wurden, auf einen gewünschten Größenbereich und eine relativ enge Verteilung der Liposomgrößen gebracht werden. Ein Größenbereich von etwa 0,2-0,4 Mikrometern erlaubt es, die Liposomsuspension mittels Filtration durch ein herkömmliches Filter, typischerweise ein 0,22 Mikrometer Filter, zu sterilisieren. Das Filtersterilisationsverfahren kann mit einem hohen Durchsatz durchgeführt werden, wenn die Liposomen auf eine Größe von etwa 0,2-0,4 Mikrometer heruntergebracht wurden.
Verschiedene Techniken stehen zur Verfügung, um Liposomen auf eine gewünschte Größe zu bringen. Ein Verfahren zur Größeneinstellung wird in dem US Patent Nr. 4 737 323 beschrieben, das durch Nennung Teil der Beschreibung ist. Beschallung einer Liposomsuspension entweder durch Bad- oder Sondenbeschallung erzeugt eine zunehmende Verkleinerung der Größe bis herunter zu kleinen unilamellaren Vesikeln mit einer Größe von weniger als etwa 0,05 Mikrometern. Homogenisierung ist ein anderes Verfahren, das auf Scherenergie basiert, um große Liposomen in kleinere zu brechen. In einem typischen Homogenisierungsverfahren werden multilamellare Vesikeln durch einen Standard-Emulsionshomogenisator im Kreislauf geführt, bis gewählte Liposomgrößen typischerweise zwischen etwa 0,1 und 0,5 Mikrometern beobachtet werden. Die Größe der liposomalen Vesikeln kann durch eine quasielastische Lichtstreuung (QELS) bestimmt werden, wie in Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10: 421-450 (1981) beschrieben, was durch Nennung Teil der Beschreibung ist. Ein durchschnittlicher Liposomdurchmesser kann durch Beschallung von gebildeten Liposomen verkleinert werden. Intermittierende Beschallungszyklen können mit QELS Bewertungen abwechseln, um eine effiziente Liposomsynthese zu führen.
Die Extrusion von Liposomen durch eine kleinporige Polycarbonatmembran oder eine asymmetrische Keramikmembran ist auch ein wirksames Verfahren zur Verkleinerung der Liposomgrößen auf eine relativ gut definierte Größenverteilung. Typischerweise wird die Suspension durch die Membran ein oder mehrere Male zyklisiert, bis die gewünschte Liposomgrößenverteilung erreicht ist. Die Liposomen können durch aufeinanderfolgend kleinerporige Membranen extrudiert werden, um eine allmähliche Verkleinerung der Liposomgröße zu erreichen. Zur Verwendung in der vorligenden Erfindung sind Liposomen mit einer Größe von etwa 0,05 Mikrometern bis etwa 0,20 Mikrometern bevorzugt.
Verfahren zum Laden von Mitoxantron oder anderen herkömmlichen Arzneimitteln in Liposomen umfassen eine Einkapselungstechnik und das Verfahren, bei dem mittels Transmembranpotential beladen wird.
In einer Einkapselungstechnik werden Mitoxantron und die Liposomkomponenten in einem organischen Lösemittel gelöst, in dem alle Arten mischbar sind, und zu einem trockenen Film konzentriert. Ein Puffer wird dann zu dem getrockneten Film gegeben, und Liposomen werden gebildet, die das Arzneimittel in die Vesikelwände eingebaut haben. Alternativ kann Mitoxantron in einen Puffer gegeben und einem getrockneten Film nur aus Lipidkomponenten zugesetzt werden. Auf diese Weise wird das Arzneimittel in das wäßrige Innere des Liposoms eingekapselt werden. Der Puffer, der bei der Bildung der Liposomen verwendet wird, kann irgendeine biologisch verträgliche Pufferlösung sein aus zum Beispiel isotonischer Salzlösung, mit Phosphat gepufferter Salzlösung oder anderen Puffern mit geringer Ionenstärke. Im allgemeinen wird das Arzneimittel in einer Menge von etwa 0,01 ng/ml bis etwa 50 mg/ml vorliegen. Die resultierenden Liposomen mit den in dem wäßrigen Inneren oder in der Membran eingebauten Arzneimittel werden dann, wie oben beschrieben, gegebenenfalls auf eine geeignete Größe gebracht.
Das Beladen mittels Transmembranpotential ist im einzelnen in dem US-Patent Nr. 4 885 172, US-Patent Nr. 5 059 421 und US- Patent Nr. 5 171 578 beschrieben worden, deren Inhalt durch Nennung Teil der Beschreibung ist. Kurz beschrieben, kann das Verfahren zum Beladen mittels Transmembranpotential mit im wesentlichen jedem herkömmlichen Arzneimittel verwendet werden, das in einem geladenen Zustand vorliegen kann, wenn es in einem geeigneten wäßrigen Medium gelöst ist. Vorzugsweise wird das Arzneimittel relativ lipophil sein, so daß es in die Liposommembranen verteilt wird. Ein Transmembranpotential wird quer durch die Doppelschicht der Liposomen oder der Protein (auf ein Ziel richtende Spezies)-Liposom-Komplexe geschaffen, und das Arzneimittel wird mittels des Transmembranpotentials in das Liposom geladen. Das Transmembranpotential wird durch die Schaffung eines Konzentrationsgradienten für ein oder mehrere geladene Spezien (z. B. Na&spplus;, K&spplus; und/oder H&spplus;) durch die Membranen erzeugt. Dieser Konzentrationsgradient wird durch die Herstellung von Liposomen mit unterschiedlichem innerem und äußerem Medium erzeugt. Daher wird für ein Arzneimittel, das negativ geladen ist, wenn es ionisiert ist, ein Transmembranpotential durch die Membranen geschaffen, das ein inneres Potential hat, das bezogen auf das äußere Potential positiv ist. Für ein Arzneimittel, wie Mitoxantron, das in sauren Medien positiv geladen ist, würde das entgegengesetzte Transmembranpotential verwendet werden.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit zur Behandlung solider Tumore in einem Wirt, indem dem Wirt eine der obigen liposomalen Zusammensetzungen von Mitoxantron verabreicht wird. Um die Freisetzung von Mitoxantron zu bewirken, können die Liposomen mit Mitoxantron oder gegebenenfalls mit Mitoxantron in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel beladen sein und dem eine Behandlung benötigenden Subjekt verabreicht werden. Die therapeutischen Mittel, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, können irgendeines aus einer Vielzahl von Arzneimitteln sein, die so ausgewählt werden, daß sie eine geeignete Behandlung für die Krankheit sind, die in dem Gewebe zu behandeln ist. Häufig wird das Arzneimittel ein zusätzliches antineoplastisches Mittel sein, wie Vincristin, Doxorubicin, Camptothecin, Cisplatin, Bleomycin, Cyclophosphamid, Methotrexat, Streptozotocin und ähnliche. Es kann auch wünschenswert sein, antiinfektiöse Mittel an spezifische Gewebe mit den vorliegenden Verfahren zu liefern. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch für die selektive Lieferung von anderen Arzneimitteln verwendet werden einschließlich, aber nicht auf lokale Anästhetika beschränkt, z. B. Dibucain und Chlorpromazin; beta-adrenergene Blocker z.B. Propranolol, Timolol und Labetalol; antihypertonische Mittel, z. B. Clonidin und Hydralazin; Antidepressiva, z. B. Imipramin, Amitriptylin und Doxepin; Krampfmittel, z. B. Phenytoin; Antihistamine, z. B. Diphenhydramin, Chlorpheniramin und Promethazin; antibiotische/antibakterielle Mittel, z. B. Gentamycin, Ciprofloxacin und Cefoxitin; fungizide Mittel, z. B. Miconazol, Terconazol, Econazol, Isoconazol, Butaconazol, Clotrimazol, Itraconazol, Nystatin, Naftifin und Amphotericin B; antiparasitische Mittel, Hormone, Hormon-Antagonisten, Immunomodulatoren, Neurotransmitter-Antagonisten, Antiglaukommittel, Vitamine, Narkotika und imaging agents. Andere besondere Arzneimittel, die mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen selektiv verabreicht werden können, werden Fachleuten wohl bekannt sein. Außerdem können zwei oder mehrere therapeutische Mittel gleichzeitig verabreicht werden, falls erwünscht, wo solche Mittel komplementäre oder synergistische Wirkungen haben.
Die erfindungsgemäßen Mitoxantron-Liposom-Komplexe können einem Subjekt nach Standardtechniken verabreicht werden. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Mitoxantron-Liposom-Komplexe parenteral, d. h. intraartikulär, intravenös, subkutan oder intramuskulär verabreicht. Bevorzugter werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen intravenös durch eine Bolusinjektion verabreicht. Geeignete Formulierungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Auflage (1985) gefunden.
Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen intravenös verabreicht. Daher sieht diese Erfindung Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung vor, die eine Lösung der Liposomen, suspendiert in einem akzeptablen Träger, vorzugsweise ein wäßriger Träger, umfassen. Eine Vielzahl wäßriger Träger kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,9% isotonische Salzlösung und ähnliches. Diese Zusammensetzungen können mit herkömmlichen, wohl bekannten Sterilisationstechniken sterilisiert werden oder können steril filtriert werden. Die resultierenden wäßrigen Lösungen können so zur Verwendung verpackt oder lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierten Präparationen mit einer sterilen wäßrigen Lösung vor der Verabreichung kombiniert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen enthalten, wie es erforderlich ist, um physiologischen Bedingungen angenähert zu werden, wie pH einstellende und puffernde Mittel, die Tonizität einstellende Mittel, Benetzungsmittel und ähnliche, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat u. s. w.
Die Konzentration der Mitoxantron-Liposom-Komplexe kann in den pharmazeutischen Formulierungen weit variieren, d. h. von weniger als etwa 0,05 Gew.-%, üblicherweise bei oder wenigstens etwa 2-5 Gew.-% bis so viel wie 10 bis 30 Gew.-%, und wird vor allem durch Flüssigkeitsvolumen, Viskositäten u. s. w. entsprechend der gewählten besonderen Verabreichungsart ausgewählt.
Die Liposomenladung ist eine wichtige Determinante in der Liposomolearance aus dem Blut, wobei negativ geladene Liposomen schneller durch das retikuloendotheliale System schneller aufgenommen werden (Juliano, Biochem. Biophys. Res. Commun., 63: 651 (1975)) und daher kürzere Halbwertszeiten in dem Blutstrom haben. Liposomen mit verlängerten Zirkulationshalbwertszeiten sind für die meisten therapeutischen und diagnostischen Verwendungen typischerweise wünschenswert. Ein Mittel zur Erhöhung der Zirkulationshalbwertzeit ist die Einarbeitung von GM&sub1; oder Phospholipid-Polyoxyethylen-Konjugaten in die Liposomformulierung. Zusätzlich können die Phospholipid-Polyoxyethylen-Konjugate und verwandte Lipidderivate zu den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als sterische Barrierekomponenten zugegeben werden. Der Zweck der sterischen Barrierekomponenten ist es, Liposom-Liposom Wechselwirkungen zu verhindern und dadurch die Aggregation von gebildeten Liposomsystemen zu verringern. Geeignete sterische Barrierekomponenten sind modifizierte Derivate von Lipiden und Cholesterin, wie Polyethylenglykolderivate von Cholesterin (PEG-Cholesterine) und PEG- Lipide (z. B. Phosphatidylethanolamin-Polyoxyethylen-Konjugate .und Phosphatidsäure-Polyoxyethylen-Konjugate). Die Polyoxyethylenkonjugate, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden, können durch Kombinieren der konjugierenden Gruppe (d. h. Phosphatidsäure oder Phosphatidylethanolamin) mit einem geeignet funktionalisierten Polyoxyethylenderivat hergestellt werden. Zum Beispiel kann Phosphatidylethanolamin mit ω-Methoxypolyethylenglykolsuccinat kombiniert werden, um ein Phosphatidylethanolamin-Polyoxyethylen-Konjugat zu liefern. Siehe Parr et al., Biochim. Biophys. Acta, 1195: 21-30 (1994), das durch Nennung Teil der Beschreibung ist. Falls vorhanden, wird das PEG-Cholesterin oder die PEG- Lipide von 0,5 bis etwa 5,0 mol-% der gesamten Lipidzusammensetzung ausmachen. Andere PEG-modifizierte Lipide sind in US-A-5 820 873 beschrieben (z. B. MePEGS-2000-Cer). Während PEG-Lipid-Konjugate in vielen liposomalen Zusammensetzungen bevorzugt sind, werden solche Zusammensetzungen, die zur Behandlung von Lebertumoren verwendet werden, vorzugsweise kein PEG-Konjugat enthalten.
Zusätzlich kann die Liposomsuspension lipidschützende Mittel enthalten, die Lipide gegen Schädigung durch freie Radikale und Lipidperoxidation bei der Lagerung schützen. Fänger von lipophilen freien Radikalen, wie Alphatocopherol und wasserlösliche, eisenspezifische Chelatbildner, wie Ferrioxamin, sind geeignet.
In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit zur Erhöhung des therapeutischen Index von Mitoxantron bei einem Patienten. Diese Verfahren umfassen
(i) die Einkapselung von Mitoxantron in Liposomen, die eine Mischung von Cholesterin und 1,2-sn-Dimyristoylphospatidylcholin enthalten, um eine liposomale Formulierung zu schaffen; und
(ii) Verabreichung der liposomalen Formulierung an den Patienten, wodurch der therapeutische Index von Mitoxantron verbessert wird, verglichen mit nicht-liposomalen Formulierungen von Mitoxantron.
Bevorzugte Zusammensetzungen und Verfahren zur Verabreichung sind oben erläutert worden.
Die folgenden Beispiele werden nur zur Erläuterung gegeben und sollen die Erfindung weder einschränken noch definieren.

BEISPIELE

Materialien

Novatron (Mitoxantronhydrochlorid) wurde von der British Columbia Cancer Agency erhalten und ist ein Produkt von Cyanamid (Montrial, Quebec, Kanada). 1,2-sn-Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) wurde von Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA) gekauft. HEPES, Zitronensäure, Cholesterin, Nigericin und SE- PHADEXR G-50 (Medium) wurde von Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri, USA) gekauft. Dibasisches Natriumphosphat wurde von Fisher Scientific (Fair Lawn, New Jersey, USA) erhalten. Das [¹&sup4;C]-Mitoxantron, das als Tracer verwendet wurde, wurde großzügigerweise von American Cyanamid gespendet. [³H] Cholesterylhexadecylether, ein Lipidmarker, der in vivo nicht ausgetauscht oder metabolisiert wird (Stein Y. et al., FEBS Lett., 111: 104-106 (1980)) wurde von Amersham (Oakville, Ontario, Kanada) gekauft. Aquacid 11 wurde von Terochem Laboratories Ltd. (Edmonton, Alberta, Kanada) gekauft. Fetales Rinderserum wurde von Gibco Laboratories (Grand Island, New York, USA) erhalten. Weibliche CD1 und BDF1 Mäuse wurden von Charles River Laboratories (Ontario, Kanada) gekauft.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von liposomalen Formulierungen von Mitoxantron.

1.1 Herstellung der Liposomen

DSPC/Chol (55 : 45; mol : mol) und DMPC/Chol (55 : 45; mol : mol) Liposomen wurden hergestellt, jedes mit einer kleinen Menge [³H] Cholesterylhexadecylether, wobei die gut eingeführte Extrusionstechnologie verwendet wurde (siehe Hope et al., Biochim. Biophys. Acta, 812: 55 (1985), die durch Nennung Teil der Beschreibung ist). Kurz gesagt, wurden Lipid und Cholesterin in Chloroform gelöst und zu einem homogenen Lipidfilm unter einem Stickstoffgasstrom getrocknet. Dieser Film wurde dann in einem 300 mM Zitronensäurepuffer pH 4,0 hydratisiert. Die resultierende multilamellare Vesikelmischung wurde fünfmal gefroren und getaut, bevor sie durch übereinander angeordnete 100 nm Polycarbonatfilter (Nuclepore, Pleasanton, California) extrudiert wurde unter Verwendung einer Extrusionsvorrichtung (Lipex Biomembranes Inc. Vancouver, British Columbia), wie von Hope M. J. et al., Biochim. Biophys. Acta, 812 : 55-65 (1985) beschrieben. Die hergestellten großen unilamellaren Vesikeln (LUV) wurden durch quasielastische Lichtstreuung unter Verwendung eines Nicomp 270 Submikrometer Particle Sizer, der bei 632,8 nm arbeitete, auf die Größe eingestellt.
1. 2 Einkapselung von Mitoxantron durch den pH-Gradienten Anfängliche Experimente wurden durchgeführt unter Verwendung von Mitoxantron (mit Spurenmengen von [¹&sup4;C]-Mitoxantron), um die Beladungseigenschaften von DSPC/Chol und DMPC/Chol Liposomen unter Verwendung des pH-Gradienten-Verfahrens bei verschiedenen Temperaturen zu bestimmen. Das Verhältnis Arzneimittel zu Lipid wurde gemessen durch Auftragen von 100 ul auf SEPHADEXR G-50 Minidrehsäulen im Duplikat und Drehen mit 500 g während 2 Minuten. Die Duplikatproben wurden von der resultierenden Lösung genommen und [³H] und [¹&sup4;C] wurden unter Verwendung eines Szintillationszählers gemessen. Die Daten in Fig. 1 zeigen die mittleren Werte ±SA von vier Messungen des Verhältnisses von Arzneimittel zu Lipid und veranschaulichen die Temperaturabhängigkeit der Mitoxantronbeladung über den pH- Gradienten. Bei 37ºC sind 10% der maximalen Aufnahme nach 120 Minuten erreicht. Wenn die Temperatur auf 50ºC erhöht wird, tritt über 90% der maximalen Aufnahme nach 45 Minuten ein. Bei 65ºC tritt die maximale Aufnahme in 15 Minuten ein. Ebenfalls veranschaulicht in Fig. 1 ist der Unterschied in der Aufnahme infolge von Unterschieden in der Lipidzusammensetzung.
Die Ergebnisse zeigen, daß bei 37ºC und 65ºC kein signifikanter Unterschied zwischen den Beladungseigenschaften der zwei Formulierungen besteht. Bei 50ºC sind jedoch 97% Mitoxantron innerhalb der DMPC/Chol Liposomen nach 30 Minuten eingekapselt, während nur 75% Mitoxantron innerhalb der DSPC/Chol Liposomen eingekapselt sind. Die Daten für die prozentuale Liposombeladung sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Vergleich der Mitoxantronaufnahme durch DSPG/Chol und DMPC/Chol Liposomen
Mitoxantron wurde unter Verwendung des durch den Transmembran pH-1-Gradienten betriebenen Beladungsverfahrens eingekapselt (siehe Madden et al., Chem. Phys. Lipids 53: 37-46 (1990)). Die Liposomen wurden 10 Minuten auf 65ºC erhitzt und dann zu Mitoxantron mit einem Gewichtsverhältnis von Arzneimittel zu Lipid von 0,1 gegeben. Nachfolgend wurden 350 ul 0,5 M Na&sub2;HPO&sub4; Puffer (pH 7,5) zugegeben, um den pH der Mischung auf 7,0 bis 7,2 zu erhöhen. Die resultierende Lösung wurde dann 15 Minuten bei 65ºC inkubiert. Die Wirksamkeit der Einkapselung von Mitoxantron wurde bestimmt unter Verwendung der Größenausschluß-Chromatographie auf Minidrehsäulen, hergestellt aus SEPHADEXR G-50 (Chonn A. et al., Biochem. Biophys. Acta, 1070: 215-222 (1991)). Arzneimittel- und Lipidkonzentration in den Proben, die in dem Porenvolumen gesammelt wurden, wurden durch Messung von [³H]-Lipid und [¹&sup4;C]-Arzneimittel bestimmt. Ein Aliquot dieser Probe wurde mit Pico-Flor 40 Szintillationscocktail gemischt vor der Bewertung der Radioaktivität mit einem Packard 1900 Szintillationszähler.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Raten der Freisetzung von Mitoxantron aus zwei Liposomformulierungen, beide in vitro und in vivo.

2.1 In vitro Eigenschaften von in Liposomen eingekapseltem Mitoxantron

Für die Freisetzungsstudien wurde liposomales Mitoxantron hergestellt, wie oben ausgeführt. Die resultierenden mit Arzneimittel beladenen DSPC/Chol und DMPC/Chol liposomalen Formulierungen wurden in Spectrapor Dialyseröhrchen (10.000-12.000 MWCO, Spectrum Medical Industries, Los Angeles) mit 25 mm Durchmesser überführt, und die Proben (3 ml) wurden gegen einen Liter HBS bei 37ºC dialysiert. Zu den angegebenen Zeiträumen 0, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 102 Stunden wurden 100 Proben genommen und auf Arzneimittel und Lipid untersucht unter Verwendung der Minidrehsäulen, wie oben beschrieben.
Diese Studien wurden vervollständigt in An- und Abwesenheit von Nigericin, einem Ionophor, das den pH-Gradienten zusammenbrechen läßt.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse, die für die Freisetzung von Mitoxantron aus den DSPC/Chol ( ) und DMPC/Chol ( ) Liposomen in HBS bei 37ºC erhalten wurden. Ausgezogene Linien zeigen die Abwesenheit von Nigericin. Gestrichelte Linien zeigen die Zugabe von Nigericin zur Zeit null. Proben wurden aus den Dialysebeuteln entnommen und auf SEPHADEXR G-50 Minidrehsäulen in Duplikaten aufgetragen und bei 500 g 2 Minuten gedreht. Die Duplikatproben wurden aus der resultierenden Lösung genommen, und [³H] und [¹&sup4;C] wurden gemessen unter Verwendung eines Szintillationszählers. Die Daten stellen die mittleren Werte ISA von vier Messungen des Verhältnisses von Arzneimittel zu Lipid dar. Mit dem intakten pH-Gradienten gibt es keine signifikante Abnahme des Verhältnisses von Arzneimittel zu Lipid bei beiden, den DSPC/Chol und DMPC/Chol Liposomen. Bei 37ºC ist praktisch das gesamte Mitoxantron mit den Liposomen nach 67,5 Stunden verknüpft. Bei der Zugabe von Nigericin wird jedoch etwas Mitoxantron aus den Liposomen freigesetzt. Wie Fig. 2 bei 102 Stunden zeigt, sind 70% Mitoxantron mit den DSPC/Chol Liposomen verknüpft, während 50% Mitoxantron mit den DMPC/Chol Liposomen verknüpft sind.

2.2 In vivo Freisetzung von Mitoxantron

Für Plasmaclearance-Studien wurden weibliche CD1 Mäuse (20- 25 g, vier pro Gruppe) mit einer 10 mg/kg Arzneimitteldosis i.v. über die seitliche Schwanzvene injiziert. Nach 1, 4, 24 und 48 Stunden wurden die Tiere durch CO&sub2; Ersticken getötet, und das gesamte Blut wurde durch Herzpunktur gesammelt. Das gesammelte Blut wurde sofort in mit EDTA beschichtete Röhrche (MICROTAINERSR von Becton Dickinson) gegeben. Anschließend wurde das Plasma durch Zentrifugieren des mit EDTA behandelten gesamten Blutes bei 500 · g während 10 min hergestellt. Lipid und Arzneimittel wurden durch [³H]-Cholesterylhexadecylether und [¹&sup4;C]-Mitoxantron Tracer unter Verwendung eines Szintillationszählers untersucht, wie oben beschrieben.
Die in Fig. 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß die Plasmaeliminierung von mit Mitoxantron beladenen DMPC/Chol und DSPC/Chol Liposomen ähnlich sind nach der i.v. Verabreichung in weibliche CD1 Mäuse (siehe Fig. 3A). Eine Schätzung der Menge des in den Liposomen verbliebenen Mitoxantrons, die in dem Kreislauf sind, kann durch Bestimmung des Verhältnisses von Mitoxantron zu Lipid zu den angegebenen Zeitpunkten gemacht werden. Diese Schätzung setzt voraus, daß das Niveau des freien Arzneimittels in dem Plasma der Tiere, denen liposomales Mitoxantron gegeben wurde, vernachlässigbar ist. Die Ergebnisse solch einer Analyse, in Fig. 3B gezeigt, zeigten, daß eine größere Freisetzung von Mitoxantron aus den DMPC/Chol Liposomen als aus den DSPC/Chol Liposomen erfolgt. Bei den DMPC/Chol Liposomen wurden 73% Mitoxantron, das ursprünglich mit dem Träger verknüpft war, innerhalb von 48 h freigesetzt. Im Gegensatz dazu wurden weniger als 5% Arzneimittel aus den DSPC/Chol Liposomen freigesetzt. Zwischen den 4 h und 48 h Zeitpunkten wurde die Freisetzung von Mitoxantron auf 1,7 und < 0,025 ug mg-Lipid&supmin;¹ h&supmin;¹ für die DMPC/Chol bzw. DSPC/Chol Liposomen geschätzt. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den für Doxorubicin erhaltenen Ergebnissen (Mayer L. D. et al., J. Liposome Res., 4: 529-553 (1994)) und zeigen klar, daß die Steuerung der in vivo Freisetzungsraten von Mitoxantron durch einfache Änderungen der liposomalen Lipidzusammensetzung erreicht werden kann. Es sollte beachtet werden, daß die Arzneimittelniveaus im Plasma, die nach der Verabreichung des freien Arzneimittels erhalten wurden, signifikant niedriger sind als diejenigen, die mit liposomalen Formulierungen erhalten werden. Die Analysen durch trapezförmige Fläche-unter-der-Kurve (area-under-the-curve, AUC) der Arzneimittelniveaus im Plasma zeigen Plasma AUCs von 0,01145, 167,8615 und 229,8615 ug ml 1 h 1 nach der Verabreichung von freiem Mitoxantron, DMPC/Chol Mitoxantron bzw. DSPC/Chol Mitoxantron.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel zeigt die in vivo Wirksamkeit von liposomalen Mitoxantron Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung.
3.1 In vivo Wirksamkeit von in Liposomen eingekapseltem Mitoxantron,
BDF1 Mäuse wurden mit 104 L1210 Zellen i.v. injiziert vier- undzwanzig Stunden vor der Injektion als jeweils einzelner Behandlung mit freiem Mitoxantron in Dosierungen von 5 mg/kg, 10 mg/kg und 20 mg/kg; mit DMPC/Chol Mitoxantron in Dosierungen von 5 mg/kg, 10 mg/kg und 20 mg/kg; mit DSPC/Chol Mitoxantron in Dosierungen von 10 mg/kg und 20 mg/kg. Die Injektionen wurden in einem Volumen von 200 verabreicht. Um dieses Volumen für die 20 mg/kg Dosis zu erreichen, wurde die Vorratsmischung unter Verwendung von Aquacide II konzentriert. Die Überlebenszeiten der Mäuse wurden dann über einen Zeitlauf von sechzig Tagen beobachtet. Ein Anstieg der Lebensdauer (ILS%) wurde, wie folgt, berechnet
Die maximal tolerierte Dosis wurde bestimmt durch den Gewichtsverlust der Mäuse während einer zweiwöchigen Zeitspanne. Wenn die Mäuse mehr als 30% des ursprünglichen Gewichts verloren, dann wurden die Mäuse getötet.
Die Antitumor Wirkungen von freiem Mitoxantron und liposomalem Mitoxantron wurden verglichen unter Verwendung des L1210 Tumormodels. L1210 ist eine bei Mäusen vorkommende Lymphozytenleukämie. Typischerweise wurde diese Zellinie als aszitisches Tumormodell verwendet; wir haben jedoch gefunden, daß diese Zellen bei der i.v. Injektion sich in der Leber und der Milz ausbreiten. Dies ergibt identische Tumormodelle für die zwei Organe.
Befundstudien des toxischen Dosisbereichs in tumorfreien weiblichen BDF1 Mäusen ergaben, daß die maximal tolerierte Dosis (MTD) des freien Arzneimittels 10 mg/kg betrug. Wenn das Arzneimittel in DMPC/Chol oder DSPC/Chol eingekapselt war, vergrößerte sich die MTD von Mitoxantron auf 30 mg/kg. Bei dieser Dosis überlebten 100% der behandelten Tiere mehr als 30 Tage. Die Obduktionen wiesen auf keine starken Anomalien in irgendeinem der untersuchten Gewebe hin. Eine Bewertung des durch das Arzneimittel hervorgerufenen Gewichtsverlustes wies jedoch darauf hin, daß die DMPC/Chol liposomale Formulierung leicht toxischer war als das DSPC/Chol System. Dieses Ergebnis wurde in den Wirksamkeitsexperimenten bestätigt, wo die Gewichtsänderungen während 14 Tagen nach der Behandlungsaufnahme gemessen wurden (Fig. 4). Bei Tieren, denen (i. v.) 10&sup4; LI210 Zellen gegeben wurden und die 24 h später mit Mitoxantron behandelt wurden, betrug die maximale therapeutische Dosis von freiem und liposomalem Mitoxantron 10 bzw. 20 mg/kg. Daher zeigen die Ergebnisse in Fig. 4 durch Arzneimittel hervorgerufene Änderungen im Gewichtsverlust bei diesen Dosierungen. Der tiefste Punkt im Gewichtsverlust trat zwischen dem 12. und 13. Tag auf, und bei diesem Punkt verloren die mit dem freien Arzneimittel behandelten Tiere fast 30% ihres ursprüng lichen Körpergewichts. Im Gegensatz dazu zeigten mit DMPC/Cho Mitoxantron und DSPC/Chol Mitoxantron behandelte Tiere einen Körpergewichtsverlust von 20 bzw. 8%.
Die in Tabelle 2 und Fig. 5 zusammengefaßten L1210 Antitumor studien zeigen klar, daß die DMPC/Chol liposomale Formulierung therapeutisch aktiver ist als das freie Arzneimittel und das in DSPC/Chol Liposomen eingekapselte Arzneimittel. Wie in Tabelle 2 gezeigt, beträgt der mit dem freien Arzneimittel erreichte maximale prozentuale Anstieg der Lebensdauer 93%. Eine erhöhte Therapie wird bei dem in DSPC/Chol Liposomen ein gekapseltem Arzneimittel beobachtet, wo ein maximaler %ILS Wert von 180 bei einer Dosis von 20 mg/kg beobachtet wird. Die mit DSPC/Chol liposomalem Arzneimittel erreichte verbesserte Therapie ist hauptsächlich eine Folge der durch Liposom vermittelten Verringerungen der Arzneimitteltoxizität. Bei 10 mg/kg zum Beispiel ist die L1210 Antitumoraktivität dieser liposomalen Formulierung gleich der des freien Arzneimittels. Bemerkenswert ist, daß die Behandlung mit DMPC/Chol liposomalem Mitoxantron 100% langzeitiges (> 160 Tage) Überleben selbst bei einer Dosis von 10 mg/kg bewirkt. Die für Tiere, die mit einer Dosis von 10 mg/kg behandelt wurden, erhaltenen Überlebenskurven (Fig. 5) zeigen klar, daß die therapeutische Aktivität von Mitoxantron signifikant erhöht wird, wenn es in DMPC/Chol Liposomen eingekapselt ist. Tabelle 2 L1210 Antitumoraktivität von freiem und liposomalem Mitogantron in BDF1 Mäusen
a Prozentuale ILS (Anstieg der Lebensdauer) Werte wurden aus mittleren Überlebenszeiten der behandelten Gruppen und unbehandelten Kontrollgruppe bestimmt. Wenn die Tiere mehr als 60 Tage überlebten, wurde ILS% nicht bestimmt.
b ND bedeutet nicht bestimmt.
c L/F (Liposomal/Frei) Werte wurden berechnet durch Teilen der mittleren Überlebenszeit bei liposomaler Formulierung durch die mittlere Überlebenszeit bei freiem Arzneimittel bei gleicher Dosis.
Die soweit zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß der therapeutische Index von Mitoxantron enorm erhöht werden kann durch Einkapselung des Arzneimittels in DMPC/Chol Liposomen. Die Rate der Arzneimittelfreisetzung aus DMPC/Chol Liposomen ist wenigstens 68-mal schneller verglichen mit DSPC/Chol Liposomen. Zusätzlich zur Bewertung der Arzneimittelfreisetzung aus den Liposomen in den Plasmaraum ist es wichtig, die Antitumoraktivität mit der Arzneimittelexposition an der Stelle des Tumorwachstums in Wechselbeziehung zu bringen. Aus diesem Grund wurde auch die Arzneimittellieferung an die Leber bewertet, einer hauptsächlichen Stelle, wo die Krankheit für das hier verwendete Tumormodell sich verschlimmert. Die in Fig. 6 gezeigten Ergebnisse wurden in tumorfreien CD1 Mäusen erhalten, es sollte jedoch beachtet werden, daß die Arzneimittel/Liposom Daten der Arzneimittel/Liposom Eliminierung aus dem Plasma und der Bioverteilung in tumorfreien CD1 und tumortragenden (L1210 Zellen, 24 h vor der Arzneimittelinjektion) BDF1 Mäusen ähnlich waren. Wie in Fig. 6A gezeigt, ist die liposomale Lipidansammlung in der Leber für beide, die DSPC/Chol und DMPC/Chol liposomalen Mitoxantron Formulierungen ähnlich. Im Gegensatz zu Doxorubicin (Mayer L. D. et al., Cancer Res., 49: 5922-5930 (1989)) führte die Anwesenheit von eingeschlossenem Mitoxantron zu Verringerungen der liposomalen Lipidansammlung in der Leber. Das Niveau von Mitoxantron, das in der Leber 24 und 48 Stunden nach der i.v. Verabreichung von DMPC/Chol liposomalem Mitoxantron erreicht wurde, ist jedoch signifikant niedriger als das bei DSPC/Chol Mitoxantron beobachtete.
Die obigen Daten zeigen, daß die Maximierung der Arzneimittellieferung an die Stelle des Tumorwachstums einen geringen therapeutischen Wert ergeben kann, wenn das Arzneimittel nicht aus dem liposomalen Träger entweichen kann. Vorausgesetzt, daß das Arzneimittel durch die Liposommembran durchdringen kann, kann die Wichtigkeit der maximalen Arzneimittellieferung nachgewiesen werden. Es wäre zum Beispiel vorauszusagen, daß Faktoren, die die Ansammlung von DMPC/Chol Liposomen in der Leber reduzieren, die Erniedrigung in der i.v. L1210 Antitumoraktivität vermitteln würden. Die in Fig. 7 zusammengefaßten Ergebnisse stützen diese Voraussage klar. In diesen Studien wurde die Neigung von DMPC/Chol liposomalem Mitoxantron, sich in der Leber anzusammeln, durch Einarbeitung von 5 mol-% Poly(ethylenglykol)-Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) verringert. PEG-PE/DMPC/Chol Liposomen zeigten vergleichbare Eigenschaften bei der in vivo Arzneimittelfreisetzung (Ergebnisse nicht gezeigt), aber die Menge des an die Leber gelieferten Arzneimittels war um einen Faktor 2 geringer (Fig. 7A). Die Erniedrigung der Ansammlung in der Leber war mit erhöhten Niveaus von Arzneimittel und Lipid in dem Plasmaraum verbunden (Ergebnisse nicht gezeigt). Wie in Fig. 7B gezeigt, gab es eine überraschende Erniedrigung der Antitumoraktivität von Mitoxantron, das in PEG-PE/DMPC/Chol Liposomen eingekapselt war.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine liposomale Formulierung von Mitoxantron enthält, wobei die Liposomen eine Mischung von Cholesterin und 1,2-sn-Dimyristoylphospatidylcholin enthalten.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der die Mischung etwa 50% bis etwa 70% 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin und etwa 30% bis etwa 50% Cholesterin enthält.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, die außerdem ein PEG-Lipid-Konjugat enthält.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, in der das PEG-Lipid-Konjugat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyethylenglykol-Ceramid, in dem die Alkylgruppe eine Kettenlänge von 14 Kohlenstoffatomen aufweist (PEG-Cer-C&sub1;&sub4;), Polyethylenglykol-Ceramid, in dem die Alkylgruppe eine Kettenlänge von 20 Kohlenstoffatomen aufweist (PEG-Cer-C20) und Monomethoxypolyethylenglykolen mit einem mittleren Molekulargewicht von 2000 Dalton - Distearoylphosphatidylethanolamin (MePEGS- 2000-DSPE) besteht.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, in der das PEG-Lipid-Konjugat in einer Menge von etwa 1 Gew.-% bis etwa 8 Gew.-% anwesend ist.

6. Medizinische Präparation zur Behandlung von festen Tumoren, wobei die Präparation eine liposomale Formulierung von Mitoxantron enthält und die Liposomen eine Mischung von Cholesterin und 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin enthalten.

7. Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 durch Einkapselung von Mitoxantron in Liposomen, die eine Mischung von Cholesterin und 1,2-sn- Dimyristoylphosphatidylcholin enthalten, um eine liposomale Formulierung mit einem erhöhten therapeutischen Index von Mitoxantron zu schaffen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Liposomen eine Mischung von etwa 50% bis etwa 60% 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin und etwa 40% bis etwa 50% Cholesterin enthalten.

9. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Mischung außerdem ein PEG-Lipid-Konjugat enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das PEG-Lipid-Konjugat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyethylenglykol- Ceramid, in dem die Alkylgruppe eine Kettenlänge von 14 Kohlenstoffatomen aufweist (PEG-Cer-C&sub1;&sub4;), Polyethylenglykol- Ceramid, in dem die Alkylgruppe eine Kettenlänge von 20 Kohlenstoffatomen aufweist (PEG-Cer-C&sub2;&sub0;) und Monomethoxypolyethylenglykolen mit einem mittleren Molekulargewicht von 2000 Dalton - Distearoylphosphatidylethanolamin (MePEGS-2000-DSPE) besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das PEG-Lipid-Konjugat in einer Menge von etwa 1 Gew.-% bis etwa 8 Gew.-% anwesend ist.