DE69637391T2

DE69637391T2 - Modifizierte myelin proteinmoleküle

Info

Publication number: DE69637391T2
Application number: DE69637391T
Authority: DE
Inventors: John P. Old Lyme MUELLER; Michael J. Potomac LENARDO; Henry F. Gaithersburg MCFARLAND; Louis Southport MATIS; Eileen Elliott Old Lyme MUELLER; Steven H. Thiensville NYE; Clara M. Shaker Heights PELFREY; Stephen P. Bethany SQUINTO; James A. Woodbridge WILKINS
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc; US Department of Health and Human Services
Priority date: 1995-05-02
Filing date: 1996-04-22
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2016-04-23
Also published as: ATE382366T1; JPH11511650A; CA2218858A1; KR19990008329A; DE69637391D1; AU5565896A; KR100682350B1; EP0830139A4; MX9708418A; EP0830139B1; EP0830139A1; WO1996034622A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Insbesondere liefert die Erfindung Zusammensetzungen und Medikamente, welche die Diagnose und Behandlung von Multipler Sklerose (MS) vereinfachen. Spezieller werden gentechnisch hergestellte basische Myelinprotein-(MBP-)Moleküle, d. h. MBP-Polypeptide und Nukleinsäuremoleküle, die MBP-Polypeptide codieren, und Proteolipidprotein-(PLP-)Moleküle, d. h. Polypeptide, die PLP-Sequenzen umfassen, und Nukleinsäuremoleküle, die solche Polypeptide codieren, ebenso bereitgestellt wie Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide für die Diagnose, die klinische Bewertung und die therapeutische Behandlung von Multipler Sklerose.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Diskussion in diesem Abschnitt ist nicht auf einen Gegenstand beschränkt, der sich gegenüber der vorliegenden Erfindung als "Stand der Technik" qualifiziert. Daher soll keine Zulassung von solchem Stand der Technik-Status aufgrund der Aufnahme bestimmter Gegenstände in diese Diskussion impliziert oder gefolgert werden, und es soll keine Erklärung gegen das Interesse der Erfinder der vorliegenden Anmeldung aufgrund einer solchen Aufnahme impliziert werden.
Autoimmunerkrankungen
Autoimmunerkrankungen resultieren aus dem Verlust von Toleranz gegenüber bestimmten Selbstantigenen, was zu einem unangemessenen Angriff auf diese Antigene durch das Immunsystem führt. Normalerweise funktionieren zahlreiche Mechanismen so, daß die Selbsttoleranz des Immunsystems sowohl in den Antikörper-vermittelten (humoralen) als auch in den zellulären Aspekten des Immunsystems aufrechterhalten wird. Wenn diese Mechanismen versagen, kommt es zum Auftreten von Autoimmunerkrankungen.
Krankheiten, die aus einer solchen fehlgeleiteten Aktivität des Immunsystems resultieren, betreffen mehr als 10 Millionen Patienten allein in den USA. Es wird seit langem nach Therapien gesucht, die eher die Ursachen als die Symptome dieser Erkrankungen behandeln. Während Mittel gefunden wurden, die vorteilhafte Reduktionen der Autoimmunaktivität bereitstellen, haben solche Behandlungen im allgemeinen die unerwünschte und gefährliche Wirkung, daß sie auch normale Immunfunktionen beeinträchtigen, und werden daher als suboptimal angesehen.
Multiple Sklerose
Multiple Sklerose (MS) ist eine progressive neurodegenerative Autoimmunstörung, von der etwa 350.000 Amerikaner betroffen sind (siehe beispielsweise Hauser, 1994). Bei Frauen ist es doppelt so wahrscheinlich wie bei Männern, daß sie die Erkrankung entwickeln. MS betrifft üblicherweise Patienten im Alter zwischen 15 und 50 Jahren, am häufigsten junge Frauen im Alter zwischen 20 und 40 Jahren. MS leitet ihren Namen von den mehrfach vernarbten (sklerotischen) Bereichen von Degeneration ab, die bei makroskopischer Untersuchung des zentralen Nervensystems (ZNS) von betroffenen Individuen zu sehen sind. Die mit MS assoziierte Degeneration umfaßt Demyelinisierung, chronische Entzündung und Gliose (Vernarbung) betroffener Bereiche des Gehirns, des Sehnervs und des Rückenmarks.
MS ist durch verschiedene Typen und Stadien der Erkrankungsprogression gekennzeichnet. Patienten werden mit schubförmiger MS diagnostiziert, wenn sie Perioden von Verschlimmerung und Abklingen erleben. Rasch-progressive oder chronisch-progressive MS wird in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit der Erkrankungsprogression diagnostiziert. Diese Stadien treten üblicherweise später im Krankheitsverlauf auf, wenn das Ausmaß der Erholung von einzelnen Schüben abnimmt und es klinisch stabile Perioden zwischen Perioden der Verschlechterung gibt. Inaktive MS tritt typischerweise spät in der Progression der Erkrankung auf und ist durch fixierte neurologische Defizite variablen Ausmaßes gekennzeichnet.
MS wirkt immer schwächend und kann manchmal zu Paralyse und Tod führen. Obwohl die Faktoren, die das Einsetzen von MS auslösen, nach wie vor unbekannt sind, gibt es überzeugende Anhaltspunkte, wonach die MS-Pathologie aus einer abnormalen Immunantwort auf die Myelinhülle resultiert. Diese Immunantwort umfaßt Autoimmunwirkungen bestimmter weißer Blutzellen. Es wird angenommen, daß neuroantigenspezifische T-Zellen in dieser Hinsicht besonders wichtig sind.
Pathologisch betrachtet ist MS durch chronische Entzündung, Demyelinisierung und Gliose der weißen Substanz gekennzeichnet. Die klassischen Läsionen von MS, bezeichnet mit Plaques, sind gut abgegrenzte graue oder rosafarbene Bereiche, die sich leicht von umgebender weißer Substanz unterscheiden lassen. (Die Färbung der weißen Substanz ist auf die hohen Konzentrationen von Myelin in diesem Gewebe zurückzuführen.) Die akute MS-Läsion ist gekennzeichnet durch Demyelinisierung, die mit Gewebeinfiltration durch mononukleare Zellen, vorherrschend T-Zellen (sowohl Helfer- als auch zytotoxische Zellen) und Makrophagen, assoziiert ist, wobei B-Zellen und Plasmazellen kaum vorhanden sind. Diese inflammatorischen Infiltrate scheinen die Demyelinisierung zu vermitteln, die für die Erkrankung charakteristisch ist. Da aktivierte T-Zellen Zytokine freisetzen, die Makrophageninfiltration und -aktivierung fördern, werden T-Zellen als primäre Mediatoren eines pathogenen Autoimmunangriffs bei MS betrachtet. Ausführlichere Diskussionen zu T-Zellen und Myelin sind unten unter "T-Zell-Physiologie", "T-Zellen und Autoimmunpathogenese" und "T-Zellen zielen auf definierte Autoantigene bei MS" zu finden.
Die derzeitigen Behandlungen für MS variieren. In Abhängigkeit von der Schwere der Erkrankung und der Reaktion auf die Behandlung steht eine Vielzahl von Optionen für die Arzneimitteltherapie zur Verfügung. Arzneimittel, die zur Behandlung von MS verwendet werden, umfassen Steroide, wie Prednison und Methylprednisolon, Hormone, wie adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Antimetaboliten, wie Azathioprin, Alkylierungsmittel, wie Cyclophosphamid, und T-Zellen inhibierende Mittel, wie Cyclosporin. Die Verabreichung irgendeines dieser Arzneimittel ist gefährlich, da sie alle typischerweise ein gewisses Maß an generalisierter Immunsuppression erzeugen und den Patienten für Infektionen anfälliger machen. Patienten können auch Nebenwirkungen wie Übelkeit, Haarausfall, Bluthochdruck und Nierendysfunktion haben, wenn sie mit solchen Arzneimitteln behandelt werden. Zusätzlich sind einige dieser Arzneimittel karzinogen.
Neue Ansätze zur Behandlung von MS umfassen die Interferon-Beta-Therapie, die die Häufigkeit von MS-Schüben verringern und die Progression der Erkrankung verlangsamen kann. Weitere neue Ansätze umfassen die Verabreichung von Antigenen, die an MS-Autoimmunantworten beteiligt sind, wie unten diskutiert.
Diagnose von MS
MS wird typischerweise auf Basis der medizinischen Geschichte und von Körperuntersuchungen diagnostiziert. Es gibt keine klinischen Anzeichen oder diagnostischen Tests, die für MS einzigartig sind. Die Diagnose eines Patienten mit einem einzigen Initialsymptom, welches üblicherweise mit MS in Verbindung gebracht wird, kann nicht endgültig sein, obwohl Symptome einer schubweisen Erkrankung die Wahrscheinlichkeit einer MS-Diagnose erhöhen. Zwei oder mehrere Episoden der Verschlimmerung, die jeweils 24 Stunden dauern oder im Abstand von wenigstens einem Monat auftreten, oder eine langsame stufenweise Progression von Anzeichen und Symptomen über wenigstens sechs Monate werden als starke Anzeichen von MS betrachtet. MRI-Befunde, die eine Beteiligung der weißen Substanz des ZNS in zwei oder mehr Bereichen implizieren, und Hinweise auf eine systemische Erkrankung deuten ebenfalls auf MS hin.
Derzeit werden verschiedene Labortests durchgeführt, um die Diagnose zu bestätigen und die Progression der Erkrankung zu beurteilen. Solche Tests umfassen die Analyse menschlicher Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und von Blut hinsichtlich chemischer und zellulärer Anzeichen von MS-Pathologie.
CSF-Abnormalitäten, die mit MS assoziiert sind, bestehen aus der Pleozytose von mononukleären Zellen und dem Vorhandensein von autoreaktiven (typischerweise Myelin-reaktiven) T-Zellen, einer Erhöhung der Menge an Gesamt-Ig und dem Vorhandensein von oligoklonalem Ig, was typischerweise als zwei oder mehrere oligoklonale Banden zu sehen ist. In ungefähr 80 Prozent der Patienten ist der CSF-Gehalt von IgG in der Gegenwart einer normalen Konzentration von Gesamtprotein erhöht. Dies resultiert aus der selektiven Erzeugung von IgG innerhalb des ZNS.
Die oligoklonale Bandausbildung von CSF-IgG wird mittels Agarosegelelektroforesetechniken detektiert. In 75 bis 90 Prozent der MS-Patienten sind zwei oder mehrere oligoklonale Banden zu finden. Das Vorliegen von oligoklonaler Bandausbildung korreliert mit einer erhöhten Menge an Gesamt-IgG bei MS. Weitere Ig-Abnormalitäten in MS-CSF umfassen freie leichte Kappa- oder Lambda-Ketten und erhöhte Mengen an anderen Ig-Isotypen, einschließlich IgA.
Vom Myelinabbau abgeleitete Metaboliten können auch in der CSF detektiert werden. Erhöhte Mengen von PLP oder dessen Fragmenten können z. B. durch Radioimmuntest sowohl in MS- als auch in einigen Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen detektiert werden.
Zusätzlich zu vielen der oben für CSF beschriebenen pathologischen Zeichen kann das Blut von MS-Patienten erhöhte Niveaus der IgG-Synthese, polymorphonuklearer Leukozyten, reduzierte Mengen an Serum-B₁₂, eine erhöhte Geschwindigkeit der Erythrozytensedimentation und das Vorliegen von Autoantikörpern oder autoreaktiven T-Zellen aufweisen. Wie unten diskutiert, ist der "reaktive T-Zellen-Index" eine besonders nützliche zelluläre Erkenntnis für die Überwachung des klinischen Verlaufs von MS.
Obwohl diese verschiedenen Indikatoren einer MS-Erkrankung von klinischem Nutzen sind, sind weitere Mittel zum Verfolgen des Verlaufs und des Ausmaßes der Autoimmunaktivität in MS-Patienten unter Verwendung relativ kostengünstiger und leicht quantifizierbarer Tests, wie Blut- oder Zerebrospinalflüssigkeitstests (im Gegensatz zu teuren bildgebenden Techniken, wie MRI), notwendig.
T-Zellen, Antigen-präsentierende Zellen und T-Zell-Epitope
Wie oben erwähnt, wird angenommen, daß die MS-Pathogenese durch die unangemessenen Aktivitäten weißer Blutzellen (Leukozyten), im wesentlichen T-Zellen, vermittelt wird. T-Zellen sind mononukleare weiße Blutzellen, die viele wesentliche Immunfunktionen bereitstellen. Die Bedeutung von T-Zellen in menschlichen Autoimmunerkrankungen wurde in den letzten zehn Jahren zunehmend wahrgenommen. Studien, die Behandlungen verwendeten, die zu einer generalisierten Immunsuppression führen, haben für einen Teilsatz von T-Zellen, bekannt als CD4⁺- oder Helfer-T-Zellen, eine kritische Rolle als primäre Regulatoren aller Immunantworten (sowohl zellulär als auch humoral) auf Protein- oder Peptidantigene definiert.
T-Zellen vermitteln Gewebeverletzung durch indirekte und direkte Mittel. T-Zellen aus sowohl CD8⁺-(zytotoxischen) als auch CD4⁺-(Helfer-)Teilsätzen sondern eine Vielzahl von inflammatorischen Zytokinen ab, die Gewebe indirekt durch Aktivieren verschiedener weiterer Typen von weißen Blutzellen schädigen können. Beispiele solcher T-Zell-Wirkungen umfassen die Aktivierung von Antikörper-absondernden B-Zellen (stimulieren humorale Immunaktivität) und die Aktivierung von Makrophagen, die akute Gewebeschäden und Entzündung verursachen können, indem sie hydrolytische Enzyme, reaktive Sauerstoffspezies und zusätzliche pro-inflammatorische Zytokine freisetzen. Zusätzlich zu diesen indirekten Auswirkungen der T-Zell-Aktivität kön nen direkte Gewebeschäden durch zytotoxische CD8⁺-T-Zellen vermittelt werden, die Zellen angreifen, die Zielantigene zeigen.
Ein einzigartiger Aspekt der Physiologie von T-Zellen ist das Vorliegen von membrangebundenen antikörperartigen Bindungsstrukturen, genannt T-Zell-Rezeptoren (TCRs) auf ihren Zelloberflächen. Wie Antikörper binden auch TCRs mit hoher Spezifität an bestimmte Antigene. Wie Antigen-produzierende Zellen, die sich als zahlreiche Klone von Zellen entwickeln, wobei jeder Klon Antikörper mit einzigartigen Spezifitäten erzeugt, entwickeln sich T-Zellen als eine große Anzahl unterschiedlicher Klone, und jeder bestimmte T-Zell-Klon exprimiert einen einzigen Typ von TCR mit einer definierten Bindungsspezifität. T-Zell-Klone mit TCRs, die spezifisch an Selbstantigene binden, sind für die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen verantwortlich.
Zusätzlich dazu, daß sie eher Zelloberflächen- als lösliche Moleküle sind, unterscheiden sich die TCRs von Antikörpern in der Art und Weise, wie sie Antigene erkennen. Während Antikörper in verschiedenen Kontexten an Antigene binden (z. B. Antigene, die nativ, denaturiert, löslich oder membrangebunden sind), binden TCRs erst an die meisten Antigene, nachdem die Antigene durch bestimmte, als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) bekannte Zellen abgebaut (verarbeitet) und die resultierenden Peptide auf den Zelloberflächen der APCs im Zusammenhang mit Klasse II- oder Klasse I-Proteinen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gezeigt (präsentiert) wurden. In einer menschlichen Population können verschiedene Individuen sehr unterschiedliche MHC-Moleküle dieser Klassen zeigen. Daher können in solchen Individuen bevorzugt viele verschiedene Epitope präsentiert werden.
Die Einzelheiten des Mechanismus, durch den die Antigenverarbeitung durch die APCs durchgeführt wird, werden schlecht verstanden. Es besteht folglich ein beträchtliches Maß an Unsicherheit hinsichtlich der Fähigkeit von APCs, ein gegebenes Antigen in einer solchen Weise zu verarbeiten, daß ein bestimmtes Peptid erzeugt und gezeigt wird, wenn dieses Antigen nicht bereits in dieser Hinsicht charakterisiert wurde.
Eine Ausnahme bei dem Erfordernis, daß APCs Antigene verarbeiten und präsentieren, damit die Antigene T-Zellen über ihre TCRs stimulieren, stellt der Fall kleiner Peptidantigene dar. Solche Peptide können direkt an MHC-Klasse I-Moleküle auf Zelloberflächen binden, ohne durch APCs verarbeitet zu werden, und können dann "erkannt" und durch spezifische TCRs gebunden werden und dadurch T-Zellen stimulieren.
Untersuchungen der Wechselwirkungen von Antikörpern und TCRs mit ihren spezifischen Antigenen haben gezeigt, daß ein bestimmtes Polypeptidantigen typischerweise zahlreiche submolekulare Merkmale, bekannt als Epitope, umfaßt, die jeweils als eindeutige Bindungsstelle für einen bestimmten Antikörper oder (im Anschluß an die APC-Verarbeitung des Polypeptids und der MHC-Anzeige eines abgeleiteten Peptids, welches das T-Zell-Epitop umfaßt) einen bestimmten TCR dienen können.
Somit sind TCRs und Antikörper dahingehend ähnlich, daß jeder nur einen kleinen Teil eines Polypeptidantigens erkennt. Sie unterscheiden sich dahingehend, daß ein Antikörper typi scherweise sein spezifisches Epitop innerhalb des Kontexts des intakten Polypeptids erkennt, während ein TCR nur ein spezifisches Epitop als ein MHC-Klasse II- oder -Klasse I-assoziiertes Peptidfragment eines verarbeiteten Polypeptids auf der Oberfläche einer APC erkennt. Es ist von Bedeutung, daß dieser Vorgang der TCR-Epitoperkennung nur stattfinden kann, wenn eine APC das Polypeptidantigen so verarbeiten kann, daß das geeignete Peptid erzeugt und gezeigt wird. Somit ist es, obwohl ein Peptid, welches durch einen spezifischen TCR erkannt wird, in einem bestimmten Polypeptidantigen vorliegen kann, ungewiß, ob Peptide, die T-Zellen stimulieren können, welche diesen spezifischen TCR exprimieren, von diesem Polypeptidantigen in vivo abgeleitet werden. Dies ist deshalb der Fall, weil unsicher ist, ob APCs das durch den spezifischen TCR erkannte Peptid erzeugen können, indem sie das bestimmte Polypeptidantigen verarbeiten.
Dieses Fehlen von Sicherheit hinsichtlich der Ergebnisse der APC-Verarbeitung eines bestimmten Polypeptidantigens ist auf verschiedene Faktoren zurückzuführen. Ein Grund, warum eine APC ein bestimmtes Polypeptidantigen möglicherweise nicht so verarbeiten kann, daß ein spezifisches Peptidepitop, welches in dem Polypeptid enthalten ist, gezeigt wird, besteht darin, daß die APC in effizienter Weise das Polypeptid an einer Stelle innerhalb des Epitops spaltet und es dadurch zerstört. Ein zweiter Grund ist, daß das Polypeptid nicht in die subzellulären Kompartimente von APCs, die für die Polypeptidverarbeitung verantwortlich sind, eintreten oder von diesen effektiv abgebaut werden kann.
Bestimmte Aspekte der Primärstruktur (lineare Aminosäuresequenz), Sekundärstruktur (3D-Struktur, die aus Wechselwirkungen von Aminosäureresten, die in der linearen Aminosäuresequenz nahe beieinander liegen, resultiert) oder Tertiärstruktur (3D-Struktur, die aus Wechselwirkungen von Aminosäureresten, die in der linearen Aminosäuresequenz weit auseinander liegen, jedoch als Ergebnis einer Faltung der Polypeptidkette nahe zueinander kommen, resultiert) können die APC-Verarbeitung behindern. Die Aminosäuresequenz eines Polypeptids ist eindeutig der wichtigste Faktor bei der Bestimmung seines Potentials zur Verarbeitung und Anzeige durch APCs, um spezifische T-Zellen zu stimulieren. Das Peptid, das durch die TCRs der spezifischen T-Zelle erkannt wird, muß in der Aminosäuresequenz des Polypeptids enthalten sein. Die Aminosäuresequenz bestimmt auch die mögliche Sekundär- und Tertiärstruktur (d. h. die Faltung) des Polypeptids.
Die Faltung eines Polypeptids kann auch die APC-Verarbeitung in bedeutendem Maße behindern. Sowohl der erste als auch der zweite oben angegebene Grund für die Unsicherheit bezüglich der Anzeige eines spezifischen, von einem bestimmten Polypeptid abgeleiteten Epitops durch APCs können aus der Art und Weise resultieren, in der das Polypeptid gefaltet ist. Proteolytische Spaltung während der Verarbeitung innerhalb der APC kann durch die Freilegung oder Maskierung einer Spaltungsstelle aufgrund von Faltung beeinflußt werden. Es ist gut bekannt, daß der Eintritt von Polypeptiden in subzelluläre Kompartimente durch die 3D-Struktur des Polypeptids, die eine Funktion der Faltung ist, beeinflußt wird.
T-Zellen und Autoimmunerkrankungen
Bei Autoimmunerkrankungen wird nur eine begrenzte Anzahl an T-Zell-Klonen, die mit verschiedenen Epitopen einer kleinen Anzahl an Autoantigenen reaktiv sind, aktiviert und ist an der Pathogenese beteiligt. Es wurde zu verschiedenen Mechanismen postuliert, daß sie bei dieser pathogenen Aktivierung von krankheitsverursachenden autoreaktiven T-Zellen eine Rolle spielen. Eine primäre Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) durch Infektion oder lokale Entzündung ist an einem solchen Mechanismus beteiligt. Auf diese Weise aktivierte APCs können dann eine starke Co-Stimulation für bislang nicht-reaktive T-Zellen bereitstellen.
Weitere vorgeschlagene Mechanismen umfassen die polyklonale Aktivierung von zuvor ruhenden autoreaktiven T-Zellen durch Superantigene, wie bakterielle Toxine, oder eine zufällige molekulare Mimikrie zwischen Fremd- und Selbstantigenen (Abbas et al., 1994). Im letztgenannten Fall stellt das Wirtsimmunsystem eine Antwort auf ein Epitop in einem durch ein Pathogen, wie ein Virus, exprimiertes Protein auf, wobei das Epitop einem homologen Epitop auf einem Wirtsprotein ähnelt. Ein Autoimmunangriff resultiert dann aus der kreuzreaktiven Immunantwort, die sich ergibt.
Zusätzlich zu externen Faktoren liegt der Entstehung jeder T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankung ein komplexes Muster ererbter Anfälligkeit, bestimmt durch multigene Faktoren, zugrunde. Für weitere Diskussionen dieser verschiedenen Faktoren bespricht Steinman, 1995, derzeitige Theorien von Autoimmunität.
In verschiedenen Autoimmunerkrankungen, einschließlich MS (wie unmittelbar unten unter "T-Zellen zielen auf definierte Autoantigene in MS" ausführlich diskutiert), wurden einige der oder alle Autoantigene, auf die abnormale Immunantworten gerichtet sind, identifiziert. Die Kenntnis dieser Selbstantigene und der spezifischen Epitope innerhalb dieser Antigene, auf die autoreaktive T-Zellen bei einer Autoimmunstörung, wie MS, zielen, liefert einen Ansatz für die Therapie, wie unten unter "Behandlung von MS durch Verabreichung von Antigenen" und "Therapeutische Induzierung von Apoptose" ausführlich diskutiert.
T-Zellen zielen auf definierte Autoantigene in MS
Obwohl, wie oben diskutiert, die genaue Ätiologie von MS nach wie vor unbekannt ist, ist ein Autoimmunangriff ganz klar für die Zerstörung von Zentralnervensystem-(ZNS-)Myelin verantwortlich, welche die Krankheit auszeichnet. Myelin ist die charakteristische Komponente der Myelinhülle, die die Axone bestimmter Neuronen umgibt, als elektrischer Isolator wirkt und für die einwandfreien Signalübertragungsfunktionen dieser Neuronen wesentlich ist. Die mit MS einhergehende Demyelinisierung verursacht somit einen Funktionsverlust in betroffenen Neuronen, was die neuronale Signalgebung stört und zu Paralyse und schwerer Schädigung der Sinnesfunktionen führt.
Die Myelinhülle ist aus Oligodendrozyten (im zentralen Nervensystem) und Schwann-Zellen (im peripheren Nervensystem) gebildet. Myelin besteht aus sich regelmäßig abwechselnden Lagen von Lipiden (z. B. Cholesterol, Phospholipiden und Sphingolipiden) und Proteinen.
Die vier Hauptproteinkomponenten von Myelin, d. h. basisches Myelinprotein (MBP), Proteolipidprotein (PLP), Myelin-assoziiertes Glycoprotein (MAG) und Myelinoligodendrozytenprotein (MOG), werden durch autoreaktive T-Lymphozyten erkannt, die aus MS-Patienten isoliert wurden (Endoh et al., 1986; Martin et al., 1992; Kerlero de Rosbo et al., 1993; Amor et al., 1994; Johns et al., 1995).
Basisches Myelinprotein (MBP) und Proteolipidprotein (PLP) sind Hauptproteinkomponenten von Myelin, die ungefähr 30% bzw. 50% des Gesamtproteingehalts der Myelinhülle ausmachen. Es wurde gezeigt, daß MBP und PLP die Haupt-Zielautoantigene in MS sind, und T-Zellen, die mit MBP und PLP reaktiv sind, spielen Schlüsselrollen bei ihrer Pathogenese (siehe beispielsweise Schwartz, 1993; Brown und McFarlin, 1981. Lab. Invest. 45, S. 278-284; Allegretta et al., 1990; Lehmann et al., 1992; Martin et al., 1992; Sprent et al., 1994; Su und Sriram. 1991. J. of Neuroimmunol. 34, S. 181-190, und Weimbs und Stoffel. 1992).
MBP-spezifische und PLP-spezifische T-Lymphozyten sind im Blut von MS-Patienten zu finden. Obwohl sie manchmal im Blut von gesunden Individuen zu finden sind, liegen sie typischerweise in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) von Patienten mit MS vor. Tatsächlich sind solche T-Zellen nicht in CSF von gesunden Individuen zu finden (Kerlero de Rosbo et al., 1993; Zhang et al., 1994).
Die Immunantworten von MS-Patienten auf MBP und PLP unterscheiden sich eindeutig von denjenigen von gesunden Individuen. MBP- und PLP-reaktive T-Zellen werden bevorzugt in MS-Patienten aktiviert, wie durch die Beobachtung, daß die Häufigkeit von MBP-spezifischen und PLP-spezifischen T-Zellen, die Aktivierungsmarker (z. B. IL-2-Rezeptoren) exprimieren, in MS-Patienten erhöht ist (siehe beispielsweise Zhang et al., 1994), demonstriert wird.
Die Analyse der Häufigkeit von Genmutation liefert auch Hinweise darauf, daß MBP-reaktive T-Lymphozyten insbesondere in MS-Patienten aktiviert werden. Da Genmutation bei sich teilenden T-Zellen häufiger ist als in ruhenden T-Zellen, stellt eine gesteigerte Mutationshäufigkeit in T-Zellen mit einer bestimmten Spezifität einen Hinweis auf die spezifische Aktivierung dieser Zellen in vivo bereit (Allegretta et al., 1990).
T-Lymphozyten von MS-Patienten wurden in Thioguanin kultiviert, um die Häufigkeit von Mutationen in dem hprt-Gen, die sie gegenüber diesem Purinanalogen resistent machen würde, zu testen. Eine große Häufigkeit von Thioguanin-resistenten T-Zell-Klonen, die das bis zu 10-fache der Häufigkeit von T-Zellen von normalen Individuen betrug, wurde in MS-Patienten gefunden, und ein signifikanter Prozentanteil dieser mutanten Klone proliferierte in Reaktion auf Hirn-MBP, obwohl sie diesem Antigen niemals mit Absicht ausgesetzt worden waren. Im Gegensatz dazu erkannten keine resistenten Klone, die aus normalen Subjekten erhalten worden waren, MBP.
MBP, PLP und MOG werden auch als primäre Autoantigene in MS angesehen, da sie die Fähigkeit besitzen, experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) in Tieren zu induzieren. EAE ist ein experimentell induzierter Zustand, der MS stark ähnelt, und er ist das Standardtiermodell von MS. Zusätzlich kann die Übertragung von T-Zellen von einem Individuum, welches an EAE (oder MS) leidet, auf ein gesundes Tier EAE in dem Empfänger erzeugen, ein Verfahren der Krankheitsinduzierung, welches als "passive Immunisierung" bezeichnet wird. Beispielsweise verursachten in einer Mensch-zu-Tier-Übertragungsstudie mononukleare CSF-Zellen (einschließlich T-Zellen) von MS-Patienten Paralyse, Ataxie und inflammatorische Hirnläsionen, wenn sie in die CSF in den Gehirnventrikeln von Mäusen mit schwerem kombiniertem Immundefekt (SCID) injiziert wurden (Saeki et al., 1992). Auch die Immunisierung von Tieren mit MBP und/oder PLP und/oder MOG kann die ZNS-Entzündung, Paralyse und weitere Anzeichen und Symptome von EAE auslösen (siehe beispielsweise Alvord et al., 1984; Abbas et al., 1994; Amor et al., 1994, und Johns et al., 1995).
Obwohl klar ist, daß MBP, PLP und MOG primäre Antigene sind, auf die die abnormale Immunantwort in MS gerichtet ist, haben Untersuchungen eine deutliche Heterogenität von MBP- und PLP-Epitopen, die T-Zell-proliferative Antworten induzieren können, gezeigt. Diese Untersuchungen haben nicht konsistent ein einziges Epitop gezeigt, welches durch reaktive T-Zellen von MS-Patienten häufiger erkannt wird als durch diejenigen von normalen gesunden Individuen (Chou et al., 1989; Richert et al., 1989; Martin et al., 1990; Ota et al., 1990; Pette et al., 1990; Martin et al., 1992; Meinl et al., 1993). Diese Heterogenität beim Zielen auf Antigene kann zum Teil eine Funktion der Vielfalt der MHC-Moleküle und TCRs, die durch verschiedene Individuen in einer menschlichen Population exprimiert werden, sein.
Unterschiedliche molekulare Formen (Isoformen) von MBP werden durch differentielles Splicing von MBP-hnRNAs erzeugt, was zum Vorliegen einiger der oder aller sieben Exons des einzelnen MBP-Gens in dem codierten Protein führt. In gesunden Erwachsenen ist MBP nahezu ausschließlich als ein 18,5 kDa-Molekül zu finden, welches aus einer mRNA erzeugt wird, die alle Exons des MBP-Gens mit Ausnahme von Exon 2 umfaßt (Kamholtz et al., 1988). Weitere Formen von MBP beinhalten eine 21,5 kDa-Isoform voller Länge (alle 7 Exons) und zwei weitere nebengeordnete Isoformen (17,2 und 20,2 kDa). Die Expression der beiden Exon 2 enthaltenden Isoformen (21,5 kDa und 20,2 kDa) scheint mit der Myelinbildung zuzunehmen, und zwar sowohl während der frühen fötalen Entwicklung als auch während der Remyelinisierung von geschädigtem Gewebe (Kamholtz et al., 1988; Roth et al., 1987). Diese beiden Isoformen werden auf dem Gebiet und hierin als "fötale" Isoformen bezeichnet, obwohl sie auch in remyelinisierendem geschädigtem adultem Gewebe gefunden werden.
MS-Plaques enthalten Bereiche von Remyelinisierung und sollten daher größere Mengen der 21,5-Isoform von MBP enthalten, als sie in gesundem adultem ZNS-Gewebe zu finden ist, was darauf hindeutet, daß eine Immunantwort auf ein Epitop innerhalb der gemeinsamen 26 Aminosäuren-Region (die der Sequenz entspricht, die von Aminosäurerest 60 bis Aminosäurerest 85 von SEQ ID NO: 1 reicht) jeder der beiden fötalen Isoformen von MBP, codiert durch Exon 2, (diese Regionen werden als "X2MBP" oder einfach als "X2" bezeichnet) den klinischen Verlauf der etablierten Erkrankung verschlimmern könnte (Prineas et al., 1993; Raine und Wu, 1993; Bruck et al., 1994).
Da Remyelinisierung im Verlauf von MS zyklisch auftreten kann, könnte jeder Zyklus der Remyelinisierung theoretisch dazu dienen, eine gerade stattfindende Immunantwort durch Aktivierung ruhender X2MBP-spezifischer T-Zellen im ZNS voranzutreiben. Zur Unterstützung dieser Hypothese deuten verschiedene Beweisansätze auf die Beteiligung eines durch Exon 2 des MBP-Gens codierten Epitops (d. h. eines Epitops innerhalb von X2MBP) an der MS-Pathogenese hin.
Untersuchungen der Rolle alternativer Isoformen von MBP bei MS erfordern die Verfügbarkeit von Mengen von gereinigten Myelinantigenen, um deren immunologische Eigenschaften zu beurteilen. Solche Untersuchungen waren daher im allgemeinen auf die Verwendung von synthetisch abgeleiteten Peptiden, z. B. X2MPB umfassenden Peptiden, beschränkt. Kürzlich wurden MHC-Klasse II-restringierte CD4⁺-T-Zellen, die mit Peptiden, welche Exon 2-codierte Sequenzen von humanem MBP enthalten, reaktiv sind, aus Peripherblut sowohl von MS-Patienten als auch von normalen gesunden Kontrollen isoliert (Voskuhl et al., 1993a; Voskuhl et al., 1994). In einer an MS leidenden Familie war die Häufigkeit von T-Lymphozyten, die für ein X2 umfassendes Peptid spezifisch sind, größer als die Häufigkeit von T-Zellen, die für Epitope innerhalb der 18,5 kDa-Isoform von MBP, die X2 nicht enthält, spezifisch sind (Voskuhl et al., 1993b). Zusätzlich zu diesen Daten von menschlichen Subjekten wurde kürzlich herausgefunden, daß ein Maus-X2 umfassendes Peptid in SJL/J-Mäusen immunogen ist, und durch passive Immunisierung mit Exon 2-Peptid-sensibilisierten Lymphozyten wurde schwere EAE induziert (Segal et al., 1994; Fritz und Zhao, 1994).
Zusammengenommen zeigen diese Erkenntnisse in Menschen und Tieren, daß eine zelluläre Immunantwort auf das von Myelin abgeleitete Antigen MBP in vivo wenigstens einen Teil der mit Multipler Sklerose assoziierten Pathogenese verursacht. Es sei jedoch angemerkt, daß alle Untersuchungen hinsichtlich X2-Epitopen synthetische Peptide als Antigene verwendeten und keine davon MBP-21,5-Protein voller Länge verwendete. Im Hinblick auf die Unsicherheit hinsichtlich der Verarbeitung und der Anzeige bestimmter Epitope nicht getesteter Proteine durch APCs wurde auf dem Gebiet bezweifelt, ob diese Ergebnisse für die in vivo-Pathogenese von MS wirklich relevant sind.
PLP ist ein hochgradig hydrophobes integrales Myelinmembranprotein, dessen physikalische und chemische Eigenschaften es schwierig machen, es zu isolieren, zu untersuchen oder an einen Patienten zu verabreichen (siehe beispielsweise Sobel et al., 1994; Tuohy 1994; Van der Venn et al., 1989; Van der Venn et al., 1990; Van der Venn et al., 1992; van Noort et al., 1994). Die primäre Aminosäuresequenz von PLP ist zwischen den Spezies hochgradig konservativ. Typischerweise beinhaltet das reife PLP-Polypeptid nicht den Initiator Methionin, der durch das PLP-Gen codiert wird; diese Aminosäure scheint in Säugerzellen durch ein posttranslationales Verarbeitungsereignis entfernt worden zu sein. Dementsprechend ist, wie sie hier verwendet wird, die Aminosäurenumerierung von humanem PLP die in SEQ ID NO: 22 gezeigte, und sie ist beginnend mit einem Glycinrest als Aminosäure Nummer 1 numeriert.
Das 276 Aminosäuren-PLP-Polypeptid enthält ungefähr 50% an hydrophoben Resten und wird so beschrieben, daß es in fünf hydrophile Domänen und vier extrem hydrophobe Domänen, die, beginnend am Aminoterminus des Proteins, mit eins bis vier numeriert sind, strukturiert ist. Proteindomänen können so definiert werden, daß sie verschiedene Ausmaße haben können, in Abhängigkeit von den Kriterien, die verwendet werden, um die Domänengrenzen zu definieren. Somit erstrecken sich gemäß den stringentesten Kriterien die hydrophoben Domänen des humanen PLP-Moleküls über die Aminosäurereste 10 bis 36 (hydrophobe Domäne 1), 59 bis 87 (hydrophobe Domäne 2), 151 bis 178 (hydrophobe Domäne 3) und 238 bis 267 (hydrophobe Domäne 4) der Aminosäuresequenz von humanem PLP (SEQ ID NO: 22). Es werden auch weniger stringente Kriterien verwendet, um diese Domänen zu definieren, so daß alternativ gesagt werden kann, daß sich die hydrophoben Domänen über die Aminosäurereste 10 bis 18 (hydrophobe Domäne 1), 70 bis 80 (hydrophobe Domäne 2), 162 bis 170 (hydrophobe Domäne 3) und 250 bis 258 (hydrophobe Domäne 4) der Aminosäuresequenz von humanem PLP (SEQ ID NO: 22) erstrecken.
Dementsprechend können die hydrophilen Domänen von PLP als Aminosäurereste 1 bis 9 (hydrophile Domäne 1), 37 bis 58 (hydrophile Domäne 2), 88 bis 150 (hydrophile Domäne 3), 179 bis 237 (hydrophile Domäne 4) und 267 bis 276 (hydrophile Domäne 5) der Aminosäuresequenz von humanem PLP (SEQ ID NO: 22) definiert werden.
PLP-reaktive T-Zellinien reagieren stark auf PLP-Peptide. Synthetische Peptide mit Sequenzen auf Basis der PLP-Sequenz wurden verwendet, um enzephalitogene Epitope in der Maus und im Menschen zu identifizieren. Siehe beispielsweise Fritz et al., 1983. J. Immunol. 130, S. 191-194; Endoh et al., 1986; Greer et al., 1992; Kuchroo et al., 1992; Kuchroo et al., 1994; McRae et al., 1992; Pelfrey et al., 1993; Pelfrey et al., 1994; Sobel et al., 1992; Tuohy et al., 1988; Tuohy et al., 1989; Tuohy et al., 1992; Whitham et al., 1991. J. Immunol. 147, S. 101-107; Whitham et al., 1991. J. Immunol. 147, S. 3803-3808, und Correale et al., 1995. Die durch humanes Peptid definierten Epitope sind in Tabelle 1 gezeigt.
Gemäß einer kürzlich vorgeschlagenen Struktur von PLP (Weimbs und Stoffel, 1992) sind diese enzephalitogenen Epitope sowohl in den intramembranösen als auch in den extramembranösen Domänen von PLP zu finden.
Es wurde gezeigt, daß PLP-Peptide enzephalitogen sind und in Kaninchen, Ratten, Meerschweinchen und einer Vielzahl von Mausstämmen Erkrankung induzieren können (siehe beispielsweise Trotter et al., 1987). Maus-PLP ist in der Sequenz identisch zu humanem PLP (SEQ ID NO: 22). Enzephalitogene Epitope in Mausmodellen beinhalten diejenigen, die in Tabelle 2 gezeigt sind. In wenigstens einigen Mausstämmen repräsentiert PLP das Hauptenzephalito gen innerhalb des ZNS (Kennedy et al., 1990). In verschiedenen Nagetiermodellen wurde bei PLP-induzierter EAE im Vergleich zu MBP-induzierter Erkrankung bedeutend mehr Demyelinisierung beobachtet (Tabira 1988). In klinischen Studien wurde über signifikante Unterschiede in der Anzahl von PLP-Peptid-reaktiven T-Zellen in MS-Patienten gegenüber normalen gesunden Kontrollindividuen berichtet (Sun et al., 1991; Trotter et al., 1991; Chou et al., 1992; Zhang et al., 1994).
Zusätzlich zu diesen Beobachtungen wird die Bedeutung von PLP in der Pathogenese von MS durch die Beobachtung angedeutet, daß PLP, anders als MBP, lediglich im ZNS und nicht im peripheren Nervensystem zu finden ist, wo bei MS eine relativ geringe Schädigung erfolgt (Lees und Mackin, 1988).
Behandlung von MS durch Verabreichung von Antigenen
Die ideale therapeutische Behandlung für jede Erkrankung ist eine solche, die die Pathogenese spezifisch blockiert, ohne die normale Physiologie zu beeinflussen. Im Falle von Autoimmunerkrankungen ist ein Ansatz einer solchen idealen Therapie eine Behandlung, die die Immuntoleranz gegenüber mit Autoimmunerkrankung assoziierten Selbstantigenen spezifisch induziert, ohne die Immunantworten auf Fremdantigene zu beeinflussen. Es wird nach neuen therapeutischen Mitteln und Behandlungsstrategien gesucht, die die Induzierung einer Toleranz gegenüber spezifischen Autoantigenen erlauben, während alle anderen Aspekte der Immunfunktion unverändert bleiben.
Es wurden Versuche unternommen, T-Zell-Antworten über die Verabreichung von Antigenen therapeutisch zu modifizieren, um spezifische autoreaktive Lymphozyten, insbesondere T-Zellen, zu unterdrücken und dadurch eine Toleranz gegenüber mit der Erkrankung assoziierten Autoantigenen auszulösen. Ein klarer Vorteil einer solchen antigenspezifischen Therapie besteht darin, daß sie die therapeutische Modulation der Aktivitäten nur derjenigen T-Zellen erzielen kann, die durch ihr Reagieren mit den Selbstantigenen für die Entwicklung der Pathologie verantwortlich sind. Diese Spezifität liefert therapeutische Vorteile, ohne die wichtigen Immunaktivitäten von T-Zellen, die mit anderen Antigenen reaktiv sind, zu verändern.
MS-Antigene wurden als Tolerisierungsauslöser für die Behandlung von MS/EAE untersucht, da Therapien, die autoreaktive T-Zellen unterdrücken, eine Demyelinisierung von Nervengewebe und resultierende Symptome in signifikantem Maße lindern können (siehe beispielsweise Adronni et al., 1993; Critchfield et al., 1994; Miller und Karpus, 1994; Racke et al., 1995). Eine Reihe von Behandlungsprotokollen und Antigenen wurden in diesen Untersuchungen verwendet, wobei vorherrschend eher tierische als menschliche Formen der Antigene verwendet wurden. Beispielsweise verwendeten Weiner et al., 1993, aus Rindermyelin gereinigtes MBP, und Miller et al., 1992, verwendeten Meerschweinchen-, Ratten- und Maus-MBPs. In Untersuchungen unter Verwendung von humanem MBP-Antigen wurde MBP aus Gehirn von menschlichen Leichen gereinigt (siehe beispielsweise Zhang et al., 1994).
Die orale Toleranz umfaßt regulatorische CD8⁺-Zellen, die durch die Sekretion von Zytokinen, einschließlich TGF-beta, Immunantworten sowohl in vitro als auch in vivo unterdrücken (Chen et al., 1994 Science 265:1237-1240). Die Runterregulierung der Aktivität von T-Zellen, die durch diesen Mechanismus vermittelt wird, ist nicht spezifisch für bestimmte T-Zell-Klone, und sie umfaßt keine antigenspezifische Immunsuppression, sondern wirkt auf jegliche T-Zellen, die nahe genug bei den suppressiven T-Zellen liegen, um durch deren abgesonderte Zytokine beeinflußt zu werden. Dieses Phänomen wurde als "Bystander Suppression" bezeichnet.
Jüngere Studien haben die tolerisierenden Wirkungen einer oralen Verabreichung von Rindermyelin an MS-Patienten untersucht (Weiner et al., 1993 Science 259:1321-1324; Yoon et al., 1993). Während weniger von den Patienten, die oral mit Myelin behandelt worden waren, Verschlimmerungen ihrer MS-Symptome zeigten als die mit Placebo behandelten Patienten, waren die Resultate der Untersuchung nicht beweiskräftig, da die Patienten nicht geeignet randomisiert wurden. Tatsächlich warnten die Autoren: "Es muß stark betont werden, daß diese Untersuchung nicht die Wirksamkeit von oralem Myelin bei der Behandlung von MS demonstriert". Daher wird, obwohl orale Tolerisierungsstudien die Nützlichkeit von Myelinproteinen als immunmodulatorische Mittel für die Behandlung von MS unterstützen, weiterhin nach neuen, effektiveren Antigenen und alternativen Verabreichungsmodi für solche Antigene für die immunmodulatorische Behandlung von MS gesucht.
Es ist klar, daß für die Behandlung einer Erkrankung im Menschen von Menschen abgeleitete Antigene Vorteile gegenüber von Tieren abgeleiteten Antigenen besitzen, da sie die tatsächlichen Autoantigene sind, auf die für einen Autoimmunangriff bei Erkrankung im Menschen gezielt wird, und eine Suppression der Erkrankung sollte am wirkungsvollsten sein, wenn homologes Protein verabreicht wird (Miller et al., 1992). Dies ist deshalb der Fall, weil das humane Protein dieselbe MHC-Bindungsspezifität besitzt und derselben Antigenverarbeitung unterworfen ist wie das endogene Protein, auf das die Autoimmunantwort gerichtet ist.
Tatsächlich ist bekannt, daß immundominante Epitope (d. h. die antigenen Regionen des Proteins, die am häufigsten durch autoreaktive CD4⁺-T-Zellen erkannt werden) von wichtigen MS-Autoantigenen sich in Abhängigkeit von der Spezies, von der das Antigen abgeleitet ist, unterscheiden, selbst wenn viele Myelinantigene auf der Aminosäuresequenzebene eine große Homologie zwischen den Spezies zeigen. Beispielsweise ist, wie mittels Analyse von T-Zellen, die von MS-Patienten erhalten wurden, bestimmt, ein immundominantes Epitop von humanem MBP innerhalb der Region enthalten, die sich über die Aminosäuren 84–102 erstreckt, und ein weiteres ist in der Region zu finden, die sich über die Aminosäuren 143–168 erstreckt. Im Gegensatz dazu ist ein großes immundominantes Epitop von Maus-MBP in der Region zu finden, die sich über die Aminosäuren 1–9 erstreckt (Zamvil et al., Nature 324:258, 1986), und ein großes immundominantes Epitop von Ratten-MBP ist in der Region zu finden, die sich über die Aminosäuren 68–88 erstreckt (Burns et al., J. Ex. Med. 169:27, 1989).
Die Verwendung von Antigenen, die aus menschlichem ZNS-Gewebe isoliert wurden, als therapeutische Mittel ist jedoch unerwünscht. Dies ist nicht nur auf Probleme im Zusammenhang mit der Reinigung von Antigenen aus ZNS-Gewebe im allgemeinen und die Schwierigkeit beim Erhalten von menschlichen Rohmaterialien, sondern, was noch wichtiger ist, auf das Problem der Eliminierung einer möglichen pathogenen Kontamination zurückzuführen. Ein Beispiel potentieller Kontaminanten bei der Reinigung von von ZNS abgeleiteten Proteinen sind Prionenpartikel, die die schwammähnlichen Hirnerkrankungen Creutzfeldt-Jakob'sche Erkrankung und Kuru übertragen. Die Prionenpartikel stellen ein besonders schwer handhabbares Problem dar, da sie gegen jedes bekannte Sterilisationsmittel, welches nicht auch die gereinigten Proteine zerstört, resistent sind.
Ein geeigneter Ansatz zum Erhalten von humanen Antigenen, der diese Probleme umgeht, ist die Herstellung von Proteinantigenen unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie, typischerweise durch Herstellen von DNA-Molekülen, die die Antigene codieren, und Verwenden der DNAs, um die Expression der Antigenen in nicht-menschlichen Wirtszellen voranzutreiben. Oettinger et al. (1993) haben ein rekombinantes DNA-Molekül hergestellt, welches nicht-modifizierte humane Sequenzen umfaßt, die die 18,5 kDa-Form von humanem MBP codieren, und diese DNA verwendet, um rekombinantes humanes 18,5 kDa-MBP in Escherichia coli zu exprimieren. Die Expression von PLP-Polypeptiden in E. coli hat sich jedoch bislang als schwer lösbares Problem erwiesen, da wenigstens einige PLP-Sequenzen toxische Wirkungen auf Bakterien zu haben scheinen.
Tatsächlich beschränkt die Hydrophobizität von PLP die wäßrige Löslichkeit sehr stark (Tuohy 1994), was es schwierig macht, natives PLP aus irgendeiner Quelle herzustellen und intravenös zu verabreichen.
Deletion von T-Zellen
Veränderungen im T-Zell-Repertoire treten naturgemäß während der T-Zell-Entwicklung auf. Nur ein kleiner Bruchteil von Thymozyten (unreifen T-Zellen) überlebt die Entwicklungs- und Selektionsereignisse im Thymus, die zu einer Emigration von sich entwickelnden T-Zellen zum peripheren Kreislauf führt, wo sie ihre Reifung abschließen (von Boehmer, 1988; Marrack und Kappler, 1987). Experimentelle Beweise deuten stark darauf hin, daß eine große Anzahl an Thymozyten, die Rezeptoren für Autoantigene tragen, anfangs im Thymus vorliegen. Während der T-Zell-Entwicklung im Thymus werden diese Zellen, die mit Selbstantigenen reaktiv sind, als Teil des normalen Entwicklungsweges deletiert (abgetötet). Dieser Tolerisierungsprozeß innerhalb des Thymus wird als "thymische Toleranz" bezeichnet.
Sich entwickelnde T-Zellen treffen im Thymus bestimmte Autoantigene nicht an, können jedoch als reife periphere T-Zellen auf sie treffen. Beispielsweise kann es sein, daß neurale Antigene niemals im Thymus präsentiert werden. Eine Toleranz gegenüber solchen Autoantigenen wird normalerweise außerhalb des Thymus erzeugt und wird als "periphere Toleranz" bezeichnet.
Periphere Toleranz kann durch wenigstens zwei Mechanismen auftreten, von denen einer ein im Vergleich zu thymischer Tolerisierung ähnlicher, sich jedoch davon unterscheidender Prozeß ist, welcher zur Deletion dieser reifen peripheren T-Zellen führt, die spezifisch mit einem zuvor nicht angetroffenen Autoantigen reaktiv sind. Zusätzlich können T-Zellen mit bestimmten spezifischen Reaktivitäten so induziert werden, daß sie inaktiv (anerg) werden. Die periphere Deletion und die Induzierung von Anergie sind physiologische Mechanismen, die zur Entwicklung von "peripherer Toleranz" führen. Als Ergebnis von thymischer und peripherer Tolerisierung sind reife T-Zellen normalerweise gegenüber den meisten Autoantigenen tolerant, autoreaktive T-Zellen können jedoch bestehen bleiben, da ihr Antigen nicht mit der erforderlichen Co-Stimulation präsentiert wird oder an einer immunologisch privilegierten Stelle zu finden ist.
Es wurde kürzlich gezeigt, daß der Mechanismus, durch den eine Tolerisierung über T-Zell-Deletion erzeugt wird, von wiederholter Aussetzung an ein Antigen unter bestimmten definierten Bedingungen abhängig ist. Eine spezifische T-Zell-Deletion kann daher durch die geeignete Verabreichung von exogenen Verbindungen, die die relevanten Epitope umfassen, induziert werden. Da nur eine begrenzte Anzahl an Autoantigenen (die insbesondere eine viel größere Anzahl an Epitopen umfassen) an der Pathogenese irgendeiner einzelnen Autoimmunerkrankung beteiligt ist, ist es möglich, wenn sie bekannt sind, die Selbstepitope, auf die bei einer Erkrankung gezielt wird, in Form einer oder mehrerer isolierter Autoantigen-abgeleiteter Verbindungen, die die Epitope, welche an der Pathogenese beteiligt sind, enthalten, an Erkrankte zu verabreichen. Um eine optimale klinische Wirkung zu erzielen, kann es aufgrund des hohen Maßes an humanem MHC- und TCR-Polymorphismus und weil die neuen Epitopreaktivitäten während der Progression der Autoimmunerkrankung auftreten können, notwendig sein, ein umfangreiches Gemisch aus MBP- und PLP-Epitopen, möglicherweise zusammen mit MOG-Epitopen, zu haben (McCarron et al., 1990; Lehmann et al., 1992; Kaufman et al., 1993).
Apoptose
Die Deletion von autoreaktiven T-Zellen ist ein Beispiel von programmiertem Zelltod, welcher einen wichtigen Prozeß bei der Regulierung vieler biologischer Systeme darstellt (Singer et al., 1994). Programmierter Zelltod erfolgt durch einen Mechanismus, der als Apoptose bezeichnet wird, wobei Zellen auf bestimmte Stimuli reagieren, indem sie eine bestimmte Abfolge von vorbestimmten Ereignissen durchlaufen, die in effektiver Weise zellulären Selbstmord darstellen. Apoptose spielt eindeutig eine große Rolle bei der Formung und Aufrechterhaltung des T-Zell-Repertoires und trägt zur Etablierung einer Selbsttoleranz bei, indem Zellen, die autoreaktive TCRs exprimieren, aktiv eliminiert werden.
Es wurde kürzlich herausgefunden, daß T-Zellen gegenüber apoptotischem Zelltod, der durch eine Vielzahl von Stimuli an mehreren Punkten in ihrer Lebensdauer induziert wird, empfindlich sind (siehe beispielsweise Lenardo 1991; Boehme und Lenardo 1993; Critchfield et al., 1994). Es wird auch angenommen, daß positive Selektionsfaktoren beim Regulieren des Überle bens spezifischer T-Zell-Klone eine Rolle spielen. Die Reduktion oder Expansion der Anzahl an einzelnen T-Zellen eines bestimmten Klons in einem Organismus durch diese und weitere Mechanismen dient dazu, die Reaktionsfähigkeit des Immunsystems des Organismus auf ein bestimmtes Antigen zu modulieren. Es ist nun in mehreren Autoimmunerkrankungsmodellen sowie bei bestimmten Virusinfektionen fest etabliert, daß Apoptose (bei Aussetzung an Antigen unter bestimmten definierten Bedingungen) in reifen peripheren antigenspezifischen T-Lymphozyten sowie in unreifen Thymozyten induziert werden kann.
Apoptose tritt in vielen biologischen Systemen auf (siehe beispielsweise Kerr et al., 1991; Lockshin und Zakeri, 1991; Cohen et al., 1992; Duvall und Wyllie, 1986; Cotter et al., 1990). Eine Zelle, die Apoptose durchläuft, durchläuft ein spezifisches Programm von Ereignissen – zelluläre und biochemische Prozesse, die vom aktiven Metabolismus abhängen und zur Selbstzerstörung der Zelle beitragen. In apoptotischen T-Zellen schrumpft der Zellkern, das Chromatin kondensiert, das genetische Material (DNA) degeneriert stufenweise zu kleinen Fragmenten (in der Größe von nukleosomalen Wiederholungen), es findet eine zytoplasmatische Verdichtung statt, die Zellmembran bildet Bläschen, und schließlich kollabiert die Zelle (Kawabe und Ochi, 1991; Smith et al., 1989). Zellen können sich nicht von Apoptose erholen; sie führt zum irreversiblen Zelltod (Kawabe und Ochi, 1991; Smith et al., 1989).
Neuere Berichte haben auf eine Rolle des TNF-verwandten Zytokins, bekannt als der FAS-Ligand, und seines Rezeptors, CD95 (der FAS-Rezeptor), bei der Induzierung von Apoptose in T-Zellen hingedeutet (Crispe et al., 1994; Nagata und Suda, 1995; Strasser, 1995; Dhein et al., 1995; Brunner et al., 1995, und Ju et al., 1995).
T-Zellen, die keine Apoptose durchlaufen, die jedoch aktiviert wurden, führen ihre "Effektor"-Funktionen aus, indem sie Zytolyse verursachen oder indem sie Lymphokine absondern, die B-Zell-Antworten oder andere Immuneffekte bewirken (Paul, 1989). Diese Effektorfunktionen sind die Ursache von Gewebeschaden in Autoimmun- und anderen Erkrankungen.
Therapeutische Induzierung von Apoptose
Ein wirkungsvoller Ansatz zur Vermeidung oder Behandlung von Autoimmunerkrankungen besteht darin, Lymphozyten, die an der Autoimmunantwort beteiligt sind, durch Apoptose dauerhaft zu eliminieren. Beispielsweise kann eine therapeutische Wirkung erzielt werden, indem nur diejenigen T-Zellen eliminiert werden, die mit Autoantigenen, auf die in der bestimmten behandelten Autoimmunerkrankung gezielt wird, reaktiv sind, während der Großteil des T-Zell-Repertoires intakt belassen wird. Untersuchungen in vivo haben gezeigt, daß EAE durch Verabreichung von Myelinantigenen in einer Dosis und einem Intervall, die wirksam sind, um Apoptose von T-Zellen, die mit den Antigenen reaktiv sind, zu induzieren, behandelt werden kann (siehe beispielsweise Critchfield et al., 1994).
Dieser Ansatz wird in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 07/751,090, eingereicht im Namen von Michael J. Lenardo und mit dem Titel "Interleukin-2 Stimulated T Lymphocyte Cell Death for the Treatment of Autoimmune Diseases, Allergic Disorders, and Graft Rejection", und in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 07/926,290, eingereicht im Namen von Michael J. Lenardo und mit dem Titel "Interleukin-4 Stimulated T Lymphocyte Cell Death for the Treatment of Autoimmune Diseases, Allergic Disorders, and Graft Rejection", beschrieben.
Die begleitenden Figuren, die in der Beschreibung aufgenommen sind und einen Teil hiervon darstellen, veranschaulichen bestimmte Aspekte der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die Prinzipien der Erfindung zu erläutern. Es versteht sich natürlich, daß sowohl die Figuren als auch die Beschreibung lediglich beispielhaft sind und die Erfindung nicht beschränken.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Klinischer Verlauf von aktiver (Antigen-induzierter) EAE in vier einzelnen SJL/J-Mäusen, behandelt mit Ovalbumin (1A – OVA), PLP-Peptid 139–151 (1B – ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die den Aminosäureresten 139–151 von SEQ ID NO: 22 entspricht), ΔPLP4 (1C – PLP4) oder MP4 (1D) – die in CFA-Adjuvans verabreicht werden. Die Erkrankung wurde eingestuft mit 0, keine Abnormalität; 1, schlaffer Schwanz; 2, schlaffer Schwanz mit Unfähigkeit des Aufrichtens nach Umdrehen; 3, Schwäche der Hinterextremität oder Nachziehen einer Hinterextremität; 4, Paralyse beider Hinterextremitäten; 5, Sterben und 6, Tod. Klinische Auswertung – leere Kreise; Gewicht in Gramm – ausgefüllte Kreise.
2. Prävention/Behandlung von adoptiver EAE durch intravenöse Verabreichung von ΔPLP4. PLP-spezifische Lymphknotenzellen von mit ΔPLP4/CFA immunisierten Mäusen wurden in vitro mit PLP-Peptid 139–151 (wie oben für 1 beschrieben) stimuliert. T-Zellen von diesen Tieren wurden durch intravenöse Injektion in einer Menge von 10⁷ Zellen/Maus am Tag 0 in native Empfänger übertragen. Die fünf Mäuse in der behandelten Gruppe (PLP4 Tag 2, 4, 6) erhielten zwei intravenöse Injektionen (im Abstand von 6-8 h) von 125 μg ΔPLP4 an den Tagen 2, 4 und 6 nach der Übertragung. Die fünf unbehandelten Mäuse (Kontrolltiere) erhielten ein gleiches Volumen (100 μl) an sterilem Wasser. Die Mäuse wurden täglich überwacht, und eine mittlere klinische Auswertung für jede Gruppe wurde bestimmt (ausgewertet wie in 1).
3. Proliferative Antworten von T-Zell-angereicherten Lymphknotenzellen von nativen Mäusen (SJL/J), wie auf der x-Achse angezeigt, und Mäusen, die mit PLP-Peptid 139–151 (PEPTID), wie oben für 1 beschrieben, oder ΔPLP4 (PLP4) immunisiert worden waren, in Reaktion auf in vitro-Stimulation mit synthetischen PLP-Peptiden (139–151 oder 178–191 – ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die den Aminosäureresten 178–191 von SEQ ID NO: 22 entspricht) oder intaktem ΔPLP4 (PLP4) in den angegebenen Konzentrationen. Die T-Zellen wurden für 72 h in Medium alleine oder mit Antigenen inkubiert. Die Proliferation wurde mittels ³H-Thymidin-Aufnahme nach einem 18 h-Impuls gemessen. Alle Tests wurden mit Dreifachkulturen wiederholt.
4. Prävention/Behandlung von ΔPLP4-induzierter aktiver EAE durch intravenöse Verabreichung von ΔPLP4. EAE wurde in SJL/J-Mäusen durch subkutane Injektion von 100 μg ΔPLP4 in CFA, gefolgt von 300 ng Pertussistoxin an den Tagen 0 und 3 induziert. Die fünf experimentellen Mäuse erhielten zwei intravenöse Injektionen (im Abstand von 6–8 h) von 125 μg ΔPLP4 an den Tagen 5, 7 und 9 nach der Immunisierung (PLP4 Tag 5, 7, 9, ausgefüllte Kreise). Die fünf unbehandelten Mäuse (Kontrolltiere, leere Kreise) erhielten ein gleiches Volumen (100 μl) an sterilem Wasser nach dem gleichen Ablaufplan. Die Mäuse wurden täglich überwacht, und eine mittlere klinische Auswertung (bestimmt wie in 1) wurde für jede Gruppe zugewiesen.
5. PLP-Behandlung eliminiert T-Zell-Proliferation in Reaktion auf PLP- und MBP-Antigene. T-Zell-Proliferationstests wurden mit Lymphknotenzellen durchgeführt, die von Mäusen erhalten wurden, die immunisiert worden waren, um EAE zu induzieren, und mit ΔPLP4 behandelt worden waren. Die Induzierung und Behandlung waren wie für 4 beschrieben. Die in den in vitro-T-Zell-Proliferationstests in einer Menge von 50 μg/ml verwendeten Antigene Waren ΔPLP4 (PLP4) oder MP4, wie angezeigt.
6. Proliferation von humanen MBP-spezifischen T-Zellinien in Reaktion auf Stimulation mit rekombinantem MP4. MP4 wurde in einer Konzentration von 10 μg/ml verwendet. Die humanen T-Zellinien 2A2 (reaktiv mit MBP-Peptid 31–50), 3H5 (reaktiv mit MBP-Peptid 87-106) und 5B2 (reaktiv mit MBP-Peptid 151–170) wurden anfänglich von einem gesunden Individuum erhalten. Diese Zellinien sind spezifisch für MBP-Epitope, angezeigt durch die korrespondierenden Aminosäurepositionen von MBP (18,5 kDa) (SEQ ID NO: 4) von adultem menschlichem Gehirn, die in Klammern angegeben sind.
7. MP4 stimuliert Maus-T-Zellen nach Erkrankungsinduzierung mit PLP, und PLP-Behandlung eliminiert T-Zell-Proliferation in Reaktion auf MP4-Antigene. T-Zell-Proliferationstests wurden mit Lymphknotenzellen durchgeführt, die von Mäusen erhalten wurden, die mit ΔPLP4 immunisiert worden waren, um EAE zu induzieren, und mit ΔPLP4 behandelt worden waren. MP4 wurde in einer Menge von 50 μg/ml in den in vitro-T-Zell-Proliferationstests verwendet.
8. Proliferative Antworten von T-Zell-angereicherten Lymphknotenzellen von SJL/J-Mäusen, die mit PLP-Peptid 139–151 (wie oben für 1 beschrieben) immunisiert worden waren, in Reaktion auf in vitro-Stimulation mit synthetischen PIP-Peptiden (139–151, 43–64 – ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die den Aminosäureresten 43–64 von SEQ ID NO: 22 entspricht, oder 215–232 – ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die den Aminosäureresten 215–232 von SEQ ID NO: 22 entspricht) oder intaktem ΔPLP4 (PLP4) in einer Menge von 10 μg/ml. Die T-Zellen wurden für 72 h in Medium alleine oder mit Antigenen inkubiert. Die Proliferation wurde durch ³H-Thymidin-Aufnahme nach einem 18 h-Impuls gemessen. Alle Tests wurden mit Dreifachkulturen wiederholt.
9. Proliferative Antworten von T-Zell-angereicherten Lymphknotenzellen von SWR-Mäusen, die mit PLP-Peptid 103–116 immunisiert worden waren, in Reaktion auf in vitro- Stimulation mit synthetischen PLP-Peptiden (178–191 – oben diskutiert, 139–151 – oben diskutiert, oder 103–116 – ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die den Aminosäureresten 103–116 von SEQ ID NO: 22 entspricht) oder intaktem ΔPLP4 (PLP4) in einer Menge von 10 μg/ml. Die T-Zellen wurden für 72 h in Medium alleine oder mit Antigenen inkubiert. Die Proliferation wurde durch ³H-Thymidin-Aufnahme nach einem 18 h-Impuls gemessen. Alle Tests wurden mit Dreifachkulturen wiederholt.
10. Proliferative Antworten von T-Zell-angereicherten Lymphknotenzellen von PL/J-Mäusen, die mit PLP-Peptid 43–64 immunisiert worden waren, in Reaktion auf in vitro-Stimulation mit synthetischen PLP-Peptiden (139–151, 43–64 oder 178–191), wie oben diskutiert, oder intaktem ΔPLP4 (PLP4) in einer Menge von 10 μg/ml. Die T-Zellen wurden für 72 h in Medium alleine oder mit Antigenen inkubiert. Die Proliferation wurde durch ³H-Thymidin-Aufnahme nach einem 18 h-Impuls gemessen. Alle Tests wurden mit Dreifachkulturen wiederholt.
11. Behandlung von EAE, induziert durch die Übertragung von 30.000.000 T-Zellen, die mit Meerschweinchen-MBP aktiviert worden waren. Die Behandlungen waren: 200 μg MP4, 200 μg Meerschweinchen-MBP (GP-MBP), 400 μg Meerschweinchen-MBP oder 400 μg Ovalbumin (OVA, Kontrolle), wie angegeben. Diese Behandlungen wurden zweimal täglich (in 6-stündigen Intervallen) i.v. an den Tagen 6, 8 und 10 nach der passiven Immunisierung mit enzephalitogenen T-Zellen verabreicht. Jede Behandlungsgruppe bestand aus 3 bis 5 Tieren.
12. Behandlung von EAE, induziert durch Immunisierung von SJL-Mäusen mit 100 μg PLP-Peptid 139–151, wie oben für 1 diskutiert. Die Behandlungen erfolgten mit 250 μg MP4 oder 250 μg Tauben-Cytochrom c (Kontrolle), wie angegeben. Diese Behandlungen wurden zweimal täglich (in 6-stündigen Intervallen) i.v. an den Tagen 5, 7 und 9 nach der Immunisierung verabreicht. Jede Behandlungsgruppe bestand aus 3 Tieren.
13. PCR-Strategie zur Konstruktion eines synthetischen MBP21,5-Gens (cDNA). Angegeben in der eckigen Klammer A ist das Alignment der überlappenden Oligonukleotide 1 bis 6 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10), die verwendet wurden, um das MBP + X2^cys81/Bakt.-Gen zu konstruieren. Drei Teildomänen des Gens (I, II und II, wie durch das Diagramm gezeigt, welches durch die eckige Klammer B angezeigt wird) wurden anfangs synthetisiert. Größere Domänen (I + II, II + III) wurden durch überlappende PCR unter Verwendung der geeigneten äußeren Oligonukleotide (Oligonukleotide 1 und 4 bzw. Oligonukleotide 3 und 6) gebildet, wie durch das durch die eckige Klammer C angezeigte Diagramm gezeigt. Das Molekül mit voller Länge wurde durch überlappende PCR der Domänen I + II und II + III unter Verwendung der äußeren Oligonukleotide 1 und 6 vollendet. Eine Kartierung des Endprodukts ist durch das durch die eckige Klammer D angezeigte Diagramm gezeigt. In diesem Diagramm stellt der schraffierte Bereich in dieser Kartierung des Moleküls mit voller Länge den Ort von Exon 2 dar, wobei das Cystein an Aminosäurerest 81 (Cys⁸¹) als zu Serin (Ser⁸¹) verändert gezeigt ist. Die dunkle Box am 3'-Ende des Gens (rechte Seite des Diagramms) veranschaulicht die Hinzufügung von Sequenzen, die die Histidinmarkierung codieren, welche hinzugefügt wurde, um die Reinigung zu vereinfachen.
14. Rekombinante MBP-Expression und subzelluläre Lokalisierung in Bakterienzellen – nicht-fraktionierte Gesamtzelllysate. Zelllysate wurden aus induzierten Kulturen von BL21(DE3)-Zellen, die mit Kontroll-pET22b-Vektor ohne hinzugefügtes Insert ("1"), pET22b/MBP18,5^hum ("2") oder pET22b/MBP + X2^Cys81/Bakt. ("3") transformiert waren, hergestellt. Gesamtzelllysate wurden mittels 16%-iger SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (es sei angemerkt, daß unter diesen Bedingungen keine Dimere zu sehen sind) abgetrennt, dann Coomassie-gefärbt (Coom) oder mit monoklonalen Antikörpern, die entweder ein carboxyterminales Epitop ("C-term Ab") oder ein aminoterminales Epitop ("N-term Ab") von MBP aus menschlichem Gehirn erkennen, immungeblottet. Sternchen markieren die Position der beiden Fragmente von MBP + X2^Cys81, die nur durch den "N-term Ab"-mAb erkannt werden. Die Molekulargewichte in Kilodalton (bestimmt mittels Elektroforese von Markerproteinen) erscheinen auf der linken Seite. Die leeren und ausgefüllten Pfeile markieren die Positionen von MBP + X2^Cys81 bzw. MBP18,5.
15. Rekombinante MBP-Expression und subzelluläre Lokalisierung in Bakterienzellen – lösliche vs. unlösliche Fraktionen. Zelllysate wurden aus induzierten Kulturen von BL21(DE3)-Zellen, die mit Kontroll-pET22b-Vektor ohne Insert ("1"), pET22b/MBP18,5^hum. ("2") oder pET22b/MBP + X2^Cys81/Bakt. ("3") transformiert waren, hergestellt. Bakterielle Lysate wurden unter Verwendung von entweder neutralem Puffer ("Tris") oder 0,1 N HCl-("Säure"-)Bedingungen wie oben beschrieben zu löslichen ("S") oder unlöslichen Pellet-("P"-)Fraktionen fraktioniert. Gezeigt sind die Coomassie-gefärbten Gele, die durch SDS-PAGE der Zellfraktionen unter reduzierenden Bedingungen (es sei angemerkt, daß unter diesen Bedingungen keine Dimere zu sehen sind) erhalten wurden. Die leeren und ausgefüllten Pfeile markieren die Positionen von MBP + X2^Cys81 bzw. MBP18,5. Es sei angemerkt, daß die Säureextraktion (nicht jedoch die neutrale Extraktion) eine Gewinnung der MBP + X2^Cys81- und der MBP18,5-Polypeptide in den löslichen Fraktionen erlaubte.
16. Säureextraktion von rekombinantem MBP aus Bakterienzellen in großem Maßstab. Gezeigt ist ein Coomassie-gefärbtes SDS/PAGE-Gel, durchgeführt unter reduzierenden Bedingungen (es sei angemerkt, daß unter diesen Bedingungen keine Dimere zu sehen sind). Jede Gruppe von drei Spuren zeigt Gesamtzelllysat ("Lysat") und unlösliche ("unlös.") und lösliche ("lös.") Fraktionen, erhalten durch gleichzeitige Säureextraktion und mechanisches Aufbrechen. Die Zellen wurden aus induzierten Kulturen von BL21(DE3)-Zellen, die entweder mit pET22b-Vektor ohne hinzugefügtes Insert ("1"), pET22b/MBP18,5^hum. ("2") oder pET22b/MBP + X2^Cys81/Bakt. ("3") transformiert waren, geerntet. Die Positionen von MBP + X2^Cys81 (leere Pfeile) und MBP18,5^hum. (ausgefüllte Pfeile) sind angezeigt. Es sei angemerkt, daß diese Säureextraktion in großem Maßstab die Gewinnung nahezu aller MBP + X2^Cys81- und MBP18,5-Polypeptide in den löslichen Fraktionen erlaubte.
17. Chromatogramm, das die Isolierung von säureextrahiertem MBP + X2^Cys81 mittels Umkehrphasen-Chromatographie zeigt. Die lösliche Fraktion, die aus dem in 16 gezeigten Experiment gewonnen wurde ("lös." Spur "3"), wurde über eine VYDAC-C4-Umkehrphasensäule chromatographiert und über einen 25–50% (CH₃CN)/0,1% TFA-Gradienten eluiert. MBP + X2^Cys81 ist in den gepoolten Fraktionen zu finden, die dem großen Peak entsprechen, der zwischen 17 und 20 Minuten eluiert. Ein ähnliches Chromatogramm wurde für MBP18,5 erhalten.
18. Reinigung von MBP + X2^Cys81 (oberes Feld) und MBP18,5 (unteres Feld) mittels Metallchelatchromatographie von sauren Extrakten von Bakterienzellen. Gezeigt sind Coomassie-gefärbte Gele von Proteinfraktionen, die während der Affinitätsreinigung gesammelt und SDS-PAGE unterworfen wurden. Die Positionen von MBP + X2^Cys81 (leerer Pfeil) und MBP18,5 (ausgefüllter Pfeil) sind angezeigt. Die Spuren sind beschriftet mit "beladen" (das auf die Säule geladene Lysat), "ungebunden" (der Säulendurchfluß), "Waschschritt 1", "Waschschritt 2" und "Waschschritt 3" (das Säuleneluat für jeden Waschschritt), "Elution 1", "Elution 2" und "Elution 3" (das Säuleneluat aus jeder Elutionsstufe) und Harz (eine Probe von Säulenharz, entnommen nach der letzten Elution, gekocht in Probenpuffer und auf das Gel geladen).
19. Ausbeute an bakteriell exprimierten Polypeptiden in Bakterien, transfiziert mit Nukleinsäurevektoren, die die Nukleinsäuresequenzen MBP18,5^hum. (SEQ ID NO: 4), MBP + X2^Cys81/hum. (SEQ ID NO: 1), MBP + X2^Ser81/Bakt ^. (SEQ ID NO: 3) und MBP + X2^Cys81/Bakt. (SEQ ID NO: 2) umfassen, wie angezeigt.
20. MBP-Antigene lösen proliferative Antworten von humanen T-Zell-Klonen aus, die für von adultem Gehirn abgeleitetes MBP spezifisch sind. T-Zellinien, die für MBP18,5 von adultem Gehirn spezifisch sind, wurden mit Medium alleine ("Kontrolle") oder Medium, enthaltend 10 mg von entweder gereinigtem MBP aus adultem menschlichem Gehirn ("Gehirn-MBP"), bakteriell erzeugtem MBP18,5 ("MBP18,5") oder bakteriell erzeugtem MBP + X2^Cys81 ("MBP + X2^Cys81"), stimuliert. Berichtet wird über das insgesamt aufgenommene ³H-CPM aus einem repräsentativen Proliferationstest, der wie in den Beispielen beschrieben dreifach durchgeführt wurde. "2A2" und "3H5" sind humane T-Zellinien, die von normalen Individuen erhalten wurden, wie in den Beispielen beschrieben.
21. Proliferative Antworten von Exon 2-spezifischen humanen T-Zellinien auf MBP-Antigene. Die humanen T-Zellinien 1H7 und 1G1 wurden mit Medium alleine ("Kontrolle") oder Medium, enthaltend 10 μg von entweder gereinigtem MBP aus adultem menschlichem Gehirn ("Gehirn-MBP"), bakteriell erzeugtem MBP18,5 ("MBP18,5"), bakteriell erzeugtem MBP + X2^Cys81 ("MBP + X2^Cys81") oder Exon 2-codiertem Peptid entsprechend den Aminosäuren 59 bis 84 von SEQ ID NO: 1 ("X2-Peptid"), stimuliert. Dargestellt sind das ³H-CPM, das während der Proliferationstests, die wie in den Beispielen beschrieben dreifach durchgeführt wurden, insgesamt aufgenommen wurde. 1H7 und 1G1 sind humane T-Zellinien, die für die Exon 2-codierte Region von MBP spezifisch sind und von demselben MS-Patienten erhalten wurden wie die 3A11-Linie, die in dem Experiment verwendet wurde, das unten zu 22 ausgeführt wird. Dar gestellt sind das ³H-cpm, das während der Proliferationstests, die wie in den Beispielen beschrieben dreifach durchgeführt wurden, insgesamt aufgenommen wurde.
22. Proliferative Antworten von Exon 2-spezifischen humanen T-Zellinien auf MBP + X2^Cys81 und MBP + X2^Ser81. Die humane T-Zellinie 3A11 wurde mit variierenden Dosen von Exon 2-Peptid ("A"), MBP + X2^Cys81 ("B"), MBP + X2^Ser81 ("C") oder Medium alleine ("D") stimuliert.
3A11 ist eine humane T-Zellinie, die für die Exon 2-codierte Region von MBP spezifisch ist, und wurde von demselben MS-Patienten erhalten wie die 1H7- und 1G1-Linien, die in dem zu 21 beschriebenen Experiment verwendet wurden. Dargestellt sind das ³H-cpm, das während der Proliferationstests, die wie in den Beispielen beschrieben dreifach durchgeführt wurden, insgesamt aufgenommen wurde.
23. Sequenzvergleich von rekombinantem humanem MBP + X2^Cys81/Bakt. (fötale Form, "f", SEQ ID NO: 1) mit derjenigen von von adultem menschlichem Gehirn abgeleitetem MBP (adulte Form, "a", SEQ ID NO: 4). Die von adultem menschlichem Gehirn abgeleitete MBP-Sequenz (Genbank-Hinterlegungsnummer #M13577) wird nur in Positionen beobachtet, die von der von E. coli bevorzugten Codonsequenz von MBP + X2^Cys81/Bakt. abweichen. Die Initiator- (ATG) und Stopcodons (TAA) sind für beide Gene angezeigt. Striche in der von adultem Gehirn abgeleiteten humanen MBP-Sequenz reflektieren die Positionen von Exon 2 (bp 177–255) und Histidinmarkierung(bp 595–612)-Additionen zu dieser Version von MBP + X2^Cys81/Bakt. (d. h. MBP + X2^Cys81/Bakt. mit 6 carboxyterminalen Histidinresten, auch bezeichnet als eine Histidinmarkierung). Überlappungsbereiche zwischen synthetischen Oligonukleotiden, die für die Konstruktion des MBP + X2^Cys817Bakt.-Gens verwendet werden, sind unterstrichen. C-zu-T-bp-Mutationen gegenüber der beabsichtigten MBP + X2^Cys81/Bakt.-Gensequenz sind mit Sternchen oberhalb der Positionen 462, 528 und 532 markiert. Diese Veränderungen konservieren die MBP + X2^Cys81-Aminosäuresequenz. Sense-Oligonukleotid 1 (SEQ ID NO: 5) beinhaltet die Sequenz GGAATTCCGT AAGGAGGTAT AG (in dieser Figur nicht gezeigt), die sich 5' zu der NdeI-Klonierungsstelle befindet, und erstreckt sich durch die Base 108. Oligonukleotid 6 (bp 516–622, SEQ ID NO: 10) ist ein Antisense-Oligonukleotid zu der gezeigten Sequenz und beinhaltet das Tetranukleotid CCCC (in dieser Figur nicht gezeigt), das sich 3' zu der HindIII-Stelle befindet. Vier weitere verwendete Oligonukleotide beinhalten die Sense-Oligonukleotide 3 (SEQ ID NO: 7) und 5 (SEQ ID NO: 9) und die Antisense-Oligonukleotide 2 (SEQ ID NO: 6) und 4 (SEQ ID NO: 8). Das Cystein an Aminosäure 81 ist in Fettdruck markiert.
24. Graphische Darstellung des Ortes von MBP-Epitopen von rekombinantem humanem MBP 21,5 ("rhMBP21,5"). Die Zahlen zeigen die Aminosäurereste von SEQ ID NO: 1 an, die der bekannten Epitopspezifität der getesteten T-Zellinien entsprechen (angezeigt durch Zahl-Buchstabe-Zahl-Bezeichnungen oder "Gimer"). Jede der gezeigten T-Zellinien ergab eine positive T-Zell-Antwort auf die gereinigten rhMBP21,5-Moleküle der Erfindung.
25. Einzelheiten der spezifischen getesteten Moleküle und Ergebnisse, die mit jeder in 24 gezeigten T-Zellinie erhalten wurden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen und Verfahren für die Diagnose, die klinische Bewertung und die therapeutische Behandlung von MS in menschlichen Patienten und für die Feststellung des potentiellen Ansprechens von MS-Patienten auf eine solche therapeutische Behandlung bereitzustellen.
Die Erfindung liefert Zusammensetzungen, die neue rekombinante humane PLP-Polypeptide umfassen. Wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, sind "PLP-Polypeptide" Polypeptide, die wenigstens eine Sequenz enthalten, die wenigstens einer hydrophilen Domäne von humanem PLP, wie oben diskutiert, entspricht. Gemäß der Erfindung umfassen solche PLP-Polypeptide weiterhin eine MBP-Polypeptidsequenz. In manchen Fällen umfassen die Polypeptide auch eine MOG-Sequenz. Ebenfalls bereitgestellt werden DNA-Konstrukte, die PLP-Polypeptide codieren und die so konstruiert wurden, daß sie die Herstellung und Isolierung solcher Moleküle aus Bakterienzellen optimieren.
Spezieller umfassen die Moleküle der Erfindung immunreaktive Polypeptide, die PLP-Muteine umfassen, welche eine Sequenz von Aminosäuren umfassen, die der Sequenz eines nativen PlP-Polypeptids abzüglich wenigstens einer hydrophoben Peptidregion und bevorzugt abzüglich wenigstens zweier hydrophober Regionen entspricht. Bevorzugter umfaßt die Sequenz von Aminosäuren die Sequenz eines nativen PLP-Polypeptids abzüglich wenigstens dreier hydrophober Peptidregionen. Am meisten bevorzugt sind immunreaktive Polypeptide, die PLP-Muteine umfassen, die eine Sequenz von Aminosäuren umfassen, welche die Sequenz eines nativen PLP-Polypeptids abzüglich wenigstens einiger der Aminosäurereste, die jede der vier hydrophoben Domänen von PLP bilden, umfaßt.
Die Polypeptid- und Nukleinsäuremoleküle der Erfindung umfassen weiterhin MBP-Sequenzen, d. h. Sequenzen, die irgendeiner Spanne von wenigstens 10 zusammenhängenden Aminosäureresten von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 entsprechen. Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, ist ein "MBP-Polypeptid" ein Polypeptid, welches eine solche MBP-Sequenz umfaßt, und "eine Aminosäuresequenz, die durch wenigstens einen Teil von Exon 2 des humanen MBP-Gens codiert wird", ist eine Sequenz von wenigstens 10 zusammenhängenden Aminosäuren, die wenigstens 10 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Region, die sich über die Aminosäuren 60–85 von SEQ ID NO: 1 erstreckt, entspricht.
Die Erfindung liefert Zusammensetzungen, die neue rekombinante humane MBP 21,5-Polypeptide (d. h. MBP-Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz umfassen, welche durch wenigstens einen Teil von Exon 2 des humanen MBP-Gens codiert wird) umfassen. Vorzugsweise beinhalten diese MBP-Polypeptide Aminosäuresequenzen, die durch alle sieben Exons des humanen MBP-Gens codiert werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die durch Exon 2 codierte Sequenz modifiziert, um eine Herstellung und Reinigung des Polypeptids in großem Maßstab zu vereinfachen. Ebenfalls bereitgestellt werden DNA-Konstrukte, die MBP 21,5- Polypeptide codieren und die so ausgestaltet wurden, daß sie die Herstellung und die Isolierung solcher Moleküle aus Bakterienzellen optimieren.
Die Verfahren der Erfindung umfassen die Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung bei der Diagnose und der klinischen Bewertung von MS sowie bei der therapeutischen Behandlung von MS und bei der Feststellung des potentiellen Ansprechens von MS-Patienten auf eine solche therapeutische Behandlung.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Wie oben diskutiert, betrifft die vorliegende Erfindung MBP- und PLP-Polypeptide (Proteine) zur Verwendung in der Behandlung, der Diagnose und der klinischen Bewertung von MS sowie Nukleinsäuremoleküle, die bei der Herstellung von MBP- und PLP-Polypeptiden von Nutzen sind.
I. MBP-Polypeptide
Wie in dieser Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, bezieht sich "MBP 21,5-Polypeptide" auf eines oder mehrere der folgenden Polypeptide: das Polypeptid von SEQ ID NO: 1 (humanes 21,5 kDa-MBP, "MBP + X2"), das Polypeptid von SEQ ID NO: 1, wobei Aminosäure 81 irgendeine Standard-Aminosäure ist ("MBP + X2^Xxx81"), das Polypeptid von SEQ ID NO: 1, wobei Cystein 81 durch irgendeine andere Standard-Aminosäure ersetzt ist ("MBP + X2^Xaa81") das Polypeptid von SEQ ID NO: 1, wobei Cystein 81 durch eine ungeladene Aminosäure (d. h. eine Aminosäure, die bei einem pH-Wert von zwischen 6 und 7 ungeladen ist) mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 150 ersetzt ist ("MBP + X2^Xaa81<150") und das Polypeptid von SEQ ID NO: 1, wobei Cystein 81 durch Serin ersetzt ist ("MBP + X2^Ser81").
"MBP 21,5-Polypeptide" umfassen auch Variationen der vorgenannten vier Sequenzen, mit der Maßgabe, daß die Sequenz nach wie vor wenigstens einige aus der Sequenz von Aminosäuren, die durch Exon 2 des humanen MBP-Gens codiert werden, beinhaltet, und mit der weiteren Maßgabe, daß das Polypeptid eine "T-Zell-Antwort" in einer Population von MBP-reaktiven T-Zellen, die aus einem MS-Patienten isoliert wurden, induzieren kann. Der Begriff "T-Zell-Antwort" wird unten diskutiert.
Ein bevorzugtes MBP 21,5-Polypeptid der Erfindung ist ein bakteriell exprimiertes humanes rekombinantes MBP, welches Aminosäuren enthält, die durch Exon 2 des humanen MBP-Gens codiert werden, und ein Molekulargewicht von ungefähr 21,5 kDa hat, wobei Cys 81 durch irgendeine andere Standard-Aminosäure ersetzt wurde (dieses Polypeptid wird hier als "MBP + X2^Xaa81" bezeichnet, und dieses codierende Nukleinsäuremoleküle werden als "MBP + X2^Xaa81/hum." oder "MBP + X2^Xaa81/Bakt." bezeichnet, wobei das hochgestellte ^hum. oder ^Bakt. die Codonverwendung in der codierenden Region des Nukleinsäuremoleküls anzeigt, wie unten diskutiert). Wie es auf dem Gebiet verwendet wird, ist eine "Standard"-Aminosäure eine der 20 Aminosäuren, die üblicherweise in Proteinen zu finden sind.
Wie hierin verwendet, wird die durch Exon 2 codierte Aminosäuresequenz als X2MBP oder einfach als X2 bezeichnet. Gemäß der Erfindung kann die X2MBP-Sequenz an irgendeiner Position in dem MBP + X2^Xxx81-Polypeptid liegen, obwohl die natürlich vorkommende Position der nativen Exon 2-codierten Sequenz (wie in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 gezeigt) bevorzugt ist. Weitere Polypeptide, die X2MBP-Sequenzen umfassen, werden unten beschrieben.
Vorzugsweise bewirkt die Austausch-Aminosäure keine Epitopumwandlung, d. h. die T-Zell-Erkennung des (der) immundominanten Epitops oder Epitope von XMBP bleibt durch die Ersetzung von Cys 81 durch die bestimmte Austausch-Aminosäure im wesentlichen unverändert. Vor der vorliegenden Erfindung war es unbekannt, ob eine Ersetzung von Aminosäurerest 81 durch eine andere Standard-Aminosäure eine solche Epitopumwandlung verursachen würde (d. h. ob solche Veränderungen epitopneutral wären).
Das Fehlen von Epitopumwandlung durch die Substitution irgendeiner Standard-Aminosäure kann gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden, indem die Reaktionen von T-Zellen (z. B. T-Zellinien), die mit X2MBP (X2MBP-spezifischen T-Zellen) spezifisch reaktiv sind, auf MBP + X2^Xaa81 oder bevorzugt auf ein Testpeptid (das X2^Xaa81-Peptid), welches die Exon 2-codierte Region von MBP + X2^Xaa81 umfaßt, getestet werden, wie unten ausführlich beschrieben. Das Testpeptid ist vorzugsweise ein aus 26 Aminosäuren bestehendes Peptid mit einer Sequenz, die den Aminosäureresten 59 bis 84 von SEQ ID NO: 1 entspricht, wobei Cys 81 durch die andere Standard-Aminosäure ersetzt ist (das "X2^Xaa81-26mer").
X2MBP-spezifische T-Zellen können durch konventionelle Verfahren unter Verwendung eines Peptids, welches die durch Exon 2 codierte Aminosäuresequenz enthält (im folgenden bezeichnet als ein "X2MBP-Peptid"), als T-Zellinien erhalten werden. Beispielsweise können die von Voskuhl et al,. 1993a, beschriebenen Verfahren verwendet werden. Siehe auch Voskuhl et al., 1993b; Segal et al., 1994; Voskuhl et al., 1994, und Fritz und Zhao, 1994.
Vorzugsweise werden humane T-Zellinien durch solche Standardverfahren nach einer Stimulation mit einem X2MBP-Peptid, das nur die durch Exon 2 codierten 26 Aminosäuren aufweist, d. h. ein X2MBP-Peptid, dessen Sequenz den Aminosäureresten 59 bis 84 von SEQ ID NO: 1 entspricht (das "X2-26mer"), erhalten. Insbesondere ist eine Stimulation mit dem X2-26-mer gegenüber einer Stimulation mit dem 40 Aminosäuren umfassenden X2MBP-Peptid oder der 18,5 kDa-Isoform von MBP, die in der Publikation von Voskuhl et al., 1993a, beschrieben ist, bevorzugt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden so erhaltene X2MBP-spezifische T-Zellinien unter anderem verwendet, um die Epitopneutralität einer bestimmten Aminosäuresubstitution an Position 81 zu bestimmen. Dies wird bewerkstelligt durch Beurteilen der Reaktion der Zellen der X2MBP-spezifischen humanen T-Zellinie auf das X2^Xaa81-Peptid. (MBP + X2^Xaa81 kann auch verwendet werden, um die Epitopneutralität zu testen, dies ist jedoch weniger bevorzugt.) Wenn die X2MBP-spezifischen T-Zellen auf das X2^Xaa81-Peptid, welches die bestimmte Aminosäuresubsti tution enthält, in einem Maße reagieren, welches das von Voskuhl et al., 1993a, ausgeführte Kriterium für X2MBP-Spezifität erfüllt, d. h. wenn das bestimmte X2^Xaa81-Peptid im Vergleich zu Kontrollen mit Medium alleine einen Stimulationsindex von größer als 2 zeigt, dann wird eine Epitopneutralität einer bestimmten Austausch-Aminosäure bestätigt. Bevorzugt ist der Stimulationsindex größer als 3.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine solche epitopneutrale Ersetzung im allgemeinen unter Verwendung einer ungeladenen Aminosäure erzielt werden, die ein Molekulargewicht von weniger als etwa 150 hat und die vorzugsweise nicht stark hydrophob ist.
Aminosäuren, die diese Anforderungen erfüllen, umfassen Ala, Asn, Gly, Pro, Thr und Ser. Am meisten bevorzugt ist die Ersetzung Ser, was zu einem MBP 21,5-Polypeptid führt, welches eine Exon 2-codierte Region umfaßt, in der Cys 81 zu Ser 81 verändert wurde (im folgenden wird dieses Polypeptid als "MBP + X2^Ser81" bezeichnet, und dieses codierende Nukleinsäuremoleküle werden als "MBP + X2^Ser81/hum." oder "MBP + X2^Ser81/Bakt." bezeichnet, wobei die hochgestellten ^hum. und ^Bakt. die Codonverwendung in der codierenden Region des Nukleinsäuremoleküls anzeigen, wie unten diskutiert).
Vor der vorliegenden Erfindung war nicht bekannt, ob bakteriell exprimierte MBP + X2-Polypeptide in dem gleichen Maße von T-Zellen erkannt würden und ob die T-Zellen in gleichem Maße auf sie reagieren würden wie (auf) durch Säuger exprimierte MBP-Polypeptide (z. B. vom Menschen abgeleitetes MBP-X2). Diese Unsicherheit war unter anderem auf die Unterschiede in der Proteinfaltung während der Expression von Proteinen in Bakterien- oder Säugerzellen zurückzuführen. Bakteriell exprimierte Proteine werden typischerweise nicht zu der nativen Konformation von in Säugerzellen exprimierten Proteinen gefaltet. Wie in dem Abschnitt zum Hintergrund der Erfindung oben unter der Überschrift "T-Zellen, Antigen-präsentierende Zellen und T-Zell-Epitope" diskutiert, kann die Proteinfaltung bestimmen, ob ein spezifisches Epitop durch APCs in angemessener Weise verarbeitet wird. Aus diesem Grund werden bakteriell exprimierte Proteine möglicherweise durch APCs nicht in der gleichen Weise verarbeitet und präsentiert wie native Proteine und werden deshalb womöglich durch T-Zellen nicht erkannt.
Die Exon 2-Sequenzen in MBP + X2^Cys81 waren der Grund für zusätzliche Unsicherheit, da von solchen Sequenzen nur gezeigt worden war, daß sie T-Zellen stimulieren, wenn sie zu T-Zellen als synthetische Peptide (die nicht durch APCs verarbeitet werden müssen, um von TCRs erkannt zu werden und damit T-Zellen auf sie reagieren) zugegeben werden. Vor der vorliegenden Erfindung wurde niemals gezeigt, daß die 21,5 kDa-Isoform von MBP (ungeachtet der Quelle) durch APCs korrekt verarbeitet werden konnte, um enzephalitogene T-Zellen zu stimulieren, eine Frage, die im Hinblick auf die Rolle von X2-Epitopen in der MS-Pathogenese von besonderem Interesse ist. Die vorliegende Erfindung ermöglichte es, zu zeigen, daß dies der Fall ist, was die klinische Relevanz der zuvor berichteten X2MBP-Peptid-Arbeit demonstriert.
II. PLP-Polypeptide
Ein bevorzugtes PLP-Polypeptid der Erfindung ist ein bakteriell exprimiertes humanes rekombinantes PLP, welches die hydrophilen Domänen 2, 3 und 4 enthält. Solche PLP-Polypeptide können eine oder mehrere hydrophobe Domänen enthalten. Bevorzugter umfassen PLP-Polypeptide die in Tabelle 1 gezeigten, mit MS assoziierten PLP-Epitope. Solche bevorzugte PLP-Polypeptide umfassen die in SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 (vorzugsweise Aminosäurereste 1 bis einschließlich 368 von SEQ ID NO: 26), SEQ ID NO: 27 (vorzugsweise Aminosäurereste 6 bis einschließlich 374 von SEQ ID NO: 27) oder SEQ ID NO: 28 (vorzugsweise Aminosäurereste 1 bis einschließlich 487 von SEQ ID NO: 28).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die immunreaktiven Polypeptide wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäuren (d. h. ein lineares Polymer von Aminosäuren mit ausreichender Größe, um ein Epitop zu umfassen), von denen alle bis auf einen Ziel-Aminosäurerest einer Region der 21,5 kDa-Isoform von humanem MBP (SEQ ID NO: 1), die den Aminosäurerest 81 von SEQ ID NO: 1 umfaßt, entsprechen. In dieser Ausführungsform liegt der Ziel-Aminosäurerest an einer Position innerhalb der MBP-Aminosäuresequenz, die der Position von Aminosäurerest 81 von SEQ ID NO: 1 entspricht, und der Ziel-Aminosäurerest ist irgendeine andere Standard-Aminosäure als Cystein.
Bestimmte bevorzugte immunreaktive Polypeptide der Erfindung umfassen weiterhin eine Myelin-Oligodendrozyten-Glycoprotein-Aminosäuresequenz, die wenigstens 10 zusammenhängenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz von humanem Myelin-Oligodendrozyten-Glycoprotein (Aminosäurereste 199 bis einschließlich 319 von SEQ ID NO: 28) entspricht.
Vorzugsweise werden die immunreaktiven Polypeptide der Erfindung in Bakterien in größeren Mengen exprimiert als das native PLP-Polypeptid und/oder sind in wäßriger Lösung löslicher als das native PLP-Polypeptid.
PLP-spezifische T-Zellen können durch konventionelle Verfahren unter Verwendung eines Peptids, welches eine PLP-Aminosäuresequenz enthält, als T-Zellinien erhalten werden. Beispielsweise können die von Voskuhl et al., 1993a, beschriebenen Verfahren verwendet werden. Siehe auch Voskuhl et al., 1993b; Segal et al., 1994; Voskuhl et al., 1994; Fritz und Zhao, 1994; Pelfrey et al., 1993; Pelfrey et al., 1994, und Correale et al., 1995.
Vor der vorliegenden Erfindung war nicht bekannt, ob bakteriell exprimierte PLP-Polypeptide auf eine solche Weise von T-Zellen erkannt würden und ob T-Zellen in einer solchen Weise auf sie reagieren würden, die deren Verwendung als therapeutische Mittel gestattet. Diese Unsicherheit war unter anderem auf die Unterschiede in der Proteinfaltung während der Expression von Proteinen in Bakterien- oder Säugerzellen zurückzuführen. Bakteriell exprimierte Proteine werden typischerweise nicht zu der nativen Konformation von in Säugerzellen exprimierten Proteinen gefaltet. Wie in dem Abschnitt zum Hintergrund der Erfindung oben unter der Überschrift "T-Zellen, Antigen-präsentierende Zellen und T-Zell-Epitope" diskutiert, kann die Proteinfaltung bestimmen, ob ein spezifisches Epitop durch APCs in geeigneter Weise verarbeitet wird.
Aus diesem Grund werden bakteriell exprimierte Proteine durch APCs möglicherweise nicht in der gleichen Weise verarbeitet und präsentiert wie native Proteine. Daher werden womöglich einige der oder alle Epitope in einem solchen bakteriell exprimierten Protein durch T-Zellen nicht erkannt.
III. Nukleinsäuremoleküle, die MBP- und PLP-Polypeptide codieren
Nukleinsäuremoleküle, die bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, können unter Verwendung einer Vielzahl von nun auf dem Gebiet bekannten oder anschließend entwickelten Techniken hergestellt werden. Beispielsweise können sie unter Verwendung von auf dem Gebiet gut bekannten Techniken unter Verwendung von klonierten Genen hergestellt werden. Die Begriffe Gen und Gene, wie sie hier verwendet werden, umfassen exprimierte (z. B. Protein-codierende) Nukleinsäuremoleküle, entweder mit Intron-umfassenden Sequenzen oder ohne Introns, z. B. cDNAs. Die klonierten Gene werden durch konventionelle Techniken, z. B. PCR-Vervielfältigung und/oder Restriktionsverdau von Nukleinsäuremolekülen, manipuliert, um Restriktionsfragmente zu erzeugen, die Teile der MBP- oder PLP-Polypeptide codieren. Diese Fragmente können unter Verwendung von beispielsweise PCR-Fusion (überlappende PCR) oder enzymatischer Ligation der Restriktionsverdauprodukte zusammengesetzt werden. Die zusammengesetzten Konstrukte oder Fragmente davon können durch mutagene Techniken, wie Oligonukleotid-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese, modifiziert werden.
Es sind zahlreiche Publikationen verfügbar, die diese konventionellen Verfahren lehren, einschließlich Sambrook et al., 1989; Ho et al., Gene 1989; Farrell 1993; Ausubel et al., 1994; Griffin und Griffin 1994; Mullis et al., 1994; Harwood 1994 und Davis et al., 1994. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle, die die MBP- oder PLP-Polypeptide, die bei der Ausübung der Erfindung verwendet werden, oder irgendwelche der oder alle Nukleinsäurefragmente, die verwendet werden, um solche Nukleinsäuremoleküle zusammenzusetzen, codieren, durch chemische Mittel synthetisiert werden (siehe beispielsweise Talib et al., 1991, und Ausubel et al., 1994).
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Codons für verschiedene der Aminosäuren der MBP- und PLP-Polypeptide der Erfindung "bakterialisiert" werden, um die Herstellung des Proteins in Bakterien zu steigern. Wie auf dem Gebiet bekannt ist, neigen Bakterien dazu, bestimmte Codons für bestimmte Aminosäuren gegenüber anderen möglichen Codons, die die gleiche Aminosäure codieren, bevorzugt zu verwenden. Dementsprechend wird angenommen, daß die Proteinsynthesemaschinerie der Bakterien möglicherweise effektiver arbeitet, wenn die bevorzugten Codons verarbeitet werden. Eine Bakterialisierung und andere Veränderungen von Myelinprotein-codierenden Codons werden nun ausführlicher diskutiert, wie unter spezieller Bezugnahme auf die MBP-Moleküle der Erfindung beispielhaft veranschaulicht.
SEQ ID NO: 1 legt die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen für die native humane fötale 21,5 kDa-Isoform von MBP dar. Ein Nukleinsäuremolekül, welches MBP + X2^Xaa81 codiert, kann durch Modifizieren wenigstens eines der Nukleotide 241 bis 243 (d. h. Codon 81) von SEQ ID NO: 1, so daß das Codon der gewünschten Austausch-Aminosäure entspricht, hergestellt werden. Eine solche Modifikation kann unter Verwendung einer Vielzahl von Nukleinsäuremanipulationstechniken, die nun auf dem Gebiet bekannt sind oder anschließend entwickelt werden, einschließlich konventioneller rekombinanter DNA-Techniken, wie Oligonukleotid-vermittelter ortsgerichteter Mutagenese, PCR-Mutagenese oder de novo-Synthese des gewünschten Polypeptids, erzielt werden, wie oben beschrieben.
Für MBP + X2^Ser81 kann das native TGC-Codon zu irgendeinem von AGC, AGT, TCA, TCC, TCG und TCT verändert werden. Im allgemeinen erfolgt die Veränderung bevorzugt zu TCG, da diese Veränderung zur Erzeugung einer neuen TCGA-Restriktionsstelle an dieser Stelle führt. Die Erzeugung einer neuen Restriktionsstelle an dieser Stelle vereinfacht die Identifizierung und Abtrennung eines Nukleinsäuremoleküls, welches die gewünschte Modifikation umfaßt, von dem Gemisch aus modifizierten und nicht-modifizierten Nukleinsäuremolekülen, das typischerweise als eine Zwischenstufe in dem Gesamtverfahren der Herstellung eines MBP + X2^Xaa81 codierenden Nukleinsäuremoleküls, wie z. B. eines MBP + X2^Ser81 codierenden Nukleinsäuremoleküls, erhalten wird. Wenn Erwägungen zur Optimierung der Proteinherstellung Erwägungen zur Einfachheit der Nukleinsäuremanipulation dominieren, und wenn MBP + X2^Ser81 in Bakterien, z. B. E. coli, hergestellt werden soll (wobei das TCG-Codon kein bakteriell bevorzugtes Codon ist), erfolgt die Veränderung vorzugsweise zu TCC, TCT oder AGC, da diese Codons in Bakterien bevorzugt sind.
SEQ ID NO: 2 legt die Aminosäuresequenz für die native humane fötale 21,5 kDa-Isoform von MBP und eine dieses Protein codierende modifizierte Nukleotidsequenz dar, wobei die Codons für mehrere der Aminosäuren "bakterialisiert" wurden, um die Herstellung des Proteins in Bakterien zu steigern. Wie auf dem Gebiet bekannt ist, neigen Bakterien dazu, bestimmte Codons für bestimmte Aminosäuren gegenüber anderen möglichen Codons, die die gleiche Aminosäure codieren, bevorzugt zu verwenden. Dementsprechend wird angenommen, daß die Proteinsynthesemaschinerie der Bakterien möglicherweise effektiver arbeitet, wenn die bevorzugten Codons verarbeitet werden. Wie jedoch auf dem Gebiet auch bekannt ist, ist nicht vorhersehbar, ob die Substitution bevorzugter Codons gegen nicht-bevorzugte Codons tatsächlich zu einer wesentlichen Steigerung der Produktion eines bestimmten Proteins in Bakterien führt. Wie in den Beispielen unten ausführlich diskutiert wird, steigerte die Bakterialisierung von SEQ ID NO: 2 die Produktion von MBP in E. coli um wenigstens 50 Prozent.
In SEQ ID NO: 2 wurde die Bakterialisierung durch Substituieren von bakteriell bevorzugten Codons gegen native humane Codons, die nicht bereits bakteriell bevorzugten Codons entsprachen (Kriterium 1), durchgeführt. Bei der Auswahl der auszutauschenden Codons wurde besondere Aufmerksamkeit auf die folgenden sieben Aminosäuren gerichtet: Arg (17 von 21 Codons verändert), Gly (13 von 28 Codons verändert), Pro (10 von 17 Codons verändert), Lys (12 von 14 Codons verändert), Leu (3 von 11 Codons verändert), Thr (6 von 8 Codons verändert) und Val (3 von 5 Codons verändert). Diese Aminosäuren wurden aufgrund einer starken Neigung zur Verwendung von bestimmten ihrer redundanten Codons in E. coli betont (Wada et al., 1992). Von diesen sieben wurden Arg, Pro und Lys als die wichtigsten erachtet, da sie 26% der Aminosäurereste in MBP 21,5 ausmachen. Als alternatives Kriterium wurden einige Codons zu einem Codon verändert, welches bevorzugt in hochgradig exprimierten bakteriellen Genen verwendet wird (Kriterium 2, siehe Grosjean und Fiers, 1982). Eine vollständige Auflistung von Codonveränderungen, die in das SEQ ID NO: 3 entsprechende Nukleinsäuremolekül aufgenommen wurden (mit Ausnahme des nativen Cysteincodons 81, welches in diesem Vergleich anstelle des Ser-Codons für Aminosäure Nummer 81, wie in SEQ ID NO: 3 zu finden, beibehalten wurde), ist in Tabelle 4 angegeben, wo die Sequenzdaten zu nativem (fötalem) MBP21,5 als "huMBP 21,5" angegeben sind und die Sequenzdaten zu bakterialisiertem rekombinantem MBP (MBP + X2^Cys81/Bakt.) als "recMBP 21,5" angegeben sind.
Wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, bezieht sich der Ausdruck "bakteriell bevorzugtes Codon" auf ein Codon, welches auf Basis eines der obigen beiden Kriterien ausgewählt wurde, und die Hochstellungen (1) "^hum." und (2) "^Bakt." bezeichnen MBP-codierende Nukleinsäuresequenzen mit (1) nativen humanen Codons und (2) wenigstens einigen Codons, die von nativen humanen Codons zu bakteriell bevorzugten Codons verändert wurden.
Es kann mehr oder weniger Bakterialisierung durchgeführt werden, falls dies gewünscht ist, wobei das Kriterium darin besteht, ob eine gewünschte Steigerung des Produktionsniveaus erzielt wird. Im Hinblick auf MBP kann die bakterialisierte Sequenz auch weiter verändert werden, um MBP + X2^Xaa81/Bakt. oder vorzugsweise MBP + X2^Ser81/Bakt. zu erzeugen. Die Bakterialisierung und die weiteren Veränderungen an Codon 81 können unter Verwendung der oben und in den Beispielen diskutierten Nukleinsäuremanipulationstechniken durchgeführt werden.
Wie oben diskutiert, zeigt SEQ ID NO: 3 eine solche bakterialisierte Nukleotidsequenz, die MBP + X2^Ser81 codiert und weiterhin eine zusätzliche, aus 18 Nukleotiden bestehende Sequenz am 3'-Ende (unmittelbar vor dem Terminationscodon, d. h. Nukleotide 592–609 von SEQ ID NO: 3) umfaßt, die sechs Histidinreste am Carboxyterminus des codierten Polypeptids codiert (wobei eine solche mehrfache Histidinaddition von wenigstens vier Resten als eine Histidinmarkierung bezeichnet wird). Diese Histidinmarkierung ist in dem nativen MBP + X2^Cys81/hum.-Protein nicht zu finden, und sie wurde hinzugefügt, um die Reinigung des Polypeptidprodukts der Expression dieses MBP + X2^Ser81/Bakt.Gens zu vereinfachen.
Histidinmarkierungen sind Gruppen von wenigstens fünf aufeinanderfolgenden Histidinresten, die als Metallchelatoren wirken und die Verwendung von Metallchelatchromatographie oder dergleichen erlauben, um Polypeptide, die solche Markierungen enthalten, rasch und in effizienter Weise aus Gemischen von Proteinen zu reinigen. Gemäß der Erfindung kann eine solche Histidinmarkierung zu irgendeinem der Polypeptide der Erfindung hinzugefügt werden, oder eine Sequenz, die eine solche Markierung codiert, kann zu irgendeinem der Nukleinsäuremoleküle der Erfindung hinzugefügt werden, um die leichte Reinigung der Polypeptide der Erfindung zu gestatten.
Bevorzugte Nukleinsäuremoleküle der Erfindung sind isolierte Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleotidsequenz (und/oder eine dazu komplementäre Nukleotidsequenz) umfassen, die, wenn sie in einem geeigneten Wirt exprimiert wird, die Expression der PLP-Polypeptide der Erfindung reguliert.
Die Protein-codierenden Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können in einen geeigneten Expressionsvektor, d. h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der eingebrachten Protein-codierenden Sequenz enthält, eingebracht und dann verwendet werden, um MBP- und/oder PLP-Polypeptide zu erzeugen. Eine Vielzahl von Wirtsvektorsystemen kann verwendet werden, um die Protein-codierende Sequenz zu exprimieren. Diese umfassen ohne Beschränkung hierauf Säugerzellsysteme, die mit einem Virus, wie Vacciniavirus, Adenovirus, einem Retrovirus usw., infiziert sind, mit Plasmiden transfizierte Säugerzellsysteme, mit einem Virus, wie Baculovirus, infizierte Insektenzellsysteme, Mikroorganismen, wie Hefe, die Hefeexpressionsvektoren enthalten, oder Bakterien, die mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA, Cosmid-DNA oder dergleichen transformiert sind.
Geeignete Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung können einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, abgeleitet von kommerziell erhältlichen Plasmiden, einschließlich derjenigen, die genetische Elemente des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, Maryland 20852, Vereinigte Staaten von Amerika, ATCC-Hinterlegungsnummer 37017) umfassen. Diese pBR322-"Rückgrat-Abschnitte" oder funktionell äquivalente Sequenzen werden mit einem geeigneten Promotor und dem zu exprimierenden Strukturgen vereinigt.
Bevorzugte bakterielle Expressionsvektoren umfassen ohne Beschränkung hierauf die Phagen-T7-Promotor-Plasmide pET14b und pEP22b (Novagen, Madison, WI). Diese Vektoren werden vorzugsweise in E. coli BL21(DE3) (Novagen, Madison, WI) exprimiert. Dieser Stamm ist für ein rekombinantes Bakteriophagen-DE3-Lysogen, welches das Gen für T7-Polymerase hinter dem E. coli-lacUV5-Promotor enthält, lysogen (Studier et al., 1990). Weitere bevorzugte bakterielle Expressionsvektoren sind Trc-Vektoren, einschließlich des pET-Trc-SO5/NI-Vektors (SEQ ID NO: 21), des pTrc-99A-Vektors (Pharmacia) und der pSE-Vektoren (Invitrogen, San Diego, CA).
Weitere Promotoren, die üblicherweise in rekombinanten mikrobiellen Expressionsvektoren verwendet werden, umfassen ohne Beschränkung hierauf das Lactose-Promotorsystem (Chang et al., 1978), den Tryptophan-(trp-)Promotor (Goeddel et al., 1980) und den tac-Promotor oder eine Fusion zwischen den tac- und trp-Promotoren, die als der trc-Promotor bezeichnet wird (siehe Sambrook et al., 1989, und Maniatis et al., 1982, insbesondere Seite 412). Besonders bevorzugte Promotoren sind Bakteriophagenpromotoren, z. B. der oben diskutierte T7-Promotor, die zusammen mit der Expression der korrespondierenden Bakteriophagen-RNA-Polymerase, z. B. T7-RNA-Polymerase, in der Wirtszelle verwendet werden können.
Rekombinante MBP- und PLP-Polypeptide können auch in Pilzwirten exprimiert werden, vorzugsweise in Hefe der Gattung Saccharomyces, wie S. cerevisiae. Pilze anderer Gattungen, wie Aspergillus, Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls verwendet werden. Pilzvektoren enthalten im allgemeinen einen Replikationsursprung aus dem 2 μm Hefeplasmid oder eine andere autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, DNA, die das MPB- und/oder PLP-Polypeptid codiert, Sequenzen, die Polyadenylierung und Transkriptionstermination regulieren, und ein selektierbares Markergen. Vorzugsweise beinhalten Pilzvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Marker, die die Transformation von sowohl E. coli als auch Pilzen gestatten.
Geeignete Promotorsysteme in Pilzen beinhalten die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glycolytische Enzyme, wie Enolyse, Hexokinase, Pyruvatkinase und Glucokinase, sowie den durch Glucose hemmbaren Alkoholdehydrogenasepromotor (ADH2), den konstitutiven Promotor aus dem Alkoholdehydrogenasegen, ADH1, und andere. Siehe beispielsweise Schena et al., 1991. Sekretionssignale, wie diejenigen, die die Sekretion von Hefe-Alpha-Faktor oder Hefeinvertase regulieren, können in den Pilzvektor aufgenommen werden, um die Sekretion des MPB- und/oder PLP-Polypeptids in das Pilzwachstumsmedium zu fördern. Siehe Moir et al., 1991.
Bevorzugte Pilzexpressionsvektoren können unter Verwendung von DNA-Sequenzen aus pBR322 für die Selektion und Replikation in Bakterien und von Pilz-DNA-Sequenzen, einschließlich der ADH1-Promotor- und der Alkoholdehydrogenase-ADH1-Terminationssequenz, wie sie in Vektor pAAH5 zu finden ist, konstruiert werden (Ammerer, 1983).
Verschiedene Säuger- oder Insektenzellkultursysteme können verwendet werden, um die rekombinanten MBP- und/oder PLP-Polypeptide der Erfindung zu exprimieren. Geeignete Baculovirussysteme für die Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen werden von Lukkow et al., 1988, besprochen. Beispiele geeigneter Säugerwirtszellinien umfassen die COS-Zelle mit Affenleberursprung, Maus-C127-Brustepithelzellen, Maus-BALG/c-3T3-Zellen, Maus-MOP8-Zellen, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), humane 293T-Zellen, HeLa-, Myelom- und Baby-Hamsternieren-(BHK-)Zellen. Säugerexpressionsvektoren können nicht-transkribierte Elemente, wie einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und einen Enhancer, die mit der MBP- und/oder PLP-codierenden Sequenz, die exprimiert werden soll, verknüpft sind, und weitere 5'- oder 3'-flankierende Sequenzen, wie Ribosombindungsstellen, Polyadenylierungssequenzen, Splicing-Donor- und -Akzeptorstellen und transkriptionale Terminationssequenzen, umfassen.
Die transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen in Säugerexpressionsvektorsystemen, die beim Transformieren von Wirbeltierzellen verwendet werden sollen, können durch virale Quellen bereitgestellt werden. Beispielsweise sind herkömmlicherweise verwendete Promotoren und Enhancer von Polyomavirus, Adenovirus, Simian-Virus 40, Vaccinia- und humanem Cytomegalovirus (CMV), einschließlich des Immediate-early-Cytomegalovirus-Gen 1-Promotors und -Enhancers, abgeleitet.
Besonders bevorzugte eukaryotische Vektoren für die Expression von rekombinanten MBP- und/oder PLP-Polypeptiden sind pAPEX-1 (SEQ ID NO: 11) und bevorzugter pAPEX-3p, SEQ ID NO: 12. Der Vektor pAPEX-1 ist ein Derivat des Vektors pcDNAI/Amp (Invitrogen), der modifiziert wurde, um die Proteinexpressionsniveaus zu steigern. Zuerst wurde das 3'-untranslatierte kleine SV40 T-Antigen-Intron durch Deletion eines 601 Basenpaare umfassenden XbaI/HpaI-Fragments entfernt, da dieses Intron für abnormes Splicing in stromaufwärts codierende Regionen anfällig ist (Evans und Scarpulla, 1989; Huang und Gorman, 1990). Als zweites wurde ein chimäres Adenovirus-Immunglobulin-Hybrid-Intron in die 5'-untranslatierte Region eingebracht, indem ein 484 Basenpaare umfassendes NdeI-NotI-Fragment durch ein korrespondierendes, 845 Basenpaare umfassendes NdeI-NotI-Fragment aus dem Vektor pRc/CMV7SB ersetzt wurde (Sato et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:17267ff.). Schließlich wurde, um die Plasmid-DNA-Ausbeute aus E. coil zu steigern, die resultierende CMV-Promotor-Expressionskassette in den Vektor pGEM-4Z (Promega Corp., Madison, WI) einschleust.
Der Vektor pAPEX-3 ist ein Derivat des Vektors pDR2 (Clontech Laborstories, Inc., Palo Alto, CA), in welchem das EBNA-Gen zuerst durch Deletion eines 2,4 kb ClaI/AccI-Fragments entfernt wurde. Der RSV-Promotor wurde dann durch den CMV-Promotor und das chimäre Adenovirus/Immunglobulin-Intron ersetzt, indem ein 450 bp MluI/BamHI-Fragment aus pDR2 gegen ein 1,0 kb MluI/BamHI-Fragment aus dem Vektor pAPEX-1 ausgetauscht wurde. Für die Konstruktion von pAPEX-3p wurde ein 1,7 kb BstBI/SwaI-Fragment, welches den HSV-tk-Promotor und das Hygromycinphosphotransferase-(hyg-)Gen enthielt, aus pAPEX-3 entfernt und durch ein 1,1 kb SnaBI/NheI-Fragment, welches den frühen SV40-Promotor und das Puromycinacetyltransferase-(pac-)Gen enthielt (Morgenstern und Land, 1990, Nucleic Acids Res. 18:3587-3596), plus ein 137 bp XbaI/ClaI-Fragment, welches ein SV40-Polyadenylierungssignal von dem Vektor pAPEX-1 enthielt, ersetzt.
Eine besonders bevorzugte Wirtszelle für die Expression von rekombinanten MBP- und/oder PLP-codierenden Inserts in den pAPEX-Vektoren ist die humane 293 EBNA-Zellinie (Invitrogen, San Diego, CA).
Ein weiterer bevorzugter eukaryotischer Vektor für die Expression von rekombinanten MBPs und/oder PLPs ist pcDNAI/Amp (Invitrogen Corporation, San Diego, Kalifornien). Der pcDNAI/Amp-Expressionsvektor enthält die Immediate-early-Gen I-Promotor- und -Enhancerelemente von humanem Cytomegalovirus, die Konsensus-Intron-Donor- und -Akzeptor-Splicing-Sequenzen von Simian-Virus 40 (SV40) und das SV40-Konsensus-Polyadenylierungssignal. Dieser Vektor enthält auch einen SV40-Replikationsursprung, der eine episomale Vervielfältigung in Zellen (z. B. COS-Zellen, MOP8-Zellen usw.), die mit großem SV40 T-Antigen transformiert sind, gestattet, und ein Ampicillinresistenzgen für die Vermehrung und Selektion in Bakterienwirten.
III. Herstellung der Polypeptide der Erfindung
Gereinigte rekombinante MBPs und PLPs werden hergestellt durch Kultivieren geeigneter Wirt/Vektor-Systeme (bevorzugt bakterieller Systeme), um die rekombinanten MBP- und/oder PLP-Translationsprodukte der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, die dann aus dem Kulturmedium oder Zellextrakten des Wirtssystems, z. B. den Bakterienzellen, Insektenzellen, Pilz- oder Säugerzellen, gereinigt werden. Die Erfindung liefert somit ein Verfahren zum Herstellen von MBP- und PLP-Polypeptiden, welches das Züchten eines rekombinanten Wirts, der ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung enthält, so daß das Nukleinsäuremolekül durch den Wirt exprimiert wird, und das Isolieren des exprimierten Polypeptids umfaßt.
Die Fermentation von Zellen, die rekombinante MBP- und/oder PLP-Proteine exprimieren, die eine oder mehrere Histidinmarkierungssequenzen (eine Sequenz, die einen Stretch von wenigstens 5 Histidinresten umfaßt) als sekretiertes Produkt enthalten, vereinfacht die Reinigung erheblich. Eine solche Histidinmarkierungssequenz ermöglicht unter spezifischen Bedingungen die Bindung an Metalle, wie Nickel, und damit an Nickel-(oder andere Metall-)Säulen für die Reinigung.
Allgemein ausgedrückt wird die Reinigung unter Verwendung eines geeigneten Satzes von Konzentrations- und Fraktionierungs-(z. B. Chromatographie-)Stufen durchgeführt. Für die Reinigung von MBP-Polypeptiden umfaßt eine besonders bevorzugte Reinigungsstufe die Säureextraktion, wie in den Beispielen unten unter der Überschrift "Reinigung und Charakterisierung von MBP-Polypeptiden" beschrieben.
Die gereinigten MBP- und PLP-Polypeptide der Erfindung werden, ganz gleich, wie sie hergestellt wurden, im allgemeinen durch das Vorliegen einiger Verunreinigungen charakterisiert. Diese Verunreinigungen können Proteine, Kohlehydrate, Lipide oder andere Moleküle in Mengen und mit einer Beschaffenheit, die von den verwendeten Herstellungs- und Reinigungsverfahren abhängen, umfassen. Diese Komponenten sind für gewöhnlich viralen, prokaryotischen, eukaryotischen oder synthetischen Ursprungs und sind vorzugsweise nicht-pyrogen und liegen in unschädlichen kontaminierenden Mengen in der Größenordnung von weniger als etwa 1 Gewichts-% vor.
IV. Klinische Anwendungen
Wie oben diskutiert, können die MBP- und PLP-Polypeptide, die durch die MBP- und/oder PLP-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung codiert werden, in der Diagnose, der klinischen Bewertung und bei der Behandlung von MS sowie für die Beurteilung des potentiellen Ansprechens von MS-Patienten auf eine therapeutische Behandlung, die die Verabreichung der PLP-Polypeptide umfaßt, verwendet werden. Verfahren für eine solche Diagnose und Bewertung umfassen einen Test, der die Inkubation von replizierten Kulturen von T-Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit eines oder mehrerer der hier diskutierten MBP- und PLP-Polypeptide und die Detektion von T-Zell-Aktivierung und/oder T-Zell-Apoptose (in dieser Beschreibung und in den Ansprüchen als "T- Zell-Antwort" bezeichnet), die aus der Inkubation in Gegenwart, nicht jedoch in Abwesenheit des einen oder der mehreren Polypeptide resultiert, umfaßt.
Spezieller umfaßt ein solcher Test vorzugsweise das Isolieren und teilweise Reinigen von T-Zellen aus einem Patienten, das Vereinigen der isolierten T-Zellen mit einem PLP- und/oder MBP-Polypeptid, wie einem Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 1, dem Polypeptid von SEQ ID NO: 1, wobei Cystein 81 durch irgendeine andere Standard-Aminosäure ersetzt ist, dem Polypeptid von SEQ ID NO: 1, wobei Cystein 81 durch eine ungeladene Aminosäure mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 150 ersetzt ist, und dem Polypeptid von SEQ ID NO: 1, wobei Cystein 81 durch Serin ersetzt ist, und/oder mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 23, dem Polypeptid von SEQ ID NO: 24, dem Polypeptid von SEQ ID NO: 26, dem Polypeptid von SEQ ID NO: 27, dem Polypeptid von SEQ ID NO: 28 oder einem der oben beschriebenen weiteren bevorzugten MBP- oder PLP-Polypeptide, und das Messen des Niveaus einer durch das Polypeptid induzierten T-Zell-Antwort. Verfahren zum Messen von T-Zell-Antworten werden unten unter der Unterüberschrift "Detektion von T-Zell-Antworten" beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein solcher Test als ein Kit für die Detektion von MBP- oder PLP-reaktiven T-Zellen bereitgestellt werden, welcher ein isoliertes PLP- oder MBP-21,5-Polypeptid in großer Enge mit und/oder Nähe zu einem Mittel zur Verwendung bei der Detektion einer T-Zell-Antwort, wie z. B. irgendeinem der Mittel, die unten unter der Unterüberschrift "Detektion von T-Zell-Antworten" beschrieben werden, umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform eines solchen Kits umfaßt der Kit weiterhin eine Markierung, die anzeigt, daß der Kit für die Verwendung bei der Diagnose und/oder der klinischen Bewertung von Multipler Sklerose bestimmt ist.
Ein Auffinden von T-Zellen in der CSF eines Patienten, die eine T-Zell-Antwort zeigen, wenn sie auf diese Weise mit PLP- oder MBP-21,5-Polypeptiden inkubiert werden, wird als ein Hinweis darauf genommen, daß der Patient an MS leidet. Ein Auffinden solcher auf MBP oder PLP reagierender T-Zellen in der CSF und/oder im Blut eines MS-Patienten ist ein Hinweis darauf, daß der Patient ein geeigneter Kandidat für die Behandlung mit MBP- und/oder PLP-Polypeptiden ist. Die Mengen solcher T-Zellen im Blut oder in der CSF können als ein Hinweis auf die Progression der Erkrankung und die Reaktion auf die Behandlung überwacht werden.
Die Anzahl solcher reaktiver T-Zellen im Blut und/oder in der CSF eines Patienten (die "Präkursor-Häufigkeit" oder der "reaktive T-Zellen-Index") kann über den Zeitverlauf überwacht werden und kann als ein Hinweis auf die klinische Progression der Erkrankung verwendet werden, wobei steigende Zahlen eine Verschlimmerung anzeigen und abnehmende Zahlen eine Verbesserung anzeigen. Der reaktive T-Zellen-Index dient auch als Prädiktor dafür, wann eine therapeutische Behandlung angemessen wäre, z. B. würde ein plötzlicher Anstieg des Index andeuten, daß eine therapeutische Intervention begonnen oder intensiviert werden sollte. Wenn der Index während eines Behandlungsverlaufs überwacht wird, ganz gleich, ob die Behandlung die Verabreichung von chimärem PLP umfaßt, ist eine signifikante Abnahme des reaktiven T-Zellen-Index ein Hinweis auf therapeutischen Erfolg, während ein signifikanter Anstieg des Index einen therapeutischen Fehlschlag anzeigt und darauf hindeutet, daß das therapeutische Regime angepaßt werden sollte.
Die Erfindung liefert somit einen Test, welcher das Isolieren und teilweise Reinigen von T-Zellen aus einem Patienten, das Vereinigen der isolierten T-Zellen mit einem immunreaktiven MBP 21,5-Polypeptid oder PLP-Polypeptid (wobei das PLP-Polypeptid eine PLP-Mutein-Aminosäuresequenz umfaßt, die die Aminosäuresequenz eines nativen PLP-Polypeptids abzüglich wenigstens einer oder zweier hydrophober Peptidregionen, bevorzugt abzüglich wenigstens dreier hydrophober Peptidregionen, hat) und das Messen des Niveaus einer durch das Polypeptid induzierten T-Zell-Antwort umfaßt.
A. Detektion von T-Zell-Antworten
Tests der T-Zell-Aktivierung und der Apoptose sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Ausführliche Diskussionen zu und Protokolle für solche Tests sind in zahlreichen Publikationen, einschließlich Wier, 1978; Klaus, 1987; Voskuhl et al., 1993, und Ormerod, 1994, zu finden. Solche Tests messen Veränderungen bestimmter Schlüsselindikatoren von T-Zell-Aktivierung und/oder -Apoptose.
Für die T-Zell-Aktivierung umfassen diese Indikatoren im allgemeinen Reagenzien für die Detektion von T-Zell-Proliferation, Zytokinfreisetzung und Expression von Zytokinrezeptoren und andere mit der Aktivierung assoziierte Zelloberflächenmarker. Für die Apoptose umfassen diese Indikatoren im allgemeinen Farbstoffe, Färbungen und andere Reagenzien für die Beobachtung/Detektion von Zellkernschrumpfung und/oder Zelltod, metabolische Inhibitoren, die apoptotischen Zelltod hemmen können, Färbungen, Enzyme, markierte Nukleinsäurevorläufer und weitere Indikatoren von DNA-Abbau.
Alle Tests der T-Zell-Aktivierung und der Apoptose umfassen die Verwendung von Zellkultur-(Gewebekultur-)Zubehör, typischerweise einschließlich Kulturgefäßen, wie Mehrfachwell-Platten, Schalen und Kolben, sowie Teströhrchen und Zentrifugenröhrchen, Flüssigkeitsmeßvorrichtungen, wie Pipetten, Tropfer und Tropfflaschen, Zellkulturmedien und Pufferlösungen. Viele dieser Tests umfassen auch eine Ablesung, die einen markierten Antikörper, häufig einen sekundären Antikörper gegen einen primären, unmarkierten Antikörper, der spezifisch an den gemessenen Indikator bindet, umfaßt. Zusätzlich umfassen diese Tests zahlreiche weitere Reagenzien und Instrumente, wie unten und in den Beispielen diskutiert. Wie in dieser Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet ist ein "Mittel zur Verwendung bei der Detektion einer T-Zell-Antwort" irgendeines der Reagenzien (einschließlich Antikörpern), Zubehör, Medien und Instrumente, die hier diskutiert werden und die für eine solche Detektion verwendet werden können.
Wenn für T-Zellen spezifische Reagenzien nicht als Indikatoren verwendet werden, umfassen die Messungen von T-Zell-Antworten im allgemeinen die Markierung und/oder die weitere Reinigung von T-Zellen aus Präparationen weißer Blutzellen, die typischerweise mittels Zentrifugation und/oder Filtration der Körperflüssigkeit (z. B. Zerebrospinalflüssigkeit oder dekoaguliertem Blut), in der sie isoliert sind, erhalten (d. h. teilweise gereinigt) werden. Wie im folgenden und in den Ansprüchen verwendet, sind "isolierte T-Zellen" T-Zellen, die aus dem Körper eines lebenden Subjekts entnommen, jedoch nicht notwendigerweise weiter gereinigt wurden (z. B. mittels Zentrifugation, um weiße Blutzellen aus einer Körperflüssigkeit zu entfernen, oder durch Abtrennen von T-Zellen von anderen Blutzellen). Die Isolierung von T-Zellen umfaßt somit Lanzetten, Nadeln, Spritzen, evakuierte Blutsammelröhrchen und weiteres Blut- und/oder CSF-Sammelzubehör und kann weiterhin die Verwendung von Filtrations- und Zentrifugationszubehör umfassen.
Verfahren zum spezifischen Markieren von T-Zellen umfassen typischerweise herkömmliche immunhistochemische und/oder FACS-Techniken, die Antikörper gegen T-Zell-spezifische Marker umfassen, die im allgemeinen T-Zell-Rezeptoren, Untereinheiten davon und assoziierte Moleküle, wie CD3, sind. Solche Antikörper sind von zahlreichen Quellen kommerziell erhältlich.
Verfahren für die wenigstens teilweise Reinigung von T-Zellen umfassen die Zellsortierung mittels FACS unter Verwendung der oben genannten Antikörper, verschiedene Affinitätsreinigungsverfahren, einschließlich der Passage durch Glasperlen und/oder Nylonwolle, die Verwendung von Antikörper gegen Marker für andere weiße Blutzelltypen, um Zellen, die keine T-Zellen sind, aus Gemischen von weißen Blutzellen zu entfernen, und Differentialzentrifugation, z. B. zentrifugale Elutriation und/oder Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Dichtegradientenmedien, wie Polysaccharose (FICOLL), Albumin, kolloidalem Silica und dergleichen.
Die Detektion von T-Zell-Proliferation kann durch Markieren oder teilweises Reinigen von T-Zellen, wie oben diskutiert, und unter Verwendung von Verfahren, die verwendet werden, um Zellproliferation im allgemeinen zu detektieren, bewerkstelligt werden. Ein solches Verfahren umfaßt die Markierung neu synthetisierter DNA durch Kultivieren der T-Zellen in der Gegenwart von detektierbaren Nukleinsäurevorläufermolekülen, die durch lebende Zellen in die naszierende DNA aufgenommen werden können. Solche Vorläufer umfassen ³H-Thymidin und weitere radioaktiv markierte Vorläufer und BrdU und andere in geeigneter Weise detektierbare nicht-radioaktive Vorläufer. Wenn radioaktiv markierte Vorläufer verwendet werden, werden nicht aufgenommene Vorläufer abgewaschen, und die Mengen der aufgenommenen Vorläufer werden mittels Autoradiographie, Szintillationszählung oder anderer konventioneller Verfahren der Quantifizierung von Strahlung gemessen.
Wenn BrdU und dergleichen verwendet werden, werden nicht aufgenommene Vorläufer abgewaschen, und Antikörper oder andere Reagenzien, die spezifisch an den Vorläufer binden können, werden verwendet, um Vorläufer zu detektieren, der in nukleare DNA aufgenommen wurde. Zusätzlich können Reagenzien, die metabolisch aktive Zellen markieren, verwendet werden, um Zunahmen der Zellenzahl zu verfolgen. Solche Reagenzien umfassen MTT, XTT, MTS und WST-1, die durch mitochondriale Enzyme aufgespalten werden, wodurch Produkte erhalten werden, die leicht detektiert und spektrophotometrisch gemessen werden können, wobei die Menge an so gemessenen Spaltungsprodukten proportional zur Anzahl an metabolisch aktiven Zellen in der getesteten Probe ist. Solche Reagenzien sind von vielen Quellen kommerziell erhältlich.
Auf dem Gebiet sind zahlreiche Zelloberflächenmarker von T-Zell-Aktivierung bekannt und werden im allgemeinen durch Antikörper (die von zahlreichen Quellen kommerziell erhältlich sind) unter Verwendung konventioneller immunhistochemischer und/oder FACS-Techniken detektiert. Diese Marker umfassen CD25 (den IL-2-Rezeptor), CD26, CD30, CD69 und CD71 (den Transferrin-Rezeptor).
Die T-Zell-Aktivierung kann auch durch Messung der Zytokinfreisetzung in Kulturmedium detektiert werden (siehe beispielsweise Correale et al., 1995). Inaktive T-Zellen setzen keine Zytokine frei, während wenigstens einige aktive T-Zellen IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, Gamma-Interferon, TNF-alpha und das TNF-verwandte Zytokin, bekannt als der FAS-Ligand, freisetzen. Zusätzlich kann die T-Zell-Aktivierung durch T-Zell-Oberflächenexpression von aktivierungsspezifischen Markern, einschließlich CD95 (dem FAS-Rezeptor), detektiert werden. Antikörper zum Detektieren jedes dieser Zytokine und Marker sind auf dem Gebiet gut bekannt und kommerziell erhältlich; Tests unter Verwendung solcher Antikörper zur Messung von Zytokinen, z. B. in Kulturmedium, sind auf dem Gebiet ebenfalls gut bekannt und Handelsgegenstände.
Ein besonders empfindlicher Test für die T-Zell-Aktivierung ist der kürzlich entwickelte enzymgekoppelte Immunspot-(ELISPOT-)Test, der typischerweise Zytokinfreisetzung durch einzelne T-Zellen als Punkte auf einem Antikörper-beschichteten Substrat, auf dem die T-Zellen kultiviert werden, detektiert. Solche Tests sind in Taguchi et al., 1990, und Sun et al., 1991, beschrieben. Bevorzugt wird der ELISPOT-Test verwendet, um die Sekretion von Gamma-Interferon zu detektieren.
Materialien und Verfahren zum Bestimmen, ob zelluläre Morbidität ein Ergebnis eines stattfindenden Prozesses von Apoptose ist, sind Fachleuten auf dem Gebiet ebenfalls gut bekannt. Zusätzlich zu konventionellen histochemischen Färbungen, die die Detektion von Apoptose-assoziierten Ultrastrukturmodifikationen erlauben, werden Apoptosedetektionsverfahren, einschließlich Tests und Färbungstechniken, auf dem Gebiet seit vielen Jahren verwendet. Diese Verfahren bestimmen typischerweise, ob der Zelltod vom aktiven Metabolismus (z. B. Proteinsynthese) abhängt oder ob sterbende Zellen DNA-Abbau (Fragmentierung) zeigen.
Der erstgenannte Verfahrenstyp umfaßt das Züchten von replizierten Kulturen, die sterbende Zellen enthalten, in Gegenwart oder Abwesenheit eines metabolischen Inhibitors, z. B. eines Proteinsyntheseinhibitors, wie Cycloheximid, eines RNA-Syntheseinhibitors, wie Actinomycin D, oder eines immunspezifischen Inhibitors, wie Cyclosporin, und das Bestimmen, ob eine solche Inhibition den Zelltod verzögert; ist dies der Fall, ist es nahezu sicher, daß Apoptose beteiligt ist. Siehe beispielsweise Dhein et al., 1995, worin Zelltod als die Fähigkeit des Farbstoffs Propidiumiodid, in die Zelle einzutreten, detektiert wird.
Verfahren für die Detektion von DNA-Fragmentierung können die Isolierung und Größentrennung von DNA, typischerweise mittels Phenolextraktion und Gelelektroforese, umfassen. Eine neuere Technik umfaßt die Verwendung des Enzyms terminale Desoxynukleotidyltransferase ("TdT" oder "terminale Transferase"), eines geeigneten Puffers (z. B. Cacodylatpuffer, der ein Kobaltsalz und ein Reduktionsmittel, wie DTT, DTE oder BME, enthält) und eines markierten Desoxynukleotidtriphosphats (dNTP) oder eines markierten Derivats oder eines Analogen davon (z. B. BrdUTP, ein biotinyliertes dNTP, ein Digoxigenin-markiertes dNTP oder ein radioaktiv markiertes dNTP, gemeinsam bezeichnet als ein "markiertes XTP").
TdT bringt markierte XTPs an freien Enden von DNA-Molekülen ein. Da der mit Apoptose assoziierte DNA-Abbau die Erzeugung vieler freier Enden im Vergleich zu einer viel kleineren Anzahl in gesunden Zellen umfaßt, zeigt die Aufnahme großer Mengen von markierten XTPs im Vergleich zu gesunden Zellen eine stattfindende Apoptose an. TdT-Verfahren zur Detektion von Apoptose umfassen daher die Detektion des aufgenommenen markierten XTP (für gewöhnlich nach dem Waschen der Zellen, um nicht aufgenommene markierte XTPs zu entfernen) typischerweise unter Verwendung konventioneller Techniken, wie Autoradiographie oder Immunhistochemie (z. B. unter Verwendung von Antikörpern gegen das markierte XTP – entweder markiert, z. B. fluoreszierend oder enzymatisch markierte Antikörper, oder gemeinsam mit markierten sekundären Antikörpern). Ein kommerzieller Kit für die Ausführung dieses Verfahrens ist von ONCOR, Inc., Gaithersburg, MD, als der "APOPTAG"-Kit erhältlich.
Eine weitere kürzlich entwickelte Technik umfaßt einen ELISA unter Verwendung eines Anti-Histon-Einfangantikörpers und eines Anti-DNA-Detektionsantikörpers. Dieser Test ist von der konventionellen Abtrennung von intaktem Chromatin von fragmentiertem Chromatin abhängig, wobei die Mengen von so abgetrenntem fragmentiertem Chromatin durch den oben genannten ELISA gemessen werden. Ein kommerzieller Kit für die Ausführung dieses Verfahrens ist von Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN, als der "Zelltod-Detektions"-Kit erhältlich.
B. Behandlung
Hinsichtlich der Behandlung unter Verwendung der MBP-Polypeptide der Erfindung sei angemerkt, daß die MBP-21,5-Polypeptide der Erfindung (z. B. MBP + X2^Ser81) verschiedene Vorteile im Vergleich zu nicht vom Menschen abgeleiteten MBP-Antigenen haben, die bei früheren Ansätzen zum Erhalten von Antigentolerisierung in MS-Patienten verwendet wurden. Solche Vorteile umfassen die Aufnahme des vollen Spektrums von MBP-immundominanten Regionen und die daraus folgende Fähigkeit dieser Polypeptide, Toleranz in T-Zellen, die mit irgendwelchen solchen MBP-immundominanten Regionen reaktiv sind, zu induzieren.
Die intraantigene und die interantigene Ausbreitung von Autoreaktivität sind verwandte Phänomene, die mit Autoimmunerkrankungen assoziiert sind, bei welchen zusätzliche Epitope innerhalb eines Antigens oder zusätzliche Antigene innerhalb eines Zielgewebes während der Progression der Erkrankung von autoreaktiven T-Zellen angezielt werden. Eine solche Antigen ausbreitung wurde im Verlauf des inflammatorischen Autoimmunprozesses in den Mausmodellen von experimenteller allergischer Enzephalomyelitis (EAE) und insulinabhängigem Diabetes beobachtet (Lehmann et al., 1992; McCarron et al., 1990; Kaufman et al., 1993; Tisch et al., 1993).
Diese Erkenntnisse zur Antigenausbreitung sowie die Demonstration von Variabilität in den immundominanten Epitopen, die durch MBP-reaktive aktivierte T-Zellen in MS-Patienten erkannt werden, deuten darauf hin, daß eine effektive MBP-spezifische Therapie auf eine heterogene Population von MBP-spezifischen autoreaktiven T-Zellen gerichtet sein muß. Daher muß, damit die parenterale Verabreichung von MBP bei der Behandlung von MS ihre maximale Wirksamkeit erreicht, das gesamte Repertoire seiner immundominanten Epitope T-Lymphozyten präsentiert werden.
Gemäß bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung wird ein Medikament gemäß Anspruch 1 zur Behandlung eines an Multipler Sklerose leidenden Patienten bereitgestellt. Vorzugsweise umfaßt das PLP-Polypeptid das vollständige Repertoire an bekannten humanen immundominanten PLP-Epitopen. Das PLP-Polypeptid wird in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um eine Konzentration des Polypeptids in einem relevanten Kompartiment (d. h. Körperflüssigkeit oder Gewebekompartiment) im Körper des Patienten, z. B. dem Blut des Patienten, der Zerebrospinalflüssigkeit, der Lymphe, des retikuloendothelialen Systems, der Leber, den Lymphknoten, der Milz, dem Thymus und dergleichen, zu erreichen, die ausreichend ist, um Apoptose von PLP-reaktiven T-Zellen zu induzieren. Vorzugsweise wird das Polypeptid wiederholt wenigstens zweimal in einem Intervall von wenigstens zwölf Stunden und nicht mehr als vier Tagen zwischen den Verabreichungen an den Patienten verabreicht. Das Polypeptid wird vorzugsweise ohne die gleichzeitige Verabreichung eines Adjuvans verabreicht, so daß eher eine Toleranz als eine Verschlimmerung der Erkrankung resultiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Konzentration des PLP-Polypeptids in der Körperflüssigkeit oder dem Gewebekompartiment des Patienten, die ausreichend ist, um Apoptose von PLP-reaktiven T-Zellen zu induzieren, unter Verwendung der oben unter "Klinische Anwendungen" und "Detektion von T-Zell-Antworten" beschriebenen Materialien, Verfahren und Tests bestimmt. Eine Konzentration wird als ausreichend zur Induzierung von Apoptose von MBP- oder PLP-reaktiven T-Zellen angesehen, wenn nach der Behandlung in Reaktion auf das Polypeptid im Vergleich zu Kontrolltests, die unter Verwendung von irrelevanten Polypeptiden (z. B. Albumin) durchgeführt werden, eine wesentliche Verringerung der Anzahl an T-Zellen aus Peripherblut, die Antworten auf MBP- oder PLP-Epitope zeigen (die "Präkursor-Häufigkeit" oder der "reaktive T-Zellen-Index"), zu sehen ist (im Vergleich zu T-Zellen aus vor der Behandlung entnommenen Blutproben). Eine wenigstens 25%-ige Verringerung des reaktiven T-Zellen-Index umfaßt im allgemeinen eine "wesentliche Verringerung". Kleinere Verringerungen werden ebenfalls als "wesentlich" erachtet, wenn sie eine statistisch signifikante Verringerung darstellen, d. h. eine Verringerung, die, wenn sie durch einen statistischen Standardtest, wie den T-Test nach Student, analysiert wird, einen Wahrscheinlichkeitswert p von kleiner als oder gleich 0,05 und bevorzugt von kleiner als oder gleich 0,015 ergibt.
Alternativ kann die Konzentration des Polypeptids im Blut und/oder in der Zerebrospinalflüssigkeit des Patienten, die für die Induzierung von Apoptose von MBP- oder PLP-reaktiven T-Zellen ausreichend ist, durch routinemäßige in vivo-Experimente als die Menge bestimmt werden, die erforderlich ist, um den klinischen Verlauf zu stabilisieren oder die klinischen Symptome von EAE oder MS zu bessern.
Gemäß der Erfindung können auch PLP- und/oder MBP-21,5-Polypeptide verwendet werden, um Tolerisierung von PLP- und/oder MBP-reaktiven T-Zellen in einem MS-Patienten zu induzieren, indem die Verabreichung in einem Zeitplan erfolgt, der dafür ausgestaltet ist, Tolerisierung zu induzieren, ohne Apoptose zu induzieren (z. B. durch Induzieren von T-Zell-Anergie). Solche Zeitpläne werden typischerweise verwendet, um Patienten gegenüber Allergenen zu tolerisieren, und umfassen im allgemeinen die Verabreichung kleinerer Dosen (typischerweise im Bereich von Mikrogramm bis Hunderten Mikrogramm) des Tolerisierungsmittels (in diesem Fall des MBP-21,5-Präparats) auf einer wöchentlichen, zweiwöchentlichen oder monatlichen Basis.
Die Menge an verabreichtem Polypeptid, die ausreichend ist, um eine gewünschte Konzentration des Polypeptids in einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebekompartiment des Patienten zu erzielen, kann aus routinemäßigen menschlichen und tierischen Untersuchungsdaten unter Verwendung von standardmäßigen pharmakokinetischen Berechnungen, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, leicht bestimmt werden. Anfängliche in vivo-Studien werden in Mäusen durchgeführt, die behandelt wurden, um EAE zu induzieren. Vorzugsweise wird die Dosis an Polypeptid anschließend in einem Primaten, z. B. einem menschlichen Patienten oder einem Krallenaffen (einem Affen, von dem bekannt ist, daß er MBP-reaktive T-Zellen in seinem Peripherblut hat), bestimmt. Vorzugsweise ist die Dosierung so eingestellt, daß eine klinische Verbesserung (vorzugsweise in Tieren) oder eine wesentliche Verringerung der Anzahl an T-Zellen aus Peripherblut, die Reaktionen auf MBP- oder PLP-Epitope zeigen, erzielt wird.
Die Dosis variiert auch in Abhängigkeit von der Art der Verabreichung, den bestimmten Symptomen des behandelten Patienten, der Gesundheit insgesamt, dem Zustand, der Größe und dem Alter des Patienten und der Einschätzung des verordnenden Arztes.
In Abhängigkeit von der Einschätzung des Arztes umfaßt eine typische therapeutische Behandlung eine Reihe von Dosen, die üblicherweise unter gleichzeitiger Überwachung der klinischen Schwere der Erkrankung und des reaktiven T-Zellen-Index verabreicht werden.
Die Verabreichung der Polypeptide erfolgt im allgemeinen auf einem intravaskulären Weg, z. B. mittels intravenöser Infusion durch Injektion. Weitere Verabreichungswege (z. B. subkutane Injektion, intradermale Injektion, intramuskuläre Injektion, inhaliertes Aerosol, oral, nasal, vaginal, rektal und dergleichen) können wie durch den Arzt bestimmt verwendet werden, falls dies gewünscht ist.
Zur Injektion geeignete Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Aufl. (1985) zu finden. Solche Formulierungen müssen steril und nicht-pyrogen sein und enthalten im allgemeinen einen pharmazeutisch wirksamen Träger, wie Kochsalzlösung, gepufferte (z. B. phosphatgepufferte) Kochsalzlösung, Hanksche Lösung, Ringer-Lösung, Dextrose/Kochsalzlösung, Glucoselösungen und dergleichen. Die Formulierungen können nach Erfordernis pharmazeutisch verträgliche zusätzliche Substanzen, wie die Tonizität einstellende Mittel, Netzmittel, bakterizide Mittel, Konservierungsmittel, Stabilisatoren und dergleichen, enthalten.
Die Formulierungen der Erfindung können als Herstellungsgegenstände vertrieben werden, die Verpackungsmaterial und die Polypeptide umfassen. Das Verpackungsmaterial beinhaltet eine Markierung, die anzeigt, daß die Formulierung zur Verwendung bei der Behandlung von neurologischer Erkrankung bestimmt ist, und kann sich spezifisch auf Multiple Sklerose beziehen.
Ohne sie in irgendeiner Weise beschränken zu wollen, wird die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele vollständiger beschrieben.
BEISPIELE
Konstruktion von Bakterienvektoren, die die Expression von MBP-21,5-Polypeptiden und nativem MBP18,5 regulieren
Eine cDNA voller Länge, die die 18,5 kDa-Isoform von humanem MBP codiert, wurde von der ATCC (#5748; ATCC, Rockville, MD) erhalten. Plasmid-pHBP-1 wurde als Matrize in einer PCR-Standardreaktion unter Verwendung von AmpliTaq (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) für 30 Zyklen mit Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Annealen bei 52°C für 1 Min. und Verlängerung bei 72°C für 1 Min. verwendet. Der Sense-Oligonukleotidprimer (5'-CATATGGCGT CACAGAAGAG AC-3', SEQ ID NO: 13) codiert den N-Terminus von hMBP18,5 (MASQKR) und enthält eine NdeI-Klonierungsstelle, wohingegen der Antisense-Primer (5'-GGATCCTTAG CGTCTAGCCA TGGGTG-3', SEQ ID NO: 14) die C-terminalen Reste (PMARR) codiert und eine BamHI-Klonierungsstelle enthält. Nach einer zusätzlichen Verlängerung bei 72°C für 10 Min. wurde das resultierende 526 Basenpaar-(bp-)Fragment in pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) subkloniert, wie vom Hersteller beschrieben. Kanamycin-resistente E. coli-DH10B-(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)Transformanten wurden ausgewählt, und das Insert wurde mittels Restriktionsanalyse identifiziert und mittels Didesoxysequenzanalyse verifiziert. Die MBP-Codierungsregion wurde in die NdeI- und XhoI-Stellen des Phagen-T7-Promotorplasmids pET14b (Novagen, Madison, WI) subkloniert und später erneut in pET22b (Novagen, Madison, WI) kloniert. Das resultierende rekombinante MBP18,5-Gen enthält nur unmodifizierte native Codons, mit Ausnahme einer zusätzlichen aus 18 Nukleotiden bestehenden Sequenz, die eine Histidinmarkierung am 3'-Ende (unmittelbar vor dem Terminationscodon) codiert, die in dem nativen humanen MBP18,5-Protein nicht zu finden ist und hinzugefügt wurde, um die Reinigung des Produkts dieses MBP18,5^hum.-Gens zu vereinfachen. Der resultierende rekombinante Vektor (pET22b/MBP18,5^hum.) wurde in E. coli BL21(DE3) (Novagen, Madison, WI) transformiert, wo das DE3-Lysogen das Gen für T7-Polymerase hinter dem E. coli-lacUV5-Promotor enthält (Studier et al., 1990).
Ein synthetisches rekombinantes Gen, welches die 21,5 kDa-Isoform von humanem MBP codiert, wurde in drei Runden überlappender PCR konstruiert (Ho et al., 1989) (siehe 13). Jede von drei Genteildomänen wurde in einer 100 μl-Reaktion unter Verwendung von 5 pmol von jedem aus dem geeigneten Paar von HPLC-gereinigten Oligonukleotiden und 0,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer) synthetisiert. Dreißig Zyklen der Denaturierung für 1 Minute bei 95°C, Annealen bei 50°C für 1 Minute und DNA-Strangverlängerung bei 72°C für 1 Minute wurden durchgeführt. Fünf Prozent von jedem gereinigten PCR-Fragment wurden dann als Matrize in einer zweiten Runde von PCR verwendet, wo zwei Teildomänen unter Verwendung flankierender Oligonukleotide vereinigt wurden. Die Reinigung dieser DNA-Fragmente und eine dritte Runde von PCR führten zu einer Vervielfältigung eines 648bp-Produkts. Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und HindIII verdaut, in pBS(-) subkloniert und in E. coli XL-1 Blue (Stratagene, LaJolla, CA) transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt, und die gewünschten Konstrukte wurden mittels Restriktions- und Sequenzanalyse identifiziert. Restriktionsfragmente aus mehreren unabhängigen Klonen wurden vereinigt, um unerwünschte Mutationen zu entfernen, die während der PCR-Klonierung auftraten, und das resultierende MBP + X2^Cys81/Bakt.-Gen wurde an den NdeI- und HindIII-Stellen in pET22B kloniert.
Ein verändertes Gen, welches eine Cystein-zu-Serin-Substitution an Aminosäurerest 81 der 21,5 kDa-Isoform von humanem MBP codiert, wurde durch die folgenden Stufen konstruiert. PCR-Vervielfältigung eines internen MBP-Fragments wurde unter Verwendung von pET22b/MBP21,5^hum ^. als Matrize zusammen mit dem mutagenen Antisense-Primer (5'-GTCTTTGTAC ATGTTCGACA GGCCCGGCTG GCTACG-3', SEQ ID NO: 15, Ser⁸¹-Codon unterstrichen, NspI-Stelle kursiv) in Kombination mit einem Sense-Oligonukleotidprimer (5'-CAGCACCATG GACC-3', SEQ ID NO: 16, NcoI-Stelle kursiv) durchgeführt. Das NspI-NcoI-Restriktionsfragment in MBP + X2^Cys81/Bakt. wurde dann gegen das mutierte Fragment ausgetauscht, um MBP+X2^Ser81/Bakt. zu erzeugen.
Durch die Verwendung des MBP18,5^hum ^.-Gens als Matrize in überlappender PCR wurde eine Version von MBP + X2^Cys81 mit nativen humanen Codons erzeugt. Ein PCR-Fragment, welches die humane Exon 2-Sequenz enthält, wurde aus pET22b/rhMBP18,5 unter Verwendung des Sense-Oligonukleotids 5'-GGTGCGCCAA AGCGGGGCTC TGGCAAGGTA CCCTGGCTAA AGCCGGCCG GAGCCCTCTG CCCTCTCATG CCCGCAGCCA GCCTGGGCTG TGCAACATGT ACAAGGACTC ACACCACCCG GCAAGAAC-3', SEQ ID NO: 17, in Kombination mit einem Antisense-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 18), welches an den T7-Terminator von Plasmid pET22b hybridisiert, erzeugt. Ein zweites PCR-Fragment wurde unter Verwendung der gleichen Matrize, jedoch mit einem T7-Promotor-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 19) in Kombination mit einem Antisense-Oligonukleotid (5'-GGCTTTAGCC AGGGTACCTT GCCAGAGCCC CGCTTTGGC-3', SEQ ID NO: 20), welches an das 5'-Ende von Exon 2 hybridisierte, erzeugt. Die Fusion beider PCR-Produkte durch Vervielfältigung mit T7-Promotor- und -Terminator-Oligonukleotiden in einer zweiten Runde von PCR vervollständigte die Konstruktion eines PCR-Produkts, welches das MBP + X2^Cys81/hum.-Gen enthält. Ein aus diesem PCR-Produkt erhaltenes Restriktionsfragment wurde dann an den NdeI- und HindIII-Stellen in pET22b subkloniert, und die Selektion des gewünschten Klons wurde mittels Sequenzanalyse bestätigt.
Bakterielle Expression und Identifikation von rekombinantem MBP
Für die Expression von rekombinanten MBP-Polypeptiden wurde E. coli-Stamm BL21(DE3) mit den Expressionsplasmiden und Ampicillin-resistenten Kolonien, ausgewählt und gezüchtet in Terrific-Broth-(TB-)Medium (Sambrook et al., 1989) zu einer OD₆₀₀ von 0,6 transformiert. Die Proteinexpression wurde für 4 Stunden mit 1 mM Isopropylthiogalactosid (IPTG) induziert. Analytische Charakterisierung von rekombinant exprimierten MBP-Polypeptiden wurde durch Entfernen von 1 ml induzierter Zellen bei einer OD₆₀₀ von 1,5 durchgeführt. Zellpellets wurden durch Kochen in 100 μl 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, lysiert, wobei 10% des Lysats mittels 16%-iger SDS-PAGE analysiert wurden (Novex, San Diego, CA). Rekombinant exprimierte MBP-Polypeptide wurden entweder durch Coomassie R-250-Färbung oder Immunblotten mit monoklonalen Rattenantikörpern, die entweder für die aminoterminalen Reste 36–50 von humanem MBP, entsprechend MBP Exon 1 (MCA 408, SeroTec, Indianapolis, IN), oder die carboxyterminalen Reste 129–138, entsprechend MBP-Exon 6 (MCA 70, SeroTec, Indianapolis, IN), spezifisch waren, identifiziert.
Für die Fraktionierung von E. coli-Zellen in lösliche und unlösliche Fraktionen wurden Zellpellets von zwei ml jeder induzierten Kultur bei einer OD₆₀₀ von 1,5 gesammelt und in 400 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, resuspendiert. Um ein Gesamtzelllysat herzustellen, wurde die Suspension mit Lysozym auf 100 mg/ml und mit Phenylmethylsulfonylfluorid auf 1 mM gebracht, dann bei 30°C für 15 Minuten inkubiert. Darauf folgten die Zugabe von 10 mM MgCl₂ und 200 mg/ml DNase I (Sigma, St. Louis, MO) und Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Das Zelllysat wurde geteilt; eine Hälfte erhielt zusätzlichen Tris-Puffer, und die andere Hälfte wurde auf 0,1 N HCl gebracht und bei Raumtemperatur für 30 Minuten extrahiert. Nach der Zentrifugation wurde der lösliche Überstand aus dem unlöslichen Pellet entfernt, und jede Fraktion wurde für 5 Minuten in SDS-enthaltendem Beladungsfarbstoff gekocht. SDS-PAGE-Gele von 20% von jeder Fraktion wurden hinsichtlich rekombinant exprimierter MBP-Polypeptide wie oben beschrieben analysiert.
Reinigung und Charakterisierung von rekombinanten MBPs
Für die Reinigung von rekombinant exprimierten MBP-Polypeptiden wurden 1 l-Kulturen von induzierten Zellen mittels Zentrifugation geerntet, und die Pellets wurden in 10 ml/g (10% w/v) 0,1 N HCl unter Verwendung eines TEKMAR-Homogenisierers (The Tekmar Co., Cincinnati, OH) homogenisiert. Die Zellen wurden durch 3 Durchläufe (bei 10.000 psgi mit Stickstoff) durch einen MICROFLUIDIZER (Modell M110-T, Microfluidics Corp., Newton, MA) mechanisch aufgebrochen, wobei alle Manipulationen auf Eis durchgeführt wurden. Die lösliche Fraktion, die rekombinant exprimiertes MBP enthielt, wurde nach der Zentrifugation des Zelllysats bei 10.000 × g für 30 Min. bei 4°C in einem Beckman JA-10-Rotor als Überstand gesammelt. Der Überstand wurde durch eine WHATMAN POLYCAP TF (0,45 μm)-Membran (Whatman LabSales, Hillsboro, OR) filtriert und unter Verwendung einer PM-10-Membran in einer AMICON-Rührzellenvorrichtung (Amicon, Beverly, MA) 5- bis 10-fach konzentriert. Teilchenförmige Stoffe wurden durch Hindurchleiten durch einen MILLEX GV (0,2 mm)-Spritzenfilter (Millipore Corporation, Redford, MA) aus der konzentrierten Fraktion entfernt, und die gefilterte Probe wurde bei 4,1 ml/Minute auf eine VYDAC C4-Umkehrphasensäule (1,0 cm Durchm./25 cm Länge, VYDAC, Hesperia, CA) geladen. Proteine wurden unter Verwendung eines linearen 25–40% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure(TFA)-Gradienten für 30 Minuten eluiert, dann lyophilisiert.
Für die Reinigung von rekombinant exprimierten MBP-Polypeptiden wurde das lyophilisierte Material in Bindungspuffer (8 M Harnstoff, 10 mM Beta-Mercaptoethanol, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0) resuspendiert und gemäß den Anleitungen des Herstellers (Qiagen Inc., Chadsworth, CA) an Ni-NTA-Harz gebunden. Die Säule wurde zweimal mit demselben Bindungspuffer gewaschen, und kontaminierende E. coli-Proteine wurden mit Bindungspuffer, der auf einen pH-Wert von 6,3 (Waschschritt 3) eingestellt war, entfernt. rhMBP wurde mit einem Stufengradienten eluiert, der Bindungspuffer bei einem pH-Wert von 5,9 (Elution 1) und einem pH-Wert von 4,5 (Elution 2) und schließlich 6 M Guanidinhydrochlorid, 0,2 M Essigsäure (Elution 3) enthielt. Alle Fraktionen und ein Teil des Säulenharzes wurden mittels 16%-iger SDS-PAGE in Gegenwart eines Reduktionsmittels analysiert.
MBP-Polypeptide wurden unter Verwendung eines schnellen analytischen Umkehrphasen-HPLC-Tests quantifiziert. Eine 4,6 × 50 mm-C18-Säule (C18 HYTACH, Glycotech, Branford, CT) wurde verwendet, und Tests wurden bei 80°C in ähnlicher Weise durchgeführt wie die von Kalghatgi und Horvath, 1987, beschriebene HPLC. Rekombinant exprimierte MBP-Polypeptide wurden mit 0,1 N HCl aus zerstörten Zellen extrahiert und unter Verwendung eines linearen 10–30% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure(TFA)-Gradienten über 1 Minute auf der C18-HYTACH-Umkehrphasensäule fraktioniert. Im linearen Testbereich ist die Messung der Höhe des MBP-Polypeptid-Peaks direkt proportional zu der Menge an MBP-Polypeptid. Die Konzentration eines MBP + X2^Cys81-Standards wurde anhand der Aminosäurezusammensetzung bestimmt. Das Molekulargewicht für MBP + X2^Cys81 wurde mittels Massenspektrophotometrie mit 22.188 Dalton bestimmt. N-terminale Sequenzierung des gereinigten MBP + X2^Cys81-Proteins ergab die Aminosäuresequenz Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg, entsprechend den ersten 25 Aminosäuren, die aus der Nukleotidsequenz von MBP + X2^Cys81/hum. (SEQ ID NO: 1) vorhergesagt wurden.
Etablierung von MBP18,5- und Exon 2-spezifischen T-Zellinien und Proliferationstests
Natives humanes MBP wurde wie zuvor beschrieben hergestellt (Voskuhl et al., 1993a). MBP-Exon 2-codiertes synthetisches Peptid wurde von Synthecell Corp. (Rockville, MD) erworben und hatte eine Reinheit von mehr als 95%, bestimmt mittels HPLC-Analyse. Peripherblutlymphozyten wurden mittels Leukapherese und Abtrennung auf FICOLL-Gradienten isoliert. Die Zellen wurden dann in RPMI 1640 (Whittaker Bioproducts, Walkersville, MD) mit 10% DMSO kältekonserviert und in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung gelagert. T-Zellinien wurden unter Verwendung einer beschränkenden Zellkonzentration, wie zuvor beschrieben, erzeugt (Voskuhl et al., 1993a). 2A2 und 3H5 sind humane T-Zellinien, die von normalen Individuen erhalten wurden. 1H7, 1G1 und 3A11 sind humane T-Zellinien, die von MS-Patienten erhalten wurden und für die Exon 2-codierte Region von MBP spezifisch sind. Nach der letzten Restimulation ließ man die T-Zellinien für 10 Tage ruhen, dann wurden sie in einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/ml als Responder verwendet. Autologe bestrahlte (3000 rad) Peripherblutlymphozyten (PBL) wurden als Stimulatoren in einer Konzentration von 1 × 10⁶/m1 verwendet. Fünfzig Mikroliter von sowohl Responder- als auch Stimulatorzellen wurden in jedem Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit rundem Boden (Nunc, Roskilde, Dänemark) mit 100 μl des bestimmten MBP-Antigens oder mit Medium alleine gemischt. Für die rekombinanten MBPs wurden lyophilisierte Präparate aus der Umkehrphasen-HPLC-Reinigung in einer Konzentration von 8–10 mg/ml in PBS resuspendiert, dann unmittelbar vor der Verwendung mit Medium verdünnt. Tests erfolgten dreifach und wurden in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM, Gibco, Grand Island, NY), enthaltend 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin (alle Whittaker Bioproducts, Walkersville, MD), ergänzt mit 10% gepooltem humanem Serum (erhalten von 4–7 normalen AB-NIH-Blutbankspendern, vor Gebrauch hitzeinaktiviert und sterilfiltriert), durchgeführt. Die Kulturen wurden für 72 h bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Während der letzten 18 h des Kultivierens wurden die Zellen mit 1 mCi/Well ³[H]-Thymidin gepulst und auf Glasfaserfiltern geerntet, und die Thymidinaufnahme wurde mittels Szintillationszählung gemessen.
Konstruktion und bakterielle Expression von rekombinanten humanen MBP-Genen
Ein synthetisches Gen wurde so konstruiert, daß es die fötale Isoform von adultem humanem MBP (21,5 kDa-Isoform, MBP + X2^Cys81) codierte (siehe 1 und 2). Während andere typischerweise synthetische Gene konstruierten, indem sie zahlreiche Oligonukleotide ligierten, die die kompletten Sense- und Antisense-Stränge einer bestimmten codierenden Region umfassen (Jayarman et al., 1991; Williams et al., 1988; Hernan et al., 1992; Wosnick et al., 1987), wurden hier nur sechs Oligonukleotide (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10) verwendet, um das 644 bp-Gen, welches rekombinantes humanes MBP + X2^Cys81 codiert, zu synthetisieren. Die Größe der HPLC-gereinigten Oligonukleotide lag im Bereich von 110 bis 130 bp, mit 20–25 bp-Überlappungsregionen, die für die Hybridisierung von Sense- und Antisense-Strängen während 3 Runden von PCR (13) ausgestaltet sind. Für eine optimale bakterielle Expression des rekombinanten MBP-Gens wurden viele der humanen Codons auf Basis von Codonpräferenztabellen, die für alle bekannten (Wada et al., 1992) oder hochgradig exprimierten (Grosjean und Fiers, 1982) E. coli-Gene erstellt wurden, in bevorzugte bakterielle Codons umgewandelt. Signifikante Codonveränderungen wurden verwendet, insbesondere für diejenigen, die Arginin, Prolin und Lysin codieren, welche 26% der Aminosäurereste in MBP21,5 ausmachen.
Mehrere unabhängige Klone wurden sequenziert, und jeder hatte mehrere Nukleotidsubstitutionen oder -deletionen, die entweder einer Abstoßung der synthetischen DNA durch den bakteriellen Klonierungsstamm oder auf PCR basierenden Fehlern zugeschrieben wurden. Alle dieser Fehler wurden korrigiert, mit Ausnahme von Cytosin-zu-Thymin-Substitutionen, die an den Nukleotidpositionen 462, 528 und 532 identifiziert wurden. Diese Veränderungen wurden nicht korrigiert, da sie die codierte MBP + X2^Cys81-Aminosäuresequenz konservieren und für die bakterielle Codonpräferenz nicht nachteilig sind (Wada et al., 1992). Für die rekombinante Expression der von adultem menschlichem Gehirn abgeleiteten (18,5 kDa-) Isoform von MBP wurde ein cDNA-Klon mit nativen humanen Codons, die diese Isoform codieren (MBP18,5^/hum., codiert MBP18,5), mittels PCR so modifiziert, daß er die geeigneten Restriktionsstellen für eine Klonierung in den gleichen Expressionsvektor enthielt.
Die Expression von rekombinanten MBP-Polypeptiden in Bakterien wurde anfangs unter Verwendung von Schüttelkolbenkulturen in kleinem Maßstab, die in reichem TB-Medium kultiviert wurden, charakterisiert. Nach Induzieren der 10 ml-Kulturen mit IPTG wurden beide rekombinante Formen von MBP in BL21(DE3)-Zellen in hohem Maße exprimiert. MBP18,5 und MBP + X2^Cys81 waren die Hauptproteine, die mittels Färbung aller bakterieller Proteine, die mittels SDS-PAGE mit Coomassie-Farbstoff abgetrennt worden waren, identifiziert wurden (14, "Coom"), und wurden durch Antikörper, die entweder auf den Carboxy- (14, "C-term Ab") oder den "Amino- (14, "N-term Ab") Terminus von humanem MBP gerichtet waren, spezifisch erkannt. Zwei kleinere MBP-immunreaktive Polypeptide (zwischen 6–16 kDa) konnten in dem MBP + X2^Cys81-Lysat identifiziert werden, jedoch nur mittels Immunoblot-Analyse mit dem N-terminalen Antikörper, was darauf hinweist, daß eine vorzeitige Termination der Translation in der Nähe des Carboxyterminus und nicht Proteolyse für ihr Vorliegen verantwortlich war. Dies wurde in Pulse-Chase-Markierungsexperimenten (Verdrängungsversuche) bestätigt, die zeigten, daß die kleineren Polypeptide im Verlauf des Experiments stabil waren.
Obwohl Einschlußkörper in Schüttelkolbenkulturen nicht ersichtlich waren, wurden rekombinante MBPs in der unlöslichen Fraktion von lysierten Bakterienzellen beobachtet (15, "Tris"). Zuvor wurde gezeigt, daß ein aus Rinderrückenmark gereinigtes homogenes Protein enzephalitogene Aktivität aufweist und bei einem pH-Wert von 2–3 löslich ist (Einstein et al., 1962). Dieses enzephalitogene Protein wurde anschließend als MBP identifiziert und besteht nahezu ausschließlich aus der 18,5 kDa-Isoform (Deibler et al., 1972). Da MBP in Säure löslich ist, folgerten wir, daß es eventuell möglich ist, die Reinigung durch direkte Säureextraktion von Bakterien lysaten zu rationalisieren. Wir versuchten daher, rhMBPs unter sauren Bedingungen löslich zu machen. Die Behandlung der gesamten zellulären Lysate mit 0,1 N HCl (15, "Säure") setzte die meisten der rhMBPs in die lösliche Fraktion (S) frei. Das Unvermögen, alle rhMBPs aus der unlöslichen Pelletfraktion (P) zu extrahieren, kann auf eine unvollständige Lyse der Zellen während dieser bestimmten Probenherstellung zurückzuführen sein.
Reinigung und Charakterisierung von MBP-Polypeptiden
Für die Reinigung von rekombinant exprimierten MBP-Polypeptiden wurden Zellen aus 1 l-Schüttelkolbenkulturen unter den oben beschriebenen sauren Bedingungen mechanisch aufgebrochen. Nach der gleichzeitigen Zellzerstörung und Säureextraktion waren alle rekombinant exprimierten MBP-Polypeptide in der löslichen Fraktion zu finden (16, "lös."). Die lösliche Säurefraktion wurde direkt auf eine VYDAC C4-Umkehrphasensäule aufgebracht, und rhMBPs eluierten als ein einziger, scharfer Peak bei 17–20 Min. mit einem 25–40% Acetonitril/0,1% TFA-Gradienten (17). Die N-terminale Sequenzierung der Peakfraktion verifizierte die korrekte aminoterminale Sequenz für die MBP-Polypeptide wie oben beschrieben. Das vorhergesagte Molekulargewicht von MBP + X2^Cys81 mit einer zusätzlichen carboxyterminalen Histidinmarkierung stimmte mit der Masse von 22.185 Dalton überein, die mittels massenspektrophotometrischer Analyse der Peakfraktion erhalten wurde. Coomassie-gefärbte Gele der gepoolten Peakfraktionen identifizierten die rekombinanten MBP-Polypeptide, zeigten jedoch auch ein heterogenes Gemisch aus stumpfendig gemachten MBP-Fragmenten, die offenbar durch beschränkte Säurehydrolyse von MBP-Polypeptiden voller Länge erzeugt wurden (18, "Ladung"). Durch Ausnutzen der C-terminalen Histidinmarkierung wurde MBP-Material voller Länge durch Metallchelatchromatographie unter Verwendung von denaturierenden Bedingungen und sauren pH-Elutionen erhalten (18). Die Mehrheit der MBP-Polypeptide voller Länge eluierte entweder mit Elution 2 (8 M Harnstoff, 10 mM Beta-Mercaptoethanol, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 4,5) oder Elution 3 (6 M Guanidinhydrochlorid, 0,2 M Essigsäure), obwohl kontaminierende E. coli-Proteine in dem Eluat aus der weniger stringenten zweiten Elution beobachtet wurden (18, "Elution 2").
Um die Expression von MBP+X2^Cys81/Bakt. mit der von MBP18,5^/hum. mengenmäßig zu vergleichen, wurden lösliche Säurelysate aus drei Sätzen von Ein-Liter-Bakterienkulturen hergestellt und unter Verwendung des oben beschriebenen schnellen analytischen Umkehrphasen-HPLC-Tests analysiert. Unter Verwendung einer Standardmenge von MBP + X2^Cys81, bestimmt mittels Aminosäureanalyse, und Inbeziehungsetzen der Peakhöhe mit der Proteinkonzentration beobachteten wir, daß aus dem synthetischen MBP + X2^Cys81/Bakt.-Gen im Vergleich zu der Expression aus dem MBP18,5^/hum.-Gen 1,5- bis 2,0-mal mehr MBP-21,5-Polypeptid exprimiert wurde. Das mittlere Expressionsniveau von rekombinantem Protein aus MBP-Genen mit bakteriellen Codons betrug 50 mg/l im Vergleich zu 30 mg/l aus Genen mit humanen Codons. Dies spiegelt eine bakterielle Codonpräferenz und nicht eine Auswirkung von mit Exon 2 verwandten Sequenzen wider, da ein Stamm, der das MBP + X2^Cys81/hum.-Gen exprimierte, eine ähnliche Menge an MBP-Polypeptid erzeugte wie der Stamm, der MBP18,5^/hum. exprimierte (siehe 19 und Tabelle 5).
Unter physiologischen Bedingungen bildete eine Fraktion von MBP + X2^Cys81, nicht jedoch von MBP18,5, ein offensichtliches dimeres Molekül, welches durch Coomassie-Färbung und Western-Blotten von nicht-reduzierten Proben auf SDS-PAGE-Gelen identifiziert wurde. Dimere werden unter ähnlichen Bedingungen mit reduzierten Proben nicht beobachtet. MBP-Dimere wurden auch nach Umkehrphasen-HPLC-Fraktionierung von Myelinproteinen aus Rinder-ZNS beobachtet (van Noort et al., 1994).
Solche Dimere sind in einem Proteinpräparat, welches für die pharmazeutische Verabreichung formuliert werden soll, besonders unerwünscht, da für einen solchen Gebrauch solche Proteine im allgemeinen als einzelne molekulare Einheiten mit definierten Charakteristika, einschließlich eines eindeutigen Molekulargewichts, bevorzugt sind. Es war somit wichtig, ein Mittel auszugestalten, durch das einzelne monomere Formen von MBP-21,5-Polypeptiden in geeigneter und effizienter Weise hergestellt werden konnten. Um zu testen, ob die Dimerbildung von MBP + X2^Cys81 durch den einzelnen Cysteinrest an Position 81 (Cys⁸¹) von Exon 2 vermittelt wurde, wurde das Cystein (Cys⁸¹) mittels ortsgerichteter Mutagenese in ein Serin (Ser⁸¹) umgewandelt.
Umkehrphasen-HPLC zeigte, daß MBP+X2^Ser81 in Bakterien in einer ähnlichen Menge exprimiert wurde wie MBP + X2^Cys81 (im Durchschnitt 50 mg/l, siehe 19) und in physiologischer Lösung ohne Reduktionsmittel monomerisch blieb. Als alternatives Verfahren zum Testen einer solchen Aminosäuresubstitution hinsichtlich einer effektiven Eliminierung von Dimerbildung können X2MBP-Peptide hergestellt und in physiologischer Lösung ohne Reduktionsmittel hinsichtlich Dimerbildung getestet werden.
MBP18,5- und MBP-Exon 2-spezifische T-Zellen erkennen rekombinante humane (rh) MBPs
Um die biologische Aktivität von rekombinanten Formen von MBP zu beurteilen, testeten wir die in vitro-Proliferationsantwort von humanen MBP-spezifischen T-Zellinien, wenn sie mit den rekombinanten Proteinen herausgefordert wurden. Es wurden T-Zellinien erzeugt, die auf ein vom Gehirn abgeleitetes humanes MBP18,5- oder ein synthetisches Exon 2-Peptid (Aminosäurereste 60–85 von MBP21,5, SEQ ID NO: 1) reagieren. Zwei MBP18,5-spezifische Linien, 2A2 (erkennt Reste 31–50) und 3H5 (erkennt Reste 87–106), wurden durch Inkubation für 72 Stunden in vitro mit entweder MBP18,5 oder den MBP + X2-Polypeptiden stimuliert. Während der letzten 18 Stunden dieser Inkubation wurden die Zellen mit ³H-Thymidin gepulst, um eine Messung der Zellproliferation zu gestatten. Wie in 20 gezeigt, reagierten beide T-Zellinien gleich gut auf MBP + X2^Cys81 und MBP18,5, ganz gleich, ob es aus menschlichem Gehirn oder Bakterien gereinigt worden war. Wir analysierten auch die Antigenerkennung von zusätzlichen humanen T-Zellinien, die auf MBP-Epitope reagieren, die auf dem Gebiet beschrieben wurden. Wie auf dem Gebiet bestimmt und hier beschrieben, sind diese MBP18,5-Epitope innerhalb der Reste 106– 125, 136–155, 141–170 und 151–170 von MBP18,5 enthalten, wobei die Numerierung die auf dem Gebiet verwendete ist, die auf der Aminosäuresequenz des Schweine-MBP-Moleküls basiert. In jedem Fall wurde eine signifikante T-Zell-Proliferation in Reaktion auf natives MBP18,5 und rekombinantes MBP + X2^Cys81 beobachtet.
Die MBP + X2-Moleküle wurden so hergestellt, daß sie Exon 2-codierte Peptidsequenzen enthalten. Zusätzlich zur Bereitstellung eines Mittels zur Herstellung therapeutischer Mittel, die X2 enthalten, erlaubten es die Moleküle, zu bestimmen, ob APCs Exon 2-Epitope, die von MBP21,5 voller Länge abgeleitet sind, in einer Weise präsentieren können, die eine Erkennung durch T-Zellen erlaubte, oder nicht. Dies war auch wichtig für das MBP + X2^Ser81-Polypeptid, da nicht bekannt war, ob der einzelne Cysteinrest in Exon 2 für die T-Zell-Erkennung wesentlich war.
Proliferationstests mit zwei unabhängigen Exon 2-Peptid-spezifischen humanen T-Zelllinien zeigten klar, daß nur synthetisches Exon 2-Peptid, MBP + X2^Cys81 (21) und MBP + X2^Ser81 (22) eine T-Zell-Antwort auslösen konnten. Zusätzlich offenbarten Dosisantworttests (22), daß sowohl MBP + X2^Cys81 als auch MBP + X2^Ser81 den T-Zellen in vitro in effizienter Weise präsentiert wurden. Dies zeigt an, daß Cys⁸¹ für die Präsentation des Exon 2-codierten Epitops, das durch die getesteten Klone erkannt wird, entbehrlich ist. T-Zell-Proliferationsdaten sind auch in 24 und 25 zusammengefaßt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß humane T-Zellen auf verarbeitete X2-Epitope, die von MBP-21,5-Molekülen voller Länge abgeleitet sind, reagieren können, und daß die bakteriell exprimierten rekombinanten Formen von MBP, einschließlich MBP18,5, MBP + X2^Cys81 und MBP + X2^Ser81, beim Stimulieren enzephalitogener T-Zellen ebenso effektiv sein können wie das native MBP18,5-Protein.
Synthese, Expression und Reinigung von ΔPLP4 und anderen PLP-Muteinen
Eine DNA-Matrize, bestehend aus einem 1,5 kb-Fragment, welches humane PLP-Zielsequenz voller Länge, kloniert in Plasmid pUC8 (ATCC# 57466), enthielt, wurde umfassend modifiziert, um ΔPLP4 zu erzeugen. Drei Polynukleotide, von denen jedes ein Peptid codiert, welches die hydrophile Domäne 2, 3 oder 4 umfaßt, wurden unabhängig voneinander mittels PCR synthetisiert und anschließend durch überlappende PCR fusioniert. Die Sequenzintegrität der DNA, die den gesamten offenen Leserahmen von ΔPLP4 enthielt, wurde mittels Didesoxysequenzanalyse verifiziert. Die ΔPLP4-codierende Region wurde in Plasmid pET22b (Novagen) als ein NdeI/HindIII-Fragment subkloniert. Das ΔPLP4-Protein enthält fünf zusätzliche Aminosäuren (Met-Leu-Glu-Asp-Pro), die an den N-Terminus fusioniert sind, und fünf zusätzliche Histidine (eine Histidinmarkierung), die an das C-terminale Histidin fusioniert sind.
Das Plasmid pΔPLP4 wurde in E. coli-Stamm W3110 (DE3), der ein Lambda-DE3-Lysogen umfaßt, transformiert (Studier et al., 1990), und das durch die transformierten Bakterien erzeugte ΔPLP4-Polypeptid wurde mittels Coomassie-Blau-Färbung und durch Sondieren von Western-Blots mit polyklonalem Kaninchenserum, angezogen gegen ein synthetisches Peptid (Ami nosäuren 118-130) von humanem PLP (Serotec, AHP261), identifiziert, gefolgt von Detektion mit Meerrettichperoxidase-markiertem Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper und einem Detektionssystem mit verstärkter Chemilumineszenz (ECL) (Amersham). Nach Induzieren mit 1 mM IPTG machte ΔPLP4 ungefähr 50% des gesamten Zellproteins aus und schien sich ausschließlich in Einschlußkörpern zu befinden. Selektive Extraktion der Einschlußkörper erfolgt mit einem Puffer, der 6 M Guanidin-HCl oder bevorzugt 5 M Guanidin-HCl, 20 mM Natriumcitrat, pH 5,0, enthält. Eine solche Extraktion führte zu einem Präparat mit einer Reinheit von bis zu 90%, beurteilt mittels SDS-PAGE und analytischer Umkehrphasen-HPLC. N-terminale Aminosäuresequenzbestimmung bestätigte, daß die Sequenz des isolierten Polypeptids die vorhergesagten aminoterminalen Reste von ΔPLP4 enthielt.
Unter Verwendung ähnlicher konventioneller Techniken wurden Nukleinsäuremoleküle, die andere PLP-Mutein-Polypeptide codieren, konstruiert und in W3110 (DE3) exprimiert. Diese umfassen ΔPLP3 (SEQ ID NO: 23), worin die hydrophoben Domänen 1, 3 und 4 fehlen, und ein ähnliches Konstrukt, welches ein PLP-Mutein codiert, in dem nur die hydrophoben Domänen 1 und 4 fehlen (ΔPLP2, SEQ ID NO: 29). ΔPLP2 enthält auch eine His-Markierungssequenz, die an seinen Aminoterminus angehängt ist, die durch einen Linker, der eine Thrombin-Spaltungsstelle (Aminosäurereste 14–19 von SEQ ID NO: 29) enthält, mit dem Aminoterminus der zweiten hydrophilen Domäne von PLP verknüpft und hiervon getrennt ist. Die Expression der codierten PLP-Muteine ergab, daß ΔPLP3 in Mengen exprimiert wurde, die mit denen vergleichbar sind, die oben für ΔPLP4 diskutiert wurden, während ΔPLP2 in Mengen exprimiert wurde, die so gering waren, daß sie nur durch Pulse-Chase-Radioaktivmarkierungsanalyse detektiert werden konnten. Ein natives PLP-Konstrukt, das in dem gleichen Expressionssystem getestet wurde, ergab kein detektierbares PLP-Polypeptid, selbst wenn eine Analyse mittels Pulse-Chase-Radioaktivmarkierung erfolgte.
Konstruktion, Expression und Reinigung von MP4 und anderen chimären PLP-Molekülen
Ein MBP21,5-ΔPLP4-Fusionsprotein, MP4, wurde wie folgt konstruiert. Ein synthetisches DNA-Fragment, welches MBP21,5 (SEQ ID NO: 1) codierte, wurde der Kontrolle durch den T7-Promotor in dem Expressionsvektor pET22b, wie oben beschrieben, unterstellt. Als nächstes wurde das DNA-Fragment, welches eine geeignet beabstandete Ribosomenbindungsstelle und das ΔPLP4-Gen enthielt, abstromig von dem MBP21,5-Gen ligiert, wodurch ein dicistronisches Operon für die unabhängige Expression von MBP21,5 und ΔPLP4 erzeugt wurde. Das dicistronische Konstrukt wurde mit AatII-XhoI verdaut und an einen synthetischen AatII-XhoI-Linker/Adapter (entsprechend der Sequenz, die sich über die Nukleotide 588 bis 605 von SEQ ID NO: 26 erstreckt) ligiert, wodurch eine Genfusion erzeugt wurde, die das mit MP4 bezeichnete chimäre MBP21,5/ΔPLP4-Protein (SEQ ID NO: 26) codiert. Die Sequenzintegrität des resultierenden Expressionskonstrukts für das MP4-Fusionsprotein wurde bestätigt, und das MP4-codierende Plas mid wurde verwendet, um E. coli W3110 (DE3) zu transformieren, wie oben erwähnt, welcher eine lysogene chromosomale Kopie der Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase beherbergt.
Unter Verwendung ähnlicher konventioneller Techniken wurden Nukleinsäuremoleküle, die andere chimäre PLP-Polypeptide codieren, konstruiert und in W3110 (DE3) exprimiert. Diese umfassen MP3 (SEQ ID NO: 25), PM4 (SEQ ID NO: 27) und MMOGP4 (SEQ ID NO: 28). MP3 war eine zu MP4 analoge Chimäre, mit der Ausnahme, daß der PLP-Mutein-Rest die ΔPLP3-Chimäre von SEQ ID NO: 23 war. PM4 war analog zu MP4, mit der Ausnahme, daß ein unterschiedlicher Linker (entsprechend der Sequenz, die sich über die Nukleotide 508 bis 519 von SEQ ID NO: 27 erstreckt) in einem überlappenden PCR-Verfahren verwendet wurde, um MBP21,5 und ΔPLP4 in der zu MP4 entgegengesetzten Orientierung zu verknüpfen. MMOGP4 wurde konstruiert durch Einfügen einer Sequenz, die die extrazelluläre Domäne von humanem Myelin-Oligodendrozyten-Glycoprotein codiert (Pham-Dinh et al., J. Neurochem. 1994, 63:2353ff.), in MP4 zwischen den von MBP und PLP abgeleiteten Sequenzen. Die Expression der codierten chimären PLP-Polypeptide zeigte, daß sie in Mengen exprimiert wurden, die mit denjenigen für MP4 vergleichbar sind, wie unten diskutiert.
Die Synthese von MP4 wurde in E. coli W3110 (DE3), der das MP4-Plasmid trug, induziert, indem 1 mM IPTG zugegeben wurde, und das Protein schien sich ausschließlich in einer unlöslichen Fraktion zu befinden, die ungefähr 20% des Gesamtzellproteins ausmacht. MP4 wurde wie folgt isoliert. E. coli-Paste aus einer IPTG-induzierten 20 l-Fermentation wurde in 10 Volumen (10 ml/g Naßgewicht) Lysepuffer (20 mM Na-Citrat, 1 mM EDTA, pH 5,0) resuspendiert. Die Paste wurde unter Verwendung eines UltraTurrax-T 50-Homogenisierers auf Eis einheitlich suspendiert. HCl wurde bis zu einem pH-Wert von 5,0 zugegeben, und Zellen wurden unter Verwendung eines Microfluidizer-Modell M-110T-Homogenisierers, der bei einem Druck von 15.000-20.000 psi in der Reaktionskammer betrieben wurde, auf Eis lysiert. Das resultierende Lysat wurde bei ungefähr 10.000 × g zentrifugiert, um lösliche und unlösliche Fraktionen zu trennen. Die lösliche Fraktion wurde verworfen, und die unlösliche Fraktion wurde in 10 Volumen (10 ml/Gramm Naßgewicht) Extraktionspuffer (6M Guanidin-HCl, 0,5 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat, pH 5,0) unter Verwendung eines Homogenisierers (Tekmar TP 18/1051) resuspendiert. Der Extrakt wurde unter Rühren für 60 Min. bei 2–8 Grad C inkubiert. Der Extrakt wurde dann bei 10.000 × g für 30 Min. zentrifugiert. Der Überstand aus der Zentrifugation wurde auf Eis mit einem Branson Sonifier 450 für 5 Min. ultraschallbehandelt, um kontaminierende Nukleinsäuren abzuscheren, und durch einen 0,45 Mikrometer-Filter (Whatman 75AS Polycap) filtriert, wodurch ein filtrierter Überstand erhalten wurde.
Säulenchromatographie wurde in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wurde Metallchelatchromatographie wie folgt verwendet: Eine Säule mit Abmessungen von 5 cm Durchmesser × 20 cm Länge, die Chelating SEPHAROSE Fast Flow (Pharmacia Biotech) enthielt, wurde in entionisiertem Wasser gepackt. Ungefähr die oberen zwei Drittel der Säule wurden mit Ni⁺⁺ geladen, indem 1 ml 0,1 M NiCl₂ pro 7,8 ml Harz geladen wurden. Die Säule wurde dann mit 5 CV entionisiertem Wasser gewaschen. Die Säule wurde mit 2 CV Puffer A (6 M Guanidin-HCl, 0,5 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat, 1 mM 2-Mercaptoethanol, pH 7,2) äquilibriert, und die Grundlinie der optischen Dichte bei 280 nm wurde gemessen. Der filtrierte Überstand wurde mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, und 2-Mercaptoethanol wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Diese reduzierte Probe wurde auf Raumtemperatur erwärmt. Die reduzierte Probe wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/Min. geladen. Die Fließgeschwindigkeit wurde dann auf 100 ml/Min. eingestellt, und die Säule wurde mit Puffer A gewaschen, bis der Säulenausfluß die Grundlinie der optischen Dichte bei 280 nm erreichte. Die Säule wurde dann dreimal nacheinander mit 6 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 0,02 M Natriumphosphat, zuerst bei pH 7,2, dann bei pH 6,3 und schließlich bei pH 5,5 gewaschen, wobei jeder Waschschritt fortgesetzt wurde, bis die optische Dichte auf die Grundlinie zurückkehrte.
MP4 wurde mit 6 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 0,02 M Natriumphosphat, pH 3,5, aus der Säule eluiert, während die optische Dichte bei 280 nm überwacht wurde. Protein enthaltende Fraktionen wurden gepoolt, und MP4 wurde wie folgt weiter gereinigt: Ein aliquoter Teil von gepoolten Fraktionen, der ungefähr fünfunddreißig mg MP4 enthielt (berechnet mittels analytischer HPLC und SDS-PAGE), wurde durch die Zugabe von Dithiothreitol zu einer Endkonzentration von 50 mM, Guanidin-HCl zu einer Endkonzentration von 6 M und Einstellen des pH-Wertes auf 8,0 vollständig reduziert. Die Probe wurde dann bei 37 Grad C für 0,5 h inkubiert. Das resultierende reduzierte und denaturierte Präparat wurde dann durch einen 0,45 Mikrometer-Filter filtriert und auf eine C4 VYDAC (Hesperia, CA)-Umkehrphasen-HPLC-Säule mit 1 cm Durchmesser × 25 cm Länge, äquilibriert in 55% Lösungsmittel A (50% Ameisensäure/50% H₂O) und 45% Lösungsmittel B (50% Acetonitril/50% Ameisensäure), bei Raumtemperatur aufgebracht. (Eine Ablesung der Grundlinie der optischen Dichte bei 280 nm wird vorgenommen, ehe die Probe auf die Säule geladen wird.) Nach dem Beladen wurde der Säulenabfluß bei 280 nm überwacht, bis der Ablesewert zur Grundlinie zurückkehrte. Die Säule wurde dann mit einem linearen Gradienten eluiert, der die Konzentration von Lösungsmittel B von 55% Lösungsmittel A, 45% Lösungsmittel B auf 0% Lösungsmittel A, 100% Lösungsmittel B steigerte.
Gepoolte Protein-enthaltende Fraktionen wurden in einem Rotavap-Konzentrator (Buchi Corp.) konzentriert, bis eine Konzentration von ungefähr 2–3 mg/ml erreicht war. Entionisiertes Wasser wurde dann zu dem Kolben zugegeben, um die Probe ungefähr auf ihr ursprüngliches Volumen zu bringen, und die Probe wurde erneut konzentriert, um restliche Ameisensäure zu entfernen. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis das ungefähr Fünf- bis Zehnfache des ursprünglichen Volumens an Wasser zugegeben und entfernt worden war. Die Probe wurde dann in einen Rührzellenkonzentrator (Amicon), ausgestattet mit einer 10.000 Dalton PM-10-Cut-off-Membran, überführt. Diafiltration wurde bei 4 Grad C mit dreimaliger Zugabe von entionisiertem Wasser durchgeführt, bis insgesamt zwölf Diavolumen an entionisiertem Wasser durch die Probe geleitet wurden. (Der endgültige pH-Wert der Probe betrug 3,5.)
Das resultierende konzentrierte Material enthielt MP4 in einer Reinheit von bis zu 90%, bestimmt mittels SDS-PAGE und analytischer Umkehrphasen-HPLC. N-terminale Aminosäuresequenzbestimmung bestätigte, daß die Sequenz des isolierten Polypeptids die vorhergesagten aminoterminalen Reste von SEQ ID NO: 26 enthielt.
Weitere Reinigung von MP4 kann wünschenswert sein. Zusätzliche Reinigungsstufen umfassen Gelfiltrationschromatographie und Ionenaustauschchromatographie (vorzugsweise Kationenaustauschchromatographie). Diese Stufen werden durch die Zugabe eines nicht-ionischen Detergens (vorzugsweise TWEEN 20) bis zu einer Konzentration von 0,1% bis 1,0% vereinfacht. Das nicht-ionische Detergens kann an irgendeinem Punkt in der Reinigung im Anschluß an die Zelllyse zugegeben werden, da es die Metallchelatchromatographie nicht stört.
Wie bei jedem von Bakterien abgeleiteten pharmazeutischen Präparat wird das MP4-Präparat hinsichtlich Toxizität in Tieren getestet, ehe es an Menschen verabreicht wird, wobei jegliche toxische Präparate weiter gereinigt oder verworfen werden. Solche Toxizitätstests werden vorzugsweise unter Verwendung von Mäusen und am meisten bevorzugt unter Verwendung von Mäusen, in denen EAE wie unten beschrieben induziert wurde, durchgeführt, indem entweder enzephalitogene Proteine injiziert werden oder, was bevorzugt ist, indem passive Immunisierung mit T-Zellen von Tieren, die an EAE leiden, erfolgt. Auf diese Weise durchgeführte Tests haben den zusätzlichen Vorteil, daß die Wirksamkeit der Behandlung in dem Tiermodellsystem festgestellt werden kann. Für solche Tests werden vorzugsweise 300 μg-Dosen von bakteriell hergestelltem Polypeptid in Übereinstimmung mit dem geeigneten Behandlungsplan, der unten unter der Unterüberschrift "Behandlung von Mäusen mit EAE" beschrieben wird, verabreicht.
T-Zell-Antworten, induziert durch die PLP-Polypeptide der Erfindung Die ΔPLP4- und MP4-Polypeptide der Erfindung wurden in in vitro- und in vivo-Systemen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zum Stimulieren von T-Zell-Antworten und zum Verhindern und Behandeln von EAE/MS getestet. Die Ergebnisse dieser Studien sind in den 1–12 und in Tabelle 3 ausgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die PLP-Polypeptide der Erfindung T-Zell-Antworten induzieren und die Reaktivität von T-Zellen auf eine Vielzahl von MBP- und PLP-Epitopen beeinflussen können und EAE induzieren und verhindern und behandeln können.
Induzieren von EAE durch aktive Immunisierung
Weibliche SJL/J-Mäuse wurden von The Jackson Laborstories (Bar Harbor, ME) erworben. Alle Mäuse wurden im Alter zwischen 8 und 12 Wochen verwendet. Alle Mäuse wurden bei standardmäßigem Laborfutter und Wasser nach Belieben gehalten. Die Fütterung wurde so angepaßt, daß paralysierte Tiere leichteren Zugang zu Futter und Wasser erhielten.
Weibliche SJL/J-Mäuse wurden durch subkutane Injektion von 150 μl einer Emulsion von unvollständigem Freund'schem Adjuvans, enthaltend 150 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco; vollständiges Freund'sches Adjuvans) und Antigen, immunisiert. Die Antigene umfaßten 100 μg Ovalbumin, 100 μg rekombinantes ΔPLP4, 300 μg MP4 oder 150 μg PLP-Peptid 1CS (Aminosäurereste 139–151 von SEQ ID NO: 22, worin ein Serin gegen das Cystein an Position 140 substituiert ist). Jede 150 μl-Injektion wurde über drei Stellen an der dorsalen Flanke verteilt.
Alle Mäuse erhielten auch anschließende Injektionen von 300 ng Pertussistoxin (List Biologicals, Campbell, CA) an den Tagen 0 und 3, da ein höheres Auftreten von Erkrankung erhalten wurde, wenn in vorab durchgeführten Tests Pertussistoxin mit verabreicht wurde. Die immunmodulierende Wirkung von Pertussistoxin auf die Induzierung von EAE ist gut bekannt, obwohl der genaue Wirkmechanismus unbekannt ist. Pertussistoxin ist eine vasoaktive Substanz, von der angenommen wird, daß sie eine Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke erzeugt und damit den Eintritt von enzephalitogenen Zellen in das ZNS vereinfacht.
Anfängliche klinische Anzeichen von Erkrankung wurden üblicherweise zwischen Tag 12 und Tag 16 nach der Immunisierung beobachtet. Die Mäuse wurden täglich überwacht, und jeder Gruppe wurde eine mittlere klinische Maßzahl zugewiesen. Der mittlere Tag des Beginns wurde auf Basis des ersten Auftretens von klinischen Anzeichen berechnet.
Passive Immunisierung mit EAE
SJL/J-Spendermäuse wurden subkutan mit 100 μg ΔPLP4 wie oben beschrieben immunisiert. Neun bis elf Tage später wurden sich leerende Lymphknotenzellen geerntet und mit 25 μg/ml PLP-Peptid 1CS für 4 Tage in Gegenwart von syngenen SJL/J-Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) stimuliert. Die Peptid-aktivierten T-Zellen (1,6 × 10⁷ in 0,1 ml PBS) wurden geerntet, zweimal gewaschen und intravenös in syngene native Empfänger injiziert.
Behandlung von Mäusen mit EAE
Die Mäuse wurden in Behandlungsgruppen unterteilt, die unbehandelte Mäuse und Mäuse, die intravenöse Injektionen von entweder 125 μg ΔPLP4 oder Tauben-Cytochrom c (als Kontrolle) zweimal täglich (im Abstand von 6–8 Stunden) an den Tagen 2, 4 und 6 bei den Experimenten mit passiver Immunisierung oder an den Tagen 5, 7 und 9 bei den Experimenten mit aktiver Immunisierung erhielten.
Obwohl hierin bevorzugte und weitere Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurden, können weitere Ausführungsformen von Fachleuten auf dem Gebiet erkannt und ausgeführt werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen, wie er durch die nachfolgenden Ansprüche definiert wird.
Tabelle 1 Autoreaktive humane PLP-Peptide in MS-Patienten
Die Zahlen nach den Buchstaben PLP in den PLP-Peptidnamen (linke Spalte) zeigen an, daß die Sequenz dieses Peptids sich über die Aminosäurereste mit diesen Zahlen (einschließlich) von SEQ ID NO: 22 erstreckt und diesen entspricht.
Hochgestellte Kleinbuchstaben am Ende der Peptidsequenzen zeigen Literaturstellen an, die die Peptide diskutieren, wie folgt:

^a Kinkel et al., 1992. Neurology 42 (Erg. 3): 159 (Abstr. 87P).
^b Pelfrey et al., 1993. J. Neuroimmunol. 46: 33-42.
^c Trotter et al., 1993. J. Immunol. 150: 196A (Abstr. 1117).
^d Inobe et al., 1992. Neurology 42 (Erg. 3): 159-160 (Abstr. 87P).
^e Trotter et al., 1991. J. Neuroimmunol. 33: 55-62.
^f Correale et al., 1995. J. Immunol. 154: 2959-2968.
^g Chou et al., 1992. J. Neuroimmunol. 38: 105-113.

PLP-Peptid	Reste in SEQ ID NO: 24	Aminosäuresequenz	Stamm
43–64	14–35	EKLIETYFSKNYQDYEYLINVI	PL/J (H-2^d)
103–116	57–70	YKTTICGKGLSATV	SWR (H-2^q)
139–151	93–105	HCLGKWLGHPDKF	SJL/J (H-2^s)

Die Zahlen in der linken Spalte ("PLP-Peptid") zeigen, daß die Sequenz dieses Peptids sich über die Aminosäurereste mit diesen Zahlen (einschließlich) von SEQ ID NO: 22 erstreckt und diesen entspricht. Tabelle 3. Induzierung von EAE in SJL/J-Mäusen

Gruppe	Antigen*	Auftreten	Mittlerer Tag des Beginns^[]	Mittlere klin. Maßzahl^[]
A	Ovalbumin	0/6
B	ΔPLP4	6/6	12,6 (12–15)	3,7 (3–4)
C	139–151	6/6	14,2 (13–22)	4,6 (3–5)
D	MP4	5/5	12,8 (12–16)	2,3 (2–3)

* Immunisierungen wurden am Tag 0 mit CFA (150 μg H37Ra) durchgeführt. Die verwendeten Antigene waren entweder 100 μg Ovalbumin (Sigma), 100 μg ΔPLP4, 150 μg PLP-Peptid 139–151 oder 300 μg MP4. Alle Gruppen erhielten 300 ng Pertussistoxin, i.v. injiziert an den Tagen 0 und 3.
^[] Die mittlere Anzahl an Tagen zwischen der Immunisierung und den ersten Anzeichen von EAE ist für jede Gruppe von Tieren gezeigt, wobei der Bereich in Klammern angegeben ist.
^[] Die mittlere klinische Maßzahl auf dem Höhepunkt der Schwere der Erkrankung ist gezeigt, wobei der Bereich in Klammern angegeben ist.

Aminosäure	Codon	huMBP 21,5	recMBP 21,5	Aminosäure	Codon	huMBP 21,5	recMBP 21,5
Arg	CGT	2	19	Ser	TCT	3	7
	CGC	4	1		TCC	7	9
	CGA				TCA	4
	CGG	2			TCG	2
	AGA	9	1		AGT	2
	AGG	4			AGC	4	6
Gly	GGT	2	4	Ala	GCT	3	3
	GGC	13	24		GCC	5	6
	GGA	10			GCA	2
	GGG	3			GCG	3	4
Lys	AAA	2	14	Val	GTT
	AAG	12			GTC	2
Leu	CTT	2			GTA	1
	CTC	1			GTG	2	5
	CTA			His*	CAT	3	6
	CTG	8	10		CAC	8	11
	PTA			Gln	CAA	1
	TTG		1		CAG	7	8
Pro	CCT	1		Asn	AAT
	CCC	5			AAC	3	3
	CCA	4		Asp	GAT	3	3
	CCG	7	17		GAC	6	6
Thr	ACT	1		Glu	GAA	2	2
	ACC	2	8		GAG
	ACA	2		Ile	ATT	2	2
	ACG	3			ATC	2	2
Phe	TTT	4			ATA
	TTC	5	9	Tyr	TAT	2	2
Cys	TGT				TAC	3	3
	TGC	1	1	Trp	TGG	2	2
Met	ATG	4	4

* recMBP21,5 enthält sechs zusätzliche Histidine am C-Terminus.

GEN	OD₆₀₀	NASSGEW. (g)	0,1 N HCl (g/ml)	PEAKHÖHE (cm)	LYSAT VOL. (ml)
MBP + X2^Cys81/Bakt.	2,70	8,0	0,080	4,3	126
MBP + X2^Ser81/Bakt.	1,89	8,8	0,088	3,6	126
MBP18,5^hum	1,96	8,0	0,080	2,8	126
MBP + X2^Cys81/hum.	1,76	6,0	0,060	1,6	126

Literaturstellen

Abbas et al. 1994. Cell and Mol. Immunology, S. 377-391.
Adorini et al. 1993. Immunol. Today 14, S. 285-289.
Allegretta et al. 1990. Science 247, S. 718-722.
Alvord et al. 1984. Prog. Clin. Biol. Res. 146, S. 359-363.
Ammerer 1983. Meth. Enzymol. 101, S. 192ff.
Amor et al. 1994. J. Immunol. 153, S. 4349-4356.
Ausubel et al. 1994. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York.
Boehme und Lenardo 1993. Eur. J. Immunol. 23, S. 1552-1560.
Bruck et al. 1994. Ann. Neurol. 35, S. 65.
Brunner et al. 1995. Nature 373, S. 441-444.
Chang et al. 1978. Nature 275, S. 615ff.
Chou et al. 1989 J. Neurosci. Res. 23, S. 207ff.
Chou et al. 1992. J. Neuroimmunol. 38, S. 105-114.
Cohen et al. 1992. Ann. Rev. Immunol., S. 267ff.
Correale et al. 1995. J. Immunol. 154, S. 2959-2968.
Cotter et al. 1990. Anticancer Research 10, S. 1153ff.
Crispe 1994. Immunity 1, S. 347-349.
Critchfield et al. 1994. Science 263, S. 1139-1143.
Davis et al., 1994. Basic methods in molecular biology, 2. Aufl. Appleton und Lange, Norwalk, CT.
Dhein et al. 1995. Nature 373, S. 438-441.
Deibler et al. 1972. Prep. Biochem. 2, S. 139-165.
Duvall und Wyllie 1986. Immunol. Today 7, S. 115.
Einstein et al. 1962. J. Neurochem. 9, 353.
Endoh et al. 1986. J. of Immunol. 137, S. 3832-3835.
Evans und Scarpulla, 1989. Gene 84, S. 135ff.
Farrell, Jr. 1993. RNA Methodologies: A laboratory quide for isolation and characterization. Academic Press Inc., San Diego, CA.
Fritz und Zhao. 1994. J. Neuroimmunol. 51, S. 1-6.
Goeddel et al., 1980. Nucl. Acids Res. 8, S. 4057ff.
Greer et al. 1992. J. of Immunol. 149, S. 783-788.
Griffin und Griffin, Hsg., 1994. PCR technology, current innovations. CRC Press, Boca Raton, FL.
Grosjean und Fiers, 1982. Gene 18, S. 199ff.
Harwood, Hsg., 1994. Protocols for gene analysis: Methods in molecular biology. Band 31. The Humana Press, Totowa, NJ..
Hauser 1994. Harrison's Principles of Int. Med., Dreizehnte Ausgabe, S. 2287-2295.
Hernan et al. 1992 Biochemistry 31, S. 8619ff.
Ho et al. 1989. Gene 77, S. 51-59.
Huang und Gorman, 1990. Mol. Cell Biol. 10, S. 1805ff.
Jayarman et al. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084.
Johns et al., 1995. J. Immunol. 154, S. 5536-5541.
Ju et al., 1995. Nature 373, S. 444-448.
Kalghatgi und Horvath. 1987 J. Chromatogr. 398, 335.
Kamholtz et al. 1988. J. Neurosci. Res. 21, S. 62-70.
Kaufman et al. 1993. Nature 366, S. 69ff.
Kawabe und Ochi, 1991. Nature 349, S. 245-248.
Kennedy et al. 1990. J. of Immunol. 144, S. 909-915.
Kerlero de Rosbol et al. 1993. J. Clin. Invest. 92, S. 2602ff.
Kerr et al., 1991. Apoptosis: the molecular basis of cell death, Tomei und Cope (Hsg.), Cold Spring Harbor Laborstory Press, Plainview, New York, S. 5ff.
Klaus, Hsg., 1987. Lymphocytes: A practical approach. IRL Press, Oxford, England.
Kuchroo et al. 1992. J. of Immunol. 148, S. 3776-3782.
Kuchroo et al. 1994. J. of Immunol. 150, S. 3326-3336.
Lees und Mackin. 1988. Neuronal and Glial Proteins. Academic Press, San Diego, S. 267-298
Lehmann et al. 1992. Nature 358, S. 155-157.
Lenardo 1991. Nature 353, S. 858-860.
Lockshin und Zakeri, 1991. Apoptosis: the molecular basis of cell death, Tomei und Cope (Hsg.), Cold Spring Harbor Laborstory Press, Plainview, New York, S. 47ff.
Luckow, et al., 1988. Bio/Technology 6, S. 47ff.
Maniatis, 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Marrack und Kappler, 1987. Science 238, S. 1073ff.
Martin et al. 1990. J. Immunol. 145, S. 540ff.
Martin et al. 1992. Ann. Rev. Immunol., 10, S. 153-187.
McCarron et al. 1990. J. Neuroimmunol. 29, S. 73ff.
McRae et al. 1992. J. of Neuroimmunol. 38, S. 229-240.
Meinl et al. 1993. J. Clin. Invest. 92, S. 2633ff.
Miller et al. 1992. J. Neuroimmunol. 39, S. 243ff.
Miller und Karpus. 1994. Immunol. Today, S. 356-361.
Moir et al., 1991. Meth. Enzymol. 194, S. 491-507.
Morgenstern und Land, 1990. Nucl. Acids Res. 18, S. 3587ff.
Mullis et al., Hsg., 1994. The Polymerase Chain Reaction. Springer-Verlag, New York, NY.
Nagata und Suda, 1995. Immunol. Today 16, S. 39ff.
Oettinger at al. 1993. J. Neuroimmunol. 44, S. 157ff.
Ormerod, Hsg., 1994. Flow cytometry: A practical approach. 2. Ausg. IRL Press at Oxford Uni versity Press, Oxford, England.
Ota et al. 1990. Nature 346, S. 183ff.
Paul, 1989. Fundamental Immunology, 2. Ausg. Paul (Hsg.), Raven Press, New York.
Pette et al. 1990. Neurology 40, S. 1770ff.
Pelfry et al. 1993. J. of Neuroimmunol., 46, S. 33-42.
Pelfry et al. 1994. J. of Neuroimmunol. 53, S. 153-161.
Prineas et al. 1993. Ann. Neurol. 33, S. 137.
Raine und Wu. 1993. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52, S. 199.
Racke et al. 1995. J. Immunol. 154, S. 450-458.
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Philadelphia, PA, 17th Ausg. (1985)
Richert et al. 1989. J. Neuroimmunol. 23, S. 55ff.
Roth et al. 1987. J. of Neurosci. Res. 17, S. 321-328.
Russell et al. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, S. 4409-4413.
Saeki et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, S. 6157-6161.
Sambrook et al. 1990. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)
Sato et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, S. 17267ff.
Schena et al., 1991. Meth. Enzymol. 194, S. 389-398.
Schwartz, 1993. Schwartz, RS, "Autoimmunity and Autoimmune Diseases" in Paul, Fundamental Immunology, 3. Ausg. Raven Press, New York, 1993, S. 1033-1097.
Segal et al. 1994. J. of Neuroimmunol. 51, S. 7-19.
Sercarz et al. 1959. Nature 184, S. 1080-1082.
Singer et al. 1994. Immunity 1, S. 365-371.
Smith et al. 1989. Nature 337, S. 181-184.
Sobel et al. 1992. J. of Immunol. 149, S. 1444-1451.
Sobel et al. 1994. Neurochem. Res. 19, S. 915-921.
Smith et al. 1989. Nature 337, S. 181-184.
Sprent 1994. Cell 76, S. 315-322.
Steinman 1995. Cell 80, S. 7-10.
Studier et al. 1990. Meth. Enzymol. 185, S. 60-89.
Strasser 1995. Nature 373, S. 385-386.
Sun et al. 1991. Eur. J. Immunol. 21, S. 1461-1468.
Tabira, 1988. Ann. NY Acad. Sci. 540, S. 187-201.
Taguchi et al. 1990. J. Immunol. Meth. 128, S. 65-73.
Talib et al. 1991. Gene 98:289-293.
Tisch et al. 1993 Nature 366, S. 72-75.
Trotter et al. 1987. J. of Neurosci. Res. 79, S. 173-188.
Trotter et al. 1991. J. of Neuroimmunol. 33, S. 55-62.
Tuohy et al. 1988. J. of Immunol. 141, S. 1126-1130.
Tuohy et al. 1989. J. of Immunol. 142, S. 1523-1527.
Tuohy et al. 1992. J. of Neuroimmunol. 39, S. 67-74.
Touhy 1994. Neurochem. Res. 19, S. 935-944.
Van der Venn et al. 1989. J. of Neuroimmunol. 21, S. 183-191.
Van der Venn et al. 1990. J. of Neuroimmunol. 26, S. 139-145.
Van der Venn et al. 1992. J. of Neuroimmunol. 38, S. 139-146.
van Noort et al. 1994. J. Chromatogr. B. 653, S. 155ff.
von Boehmer, 1988. Ann. Rev. Immunol, 6, S. 309ff.
Voskuhl et al. 1993a. J. of Neuroimmunol. 42, S. 187-192.
Voskuhl et al. 1993b. J. of Neuroimmunol. 46, S. 137-144.
Voskuhl et al. 1994. J. Immunol. 149, S. 4834ff.
Wada et al. 1992. Nucl. Acids Res. 20 (Ergänzung), S. 2111-2118
Weimbs und Stoffel. 1992. Biochemistry 31, S. 12289-12296.
Weiner et al. 1993. Science 259, S. 1321ff.
Weir, 1978. Handbook of experimental immunology, 3. Ausg. Band 2, Cellular immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England.
Whitham et al. 1991. J. of Immunol. 147, S. 101-107.
Whitham et al. 1991. J. of Immunol. 147, S. 3803-3808.
Williams et al. 1988. Nucl. Acids Res. 16, S. 10453ff.
Wosnick et al. 1987. Gene 60, 115.
Yoon et al. 1993. Science 259, S. 1263ff.
Zhang et al. 1993. Science 261, S. 1451-1454.
Zhang et al. 1994. J. Exp. Med. 179, S. 973-984.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes immunreaktives Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es eine der Aminosäuresequenzen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus den Folgenden besteht: SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 und SEQ ID No: 28, wobei diese Polypeptide als MP3-Chimäre, MP4-Chimäre, PM4-Chimäre bzw. MMOGP4-Chimäre bezeichnet werden.
Isoliertes immunreaktives Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine der Aminosäuresequenzen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus den Folgenden besteht: Aminosäurereste 1 bis 385 von SEQ ID No: 25, Aminosäurereste 1 bis 368 von SEQ ID No: 26, Aminosäurereste 6 bis 374 von SEQ ID No: 27 und Aminosäurereste 1 bis 487 von SEQ ID No: 28, wobei diese Polypeptide als MP3-Chimäre, MP4-Chimäre, PM4-Chimäre bzw. MMOGP4-Chimäre bezeichnet werden.
Isoliertes immunreaktives Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welches die Aminosäurereste 1 bis 368 von SEQ ID No: 26 umfasst und als MP4 bezeichnet wird.
Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleotidsequenz umfasst, welche, wenn sie in einem geeigneten Wirt exprimiert wird, die Expression eines Polypeptides nach Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 3 steuert.
Für eine Verabreichung an einen menschlichen Patienten geeignete Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein immunreaktives Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Für eine Verabreichung an einen menschlichen Patienten geeignete toleranzauslösende Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere immunreaktive Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines isolierten immunreaktiven Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches die Stufe umfasst, bei der man einen rekombinanten Wirt, der ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4 enthält, züchtet, so dass die Nukleinsäure von dem Wirt exprimiert wird, und das exprimierte Polypeptid isoliert.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die rekombinante Wirtszelle eine Bakterienwirtszelle ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Isolieren des exprimierten Polypeptids das Aufbrechen des Wirts zum Erhalt eines Extraktes, gefolgt von Fraktionierung des Extraktes, welche eine Säureextraktion davon einbezieht, umfasst.
Isoliertes immunreaktives Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder Zusammensetzung nach Anspruch 5 für eine Verwendung in der Prävention gegen MS oder zur Behandlung eines Patienten, der unter MS leidet.
Verwendung eines isolierten immunreaktiven Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention von multipler Sklerose oder zur Behandlung eines Patienten, der unter multipler Sklerose leidet.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid dem Patienten nach einer Vorschrift verabreicht wird, welche eine Verabreichung des Polypeptids wenigstens zweimal in einem Intervall von wenigstens zwölf Stunden und nicht mehr als vier Tagen umfasst.
Verfahren zum Untersuchung des potentiellen Ansprechens eines menschlichen MS-Patienten auf eine therapeutische Behandlung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Inkubieren von Replikaten von T-Zell-Kulturen, die aus dem Patienten isoliert wurden, in der Gegenwart und Abwesenheit von einem oder mehreren Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und b) Untersuchen hinsichtlich des Vorhandenseins von T-Zell-Aktivierung und/oder T-Zell-Apoptose, welche aus einer Inkubation in der Gegenwart, aber nicht in der Abwesenheit von einem oder mehreren solcher Polypeptide nach den Ansprüchen 1 bis 3 resultieren.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das eine Polypeptid oder die mehreren Polypeptide aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, welche aus den Folgenden besteht: Aminosäurereste 1 bis 385 von SEQ ID No: 25, Aminosäurereste 1 bis 368 von SEQ ID No: 26, Ami nosäurereste 6 bis 374 von SEQ ID No: 27 und Aminosäurereste 1 bis 487 von SEQ ID No: 28, wobei diese Polypeptide als MP3-Chimäre, MP4-Chimäre, PM4-Chimäre bzw. MMOGP4-Chimäre bezeichnet werden.
Verwendung eines isolierten immunreaktiven Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Untersuchung des potentiellen Ansprechens eines menschlichen MS-Patienten auf eine therapeutische Behandlung.